{"words": ["figf1a", ",", "Sections", "of", "the", "thymus", "and", "muscle", "of", "fed", "and", "starved", "GFP", "-", "LC3", "mice", "were", "stained", "with", "anti", "-", "GFP", "Alexa", "488", "antibody", "(", "green", ")", "and", "4", ",", "6", "-", "diamidino", "-", "2", "-", "phenylindole", "(", "DAPI", ";", "blue", ")", ".", "Images", "are", "representative", "of", "n", "=", "6", ".", "b", ",", "Thymic", "stromal", "cells", "from", "GFP", "-", "LC3", "mice", "were", "fixed", "onto", "glass", "slides", "and", "stained", "with", "anti", "-", "GFP", "Alexa", "488", "and", "DAPI", ".", "Typical", "autophagy", "-", "positive", "cTECs", "and", "mTEChi", "are", "shown", ".", "The", "average", "frequencies", "±", "s", ".", "d", ".", "of", "cTECs", "and", "mTEChi", "scoring", "autophagy", "positive", "(", "that", "is", ",", "≥", "5", "autophagosomes", ")", "in", "two", "independent", "preparations", "are", "indicated", ".", "Less", "than", "1", "%", "of", "dendritic", "cells", "(", "DCs", ")", "and", "mTEClo", "were", "positive", ".", "c", ",", "Relative", "distribution", "of", "the", "number", "of", "autophagosomes", "in", "autophagy", "-", "positive", "cTECs", "and", "mTEChi", ";", "a", ".", "u", ".", ",", "arbitrary", "units", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf1a, Sections of the thymus and muscle of fed and starved GFP-LC3 mice were stained with anti-GFP Alexa 488 antibody (green) and 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI; blue). Images are representative of n = 6.b, Thymic stromal cells from GFP-LC3 mice were fixed onto glass slides and stained with anti-GFP Alexa 488 and DAPI. Typical autophagy-positive cTECs and mTEChi are shown. The average frequencies ± s.d. of cTECs and mTEChi scoring autophagy positive (that is, ≥5 autophagosomes) in two independent preparations are indicated. Less than 1% of dendritic cells (DCs) and mTEClo were positive.c, Relative distribution of the number of autophagosomes in autophagy-positive cTECs and mTEChi; a.u., arbitrary units."}
{"words": ["figf2a", ",", "Thymi", "from", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "or", "Atg5", "-", "/", "-", "embryos", "were", "transplanted", "under", "the", "kidney", "capsule", "of", "wild", "-", "type", "recipients", "and", "analysed", "6", "weeks", "later", ".", "The", "average", "cellularities", "±", "s", ".", "d", ".", "are", "shown", ";", "n", "=", "5", ".", "b", ",", "Normal", "compartmentalization", "of", "Atg5", "-", "/", "-", "grafts", "in", "cytokeratin", "-", "8", "-", "positive", "(", "red", ";", "K8", ")", "cortical", "and", "cytokeratin", "-", "5", "-", "positive", "(", "green", ";", "K5", ")", "medullary", "regions", ";", "n", "=", "8", ".", "c", ",", "Expression", "of", "MHC", "class", "I", "and", "II", "on", "cTECs", "or", "mTECs", "from", "Atg5", "-", "/", "-", "to", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "grafts", "(", "red", ")", ",", "or", "wild", "-", "type", "to", "wild", "-", "type", "grafts", "(", "blue", ")", ".", "Staining", "controls", "are", "depicted", "in", "grey", ";", "data", "are", "representative", "of", "three", "experiments", ".", "dd", ",", "RT", "-", "PCR", "analysis", "of", "autoimmune", "regulator", "(", "Aire", ")", "and", "TRA", "expression", "in", "mTECs", "isolated", "from", "Atg5", "-", "/", "-", "to", "wild", "-", "type", ",", "or", "wild", "-", "type", "to", "wild", "-", "type", "grafts", ".", "Expression", "of", "β", "-", "actin", "(", "Actb", ")", ",", "intestinal", "trefoil", "factor", "(", "Tff3", ")", ",", "casein", "2", "(", "Csn2", ")", "and", "salivary", "protein", "1", "(", "Spt1", ")", "are", "also", "shown", "(", "5", "-", "fold", "serial", "dilutions", ")", ".", "Data", "are", "representative", "of", "two", "experiments", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf2a, Thymi from wild-type (WT) or Atg5-/- embryos were transplanted under the kidney capsule of wild-type recipients and analysed 6 weeks later. The average cellularities ± s.d. are shown; n = 5.b, Normal compartmentalization of Atg5-/- grafts in cytokeratin-8-positive (red; K8) cortical and cytokeratin-5-positive (green; K5) medullary regions; n = 8.c, Expression of MHC class I and II on cTECs or mTECs from Atg5-/- to wild-type (WT) grafts (red), or wild-type to wild-type grafts (blue). Staining controls are depicted in grey; data are representative of three experiments. dd, RT-PCR analysis of autoimmune regulator (Aire) and TRA expression in mTECs isolated from Atg5-/- to wild-type, or wild-type to wild-type grafts. Expression of β-actin (Actb), intestinal trefoil factor (Tff3), casein 2 (Csn2) and salivary protein 1 (Spt1) are also shown (5-fold serial dilutions). Data are representative of two experiments."}
{"words": ["figf3a", ",", "Polyclonal", "T", "-", "cell", "development", "in", "Atg5", "-", "/", "-", "to", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", ",", "or", "wild", "-", "type", "to", "wild", "-", "type", "grafts", ".", "The", "top", "dot", "plots", "show", "CD4", "and", "CD8", "staining", ";", "the", "bottom", "dot", "plots", "show", "expression", "of", "CD25", "and", "Foxp3", "by", "CD4", "SP", "thymocytes", ";", "n", "≥", "5", ".", "b", ",", "Atg5", "-", "/", "-", "or", "wild", "-", "type", "lobes", "were", "grafted", "into", "TCR", "-", "HA", "transgenic", "recipients", ".", "Graft", "cellularity", "±", "s", ".", "d", ".", "and", "the", "expression", "of", "the", "transgenic", "TCR", "on", "CD4", "SP", "cells", "were", "analysed", "after", "6", "weeks", ".", "The", "frequency", "±", "s", ".", "d", ".", "of", "TCR", "-", "HA", "+", "cells", "among", "CD4", "SP", "cells", "was", "32", ".", "1", "%", "±", "3", ".", "2", "%", "in", "wild", "-", "type", "to", "TCR", "-", "HA", ",", "and", "19", ".", "6", "%", "±", "4", ".", "3", "%", "in", "Atg5", "-", "/", "-", "to", "TCR", "-", "HAlobes", ";", "P", "=", "1", ".", "8", "×", "10", "-", "8", "(", "n", "≥", "14", ")", ".", "c", ",", "Atg5", "-", "/", "-", "or", "wild", "-", "type", "lobes", "were", "grafted", "into", "AND", "transgenic", "mice", ".", "Graft", "cellularity", " ", "±", " ", "s", ".", "d", ".", "and", "the", "expression", "of", "the", "transgenic", "TCR", "(", "Vb3", "-", "Va11", ")", "on", "CD4", "SP", "cells", "were", "analysed", "after", "6", " ", "weeks", ".", "The", "frequency", " ", "±", " ", "s", ".", "d", ".", "of", "Vb3", "-", "Va11", "+", "CD4", "SP", "cells", "was", "93", ".", "5", "%", " ", "±", " ", "0", ".", "2", "%", "in", "wild", "-", "type", "to", "ANDlobes", "(", "n", "=", "3", ")", "and", "97", ".", "9", "%", " ", "±", " ", "1", ".", "1", "%", "(", "n", "=", "6", ")", "in", "Atg5", "-", "/", "-", "to", "ANDlobes", "(", "P", "=", "9", " ", "×", " ", "10", "-", "4", ")", ".", "d", ",", "Thymi", "from", "wild", "-", "type", "or", "Atg5", "-", "/", "-", "embryos", "were", "grafted", "into", "P14", ",", "OT", "-", "I", "or", "HY", "TCR", "-", "transgenic", "recipients", ".", "The", "dot", "plots", "show", "the", "expression", "of", "the", "transgenic", "TCR", "V", "-", "segments", "on", "CD8", "SP", "cells", ".", "Thymus", "cellularities", "±", "s", ".", "d", ".", "are", "shown", "in", "the", "respective", "bar", "diagrams", ".", "Data", "are", "representative", "of", "n", "=", "4", "(", "P14", ")", ",", "n", "≥", "4", "(", "OT", "-", "I", ")", "and", "n", "≥", "2", "(", "HY", ")", ".", "e", ",", "Thymi", "from", "wild", "-", "type", "or", "(", "BALB", "/", "c3C57BL", "/", "6", ")", "F1", "Atg5", "-", "/", "-", "embryos", "were", "transplanted", "into", "(", "BALB", "/", "c3C57BL", "/", "6", ")", "F1", "recipients", ".", "Six", "weeks", "after", "grafting", ",", "expression", "of", "the", "I", "-", "Ea52", "-", "68", "-", "I", "-", "Ab", "complex", "on", "cTECs", "was", "analysed", "using", "the", "monoclonal", "antibody", "Y", "-", "Ae", ".", "Atg5", "-", "/", "-", "cTECs", "are", "shown", "in", "red", ";", "wild", "-", "type", "cTECs", "are", "shown", "in", "blue", ".", "Control", "stainings", "are", "shown", "in", "orange", "(", "Atg5", "-", "/", "-", ")", "and", "green", "(", "wild", "type", ")", ".", "Data", "are", "representative", "of", "two", "independent", "experiments", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf3a, Polyclonal T-cell development in Atg5-/- to wild-type (WT), or wild-type to wild-type grafts. The top dot plots show CD4 and CD8 staining; the bottom dot plots show expression of CD25 and Foxp3 by CD4 SP thymocytes; n ≥ 5.b, Atg5-/- or wild-type lobes were grafted into TCR-HA transgenic recipients. Graft cellularity ± s.d. and the expression of the transgenic TCR on CD4 SP cells were analysed after 6 weeks. The frequency ± s.d. of TCR-HA+ cells among CD4 SP cells was 32.1% ± 3.2% in wild-type to TCR-HA, and 19.6% ± 4.3% in Atg5-/- to TCR-HAlobes; P = 1.8 × 10-8 (n ≥ 14).c, Atg5-/- or wild-type lobes were grafted into AND transgenic mice. Graft cellularity ± s.d. and the expression of the transgenic TCR (Vb3-Va11) on CD4 SP cells were analysed after 6 weeks. The frequency ± s.d. of Vb3-Va11+ CD4 SP cells was 93.5% ± 0.2% in wild-type to ANDlobes (n = 3) and 97.9% ± 1.1% (n = 6) in Atg5-/- to ANDlobes (P = 9 × 10-4).d, Thymi from wild-type or Atg5-/- embryos were grafted into P14, OT-I or HY TCR-transgenic recipients. The dot plots show the expression of the transgenic TCR V-segments on CD8 SP cells. Thymus cellularities ± s.d. are shown in the respective bar diagrams. Data are representative of n = 4 (P14), n ≥ 4 (OT-I) and n ≥ 2 (HY).e, Thymi from wild-type or (BALB/c3C57BL/6)F1 Atg5-/- embryos were transplanted into (BALB/c3C57BL/6)F1 recipients. Six weeks after grafting, expression of the I-Ea52-68-I-Ab complex on cTECs was analysed using the monoclonal antibody Y-Ae. Atg5-/- cTECs are shown in red; wild-type cTECs are shown in blue. Control stainings are shown in orange (Atg5-/-) and green (wild type). Data are representative of two independent experiments."}
{"words": ["figf4Atg5", "-", "/", "-", "or", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "lobes", "were", "grafted", "into", "athymic", "(", "nu", "/", "nu", ")", "mice", "(", "nu", "/", "nuAtg5", "-", "/", "-", "or", "nu", "/", "nuWT", ",", "respectively", ")", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "experiments", "with", "n", "≥", "4", ".", "a", ",", "Expression", "of", "activation", "markers", "on", "lymph", "node", "CD4", "T", "cells", "in", "nu", "/", "nuAtg5", "-", "/", "-", "or", "nu", "/", "nuWT", "chimaeras", ".", "b", ",", "The", "changes", "in", "body", "weight", "over", "time", "are", "shown", ".", "c", ",", "The", "appearance", "of", "nu", "/", "nuAtg5", "-", "/", "-", "or", "nu", "/", "nuWT", "chimaeras", ".", "The", "colon", "(", "arrow", ")", "and", "uterus", "(", "arrowhead", ")", "are", "highlighted", ";", "note", "the", "absence", "of", "fat", "pads", "(", "asterisk", ")", "in", "nu", "/", "nuAtg5", "-", "/", "-", "chimaeras", ".", "d", ",", "Haematoxylin", "and", "eosin", "staining", "of", "organs", "from", "nu", "/", "nuAtg5", "-", "/", "-", "or", "nu", "/", "nuWT", "chimaeras", ".", "Arrows", "indicate", "infiltrates", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf4Atg5-/- or wild-type (WT) lobes were grafted into athymic (nu/nu) mice (nu/nuAtg5-/- or nu/nuWT, respectively). Data are representative of three experiments with n ≥ 4. a, Expression of activation markers on lymph node CD4 T cells in nu/nuAtg5-/- or nu/nuWT chimaeras.b, The changes in body weight over time are shown.c, The appearance of nu/nuAtg5-/- or nu/nuWT chimaeras. The colon (arrow) and uterus (arrowhead) are highlighted; note the absence of fat pads (asterisk) in nu/nuAtg5-/- chimaeras.d, Haematoxylin and eosin staining of organs from nu/nuAtg5-/- or nu/nuWT chimaeras. Arrows indicate infiltrates."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "Representative", "images", "of", "immunofluorescence", "of", "α", "-", "smooth", "muscle", "actin", "(", "α", "-", "SMA", ")", ",", "pan", "Cytokeratin", ",", "Pan", "-", "hMENA", ",", "hMENA11a", "and", "E", "-", "cadherin", "expression", "in", "CAFs", "and", "autologous", "cancer", "cells", "(", "Ep", "-", "PDAC", ")", "obtained", "from", "enzymatically", "digested", "primary", "PDAC", "tissue", "of", "patient", "#", "36", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "4", "′", ",", "6", "-", "diamidino", "-", "2", "-", "phenylindole", "(", "DAPI", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "20", "μm", ".", "B", ".", "Representative", "immunoblot", "(", "top", ")", "of", "hMENA", "/", "hMENA", "∆", "v6", "expression", "levels", "(", "detected", "by", "Pan", "-", "hMENA", "mAb", "and", "by", "the", "specific", "anti", "-", "hMENAΔv6", "antibody", ")", "in", "normal", "fibroblasts", "derived", "from", "transplant", "donor", "(", "P", "-", "NF", ")", ",", "pancreatic", "serous", "cystadenoma", "#", "71", "and", "cancer", "associated", "fibroblasts", "(", "n", "=", "10", ")", "obtained", "from", "primary", "PDAC", "tissues", ".", "Densitometry", "quantified", "data", "(", "bottom", ")", "of", "hMENA", "∆", "v6", "expression", ".", "Quantification", "of", "P", "#", "110", "is", "relative", "to", "the", "sample", "shown", "in", "the", "WB", "on", "the", "left", ".", "C", ".", "Representative", "immunoblot", "(", "top", ")", "of", "hMENA", "/", "hMENA", "∆", "v6", "expression", "levels", "(", "detected", "by", "Pan", "-", "hMENA", "mAb", "and", "by", "the", "specific", "anti", "-", "hMENAΔv6", "antibody", ")", "in", "normal", "lung", "fibroblasts", "(", "L", "-", "NF", ")", ",", "cancer", "associated", "fibroblasts", "obtained", "from", "NSCLC", "tissues", "(", "n", "=", "4", ")", "and", "normal", "dermal", "fibroblasts", "(", "HNF", ")", ".", "Densitometry", "quantified", "data", "(", "bottom", ")", "of", "hMENA", "∆", "v6", "expression", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. Representative images of immunofluorescence of α-smooth muscle actin (α-SMA), pan Cytokeratin, Pan-hMENA, hMENA11a and E-cadherin expression in CAFs and autologous cancer cells (Ep-PDAC) obtained from enzymatically digested primary PDAC tissue of patient #36. Nuclei were stained with 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Scale bar: 20 μm.B. Representative immunoblot (top) of hMENA/hMENA∆v6 expression levels (detected by Pan-hMENA mAb and by the specific anti-hMENAΔv6 antibody) in normal fibroblasts derived from transplant donor (P-NF), pancreatic serous cystadenoma #71 and cancer associated fibroblasts (n=10) obtained from primary PDAC tissues. Densitometry quantified data (bottom) of hMENA∆v6 expression. Quantification of P#110 is relative to the sample shown in the WB on the left. C. Representative immunoblot (top) of hMENA/hMENA∆v6 expression levels (detected by Pan-hMENA mAb and by the specific anti-hMENAΔv6 antibody) in normal lung fibroblasts (L-NF), cancer associated fibroblasts obtained from NSCLC tissues (n=4) and normal dermal fibroblasts (HNF). Densitometry quantified data (bottom) of hMENA∆v6 expression."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Representative", "images", "of", "immunofluorescence", "of", "Pan", "-", "hMENA", "(", "yellow", ")", "and", "α", "-", "SMA", "(", "red", ")", "in", "the", "primary", "PDAC", "tissue", "of", "patient", "#", "138", "from", "whom", "high", "hMENA", "∆", "v6", "CAFs", "were", "obtained", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "4", "′", ",", "6", "-", "diamidino", "-", "2", "-", "phenylindole", "(", "DAPI", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "The", "inset", "of", "the", "dashed", "area", "is", "provided", "on", "the", "right", "as", "a", "zoomed", "-", "in", "and", "cropped", "fluorescence", "image", ".", "Scale", "bar", ":", "20", "μm", ".", "αSMA", "‑", "positive", "CAFs", "are", "also", "positive", "for", "Pan", "-", "hMENA", "(", "arrow", ")", ".", "B", ".", "Representative", "images", "of", "immunofluorescence", "of", "Pan", "-", "hMENA", "(", "yellow", ")", "and", "α", "-", "SMA", "(", "red", ")", "in", "NSCLC", "case", "#", "484", "from", "whom", "high", "hMENA", "∆", "v6", "CAFs", "were", "obtained", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "4", "′", ",", "6", "-", "diamidino", "-", "2", "-", "phenylindole", "(", "DAPI", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "The", "inset", "of", "the", "dashed", "area", "is", "provided", "on", "the", "right", "as", "a", "zoomed", "-", "in", "and", "cropped", "fluorescence", "image", ".", "Scale", "bar", ":", "20", "μm", ".", "As", "in", "A", ",", "α", "-", "SMA", "signal", "is", "evident", "in", "stromal", "cells", "which", "are", "also", "positive", "for", "Pan", "-", "hMENA", "(", "arrow", ")", ".", "C", ".", "Boxplots", "showing", "the", "mean", "mRNA", "expression", "of", "ENAH", "gene", "(", "hMENA", ")", "for", "22", "patients", "in", "the", "10", "groups", "of", "cell", "types", "(", "Peng", "et", "al", ".", ",", "2019", ")", "(", "total", "number", "of", "cells", ":", "38487", ",", "mean", "of", "cells", "for", "patient", ":", "1603", ")", ".", "Shown", "in", "each", "boxplot", "are", "the", "median", "value", "(", "horizontal", "line", ")", ",", "25th", "-", "75th", "percentiles", "(", "box", "outline", ")", ",", "and", "highest", "and", "lowest", "values", "within", "1", ".", "5x", "of", "the", "inter", "-", "quartile", "range", "(", "vertical", "line", ")", ".", "Expressions", "from", "each", "cell", "-", "type", "group", "were", "compared", "to", "all", "other", "groups", "by", "using", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", "(", "two", "-", "sided", ")", "and", "P", "-", "values", "were", "adjusted", "for", "multiple", "testing", "using", "the", "Benjamini", "-", "Hochberg", "method", ".", "Stromal", "cell", "-", "type", "groups", "with", "significantly", "up", "-", "regulated", "ENAH", "expression", "respect", "to", "other", "stromal", "groups", "are", ":", "Fibroblast", ",", "*", "*", "*", "q", "=", "0", ".", "0002", ";", "Stellate", ",", "*", "*", "*", "q", "=", "1", ".", "5e", "-", "07", ".", "Non", "-", "stromal", "cell", "-", "type", "groups", "with", "significantly", "up", "-", "regulated", "ENAH", "expression", "with", "respect", "to", "other", "non", "-", "stromal", "groups", "are", ":", "Ductal", "1", ",", "*", "*", "q", "=", "0", ".", "0013", ".", "D", ".", "Boxplots", "showing", "the", "mRNA", "expression", "of", "ENAH", "gene", "(", "hMENA", ")", "in", "the", "7", "groups", "of", "cell", "types", "from", "(", "Lambrechts", "et", "al", ".", ",", "2018", ")", "(", "total", "n", "=", "52", ")", ".", "Shown", "in", "each", "boxplot", "are", "the", "median", "value", "(", "horizontal", "line", ")", ",", "25th", "-", "75th", "percentiles", "(", "box", "outline", ")", ",", "and", "highest", "and", "lowest", "values", "within", "1", ".", "5x", "of", "the", "inter", "-", "quartile", "range", "(", "vertical", "line", ")", ".", "Cell", "expression", "from", "each", "group", "were", "compared", "to", "all", "other", "stromal", "/", "not", "-", "stromal", "cells", "by", "using", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", "(", "two", "-", "sided", ")", "and", "P", "-", "values", "were", "adjusted", "for", "multiple", "testing", "using", "the", "Benjamini", "-", "Hochberg", "method", "(", "Fibroblast", "group", "vs", "other", "stromal", "groups", ",", "*", "*", "q", "=", "0", ".", "0022", ";", "Other", "comparisons", ",", "q", ">", "0", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Representative images of immunofluorescence of Pan-hMENA (yellow) and α-SMA (red) in the primary PDAC tissue of patient #138 from whom high hMENA∆v6 CAFs were obtained. Nuclei were stained with 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Scale bar: 50 μm. The inset of the dashed area is provided on the right as a zoomed-in and cropped fluorescence image. Scale bar: 20 μm. αSMA‑positive CAFs are also positive for Pan-hMENA (arrow).B. Representative images of immunofluorescence of Pan-hMENA (yellow) and α-SMA (red) in NSCLC case #484 from whom high hMENA∆v6 CAFs were obtained. Nuclei were stained with 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Scale bar: 50 μm. The inset of the dashed area is provided on the right as a zoomed-in and cropped fluorescence image. Scale bar: 20 μm. As in A, α-SMA signal is evident in stromal cells which are also positive for Pan-hMENA (arrow).C. Boxplots showing the mean mRNA expression of ENAH gene (hMENA) for 22 patients in the 10 groups of cell types (Peng et al., 2019) (total number of cells: 38487, mean of cells for patient: 1603). Shown in each boxplot are the median value (horizontal line), 25th-75th percentiles (box outline), and highest and lowest values within 1.5x of the inter-quartile range (vertical line). Expressions from each cell-type group were compared to all other groups by using Mann-Whitney U-test (two-sided) and P-values were adjusted for multiple testing using the Benjamini-Hochberg method. Stromal cell-type groups with significantly up-regulated ENAH expression respect to other stromal groups are: Fibroblast, ***q=0.0002; Stellate, ***q= 1.5e-07. Non-stromal cell-type groups with significantly up-regulated ENAH expression with respect to other non-stromal groups are: Ductal 1, **q=0.0013.D. Boxplots showing the mRNA expression of ENAH gene (hMENA) in the 7 groups of cell types from (Lambrechts et al., 2018) (total n=52). Shown in each boxplot are the median value (horizontal line), 25th-75th percentiles (box outline), and highest and lowest values within 1.5x of the inter-quartile range (vertical line). Cell expression from each group were compared to all other stromal/not-stromal cells by using Mann-Whitney U-test (two-sided) and P-values were adjusted for multiple testing using the Benjamini-Hochberg method (Fibroblast group vs other stromal groups, **q=0.0022; Other comparisons, q>0.05"}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "Quantification", "of", "in", "vitro", "matrigel", "invasion", "assay", "(", "bottom", ")", "of", "P", "-", "CAF", "and", "L", "-", "CAF", "(", "P", "-", "CAF", "#", "36", ",", "138", "and", "L", "-", "CAF", "#", "189", ",", "484", ")", "transfected", "with", "control", "siRNA", "(", "CNT", ")", "or", "hMENA", "siRNA", "(", "hMENA", "(", "t", ")", ")", "indicating", "that", "the", "siRNA", "‐", "mediated", "knock", "‐", "down", "of", "hMENA", "/", "hMENA", "∆", "v6", "reduces", "the", "invasive", "ability", "of", "CAFs", "with", "respect", "to", "siCNT", "CAFs", ".", "Number", "of", "invading", "cells", "was", "measured", "by", "counting", "6", "random", "fields", ".", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", "of", "two", "biological", "replicates", ",", "performed", "in", "triplicates", "each", ".", "Immunoblot", "showing", "hMENA", "/", "hMENAΔv6", "expression", "(", "detected", "by", "Pan", "-", "hMENA", "mAb", "and", "by", "the", "specific", "anti", "-", "hMENAΔv6", "antibody", ")", "of", "the", "CAFs", "employed", "is", "reported", "(", "top", ")", ".", "TUBULIN", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "P", "values", "were", "calculated", "by", "two", "‐", "sided", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "B", ".", "Quantification", "of", "in", "vitro", "matrigel", "invasion", "assay", "(", "bottom", ")", "of", "P", "-", "NF", "and", "L", "-", "NF", "and", "P", "-", "CAF", "#", "110", "and", "L", "-", "CAF", "#", "400", "transfected", "with", "control", "or", "hMENA", "∆", "v6", "expressing", "vectors", ",", "demonstrating", "that", "the", "overexpression", "of", "hMENA", "∆", "v6", "isoform", "induced", "the", "invasiveness", "of", "P", "-", "NFs", "and", "L", "-", "NFs", "and", "/", "or", "P", "-", "and", "L", "-", "CAFs", ".", "Number", "of", "invading", "cells", "was", "measured", "by", "counting", "6", "random", "fields", ".", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", "of", "two", "biological", "replicates", ",", "performed", "in", "triplicates", "each", ".", "Immunoblot", "of", "hMENAΔv6", "expression", "(", "detected", "by", "the", "specific", "anti", "-", "hMENAΔv6", "antibody", ")", "in", "fibroblasts", "employed", "is", "reported", "(", "top", ")", ".", "TUBULIN", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "P", "values", "were", "calculated", "by", "two", "‐", "sided", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. Quantification of in vitro matrigel invasion assay (bottom) of P-CAF and L-CAF (P-CAF # 36, 138 and L-CAF #189, 484) transfected with control siRNA (CNT) or hMENA siRNA (hMENA(t)) indicating that the siRNA‐mediated knock‐down of hMENA/hMENA∆v6 reduces the invasive ability of CAFs with respect to siCNT CAFs. Number of invading cells was measured by counting 6 random fields. Data are presented as the mean ± SD of two biological replicates, performed in triplicates each. Immunoblot showing hMENA/hMENAΔv6 expression (detected by Pan-hMENA mAb and by the specific anti-hMENAΔv6 antibody) of the CAFs employed is reported (top). TUBULIN was used as loading control. P values were calculated by two‐sided Student's t‐test. *P<0.05, ***P<0.001.B. Quantification of in vitro matrigel invasion assay (bottom) of P-NF and L-NF and P-CAF#110 and L-CAF#400 transfected with control or hMENA∆v6 expressing vectors, demonstrating that the overexpression of hMENA∆v6 isoform induced the invasiveness of P-NFs and L-NFs and/or P-and L-CAFs. Number of invading cells was measured by counting 6 random fields. Data are presented as the mean ± SD of two biological replicates, performed in triplicates each. Immunoblot of hMENAΔv6 expression (detected by the specific anti-hMENAΔv6 antibody) in fibroblasts employed is reported (top). TUBULIN was used as loading control. P values were calculated by two‐sided Student's t‐test. *P<0.05, ***P<0.001."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "Quantification", "of", "in", "vitro", "matrigel", "invasion", "assay", "of", "PANC", "-", "1", "cells", "cultured", "for", "48", " ", "h", "with", "conditioned", "media", "(", "CM", ")", "of", "NFs", "(", "P", "-", "NFs", "-", "CM", ")", ",", "CAF", "low", "#", "44", "and", "#", "110", "and", "CAFs", "high", "#", "36", "and", "138", ".", "Histograms", "show", "the", "number", "of", "invading", "cells", "measured", "by", "counting", "6", "random", "fields", ".", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", ",", "performed", "at", "least", "in", "duplicate", "each", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "with", "one", "-", "way", "ANOVA", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "B", ".", "Quantification", "of", "in", "vitro", "matrigel", "invasion", "assay", "of", "PANC", "-", "1", "cultured", "for", "48", " ", "h", "with", "CM", "derived", "from", "control", "P", "-", "CAFs", "#", "36", "(", "siCNT", "-", "P", "-", "CAF", "-", "CM", "#", "36", ")", "and", "hMENA", "/", "hMENA", "∆", "v6", "silenced", "P", "-", "CAFs", "(", "sihMENA", "(", "t", ")", "-", "P", "-", "CAF", "-", "CM", "#", "36", ")", ",", "showing", "that", "the", "siRNA", "‐", "mediated", "knock", "‐", "down", "of", "hMENA", "/", "hMENA", "∆", "v6", "affects", "PANC", "-", "1", "invasive", "ability", "mediated", "by", "CAF", "-", "CM", ".", "Culture", "medium", "(", "DMEM", ")", "was", "used", "as", "control", ".", "Cells", "invading", "matrigel", "were", "counted", "in", "6", "random", "fields", ".", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "with", "one", "-", "way", "ANOVA", "P", "=", "0", ".", "006", ",", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "C", ".", "Quantification", "of", "in", "vitro", "matrigel", "invasion", "assay", "of", "H1975", "cells", "cultured", "for", "48", " ", "h", "with", "control", "media", "(", "culture", "medium", ")", "or", "conditioned", "media", "(", "CM", ")", "of", "L", "-", "CAF", "low", "#", "400", "and", "CAFs", "high", "#", "189", ",", "as", "described", "above", ".", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", "of", "two", "biological", "replicates", ",", "performed", "in", "triplicates", "each", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "with", "one", "-", "way", "ANOVA", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "D", ".", "Quantification", "of", "in", "vitro", "matrigel", "invasion", "assay", "of", "H1975", "cultured", "for", "48", " ", "h", "with", "CM", "derived", "from", "control", "L", "-", "CAFs", "#", "484", "(", "siCNT", "-", "L", "-", "CAF", "-", "CM", "#", "484", ")", "and", "hMENA", "/", "hMENA", "∆", "v6", "silenced", "L", "-", "CAFs", "(", "sihMENA", "(", "t", ")", "-", "L", "-", "CAF", "-", "CM", "#", "484", ")", ",", "showing", "that", "the", "siRNA", "‐", "mediated", "knock", "‐", "down", "of", "hMENA", "/", "hMENA", "∆", "v6", "affects", "H1975", "invasive", "ability", "mediated", "by", "CAF", "-", "CM", ".", "Culture", "medium", "(", "DMEM", ")", "was", "used", "as", "control", ".", "Cells", "invading", "matrigel", "were", "counted", "in", "6", "random", "fields", ".", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", "of", "six", "replicates", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "with", "one", "-", "way", "ANOVA", "P", "=", "0", ".", "006", ",", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "E", ".", "Representative", "immunoblot", "(", "top", ")", "and", "densitometry", "quantification", "(", "bottom", ")", "of", "hMENA", "∆", "v6", "expression", "level", "in", "P", "-", "NFs", "grown", "in", "RPMI", "control", "medium", "(", "-", ")", "or", "PANC", "-", "1", "-", "CM", "for", "24", " ", "h", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "are", "represented", "as", "fold", "increase", "with", "respect", "to", "control", "medium", "±", "SD", "(", "set", "as", "1", ")", ".", "Data", "were", "analyzed", "using", "two", "‐", "sided", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ".", "F", ".", "Representative", "images", "(", "top", ")", "and", "quantification", "(", "bottom", ")", "of", "collagen", "gel", "-", "contraction", "ability", "of", "CAFs", "(", "monoculture", ")", "or", "CAFs", "co", "-", "cultured", "with", "siCNT", "(", "co", "-", "siCNT", ")", "or", "sihMENA", "(", "t", ")", "PANC", "-", "1", "cells", "(", "co", "-", "sihMENA", "(", "t", ")", ")", ".", "Dashed", "white", "circles", "illustrate", "the", "margins", "of", "the", "gel", "area", ".", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", "of", "two", "biological", "replicates", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "with", "one", "-", "way", "ANOVA", "P", "=", "0", ".", "005", ",", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", "ANOVA", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "G", ".", "Representative", "immunoblot", "(", "top", ")", "and", "quantification", "(", "bottom", ")", "of", "hMENA", "∆", "v6", "and", "α", "-", "SMA", "expression", "in", "P", "-", "CAFs", "#", "110", "treated", "with", "DMEM", "medium", "(", "-", ")", "or", "with", "conditioned", "medium", "(", "CM", ")", "derived", "from", "siCNT", "(", "siCNT", "PANC", "-", "1", ")", "or", "sihMENA", "(", "t", ")", "PANC", "-", "1", "cells", "(", "(", "sihMENA", "(", "t", ")", "PANC", "-", "1", ")", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "are", "represented", "as", "fold", "increase", "with", "respect", "to", "DMEM", "(", "set", "as", "1", "±", "SD", ")", ".", "Data", "presented", "were", "analyzed", "using", "two", "‐", "sided", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. Quantification of in vitro matrigel invasion assay of PANC-1 cells cultured for 48 h with conditioned media (CM) of NFs (P-NFs-CM), CAF low #44 and #110 and CAFs high #36 and 138. Histograms show the number of invading cells measured by counting 6 random fields. Data are presented as the mean ± SD of three biological replicates, performed at least in duplicate each. Statistical analysis was performed with one-way ANOVA P<0.0001, followed by Bonferroni's multiple comparison test. * P <0.05, **P<0.01, ***P<0.001.B. Quantification of in vitro matrigel invasion assay of PANC-1 cultured for 48 h with CM derived from control P-CAFs#36 (siCNT-P-CAF-CM#36) and hMENA/hMENA∆v6 silenced P-CAFs (sihMENA(t)-P-CAF-CM#36), showing that the siRNA‐mediated knock‐down of hMENA/hMENA∆v6 affects PANC-1 invasive ability mediated by CAF-CM. Culture medium (DMEM) was used as control. Cells invading matrigel were counted in 6 random fields. Data are presented as the mean ± SD of three biological replicates. Statistical analysis was performed with one-way ANOVA P=0.006, followed by Bonferroni's multiple comparison test. *P < 0.05, **P<0.01.C. Quantification of in vitro matrigel invasion assay of H1975 cells cultured for 48 h with control media (culture medium) or conditioned media (CM) of L-CAF low #400 and CAFs high #189, as described above. Data are presented as the mean ± SD of two biological replicates, performed in triplicates each. Statistical analysis was performed with one-way ANOVA P<0.0001, followed by Bonferroni's multiple comparison test. ***P<0.001.D. Quantification of in vitro matrigel invasion assay of H1975 cultured for 48 h with CM derived from control L-CAFs#484 (siCNT-L-CAF-CM#484) and hMENA/hMENA∆v6 silenced L-CAFs (sihMENA(t)-L-CAF-CM#484), showing that the siRNA‐mediated knock‐down of hMENA/hMENA∆v6 affects H1975 invasive ability mediated by CAF-CM. Culture medium (DMEM) was used as control. Cells invading matrigel were counted in 6 random fields. Data are presented as the mean ± SD of six replicates. Statistical analysis was performed with one-way ANOVA P=0.006, followed by Bonferroni's multiple comparison test. *P < 0.05, **P<0.01.E. Representative immunoblot (top) and densitometry quantification (bottom) of hMENA∆v6 expression level in P-NFs grown in RPMI control medium (-) or PANC-1-CM for 24 h (n = 3). Data are represented as fold increase with respect to control medium ± SD (set as 1). Data were analyzed using two‐sided Student's t‐test. *P < 0.05.F. Representative images (top) and quantification (bottom) of collagen gel-contraction ability of CAFs (monoculture) or CAFs co-cultured with siCNT (co-siCNT) or sihMENA(t) PANC-1 cells (co-sihMENA(t)). Dashed white circles illustrate the margins of the gel area. Data are presented as the mean ± SD of two biological replicates. Statistical analysis was performed with one-way ANOVA P=0.005, followed by Bonferroni's multiple comparison test ANOVA: *P<0.05, **P<0.01.G. Representative immunoblot (top) and quantification (bottom) of hMENA∆v6 and α-SMA expression in P-CAFs #110 treated with DMEM medium (-) or with conditioned medium (CM) derived from siCNT (siCNT PANC-1) or sihMENA(t) PANC-1 cells ((sihMENA(t) PANC-1) (n = 3). Data are represented as fold increase with respect to DMEM (set as 1± SD). Data presented were analyzed using two‐sided Student's t‐test: *P<0.05."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "Heat", "map", "of", "proteins", "identified", "by", "LC", "-", "MS", "/", "MS", "analysis", "as", "differentially", "secreted", "in", "CM", "of", "normal", "fibroblasts", "(", "P", "-", "NF", "#", "1", "and", "P", "-", "NF", "#", "2", ")", ",", "CAFs", "with", "low", "level", "of", "hMENA", "∆", "v6", "expression", "(", "P", "-", "CAFs", "low", "#", "44", "and", "#", "49", ")", ",", "CAFs", "with", "high", "level", "of", "hMENA", "∆", "v6", "expression", "(", "P", "-", "CAFs", "high", "#", "67", "and", "#", "36", ")", ".", "The", "boxed", "hMENA", "∆", "v6", "associated", "signature", "represents", "proteins", "exclusively", "present", "in", "the", "CM", "derived", "from", "CAFs", "high", ".", "Color", "code", "is", "shown", "in", "the", "upper", "left", "corner", ".", "Co", "-", "variance", "=", "0", ".", "2", ",", "q", "value", "=", "0", ".", "1", "(", "10", "%", "false", "discovery", "rate", ")", ",", "adjusted", "P", "value", "=", "0", ".", "0074542", ".", "N", "=", "36", ".", "The", "values", "of", "mass", "spec", "identified", "for", "each", "protein", "were", "plotted", "in", "log2", "scale", ".", "B", ".", "Quantification", "of", "GAS6", "secretion", "levels", ",", "as", "detected", "by", "ELISA", ",", "in", "the", "CM", "of", "P", "-", "NF", "(", "#", "1", ")", ",", "P", "-", "CAFlow", "(", "#", "44", "and", "#", "49", ")", "and", "P", "-", "CAF", "high", "(", "#", "67", "and", "#", "36", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", "of", "two", "biological", "replicates", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "with", "one", "-", "way", "ANOVA", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "C", ".", "Real", "time", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "the", "relative", "GAS6", "mRNA", "expression", "level", "in", "NFs", "(", "P", "-", "NF", "#", "1", ")", ",", "P", "-", "CAF", "low", "and", "P", "-", "CAF", "high", ",", "as", "described", "above", ".", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "replicates", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "with", "one", "-", "way", "ANOVA", "P", "=", "0", ".", "001", ",", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "D", ".", "Real", "time", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "the", "relative", "GAS6", "mRNA", "expression", "level", "in", "PANC", "-", "1", "and", "P", "-", "CAF", "(", "n", "=", "3", ")", ",", "showing", "a", "low", "GAS6", "expression", "in", "PANC", "-", "1", "cells", ".", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", ".", "P", "values", "were", "calculated", "by", "two", "‐", "sided", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "E", ".", "Boxplots", "showing", "the", "mRNA", "expression", "of", "GAS6", "in", "normal", "lung", "fibroblasts", "(", "white", ")", "(", "n", "=", "15", ")", "versus", "primary", "NSCLC", "fibroblasts", "(", "light", "blue", ")", "(", "n", "=", "15", ")", "(", "GSE22862", "data", "set", ")", ".", "In", "each", "boxplot", "the", "median", "value", "(", "horizontal", "line", ")", ",", "25th", "-", "75th", "percentiles", "(", "box", "outline", ")", ",", "and", "highest", "and", "lowest", "values", "within", "1", ".", "5x", "of", "the", "inter", "-", "quartile", "range", "(", "vertical", "line", ")", "are", "shown", ".", "Statistical", "significance", "was", "calculated", "by", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", "(", "two", "-", "sided", ")", "(", "P", "=", "0", ".", "0208", ")", ".", "F", ",", "G", ".", "Real", "time", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "P", "#", "138", "CAF", "(", "F", ")", "and", "L", "#", "189", "CAF", "(", "G", ")", "transfected", "with", "control", "siRNA", "(", "siCNT", ")", "or", "hMENA", "(", "t", ")", "siRNA", "(", "sihMENA", "(", "t", ")", ")", "as", "representative", "cases", ".", "The", "siRNA", "‐", "mediated", "knock", "‐", "down", "of", "hMENA", "/", "hMENA", "∆", "v6", "resulted", "in", "a", "significant", "reduction", "of", "GAS6", "mRNA", "expression", "levels", "compared", "to", "siCNT", "cells", "(", "set", "as", "100", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "replicates", ".", "P", "values", "were", "calculated", "by", "two", "‐", "sided", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "H", ".", "Quantification", "of", "matrigel", "invasion", "assay", "of", "PANC", "-", "1", "cultured", "for", "48", "h", "with", "DMEM", "(", "culture", "medium", ")", ",", "or", "conditioned", "medium", "(", "CM", ")", "derived", "from", "control", "siRNA", "P", "#", "106", "CAFs", "(", "siCNT", "P", "-", "CAF", "-", "CM", ")", ",", "GAS6", "siRNA", "(", "siGAS6", "P", "-", "CAF", "-", "CM", ")", ",", "hMENA", "(", "t", ")", "siRNA", "(", "sihMENA", "(", "t", ")", "P", "-", "CAF", "-", "CM", ")", ",", "hMENA", "(", "t", ")", "siRNA", "plus", "rGAS6", "(", "sihMENA", "(", "t", ")", "P", "-", "CAF", "-", "CM", "+", "rGAS6", ")", ".", "Number", "of", "invaded", "PANC", "-", "1", "cells", "after", "48", "h", "of", "treatment", "was", "measured", "by", "counting", "6", "random", "fields", ".", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "with", "one", "-", "way", "ANOVA", "P", "=", "0", ".", "004", ",", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. Heat map of proteins identified by LC-MS/MS analysis as differentially secreted in CM of normal fibroblasts (P-NF#1 and P-NF#2), CAFs with low level of hMENA∆v6 expression (P-CAFs low#44 and #49), CAFs with high level of hMENA∆v6 expression (P-CAFs high #67 and #36). The boxed hMENA∆v6 associated signature represents proteins exclusively present in the CM derived from CAFs high. Color code is shown in the upper left corner. Co-variance = 0.2, q value = 0.1 (10% false discovery rate), adjusted P value = 0.0074542. N = 36. The values of mass spec identified for each protein were plotted in log2 scale.B. Quantification of GAS6 secretion levels, as detected by ELISA, in the CM of P-NF (#1), P-CAFlow (#44 and #49) and P-CAF high (#67 and #36). Data are presented as the mean ± SD of two biological replicates. Statistical analysis was performed with one-way ANOVA P<0.0001, followed by Bonferroni's multiple comparison test. ***P<0.001.C. Real time qRT-PCR analysis of the relative GAS6 mRNA expression level in NFs (P-NF#1), P-CAF low and P-CAF high, as described above. Data are presented as the mean ± SD of three replicates. Statistical analysis was performed with one-way ANOVA P=0.001, followed by Bonferroni's multiple comparison test. *P< 0.05, **P<0.01.D. Real time qRT-PCR analysis of the relative GAS6 mRNA expression level in PANC-1 and P-CAF (n=3), showing a low GAS6 expression in PANC-1 cells. Data are presented as the mean ± SD. P values were calculated by two‐sided Student's t‐test. ***P<0.001.E. Boxplots showing the mRNA expression of GAS6 in normal lung fibroblasts (white) (n=15) versus primary NSCLC fibroblasts (light blue) (n=15) (GSE22862 data set). In each boxplot the median value (horizontal line), 25th-75th percentiles (box outline), and highest and lowest values within 1.5x of the inter-quartile range (vertical line) are shown. Statistical significance was calculated by Mann-Whitney U-test (two-sided) (P=0.0208).F, G. Real time qRT-PCR analysis of P#138 CAF (F) and L#189 CAF (G) transfected with control siRNA (siCNT) or hMENA(t) siRNA (sihMENA(t)) as representative cases. The siRNA‐mediated knock‐down of hMENA/hMENA∆v6 resulted in a significant reduction of GAS6 mRNA expression levels compared to siCNT cells (set as 100). Data are presented as the mean ± SD of three replicates. P values were calculated by two‐sided Student's t‐test **P<0.01, ***P<0.001.H. Quantification of matrigel invasion assay of PANC-1 cultured for 48 h with DMEM (culture medium), or conditioned medium (CM) derived from control siRNA P#106 CAFs (siCNT P-CAF-CM), GAS6 siRNA (siGAS6 P-CAF-CM), hMENA(t) siRNA (sihMENA(t) P-CAF-CM), hMENA(t) siRNA plus rGAS6 (sihMENA(t) P-CAF-CM +rGAS6). Number of invaded PANC-1 cells after 48 h of treatment was measured by counting 6 random fields. Data are presented as the mean ± SD of three biological replicates. Statistical analysis was performed with one-way ANOVA P=0.004, followed by Bonferroni's multiple comparison test. *P< 0.05, **P<0.01."}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "Immunoblot", "of", "AXL", "expression", "in", "PANC", "-", "1", "and", "A549", "cancer", "cells", "upon", "transfection", "of", "control", "siRNA", "(", "CNT", ")", "or", "hMENA", "(", "t", ")", "siRNA", "(", "sihMENA", "(", "t", ")", ")", ",", "indicating", "that", "the", "knock", "‐", "down", "of", "hMENA", "isoforms", ",", "resulted", "in", "a", "reduction", "of", "AXL", "protein", "expression", ".", "B", ".", "Real", "time", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "the", "relative", "AXL", "mRNA", "expression", "in", "PANC", "-", "1", "and", "A549", "cancer", "cells", "transfected", "with", "control", "siRNA", "(", "siCNT", ")", "or", "hMENA", "(", "t", ")", "siRNA", "(", "sihMENA", "(", "t", ")", ")", ",", "indicating", "that", "the", "knock", "‐", "down", "of", "hMENA", "isoforms", ",", "resulted", "in", "a", "significant", "reduction", "of", "mRNA", "AXL", "expression", ".", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "replicates", ".", "P", "values", "were", "calculated", "by", "two", "‐", "sided", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "C", ".", "Real", "time", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "the", "relative", "levels", "of", "mature", "AXL", "mRNA", "or", "AXL", "pre", "-", "mRNA", "in", "PANC", "-", "1", "(", "left", ")", "and", "A549", "(", "right", ")", "cell", "lines", ",", "transfected", "with", "control", "siRNA", "(", "siCNT", ")", "or", "hMENA", "(", "t", ")", "siRNA", ",", "sihMENA", "(", "t", ")", ".", "Data", "represent", "percent", "of", "AXL", "mRNA", "or", "pre", "-", "mRNA", "levels", "in", "hMENA", "(", "t", ")", "silenced", "cells", "relative", "to", "siCNT", "control", "cells", "(", "set", "at", "100", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", "of", "two", "biological", "replicates", ".", "P", "values", "were", "calculated", "by", "two", "‐", "sided", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "D", ".", "Immunoblot", "analysis", "with", "the", "indicated", "antibodies", "of", "PANC", "-", "1", "cells", "transfected", "with", "control", "siRNA", "(", "CNT", ")", "or", "hMENA", "(", "t", ")", "siRNA", ",", "showing", "that", "the", "knock", "‐", "down", "of", "total", "hMENA", "isoforms", ",", "(", "hMENA", "(", "t", ")", ")", "inhibits", "GAS6", "-", "mediated", "pAXL", "and", "pAKT", "expression", ".", "Cells", "were", "serum", "starved", "overnight", "and", "subsequently", "stimulated", "with", "DMSO", "(", "0", ".", "02", "%", ")", "in", "control", "culture", "medium", "(", "-", ")", "or", "rGAS6", "(", "200", "ng", "/", "mL", ")", ",", "for", "30", "and", "60", "min", ".", "The", "fold", "change", "of", "pAXL", "or", "pAKT", "expression", "respect", "to", "siCNT", "untreated", "cells", "is", "reported", ".", "E", ".", "Quantification", "of", "in", "vitro", "matrigel", "invasion", "assay", "of", "PANC", "-", "1", "siCNT", "cells", "(", "siCNT", ")", "and", "hMENA", "/", "hMENA", "∆", "v6", "silenced", "cells", "(", "sihMENA", "(", "t", ")", ")", "toward", "rGAS6", "as", "chemo", "-", "attractant", "(", "siCNT", "+", "rGAS6", "and", "sihMENA", "(", "t", ")", "+", "rGAS6", ")", ",", "showing", "that", "the", "knock", "‐", "down", "of", "hMENA", "(", "t", ")", "reduced", "cancer", "cell", "invasion", "toward", "GAS6", ".", "The", "number", "of", "invading", "cells", "were", "counted", "in", "6", "random", "fields", ".", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "with", "one", "-", "way", "ANOVA", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "F", ".", "Quantification", "of", "in", "vitro", "matrigel", "invasion", "assay", "of", "PANC", "-", "1", "siCNT", "cells", "(", "siCNT", ")", "and", "hMENA", "/", "hMENA", "∆", "v6", "silenced", "cells", "(", "sihMENA", "(", "t", ")", ")", ",", "untreated", "(", "-", ")", "or", "treated", "with", "conditioned", "media", "derived", "from", "CAFs", "(", "P", "-", "CAF", "#", "36", "-", "CM", ")", "for", "48", "h", ".", "The", "number", "of", "invaded", "cells", "were", "counted", "in", "6", "random", "fields", ".", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "with", "one", "-", "way", "ANOVA", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A. Immunoblot of AXL expression in PANC-1 and A549 cancer cells upon transfection of control siRNA (CNT) or hMENA(t) siRNA (sihMENA(t)), indicating that the knock‐down of hMENA isoforms, resulted in a reduction of AXL protein expression.B. Real time qRT-PCR analysis of the relative AXL mRNA expression in PANC-1 and A549 cancer cells transfected with control siRNA (siCNT) or hMENA(t) siRNA (sihMENA(t)), indicating that the knock‐down of hMENA isoforms, resulted in a significant reduction of mRNA AXL expression. Data are presented as the mean ± SD of three replicates. P values were calculated by two‐sided Student's t‐test. **P<0.01, ***P<0.001.C. Real time qRT-PCR analysis of the relative levels of mature AXL mRNA or AXL pre-mRNA in PANC-1 (left) and A549 (right) cell lines, transfected with control siRNA (siCNT) or hMENA(t) siRNA, sihMENA(t). Data represent percent of AXL mRNA or pre-mRNA levels in hMENA(t) silenced cells relative to siCNT control cells (set at 100). Data are presented as the mean ± SD of two biological replicates. P values were calculated by two‐sided Student's t‐test. *P< 0.05, ***P<0.001.D. Immunoblot analysis with the indicated antibodies of PANC-1 cells transfected with control siRNA (CNT) or hMENA(t) siRNA, showing that the knock‐down of total hMENA isoforms, (hMENA(t)) inhibits GAS6-mediated pAXL and pAKT expression. Cells were serum starved overnight and subsequently stimulated with DMSO (0.02%) in control culture medium (-) or rGAS6 (200 ng/mL), for 30 and 60 min. The fold change of pAXL or pAKT expression respect to siCNT untreated cells is reported.E. Quantification of in vitro matrigel invasion assay of PANC-1 siCNT cells (siCNT) and hMENA/hMENA∆v6 silenced cells (sihMENA(t)) toward rGAS6 as chemo-attractant (siCNT + rGAS6 and sihMENA(t) + rGAS6), showing that the knock‐down of hMENA(t) reduced cancer cell invasion toward GAS6. The number of invading cells were counted in 6 random fields. Data are presented as the mean ± SD of three biological replicates. Statistical analysis was performed with one-way ANOVA P<0.0001, followed by Bonferroni's multiple comparison test. **P<0.01.F. Quantification of in vitro matrigel invasion assay of PANC-1 siCNT cells (siCNT) and hMENA/hMENA∆v6 silenced cells (sihMENA(t)), untreated (-) or treated with conditioned media derived from CAFs (P-CAF#36-CM) for 48 h. The number of invaded cells were counted in 6 random fields. Data are presented as the mean ± SD of three biological replicates. Statistical analysis was performed with one-way ANOVA P<0.0001, followed by Bonferroni's multiple comparison test. *** P< 0.001."}
{"words": ["Figure", "7A", ".", "Overall", "survival", "(", "OS", ")", "curves", "in", "Pancreatic", "Adenocarcinoma", "patients", "(", "PDAC", ")", "(", "n", "=", "172", ")", "from", "The", "Cancer", "Genome", "Atlas", "(", "TCGA", ")", ",", "showed", "that", "combined", "expression", "of", "AXL", ",", "GAS6", "and", "ENAH", "(", "hMENA", ")", ",", "is", "a", "prognostic", "signature", "in", "PDAC", ".", "B", ".", "Overall", "survival", "(", "OS", ")", "curves", "in", "Lung", "Squamous", "cancer", "patients", "(", "LUSC", ")", "(", "n", "=", "501", ")", "from", "The", "Cancer", "Genome", "Atlas", "(", "TCGA", ")", ",", "showed", "that", "combined", "expression", "of", "AXL", ",", "GAS6", "and", "ENAH", "(", "hMENA", ")", ",", "is", "a", "prognostic", "signature", "in", "LUSC", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A. Overall survival (OS) curves in Pancreatic Adenocarcinoma patients (PDAC) (n=172) from The Cancer Genome Atlas (TCGA), showed that combined expression of AXL, GAS6 and ENAH (hMENA), is a prognostic signature in PDAC.B. Overall survival (OS) curves in Lung Squamous cancer patients (LUSC) (n=501) from The Cancer Genome Atlas (TCGA), showed that combined expression of AXL, GAS6 and ENAH (hMENA), is a prognostic signature in LUSC."}
{"words": ["Figure", "6Micrographs", "of", "maximum", "intensity", "projections", "of", "forebrain", "sections", "from", "3", "mo", "old", "GLASTCreERT2", "/", "eGFP", "mice", "21", "days", "after", "tamoxifen", "treatment", "Double", "-", "positive", "cells", "are", "indicated", "by", "arrowheads", ".", "CTX", ":", "cerebral", "cortex", ";", "DIE", ":", "diencephalon", ";", "HC", ":", "hippocampus", ".", "Scale", "bars", ":", "300", "µm", "(", "A", ")", ",", "20", "µm", "(", "B", ")", ",", "75", "µm", "(", "C", ")", ",", "30", "µm", "(", "D", ")", ",", "Histograms", "showing", "quantifications", "(", "B", ",", "n", "=", "6", "animals", ";", "5", "region", "of", "interest", "(", "ROI", ")", "covering", "the", "diencephalon", "on", "a", "total", "of", "3", "slides", "analyzed", "per", "animal", "Data", "information", ":", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "Each", "data", "point", "represents", "one", "animal", ".", "Micrographs", "of", "maximum", "intensity", "projections", "of", "forebrain", "sections", "from", "3", "mo", "old", "C57BL", "/", "6J", "mice", "after", "EdU", "application", "for", "4", "weeks", "in", "drinking", "water", "(", "F", ")", "immunostained", "as", "indicated", "on", "top", "of", "the", "panels", ".", "Double", "-", "positive", "cells", "are", "indicated", "by", "arrowheads", ".", "CTX", ":", "cerebral", "cortex", ";", "DIE", ":", "diencephalon", ";", "HC", ":", "hippocampus", ".", "Scale", "bars", ":", "10", "µm", "(", "F", ")", ".", "G", ")", "Histograms", "showing", "quantifications", "for", "n", "=", "5", "animals", ";", "5", "ROI", "covering", "the", "diencephalon", "on", "a", "total", "of", "2", "slides", "analyzed", "per", "animal", ")", ".", "Data", "information", ":", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "Each", "data", "point", "represents", "one", "animal", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Micrographs of maximum intensity projections of forebrain sections from 3 mo old GLASTCreERT2/eGFP mice 21 days after tamoxifen treatment Double-positive cells are indicated by arrowheads. CTX: cerebral cortex; DIE: diencephalon; HC: hippocampus. Scale bars: 300 µm (A), 20 µm (B), 75 µm (C), 30 µm (D), Histograms showing quantifications (B, n = 6 animals; 5 region of interest (ROI) covering the diencephalon on a total of 3 slides analyzed per animal Data information: data are presented as mean ± SEM. Each data point represents one animal.Micrographs of maximum intensity projections of forebrain sections from 3 mo old C57BL/6J mice after EdU application for 4 weeks in drinking water (F) immunostained as indicated on top of the panels. Double-positive cells are indicated by arrowheads. CTX: cerebral cortex; DIE: diencephalon; HC: hippocampus. Scale bars: 10 µm (F).G) Histograms showing quantifications for n = 5 animals; 5 ROI covering the diencephalon on a total of 2 slides analyzed per animal). Data information: data are presented as mean ± SEM. Each data point represents one animal."}
{"words": ["Figure", "7A", "-", "E", "Micrographs", "of", "maximum", "intensity", "projections", "(", "A", "-", "D", ")", "or", "single", "optical", "section", "(", "E", ")", "of", "forebrain", "sections", "stained", "as", "indicated", "for", "fluorescent", "proteins", "in", "astrocytes", "labelled", "in", "8", "mo", "(", "A", ",", "B", ",", "E", ")", "and", "3", "mo", "(", "C", ",", "D", ")", "GLASTCreERT2", "/", "Confetti", "mice", "at", "21", "dpt", ".", "Note", "that", "clusters", "of", "duplets", "(", "D", ")", "and", "triplets", "(", "C", ")", "labelled", "in", "the", "same", "color", "can", "be", "found", "only", "in", "the", "DIE", ".", "Also", "note", "that", "astrocyte", "somata", "are", "often", "very", "close", "together", ",", "as", "also", "observed", "after", "live", "in", "vivo", "imaging", "of", "dividing", "astrocytes", "Somata", "of", "single", "cells", "are", "highlighted", "in", "circles", ".", "Data", "information", ":", "CTX", ":", "cerebral", "cortex", ";", "DIE", ":", "diencephalon", ";", "HC", ":", "hippocampus", ".", "Scale", "bars", ":", "300", "µm", "(", "A", ")", ",", "100", "µm", "(", "B", ")", ",", "50", "µm", "(", "C", ",", "D", ")", ",", "20", "µm", "(", "E", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A-E Micrographs of maximum intensity projections (A - D) or single optical section (E) of forebrain sections stained as indicated for fluorescent proteins in astrocytes labelled in 8 mo (A, B, E) and 3 mo (C, D) GLASTCreERT2/Confetti mice at 21 dpt. Note that clusters of duplets (D) and triplets (C) labelled in the same color can be found only in the DIE. Also note that astrocyte somata are often very close together, as also observed after live in vivo imaging of dividing astrocytes Somata of single cells are highlighted in circles. Data information: CTX: cerebral cortex; DIE: diencephalon; HC: hippocampus. Scale bars: 300 µm (A), 100 µm (B), 50 µm (C, D), 20 µm (E)."}
{"words": ["Figure", "8B", "Micrographs", "of", "forebrain", "sections", "of", "3", "mo", "old", "GLASTCreERT2", "/", "RPL22HA", "/", "eGFP", "21", "dpt", "mice", "stained", "for", "HA", "show", "maximum", "intensity", "projections", "of", "HA", "+", "expressing", "cells", "with", "astroglial", "morphology", ".", "CTX", "GM", ":", "cerebral", "cortex", "grey", "matter", ";", "DIE", ":", "diencephalon", ".", "Scale", "bars", ":", "100", "µm", ".", "C", "Micrographs", "of", "forebrain", "sections", "of", "3", "mo", "old", "GLASTCreERT2", "/", "RPL22HA", "/", "eGFP", "mice", "21dpt", "stained", "for", "HA", "and", "S100β", "showing", "the", "specificity", "of", "the", "mouse", "line", "with", "HA", "detected", "only", "in", "S100β", "+", "astrocytes", ".", "DIE", ":", "diencephalon", ".", "Scale", "bar", ":", "70", "μm", ".", "Data", "information", ":", "CTX", "GM", ":", "cerebral", "cortex", "grey", "matter", ";", "DIE", ":", "diencephalon", ";", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ",", "tissue", "from", "3", "mice", "was", "pooledD", "Histogram", "showing", "expression", "levels", "of", "the", "top", "10", "astrocyte", "specific", "markers", "genes", "in", "DIE", "(", "blue", "bars", ")", "and", "CTX", "GM", "(", "red", "bars", ")", "samples", ".", "Data", "information", ":", "CTX", "GM", ":", "cerebral", "cortex", "grey", "matter", ";", "DIE", ":", "diencephalon", ";", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ",", "tissue", "from", "3", "mice", "was"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8B Micrographs of forebrain sections of 3 mo old GLASTCreERT2/RPL22HA/eGFP 21 dpt mice stained for HA show maximum intensity projections of HA+ expressing cells with astroglial morphology. CTX GM: cerebral cortex grey matter; DIE: diencephalon. Scale bars: 100 µm. C Micrographs of forebrain sections of 3 mo old GLASTCreERT2/RPL22HA/eGFP mice 21dpt stained for HA and S100β showing the specificity of the mouse line with HA detected only in S100β+ astrocytes. DIE: diencephalon. Scale bar: 70 μm. Data information: CTX GM: cerebral cortex grey matter; DIE: diencephalon; n=3 biological replicates, tissue from 3 mice was pooledD Histogram showing expression levels of the top 10 astrocyte specific markers genes in DIE (blue bars) and CTX GM (red bars) samples. Data information: CTX GM: cerebral cortex grey matter; DIE: diencephalon; n=3 biological replicates, tissue from 3 mice was pooled"}
{"words": ["Figure", "9C", "Example", "of", "a", "Smad4", "/", "GFP", "double", "-", "positive", "astrocyte", "(", "indicated", "by", "arrowhead", ")", "in", "a", "single", "optical", "section", "of", "DIE", "from", "3", "mo", "old", "GLASTCreERT2", "/", "eGFP", "mice", "21", "dpt", "immunostained", "as", "indicated", "on", "top", "of", "the", "panel", ".", "Orthogonal", "projections", "of", "the", "area", "highlighted", "in", "left", "panel", "of", "C", "shown", "at", "higher", "magnification", "in", "the", "right", "panel", ".", "Scale", "bar", ":", "15", "µm", ".", "D", "Example", "of", "a", "proliferating", "(", "PCNA", "+", ",", "arrowhead", ")", "astrocyte", "in", "a", "single", "optical", "section", "of", "DIE", "from", "3", "mo", "old", "GLASTCreERT2", "/", "eGFP", "mice", "21", "dpt", "immunostained", "as", "indicated", "on", "top", "with", "single", "channels", "shown", "in", "middle", "and", "right", "panels", ".", "Scale", "bars", ":", "15", "µm", ".", "E", "Histogram", "depicting", "percentage", "of", "PCNA", "positive", "cells", "of", "all", "GFP", "positive", "cells", "in", "the", "DIE", "of", "the", "genotype", "indicated", "on", "the", "x", "-", "axis", "(", "n", "=", "6", "animals", "per", "genotype", ";", "5", "ROI", "covering", "the", "diencephalon", "on", "a", "total", "of", "3", "slides", "were", "analyzed", "per", "animal", ";", "PCNA", "negative", "and", "positive", "cells", "comparing", "wt", "/", "wt", "vs", ".", "fl", "/", "fl", "animals", ",", "adjusted", "P", "-", "value", "=", "0", ".", "002", ")", ".", "Data", "information", ":", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "Each", "dot", "represents", "one", "n", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "nonparametric", "2way", "ANOVA", "followed", "by", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparisons", "testF", ",", "G", "Histograms", "depicting", "percentage", "of", "the", "neurosphere", "-", "generating", "cells", "obtained", "from", "the", "DIE", "(", "F", ")", "or", "SEZ", "(", "G", ")", "of", "GLASTCreERT2", "/", "Smad4fl", "/", "fl", "/", "eGFP", "or", "GLASTCreERT2", "/", "Smad4WT", "/", "WT", "/", "eGFP", ",", "as", "indicated", "on", "the", "x", "-", "axis", "(", "n", "=", "3", "-", "4", "animals", "for", "SEZ", ",", "4", "to", "8", "technical", "replicates", "analyzed", "per", "animal", ";", "4", "animals", "for", "DIE", ",", "8", "technical", "replicates", "analyzed", "per", "animal", ")", ".", "Data", "information", ":", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "F", ":", "GFP", "negative", "and", "GFP", "positive", "cells", "comparing", "wt", "/", "wt", "vs", "fl", "/", "fl", "animals", ",", "adjusted", "P", "-", "value", "=", "0", ".", "0408", ";", "G", ":", "GFP", "negative", "and", "GFP", "positive", "cells", "comparing", "wt", "/", "wt", "vs", "fl", "/", "fl", "animals", ",", "ns", ")", ".", "Each", "dot", "represents", "one", "n", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "nonparametric", "2way", "ANOVA", "followed", "by", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparisons", "testH", "Histogram", "depicting", "the", "number", "of", "secondary", "neurospheres", "generated", "from", "10000", "Smad4f", "/", "f", "neurosphere", "cells", "at", "7", "days", "after", "infection", "with", "MLV", "-", "based", "retrovirus", "containing", "either", "CAG", "-", "NLS", "-", "Cre", "or", "only", "CAG", "-", "GFP", "(", "n", "=", "11", "cultures", "/", "animals", ",", "3", "technical", "replicates", "per", "condition", "analyzed", ";", "control", "vs", ".", "Cre", ",", "P", "-", "value", "=", "0", ".", "0149", ")", ".", "Note", "the", "decrease", "in", "DIE", "astrocyte", "proliferation", "in", "vivo", "and", "in", "neurosphere", "formation", "upon", "Smad4", "deletion", "Data", "information", ":", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "Each", "dot", "represents", "one", "n", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "nonparametric", "Mann", "-", "Whitney", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 9C Example of a Smad4/GFP double-positive astrocyte (indicated by arrowhead) in a single optical section of DIE from 3 mo old GLASTCreERT2/eGFP mice 21 dpt immunostained as indicated on top of the panel. Orthogonal projections of the area highlighted in left panel of C shown at higher magnification in the right panel. Scale bar: 15 µm.D Example of a proliferating (PCNA+, arrowhead) astrocyte in a single optical section of DIE from 3 mo old GLASTCreERT2/eGFP mice 21 dpt immunostained as indicated on top with single channels shown in middle and right panels. Scale bars: 15 µm.E Histogram depicting percentage of PCNA positive cells of all GFP positive cells in the DIE of the genotype indicated on the x-axis (n = 6 animals per genotype; 5 ROI covering the diencephalon on a total of 3 slides were analyzed per animal; PCNA negative and positive cells comparing wt/wt vs. fl/fl animals, adjusted P-value = 0.002). Data information: data are presented as mean ± SEM. Each dot represents one n. * P < 0.05, ** P < 0.01 nonparametric 2way ANOVA followed by Sidak's multiple comparisons testF, G Histograms depicting percentage of the neurosphere-generating cells obtained from the DIE (F) or SEZ (G) of GLASTCreERT2/Smad4fl/fl/eGFP or GLASTCreERT2/Smad4WT/WT/eGFP, as indicated on the x-axis (n = 3-4 animals for SEZ, 4 to 8 technical replicates analyzed per animal; 4 animals for DIE, 8 technical replicates analyzed per animal). Data information: data are presented as mean ± SEM. F: GFP negative and GFP positive cells comparing wt/wt vs fl/fl animals, adjusted P-value = 0.0408; G: GFP negative and GFP positive cells comparing wt/wt vs fl/fl animals, ns). Each dot represents one n. * P < 0.05, ** P < 0.01 nonparametric 2way ANOVA followed by Sidak's multiple comparisons testH Histogram depicting the number of secondary neurospheres generated from 10000 Smad4f/f neurosphere cells at 7 days after infection with MLV-based retrovirus containing either CAG-NLS-Cre or only CAG-GFP (n = 11 cultures / animals, 3 technical replicates per condition analyzed; control vs. Cre, P-value = 0.0149). Note the decrease in DIE astrocyte proliferation in vivo and in neurosphere formation upon Smad4 deletion Data information: data are presented as mean ± SEM. Each dot represents one n. * P < 0.05, ** P < 0.01 nonparametric Mann-Whitney test)."}
{"words": ["Figure", "1Antibacterial", "competition", "assay", ".", "E", ".", "coli", "K12", "recipient", "cells", "(", "W3110", "gfp", "+", ",", "kanR", ")", "were", "mixed", "with", "the", "indicated", "EAEC", "attacker", "cells", "(", "1", ":", "4", "ratio", ")", ":", "WT", ",", "∆", "T6SS", "-", "1", "and", "∆", "tle1", "-", "tli1", "carrying", "pBAD18", "and", "pBAD33", "vectors", ",", "or", "producing", "the", "indicated", "proteins", ",", "and", "spotted", "on", "SIM", "0", ".", "02", "%", "arabinose", "agar", "plates", "for", "4", "-", "h", "at", "37", "°", "C", ".", "The", "image", "of", "a", "representative", "bacterial", "spot", "is", "shown", ".", "The", "number", "of", "recovered", "prey", "cells", "is", "indicated", "in", "the", "upper", "graph", "(", "in", "log", "of", "colony", "-", "forming", "units", "(", "cfu", ")", ")", ".", "The", "black", ",", "dark", "grey", "and", "light", "grey", "circles", "indicate", "values", "obtained", "from", "three", "different", "spots", ",", "and", "the", "average", "is", "indicated", "by", "the", "bar", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "the", "production", "of", "Tle1V", "and", "Tle1", "∆", "1", "-", "26", "V", "is", "shown", "in", "the", "inset", ".", "The", "experiment", "was", "performed", "in", "triplicate", "and", "a", "representative", "result", "is", "shown", ".", "Co", "-", "immunoprecipitation", "assay", ".", "Lysates", "from", "E", ".", "coli", "K", "-", "12", "W3110", "cells", "producing", "VSVG", "-", "tagged", "Tle1", "(", "Tle1V", ")", "or", "VSVG", "-", "tagged", "Tle1", "∆", "1", "-", "26", "truncated", "variant", "(", "Tle1", "∆", "1", "-", "26", "V", ")", "were", "mixed", "with", "lysates", "from", "W3110", "cells", "producing", "FLAG", "-", "tagged", "VgrG", "(", "VgrGFL", ")", "or", "not", "(", "-", ",", "empty", "vector", ")", "and", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "on", "anti", "-", "FLAG", "-", "coupled", "beads", ".", "The", "mixed", "soluble", "lysates", "(", "Input", ")", "and", "the", "immunoprecipitated", "material", "(", "IP", ")", "were", "subjected", "to", "12", ".", "5", "%", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunodetected", "with", "anti", "-", "FLAG", "(", "upper", "panel", ")", "and", "anti", "-", "VSVG", "(", "lower", "panel", ")", "monoclonal", "antibodies", ".", "Molecular", "weight", "markers", "(", "in", "kDa", ")", "are", "indicated", "on", "the", "left", ".", "This", "experiment", "was", "performed", "in", "triplicate", "and", "a", "representative", "result", "is", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Antibacterial competition assay. E. coli K12 recipient cells (W3110 gfp+, kanR) were mixed with the indicated EAEC attacker cells (1:4 ratio): WT, ∆T6SS-1 and ∆tle1-tli1 carrying pBAD18 and pBAD33 vectors, or producing the indicated proteins, and spotted on SIM 0.02 % arabinose agar plates for 4-h at 37°C. The image of a representative bacterial spot is shown. The number of recovered prey cells is indicated in the upper graph (in log of colony-forming units (cfu)). The black, dark grey and light grey circles indicate values obtained from three different spots, and the average is indicated by the bar. Western blot analysis of the production of Tle1V and Tle1∆1-26 V is shown in the inset. The experiment was performed in triplicate and a representative result is shown.Co-immunoprecipitation assay. Lysates from E. coli K-12 W3110 cells producing VSVG-tagged Tle1 (Tle1V) or VSVG-tagged Tle1∆1-26 truncated variant (Tle1∆1-26 V) were mixed with lysates from W3110 cells producing FLAG-tagged VgrG (VgrGFL) or not (-, empty vector) and subjected to immunoprecipitation on anti-FLAG-coupled beads. The mixed soluble lysates (Input) and the immunoprecipitated material (IP) were subjected to 12.5% SDS-PAGE and immunodetected with anti-FLAG (upper panel) and anti-VSVG (lower panel) monoclonal antibodies. Molecular weight markers (in kDa) are indicated on the left. This experiment was performed in triplicate and a representative result is shown."}
{"words": ["Figure", "5Specific", "phospholipase", "A1", "(", "PLA1", ")", "activity", "measurements", "of", "Tle1H", ",", "SVgrG", "-", "Tle1H", "complex", ",", "and", "isolated", "SVgrG", ".", "Thermomyces", "lanuginosus", "lipase", "(", "TLL", ")", "was", "used", "as", "positive", "standard", "for", "PLA1", "activity", ".", "Mean", "values", "and", "standard", "deviation", "from", "at", "least", "three", "independent", "assays", "are", "shown", ".", "Statistical", "analysis", "relative", "to", "the", "Tle1", "activity", "is", "indicated", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "P", "=", "0", ",", "0001998", ")", ",", "unpaired", "two", "-", "sample", "Fisher", "-", "Pitman", "permutation", "test", ".", "VgrG", "inhibition", "of", "Tle1H", ".", "Specific", "phospholipase", "A1", "(", "PLA1", ")", "activity", "measurements", "of", "purified", "Tle1H", "in", "the", "presence", "of", "1", ":", "10", "molar", "ratio", "of", "lysozyme", "from", "chicken", "egg", "white", "(", "Lyso", ")", "and", "increasing", "molar", "ratio", "(", "0", ",", "1", ",", "5", ",", "and", "10", ")", "of", "SVgrG", "or", "SVgrG1", "-", "490", ".", "Inhibition", "experiments", "with", "SVgrG", "were", "repeated", "three", "times", "with", "independent", "protein", "preparations", ",", "each", "measured", "in", "triplicate", ".", "Inhibition", "experiments", "with", "SVgrG1", "-", "490", "were", "repeated", "twice", "with", "two", "independent", "protein", "preparations", ",", "each", "measured", "in", "triplicate", ".", "Mean", "values", "and", "standard", "deviation", "are", "shown", ".", "Statistical", "analysis", "relative", "to", "the", "Tle1", "activity", "is", "indicated", ".", "ns", ",", "non", "-", "significant", "(", "P", ">", "0", ".", "05", ")", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "unpaired", "two", "-", "sample", "Fisher", "-", "Pitman", "permutation", "test", ".", "(", "P", "values", ":", "Lyso", ",", "0", ".", "7006", ";", "VgrG", "1", ":", "1", ",", "0", ".", "004946", ";", "VgrG", "1", ":", "5", ",", "1", ".", "448e", "-", "07", ";", "VgrG1", ":", "10", ",", "1", ".", "448e", "-", "07", ";", "VgrG1", "-", "490", "1", ":", "1", ",", "0", ".", "5627", ";", "VgrG1", "-", "490", "1", ":", "5", ",", "0", ".", "2977", ";", "VgrG1", "-", "490", "1", ":", "10", ",", "0", ".", "002631", ")", ".", "Representative", "SDS", "-", "PAGE", "/", "Coomassie", "blue", "staining", "of", "the", "Tle1H", ",", "SVgrG", "and", "SVgrG1", "-", "490", "purified", "proteins", "used", "in", "B", "(", "5", "μg", "/", "well", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Specific phospholipase A1 (PLA1) activity measurements of Tle1H, SVgrG-Tle1H complex, and isolated SVgrG. Thermomyces lanuginosus lipase (TLL) was used as positive standard for PLA1 activity. Mean values and standard deviation from at least three independent assays are shown. Statistical analysis relative to the Tle1 activity is indicated. ***P<0.001 (P=0,0001998), unpaired two-sample Fisher-Pitman permutation test.VgrG inhibition of Tle1H. Specific phospholipase A1 (PLA1) activity measurements of purified Tle1H in the presence of 1:10 molar ratio of lysozyme from chicken egg white (Lyso) and increasing molar ratio (0, 1, 5, and 10) of SVgrG or SVgrG1-490. Inhibition experiments with SVgrG were repeated three times with independent protein preparations, each measured in triplicate. Inhibition experiments with SVgrG1-490 were repeated twice with two independent protein preparations, each measured in triplicate. Mean values and standard deviation are shown. Statistical analysis relative to the Tle1 activity is indicated. ns, non-significant (P>0.05), *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, unpaired two-sample Fisher-Pitman permutation test. (P values: Lyso, 0.7006; VgrG 1:1, 0.004946; VgrG 1:5, 1.448e-07; VgrG1:10, 1.448e-07; VgrG1-490 1:1, 0.5627; VgrG1-490 1:5, 0.2977; VgrG1-490 1:10, 0.002631).Representative SDS-PAGE / Coomassie blue staining of the Tle1H, SVgrG and SVgrG1-490 purified proteins used in B (5 μg/well)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "G", ")", ".", "GFP", "-", "tagged", "ERMES", "complex", "proteins", "retain", "their", "characteristic", "punctate", "structure", "in", "Δlam6", ",", "suggesting", "that", "Lam6", "is", "not", "an", "essential", "complex", "member", ".", "Scale", "bar", "represents", "5", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(G). GFP-tagged ERMES complex proteins retain their characteristic punctate structure in Δlam6, suggesting that Lam6 is not an essential complex member. Scale bar represents 5 μm."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Fluorescence", "microscopy", "demonstrates", "that", "Lam6", "-", "GFP", "co", "-", "localizes", "with", "ERMES", "(", "Mdm34", "-", "Cherry", ")", "(", "yellow", "arrows", ")", "and", "also", "localizes", "to", "non", "-", "ERMES", "locations", "in", "the", "cell", "(", "red", "arrows", ")", ".", "These", "additional", "locations", "co", "-", "localized", "with", "the", "NVJ", "(", "Nvj1", "-", "GFP", ")", "as", "well", "as", "with", "the", "vCLAMP", "(", "GFP", "-", "Vps39", ")", ".", "Scale", "bar", "represents", "5", "μm", ".", "(", "B", ")", "Overexpression", "and", "tagging", "of", "Lam6", "confirmed", "that", "it", "co", "-", "localizes", "with", "ERMES", "(", "Mdm34", "-", "GFP", ")", "(", "yellow", "arrows", ")", "as", "well", "as", "to", "additional", "contact", "sites", "(", "red", "arrows", ")", ",", "NVJ", "(", "marked", "by", "Nvj1", ")", "and", "vCLAMP", "(", "marked", "by", "Vps39", ")", ".", "Scale", "bar", "represents", "5", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Fluorescence microscopy demonstrates that Lam6-GFP co-localizes with ERMES (Mdm34-Cherry) (yellow arrows) and also localizes to non-ERMES locations in the cell (red arrows). These additional locations co-localized with the NVJ (Nvj1-GFP) as well as with the vCLAMP (GFP-Vps39). Scale bar represents 5 μm.(B) Overexpression and tagging of Lam6 confirmed that it co-localizes with ERMES (Mdm34-GFP) (yellow arrows) as well as to additional contact sites (red arrows), NVJ (marked by Nvj1) and vCLAMP (marked by Vps39). Scale bar represents 5 μm."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Fluorescence", "microscopy", "demonstrates", "that", "the", "overexpression", "of", "Cherry", "-", "Lam6", "(", "OE", "-", "Cherry", "-", "LAM6", ")", "results", "in", "an", "expansion", "of", "the", "following", "three", "contact", "sites", ":", "ERMES", "(", "Mdm34", "-", "GFP", ")", ",", "NVJ", "(", "Nvj1", "-", "GFP", ")", ",", "and", "vCLAMP", "(", "GFP", "-", "Vps39", ")", ".", "This", "suggests", "that", "an", "increase", "in", "Lam6", "levels", "in", "the", "contact", "site", "is", "sufficient", "for", "its", "expansion", ".", "The", "numbers", "represent", "the", "average", "contact", "site", "size", "(", "120", "cells", "per", "sample", ")", ".", "Scale", "bar", "represents", "5", "μm", ".", "(", "B", ")", "Immuno", "-", "EM", "verified", "that", "GFP", "-", "Lam6", "overexpression", "indeed", "causes", "an", "expansion", "of", "contact", "site", "size", ".", "While", "vCLAMP", "was", "hardly", "visible", "in", "WT", "cells", ",", "it", "could", "be", "detected", "easily", "in", "the", "OE", "strain", "(", "albeit", "often", "had", "ER", "tubules", "invading", "it", ")", ".", "The", "NVJ", "underwent", "expansion", "as", "well", "as", "evoked", "PMN", "in", "OE", "strains", ",", "and", "the", "ER", "-", "mitochondria", "contact", "became", "large", "and", "elongated", "instead", "of", "small", "and", "distinct", ".", "N", ",", "nucleus", ";", "M", ",", "mitochondria", ";", "V", ",", "vacuole", ".", "Scale", "bar", "represents", "200", "nm", "(", "see", "also", "Figure", "S3I", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Fluorescence microscopy demonstrates that the overexpression of Cherry-Lam6 (OE-Cherry-LAM6) results in an expansion of the following three contact sites: ERMES (Mdm34-GFP), NVJ (Nvj1-GFP), and vCLAMP (GFP-Vps39). This suggests that an increase in Lam6 levels in the contact site is sufficient for its expansion. The numbers represent the average contact site size (120 cells per sample). Scale bar represents 5 μm.(B) Immuno-EM verified that GFP-Lam6 overexpression indeed causes an expansion of contact site size. While vCLAMP was hardly visible in WT cells, it could be detected easily in the OE strain (albeit often had ER tubules invading it). The NVJ underwent expansion as well as evoked PMN in OE strains, and the ER-mitochondria contact became large and elongated instead of small and distinct. N, nucleus; M, mitochondria; V, vacuole. Scale bar represents 200 nm (see also Figure S3I)."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Fluorescent", "microscopy", "shows", "that", "the", "ERMES", "contact", "(", "as", "measured", "by", "the", "number", "of", "Mdm34", "-", "GFP", "puncta", "per", "cell", ")", "expanded", "in", "the", "Δvps39", "background", "relative", "to", "WT", ".", "However", ",", "the", "expansion", "did", "not", "occur", "on", "the", "background", "of", "Δvps39", "Δlam6", ",", "demonstrating", "that", "Lam6", "is", "necessary", "for", "ERMES", "expansion", "under", "these", "conditions", ".", "Scale", "bar", "represents", "5", "μm", ".", "(", "B", ")", "Quantitation", "of", "(", "A", ")", ".", "Bars", "represent", "the", "percentage", "of", "cells", "containing", "the", "specific", "number", "of", "puncta", "/", "cell", "out", "of", "total", "cells", "counted", "for", "the", "strain", "(", "for", "WT", ",", "n", "=", "234", "cells", ";", "for", "Δvps39", ",", "n", "=", "246", ";", "for", "Δvps39", "Δlam6", ",", "n", "=", "271", ")", ".", "(", "C", ")", "Fluorescent", "microscopy", "demonstrates", "that", "downregulating", "ERMES", "contacts", "(", "by", "growing", "GALp", "-", "MDM34", "strains", "in", "glucose", ")", "indeed", "caused", "expansion", "of", "vCLAMP", "(", "GFP", "-", "Vps39", ")", ".", "However", ",", "this", "expansion", "was", "diminished", "in", "a", "Δlam6", "background", ".", "Scale", "bar", "represents", "5", "μm", "(", "see", "also", "Figure", "S4", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Fluorescent microscopy shows that the ERMES contact (as measured by the number of Mdm34-GFP puncta per cell) expanded in the Δvps39 background relative to WT. However, the expansion did not occur on the background of Δvps39 Δlam6, demonstrating that Lam6 is necessary for ERMES expansion under these conditions. Scale bar represents 5 μm.(B) Quantitation of (A). Bars represent the percentage of cells containing the specific number of puncta/cell out of total cells counted for the strain (for WT, n = 234 cells; for Δvps39, n = 246; for Δvps39 Δlam6, n = 271).(C) Fluorescent microscopy demonstrates that downregulating ERMES contacts (by growing GALp-MDM34 strains in glucose) indeed caused expansion of vCLAMP (GFP-Vps39). However, this expansion was diminished in a Δlam6 background. Scale bar represents 5 μm (see also Figure S4)."}
{"words": ["Figure", "1C", ".", "Quantification", "of", "Cre", "activity", "by", "dual", "luciferase", "assays", "(", "mean", "±", "SD", ",", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "information", "Npu", ":", "Nostoc", "punctiforme", ",", "Ssp", ":", "Synechocystis", "sp", ".", ",", "CDS", ":", "coding", "sequence", ".", "D", ".", "Quantification", "of", "tTA", "activity", "by", "dual", "luciferase", "assays", "(", "mean", "±", "SD", ",", "n", "=", "3", "(", "N", "and", "C", ")", "or", "n", "=", "7", "(", "N", "/", "C", ")", ")", ".", "Data", "information", ":", "Npu", ":", "Nostoc", "punctiforme", "CDS", ":", "coding", "sequence", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1C. Quantification of Cre activity by dual luciferase assays (mean±SD, n=3). Data information Npu: Nostoc punctiforme, Ssp: Synechocystis sp., CDS: coding sequence.D. Quantification of tTA activity by dual luciferase assays (mean±SD, n=3 (N and C) or n=7 (N/C)). Data information: Npu: Nostoc punctiforme CDS: coding sequence."}
{"words": ["Figure", "2A", "-", "B", ".", "Scheme", "of", "engineered", "Spc", "and", "Ccsp", "loci", "after", "integration", "of", "split", "-", "Cre", "and", "split", "-", "tTA", "effectors", "(", "red", "mark", "=", "stop", "codon", ")", "and", "comparison", "of", "endogenous", "SPC", "or", "CCSP", "expression", "and", "YFP", "or", "mCherry", "reporter", "expression", "in", "lung", "sections", ".", "Blue", ":", "DAPI", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "µm", ".", "C", "-", "D", ".", "β", "-", "galactosidase", "and", "H", "&", "E", "staining", "of", "lung", "sections", "from", "BASC", "tracer", "and", "BASC", "viewer", "animals", ".", "Scale", "bars", ":", "500", "µm", "(", "overview", ")", "and", "20", "µm", "(", "boxed", "magnification", ")", ".", "E", ".", "Localization", "of", "β", "-", "gal", "+", "cells", "in", "adult", "BASC", "viewer", "animals", ".", "BADJ", "-", "associated", "and", "\"", "alveolar", "\"", "β", "-", "gal", "+", "cells", "are", "expressed", "as", "percentage", "of", "all", "lineage", "-", "labeled", "cells", "(", "means", "±", "SD", "n", "=", "3", ")", ".", "F", ".", "Number", "of", "β", "-", "gal", "+", "cells", "in", "adult", "BASC", "tracer", "and", "BASC", "viewer", "animals", ",", "normalized", "to", "the", "number", "of", "terminal", "bronchioles", "(", "TBs", ")", "(", "means", "±", "SD", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A-B. Scheme of engineered Spc and Ccsp loci after integration of split-Cre and split-tTA effectors (red mark = stop codon) and comparison of endogenous SPC or CCSP expression and YFP or mCherry reporter expression in lung sections. Blue: DAPI. Scale bar: 100 µm.C-D. β-galactosidase and H&E staining of lung sections from BASC tracer and BASC viewer animals. Scale bars: 500 µm (overview) and 20 µm (boxed magnification).E. Localization of β-gal+ cells in adult BASC viewer animals. BADJ-associated and \"alveolar\" β-gal+ cells are expressed as percentage of all lineage-labeled cells (means±SD n=3).F. Number of β-gal+ cells in adult BASC tracer and BASC viewer animals, normalized to the number of terminal bronchioles (TBs) (means±SD n=3)."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "Sequential", "microscopic", "imaging", "of", "epifluorescence", "and", "β", "-", "galactosidase", "activity", "in", "lung", "sections", "of", "adult", "BASC", "viewer", "animals", ".", "Arrow", "highlights", "labeled", "BASC", "at", "BADJ", "(", "magnified", "in", "box", ")", ".", "Blue", ":", "DAPI", ".", "Scale", "bars", ":", "100", "µm", "(", "overview", ")", "and", "20", "µm", "(", "boxed", "magnification", ")", ".", "B", ".", "β", "-", "galactosidase", "staining", "of", "AT2", "cells", "(", "YFP", "+", ")", ",", "Club", "cells", "(", "mCherry", "+", ")", "and", "BASCs", "(", "mCherry", "+", "/", "YFP", "+", ")", "isolated", "from", "BASC", "viewer", "mice", "by", "fluorescence", "-", "activated", "cell", "sorting", "(", "FACS", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "µm", ".", "C", ".", "Doxycycline", "-", "dependent", "reversible", "labeling", "of", "BASCs", "in", "BASC", "viewer", "mice", ".", "Scale", "bar", ":", "200", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. Sequential microscopic imaging of epifluorescence and β-galactosidase activity in lung sections of adult BASC viewer animals. Arrow highlights labeled BASC at BADJ (magnified in box). Blue: DAPI. Scale bars: 100 µm (overview) and 20 µm (boxed magnification).B. β-galactosidase staining of AT2 cells (YFP+), Club cells (mCherry+) and BASCs (mCherry+/YFP+) isolated from BASC viewer mice by fluorescence-activated cell sorting (FACS). Scale bar: 50 µm.C. Doxycycline-dependent reversible labeling of BASCs in BASC viewer mice. Scale bar: 200 µm."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "Heatmaps", "for", "Spearman", "correlation", ".", "C", ".", "MA", "and", "Volcano", "plots", ",", "and", "Top50", "DEGs", "(", "FDR", "<", "0", ".", "05", ",", "Log2FC", ">", "±", "0", ".", "585", ",", "Means", ">", "5", ")", "for", "visualization", "of", "pairwise", "differential", "gene", "expression", "analysis", "of", "BASCs", "and", "Club", "cells", ".", "D", ".", "MA", "and", "Volcano", "plots", ",", "and", "Top50", "DEGs", "(", "FDR", "<", "0", ".", "05", ",", "Log2FC", ">", "±", "0", ".", "585", ",", "Means", ">", "5", ")", "for", "visualization", "of", "pairwise", "differential", "gene", "expression", "analysis", "of", "BASCs", "and", "AT2", "cells", ".", "E", ".", "Heatmap", "of", "RNA", "-", "seq", "z", "-", "scores", "computed", "for", "the", "Top50", "DEGs", "in", "BASC", ",", "AT2", ",", "and", "Club", "cells", "(", "FDR", "<", "0", ".", "05", ",", "Log2FC", ">", "±", "0", ".", "585", ",", "Means", ">", "5", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. Heatmaps for Spearman correlation.C. MA and Volcano plots, and Top50 DEGs (FDR<0.05, Log2FC>±0.585, Means>5) for visualization of pairwise differential gene expression analysis of BASCs and Club cells. D. MA and Volcano plots, and Top50 DEGs (FDR<0.05, Log2FC>±0.585, Means>5) for visualization of pairwise differential gene expression analysis of BASCs and AT2 cells. E. Heatmap of RNA-seq z-scores computed for the Top50 DEGs in BASC, AT2, and Club cells (FDR<0.05, Log2FC>±0.585, Means>5)."}
{"words": ["Figure", "5B", ".", "Quantification", "of", "β", "-", "gal", "+", "cells", "in", "FACS", "-", "purified", "AT2", "and", "Club", "cell", "fractions", "isolated", "from", "3", "months", "old", "BASC", "v", "-", "race", "mice", "(", "mean", "±", "SD", ",", "n", "=", "3", ")", "and", "example", "of", "β", "-", "galactosidase", "label", "distribution", "in", "lung", "sections", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "µm", ".", "C", ".", "BASCs", "emerge", "at", "early", "postnatal", "stages", "and", "contribute", "to", "epithelial", "turnover", "throughout", "life", ".", "β", "-", "galactosidase", "staining", "of", "lung", "sections", "derived", "from", "BASC", "v", "-", "race", "animals", "collected", "at", "indicated", "time", "points", ".", "Arrow", "highlights", "β", "-", "gal", "+", "cell", "at", "P6", ".", "Scale", "bar", ":", "200", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5B. Quantification of β-gal+ cells in FACS-purified AT2 and Club cell fractions isolated from 3 months old BASC v-race mice (mean±SD, n=3) and example of β-galactosidase label distribution in lung sections. Scale bar: 100 µm.C. BASCs emerge at early postnatal stages and contribute to epithelial turnover throughout life. β-galactosidase staining of lung sections derived from BASC v-race animals collected at indicated time points. Arrow highlights β-gal+ cell at P6. Scale bar: 200 µm."}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "β", "-", "galactosidase", "staining", "of", "cleared", "whole", "lung", "preparations", "isolated", "from", "control", "and", "injured", "BASC", "v", "-", "race", "animals", "21", "days", "(", "bleomycin", ",", "naphthalene", ")", "or", "35", "days", "(", "influenza", ")", "following", "injury", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "mm", "(", "whole", "lungs", ")", "and", "1", "mm", "(", "magnification", ")", ".", "B", ".", "Sequential", "microscopic", "imaging", "of", "epifluorescence", "and", "β", "-", "galactosidase", "activity", "in", "lung", "sections", "of", "control", "and", "injured", "BASC", "v", "-", "race", "mice", ".", "Clusters", "of", "BASC", "-", "derived", "AT2", "(", "YFP", "+", ")", "and", "Club", "cells", "(", "mCherry", "+", ")", "are", "highlighted", ".", "Blue", ":", "DAPI", ".", "Scale", "bar", ":", "200", "µm", ".", "C", ".", "Contribution", "of", "BASCs", "to", "different", "cellular", "compartments", ".", "Bronchiolar", "and", "alveolar", "accumulations", "of", "lineage", "-", "traced", "BASC", "derivatives", "are", "expressed", "as", "percentage", "of", "all", "clusters", "containing", "≥", "10", "β", "-", "gal", "+", "cells", ".", "Data", "depicted", "as", "mean", "±", "SD", ",", "n", "=", "4", "(", "bleomycin", ",", "naphthalene", ")", "or", "n", "=", "5", "(", "influenza", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A. β-galactosidase staining of cleared whole lung preparations isolated from control and injured BASC v-race animals 21 days (bleomycin, naphthalene) or 35 days (influenza) following injury. Scale bar: 5 mm (whole lungs) and 1 mm (magnification).B. Sequential microscopic imaging of epifluorescence and β-galactosidase activity in lung sections of control and injured BASC v-race mice. Clusters of BASC-derived AT2 (YFP+) and Club cells (mCherry+) are highlighted. Blue: DAPI. Scale bar: 200 µm.C. Contribution of BASCs to different cellular compartments. Bronchiolar and alveolar accumulations of lineage-traced BASC derivatives are expressed as percentage of all clusters containing ≥ 10 β-gal+ cells. Data depicted as mean±SD, n=4 (bleomycin, naphthalene) or n=5 (influenza)."}
{"words": ["Figure", "7A", ".", "β", "-", "galactosidase", "and", "H", "&", "E", "staining", "of", "lung", "sections", "from", "control", "(", "non", "-", "infected", ")", "and", "injured", "BASC", "viewer", "mice", "7", "days", "post", "infection", "(", "7", "dpi", ")", "with", "influenza", "virus", ".", "Scale", "bar", ":", "200", "µm", ".", "B", ".", "Abundance", "of", "β", "-", "gal", "+", "cells", "in", "control", "(", "non", "-", "infected", ")", "and", "injured", "(", "7", "dpi", ")", "BASC", "viewer", "animals", ".", "Data", "depicted", "as", "mean", "±", "SD", ",", "n", "=", "4", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0286", "(", "Mann", "-", "Whitney", "test", ")", ",", "TB", "-", "terminal", "bronchiole", ".", "C", ".", "Club", "cell", "depletion", "/", "recovery", "after", "naphthalene", "treatment", ".", "Microscopic", "imaging", "of", "epifluorescence", "in", "lung", "sections", "from", "control", "and", "injured", "BASC", "viewer", "animals", "isolated", "3", ",", "7", "and", "21", "days", "post", "naphthalene", "(", "dpn", ")", ".", "Blue", ":", "DAPI", ".", "Scale", "bar", ":", "200", "µm", ".", "D", ".", "β", "-", "galactosidase", "staining", "of", "lung", "sections", "from", "control", "and", "injured", "BASC", "viewer", "animals", "3", ",", "7", "and", "21", "days", "post", "naphthalene", "(", "dpn", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "200", "µm", ".", "E", ".", "Abundance", "of", "β", "-", "gal", "+", "cells", "in", "control", "and", "injured", "BASC", "viewer", "animals", ".", "The", "percentage", "of", "terminal", "bronchioles", "containing", "0", ",", "1", ",", "2", ",", "3", ",", "4", ",", "≥", "5", "β", "-", "gal", "+", "cells", "is", "shown", ".", "Data", "depicted", "as", "mean", "±", "SD", ",", "n", "=", "3", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A. β-galactosidase and H&E staining of lung sections from control (non-infected) and injured BASC viewer mice 7 days post infection (7 dpi) with influenza virus. Scale bar: 200 µm. B. Abundance of β-gal+ cells in control (non-infected) and injured (7 dpi) BASC viewer animals. Data depicted as mean±SD, n = 4, *p = 0.0286 (Mann-Whitney test), TB - terminal bronchiole. C. Club cell depletion/recovery after naphthalene treatment. Microscopic imaging of epifluorescence in lung sections from control and injured BASC viewer animals isolated 3, 7 and 21 days post naphthalene (dpn). Blue: DAPI. Scale bar: 200 µm.D. β-galactosidase staining of lung sections from control and injured BASC viewer animals 3, 7 and 21 days post naphthalene (dpn). Scale bar: 200 µm.E. Abundance of β-gal+ cells in control and injured BASC viewer animals. The percentage of terminal bronchioles containing 0, 1, 2, 3, 4, ≥ 5 β-gal+ cells is shown. Data depicted as mean±SD, n=3."}
{"words": ["Figure", "8A", ".", "Quantification", "of", "lineage", "-", "traced", "Club", "cells", "in", "distal", "TBs", "and", "β", "-", "galactosidase", "staining", "of", "cleared", "accessory", "lobe", "preparation", "(", "scale", "bar", ":", "250", "µm", ")", "isolated", "from", "injured", "BASC", "v", "-", "race", "mice", "at", "21", "dpn", "(", "mean", "±", "SD", ",", "n", "=", "4", ")", ".", "Bottom", "panel", ":", "example", "of", "sequential", "microscopic", "imaging", "to", "quantify", "β", "-", "gal", "+", "mCherry", "+", "cells", "in", "distal", "TBs", ".", "Arrows", "denote", "last", "airway", "bifurcation", "before", "bronchioalveolar", "duct", "junction", "(", "BADJ", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "200", "µm", ".", "B", ".", "β", "-", "galactosidase", "staining", "of", "FACS", "-", "purified", "Club", "cells", "from", "control", "and", "injured", "BASC", "v", "-", "race", "animals", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "µm", ".", "The", "percentage", "of", "lineage", "-", "traced", "Club", "cells", "is", "shown", "(", "mean", "±", "SD", ",", "n", "=", "4", "(", "oil", "ctrl", ".", ")", "or", "n", "=", "5", "(", "21", "dpn", ")", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0159", "(", "Mann", "-", "Whitney", "test", ")", ".", "C", ".", "Combined", "β", "-", "galactosidase", "(", "blue", ")", "and", "acetylated", "tubulin", "staining", "(", "cilia", ",", "brown", "color", ")", "of", "lung", "sections", "from", "BASC", "v", "-", "race", "animals", "at", "21", "dpn", ".", "Red", ":", "DAPI", "(", "pseudocolor", ")", ".", "Examples", "of", "lineage", "-", "traced", "ciliated", "cells", "(", "arrowheads", ")", "and", "Club", "cells", "(", "asterisks", ")", "are", "highlighted", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "µm", ".", "D", ".", "β", "-", "galactosidase", "staining", "of", "cleared", "accessory", "lobe", "preparations", "(", "scale", "bar", ":", "5", "mm", ")", "and", "quantification", "of", "β", "-", "gal", "+", "bronchioles", "in", "lung", "sections", "from", "adult", "BASC", "v", "-", "race", "(", "ctrl", ".", ")", "and", "BASC", "-", "ablated", "mice", "(", "DTA", ")", ".", "Data", "depicted", "as", "mean", "±", "SD", ",", "n", "=", "3", ".", "E", ".", "β", "-", "galactosidase", "staining", "of", "cleared", "accessory", "lobe", "preparations", "(", "scale", "bar", ":", "5", "mm", ")", "and", "fluorescence", "microscopy", "of", "lung", "sections", "from", "uninjured", "and", "naphthalene", "-", "exposed", "BASC", "v", "-", "race", "(", "ctrl", ".", ")", "and", "BASC", "-", "ablated", "(", "DTA", ")", "mice", "12", "days", "post", "naphthalene", "(", "dpn", ")", ".", "Dotted", "lines", "depict", "bronchiolar", "boundaries", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "µm", ".", "F", ".", "Quantification", "of", "Club", "cell", "recovery", "in", "injured", "BASC", "v", "-", "race", "(", "ctrl", ".", ")", "and", "BASC", "-", "ablated", "(", "DTA", ")", "animals", ",", "expressed", "as", "percentage", "of", "bronchiolar", "circumference", "re", "-", "populated", "by", "mCherry", "+", "cells", "at", "12", "dpn", ".", "Data", "depicted", "as", "mean", "±", "SD", ",", "n", "=", "5", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0079", "(", "Mann", "-", "Whitney", "test", ")", ".", "DTA", "-", "diphtheria", "toxin", "fragment", "A", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8A. Quantification of lineage-traced Club cells in distal TBs and β-galactosidase staining of cleared accessory lobe preparation (scale bar: 250 µm) isolated from injured BASC v-race mice at 21 dpn (mean±SD, n=4). Bottom panel: example of sequential microscopic imaging to quantify β-gal+ mCherry+ cells in distal TBs. Arrows denote last airway bifurcation before bronchioalveolar duct junction (BADJ). Scale bar: 200 µm.B. β-galactosidase staining of FACS-purified Club cells from control and injured BASC v-race animals. Scale bar: 50 µm. The percentage of lineage-traced Club cells is shown (mean±SD, n=4 (oil ctrl.) or n=5 (21 dpn), *p = 0.0159 (Mann-Whitney test).C. Combined β-galactosidase (blue) and acetylated tubulin staining (cilia, brown color) of lung sections from BASC v-race animals at 21 dpn. Red: DAPI (pseudocolor). Examples of lineage-traced ciliated cells (arrowheads) and Club cells (asterisks) are highlighted. Scale bar: 50 µm.D. β-galactosidase staining of cleared accessory lobe preparations (scale bar: 5 mm) and quantification of β-gal+ bronchioles in lung sections from adult BASC v-race (ctrl.) and BASC-ablated mice (DTA). Data depicted as mean±SD, n=3. E. β-galactosidase staining of cleared accessory lobe preparations (scale bar: 5 mm) and fluorescence microscopy of lung sections from uninjured and naphthalene-exposed BASC v-race (ctrl.) and BASC-ablated (DTA) mice 12 days post naphthalene (dpn). Dotted lines depict bronchiolar boundaries. Scale bar: 100 µm. F. Quantification of Club cell recovery in injured BASC v-race (ctrl.) and BASC-ablated (DTA) animals, expressed as percentage of bronchiolar circumference re-populated by mCherry+ cells at 12 dpn. Data depicted as mean±SD, n=5, **p = 0.0079 (Mann-Whitney test). DTA - diphtheria toxin fragment A."}
{"words": ["Figure", "1Assessment", "of", "mtDNA", "damage", "by", "quantitative", "PCR", ".", "HEK293", "cells", "infected", "with", "control", "(", "empty", "vector", ")", "or", "shATG5", "for", "5", "days", ".", "Cells", "were", "then", "incubated", "with", "DMSO", "or", "4", "mM", "3", "-", "NPA", "for", "2", "h", "and", "either", "immediately", "harvested", "or", "washed", "with", "fresh", "medium", "and", "incubated", "for", "another", "1", "h", ".", "Cells", "with", "or", "without", "washout", "were", "used", "for", "the", "extraction", "of", "total", "DNA", ".", "All", "DNA", "samples", "were", "used", "for", "amplification", "of", "8", ".", "9", "kb", "mtDNA", "fragment", "using", "quantitative", "PCR", "and", "were", "normalized", "to", "amplification", "of", "a", "221", "bp", "mtDNA", "fragment", ".", "PCR", "products", "were", "quantitated", "by", "PicoGreen", "staining", "using", "Micro", "Plate", "Reader", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ",", "statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "two", "-", "tailed", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "N", ".", "S", ".", ",", "not", "significant", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "The", "data", "in", "(", "A", ")", "were", "further", "calculated", "for", "the", "frequency", "of", "mtDNA", "damage", ".", "The", "equation", "was", "seen", "in", "\"", "Materials", "and", "Methods", "\"", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ",", "statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "a", "two", "-", "tailed", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "N", ".", "S", ".", ",", "not", "significant", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Representative", "images", "show", "8", "-", "oxo", "-", "dG", "staining", ".", "Control", "or", "shATG5", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "DMSO", ",", "200", "µM", "H2O2", ",", "or", "4", "mM", "3", "-", "NPA", "for", "2", "h", ",", "and", "then", "either", "fixed", "immediately", "or", "washed", "with", "fresh", "medium", "and", "incubated", "for", "another", "1", "h", ".", "Cells", "were", "immunostained", "with", "DAPI", "and", "anti", "-", "8", "-", "oxo", "-", "dG", "antibody", "and", "analyzed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "Quantification", "of", "the", "relative", "8", "-", "oxo", "-", "dG", "fluorescence", "intensity", "in", "(", "C", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "20", "cells", "per", "experiment", ")", ",", "statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "a", "two", "-", "tailed", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "N", ".", "S", ".", ",", "not", "significant", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Control", "or", "shATG5", "HEK293", "cells", "stably", "expressing", "mito", "-", "Keima", ".", "Control", "cells", "were", "treated", "with", "DMSO", ",", "200", "µM", "H2O2", ",", "or", "4", "mM", "3", "-", "NPA", "for", "2", "h", ",", "and", "shATG5", "cells", "were", "treated", "with", "200", "µM", "H2O2", "as", "a", "negative", "control", ".", "Cells", "were", "then", "imaged", "with", "458", "nm", "(", "measuring", "mitochondria", "with", "a", "neutral", "pH", ")", "and", "561", "nm", "(", "measuring", "mitochondria", "with", "an", "acidic", "pH", ")", "laser", "excitation", "for", "mito", "-", "Keima", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Right", "panels", "show", "the", "pixel", "intensity", "of", "red", "(", "mitochondria", "within", "lysosomes", ")", "and", "green", "(", "mitochondria", "in", "the", "cytoplasm", ")", "from", "a", "line", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "Quantification", "of", "the", "relative", "ratio", "of", "red", "to", "green", "fluorescence", "intensity", "(", "561", "nm", "/", "458", "nm", ")", "of", "the", "cells", "described", "in", "(", "E", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "20", "cells", "per", "experiment", ")", ",", "statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "a", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "N", ".", "S", ".", ",", "not", "significant", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "HeLa", "cells", "expressing", "GFP", "-", "LC3", "were", "treated", "with", "DMSO", ",", "200", "µM", "H2O2", ",", "or", "4", "mM", "3", "-", "NPA", "for", "2", "h", ".", "Cells", "were", "stained", "with", "anti", "-", "Tom20", "and", "anti", "-", "DNA", "antibodies", ",", "then", "analyzed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "The", "white", "arrows", "were", "indicated", "the", "LC3", "punta", "colocalizing", "or", "contacting", "with", "mtDNA", "/", "Tom20", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "Quantification", "of", "the", "LC3", "punta", "colocalizing", "or", "contacting", "with", "mtDNA", "/", "Tom20", "in", "a", "cell", ".", "n", "=", "30", "cells", "from", "3", "coverslips", ",", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "30", ")", ",", "statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "a", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Assessment of mtDNA damage by quantitative PCR. HEK293 cells infected with control (empty vector) or shATG5 for 5 days. Cells were then incubated with DMSO or 4 mM 3-NPA for 2 h and either immediately harvested or washed with fresh medium and incubated for another 1 h. Cells with or without washout were used for the extraction of total DNA. All DNA samples were used for amplification of 8.9 kb mtDNA fragment using quantitative PCR and were normalized to amplification of a 221 bp mtDNA fragment. PCR products were quantitated by PicoGreen staining using Micro Plate Reader. Data are presented as mean ± SD (n = 3 independent experiments), statistical significance was assessed by two-tailed student's t-test, N.S., not significant, *p < 0.05, **p < 0.01. The data in (A) were further calculated for the frequency of mtDNA damage. The equation was seen in \"Materials and Methods\". Data are presented as mean ± SD (n = 3 independent experiments), statistical significance was assessed by a two-tailed student's t-test, N.S., not significant, **p < 0.01.Representative images show 8-oxo-dG staining. Control or shATG5 HeLa cells were treated with DMSO, 200 µM H2O2, or 4 mM 3-NPA for 2 h, and then either fixed immediately or washed with fresh medium and incubated for another 1 h. Cells were immunostained with DAPI and anti-8-oxo-dG antibody and analyzed by confocal microscopy. Scale bar, 10 µm. Quantification of the relative 8-oxo-dG fluorescence intensity in (C). Data are presented as mean ± SD (n = 3 independent experiments, 20 cells per experiment), statistical significance was assessed by a two-tailed student's t-test, N.S., not significant, *p < 0.05, **p < 0.01.Control or shATG5 HEK293 cells stably expressing mito-Keima. Control cells were treated with DMSO, 200 µM H2O2, or 4 mM 3-NPA for 2 h, and shATG5 cells were treated with 200 µM H2O2 as a negative control. Cells were then imaged with 458 nm (measuring mitochondria with a neutral pH) and 561 nm (measuring mitochondria with an acidic pH) laser excitation for mito-Keima by confocal microscopy. Right panels show the pixel intensity of red (mitochondria within lysosomes) and green (mitochondria in the cytoplasm) from a line. Scale bar, 10 µm. Quantification of the relative ratio of red to green fluorescence intensity (561 nm/458 nm) of the cells described in (E). Data are presented as mean ± SD (n = 3 independent experiments, 20 cells per experiment), statistical significance was assessed by a two-way ANOVA, N.S., not significant, **p < 0.01.HeLa cells expressing GFP-LC3 were treated with DMSO, 200 µM H2O2, or 4 mM 3-NPA for 2 h. Cells were stained with anti-Tom20 and anti-DNA antibodies, then analyzed by confocal microscopy. The white arrows were indicated the LC3 punta colocalizing or contacting with mtDNA/Tom20. Scale bar, 10 µm. Quantification of the LC3 punta colocalizing or contacting with mtDNA/Tom20 in a cell. n = 30 cells from 3 coverslips, Data are presented as mean ± SD (n = 30), statistical significance was assessed by a one-way ANOVA with Tukey's multiple comparisons test, ***p < 0.001."}
{"words": ["Figure", "2Screening", "of", "mitophagy", "regulators", "for", "removing", "damaged", "mtDNA", ".", "HeLa", "cells", "were", "infected", "by", "lentiviral", "particles", "containing", "the", "indicated", "knockdown", "vectors", ".", "Five", "days", "later", ",", "cells", "were", "treated", "with", "200", "µM", "H2O2", "for", "2", "h", ".", "Cells", "were", "then", "imaged", "with", "458", "nm", "(", "measuring", "mitochondria", "with", "a", "neutral", "pH", ")", "and", "561", "nm", "(", "measuring", "mitochondria", "with", "an", "acidic", "pH", ")", "laser", "excitation", "for", "mito", "-", "Keima", ".", "ShATG5", "was", "used", "as", "a", "negative", "control", ".", "Right", "panels", "for", "each", "image", "show", "the", "FACS", "-", "based", "mito", "-", "Keima", "dot", "plots", ".", "The", "y", "-", "axis", "represents", "the", "fluorescence", "emission", "of", "mito", "-", "Keima", "at", "pH", "4", ".", "0", "(", "lysosome", ")", ",", "while", "the", "x", "-", "axis", "indicates", "mito", "-", "Keima", "at", "pH", "7", ".", "0", "(", "mitochondria", ")", ".", "The", "percentages", "of", "cells", "within", "the", "different", "regions", "are", "indicated", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "Control", "or", "ATAD3B", "KO", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "mito", "-", "Keima", "were", "treated", "with", "4", "mM", "3", "-", "NPA", "for", "2", "h", "and", "imaged", "with", "458", "nm", "(", "measuring", "mitochondria", "with", "a", "neutral", "pH", ")", "and", "561", "nm", "(", "measuring", "mitochondria", "with", "an", "acidic", "pH", ")", "laser", "excitation", "for", "mito", "-", "Keima", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "Quantification", "of", "the", "relative", "ratio", "of", "red", "to", "green", "fluorescence", "intensity", "(", "561", "nm", "/", "458", "nm", ")", "of", "the", "cells", "described", "in", "(", "B", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "20", "cells", "per", "experiment", ")", ",", "statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "two", "-", "tailed", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "N", ".", "S", ".", ",", "not", "significant", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Control", "or", "KO", "ATAD3B", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "4", "mM", "3", "-", "NPA", "for", "2", "h", ".", "Cells", "were", "washed", "with", "fresh", "medium", "and", "incubated", "for", "another", "1", "h", ".", "Cells", "were", "then", "fixed", "and", "immunostained", "with", "DAPI", "and", "anti", "-", "8", "-", "oxo", "-", "dG", "antibodies", "and", "were", "analyzed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "Quantification", "of", "the", "relative", "8", "-", "oxo", "-", "dG", "fluorescence", "intensity", "in", "cells", "described", "in", "(", "D", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "20", "cells", "per", "experiment", ")", ",", "statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "two", "-", "tailed", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "N", ".", "S", ".", ",", "not", "significant", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Screening of mitophagy regulators for removing damaged mtDNA. HeLa cells were infected by lentiviral particles containing the indicated knockdown vectors. Five days later, cells were treated with 200 µM H2O2 for 2 h. Cells were then imaged with 458 nm (measuring mitochondria with a neutral pH) and 561 nm (measuring mitochondria with an acidic pH) laser excitation for mito-Keima. ShATG5 was used as a negative control. Right panels for each image show the FACS-based mito-Keima dot plots. The y-axis represents the fluorescence emission of mito-Keima at pH 4.0 (lysosome), while the x-axis indicates mito-Keima at pH 7.0 (mitochondria). The percentages of cells within the different regions are indicated. Scale bar, 10 µm.Control or ATAD3B KO HeLa cells stably expressing mito-Keima were treated with 4 mM 3-NPA for 2 h and imaged with 458 nm (measuring mitochondria with a neutral pH) and 561 nm (measuring mitochondria with an acidic pH) laser excitation for mito-Keima by confocal microscopy. Scale bar, 10 µm. Quantification of the relative ratio of red to green fluorescence intensity (561 nm/458 nm) of the cells described in (B). Data are presented as mean ± SD (n = 3 independent experiments, 20 cells per experiment), statistical significance was assessed by two-tailed student's t-test, N.S., not significant, **p < 0.01.Control or KO ATAD3B HeLa cells were treated with 4 mM 3-NPA for 2 h. Cells were washed with fresh medium and incubated for another 1 h. Cells were then fixed and immunostained with DAPI and anti-8-oxo-dG antibodies and were analyzed by confocal microscopy. Scale bar, 10 µm. Quantification of the relative 8-oxo-dG fluorescence intensity in cells described in (D). Data are presented as mean ± SD (n = 3 independent experiments, 20 cells per experiment), statistical significance was assessed by two-tailed student's t-test , N.S., not significant, **p < 0.01."}
{"words": ["Figure", "3PINK1", "KO", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "mito", "-", "Keima", "were", "infected", "with", "control", "or", "shATAD3B", ".", "Five", "days", "later", ",", "cells", "were", "treated", "with", "DMSO", ",", "200", "µM", "H2O2", ",", "or", "4", "mM", "3", "-", "NPA", "for", "2", "h", ".", "Cells", "were", "then", "analyzed", "and", "imaged", "with", "458", "nm", "(", "measuring", "mitochondria", "with", "a", "neutral", "pH", ")", "and", "561", "nm", "(", "measuring", "mitochondria", "with", "an", "acidic", "pH", ")", "laser", "excitation", "for", "mito", "-", "Keima", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "Quantification", "of", "the", "relative", "ratio", "of", "red", "to", "green", "fluorescence", "intensity", "(", "561nm", "/", "458nm", ")", "of", "the", "cells", "described", "in", "(", "A", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "20", "cells", "per", "experiment", ")", ",", "statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "two", "-", "tailed", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "N", ".", "S", ".", ",", "not", "significant", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "DMSO", ",", "4", "mM", "3", "-", "NPA", ",", "8", "mM", "3", "-", "NPA", ",", "or", "10", "µM", "CCCP", "for", "2", "h", ",", "and", "cell", "lysates", "were", "then", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "using", "the", "indicated", "antibodies", ".", "PINK1", "KO", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "ATAD3A", "-", "Flag", "(", "3A", "-", "Flag", ")", "or", "ATAD3B", "-", "Flag", "(", "3B", "-", "Flag", ")", "were", "mixed", "with", "control", "PINK1", "KO", "cells", "respectively", ",", "and", "incubated", "for", "24", "h", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "4", "mM", "3", "-", "NPA", "(", "D", ")", "or", "200", "µM", "H2O2", "(", "F", ")", "for", "2", "h", ",", "and", "then", "washed", "with", "fresh", "medium", "and", "incubated", "for", "another", "1", "h", ".", "Cells", "were", "fixed", "and", "immunostained", "with", "anti", "-", "8", "-", "oxo", "-", "dG", "and", "anti", "-", "Flag", "antibodies", "and", "analyzed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "8", "-", "oxo", "-", "dG", "fluorescence", "intensity", "of", "cells", "treated", "with", "3", "-", "NPA", "(", "E", ")", "or", "H2O2", "(", "G", ")", "was", "quantified", "by", "ImageJ", "software", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "20", "cells", "per", "experiment", ")", ",", "statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "individual", "two", "-", "tailed", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "N", ".", "S", ".", ",", "not", "significant", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "Control", "(", "GFP", "+", ")", "and", "shATAD3B", "(", "GFP", "-", ")", "PINK1", "KO", "HeLa", "cells", "were", "mixed", "and", "incubated", "for", "24", "h", ".", "Cells", "were", "then", "treated", "with", "4", "mM", "3", "-", "NPA", "(", "H", ")", "or", "200", "µM", "H2O2", "(", "J", ")", "for", "2", "h", ",", "and", "washed", "with", "fresh", "medium", ",", "and", "incubated", "for", "another", "1", "h", ".", "Cells", "were", "fixed", "and", "immunostained", "with", "anti", "-", "8", "-", "oxo", "-", "dG", "and", "DAPI", ",", "then", "analyzed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Control", "or", "shATAD3B", "cells", "are", "circled", "by", "white", "dashed", "lines", ".", "8", "-", "oxo", "-", "dG", "fluorescence", "intensity", "of", "cells", "treated", "with", "3", "-", "NPA", "(", "I", ")", "or", "H2O2", "(", "K", ")", "was", "quantified", "using", "ImageJ", "software", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "20", "cells", "per", "experiment", ")", ",", "statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "two", "-", "tailed", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3PINK1 KO HeLa cells stably expressing mito-Keima were infected with control or shATAD3B. Five days later, cells were treated with DMSO, 200 µM H2O2, or 4 mM 3-NPA for 2 h. Cells were then analyzed and imaged with 458 nm (measuring mitochondria with a neutral pH) and 561 nm (measuring mitochondria with an acidic pH) laser excitation for mito-Keima by confocal microscopy. Scale bar, 10 µm. Quantification of the relative ratio of red to green fluorescence intensity (561nm/458nm) of the cells described in (A). Data are presented as mean ± SD (n = 3 independent experiments, 20 cells per experiment), statistical significance was assessed by two-tailed student's t-test, N.S., not significant, **p < 0.01.HeLa cells were treated with DMSO, 4 mM 3-NPA, 8 mM 3-NPA, or 10 µM CCCP for 2 h, and cell lysates were then analyzed by Western blotting using the indicated antibodies.PINK1 KO HeLa cells stably expressing ATAD3A-Flag (3A-Flag) or ATAD3B-Flag (3B-Flag) were mixed with control PINK1 KO cells respectively, and incubated for 24 h. Cells were treated with 4 mM 3-NPA (D) or 200 µM H2O2 (F) for 2 h, and then washed with fresh medium and incubated for another 1 h. Cells were fixed and immunostained with anti-8-oxo-dG and anti-Flag antibodies and analyzed by confocal microscopy. 8-oxo-dG fluorescence intensity of cells treated with 3-NPA (E) or H2O2 (G) was quantified by ImageJ software. Data are presented as mean ± SD (n = 3 independent experiments, 20 cells per experiment), statistical significance was assessed by individual two-tailed student's t-test, N.S., not significant, *p < 0.05, **p < 0.01. Scale bar, 10 µm.Control (GFP+) and shATAD3B (GFP-) PINK1 KO HeLa cells were mixed and incubated for 24 h. Cells were then treated with 4 mM 3-NPA (H) or 200 µM H2O2 (J) for 2 h, and washed with fresh medium, and incubated for another 1 h. Cells were fixed and immunostained with anti-8-oxo-dG and DAPI, then analyzed by confocal microscopy. Control or shATAD3B cells are circled by white dashed lines. 8-oxo-dG fluorescence intensity of cells treated with 3-NPA (I) or H2O2 (K) was quantified using ImageJ software. Data are presented as mean ± SD (n = 3 independent experiments, 20 cells per experiment), statistical significance was assessed by two-tailed student's t-test, **p < 0.01. Scale bar, 10 µm."}
{"words": ["Figure", "4293T", "cells", "were", "treated", "with", "H2O2", "for", "2", "h", ",", "and", "cell", "lysates", "were", "then", "immunoprecipitated", "with", "Dynabeads", "Protein", "G", "pre", "-", "coupled", "with", "rabbit", "IgG", "(", "control", ")", "or", "anti", "-", "ATAD3", "antibody", ",", "followed", "by", "Western", "blotting", "with", "anti", "-", "LC3B", "or", "anti", "-", "ATAD3", "antibodies", ".", "ATAD3", "DKO", "HeLa", "cells", "expressing", "GFP", "-", "LC3B", "were", "transiently", "transfected", "with", "control", ",", "ATAD3A", "-", "Flag", "or", "ATAD3B", "-", "Flag", ".", "48", "h", "after", "transfection", ",", "cell", "lysates", "were", "immunoprecipitated", "(", "IP", ")", "with", "anti", "-", "Flag", "M2", "affinity", "gel", ",", "and", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "using", "anti", "-", "Flag", "or", "anti", "-", "GFP", "antibodies", ".", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "200", "µM", "H2O2", "for", "2", "h", ",", "and", "cell", "lysates", "were", "incubated", "with", "the", "indicated", "GST", "-", "ATAD3A", "or", "GST", "-", "ATAD3B", "protein", "fragments", "(", "expressed", "in", "E", ".", "coli", ")", "coupled", "to", "glutathione", "agarose", "beads", "(", "Pierce", ")", "for", "GST", "pull", "-", "down", "assay", ".", "Eluted", "protein", "samples", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "using", "antibodies", "against", "GST", "or", "LC3B", ".", "The", "indicated", "GST", "-", "ATAD3A", "or", "GST", "-", "ATAD3B", "protein", "fragments", "and", "His", "-", "LC3B", "were", "expressed", "in", "E", ".", "coli", "and", "purified", ".", "GST", "pull", "-", "down", "assay", "was", "performed", "using", "glutathione", "agarose", "beads", ".", "Eluted", "protein", "samples", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "using", "anti", "-", "GST", "or", "anti", "-", "His", "antibodies", ".", "The", "indicated", "GST", "-", "ATAD3B", "(", "WT", ")", "or", "GST", "-", "ATAD3B", "(", "LIR", "mutations", ")", "and", "His", "-", "LC3", "were", "expressed", "in", "E", ".", "coli", "and", "purified", ".", "GST", "pull", "-", "down", "assay", "was", "performed", "using", "the", "glutathione", "agarose", "beads", ".", "Eluted", "protein", "samples", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "using", "antibodies", "against", "GST", "or", "LC3B", ".", "HeLa", "expressing", "GFP", "-", "LC3", "monoclonal", "cell", "line", "was", "infected", "with", "lentivirus", "particles", "containing", "control", "or", "shATAD3B", ".", "Five", "days", "later", ",", "cells", "were", "treated", "with", "DMSO", ",", "or", "200", "µM", "H2O2", "for", "2", "h", ".", "Cells", "were", "fixed", "and", "immunostained", "with", "anti", "-", "Tom20", "and", "imaged", "by", "confocal", "microscopy", ".", "The", "white", "arrows", "indicate", "the", "LC3", "puncta", "colocalizing", "or", "contacting", "with", "Tom20", "(", "mitochondria", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "Quantification", "of", "the", "GFP", "-", "LC3", "puncta", "colocalized", "or", "contacted", "with", "Tom20", "(", "mitochondria", ")", "in", "cells", "described", "in", "(", "G", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "30", "cells", "from", "3", "coverslips", ")", ",", "statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "a", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "N", ".", "S", ".", ",", "not", "significant", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "293T", "cells", "transiently", "transfected", "with", "control", "or", "ATAD3B", "-", "Flag", "were", "treated", "with", "or", "without", "200", "µM", "H2O2", "for", "2", "h", ".", "Cell", "lysates", "were", "then", "immunoprecipitated", "with", "Dynabeads", "Protein", "G", "pre", "-", "coupled", "with", "anti", "-", "Flag", "antibody", ",", "followed", "by", "Western", "blotting", "with", "anti", "-", "Flag", "or", "anti", "-", "LC3B", "antibodies", ".", "Relative", "protein", "levels", "of", "LC3B", "and", "ATAD3B", "-", "Flag", "were", "further", "evaluated", "by"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4293T cells were treated with H2O2 for 2 h, and cell lysates were then immunoprecipitated with Dynabeads Protein G pre-coupled with rabbit IgG (control) or anti-ATAD3 antibody, followed by Western blotting with anti-LC3B or anti-ATAD3 antibodies.ATAD3 DKO HeLa cells expressing GFP-LC3B were transiently transfected with control, ATAD3A-Flag or ATAD3B-Flag. 48 h after transfection, cell lysates were immunoprecipitated (IP) with anti-Flag M2 affinity gel, and analyzed by Western blotting using anti-Flag or anti-GFP antibodies.HeLa cells were treated with 200 µM H2O2 for 2 h, and cell lysates were incubated with the indicated GST-ATAD3A or GST-ATAD3B protein fragments (expressed in E.coli) coupled to glutathione agarose beads (Pierce) for GST pull-down assay. Eluted protein samples were analyzed by Western blotting using antibodies against GST or LC3B.The indicated GST-ATAD3A or GST-ATAD3B protein fragments and His-LC3B were expressed in E.coli and purified. GST pull-down assay was performed using glutathione agarose beads. Eluted protein samples were analyzed by Western blotting using anti-GST or anti-His antibodies.The indicated GST-ATAD3B(WT) or GST-ATAD3B (LIR mutations) and His-LC3 were expressed in E.coli and purified. GST pull-down assay was performed using the glutathione agarose beads. Eluted protein samples were analyzed by Western blotting using antibodies against GST or LC3B.HeLa expressing GFP-LC3 monoclonal cell line was infected with lentivirus particles containing control or shATAD3B. Five days later, cells were treated with DMSO, or 200 µM H2O2 for 2 h. Cells were fixed and immunostained with anti-Tom20 and imaged by confocal microscopy. The white arrows indicate the LC3 puncta colocalizing or contacting with Tom20 (mitochondria). Scale bar, 10 µm.Quantification of the GFP-LC3 puncta colocalized or contacted with Tom20 (mitochondria) in cells described in (G). Data are presented as mean ± SD (n =30 cells from 3 coverslips), statistical significance was assessed by a two-way ANOVA, N.S., not significant, ***p < 0.001.293T cells transiently transfected with control or ATAD3B-Flag were treated with or without 200 µM H2O2 for 2 h. Cell lysates were then immunoprecipitated with Dynabeads Protein G pre-coupled with anti-Flag antibody, followed by Western blotting with anti-Flag or anti-LC3B antibodies. Relative protein levels of LC3B and ATAD3B-Flag were further evaluated by densitometry"}
{"words": ["Figure", "5Mic10", "KO", "COS7", "cells", "stably", "expressing", "ATAD3A", "-", "Flag", "or", "ATAD3B", "-", "Flag", "were", "treated", "with", "DMSO", "or", "200", "µM", "H2O2", "for", "2", "h", ",", "and", "then", "fixed", "and", "immunostained", "with", "anti", "-", "Tom20", "and", "anti", "-", "Flag", "antibodies", ",", "and", "analyzed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "293T", "cells", "treated", "with", "DMSO", "(", "B", ")", "or", "H2O2", "(", "200", "µM", ",", "2", "h", ")", "(", "D", ")", ",", "were", "harvested", "for", "mitochondrial", "isolation", ".", "Purified", "mitochondria", "were", "treated", "with", "the", "indicated", "gradient", "concentration", "of", "proteinase", "K", "for", "20", "min", "on", "ice", ",", "and", "then", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "with", "anti", "-", "ATAD3", ",", "anti", "-", "Tom20", "(", "OMM", ")", ",", "anti", "-", "Tim23", "(", "IMS", ")", ",", "and", "anti", "-", "HSP60", "(", "matrix", ")", ".", "Relative", "protein", "levels", "of", "proteins", "in", "(", "B", ")", "or", "(", "D", ")", "were", "further", "evaluated", "by", "densitometry", "analysis", "using", "ImageJ", "software", ".", "Relative", "trends", "of", "proteolysis", "of", "indicated", "mitochondrial", "proteins", "from", "DMSO", "-", "or", "H2O2", "-", "treated", "cells", "were", "shown", "(", "C", "and", "E", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "Control", ",", "ATAD3A", "KO", ",", "ATAD3B", "KO", ",", "or", "ATAD3", "DKO", "HeLa", "cells", "were", "harvested", "for", "mitochondrial", "isolation", ".", "Purified", "mitochondria", "were", "treated", "with", "DMSO", "or", "EDC", "(", "20", "mM", ")", "for", "30", "min", ",", "and", "then", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "293T", "cells", "were", "treated", "with", "DMSO", ",", "200", "µM", "H2O2", ",", "10", "mM", "NAC", ",", "or", "200", "µM", "H2O2", "plus", "10", "mM", "NAC", "for", "2", "h", ".", "Cells", "were", "then", "harvested", "and", "used", "for", "mitochondrial", "isolation", ".", "Purified", "mitochondria", "were", "treated", "with", "DMSO", "or", "EDC", "(", "20", "mM", ")", "for", "30", "min", "at", "37", "℃", ",", "and", "then", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Quantification", "of", "the", "relative", "protein", "level", "of", "ATAD3", "oligomers", "to", "HSP60", "described", "in", "(", "F", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ",", "statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "a", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "N", ".", "S", ".", ",", "not", "significant", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "143B", ",", "143B", "ρ0", "cells", "were", "harvested", "for", "mitochondrial", "isolation", ".", "Purified", "mitochondria", "were", "treated", "with", "DMSO", "or", "EDC", "(", "20", "mM", ")", "for", "30", "min", "at", "37", "℃", ",", "and", "then", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "293T", "cells", "were", "treated", "with", "DMSO", "or", "ddC", "(", "50", "µM", ")", "plus", "EB", "(", "0", ".", "5", "µg", "/", "ml", ")", "for", "10", "days", ".", "Cells", "were", "then", "harvested", "and", "used", "for", "mitochondrial", "isolation", ".", "Purified", "mitochondria", "were", "treated", "with", "DMSO", "or", "EDC", "(", "20", "mM", ")", "for", "30", "min", "at", "37", "℃", ",", "and", "then", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "ATAD3A", "KO", "HeLa", "cells", "were", "harvested", "for", "mitochondrial", "isolation", ".", "Purified", "mitochondria", "were", "treated", "with", "the", "indicated", "gradient", "concentration", "of", "proteinase", "K", "for", "20", "min", "on", "ice", ",", "and", "then", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "with", "anti", "-", "ATAD3", ",", "anti", "-", "Tom20", "(", "OMM", ")", ",", "anti", "-", "Tim23", "(", "IMS", ")", ",", "and", "anti", "-", "HSP60", "(", "matrix", ")", "(", "K", ")", ".", "Relative", "protein", "levels", "of", "proteins", "in", "(", "K", ")", "were", "further", "evaluated", "by", "densitometry", "analysis", "using", "ImageJ", "software", ".", "Relative", "trends", "of", "proteolysis", "of", "indicated", "mitochondrial", "proteins", "from", "ATAD3A", "KO", "HeLa", "cells", "were", "shown", "(", "L", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Mic10 KO COS7 cells stably expressing ATAD3A-Flag or ATAD3B-Flag were treated with DMSO or 200 µM H2O2 for 2 h, and then fixed and immunostained with anti-Tom20 and anti-Flag antibodies, and analyzed by confocal microscopy. Scale bar, 10 µm.293T cells treated with DMSO (B) or H2O2 (200 µM, 2 h) (D), were harvested for mitochondrial isolation. Purified mitochondria were treated with the indicated gradient concentration of proteinase K for 20 min on ice, and then were analyzed by Western blotting with anti-ATAD3, anti-Tom20 (OMM), anti-Tim23 (IMS), and anti-HSP60 (matrix). Relative protein levels of proteins in (B) or (D) were further evaluated by densitometry analysis using ImageJ software. Relative trends of proteolysis of indicated mitochondrial proteins from DMSO- or H2O2-treated cells were shown (C and E). Data are presented as mean ± SD (n = 3 independent experiments).Control, ATAD3A KO, ATAD3B KO, or ATAD3 DKO HeLa cells were harvested for mitochondrial isolation. Purified mitochondria were treated with DMSO or EDC (20 mM) for 30 min, and then were analyzed by Western blotting with the indicated antibodies.293T cells were treated with DMSO, 200 µM H2O2, 10 mM NAC, or 200 µM H2O2 plus 10 mM NAC for 2 h. Cells were then harvested and used for mitochondrial isolation. Purified mitochondria were treated with DMSO or EDC (20 mM) for 30 min at 37 ℃, and then were analyzed by Western blotting with the indicated antibodies. Quantification of the relative protein level of ATAD3 oligomers to HSP60 described in (F). Data are presented as mean ± SD (n = 3 independent experiments), statistical significance was assessed by a one-way ANOVA, N.S., not significant, *p < 0.05.143B, 143B ρ0 cells were harvested for mitochondrial isolation. Purified mitochondria were treated with DMSO or EDC (20 mM) for 30 min at 37 ℃, and then were analyzed by Western blotting with the indicated antibodies.293T cells were treated with DMSO or ddC (50 µM) plus EB (0.5 µg/ml) for 10 days. Cells were then harvested and used for mitochondrial isolation. Purified mitochondria were treated with DMSO or EDC (20 mM) for 30 min at 37℃, and then were analyzed by Western blotting with the indicated antibodies.ATAD3A KO HeLa cells were harvested for mitochondrial isolation. Purified mitochondria were treated with the indicated gradient concentration of proteinase K for 20 min on ice, and then were analyzed by Western blotting with anti-ATAD3, anti-Tom20 (OMM), anti-Tim23 (IMS), and anti-HSP60 (matrix) (K). Relative protein levels of proteins in (K) were further evaluated by densitometry analysis using ImageJ software. Relative trends of proteolysis of indicated mitochondrial proteins from ATAD3A KO HeLa cells were shown (L). Data are presented as mean ± SD (n = 3 independent experiments)."}
{"words": ["Figure", "6ρ0206", "_", "A", "and", "ρ0206", "_", "B", "cells", "were", "stained", "with", "mitoSOX", "and", "analyzed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "DIC", ",", "Differential", "Interference", "Contrast", ".", "Scale", "bar", ",", "25", "µm", ".", "Quantification", "of", "the", "MitoSOX", "fluorescence", "intensity", "described", "in", "(", "A", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "20", "cells", "per", "experiment", ")", ",", "statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Mitochondria", "carrying", "the", "3243A", ">", "G", "mutation", "in", "the", "tRNA", "Leu", "(", "UUR", ")", "gene", "from", "the", "same", "MELAS", "myoblasts", "were", "transferred", "into", "ρ0", "206", "cell", "line", "to", "generate", "ρ0206", "_", "A", "(", "100", "%", "wild", "-", "type", "mtDNA", ")", "and", "ρ0206", "_", "B", "(", "~", "90", "%", "m", ".", "3243A", ">", "G", "mtDNA", ")", "cell", "lines", ".", "ρ0206", "_", "A", "and", "ρ0206", "_", "B", "cell", "lysates", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "with", "anti", "-", "ATAD3", "or", "anti", "-", "Tubulin", "antibodies", ".", "Relative", "protein", "levels", "of", "proteins", "were", "further", "evaluated", "by", "densitometry", "analysis", "using", "ImageJ", "software", ".", "Quantification", "of", "the", "relative", "protein", "level", "of", "ATAD3B", "to", "Tubulin", "was", "shown", "at", "right", "panels", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ",", "statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "Normal", "or", "MELAS", "patient", "fibroblasts", "cell", "lysates", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "with", "anti", "-", "ATAD3", "or", "anti", "-", "Tubulin", "antibodies", ".", "Relative", "protein", "levels", "of", "proteins", "were", "further", "evaluated", "by", "densitometry", "analysis", "using", "ImageJ", "software", ".", "Quantification", "of", "the", "relative", "protein", "level", "of", "ATAD3B", "to", "Tubulin", "was", "shown", "at", "right", "panels", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ",", "statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "ρ0206", "_", "A", ",", "ρ0206", "_", "B", ",", "and", "ρ0206", "-", "B", "cells", "pretreated", "with", "ddC", "(", "50µM", ")", "plus", "EB", "(", "0", ".", "5µg", "/", "ml", ")", "for", "10", "days", ",", "and", "then", "harvested", "and", "lysed", ".", "Cell", "lysates", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "with", "anti", "-", "ATAD3", "or", "anti", "-", "GAPDH", "antibodies", ".", "ρ0206", "_", "B", "cells", "were", "infected", "with", "control", ",", "ATAD3B", "-", "Flag", "or", "ATAD3B", "(", "mLIR", ")", "-", "Flag", ".", "After", "two", "weeks", ",", "total", "DNA", "from", "cells", "was", "isolated", "and", "used", "to", "calculate", "the", "mutation", "rate", "of", "3243A", ">", "G", "by", "quantitative", "real", "-", "time", "PCR", "using", "the", "TaqMan", "Probe", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ",", "statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "a", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "N", ".", "S", ".", ",", "not", "significant", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "ρ0206", "_", "B", "cells", "were", "infected", "with", "control", ",", "ATAD3A", "-", "Flag", ",", "ATAD3B", "-", "Flag", ",", "or", "ATAD3B", "(", "mLIR", ")", "-", "Flag", ".", "After", "two", "weeks", ",", "the", "cellular", "ATP", "levels", "were", "measured", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ",", "statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "a", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "N", ".", "S", ".", ",", "not", "significant", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "MELAS", "patient", "fibroblasts", "were", "infected", "with", "control", ",", "ATAD3A", "-", "Flag", ",", "ATAD3B", "-", "Flag", "or", "ATAD3B", "(", "mLIR", ")", "-", "Flag", ".", "After", "two", "weeks", ",", "total", "DNA", "was", "isolated", "from", "fibroblasts", "and", "used", "to", "calculate", "the", "mutation", "rate", "of", "3243A", ">", "G", "by", "quantitative", "real", "-", "time", "PCR", "using", "the", "TaqMan", "Probe", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ",", "statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "a", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "N", ".", "S", ".", ",", "not", "significant", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6ρ0206_A and ρ0206_B cells were stained with mitoSOX and analyzed by confocal microscopy. DIC, Differential Interference Contrast. Scale bar, 25 µm. Quantification of the MitoSOX fluorescence intensity described in (A). Data are presented as mean ± SD (n = 3 independent experiments, 20 cells per experiment), statistical significance was assessed by student's t-test, **p < 0.01.Mitochondria carrying the 3243A>G mutation in the tRNA Leu(UUR) gene from the same MELAS myoblasts were transferred into ρ0 206 cell line to generate ρ0206_A (100% wild-type mtDNA) and ρ0206_B (~90% m.3243A>G mtDNA) cell lines. ρ0206_A and ρ0206_B cell lysates were analyzed by Western blotting with anti-ATAD3 or anti-Tubulin antibodies. Relative protein levels of proteins were further evaluated by densitometry analysis using ImageJ software. Quantification of the relative protein level of ATAD3B to Tubulin was shown at right panels. Data are presented as mean ± SD (n =3 independent experiments), statistical significance was assessed by student's t-test, ***p < 0.001.Normal or MELAS patient fibroblasts cell lysates were analyzed by Western blotting with anti-ATAD3 or anti-Tubulin antibodies. Relative protein levels of proteins were further evaluated by densitometry analysis using ImageJ software. Quantification of the relative protein level of ATAD3B to Tubulin was shown at right panels. Data are presented as mean ± SD (n =3 independent experiments), statistical significance was assessed by student's t-test, ***p < 0.001.ρ0206_A, ρ0206_B, and ρ0206-B cells pretreated with ddC (50µM) plus EB (0.5µg/ml) for 10 days, and then harvested and lysed. Cell lysates were analyzed by Western blotting with anti-ATAD3 or anti-GAPDH antibodies.ρ0206_B cells were infected with control, ATAD3B-Flag or ATAD3B (mLIR)-Flag. After two weeks, total DNA from cells was isolated and used to calculate the mutation rate of 3243A>G by quantitative real-time PCR using the TaqMan Probe. Data are presented as mean ± SD (n =3 independent experiments), statistical significance was assessed by a one-way ANOVA, N.S., not significant, *p < 0.05.ρ0206_B cells were infected with control, ATAD3A-Flag, ATAD3B-Flag, or ATAD3B (mLIR)-Flag. After two weeks, the cellular ATP levels were measured. Data are presented as mean ± SD (n =3 independent experiments), statistical significance was assessed by a one-way ANOVA, N.S., not significant, *p < 0.05.MELAS patient fibroblasts were infected with control, ATAD3A-Flag, ATAD3B-Flag or ATAD3B(mLIR)-Flag. After two weeks, total DNA was isolated from fibroblasts and used to calculate the mutation rate of 3243A>G by quantitative real-time PCR using the TaqMan Probe. Data are presented as mean ± SD (n =3 independent experiments), statistical significance was assessed by a one-way ANOVA, N.S., not significant, **p < 0.01."}
{"words": ["f1Confocal", "images", "of", "the", "GFP", "fluorescent", "patterns", "in", "seedlings", "expressing", "ATG5", "-", "GFP", "or", "GFP", "-", "ATG8", ".", "(", "a", ",", "b", ")", "Control", "conditions", ":", "cytosolic", "signal", "associated", "with", "rare", "fluorescent", "puncta", ".", "(", "c", ",", "d", ")", "High", "increase", "of", "fluorescent", "puncta", "after", "2", " ", "h", "of", "nutrient", "starvation", ".", "Note", "ring", "-", "like", "ATG5", "structures", "in", "c", ".", "(", "e", ",", "f", ")", "Wortmannin", "treatment", "blocks", "the", "occurrence", "of", "fluorescent", "ATG5", "or", "ATG8", "structures", ".", "(", "g", ",", "h", ")", "Maximum", "intensity", "projections", "of", "vacuolar", "focal", "planes", ",", "allowing", "visualization", "of", "autophagic", "bodies", "after", "4", " ", "h", "of", "nutrient", "starvation", "in", "the", "presence", "of", "concanamycin", "A", ".", "Vacuolar", "ATG5", "-", "GFP", "fluorescence", "is", "not", "detected", "(", "g", ")", ",", "while", "GFP", "-", "ATG8", "signals", "are", "abundant", "(", "h", ")", ".", "An", "inset", "in", "g", ",", "corresponding", "to", "a", "cortical", "focal", "plane", ",", "shows", "that", "formation", "of", "cytosolic", "ATG5", "structures", "in", "the", "cytosol", "is", "not", "inhibited", "by", "concanamycin", "A", "treatment", ".", "Maximum", "intensity", "projections", "of", "10", "-", "μm", "-", "deep", "deconvolved", "stacks", ",", "of", "cortical", "(", "a", "-", "f", ",", "and", "inset", "in", "g", ")", "or", "vacuolar", "focal", "planes", "(", "g", ",", "h", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "10", " ", "μm", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f1Confocal images of the GFP fluorescent patterns in seedlings expressing ATG5-GFP or GFP-ATG8. (a,b) Control conditions: cytosolic signal associated with rare fluorescent puncta. (c,d) High increase of fluorescent puncta after 2 h of nutrient starvation. Note ring-like ATG5 structures in c. (e,f) Wortmannin treatment blocks the occurrence of fluorescent ATG5 or ATG8 structures. (g,h) Maximum intensity projections of vacuolar focal planes, allowing visualization of autophagic bodies after 4 h of nutrient starvation in the presence of concanamycin A. Vacuolar ATG5-GFP fluorescence is not detected (g), while GFP-ATG8 signals are abundant (h). An inset in g, corresponding to a cortical focal plane, shows that formation of cytosolic ATG5 structures in the cytosol is not inhibited by concanamycin A treatment. Maximum intensity projections of 10-μm-deep deconvolved stacks, of cortical (a-f, and inset in g) or vacuolar focal planes (g,h). Scale bar, 10 μm."}
{"words": ["f2", "(", "a", ")", "Differential", "interference", "contrast", "micrographs", "of", "root", "epidermal", "cells", "incubated", "for", "8", " ", "h", "with", "concanamycin", "A", ",", "in", "nutrient", "starvation", "conditions", ".", "Autophagic", "bodies", "accumulation", "in", "the", "vacuole", "is", "clearly", "visible", "in", "wild", "-", "type", "seedlings", ",", "absent", "in", "the", "atg5", "-", "1", "mutant", "and", "restored", "in", "atg5", "-", "1", "seedlings", "expressing", "ATG5", "-", "GFP", ".", "(", "b", ")", "Confocal", "microscopy", ".", "The", "ATG5", "-", "GFP", "fluorescence", "pattern", "in", "the", "atg5", "-", "1", "background", "is", "identical", "to", "that", "observed", "in", "wild", "-", "type", "seedling", ",", "including", "ring", "-", "like", "structures", ".", "Scale", "bar", ",", "15", " ", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f2(a) Differential interference contrast micrographs of root epidermal cells incubated for 8 h with concanamycin A, in nutrient starvation conditions. Autophagic bodies accumulation in the vacuole is clearly visible in wild-type seedlings, absent in the atg5-1 mutant and restored in atg5-1 seedlings expressing ATG5-GFP. (b) Confocal microscopy. The ATG5-GFP fluorescence pattern in the atg5-1 background is identical to that observed in wild-type seedling, including ring-like structures. Scale bar, 15 μm."}
{"words": ["f3", "(", "a", ")", "Dual", "observation", "of", "ATG5", "-", "GFP", "and", "mCh", "-", "ATG8", "under", "nutrient", "starvation", "reveals", "a", "partial", "colocalization", "of", "the", "two", "reporters", ".", "Merge", "of", "the", "GFP", "(", "green", ")", "and", "ATG8", "(", "magenta", ")", "channels", "of", "maximum", "intensity", "projections", "of", "20", "-", "μm", "-", "deep", "deconvolved", "stacks", ".", "Scale", "bar", ",", "3", " ", "μm", ".", "(", "b", ")", "Real", "-", "time", "imaging", "of", "an", "individual", "autophagosomal", "structure", ",", "showing", "one", "deconvolved", "image", "per", "20", " ", "s", ".", "The", "ATG5", "ring", "formation", "phase", "is", "defined", "as", "the", "steps", "up", "to", "establishment", "of", "the", "maximum", "diameter", "of", "the", "ring", "structure", ".", "The", "following", "steps", ",", "defined", "as", "the", "decay", "phase", ",", "being", "more", "dynamic", ",", "are", "depicted", "also", "at", "higher", "time", "resolution", ".", "Single", "-", "plane", "merged", "images", "of", "ATG5", "-", "GFP", "(", "green", ")", "and", "mCh", "-", "ATG8", "(", "magenta", ")", "channels", ",", "deconvolved", ".", "Scale", "bar", ",", "1", " ", "μm", ".", "(", "c", ")", "Representative", "FRAP", "experiment", "on", "mCh", "-", "ATG8", "during", "the", "ring", "formation", "phase", ".", "Deconvolved", "images", ".", "Scale", "bar", ",", "1", " ", "μm", ".", "The", "corresponding", "fluorescence", "recovery", "kinetic", ",", "measured", "on", "non", "-", "deconvolved", "images", ",", "is", "shown", "on", "the", "right", ".", "(", "d", ")", "Representative", "FRAP", "experiment", "of", "mCh", "-", "ATG8", "during", "the", "ring", "decay", "phase", ",", "presented", "as", "in", "c", ".", "(", "e", ")", "Box", "and", "whiskers", "representations", "of", "fluorescence", "recoveries", "during", "ATG5", "ring", "formation", "(", "n", "=", "11", ")", "and", "decay", "(", "n", "=", "17", ")", ".", "Whiskers", "comprise", "the", "10", "-", "90", "percentile", ",", "the", "box", "the", "two", "central", "quartiles", ".", "The", "mean", "recovery", "values", "are", "indicated", "by", "an", "horizontal", "line", ".", "Recoveries", "during", "ATG5", "ring", "formation", "and", "ring", "decay", "were", "significantly", "different", "according", "to", "the", "Mann", "-", "Whitney", "statistical", "test", "(", "*", "*", "*", "P0", ".", "001", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f3(a) Dual observation of ATG5-GFP and mCh-ATG8 under nutrient starvation reveals a partial colocalization of the two reporters. Merge of the GFP (green) and ATG8 (magenta) channels of maximum intensity projections of 20-μm-deep deconvolved stacks. Scale bar, 3 μm.(b) Real-time imaging of an individual autophagosomal structure, showing one deconvolved image per 20 s. The ATG5 ring formation phase is defined as the steps up to establishment of the maximum diameter of the ring structure. The following steps, defined as the decay phase, being more dynamic, are depicted also at higher time resolution. Single-plane merged images of ATG5-GFP (green) and mCh-ATG8 (magenta) channels, deconvolved. Scale bar, 1 μm.(c) Representative FRAP experiment on mCh-ATG8 during the ring formation phase. Deconvolved images. Scale bar, 1 μm. The corresponding fluorescence recovery kinetic, measured on non-deconvolved images, is shown on the right.(d) Representative FRAP experiment of mCh-ATG8 during the ring decay phase, presented as in c.(e) Box and whiskers representations of fluorescence recoveries during ATG5 ring formation (n=11) and decay (n=17). Whiskers comprise the 10-90 percentile, the box the two central quartiles. The mean recovery values are indicated by an horizontal line. Recoveries during ATG5 ring formation and ring decay were significantly different according to the Mann-Whitney statistical test (***P0.001)."}
{"words": ["f6", "(", "a", ")", "Correlative", "light", "-", "electron", "microscopy", "of", "GFP", "-", "ATG8", "-", "labelled", "autophagosomal", "structures", ".", "Correlation", "of", "a", "TEM", "micrograph", "of", "a", "root", "transverse", "section", "(", "1", ")", "with", "fluorescent", "imaging", "of", "GFP", "-", "ATG8", "(", "arrowheads", ",", "2", ")", "confirms", "the", "association", "of", "ATG8", "signal", "with", "autophagosome", "(", "3", ")", ".", "A", "closer", "view", "shows", "close", "contacts", "with", "ER", "-", "like", "membranes", "(", "empty", "arrowheads", ",", "4", ")", ".", "(", "b", ")", "Immunogold", "labelling", "of", "GFP", "-", "ATG8", "on", "cryosections", ",", "employing", "an", "anti", "-", "GFP", "antibody", "(", "arrowheads", ")", ".", "Similar", "interactions", "between", "ER", "membranes", "and", "autophagosomal", "structures", "can", "be", "detected", "either", "on", "cryofixed", "(", "samples", "c", ")", "or", "after", "chemical", "fixation", "(", "d", ")", ".", "Empty", "arrowheads", ":", "connections", "with", "ER", "-", "like", "membranes", ".", "Scale", "bars", ",", "5", " ", "μm", "in", "a", "(", "1", "-", "3", ")", ";", "0", ".", "5", " ", "μm", "in", "a", "(", "4", ")", "and", "b", "(", "1", "-", "3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f6(a) Correlative light-electron microscopy of GFP-ATG8-labelled autophagosomal structures. Correlation of a TEM micrograph of a root transverse section (1) with fluorescent imaging of GFP-ATG8 (arrowheads, 2) confirms the association of ATG8 signal with autophagosome (3). A closer view shows close contacts with ER-like membranes (empty arrowheads, 4).(b) Immunogold labelling of GFP-ATG8 on cryosections, employing an anti-GFP antibody (arrowheads). Similar interactions between ER membranes and autophagosomal structures can be detected either on cryofixed (samples c) or after chemical fixation (d). Empty arrowheads: connections with ER-like membranes. Scale bars, 5 μm in a(1-3); 0.5 μm in a(4) and b(1-3)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "p53", "-", "dependent", "dephosphorylation", "of", "Ulk1", "at", "Ser637", ".", "p53", "+", "/", "+", "and", "p53", "−", "/", "−", "MEFs", "were", "treated", "with", "etoposide", "(", "10", "µM", ")", ",", "and", "the", "expression", "of", "each", "protein", "was", "examined", "by", "western", "blotting", ".", "Dead", "cells", "(", "%", ")", "indicates", "the", "population", "of", "apoptotic", "cells", "assessed", "by", "propidium", "iodide", "(", "PI", ")", "staining", ".", "α", "-", "Tubulin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "A", "semiquantitative", "analysis", "of", "protein", "expression", "is", "shown", "in", "Fig", ".", "EV1", ".", "(", "B", ",", "C", ")", "PPM1D", "-", "dependent", "dephosphorylation", "of", "Ulk1", "at", "Ser637", "and", "the", "induction", "of", "autophagy", ".", "PPM1D", "+", "/", "+", "MEFs", "and", "PPM1D", "−", "/", "−", "MEFs", "were", "treated", "with", "etoposide", "(", "10", "µM", ")", ",", "and", "the", "expression", "of", "each", "protein", "was", "examined", "by", "western", "blotting", ".", "Dead", "cells", "(", "%", ")", "indicates", "the", "population", "of", "apoptotic", "cells", ".", "(", "B", ",", "C", ")", "PPM1D", "-", "dependent", "dephosphorylation", "of", "Ulk1", "at", "Ser637", "and", "the", "induction", "of", "autophagy", ".", "PPM1D", "+", "/", "+", "MEFs", "and", "PPM1D", "−", "/", "−", "MEFs", "were", "treated", "with", "etoposide", "(", "10", "µM", ")", ",", "and", "the", "expression", "of", "each", "protein", "was", "examined", "by", "western", "blotting", ".", "Dead", "cells", "(", "%", ")", "indicates", "the", "population", "of", "apoptotic", "cells", ".", "(", "C", ")", "Semiquantitative", "analysis", "of", "protein", "expression", "is", "shown", "(", "n", "=", "3", ";", "mean", "±", "SD", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "NS", ":", "not", "significant", ".", "(", "D", "-", "I", ")", "Suppression", "of", "etoposide", "-", "induced", "autophagy", "in", "PPM1D", "−", "/", "−", "MEFs", ".", "(", "D", ",", "E", ")", "The", "indicated", "MEFs", "were", "treated", "with", "etoposide", "(", "10", "µM", ")", "for", "6", "hr", "and", "then", "immunostained", "with", "an", "anti", "-", "LC3", "antibody", "(", "green", ")", ".", "Representative", "images", "are", "shown", "in", "(", "D", ")", ".", "LC3", "puncta", "are", "observed", "in", "etoposide", "-", "treated", "PPM1D", "+", "/", "+", "MEFs", ".", "(", "E", ")", "The", "proportion", "of", "cells", "with", "LC3", "puncta", "was", "calculated", "(", "n", ">", "100", "cells", "in", "each", "experiment", ")", ".", "Data", "are", "shown", "as", "the", "mean", " ", "±", " ", "SD", "(", "n", "=", "3", "experiments", ")", ".", "*", "p", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "(", "F", ",", "G", ")", "The", "indicated", "MEFs", "were", "treated", "with", "etoposide", "(", "10", "µM", ")", "for", "6", "hr", "and", "then", "analyzed", "using", "electron", "microscopy", ".", "Representative", "images", "are", "shown", "in", "(", "F", ")", ".", "Many", "autophagic", "vacuoles", "(", "arrows", ")", "can", "be", "seen", "in", "etoposide", "-", "treated", "PPM1D", "+", "/", "+", "cells", "(", "upper", "panel", ")", ".", "\"", "N", "\"", "indicates", "the", "nucleus", ".", "Bar", "=", "2", "µm", ".", "A", "representative", "autophagosome", "(", "AP", ")", "and", "autolysosome", "(", "AL", ")", "are", "shown", "in", "the", "insets", ".", "(", "G", ")", "The", "number", "of", "autophagosomes", "and", "autolysosomes", "in", "each", "cell", "were", "counted", "(", "n", ">", "8", "cells", ")", ".", "Red", "lines", "indicate", "the", "mean", "value", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "(", "H", ",", "I", ")", "Analysis", "of", "autophagic", "flux", ".", "The", "indicated", "MEFs", "were", "treated", "with", "etoposide", "(", "10", "µM", ")", "for", "6", "hr", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "bafilomycin", "A1", "(", "10", "nM", ")", ",", "and", "the", "expression", "of", "each", "protein", "was", "examined", "by", "western", "blotting", ".", "α", "-", "Tubulin", "was", "included", "as", "a", "loading", "control", ".", "(", "I", ")", "Semiquantitative", "analyses", "of", "protein", "expression", "(", "n", " ", "=", " ", "3", ";", "mean", " ", "±", " ", "SD", ")", ".", "*", "p", "<", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "NS", ":", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) p53-dependent dephosphorylation of Ulk1 at Ser637. p53+/+ and p53−/−MEFs were treated with etoposide (10 µM), and the expression of each protein was examined by western blotting. Dead cells (%) indicates the population of apoptotic cells assessed by propidium iodide (PI) staining. α-Tubulin was used as a loading control. A semiquantitative analysis of protein expression is shown in Fig. EV1.(B, C) PPM1D-dependent dephosphorylation of Ulk1 at Ser637 and the induction of autophagy. PPM1D+/+MEFs and PPM1D−/−MEFs were treated with etoposide (10 µM), and the expression of each protein was examined by western blotting. Dead cells (%) indicates the population of apoptotic cells.(B, C) PPM1D-dependent dephosphorylation of Ulk1 at Ser637 and the induction of autophagy. PPM1D+/+MEFs and PPM1D−/−MEFs were treated with etoposide (10 µM), and the expression of each protein was examined by western blotting. Dead cells (%) indicates the population of apoptotic cells. (C) Semiquantitative analysis of protein expression is shown (n = 3; mean ± SD). *p < 0.05, **p < 0.01, NS: not significant. (D-I) Suppression of etoposide-induced autophagy in PPM1D−/−MEFs.(D, E) The indicated MEFs were treated with etoposide (10 µM) for 6 hr and then immunostained with an anti-LC3 antibody (green). Representative images are shown in (D). LC3 puncta are observed in etoposide-treated PPM1D+/+MEFs. (E) The proportion of cells with LC3 puncta was calculated (n > 100 cells in each experiment). Data are shown as the mean  ±  SD (n = 3 experiments). *p < 0.05, **p < 0.01.(F, G) The indicated MEFs were treated with etoposide (10 µM) for 6 hr and then analyzed using electron microscopy. Representative images are shown in (F). Many autophagic vacuoles (arrows) can be seen in etoposide-treated PPM1D+/+cells (upper panel). \"N\" indicates the nucleus. Bar = 2 µm. A representative autophagosome (AP) and autolysosome (AL) are shown in the insets. (G) The number of autophagosomes and autolysosomes in each cell were counted (n > 8 cells). Red lines indicate the mean value. *p < 0.05.(H, I) Analysis of autophagic flux. The indicated MEFs were treated with etoposide (10 µM) for 6 hr in the presence or absence of bafilomycin A1 (10 nM), and the expression of each protein was examined by western blotting. α-Tubulin was included as a loading control. (I) Semiquantitative analyses of protein expression (n = 3; mean  ±  SD). *p < 0.05, **p < 0.01, NS: not significant."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ",", "B", ")", "Effect", "of", "stable", "expression", "of", "PPM1D", "in", "PPM1D", "−", "/", "−", "MEFs", ".", "PPM1D", "−", "/", "−", "MEFs", "and", "PPM1D", "-", "transfected", "PPM1D", "−", "/", "−", "MEFs", "were", "treated", "with", "etoposide", "(", "10", "µM", ")", ",", "and", "the", "expression", "of", "each", "protein", "was", "examined", "by", "western", "blotting", ".", "(", "B", ")", "Semiquantitative", "analyses", "of", "protein", "expression", "in", "(", "A", ")", "(", "n", "=", "3", ";", "mean", "±", " ", "SD", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "NS", ":", "not", "significant", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "Effect", "of", "a", "PPM1D", "inhibitor", "on", "etoposide", "-", "treated", "PPM1D", "+", "/", "+", "MEFs", ".", "PPM1D", "+", "/", "+", "MEFs", "were", "treated", "with", "etoposide", "(", "10", "µM", ")", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "GSK2830371", "(", "30", "µM", ")", ",", "and", "the", "expression", "of", "each", "protein", "was", "examined", "by", "western", "blotting", ".", "(", "D", ")", "Semiquantitative", "analysis", "of", "protein", "expression", "in", "(", "C", ")", "(", "n", " ", "=", " ", "3", ";", "mean", " ", "±", " ", "SD", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "NS", ":", "not", "significant", ".", "(", "E", ",", "F", ")", "Effect", "of", "the", "transient", "overexpression", "of", "PPM1D", ".", "PPM1D", "+", "/", "+", "MEFs", "were", "transfected", "with", "a", "PPM1D", "-", "Flag", "plasmid", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "bafilomycin", "A1", "(", "10", "nM", ")", ",", "and", "the", "expression", "of", "each", "protein", "was", "examined", "by", "western", "blotting", ".", "(", "F", ")", "Semiquantitative", "analyses", "of", "protein", "expression", "in", "(", "E", ")", "(", "n", " ", "=", " ", "3", ";", "mean", " ", "±", " ", "SD", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "NS", ":", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A, B) Effect of stable expression of PPM1D in PPM1D−/−MEFs. PPM1D−/−MEFs and PPM1D-transfected PPM1D−/−MEFs were treated with etoposide (10 µM), and the expression of each protein was examined by western blotting. (B) Semiquantitative analyses of protein expression in (A) (n = 3; mean ±  SD). *p < 0.05, **p < 0.01, NS: not significant.(C, D) Effect of a PPM1D inhibitor on etoposide-treated PPM1D+/+MEFs. PPM1D+/+MEFs were treated with etoposide (10 µM) in the presence or absence of GSK2830371 (30 µM), and the expression of each protein was examined by western blotting. (D) Semiquantitative analysis of protein expression in (C) (n = 3; mean  ±  SD). *p < 0.05, **p < 0.01, NS: not significant.(E, F) Effect of the transient overexpression of PPM1D. PPM1D+/+MEFs were transfected with a PPM1D-Flag plasmid in the presence or absence of bafilomycin A1 (10 nM), and the expression of each protein was examined by western blotting. (F) Semiquantitative analyses of protein expression in (E) (n = 3; mean  ±  SD). *p < 0.05, **p < 0.01, NS: not significant."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Physical", "interaction", "between", "endogenous", "Ulk1", "and", "endogenous", "PPM1D", ".", "PPM1D", "+", "/", "+", "MEFs", "were", "treated", "with", "etoposide", "(", "10", "µM", ")", "or", "left", "untreated", "for", "6", "hr", ".", "Cells", "were", "then", "lysed", "and", "immunoprecipitated", "with", "an", "anti", "-", "Ulk1", "antibody", "or", "a", "control", "IgG", ".", "Immune", "complexes", "and", "total", "lysates", "(", "1", ".", "8", "%", "input", ")", "were", "analyzed", "by", "western", "blotting", "using", "anti", "-", "PPM1D", "and", "anti", "-", "Ulk1", "antibodies", ".", "(", "B", ")", "Interaction", "between", "endogenous", "Ulk1", "and", "recombinant", "PPM1D", ".", "Lysates", "from", "healthy", "PPM1D", "+", "/", "+", "MEFs", "were", "incubated", "with", "GST", "-", "PPM1D", "or", "GST", ".", "Binding", "molecules", "were", "then", "analyzed", "by", "western", "blotting", "using", "anti", "-", "Ulk1", "and", "anti", "-", "GST", "antibodies", ".", "\"", "Total", "lysate", "\"", "indicates", "7", "%", "of", "the", "lysates", "that", "were", "incubated", "with", "GST", "fusion", "protein", ".", "(", "C", ")", "In", "vitro", "Ulk1", "dephosphorylation", "assay", ".", "Immunoprecipitated", "Ulk1", "from", "PPM1D", "+", "/", "+", "MEF", "lysates", "was", "incubated", "with", "GST", "-", "PPM1D", "(", "1", "µg", ")", "with", "or", "without", "a", "phosphatase", "inhibitor", "cocktail", "for", "1", "hr", ".", "Then", ",", "the", "extent", "of", "Ulk1", "dephosphorylation", "was", "analyzed", "by", "western", "blotting", "using", "anti", "-", "phospho", "-", "Ulk1637", "and", "anti", "-", "phospho", "-", "Ulk1757", "antibodies", ".", "Semiquantitative", "analyses", "are", "shown", "in", "Fig", ".", "EV2B", ".", "(", "D", ")", "The", "presence", "of", "cytosolic", "PPM1D", "puncta", "in", "etoposide", "-", "treated", "PPM1D", "+", "/", "+", "MEFs", ".", "PPM1D", "+", "/", "+", "MEFs", "were", "treated", "with", "etoposide", "(", "10", "µM", ")", "for", "6", "hr", ",", "immunostained", "with", "an", "anti", "-", "PPM1D", "antibody", ",", "and", "their", "nuclei", "stained", "with", "Hoechst", "33342", "(", "50", "ng", "/", "ml", ")", ".", "Representative", "images", "of", "anti", "-", "PPM1D", "(", "green", ";", "upper", "panels", ")", "and", "Hoechst", "33342", "(", "blue", ";", "lower", "panels", ")", "are", "shown", ".", "Arrowheads", "indicate", "cytoplasmic", "PPM1D", "puncta", ".", "(", "E", ")", "Colocalization", "of", "endogenous", "PPM1D", "and", "endogenous", "Ulk1", "in", "etoposide", "-", "treated", "PPM1D", "+", "/", "+", "MEFs", ".", "PPM1D", "+", "/", "+", "MEFs", "were", "treated", "with", "etoposide", "(", "10", "µM", ")", "for", "6", "hr", ",", "immunostained", "with", "anti", "-", "PPM1D", "and", "anti", "-", "Ulk1", "antibodies", ",", "and", "their", "nuclei", "stained", "with", "Hoechst", "33342", "(", "50", "ng", "/", "ml", ")", ".", "Representative", "images", "of", "anti", "-", "PPM1D", "(", "red", ";", "left", ")", ",", "anti", "-", "Ulk1", "(", "green", ";", "middle", ")", ",", "and", "a", "merged", "image", "(", "right", ")", "are", "shown", ".", "Magnified", "images", "of", "the", "areas", "within", "the", "dashed", "squares", "are", "shown", "at", "the", "bottom", ".", "Arrowheads", "indicate", "cytoplasmic", "PPM1D", "colocalized", "with", "Ulk1", ".", "(", "F", "-", "J", ")", "The", "crucial", "role", "of", "Ulk1", "dephosphorylation", "at", "Ser637", "in", "etoposide", "-", "induced", "autophagy", ".", "(", "F", "-", "H", ")", "Ulk1", "/", "Ulk2", "DKO", "MEFs", "that", "were", "stably", "transfected", "with", "HA", "-", "Ulk1", "or", "its", "mutants", ",", "S637D", "and", "S637A", ",", "were", "treated", "with", "etoposide", "(", "10", "µM", ")", ".", "Then", ",", "the", "cell", "lysates", "were", "collected", "time", "-", "dependently", ",", "and", "the", "expression", "of", "each", "protein", "was", "examined", "by", "western", "blotting", ".", "Asterisks", "in", "the", "Ulk1", "blots", "are", "nonspecific", "bands", ".", "Semiquantitative", "analyses", "are", "shown", "in", "Fig", ".", "EV2E", ".", "(", "F", "-", "J", ")", "The", "crucial", "role", "of", "Ulk1", "dephosphorylation", "at", "Ser637", "in", "etoposide", "-", "induced", "autophagy", ".", "(", "I", ",", "J", ")", "The", "indicated", "MEFs", "were", "treated", "with", "or", "without", "etoposide", "(", "10", "µM", ")", "for", "6", "hr", ",", "followed", "by", "immunostaining", "with", "an", "anti", "-", "LC3", "antibody", ".", "Representative", "images", "are", "shown", "in", "(", "I", ")", ".", "LC3", "puncta", "are", "markedly", "observed", "in", "DKO", "MEFs", "transfected", "with", "wild", "-", "type", "HA", "-", "Ulk1", ".", "Puncta", "were", "absent", "and", "weakly", "observed", "in", "MEFs", "expressing", "the", "mutants", "S637D", "and", "S637A", ",", "respectively", ".", "(", "J", ")", "The", "population", "of", "cells", "with", "LC3", "puncta", "was", "calculated", "(", "n", " ", ">", " ", "100", "cells", "in", "each", "experiment", ")", ".", "Data", "are", "shown", "as", "the", "mean", " ", "±", " ", "SD", "(", "n", "=", "3", "experiments", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Physical interaction between endogenous Ulk1 and endogenous PPM1D. PPM1D+/+MEFs were treated with etoposide (10 µM) or left untreated for 6 hr. Cells were then lysed and immunoprecipitated with an anti-Ulk1 antibody or a control IgG. Immune complexes and total lysates (1.8% input) were analyzed by western blotting using anti-PPM1D and anti-Ulk1 antibodies.(B) Interaction between endogenous Ulk1 and recombinant PPM1D. Lysates from healthy PPM1D+/+ MEFs were incubated with GST-PPM1D or GST. Binding molecules were then analyzed by western blotting using anti-Ulk1 and anti-GST antibodies. \"Total lysate\" indicates 7% of the lysates that were incubated with GST fusion protein.(C) In vitro Ulk1 dephosphorylation assay. Immunoprecipitated Ulk1 from PPM1D+/+ MEF lysates was incubated with GST-PPM1D (1 µg) with or without a phosphatase inhibitor cocktail for 1 hr. Then, the extent of Ulk1 dephosphorylation was analyzed by western blotting using anti-phospho-Ulk1637 and anti-phospho-Ulk1757 antibodies. Semiquantitative analyses are shown in Fig. EV2B.(D) The presence of cytosolic PPM1D puncta in etoposide-treated PPM1D+/+MEFs. PPM1D+/+MEFs were treated with etoposide (10 µM) for 6 hr, immunostained with an anti-PPM1D antibody, and their nuclei stained with Hoechst 33342 (50 ng/ml). Representative images of anti-PPM1D (green; upper panels) and Hoechst 33342 (blue; lower panels) are shown. Arrowheads indicate cytoplasmic PPM1D puncta.(E) Colocalization of endogenous PPM1D and endogenous Ulk1 in etoposide-treated PPM1D+/+MEFs. PPM1D+/+MEFs were treated with etoposide (10 µM) for 6 hr, immunostained with anti-PPM1D and anti-Ulk1 antibodies, and their nuclei stained with Hoechst 33342 (50 ng/ml). Representative images of anti-PPM1D (red; left), anti-Ulk1 (green; middle), and a merged image (right) are shown. Magnified images of the areas within the dashed squares are shown at the bottom. Arrowheads indicate cytoplasmic PPM1D colocalized with Ulk1.(F-J) The crucial role of Ulk1 dephosphorylation at Ser637 in etoposide-induced autophagy. (F-H) Ulk1/Ulk2 DKO MEFs that were stably transfected with HA-Ulk1 or its mutants, S637D and S637A, were treated with etoposide (10 µM). Then, the cell lysates were collected time-dependently, and the expression of each protein was examined by western blotting. Asterisks in the Ulk1 blots are nonspecific bands. Semiquantitative analyses are shown in Fig. EV2E.(F-J) The crucial role of Ulk1 dephosphorylation at Ser637 in etoposide-induced autophagy. (I, J) The indicated MEFs were treated with or without etoposide (10 µM) for 6 hr, followed by immunostaining with an anti-LC3 antibody. Representative images are shown in (I). LC3 puncta are markedly observed in DKO MEFs transfected with wild-type HA-Ulk1. Puncta were absent and weakly observed in MEFs expressing the mutants S637D and S637A, respectively. (J) The population of cells with LC3 puncta was calculated (n > 100 cells in each experiment). Data are shown as the mean  ±  SD (n = 3 experiments). *p < 0.05, **p < 0.01."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", "-", "D", ")", "Ulk1", "puncta", "formation", "was", "induced", "by", "etoposide", "in", "a", "PPM1D", "-", "dependent", "manner", ".", "The", "indicated", "MEFs", "were", "treated", "with", "etoposide", "(", "10", "µM", ")", "with", "or", "without", "GSK2830371", "(", "20", "µM", ")", "for", "the", "indicated", "times", ",", "followed", "by", "immunostaining", "with", "an", "anti", "-", "Ulk1", "antibody", ".", "Representative", "images", "are", "shown", "in", "(", "A", ")", ".", "Ulk1", "puncta", "are", "observed", "in", "etoposide", "-", "treated", "PPM1D", "+", "/", "+", "MEFs", ".", "(", "B", "-", "D", ")", "The", "proportion", "of", "cells", "with", "Ulk1", "puncta", "was", "calculated", "(", "n", ">", "100", "cells", "in", "each", "experiment", ")", ".", "Data", "are", "shown", "as", "the", "mean", " ", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "experiments", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "NS", ":", "not", "significant", ".", "(", "E", "-", "I", ")", "Role", "of", "the", "dephosphorylation", "of", "Ulk1", "at", "Ser637", "on", "etoposide", "-", "induced", "Ulk1", "puncta", "formation", "and", "Atg13", "phosphorylation", ".", "Ulk1", "/", "Ulk2", "DKO", "MEFs", "stably", "transfected", "with", "HA", "-", "Ulk1", "or", "its", "mutants", ",", "S637D", "and", "S637A", ",", "were", "treated", "with", "etoposide", "(", "10", "µM", ")", "for", "the", "indicated", "times", ".", "(", "E", ",", "F", ")", "Cells", "were", "immunostained", "with", "an", "anti", "-", "Ulk1", "antibody", "(", "E", ")", ",", "and", "the", "population", "of", "cells", "with", "Ulk1", "puncta", "was", "calculated", "(", "n", ">", "100", "cells", "in", "each", "experiment", ")", "(", "F", ")", ".", "Data", "are", "shown", "as", "the", "mean", " ", "±", " ", "SD", "(", "n", "=", "3", "experiments", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "(", "E", "-", "I", ")", "Role", "of", "the", "dephosphorylation", "of", "Ulk1", "at", "Ser637", "on", "etoposide", "-", "induced", "Ulk1", "puncta", "formation", "and", "Atg13", "phosphorylation", ".", "Ulk1", "/", "Ulk2", "DKO", "MEFs", "stably", "transfected", "with", "HA", "-", "Ulk1", "or", "its", "mutants", ",", "S637D", "and", "S637A", ",", "were", "treated", "with", "etoposide", "(", "10", "µM", ")", "for", "the", "indicated", "times", ".", "(", "G", "-", "I", ")", "Cell", "lysates", "were", "collected", "in", "a", "time", "-", "dependent", "manner", ",", "and", "Atg13", "protein", "levels", "and", "its", "phosphorylation", "at", "Ser317", "were", "examined", "by", "western", "blotting", ".", "Semiquantitative", "analyses", "are", "shown", "in", "Fig", ".", "EV3D", ".", "(", "J", ")", "EGFP", "-", "DFCP1", "-", "expressing", "PPM1D", "+", "/", "+", "MEFs", "were", "treated", "with", "etoposide", "(", "10", "µM", ")", "for", "the", "indicated", "times", ",", "followed", "by", "immunostaining", "with", "an", "anti", "-", "Ulk1", "antibody", ".", "Representative", "images", "of", "EGFP", "-", "DFCP1", "(", "green", ";", "left", ")", ",", "anti", "-", "Ulk1", "(", "red", ";", "center", ")", ",", "and", "a", "merged", "image", "(", "right", ")", "are", "shown", ".", "The", "nuclei", "were", "stained", "with", "Hoechst", "33342", "in", "the", "merged", "image", ".", "A", "magnified", "image", "of", "the", "area", "within", "the", "dashed", "square", "is", "also", "shown", ".", "Arrowheads", "indicate", "DFCP1", "puncta", "localized", "close", "to", "Ulk1", "puncta", ".", "(", "K", ",", "L", ")", "The", "role", "of", "Ulk1", "dephosphorylation", "at", "Ser637", "on", "etoposide", "-", "induced", "DFCP1", "puncta", "formation", ".", "Ulk1", "/", "Ulk2", "DKO", "MEFs", "stably", "transfected", "with", "HA", "-", "Ulk1", "or", "its", "mutants", ",", "S637D", "and", "S637A", ",", "were", "transfected", "with", "EGFP", "-", "DFCP1", "and", "treated", "with", "etoposide", "(", "10", "µM", ")", "for", "the", "indicated", "hours", ",", "followed", "by", "immunostaining", "with", "an", "anti", "-", "HA", "antibody", ".", "Representative", "merged", "images", "of", "EGFP", "-", "DFCP1", "(", "green", ")", ",", "anti", "-", "HA", "(", "red", ")", ",", "and", "Hoechst", "33342", "(", "blue", ")", "are", "shown", "in", "(", "K", ")", ".", "Arrowheads", "indicate", "DFCP1", "puncta", "localized", "close", "to", "Ulk1", "puncta", ".", "The", "number", "of", "DFCP1", "puncta", "in", "each", "cell", "was", "calculated", "and", "is", "shown", "in", "(", "L", ")", "(", "n", ">", "8", "cells", "in", "each", "experiment", ")", ".", "Red", "lines", "indicate", "the", "mean", "values", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "NS", ":", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A-D) Ulk1 puncta formation was induced by etoposide in a PPM1D-dependent manner. The indicated MEFs were treated with etoposide (10 µM) with or without GSK2830371 (20 µM) for the indicated times, followed by immunostaining with an anti-Ulk1 antibody. Representative images are shown in (A). Ulk1 puncta are observed in etoposide-treated PPM1D+/+MEFs. (B-D) The proportion of cells with Ulk1 puncta was calculated (n > 100 cells in each experiment). Data are shown as the mean  ± SD (n = 3 experiments). *p < 0.05, **p < 0.01, NS: not significant.(E-I) Role of the dephosphorylation of Ulk1 at Ser637 on etoposide-induced Ulk1 puncta formation and Atg13 phosphorylation. Ulk1/Ulk2 DKO MEFs stably transfected with HA-Ulk1 or its mutants, S637D and S637A, were treated with etoposide (10 µM) for the indicated times. (E, F) Cells were immunostained with an anti-Ulk1 antibody (E), and the population of cells with Ulk1 puncta was calculated (n > 100 cells in each experiment) (F). Data are shown as the mean  ±  SD (n = 3 experiments). *p < 0.05, **p < 0.01.(E-I) Role of the dephosphorylation of Ulk1 at Ser637 on etoposide-induced Ulk1 puncta formation and Atg13 phosphorylation. Ulk1/Ulk2 DKO MEFs stably transfected with HA-Ulk1 or its mutants, S637D and S637A, were treated with etoposide (10 µM) for the indicated times. (G-I) Cell lysates were collected in a time-dependent manner, and Atg13 protein levels and its phosphorylation at Ser317 were examined by western blotting. Semiquantitative analyses are shown in Fig. EV3D.(J) EGFP-DFCP1-expressing PPM1D+/+MEFs were treated with etoposide (10 µM) for the indicated times, followed by immunostaining with an anti-Ulk1 antibody. Representative images of EGFP-DFCP1 (green; left), anti-Ulk1 (red; center), and a merged image (right) are shown. The nuclei were stained with Hoechst 33342 in the merged image. A magnified image of the area within the dashed square is also shown. Arrowheads indicate DFCP1 puncta localized close to Ulk1 puncta.(K, L) The role of Ulk1 dephosphorylation at Ser637 on etoposide-induced DFCP1 puncta formation. Ulk1/Ulk2 DKO MEFs stably transfected with HA-Ulk1 or its mutants, S637D and S637A, were transfected with EGFP-DFCP1 and treated with etoposide (10 µM) for the indicated hours, followed by immunostaining with an anti-HA antibody. Representative merged images of EGFP-DFCP1 (green), anti-HA (red), and Hoechst 33342 (blue) are shown in (K). Arrowheads indicate DFCP1 puncta localized close to Ulk1 puncta. The number of DFCP1 puncta in each cell was calculated and is shown in (L) (n > 8 cells in each experiment). Red lines indicate the mean values. **p < 0.01, NS: not significant."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "PPM1D", "-", "dependent", "dephosphorylation", "of", "Ulk1", "at", "Ser637", ",", "induction", "of", "autophagy", ",", "and", "degradation", "of", "Noxa", ".", "PPM1D", "+", "/", "+", "and", "PPM1D", "−", "/", "−", "primary", "thymocytes", "were", "X", "-", "rayirradiated", "(", "5", "Gy", ")", ",", "and", "3", "hr", "later", ",", "thymocytes", "were", "lysed", "and", "the", "expression", "of", "each", "protein", "was", "examined", "by", "western", "blotting", ".", "α", "-", "Tubulin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Semiquantitative", "analyses", "are", "shown", "in", "Fig", ".", "EV5B", ".", "(", "B", "-", "F", ")", "Suppression", "of", "X", "-", "ray", "-", "induced", "autophagy", "in", "PPM1D", "−", "/", "−", "thymocytes", ".", "(", "B", ",", "C", ")", "The", "indicated", "thymocytes", "were", "X", "-", "rayirradiated", "(", "5", "Gy", ")", ",", "and", "3", "hr", "later", ",", "thymocytes", "were", "immunostained", "with", "an", "anti", "-", "LC3", "antibody", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "Hoechst", "33342", ".", "Representative", "images", "are", "shown", "in", "(", "B", ")", ".", "LC3", "puncta", "can", "be", "seen", "in", "irradiatedPPM1D", "+", "/", "+", "thymocytes", "(", "arrowheads", ")", ".", "In", "(", "C", ")", ",", "the", "proportion", "of", "cells", "with", "LC3", "puncta", "was", "calculated", "(", "n", ">", "100", "cells", "in", "each", "experiment", ")", ".", "Data", "are", "shown", "as", "the", "mean", " ", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "experiments", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "(", "B", "-", "F", ")", "Suppression", "of", "X", "-", "ray", "-", "induced", "autophagy", "in", "PPM1D", "−", "/", "−", "thymocytes", ".", "(", "D", ")", "The", "indicated", "thymocytes", "were", "X", "-", "ray", "irradiated", "(", "5", "Gy", ")", ",", "and", "3", "hr", "later", ",", "thymocytes", "were", "subjected", "to", "EM", "analysis", ".", "An", "autophagic", "vacuole", "(", "arrowhead", ")", "can", "be", "seen", "in", "an", "irradiated", "PPM1D", "+", "/", "+", "thymocyte", ".", "(", "B", "-", "F", ")", "Suppression", "of", "X", "-", "ray", "-", "induced", "autophagy", "in", "PPM1D", "−", "/", "−", "thymocytes", ".", "(", "E", ")", "The", "indicated", "thymocytes", "were", "X", "-", "ray", "irradiated", "(", "5", "Gy", ")", ",", "and", "3", "hr", "later", ",", "thymocytes", "were", "stained", "with", "Cyto", "-", "IDTM", ".", "Representative", "flow", "cytometry", "data", "are", "shown", ".", "Quantitative", "data", "are", "shown", "in", "Fig", ".", "EV5C", ".", "Cyto", "-", "ID", "fluorescence", "in", "irradiated", "PPM1D", "+", "/", "+", "thymocytes", "was", "higher", "than", "that", "in", "the", "other", "thymocytes", ".", "(", "B", "-", "F", ")", "Suppression", "of", "X", "-", "ray", "-", "induced", "autophagy", "in", "PPM1D", "−", "/", "−", "thymocytes", ".", "(", "F", ")", "Analysis", "of", "autophagic", "flux", ".", "The", "indicated", "thymocytes", "were", "X", "-", "rayirradiated", "(", "5", "Gy", ")", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "chloroquine", "(", "120", "µM", ")", ",", "and", "the", "expression", "of", "each", "protein", "was", "examined", "by", "western", "blotting", ".", "α", "-", "Tubulin", "was", "included", "as", "a", "loading", "control", ".", "Semiquantitative", "analyses", "are", "shown", "in", "Figure", "EV4D", ".", "(", "G", "-", "J", ")", "Contribution", "of", "PPM1D", "/", "Ulk1", "-", "dependent", "autophagy", "to", "irradiation", "-", "induced", "apoptosis", ".", "(", "G", ")", "Thymocytes", "were", "X", "-", "ray", "irradiated", "(", "5", "Gy", ")", ",", "and", "6", "hr", "later", ",", "cell", "death", "was", "determined", "using", "the", "PI", "assay", ".", "Data", "represent", "the", "mean", " ", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "thymi", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "NS", ":", "not", "significant", ".", "(", "G", "-", "J", ")", "Contribution", "of", "PPM1D", "/", "Ulk1", "-", "dependent", "autophagy", "to", "irradiation", "-", "induced", "apoptosis", ".", "(", "H", ",", "I", ")", "Thymocytes", "were", "X", "-", "rayirradiated", "(", "5", "Gy", ")", ",", "and", "3", "hr", "later", ",", "the", "expression", "of", "each", "protein", "was", "examined", "by", "western", "blotting", ".", "α", "-", "Tubulin", "was", "included", "as", "a", "loading", "control", ".", "(", "I", ")", "Semiquantitative", "analyses", "are", "shown", "(", "n", " ", "=", " ", "3", ";", "mean", " ", "±", " ", "SD", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "(", "G", "-", "J", ")", "Contribution", "of", "PPM1D", "/", "Ulk1", "-", "dependent", "autophagy", "to", "irradiation", "-", "induced", "apoptosis", ".", "(", "J", ")", "Indicated", "thymocytes", "were", "X", "-", "ray", "irradiated", "(", "5", "Gy", ")", ",", "and", "3", "hr", "later", ",", "caspase3", "/", "7", "activity", "was", "examined", "using", "the", "Caspase", "-", "Glo", "3", "/", "7", "assay", "(", "Promega", ")", "according", "to", "the", "manufacturer", "'", "s", "protocol", ".", "Data", "are", "shown", "as", "the", "mean", " ", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "experiments", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "(", "K", ")", "The", "effect", "of", "Noxa", "siRNA", "on", "thymocytes", ".", "The", "indicated", "thymocytes", "were", "transfected", "with", "the", "pmaxGFP", "vector", "and", "siRNAs", ".", "After", "12", "hr", ",", "cells", "were", "X", "-", "ray", "irradiated", "(", "5", "Gy", ")", ",", "and", "6", "hr", "or", "10", "hr", "later", ",", "the", "population", "of", "dead", "cells", "among", "the", "GFP", "-", "positive", "cells", "was", "determined", "using", "the", "PI", "assay", ".", "Data", "are", "shown", "as", "the", "mean", " ", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "experiments", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "NS", ":", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) PPM1D-dependent dephosphorylation of Ulk1 at Ser637, induction of autophagy, and degradation of Noxa. PPM1D+/+ and PPM1D−/− primary thymocytes were X-rayirradiated (5 Gy), and 3 hr later, thymocytes were lysed and the expression of each protein was examined by western blotting. α-Tubulin was used as a loading control. Semiquantitative analyses are shown in Fig. EV5B.(B-F) Suppression of X-ray-induced autophagy in PPM1D−/−thymocytes. (B, C) The indicated thymocytes were X-rayirradiated (5 Gy), and 3 hr later, thymocytes were immunostained with an anti-LC3 antibody. Nuclei were stained with Hoechst 33342. Representative images are shown in (B). LC3 puncta can be seen in irradiatedPPM1D+/+thymocytes (arrowheads). In (C), the proportion of cells with LC3 puncta was calculated (n > 100 cells in each experiment). Data are shown as the mean  ± SD (n = 3 experiments). *p < 0.05.(B-F) Suppression of X-ray-induced autophagy in PPM1D−/−thymocytes. (D) The indicated thymocytes were X-ray irradiated (5 Gy), and 3 hr later, thymocytes were subjected to EM analysis. An autophagic vacuole (arrowhead) can be seen in an irradiated PPM1D+/+thymocyte.(B-F) Suppression of X-ray-induced autophagy in PPM1D−/−thymocytes. (E) The indicated thymocytes were X-ray irradiated (5 Gy), and 3 hr later, thymocytes were stained with Cyto-IDTM. Representative flow cytometry data are shown. Quantitative data are shown in Fig. EV5C. Cyto-ID fluorescence in irradiated PPM1D+/+thymocytes was higher than that in the other thymocytes.(B-F) Suppression of X-ray-induced autophagy in PPM1D−/−thymocytes. (F) Analysis of autophagic flux. The indicated thymocytes were X-rayirradiated (5 Gy) in the presence or absence of chloroquine (120 µM), and the expression of each protein was examined by western blotting. α-Tubulin was included as a loading control. Semiquantitative analyses are shown in Figure EV4D.(G-J) Contribution of PPM1D/Ulk1-dependent autophagy to irradiation-induced apoptosis. (G) Thymocytes were X-ray irradiated (5 Gy), and 6 hr later, cell death was determined using the PI assay. Data represent the mean  ± SD (n = 3 independent thymi). *p < 0.05, **p < 0.01, NS: not significant.(G-J) Contribution of PPM1D/Ulk1-dependent autophagy to irradiation-induced apoptosis. (H, I) Thymocytes were X-rayirradiated (5 Gy), and 3 hr later, the expression of each protein was examined by western blotting. α-Tubulin was included as a loading control. (I) Semiquantitative analyses are shown (n = 3; mean  ±  SD). *p < 0.05, **p < 0.01.(G-J) Contribution of PPM1D/Ulk1-dependent autophagy to irradiation-induced apoptosis. (J) Indicated thymocytes were X-ray irradiated (5 Gy), and 3 hr later, caspase3/7 activity was examined using the Caspase-Glo 3/7 assay (Promega) according to the manufacturer's protocol. Data are shown as the mean  ± SD (n = 3 experiments). *p < 0.05, **p < 0.01.(K) The effect of Noxa siRNA on thymocytes. The indicated thymocytes were transfected with the pmaxGFP vector and siRNAs. After 12 hr, cells were X-ray irradiated (5 Gy), and 6 hr or 10 hr later, the population of dead cells among the GFP-positive cells was determined using the PI assay. Data are shown as the mean  ± SD (n = 3 experiments). *p < 0.05, NS: not significant."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ",", "B", ")", "Net", "charge", "distribution", "(", "black", ")", "of", "αSyn", "(", "A", ")", "and", "Aß", "(", "B", ")", ",", "plotted", "together", "with", "the", "binding", "distribution", "of", "wild", "-", "type", "SERF2", "(", "blue", ")", "and", "the", "SERF2", "charge", "mutant", "(", "red", ")", ".", "Blue", "boxes", "represent", "the", "SERF2", "interacting", "regions", ".", "(", "C", ")", "ThT", "-", "monitored", "amyloid", "kinetics", "of", "50uM", "alpha", "-", "synuclein", "in", "the", "presence", "of", "either", "wild", "-", "type", "SERF2", "or", "mutant", "SERF2", "in", "a", "1", ":", "1", "ratio", ".", "The", "average", "of", "three", "biological", "replicates", "is", "represented", "and", "error", "bars", "indicate", "mean", "±", "SD", ".", "(", "D", ")", "ThT", "-", "monitored", "amyloid", "kinetics", "of", "1uM", "amyloid", "-", "beta", "in", "the", "presence", "of", "either", "wild", "-", "type", "SERF2", "or", "mutant", "SERF2", "in", "a", "1", ":", "4", "ratio", ".", "The", "average", "of", "four", "technical", "replicates", "is", "represented", "and", "error", "bars", "indicate", "mean", "±", "SD", ".", "(", "E", ")", "Net", "charge", "distribution", "of", "hIAPP", "(", "black", ")", ",", "plotted", "together", "with", "the", "binding", "distribution", "of", "wild", "-", "type", "SERF2", "(", "blue", ")", "and", "the", "SERF2", "charge", "mutant", "(", "red", ")", ".", "(", "F", ")", "ThT", "-", "monitored", "amyloid", "kinetics", "of", "2uM", "human", "islet", "amyloid", "polypeptide", "in", "the", "presence", "of", "either", "wild", "-", "type", "SERF2", "or", "mutant", "SERF2", "in", "a", "1", ":", "4", "ratio", ".", "The", "average", "of", "five", "technical", "replicates", "is", "represented", "and", "error", "bars", "indicate", "mean", "±", "SD", ".", "(", "G", ")", "Model", "and", "charge", "distribution", "graph", "of", "HA", "-", "Q74", "and", "muHA", "-", "Q74", "constructs", ".", "(", "H", ")", "Mutations", "and", "charge", "distribution", "in", "the", "SERF2", "control", "mutant", "and", "SERF2", "charge", "mutant", "proteins", ".", "Filter", "Trap", "with", "5", "-", "fold", "serial", "dilution", "and", "quantification", "of", "crude", "protein", "extract", "from", "SERF2", "CRISPR", "deletion", "mutant", "cells", "transiently", "transfected", "with", "HA", "-", "polyQ74", "and", "either", "wild", "-", "type", "SERF2", ",", "empty", "vector", "or", "SERF2", "charge", "mutant", "(", "I", ")", ",", "Western", "blots", "for", "HA", "-", "Q74", ",", "SERF2", "and", "Tubulin", "expression", "were", "included", "as", "controls", "For", "all", "Filter", "Trap", "assays", ",", "the", "depicted", "blots", "are", "from", "one", "representative", "experiment", "of", "four", "biological", "replicates", ".", "The", "average", "of", "four", "biological", "replicates", "with", "each", "three", "or", "four", "technical", "replicates", "is", "represented", "in", "the", "graphs", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SD", ",", "significance", "was", "calculated", "using", "a", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "followed", "by", "a", "post", "-", "hoc", "Bonferroni", "multiple", "comparisons", "test", ".", "(", "I", ")", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "Filter", "Trap", "with", "5", "-", "fold", "serial", "dilution", "and", "quantification", "of", "crude", "protein", "extract", "from", "SERF2", "CRISPR", "deletion", "mutant", "cells", "transiently", "transfected", "with", "HA", "-", "polyQ74", "and", "either", "wild", "-", "type", "SERF2", ",", "empty", "vector", "or", "SERF2", "control", "mutant", "(", "J", ")", "or", "SERF2", "charge", "mutant", ".", "Western", "blots", "for", "HA", "-", "Q74", ",", "muHA", "-", "Q74", ",", "SERF2", "and", "Tubulin", "expression", "were", "included", "as", "controls", "For", "all", "Filter", "Trap", "assays", ",", "the", "depicted", "blots", "are", "from", "one", "representative", "experiment", "of", "four", "biological", "replicates", ".", "The", "average", "of", "four", "biological", "replicates", "with", "each", "three", "or", "four", "technical", "replicates", "is", "represented", "in", "the", "graphs", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SD", ",", "significance", "was", "calculated", "using", "a", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "followed", "by", "a", "post", "-", "hoc", "Bonferroni", "multiple", "comparisons", "test", ".", "(", "J", ")", "=", "0", ".", "0003", ",", "(", "K", ")", "p", "=", "0", ".", "9130", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A,B) Net charge distribution (black) of αSyn (A) and Aß (B), plotted together with the binding distribution of wild-type SERF2 (blue) and the SERF2 charge mutant (red). Blue boxes represent the SERF2 interacting regions.(C) ThT-monitored amyloid kinetics of 50uM alpha-synuclein in the presence of either wild-type SERF2 or mutant SERF2 in a 1:1 ratio. The average of three biological replicates is represented and error bars indicate mean ± SD.(D) ThT-monitored amyloid kinetics of 1uM amyloid-beta in the presence of either wild-type SERF2 or mutant SERF2 in a 1:4 ratio. The average of four technical replicates is represented and error bars indicate mean ± SD.(E) Net charge distribution of hIAPP (black), plotted together with the binding distribution of wild-type SERF2 (blue) and the SERF2 charge mutant (red).(F) ThT-monitored amyloid kinetics of 2uM human islet amyloid polypeptide in the presence of either wild-type SERF2 or mutant SERF2 in a 1:4 ratio. The average of five technical replicates is represented and error bars indicate mean ± SD.(G) Model and charge distribution graph of HA-Q74 and muHA-Q74 constructs.(H) Mutations and charge distribution in the SERF2 control mutant and SERF2 charge mutant proteins.Filter Trap with 5-fold serial dilution and quantification of crude protein extract from SERF2 CRISPR deletion mutant cells transiently transfected with HA-polyQ74 and either wild-type SERF2, empty vector or SERF2 charge mutant (I), Western blots for HA-Q74, SERF2 and Tubulin expression were included as controls For all Filter Trap assays, the depicted blots are from one representative experiment of four biological replicates. The average of four biological replicates with each three or four technical replicates is represented in the graphs. Data are represented as mean ± SD, significance was calculated using a one-way ANOVA, followed by a post-hoc Bonferroni multiple comparisons test. (I) p<0.0001, **p < 0.01; ***p < 0.001.Filter Trap with 5-fold serial dilution and quantification of crude protein extract from SERF2 CRISPR deletion mutant cells transiently transfected with HA-polyQ74 and either wild-type SERF2, empty vector or SERF2 control mutant (J) or SERF2 charge mutant. Western blots for HA-Q74, muHA-Q74, SERF2 and Tubulin expression were included as controls For all Filter Trap assays, the depicted blots are from one representative experiment of four biological replicates. The average of four biological replicates with each three or four technical replicates is represented in the graphs. Data are represented as mean ± SD, significance was calculated using a one-way ANOVA, followed by a post-hoc Bonferroni multiple comparisons test. (J)=0.0003, (K) p=0.9130 **p < 0.01; ***p < 0.001."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "B", ")", "Representative", "images", "of", "Q40", "and", "Q40", ";", "moag", "-", "4", "charge", "mutant", "animals", ".", "Scale", "bar", ",", "75", "mm", ".", "(", "C", ")", "Representative", "quantification", "of", "the", "number", "of", "aggregates", "in", "Q40", "worms", "with", "moag", "-", "4", "deletion", "or", "expression", "of", "either", "wild", "-", "type", "moag", "-", "4", ",", "moag", "-", "4", "charge", "mutant", "or", "moag", "-", "4", "ctrl", "mutant", ".", "The", "results", "shown", "are", "representative", "experiments", "of", "three", "biological", "replicates", "of", "n", "=", "20", "worms", "in", "L4", "stage", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SD", "and", "significance", "was", "calculated", "using", "a", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "followed", "by", "a", "post", "-", "hoc", "Bonferroni", "multiple", "comparisons", "test", ".", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "(", "D", ")", "Representative", "TCSPC", "-", "FLIM", "images", "from", "the", "indicated", "strains", ".", "The", "dashed", "lines", "mark", "the", "retro", "vesicular", "ganglion", "and", "arrowheads", "indicate", "aggregates", ".", "Scale", "bar", "is", "50", "µm", ".", "(", "E", ")", "Number", "of", "aggregates", "per", "retro", "vesicular", "ganglion", "from", "three", "independent", "cohorts", "of", "the", "indicated", "Aβ1", "-", "42", "strains", "with", "moag", "-", "4", "deletion", "mutant", "(", "del", "(", "tm4909", ")", ")", "n", "=", "11", ",", "moag", "-", "4", "control", "mutant", "(", "ctrl", "mutant", ")", "n", "=", "12", ",", "moag", "-", "4", "charge", "mutant", "(", "charge", "mutant", ")", "n", "=", "17", ",", "and", "wild", "-", "type", "n", "=", "15", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SD", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "+", "Bonferroni", "post", "-", "hoc", "test", "for", "significance", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(B) Representative images of Q40 and Q40;moag-4 charge mutant animals. Scale bar, 75 mm. (C) Representative quantification of the number of aggregates in Q40 worms with moag-4 deletion or expression of either wild-type moag-4, moag-4 charge mutant or moag-4 ctrl mutant. The results shown are representative experiments of three biological replicates of n=20 worms in L4 stage. Data are represented as mean ± SD and significance was calculated using a one-way ANOVA, followed by a post-hoc Bonferroni multiple comparisons test. ****p < 0.0001.(D) Representative TCSPC-FLIM images from the indicated strains. The dashed lines mark the retro vesicular ganglion and arrowheads indicate aggregates. Scale bar is 50 µm.(E) Number of aggregates per retro vesicular ganglion from three independent cohorts of the indicated Aβ1-42 strains with moag-4 deletion mutant (del (tm4909)) n=11, moag-4 control mutant (ctrl mutant) n=12, moag-4 charge mutant (charge mutant) n=17, and wild-type n=15. Data are represented as mean ± SD. One-way ANOVA + Bonferroni post-hoc test for significance (* p < 0.05, **** p < 0.0001)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", "and", "C", ")", "IC50", "values", "for", "MPA", "-", "response", "curves", "using", "cell", "viability", "assay", "were", "shown", ".", "Human", "AML", "cell", "lines", "(", "with", "MLL", "-", "fusions", ":", "MV4", ";", "11", ",", "MOLM13", ",", "NOMO1", "and", "THP1", ",", "without", "MLL", "-", "fusions", ":", "HL60", ",", "Kasumi", "-", "1", ",", "OCI", "-", "AML3", "and", "U937", ")", ",", "human", "cord", "blood", "(", "CB", ")", "CD34", "+", "cells", ",", "and", "those", "expressing", "MLL", "-", "AF9", "(", "CB", "-", "MLL", "-", "AF9", "#", "1", ",", "2", ",", "3", ")", "or", "MLL", "-", "ENL", "(", "CB", "#", "MLL", "-", "ENL", "-", "1", ",", "2", ")", ",", "and", "patient", "cells", "with", "or", "without", "MLL", "-", "fusions", "(", "AML", "#", "1", ",", "2", ",", "3", "or", "AML", "#", "4", ",", "5", ",", "6", ")", "were", "treated", "with", "titrating", "doses", "of", "MPA", "(", "1", "-", "100", "μM", ")", "for", "72", "hours", "in", "three", "technical", "replicates", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "are", "shown", "as", "mean", " ", "±", "SEM", ".", "(", "D", ")", "Response", "curves", "of", "FF", "-", "10501", "-", "01", "(", "1", "-", "100", "μM", ")", "for", "72", "hours", "in", "three", "technical", "replicates", ".", "(", "E", ")", "FCM", "plots", "of", "the", "cell", "cycle", "and", "apoptosis", "analyses", "in", "MLL", "-", "AF9", "expressing", "CB", "cells", "and", "MV4", ";", "11", "cells", ".", "Cells", "were", "incubated", "with", "/", "without", "1", "μM", "MPA", "and", "100", "mM", "Guanosine", "for", "36", "hours", ".", "Numbers", "indicate", "the", "frequency", "of", "S", "/", "G2", "/", "M", "-", "phase", "cells", "(", "left", ")", "and", "Annexin", "V", "+", "cells", "(", "right", ")", ".", "(", "F", "and", "G", ")", "Immunophenotypes", "and", "Wright", "-", "Giemsa", "staining", "of", "MLL", "-", "AF9", "expressing", "CB", "cells", "after", "four", "days", "of", "culture", "with", "/", "without", "3", ".", "3", "μM", "MPA", "and", "100", "μM", "Guanosine", "(", "Scale", "bar", ":", "20", "mm", ")", ".", "(", "H", ")", "MLL", "-", "ENL", "-", "expressing", "CB", "cells", "and", "MOLM13", "cells", "were", "transduced", "with", "Cas9", "together", "with", "non", "-", "targeting", "(", "NT", ")", "sgRNA", "or", "IMPDH2", "-", "targeting", "sgRNAs", "(", "IMPDH2", "-", "KO1", "and", "KO2", ")", "co", "-", "expressing", "tRFP657", ".", "Changes", "in", "the", "frequency", "of", "tRFP657", "+", "cells", "(", "sgRNA", "-", "transduced", "cells", ")", "in", "cell", "cultures", "are", "shown", ".", "Results", "are", "normalized", "to", "the", "frequency", "of", "tRFP657", "+", "cells", "at", "day", "4", ",", "set", "to", "1", ".", "(", "I", ")", "The", "tRFP657", "+", "cells", "in", "(", "H", ")", "were", "sorted", "and", "subjected", "to", "western", "blotting", ".", "The", "depletion", "of", "IMPDH2", "protein", "in", "MLL", "-", "ENL", "cells", "and", "MOLM13", "cells", "was", "confirmed", "by", "western", "blotting", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B and C) IC50 values for MPA-response curves using cell viability assay were shown. Human AML cell lines (with MLL-fusions: MV4;11, MOLM13, NOMO1 and THP1, without MLL-fusions: HL60, Kasumi-1, OCI-AML3 and U937), human cord blood (CB) CD34+ cells, and those expressing MLL-AF9 (CB-MLL-AF9#1, 2, 3) or MLL-ENL (CB#MLL-ENL-1, 2), and patient cells with or without MLL-fusions (AML#1, 2, 3 or AML#4, 5, 6) were treated with titrating doses of MPA (1-100 μM) for 72 hours in three technical replicates. Data information: All data are shown as mean ± SEM.(D) Response curves of FF-10501-01 (1-100 μM) for 72 hours in three technical replicates.(E) FCM plots of the cell cycle and apoptosis analyses in MLL-AF9 expressing CB cells and MV4;11 cells. Cells were incubated with/without 1 μM MPA and 100 mM Guanosine for 36 hours. Numbers indicate the frequency of S/G2/M-phase cells (left) and Annexin V+ cells (right).(F and G) Immunophenotypes and Wright-Giemsa staining of MLL-AF9 expressing CB cells after four days of culture with/without 3.3 μM MPA and 100 μM Guanosine (Scale bar: 20 mm).(H) MLL-ENL-expressing CB cells and MOLM13 cells were transduced with Cas9 together with non-targeting (NT) sgRNA or IMPDH2-targeting sgRNAs (IMPDH2-KO1 and KO2) co-expressing tRFP657. Changes in the frequency of tRFP657+ cells (sgRNA-transduced cells) in cell cultures are shown. Results are normalized to the frequency of tRFP657+ cells at day 4, set to 1.(I) The tRFP657+ cells in (H) were sorted and subjected to western blotting. The depletion of IMPDH2 protein in MLL-ENL cells and MOLM13 cells was confirmed by western blotting."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Immunoblotting", "of", "the", "cord", "blood", "cells", "and", "those", "expressing", "RUNX1", "-", "ETO", "or", "MLL", "-", "AF9", ".", "The", "cells", "were", "incubated", "with", "/", "without", "1", "μM", "MPA", "(", "M", ")", "and", "100", "μM", "Guanosine", "(", "G", ")", "for", "24", "h", ".", "(", "B", ")", "CB", "-", "MLL", "-", "AF9", "#", "2", "cells", "were", "transduced", "with", "a", "Non", "-", "targeting", "(", "NT", ")", "control", "and", "an", "shRNA", "targeting", "p21", "(", "sh", "-", "p21", ")", ".", "Cells", "were", "incubated", "with", "/", "without", "1", "μM", "MPA", "(", "M", ")", "and", "100", "μM", "guanosine", "(", "G", ")", "for", "24", "hours", ".", "Total", "cell", "lysates", "were", "analyzed", "by", "western", "blotting", "using", "the", "antibodies", "for", "p21", "and", "Tubulin", ".", "(", "C", ")", "CB", "-", "MLL", "-", "AF9", "#", "2", "cells", "transduced", "with", "NT", "or", "sh", "-", "p21", "shRNAs", "were", "incubated", "with", "MPA", "at", "the", "indicated", "concentration", "for", "72", "hours", ".", "Cell", "viability", "assays", "were", "performed", "using", "WST", "-", "1", "in", "three", "technical", "replicates", ".", "(", "D", ")", "CB", "-", "MLL", "-", "AF9", "#", "2", "cells", "were", "transduced", "by", "vector", "control", "or", "p53DD", "(", "dominant", "-", "negative", ")", "and", "were", "incubated", "with", "/", "without", "1", "μM", "MPA", "(", "M", ")", "and", "100", "μM", "guanosine", "(", "G", ")", "for", "24", "h", ".", "Total", "cell", "lysates", "were", "analyzed", "by", "western", "blotting", "using", "the", "antibodies", "for", "p53", "and", "Tubulin", ".", "Note", "the", "elevated", "levels", "of", "endogenous", "p53", "protein", "(", "upper", "arrow", ")", "in", "p53DD", "(", "lower", "arrow", ")", "-", "expressing", "cells", ".", "(", "E", ")", "Cells", "were", "incubated", "with", "MPA", "at", "the", "indicated", "concentration", "with", "/", "without", "100", "μM", "guanosine", "for", "72", "hours", "then", "measured", "with", "WST", "-", "1", "in", "three", "technical", "replicates", ".", "(", "F", ")", "Mouse", "bone", "marrow", "c", "-", "Kit", "+", "cells", "derived", "from", "Trp53", "-", "/", "-", "mice", "were", "transduced", "with", "MLL", "-", "AF9", "-", "GFP", "and", "were", "transplanted", "into", "mice", "to", "generate", "p53", "-", "deficient", "(", "p53", "-", "/", "-", ")", "leukemia", "cells", ".", "GFP", "+", "MLL", "-", "AF9", "leukemia", "cells", "were", "collected", "from", "bone", "marrows", "of", "vehicle", "-", "or", "FF", "-", "10501", "-", "01", "-", "treated", "wild", "-", "type", "and", "p53", "-", "/", "-", "leukemic", "mice", ".", "Expression", "levels", "of", "p53", "and", "Tubulin", "were", "assessed", "by", "western", "blotting", "24", "hours", "after", "the", "treatment", ".", "(", "H", ")", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "curves", "of", "p53", "-", "/", "-", "MLL", "-", "AF9", "leukemia", "mice", "treated", "with", "vehicle", "or", "FF", "-", "10501", "-", "01or", "DS", "-", "5272", "(", "n", " ", "=", " ", "6", "per", "group", ")", ".", "Statistical", "significance", "was", "evaluated", "by", "the", "log", "-", "rank", "test", "(", "left", ")", ".", "Frequency", "of", "GFP", "+", "leukemia", "cells", "in", "peripheral", "blood", "at", "day", "19", "(", "right", ",", "n", " ", "=", " ", "6", "per", "group", ")", ".", "A", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "the", "comparison", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "are", "shown", "as", "mean", " ", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Immunoblotting of the cord blood cells and those expressing RUNX1-ETO or MLL-AF9. The cells were incubated with/without 1 μM MPA (M) and 100 μM Guanosine (G) for 24 h.(B) CB-MLL-AF9#2 cells were transduced with a Non-targeting (NT) control and an shRNA targeting p21 (sh-p21). Cells were incubated with/without 1 μM MPA (M) and 100 μM guanosine (G) for 24 hours. Total cell lysates were analyzed by western blotting using the antibodies for p21 and Tubulin.(C) CB-MLL-AF9#2 cells transduced with NT or sh-p21 shRNAs were incubated with MPA at the indicated concentration for 72 hours. Cell viability assays were performed using WST-1 in three technical replicates.(D) CB-MLL-AF9#2 cells were transduced by vector control or p53DD (dominant-negative) and were incubated with/without 1 μM MPA (M) and 100 μM guanosine (G) for 24 h. Total cell lysates were analyzed by western blotting using the antibodies for p53 and Tubulin. Note the elevated levels of endogenous p53 protein (upper arrow) in p53DD (lower arrow)-expressing cells.(E) Cells were incubated with MPA at the indicated concentration with/without 100 μM guanosine for 72 hours then measured with WST-1 in three technical replicates.(F) Mouse bone marrow c-Kit+ cells derived from Trp53-/- mice were transduced with MLL-AF9-GFP and were transplanted into mice to generate p53-deficient (p53-/-) leukemia cells. GFP+ MLL-AF9 leukemia cells were collected from bone marrows of vehicle- or FF-10501-01-treated wild-type and p53-/- leukemic mice. Expression levels of p53 and Tubulin were assessed by western blotting 24 hours after the treatment.(H) Kaplan-Meier survival curves of p53-/- MLL-AF9 leukemia mice treated with vehicle or FF-10501-01or DS-5272 (n = 6 per group). Statistical significance was evaluated by the log-rank test (left). Frequency of GFP+ leukemia cells in peripheral blood at day 19 (right, n = 6 per group). A two-tailed unpaired t-test was used for the comparison. Data information: All data are shown as mean ± SEM."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "B", ")", "The", "TLR", "-", "expressing", "BaκB", "cells", "were", "stimulated", "with", "the", "corresponding", "TLR", "ligands", "(", "100", "ng", "/", "mL", "Pam3CSK4", "for", "TLR2", ",", "100", "ng", "/", "mL", "LPS", "for", "TLR4", ",", "10", "ng", "/", "mL", "Flagellin", "for", "TLR5", ",", "100", "ng", "/", "ml", "R848", "for", "TLR7", ")", "with", "titrating", "doses", "of", "MPA", "(", "1", "-", "10", "μM", ")", ".", "GFP", "expression", "was", "assessed", "24", "hours", "after", "the", "stimulation", ".", "(", "C", ")", "293T", "cells", "were", "transfected", "with", "FLAG", "-", "tagged", "TRAF6", "and", "HA", "-", "tagged", "K63", "-", "ubiquitin", ".", "After", "24", "hours", ",", "these", "cells", "were", "treated", "with", "3", "or", "10", "μM", "MPA", "(", "M", "-", "3", "μM", "or", "M", "-", "10", "μM", ")", "with", "/", "without", "100", "μM", "guanosine", "(", "G", ")", ".", "IRAK1", "/", "4", "inhibitor", "(", "IRAK1", "/", "4", "i", ")", "was", "also", "used", "as", "a", "control", ".", "Whole", "-", "cell", "extracts", "were", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "FLAG", "antibody", ",", "and", "ubiquitinated", "TRAF6", "was", "detected", "with", "anti", "-", "HA", "antibody", ".", "(", "D", ",", "Murine", "bone", "marrow", "-", "derived", "macrophages", "(", "BMDMs", ")", "were", "treated", "with", "vehicle", ",", "10", "μM", "MPA", "alone", "(", "D", ")", "N", "=", "3", "(", "technical", "replicates", ")", "per", "group", ".", "mRNA", "levels", "of", "TNF", "-", "α", "and", "IL", "-", "1β", "were", "measured", "by", "qPCR", ".", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "tests", "were", "used", "for", "the", "comparison", "in", "(", "D", ")", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "are", "shown", "as", "mean", " ", "±", "SEM", ".", "E", ")", "Murine", "bone", "marrow", "-", "derived", "macrophages", "(", "BMDMs", ")", "were", "treated", "with", "vehicle", ",", "10", "μM", "MPA", "alone", "or", "co", "-", "treated", "with", "vehicle", ",", "10", "μM", "MPA", "(", "M", ")", ",", "100", "ng", "/", "mL", "Pam3CSK4", "and", "100", "μM", "Guanosine", "(", "G", ")", "for", "4", "hours", "(", "E", ")", ",", "as", "indicated", ".", "N", "=", "3", "(", "technical", "replicates", ")", "per", "group", ".", "mRNA", "levels", "of", "TNF", "-", "α", "and", "IL", "-", "1β", "were", "measured", "by", "qPCR", ".", "Ordinary", "one", "-", "way", "ANOVA", "was", "used", "for", "the", "comparison", "in", "(", "E", ")", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "are", "shown", "as", "mean", " ", "±", "SEM", ".", "(", "F", ")", "THP1", "cells", "were", "pretreated", "with", "10", "μM", "MPA", "for", "2", "hours", "and", "then", "treated", "with", "1000", "ng", "/", "mL", "Pam3CSK4", "for", "0", ",", "30", ",", "60", ",", "and", "(", "120", ")", "minutes", ".", "Cells", "were", "lysed", "and", "subjected", "to", "SDS", "-", "PAGE", ".", "Levels", "of", "total", "IκBα", ",", "phosphate", "-", "p38", ",", "total", "p38", ",", "and", "GAPDH", "were", "evaluated", "by", "western", "blotting", ".", "(", "G", ")", "MLL", "-", "AF9", "-", "expressing", "CB", "cells", "(", "CB", "-", "MLL", "-", "AF9", "#", "1", ")", "were", "pretreated", "with", "10", "μM", "MPA", "for", "2", "hours", "and", "then", "treated", "with", "1000", "ng", "/", "mL", "Pam3CSK4", "for", "0", ",", "30", ",", "60", "Cells", "were", "lysed", "and", "subjected", "to", "SDS", "-", "PAGE", ".", "Levels", "of", "total", "IκBα", ",", "phosphate", "-", "p38", ",", "total", "p38", "were", "evaluated", "by", "western", "blotting", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(B) The TLR-expressing BaκB cells were stimulated with the corresponding TLR ligands (100 ng/mL Pam3CSK4 for TLR2, 100 ng/mL LPS for TLR4, 10 ng/mL Flagellin for TLR5, 100 ng/ml R848 for TLR7) with titrating doses of MPA (1 - 10 μM). GFP expression was assessed 24 hours after the stimulation.(C) 293T cells were transfected with FLAG-tagged TRAF6 and HA-tagged K63-ubiquitin. After 24 hours, these cells were treated with 3 or 10 μM MPA (M-3 μM or M-10 μM) with/without 100 μM guanosine (G). IRAK1/4 inhibitor (IRAK1/4 i) was also used as a control. Whole-cell extracts were immunoprecipitated with anti-FLAG antibody, and ubiquitinated TRAF6 was detected with anti-HA antibody.(D, Murine bone marrow-derived macrophages (BMDMs) were treated with vehicle, 10 μM MPA alone (D) N=3 (technical replicates) per group. mRNA levels of TNF-α and IL-1β were measured by qPCR. Two-tailed unpaired t-tests were used for the comparison in (D). Data information: All data are shown as mean ± SEM.E) Murine bone marrow-derived macrophages (BMDMs) were treated with vehicle, 10 μM MPA alone or co-treated with vehicle, 10 μM MPA (M), 100 ng/mL Pam3CSK4 and 100 μM Guanosine (G) for 4 hours (E), as indicated. N=3 (technical replicates) per group. mRNA levels of TNF-α and IL-1β were measured by qPCR. Ordinary one-way ANOVA was used for the comparison in (E). Data information: All data are shown as mean ± SEM.(F) THP1 cells were pretreated with 10 μM MPA for 2 hours and then treated with 1000 ng/mL Pam3CSK4 for 0, 30, 60, and (120) minutes. Cells were lysed and subjected to SDS-PAGE. Levels of total IκBα, phosphate-p38, total p38, and GAPDH were evaluated by western blotting.(G) MLL-AF9-expressing CB cells (CB-MLL-AF9#1) were pretreated with 10 μM MPA for 2 hours and then treated with 1000 ng/mL Pam3CSK4 for 0, 30, 60 Cells were lysed and subjected to SDS-PAGE. Levels of total IκBα, phosphate-p38, total p38 were evaluated by western blotting."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "SDS", "-", "PAGE", "analysis", "of", "purified", "T4SS3", "-", "10", "+", "D4", "complex", ".", "Left", "panel", ":", "Coomassie", "-", "stained", "SDS", "-", "PAGE", "gel", "of", "the", "T4SS3", "-", "10", "+", "D4", "complex", ".", "Right", "panel", ":", "Sypro", "Ruby", "-", "stained", "SDS", "-", "PAGE", "gel", "of", "the", "T4SS3", "-", "10m", "and", "T4SS3", "-", "10", "+", "D4", "complexes", ".", "Molecular", "weights", "of", "MW", "markers", "are", "shown", "on", "the", "left", ".", "Identification", "of", "bands", "is", "shown", "in", "the", "middle", ".", "\"", "*", "\"", "indicates", "TrwK", "/", "VirB4", "degradation", "products", ".", "\"", "*", "*", "\"", "indicates", "minor", "contaminants", "OmpA", "and", "OmpC", ".", "B", ".", "Stoichiometry", "measurement", ".", "Fluorescence", "scan", "of", "an", "SDS", "-", "PAGE", "gel", "analysis", "of", "the", "T4SS3", "-", "10", "+", "D4", "complex", "where", "cysteine", "residues", "were", "reacted", "with", "AlexaFluor", "633", "C5", "maleimide", ".", "Signals", "corresponding", "to", "the", "proteins", "coupled", "to", "AlexaFluor", "633", "were", "detected", "at", "a", "wavelength", "of", "633", "nm", ".", "Fluorescent", "Trw", "protein", "bands", "are", "labelled", "and", "the", "derived", "stoichiometry", "for", "TrwB", "/", "VirD4", "is", "indicated", ".", "C", ".", "SDS", "-", "PAGE", "analysis", "of", "complexes", "purified", "from", "cell", "expressing", "deletion", "mutants", "of", "the", "pBADM11", "_", "trwN", "/", "virB1", "-", "trwE", "/", "virB10Strep", "_", "trwD", "/", "virB11", "_", "HistrwB", "/", "virD4", "constructs", "termed", "pBADM11", "_", "ΔtrwX", "/", "ΔvirBY", "(", "see", "main", "text", ")", ".", "The", "same", "molecular", "weights", "marker", "has", "been", "used", "on", "this", "gel", "as", "in", "the", "gel", "presented", "in", "Figure", "1A", ".", "*", "indicates", "degradation", "products", "of", "TrwK", "/", "VirB4", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. SDS-PAGE analysis of purified T4SS3-10+D4 complex. Left panel: Coomassie-stained SDS-PAGE gel of the T4SS3-10+D4 complex. Right panel: Sypro Ruby-stained SDS-PAGE gel of the T4SS3-10m and T4SS3-10+D4 complexes. Molecular weights of MW markers are shown on the left. Identification of bands is shown in the middle. \"*\" indicates TrwK/VirB4 degradation products. \"**\" indicates minor contaminants OmpA and OmpC.B. Stoichiometry measurement. Fluorescence scan of an SDS-PAGE gel analysis of the T4SS3-10+D4 complex where cysteine residues were reacted with AlexaFluor 633 C5 maleimide. Signals corresponding to the proteins coupled to AlexaFluor 633 were detected at a wavelength of 633 nm. Fluorescent Trw protein bands are labelled and the derived stoichiometry for TrwB/VirD4 is indicated.C. SDS-PAGE analysis of complexes purified from cell expressing deletion mutants of the pBADM11_trwN/virB1-trwE/virB10Strep_trwD/virB11_HistrwB/virD4 constructs termed pBADM11_ΔtrwX/ΔvirBY (see main text). The same molecular weights marker has been used on this gel as in the gel presented in Figure 1A. * indicates degradation products of TrwK/VirB4."}
{"words": ["Figure", "2Figure", "2", ".", "Interaction", "between", "TrwB", "/", "VirD4", "and", "TrwE", "/", "VirB10", ".", "Left", "panel", ":", "Coomassie", "-", "stained", "SDS", "-", "PAGE", "gel", "of", "the", "T4SS3", "-", "10", "+", "D4", "complex", "(", "lane", "1", ")", ",", "T4SS3", "-", "10", "+", "D4", ":", "TrwEΔN42", "complex", "(", "lane", "2", ")", "and", "T4SS3", "-", "10", "+", "D4", ":", "TrwEΔN64", "complex", "(", "lane", "3", ")", ".", "Middle", "panel", ":", "Western", "Blot", "analysis", "using", "αStrep", "antibodies", "to", "detect", "the", "TrwE", "/", "VirB10", "protein", "within", "the", "T4SS3", "-", "10", "+", "D4", "complex", "and", "its", "variants", ".", "Right", "panel", ":", "Western", "Blot", "analysis", "using", "αHis", "antibodies", "to", "detect", "the", "TrwB", "/", "VirD4", "protein", "within", "the", "T4SS3", "-", "10", "+", "D4", "complex", "and", "its", "variants", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Figure 2. Interaction between TrwB/VirD4 and TrwE/VirB10. Left panel: Coomassie-stained SDS-PAGE gel of the T4SS3-10+D4 complex (lane 1), T4SS3-10+D4:TrwEΔN42 complex (lane 2) and T4SS3-10+D4:TrwEΔN64 complex (lane 3). Middle panel: Western Blot analysis using αStrep antibodies to detect the TrwE/VirB10 protein within the T4SS3-10+D4 complex and its variants. Right panel: Western Blot analysis using αHis antibodies to detect the TrwB/VirD4 protein within the T4SS3-10+D4 complex and its variants."}
{"words": ["Figure", "3", "A", ".", "NS", "-", "EM", "micrograph", "of", "the", "T4SS3", "-", "10", "+", "D4", "complex", ".", "A", "few", "representative", "particles", "of", "the", "T4SS3", "-", "10", "+", "D4", "complex", "are", "circled", "in", "yellow", ".", "Scale", "bar", "50nm", ".", "B", ".", "Representative", "class", "averages", "of", "T4SS3", "-", "10", "+", "D4", "complex", "obtained", "after", "initial", "alignment", "and", "classification", ".", "C", ".", "The", "upper", "row", "represents", "typical", "class", "averages", "of", "the", "T4SS3", "-", "10", "+", "D4", "IMC", "complex", "(", "i", ".", "e", ".", "with", "the", "outer", "membrane", "core", "complex", "(", "OMC", ")", "masked", "out", ")", ".", "The", "second", "row", "shows", "projections", "of", "the", "T4SS3", "-", "10", "+", "D4", "IMC", "complex", "in", "the", "same", "directions", "determined", "for", "the", "classes", "above", ".", "The", "third", "row", "displays", "projections", "of", "the", "T4SS3", "-", "10", "IMC", "complex", "(", "EMD", "-", "2567", ")", "in", "the", "same", "directions", ".", "The", "bottom", "row", "shows", "the", "differences", "between", "the", "projections", "above", "(", "plus", "or", "minus", "TrwB", "/", "VirD4", ")", "corresponding", "to", "positions", "of", "the", "TrwB", "/", "VirD4", "protein", ".", "D", ".", "FSC", "of", "the", "electron", "density", "map", "of", "the", "T4SS3", "-", "10", "+", "D4", "complex", ".", "The", "0", ".", "5", "line", "crosses", "the", "FSC", "at", "a", "resolution", "of", "28", "Å", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3 A. NS-EM micrograph of the T4SS3-10+D4 complex. A few representative particles of the T4SS3-10+D4 complex are circled in yellow. Scale bar 50nm. B. Representative class averages of T4SS3-10+D4 complex obtained after initial alignment and classification. C. The upper row represents typical class averages of the T4SS3-10+D4 IMC complex (i.e. with the outer membrane core complex (OMC) masked out). The second row shows projections of the T4SS3-10+D4 IMC complex in the same directions determined for the classes above. The third row displays projections of the T4SS3-10 IMC complex (EMD-2567) in the same directions. The bottom row shows the differences between the projections above (plus or minus TrwB/VirD4) corresponding to positions of the TrwB/VirD4 protein.D. FSC of the electron density map of the T4SS3-10+D4 complex. The 0.5 line crosses the FSC at a resolution of 28 Å."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "Side", "views", "of", "the", "NS", "-", "EM", "structure", "of", "the", "T4SS3", "-", "10", "(", "left", ")", "and", "T4SS3", "-", "10", "+", "D4", "(", "right", ")", "complexes", ".", "The", "arches", ",", "the", "TrwK", "/", "VirB4", "barrels", ",", "and", "the", "TrwB", "/", "VirD4", "density", "are", "shown", "in", "green", ",", "yellow", ",", "and", "blue", ",", "respectively", ".", "The", "boundaries", "of", "the", "3", "-", "tiers", "structure", "of", "the", "TrwK", "/", "VirB4", "barrel", "are", "indicated", "in", "the", "middle", "of", "the", "panels", "and", "each", "tier", "is", "labelled", "as", "lower", ",", "middle", ",", "and", "upper", ",", "respectively", ".", "B", ".", "Side", "view", "of", "the", "T4SS3", "-", "10", "+", "D4", "structure", "(", "upper", "panel", ")", "and", "derived", "schematic", "representation", "(", "lower", "panel", ")", ".", "Overall", "dimensions", "are", "indicated", "C", ".", "Same", "as", "in", "B", "except", "that", "the", "side", "-", "view", "shown", "is", "rotated", "90", "degrees", "along", "a", "vertical", "axis", "compared", "to", "the", "view", "shown", "in", "panel", "B", ".", "Overall", "dimension", "is", "indicated", ".", "D", ".", "Bottom", "view", "of", "the", "NS", "-", "EM", "structure", "of", "the", "T4SS3", "-", "10", "(", "upper", "panel", ")", "and", "the", "corresponding", "schematic", "representation", "(", "lower", "panel", ")", ".", "Angle", "between", "the", "axes", "connecting", "the", "TrwK", "/", "VirB4", "hexamer", "pair", "and", "the", "TrwB", "/", "VirD4", "dimer", "pair", "is", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. Side views of the NS-EM structure of the T4SS3-10 (left) and T4SS3-10+D4 (right) complexes. The arches, the TrwK/VirB4 barrels, and the TrwB/VirD4 density are shown in green, yellow, and blue, respectively. The boundaries of the 3-tiers structure of the TrwK/VirB4 barrel are indicated in the middle of the panels and each tier is labelled as lower, middle, and upper, respectively. B. Side view of the T4SS3-10+D4 structure (upper panel) and derived schematic representation (lower panel). Overall dimensions are indicated C. Same as in B except that the side-view shown is rotated 90 degrees along a vertical axis compared to the view shown in panel B. Overall dimension is indicated. D. Bottom view of the NS-EM structure of the T4SS3-10 (upper panel) and the corresponding schematic representation (lower panel). Angle between the axes connecting the TrwK/VirB4 hexamer pair and the TrwB/VirD4 dimer pair is shown. "}
{"words": ["Figure", "5B", ".", "Class", "averages", "of", "antibody", "-", "bound", "T4SS3", "-", "10", "+", "D4FLAG", ".", "Class", "averages", "of", "the", "aligned", "NS", "-", "EM", "images", "of", "the", "T4SS3", "-", "10", "+", "D4FLAG", "with", "3", "-", "4", "particles", "per", "class", ".", "Red", "circles", "indicate", "the", "position", "of", "the", "antibody", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5B. Class averages of antibody-bound T4SS3-10+D4FLAG. Class averages of the aligned NS-EM images of the T4SS3-10+D4FLAG with 3-4 particles per class. Red circles indicate the position of the antibody."}
{"words": ["Figure", "1A", ",", "B", "Tumor", "growth", "curve", "(", "left", ")", "and", "summary", "of", "end", "-", "point", "tumor", "masses", "(", "right", ")", "of", "6", "-", "8", "week", "-", "old", "wildtype", "(", "WT", ")", "and", "Peli1", "-", "KO", "(", "KO", ")", "mice", "inoculated", "s", ".", "c", ".", "with", "B16F10", "(", "A", ";", "WT", ",", "n", "=", "7", ";", "KO", ",", "n", "=", "6", ")", "or", "E", ".", "G7", "(", "B", ";", "WT", ",", "n", "=", "5", ";", "KO", ",", "n", "=", "5", ")", "tumor", "cells", ".", "C", ",", "D", "Flow", "cytometry", "analysis", "of", "CD4", "+", "and", "CD8", "+", "T", "cells", "in", "CD45", ".", "2", "+", "TILs", "and", "dLN", "cells", "from", "B16F10", "tumor", "-", "bearing", "wildtype", "and", "Peli1", "-", "KO", "mice", ",", "presented", "as", "a", "representative", "plot", "(", "C", ")", "and", "summary", "graph", "based", "on", "multiple", "mice", "(", "D", ";", "WT", ",", "n", "=", "6", ";", "KO", ",", "n", "=", "6", ")", ".", "E", ",", "F", "Flow", "cytometry", "analysis", "of", "IFNγ", "-", "producing", "CD4", "+", "and", "CD8", "+", "T", "cells", "in", "TILs", ",", "and", "dLN", "cells", "of", "B16F10", "tumor", "-", "bearing", "(", "day", "19", ")", "wildtype", "and", "Peli1", "-", "KO", "mice", ",", "presented", "as", "a", "representative", "plot", "(", "E", ")", "and", "summary", "graph", "(", "F", ")", ".", "(", "WT", ",", "n", "=", "6", ";", "KO", ",", "n", "=", "6", ")", "G", ",", "H", "Flow", "cytometry", "analysis", "of", "IFNγ", "+", "CD8", "+", "T", "cells", "in", "TILs", "of", "E", ".", "G7", "tumor", "-", "bearing", "(", "day", "24", ")", "wildtype", "and", "Peli1", "-", "KO", "mice", ",", "presented", "as", "a", "representative", "plot", "(", "G", ")", "and", "summary", "graph", "(", "H", ")", ".", "(", "WT", ",", "n", "=", "3", ";", "KO", ",", "n", "=", "3", ")"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A,B Tumor growth curve (left) and summary of end-point tumor masses (right) of 6-8 week-old wildtype (WT) and Peli1-KO (KO) mice inoculated s.c. with B16F10 (A; WT, n=7; KO, n=6) or E.G7 (B; WT, n=5; KO, n=5) tumor cells.C,D Flow cytometry analysis of CD4+ and CD8+ T cells in CD45.2+ TILs and dLN cells from B16F10 tumor-bearing wildtype and Peli1-KO mice, presented as a representative plot (C) and summary graph based on multiple mice (D; WT, n=6; KO, n=6).E,F Flow cytometry analysis of IFNγ-producing CD4+ and CD8+ T cells in TILs, and dLN cells of B16F10 tumor-bearing (day 19) wildtype and Peli1-KO mice, presented as a representative plot (E) and summary graph (F). (WT, n=6; KO, n=6)G,H Flow cytometry analysis of IFNγ+CD8+ T cells in TILs of E.G7 tumor-bearing (day 24) wildtype and Peli1-KO mice, presented as a representative plot (G) and summary graph (H). (WT, n=3; KO, n=3)"}
{"words": ["Figure", "2A", ",", "B", "Tumor", "growth", "curve", "(", "left", ")", "and", "summary", "graph", "of", "end", "-", "point", "tumor", "masses", "(", "right", ")", "of", "wildtype", "(", "WT", ")", "and", "Peli1", "-", "TKO", "(", "TKO", ")", "mice", "inoculated", "s", ".", "c", ".", "with", "B16", "-", "OVA", "(", "A", ";", "WT", ",", "n", "=", "5", ";", "KO", ",", "n", "=", "5", ")", "or", "E", ".", "G7", "(", "B", ";", "WT", ",", "n", "=", "6", ";", "KO", ",", "n", "=", "4", ")", "tumor", "cells", ".", "C", "Flow", "cytometry", "analysis", "of", "IFNγ", "-", "producing", "CD4", "+", "and", "CD8", "+", "T", "cells", "in", "TILs", "and", "dLN", "cells", "from", "B16OVA", "tumor", "-", "bearing", "wildtype", "and", "Peli1", "-", "TKO", "mice", ",", "presented", "as", "a", "representative", "plot", "(", "upper", ")", "and", "summary", "graph", "(", "lower", ")", ".", "(", "WT", ",", "n", "=", "5", ";", "KO", ",", "n", "=", "5", ")", "D", "Flow", "cytometry", "analysis", "of", "GZMB", "+", "CD8", "+", "T", "cells", "in", "TILs", "from", "B16", "-", "OVA", "tumor", "-", "bearing", "wildtype", "and", "Peli1", "-", "TKO", "mice", ",", "presented", "as", "a", "representative", "plot", "(", "upper", ")", "and", "summary", "graph", "(", "lower", ")", ".", "(", "WT", ",", "n", "=", "5", ";", "KO", ",", "n", "=", "5", ")", "E", "Tumor", "growth", "curve", "(", "left", ")", "and", "summary", "graph", "of", "end", "-", "point", "tumor", "masses", "(", "right", ")", "of", "B16", "-", "OVA", "tumor", "-", "bearing", "wildtype", "and", "the", "indicated", "Peli1", "conditional", "KO", "mice", ".", "(", "Treg", "KO", "model", ":", "WT", ",", "n", "=", "5", ";", "Treg", "KO", ",", "n", "=", "6", ";", "MKO", "model", ":", "WT", ",", "n", "=", "3", ";", "MKO", ",", "n", "=", "5", ";", "BKO", "model", ":", "WT", ",", "n", "=", "9", ";", "BKO", ",", "n", "=", "9", ")"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A,B Tumor growth curve (left) and summary graph of end-point tumor masses (right) of wildtype (WT) and Peli1-TKO (TKO) mice inoculated s.c. with B16-OVA (A; WT, n=5; KO, n=5) or E.G7 (B; WT, n=6; KO, n=4) tumor cells.C Flow cytometry analysis of IFNγ-producing CD4+ and CD8+ T cells in TILs and dLN cells from B16OVA tumor-bearing wildtype and Peli1-TKO mice, presented as a representative plot (upper) and summary graph (lower). (WT, n=5; KO, n=5)D Flow cytometry analysis of GZMB+CD8+ T cells in TILs from B16-OVA tumor-bearing wildtype and Peli1-TKO mice, presented as a representative plot (upper) and summary graph (lower). (WT, n=5; KO, n=5)E Tumor growth curve (left) and summary graph of end-point tumor masses (right) of B16-OVA tumor-bearing wildtype and the indicated Peli1 conditional KO mice. (Treg KO model: WT, n=5; Treg KO, n=6; MKO model: WT, n=3; MKO, n=5; BKO model: WT, n=9; BKO, n=9)"}
{"words": ["Figure", "3A", ",", "B", "Seahorse", "analysis", "of", "basal", "(", "glucose", "injection", ")", "and", "maximal", "(", "oligomycin", "injection", ")", "ECAR", "or", "basal", "(", "no", "treatment", ")", "and", "maximal", "(", "FCCP", "injection", ")", "OCR", "in", "WT", "and", "Peli1", "-", "KO", "OT", "-", "I", "CD8", "T", "cells", "that", "were", "either", "untreated", "(", "naïve", ")", "or", "activated", "with", "plate", "-", "bound", "anti", "-", "CD3", "(", "1", " ", "μg", "/", "ml", ")", "plus", "anti", "-", "CD28", "(", "1", " ", "μg", "/", "ml", ")", "for", "16", " ", "h", ".", "Data", "are", "presented", "as", "a", "representative", "plot", "(", "A", ")", "or", "summary", "graph", "based", "on", "6", "wildtype", "and", "6", "KO", "mice", "(", "B", ")", ".", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "the", "indicated", "genes", "using", "RNAs", "isolated", "from", "wildtype", "or", "Peli1", "-", "KO", "OT", "-", "I", "CD8", "T", "cells", "stimulated", "with", "anti", "-", "CD3", "and", "anti", "-", "CD28", "for", "6", "h", ".", "D", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "the", "indicated", "genes", "using", "RNAs", "isolated", "from", "wildtype", "or", "Peli1", "-", "KO", "OT", "-", "I", "CD8", "T", "cells", "stimulated", "with", "anti", "-", "CD3", "and", "anti", "-", "CD28", "for", "6", "h", ".", "E", "Immunoblot", "analysis", "of", "HK2", "and", "Glut1", "in", "wildtype", "or", "Peli1", "-", "KO", "OT", "-", "I", "CD8", "T", "cells", "that", "were", "stimulated", "with", "plate", "-", "bound", "anti", "-", "CD3", "and", "anti", "-", "CD28", "for", "24", " ", "h", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A,B Seahorse analysis of basal (glucose injection) and maximal (oligomycin injection) ECAR or basal (no treatment) and maximal (FCCP injection) OCR in WT and Peli1-KO OT-I CD8 T cells that were either untreated (naïve) or activated with plate-bound anti-CD3 (1 μg/ml) plus anti-CD28 (1 μg/ml) for 16 h. Data are presented as a representative plot (A) or summary graph based on 6 wildtype and 6 KO mice (B).qRT-PCR analysis of the indicated genes using RNAs isolated from wildtype or Peli1-KO OT-I CD8 T cells stimulated with anti-CD3 and anti-CD28 for 6 h.D qRT-PCR analysis of the indicated genes using RNAs isolated from wildtype or Peli1-KO OT-I CD8 T cells stimulated with anti-CD3 and anti-CD28 for 6 h.E Immunoblot analysis of HK2 and Glut1 in wildtype or Peli1-KO OT-I CD8 T cells that were stimulated with plate-bound anti-CD3 and anti-CD28 for 24 h."}
{"words": ["Figure", "4A", "Immunoblot", "analysis", "of", "the", "indicated", "phosphorylated", "(", "p", "-", ")", "and", "total", "proteins", "in", "whole", "-", "cell", "lysates", "of", "freshly", "isolated", "CD8", "T", "cells", "from", "wildtype", "(", "WT", ")", "or", "Peli1", "KO", "(", "KO", ")", "mice", "(", "6", " ", "weeks", "old", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "a", "representative", "blot", "(", "left", ")", "and", "summary", "graphs", "of", "densitometric", "quantifications", "of", "the", "indicated", "proteins", "(", "presented", "as", "phosphorylated", "/", "total", "protein", "ratio", ")", "based", "on", "three", "independent", "experiments", ".", "B", ",", "C", "Immunoblot", "analysis", "of", "the", "indicated", "phosphorylated", "(", "p", "-", ")", "and", "total", "proteins", "in", "whole", "-", "cell", "lysates", "of", "wildtype", "or", "Peli1", "-", "KO", "OT", "-", "I", "CD8", "T", "cells", "that", "were", "first", "rested", "on", "ice", "for", "15", "min", "and", "then", "stimulated", "in", "low", "-", "serum", "(", "1", "%", "FBS", ")", "medium", "with", "anti", "-", "CD3", "and", "anti", "-", "CD28", "for", "the", "indicated", "time", "periods", ".", "D", ",", "E", "Seahorse", "analysis", "of", "basal", "and", "maximal", "ECAR", "(", "D", ")", "or", "OCR", "(", "E", ")", "using", "wildtype", "or", "Peli1", "-", "KO", "OT", "-", "I", "CD8", "T", "cells", "that", "were", "activated", "for", "16", "h", "with", "plate", "-", "bound", "anti", "-", "CD3", "(", "1", " ", "μg", "/", "ml", ")", "plus", "anti", "-", "CD28", "(", "1", " ", "μg", "/", "ml", ")", "in", "the", "presence", "of", "solvent", "control", "(", "DMSO", ")", ",", "rapamycin", "(", "Rapa", ",", "10", "nM", ")", ",", "or", "Torin", "1", "(", "100", "nM", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "a", "representative", "plot", "(", "left", ")", "and", "summary", "graphs", "(", "right", ")", ".", "F", ",", "G", "Immunoblot", "analysis", "of", "the", "indicated", "phosphorylated", "(", "p", "-", ")", "and", "total", "proteins", "in", "whole", "-", "cell", "lysates", "of", "wildtype", "or", "Peli1", "-", "KO", "OT", "-", "I", "CD8", "T", "cells", "that", "were", "either", "not", "treated", "(", "-", ")", "or", "stimulated", "(", "+", ")", "for", "1", "h", "(", "F", ")", "or", "24", "h", "(", "G", ")", "with", "anti", "-", "CD3", "(", "1", " ", "μg", "/", "ml", ")", "and", "anti", "-", "CD28", "(", "1", " ", "μg", "/", "ml", ")", "in", "the", "presence", "(", "+", ")", "or", "absence", "(", "-", ")", "of", "rapamycin", "(", "10", "nM", ")", "and", "Torin", "1", "(", "100", "nM", ")", ".", "H", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "Ifng", "gene", "expression", "in", "naïve", "wildtype", "or", "Peli1", "-", "KO", "OT", "-", "I", "CD8", "T", "cells", "that", "were", "either", "not", "treated", "(", "-", ")", "or", "stimulated", "for", "6", "h", "(", "+", ")", "with", "anti", "-", "CD3", "plus", "anti", "-", "CD28", "in", "the", "presence", "(", "+", ")", "or", "absence", "(", "-", ")", "or", "rapamycin", ".", "I", "-", "K", "Schematic", "of", "experimental", "design", "(", "I", ")", ",", "tumor", "growth", "curve", "(", "J", ")", ",", "and", "summary", "of", "day", "15", "tumor", "weight", "(", "K", ")", "of", "B6", ".", "SJL", "mice", "inoculated", "with", "B16", "-", "OVA", "melanoma", "cells", "(", "2", "x", "105", ")", "and", "adoptively", "transferred", "on", "day", "7", "with", "in", "vitro", "activated", "and", "rapamycin", "-", "or", "DMSO", "-", "treated", "wildtype", "or", "Peli1", "-", "KO", "OT", "-", "I", "CD8", "T", "cells", "(", "4", "x", "105", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A Immunoblot analysis of the indicated phosphorylated (p-) and total proteins in whole-cell lysates of freshly isolated CD8 T cells from wildtype (WT) or Peli1 KO (KO) mice (6 weeks old). Data are presented as a representative blot (left) and summary graphs of densitometric quantifications of the indicated proteins (presented as phosphorylated/total protein ratio) based on three independent experiments.B,C Immunoblot analysis of the indicated phosphorylated (p-) and total proteins in whole-cell lysates of wildtype or Peli1-KO OT-I CD8 T cells that were first rested on ice for 15 min and then stimulated in low-serum (1% FBS) medium with anti-CD3 and anti-CD28 for the indicated time periods.D,E Seahorse analysis of basal and maximal ECAR (D) or OCR (E) using wildtype or Peli1-KO OT-I CD8 T cells that were activated for 16 h with plate-bound anti-CD3 (1 μg/ml) plus anti-CD28 (1 μg/ml) in the presence of solvent control (DMSO), rapamycin (Rapa, 10 nM), or Torin 1 (100 nM). Data are presented as a representative plot (left) and summary graphs (right).F,G Immunoblot analysis of the indicated phosphorylated (p-) and total proteins in whole-cell lysates of wildtype or Peli1-KO OT-I CD8 T cells that were either not treated (-) or stimulated (+) for 1 h (F) or 24 h (G) with anti-CD3 (1 μg/ml) and anti-CD28 (1 μg/ml) in the presence (+) or absence (-) of rapamycin (10 nM) and Torin 1 (100 nM).H qRT-PCR analysis of Ifng gene expression in naïve wildtype or Peli1-KO OT-I CD8 T cells that were either not treated (-) or stimulated for 6 h (+) with anti-CD3 plus anti-CD28 in the presence (+) or absence (-) or rapamycin.I-K Schematic of experimental design (I), tumor growth curve (J), and summary of day 15 tumor weight (K) of B6.SJL mice inoculated with B16-OVA melanoma cells (2 x 105) and adoptively transferred on day 7 with in vitro activated and rapamycin- or DMSO-treated wildtype or Peli1-KO OT-I CD8 T cells (4 x 105)."}
{"words": ["Figure", "5Immunoblot", "analysis", "of", "the", "indicated", "phosphorylated", "(", "p", "-", ")", "and", "total", "proteins", "in", "whole", "-", "cell", "lysates", "of", "wildtype", "(", "WT", ")", "or", "Peli1", "-", "KO", "(", "KO", ")", "OT", "-", "I", "CD8", "T", "cells", "that", "were", "activated", "for", "16", " ", "h", "with", "plate", "-", "coated", "anti", "-", "CD3", "(", "1", " ", "μg", "/", "ml", ")", "plus", "anti", "-", "CD28", ",", "starved", "for", "6", "h", "in", "serum", "-", "free", "RPMI", "medium", ",", "and", "then", "treated", "for", "indicated", "time", "periods", "with", "FBS", "(", "10", "%", ")", "(", "A", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "the", "indicated", "phosphorylated", "(", "p", "-", ")", "and", "total", "proteins", "in", "whole", "-", "cell", "lysates", "of", "wildtype", "(", "WT", ")", "or", "Peli1", "-", "KO", "(", "KO", ")", "OT", "-", "I", "CD8", "T", "cells", "that", "were", "activated", "for", "16", " ", "h", "with", "plate", "-", "coated", "anti", "-", "CD3", "(", "1", " ", "μg", "/", "ml", ")", "plus", "anti", "-", "CD28", ",", "starved", "for", "6", "h", "in", "serum", "-", "free", "RPMI", "medium", ",", "and", "then", "treated", "for", "indicated", "time", "periods", "with", "insulin", "(", "B", ")", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "the", "indicated", "phosphorylated", "(", "p", "-", ")", "and", "total", "proteins", "in", "whole", "-", "cell", "lysates", "of", "wildtype", "(", "WT", ")", "or", "Peli1", "-", "KO", "(", "KO", ")", "MEFs", "that", "were", "starved", "for", "16", "h", "in", "serum", "-", "free", "DMEM", "medium", "and", "then", "treated", "for", "the", "indicated", "time", "periods", "with", "FBS", "(", "C", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "the", "indicated", "phosphorylated", "(", "p", "-", ")", "and", "total", "proteins", "in", "whole", "-", "cell", "lysates", "of", "wildtype", "(", "WT", ")", "or", "Peli1", "-", "KO", "(", "KO", ")", "MEFs", "that", "were", "starved", "for", "16", "h", "in", "serum", "-", "free", "DMEM", "medium", "and", "then", "treated", "for", "the", "indicated", "time", "periods", "with", "insulin", "(", "D", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "the", "indicated", "phosphorylated", "(", "p", "-", ")", "and", "total", "proteins", "in", "whole", "-", "cell", "lysates", "of", "wildtype", "(", "WT", ")", "or", "Peli1", "-", "KO", "(", "KO", ")", "MEFs", "that", "were", "starved", "for", "16", "h", "in", "serum", "-", "free", "DMEM", "medium", "and", "then", "treated", "for", "the", "indicated", "time", "periods", "with", "EGF", "(", "E", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Immunoblot analysis of the indicated phosphorylated (p-) and total proteins in whole-cell lysates of wildtype (WT) or Peli1-KO (KO) OT-I CD8 T cells that were activated for 16 h with plate-coated anti-CD3 (1 μg/ml) plus anti-CD28, starved for 6 h in serum-free RPMI medium, and then treated for indicated time periods with FBS (10%) (A)Immunoblot analysis of the indicated phosphorylated (p-) and total proteins in whole-cell lysates of wildtype (WT) or Peli1-KO (KO) OT-I CD8 T cells that were activated for 16 h with plate-coated anti-CD3 (1 μg/ml) plus anti-CD28, starved for 6 h in serum-free RPMI medium, and then treated for indicated time periods with insulin (B).Immunoblot analysis of the indicated phosphorylated (p-) and total proteins in whole-cell lysates of wildtype (WT) or Peli1-KO (KO) MEFs that were starved for 16 h in serum-free DMEM medium and then treated for the indicated time periods with FBS (C)Immunoblot analysis of the indicated phosphorylated (p-) and total proteins in whole-cell lysates of wildtype (WT) or Peli1-KO (KO) MEFs that were starved for 16 h in serum-free DMEM medium and then treated for the indicated time periods with insulin (D)Immunoblot analysis of the indicated phosphorylated (p-) and total proteins in whole-cell lysates of wildtype (WT) or Peli1-KO (KO) MEFs that were starved for 16 h in serum-free DMEM medium and then treated for the indicated time periods with EGF (E)."}
{"words": ["Figure", "6A", "Immunoblot", "analysis", "of", "the", "indicated", "proteins", "in", "whole", "-", "cell", "lysates", "of", "wildtype", "(", "WT", ")", "and", "Peli1", "-", "KO", "(", "KO", ")", "CD8", "T", "cells", "that", "were", "either", "not", "treated", "(", "NT", ")", "or", "activated", "for", "16", " ", "h", "with", "plate", "-", "bound", "anti", "-", "CD3", "and", "anti", "-", "CD28", ".", "Data", "are", "presented", "as", "a", "representative", "blot", "(", "left", "panel", ")", "and", "a", "summary", "graph", "of", "quantified", "TSC1", "(", "middle", "panel", ")", "and", "TSC2", "(", "right", "panel", ")", "protein", "bands", "relative", "to", "the", "level", "of", "α", "-", "Tubulin", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "the", "indicated", "proteins", "in", "whole", "-", "cell", "lysates", "of", "wildtype", "and", "Peli1", "-", "KO", "CD8", "T", "cells", "that", "were", "activated", "for", "1", "h", "with", "anti", "-", "CD3", "and", "anti", "-", "CD28", "and", "then", "treated", "with", "cycloheximide", "(", "CHX", ")", "for", "the", "indicated", "time", "periods", ".", "Data", "are", "presented", "as", "a", "representative", "blot", "(", "B", ")", "a", "summary", "graph", "of", "quantified", "TSC1", "and", "TSC2", "protein", "bands", "presented", "as", "percentage", "of", "the", "level", "in", "untreated", "(", "0", "min", ")", "cells", "(", "C", ")", ".", "D", "Immunoblot", "analysis", "of", "TSC1", "and", "TSC2", "in", "wildtype", "or", "Peli1", "-", "KO", "CD8", "T", "cells", "stimulated", "with", "anti", "-", "CD3", "plus", "anti", "-", "CD28", "for", "1", "h", "and", "then", "incubated", "with", "(", "+", ")", "or", "without", "(", "-", ")", "cycloheximide", "(", "CHX", ")", "and", "/", "or", "MG132", "for", "2", "h", ".", "Data", "are", "presented", "as", "a", "representative", "blot", "(", "left", "panel", ")", "and", "a", "summary", "graph", "of", "quantified", "TSC1", "(", "middle", "panel", ")", "and", "TSC2", "(", "right", "panel", ")", "protein", "bands", "relative", "to", "the", "level", "of", "α", "-", "Tubulin", ".", "Ubiquitination", "analysis", "of", "immunoprecipitated", "TSC2", "(", "E", ")", "from", "activated", "(", "anti", "-", "CD3", "plus", "anti", "-", "CD28", "for", "2", "h", ")", "wildtype", "or", "Peli1", "-", "KO", "CD8", "T", "cells", "by", "immunobloting", "using", "anti", "-", "ubiquitin", "Abs", "detecting", "total", "(", "Ub", ")", ",", "K48", "(", "Ub", "-", "K48", ")", ",", "or", "K63", "(", "Ub", "-", "K63", ")", "polyubiquitin", "chains", ".", "Ubiquitination", "analysis", "of", "immunoprecipitated", "TSC1", "(", "F", ")", "from", "activated", "(", "anti", "-", "CD3", "plus", "anti", "-", "CD28", "for", "2", "h", ")", "wildtype", "or", "Peli1", "-", "KO", "CD8", "T", "cells", "by", "immunobloting", "using", "anti", "-", "ubiquitin", "Abs", "detecting", "total", "(", "Ub", ")", ",", "K48", "(", "Ub", "-", "K48", ")", ",", "or", "K63", "(", "Ub", "-", "K63", ")", "polyubiquitin", "chains", ".", "Analysis", "of", "ubiquitin", "conjugation", "to", "TSC1", "(", "G", ",", "H", ")", "in", "293T", "cells", "transiently", "transfected", "(", "for", "48", "h", ")", "with", "the", "indicated", "expression", "vectors", ".", "Analysis", "of", "ubiquitin", "conjugation", "to", "TSC1", "TSC2", "(", "I", ",", "J", ")", "in", "293T", "cells", "transiently", "transfected", "(", "for", "48", "h", ")", "with", "the", "indicated", "expression", "vectors", ".", "K", "Co", "-", "immunoprecipitaton", "analysis", "of", "TSC1", "-", "TSC2", "interaction", "in", "293T", "cells", "transiently", "transfected", "(", "for", "48", "h", ")", "with", "the", "indicated", "expression", "vectors", ".", "L", "Co", "-", "immunoprecipitation", "analysis", "of", "endogenous", "TSC1", "-", "TSC2", "interaction", "in", "wildtype", "and", "Peli1", "-", "KO", "CD8", "T", "cells", "that", "were", "either", "not", "treated", "(", "NT", ")", "or", "stimulated", "for", "2", "h", "with", "anti", "-", "CD3", "plus", "anti", "-", "CD28", ".", "The", "right", "panel", "is", "a", "summary", "graph", "of", "TSC2", "/", "TSC1", "ratio", "based", "on", "quantification", "of", "the", "blot", "from", "anti", "-", "TSC1", "IP", "(", "the", "right", "four", "lanes", "of", "the", "top", "two", "panels", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A Immunoblot analysis of the indicated proteins in whole-cell lysates of wildtype (WT) and Peli1-KO (KO) CD8 T cells that were either not treated (NT) or activated for 16 h with plate-bound anti-CD3 and anti-CD28. Data are presented as a representative blot (left panel) and a summary graph of quantified TSC1 (middle panel) and TSC2 (right panel) protein bands relative to the level of α-Tubulin.Immunoblot analysis of the indicated proteins in whole-cell lysates of wildtype and Peli1-KO CD8 T cells that were activated for 1 h with anti-CD3 and anti-CD28 and then treated with cycloheximide (CHX) for the indicated time periods. Data are presented as a representative blot (B)a summary graph of quantified TSC1 and TSC2 protein bands presented as percentage of the level in untreated (0 min) cells (C).D Immunoblot analysis of TSC1 and TSC2 in wildtype or Peli1-KO CD8 T cells stimulated with anti-CD3 plus anti-CD28 for 1 h and then incubated with (+) or without (-) cycloheximide (CHX) and/or MG132 for 2 h. Data are presented as a representative blot (left panel) and a summary graph of quantified TSC1 (middle panel) and TSC2 (right panel) protein bands relative to the level of α-Tubulin.Ubiquitination analysis of immunoprecipitated TSC2 (E) from activated (anti-CD3 plus anti-CD28 for 2 h) wildtype or Peli1-KO CD8 T cells by immunobloting using anti-ubiquitin Abs detecting total (Ub), K48 (Ub-K48), or K63 (Ub-K63) polyubiquitin chains.Ubiquitination analysis of immunoprecipitated TSC1 (F) from activated (anti-CD3 plus anti-CD28 for 2 h) wildtype or Peli1-KO CD8 T cells by immunobloting using anti-ubiquitin Abs detecting total (Ub), K48 (Ub-K48), or K63 (Ub-K63) polyubiquitin chains.Analysis of ubiquitin conjugation to TSC1 (G, H) in 293T cells transiently transfected (for 48 h) with the indicated expression vectors.Analysis of ubiquitin conjugation to TSC1 TSC2 (I, J) in 293T cells transiently transfected (for 48 h) with the indicated expression vectors.K Co-immunoprecipitaton analysis of TSC1-TSC2 interaction in 293T cells transiently transfected (for 48 h) with the indicated expression vectors.L Co-immunoprecipitation analysis of endogenous TSC1-TSC2 interaction in wildtype and Peli1-KO CD8 T cells that were either not treated (NT) or stimulated for 2 h with anti-CD3 plus anti-CD28. The right panel is a summary graph of TSC2/TSC1 ratio based on quantification of the blot from anti-TSC1 IP (the right four lanes of the top two panels)."}
{"words": ["Figure", "7A", "Analysis", "of", "ubiquitin", "conjugation", "to", "wildtype", "(", "WT", ")", "TSC1", "and", "the", "indicated", "TSC1", "mutants", "in", "293T", "cells", "transiently", "transfected", "Flag", "-", "tagged", "TSC1", "and", "its", "mutants", "along", "with", "(", "+", ")", "or", "without", "(", "-", ")", "the", "indicated", "expression", "vectors", ".", "B", "Immunoblot", "analysis", "of", "the", "indicated", "phosphorylated", "(", "p", "-", ")", "and", "total", "proteins", "in", "lysates", "of", "TSC1", "-", "KO", "MEFs", "transfected", "with", "(", "+", ")", "or", "without", "(", "-", ")", "TSC1", "wildtype", "or", "K30A", "expression", "vectors", ".", "The", "cells", "were", "serum", "starved", "and", "then", "left", "either", "untreated", "(", "NT", ")", "or", "stimulated", "with", "10", "%", "FBS", "for", "30", "mins", ".", "Data", "are", "presented", "as", "a", "representative", "blot", "(", "left", "panel", ")", "and", "a", "summary", "graph", "of", "quantified", "TSC2", "(", "right", "panel", ")", "protein", "bands", "relative", "to", "the", "level", "of", "β", "-", "Actin", ".", "C", "Analysis", "of", "TSC2", "ubiquitination", "in", "293", "cells", "transfected", "(", "for", "48", "h", ")", "with", "(", "+", ")", "or", "without", "(", "-", ")", "the", "indicated", "expression", "vectors", ".", "D", "Co", "-", "immunoprecipitation", "analysis", "of", "the", "interaction", "between", "endogenous", "TSC2", "and", "exogenous", "TSC1", "wildtype", "and", "K30A", "in", "TSC1", "-", "KO", "MEFs", "transfected", "(", "for", "48", "h", ")", "with", "(", "+", ")", "or", "without", "(", "-", ")", "the", "indicated", "expression", "vectors", ".", "KO", "MEF", "cells", "were", "transfected", "with", "indicated", "expression", "plasmids", ".", "The", "right", "panel", "is", "a", "summary", "graph", "of", "TSC2", "/", "TSC1", "ratio", "based", "on", "quantification", "of", "the", "last", "four", "lanes", "of", "the", "anti", "-", "Flag", "IP", "blot", "in", "left", "panel", ".", "E", "Analysis", "of", "ubiquitin", "conjugation", "to", "endogenous", "TSC2", "in", "TSC1", "-", "KO", "MEFs", "transfected", "(", "for", "48", "h", ")", "with", "(", "+", ")", "or", "without", "(", "-", ")", "TSC1", "WT", "or", "K30A", "and", "treated", "with", "MG132", "for", "2", "h", "before", "lysis", ".", "F", "Immunoblot", "analysis", "of", "endogenous", "TSC2", "in", "TSC1", "-", "KO", "MEFs", "transfected", "(", "for", "48", "h", ")", "with", "Myc", "-", "TSC1", "wildtype", "or", "K30A", "and", "subsequently", "treated", "with", "cycloheximide", "(", "10", "μg", "/", "ml", ")", "for", "the", "indicated", "time", "periods", "before", "lysis", ".", "The", "right", "panel", "is", "a", "summary", "graph", "of", "quantified", "TSC2", "WT", "and", "K30A", "protein", "bands", "presented", "as", "percentages", "of", "the", "level", "in", "the", "untreated", "(", "0", "min", ")", "lane", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A Analysis of ubiquitin conjugation to wildtype (WT) TSC1 and the indicated TSC1 mutants in 293T cells transiently transfected Flag-tagged TSC1 and its mutants along with (+) or without (-) the indicated expression vectors.B Immunoblot analysis of the indicated phosphorylated (p-) and total proteins in lysates of TSC1-KO MEFs transfected with (+) or without (-) TSC1 wildtype or K30A expression vectors. The cells were serum starved and then left either untreated (NT) or stimulated with 10% FBS for 30 mins. Data are presented as a representative blot (left panel) and a summary graph of quantified TSC2 (right panel) protein bands relative to the level of β-Actin.C Analysis of TSC2 ubiquitination in 293 cells transfected (for 48 h) with (+) or without (-) the indicated expression vectors.D Co-immunoprecipitation analysis of the interaction between endogenous TSC2 and exogenous TSC1 wildtype and K30A in TSC1-KO MEFs transfected (for 48 h) with (+) or without (-) the indicated expression vectors. KO MEF cells were transfected with indicated expression plasmids. The right panel is a summary graph of TSC2/TSC1 ratio based on quantification of the last four lanes of the anti-Flag IP blot in left panel.E Analysis of ubiquitin conjugation to endogenous TSC2 in TSC1-KO MEFs transfected (for 48 h) with (+) or without (-) TSC1 WT or K30A and treated with MG132 for 2 h before lysis.F Immunoblot analysis of endogenous TSC2 in TSC1-KO MEFs transfected (for 48 h) with Myc-TSC1 wildtype or K30A and subsequently treated with cycloheximide (10 μg/ml) for the indicated time periods before lysis. The right panel is a summary graph of quantified TSC2 WT and K30A protein bands presented as percentages of the level in the untreated (0 min) lane."}
{"words": ["Figure", "1C", "-", "E", ".", "2a", "and", "2b", "ESCs", "maintained", "in", "2i", "medium", "were", "cultured", "in", "the", "absence", "(", "Ctrl", ")", "or", "presence", "of", "OHT", "and", "subsequently", "used", "for", "WB", "(", "C", ")", "C", "-", "E", ".", "2a", "and", "2b", "ESCs", "maintained", "in", "2i", "medium", "were", "cultured", "in", "the", "absence", "(", "Ctrl", ")", "or", "presence", "of", "OHT", "and", "subsequently", "used", "for", "growth", "curves", "and", "RT", "-", "qPCR", "(", "D", ",", "E", ")", ".", "F", "-", "G", ".", "2a", "and", "2b", "ESCs", "were", "adapted", "to", "grow", "in", "serum", "-", "containing", "ESC", "medium", ",", "exposed", "to", "OHT", "as", "indicated", "and", "subsequently", "used", "for", "growth", "curves", "and", "RT", "-", "qPCR", "analyses", ".", "H", "-", "I", ".", "Jmjd2a", "(", "+", "/", "-", ")", ";", "Jmjd2a", "(", "+", "/", "-", ")", "(", "H", ")", "or", "Jmjd2b", "(", "+", "/", "-", ")", ";", "Jmjd2b", "(", "+", "/", "-", ")", "(", "I", ")", "mice", "were", "inter", "-", "crossed", "and", "the", "number", "of", "pups", "alive", "at", "time", "of", "weaning", "reported", ".", "P", "values", "were", "calculated", "using", "a", "Chi", "-", "square", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1C-E. 2a and 2b ESCs maintained in 2i medium were cultured in the absence (Ctrl) or presence of OHT and subsequently used for WB (C)C-E. 2a and 2b ESCs maintained in 2i medium were cultured in the absence (Ctrl) or presence of OHT and subsequently used for growth curves and RT-qPCR (D,E).F-G. 2a and 2b ESCs were adapted to grow in serum-containing ESC medium, exposed to OHT as indicated and subsequently used for growth curves and RT-qPCR analyses.H-I. Jmjd2a(+/-); Jmjd2a(+/-) (H) or Jmjd2b(+/-); Jmjd2b(+/-) (I) mice were inter-crossed and the number of pups alive at time of weaning reported. P values were calculated using a Chi-square test."}
{"words": ["Figure", "2A", "-", "D", ".", "WB", "and", "growth", "curves", "of", "2ac", "(", "A", ")", ",", "2abc", "(", "B", ")", ",", "2ab", "(", "C", ")", "and", "2bc", "(", "D", ")", "ESCs", "cultured", "in", "2i", "medium", "and", "exposed", "to", "OHT", "as", "indicated", ".", "E", ".", "Flow", "cytometry", "profiles", "of", "2ac", "ESCs", "pulsed", "with", "BrdU", "in", "2i", "medium", ".", "The", "upper", "table", "shows", "the", "percentages", "of", "living", "cells", "(", "the", "subG1", "fraction", "is", "omitted", "from", "the", "analysis", ")", ",", "which", "can", "be", "classified", "as", "being", "in", "S", "(", "BrdU", "+", ")", ",", "G1", "(", "2N", "DNA", "content", ",", "BrdU", "-", ")", "or", "G2", "/", "M", "phase", "(", "4N", "DNA", "content", ",", "BrdU", "-", ")", ".", "The", "percentages", "of", "dead", "cells", "(", "subG1", ",", "events", "with", "a", "<", "2N", "DNA", "content", ")", "is", "shown", "in", "red", ".", "F", ".", "RT", "-", "qPCR", "analyses", "for", "ESCs", "cultured", "in", "2i", "medium", ".", "G", "-", "J", ".", "2ac", "and", "2abc", "ESCs", "were", "adapted", "to", "grow", "in", "serum", "-", "containing", "ESC", "medium", ",", "exposed", "to", "OHT", "as", "indicated", "and", "subsequently", "used", "for", "growth", "curves", "(", "G", "-", "H", ")", "and", "RT", "-", "qPCR", "analyses", "(", "I", "-", "J", ")", ".", "The", "RT", "-", "qPCR", "data", "are", "also", "presented", "in", "Appendix", "Fig", "S2C", "-", "D", "with", "a", "zoom", "-", "in", "on", "the", "lower", "region", "of", "the", "y", "-", "axis", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A-D. WB and growth curves of 2ac (A), 2abc (B), 2ab (C) and 2bc (D) ESCs cultured in 2i medium and exposed to OHT as indicated.E. Flow cytometry profiles of 2ac ESCs pulsed with BrdU in 2i medium. The upper table shows the percentages of living cells (the subG1 fraction is omitted from the analysis), which can be classified as being in S (BrdU+), G1 (2N DNA content, BrdU-) or G2/M phase (4N DNA content, BrdU-). The percentages of dead cells (subG1, events with a <2N DNA content) is shown in red.F. RT-qPCR analyses for ESCs cultured in 2i medium.G-J. 2ac and 2abc ESCs were adapted to grow in serum-containing ESC medium, exposed to OHT as indicated and subsequently used for growth curves (G-H) and RT-qPCR analyses (I-J). The RT-qPCR data are also presented in Appendix Fig S2C-D with a zoom-in on the lower region of the y-axis."}
{"words": ["Figure", "3A", "-", "B", ".", "2ac", "ESCs", "expressing", "GFP", "were", "cultured", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "OHT", "and", "subsequently", "used", "for", "morula", "injections", ".", "(", "A", ")", "Average", "volume", "of", "the", "GFP", "-", "positive", "area", "in", "chimeric", "embryos", "at", "24", "and", "72", "hrs", "after", "morula", "injection", ".", "Number", "of", "embryos", "used", "for", "quantification", ":", "Ctrl", "24h", "n", "=", "18", ";", "+", "OHT", "24h", "n", "=", "15", ";", "Ctrl", "72h", "n", "=", "5", ";", "+", "OHT", "72h", "n", "=", "5", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", ".", "(", "B", ")", "Representative", "images", "of", "chimeric", "embryos", ".", "The", "white", "bars", "indicate", "a", "length", "of", "32", "µm", ".", "Relative", "intensities", "of", "the", "GFP", "signal", "are", "indicated", "for", "each", "image", ".", "C", "-", "D", ".", "Jmjd2a", "(", "+", "/", "-", ")", ";", "Jmjd2c", "(", "+", "/", "-", ")", "mice", "were", "inter", "-", "crossed", ".", "The", "number", "of", "(", "C", ")", "pups", "alive", "at", "weaning", "or", "(", "D", ")", "embryos", "recovered", "at", "E6", ".", "5", "is", "presented", ".", "P", "values", "were", "calculated", "using", "exact", "binomial", "test", "with", "the", "most", "conservative", "estimate", "of", "expected", "(", "-", "/", "-", ";", "-", "/", "-", ")", "embryos", "(", "6", ".", "25", "%", ",", "assuming", "no", "linkage", "between", "the", "Jmjd2a", "and", "Jmjd2cloci", "even", "though", "they", "are", "located", "on", "the", "same", "chromosome", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A-B. 2ac ESCs expressing GFP were cultured in the absence or presence of OHT and subsequently used for morula injections. (A) Average volume of the GFP-positive area in chimeric embryos at 24 and 72 hrs after morula injection. Number of embryos used for quantification: Ctrl 24h n=18; +OHT 24h n=15; Ctrl 72h n=5; +OHT 72h n=5. Data are presented as mean ± SD. (B) Representative images of chimeric embryos. The white bars indicate a length of 32 µm. Relative intensities of the GFP signal are indicated for each image.C-D. Jmjd2a(+/-); Jmjd2c(+/-) mice were inter-crossed. The number of (C) pups alive at weaning or (D) embryos recovered at E6.5 is presented. P values were calculated using exact binomial test with the most conservative estimate of expected (-/-;-/-) embryos (6.25 %, assuming no linkage between the Jmjd2a and Jmjd2cloci even though they are located on the same chromosome)."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "Examples", "of", "ChIP", "-", "seq", "data", "obtained", "for", "Jmjd2a", ",", "Jmjd2c", "(", "Pedersen", "et", "al", ",", "2014", ")", ",", "and", "H3K4me3", ".", "C", ".", "Unsupervised", "k", "-", "means", "clustering", "of", "ChIP", "-", "seq", "tags", "over", "all", "TSSs", "(", "+", "/", "-", "5kb", ")", ".", "D", "-", "E", ".", "Bar", "graphs", "showing", "the", "number", "of", "Jmjd2a", "peaks", "displaying", "at", "least", "1", "bp", "overlap", "with", "(", "D", ")", "an", "H3K4me3", "peak", ".", "Jmjd2a", "peaks", "were", "classified", "as", "TSS", "-", "associated", "(", "'", "TSS", "'", ")", "if", "overlapping", "a", "region", "of", "+", "/", "-", "1kb", "of", "a", "TSS", ".", "D", "-", "E", ".", "Bar", "graphs", "showing", "the", "number", "of", "Jmjd2a", "peaks", "displaying", "at", "least", "1", "bp", "overlap", "with", "(", "E", ")", "a", "Jmjd2c", "peak", ".", "Jmjd2a", "peaks", "were", "classified", "as", "TSS", "-", "associated", "(", "'", "TSS", "'", ")", "if", "overlapping", "a", "region", "of", "+", "/", "-", "1kb", "of", "a", "TSS", ".", "G", ".", "ChIP", "-", "qPCR", "validations", ".", "Graphs", "show", "mean", "±", "SD", "for", "3", "technical", "replicates", "and", "are", "representative", "of", "results", "obtained", "in", "at", "least", "2", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. Examples of ChIP-seq data obtained for Jmjd2a, Jmjd2c (Pedersen et al, 2014), and H3K4me3.C. Unsupervised k-means clustering of ChIP-seq tags over all TSSs (+/- 5kb).D-E. Bar graphs showing the number of Jmjd2a peaks displaying at least 1 bp overlap with (D) an H3K4me3 peak. Jmjd2a peaks were classified as TSS-associated ('TSS') if overlapping a region of +/- 1kb of a TSS.D-E. Bar graphs showing the number of Jmjd2a peaks displaying at least 1 bp overlap with (E) a Jmjd2c peak. Jmjd2a peaks were classified as TSS-associated ('TSS') if overlapping a region of +/- 1kb of a TSS.G. ChIP-qPCR validations. Graphs show mean ± SD for 3 technical replicates and are representative of results obtained in at least 2 independent experiments."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "Density", "plots", "showing", "average", "ChIP", "-", "seq", "signals", "with", "95", "%", "confidence", "intervals", "of", "the", "mean", "indicated", "in", "grey", ".", "y", "-", "axes", "show", "mean", "Tags", "per", "Million", "(", "TPM", ")", ".", "Data", "were", "obtained", "using", "the", "2ac", "ESCs", "line", "#", "4", ".", "TSSs", "were", "classified", "as", "'", "Bound", "'", "if", "containing", "binding", "sites", "for", "both", "Jmjd2a", "and", "Jmjd2c", "within", "+", "/", "-", "1kb", "(", "see", "Fig", "4F", ")", ",", "or", "'", "Not", "bound", "'", "if", "neither", "protein", "binds", "within", "the", "same", "region", ".", "B", ".", "Heat", "map", "showing", "H3K9me3", "ChIP", "-", "seq", "data", "for", "Jmjd2a", "/", "c", "bound", "TSSs", "(", "+", "/", "-", "5kb", ")", "sorted", "according", "to", "read", "number", "in", "2abc", "#", "13", "+", "OHT", ".", "C", ".", "ChIP", "-", "qPCR", "validations", "for", "selected", "Jmjd2a", "/", "c", "targets", "(", "see", "Fig", "4G", ")", ".", "Graphs", "show", "mean", "±", "SD", "for", "technical", "triplicates", "and", "are", "representative", "of", "results", "obtained", "in", "at", "least", "2", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. Density plots showing average ChIP-seq signals with 95% confidence intervals of the mean indicated in grey. y-axes show mean Tags per Million (TPM). Data were obtained using the 2ac ESCs line #4. TSSs were classified as 'Bound' if containing binding sites for both Jmjd2a and Jmjd2c within +/- 1kb (see Fig 4F), or 'Not bound' if neither protein binds within the same region.B. Heat map showing H3K9me3 ChIP-seq data for Jmjd2a/c bound TSSs (+/- 5kb) sorted according to read number in 2abc #13+OHT.C. ChIP-qPCR validations for selected Jmjd2a/c targets (see Fig 4G). Graphs show mean ± SD for technical triplicates and are representative of results obtained in at least 2 independent experiments."}
{"words": ["Figure", "6A", "-", "B", ".", "Independent", "RT", "-", "qPCR", "validations", "of", "genes", "identified", "as", "being", "(", "A", ")", "down", "-", "regulated", "or", "(", "B", ")", "up", "-", "regulated", "by", "expression", "arrays", ".", "Graphs", "show", "mean", "±", "SD", "for", "technical", "triplicates", "and", "are", "representative", "of", "results", "obtained", "with", "at", "least", "2", "different", "ESCs", "lines", "of", "each", "genotype", "in", "independent", "experiments", ".", "A", "-", "B", ".", "Independent", "RT", "-", "qPCR", "validations", "of", "genes", "identified", "as", "being", "(", "A", ")", "down", "-", "regulated", "or", "(", "B", ")", "up", "-", "regulated", "by", "expression", "arrays", ".", "Graphs", "show", "mean", "±", "SD", "for", "technical", "triplicates", "and", "are", "representative", "of", "results", "obtained", "with", "at", "least", "2", "different", "ESCs", "lines", "of", "each", "genotype", "in", "independent", "experiments", ".", "C", "-", "D", ".", "Density", "plots", "showing", "average", "ChIP", "-", "seq", "signals", "for", "(", "C", ")", "H3K9me3", "or", "(", "D", ")", "H3K36me3", "with", "95", "%", "confidence", "intervals", "of", "the", "mean", "indicated", "in", "grey", ".", "Plots", "are", "shown", "for", "genes", ",", "which", "are", "down", "-", "or", "up", "-", "regulated", "according", "to", "the", "microarray", "analyses", "(", "FDR", "<", "0", ".", "05", ",", "absolute", "fold", "change", "log2", "(", "|", "FC", "|", ")", ">", "0", ".", "5", ")", "for", "both", "2ac", "and", "2abc", "KO", "ESCs", "(", "overlaps", "presented", "in", "Appendix", "Fig", "S6A", ")", ",", "or", "do", "not", "show", "strong", "expression", "changes", "(", "log2", "(", "|", "FC", "|", ")", "<", "0", ".", "2", ")", ".", "Genes", "are", "further", "classified", "as", "\"", "Bound", "\"", "if", "containing", "binding", "sites", "for", "both", "Jmjd2a", "and", "Jmjd2c", "within", "+", "/", "-", "1kb", "of", "a", "TSS", ".", "E", ".", "Heat", "map", "presenting", "array", "data", "in", "the", "form", "of", "log2", "(", "fold", "change", ")", "values", "comparing", "OHT", "with", "control", "treated", "ESCs", ".", "Genes", "are", "shown", "for", "which", "TSS", "regions", "(", "+", "/", "-", "1kb", ")", "show", "the", "most", "substantial", "increase", "in", "H3K9me3", "levels", "in", "OHT", "treated", "cells", "according", "to", "the", "ChIP", "-", "seq", "analyses", "(", "defined", "in", "Fig", "EV4", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A-B. Independent RT-qPCR validations of genes identified as being (A) down-regulated or (B) up-regulated by expression arrays. Graphs show mean ± SD for technical triplicates and are representative of results obtained with at least 2 different ESCs lines of each genotype in independent experiments.A-B. Independent RT-qPCR validations of genes identified as being (A) down-regulated or (B) up-regulated by expression arrays. Graphs show mean ± SD for technical triplicates and are representative of results obtained with at least 2 different ESCs lines of each genotype in independent experiments.C-D. Density plots showing average ChIP-seq signals for (C) H3K9me3 or (D) H3K36me3 with 95% confidence intervals of the mean indicated in grey. Plots are shown for genes, which are down- or up-regulated according to the microarray analyses (FDR<0.05, absolute fold change log2(|FC|)>0.5) for both 2ac and 2abc KO ESCs (overlaps presented in Appendix Fig S6A), or do not show strong expression changes (log2(|FC|) < 0.2). Genes are further classified as \"Bound\" if containing binding sites for both Jmjd2a and Jmjd2c within +/- 1kb of a TSS.E. Heat map presenting array data in the form of log2(fold change) values comparing OHT with control treated ESCs. Genes are shown for which TSS regions (+/- 1kb) show the most substantial increase in H3K9me3 levels in OHT treated cells according to the ChIP-seq analyses (defined in Fig EV4)."}
{"words": ["Figure", "7A", "-", "C", ".", "2ac", "clones", "established", "after", "transfection", "with", "an", "empty", "vector", "(", "empty", ")", "or", "plasmids", "expressing", "wild", "type", "Jmjd2c", "(", "2c", "wt", ")", "or", "a", "catalytic", "mutant", "(", "2c", "mut", ")", "were", "exposed", "to", "OHT", "as", "indicated", "and", "subsequently", "used", "for", "(", "A", ")", "WB", ".", "A", "-", "C", ".", "2ac", "clones", "established", "after", "transfection", "with", "an", "empty", "vector", "(", "empty", ")", "or", "plasmids", "expressing", "wild", "type", "Jmjd2c", "(", "2c", "wt", ")", "or", "a", "catalytic", "mutant", "(", "2c", "mut", ")", "were", "exposed", "to", "OHT", "as", "indicated", "and", "subsequently", "used", "for", "(", "B", ")", "RT", "-", "qPCR", "analysesA", "-", "C", ".", "2ac", "clones", "established", "after", "transfection", "with", "an", "empty", "vector", "(", "empty", ")", "or", "plasmids", "expressing", "wild", "type", "Jmjd2c", "(", "2c", "wt", ")", "or", "a", "catalytic", "mutant", "(", "2c", "mut", ")", "were", "exposed", "to", "OHT", "as", "indicated", "and", "subsequently", "used", "for", "(", "C", ")", "serial", "plating", "for", "the", "generation", "of", "growth", "curves", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A-C. 2ac clones established after transfection with an empty vector (empty) or plasmids expressing wild type Jmjd2c (2c wt) or a catalytic mutant (2c mut) were exposed to OHT as indicated and subsequently used for (A) WB.A-C. 2ac clones established after transfection with an empty vector (empty) or plasmids expressing wild type Jmjd2c (2c wt) or a catalytic mutant (2c mut) were exposed to OHT as indicated and subsequently used for (B) RT-qPCR analysesA-C. 2ac clones established after transfection with an empty vector (empty) or plasmids expressing wild type Jmjd2c (2c wt) or a catalytic mutant (2c mut) were exposed to OHT as indicated and subsequently used for (C) serial plating for the generation of growth curves."}
{"words": ["figf1a", ",", "Polychromasia", "(", "Wright", "-", "Giemsa", "stain", ",", "indicated", "by", "arrows", ")", "and", "increased", "reticulocytes", "(", "brilliant", "cresyl", "blue", "stain", ")", "revealed", "by", "staining", "blood", "smears", "from", "6", "-", "week", "-", "old", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "or", "Nix", "-", "/", "-", "mice", "(", "scale", "bar", ",", "20", "µm", ")", ".", "b", ",", "c", ",", "Ter119", "(", "b", ")", "or", "Mitotracker", "deep", "red", "(", "c", ")", "versus", "CD71", "staining", "of", "RBCs", "from", "3", "-", "or", "6", "-", "week", "-", "old", "mice", ".", "Cell", "counts", "were", "also", "calculated", "(", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "b", ",", "c", ",", "Ter119", "(", "b", ")", "or", "Mitotracker", "deep", "red", "(", "c", ")", "versus", "CD71", "staining", "of", "RBCs", "from", "3", "-", "or", "6", "-", "week", "-", "old", "mice", ".", "Cell", "counts", "were", "also", "calculated", "(", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "d", ",", "Analyses", "of", "RBCs", "from", "3", "-", "or", "6", "-", "week", "-", "oldmice", "by", "immunocytochemistryAnalyses", "of", "RBCs", "from", "3", "-", "or", "6", "-", "week", "-", "oldmice", "by", "transmission", "electron"], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf1a, Polychromasia (Wright-Giemsa stain, indicated by arrows) and increased reticulocytes (brilliant cresyl blue stain) revealed by staining blood smears from 6-week-old wild-type (WT) or Nix-/- mice (scale bar, 20 µm).b, c, Ter119 (b) or Mitotracker deep red (c) versus CD71 staining of RBCs from 3- or 6-week-old mice. Cell counts were also calculated (mean ± s.e.m.; n = 3). *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001.b, c, Ter119 (b) or Mitotracker deep red (c) versus CD71 staining of RBCs from 3- or 6-week-old mice. Cell counts were also calculated (mean ± s.e.m.; n = 3). *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001.d, Analyses of RBCs from 3- or 6-week-oldmice by immunocytochemistryAnalyses of RBCs from 3- or 6-week-oldmice by transmission electron microscopy"}
{"words": ["figf2a", ",", "Quantification", "of", "NHS", "-", "biotin", "-", "labelled", "RBCs", "or", "transferred", "CMFDA", "-", "labelled", "RBCs", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "b", ",", "Western", "blot", "analyses", "of", "caspases", "in", "RBCs", "after", "in", "vitro", "culture", ".", "Asterisks", "denote", "processed", "caspases", ".", "FL", ",", "full", "length", ".", "c", ",", "The", "relative", "luminescence", "units", "(", "RLU", ")", "of", "caspase", "activities", "in", "cultured", "RBCs", "and", "the", "suppression", "of", "annexin", "V", "staining", "in", "Nix", "-", "/", "-", "RBCs", "after", "12", "-", "h", "culture", "in", "the", "presence", "of", "qVD", "-", "oph", "or", "solvent", "control", "(", "DMSO", ")", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "d", ",", "Mitotracker", "versus", "annexin", "V", "staining", "of", "RBCs", "after", "in", "vitro", "culture", ".", "e", ",", "Mean", "fluorescent", "intensity", "(", "MFI", ")", "of", "ROS", "staining", "in", "RBCs", "after", "in", "vitro", "culture", ",", "and", "caspase", "activities", "in", "Nix", "-", "/", "-", "RBCs", "after", "24", "h", "culture", "with", "solvent", "control", ",", "ROS", "scavengers", "or", "qVD", "-", "oph", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "BHT", ",", "butylated", "hydroxytoluene", ";", "CAT", ",", "catalase", ";", "TEM", ",", "tempol", ".", "f", ",", "Haematoxylin", "and", "eosin", "(", "HE", ")", "staining", "of", "spleen", "sections", "of", "9", "-", "week", "-", "old", "wild", "-", "type", "and", "Nix", "-", "/", "-", "mice", ".", "Arrows", "denote", "iron", "deposits", "within", "macrophagecytoplasm", ".", "Iron", "deposits", "were", "also", "stained", "with", "Prussian", "blue", ",", "followed", "by", "counterstain", "with", "nuclear", "-", "fast", "red", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "µm", ".", "g", ",", "Real", "-", "time", "RT", "-", "PCR", "of", "erythropoietin", "(", "Epo", ")", "(", "n", "=", "12", ")", ".", "For", "all", "relevant", "panels", ",", "statistical", "significance", "of", "the", "data", "(", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", "is", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf2a, Quantification of NHS-biotin-labelled RBCs or transferred CMFDA-labelled RBCs (n = 3).b, Western blot analyses of caspases in RBCs after in vitro culture. Asterisks denote processed caspases. FL, full length.c, The relative luminescence units (RLU) of caspase activities in cultured RBCs and the suppression of annexin V staining in Nix-/- RBCs after 12-h culture in the presence of qVD-oph or solvent control (DMSO) (n = 3).d, Mitotracker versus annexin V staining of RBCs after in vitro culture.e, Mean fluorescent intensity (MFI) of ROS staining in RBCs after in vitro culture, and caspase activities in Nix-/- RBCs after 24 h culture with solvent control, ROS scavengers or qVD-oph (n = 3). BHT, butylated hydroxytoluene; CAT, catalase; TEM, tempol.f, Haematoxylin and eosin (HE) staining of spleen sections of 9-week-old wild-type and Nix-/- mice. Arrows denote iron deposits within macrophagecytoplasm. Iron deposits were also stained with Prussian blue, followed by counterstain with nuclear-fast red. Scale bar, 20 µm.g, Real-time RT-PCR of erythropoietin (Epo) (n = 12). For all relevant panels, statistical significance of the data (mean ± s.e.m.) is: *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001."}
{"words": ["figf3a", ",", "Ter119", "+", "CD71", "+", "reticulocytes", "sorted", "at", "day", "3", "or", "6", "after", "PHZ", "treatment", "were", "cultured", "for", "in", "vitro", "maturation", "for", "0", "(", "top", "row", ")", ",", "2", "(", "middle", "row", ")", "or", "4", "(", "bottom", "row", ")", "days", ",", "followed", "by", "Mitotracker", "deep", "red", "and", "Ter119", "staining", ".", "b", ",", "CD71", "+", "Ter119", "+", "reticulocytes", "sorted", "at", "day", "3", "after", "PHZ", "treatment", "were", "cultured", "and", "stained", "with", "new", "methylene", "blue", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "µm", ".", "c", ",", "CD71", "+", "Ter119", "+", "reticulocytes", "sorted", "at", "day", "3", "after", "PHZ", "treatment", "were", "stained", "for", "LC3", "and", "COX", "IV", "and", "analysed", "by", "deconvolution", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "µm", ".", "The", "Pearson", "coefficiency", "for", "LC3", "and", "COX", "IV", "co", "-", "localization", "at", "day", "0", "(", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", "is", ":", "wild", "type", ",", "0", ".", "81", " ", "±", " ", "0", ".", "001", ";", "Nix", "-", "/", "-", ",", "0", ".", "44", " ", "±", " ", "0", ".", "036", "(", "n", "=", "35", ",", "P", "=", "0", ".", "0006", ")", ".", "d", ",", "CD71", "+", "Ter119", "+", "reticulocytes", "sorted", "at", "day", "3", "after", "PHZ", "treatment", "were", "analysed", "by", "electron", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "0", ".", "5", " ", "µm", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf3a, Ter119+CD71+ reticulocytes sorted at day 3 or 6 after PHZ treatment were cultured for in vitro maturation for 0 (top row), 2 (middle row) or 4 (bottom row) days, followed by Mitotracker deep red and Ter119 staining.b, CD71+Ter119+ reticulocytes sorted at day 3 after PHZ treatment were cultured and stained with new methylene blue. Scale bar, 20 µm.c, CD71+Ter119+ reticulocytes sorted at day 3 after PHZ treatment were stained for LC3 and COX IV and analysed by deconvolution microscopy. Scale bar, 5 µm. The Pearson coefficiency for LC3 and COX IV co-localization at day 0 (mean ± s.e.m.) is: wild type, 0.81 ± 0.001; Nix-/-, 0.44 ± 0.036 (n = 35, P = 0.0006).d, CD71+Ter119+ reticulocytes sorted at day 3 after PHZ treatment were analysed by electron microscopy. Scale bar, 0.5 µm."}
{"words": ["figf4a", ",", "Ter119", "+", "CD71", "+", "reticulocytes", "were", "sorted", "from", "the", "peripheral", "blood", "of", "wild", "-", "type", "and", "Nix", "-", "/", "-", "mice", "at", "day", "6", "after", "PHZ", "treatment", ".", "The", "cells", "were", "cultured", "for", "in", "vitro", "maturation", "in", "the", "presence", "of", "10", "µM", "FCCP", "or", "1", "µM", "ABT", "-", "737", ",", "followed", "by", "staining", "with", "Mitotracker", "deep", "red", "and", "phycoerythrin", "-", "conjugated", "anti", "-", "Ter119", ".", "b", ",", "c", ",", "Reticulocytes", "were", "cultured", "with", "FCCP", "(", "b", ")", "or", "ABT", "-", "737", "(", "c", ")", "for", "24", "h", "and", "analysed", "by", "transmission", "electron", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "0", ".", "5", "µm", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf4a, Ter119+CD71+ reticulocytes were sorted from the peripheral blood of wild-type and Nix-/- mice at day 6 after PHZ treatment. The cells were cultured for in vitro maturation in the presence of 10 µM FCCP or 1 µM ABT-737, followed by staining with Mitotracker deep red and phycoerythrin-conjugated anti-Ter119.b, c, Reticulocytes were cultured with FCCP (b) or ABT-737 (c) for 24 h and analysed by transmission electron microscopy. Scale bar, 0.5 µm."}
{"words": ["Figure", "1RNAi", "injections", "schedule", "in", "starved", "conditions", ".", "Planarians", "are", "at", "14dS", "when", "the", "amputation", "is", "performed", "(", "indicated", "by", "the", "grey", "cross", "at", "day", "14", ")", ".", "Live", "images", "show", "that", "cct3A", "(", "RNAi", ")", "planarians", "form", "a", "minimal", "blastema", "compared", "to", "controls", "at", "the", "time", "points", "shown", ".", "At", "the", "bottom", "are", "the", "number", "of", "planarians", "with", "the", "phenotype", "shown", ".", "The", "remaining", "planarians", "are", "dead", "by", "the", "time", "point", "of", "regeneration", "shown", ".", "dR", "indicates", "days", "of", "regeneration", ".", "RNAi", "injections", "schedule", "in", "feeding", "conditions", ".", "One", "extra", "feeding", "in", "respect", "to", "(", "B", ")", "is", "introduced", "one", "day", "prior", "to", "injections", ".", "Planarians", "are", "at", "8dS", "when", "the", "amputation", "is", "performed", ".", "The", "live", "images", "show", "that", "most", "of", "the", "cct3A", "(", "RNAi", ")", "planarians", "regenerate", "like", "controls", ".", "At", "the", "bottom", "are", "the", "number", "of", "planarians", "with", "the", "phenotype", "shown", ".", "At", "8", "-", "10dR", ",", "the", "remaining", "planarians", "are", "either", "dead", "(", "4", "/", "124", ")", "or", "have", "a", "tiny", "blastema", "(", "23", "/", "124", ")", "and", "either", "died", "or", "regenerated", "later", ".", "At", "51", "-", "68dR", ",", "the", "remaining", "planarians", "are", "either", "dead", "(", "10", "/", "93", ")", "or", "have", "a", "tiny", "blastema", "and", "died", "later", "(", "5", "/", "93", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1RNAi injections schedule in starved conditions. Planarians are at 14dS when the amputation is performed (indicated by the grey cross at day 14). Live images show that cct3A(RNAi) planarians form a minimal blastema compared to controls at the time points shown. At the bottom are the number of planarians with the phenotype shown. The remaining planarians are dead by the time point of regeneration shown. dR indicates days of regeneration. RNAi injections schedule in feeding conditions. One extra feeding in respect to (B) is introduced one day prior to injections. Planarians are at 8dS when the amputation is performed. The live images show that most of the cct3A(RNAi) planarians regenerate like controls. At the bottom are the number of planarians with the phenotype shown. At 8-10dR, the remaining planarians are either dead (4/124) or have a tiny blastema (23/124) and either died or regenerated later. At 51-68dR, the remaining planarians are either dead (10/93) or have a tiny blastema and died later (5/93)."}
{"words": ["Figure", "2The", "graph", "shows", "the", "mitotic", "numbers", "of", "trunks", "during", "different", "time", "points", "of", "regeneration", "in", "the", "starved", "condition", "for", "cct3A", "RNAi", "and", "controls", ".", "Error", "bars", "are", "s", ".", "d", ".", "from", "the", "mean", "and", "asterisks", "indicate", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "three", "asterisks", ")", ",", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "two", "asterisks", ")", "and", "n", ".", "s", ".", "indicates", "not", "significant", "using", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "test", "with", "equal", "variance", ".", "n", "≥", "9", "planarians", "per", "time", "point", ".", "Also", "shown", "are", "maximum", "projections", "of", "representative", "trunks", "labelled", "with", "anti", "-", "H3P", "at", "different", "time", "points", "of", "regeneration", "in", "the", "starved", "condition", ".", "On", "the", "bottom", ",", "the", "number", "of", "planarians", "with", "the", "phenotype", "shown", "from", "the", "total", "is", "displayed", ".", "Note", "that", "at", "50dR", "planarians", "show", "few", "(", "a4", ")", "or", "no", "mitoses", "(", "a5", ")", ".", "The", "dashed", "line", "delimits", "the", "body", "of", "the", "planarian", ".", "Maximum", "projections", "of", "representative", "trunks", "after", "FISH", "for", "smedwi", "-", "1", "at", "different", "time", "points", "of", "regeneration", "under", "starved", "and", "feeding", "conditions", ".", "On", "the", "bottom", ",", "the", "number", "of", "planarians", "with", "the", "phenotype", "shown", "from", "the", "total", "is", "displayed", ".", "At", "15dR", "the", "expression", "levels", "are", "similar", ".", "At", "30dR", "some", "planarians", "have", "almost", "no", "expression", "(", "c5", ")", "and", "at", "50dR", "almost", "all", "planarians", "show", "no", "expression", "(", "c10", "and", "c11", ")", "in", "starved", "conditions", ".", "Under", "the", "feeding", "condition", "the", "expression", "levels", "at", "30dS", "are", "similar", ".", "On", "the", "bottom", ",", "the", "number", "of", "planarians", "with", "the", "phenotype", "shown", "from", "the", "total", "is", "displayed", ".", "The", "dashed", "line", "delimits", "the", "body", "of", "the", "planarian", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2The graph shows the mitotic numbers of trunks during different time points of regeneration in the starved condition for cct3A RNAi and controls. Error bars are s.d. from the mean and asterisks indicate P < 0.001 (three asterisks), P < 0.01 (two asterisks) and n.s. indicates not significant using two-tailed Student's test with equal variance. n ≥ 9 planarians per time point. Also shown are maximum projections of representative trunks labelled with anti-H3P at different time points of regeneration in the starved condition. On the bottom, the number of planarians with the phenotype shown from the total is displayed. Note that at 50dR planarians show few (a4) or no mitoses (a5). The dashed line delimits the body of the planarian.Maximum projections of representative trunks after FISH for smedwi-1 at different time points of regeneration under starved and feeding conditions. On the bottom, the number of planarians with the phenotype shown from the total is displayed. At 15dR the expression levels are similar. At 30dR some planarians have almost no expression (c5) and at 50dR almost all planarians show no expression (c10 and c11) in starved conditions. Under the feeding condition the expression levels at 30dS are similar. On the bottom, the number of planarians with the phenotype shown from the total is displayed. The dashed line delimits the body of the planarian."}
{"words": ["Figure", "3The", "cartoon", "represents", "a", "regenerating", "trunk", "and", "the", "squares", "display", "the", "region", "analyzed", "at", "the", "anterior", "\"", "A", "\"", "and", "posterior", "\"", "P", "\"", "blastemas", ".", "The", "images", "are", "TUNEL", "maximum", "projections", "of", "representative", "blastemas", "from", "72", "hours", "and", "4", "days", "regenerating", "trunks", "in", "starved", "conditions", ".", "The", "dashed", "line", "delimits", "the", "body", "of", "the", "planarian", ".", "The", "graph", "shows", "the", "number", "of", "TUNEL", "+", "cells", "per", "mm2", ".", "The", "differences", "in", "cell", "death", "are", "not", "significant", "(", "n", ".", "s", ".", ")", "at", "72hR", "(", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "test", "with", "equal", "sample", "variance", ")", "and", "significant", "(", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "using", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "test", "with", "equal", "variance", ")", "at", "4dR", ".", "n", "≥", "5", "planarians", "per", "condition", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3The cartoon represents a regenerating trunk and the squares display the region analyzed at the anterior \"A\" and posterior \"P\" blastemas. The images are TUNEL maximum projections of representative blastemas from 72 hours and 4 days regenerating trunks in starved conditions. The dashed line delimits the body of the planarian. The graph shows the number of TUNEL+ cells per mm2. The differences in cell death are not significant (n.s.) at 72hR (two-tailed Student's test with equal sample variance) and significant (***P < 0.001 using two-tailed Student's test with equal variance) at 4dR. n ≥ 5 planarians per condition."}
{"words": ["Figure", "4Volcano", "plot", "displaying", "DEGs", "in", "starved", "cct3A", "(", "RNAi", ")", "planarians", "compared", "to", "controls", "at", "72hR", "(", "q", "-", "value", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "Y", "-", "axis", "indicates", "the", "negative", "log10", "of", "the", "false", "discovery", "rate", "(", "FDR", ")", "(", "q", "-", "value", ")", ".", "X", "-", "axis", "indicates", "the", "beta", "values", "(", "b", ")", ",", "a", "biased", "estimator", "of", "the", "fold", "change", ".", "For", "better", "visualization", ",", "13", "dots", "with", "-", "log10", "(", "q", "-", "value", ")", ">", "20", "are", "not", "displayed", ".", "This", "includes", "cct3A", "with", "q", "=", "0", ".", "Notice", "that", "when", "down", "-", "regulating", "cct3A", "in", "starved", "planarians", ",", "xbp1", ",", "atf6", ",", "bip", "-", "1", "and", "a", "repertoire", "of", "ER", "chaperones", "are", "down", "-", "regulated", ",", "whereas", "dnajb9", ",", "a", "repressor", "of", "the", "UPR", ",", "and", "other", "ccts", "are", "up", "-", "regulated", ".", "Live", "images", "show", "that", "xbp1", "/", "atf6", "(", "RNAi", ")", "planarians", "in", "starved", "conditions", "form", "a", "minimal", "blastema", "when", "compared", "to", "controls", "while", "at", "the", "feeding", "condition", "most", "of", "them", "can", "regenerate", "as", "controls", ".", "The", "remaining", "planarians", "in", "the", "starved", "condition", "are", "dead", "by", "the", "time", "point", "of", "regeneration", "shown", ".", "In", "the", "feeding", "condition", ",", "the", "remaining", "planarians", "at", "8", "-", "10dR", "are", "either", "dead", "(", "13", "/", "145", ")", "or", "have", "a", "tiny", "blastema", "and", "died", "or", "regenerated", "later", "(", "40", "/", "145", ")", "while", "at", "21", "-", "27dR", "are", "dead", ".", "Maximum", "projections", "of", "representative", "regenerating", "trunks", "after", "FISH", "for", "smedwi", "-", "1", "in", "starved", "conditions", ".", "The", "dashed", "line", "delimits", "the", "body", "of", "the", "planarian", ".", "TUNEL", "maximum", "projections", "of", "representative", "blastemas", "from", "regenerating", "trunks", "in", "starved", "conditions", ".", "The", "dashed", "line", "delimits", "the", "body", "of", "the", "planarian", ".", "The", "graph", "shows", "the", "number", "of", "TUNEL", "+", "cells", "per", "mm2", "at", "the", "same", "time", "points", "in", "anterior", "(", "A", ")", "and", "posterior", "(", "P", ")", "blastemas", ".", "n", "≥", "6", "planarians", "per", "time", "point", ".", "Quantification", "of", "the", "percentage", "of", "stem", "cells", "in", "different", "mitotic", "phases", "and", "the", "percentage", "of", "defective", "mitotic", "figures", "in", "72hR", "anterior", "blastemas", "of", "xbp1", "/", "atf6", "RNAi", "and", "controls", "in", "starved", "conditions", "after", "double", "immunostaining", "with", "anti", "-", "tyrosine", "-", "tubulin", "and", "anti", "-", "H3P", "(", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "n", ".", "s", ".", "indicates", "not", "significant", "using", "two", "-", "sided", "Chi", "-", "square", "test", ")", ";", "n", "≥", "5", "planarians", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "Arrows", "indicate", "abnormal", "organization", "or", "number", "of", "spindle", "poles", ".", "j8", "displays", "asymmetrical", "distribution", "of", "chromosome", "content", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Volcano plot displaying DEGs in starved cct3A(RNAi) planarians compared to controls at 72hR (q-value < 0.05). Y-axis indicates the negative log10 of the false discovery rate (FDR) (q- value). X-axis indicates the beta values (b), a biased estimator of the fold change. For better visualization, 13 dots with -log10 (q-value) > 20 are not displayed. This includes cct3A with q = 0. Notice that when down-regulating cct3A in starved planarians, xbp1, atf6, bip-1 and a repertoire of ER chaperones are down-regulated, whereas dnajb9, a repressor of the UPR, and other ccts are up-regulated.Live images show that xbp1/atf6(RNAi) planarians in starved conditions form a minimal blastema when compared to controls while at the feeding condition most of them can regenerate as controls. The remaining planarians in the starved condition are dead by the time point of regeneration shown. In the feeding condition, the remaining planarians at 8-10dR are either dead (13/145) or have a tiny blastema and died or regenerated later (40/145) while at 21-27dR are dead.Maximum projections of representative regenerating trunks after FISH for smedwi-1 in starved conditions. The dashed line delimits the body of the planarian.TUNEL maximum projections of representative blastemas from regenerating trunks in starved conditions. The dashed line delimits the body of the planarian. The graph shows the number of TUNEL+ cells per mm2 at the same time points in anterior (A) and posterior (P) blastemas. n ≥ 6 planarians per time point.Quantification of the percentage of stem cells in different mitotic phases and the percentage of defective mitotic figures in 72hR anterior blastemas of xbp1/atf6 RNAi and controls in starved conditions after double immunostaining with anti-tyrosine-tubulin and anti-H3P (****P < 0.0001, ***P < 0.001, *P < 0.05, n.s. indicates not significant using two-sided Chi-square test); n ≥ 5 planarians. Representative images are shown. Arrows indicate abnormal organization or number of spindle poles. j8 displays asymmetrical distribution of chromosome content."}
{"words": ["Figure", "5The", "Kaplan", "-", "Meier", "curve", "demonstrates", "increased", "survival", "of", "cct3A", "RNAi", "animals", "when", "treated", "with", "DTT", "under", "starved", "conditions", ".", "Percentages", "indicate", "the", "number", "of", "survivals", "at", "the", "indicated", "time", "points", ".", "Three", "asterisks", "indicate", "p", "<", "0", ".", "001", "with", "log", "-", "rank", "(", "Mantel", "-", "Cox", ")", "test", ".", "Images", "are", "representative", "surviving", "animals", "for", "the", "different", "conditions", "at", "the", "displayed", "time", "point", "of", "regeneration", ".", "At", "the", "bottom", "are", "the", "number", "of", "planarians", "with", "the", "phenotype", "shown", ".", "The", "rest", "of", "planarians", "are", "dead", "at", "the", "displayed", "time", "point", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5The Kaplan-Meier curve demonstrates increased survival of cct3A RNAi animals when treated with DTT under starved conditions. Percentages indicate the number of survivals at the indicated time points. Three asterisks indicate p < 0.001 with log-rank (Mantel-Cox) test. Images are representative surviving animals for the different conditions at the displayed time point of regeneration. At the bottom are the number of planarians with the phenotype shown. The rest of planarians are dead at the displayed time point."}
{"words": ["Figure", "6Volcano", "plots", "displaying", "shRNA", "-", "Cct3", "-", "and", "shRNA", "-", "luciferase", "-", "infected", "LSK", "cells", "cultured", "either", "in", "normal", "glucose", "(", "upper", "graph", ")", "or", "low", "glucose", "conditions", "(", "lower", "graph", ")", ".", "Dots", "represent", "all", "the", "NanoString", "analyzed", "transcripts", ".", "Red", "dots", "are", "UPR", "and", "ER", "stress", "related", "genes", ".", "The", "UPR", "and", "ER", "stress", "genes", "significantly", "down", "-", "regulated", "only", "under", "low", "glucose", "conditions", "in", "shCct3", "cells", "compared", "to", "controls", "are", "indicated", "near", "the", "lower", "graph", ".", "For", "better", "visualization", "two", "dots", "with", "q", "≤", "0", ".", "001", "have", "been", "removed", "from", "the", "volcano", "plot", "(", "see", "them", "in", "Dataset", "EV4", ")", ".", "Y", "-", "axis", "indicates", "the", "false", "discovery", "rate", "(", "FDR", ")", "(", "q", "-", "value", ")", ",", "and", "the", "X", "-", "axis", "indicates", "the", "log2", "fold", "changes", ".", "The", "FDR", "-", "based", "method", "of", "p", "-", "value", "adjustment", "was", "conducted", "to", "calculate", "the", "q", "-", "values", "by", "nSolver", "software", "using", "Benjamini", "-", "Hochberg", "methods", ".", "Significance", "is", "established", "by", "q", "-", "value", "<", "0", ".", "05", "and", "indicated", "by", "the", "dotted", "horizontal", "line", ".", "n", "=", "3", "mice", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Volcano plots displaying shRNA-Cct3- and shRNA-luciferase-infected LSK cells cultured either in normal glucose (upper graph) or low glucose conditions (lower graph). Dots represent all the NanoString analyzed transcripts. Red dots are UPR and ER stress related genes. The UPR and ER stress genes significantly down-regulated only under low glucose conditions in shCct3 cells compared to controls are indicated near the lower graph. For better visualization two dots with q ≤ 0.001 have been removed from the volcano plot (see them in Dataset EV4). Y-axis indicates the false discovery rate (FDR) (q- value), and the X-axis indicates the log2 fold changes. The FDR-based method of p-value adjustment was conducted to calculate the q-values by nSolver software using Benjamini-Hochberg methods. Significance is established by q-value < 0.05 and indicated by the dotted horizontal line. n= 3 mice."}
{"words": ["Figure", "7The", "Kaplan", "-", "Meier", "curve", "demonstrates", "increased", "survival", "of", "starved", "cct3A", "(", "RNAi", ")", "animals", "when", "treated", "with", "palmitic", "acid", "/", "palmitoylcarnitine", "(", "PA", "/", "PC", ")", ".", "Percentages", "indicate", "the", "number", "of", "survivals", "at", "the", "indicated", "time", "points", ".", "Three", "asterisks", "indicate", "P", "<", "0", ".", "001", "with", "log", "-", "rank", "(", "Mantel", "-", "Cox", ")", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7The Kaplan-Meier curve demonstrates increased survival of starved cct3A(RNAi) animals when treated with palmitic acid/palmitoylcarnitine (PA/PC). Percentages indicate the number of survivals at the indicated time points. Three asterisks indicate P < 0.001 with log-rank (Mantel-Cox) test."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Western", "blot", "of", "SMC3", "-", "LAP", "expressing", "HeLa", "cells", "treated", "with", "siRNA", "as", "indicated", "and", "synchronized", "in", "G2", "-", "phase", ".", "Efficiency", "of", "RNA", "interference", "and", "SMC3", "acetylation", "levels", "were", "analyzed", "from", "total", "extracts", "and", "after", "chromatin", "fractionation", "(", "asterisks", "indicate", "unspecific", "signals", "that", "were", "depleted", "from", "antibody", "dilutions", "used", "in", "later", "experiments", ",", "presumably", "by", "repeated", "usage", "of", "the", "antibody", "samples", ")", ".", "Note", "that", "ESCO1", "levels", "were", "increased", "on", "chromatin", "after", "depletion", "of", "ESCO2", ",", "raising", "the", "possibility", "that", "a", "decrease", "in", "chromatin", "bound", "ESCO2", "might", "be", "compensated", "for", "by", "ESCO1", "recruitment", "to", "chromatin", ".", "(", "B", ")", "Still", "images", "of", "an", "inverse", "fluorescence", "recovery", "after", "photobleaching", "(", "iFRAP", ")", "experiment", ".", "Fluorescence", "intensities", "are", "false", "-", "colored", "as", "indicated", ".", "Size", "bar", ",", "5", "μm", ".", "(", "C", ")", "Graph", "depicting", "the", "normalized", "intensity", "after", "photobleaching", "from", "two", "biological", "replicates", "to", "quantify", "chromatin", "dissociation", "kinetics", ".", "Error", "bars", "denote", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", ",", "n", "=", "10", "cells", "per", "condition", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "the", "relative", "abundance", "of", "SMC3", "-", "LAP", "in", "the", "stable", "chromatin", "binding", "mode", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Western blot of SMC3-LAP expressing HeLa cells treated with siRNA as indicated and synchronized in G2-phase. Efficiency of RNA interference and SMC3 acetylation levels were analyzed from total extracts and after chromatin fractionation (asterisks indicate unspecific signals that were depleted from antibody dilutions used in later experiments, presumably by repeated usage of the antibody samples). Note that ESCO1 levels were increased on chromatin after depletion of ESCO2, raising the possibility that a decrease in chromatin bound ESCO2 might be compensated for by ESCO1 recruitment to chromatin.(B) Still images of an inverse fluorescence recovery after photobleaching (iFRAP) experiment. Fluorescence intensities are false-colored as indicated. Size bar, 5 μm.(C) Graph depicting the normalized intensity after photobleaching from two biological replicates to quantify chromatin dissociation kinetics. Error bars denote standard error of the mean (s.e.m.), n = 10 cells per condition.(D) Quantification of the relative abundance of SMC3-LAP in the stable chromatin binding mode."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Quantification", "of", "iFRAP", "experiments", "using", "HeLa", "cells", "expressing", "SMC3", "-", "LAP", "in", "the", "wild", "-", "type", "form", "(", "wt", ")", "or", "with", "lysines", "105", "-", "106", "mutated", "to", "glutamines", "(", "QQ", ")", "or", "arginines", "(", "RR", ")", "and", "synchronized", "in", "G1", "-", "phase", ".", "Error", "bars", "denote", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "n", ">", "25", "cells", "per", "condition", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "chromatin", "residence", "time", "of", "SMC3", "-", "LAP", "alleles", "in", "G1", "-", "phase", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "iFRAP", "experiments", "using", "cells", "synchronized", "in", "G2", "-", "phase", ".", "Error", "bars", "denote", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "n", ">", "26", "cells", "per", "condition", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "stably", "bound", "SMC3", "-", "LAP", "alleles", "in", "G2", "-", "phase", ".", "(", "E", ")", "Western", "blot", "of", "mouse", "fibroblasts", "expressing", "SMC3", "-", "LAP", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "endogenous", "Smc3", "after", "gene", "deletion", ".", "Extracts", "were", "prepared", "after", "subculturing", "two", "times", ".", "Cells", "without", "SMC3", "-", "LAP", "do", "not", "proliferate", "after", "deletion", "of", "Smc3", ".", "(", "F", ")", "Western", "blot", "showing", "HeLa", "cell", "extracts", "after", "treatment", "with", "siRNA", "as", "indicated", "and", "synchronized", "in", "G2", "-", "phase", ".", "Note", "that", "ESCO1", "immunoblot", "signals", "were", "also", "reduced", "in", "sororin", "depleted", "cells", ".", "We", "currently", "do", "not", "know", "if", "this", "is", "an", "effect", "of", "sororin", "depletion", ",", "an", "off", "-", "target", "effect", "or", "an", "artefact", "of", "unequal", "sample", "loading", ".", "(", "G", ")", "iFRAP", "quantification", "of", "stably", "chromatin", "bound", "SMC3", "-", "LAP", "after", "siRNA", "treatment", "using", "cells", "synchronized", "in", "G2", "-", "phase", ".", "Error", "bars", "denote", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "n", ">", "11", "cells", "per", "condition", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Quantification of iFRAP experiments using HeLa cells expressing SMC3-LAP in the wild-type form (wt) or with lysines 105-106 mutated to glutamines (QQ) or arginines (RR) and synchronized in G1-phase. Error bars denote s.e.m., n > 25 cells per condition.(B) Quantification of chromatin residence time of SMC3-LAP alleles in G1-phase.(C) Quantification of iFRAP experiments using cells synchronized in G2-phase. Error bars denote s.e.m., n > 26 cells per condition.(D) Quantification of stably bound SMC3-LAP alleles in G2-phase.(E) Western blot of mouse fibroblasts expressing SMC3-LAP in the presence or absence of endogenous Smc3 after gene deletion. Extracts were prepared after subculturing two times. Cells without SMC3-LAP do not proliferate after deletion of Smc3.(F) Western blot showing HeLa cell extracts after treatment with siRNA as indicated and synchronized in G2-phase. Note that ESCO1 immunoblot signals were also reduced in sororin depleted cells. We currently do not know if this is an effect of sororin depletion, an off-target effect or an artefact of unequal sample loading.(G) iFRAP quantification of stably chromatin bound SMC3-LAP after siRNA treatment using cells synchronized in G2-phase. Error bars denote s.e.m., n > 11 cells per condition."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "FACS", "profile", "of", "cells", "transfected", "with", "nondegradable", "KEN", "-", "box", "mutant", "sororin", "-", "FLAG", "(", "sorKBM", "-", "FLAG", ")", "after", "synchronization", "in", "G1", "-", "phase", "and", "propidium", "iodide", "staining", ".", "(", "B", ")", "Immunofluorescence", "microscopy", "experiment", "to", "determine", "transfection", "efficiency", ".", "(", "C", ")", "Western", "blot", "of", "fractionated", "lysates", "to", "detect", "sororinKBM", "-", "FLAG", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "SMC3", "-", "LAP", "residence", "time", "on", "chromatin", "after", "transfecting", "cells", "with", "sorKBM", "-", "FLAG", "in", "G1", "-", "phase", ".", "Error", "bars", "denote", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "n", ">", "15", "cells", "per", "condition", ".", "(", "E", "-", "F", ")", "Analysis", "of", "cell", "cycle", "distribution", "and", "transfection", "efficiency", "using", "cells", "synchronized", "in", "G2", "-", "phase", ".", "(", "G", ")", "Quantification", "of", "stably", "chromatin", "-", "bound", "SMC3", "-", "LAP", "from", "cells", "expressing", "nondegradable", "sororin", "in", "G2", "-", "phase", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "siRNA", "as", "indicated", ".", "(", "H", ")", "Western", "blot", "showing", "fractionated", "and", "nuclease", "digested", "chromatin", "from", "cells", "synchronized", "in", "G1", "and", "G2", "-", "phase", "after", "immunoprecipitation", "with", "FLAG", "antibodies", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) FACS profile of cells transfected with nondegradable KEN-box mutant sororin-FLAG (sorKBM-FLAG) after synchronization in G1-phase and propidium iodide staining.(B) Immunofluorescence microscopy experiment to determine transfection efficiency.(C) Western blot of fractionated lysates to detect sororinKBM-FLAG.(D) Quantification of SMC3-LAP residence time on chromatin after transfecting cells with sorKBM-FLAG in G1-phase. Error bars denote s.e.m.; n > 15 cells per condition.(E-F) Analysis of cell cycle distribution and transfection efficiency using cells synchronized in G2-phase.(G) Quantification of stably chromatin-bound SMC3-LAP from cells expressing nondegradable sororin in G2-phase. Cells were treated with siRNA as indicated.(H) Western blot showing fractionated and nuclease digested chromatin from cells synchronized in G1 and G2-phase after immunoprecipitation with FLAG antibodies."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Examples", "of", "sororin", "(", "dotted", "arrows", ")", "and", "SMC3ChIP", "-", "seq", "and", "BrdU", "DIP", "-", "seq", "data", "from", "early", "S", "-", "phase", "as", "compared", "to", "G2", "-", "phase", "using", "the", "Integrated", "Genome", "Browser", "(", "IGB", ";", "Nicol", "et", "al", ",", "2009", ")", ".", "(", "B", ")", "Alignment", "of", "sororin", ",", "BrdU", "and", "BrdU", "-", "negative", "control", "sequencing", "bins", "in", "early", "S", "-", "phase", "to", "humanchromosome", "18", "(", "GRCh37", "/", "hg19", ")", ".", "Bars", "correspond", "to", "called", "peaks", ",", "curves", "to", "read", "enrichments", "after", "smoothing", "(", "k", "=", "25", "kbp", ")", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "the", "co", "-", "occupancy", "of", "BrdU", "incorporation", "and", "sororin", "localization", "in", "early", "S", "-", "phase", "and", "sororin", "in", "G2", "-", "phase", "depicted", "as", "p", "-", "value", "distributions", "calculated", "with", "IntervalStats", "(", "Chikina", "Troyanskaya", ",", "2012", ")", "and", "compared", "to", "randomized", "controls", ".", "Sororin", "peaks", "were", "identified", "as", "overlapping", "peaks", "of", "4", "samples", "in", "early", "S", "-", "phase", "and", "2", "samples", "in", "G2", "-", "phase", ",", "using", "only", "the", "common", "peaks", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "the", "co", "-", "occupancy", "of", "SMC3", "in", "early", "S", "-", "phase", "and", "in", "G2", "-", "phase", "with", "BrdU", "incorporation", "in", "early", "S", "-", "phase", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Examples of sororin (dotted arrows) and SMC3ChIP-seq and BrdU DIP-seq data from early S-phase as compared to G2-phase using the Integrated Genome Browser (IGB; Nicol et al, 2009).(B) Alignment of sororin, BrdU and BrdU-negative control sequencing bins in early S-phase to humanchromosome 18 (GRCh37/hg19). Bars correspond to called peaks, curves to read enrichments after smoothing (k=25 kbp).(C) Quantification of the co-occupancy of BrdU incorporation and sororin localization in early S-phase and sororin in G2-phase depicted as p-value distributions calculated with IntervalStats (Chikina Troyanskaya, 2012) and compared to randomized controls. Sororin peaks were identified as overlapping peaks of 4 samples in early S-phase and 2 samples in G2-phase, using only the common peaks.(D) Quantification of the co-occupancy of SMC3 in early S-phase and in G2-phase with BrdU incorporation in early S-phase."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Schematic", "representation", "of", "wild", "-", "type", "(", "wt", ")", ",", "targeted", "(", "flx", ")", "and", "deleted", "(", "Δ", ")", "Cdca5", "alleles", "(", "left", ")", "and", "Southern", "blot", "of", "mouse", "genomic", "DNA", "(", "right", ")", ".", "Red", "triangles", ",", "loxP", "sites", ".", "(", "B", ")", "Observed", "and", "expected", "genotype", "distribution", "among", "offspring", "of", "heterozygous", "Cdca5", "Δ", "/", "+", "mice", "(", "newborn", "mice", ",", "n", "=", "136", ";", "E9", ".", "5", ",", "n", "=", "54", ")", ".", "(", "D", ")", "Western", "blot", "of", "cell", "extracts", "to", "analyze", "depletion", "of", "sororin", "protein", "from", "fibroblasts", "after", "tamoxifen", "-", "induced", "Cre", "expression", ".", "Extracts", "were", "prepared", "either", "one", "or", "two", "days", "after", "release", "from", "the", "arrest", "as", "indicated", ".", "Chr", ",", "fractionated", "chromatin", ";", "sol", ",", "soluble", "proteins", ".", "(", "E", ")", "Proliferation", "curve", "of", "cells", "with", "the", "indicated", "genotype", "after", "tamoxifen", "treatment", ".", "(", "F", ")", "Observed", "cell", "cycle", "distribution", "of", "fibroblasts", "treated", "with", "tamoxifen", "under", "starvation", "and", "subcultured", "in", "rich", "medium", ".", "(", "G", ")", "Quantification", "of", "mitotic", "cells", "with", "misaligned", "chromosomes", "after", "Cdca5", "deletion", "and", "proliferation", "for", "36", "to", "60", "hours", ".", "Size", "bar", ",", "10", "µm", ";", "error", "bars", "denote", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "n", ">", "500", "cells", "per", "condition", ".", "(", "H", ")", "Phenotypic", "classification", "of", "nuclear", "morphology", "after", "Cdca5", "deletion", "and", "proliferation", "for", "5", "to", "7", "days", ".", "Size", "bar", ",", "10", "µm", ";", "error", "bars", "denote", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "n", ">", "500", "cells", "per", "condition", ".", "(", "I", ")", "Western", "blot", "showing", "protein", "depletion", "efficiency", ".", "Cre", "expression", "was", "induced", "with", "tamoxifen", "for", "24", "hours", "in", "proliferating", "Smc3", "and", "Cdca5", "conditional", "knockout", "immortalized", "fibroblasts", ".", "(", "J", ")", "Analysis", "of", "chromosome", "spreads", "after", "Smc3", "or", "Cdca5", "deletion", "and", "nocodazole", "treatment", ".", "Representative", "images", "from", "every", "category", "are", "shown", ";", "size", "bar", ",", "10", "µm", ";", "error", "bars", "denote", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "n", ">", "500", "per", "genotype", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Schematic representation of wild-type (wt), targeted (flx) and deleted (Δ) Cdca5 alleles (left) and Southern blot of mouse genomic DNA (right). Red triangles, loxP sites.(B) Observed and expected genotype distribution among offspring of heterozygous Cdca5 Δ/+ mice (newborn mice, n = 136; E9.5, n = 54).(D) Western blot of cell extracts to analyze depletion of sororin protein from fibroblasts after tamoxifen-induced Cre expression. Extracts were prepared either one or two days after release from the arrest as indicated. Chr, fractionated chromatin; sol, soluble proteins.(E) Proliferation curve of cells with the indicated genotype after tamoxifen treatment.(F) Observed cell cycle distribution of fibroblasts treated with tamoxifen under starvation and subcultured in rich medium.(G) Quantification of mitotic cells with misaligned chromosomes after Cdca5 deletion and proliferation for 36 to 60 hours. Size bar, 10 µm; error bars denote s.e.m.; n > 500 cells per condition.(H) Phenotypic classification of nuclear morphology after Cdca5 deletion and proliferation for 5 to 7 days. Size bar, 10 µm; error bars denote s.e.m.; n > 500 cells per condition.(I) Western blot showing protein depletion efficiency. Cre expression was induced with tamoxifen for 24 hours in proliferating Smc3 and Cdca5 conditional knockout immortalized fibroblasts.(J) Analysis of chromosome spreads after Smc3 or Cdca5 deletion and nocodazole treatment. Representative images from every category are shown; size bar, 10 µm; error bars denote s.e.m.; n > 500 per genotype."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Schematic", "illustration", "of", "the", "LAP", "-", "AID", "-", "tag", "integrated", "into", "the", "bacterial", "artificial", "chromosome", "containing", "the", "mouse", "Cdca5", "locus", ".", "(", "B", ")", "Immunofluorescence", "staining", "of", "cells", "expressing", "sor", "-", "LAP", "-", "AID", "and", "the", "F", "-", "box", "helper", "protein", "after", "treatment", "with", "auxin", ".", "Antibodies", "against", "GFP", "mark", "the", "fusion", "protein", "and", "Aurora", "B", "antibody", "stains", "cells", "in", "G2", "/", "M", "-", "phase", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "immunofluorescence", "after", "treating", "cells", "with", "auxin", ".", "Error", "bars", "denote", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "a", ".", "u", ".", ",", "arbitrary", "units", ".", "(", "D", ")", "Time", "course", "quantification", "of", "GFP", "immunofluorescence", "signal", "decrease", "after", "auxin", "addition", ".", "(", "E", ")", "Analysis", "of", "chromosome", "spreads", "after", "auxin", "treatment", ".", "(", "F", ")", "Western", "blot", "showing", "cell", "extracts", "after", "treatment", "with", "auxin", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Schematic illustration of the LAP-AID-tag integrated into the bacterial artificial chromosome containing the mouse Cdca5 locus.(B) Immunofluorescence staining of cells expressing sor-LAP-AID and the F-box helper protein after treatment with auxin. Antibodies against GFP mark the fusion protein and Aurora B antibody stains cells in G2/M-phase. Scale bar, 10 µm.(C) Quantification of immunofluorescence after treating cells with auxin. Error bars denote s.e.m.; a.u., arbitrary units.(D) Time course quantification of GFP immunofluorescence signal decrease after auxin addition.(E) Analysis of chromosome spreads after auxin treatment.(F) Western blot showing cell extracts after treatment with auxin."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Cell", "cycle", "distribution", "of", "immortalized", "Cdca5", "Δ", "/", "Δ", "sor", "-", "LAP", "-", "AID", "fibroblasts", "after", "24", "-", "hour", "incubation", "with", "aphidicolin", "and", "release", ".", "(", "B", ")", "Western", "blot", "showing", "cell", "extracts", "after", "incubation", "with", "aphidicolin", "and", "release", ".", "(", "C", ")", "Still", "images", "of", "a", "fluorescence", "recovery", "after", "photobleaching", "experiment", ".", "Size", "bar", ",", "5", "μm", ".", "Bleach", "area", "radius", ",", "2", "µm", ".", "(", "D", ")", "Graph", "depicting", "the", "normalized", "intensity", "after", "photobleaching", "to", "quantify", "turnover", "of", "sororin", "(", "n", "=", "15", ")", ".", "(", "E", ")", "Quantification", "of", "the", "relative", "abundance", "of", "sororin", "-", "LAP", "-", "AID", "on", "chromatin", ".", "Error", "bars", "denote", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "the", "chromatin", "residence", "time", "of", "sor", "-", "LAP", "-", "AID", "at", "different", "times", ".", "Error", "bars", "denote", "s", ".", "e", ".", "m", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Cell cycle distribution of immortalized Cdca5 Δ/Δ sor-LAP-AID fibroblasts after 24-hour incubation with aphidicolin and release.(B) Western blot showing cell extracts after incubation with aphidicolin and release.(C) Still images of a fluorescence recovery after photobleaching experiment. Size bar, 5 μm. Bleach area radius, 2 µm.(D) Graph depicting the normalized intensity after photobleaching to quantify turnover of sororin (n = 15).(E) Quantification of the relative abundance of sororin-LAP-AID on chromatin. Error bars denote s.e.m.(F) Quantification of the chromatin residence time of sor-LAP-AID at different times. Error bars denote s.e.m."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "EdU", "-", "labeled", "prometaphase", "cells", "after", "treating", "cells", "with", "auxin", "and", "EdU", "at", "indicated", "time", "points", ".", "Error", "bars", "denote", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "n", ">", "200", "cells", "per", "condition", ".", "(", "C", ")", "Analysis", "of", "chromosome", "spreads", "after", "auxin", "and", "EdU", "treatment", "and", "Giemsa", "staining", ".", "(", "D", ")", "Representative", "picture", "of", "the", "most", "prominent", "phenotype", "class", "upon", "auxin", "and", "EdU", "treatment", "and", "immunofluorescence", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "(", "E", ")", "Analysis", "of", "chromosome", "spreads", "after", "auxin", "treatment", "and", "EdU", "and", "DAPI", "labeling", ".", "Error", "bars", "denote", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "n", ">", "200", "cells", "per", "condition", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(B) Quantification of EdU-labeled prometaphase cells after treating cells with auxin and EdU at indicated time points. Error bars denote s.e.m.; n > 200 cells per condition.(C) Analysis of chromosome spreads after auxin and EdU treatment and Giemsa staining.(D) Representative picture of the most prominent phenotype class upon auxin and EdU treatment and immunofluorescence microscopy. Scale bar, 10 µm.(E) Analysis of chromosome spreads after auxin treatment and EdU and DAPI labeling. Error bars denote s.e.m.; n > 200 cells per condition."}
{"words": ["Figure", "1Phloroglucinol", "staining", "of", "wild", "-", "type", "seedlings", "inoculated", "with", "PTI", "-", "inducing", "Pst", "DC3000", "hrcC", "-", ",", "virulent", "Pst", "DC3000", ",", "and", "avirulent", "Pst", "DC3000", "(", "AvrRpm1", ")", "and", "Pst", "DC3000", "(", "AvrRpt2", ")", ".", "Data", "information", ":", "Twelve", "-", "day", "-", "old", "seedlings", "were", "flood", "-", "inoculated", "with", "P", ".", "syringae", "at", "108", "cfu", "/", "ml", "in", "(", "A", "hrcC", "-", ",", "Pst", "DC3000", "hrcC", "-", ";", "DC3000", ",", "Pst", "DC3000", ";", "AvrRpm1", ",", "Pst", "DC3000", "(", "AvrRpm1", ")", ";", "AvrRpt2", ",", "Pst", "DC3000", "(", "AvrRpt2", ")", ";", "dpi", ",", "days", "post", "-", "inoculationB", "Phloroglucinol", "staining", "of", "wild", "-", "type", "adult", "leaves", "inoculated", "with", "PTI", "-", "inducing", "Pst", "DC3000", "hrcC", "-", ",", "virulent", "Pst", "DC3000", ",", "and", "avirulent", "Pst", "DC3000", "(", "AvrRpm1", ")", "and", "Pst", "DC3000", "(", "AvrRpt2", ")", ".", "The", "upper", "images", "are", "enlarged", "ones", "of", "the", "lower", "boxes", "at", "2", "dpi", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", ".", "Data", "information", "Six", "-", "week", "-", "old", "leaves", "were", "syringe", "-", "infiltrated", "with", "P", ".", "syringae", "at", "108", "cfu", "/", "ml", "in", "(", "B", "hrcC", "-", ",", "Pst", "DC3000", "hrcC", "-", ";", "DC3000", ",", "Pst", "DC3000", ";", "AvrRpm1", ",", "Pst", "DC3000", "(", "AvrRpm1", ")", ";", "AvrRpt2", ",", "Pst", "DC3000", "(", "AvrRpt2", ")", ";", "dpi", ",", "days", "post", "-", "inoculation", ";", "IS", ",", "infected", "site", ";", "UIS", ",", "uninfected", "site", ".", "C", "Quantification", "of", "lignin", "content", "in", "pathogen", "-", "treated", "seedlings", "Data", "are", "shown", "as", "means", "±", "SD", "(", "n", "=", "4", ";", "20", "-", "30", "seedlings", "each", ")", ".", "Data", "information", ":", "Twelve", "-", "day", "-", "old", "seedlings", "were", "flood", "-", "inoculated", "with", "P", ".", "syringae", "at", "108", "cfu", "/", "ml", "Significant", "differences", "are", "indicated", "by", "different", "letters", "(", "Tukey", "'", "s", "HSD", "test", ";", "P", "<", "0", ".", "05", ")", "Experiments", "were", "repeated", "3", "times", "with", "similar", "results", ".", "hrcC", "-", ",", "Pst", "DC3000", "hrcC", "-", ";", "DC3000", ",", "Pst", "DC3000", ";", "AvrRpm1", ",", "Pst", "DC3000", "(", "AvrRpm1", ")", ";", "AvrRpt2", ",", "Pst", "DC3000", "(", "AvrRpt2", ")", ";", "dpi", ",", "days", "post", "-", "inoculationD", "Quantification", "of", "lignin", "content", "in", "pathogen", "-", "treated", "wild", "-", "type", "leaves", "Data", "are", "shown", "as", "means", "±", "SD", "(", "n", "=", "4", ";", "3", "-", "9", "leaves", "each", ")", ".", "Data", "information", ":", "Six", "-", "week", "-", "old", "leaves", "were", "syringe", "-", "infiltrated", "with", "P", ".", "syringae", "at", "108", "cfu", "/", "ml", "Significant", "differences", "are", "indicated", "by", "different", "letters", "(", "Tukey", "'", "s", "HSD", "test", ";", "P", "<", "0", ".", "05", ")", "Experiments", "were", "repeated", "3", "times", "with", "similar", "results", ".", "hrcC", "-", ",", "Pst", "DC3000", "hrcC", "-", ";", "DC3000", ",", "Pst", "DC3000", ";", "AvrRpm1", ",", "Pst", "DC3000", "(", "AvrRpm1", ")", ";", "AvrRpt2", ",", "Pst", "DC3000", "(", "AvrRpt2", ")", ";", "dpi", ",", "days", "post", "-", "inoculationE", "Quantification", "of", "lignin", "content", "in", "wild", "-", "type", "leaves", "treated", "with", "different", "titers", "of", "Pst", "DC3000", "(", "AvrRpm1", ")", ".", "Data", "are", "shown", "as", "means", "±", "SD", "(", "n", "=", "4", ";", "3", "-", "9", "leaves", "each", ")", ".", "Six", "-", "week", "-", "old", "leaves", "were", "syringe", "-", "infiltrated", "with", "P", ".", "syringae", "at", "the", "indicated", "titers", "in", "(", "E", ")", ".", "Significant", "differences", "are", "indicated", "by", "asterisks", "(", "t", "test", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "Experiments", "were", "repeated", "3", "times", "with", "similar", "results", ".", "dpi", ",", "days", "post", "-", "inoculationF", "Quantification", "of", "lignin", "content", "in", "wild", "-", "type", "and", "rpm1", "-", "3", "rps2", "-", "101c", "leaves", "treated", "with", "avirulent", "bacteria", ".", "Data", "are", "shown", "as", "means", "±", "SD", "(", "n", "=", "4", ";", "3", "-", "9", "leaves", "each", ")", ".", "Six", "-", "week", "-", "old", "leaves", "were", "syringe", "-", "infiltrated", "with", "P", ".", "syringae", "at", "108", "cfu", "/", "ml", "Significant", "differences", "are", "indicated", "by", "asterisks", "(", "t", "test", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "Experiments", "were", "repeated", "3", "times", "with", "similar", "results", ".", "AvrRpm1", ",", "Pst", "DC3000", "(", "AvrRpm1", ")", ";", "AvrRpt2", ",", "Pst", "DC3000", "(", "AvrRpt2", ")", ";", "dpi", ",", "days", "post", "-"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Phloroglucinol staining of wild-type seedlings inoculated with PTI-inducing Pst DC3000 hrcC-, virulent Pst DC3000, and avirulent Pst DC3000 (AvrRpm1) and Pst DC3000 (AvrRpt2). Data information: Twelve-day-old seedlings were flood-inoculated with P. syringae at 108 cfu/ml in (A hrcC-, Pst DC3000 hrcC-; DC3000, Pst DC3000; AvrRpm1, Pst DC3000 (AvrRpm1); AvrRpt2, Pst DC3000 (AvrRpt2); dpi, days post-inoculationB Phloroglucinol staining of wild-type adult leaves inoculated with PTI-inducing Pst DC3000 hrcC-, virulent Pst DC3000, and avirulent Pst DC3000 (AvrRpm1) and Pst DC3000 (AvrRpt2). The upper images are enlarged ones of the lower boxes at 2 dpi. Scale bars, 100 μm. Data information Six-week-old leaves were syringe-infiltrated with P. syringae at 108 cfu/ml in (B hrcC-, Pst DC3000 hrcC-; DC3000, Pst DC3000; AvrRpm1, Pst DC3000 (AvrRpm1); AvrRpt2, Pst DC3000 (AvrRpt2); dpi, days post-inoculation; IS, infected site; UIS, uninfected site.C Quantification of lignin content in pathogen-treated seedlings Data are shown as means ± SD (n = 4; 20-30 seedlings each). Data information: Twelve-day-old seedlings were flood-inoculated with P. syringae at 108 cfu/ml Significant differences are indicated by different letters (Tukey's HSD test; P < 0.05) Experiments were repeated 3 times with similar results. hrcC-, Pst DC3000 hrcC-; DC3000, Pst DC3000; AvrRpm1, Pst DC3000 (AvrRpm1); AvrRpt2, Pst DC3000 (AvrRpt2); dpi, days post-inoculationD Quantification of lignin content in pathogen-treated wild-type leaves Data are shown as means ± SD (n = 4; 3-9 leaves each). Data information: Six-week-old leaves were syringe-infiltrated with P. syringae at 108 cfu/ml Significant differences are indicated by different letters (Tukey's HSD test; P < 0.05) Experiments were repeated 3 times with similar results. hrcC-, Pst DC3000 hrcC-; DC3000, Pst DC3000; AvrRpm1, Pst DC3000 (AvrRpm1); AvrRpt2, Pst DC3000 (AvrRpt2); dpi, days post-inoculationE Quantification of lignin content in wild-type leaves treated with different titers of Pst DC3000 (AvrRpm1). Data are shown as means ± SD (n = 4; 3-9 leaves each). Six-week-old leaves were syringe-infiltrated with P. syringae at the indicated titers in (E). Significant differences are indicated by asterisks (t test; *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001). Experiments were repeated 3 times with similar results. dpi, days post-inoculationF Quantification of lignin content in wild-type and rpm1-3 rps2-101c leaves treated with avirulent bacteria. Data are shown as means ± SD (n = 4; 3-9 leaves each). Six-week-old leaves were syringe-infiltrated with P. syringae at 108 cfu/ml Significant differences are indicated by asterisks (t test; *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001). Experiments were repeated 3 times with similar results. AvrRpm1, Pst DC3000 (AvrRpm1); AvrRpt2, Pst DC3000 (AvrRpt2); dpi, days post-inoculation"}
{"words": ["Figure", "2B", "Quantification", "of", "lignin", "content", "in", "palQ", "leaves", "after", "the", "indicated", "treatments", "and", "pathogen", "infection", ".", "Data", "are", "shown", "as", "means", "±", "SD", "(", "n", "=", "4", ";", "3", "-", "9", "leaves", "each", ")", ".", "Data", "information", ":", "Six", "-", "week", "-", "old", "leaves", "were", "inoculated", "with", "Pst", "DC3000", "(", "AvrRpm1", ")", "at", "108", "cfu", "/", "ml", "for", "experiments", ".", "Different", "letters", "indicate", "significant", "differences", "(", "Tukey", "'", "s", "HSD", "test", ";", "P", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "Experiments", "were", "repeated", "3", "times", "with", "similar", "results", ".", "M", ",", "mock", ";", "PA", ",", "piperonylic", "acid", ";", "CA", ",", "coniferyl", "alcohol", ";", "dpi", ",", "days", "post", "-", "inoculation", ".", "C", "Measurements", "of", "Pst", "DC3000", "(", "AvrRpm1", ")", "growth", ".", "Data", "are", "shown", "as", "means", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "information", ":", "Six", "-", "week", "-", "old", "leaves", "were", "inoculated", "with", "Pst", "DC3000", "(", "AvrRpm1", ")", "at", "105", "cfu", "/", "ml", "for", "growth", "assays", "Different", "letters", "indicate", "significant", "differences", "(", "Tukey", "'", "s", "HSD", "test", ";", "P", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "Experiments", "were", "repeated", "3", "times", "with", "similar", "results", ".", "M", ",", "mock", ";", "PA", ",", "piperonylic", "acid", ";", "CA", ",", "coniferyl", "alcohol", ";", "dpi", ",", "days", "post", "-", "inoculation", ".", "D", "Cell", "death", "phenotypes", "of", "leaves", "inoculated", "with", "Pst", "DC3000", "(", "AvrRpm1", ")", ".", "E", "Quantification", "of", "leaves", "(", "n", "≥", "30", ")", "with", "spreading", "cell", "death", "as", "in", "(", "D", ")", ".", "Data", "information", ":", "Six", "-", "week", "-", "old", "leaves", "were", "inoculated", "with", "Pst", "DC3000", "(", "AvrRpm1", ")", "at", "105", "cfu", "/", "ml", "for", "growth", "assays", "M", ",", "mock", ";", "PA", ",", "piperonylic", "acid", ";", "CA", ",", "coniferyl", "alcohol", ";", "dpi", ",", "days", "post", "-", "inoculation", ".", "F", "Quantification", "of", "total", "and", "free", "SA", "in", "Col", "-", "0", "and", "palQ", "leaves", "after", "the", "indicated", "treatments", "and", "pathogen", "infection", ".", "Data", "are", "shown", "as", "means", "±", "SD", "(", "n", "=", "5", ";", "6", "leaves", "each", ")", ".", "Data", "information", ":", "Six", "-", "week", "-", "old", "leaves", "were", "inoculated", "with", "Pst", "DC3000", "(", "AvrRpm1", ")", "at", "108", "cfu", "/", "ml", "for", "experiments", ".", "Different", "letters", "indicate", "significant", "differences", "(", "Tukey", "'", "s", "HSD", "test", ";", "P", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "Experiments", "were", "repeated", "3", "times", "with", "similar", "results", ".", "M", ",", "mock", ";", "PA", ",", "piperonylic", "acid", "dpi", ",", "days", "post", "-", "inoculation", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B Quantification of lignin content in palQ leaves after the indicated treatments and pathogen infection. Data are shown as means ± SD (n = 4; 3-9 leaves each). Data information: Six-week-old leaves were inoculated with Pst DC3000 (AvrRpm1) at 108 cfu/ml for experiments. Different letters indicate significant differences (Tukey's HSD test; P < 0.05). Experiments were repeated 3 times with similar results. M, mock; PA, piperonylic acid; CA, coniferyl alcohol; dpi, days post-inoculation.C Measurements of Pst DC3000 (AvrRpm1) growth. Data are shown as means ± SD (n = 3). Data information: Six-week-old leaves were inoculated with Pst DC3000 (AvrRpm1) at 105 cfu/ml for growth assays Different letters indicate significant differences (Tukey's HSD test; P < 0.05). Experiments were repeated 3 times with similar results. M, mock; PA, piperonylic acid; CA, coniferyl alcohol; dpi, days post-inoculation.D Cell death phenotypes of leaves inoculated with Pst DC3000 (AvrRpm1). E Quantification of leaves (n ≥ 30) with spreading cell death as in (D). Data information: Six-week-old leaves were inoculated with Pst DC3000 (AvrRpm1) at 105 cfu/ml for growth assays M, mock; PA, piperonylic acid; CA, coniferyl alcohol; dpi, days post-inoculation.F Quantification of total and free SA in Col-0 and palQ leaves after the indicated treatments and pathogen infection. Data are shown as means ± SD (n = 5; 6 leaves each). Data information: Six-week-old leaves were inoculated with Pst DC3000 (AvrRpm1) at 108 cfu/ml for experiments. Different letters indicate significant differences (Tukey's HSD test; P < 0.05). Experiments were repeated 3 times with similar results. M, mock; PA, piperonylic acid dpi, days post-inoculation."}
{"words": ["Figure", "3A", "Colonization", "patterns", "of", "GFP", "-", "Pst", "DC3000", "and", "Pst", "DC3000", "(", "AvrRpt2", ")", "in", "wild", "-", "type", "plants", ".", "Data", "information", ":", "Leaves", "were", "inoculated", "with", "GFP", "-", "labeled", "bacteria", "at", "108", "cfu", "/", "ml", "for", "2", "days", ".", "IS", ",", "infected", "site", ";", "UIS", ",", "uninfected", "site", ".", "White", "dash", "lines", "indicate", "the", "boundary", "between", "IS", "and", "UIS", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μmB", "Time", "-", "lapse", "images", "of", "GFP", "-", "Pst", "DC3000", "and", "Pst", "DC3000", "(", "AvrRpt2", ")", "captured", "at", "0", "(", "magenta", ")", ",", "15", ",", "(", "yellow", ")", ",", "and", "30", "(", "green", ")", "sec", "Time", "in", "seconds", "in", "the", "movies", "is", "shown", "at", "the", "top", "of", "images", ".", "Blue", "color", "was", "used", "for", "chlorophyll", "autofluorescence", ".", "Data", "information", ":", "Leaves", "were", "inoculated", "with", "GFP", "-", "labeled", "bacteria", "at", "108", "cfu", "/", "ml", "for", "2", "days", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μmC", "Colonization", "patterns", "of", "GFP", "-", "Pst", "DC3000", "(", "AvrRpt2", ")", "in", "wild", "-", "type", "and", "palQ", "plants", "after", "PA", "and", "CA", "pretreatments", ".", "Data", "information", ":", "Leaves", "were", "inoculated", "with", "GFP", "-", "labeled", "bacteria", "at", "108", "cfu", "/", "ml", "for", "2", "days", ".", "M", ",", "mock", ";", "PA", ",", "piperonylic", "acid", ";", "CA", ",", "coniferyl", "alcohol", ";", "IS", ",", "infected", "site", ";", "UIS", ",", "uninfected", "site", ".", "White", "dash", "lines", "indicate", "the", "boundary", "between", "IS", "and", "UIS", ".", "Scale", "bars", ",", "100"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Colonization patterns of GFP-Pst DC3000 and Pst DC3000 (AvrRpt2) in wild-type plants. Data information: Leaves were inoculated with GFP-labeled bacteria at 108 cfu/ml for 2 days. IS, infected site; UIS, uninfected site. White dash lines indicate the boundary between IS and UIS. Scale bars, 100 μmB Time-lapse images of GFP-Pst DC3000 and Pst DC3000 (AvrRpt2) captured at 0 (magenta), 15, (yellow), and 30 (green) sec Time in seconds in the movies is shown at the top of images. Blue color was used for chlorophyll autofluorescence. Data information: Leaves were inoculated with GFP-labeled bacteria at 108 cfu/ml for 2 days. Scale bars, 10 μmC Colonization patterns of GFP-Pst DC3000 (AvrRpt2) in wild-type and palQ plants after PA and CA pretreatments. Data information: Leaves were inoculated with GFP-labeled bacteria at 108 cfu/ml for 2 days. M, mock; PA, piperonylic acid; CA, coniferyl alcohol; IS, infected site; UIS, uninfected site. White dash lines indicate the boundary between IS and UIS. Scale bars, 100 μm"}
{"words": ["Figure", "4A", "CANBD", "-", "and", "CADMAC", "-", "incorporated", "lignin", "polymerization", ".", "CANBD", "(", "green", ")", "and", "CADMAC", "(", "blue", ")", "fluorescence", "was", "observed", "in", "the", "lignified", "infection", "site", "at", "2", "dpi", ",", "as", "revealed", "by", "phloroglucinol", "staining", ".", "Data", "information", ":", "Bacterial", "inoculum", "was", "at", "108", "cfu", "/", "ml", ".", "IS", ",", "infected", "site", ";", "UIS", ",", "uninfected", "site", "White", "dash", "lines", "indicate", "the", "boundary", "between", "IS", "and", "UIS", ".", "Scale", "bars", ",", "500", "μmB", "Cross", "-", "sections", "of", "CANBD", "-", "and", "Pst", "DC3000", "(", "AvrRpm1", ")", "-", "treated", "leaves", ".", "Data", "information", ":", "Bacterial", "inoculum", "was", "at", "108", "cfu", "/", "ml", ".", "hpi", ",", "hours", "post", "-", "inoculation", "Scale", "bars", ",", "40", "μmC", "Cross", "-", "section", "of", "the", "entire", "leaf", "with", "one", "half", "leaf", "infected", ".", "Data", "information", ":", "Bacterial", "inoculum", "was", "at", "108", "cfu", "/", "ml", ".", "IS", ",", "infected", "site", ";", "UIS", ",", "uninfected", "site", ";", "hpi", ",", "hours", "post", "-", "inoculation", "Scale", "bars", ",", "120", "μmD", "CADMAC", "-", "incorporated", "lignin", "deposition", "in", "the", "GFP", "-", "Pst", "DC3000", "(", "AvrRpt2", ")", "-", "infected", "site", "at", "2", "dpi", ".", "Data", "information", ":", "Bacterial", "inoculum", "was", "at", "108", "cfu", "/", "ml", ".", "IS", ",", "infected", "site", ";", "UIS", ",", "uninfected", "site", "DC3000", ",", "Pst", "DC3000", ";", "AvrRpt2", ",", "Pst", "DC3000", "(", "AvrRpt2", ")", ";", "Chl", ",", "chlorophyll", ".", "White", "dash", "lines", "indicate", "the", "boundary", "between", "IS", "and", "UIS", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μmE", "Cellular", "observation", "of", "CADMAC", "-", "incorporated", "lignin", "formation", "against", "infecting", "GFP", "-", "Pst", "DC3000", "(", "AvrRpt2", ")", ".", "Data", "information", ":", "Bacterial", "inoculum", "was", "at", "108", "cfu", "/", "ml", ".", "hpi", ",", "hours", "post", "-", "inoculation", "Scale", "bars", ",", "20", "μmF", "3D", "image", "of", "CANBD", "-", "polymerized", "structure", ".", "Images", "were", "taken", "at", "24", "hpi", "Data", "information", ":", "Bacterial", "inoculum", "was", "at", "108", "cfu", "/", "ml", ".", "Scale", "bars", ",", "20"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A CANBD- and CADMAC-incorporated lignin polymerization. CANBD (green) and CADMAC (blue) fluorescence was observed in the lignified infection site at 2 dpi, as revealed by phloroglucinol staining. Data information: Bacterial inoculum was at 108 cfu/ml. IS, infected site; UIS, uninfected site White dash lines indicate the boundary between IS and UIS. Scale bars, 500 μmB Cross-sections of CANBD- and Pst DC3000 (AvrRpm1)-treated leaves. Data information: Bacterial inoculum was at 108 cfu/ml. hpi, hours post-inoculation Scale bars, 40 μmC Cross-section of the entire leaf with one half leaf infected. Data information: Bacterial inoculum was at 108 cfu/ml. IS, infected site; UIS, uninfected site; hpi, hours post-inoculation Scale bars, 120 μmD CADMAC-incorporated lignin deposition in the GFP-Pst DC3000 (AvrRpt2)-infected site at 2 dpi. Data information: Bacterial inoculum was at 108 cfu/ml. IS, infected site; UIS, uninfected site DC3000, Pst DC3000; AvrRpt2, Pst DC3000 (AvrRpt2); Chl, chlorophyll. White dash lines indicate the boundary between IS and UIS. Scale bars, 100 μmE Cellular observation of CADMAC-incorporated lignin formation against infecting GFP-Pst DC3000 (AvrRpt2). Data information: Bacterial inoculum was at 108 cfu/ml. hpi, hours post-inoculation Scale bars, 20 μmF 3D image of CANBD-polymerized structure. Images were taken at 24 hpi Data information: Bacterial inoculum was at 108 cfu/ml. Scale bars, 20 μm"}
{"words": ["Figure", "5A", "Time", "course", "expression", "profiles", "of", "CASPLs", "in", "response", "to", "Pst", "DC3000", "(", "AvrRpm1", ")", "treatment", ".", "Analysis", "was", "based", "on", "the", "Genevestigator", "database", "(", "http", ":", "/", "/", "www", ".", "genevestigator", ".", "ethz", ".", "ch", "/", ")", ".", "The", "darker", "color", "corresponds", "to", "stronger", "expression", ".", "ND", ",", "not", "determined", ".", "Quantification", "of", "lignin", "content", "in", "wild", "-", "type", "and", "caspl", "mutant", "leaves", "after", "Pst", "DC3000", "(", "AvrRpm1", ")", "inoculation", ".", "ata", "are", "shown", "as", "means", "±", "SD", "(", "n", "=", "4", ";", "3", "-", "9", "leaves", "each", ")", ".", "ata", "information", ":", "Different", "letters", "indicate", "significant", "differences", "(", "Tukey", "'", "s", "HSD", "test", ";", "P", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "Experiments", "were", "repeated", "3", "times", "with", "similar", "results", ".", "AvrRpm1", ",", "Pst", "DC3000", "(", "AvrRpm1", ")", ";", "dpi", ",", "days", "post", "-", "inoculation", ".", "C", "Cell", "death", "phenotypes", "of", "leaves", "inoculated", "with", "Pst", "DC3000", "(", "AvrRpm1", ")", ".", "Data", "information", ":", "AvrRpm1", ",", "Pst", "DC3000", "(", "AvrRpm1", ")", "dpi", ",", "days", "post", "-", "inoculation", ".", "D", "Quantification", "of", "leaves", "(", "n", "≥", "30", ")", "with", "spreading", "cell", "death", "after", "Pst", "DC3000", "(", "AvrRpm1", ")", "inoculation", ".", "dpi", ",", "days", "post", "-", "inoculation", ".", "E", "Measurements", "of", "Pst", "DC3000", "(", "AvrRpm1", ")", "and", "Pst", "DC3000", "(", "AvrRpt2", ")", "growth", ".", "Data", "are", "shown", "as", "means", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "information", ":", "Different", "letters", "indicate", "significant", "differences", "(", "Tukey", "'", "s", "HSD", "test", ";", "P", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "Experiments", "were", "repeated", "3", "times", "with", "similar", "results", ".", "AvrRpm1", ",", "Pst", "DC3000", "(", "AvrRpm1", ")", ";", "AvrRpt2", ",", "Pst", "DC3000", "(", "AvrRpt2", ")", ";", "dpi", ",", "days", "post", "-", "inoculation", ".", "F", "Colonization", "patterns", "of", "GFP", "-", "Pst", "DC3000", "(", "AvrRpt2", ")", "in", "caspl", "mutant", "plants", ".", "IS", ",", "infected", "site", ";", "UIS", ",", "uninfected", "site", ".", "White", "dash", "lines", "indicate", "the", "boundary", "between", "IS", "and", "UIS", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A Time course expression profiles of CASPLs in response to Pst DC3000 (AvrRpm1) treatment. Analysis was based on the Genevestigator database (http://www.genevestigator.ethz.ch/). The darker color corresponds to stronger expression. ND, not determined.Quantification of lignin content in wild-type and caspl mutant leaves after Pst DC3000 (AvrRpm1) inoculation. ata are shown as means ± SD (n = 4; 3-9 leaves each). ata information: Different letters indicate significant differences (Tukey's HSD test; P < 0.05). Experiments were repeated 3 times with similar results. AvrRpm1, Pst DC3000 (AvrRpm1); dpi, days post-inoculation.C Cell death phenotypes of leaves inoculated with Pst DC3000 (AvrRpm1). Data information: AvrRpm1, Pst DC3000 (AvrRpm1) dpi, days post-inoculation.D Quantification of leaves (n ≥ 30) with spreading cell death after Pst DC3000 (AvrRpm1) inoculation. dpi, days post-inoculation.E Measurements of Pst DC3000 (AvrRpm1) and Pst DC3000 (AvrRpt2) growth. Data are shown as means ± SD (n = 3). Data information: Different letters indicate significant differences (Tukey's HSD test; P < 0.05). Experiments were repeated 3 times with similar results. AvrRpm1, Pst DC3000 (AvrRpm1); AvrRpt2, Pst DC3000 (AvrRpt2); dpi, days post-inoculation.F Colonization patterns of GFP-Pst DC3000 (AvrRpt2) in caspl mutant plants. IS, infected site; UIS, uninfected site. White dash lines indicate the boundary between IS and UIS. Scale bars, 100 μm."}
{"words": ["Figure", "6A", "Visualization", "of", "CASPL4D1", "proteins", "and", "lignin", "by", "mCherry", "and", "CADMAC", "fluorescence", ".", "Data", "information", ":", "pCASPL4D1", ":", ":", "CASPL4D1", "-", "mCherry", "plants", "were", "pretreated", "with", "CADMAC", "and", "then", "inoculated", "with", "Pst", "DC3000", "(", "AvrRpm1", ")", ".", "mCh", ",", "mCherry", ";", "Chl", ",", "chlorophyll", ";", "hpi", ",", "hours", "post", "-", "inoculation", ".", "Scale", "bars", ",", "20", "μm", "(", "A", ")", "B", "Magnified", "views", "of", "CASPL4D1", "and", "lignin", "localization", ".", "Images", "in", "boxes", "were", "enlarged", "in", "the", "2nd", "to", "4th", "columns", ".", "Arrows", "indicate", "lignin", "deposition", "between", "cells", ".", "Data", "information", ":", "pCASPL4D1", ":", ":", "CASPL4D1", "-", "mCherry", "plants", "were", "pretreated", "with", "CADMAC", "and", "then", "inoculated", "with", "Pst", "DC3000", "(", "AvrRpm1", ")", ".", "mCh", ",", "mCherry", ";", "Chl", ",", "chlorophyll", ";", "hpi", ",", "hours", "post", "-", "inoculation", ".", "Scale", "bars", "10", "μm", "(", "B", ")", ".", "C", "Relative", "fluorescence", "intensity", "profiles", "of", "CASPL1D1", "(", "mCherry", ")", "and", "lignin", "(", "CADMAC", ")", "across", "transects", "indicated", "by", "dotted", "lines", "Data", "information", ":", "pCASPL4D1", ":", ":", "CASPL4D1", "-", "mCherry", "plants", "were", "pretreated", "with", "CADMAC", "and", "then", "inoculated", "with", "Pst", "DC3000", "(", "AvrRpm1", ")", ".", "D", "A", "model", "showing", "morphological", "changes", "of", "CASPL", "-", "and", "lignin", "-", "deposited", "cells", "during", "the", "HR", "response", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A Visualization of CASPL4D1 proteins and lignin by mCherry and CADMAC fluorescence. Data information: pCASPL4D1::CASPL4D1-mCherry plants were pretreated with CADMAC and then inoculated with Pst DC3000 (AvrRpm1). mCh, mCherry; Chl, chlorophyll; hpi, hours post-inoculation. Scale bars, 20 μm (A)B Magnified views of CASPL4D1 and lignin localization. Images in boxes were enlarged in the 2nd to 4th columns. Arrows indicate lignin deposition between cells. Data information: pCASPL4D1::CASPL4D1-mCherry plants were pretreated with CADMAC and then inoculated with Pst DC3000 (AvrRpm1). mCh, mCherry; Chl, chlorophyll; hpi, hours post-inoculation. Scale bars 10 μm (B).C Relative fluorescence intensity profiles of CASPL1D1 (mCherry) and lignin (CADMAC) across transects indicated by dotted lines Data information: pCASPL4D1::CASPL4D1-mCherry plants were pretreated with CADMAC and then inoculated with Pst DC3000 (AvrRpm1).D A model showing morphological changes of CASPL- and lignin-deposited cells during the HR response."}
{"words": ["Figure", "2C", ",", "D", ",", "E", "Examples", "of", "embryos", "expressing", "the", "tFT", "-", "Bcd", "reporter", "with", "C", ":", "mCherry", "-", "sfGFP", "-", "Bcd", ",", "D", ":", "fmCherry", "-", "sfGFP", "-", "Bcd", ",", "and", "E", ":", "mCherry", "-", "sfGFP", ".", "For", "all", ",", "(", "i", ")", "Images", "of", "\"", "shells", "\"", "of", "embryos", "in", "early", "n", ".", "c", ".", "14", ".", "3D", "images", "of", "the", "embryos", "were", "generated", ",", "and", "then", "the", "interior", "of", "the", "embryo", "was", "erased", ",", "leaving", "only", "the", "embryo", "cortex", "to", "improve", "clarity", "(", "ii", ")", "Mean", "AP", "intensity", "profile", "of", "each", "color", "for", "the", "embryo", "in", "i", ".", "Shade", "region", "represents", "±", "1", "s", ".", "d", ".", "Inset", "shows", "same", "profiles", "after", "multiplication", "of", "red", "intensity", "by", "constant", "factor", ".", "Data", "binned", "into", "10", "µm", "bins", "(", "n", "=", "4", "embryos", ")", ".", "(", "iii", ")", "Ratio", "of", "green", "over", "red", "signal", ",", "reflecting", "protein", "age", ".", "The", "thin", "lines", "represent", "individual", "embryos", ",", "while", "the", "thick", "solid", "line", "is", "the", "mean", ".", "The", "solid", "dashed", "line", "depicts", "the", "mean", "green", "/", "red", "ratio", "for", "a", "line", "with", "the", "tFT", "-", "Bcd", "reporter", "but", "lacking", "endogenous", "Bcd", "(", "BcdE1", "mutant", ",", "n", "=", "4", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2C,D,E Examples of embryos expressing the tFT-Bcd reporter with C: mCherry-sfGFP-Bcd, D: fmCherry-sfGFP-Bcd, and E: mCherry-sfGFP. For all, (i) Images of \"shells\" of embryos in early n.c. 14. 3D images of the embryos were generated, and then the interior of the embryo was erased, leaving only the embryo cortex to improve clarity (ii) Mean AP intensity profile of each color for the embryo in i. Shade region represents ±1 s.d. Inset shows same profiles after multiplication of red intensity by constant factor. Data binned into 10 µm bins (n=4 embryos). (iii) Ratio of green over red signal, reflecting protein age. The thin lines represent individual embryos, while the thick solid line is the mean. The solid dashed line depicts the mean green/red ratio for a line with the tFT-Bcd reporter but lacking endogenous Bcd (BcdE1 mutant, n=4)."}
{"words": ["Figure", "4", ",", "B", ",", "C", "Injection", "of", "the", "proteasome", "inhibitor", "MG132", "in", "embryos", "increases", "both", "the", "amount", "and", "the", "average", "age", "of", "Bcd", "(", "gray", ",", "open", "squares", ",", "N", "=", "10", ")", ".", "Control", "embryos", "were", "injected", "with", "DMSO", "(", "black", ",", "filled", "circles", ",", "N", "=", "9", ")", ".", "All", "embryos", "are", "y", "/", "w", "and", "were", "injected", "while", "in", "cycle", "14", "and", "imaged", "60", "min", "later", ".", "D", "The", "age", "of", "Bcd", "and", "its", "gradient", "are", "unaltered", "in", "fsd", "mutant", ".", "Comparison", "of", "a", "representative", "y", "/", "w", "embryo", "(", "left", ")", "and", "loss", "-", "of", "-", "function", "mutation", "fsdKG02393", "(", "right", ")", "are", "shown", ".", "Both", "embryos", "have", "the", "tFT", "-", "Bcd", "construct", "in", "the", "same", "locus", ",", "are", "in", "early", "n", ".", "c", ".", "14", ",", "were", "imaged", "side", "-", "by", "-", "side", "under", "identical", "conditions", ",", "and", "are", "displayed", "with", "the", "same", "settings", ".", "Embryo", "\"", "shells", "\"", "are", "displayed", ".", "E", "Quantification", "of", "embryos", "Fluorescence", "intensity", "from", "sfGFP", "(", "green", ")", "and", "mCherry", "(", "magenta", ")", "for", "wt", "(", "N", "=", "8", ",", "filled", "circles", ")", "and", "fsd", "(", "N", "=", "6", ",", "open", "squares", ")", "at", "early", "cycle", "14", ".", "Inset", ":", "tFT", "-", "Bcd", "ratio", "for", "wt", "(", "black", ")", "and", "FSD", "(", "gray", ")", "embryos", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4,B,C Injection of the proteasome inhibitor MG132 in embryos increases both the amount and the average age of Bcd (gray, open squares, N=10). Control embryos were injected with DMSO (black, filled circles, N=9). All embryos are y/w and were injected while in cycle 14 and imaged 60 min later.D The age of Bcd and its gradient are unaltered in fsd mutant. Comparison of a representative y/w embryo (left) and loss-of-function mutation fsdKG02393 (right) are shown. Both embryos have the tFT-Bcd construct in the same locus, are in early n.c. 14, were imaged side-by-side under identical conditions, and are displayed with the same settings. Embryo \"shells\" are displayed.E Quantification of embryos Fluorescence intensity from sfGFP (green) and mCherry (magenta) for wt (N=8, filled circles) and fsd (N=6, open squares) at early cycle 14. Inset: tFT-Bcd ratio for wt (black) and FSD (gray) embryos."}
{"words": ["Figure", "5Time", "-", "course", "of", "a", "representative", "y", "/", "w", "embryo", "with", "the", "tFT", "-", "Bcd", "reporter", "from", "the", "division", "cycle", "10", "to", "the", "early", "gastrulation", ".", "A", "SPIM", "images", "of", "the", "embryo", "early", "development", ".", "Embryo", "\"", "shells", "\"", "are", "displayed", ".", "Left", ":", "Green", "fluorescence", ",", "center", ":", "Red", "fluorescence", ",", "right", ":", "Intensity", "-", "weighted", "ratiometric", "image", "of", "the", "mCherry", "/", "sfGFP", "ratio", ",", "reporting", "average", "protein", "age", ".", "The", "scale", "corresponds", "to", "50", "μm", ".", "B", "Quantification", "of", "the", "same", "embryo", "as", "is", "A", ".", "Each", "line", "represents", "the", "fluorescence", "profile", "along", "the", "anterior", "-", "posterior", "axis", "of", "the", "embryo", "for", "a", "time", "frame", "(", "separated", "by", "6", "min", ")", ".", "In", "the", "lower", "panel", ",", "where", "the", "mCherry", "/", "sfGFP", "ratio", "is", "shown", ",", "the", "posterior", "half", "of", "the", "embryo", "is", "not", "shown", "because", "the", "signal", "drops", "to", "the", "background", "levels", "(", "due", "to", "softer", "imaging", "conditions", "for", "the", "long", "term", "time", "-", "course", ")", ".", "C", "The", "same", "data", "is", "shown", "as", "a", "function", "of", "time", "for", "different", "embryo", "segments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Time-course of a representative y/w embryo with the tFT-Bcd reporter from the division cycle 10 to the early gastrulation. A SPIM images of the embryo early development. Embryo \"shells\" are displayed. Left: Green fluorescence, center: Red fluorescence, right: Intensity-weighted ratiometric image of the mCherry/sfGFP ratio, reporting average protein age. The scale corresponds to 50 μm. B Quantification of the same embryo as is A. Each line represents the fluorescence profile along the anterior-posterior axis of the embryo for a time frame (separated by 6 min). In the lower panel, where the mCherry/sfGFP ratio is shown, the posterior half of the embryo is not shown because the signal drops to the background levels (due to softer imaging conditions for the long term time-course). C The same data is shown as a function of time for different embryo segments."}
{"words": ["Figure", "1", "Immunofluorescence", "microscopy", "of", "HEK293T", "exogenously", "expressing", "ATF6α", "-", "V5", "tagged", ".", "Cells", "were", "fixed", "and", "stained", "with", "anti", "-", "calnexin", "(", "green", ")", "or", "anti", "-", "V5", "(", "red", ")", ".", "An", "overlay", "of", "the", "cells", "is", "presented", "in", "the", "third", "panel", ".", "Bar", "=", "10", "µm", ".", "Whole", "cell", "lysates", "from", "HEK293T", "cells", ",", "with", "or", "without", "stable", "expression", "of", "ATF6α", "(", "as", "indicated", ")", "were", "immunoisolated", "with", "mouse", "anti", "-", "V5", ".", "RCN1", "was", "transiently", "transfected", "into", "both", "cell", "lines", "in", "the", "experiment", "depicted", "in", "panel", "3", ".", "Immunoisolated", "material", "was", "separated", "by", "SDS", "-", "PAGE", "under", "reducing", "conditions", "followed", "by", "western", "blotting", "to", "determine", "the", "co", "-", "isolation", "of", "ER", "proteins", "with", "ATF6α", ".", "Ig", "-", "HC", "(", "anti", "-", "BiP", "blot", ")", "indicates", "immunoglobulin", "heavy", "chains", ".", "Whole", "cell", "lysates", "from", "HEK293T", "cells", "stably", "expressing", "ATF6α", "were", "either", "untreated", "(", "-", ")", "or", "treated", "(", "+", ")", "with", "5", "µM", "thapsigargin", "(", "TG", ")", "for", "1", "h", ".", "THBS4", "was", "transiently", "transfected", "into", "cells", "in", "the", "experiment", "depicted", "in", "panel", "2", ".", "ATF6α", "was", "either", "immunoisolated", "with", "anti", "-", "V5", "(", "panel", "1", "and", "3", ")", "or", "anti", "-", "HA", "(", "panel", "2", ")", ".", "For", "the", "experiment", "in", "panel", "3", "the", "cells", "were", "cross", "-", "linked", "prior", "to", "immunoisolation", ".", "Samples", "were", "separated", "by", "SDS", "-", "PAGE", "under", "reducing", "conditions", "followed", "by", "western", "blots", "to", "determine", "co", "-", "isolation", "of", "endogenous", "PDIR", ",", "ERp18", "or", "exogenously", "expressed", "THBS4", "with", "ATF6α", ".", "HC", "indicates", "immunoglobulin", "heavy", "chain", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1 Immunofluorescence microscopy of HEK293T exogenously expressing ATF6α-V5 tagged. Cells were fixed and stained with anti-calnexin (green) or anti-V5 (red). An overlay of the cells is presented in the third panel. Bar = 10 µm.  Whole cell lysates from HEK293T cells, with or without stable expression of ATF6α (as indicated) were immunoisolated with mouse anti-V5. RCN1 was transiently transfected into both cell lines in the experiment depicted in panel 3. Immunoisolated material was separated by SDS-PAGE under reducing conditions followed by western blotting to determine the co-isolation of ER proteins with ATF6α. Ig-HC (anti-BiP blot) indicates immunoglobulin heavy chains. Whole cell lysates from HEK293T cells stably expressing ATF6α were either untreated (-) or treated (+) with 5 µM thapsigargin (TG) for 1 h. THBS4 was transiently transfected into cells in the experiment depicted in panel 2. ATF6α was either immunoisolated with anti-V5 (panel 1 and 3) or anti-HA (panel 2). For the experiment in panel 3 the cells were cross-linked prior to immunoisolation. Samples were separated by SDS-PAGE under reducing conditions followed by western blots to determine co-isolation of endogenous PDIR, ERp18 or exogenously expressed THBS4 with ATF6α. HC indicates immunoglobulin heavy chain. "}
{"words": ["Figure", "2HEK293T", "cells", "stably", "expressing", "ATF6α", "were", "either", "left", "untransfected", "(", "UT", ")", "or", "transfected", "with", "substrate", "-", "trapping", "mutants", "of", "PDI", "oxidoreductases", ".", "ATF6α", "was", "immunoisolated", "from", "cell", "lysates", "with", "mouse", "anti", "-", "ATF6α", ",", "separated", "by", "SDS", "-", "PAGE", "under", "non", "-", "reducing", "conditions", "and", "ATF6α", "detected", "by", "western", "blotting", "using", "rabbit", "anti", "-", "HA", ".", "Blots", "confirm", "mixed", "-", "disulfide", "complexes", "between", "ATF6α", "and", "ERp18", ",", "ERp57", ",", "and", "PDIR", "indicated", "with", "arrows", "(", "lanes", "2", ",", "4", ",", "5", ")", ".", "M", ",", "D", "and", "O", "refer", "to", "ATF6α", "monomer", ",", "dimer", "and", "oligomer", "respectively", ".", "Whole", "cell", "lysates", "of", "HEK293T", "cells", "expressing", "an", "ATF6α", "mutant", "containing", "cysteine", "to", "alanine", "mutations", "in", "the", "lumenal", "domain", "(", "ATF6", "DM", ")", "were", "transfected", "with", "PDI", "substrate", "-", "trapping", "mutants", ".", "ATF6α", "was", "immunoisolated", "with", "mouse", "anti", "-", "ATF6α", ",", "separated", "by", "SDS", "-", "PAGE", "under", "non", "-", "reducing", "conditions", ",", "and", "ATF6α", "detected", "with", "rabbit", "anti", "-", "HA", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2HEK293T cells stably expressing ATF6α were either left untransfected (UT) or transfected with substrate-trapping mutants of PDI oxidoreductases. ATF6α was immunoisolated from cell lysates with mouse anti-ATF6α, separated by SDS-PAGE under non-reducing conditions and ATF6α detected by western blotting using rabbit anti-HA. Blots confirm mixed-disulfide complexes between ATF6α and ERp18, ERp57, and PDIR indicated with arrows (lanes 2, 4, 5). M, D and O refer to ATF6α monomer, dimer and oligomer respectively. Whole cell lysates of HEK293T cells expressing an ATF6α mutant containing cysteine to alanine mutations in the lumenal domain (ATF6 DM) were transfected with PDI substrate-trapping mutants. ATF6α was immunoisolated with mouse anti-ATF6α, separated by SDS-PAGE under non-reducing conditions, and ATF6α detected with rabbit anti-HA. "}
{"words": ["Figure", "3", "HEK293T", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "ATF6α", "S1P", "and", "PDI", "substrate", "-", "trapping", "mutants", "and", "either", "left", "untreated", "(", "-", ")", "or", "treated", "(", "+", ")", "for", "1", "h", "with", "5", "µM", "TG", "to", "induce", "ER", "stress", ".", "ATF6α", "was", "immunoisolated", "from", "cell", "lysates", "with", "mouse", "anti", "-", "ATF6α", ",", "separated", "by", "SDS", "-", "PAGE", "under", "non", "-", "reducing", "conditions", "and", "ATF6α", "detected", "by", "western", "blotting", "using", "rabbit", "anti", "-", "HA", ".", "Blots", "indicate", "that", "mixed", "-", "disulfide", "complexes", "between", "ATF6α", "and", "PDI", "enzymes", "are", "regulated", "by", "ER", "stress", ".", "M", ",", "D", "and", "O", "refer", "to", "ATF6α", "monomer", ",", "dimer", "and", "oligomer", "respectively", ".", "*", "indicates", "positions", "of", "the", "ATF6α", "-", "PDI", "enzymes", "mixed", "-", "disulfide", "complexes", ".", "HEK293T", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "ATF6α", "S1P", "and", "PDI", "substrate", "-", "trapping", "mutants", "and", "either", "left", "untreated", "(", "-", ")", "or", "treated", "(", "+", ")", "for", "1", "h", "with", "5", "µg", "/", "ml", "tunicamycin", "to", "induce", "ER", "stress", ".", "ATF6α", "was", "immunoisolated", "from", "cell", "lysates", "with", "mouse", "anti", "-", "ATF6α", ",", "separated", "by", "SDS", "-", "PAGE", "under", "non", "-", "reducing", "conditions", "and", "ATF6α", "detected", "by", "western", "blotting", "using", "rabbit", "anti", "-", "HA", ".", "Blots", "indicate", "that", "mixed", "-", "disulfide", "complexes", "between", "ATF6α", "and", "PDI", "enzymes", "are", "regulated", "by", "ER", "stress", ".", "M", ",", "D", "and", "O", "refer", "to", "ATF6α", "monomer", ",", "dimer", "and", "oligomer", "respectively", ".", "*", "indicates", "positions", "of", "the", "ATF6α", "-", "PDI", "enzymes", "mixed", "-", "disulfide", "complexes", ".", "*", "*", "indicates", "hypoglycosylated", "ATF6α", ".", "Data", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "HEK293T", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "ATF6α", "S1P", "and", "PDI", "substrate", "-", "trapping", "mutants", "and", "either", "left", "untreated", "(", "-", ")", "or", "treated", "(", "+", ")", "for", "1", "h", "with", "20", "µM", "MG132", "to", "induce", "ER", "stress", ".", "ATF6α", "was", "immunoisolated", "from", "cell", "lysates", "with", "mouse", "anti", "-", "ATF6α", ",", "separated", "by", "SDS", "-", "PAGE", "under", "non", "-", "reducing", "conditions", "and", "ATF6α", "detected", "by", "western", "blotting", "using", "rabbit", "anti", "-", "HA", ".", "Blots", "indicate", "that", "mixed", "-", "disulfide", "complexes", "between", "ATF6α", "and", "PDI", "enzymes", "are", "regulated", "by", "ER", "stress", ".", "M", ",", "D", "and", "O", "refer", "to", "ATF6α", "monomer", ",", "dimer", "and", "oligomer", "respectively", ".", "*", "indicates", "positions", "of", "the", "ATF6α", "-", "PDI", "enzymes", "mixed", "-", "disulfide", "complexes", ".", "*", "*", "indicates", "hypoglycosylated", "ATF6α", ".", "Data", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "HEK293T", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "ATF6α", "S1P", "and", "PDI", "substrate", "-", "trapping", "mutants", "and", "either", "left", "untreated", "(", "-", ")", "or", "treated", "(", "+", ")", "for", "1", "h", "with", "5", "µM", "TG", "to", "induce", "ER", "stress", ".", "Samples", "from", "(", "A", ")", "were", "rerun", "and", "probed", "with", "anti", "-", "sera", "raised", "against", "respective", "PDI", "enzymes", "as", "indicated", "(", "D", ")", ".", "*", "indicates", "positions", "of", "the", "ATF6α", "-", "PDI", "enzymes", "mixed", "-", "disulfide", "complexes", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3 HEK293T cells were co-transfected with ATF6α S1P and PDI substrate-trapping mutants and either left untreated (-) or treated (+) for 1 h with 5 µM TG to induce ER stress. ATF6α was immunoisolated from cell lysates with mouse anti-ATF6α, separated by SDS-PAGE under non-reducing conditions and ATF6α detected by western blotting using rabbit anti-HA. Blots indicate that mixed-disulfide complexes between ATF6α and PDI enzymes are regulated by ER stress. M, D and O refer to ATF6α monomer, dimer and oligomer respectively. *indicates positions of the ATF6α-PDI enzymes mixed-disulfide complexes.  HEK293T cells were co-transfected with ATF6α S1P and PDI substrate-trapping mutants and either left untreated (-) or treated (+) for 1 h with 5 µg/ml tunicamycin to induce ER stress. ATF6α was immunoisolated from cell lysates with mouse anti-ATF6α, separated by SDS-PAGE under non-reducing conditions and ATF6α detected by western blotting using rabbit anti-HA. Blots indicate that mixed-disulfide complexes between ATF6α and PDI enzymes are regulated by ER stress. M, D and O refer to ATF6α monomer, dimer and oligomer respectively. *indicates positions of the ATF6α-PDI enzymes mixed-disulfide complexes. ** indicates hypoglycosylated ATF6α. Data shown are representative of three independent experiments.  HEK293T cells were co-transfected with ATF6α S1P and PDI substrate-trapping mutants and either left untreated (-) or treated (+) for 1 h with 20 µM MG132 to induce ER stress. ATF6α was immunoisolated from cell lysates with mouse anti-ATF6α, separated by SDS-PAGE under non-reducing conditions and ATF6α detected by western blotting using rabbit anti-HA. Blots indicate that mixed-disulfide complexes between ATF6α and PDI enzymes are regulated by ER stress. M, D and O refer to ATF6α monomer, dimer and oligomer respectively. *indicates positions of the ATF6α-PDI enzymes mixed-disulfide complexes. ** indicates hypoglycosylated ATF6α. Data shown are representative of three independent experiments.  HEK293T cells were co-transfected with ATF6α S1P and PDI substrate-trapping mutants and either left untreated (-) or treated (+) for 1 h with 5 µM TG to induce ER stress. Samples from (A) were rerun and probed with anti-sera raised against respective PDI enzymes as indicated (D). *indicates positions of the ATF6α-PDI enzymes mixed-disulfide complexes. "}
{"words": ["Figure", "4", "HEK293T", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "the", "ERp18", "substrate", "-", "trapping", "mutant", "and", "the", "indicated", "ATF6α", "constructs", ".", "Cell", "were", "allowed", "to", "recover", "for", "24", "h", "post", "-", "transfection", "before", "being", "either", "left", "untreated", "(", "-", ")", "or", "treated", "(", "+", ")", "for", "1", "h", "with", "5", "µM", "TG", "to", "induce", "ER", "stress", ".", "ATF6α", "was", "immunoisolated", "from", "cell", "lysates", "with", "mouse", "anti", "-", "ATF6α", ",", "separated", "by", "SDS", "-", "PAGE", "under", "non", "-", "reducing", "conditions", "and", "ATF6α", "detected", "by", "western", "blotting", "using", "rabbit", "anti", "-", "HA", ".", "The", "blot", "confirms", "that", "ATF6α", "C618A", "forms", "a", "stable", "complex", "with", "ERp18", "trapping", "mutant", "following", "ER", "stress", ".", "M", ",", "D", "and", "O", "refer", "to", "ATF6", "monomer", ",", "dimer", "and", "oligomer", "respectively", ".", "*", "indicates", "positions", "of", "the", "ATF6", "-", "ERp18", "mixed", "-", "disulfide", "complexes", ".", "HEK293T", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "GFP", "-", "ATF6α", "and", "ERp18", "trapping", "mutant", "constructs", "as", "indicated", ".", "GFP", "-", "ATF6α", "complexes", "were", "immunoisolated", "using", "GFP", "-", "trap", ".", "Immunoisolated", "material", "was", "separated", "by", "SDS", "-", "PAGE", "under", "non", "-", "reducing", "conditions", "and", "silver", "stained", "to", "detect", "ATF6α", "disulfide", "-", "linked", "complexes", ".", "MS", "analyses", "confirmed", "that", "protein", "bands", "indicated", "by", "black", "arrows", "are", "a", "complex", "comprising", "ATF6α", "and", "ERp18", ",", "whilst", "bands", "marked", "as", "monomer", "(", "M", ")", "and", "oligomer", "(", "O", ")", "contain", "ATF6α", "only", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4 HEK293T cells were co-transfected with the ERp18 substrate-trapping mutant and the indicated ATF6α constructs. Cell were allowed to recover for 24 h post-transfection before being either left untreated (-) or treated (+) for 1 h with 5 µM TG to induce ER stress. ATF6α was immunoisolated from cell lysates with mouse anti-ATF6α, separated by SDS-PAGE under non-reducing conditions and ATF6α detected by western blotting using rabbit anti-HA. The blot confirms that ATF6α C618A forms a stable complex with ERp18 trapping mutant following ER stress. M, D and O refer to ATF6 monomer, dimer and oligomer respectively. *indicates positions of the ATF6-ERp18 mixed-disulfide complexes.  HEK293T cells were co-transfected with GFP-ATF6α and ERp18 trapping mutant constructs as indicated. GFP-ATF6α complexes were immunoisolated using GFP-trap. Immunoisolated material was separated by SDS-PAGE under non-reducing conditions and silver stained to detect ATF6α disulfide-linked complexes. MS analyses confirmed that protein bands indicated by black arrows are a complex comprising ATF6α and ERp18, whilst bands marked as monomer (M) and oligomer (O) contain ATF6α only. "}
{"words": ["Figure", "5CRISPR", "/", "Cas9", "-", "based", "knockout", "of", "ERp18", "in", "HEK293T", "cells", "expressing", "ATF6α", ".", "ERp18", "levels", "in", "control", "(", "WT", ")", "and", "knockout", "(", "KO", ")", "cells", "were", "detected", "with", "an", "antibody", "to", "ERp18", ".", "qPCR", "analysis", "of", "UPR", "target", "genes", "in", "the", "absence", "of", "ER", "stress", ".", "Wild", "type", "and", "ERp18", "knockout", "HEK293T", "cells", "were", "untreated", "prior", "to", "isolation", "of", "mRNA", "for", "qPCR", "analysis", ".", "mRNA", "levels", "for", "Grp78", ",", "Grp94", ",", "ATF6α", ",", "ATF4", ",", "XBP1s", "(", "spliced", "form", "of", "XBP1", ")", "and", "ERp72", "were", "normalized", "to", "GAPDH", "and", "then", "ERp18", "KO", "levels", "compared", "to", "wild", "type", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "standard", "deviation", "for", "three", "independent", "experiments", ".", "qPCR", "analysis", "of", "UPR", "target", "genes", "following", "ER", "stress", ".", "Wild", "type", "and", "ERp18", "knockout", "HEK293T", "cells", "were", "treated", "with", "1", "µM", "TG", "for", "approximately", "16", "h", "prior", "to", "isolation", "of", "mRNA", "for", "qPCR", "analysis", ".", "mRNA", "levels", "for", "Grp78", ",", "Grp94", ",", "ATF6α", ",", "ATF4", ",", "XBP1s", "(", "spliced", "form", "of", "XBP1", ")", "and", "ERp72", "were", "normalized", "to", "GAPDH", "and", "then", "ERp18", "KO", "levels", "compared", "to", "wild", "type", "controls", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "standard", "deviation", "for", "three", "independent", "experiments", ".", "Levels", "of", "BiP", "protein", "in", "wild", "type", "or", "ERp18", "KO", "cells", "before", "and", "after", "ER", "stress", "induction", "with", "thapsigargin", "(", "TG", ")", ".", "Panel", "1", "compares", "wild", "type", "and", "ERp18", "KO", "cells", "as", "indicated", ".", "Panel", "2", "compares", "ERp18", "KO", "cells", "to", "ERp18", "KO", "cells", "that", "have", "been", "transfected", "with", "ERp18", "(", "RV", ")", ".", "Normalised", "BiP", "levels", "from", "(", "D", ")", "were", "quantified", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "standard", "deviation", "for", "three", "independent", "experiments", ".", "Levels", "of", "ERp72", "protein", "in", "wild", "type", "or", "ERp18", "KO", "cells", "before", "and", "after", "ER", "stress", "induction", "with", "thapsigargin", "(", "TG", ")", ".", "Panel", "1", "compares", "wild", "type", "and", "ERp18", "KO", "cells", "as", "indicated", ".", "Panel", "2", "compares", "ERp18", "KO", "cells", "to", "ERp18", "KO", "cells", "that", "have", "been", "transfected", "with", "ERp18", "(", "RV", ")", ".", "Normalised", "ERp72", "levels", "from", "(", "F", ")", "were", "quantified", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "standard", "deviation", "for", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5CRISPR/Cas9-based knockout of ERp18 in HEK293T cells expressing ATF6α. ERp18 levels in control (WT) and knockout (KO) cells were detected with an antibody to ERp18. qPCR analysis of UPR target genes in the absence of ER stress. Wild type and ERp18 knockout HEK293T cells were untreated prior to isolation of mRNA for qPCR analysis. mRNA levels for Grp78, Grp94, ATF6α, ATF4, XBP1s (spliced form of XBP1) and ERp72 were normalized to GAPDH and then ERp18 KO levels compared to wild type. Error bars represent ± standard deviation for three independent experiments.   qPCR analysis of UPR target genes following ER stress. Wild type and ERp18 knockout HEK293T cells were treated with 1 µM TG for approximately 16 h prior to isolation of mRNA for qPCR analysis. mRNA levels for Grp78, Grp94, ATF6α, ATF4, XBP1s (spliced form of XBP1) and ERp72 were normalized to GAPDH and then ERp18 KO levels compared to wild type controls. Error bars represent ± standard deviation for three independent experiments.    Levels of BiP protein in wild type or ERp18 KO cells before and after ER stress induction with thapsigargin (TG). Panel 1 compares wild type and ERp18 KO cells as indicated. Panel 2 compares ERp18 KO cells to ERp18 KO cells that have been transfected with ERp18 (RV).   Normalised BiP levels from (D ) were quantified. Error bars represent ± standard deviation for three independent experiments.    Levels of ERp72 protein in wild type or ERp18 KO cells before and after ER stress induction with thapsigargin (TG). Panel 1 compares wild type and ERp18 KO cells as indicated. Panel 2 compares ERp18 KO cells to ERp18 KO cells that have been transfected with ERp18 (RV).   Normalised ERp72 levels from (F) were quantified. Error bars represent ± standard deviation for three independent experiments.   "}
{"words": ["Figure", "6", "A", ",", "B", "Wild", "type", "and", "ERp18", "KO", "cells", "stably", "expressing", "ATF6α", "were", "treated", "with", "5", "µM", "TG", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Cells", "were", "then", "subject", "to", "differential", "centrifugation", "to", "obtain", "membrane", "(", "A", ")", "and", "nuclear", "fractions", "(", "B", ")", "which", "were", "separated", "by", "SDS", "-", "PAGE", "under", "reducing", "conditions", "and", "analysed", "by", "western", "blotting", "for", "ATF6α", ".", "The", "positions", "of", "full", "-", "length", "ATF6α", "(", "ATF6", "-", "FL", ")", ",", "cleaved", "membrane", "-", "associated", "ATF6α", "(", "ATF6", "-", "P", ")", "and", "nuclear", "translocated", "S2P", "cleaved", "ATF6α", "(", "ATF6", "-", "N", ")", "are", "as", "indicated", ".", "HDAC2", "was", "used", "as", "a", "nuclear", "marker", ".", "(", "C", ")", "ATF6α", "was", "immunoisolated", "from", "wild", "type", "or", "ERp18", "KO", "cells", "expressing", "ATF6α", ".", "Samples", "were", "separated", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "ATF6α", "was", "detected", "by", "western", "blotting", ".", "HC", "indicates", "immunoglobulin", "heavy", "chains", ".", "(", "D", ",", "E", ")", "Blots", "of", "membrane", "and", "nuclear", "fractions", "respectively", "from", "ERp18", "KO", "cells", "overexpressing", "ATF6α", ",", "either", "untreated", "(", "-", ")", "or", "treated", "(", "+", ")", "with", "30", "µM", "PF429242", "(", "S1P", "inhibitor", ")", "prior", "to", "and", "following", "induction", "of", "ER", "stress", "with", "10", "mM", "DTT", ".", "The", "positions", "of", "ATF6", "-", "P", ",", "ATF6", "-", "M", "and", "ATF6", "-", "N", "are", "as", "indicated", ".", "The", "unprocessed", "ER", "-", "localised", "ATF6α", "(", "designated", "ER", ")", "and", "the", "O", "-", "linked", "glycan", "modified", "Golgi", "-", "translocated", "ATF6α", "(", "designated", "G", ")", "are", "indicated", ".", "HDAC2", "was", "included", "as", "a", "nuclear", "marker", ".", "The", "blots", "in", "(", "D", ",", "E", ")", "confirm", "that", "ATF6", "-", "P", "is", "produced", "independently", "of", "S1P", "and", "also", "the", "absence", "of", "ATF6α", "processing", "to", "ATF6", "-", "N", "in", "the", "presence", "of", "the", "S1P", "inhibitor", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6 A, B Wild type and ERp18 KO cells stably expressing ATF6α were treated with 5 µM TG for the indicated times. Cells were then subject to differential centrifugation to obtain membrane (A) and nuclear fractions (B) which were separated by SDS-PAGE under reducing conditions and analysed by western blotting for ATF6α. The positions of full-length ATF6α (ATF6-FL), cleaved membrane-associated ATF6α (ATF6-P) and nuclear translocated S2P cleaved ATF6α (ATF6-N) are as indicated. HDAC2 was used as a nuclear marker.  (C) ATF6α was immunoisolated from wild type or ERp18 KO cells expressing ATF6α. Samples were separated by SDS-PAGE and ATF6α was detected by western blotting. HC indicates immunoglobulin heavy chains.  (D, E) Blots of membrane and nuclear fractions respectively from ERp18 KO cells overexpressing ATF6α, either untreated (-) or treated (+) with 30 µM PF429242 (S1P inhibitor) prior to and following induction of ER stress with 10 mM DTT. The positions of ATF6-P, ATF6-M and ATF6-N are as indicated. The unprocessed ER-localised ATF6α (designated ER) and the O-linked glycan modified Golgi-translocated ATF6α (designated G) are indicated. HDAC2 was included as a nuclear marker. The blots in (D, E) confirm that ATF6-P is produced independently of S1P and also the absence of ATF6α processing to ATF6-N in the presence of the S1P inhibitor. "}
{"words": ["Figure", "7", "HEK293T", "cells", "stably", "overexpressing", "wild", "type", "ATF6α", "or", "a", "D564G", "mutant", "were", "treated", "with", "10", "mM", "DTT", "as", "indicated", "to", "induce", "ER", "stress", "in", "the", "presence", "of", "the", "S1P", "inhibitor", ".", "Cell", "lysates", "were", "prepared", ",", "separated", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "then", "probed", "with", "anti", "-", "ATF6α", ".", "Blot", "reveals", "the", "presence", "of", "O", "-", "linked", "glycan", "modified", "Golgi", "-", "translocated", "ATF6", "(", "designated", "G", ")", ",", "which", "is", "absent", "for", "the", "D564G", "mutant", ",", "confirming", "a", "lack", "of", "ER", "to", "Golgi", "trafficking", ".", "Wild", "type", "and", "ERp18", "KO", "cell", "lines", "stably", "expressing", "ATF6α", "D564G", "were", "either", "left", "untreated", "(", "-", ")", "or", "treated", "(", "+", ")", "with", "5", "µg", "/", "ml", "brefeldin", "A", "for1", "h", "prior", "to", "cell", "lysis", ".", "The", "anti", "-", "ATF6α", "western", "blot", "of", "membrane", "fractions", "reveals", "proteolytic", "processing", "by", "S1P", "to", "produce", "ATF6", "-", "M", ",", "only", "in", "the", "brefeldin", "A", "treated", "cells", ".", "Nuclear", "fractions", "confirm", "the", "presence", "of", "S2P", "cleavage", "product", ",", "ATF6", "-", "N", "following", "brefeldin", "A", "treatment", ".", "Anti", "-", "HDAC2", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", "for", "the", "nuclear", "fraction", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7 HEK293T cells stably overexpressing wild type ATF6α or a D564G mutant were treated with 10 mM DTT as indicated to induce ER stress in the presence of the S1P inhibitor. Cell lysates were prepared, separated by SDS-PAGE and then probed with anti-ATF6α. Blot reveals the presence of O-linked glycan modified Golgi-translocated ATF6 (designated G), which is absent for the D564G mutant, confirming a lack of ER to Golgi trafficking.  Wild type and ERp18 KO cell lines stably expressing ATF6α D564G were either left untreated (-) or treated (+) with 5 µg/ml brefeldin A for1 h prior to cell lysis. The anti-ATF6α western blot of membrane fractions reveals proteolytic processing by S1P to produce ATF6-M, only in the brefeldin A treated cells. Nuclear fractions confirm the presence of S2P cleavage product, ATF6-N following brefeldin A treatment. Anti-HDAC2 was used as a loading control for the nuclear fraction. "}
{"words": ["Figure", "8", "A", "-", "C", "Wild", "type", "cells", "stably", "expressing", "ATF6α", "(", "A", ")", "or", "ERp18", "KO", "cells", "stably", "expressing", "ATF6α", "(", "B", ")", ",", "and", "ERp18", "KO", "cells", "stably", "expressing", "ATF6α", "transiently", "transfected", "with", "ERp18", "(", "RV", "cells", ")", "(", "C", ")", ",", "were", "pre", "-", "treated", "with", "30", "µM", "PF429242", "(", "S1P", "inhibitor", ")", "for", "1", "h", "prior", "to", "induction", "of", "ER", "stress", "with", "10", "mM", "DTT", "as", "indicated", ".", "D", "-", "F", "Wild", "type", "cells", "transiently", "expressing", "ATF6", "C467A", "(", "D", ")", ",", "ATF6", "C618A", "(", "E", ")", ",", "or", "ATF6", "DM", "(", "F", ")", "were", "treated", "as", "above", ".", "Whole", "cell", "lysates", "were", "separated", "by", "SDS", "-", "PAGE", "under", "reducing", "conditions", "and", "analysed", "by", "western", "blotting", "for", "ATF6α", ".", "The", "positions", "of", "unprocessed", "ER", "-", "localised", "ATF6α", "(", "ER", ")", "and", "the", "O", "-", "linked", "glycan", "modified", "Golgi", "-", "translocated", "ATF6α", "(", "Gol", ")", "are", "indicated", "as", "is", "ATF6", "-", "P", ".", "G", "The", "percentage", "of", "Golgi", "-", "ATF6α", "was", "quantified", ",", "the", "error", "bars", "represent", "±", "standard", "deviation", "for", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8 A-C Wild type cells stably expressing ATF6α (A) or ERp18 KO cells stably expressing ATF6α (B), and ERp18 KO cells stably expressing ATF6α transiently transfected with ERp18 (RV cells) (C), were pre-treated with 30 µM PF429242 (S1P inhibitor) for 1 h prior to induction of ER stress with 10 mM DTT as indicated.  D-F Wild type cells transiently expressing ATF6 C467A (D), ATF6 C618A (E), or ATF6 DM (F) were treated as above. Whole cell lysates were separated by SDS-PAGE under reducing conditions and analysed by western blotting for ATF6α. The positions of unprocessed ER-localised ATF6α (ER) and the O-linked glycan modified Golgi-translocated ATF6α (Gol) are indicated as is ATF6-P.  G The percentage of Golgi-ATF6α was quantified, the error bars represent ± standard deviation for at least three independent experiments. "}
{"words": ["Figure", "1FOXA1", "and", "FOXA2", "expression", "in", "human", "PDAC", "areas", "with", "distinct", "differentiation", "grade", ".", "Immunohistochemistry", "analysis", "of", "FOXA1", "(", "top", ")", "and", "FOXA2", "(", "bottom", ")", "in", "human", "PDAC", ".", "Representative", "G1", ",", "G2", "and", "G3", "areas", "from", "one", "patient", "are", "shown", ".", "Red", "dotted", "lines", "indicate", "the", "borders", "of", "poorly", "differentiated", "(", "G3", ")", "tumor", "areas", ".", "Percent", "of", "FOXA1", "-", "and", "FOXA2", "-", "positive", "nuclei", "in", "PDAC", "cells", "from", "areas", "of", "different", "grade", ".", "Tissue", "microarrays", "were", "automatically", "acquired", "and", "quantified", "using", "QuPath", ".", "The", "number", "(", "n", ")", "of", "analyzed", "areas", "of", "each", "grade", "is", "indicated", ".", "Expression", "of", "FOXA1", "and", "FOXA2", "in", "low", "-", "grade", "and", "high", "-", "grade", "PDAC", "cell", "lines", ".", "Vinculin", "is", "shown", "as", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1FOXA1 and FOXA2 expression in human PDAC areas with distinct differentiation grade. Immunohistochemistry analysis of FOXA1 (top) and FOXA2 (bottom) in human PDAC. Representative G1, G2 and G3 areas from one patient are shown. Red dotted lines indicate the borders of poorly differentiated (G3) tumor areas.Percent of FOXA1- and FOXA2-positive nuclei in PDAC cells from areas of different grade. Tissue microarrays were automatically acquired and quantified using QuPath. The number (n) of analyzed areas of each grade is indicated.Expression of FOXA1 and FOXA2 in low-grade and high-grade PDAC cell lines. Vinculin is shown as loading control."}
{"words": ["Figure", "2Western", "blot", "showing", "siRNA", "-", "mediated", "depletion", "of", "FOXA1", "and", "/", "or", "FOXA2", "in", "the", "low", "-", "grade", "CFPAC1", "cell", "line", ".", "The", "three", "biological", "replicates", "used", "in", "the", "subsequent", "experiments", "are", "shown", ".", "Heatmap", "showing", "row", "-", "normalized", "expression", "of", "differentially", "expressed", "genes", "in", "CFPAC1", "cells", "depleted", "of", "FOXA1", "/", "2", "(", "FDR", "≤", "0", ".", "05", "and", "absolute", "log2", "FC", "≥", "1", ")", ".", "Blue", "and", "orange", "depict", "down", "-", "and", "up", "-", "regulation", ",", "respectively", ".", "FOXA2", "and", "FOXA1", "expression", "in", "wild", "type", "and", "genome", "-", "edited", "high", "-", "grade", "PANC1", "cells", ".", "Three", "different", "bulk", "populations", "were", "used", "for", "RNA", "-", "seq", "experiments", ".", "Heatmap", "showing", "row", "-", "normalized", "expression", "of", "differentially", "expressed", "genes", "in", "PANC1", "cells", "deleted", "of", "FOXA2", "(", "FDR", "≤", "0", ".", "05", "and", "absolute", "log2", "FC", "≥", "1", ")", ".", "Blue", "and", "orange", "depict", "down", "-", "and", "up", "-", "regulation", ",", "respectively", ".", "Representative", "Gene", "Ontology", "(", "GO", ")", "terms", "enriched", "in", "genes", "differentially", "expressed", "upon", "FOXA1", "/", "2", "depletion", "in", "CFPAC1", "cells", ".", "Terms", "are", "ranked", "by", "the", "negative", "log10", "p", "-", "value", "from", "the", "hypergeometric", "test", ".", "Panels", "on", "the", "right", "show", "the", "effects", "of", "FOXA1", "/", "2", "depletion", "on", "cell", "morphology", "and", "adhesion", "to", "multiple", "substrates", ".", "Three", "replicates", "per", "condition", "were", "used", ":", "circularity", "index", "was", "measured", "on", "100", "different", "cells", "per", "condition", "while", "adhesion", "is", "reported", "as", "mean", "of", "three", "different", "fields", "per", "replicate", "for", "a", "total", "of", "nine", "observations", "per", "condition", ".", "Representative", "GO", "terms", "enriched", "in", "genes", "differentially", "expressed", "upon", "FOXA2", "deletion", "in", "PANC1", "cells", ".", "Terms", "are", "ranked", "by", "the", "negative", "log10", "p", "-", "value", "from", "the", "hypergeometric", "test", ".", "Panels", "on", "the", "right", "show", "the", "effects", "of", "FOXA2", "deletion", "on", "cell", "morphology", "and", "adhesion", "to", "multiple", "substrates", ".", "Three", "different", "bulk", "populations", "were", "used", "as", "biological", "replicates", ":", "circularity", "index", "was", "measured", "on", "60", "different", "cells", "per", "bulk", "population", "while", "adhesion", "is", "reported", "as", "mean", "of", "six", "different", "fields", "per", "bulk", "for", "a", "total", "of", "eighteen", "observations", "per", "condition", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Western blot showing siRNA-mediated depletion of FOXA1 and/or FOXA2 in the low-grade CFPAC1 cell line. The three biological replicates used in the subsequent experiments are shown.Heatmap showing row-normalized expression of differentially expressed genes in CFPAC1 cells depleted of FOXA1/2 (FDR ≤ 0.05 and absolute log2 FC ≥ 1). Blue and orange depict down- and up-regulation, respectively.FOXA2 and FOXA1 expression in wild type and genome-edited high-grade PANC1 cells. Three different bulk populations were used for RNA-seq experiments.Heatmap showing row-normalized expression of differentially expressed genes in PANC1 cells deleted of FOXA2 (FDR ≤ 0.05 and absolute log2 FC ≥ 1). Blue and orange depict down- and up-regulation, respectively.Representative Gene Ontology (GO) terms enriched in genes differentially expressed upon FOXA1/2 depletion in CFPAC1 cells. Terms are ranked by the negative log10 p-value from the hypergeometric test. Panels on the right show the effects of FOXA1/2 depletion on cell morphology and adhesion to multiple substrates. Three replicates per condition were used: circularity index was measured on 100 different cells per condition while adhesion is reported as mean of three different fields per replicate for a total of nine observations per condition.Representative GO terms enriched in genes differentially expressed upon FOXA2 deletion in PANC1 cells. Terms are ranked by the negative log10 p-value from the hypergeometric test. Panels on the right show the effects of FOXA2 deletion on cell morphology and adhesion to multiple substrates. Three different bulk populations were used as biological replicates: circularity index was measured on 60 different cells per bulk population while adhesion is reported as mean of six different fields per bulk for a total of eighteen observations per condition."}
{"words": ["Figure", "3Scatter", "plots", "showing", "the", "correlation", "between", "FOXA2", "ChIP", "-", "seq", "biological", "duplicates", "in", "CFPAC1", "(", "top", "panel", ")", "and", "PANC1", "cells", "(", "bottom", "panel", ")", ".", "Pearson", "'", "s", "correlation", "(", "r", ")", "between", "samples", "is", "indicated", ".", "Scatter", "plot", "showing", "the", "correlation", "between", "FOXA2", "ChIP", "-", "seq", "peaks", "in", "CFPAC1", "and", "PANC1", "cells", ".", "Green", "and", "blue", "dots", "indicate", "FOXA2", "peaks", "that", "are", "significantly", "(", "FDR", "<", "0", ".", "001", ")", "different", "between", "the", "two", "cell", "types", "and", "with", "log2", "fold", "enrichment", "≥", "2", "as", "determined", "by", "DiffBind", ".", "All", "other", "peaks", "are", "indicated", "as", "grey", "dots", ".", "The", "boxplots", "on", "the", "right", "show", "the", "intensity", "of", "CFPAC1", "-", "specific", ",", "PANC1", "-", "specific", "and", "other", "FOXA2", "peaks", ".", "Central", "values", "represent", "the", "median", ",", "the", "bars", "the", "25th", "and", "75th", "percentile", "and", "the", "vertical", "lines", "the", "lower", "and", "upper", "whiskers", ".", "Representative", "FOXA2", "ChIP", "-", "seq", "snapshot", "showing", "FOXA2", "peaks", "classified", "as", "CFPAC1", "-", "specific", ",", "shared", "or", "PANC1", "-", "specific", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Scatter plots showing the correlation between FOXA2 ChIP-seq biological duplicates in CFPAC1 (top panel) and PANC1 cells (bottom panel). Pearson's correlation (r) between samples is indicated.Scatter plot showing the correlation between FOXA2 ChIP-seq peaks in CFPAC1 and PANC1 cells. Green and blue dots indicate FOXA2 peaks that are significantly (FDR < 0.001) different between the two cell types and with log2 fold enrichment ≥ 2 as determined by DiffBind. All other peaks are indicated as grey dots. The boxplots on the right show the intensity of CFPAC1-specific, PANC1-specific and other FOXA2 peaks. Central values represent the median, the bars the 25th and 75th percentile and the vertical lines the lower and upper whiskers.Representative FOXA2 ChIP-seq snapshot showing FOXA2 peaks classified as CFPAC1-specific, shared or PANC1-specific."}
{"words": ["Figure", "4The", "five", "top", "transcription", "factor", "motifs", "over", "-", "represented", "in", "TSS", "-", "distal", "CFPAC1", "-", "specific", "FOXA2", "peaks", ".", "TFs", "were", "grouped", "into", "families", "or", "subfamilies", "and", "ranked", "based", "on", "the", "best", "PWM", "q", "-", "value", ".", "The", "POU", "domain", "TF", "family", "includes", "HNF1β", ".", "Top", "scoring", "motifs", "are", "shown", "on", "the", "right", ".", "Bar", "plot", "showing", "the", "percentage", "of", "different", "sets", "of", "FOXA2", "peaks", "overlapping", "with", "HNF1β", "ChIP", "-", "seq", "peaks", ".", "Bar", "plot", "showing", "the", "percentage", "of", "different", "sets", "of", "FOXA2", "peaks", "overlapping", "with", "FOS", "(", "left", ")", "and", "JUNB", "(", "right", ")", "ChIP", "-", "seq", "peaks", ".", "Two", "representative", "ChIP", "-", "seq", "snapshots", "indicating", "the", "genomic", "distribution", "of", "FOXA2", "and", "partner", "transcription", "factors", "in", "CFPAC1", "peaks", ".", "The", "FOXA2", "ChIP", "-", "seq", "track", "in", "PANC1", "cells", "is", "also", "shown", "for", "comparison", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4The five top transcription factor motifs over-represented in TSS-distal CFPAC1-specific FOXA2 peaks. TFs were grouped into families or subfamilies and ranked based on the best PWM q-value. The POU domain TF family includes HNF1β. Top scoring motifs are shown on the right.Bar plot showing the percentage of different sets of FOXA2 peaks overlapping with HNF1β ChIP-seq peaks.Bar plot showing the percentage of different sets of FOXA2 peaks overlapping with FOS (left) and JUNB (right) ChIP-seq peaks.Two representative ChIP-seq snapshots indicating the genomic distribution of FOXA2 and partner transcription factors in CFPAC1 peaks. The FOXA2 ChIP-seq track in PANC1 cells is also shown for comparison."}
{"words": ["Figure", "5Representative", "areas", "from", "human", "PDAC", "tissue", "showing", "expression", "of", "HNF1β", "in", "G1", ",", "G2", "and", "G3", "areas", ".", "The", "red", "dotted", "line", "indicates", "the", "borders", "of", "a", "G3", "area", ".", "The", "percentage", "of", "HNF1β", "-", "positive", "cells", "in", "areas", "of", "different", "grade", "from", "a", "PDAC", "tissue", "microarray", "is", "shown", ".", "Colocalization", "of", "HNF1β", "and", "FOXA2", "in", "human", "PDAC", "areas", ".", "PDAC", "sections", "from", "three", "different", "patients", "were", "stained", "with", "the", "anti", "-", "HNF1β", "antibody", ",", "stripped", "and", "re", "-", "stained", "with", "the", "anti", "-", "FOXA2", "antibody", ".", "The", "red", "dotted", "areas", "on", "the", "left", "represent", "poorly", "differentiated", "(", "G3", ")", "tumor", "regions", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Representative areas from human PDAC tissue showing expression of HNF1β in G1, G2 and G3 areas. The red dotted line indicates the borders of a G3 area. The percentage of HNF1β-positive cells in areas of different grade from a PDAC tissue microarray is shown.Colocalization of HNF1β and FOXA2 in human PDAC areas. PDAC sections from three different patients were stained with the anti-HNF1β antibody, stripped and re-stained with the anti-FOXA2 antibody. The red dotted areas on the left represent poorly differentiated (G3) tumor regions."}
{"words": ["Figure", "6FOXA2", "peaks", "in", "CFPAC1", "cells", "were", "divided", "into", "5", "clusters", "based", "on", "their", "association", "with", "HNF1β", "and", "the", "effects", "of", "HNF1β", "loss", "on", "FOXA2", "binding", "and", "chromatin", "accessibility", "(", "determined", "by", "ATAC", "-", "seq", ")", ".", "Clusters", "1", "-", "4", "were", "HNF1β", "-", "positive", "while", "cluster", "5", "was", "HNF1β", "-", "negative", ".", "The", "heat", "-", "maps", "on", "the", "left", "show", "FOXA2", ",", "HNF1β", ",", "ATAC", "-", "seq", "and", "H3K27Ac", "profiles", "at", "FOXA2", "-", "bound", "genomic", "regions", ".", "The", "three", "heat", "-", "maps", "on", "the", "right", "show", "JunB", "ChIP", "-", "seq", "data", "and", "ATAC", "-", "seq", "data", "in", "wild", "type", "or", "Jun", "/", "JunB", "double", "knockout", "(", "DKO", ")", "CFPAC1", "cells", ".", "Data", "are", "shown", "in", "+", "/", "-", "3", "kb", "regions", "centered", "on", "the", "summit", "of", "FOXA2", "peaks", ".", "Characterization", "of", "clusters", "1", "-", "3", ".", "Left", ":", "quantification", "of", "the", "indicated", "signals", "at", "FOXA2", "bound", "regions", "in", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "HNF1β", "knock", "-", "out", "(", "KO", ")", "cells", ".", "Central", "values", "represent", "the", "median", ",", "the", "bars", "the", "25th", "and", "75th", "percentile", "and", "the", "vertical", "lines", "the", "lower", "and", "upper", "whiskers", ".", "Middle", ":", "distribution", "of", "FOXA", "and", "HNF1β", "motifs", "relative", "to", "the", "summit", "of", "FOXA2", "peaks", ".", "Right", ":", "over", "-", "represented", "motifs", "in", "clusters", "1", "-", "3", "and", "inferred", "binding", "models", ".", "Quantification", "of", "JunB", "ChIP", "-", "seq", "signals", "in", "clusters", "1", "to", "5", ".", "(", "Right", ")", "Quantification", "of", "ATAC", "-", "seq", "signals", "in", "clusters", "1", "to", "5", "in", "wild", "type", "and", "Jun", "/", "JunB", "double", "KO", "(", "DKO", ")", "CFPAC1", "cells", ".", "Central", "values", "represent", "the", "median", ",", "the", "bars", "the", "25th", "and", "75th", "percentile", "and", "the", "vertical", "lines", "the", "lower", "and", "upper", "whiskers", ".", "Representative", "snapshot", "showing", "changes", "in", "FOXA2", "occupancy", ",", "chromatin", "accessibility", "and", "histone", "acetylation", "in", "HNF1β", "knock", "-", "out", "CFPAC1", "cells", ".", "The", "FOXA2", "ChIP", "-", "seq", "track", "in", "PANC1", "cells", "is", "also", "shown", "for", "comparison", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6FOXA2 peaks in CFPAC1 cells were divided into 5 clusters based on their association with HNF1β and the effects of HNF1β loss on FOXA2 binding and chromatin accessibility (determined by ATAC-seq). Clusters 1-4 were HNF1β- positive while cluster 5 was HNF1β-negative. The heat-maps on the left show FOXA2, HNF1β, ATAC-seq and H3K27Ac profiles at FOXA2-bound genomic regions. The three heat-maps on the right show JunB ChIP-seq data and ATAC-seq data in wild type or Jun/JunB double knockout (DKO) CFPAC1 cells. Data are shown in +/- 3 kb regions centered on the summit of FOXA2 peaks.Characterization of clusters 1-3. Left: quantification of the indicated signals at FOXA2 bound regions in wild-type (WT) and HNF1β knock-out (KO) cells. Central values represent the median, the bars the 25th and 75th percentile and the vertical lines the lower and upper whiskers. Middle: distribution of FOXA and HNF1β motifs relative to the summit of FOXA2 peaks. Right: over-represented motifs in clusters 1-3 and inferred binding models.Quantification of JunB ChIP-seq signals in clusters 1 to 5. (Right) Quantification of ATAC-seq signals in clusters 1 to 5 in wild type and Jun/JunB double KO (DKO) CFPAC1 cells. Central values represent the median, the bars the 25th and 75th percentile and the vertical lines the lower and upper whiskers.Representative snapshot showing changes in FOXA2 occupancy, chromatin accessibility and histone acetylation in HNF1β knock-out CFPAC1 cells. The FOXA2 ChIP-seq track in PANC1 cells is also shown for comparison."}
{"words": ["Figure", "7Western", "blot", "showing", "HNF1β", "over", "-", "expression", "after", "lentiviral", "transduction", "of", "PANC1", "cells", ".", "Expression", "of", "FOXA2", "in", "wild", "type", "and", "over", "-", "expressing", "(", "O", ".", "E", ".", ")", "cells", "is", "shown", ".", "Vinculin", ":", "loading", "control", ".", "Scatter", "plot", "showing", "the", "genomic", "distribution", "of", "FOXA2", "in", "PANC1", "cells", "transduced", "with", "the", "HNF1β", "-", "expressing", "lentivirus", "(", "HNF1B", "O", ".", "E", ".", ")", "and", "in", "their", "matched", "mock", "-", "infected", "control", ".", "The", "fraction", "of", "gained", ",", "unchanged", "and", "lost", "FOXA2", "peaks", "overlapping", "HNF1β", "ChIP", "-", "seq", "peaks", "in", "transduced", "PANC1", "cells", "is", "shown", "in", "the", "pie", "-", "charts", "on", "the", "right", ".", "TF", "motif", "over", "-", "represented", "in", "gained", "or", "lost", "FOXA2", "-", "bound", "genomic", "regions", ".", "Representative", "snapshot", "from", "PANC1", "cells", "transduced", "with", "the", "HNF1β", "-", "expressing", "lentivirus", ".", "HNF1B", "O", ".", "E", ".", ":", "HNF1B", "over", "-", "expression", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Western blot showing HNF1β over-expression after lentiviral transduction of PANC1 cells. Expression of FOXA2 in wild type and over-expressing (O.E.) cells is shown. Vinculin: loading control.Scatter plot showing the genomic distribution of FOXA2 in PANC1 cells transduced with the HNF1β-expressing lentivirus (HNF1B O.E.) and in their matched mock-infected control. The fraction of gained, unchanged and lost FOXA2 peaks overlapping HNF1β ChIP-seq peaks in transduced PANC1 cells is shown in the pie-charts on the right.TF motif over-represented in gained or lost FOXA2-bound genomic regions.Representative snapshot from PANC1 cells transduced with the HNF1β-expressing lentivirus. HNF1B O.E.: HNF1B over-expression."}
{"words": ["Figure", "8Percentage", "of", "different", "sets", "of", "FOXA2", "peaks", "overlapping", "HOXB8", "ChIP", "-", "seq", "peaks", ".", "Representative", "snapshots", "showing", "the", "overlap", "between", "HOXB8", "and", "FOXA2", "ChIP", "-", "seq", "peaks", "in", "PANC1", "cells", ".", "The", "FOXA2", "ChIP", "-", "seq", "track", "in", "CFPAC1", "cells", "is", "also", "shown", "for", "comparison", ".", "FOXA2", "ChIP", "-", "seq", "in", "CFPAC1", "cells", "transduced", "with", "a", "HOXB8", "-", "expressing", "lentivirus", "and", "in", "their", "matched", "mock", "-", "infected", "control", ".", "Gained", "(", "brown", ")", "and", "lost", "(", "yellow", ")", "FOXA2", "peaks", "are", "shown", ".", "Pie", "-", "charts", "on", "the", "right", "show", "the", "fraction", "of", "gained", ",", "unchanged", "and", "lost", "peaks", "overlapping", "HOXB8", "ChIP", "-", "seq", "peaks", "in", "transduced", "CFPAC1", "cells", ".", "TF", "motif", "over", "-", "represented", "in", "gained", "or", "lost", "FOXA2", "-", "bound", "genomic", "regions", ".", "Expression", "of", "HNF1β", "protein", "in", "wild", "-", "type", "and", "HOXB8", "-", "expressing", "PANC1", "cells", ".", "Representative", "snapshots", "from", "CFPAC1", "cells", "transduced", "with", "the", "HOXB8", "-", "expressing", "lentivirus", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8Percentage of different sets of FOXA2 peaks overlapping HOXB8 ChIP-seq peaks.Representative snapshots showing the overlap between HOXB8 and FOXA2 ChIP-seq peaks in PANC1 cells. The FOXA2 ChIP-seq track in CFPAC1 cells is also shown for comparison.FOXA2 ChIP-seq in CFPAC1 cells transduced with a HOXB8-expressing lentivirus and in their matched mock-infected control. Gained (brown) and lost (yellow) FOXA2 peaks are shown. Pie-charts on the right show the fraction of gained, unchanged and lost peaks overlapping HOXB8 ChIP-seq peaks in transduced CFPAC1 cells.TF motif over-represented in gained or lost FOXA2-bound genomic regions.Expression of HNF1β protein in wild-type and HOXB8-expressing PANC1 cells.Representative snapshots from CFPAC1 cells transduced with the HOXB8-expressing lentivirus."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Co", "-", "localization", "of", "c", "-", "terminally", "GFP", "-", "or", "mCherry", "-", "tagged", "Apl5", ",", "Sec7", "and", "Vps41", "in", "a", "vam3", "temperature", "sensitive", "(", "ts", ")", "background", "strain", ".", "Cells", "were", "grown", "over", "night", "at", "23", "°", "C", "and", "where", "indicated", "shifted", "to", "37", "°", "C", "for", "3", "h", "prior", "to", "imaging", ".", "White", "arrowheads", "indicate", "co", "-", "localization", "events", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "µm", ".", "Scale", "bar", "in", "inset", ",", "2", "µm", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "co", "-", "localization", "events", "Single", "events", "were", "counted", "and", "the", "percentage", "of", "co", "-", "localization", "normalized", "to", "the", "number", "of", "Apl5", "-", "punctae", "was", "plotted", "(", "n", "≥", "187", "cells", ")", ".", "Bars", "show", "the", "mean", "percentage", "of", "co", "-", "localization", "±", "standard", "deviation", ".", "(", "C", ")", "Re", "-", "localization", "of", "Apl5", "upon", "Vps41", "re", "-", "localization", ".", "Vps41", "was", "tagged", "with", "a", "C", "-", "terminal", "FRBGFP", "tag", "in", "a", "strain", ",", "where", "Apl5", "carries", "a", "C", "-", "terminal", "mCherry", "and", "Pma1", "a", "FKBP", "-", "tag", "Cells", "were", "grown", "in", "either", "the", "absence", "(", "control", ")", "or", "presence", "of", "10", "μM", "rapamycin", ",", "and", "localization", "of", "Vps41", "and", "Apl5", "was", "analysed", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μm", ".", "(", "D", ")", "Effect", "of", "clathrin", "deletion", "on", "the", "AP", "-", "3", "pathway", ".", "GFP", "-", "tagged", "Nyv1", "with", "a", "C", "-", "terminal", "Snc1", "transmembrane", "domain", "(", "GNS", ")", "was", "localized", "relative", "to", "FM4", "-", "64", "stained", "vacuoles", "in", "the", "indicated", "strains", ".", "Labeling", "of", "the", "cell", "surface", "by", "GFP", "indicates", "a", "defect", "in", "the", "AP", "-", "3", "pathway", "(", "E", ")", "Quantification", "of", "AP", "-", "3", "defect", "from", "(", "D", ")", ".", "Linear", "intensity", "plots", "were", "laid", "over", "the", "cells", ",", "the", "AP", "-", "3", "defect", "was", "calculated", "by", "dividing", "GFP", "-", "intensities", "on", "the", "vacuolar", "membrane", "by", "the", "sum", "of", "the", "intensity", "of", "vacuolar", ",", "and", "plasma", "membrane", "signal", "(", "n", "≥", "30", "cells", ")", ".", "Bars", "show", "the", "mean", "vacuolar", "signal", "over", "total", "signal", "±", "standard", "deviation", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Co-localization of c-terminally GFP- or mCherry-tagged Apl5, Sec7 and Vps41 in a vam3 temperature sensitive (ts) background strain. Cells were grown over night at 23°C and where indicated shifted to 37°C for 3 h prior to imaging. White arrowheads indicate co-localization events. Scale bar, 5 µm. Scale bar in inset, 2 µm.(B) Quantification of co-localization events Single events were counted and the percentage of co-localization normalized to the number of Apl5-punctae was plotted (n ≥ 187 cells). Bars show the mean percentage of co-localization ± standard deviation.(C) Re-localization of Apl5 upon Vps41 re-localization. Vps41 was tagged with a C-terminal FRBGFP tag in a strain, where Apl5 carries a C-terminal mCherry and Pma1 a FKBP-tag Cells were grown in either the absence (control) or presence of 10 μM rapamycin, and localization of Vps41 and Apl5 was analysed by fluorescence microscopy. Scale bar, 5 μm.(D) Effect of clathrin deletion on the AP-3 pathway. GFP-tagged Nyv1 with a C-terminal Snc1 transmembrane domain (GNS) was localized relative to FM4-64 stained vacuoles in the indicated strains. Labeling of the cell surface by GFP indicates a defect in the AP-3 pathway (E) Quantification of AP-3 defect from (D). Linear intensity plots were laid over the cells, the AP-3 defect was calculated by dividing GFP-intensities on the vacuolar membrane by the sum of the intensity of vacuolar, and plasma membrane signal (n ≥ 30 cells). Bars show the mean vacuolar signal over total signal ± standard deviation."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "C", ")", "Tethering", "of", "AP", "-", "3", "vesicles", "to", "the", "mitochondrial", "surface", ".", "Cells", "were", "grown", "at", "30", "°", "C", "in", "YPG", "and", "kept", "in", "logarithmic", "phase", ".", "Just", "prior", "to", "imaging", ",", "the", "mitochondrial", "DNA", "was", "stained", "with", "DAPI", "Localization", "of", "Apl6", "and", "Vps41", "was", "analysed", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "First", "column", "shows", "DIC", "(", "difference", "interference", "contrast", ")", "image", "of", "cells", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "µm", ".", "The", "inset", "shows", "the", "indicated", "magnification", ".", "Scale", "bar", "in", "inset", ",", "2", "µm", ".", "Apl5", "-", "dots", "co", "-", "localizing", "with", "GFP", "signal", "were", "counted", "and", "plotted", "in", "percent", "of", "the", "total", "number", "of", "Apl5", "-", "dots", ".", "Bars", "show", "the", "mean", "percentage", "of", "co", "-", "localization", "±", "standard", "deviation", "(", "n", "≥", "60", "cells", ")", ".", "(", "E", ",", "F", ")", "Purification", "of", "mitochondria", "from", "selected", "strains", ".", "Mitochondria", "were", "purified", "from", "the", "indicated", "strains", "as", "described", "in", "the", "methods", ".", "The", "amount", "corresponding", "to", "1", "%", "of", "the", "total", "volume", "was", "loaded", "of", "the", "'", "load", "'", "'", "sample", ",", "5", "%", "were", "used", "for", "'", "crude", "'", "and", "'", "pure", "'", "mitochondria", "fractions", ".", "Samples", "were", "loaded", "on", "a", "10", "%", "SDS", "PAGE", "gel", "and", "analysed", "by", "Western", "Blot", ".", "White", "asterisks", "indicate", "unspecific", "bands", ".", "(", "G", ")", "Quantification", "of", "relative", "Nyv1", "signal", "intensity", "from", "(", "F", ")", ".", "Signal", "intensity", "was", "determined", "using", "ImageJ", "and", "a", "ratio", "of", "pure", "over", "crude", "signal", "intensity", "normalized", "to", "Tom40", "signal", "intensity", "was", "plotted", ".", "Bars", "show", "the", "relative", "Nvy1", "signal", "intensity", "±", "standard", "deviation", "from", "n", "=", "3", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(C) Tethering of AP-3 vesicles to the mitochondrial surface. Cells were grown at 30°C in YPG and kept in logarithmic phase. Just prior to imaging, the mitochondrial DNA was stained with DAPI Localization of Apl6 and Vps41 was analysed by fluorescence microscopy. First column shows DIC (difference interference contrast) image of cells. Scale bar, 5 µm. The inset shows the indicated magnification. Scale bar in inset, 2 µm.Apl5-dots co-localizing with GFP signal were counted and plotted in percent of the total number of Apl5-dots. Bars show the mean percentage of co-localization ± standard deviation (n ≥ 60 cells).(E, F) Purification of mitochondria from selected strains. Mitochondria were purified from the indicated strains as described in the methods. The amount corresponding to 1 % of the total volume was loaded of the 'load'' sample, 5% were used for 'crude' and 'pure' mitochondria fractions. Samples were loaded on a 10% SDS PAGE gel and analysed by Western Blot. White asterisks indicate unspecific bands. (G) Quantification of relative Nyv1 signal intensity from (F). Signal intensity was determined using ImageJ and a ratio of pure over crude signal intensity normalized to Tom40 signal intensity was plotted. Bars show the relative Nvy1 signal intensity ± standard deviation from n = 3 independent experiments."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", "-", "H", ")", "Indicated", "strains", "were", "grown", "in", "YPG", "for", "expression", "of", "Vps41", "-", "GFP", "-", "Fis", "constructs", ".", "Two", "representative", "images", "are", "shown", "for", "each", "strain", ".", "Mitochondria", "(", "M", ")", "are", "highlighted", "in", "red", "and", "vesicular", "structures", "in", "teal", "(", "unlabeled", "for", "VPS41", "-", "GFP", "-", "Fis", ")", "or", "green", "(", "unlabeled", "for", "VPS41", "-", "GFP", "-", "Fis", ")", ".", "Cell", "wall", "(", "CW", ")", ",", "plasma", "membrane", "(", "PM", ")", ",", "and", "vacuoles", "(", "V", ")", "are", "indicated", ".", "Scale", "bars", ",", "250", "nm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A-H) Indicated strains were grown in YPG for expression of Vps41-GFP-Fis constructs. Two representative images are shown for each strain. Mitochondria (M) are highlighted in red and vesicular structures in teal (unlabeled for VPS41-GFP-Fis) or green (unlabeled for VPS41-GFP-Fis). Cell wall (CW), plasma membrane (PM), and vacuoles (V) are indicated. Scale bars, 250 nm."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "GNS", "was", "localized", "by", "fluorescence", "microscopy", "in", "the", "indicated", "strains", "grown", "in", "medium", "containing", "glucose", "or", "galactose", "Images", "were", "inverted", "to", "visualize", "possible", "defects", ".", "First", "column", "shows", "DIC", "image", "of", "cells", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "µm", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "the", "AP", "-", "3", "defect", "from", "(", "A", ")", ".", "Linear", "intensity", "plots", "were", "laid", "over", "cells", "grown", "in", "medium", "containing", "glucose", "(", "D", ")", "or", "galactose", "(", "G", ")", ",", "the", "AP", "-", "3", "defect", "was", "calculated", "by", "dividing", "GFP", "-", "intensities", "on", "the", "vacuolar", "membrane", "by", "the", "sum", "of", "the", "intensity", "of", "vacuolar", ",", "and", "plasma", "membrane", "signal", "(", "n", "≥", "15", "cells", ")", ".", "Bars", "show", "the", "mean", "vacuolar", "signal", "over", "total", "signal", "±", "standard", "deviation", ".", "(", "C", ")", "Effect", "of", "different", "truncations", "and", "deletions", "on", "AP", "-", "3", "targeting", "to", "mitochondria", ".", "Indicated", "strains", "were", "grown", "at", "30", "°", "C", "in", "YPG", "and", "kept", "in", "logarithmic", "phase", ".", "Localization", "of", "Apl5", "or", "Apl6", "and", "Vps41", "was", "analysed", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "First", "column", "shows", "DIC", "image", "of", "cells", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "µm", ".", "Scale", "bar", "in", "inset", ",", "2", "µm", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "(", "C", ")", ".", "(", "-", ")", "Control", "corresponds", "to", "Vps41", "(", "ΔPEST", ")", "-", "GFP", "-", "Fis1", "Apl6", "-", "mCherry", "(", "CUY12558", ")", "and", "(", "+", ")", "corresponds", "to", "Vps41", "(", "S", "-", "D", ")", "-", "GFP", "-", "Fis1", "Apl6", "-", "mCherry", "(", "CUY12560", ")", ".", "Apl5", "-", "/", "Apl6", "-", "dots", "co", "-", "localizing", "with", "GFP", "signal", "were", "counted", "and", "plotted", "in", "percent", "of", "the", "total", "number", "of", "Apl5", "-", "/", "Apl6", "-", "dots", "(", "n", "≥", "63", ")", ".", "Bars", "show", "the", "mean", "percentage", "of", "co", "-", "localization", "±", "standard", "deviation", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) GNS was localized by fluorescence microscopy in the indicated strains grown in medium containing glucose or galactose Images were inverted to visualize possible defects. First column shows DIC image of cells. Scale bar, 5 µm. (B) Quantification of the AP-3 defect from (A). Linear intensity plots were laid over cells grown in medium containing glucose (D) or galactose (G), the AP-3 defect was calculated by dividing GFP-intensities on the vacuolar membrane by the sum of the intensity of vacuolar, and plasma membrane signal (n ≥ 15 cells). Bars show the mean vacuolar signal over total signal ± standard deviation.(C) Effect of different truncations and deletions on AP-3 targeting to mitochondria. Indicated strains were grown at 30°C in YPG and kept in logarithmic phase. Localization of Apl5 or Apl6 and Vps41 was analysed by fluorescence microscopy. First column shows DIC image of cells. Scale bar, 5 µm. Scale bar in inset, 2 µm. (D) Quantification of (C). (-) Control corresponds to Vps41(ΔPEST)-GFP-Fis1 Apl6-mCherry (CUY12558) and (+) corresponds to Vps41(S-D)-GFP-Fis1 Apl6-mCherry (CUY12560). Apl5- /Apl6-dots co-localizing with GFP signal were counted and plotted in percent of the total number of Apl5- /Apl6-dots (n ≥ 63). Bars show the mean percentage of co-localization ± standard deviation."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "C", ")", "Volcano", "plots", "of", "proteins", "in", "close", "proximity", "to", "Apl5", "-", "TurboID", "versus", "control", "cells", ",", "from", "a", "label", "-", "free", "proteomics", "analysis", "of", "streptavidin", "-", "biotin", "pulldowns", ".", "The", "logarithmic", "ratios", "of", "protein", "intensities", "are", "plotted", "against", "negative", "logarithmic", "P", "values", "of", "two", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "equal", "variance", ",", "performed", "from", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "The", "red", "dashed", "line", "(", "significance", ",", "0", ".", "05", ")", "separates", "specifically", "identified", "proteins", "(", "top", "right", "portion", "of", "plot", ")", "from", "background", ".", "Selected", "top", "hits", "are", "indicated", "with", "black", "dots", ",", "(", "E", ")", "Volcano", "plots", "of", "proteins", "in", "close", "proximity", "to", "Apl5", "-", "TurboID", "versus", "control", "cells", "in", "a", "GAL1pr", "-", "Vps41", "-", "GFP", "-", "Fis1", "background", ",", "from", "a", "label", "-", "free", "proteomics", "analysis", "of", "streptavidin", "-", "biotin", "pulldowns", "with", "cells", "grown", "in", "YPG", ".", "The", "logarithmic", "ratios", "of", "protein", "intensities", "are", "plotted", "against", "negative", "logarithmic", "P", "values", "of", "two", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "equal", "variance", ",", "performed", "from", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "The", "red", "dashed", "line", "(", "significance", ",", "0", ".", "001", ")", "separates", "specifically", "identified", "proteins", "(", "top", "right", "portion", "of", "plot", ")", "from", "background", ".", "Selected", "top", "hits", "are", "indicated", "with", "black"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(C) Volcano plots of proteins in close proximity to Apl5-TurboID versus control cells, from a label-free proteomics analysis of streptavidin-biotin pulldowns. The logarithmic ratios of protein intensities are plotted against negative logarithmic P values of two tailed Student's t-test, equal variance, performed from n = 3 independent experiments. The red dashed line (significance, 0.05) separates specifically identified proteins (top right portion of plot) from background. Selected top hits are indicated with black dots,(E) Volcano plots of proteins in close proximity to Apl5-TurboID versus control cells in a GAL1pr-Vps41-GFP-Fis1 background, from a label-free proteomics analysis of streptavidin-biotin pulldowns with cells grown in YPG. The logarithmic ratios of protein intensities are plotted against negative logarithmic P values of two tailed Student's t-test, equal variance, performed from n = 3 independent experiments. The red dashed line (significance, 0.001) separates specifically identified proteins (top right portion of plot) from background. Selected top hits are indicated with black dots"}
{"words": ["Figure", "6", "(", "B", ")", "AP", "-", "3", "sorting", "defects", "in", "GAP", "deletions", ".", "The", "AP", "-", "3", "reporter", "was", "localized", "relative", "to", "FM4", "-", "64", "stained", "vacuoles", "in", "the", "indicated", "strains", ".", "First", "column", "shows", "the", "DIC", "image", "of", "cells", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "µm", ".", "(", "D", ")", "Localization", "of", "AP", "-", "3", "in", "ArfGAP", "deletion", "strains", ".", "Localization", "of", "C", "-", "terminally", "GFP", "-", "tagged", "Apl5", "relative", "to", "FM4", "-", "64", "stained", "vacuoles", "in", "the", "indicated", "strains", ".", "First", "column", "shows", "DIC", "image", "of", "cells", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "µm", ".", "(", "E", ")", "Quantification", "of", "Apl5", "-", "dots", "in", "(", "D", ")", ".", "Apl5", "-", "positve", "dots", "were", "counted", "and", "averaged", "to", "the", "number", "of", "dots", "per", "cell", ".", "Box", "boundaries", "indicate", "25", "%", "and", "75", "%", "of", "the", "dataset", ".", "The", "middle", "line", "indicates", "the", "median", "and", "the", "small", "square", "the", "mean", ".", "(", "F", ")", "Co", "-", "localization", "of", "C", "-", "terminally", "GFP", "-", "tagged", "Apl5", "and", "C", "-", "terminally", "mCherry", "-", "tagged", "Sec7", "in", "wt", "and", "age2Δ", "background", ".", "Cells", "were", "grown", "at", "30", "°", "C", "and", "kept", "in", "logarithmic", "phase", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "µm", ".", "Scale", "bar", "in", "inset", ",", "2", "µm", ".", "(", "G", ")", "Quantification", "of", "co", "-", "localization", "from", "(", "F", ")", "normalized", "per", "cell", ".", "Number", "of", "co", "-", "localizing", "dots", "was", "determined", "and", "normalized", "to", "the", "number", "of", "co", "-", "localization", "events", "per", "cell", ".", "Bars", "show", "the", "mean", "number", "of", "co", "-", "localizing", "dots", "per", "cell", "±", "standard", "deviation", "(", "n", "≥", "60", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(B) AP-3 sorting defects in GAP deletions. The AP-3 reporter was localized relative to FM4-64 stained vacuoles in the indicated strains. First column shows the DIC image of cells. Scale bar, 5 µm.(D) Localization of AP-3 in ArfGAP deletion strains. Localization of C-terminally GFP-tagged Apl5 relative to FM4-64 stained vacuoles in the indicated strains. First column shows DIC image of cells. Scale bar, 5 µm. (E) Quantification of Apl5-dots in (D). Apl5-positve dots were counted and averaged to the number of dots per cell. Box boundaries indicate 25% and 75% of the dataset. The middle line indicates the median and the small square the mean.(F) Co-localization of C-terminally GFP-tagged Apl5 and C-terminally mCherry-tagged Sec7 in wt and age2Δ background. Cells were grown at 30°C and kept in logarithmic phase. Scale bar, 5 µm. Scale bar in inset, 2 µm. (G) Quantification of co-localization from (F) normalized per cell. Number of co-localizing dots was determined and normalized to the number of co-localization events per cell. Bars show the mean number of co-localizing dots per cell ± standard deviation (n ≥ 60). "}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ",", "B", ")", "AP", "-", "3", "sorting", "defects", "in", "strains", "overexpressing", "Gcs1", "(", "A", ")", "or", "Age2", "(", "B", ")", ".", "The", "AP", "-", "3", "reporter", "GNS", "was", "localized", "relative", "to", "FM4", "-", "64", "stained", "vacuoles", "in", "the", "indicated", "strains", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "µm", ".", "(", "C", ")", "Localization", "of", "AP", "-", "3", "in", "ArfGAP", "overexpression", "strains", ".", "Localization", "of", "C", "-", "terminally", "GFP", "-", "tagged", "Apl5", "relative", "to", "FM4", "-", "64", "stained", "vacuoles", "in", "the", "indicated", "strains", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "µm", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "Apl5", "dots", "in", "(", "C", ")", ".", "Apl5", "-", "positve", "dots", "were", "counted", "and", "averaged", "to", "the", "number", "of", "dots", "per", "cell", ".", "Box", "boundaries", "indicate", "25", "%", "and", "75", "%", "of", "the", "dataset", ".", "The", "middle", "line", "indicates", "the", "median", "and", "the", "small", "square", "the", "mean", ".", "(", "E", ",", "F", ")", "AP", "-", "3", "sorting", "defects", "in", "GAP", "-", "dead", "mutants", "of", "Gcs1", "(", "E", ")", "and", "Age2", "(", "F", ")", ".", "The", "AP", "-", "3", "reporter", "GNS", "was", "localized", "relative", "to", "FM4", "-", "64", "stained", "vacuoles", "in", "the", "indicated", "strains", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "µm", ".", "(", "G", ")", "Localization", "of", "AP", "-", "3", "in", "GAP", "-", "dead", "mutants", "of", "Gcs1", "and", "Age2", ".", "Localization", "of", "C", "-", "terminally", "GFP", "-", "tagged", "Apl5", "relative", "to", "FM4", "-", "64", "stained", "vacuoles", "in", "the", "indicated", "strains", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "µm", ".", "(", "H", ")", "Quantification", "of", "Apl5", "dots", "in", "(", "G", ")", ".", "Apl5", "-", "positve", "dots", "were", "counted", "and", "averaged", "to", "the", "number", "of", "dots", "per", "cell", ".", "Box", "boundaries", "indicate", "25", "%", "and", "75", "%", "of", "the", "dataset", ".", "The", "middle", "line", "indicates", "the", "median", "and", "the", "small", "square", "the", "mean", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A, B) AP-3 sorting defects in strains overexpressing Gcs1 (A) or Age2 (B). The AP-3 reporter GNS was localized relative to FM4-64 stained vacuoles in the indicated strains. Scale bar, 5 µm.(C) Localization of AP-3 in ArfGAP overexpression strains. Localization of C-terminally GFP-tagged Apl5 relative to FM4-64 stained vacuoles in the indicated strains. Scale bar, 5 µm. (D) Quantification of Apl5 dots in (C). Apl5-positve dots were counted and averaged to the number of dots per cell. Box boundaries indicate 25% and 75% of the dataset. The middle line indicates the median and the small square the mean. (E, F) AP-3 sorting defects in GAP-dead mutants of Gcs1 (E) and Age2 (F). The AP-3 reporter GNS was localized relative to FM4-64 stained vacuoles in the indicated strains. Scale bar, 5 µm.(G) Localization of AP-3 in GAP-dead mutants of Gcs1 and Age2. Localization of C-terminally GFP-tagged Apl5 relative to FM4-64 stained vacuoles in the indicated strains. Scale bar, 5 µm. (H) Quantification of Apl5 dots in (G). Apl5-positve dots were counted and averaged to the number of dots per cell. Box boundaries indicate 25% and 75% of the dataset. The middle line indicates the median and the small square the mean. "}
{"words": ["Figure", "1B", ".", "Analysis", "of", "cell", "cycle", "arrest", "(", "in", "G2", ")", "in", "response", "to", "DSB", "induction", "assayed", "by", "flow", "cytometry", ".", "C", ".", "Rad53", "phosphorylation", "(", "Rad53", "-", "P", ")", "in", "response", "to", "DSB", "assayed", "by", "western", "blotting", ".", "D", ".", "Cell", "survival", "upon", "DSB", "induction", ".", "Average", "±", "SD", "(", "n", "=", "4", ")", "is", "shown", "for", "each", "genotype", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B. Analysis of cell cycle arrest (in G2) in response to DSB induction assayed by flow cytometry.C. Rad53 phosphorylation (Rad53-P) in response to DSB assayed by western blotting.D. Cell survival upon DSB induction. Average ± SD (n=4) is shown for each genotype."}
{"words": ["Figure", "2B", ".", "Srs2", "requirement", "in", "de", "novo", "telomere", "addition", "in", "cells", "with", "and", "without", "functional", "HR", ".", "All", "strains", "are", "pif1", "-", "m2", ".", "Strains", "used", ":", "NK1264", ";", "NK2375", ",", "NK2376", ";", "NK2014", ",", "NK2015", ";", "NK2451", ",", "NK2452", ";", "NK2012", ",", "NK2013", ";", "NK2457", ",", "NK2458", ";", "NK2363", ",", "NK2364", ";", "NK2469", ";", "2369", ",", "NK2370", ";", "NK2473", "-", "2475", ".", "D", ".", "Dynamics", "of", "(", "TG1", "-", "3", ")", "n", "addition", "monitored", "by", "qPCR", "through", "a", "time", "-", "course", "experiment", "(", "asynchronous", "populations", ")", ".", "The", "Y", "axis", "shows", "a", "fold", "increase", "in", "de", "novo", "telomere", "-", "specific", "PCR", "product", "relative", "to", "the", "background", "levels", "at", "0", "h", "and", "normalised", "against", "an", "internal", "control", "(", "ARO1", "locus", ")", ".", "Average", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", "is", "shown", "for", "each", "time", "-", "point", "of", "each", "genotype", ".", "Strains", "used", ":", "NK3292", ",", "NK3293", ";", "NK4670", ",", "NK4671", ";", "NK4112", ",", "NK4113", ";", "NK4114", ",", "NK4115", ";", "NK3292", "est2", "∆", ",", "NK3293", "est2", "∆", ";", "NK4232", ",", "NK4233", ".", "F", ".", "Comparative", "analysis", "of", "ssDNA", "/", "dsDNA", "at", "de", "novo", "telomere", "addition", "loci", "in", "SRS2", "and", "srs2Δ", "during", "a", "time", "-", "course", "experiment", "(", "synchronised", "populations", ")", ".", "The", "Y", "axis", "shows", "a", "fold", "increase", "in", "de", "novo", "telomere", "-", "specific", "PCR", "product", "relative", "to", "the", "background", "levels", "at", "0", "h", "and", "normalised", "against", "an", "internal", "control", "(", "ARO1", "locus", ")", ".", "Average", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", "is", "shown", "for", "each", "time", "-", "point", "of", "each", "genotype", ".", "Top", "set", "of", "error", "bars", "represents", "SD", "in", "relative", "increase", "of", "the", "de", "novo", "telomere", "-", "specific", "PCR", "product", "(", "as", "in", "panel", "D", ")", "while", "the", "lower", "set", "of", "error", "bars", "corresponds", "to", "quantifications", "of", "ss", "/", "dsDNA", "fractions", ".", "Strains", "used", ":", "NK3292", ",", "NK3293", ";", "NK4670", ",", "NK4671", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B. Srs2 requirement in de novo telomere addition in cells with and without functional HR. All strains are pif1-m2. Strains used: NK1264; NK2375, NK2376; NK2014, NK2015; NK2451, NK2452; NK2012, NK2013; NK2457, NK2458; NK2363, NK2364; NK2469; 2369, NK2370; NK2473-2475.D. Dynamics of (TG1-3)n addition monitored by qPCR through a time-course experiment (asynchronous populations). The Y axis shows a fold increase in de novo telomere-specific PCR product relative to the background levels at 0 h and normalised against an internal control (ARO1 locus). Average ± SD (n=3) is shown for each time-point of each genotype. Strains used: NK3292, NK3293; NK4670, NK4671; NK4112, NK4113; NK4114, NK4115; NK3292 est2∆, NK3293 est2∆; NK4232, NK4233.F. Comparative analysis of ssDNA/dsDNA at de novo telomere addition loci in SRS2 and srs2Δ during a time-course experiment (synchronised populations). The Y axis shows a fold increase in de novo telomere-specific PCR product relative to the background levels at 0 h and normalised against an internal control (ARO1 locus). Average ± SD (n=3) is shown for each time-point of each genotype. Top set of error bars represents SD in relative increase of the de novo telomere-specific PCR product (as in panel D) while the lower set of error bars corresponds to quantifications of ss/dsDNA fractions. Strains used: NK3292, NK3293; NK4670, NK4671."}
{"words": ["Figure", "3B", ".", "Southern", "blot", "analysis", "of", "re", "-", "synthesis", "of", "resected", "DNA", "during", "BIR", "in", "SRS2", "and", "srs2Δ", "corresponding", "to", "the", "data", "quantifications", "in", "C", ".", "DNA", "was", "digested", "with", "EcoRI", "and", "BamHI", ",", "resolved", "on", "0", ".", "7", "%", "agarose", "gels", ",", "transferred", "onto", "charged", "Nylon", "membrane", "and", "hybridised", "to", "the", "mixture", "of", "4", "probes", "(", "three", "RS", "probes", "and", "a", "reference", "probe", ",", "REF", ",", "hybridizing", "to", "an", "ARS522", "-", "containing", "fragment", "on", "chr", ".", "V", "which", "is", "not", "involved", "in", "the", "repair", ")", ".", "A", "representative", "image", "of", "one", "of", "the", "three", "repeats", "is", "shown", ".", "C", ".", "Re", "-", "synthesis", "of", "resected", "DNA", "on", "chr", ".", "VIIL", "in", "SRS2", "and", "srs2Δ", "cells", "(", "solid", "and", "dashed", "lines", ",", "respectively", ")", "at", "the", "distance", "of", "15", ".", "2", "(", "RS15", ".", "2", ")", ",", "6", ".", "8", "(", "RS6", ".", "8", ")", "and", "2", ".", "6", "(", "RS2", ".", "6", ")", "kb", "away", "from", "the", "homology", "region", ".", "Average", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", "is", "shown", "for", "each", "time", "point", ".", "D", ".", "Southern", "blot", "analysis", "of", "BIR", "-", "dependent", "DNA", "synthesis", "in", "SRS2", "and", "srs2Δ", "corresponding", "to", "the", "data", "quantifications", "in", "D", ".", "DNA", "was", "digested", "with", "EcoRI", "and", "BamHI", ",", "resolved", "on", "0", ".", "7", "%", "agarose", "gels", ",", "transferred", "onto", "charged", "Nylon", "membrane", "and", "hybridised", "to", "the", "mixture", "of", "4", "probes", "(", "three", "BIR", "probes", "and", "a", "reference", "probe", ",", "REF", ",", "hybridizing", "to", "an", "ARS522", "-", "containing", "fragment", "on", "chr", ".", "V", "which", "is", "not", "involved", "in", "the", "repair", ")", ".", "A", "representative", "image", "of", "one", "of", "the", "three", "repeats", "is", "shown", ".", "C", "-", "control", "strain", "NK3980", ".", "E", ".", "BIR", "-", "dependent", "DNA", "synthesis", "in", "SRS2", "and", "srs2Δ", "cells", "(", "solid", "and", "dashed", "lines", ",", "respectively", ")", "at", "the", "distance", "of", "6", "(", "BIR6", ")", ",", "36", "(", "BIR36", ")", "and", "77", "(", "BIR77", ")", "kb", "away", "from", "the", "homology", "region", ".", "Average", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", "is", "shown", "for", "each", "time", "point", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B. Southern blot analysis of re-synthesis of resected DNA during BIR in SRS2 and srs2Δ corresponding to the data quantifications in C. DNA was digested with EcoRI and BamHI, resolved on 0.7% agarose gels, transferred onto charged Nylon membrane and hybridised to the mixture of 4 probes (three RS probes and a reference probe, REF, hybridizing to an ARS522-containing fragment on chr. V which is not involved in the repair). A representative image of one of the three repeats is shown.C. Re-synthesis of resected DNA on chr.VIIL in SRS2 and srs2Δ cells (solid and dashed lines, respectively) at the distance of 15.2 (RS15.2), 6.8 (RS6.8) and 2.6 (RS2.6) kb away from the homology region. Average ± SD (n=3) is shown for each time point.D. Southern blot analysis of BIR-dependent DNA synthesis in SRS2 and srs2Δ corresponding to the data quantifications in D. DNA was digested with EcoRI and BamHI, resolved on 0.7% agarose gels, transferred onto charged Nylon membrane and hybridised to the mixture of 4 probes (three BIR probes and a reference probe, REF, hybridizing to an ARS522-containing fragment on chr. V which is not involved in the repair). A representative image of one of the three repeats is shown. C - control strain NK3980.E. BIR-dependent DNA synthesis in SRS2 and srs2Δ cells (solid and dashed lines, respectively) at the distance of 6 (BIR6), 36 (BIR36) and 77 (BIR77) kb away from the homology region. Average ± SD (n=3) is shown for each time point."}
{"words": ["Figure", "4B", ".", "Frequency", "of", "DSB", "repair", "via", "SSA", "in", "SRS2", "and", "srs2Δ", "cells", "with", "and", "without", "functional", "HR", "in", "the", "assay", "based", "on", "the", "system", "shown", "in", "panel", "A", ".", "Average", "±", "SD", "(", "n", "=", "4", ")", "is", "shown", "for", "each", "genotype", ".", "Strains", "used", "in", "B", "and", "D", ":", "NK4691", "-", "4693", ";", "NK4805", "-", "4808", ";", "NK5081", "-", "5084", ";", "NK5085", "-", "5091", ".", "D", ".", "Fragment", "L", "formation", "in", "SRS2", "and", "srs2Δ", "cells", "in", "the", "presence", "and", "absence", "of", "Rad51", ".", "Also", "see", "Figure", "EV3", "for", "blot", "images", ".", "Average", "±", "SD", "(", "n", "=", "4", ")", "is", "shown", "for", "each", "time", "point", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B. Frequency of DSB repair via SSA in SRS2 and srs2Δ cells with and without functional HR in the assay based on the system shown in panel A. Average ± SD (n=4) is shown for each genotype. Strains used in B and D: NK4691-4693; NK4805-4808; NK5081-5084; NK5085-5091.D. Fragment L formation in SRS2 and srs2Δ cells in the presence and absence of Rad51. Also see Figure EV3 for blot images. Average ± SD (n=4) is shown for each time point."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "D", ")", "Absolute", "cell", "numbers", "of", "the", "indicated", "cell", "types", "were", "determined", "by", "flow", "-", "cytometric", "analysis", "of", "the", "bone", "marrow", "from", "3", "-", "week", "-", "old", "Pax5", "+", "/", "+", "and", "Pax5Jak2", "/", "+", "mice", ".", "Average", "cell", "numbers", "are", "shown", "with", "SEM", "and", "were", "statistically", "analyzed", "by", "multiple", "t", "-", "tests", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "with", "Holm", "-", "Šídák", "'", "s", "correction", ")", ";", "ns", ",", "not", "significant", "(", "P", ">", "0", ".", "05", ")", ".", "One", "of", "3", "independent", "experiments", "is", "shown", ".", "(", "F", ")", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "analysis", "of", "Pax5Jak2", "/", "+", "(", "black", ")", "and", "control", "Pax5", "+", "/", "+", "(", "grey", ")", "mice", ".", "n", ",", "number", "of", "mice", "analyzed", ".", "A", "P", "value", "of", "<", "0", ".", "0001", "was", "determined", "for", "the", "survival", "curves", "by", "statistical", "analysis", "with", "the", "log", "-", "rank", "(", "Mantel", "-", "Cox", ")", "test", ".", "(", "H", ")", "Eosin", "-", "hematoxylin", "-", "stained", "sections", "of", "the", "lung", "and", "liver", "of", "a", "Pax5Jak2", "/", "+", "tumor", "mouse", ".", "Infiltrating", "and", "blasting", "tumor", "cells", "are", "indicated", "by", "an", "arrow", ".", "(", "I", ")", "Flow", "-", "cytometric", "analysis", "of", "lymph", "node", "cells", "from", "a", "control", "Pax5", "+", "/", "+", "mouse", "and", "a", "10", "-", "week", "-", "old", "Pax5Jak2", "/", "+", "tumor", "mouse", ".", "(", "J", ")", "Flow", "-", "cytometric", "analysis", "of", "B220lowCD19", "+", "B", "cells", "from", "the", "bone", "marrow", "of", "a", "4", "-", "week", "-", "old", "Pax5Jak2", "/", "+", "mouse", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(D) Absolute cell numbers of the indicated cell types were determined by flow-cytometric analysis of the bone marrow from 3-week-old Pax5+/+ and Pax5Jak2/+ mice. Average cell numbers are shown with SEM and were statistically analyzed by multiple t-tests (unpaired two-tailed with Holm-Šídák's correction); ns, not significant (P > 0.05). One of 3 independent experiments is shown.(F) Kaplan-Meier survival analysis of Pax5Jak2/+ (black) and control Pax5+/+ (grey) mice. n, number of mice analyzed. A P value of < 0.0001 was determined for the survival curves by statistical analysis with the log-rank (Mantel-Cox) test.(H) Eosin-hematoxylin-stained sections of the lung and liver of a Pax5Jak2/+ tumor mouse. Infiltrating and blasting tumor cells are indicated by an arrow.(I) Flow-cytometric analysis of lymph node cells from a control Pax5+/+ mouse and a 10-week-old Pax5Jak2/+ tumor mouse. (J) Flow-cytometric analysis of B220lowCD19+ B cells from the bone marrow of a 4-week-old Pax5Jak2/+ mouse."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "D", "-", "G", ")", "GSEA", "analysis", "of", "327", "repressed", "(", "D", ")", "or", "330", "activated", "(", "F", ")", "Pax5", "target", "genes", "identified", "in", "pro", "-", "B", "cells", "as", "compared", "with", "the", "ranked", "log2", "-", "fold", "gene", "expression", "changes", "in", "Pax5Jak2", "/", "+", "(", "PJ", ")", "B", "-", "ALLs", "versus", "control", "(", "Ctrl", ")", "Pax5", "+", "/", "-", "Cdkn2ab", "+", "/", "-", "B", "-", "ALLs", "(", "left", ")", ".", "NES", ",", "normalized", "enrichment", "score", ".", "The", "expression", "of", "five", "genes", "that", "are", "upregulated", "in", "Pax5Jak2", "/", "+", "B", "-", "ALL", "cells", "(", "upper", "row", ")", "and", "Pax5", "-", "/", "-", "(", "KO", ")", "pro", "-", "B", "cells", "(", "lower", "row", ")", "is", "shown", "in", "(", "E", ")", ".", "Likewise", ",", "the", "expression", "of", "five", "genes", "that", "are", "upregulated", "in", "control", "B", "-", "ALL", "cells", "(", "upper", "row", ")", "and", "Pax5", "+", "/", "+", "(", "WT", ")", "pro", "-", "B", "cells", "(", "lower", "row", ")", "is", "shown", "in", "(", "G", ")", ".", "TPM", ",", "transcripts", "per", "million", ".", "Mean", "TPM", "values", "with", "SEM", "are", "shown", "for", "the", "following", "RNA", "-", "seq", "experiments", ":", "3", "(", "WT", "pro", "-", "B", ")", ",", "2", "(", "KO", "pro", "-", "B", ")", ",", "2", "(", "Ctrl", "B", "-", "ALL", ")", ",", "and", "4", "(", "PJ", "B", "-", "ALL", ")", ".", "(", "H", ")", "Expression", "of", "the", "Ptprc", "(", "CD45", ")", "gene", "from", "exon", "3", "to", "exon", "8", ",", "as", "determined", "by", "RNA", "-", "seq", "of", "Pax5Jak2", "/", "+", "and", "Pax5", "+", "/", "-", "Cdkn2ab", "+", "/", "-", "B", "-", "ALL", "cells", ".", "The", "alternatively", "spliced", "exons", "4", "(", "A", ")", ",", "5", "(", "B", ")", "and", "6", "(", "C", ")", "are", "indicated", "in", "orange", "in", "the", "respective", "exon", "-", "intron", "structure", "of", "the", "Ptprc", "gene", ".", "Ptprc", "transcripts", "of", "B220", "+", "Pax5", "+", "/", "-", "Cdkn2ab", "+", "/", "-", "B", "-", "ALL", "cells", "contain", "all", "three", "exons", ",", "thus", "giving", "rise", "to", "expression", "of", "the", "CD45", "isoform", "RABC", "(", "known", "as", "B220", ")", ".", "In", "contrast", ",", "reads", "at", "exon", "4", "are", "barely", "detectable", "and", "reads", "at", "exon", "6", "are", "strongly", "reduced", "in", "the", "mRNA", "of", "Pax5Jak2", "/", "+", "B", "-", "ALL", "cells", ",", "which", "likely", "gives", "rise", "to", "the", "CD45", "isoforms", "RBC", "and"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(D-G) GSEA analysis of 327 repressed (D) or 330 activated (F) Pax5 target genes identified in pro-B cells as compared with the ranked log2-fold gene expression changes in Pax5Jak2/+ (PJ) B-ALLs versus control (Ctrl) Pax5+/- Cdkn2ab+/- B-ALLs (left). NES, normalized enrichment score. The expression of five genes that are upregulated in Pax5Jak2/+ B-ALL cells (upper row) and Pax5-/- (KO) pro-B cells (lower row) is shown in (E). Likewise, the expression of five genes that are upregulated in control B-ALL cells (upper row) and Pax5+/+ (WT) pro-B cells (lower row) is shown in (G). TPM, transcripts per million. Mean TPM values with SEM are shown for the following RNA-seq experiments: 3 (WT pro-B), 2 (KO pro-B), 2 (Ctrl B-ALL), and 4 (PJ B-ALL).(H) Expression of the Ptprc (CD45) gene from exon 3 to exon 8, as determined by RNA-seq of Pax5Jak2/+ and Pax5+/- Cdkn2ab+/- B-ALL cells. The alternatively spliced exons 4 (A), 5 (B) and 6 (C) are indicated in orange in the respective exon-intron structure of the Ptprc gene. Ptprc transcripts of B220+ Pax5+/- Cdkn2ab+/- B-ALL cells contain all three exons, thus giving rise to expression of the CD45 isoform RABC (known as B220). In contrast, reads at exon 4 are barely detectable and reads at exon 6 are strongly reduced in the mRNA of Pax5Jak2/+ B-ALL cells, which likely gives rise to the CD45 isoforms RBC and RB"}
{"words": ["Figure", "3", "(", "D", ")", "Flow", "-", "cytometric", "analysis", "of", "bone", "marrow", "cells", "from", "4", "-", "week", "-", "old", "Pax5ihCd2", "/", "+", "and", "Pax5Jak2", "/", "ihCd2", "mice", ".", "The", "expression", "of", "human", "(", "h", ")", "CD2", "from", "the", "Pax5ihCd2", "allele", "is", "shown", "for", "CD19", "+", "B220", "+", "(", "grey", ")", "and", "CD19", "+", "B220low", "(", "black", ")", "B", "cells", ".", "(", "G", ")", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "analysis", "of", "Cd79a", "-", "Cre", "Ikzf1neo", "/", "+", "Pax5LSL", "-", "Jak2", "/", "+", "(", "black", ")", "and", "Cd79a", "-", "Cre", "Pax5LSL", "-", "Jak2", "/", "+", "(", "grey", ")", "mice", ".", "Statistical", "analysis", "of", "the", "survival", "curves", "was", "performed", "with", "the", "log", "-", "rank", "(", "Mantel", "-", "Cox", ")", "test", ";", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "n", ",", "number", "of", "mice", "analyzed", ".", "(", "H", ")", "Flow", "-", "cytometric", "analysis", "of", "B220", "and", "CD19", "expression", "in", "B", "-", "ALL", "tumor", "cells", "from", "the", "lymph", "node", "of", "a", "Cd79a", "-", "Cre", "Ikzf1neo", "/", "+", "Pax5LSL", "-", "Jak2", "/", "+", "mouse", "(", "black", ";", "left", ")", ".", "Pax5", "expression", "in", "these", "B", "-", "ALL", "tumor", "cells", "(", "black", "line", ")", "and", "control", "Pax5", "+", "/", "+", "lymph", "node", "B", "cells", "(", "grey", "filled", ")", "was", "determined", "by", "intracellular", "Pax5", "staining", "(", "right", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(D) Flow-cytometric analysis of bone marrow cells from 4-week-old Pax5ihCd2/+ and Pax5Jak2/ihCd2 mice. The expression of human (h) CD2 from the Pax5ihCd2 allele is shown for CD19+B220+ (grey) and CD19+B220low (black) B cells.(G) Kaplan-Meier survival analysis of Cd79a-Cre Ikzf1neo/+ Pax5LSL-Jak2/+ (black) and Cd79a-Cre Pax5LSL-Jak2/+ (grey) mice. Statistical analysis of the survival curves was performed with the log-rank (Mantel-Cox) test; ****P < 0.0001. n, number of mice analyzed.(H) Flow-cytometric analysis of B220 and CD19 expression in B-ALL tumor cells from the lymph node of a Cd79a-Cre Ikzf1neo/+ Pax5LSL-Jak2/+ mouse (black; left). Pax5 expression in these B-ALL tumor cells (black line) and control Pax5+/+ lymph node B cells (grey filled) was determined by intracellular Pax5 staining (right)."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "B", ",", "Flow", "-", "cytometric", "analysis", "of", "bone", "marrow", "and", "spleen", "from", "Pax5Jak2", "-", "KD", "/", "+", "(", "black", ";", "n", "=", "11", ")", "and", "control", "Pax5", "+", "/", "+", "(", "grey", ";", "n", "=", "7", ")", "mice", "at", "the", "age", "of", "6", "-", "8", "weeks", ".", "The", "frequencies", "of", "the", "indicated", "B", "cell", "types", "are", "shown", "for", "each", "organ", "(", "B", ")", ".", "The", "data", "are", "presented", "as", "mean", "percentages", "with", "SEM", "and", "were", "statistically", "analyzed", "by", "multiple", "t", "-", "tests", "(", "unpaired", "and", "two", "-", "tailed", "with", "Holm", "-", "Šídák", "'", "s", "correction", ")", ";", "ns", "(", "P", ">", "0", ".", "5", ")", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "(", "D", ",", "Tumor", "progression", "in", "mice", ",", "transplanted", "with", "Pax5Jak2", "-", "Luc", "/", "+", "tumor", "cells", ",", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "the", "JAK1", "/", "2", "inhibitor", "ruxolitinib", ".", "At", "day", "14", "after", "cell", "transfer", ",", "the", "transplanted", "mice", "were", "treated", "twice", "daily", "with", "ruxolitinib", "or", "vehicle", ",", "and", "the", "tumor", "mass", "was", "monitored", "by", "bioluminescence", "measurements", ".", "Images", "of", "three", "representative", "mice", "with", "or", "without", "ruxolitinib", "treatment", "are", "shown", "(", "F", ")", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "analysis", "of", "the", "transplanted", "mice", "upon", "prolonged", "treatment", "with", "ruxolitinib", "(", "black", ")", "and", "vehicle", "(", "grey", ")", ".", "Statistical", "analysis", "of", "the", "survival", "curves", "(", "F", ")", "was", "performed", "with", "the", "log", "-", "rank", "(", "Mantel", "-", "Cox", ")", "test", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(B, Flow-cytometric analysis of bone marrow and spleen from Pax5Jak2-KD/+ (black; n = 11) and control Pax5+/+ (grey; n = 7) mice at the age of 6-8 weeks. The frequencies of the indicated B cell types are shown for each organ (B). The data are presented as mean percentages with SEM and were statistically analyzed by multiple t-tests (unpaired and two-tailed with Holm-Šídák's correction); ns (P > 0.5), *P < 0.05, **P < 0.01.(D, Tumor progression in mice, transplanted with Pax5Jak2-Luc/+ tumor cells, in the presence or absence of the JAK1/2 inhibitor ruxolitinib. At day 14 after cell transfer, the transplanted mice were treated twice daily with ruxolitinib or vehicle, and the tumor mass was monitored by bioluminescence measurements. Images of three representative mice with or without ruxolitinib treatment are shown(F) Kaplan-Meier survival analysis of the transplanted mice upon prolonged treatment with ruxolitinib (black) and vehicle (grey). Statistical analysis of the survival curves (F) was performed with the log-rank (Mantel-Cox) test; **P < 0.01."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "B", ")", "Genome", "-", "wide", "binding", "of", "Pax5", "-", "Jak2", "in", "in", "vitro", "cultured", "pro", "-", "B", "cells", "from", "Pax5Jak2", "/", "+", "Rosa26BirA", "/", "+", "mice", "at", "the", "age", "of", "3", "weeks", "(", "expressing", "Pax5", ")", "and", "ex", "vivo", "Pax5Jak2", "/", "+", "Rosa26BirA", "/", "+", "B", "-", "ALL", "tumors", "(", "lacking", "Pax5", ")", ",", "as", "determined", "by", "Bio", "-", "ChIP", "-", "seq", "analysis", "The", "DNA", "-", "binding", "pattern", "of", "full", "-", "length", "Pax5", "was", "determined", "by", "Bio", "-", "ChIP", "-", "seq", "analysis", "of", "ex", "vivo", "sorted", "Pax5Bio", "/", "Bio", "pro", "-", "B", "cells", ",", "which", "carried", "a", "C", "‐", "terminal", "biotin", "acceptor", "sequence", "together", "with", "an", "IRES", "‐", "BirA", "gene", "insertion", "in", "the", "3", "'", "untranslated", "region", "of", "Pax5", "Two", "independent", "Bio", "-", "ChIP", "-", "seq", "experiments", "were", "performed", "for", "each", "cell", "type", ".", "Representative", "binding", "patterns", "of", "Pax5", "and", "Pax5", "-", "Jak2", "in", "the", "three", "B", "cell", "types", "are", "shown", "for", "a", "selected", "genomic", "region", ",", "with", "horizontal", "bars", "indicating", "Pax5", "or", "Pax5", "-", "Jak2", "peaks", "that", "were", "identified", "by", "MACS", "peak", "calling", "(", "left", ")", ".", "The", "number", "of", "Pax5", "(", "white", ")", "and", "Pax5", "-", "Jak2", "(", "grey", "or", "black", ")", "peaks", ",", "which", "were", "defined", "by", "stringent", "MACS", "peak", "calling", "with", "a", "P", "value", "of", "<", "10", "-", "10", "in", "the", "three", "B", "cell", "types", ",", "are", "shown", "to", "the", "right", ".", "(", "F", ",", "G", ")", "Flow", "-", "cytometric", "analysis", "of", "the", "bone", "marrow", "and", "spleen", "from", "Pax5Prd", "*", "-", "Jak2", "/", "+", "(", "black", ";", "n", "=", "6", ")", "and", "control", "Pax5", "+", "/", "+", "(", "grey", ";", "n", "=", "5", ")", "mice", "at", "the", "age", "of", "6", "-", "7", "weeks", ".", "The", "frequency", "of", "the", "indicated", "B", "cell", "types", "in", "each", "organ", "is", "indicated", "in", "(", "F", ")", ",", "and", "the", "flow", "-", "cytometric", "analysis", "of", "CD19", "and", "B220", "expression", "on", "bone", "marrow", "B", "cells", "is", "shown", "in", "(", "G", ")", ".", "Statistical", "data", "are", "shown", "as", "mean", "percentages", "with", "SEM", "and", "were", "analyzed", "by", "multiple", "t", "-", "tests", "(", "unpaired", "and", "two", "-", "tailed", "with", "Holm", "-", "Šídák", "'", "s", "correction", ")", ":", "ns", ">", "0", ".", "05", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "Each", "dot", "corresponds", "to", "one", "mouse", ".", "(", "H", ")", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "analysis", "of", "Pax5Prd", "*", "-", "Jak2", "/", "+", "(", "black", ")", "and", "Pax5", "+", "/", "+", "(", "grey", ")", "mice", ".", "A", "P", "value", "of", "<", "0", ".", "0001", "was", "determined", "for", "the", "survival", "curves", "by", "statistical", "analysis", "with", "the", "log", "-", "rank", "(", "Mantel", "-", "Cox", ")", "test", ".", "n", ",", "number", "of", "mice", "analyzed", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(B) Genome-wide binding of Pax5-Jak2 in in vitro cultured pro-B cells from Pax5Jak2/+ Rosa26BirA/+ mice at the age of 3 weeks (expressing Pax5) and ex vivo Pax5Jak2/+ Rosa26BirA/+ B-ALL tumors (lacking Pax5), as determined by Bio-ChIP-seq analysis The DNA-binding pattern of full-length Pax5 was determined by Bio-ChIP-seq analysis of ex vivo sorted Pax5Bio/Bio pro-B cells, which carried a C‐terminal biotin acceptor sequence together with an IRES‐BirA gene insertion in the 3' untranslated region of Pax5 Two independent Bio-ChIP-seq experiments were performed for each cell type. Representative binding patterns of Pax5 and Pax5-Jak2 in the three B cell types are shown for a selected genomic region, with horizontal bars indicating Pax5 or Pax5-Jak2 peaks that were identified by MACS peak calling (left). The number of Pax5 (white) and Pax5-Jak2 (grey or black) peaks, which were defined by stringent MACS peak calling with a P value of < 10-10 in the three B cell types, are shown to the right.(F, G) Flow-cytometric analysis of the bone marrow and spleen from Pax5Prd*-Jak2 /+ (black; n = 6) and control Pax5+/+ (grey; n = 5) mice at the age of 6-7 weeks. The frequency of the indicated B cell types in each organ is indicated in (F), and the flow-cytometric analysis of CD19 and B220 expression on bone marrow B cells is shown in (G). Statistical data are shown as mean percentages with SEM and were analyzed by multiple t-tests (unpaired and two-tailed with Holm-Šídák's correction): ns > 0.05; *P < 0.05; **P < 0.01. Each dot corresponds to one mouse.(H) Kaplan-Meier survival analysis of Pax5Prd*-Jak2 /+ (black) and Pax5+/+ (grey) mice. A P value of < 0.0001 was determined for the survival curves by statistical analysis with the log-rank (Mantel-Cox) test. n, number of mice analyzed."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "C", ")", "Specificity", "of", "the", "anti", "-", "H3Y41ph", "antibody", ",", "as", "shown", "by", "immunoblot", "analysis", ".", "One", "phosphorylated", "(", "pY41", ")", "or", "non", "-", "phosphorylated", "peptide", "was", "coupled", "to", "ubiquitin", "(", "Ubi", ",", "8", ".", "5", "kDa", ")", ",", "followed", "by", "separation", "of", "the", "protein", "conjugates", "on", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblot", "detection", "with", "the", "anti", "-", "H3Y41ph", "antibody", "present", "in", "the", "8B2", "-", "C1", "cell", "supernatant", ".", "Following", "treatment", "with", "calf", "intestinal", "alkaline", "phosphatase", "(", "CIP", ")", ",", "the", "dephosphorylated", "Ubi", "-", "pY41", "peptide", "conjugate", "could", "no", "longer", "be", "detected", "with", "the", "anti", "-", "H3Y41ph", "antibody", ".", "(", "D", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "whole", "-", "cell", "extracts", "prepared", "from", "Pax5Jak2", "/", "+", "and", "control", "Pax5Etv6", "/", "+", "Cdkn2ab", "+", "/", "-", "B", "-", "ALL", "cells", "as", "well", "as", "from", "the", "human", "HEL", ",", "TMD8", "and", "K1106", "cell", "lines", ".", "Phosphorylated", "(", "p", ")", "STAT5", "was", "detected", "with", "an", "anti", "-", "STAT5", "(", "pY694", ")", "antibody", "and", "the", "pY41", "-", "peptide", "with", "the", "purified", "anti", "H3Y41ph", "antibody", "One", "to", "five", "pY41", "-", "peptides", "were", "coupled", "to", "ubiquitin", ",", "which", "was", "added", "in", "the", "range", "of", "50", "ng", "per", "well", ".", "The", "Gapdh", "and", "histone", "H3", "proteins", "were", "analyzed", "as", "loading", "control", ".", "An", "unspecific", "protein", "is", "denoted", "by", "an", "asterisk", ".", "One", "representative", "of", "5", "immunoblot", "experiments", "is", "shown", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(C) Specificity of the anti-H3Y41ph antibody, as shown by immunoblot analysis. One phosphorylated (pY41) or non-phosphorylated peptide was coupled to ubiquitin (Ubi, 8.5 kDa), followed by separation of the protein conjugates on SDS-PAGE and immunoblot detection with the anti-H3Y41ph antibody present in the 8B2-C1 cell supernatant. Following treatment with calf intestinal alkaline phosphatase (CIP), the dephosphorylated Ubi-pY41 peptide conjugate could no longer be detected with the anti-H3Y41ph antibody.(D) Immunoblot analysis of whole-cell extracts prepared from Pax5Jak2/+ and control Pax5Etv6/+ Cdkn2ab+/- B-ALL cells as well as from the human HEL, TMD8 and K1106 cell lines. Phosphorylated (p) STAT5 was detected with an anti-STAT5 (pY694) antibody and the pY41-peptide with the purified anti H3Y41ph antibody One to five pY41-peptides were coupled to ubiquitin, which was added in the range of 50 ng per well. The Gapdh and histone H3 proteins were analyzed as loading control. An unspecific protein is denoted by an asterisk. One representative of 5 immunoblot experiments is shown."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ",", "Tumor", "progression", "in", "Il7", "+", "/", "+", "(", "grey", ")", ",", "Il7", "+", "/", "-", "(", "dashed", ")", "and", "Il7", "-", "/", "-", "(", "black", ")", "mice", "transplanted", "with", "Pax5Jak2", "-", "Luc", "/", "+", "tumor", "cells", ",", "as", "determined", "by", "bioluminescence", "measurements", "at", "the", "indicated", "days", "after", "cell", "transfer", ".", "Images", "of", "three", "transplanted", "mice", "for", "each", "Il7", "genotype", "are", "shown", "at", "the", "indicated", "days", "after", "cell", "transfer", "(", "C", ")", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "analysis", "of", "Il7", "+", "/", "+", ",", "Il7", "+", "/", "-", "and", "Il7", "-", "/", "-", "mice", "transplanted", "with", "Pax5Jak2", "-", "Luc", "/", "+", "tumors", "cells", ".", "Statistical", "analysis", "of", "the", "survival", "curves", "was", "performed", "with", "the", "log", "-", "rank", "(", "Mantel", "-", "Cox", ")", "test", ";", "ns", "P", ">", "0", ".", "05", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "(", "E", ")", "Quantification", "of", "the", "median", "fluorescence", "intensity", "(", "MFI", ")", "values", "of", "the", "p", "-", "STAT5", "levels", "determined", "by", "intracellular", "staining", "of", "splenic", "FO", "B", "cells", "from", "Pax5", "+", "/", "+", "(", "grey", ")", ",", "Pax5Jak2", "/", "+", "(", "black", ")", "and", "Pax5Jak2", "-", "KD", "/", "+", "(", "white", ")", "mice", "at", "the", "age", "of", "3", "-", "10", "weeks", "Statistical", "data", "are", "presented", "as", "mean", "values", "with", "SEM", "and", "were", "analyzed", "by", "the", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "Each", "dot", "corresponds", "to", "one", "mouse", ".", "(", "F", ")", "Flow", "cytometric", "analysis", "of", "p", "-", "STAT5", "levels", "in", "pro", "-", "B", "cells", "(", "B220", "+", "CD19", "+", "Kit", "+", "IgM", "-", ")", "and", "leukemic", "B220low", "B", "cells", "of", "Pax5Jak2", "/", "+", "mice", "(", "black", ")", "as", "well", "as", "in", "control", "pro", "-", "B", "cells", "of", "Pax5", "+", "/", "+", "(", "WT", ")", "mice", "(", "grey", ")", "at", "the", "age", "of", "4", "-", "5", "weeks", ".", "A", "representative", "flow", "cytometric", "analysis", "of", "the", "bone", "marrow", "of", "a", "Pax5Jak2", "/", "+", "mouse", "(", "left", ")", "and", "representative", "intracellular", "p", "-", "STAT5", "stainings", "(", "middle", ")", "are", "shown", ".", "The", "p", "-", "STAT5", "levels", "in", "pro", "-", "B", "and", "leukemic", "B220low", "B", "cells", "(", "right", ")", "are", "quantified", "as", "MFI", "values", "relative", "to", "that", "of", "Pax5", "+", "/", "+", "pro", "-", "B", "cells", ".", "Statistical", "data", "are", "presented", "as", "mean", "values", "with", "SEM", "and", "were", "analyzed", "by", "the", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "Each", "dot", "corresponds", "to", "one", "mouse", ".", "(", "I", ")", "Upregulation", "of", "the", "genes", "Cxcr5", ",", "Syndig1l", "and", "Sema4a", "in", "Pax5Jak2", "/", "+", "(", "PJ", ")", "B", "-", "ALL", "cells", ".", "Mean", "TPM", "values", "with", "SEM", "are", "shown", "for", "the", "following", "RNA", "-", "seq", "experiments", ":", "2", "(", "Ctrl", "B", "-", "ALL", ")", ",", "4", "(", "PJ", "B", "-", "ALL", ")", "K", ")", "Identification", "of", "Cxcr5", ",", "Syndig1l", "and", "Sema4a", "as", "activated", "STAT5", "target", "genes", ".", "ChIP", "-", "seq", "analysis", "identified", "STAT5", "-", "binding", "regions", "at", "all", "three", "loci", "(", "K", ")", ".", "Horizontal", "bars", "below", "the", "ChIP", "-", "seq", "track", "indicate", "STAT5", "-", "binding", "regions", "identified", "by", "MACS", "peak", "calling", ".", "RPM", ",", "reads", "per", "million", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A, Tumor progression in Il7+/+ (grey), Il7+/- (dashed) and Il7-/- (black) mice transplanted with Pax5Jak2-Luc/+ tumor cells, as determined by bioluminescence measurements at the indicated days after cell transfer. Images of three transplanted mice for each Il7 genotype are shown at the indicated days after cell transfer(C) Kaplan-Meier survival analysis of Il7+/+, Il7+/- and Il7-/- mice transplanted with Pax5Jak2-Luc/+ tumors cells. Statistical analysis of the survival curves was performed with the log-rank (Mantel-Cox) test; ns P > 0.05, *P < 0.05, **P < 0.01.(E) Quantification of the median fluorescence intensity (MFI) values of the p-STAT5 levels determined by intracellular staining of splenic FO B cells from Pax5+/+ (grey), Pax5Jak2/+ (black) and Pax5Jak2-KD/+ (white) mice at the age of 3-10 weeks Statistical data are presented as mean values with SEM and were analyzed by the two-tailed unpaired Student's t-test: *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. Each dot corresponds to one mouse.(F) Flow cytometric analysis of p-STAT5 levels in pro-B cells (B220+CD19+Kit+IgM-) and leukemic B220low B cells of Pax5Jak2/+ mice (black) as well as in control pro-B cells of Pax5+/+ (WT) mice (grey) at the age of 4-5 weeks. A representative flow cytometric analysis of the bone marrow of a Pax5Jak2/+ mouse (left) and representative intracellular p-STAT5 stainings (middle) are shown. The p-STAT5 levels in pro-B and leukemic B220low B cells (right) are quantified as MFI values relative to that of Pax5+/+ pro-B cells. Statistical data are presented as mean values with SEM and were analyzed by the two-tailed unpaired Student's t-test: *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. Each dot corresponds to one mouse.(I) Upregulation of the genes Cxcr5, Syndig1l and Sema4a in Pax5Jak2/+ (PJ) B-ALL cells. Mean TPM values with SEM are shown for the following RNA-seq experiments: 2 (Ctrl B-ALL), 4 (PJ B-ALL)K) Identification of Cxcr5, Syndig1l and Sema4a as activated STAT5 target genes. ChIP-seq analysis identified STAT5-binding regions at all three loci (K). Horizontal bars below the ChIP-seq track indicate STAT5-binding regions identified by MACS peak calling. RPM, reads per million."}
{"words": ["Figure", "1MPK4", "‐", "HA", "is", "detected", "in", "PAT1", "‐", "Myc", "immunoprecipitates", "from", "double", "transgenic", "Arabidopsis", "plants", ".", "Immunoblots", "of", "input", "and", "anti", "‐", "Myc", "IPs", "probed", "with", "anti", "‐", "HA", "and", "anti", "‐", "Myc", "antibodies", ".", "Left", "panel", ",", "input", ";", "right", "panel", ",", "anti", "‐", "Myc", "IP", ".", "Yeast", "pat1Δ", "mutants", "are", "unable", "to", "grow", "at", "37", "°", "C", "while", "wild", "‐", "type", "(", "B4742", ")", "strain", "grows", "at", "30", "°", "C", "(", "left", "panel", ")", "and", "37", "°", "C", "(", "right", ")", ".", "Growth", "at", "37", "°", "C", "is", "restored", "in", "pat1Δ", "expressing", "AtPAT1", ".", "Serial", "dilutions", "of", "each", "yeast", "strain", "were", "plated", "on", "YPAD", "agar", "plates", "and", "grown", "at", "the", "indicated", "temperatures", ".", "Co", "‐", "IP", "between", "PAT1", "‐", "HA", "and", "LSM1", "‐", "GFP", ".", "Proteins", "were", "transiently", "co", "‐", "expressed", "in", "N", ".", "benthamiana", "and", "tissue", "harvested", "3", "days", "post", "‐", "infiltration", ".", "Immunoblots", "of", "GFP", "IPs", "(", "top", "panel", ")", "and", "inputs", "(", "20", "μg", "each", ",", "bottom", "panel", ")", ".", "Immunoblots", "were", "cut", "in", "half", "and", "probed", "with", "anti", "‐", "HA", "antibodies", "and", "anti", "‐", "GFP", "antibodies", ".", "Agarose", "gel", "electrophoresis", "of", "5", "′", "RACE", "PCR", "to", "detect", "capped", "transcripts", "of", "EIF4A1", ",", "UGT87A2", "and", "EXPL1", "in", "14", "‐", "day", "‐", "old", "Col", "‐", "0", "and", "pat1", "‐", "1", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1MPK4‐HA is detected in PAT1‐Myc immunoprecipitates from double transgenic Arabidopsis plants. Immunoblots of input and anti‐Myc IPs probed with anti‐HA and anti‐Myc antibodies. Left panel, input; right panel, anti‐Myc IP.Yeast pat1Δ mutants are unable to grow at 37°C while wild‐type (B4742) strain grows at 30°C (left panel) and 37°C (right). Growth at 37°C is restored in pat1Δ expressing AtPAT1. Serial dilutions of each yeast strain were plated on YPAD agar plates and grown at the indicated temperatures.Co‐IP between PAT1‐HA and LSM1‐GFP. Proteins were transiently co‐expressed in N. benthamiana and tissue harvested 3 days post‐infiltration. Immunoblots of GFP IPs (top panel) and inputs (20 μg each, bottom panel). Immunoblots were cut in half and probed with anti‐HA antibodies and anti‐GFP antibodies.Agarose gel electrophoresis of 5′ RACE PCR to detect capped transcripts of EIF4A1, UGT87A2 and EXPL1 in 14‐day‐old Col‐0 and pat1‐1."}
{"words": ["Figure", "2MPK4", "and", "MPK6", "were", "immunoprecipitated", "from", "extracts", "of", "Col", "‐", "0", "seedlings", "treated", "with", "200", "nM", "flg22", "for", "10", "min", ".", "For", "the", "negative", "control", "(", "−", ")", ",", "extracts", "were", "incubated", "with", "agarose", "beads", "without", "antibodies", ".", "IPs", "were", "incubated", "with", "His6", "‐", "PAT1", ",", "His6", "‐", "PAT1", "S208A", "or", "MBP", "for", "60", "min", "at", "37", "°", "C", "before", "boiling", "and", "SDS", "‐", "PAGE", ".", "Autoradiogram", "(", "top", "panel", ")", ",", "Coomassie", "‐", "stained", "gel", "for", "loading", "control", "(", "bottom", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2MPK4 and MPK6 were immunoprecipitated from extracts of Col‐0 seedlings treated with 200 nM flg22 for 10 min. For the negative control (−), extracts were incubated with agarose beads without antibodies. IPs were incubated with His6‐PAT1, His6‐PAT1 S208A or MBP for 60 min at 37°C before boiling and SDS‐PAGE. Autoradiogram (top panel), Coomassie‐stained gel for loading control (bottom)."}
{"words": ["Figure", "3pat1", "mutants", "have", "a", "serrated", "leaf", ",", "semi", "‐", "dwarf", "phenotypePlants", "photographed", "at", "4", "weeks", "of", "growth", "in", "short", "day", "conditions", ",", "genotypes", "as", "indicated", ".", "Col", "‐", "0", "and", "eds1", "‐", "2", "plants", "and", "pat1", "‐", "1", "and", "pat1", "‐", "1", "/", "eds1", "‐", "2", ",", "respectively", ",", "were", "placed", "in", "the", "middle", "of", "the", "same", "pots", "before", "the", "pictures", "were", "taken", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3pat1 mutants have a serrated leaf, semi‐dwarf phenotypePlants photographed at 4 weeks of growth in short day conditions, genotypes as indicated. Col‐0 and eds1‐2 plants and pat1‐1 and pat1‐1/eds1‐2, respectively, were placed in the middle of the same pots before the pictures were taken."}
{"words": ["Figure", "4PR", "gene", "expression", "is", "elevated", "in", "mpk4", "‐", "2", "and", "pat1", "‐", "1", "mutants", ".", "Four", "‐", "week", "‐", "old", "plants", "were", "used", "for", "RNA", "extraction", ",", "followed", "by", "qRT", "‐", "PCR", ".", "Fold", "‐", "change", "in", "PR1", "(", "gray", "bars", ")", "and", "PR2", "(", "black", ")", "expression", "is", "relative", "to", "Col", "‐", "0", ",", "normalized", "to", "UBQ10", ".", "Standard", "error", "of", "the", "mean", "is", "indicated", "by", "errors", "bars", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Statistical", "significance", "between", "the", "mean", "values", "was", "determined", "by", "ANOVA", "followed", "by", "Fisher", "'", "s", "LSD", "test", ",", "P", "‐", "values", "are", "only", "shown", "for", "mean", "values", "significantly", "different", "from", "Col", "‐", "0", ".", "pat1", "is", "more", "resistant", "to", "colonization", "by", "P", ".", "syringae", "pv", ".", "tomato", "DC3000", ".", "Bacteria", "were", "syringe", "‐", "infiltrated", "and", "samples", "taken", "3", "days", "post", "‐", "infiltration", ".", "Data", "are", "shown", "as", "log10", "‐", "transformed", "colony", "‐", "forming", "units", "/", "cm2", "leaf", "tissue", "(", "cfu", "/", "cm2", ")", ".", "Standard", "error", "of", "the", "mean", "is", "indicated", "by", "errors", "bars", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Statistical", "significance", "between", "the", "mean", "values", "was", "determined", "by", "ANOVA", "followed", "by", "Fisher", "′", "s", "LSD", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4PR gene expression is elevated in mpk4‐2 and pat1‐1 mutants. Four‐week‐old plants were used for RNA extraction, followed by qRT‐PCR. Fold‐change in PR1 (gray bars) and PR2 (black) expression is relative to Col‐0, normalized to UBQ10. Standard error of the mean is indicated by errors bars (n = 3). Statistical significance between the mean values was determined by ANOVA followed by Fisher's LSD test, P‐values are only shown for mean values significantly different from Col‐0.pat1 is more resistant to colonization by P. syringae pv. tomato DC3000. Bacteria were syringe‐infiltrated and samples taken 3 days post‐infiltration. Data are shown as log10‐transformed colony‐forming units/cm2 leaf tissue (cfu/cm2). Standard error of the mean is indicated by errors bars (n = 4). Statistical significance between the mean values was determined by ANOVA followed by Fisher′s LSD test."}
{"words": ["Figure", "5Confocalmicroscopy", "with", "root", "elongation", "zones", ".", "Five", "‐", "day", "‐", "old", "Col", "‐", "0", "/", "PAT1", "‐", "GFP", "seedlings", "were", "treated", "with", "1", "μM", "flg22", "on", "glass", "slides", "for", "20", "min", "(", "second", "panel", ")", "followed", "by", "treatment", "with", "100", "μg", "/", "ml", "cycloheximide", "for", "60", "min", "(", "bottom", "panel", ")", ".", "The", "scale", "bar", "corresponds", "to", "10", "μm", ".", "Confocalmicroscopy", "with", "5", "‐", "day", "‐", "old", "VCS", "‐", "GFP", "seedlings", "treated", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "The", "scale", "bar", "corresponds", "to", "10", "μm", ".", "PAT1", "protein", "is", "induced", "by", "PAMP", "treatment", ".", "Immunoblot", "detection", "of", "equal", "amounts", "of", "protein", "from", "Col", "‐", "0", "seedlings", "at", "times", "in", "minutes", "as", "indicated", "following", "vacuum", "infiltration", "with", "1", "μM", "flg22", "or", "water", "(", "180", "min", "after", "infiltration", ")", ".", "Immunoblots", "were", "probed", "with", "anti", "‐", "PAT1", "antibodies", ".", "Negative", "control", "pat1", "‐", "1", "was", "loaded", "for", "comparison", ".", "Coomassie", "brilliant", "blue", "protein", "loading", "control", "is", "indicated", "by", "CBB", ".", "Anti", "‐", "GFP", "immunoblotting", "of", "proteins", "extracted", "from", "Col", "‐", "0", "/", "PAT1", "‐", "GFP", "seedlings", "treated", "over", "a", "time", "course", "with", "flg22", "(", "top", "panel", ")", "and", "Coomassie", "brilliant", "blue", "(", "CBB", ")", "‐", "stained", "PVDF", "loading", "control", "is", "shown", "(", "bottom", "panel", ")", ".", "No", "PAT1", "‐", "GFP", "was", "detected", "in", "negative", "control", "Col", "‐", "0", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Confocalmicroscopy with root elongation zones. Five‐day‐old Col‐0/PAT1‐GFP seedlings were treated with 1 μM flg22 on glass slides for 20 min (second panel) followed by treatment with 100 μg/ml cycloheximide for 60 min (bottom panel). The scale bar corresponds to 10 μm.Confocalmicroscopy with 5‐day‐old VCS‐GFP seedlings treated as in (A). The scale bar corresponds to 10 μm.PAT1 protein is induced by PAMP treatment. Immunoblot detection of equal amounts of protein from Col‐0 seedlings at times in minutes as indicated following vacuum infiltration with 1 μM flg22 or water (180 min after infiltration). Immunoblots were probed with anti‐PAT1 antibodies. Negative control pat1‐1 was loaded for comparison. Coomassie brilliant blue protein loading control is indicated by CBB.Anti‐GFP immunoblotting of proteins extracted from Col‐0/PAT1‐GFP seedlings treated over a time course with flg22 (top panel) and Coomassie brilliant blue (CBB)‐stained PVDF loading control is shown (bottom panel). No PAT1‐GFP was detected in negative control Col‐0."}
{"words": ["Figure", "6Elevated", "PR", "gene", "expression", "in", "pat1", "mutants", "is", "suppressed", "by", "summ2", "‐", "8", ".", "Four", "‐", "week", "‐", "old", "plants", "were", "used", "for", "RNA", "extraction", ",", "followed", "by", "qRT", "‐", "PCR", ".", "Fold", "‐", "change", "in", "PR1", "(", "gray", "bars", ")", "and", "PR2", "(", "black", "bars", ")", "expression", "is", "relative", "to", "Col", "‐", "0", ",", "normalized", "to", "UBQ10", ".", "Standard", "error", "of", "the", "mean", "is", "indicated", "by", "errors", "bars", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "pat1", "resistance", "to", "P", ".", "syringae", "pv", ".", "tomato", "DC3000", "is", "suppressed", "by", "summ2", "‐", "8", ".", "Bacteria", "were", "syringe", "‐", "infiltrated", "and", "samples", "taken", "3", "days", "post", "‐", "infiltration", ".", "Data", "are", "log10", "‐", "transformed", "colony", "‐", "forming", "units", "/", "cm2", "leaf", "tissue", "(", "cfu", "/", "cm2", ")", ".", "Standard", "error", "of", "the", "mean", "is", "indicated", "by", "errors", "bars", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "14", "‐", "day", "‐", "old", "seedlings", "grown", "on", "ms", "plates", "were", "used", "for", "RNA", "extraction", ".", "Next", ",", "1", "μg", "of", "RNA", "from", "each", "sample", "was", "treated", "with", "XRN1", "(", "NEB", ")", "or", "mock", "treated", "before", "RT", "‐", "qPCR", ".", "Data", "were", "normalized", "to", "ACT2", ",", "and", "transcript", "levels", "were", "compared", "between", "XRN1", "and", "mock", "‐", "treated", "RNA", "for", "each", "genotype", ".", "Standard", "error", "of", "the", "mean", "is", "indicated", "by", "error", "bars", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Statistical", "significance", "between", "the", "mean", "values", "was", "determined", "by", "ANOVA", "followed", "by", "Fisher", "'", "s", "LSD", "test", ".", "Phosphorylation", "of", "the", "PAT1", "peptide", "SSFVSYPPPGSISPDQR", ",", "which", "include", "Ser208", ",", "in", "Col", "‐", "0", "and", "mkk1", "/", "1", "‐", "summ2", "before", "and", "after", "flg22", "treatment", ".", "The", "phosphorylation", "stoichiometry", "is", "illustrated", "relative", "to", "Col", "PAT1", "without", "flg22", "treatment", ".", "The", "ratios", "were", "obtained", "using", "quantitative", "iTRAQ", "mass", "spectrometry", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Elevated PR gene expression in pat1 mutants is suppressed by summ2‐8. Four‐week‐old plants were used for RNA extraction, followed by qRT‐PCR. Fold‐change in PR1 (gray bars) and PR2 (black bars) expression is relative to Col‐0, normalized to UBQ10. Standard error of the mean is indicated by errors bars (n = 3).pat1 resistance to P. syringae pv. tomato DC3000 is suppressed by summ2‐8. Bacteria were syringe‐infiltrated and samples taken 3 days post‐infiltration. Data are log10‐transformed colony‐forming units/cm2 leaf tissue (cfu/cm2). Standard error of the mean is indicated by errors bars (n = 4).14‐day‐old seedlings grown on ms plates were used for RNA extraction. Next, 1 μg of RNA from each sample was treated with XRN1 (NEB) or mock treated before RT‐qPCR. Data were normalized to ACT2, and transcript levels were compared between XRN1 and mock‐treated RNA for each genotype. Standard error of the mean is indicated by error bars (n = 4). Statistical significance between the mean values was determined by ANOVA followed by Fisher's LSD test.Phosphorylation of the PAT1 peptide SSFVSYPPPGSISPDQR, which include Ser208, in Col‐0 and mkk1/1‐summ2 before and after flg22 treatment. The phosphorylation stoichiometry is illustrated relative to Col PAT1 without flg22 treatment. The ratios were obtained using quantitative iTRAQ mass spectrometry."}
{"words": ["Figure", "7Proteins", "were", "transiently", "co", "‐", "expressed", "(", "PAT1", "‐", "GFP", "+", "MPK4", "‐", "HA", "or", "SUMM2", "‐", "HA", ")", "in", "N", ".", "benthamiana", "and", "tissue", "harvested", "2", "days", "post", "‐", "infiltration", ".", "Anti", "‐", "HA", "immunoblots", "of", "inputs", "(", "20", "μg", "each", ")", "are", "shown", "in", "the", "bottom", "panel", ".", "Immunoblots", "of", "GFP", "IPs", "were", "probed", "with", "anti", "‐", "HA", "antibodies", ",", "then", "stripped", "and", "probed", "with", "anti", "‐", "GFP", "antibodies", ".", "Molecular", "weights", "are", "shown", "in", "kDa", "on", "the", "right", ".", "Confocalimages", "of", "yellow", "fluorescent", "protein", "complementation", ".", "PAT1", "‐", "Nc", "was", "transiently", "co", "‐", "expressed", "with", "either", "SUMM2", "‐", "Nn", "or", "At4g12010", "in", "N", ".", "benthamiana", ".", "Confocalmicroscopy", "on", "leaf", "disks", "was", "conducted", "2", "days", "post", "‐", "infiltration", ".", "Merged", "pictures", "show", "overlay", "of", "brightfield", ",", "chlorophyll", "and", "eYFP", ".", "The", "scale", "bar", "corresponds", "to", "25", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Proteins were transiently co‐expressed (PAT1‐GFP + MPK4‐HA or SUMM2‐HA) in N. benthamiana and tissue harvested 2 days post‐infiltration. Anti‐HA immunoblots of inputs (20 μg each) are shown in the bottom panel. Immunoblots of GFP IPs were probed with anti‐HA antibodies, then stripped and probed with anti‐GFP antibodies. Molecular weights are shown in kDa on the right.Confocalimages of yellow fluorescent protein complementation. PAT1‐Nc was transiently co‐expressed with either SUMM2‐Nn or At4g12010 in N. benthamiana. Confocalmicroscopy on leaf disks was conducted 2 days post‐infiltration. Merged pictures show overlay of brightfield, chlorophyll and eYFP. The scale bar corresponds to 25 μm."}
{"words": ["Figure", "1A", ",", "B", "Bottom", "panels", ":", "gene", "annotation", "track", "(", "mm10", ")", ";", "the", "activated", "gene", "is", "marked", "in", "green", "and", "the", "location", "of", "the", "TALE", "-", "VP64", "target", "sequence", "is", "shown", "by", "the", "vertical", "dashed", "green", "line", ".", "Middle", "panels", ":", "DamID", "tracks", "of", "NL", "interactions", "in", "control", "cells", "(", "\"", "control", "\"", ",", "blue", "line", ")", "and", "cells", "expressing", "TALE", "-", "VP64", "(", "\"", "experimental", "\"", ",", "red", "line", ")", ".", "n", "indicates", "the", "number", "of", "independent", "biological", "replicates", "that", "were", "combined", ".", "Noise", "was", "suppressed", "by", "a", "running", "mean", "filter", "of", "indicated", "window", "size", ".", "Shading", "between", "the", "lines", "corresponds", "to", "the", "color", "of", "the", "sample", "with", "the", "highest", "value", ".", "Arrowheads", "on", "the", "right", "-", "hand", "side", "mark", "the", "5th", "and", "95th", "percentiles", "of", "genome", "-", "wide", "DamID", "values", ".", "Top", "panels", ":", "domainograms", ";", "for", "every", "window", "of", "indicated", "size", "(", "vertical", "axis", ")", "and", "centered", "on", "a", "genomic", "position", "(", "horizontal", "axis", ")", "the", "pixel", "shade", "indicates", "the", "ranking", "of", "the", "change", "in", "DamID", "score", "(", "experimental", "minus", "control", ")", "in", "this", "window", "compared", "to", "the", "genome", "-", "wide", "changes", "in", "DamID", "scores", "across", "all", "possible", "windows", "of", "the", "same", "size", ".", "Blue", ":", "DamID", "score", "is", "highest", "in", "control", "samples", ";", "red", ":", "DamID", "score", "is", "highest", "in", "experimental", "samples", "(", "color", "key", "on", "the", "right", "of", "panel", "(", "a", ")", ")", ".", "In", "(", "a", ")", "activation", "of", "Sox6", "was", "the", "experimental", "perturbation", ",", "activation", "of", "Nrp1", "(", "which", "is", "located", "on", "a", "different", "chromosome", ")", "served", "as", "control", ";", "in", "(", "b", ")", "activation", "of", "Nrp1", "was", "the", "experimental", "condition", "and", "activation", "of", "Sox6", "served", "as", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A, B Bottom panels: gene annotation track (mm10); the activated gene is marked in green and the location of the TALE-VP64 target sequence is shown by the vertical dashed green line. Middle panels: DamID tracks of NL interactions in control cells (\"control\", blue line) and cells expressing TALE-VP64 (\"experimental\", red line). n indicates the number of independent biological replicates that were combined. Noise was suppressed by a running mean filter of indicated window size. Shading between the lines corresponds to the color of the sample with the highest value. Arrowheads on the right-hand side mark the 5th and 95th percentiles of genome-wide DamID values. Top panels: domainograms; for every window of indicated size (vertical axis) and centered on a genomic position (horizontal axis) the pixel shade indicates the ranking of the change in DamID score (experimental minus control) in this window compared to the genome-wide changes in DamID scores across all possible windows of the same size. Blue: DamID score is highest in control samples; red: DamID score is highest in experimental samples (color key on the right of panel (a)). In (a) activation of Sox6 was the experimental perturbation, activation of Nrp1 (which is located on a different chromosome) served as control; in (b) activation of Nrp1 was the experimental condition and activation of Sox6 served as control."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "a", "-", "b", ")", "Plots", "as", "in", "Figure", "1", ",", "showing", "changes", "in", "Lamin", "B1", "DamID", "signals", "upon", "CRISPRa", "activation", "of", "NLGN1", "(", "a", ")", "and", "SOX6", "(", "b", ")", ".", "Control", "cells", "were", "treated", "either", "without", "sgRNA", "or", "with", "one", "of", "various", "sgRNAs", "targeting", "promoters", "on", "different", "chromosomes", ".", "Vertical", "green", "dotted", "lines", "mark", "the", "position", "of", "the", "sgRNA", "target", "sequence", ".", "(", "c", ")", "Domainograms", "showing", "regions", "with", "reduced", "NL", "interactions", "around", "12", "genes", "individually", "activated", "by", "CRISPRa", ".", "Genomic", "regions", "are", "aligned", "by", "the", "respective", "sgRNA", "target", "positions", ",", "and", "oriented", "so", "that", "the", "activated", "genes", "are", "all", "transcribed", "from", "left", "to", "right", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(a-b) Plots as in Figure 1, showing changes in Lamin B1 DamID signals upon CRISPRa activation of NLGN1 (a) and SOX6 (b). Control cells were treated either without sgRNA or with one of various sgRNAs targeting promoters on different chromosomes. Vertical green dotted lines mark the position of the sgRNA target sequence.(c) Domainograms showing regions with reduced NL interactions around 12 genes individually activated by CRISPRa. Genomic regions are aligned by the respective sgRNA target positions, and oriented so that the activated genes are all transcribed from left to right."}
{"words": ["Figure", "3Average", "DamID", "values", "plotted", "against", "average", "expression", "levels", "of", "eight", "genes", "activated", "by", "CRISPRa", "(", "red", ";", "n", "=", "2", ")", "or", "in", "control", "cells", "that", "were", "treated", "either", "without", "sgRNA", "or", "with", "one", "of", "various", "sgRNAs", "targeting", "promoters", "on", "different", "chromosomes", "(", "blue", ";", "n", "ranging", "from", "19", "to", "27", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Average DamID values plotted against average expression levels of eight genes activated by CRISPRa (red; n = 2) or in control cells that were treated either without sgRNA or with one of various sgRNAs targeting promoters on different chromosomes (blue; n ranging from 19 to 27)."}
{"words": ["Figure", "4A", "-", "C", "CRISPRa", "activation", "of", "ADAM22", "(", "a", ")", ",", "ABCB1", "(", "b", ")", "and", "PTN", "(", "c", ")", "in", "human", "RPE", "-", "1", "cells", ".", "Top", "panels", "visualize", "DamID", "data", "similar", "to", "Figure", "2a", "-", "b", ".", "Middle", "panels", "show", "maps", "of", "replication", "timing", "at", "the", "same", "resolution", "and", "in", "the", "same", "plotting", "style", "as", "panels", ",", "except", "that", "different", "colors", "are", "used", "as", "indicated", ".", "Bottom", "panels", "show", "gene", "track", ",", "with", "activated", "gene", "highlighted", "in", "green", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A-C CRISPRa activation of ADAM22 (a), ABCB1 (b) and PTN (c) in human RPE-1 cells. Top panels visualize DamID data similar to Figure 2a-b. Middle panels show maps of replication timing at the same resolution and in the same plotting style as panels, except that different colors are used as indicated. Bottom panels show gene track, with activated gene highlighted in green."}
{"words": ["Figure", "5Changes", "in", "NL", "interactions", "after", "CRISPRa", "activation", "of", "MLK4", "in", "human", "RPE", "-", "1", "cells", ".", "Visualization", "of", "DamID", "data", "as", "in", "Figure", "2a", "-", "b", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Changes in NL interactions after CRISPRa activation of MLK4 in human RPE-1 cells. Visualization of DamID data as in Figure 2a-b."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "a", ")", "DamID", "domainograms", "of", "NL", "interactions", "after", "activation", "of", "CCSER1", ",", "GRID2", ",", "or", "both", ".", "All", "data", "are", "from", "human", "RPE", "-", "1", "cells", ".", "(", "b", ")", "DamID", "domainograms", "after", "activation", "of", "ADAM22", ",", "ABCB1", ",", "or", "the", "genes", "ABCB4", ",", "ABCB1", ",", "ADAM22", "and", "RUNC3B", "simultaneously", ".", "All", "data", "are", "from", "human", "RPE", "-", "1", "cells", ".", "DamID", "data", "of", "activation", "of", "ADAM22", "and", "ABCB1", "alone", "are", "same", "as", "in", "Figure", "4a", ",", "b", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(a) DamID domainograms of NL interactions after activation of CCSER1, GRID2, or both. All data are from human RPE-1 cells.(b) DamID domainograms after activation of ADAM22, ABCB1, or the genes ABCB4, ABCB1, ADAM22 and RUNC3B simultaneously. All data are from human RPE-1 cells. DamID data of activation of ADAM22 and ABCB1 alone are same as in Figure 4a, b."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "a", ")", "DamID", "profiles", "of", "the", "129Sv", "allele", "of", "the", "Morc1", "locus", "with", "deletions", "of", "the", "promoters", "of", "Morc", ",", "Morc1", "and", "DppA2", "(", "deletions", "marked", "by", "yellow", "vertical", "boxes", ")", ",", "and", "in", "control", "cells", ".", "(", "b", ")", "Same", "as", "(", "a", ")", ",", "but", "for", "the", "non", "-", "mutated", "Cast", "alleles", ".", "(", "c", "-", "d", ")", "Same", "design", "as", "(", "a", "-", "b", ")", ",", "but", "with", "only", "a", "single", "mono", "-", "allelic", "deletion", "of", "the", "Morc", "promoter", "(", "vertical", "yellow", "box", ")", ".", "(", "e", "-", "f", ")", "Effect", "of", "PAS", "insertion", "on", "NL", "interactions", "of", "Cobl", "gene", "locus", ".", "Same", "design", "as", "(", "a", "-", "b", ")", "but", "with", "insertion", "of", "a", "PAS", "(", "located", "at", "red", "triangle", "and", "vertical", "dotted", "line", ")", "that", "truncates", "the", "129Sv", "allele", "of", "the", "Cobl", "transcription", "unit", ".", "129Sv", "allele", "is", "shown", "in", "(", "e", ")", ",", "non", "-", "mutated", "Cast", "allele", "in", "(", "f", ")", ".", "Clones", "with", "Morc1", "locus", "mutations", "(", "each", "assayed", "in", "four", "independent", "biological", "replicates", ")", "served", "collectively", "as", "control", "in", "(", "e", "-", "f", ")"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(a) DamID profiles of the 129Sv allele of the Morc1 locus with deletions of the promoters of Morc, Morc1 and DppA2 (deletions marked by yellow vertical boxes), and in control cells. (b) Same as (a), but for the non-mutated Cast alleles. (c-d) Same design as (a-b), but with only a single mono-allelic deletion of the Morc promoter (vertical yellow box).(e-f) Effect of PAS insertion on NL interactions of Cobl gene locus. Same design as (a-b) but with insertion of a PAS (located at red triangle and vertical dotted line) that truncates the 129Sv allele of the Cobl transcription unit. 129Sv allele is shown in (e), non-mutated Cast allele in (f). Clones with Morc1 locus mutations (each assayed in four independent biological replicates) served collectively as control in (e-f)"}
{"words": ["Figure", "8", "(", "c", ")", "Average", "DamID", "profiles", "across", "17", "transgene", "integration", "sites", "inside", "LADs", ".", "Blue", "curve", "shows", "alleles", "without", "integrations", ",", "red", "curve", "shows", "the", "corresponding", "alleles", "with", "integrations", ".", "Shading", "between", "the", "lines", "shows", "which", "curve", "has", "the", "highest", "value", ".", "(", "d", ")", "Relative", "expression", "levels", "of", "individual", "barcoded", "transgenes", "in", "LADs", "and", "iLADs", ".", "(", "e", ")", "Estimated", "expression", "levels", "of", "integrated", "transgenes", "in", "LADs", "(", "vertical", "orange", "lines", ";", "median", "value", "indicated", "by", "arrowhead", ")", ",", "compared", "to", "the", "distribution", "of", "expression", "levels", "of", "all", "active", "endogenous", "genes", "(", "black", "curve", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(c) Average DamID profiles across 17 transgene integration sites inside LADs. Blue curve shows alleles without integrations, red curve shows the corresponding alleles with integrations. Shading between the lines shows which curve has the highest value.(d) Relative expression levels of individual barcoded transgenes in LADs and iLADs.(e) Estimated expression levels of integrated transgenes in LADs (vertical orange lines; median value indicated by arrowhead), compared to the distribution of expression levels of all active endogenous genes (black curve)."}
{"words": ["Figure", "1A", "The", "family", "pedigree", ",", "where", "circles", "denote", "female", "members", ",", "squares", "male", "members", ",", "solid", "symbols", "affected", "members", ",", "and", "white", "symbols", "asymptomatic", "members", "with", "normal", "physical", "exam", ";", "the", "dots", "indicate", "heterozygous", "carriers", "and", "double", "line", "denotes", "a", "consanguineous", "marriage", ".", "The", "pictures", "show", "scapular", "winging", "which", "is", "a", "consistent", "clinical", "sign", "in", "affected", "individuals", ".", "B", "Hematoxylin", "and", "eosin", "staining", "(", "H", "&", "amp", ";", "amp", ";", "E", ")", "of", "skeletal", "muscle", "from", "patient", "II", ".", "1", "shows", "histological", "features", "of", "moderate", "to", "severe", "dystrophic", "pattern", ".", "(", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ")", ".", "C", "T1", "-", "weighted", "MRI", "axial", "images", "at", "thigh", "and", "calf", "levels", "show", "that", "the", "fatty", "degeneration", "is", "more", "prominent", "in", "thigh", "muscles", ",", "equally", "affecting", "posterior", "and", "anterior", "compartment", ",", "with", "relative", "sparing", "of", "the", "rectus", "femoris", ",", "sartorius", "and", "gracilismuscles", "until", "late", "stages", "(", "4", ",", "10", "and", "11", ",", "respectively", ")", ".", "Strikingly", ",", "the", "fatty", "tissue", "is", "located", "in", "the", "internal", "parts", "of", "almost", "all", "the", "affected", "muscles", "in", "thigh", "(", "1", ",", "2", ",", "3", ",", "5", "-", "9", ")", ",", "while", "the", "external", "regions", "are", "spared", ".", "At", "calf", "level", ",", "only", "the", "gastrocnemius", "medialis", "muscle", "(", "12", ")", "shows", "this", "pattern", ",", "while", "the", "soleus", "(", "13", ")", "is", "diffusely", "involved", ".", "Patient", "II", ".", "2", "(", "PII", ".", "2", ")", "shows", "late", "-", "stage", "thigh", "muscles", "with", "an", "unusual", "involvement", "of", "the", "tibialis", "posteriormuscle", "(", "14", ")", "in", "the", "lower", "leg", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A The family pedigree, where circles denote female members, squares male members, solid symbols affected members, and white symbols asymptomatic members with normal physical exam; the dots indicate heterozygous carriers and double line denotes a consanguineous marriage. The pictures show scapular winging which is a consistent clinical sign in affected individuals.B Hematoxylin and eosin staining (H&amp;amp;E) of skeletal muscle from patient II.1 shows histological features of moderate to severe dystrophic pattern. (Scale bar, 50 μm).C T1-weighted MRI axial images at thigh and calf levels show that the fatty degeneration is more prominent in thigh muscles, equally affecting posterior and anterior compartment, with relative sparing of the rectus femoris, sartorius and gracilismuscles until late stages (4, 10 and 11, respectively). Strikingly, the fatty tissue is located in the internal parts of almost all the affected muscles in thigh (1, 2, 3, 5-9), while the external regions are spared. At calf level, only the gastrocnemius medialis muscle (12) shows this pattern, while the soleus (13) is diffusely involved. Patient II.2 (PII.2) shows late-stage thigh muscles with an unusual involvement of the tibialis posteriormuscle (14) in the lower leg."}
{"words": ["Figure", "2A", "Muscle", "sections", "show", "variable", "labeling", "using", "an", "antibody", "against", "glycosylated", "α", "-", "dystroglycan", "(", "αDG", "-", "IIH6", ")", ",", "whereas", "labeling", "using", "antibodies", "against", "α", "-", "dystroglycan", "core", "protein", "(", "αDG", "-", "Core", ")", ",", "β", "-", "dystroglycan", "(", "βDG", ")", "and", "laminin", "-", "2", "is", "similar", "to", "control", "(", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ")", ".", "B", "Western", "blots", "and", "ligand", "-", "overlay", "(", "O", "/", "L", ")", "of", "wheat", "-", "germ", "agglutinin", "-", "enriched", "muscle", "and", "fibroblasts", "lysates", "from", "PII", ".", "2", ",", "PII", ".", "5", ",", "the", "healthy", "sibling", "(", "HII", ".", "3", ")", "and", "healthy", "controls", "(", "Ctr", ",", "Ctr1", ",", "and", "Ctr2", ")", "(", "Muscle", ":", "250μg", "protein", "/", "lane", ",", "Fibroblasts", ":", "800μg", "/", "lane", ")", ".", "In", "muscle", ",", "expression", "of", "αDG", "-", "IIH6", "is", "reduced", "but", "the", "αDG", "-", "Core", "shows", "similar", "expression", "as", "controls", ",", "with", "a", "slight", "reduction", "in", "molecular", "weight", ";", "laminin", "overlay", "assay", "detected", "some", "binding", "activity", "but", "was", "diminished", "compared", "to", "controls", ",", "whereas", "agrin", "-", "binding", "activity", "showed", "no", "difference", "with", "controls", ".", "In", "fibroblasts", ",", "both", "αDG", "-", "IIH6", "and", "αDG", "-", "Core", "expression", "and", "laminin", "-", "binding", "activity", "were", "normal", ",", "suggesting", "that", "unlike", "other", "muscular", "dystrophies", ",", "α", "-", "dystroglycan", "glycosylation", "defect", "is", "muscle", "-", "specific", "in", "POGLUT1", "patients", ".", "C", "No", "ultrastructural", "alterations", "are", "observed", "in", "muscle", "by", "electron", "microscopy", "(", "6", "-", "7", "fields", "were", "captured", "from", "PII", ".", "1", ",", "PII", ".", "3", ",", "and", "PII", ".", "5", ")", ".", "Note", "normal", "basement", "membrane", "compactation", "(", "arrowheads", ")", ".", "Original", "magnification", ":", "26", ",", "700", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Muscle sections show variable labeling using an antibody against glycosylated α-dystroglycan (αDG-IIH6), whereas labeling using antibodies against α-dystroglycan core protein (αDG-Core), β-dystroglycan (βDG) and laminin-2 is similar to control (Scale bar, 100 μm).B Western blots and ligand-overlay (O/L) of wheat-germ agglutinin-enriched muscle and fibroblasts lysates from PII.2, PII.5, the healthy sibling (HII.3) and healthy controls (Ctr, Ctr1, and Ctr2) (Muscle: 250μg protein/lane, Fibroblasts: 800μg/lane). In muscle, expression of αDG-IIH6 is reduced but the αDG-Core shows similar expression as controls, with a slight reduction in molecular weight; laminin overlay assay detected some binding activity but was diminished compared to controls, whereas agrin-binding activity showed no difference with controls. In fibroblasts, both αDG-IIH6 and αDG-Core expression and laminin-binding activity were normal, suggesting that unlike other muscular dystrophies, α-dystroglycan glycosylation defect is muscle-specific in POGLUT1 patients.C No ultrastructural alterations are observed in muscle by electron microscopy (6-7 fields were captured from PII.1, PII.3, and PII.5). Note normal basement membrane compactation (arrowheads). Original magnification: 26,700."}
{"words": ["Figure", "4A", "Protein", "O", "-", "glucosyltransferase", "activity", "of", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "or", "D233E", "mutant", "POGLUT1", "protein", "toward", "human", "factor", "IX", "EGF", "repeat", "(", "hFIX", "-", "EGF", ")", ".", "Wild", "-", "type", "shows", "higher", "O", "-", "glucosyltransferase", "activity", "than", "D233E", ",", "and", "this", "activity", "is", "dependent", "on", "the", "concentration", "of", "the", "acceptor", "substrate", "hFIX", "-", "EGF", "repeat", "(", "left", ")", "and", "on", "the", "concentration", "of", "donor", "substrate", "UDP", "-", "glucose", "(", "UDP", "-", "Glc", ")", "(", "right", ")", ".", "Values", "indicate", "mean", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "assays", ".", "B", "O", "-", "glucosyltransferase", "activity", "towards", "five", "different", "single", "EGF", "repeats", "from", "mouse", "Notch1", ".", "Wild", "-", "type", "POGLUT1", "shows", "higher", "activity", "toward", "all", "EGF", "repeats", "tested", "than", "POGLUT1D233E", ".", "The", "Y", "-", "axis", "shows", "the", "normalized", "activity", "relative", "to", "wild", "-", "type", "POGLUT1", ".", "EGF", "repeats", "were", "at", "10", "μM", ".", "Values", "indicate", "mean", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "assays", ".", "C", "Elution", "profiles", "of", "the", "POGLUT1", "reaction", "products", "on", "reverse", "phase", "HPLC", ".", "hFIX", "-", "EGF", "repeat", "was", "incubated", "with", "wild", "-", "type", "or", "D233E", "mutant", "POGLUT1", "and", "donor", "substrate", ",", "UDP", "-", "Glc", "or", "UDP", "-", "xylose", "(", "UDP", "-", "Xyl", ")", ",", "at", "37ºC", "overnight", ".", "Values", "on", "top", "of", "the", "peaks", "indicate", "the", "measured", "masses", ".", "Addition", "of", "Glc", "(", "162", "Da", ")", "or", "xylose", "(", "132", "Da", ")", "to", "hFIX", "-", "EGF", "(", "5696", ".", "2", "Da", ")", "by", "wild", "-", "type", "POGLUT1", "caused", "a", "shift", "to", "an", "earlier", "retention", "time", "(", "left", ")", ".", "Similarly", ",", "the", "products", "exhibited", "a", "similar", "shift", "after", "incubation", "with", "POGLUT1D233E", "(", "right", ")", ".", "These", "results", "indicate", "that", "POGLUT1D233E", "can", "add", "a", "single", "glucose", "or", "xylose", "to", "hFIX", "-", "EGF", "repeats", "and", "thus", "has", "residual", "enzymatic", "activity", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A Protein O-glucosyltransferase activity of wild-type (WT) or D233E mutant POGLUT1 protein toward human factor IX EGF repeat (hFIX-EGF). Wild-type shows higher O-glucosyltransferase activity than D233E, and this activity is dependent on the concentration of the acceptor substrate hFIX-EGF repeat (left) and on the concentration of donor substrate UDP-glucose (UDP-Glc) (right). Values indicate mean ± SEM from three independent assays.B O-glucosyltransferase activity towards five different single EGF repeats from mouse Notch1. Wild-type POGLUT1 shows higher activity toward all EGF repeats tested than POGLUT1D233E. The Y-axis shows the normalized activity relative to wild-type POGLUT1. EGF repeats were at 10 μM. Values indicate mean ± SEM from three independent assays.C Elution profiles of the POGLUT1 reaction products on reverse phase HPLC. hFIX-EGF repeat was incubated with wild-type or D233E mutant POGLUT1 and donor substrate, UDP-Glc or UDP-xylose (UDP-Xyl), at 37ºC overnight. Values on top of the peaks indicate the measured masses. Addition of Glc (162 Da) or xylose (132 Da) to hFIX-EGF (5696.2 Da) by wild-type POGLUT1 caused a shift to an earlier retention time (left). Similarly, the products exhibited a similar shift after incubation with POGLUT1D233E (right). These results indicate that POGLUT1D233E can add a single glucose or xylose to hFIX-EGF repeats and thus has residual enzymatic activity."}
{"words": ["Figure", "5A", "Western", "blot", "of", "muscle", "homogenates", "shows", "reduced", "expression", "of", "Notch1", "intracellular", "domain", "(", "NICD", ")", "in", "patients", ".", "B", "-", "C", "qRT", "-", "PCR", "on", "RNA", "extracted", "from", "skeletal", "-", "muscle", "shows", "that", "expression", "of", "HES1", "(", "B", ")", "and", "PAX7", "(", "C", ")", "was", "significantly", "lower", "in", "D233E", "patients", "compared", "to", "healthy", "controls", ".", "Mean", "±", "SEM", ",", "Student", "´", "s", "t", "-", "test", "(", "B", ")", "and", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", "(", "C", ")", ".", "D", "PAX7", "+", "cells", "in", "skeletal", "muscle", "sections", ",", "demonstrating", "that", "satellite", "cells", "are", "less", "abundant", "in", "D233E", "patients", "than", "in", "controls", "(", "n", "=", "3", "muscles", "with", "10", "-", "15", "fields", "analyzed", "per", "muscle", ")", ".", "Mean", "±", "SEM", ";", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ";", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A Western blot of muscle homogenates shows reduced expression of Notch1 intracellular domain (NICD) in patients.B-C qRT-PCR on RNA extracted from skeletal-muscle shows that expression of HES1 (B) and PAX7 (C) was significantly lower in D233E patients compared to healthy controls. Mean ± SEM, Student´s t-test (B) and Mann-Whitney U test (C).D PAX7+ cells in skeletal muscle sections, demonstrating that satellite cells are less abundant in D233E patients than in controls (n = 3 muscles with 10-15 fields analyzed per muscle). Mean ± SEM; Mann-Whitney U test; Scale bar, 50 μm."}
{"words": ["Figure", "6A", "-", "A", "\"", "Staining", "of", "Drosophila", "indirect", "flight", "muscles", "at", "25", "%", "pupal", "development", "with", "22C10", "antibody", "(", "myotube", "marker", ")", "and", "anti", "-", "Twist", "antibody", "(", "myoblast", "marker", ")", "indicates", "that", "in", "wild", "-", "type", "animals", ",", "indirect", "flight", "muscles", "are", "formed", "from", "6", "myotubes", ",", "and", "a", "large", "number", "of", "Twist", "+", "myoblasts", "are", "present", ".", "B", "-", "B", "\"", "rumi79", "/", "79", "mutants", "raised", "at", "18C", "show", "no", "obvious", "defects", "in", "myoblast", "number", "or", "myotube", "morphology", ".", "C", "-", "D", "\"", "rumi79", "/", "79", "mutants", "exhibit", "decreased", "number", "of", "myoblasts", "at", "25", "°", "-", "30", "°", "C", "and", "either", "an", "incomplete", "set", "of", "short", "myotubes", "when", "raised", "at", "25C", "or", "aberrant", "morphology", "of", "myotubes", "when", "raised", "at", "30C", ".", "E", "-", "E", "\"", "rumi79", "/", "79", "animals", "overexpressing", "FLAG", "-", "tagged", "POGLUT1WT", "in", "the", "muscle", "compartment", "using", "Mef2", "-", "GAL4", "and", "raised", "at", "25C", "during", "the", "pupal", "stage", "show", "a", "rescue", "of", "the", "rumi79", "/", "79", "muscle", "phenotype", ".", "F", "-", "G", "\"", "Overexpression", "of", "FLAG", "-", "tagged", "POGLUT1D233E", "only", "partially", "rescues", "the", "rumi79", "/", "79", "muscle", "phenotype", ",", "with", "some", "variation", "in", "the", "myotube", "length", "and", "the", "number", "of", "restored", "Twist", "+", "cells", "(", "compare", "G", "and", "F", ")", ".", "Note", "that", "the", "number", "of", "Twist", "+", "cells", "restored", "by", "POGLUT1D233E", "is", "much", "smaller", "than", "that", "restored", "by", "POGLUT1WT", ".", "Scale", "bar", "in", "A", "'", "is", "50", "µm", "and", "applies", "to", "A", "-", "G", "\"", ".", "H", "Quantification", "of", "myotube", "lengths", "in", "rumi79", "/", "79", "mutants", "with", "or", "without", "POGLUT1", "expression", "indicates", "a", "weak", "rescue", "of", "the", "phenotypes", "by", "POGLUT1D233E", "compared", "to", "POGLUT1WT", ".", "Mean", "±", "standard", "deviation", "is", "shown", ".", "The", "differences", "in", "myotube", "lengths", "are", "statistically", "significant", "(", "n", "=", "22", "-", "54", ")", ".", "Mean", "±", "standard", "deviation", "is", "shown", ";", "One", "-", "way", "Anova", "with", "Bonferroni", "´", "s", "multiple", "comparisons", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A-A\" Staining of Drosophila indirect flight muscles at 25% pupal development with 22C10 antibody (myotube marker) and anti-Twist antibody (myoblast marker) indicates that in wild-type animals, indirect flight muscles are formed from 6 myotubes, and a large number of Twist+myoblasts are present.B-B\" rumi79/79 mutants raised at 18C show no obvious defects in myoblast number or myotube morphology.C-D\" rumi79/79 mutants exhibit decreased number of myoblasts at 25°-30°C and either an incomplete set of short myotubes when raised at 25C or aberrant morphology of myotubes when raised at 30C.E-E\" rumi79/79 animals overexpressing FLAG-tagged POGLUT1WT in the muscle compartment using Mef2-GAL4 and raised at 25C during the pupal stage show a rescue of the rumi79/79 muscle phenotype.F-G\" Overexpression of FLAG-tagged POGLUT1D233E only partially rescues the rumi79/79 muscle phenotype, with some variation in the myotube length and the number of restored Twist+cells (compare G and F). Note that the number of Twist+cells restored by POGLUT1D233E is much smaller than that restored by POGLUT1WT. Scale bar in A' is 50 µm and applies to A-G\".H Quantification of myotube lengths in rumi79/79 mutants with or without POGLUT1 expression indicates a weak rescue of the phenotypes by POGLUT1D233E compared to POGLUT1WT. Mean ± standard deviation is shown. The differences in myotube lengths are statistically significant (n = 22-54). Mean ± standard deviation is shown; One-way Anova with Bonferroni´s multiple comparisons test."}
{"words": ["Figure", "7A", "-", "F", "Proliferation", "assays", "examined", "proliferating", "(", "PAX7", "+", "MyoD", "+", ",", "arrows", ")", ",", "self", "-", "renewing", "(", "PAX7", "+", "MyoD", "−", ",", "open", "arrows", ")", ",", "and", "differentiating", "(", "PAX7", "−", "MyoD", "+", ",", "arrowheads", ")", "cells", "from", "D233E", "patients", "(", "n", "=", "2", ")", ",", "healthy", "controls", "(", "n", "=", "3", ")", "and", "disease", "controls", "(", "n", "=", "3", ")", "at", "1", ",", "4", ",", "and", "8", "days", "growing", "in", "proliferation", "medium", ".", "(", "A", ")", "shows", "representative", "images", "from", "day", "8", ".", "The", "number", "of", "patientmyoblasts", "is", "lower", "than", "that", "of", "controls", "at", "all", "three", "time", "points", ",", "indicating", "a", "slower", "proliferation", "rate", "in", "patientmyoblasts", "(", "B", ")", ",", "and", "accordingly", ",", "the", "percentage", "of", "proliferating", "cells", "(", "C", ")", "is", "smaller", "in", "the", "patient", ".", "(", "D", ")", "The", "percentage", "of", "self", "-", "renewing", "cells", "is", "small", "in", "patient", "´", "s", "culture", ",", "reflecting", "a", "poor", "capacity", "for", "maintaining", "the", "pool", "of", "quiescent", "SCs", ".", "In", "addition", ",", "the", "percentage", "of", "PAX7", "+", "cells", "(", "E", ")", "is", "smaller", "in", "patient", "´", "s", "culture", ",", "similarly", "to", "what", "was", "found", "in", "adult", "D233E", "muscle", "(", "shown", "in", "Fig", "5D", ")", ".", "(", "F", ")", "The", "percentage", "of", "differentiating", "cells", "is", "higher", "in", "the", "patient", ".", "We", "examine", "proliferation", "capturing", "7", "-", "12", "randomly", "fields", "per", "day", "and", "condition", "(", "mean", "±", "SEM", "is", "shown", ";", "Kruskal", "-", "Wallis", "with", "Dunn", "´", "s", "multiple", "comparisons", "test", ";", "Scale", "bar", ",", "50", "µm", ")", ".", "G", "-", "I", "When", "myoblasts", "started", "to", "be", "confluent", ",", "the", "proliferation", "medium", "was", "replaced", "with", "differentiation", "medium", ",", "and", "the", "myoblasts", "started", "to", "fuse", "yielding", "myotubes", ",", "which", "were", "analyzed", "after", "four", "days", "of", "differentiation", ".", "(", "H", ")", "The", "fusion", "index", ",", "which", "measures", "the", "percentage", "of", "nuclei", "in", "myotubes", "with", "respect", "to", "the", "total", "number", "of", "nuclei", "in", "myogenic", "cells", ",", "was", "higher", "in", "D233E", "cultures", "than", "in", "controls", ".", "(", "I", ")", "Besides", ",", "myogenin", "showed", "increased", "expression", "in", "D233E", "myoblast", "cultures", "compared", "to", "controls", ".", "The", "data", "support", "that", "differentiation", "process", "is", "facilitated", "in", "patient", "´", "s", "muscle", ".", "Data", "was", "collected", "from", "3", "-", "10", "randomly", "chosen", "areas", "per", "condition", "(", "mean", "±", "SEM", "is", "shown", ";", "Kruskal", "-", "Wallis", "with", "Dunn", "´", "s", "multiple", "comparisons", "test", "(", "H", ")", "and", "One", "-", "way", "Anova", "with", "Bonferroni", "´", "s", "multiple", "comparisons", "test", "(", "I", ")", ";", "Scale", "bar", ",", "50", "µm", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A-F Proliferation assays examined proliferating (PAX7+MyoD+, arrows), self-renewing (PAX7+ MyoD−, open arrows), and differentiating (PAX7− MyoD+, arrowheads) cells from D233E patients (n = 2), healthy controls (n = 3) and disease controls (n = 3) at 1, 4, and 8 days growing in proliferation medium. (A) shows representative images from day 8. The number of patientmyoblasts is lower than that of controls at all three time points, indicating a slower proliferation rate in patientmyoblasts (B), and accordingly, the percentage of proliferating cells (C) is smaller in the patient. (D) The percentage of self-renewing cells is small in patient´s culture, reflecting a poor capacity for maintaining the pool of quiescent SCs. In addition, the percentage of PAX7+ cells (E) is smaller in patient´s culture, similarly to what was found in adult D233E muscle (shown in Fig 5D). (F) The percentage of differentiating cells is higher in the patient. We examine proliferation capturing 7-12 randomly fields per day and condition (mean ± SEM is shown; Kruskal-Wallis with Dunn´s multiple comparisons test; Scale bar, 50 µm).G-I When myoblasts started to be confluent, the proliferation medium was replaced with differentiation medium, and the myoblasts started to fuse yielding myotubes, which were analyzed after four days of differentiation. (H) The fusion index, which measures the percentage of nuclei in myotubes with respect to the total number of nuclei in myogenic cells, was higher in D233E cultures than in controls. (I) Besides, myogenin showed increased expression in D233E myoblast cultures compared to controls. The data support that differentiation process is facilitated in patient´s muscle. Data was collected from 3-10 randomly chosen areas per condition (mean ± SEM is shown; Kruskal-Wallis with Dunn´s multiple comparisons test (H) and One-way Anova with Bonferroni´s multiple comparisons test (I); Scale bar, 50 µm)."}
{"words": ["Figure", "8A", "-", "C", "We", "overexpressed", "GFP", "-", "tagged", "NICD", "in", "immortalized", "primary", "myoblasts", "to", "rescue", "the", "features", "displayed", "by", "immortalized", "D233E", "myoblasts", ".", "(", "B", ")", "We", "analyzed", "the", "proliferation", "at", "1", ",", "3", "and", "5", "days", ",", "and", "proliferation", "rate", "in", "patient", "-", "LV", "-", "NICD", "-", "GFP", "reached", "the", "level", "observed", "in", "control", "-", "LV", "-", "GFP", ",", "which", "were", "higher", "than", "in", "patient", "-", "LV", "-", "GFP", ".", "(", "C", ")", "However", ",", "the", "percentage", "of", "PAX7", "+", "cells", "in", "patient", "-", "LV", "-", "NICD", "-", "GFP", "showed", "the", "same", "reduced", "value", "as", "in", "patient", "-", "LV", "-", "GFP", ",", "which", "were", "significantly", "lower", "than", "in", "control", "-", "LV", "-", "GFP", ".", "The", "majority", "of", "control", "myoblasts", "were", "proliferating", "cells", "(", "PAX7", "+", "MyoD", "+", ",", "arrows", ")", ",", "with", "no", "quiescent", "cells", "and", "few", "differentiating", "cells", "detected", ".", "Data", "were", "collected", "from", "n", "=", "2", "independent", "assays", "(", "5", "-", "8", "images", "per", "condition", ")", ".", "Mean", "±", "SEM", "is", "shown", ";", "One", "-", "way", "Anova", "with", "Tukey", "multiple", "comparisions", "test", "(", "B", ")", "and", "Kruskal", "-", "Wallis", "with", "Dunn", "´", "s", "multiple", "comparisons", "test", "(", "C", ")", ";", "Scale", "bar", ",", "50", "µm", ")", ".", "D", "-", "F", "As", "previously", "described", "in", "patient", "'", "s", "primary", "myoblasts", ",", "patient", "-", "LV", "-", "GFPmyoblasts", "showed", "a", "striking", "facilitated", "differentiation", "compared", "to", "control", "-", "LV", "-", "GFP", "-", "myoblasts", ".", "This", "phenotype", "fully", "disappeared", "in", "patient", "-", "LV", "-", "GFP", "-", "NICD", "myoblasts", ",", "as", "quantification", "of", "the", "fusion", "index", "(", "E", ")", ",", "and", "myogenin", "expression", "(", "F", ")", "demonstrated", ".", "The", "data", "support", "a", "pathogenic", "role", "for", "Notch", "inhibition", "on", "the", "altered", "differentiation", "in", "our", "patients", ".", "Data", "were", "collected", "from", "n", "=", "3", "independent", "assays", "(", "13", "-", "17", "images", "per", "condition", ")", ".", "Mean", "±", "SEM", "is", "shown", ";", "Kruskal", "-", "Wallis", "with", "Dunn", "´", "s", "multiple", "comparisons", "test", ";", "Scale", "bar", ",", "50", "µm", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8A-C We overexpressed GFP-tagged NICD in immortalized primary myoblasts to rescue the features displayed by immortalized D233E myoblasts. (B) We analyzed the proliferation at 1, 3 and 5 days, and proliferation rate in patient-LV-NICD-GFP reached the level observed in control-LV-GFP, which were higher than in patient-LV-GFP. (C) However, the percentage of PAX7+cells in patient-LV-NICD-GFP showed the same reduced value as in patient-LV-GFP, which were significantly lower than in control-LV-GFP. The majority of control myoblasts were proliferating cells (PAX7+ MyoD+, arrows), with no quiescent cells and few differentiating cells detected. Data were collected from n = 2 independent assays (5-8 images per condition). Mean ± SEM is shown; One-way Anova with Tukey multiple comparisions test (B) and Kruskal-Wallis with Dunn´s multiple comparisons test (C); Scale bar, 50 µm).D-F As previously described in patient's primary myoblasts, patient-LV-GFPmyoblasts showed a striking facilitated differentiation compared to control-LV-GFP-myoblasts. This phenotype fully disappeared in patient-LV-GFP-NICD myoblasts, as quantification of the fusion index (E), and myogenin expression (F) demonstrated. The data support a pathogenic role for Notch inhibition on the altered differentiation in our patients. Data were collected from n = 3 independent assays (13-17 images per condition). Mean ± SEM is shown; Kruskal-Wallis with Dunn´s multiple comparisons test; Scale bar, 50 µm)."}
{"words": ["Figure", "9A", "Immortalized", "primary", "myoblasts", "from", "a", "healthy", "control", "showed", "a", "progressive", "pattern", "of", "α", "-", "dystroglycan", "glycosylation", "during", "five", "days", "of", "differentiation", "(", "D0", "-", "D5", ")", ",", "as", "has", "been", "previously", "described", "by", "Goddeeris", "et", "al", ".", "Immortalized", "primary", "myoblasts", "from", "patients", "displayed", "an", "irregular", "pattern", "of", "glycosylation", ",", "with", "a", "final", "level", "of", "glycosylated", "α", "-", "dystroglycan", "that", "was", "lower", "than", "control", ".", "B", "α", "-", "dystroglycan", "glycosylation", "of", "infected", "immortalized", "myoblasts", "from", "patient", "-", "LV", "-", "NICD", "-", "GFP", "at", "differentiation", "day", "5", "(", "D5", ")", "showed", "a", "striking", "reduction", ",", "in", "line", "with", "the", "strong", "inhibition", "of", "myotubes", "formation", "and", "differentiation", "induced", "by", "NICD", "overexpression", ".", "α", "-", "dystroglycan", "in", "myoblasts", "from", "patient", "-", "LV", "-", "GFP", "showed", "a", "reduction", "of", "glycosylation", "compared", "to", "control", "-", "LV", "-", "GFP", "at", "D5", ",", "similar", "to", "the", "results", "obtained", "in", "the", "adult", "muscle", "from", "patients", "(", "Fig", ".", "2", ")", ".", "C", "-", "D", "C2C12", "myogenic", "cells", "showed", "a", "reduced", "level", "of", "glycosylated", "α", "-", "dystroglycan", "when", "the", "Notch", "signaling", "inhibitor", "DAPT", "or", "LY3039478", "was", "added", "to", "the", "differentiation", "medium", ".", "This", "indicates", "that", "reducing", "Notch", "signaling", "can", "affect", "α", "-", "dystroglycan", "glycosylation", "in", "wild", "-", "type", "C2C12", "myoblasts", "cells", ",", "which", "do", "not", "harbor", "any", "known", "mutations", "in", "α", "-", "dystroglycan", "glycosyltransferases", "or", "Poglut1", ".", "E", "-", "F", "qRT", "-", "PCR", "experiments", "show", "that", "upon", "DAPT", "or", "LY3039478", "treatment", ",", "a", "remarkable", "decrease", "in", "Hes1", "mRNA", "is", "induced", "in", "C2C12", "cells", "during", "differentiation", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 9A Immortalized primary myoblasts from a healthy control showed a progressive pattern of α-dystroglycan glycosylation during five days of differentiation (D0-D5), as has been previously described by Goddeeris et al. Immortalized primary myoblasts from patients displayed an irregular pattern of glycosylation, with a final level of glycosylated α-dystroglycan that was lower than control.B α-dystroglycan glycosylation of infected immortalized myoblasts from patient-LV-NICD-GFP at differentiation day 5 (D5) showed a striking reduction, in line with the strong inhibition of myotubes formation and differentiation induced by NICD overexpression. α-dystroglycan in myoblasts from patient-LV-GFP showed a reduction of glycosylation compared to control-LV-GFP at D5, similar to the results obtained in the adult muscle from patients (Fig. 2).C-D C2C12 myogenic cells showed a reduced level of glycosylated α-dystroglycan when the Notch signaling inhibitor DAPT or LY3039478 was added to the differentiation medium. This indicates that reducing Notch signaling can affect α-dystroglycan glycosylation in wild-type C2C12 myoblasts cells, which do not harbor any known mutations in α-dystroglycan glycosyltransferases or Poglut1.E-F qRT-PCR experiments show that upon DAPT or LY3039478 treatment, a remarkable decrease in Hes1 mRNA is induced in C2C12 cells during differentiation."}
{"words": ["Figure", "1Relative", "expression", "of", "Rab39a", "in", "siRNA", "-", "treated", "cells", "after", "48", "hours", "of", "knockdown", ".", "Rab39a", "expression", "in", "I", "-", "Ab", "or", "Rab39a", "siRNA", "-", "treated", "cells", "was", "normalized", "to", "expression", "in", "cells", "treated", "with", "control", "β2m", "siRNA", ".", "Error", "bars", "show", "SD", "between", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "using", "two", "-", "way", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "XPT", "of", "siRNA", "treated", "DC3", ".", "2R", "cells", "after", "48", "hours", "of", "knockdown", ".", "Treated", "cells", "were", "fed", "with", "the", "indicated", "amounts", "of", "Ova", "-", "Fe", "The", "cells", "were", "then", "exposed", "to", "RF33", ".", "70", "-", "Luc", "Reporter", "CD8", "T", "cells", "overnight", ".", "RLU", "indicates", "relative", "luminescence", "units", "produced", "by", "reporter", "T", "cell", "stimulation", ".", "Error", "bars", "show", "SD", "of", ">", "3", "replicate", "wells", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "vs", "control", "I", "-", "Ab", "using", "two", "-", "way", "ANOVA", ".", "Representative", "plot", "of", "3", "independent", "experiments", ".", "XPT", "of", "siRNA", "treated", "DC3", ".", "2R", "cells", "after", "48", "hours", "of", "knockdown", ".", "Treated", "cells", "were", "fed", "with", "the", "indicated", "amounts", "of", "Ova", "-", "latex", "The", "cells", "were", "then", "exposed", "to", "RF33", ".", "70", "-", "Luc", "Reporter", "CD8", "T", "cells", "overnight", ".", "RLU", "indicates", "relative", "luminescence", "units", "produced", "by", "reporter", "T", "cell", "stimulation", ".", "Error", "bars", "show", "SD", "of", ">", "3", "replicate", "wells", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "vs", "control", "I", "-", "Ab", "using", "two", "-", "way", "ANOVA", ".", "Representative", "plot", "of", "3", "independent", "experiments", ".", "XPT", "of", "siRNA", "treated", "DC3", ".", "2R", "cells", "after", "48", "hours", "of", "knockdown", ".", "Treated", "cells", "were", "fed", "with", "the", "indicated", "amounts", "of", "unconjugated", "soluble", "Ova", "The", "cells", "were", "then", "exposed", "to", "RF33", ".", "70", "-", "Luc", "Reporter", "CD8", "T", "cells", "overnight", ".", "RLU", "indicates", "relative", "luminescence", "units", "produced", "by", "reporter", "T", "cell", "stimulation", ".", "Error", "bars", "show", "SD", "of", ">", "3", "replicate", "wells", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "vs", "control", "I", "-", "Ab", "using", "two", "-", "way", "ANOVA", ".", "Representative", "plot", "of", "3", "independent", "experiments", ".", "DC3", ".", "2", "-", "Rab39a", "cells", "(", "Rab39a", "KO", "with", "dox", "-", "inducible", "Rab39a", ")", "were", "incubated", "overnight", "with", "or", "without", "1", "µg", "/", "ml", "dox", "to", "induce", "Rab39a", "expression", ".", "1x105", "Cells", "were", "then", "fed", "with", "Ova", "-", "Fe", "and", "exposed", "to", "reporter", "T", "cells", "as", "in", "(", "B", ")", ".", "Error", "bars", "show", "SD", "of", "duplicate", "wells", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "using", "two", "-", "way", "ANOVA", ".", "Representative", "plot", "of", "3", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Relative expression of Rab39a in siRNA-treated cells after 48 hours of knockdown. Rab39a expression in I-Ab or Rab39a siRNA-treated cells was normalized to expression in cells treated with control β2m siRNA. Error bars show SD between three independent experiments. * p < 0.05 using two-way Student's t-test.XPT of siRNA treated DC3.2R cells after 48 hours of knockdown. Treated cells were fed with the indicated amounts of Ova-Fe The cells were then exposed to RF33.70-Luc Reporter CD8 T cells overnight. RLU indicates relative luminescence units produced by reporter T cell stimulation. Error bars show SD of >3 replicate wells. * p < 0.05 vs control I-Ab using two-way ANOVA. Representative plot of 3 independent experiments.XPT of siRNA treated DC3.2R cells after 48 hours of knockdown. Treated cells were fed with the indicated amounts of Ova-latex The cells were then exposed to RF33.70-Luc Reporter CD8 T cells overnight. RLU indicates relative luminescence units produced by reporter T cell stimulation. Error bars show SD of >3 replicate wells. * p < 0.05 vs control I-Ab using two-way ANOVA. Representative plot of 3 independent experiments.XPT of siRNA treated DC3.2R cells after 48 hours of knockdown. Treated cells were fed with the indicated amounts of unconjugated soluble Ova The cells were then exposed to RF33.70-Luc Reporter CD8 T cells overnight. RLU indicates relative luminescence units produced by reporter T cell stimulation. Error bars show SD of >3 replicate wells. * p < 0.05 vs control I-Ab using two-way ANOVA. Representative plot of 3 independent experiments.DC3.2-Rab39a cells (Rab39a KO with dox-inducible Rab39a) were incubated overnight with or without 1 µg/ml dox to induce Rab39a expression. 1x105 Cells were then fed with Ova-Fe and exposed to reporter T cells as in (B). Error bars show SD of duplicate wells. * p < 0.05 using two-way ANOVA. Representative plot of 3 independent experiments."}
{"words": ["Figure", "2MHC", "-", "II", "presentation", "of", "siRNA", "treated", "DC3", ".", "2R", "cells", "after", "48", "hours", "of", "knockdown", ".", "Treated", "cells", "were", "fed", "with", "the", "indicated", "amounts", "of", "Ova", "-", "Fe", ".", "The", "cells", "were", "then", "exposed", "to", "MF2", ".", "2D9", "-", "Luc", "Reporter", "CD4", "T", "cells", "overnight", ".", "Error", "bars", "show", "SD", "of", ">", "3", "replicate", "wells", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "vs", "negative", "control", "β2m", "using", "two", "-", "way", "ANOVA", ".", "None", "of", "the", "bead", "concentrations", "are", "p", "<", "0", ".", "05", "for", "Rab39a", "siRNA", "vs", "β2m", ".", "Representative", "plot", "of", "3", "independent", "experimentsDC3", ".", "2", "-", "Rab39a", "cells", "(", "Rab39a", "KO", "with", "dox", "-", "inducible", "Rab39a", ")", "were", "incubated", "overnight", "with", "or", "without", "1", "µg", "/", "ml", "dox", "to", "induce", "Rab39a", "expression", ".", "1x105", "cells", "were", "then", "fed", "with", "Ova", "-", "Fe", "and", "exposed", "to", "reporter", "T", "cells", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "Error", "bars", "show", "SD", "of", "duplicate", "wells", ".", "None", "of", "the", "bead", "concentrations", "are", "p", "<", "0", ".", "05", "for", "Rab39a", "siRNA", "vs", "β2m", "using", "two", "-", "way", "ANOVA", ".", "Representative", "plot", "of", "3", "independent", "experimentsMHC", "-", "I", "Presentation", "of", "SIINFEKL", "-", "H2", "-", "Kb", "complexes", "on", "siRNA", "treated", "DC3", ".", "2", "NS", "-", "Ova", "(", "C", ")", "or", "DC3", ".", "2", "UbS8L", "(", "D", ")", "cells", ".", "48", "hours", "after", "siRNA", "transfection", ",", "the", "indicated", "amounts", "of", "dox", "was", "added", "to", "the", "cells", "to", "induce", "Ova", "expression", ".", "After", "2", "hours", "at", "37oC", ",", "RF33", ".", "70", "-", "Luc", "CD8", "T", "cells", "were", "added", "along", "with", "Brefeldin", "A", "(", "Golgiplug", ")", "to", "a", "final", "concentration", "of", "1", ":", "1000", ".", "The", "cells", "were", "incubated", "overnight", "for", "reporter", "T", "cell", "luciferase", "expression", ".", "Error", "bars", "show", "SD", "of", ">", "3", "replicate", "wells", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "vs", "negative", "control", "I", "-", "Ab", "using", "two", "-", "way", "ANOVA", ".", "None", "of", "the", "dox", "concentrations", "are", "p", "<", "0", ".", "05", "for", "Rab39a", "siRNA", "vs", "I", "-", "Ab", ".", "Representative", "plot", "of", "3", "independent", "experimentsFlow", "cytometric", "analysis", "of", "surface", "H2", "-", "Kb", "and", "I", "-", "Ab", "levels", "of", "siRNA", "treated", "DC3", ".", "2R", "cells", ".", "Shown", "are", "results", "after", "48", "hours", "of", "knockdown", ".", "Representative", "plot", "of", "3", "independent"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2MHC-II presentation of siRNA treated DC3.2R cells after 48 hours of knockdown. Treated cells were fed with the indicated amounts of Ova-Fe. The cells were then exposed to MF2.2D9-Luc Reporter CD4 T cells overnight. Error bars show SD of >3 replicate wells. * p < 0.05 vs negative control β2m using two-way ANOVA. None of the bead concentrations are p < 0.05 for Rab39a siRNA vs β2m. Representative plot of 3 independent experimentsDC3.2-Rab39a cells (Rab39a KO with dox-inducible Rab39a) were incubated overnight with or without 1 µg/ml dox to induce Rab39a expression. 1x105 cells were then fed with Ova-Fe and exposed to reporter T cells as in (A). Error bars show SD of duplicate wells. None of the bead concentrations are p < 0.05 for Rab39a siRNA vs β2m using two-way ANOVA. Representative plot of 3 independent experimentsMHC-I Presentation of SIINFEKL-H2-Kb complexes on siRNA treated DC3.2 NS-Ova (C) or DC3.2 UbS8L (D) cells. 48 hours after siRNA transfection, the indicated amounts of dox was added to the cells to induce Ova expression. After 2 hours at 37oC, RF33.70-Luc CD8 T cells were added along with Brefeldin A (Golgiplug) to a final concentration of 1:1000. The cells were incubated overnight for reporter T cell luciferase expression. Error bars show SD of >3 replicate wells. * p < 0.05 vs negative control I-Ab using two-way ANOVA. None of the dox concentrations are p < 0.05 for Rab39a siRNA vs I-Ab. Representative plot of 3 independent experimentsFlow cytometric analysis of surface H2-Kb and I-Ab levels of siRNA treated DC3.2R cells. Shown are results after 48 hours of knockdown. Representative plot of 3 independent experiments"}
{"words": ["Figure", "3Phagocytosis", "assay", "after", "48", "hours", "of", "siRNA", "knockdown", ".", "DC3", ".", "2R", "cells", "treated", "with", "the", "indicated", "siRNAs", "were", "incubated", "on", "ice", "for", "30", "minutes", "with", "4", "beads", "per", "cell", "of", "Alexa", "Fluor", "647", "conjugated", "beads", ".", "The", "mixture", "was", "then", "placed", "in", "media", "at", "37oC", "for", "1", "hour", ".", "Cells", "were", "harvested", "and", "incubated", "on", "ice", "with", "1", "mg", "/", "ml", "of", "Trypan", "Blue", "to", "quench", "uneaten", "beads", "before", "analysis", "through", "flow", "cytometry", ".", "As", "a", "control", ",", "some", "cells", "were", "incubated", "with", "10", "µM", "Cytochalasin", "D", "during", "the", "feeding", "period", ".", "Shown", "are", "percentages", "of", "cells", "that", "have", "taken", "up", "beads", ".", "Representative", "plot", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "Rab39a", "was", "induced", "in", "DC3", ".", "2", "-", "Rab39a", "cells", "(", "Rab39a", "KO", "with", "dox", "-", "inducible", "Rab39a", ")", "via", "overnight", "incubation", "with", "1µg", "/", "ml", "dox", ".", "KO", "and", "rescued", "cells", "were", "then", "harvested", "and", "assayed", "as", "in", "(", "A", ")", "for", "phagocytosis", ".", "Representative", "plot", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "DC3", ".", "2", "-", "Rab39a", "cells", "were", "induced", "to", "express", "Rab39a", "overnight", ".", "Cells", "on", "coverslips", "were", "washed", ",", "fixed", "and", "stained", "according", "to", "the", "listed", "protocol", "and", "antibodies", ".", "Green", "=", "Rab39a", "(", "HA", "tag", ")", ",", "Magenta", "=", "Lamp2", ".", "Arrows", "highlight", "punctate", "structures", "with", "colocalization", ".", "Scale", "bar", "=", "10", "µm", ".", "Representative", "image", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "DC3", ".", "2", "Rab39a", "KO", "cells", "were", "transduced", "with", "dox", "inducible", "mcherry", "-", "tagged", "Rab39a", ".", "Cells", "were", "plated", "in", "35", "mm", "glass", "bottom", "dishes", "and", "induced", "with", "1", "µg", "/", "ml", "dox", ".", "The", "next", "day", ",", "1", "µm", "latex", "beads", "conjugated", "with", "Alexa", "488", "-", "NHS", "(", "1", "bead", "/", "cell", ")", "were", "added", ".", "After", "2", "hours", "at", "37oC", ",", "cells", "were", "imaged", "under", "a", "Leica", "TCS", "SP5", "confocal", "microscope", ".", "Green", "=", "Alexa", "488", "labeled", "beads", ".", "Magenta", "=", "mcherry", "-", "Rab39a", ".", "Arrows", "highlight", "internalized", "beads", "surrounded", "by", "Rab39a", ".", "Scale", "bar", "=", "10", "µm", ".", "Representative", "image", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "5x105", "of", "DC3", ".", "2", "-", "Rab39a", "cells", "were", "induced", "to", "express", "Rab39a", "overnight", "with", "1", "µg", "/", "ml", "dox", "in", "a", "6", "well", "plate", ".", "Cells", "were", "fed", "at", "1", "bead", "/", "cell", "of", "biotinylated", "-", "6µm", "magnetic", "beads", "for", "the", "indicated", "lengths", "of", "time", ".", "Magnetic", "-", "bead", "-", "phagosomes", "were", "isolated", "using", "the", "listed", "protocol", ".", "Phagosomes", "were", "washed", "and", "stained", "for", "Rab39a", "(", "HA", "-", "tag", ")", ".", "Representative", "data", "for", "3", "independent", "experiments", ".", "1", ".", "25", "x", "105", "of", "DC3", ".", "2", "-", "Rab39a", "cells", "were", "incubated", "in", "a", "12", "well", "plate", "overnight", "±", "dox", "(", "1µg", "/", "ml", ")", "to", "induce", "Rab39a", ".", "Cells", "were", "fed", "at", "4", "beads", "/", "cell", "of", "biotinylated", "-", "ova", "-", "6µm", "-", "magnetic", "-", "beads", "for", "3", "hours", "with", "or", "without", "1", ":", "1000", "BFA", "(", "golgiplug", ",", "BD", ")", ".", "Phagosomes", "were", "isolated", "using", "the", "listed", "protocol", ".", "Isolated", "phagosomes", "were", "washed", ",", "permeabilized", "and", "stained", ".", "Shown", "are", "histograms", "of", "indicated", "stains", "as", "well", "as", "%", "of", "Rab39a", "positive", "phagosomes", ".", "Representative", "plot", "of", "two", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Phagocytosis assay after 48 hours of siRNA knockdown. DC3.2R cells treated with the indicated siRNAs were incubated on ice for 30 minutes with 4 beads per cell of Alexa Fluor 647 conjugated beads. The mixture was then placed in media at 37oC for 1 hour. Cells were harvested and incubated on ice with 1 mg/ml of Trypan Blue to quench uneaten beads before analysis through flow cytometry. As a control, some cells were incubated with 10 µM Cytochalasin D during the feeding period. Shown are percentages of cells that have taken up beads. Representative plot of two independent experiments.Rab39a was induced in DC3.2-Rab39a cells (Rab39a KO with dox-inducible Rab39a) via overnight incubation with 1µg / ml dox. KO and rescued cells were then harvested and assayed as in (A) for phagocytosis. Representative plot of two independent experiments.DC3.2-Rab39a cells were induced to express Rab39a overnight. Cells on coverslips were washed, fixed and stained according to the listed protocol and antibodies. Green = Rab39a (HA tag), Magenta = Lamp2. Arrows highlight punctate structures with colocalization. Scale bar = 10 µm. Representative image of two independent experiments.DC3.2 Rab39a KO cells were transduced with dox inducible mcherry-tagged Rab39a. Cells were plated in 35 mm glass bottom dishes and induced with 1 µg/ml dox. The next day, 1 µm latex beads conjugated with Alexa 488-NHS (1 bead/cell) were added. After 2 hours at 37oC, cells were imaged under a Leica TCS SP5 confocal microscope. Green = Alexa 488 labeled beads. Magenta = mcherry-Rab39a. Arrows highlight internalized beads surrounded by Rab39a. Scale bar = 10 µm. Representative image of two independent experiments.5x105 of DC3.2-Rab39a cells were induced to express Rab39a overnight with 1 µg/ml dox in a 6 well plate. Cells were fed at 1 bead/cell of biotinylated-6µm magnetic beads for the indicated lengths of time. Magnetic-bead-phagosomes were isolated using the listed protocol. Phagosomes were washed and stained for Rab39a (HA-tag). Representative data for 3 independent experiments.1.25 x 105 of DC3.2-Rab39a cells were incubated in a 12 well plate overnight ± dox (1µg/ml) to induce Rab39a. Cells were fed at 4 beads/cell of biotinylated-ova-6µm-magnetic-beads for 3 hours with or without 1:1000 BFA (golgiplug, BD). Phagosomes were isolated using the listed protocol. Isolated phagosomes were washed, permeabilized and stained. Shown are histograms of indicated stains as well as % of Rab39a positive phagosomes. Representative plot of two independent experiments."}
{"words": ["Figure", "4XPT", "of", "siRNA", "treated", "DC3", ".", "2R", "cells", "after", "48", "hours", "of", "knockdown", ".", "Treated", "cells", "were", "fed", "with", "the", "indicated", "amounts", "of", "C8L", "peptid", "conjugated", "to", "iron", "oxide", "beads", "via", "a", "disulfide", "bond", ".", "The", "cells", "were", "then", "exposed", "to", "RF33", ".", "70", "-", "Luc", "Reporter", "CD8", "T", "cells", "overnight", ".", "Error", "bars", "show", "SD", "of", ">", "3", "replicate", "wells", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "for", "siRNA", "vs", "control", "I", "-", "Ab", "using", "two", "-", "way", "ANOVA", ".", "Representative", "plot", "of", "3", "independent", "experimentsXPT", "of", "siRNA", "treated", "DC3", ".", "2R", "cells", "after", "48", "hours", "of", "knockdown", ".", "Treated", "cells", "were", "fed", "with", "the", "indicated", "amounts", "o", "Ova", "(", "B", ")", "conjugated", "to", "iron", "oxide", "beads", "via", "a", "disulfide", "bond", ".", "The", "cells", "were", "then", "exposed", "to", "RF33", ".", "70", "-", "Luc", "Reporter", "CD8", "T", "cells", "overnight", ".", "Error", "bars", "show", "SD", "of", ">", "3", "replicate", "wells", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "for", "siRNA", "vs", "control", "I", "-", "Ab", "using", "two", "-", "way", "ANOVA", ".", "Representative", "plot", "of", "3", "independent", "experimentsDC3", ".", "2", "-", "Rab39a", "cells", "(", "Rab39a", "KO", "with", "dox", "-", "inducible", "Rab39a", ")", "were", "incubated", "overnight", "with", "or", "without", "1", "µg", "/", "ml", "dox", "to", "induce", "Rab39a", "expression", ".", "1x105", "cells", "were", "then", "fed", "with", "C8L", "peptide", "beads", "and", "exposed", "to", "reporter", "T", "cells", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "Error", "bars", "show", "SD", "of", "duplicate", "wells", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "between", "no", "dox", "and", "+", "dox", "using", "two", "-", "way", "ANOVA", ".", "Representative", "plot", "of", "3", "independent", "experimentsSame", "as", "in", "(", "A", ")", "but", "cells", "were", "fed", "with", "8", "µg", "of", "A9M", "peptide", "bead", "and", "exposed", "to", "12", ".", "64", "-", "Luc", "Reporter", "T", "cells", ".", "Experiments", "were", "combined", "by", "normalizing", "RLU", "values", "to", "the", "average", "of", "the", "negative", "control", "I", "-", "Ab", ".", "Error", "bars", "show", "SD", "of", "3", "independent", "experiments", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "for", "Rab39a", "or", "β2m", "siRNA", "vs", "negative", "control", "I", "-", "Ab", "using"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4XPT of siRNA treated DC3.2R cells after 48 hours of knockdown. Treated cells were fed with the indicated amounts of C8L peptid conjugated to iron oxide beads via a disulfide bond. The cells were then exposed to RF33.70-Luc Reporter CD8 T cells overnight. Error bars show SD of >3 replicate wells. * p < 0.05 for siRNA vs control I-Ab using two-way ANOVA. Representative plot of 3 independent experimentsXPT of siRNA treated DC3.2R cells after 48 hours of knockdown. Treated cells were fed with the indicated amounts o Ova (B) conjugated to iron oxide beads via a disulfide bond. The cells were then exposed to RF33.70-Luc Reporter CD8 T cells overnight. Error bars show SD of >3 replicate wells. * p < 0.05 for siRNA vs control I-Ab using two-way ANOVA. Representative plot of 3 independent experimentsDC3.2-Rab39a cells (Rab39a KO with dox-inducible Rab39a) were incubated overnight with or without 1 µg/ml dox to induce Rab39a expression. 1x105 cells were then fed with C8L peptide beads and exposed to reporter T cells as in (A). Error bars show SD of duplicate wells. * p < 0.05 between no dox and + dox using two-way ANOVA. Representative plot of 3 independent experimentsSame as in (A) but cells were fed with 8 µg of A9M peptide bead and exposed to 12.64-Luc Reporter T cells. Experiments were combined by normalizing RLU values to the average of the negative control I-Ab. Error bars show SD of 3 independent experiments. * p < 0.05 for Rab39a or β2m siRNA vs negative control I-Ab using ANOVA"}
{"words": ["Figure", "5DC3", ".", "2", "-", "Rab39a", "-", "H2", "-", "Ld", "cells", "(", "Rab39a", "KO", "with", "dox", "-", "inducible", "Rab39a", ")", "were", "incubated", "with", "or", "without", "1", "µg", "/", "ml", "dox", "overnight", "to", "induce", "Rab39a", "expression", ".", "1x106", "cells", "were", "fed", "at", "4", "beads", "/", "cell", "of", "biotinylated", "-", "magnetic", "-", "beads", "for", "4", "hours", ".", "Magnetic", "bead", "phagosomes", "were", "isolated", "using", "the", "listed", "protocol", ".", "Phagosomes", "were", "washed", ",", "fixed", ",", "permeabilized", "and", "stained", "for", "Open", "(", "64", "-", "3", "-", "7", ")", "and", "Closed", "(", "30", "-", "5", "-", "7s", ")", "forms", "of", "H2", "-", "Ld", ".", "Representative", "histograms", "shown", "in", "(", "B", ")", ".", "The", "background", "fluorescence", "of", "unstained", "beads", "was", "subtracted", "from", "the", "resulting", "phagosome", "gMFI", "and", "the", "fold", "change", "of", "open", "or", "closed", "H2", "-", "Ld", "(", "dox", "/", "no", "dox", ")", "was", "calculated", ".", "Three", "independent", "experiments", "were", "combined", "for", "analysis", "and", "error", "bars", "show", "the", "SD", "between", "experiments", ".", "Open", "H2", "-", "Ld", ",", "but", "not", "Closed", "H2", "-", "Ld", "was", "statistically", "significant", "(", "p", "<", "0", ".", "05", ")", "between", "KO", "and", "rescued", "cells", "using", "two", "-", "tailed", "ratio", "-", "paired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "DC3", ".", "2", "-", "Rab39a", "-", "H2", "-", "Ld", "cells", "(", "Rab39a", "KO", "with", "dox", "-", "inducible", "Rab39a", ")", "were", "incubated", "with", "or", "without", "1", "µg", "/", "ml", "dox", "overnight", "to", "induce", "Rab39a", "expression", ".", "1x106", "cells", "were", "fed", "at", "4", "beads", "/", "cell", "of", "biotinylated", "-", "magnetic", "-", "beads", "for", "4", "hours", ".", "Magnetic", "bead", "phagosomes", "were", "isolated", "using", "the", "listed", "protocol", ".", "Phagosomes", "were", "washed", ",", "fixed", ",", "permeabilized", "and", "stained", "for", "Open", "(", "64", "-", "3", "-", "7", ")", "and", "Closed", "(", "30", "-", "5", "-", "7s", ")", "forms", "of", "H2", "-", "Ld", ".", "H2", "-", "Ld", "cell", "surface", "levels", "of", "KO", "and", "induced", "cells", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "Phagosomes", "from", "KO", "and", "induced", "cells", "were", "isolated", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "Permeabilized", ",", "unfixed", "phagosomes", "were", "incubated", "with", "10", "µM", "of", "the", "indicated", "peptides", "for", "3", "hours", "at", "25oC", "in", "Perm", "buffer", ".", "Phagosomes", "were", "then", "washed", "and", "stained", "for", "H2", "-", "Ld", ".", "Shown", "are", "histograms", "of", "indicated", "stains", ".", "Phagosomes", "from", "KO", "and", "induced", "cells", "were", "isolated", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "Permeabilized", ",", "unfixed", "phagosomes", "were", "incubated", "with", "10", "µM", "of", "the", "indicated", "peptides", "for", "3", "hours", "at", "25oC", "in", "Perm", "buffer", ".", "Phagosomes", "were", "then", "washed", "and", "stained", "for", "H2", "-", "Ld", ".", "Shown", "are", "histograms", "of", "indicated", "stains", ".", "Flow", "cytometry", "plots", "of", "(", "D", ")", ".", "Analysis", "of", "phagosomes", "shown", "in", "(", "D", ")", "and", "(", "E", ")", ".", "The", "background", "fluorescence", "of", "unstained", "beads", "was", "subtracted", "from", "the", "resulting", "phagosome", "gMFI", "and", "the", "fold", "change", "of", "pulsed", "/", "unpulsed", "phagosomes", "was", "calculated", ".", "DC3", ".", "2", "Rab39a", "-", "H2", "-", "Ld", "cells", "were", "incubated", "with", "or", "without", "1", "µg", "/", "ml", "dox", "overnight", "to", "induce", "Rab39a", "expression", ".", "1x106", "cells", "were", "fed", "at", "4", "beads", "/", "cell", "of", "biotinylated", "-", "Ova", "-", "magnetic", "-", "beads", "for", "4", "hours", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "BFA", ".", "Isolated", "phagosomes", "were", "stained", "for", "H2", "-", "Ld", ".", "Representative", "of", "two", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5DC3.2-Rab39a-H2-Ld cells (Rab39a KO with dox-inducible Rab39a) were incubated with or without 1 µg/ml dox overnight to induce Rab39a expression. 1x106 cells were fed at 4 beads/cell of biotinylated-magnetic-beads for 4 hours. Magnetic bead phagosomes were isolated using the listed protocol. Phagosomes were washed, fixed, permeabilized and stained for Open (64-3-7) and Closed (30-5-7s) forms of H2-Ld. Representative histograms shown in (B). The background fluorescence of unstained beads was subtracted from the resulting phagosome gMFI and the fold change of open or closed H2-Ld (dox/no dox) was calculated. Three independent experiments were combined for analysis and error bars show the SD between experiments. Open H2-Ld, but not Closed H2-Ld was statistically significant (p<0.05) between KO and rescued cells using two-tailed ratio-paired Student's t-test.DC3.2-Rab39a-H2-Ld cells (Rab39a KO with dox-inducible Rab39a) were incubated with or without 1 µg/ml dox overnight to induce Rab39a expression. 1x106 cells were fed at 4 beads/cell of biotinylated-magnetic-beads for 4 hours. Magnetic bead phagosomes were isolated using the listed protocol. Phagosomes were washed, fixed, permeabilized and stained for Open (64-3-7) and Closed (30-5-7s) forms of H2-Ld. H2-Ld cell surface levels of KO and induced cells as in (A).Phagosomes from KO and induced cells were isolated as in (A). Permeabilized, unfixed phagosomes were incubated with 10 µM of the indicated peptides for 3 hours at 25oC in Perm buffer. Phagosomes were then washed and stained for H2-Ld. Shown are histograms of indicated stains.Phagosomes from KO and induced cells were isolated as in (A). Permeabilized, unfixed phagosomes were incubated with 10 µM of the indicated peptides for 3 hours at 25oC in Perm buffer. Phagosomes were then washed and stained for H2-Ld. Shown are histograms of indicated stains. Flow cytometry plots of (D).Analysis of phagosomes shown in (D) and (E). The background fluorescence of unstained beads was subtracted from the resulting phagosome gMFI and the fold change of pulsed / unpulsed phagosomes was calculated.DC3.2 Rab39a-H2-Ld cells were incubated with or without 1 µg/ml dox overnight to induce Rab39a expression. 1x106 cells were fed at 4 beads/cell of biotinylated-Ova-magnetic-beads for 4 hours in the presence or absence of BFA. Isolated phagosomes were stained for H2-Ld. Representative of two independent experiments."}
{"words": ["Figure", "6DC3", ".", "2", "-", "Rab39a", "-", "H2", "-", "Ld", "cells", "(", "Rab39a", "KO", "with", "dox", "-", "inducible", "Rab39a", ")", "were", "incubated", "with", "1", "µg", "/", "ml", "dox", "overnight", "to", "induce", "Rab39a", "expression", ".", "1x106", "cells", "were", "fed", "at", "4", "beads", "/", "cell", "of", "biotinylated", "-", "Ova", "-", "magnetic", "-", "beads", "for", "4", "hours", "with", "the", "indicated", "inhibitors", ".", "Magnetic", "-", "bead", "phagosomes", "were", "isolated", "using", "the", "listed", "protocol", ".", "Phagosomes", "were", "washed", ",", "fixed", ",", "permeabilized", "and", "stained", "for", "Open", "and", "Closed", "(", "30", "-", "5", "-", "7s", ")", "forms", "of", "H2", "-", "Ld", ".", "Representative", "histograms", "of", "two", "independent", "experiments", "shown", ".", "Cells", "as", "in", "(", "A", ")", "were", "incubated", "with", "or", "without", "1", "µg", "/", "ml", "dox", "overnight", "to", "induce", "Rab39a", "expression", ".", "1x106", "cells", "were", "fed", "at", "4", "beads", "/", "cell", "of", "biotinylated", "-", "Ova", "-", "magnetic", "-", "beads", "for", "4", "hours", ".", "Phagosomes", "were", "isolated", "and", "stained", "for", "Ova", "and", "Open", "H2", "-", "Ld", ".", "Representative", "of", "3", "independent", "experiments", ".", "Quantification", "of", "Ova", "remaining", "in", "bead", "-", "phagosomes", "(", "C", ")", "and", "Nox2", "staining", "(", "D", ")", ".", "Representative", "Histogram", "shown", ".", "For", "analysis", ",", "the", "background", "fluorescence", "of", "unstained", "beads", "was", "subtracted", "from", "the", "resulting", "phagosome", "gMFI", "and", "the", "fold", "change", "of", "target", "protein", "(", "dox", "/", "no", "dox", ")", "was", "calculated", ".", "Three", "independent", "experiments", "were", "combined", ".", "P", "<", "0", ".", "05", "using", "two", "-", "tailed", "ratio", "-", "paired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Error", "bars", "show", "SD", "between", "experiments", ".", "Cells", "as", "in", "(", "A", ")", "were", "incubated", "with", "or", "without", "1", "µg", "/", "ml", "dox", "overnight", "to", "induce", "Rab39a", "expression", ".", "1x106", "cells", "were", "incubated", "on", "ice", "with", "4", "beads", "/", "cell", "of", "biotinylated", "-", "Ova", "-", "beads", "for", "bead", "attachment", ".", "Cells", "were", "then", "transferred", "into", "37oC", "media", "containing", "5", "µM", "CellROX", "Deep", "Red", ".", "After", "4", "hours", "of", "incubation", ",", "unfixed", "phagosomes", "were", "extracted", "and", "analyzed", "via", "flow", "cytometry", "for", "CellROX", "fluorescence", ".", "For", "analysis", ",", "the", "background", "fluorescence", "of", "unstained", "beads", "was", "subtracted", "from", "the", "resulting", "phagosome", "gMFI", "and", "the", "fold", "change", "(", "dox", "/", "no", "dox", ")", "was", "calculated", ".", "Three", "independent", "experiments", "were", "combined", ".", "P", "<", "0", ".", "05", "using", "two", "-", "tailed", "ratio", "-", "paired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Error", "bars", "show", "SD", "between", "experiments", ".", "Same", "as", "in", "C", "with", "Sec22b", "staining", ".", "Three", "independent", "experiments", "were", "combined", ".", "P", "<", "0", ".", "05", "using", "two", "-", "tailed", "ratio", "-", "paired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Error", "bars", "show", "SD", "between", "experiments", ".", "Cells", "as", "in", "(", "A", ")", "were", "fed", "at", "1", "bead", "per", "cell", "with", "pHrodo", "conjugated", "beads", "that", "increase", "fluorescence", "at", "low", "pH", ".", "After", "4", "hours", "of", "incubation", ",", "whole", "cells", "were", "harvested", "and", "run", "through", "flow", "cytometry", "to", "measure", "fluorescence", "of", "eaten", "beads", ".", "For", "analysis", ",", "the", "background", "fluorescence", "of", "uneaten", "beads", "was", "subtracted", "from", "the", "resulting", "gMFI", "and", "the", "fold", "change", "of", "dox", "/", "no", "dox", "was", "calculated", ".", "Three", "independent", "experiments", "were", "combined", ".", "p", "<", "0", ".", "05", "using", "two", "-", "tailed", "ratio", "-", "paired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Error", "bars", "show", "SD", "between", "experiments", ".", "Also", "shown", "are", "histograms", "of", "whole", "cells", "compared", "to", "background", "fluorescence", "of", "pH", "beads", ".", "DC3", ".", "2R", "cells", "were", "treated", "with", "the", "indicated", "siRNA", ".", "48", "hours", "after", "transfection", ",", "cells", "were", "fed", "with", "Ova", "-", "Fe", "(", "2", "µg", "Ova", ")", "with", "or", "without", "100", "µM", "leupeptin", ".", "RF33", ".", "70", "-", "Luc", "reporter", "T", "cells", "were", "added", ".", "After", "overnight", "incubation", ",", "T", "cell", "luciferase", "was", "measured", ".", "Representative", "plot", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "show", "SD", "between", "3", "replicate", "wells", ".", "p", "values", "were", "calculated", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", ".", "5x104", "DC3", ".", "2", "-", "Rab39a", "-", "H2", "-", "Ld", "cells", "were", "fed", "with", "Ova", "-", "Fe", "(", "1µg", "Ova", ")", "with", "or", "without", "1", "µg", "dox", "and", "/", "or", "100", "µM", "leupeptin", ".", "RF33", ".", "70", "-", "Luc", "reporter", "T", "cells", "were", "added", ".", "After", "overnight", "incubation", ",", "T", "cell", "luciferase", "was", "measured", ".", "Representative", "plot", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "show", "SD", "between", "3", "replicate", "wells", ".", "p", "values", "were", "calculated", "using", "2", "-", "way", "ANOVA", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6DC3.2-Rab39a-H2-Ld cells (Rab39a KO with dox-inducible Rab39a) were incubated with 1 µg/ml dox overnight to induce Rab39a expression. 1x106 cells were fed at 4 beads/cell of biotinylated-Ova-magnetic-beads for 4 hours with the indicated inhibitors. Magnetic-bead phagosomes were isolated using the listed protocol. Phagosomes were washed, fixed, permeabilized and stained for Open and Closed (30-5-7s) forms of H2-Ld. Representative histograms of two independent experiments shown.Cells as in (A) were incubated with or without 1 µg/ml dox overnight to induce Rab39a expression. 1x106 cells were fed at 4 beads/cell of biotinylated-Ova-magnetic-beads for 4 hours. Phagosomes were isolated and stained for Ova and Open H2-Ld. Representative of 3 independent experiments.Quantification of Ova remaining in bead-phagosomes (C) and Nox2 staining (D). Representative Histogram shown. For analysis, the background fluorescence of unstained beads was subtracted from the resulting phagosome gMFI and the fold change of target protein (dox/no dox) was calculated. Three independent experiments were combined. P<0.05 using two-tailed ratio-paired Student's t-test. Error bars show SD between experiments.Cells as in (A) were incubated with or without 1 µg/ml dox overnight to induce Rab39a expression. 1x106 cells were incubated on ice with 4 beads/cell of biotinylated-Ova-beads for bead attachment. Cells were then transferred into 37oC media containing 5 µM CellROX Deep Red. After 4 hours of incubation, unfixed phagosomes were extracted and analyzed via flow cytometry for CellROX fluorescence. For analysis, the background fluorescence of unstained beads was subtracted from the resulting phagosome gMFI and the fold change (dox/no dox) was calculated. Three independent experiments were combined. P<0.05 using two-tailed ratio-paired Student's t-test. Error bars show SD between experiments.Same as in C with Sec22b staining. Three independent experiments were combined. P<0.05 using two-tailed ratio-paired Student's t-test. Error bars show SD between experiments.Cells as in (A) were fed at 1 bead per cell with pHrodo conjugated beads that increase fluorescence at low pH. After 4 hours of incubation, whole cells were harvested and run through flow cytometry to measure fluorescence of eaten beads. For analysis, the background fluorescence of uneaten beads was subtracted from the resulting gMFI and the fold change of dox/no dox was calculated. Three independent experiments were combined. p<0.05 using two-tailed ratio-paired Student's t-test. Error bars show SD between experiments. Also shown are histograms of whole cells compared to background fluorescence of pH beads.DC3.2R cells were treated with the indicated siRNA. 48 hours after transfection, cells were fed with Ova-Fe (2 µg Ova) with or without 100 µM leupeptin. RF33.70-Luc reporter T cells were added. After overnight incubation, T cell luciferase was measured. Representative plot of two independent experiments. Error bars show SD between 3 replicate wells. p values were calculated using 2-way ANOVA.5x104 DC3.2-Rab39a-H2-Ld cells were fed with Ova-Fe (1µg Ova) with or without 1 µg dox and/or 100 µM leupeptin. RF33.70-Luc reporter T cells were added. After overnight incubation, T cell luciferase was measured. Representative plot of two independent experiments. Error bars show SD between 3 replicate wells. p values were calculated using 2-way ANOVA."}
{"words": ["Figure", "7Rab39a", "expression", "in", "splenocyte", "subsets", "was", "measured", "using", "an", "FDG", "assay", ".", "Shown", "are", "relative", "FDG", "fluorescence", "of", "Rab39a", "KO", "cells", "/", "WT", "background", ".", "Summary", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "Splenic", "DCs", "were", "expanded", "in", "Rab39a", "KO", "and", "WT", "mice", "by", "injection", "of", "B16", "-", "Flt3L", "tumor", ".", "10", "days", "post", "tumor", "implantation", ",", "DCIR2", "+", "(", "Cd8α", "-", ")", "or", "XCR1", "+", "(", "Cd8α", "+", ")", "dendritic", "cells", "were", "isolated", "from", "spleens", "via", "magnetic", "positive", "selection", ".", "5", "x", "104", "cells", "were", "plated", "in", "a", "96", "well", "plate", "and", "incubated", "with", "the", "indicated", "amounts", "of", "Ova", "-", "Fe", "and", "1", ":", "1", "of", "Reporter", "CD8", "or", "CD4", "T", "-", "cells", "overnight", "before", "measuring", "luciferase", "activity", ".", "Error", "bars", "indicate", "SD", "of", "2", "replicate", "wells", ".", "Shown", "are", "representative", "graphs", "of", "3", "independent", "experiments", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "using", "two", "-", "way", "ANOVA", ".", "CD11b", "+", "CD11c", "+", "dendritic", "cells", "were", "enriched", "from", "WT", "or", "Rab39a", "KO", "spleens", "via", "magnetic", "negative", "selection", ".", "Cells", "were", "fed", "with", "3", "µm", "biotin", "-", "ova", "-", "magnetic", "beads", "for", "4", "hours", ".", "Phagosomes", "were", "extracted", ",", "permeabilized", "and", "stained", "for", "the", "indicated", "proteins", ".", "For", "ROS", "measurements", ",", "phagocytosis", "was", "performed", "with", "5", "µM", "CellROX", "and", "the", "phagosomes", "were", "not", "permeabilized", ".", "For", "analysis", ",", "the", "background", "fluorescence", "of", "unstained", "beads", "was", "subtracted", "from", "the", "resulting", "phagosome", "gMFI", "and", "the", "fold", "change", "of", "target", "(", "dox", "/", "no", "dox", ")", "was", "calculated", ".", "Shown", "are", "three", "independent", "experiments", "combined", ".", "Error", "bars", "show", "SD", "between", "experiments", ".", "p", "values", "were", "calculated", "using", "two", "-", "tailed", "ratio", "-", "paired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "CD11b", "+", "CD11c", "+", "dendritic", "cells", "were", "enriched", "from", "WT", "or", "Rab39a", "KO", "spleens", "via", "magnetic", "negative", "selection", ".", "Cells", "were", "fed", "with", "3", "µm", "magnetic", "beads", "conjugated", "to", "pHrodo", ".", "After", "4", "hours", ",", "cells", "were", "harvested", "for", "flow", "cytometry", "to", "measure", "fluorescence", "of", "eaten", "beads", "due", "to", "phagosomal", "pH", ".", "For", "analysis", ",", "the", "background", "fluorescence", "of", "unstained", "beads", "was", "subtracted", "from", "the", "resulting", "gMFI", "and", "the", "fold", "change", "(", "dox", "/", "no", "dox", ")", "was", "calculated", ".", "Shown", "are", "three", "independent", "experiments", "with", "error", "bars", "indicating", "the", "SD", ".", "p", "values", "were", "calculated", "using", "two", "-", "tailed", "ratio", "-", "paired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "CD11b", "+", "CD11c", "+", "dendritic", "cells", "were", "enriched", "from", "WT", "or", "Rab39a", "KO", "spleens", "via", "magnetic", "negative", "selection", ".", "Cells", "were", "fed", "with", "3", "µm", "magnetic", "beads", "conjugated", "to", "Alexa", "fluor", "dye", ".", "After", "4", "hours", ",", "cells", "were", "harvested", "and", "resuspended", "in", "1", "mg", "/", "ml", "Trypan", "blue", "to", "quench", "fluorescence", "of", "uneaten", "beads", ".", "Cells", "were", "run", "for", "flow", "cytometry", "to", "measure", "phagocytosis", ".", "The", "ratio", "of", "KO", "cells", "with", "beads", "/", "WT", "cells", "with", "beads", "was", "then", "obtained", ".", "Graphs", "show", "three", "independent", "experiments", "and", "p", "values", "were", "calculated", "using", "two", "-", "tailed", "ratio", "-", "paired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Error", "bars", "show", "SD", "between", "experiments", ".", "Rab39a", "KO", "and", "WT", "mice", "were", "injected", "intravenously", "with", "1", "x", "105", "A20", "-", "Ova", "cells", ".", "The", "next", "day", ",", "CFSE", "labeled", "OTI", "-", "splenocytes", "were", "injected", "i", ".", "v", ".", ".", "3", "days", "post", "OT", "-", "I", "transfer", ",", "spleens", "were", "harvested", "and", "assayed", "for", "OT", "-", "I", "proliferation", ".", "Three", "independent", "experiments", "(", "WT", "vs", "KO", ")", "were", "performed", ".", "To", "combine", "the", "data", ",", "the", "OT", "-", "I", "proliferation", "in", "each", "individual", "mouse", "was", "normalized", "to", "the", "average", "proliferation", "of", "the", "WT", "controls", "in", "that", "experiment", ".", "Error", "bars", "show", "SD", "between", "individual", "mice", "and", "p", "value", "was", "derived", "from", "two", "-", "tailed", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "n", "=", "14", "(", "WT", ")", "or", "9", "(", "KO", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Rab39a expression in splenocyte subsets was measured using an FDG assay. Shown are relative FDG fluorescence of Rab39a KO cells/WT background. Summary of two independent experiments.Splenic DCs were expanded in Rab39a KO and WT mice by injection of B16-Flt3L tumor. 10 days post tumor implantation, DCIR2+ (Cd8α-) or XCR1+ (Cd8α+) dendritic cells were isolated from spleens via magnetic positive selection. 5 x 104 cells were plated in a 96 well plate and incubated with the indicated amounts of Ova-Fe and 1:1 of Reporter CD8 or CD4 T-cells overnight before measuring luciferase activity. Error bars indicate SD of 2 replicate wells. Shown are representative graphs of 3 independent experiments. * p < 0.05 using two-way ANOVA.CD11b+ CD11c+ dendritic cells were enriched from WT or Rab39a KO spleens via magnetic negative selection. Cells were fed with 3 µm biotin-ova-magnetic beads for 4 hours. Phagosomes were extracted, permeabilized and stained for the indicated proteins. For ROS measurements, phagocytosis was performed with 5 µM CellROX and the phagosomes were not permeabilized. For analysis, the background fluorescence of unstained beads was subtracted from the resulting phagosome gMFI and the fold change of target (dox/no dox) was calculated. Shown are three independent experiments combined. Error bars show SD between experiments. p values were calculated using two-tailed ratio-paired Student's t-test.CD11b+ CD11c+ dendritic cells were enriched from WT or Rab39a KO spleens via magnetic negative selection. Cells were fed with 3 µm magnetic beads conjugated to pHrodo. After 4 hours, cells were harvested for flow cytometry to measure fluorescence of eaten beads due to phagosomal pH. For analysis, the background fluorescence of unstained beads was subtracted from the resulting gMFI and the fold change (dox/no dox) was calculated. Shown are three independent experiments with error bars indicating the SD. p values were calculated using two-tailed ratio-paired Student's t-test.CD11b+ CD11c+ dendritic cells were enriched from WT or Rab39a KO spleens via magnetic negative selection. Cells were fed with 3 µm magnetic beads conjugated to Alexa fluor dye. After 4 hours, cells were harvested and resuspended in 1 mg/ml Trypan blue to quench fluorescence of uneaten beads. Cells were run for flow cytometry to measure phagocytosis. The ratio of KO cells with beads / WT cells with beads was then obtained. Graphs show three independent experiments and p values were calculated using two-tailed ratio-paired Student's t-test. Error bars show SD between experiments.Rab39a KO and WT mice were injected intravenously with 1 x 105 A20-Ova cells. The next day, CFSE labeled OTI-splenocytes were injected i.v.. 3 days post OT-I transfer, spleens were harvested and assayed for OT-I proliferation. Three independent experiments (WT vs KO) were performed. To combine the data, the OT-I proliferation in each individual mouse was normalized to the average proliferation of the WT controls in that experiment. Error bars show SD between individual mice and p value was derived from two-tailed student's t-test. n = 14 (WT) or 9 (KO)."}
{"words": ["Figure", "1B", "HSATIII", "ASO", "-", "mediated", "depletion", "of", "nSBs", ".", "Thermal", "stress", "-", "exposed", "HeLa", "cells", "(", "42", "°", "C", "for", "2", "h", "and", "recovery", "for", "1", "h", "at", "37", "°", "C", ")", "were", "visualized", "by", "HSATIII", "-", "FISH", "and", "immunofluorescence", "using", "an", "anti", "-", "SAFB", "antibody", "or", "anti", "-", "HNRNPM", "antibody", ".", "The", "nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "C", "qRT", "-", "PCR", "-", "validation", "of", "HSATIII", "knockdown", ".", "The", "graph", "shows", "the", "qRT", "-", "PCR", "level", "of", "HSATIII", "RNAs", "in", "control", "and", "HSATIII", "knockdown", "cells", "under", "three", "conditions", ":", "37", "°", "C", ",", "42", "°", "C", "for", "2", "h", ",", "and", "thermal", "stress", "followed", "by", "recovery", "at", "37", "°", "C", "for", "1", "h", "(", "Recovery", ")", ".", "Expression", "levels", "were", "calculated", "as", "ratios", "to", "GAPDH", "mRNA", "and", "were", "normalized", "to", "the", "levels", "in", "control", "cells", "under", "thermal", "stress", "conditions", "(", "42", "°", "C", "for", "2", "h", ")", ".", "Data", "are", "shown", "as", "the", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "HSATIII", "RNAs", "ratios", "(", "%", ")", "are", "indicated", ".", "D", "MA", "-", "plot", "(", "log2", "fold", "-", "change", "over", "the", "average", "expression", "level", ")", "of", "all", "detected", "introns", "in", "HSATIII", "KD", "and", "control", "cells", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "The", "introns", "with", "significant", "changes", "in", "their", "expression", "levels", "(", "adjusted", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "01", ")", "are", "shown", "as", "green", "dots", ".", "Among", "these", "introns", ",", "up", "-", "regulated", "(", "log2", "fold", "-", "change", ">", "1", ")", "and", "down", "-", "regulated", "(", "log2", "fold", "-", "change", "<", "-", "1", ")", "introns", "are", "shown", "with", "magenta", "and", "light", "blue", "dots", ",", "respectively", ".", "Genes", "and", "introns", "that", "were", "experimentally", "validated", "in", "subsequent", "experiments", "are", "indicated", "as", "gene", "symbol", "-", "i", "(", "intron", ")", "#", ".", "Total", "numbers", "of", "introns", "and", "genes", "utilized", "were", "144769", "and", "32623", ",", "respectively", ".", "Examples", "of", "RNA", "-", "seq", "read", "maps", "of", "HSATIII", "target", "RNAs", ".", "Affected", "introns", "and", "exons", "are", "indicated", "by", "blue", "(", "down", "-", "regulated", "upon", "HSATIII", "knockdown", ")", "G", "Examples", "of", "RNA", "-", "seq", "read", "maps", "of", "HSATIII", "target", "RNAs", ".", "Affected", "introns", "and", "exons", "are", "indicated", "by", "blue", "(", "down", "-", "regulated", "upon", "HSATIII", "knockdown", ")", "and", "magenta", "(", "up", "-", "regulated", ")", "boxes", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B HSATIII ASO-mediated depletion of nSBs. Thermal stress-exposed HeLa cells (42°C for 2 h and recovery for 1 h at 37°C) were visualized by HSATIII-FISH and immunofluorescence using an anti-SAFB antibody or anti-HNRNPM antibody. The nuclei were stained with DAPI. Scale bar: 10 μm.C qRT-PCR-validation of HSATIII knockdown. The graph shows the qRT-PCR level of HSATIII RNAs in control and HSATIII knockdown cells under three conditions: 37°C, 42°C for 2 h, and thermal stress followed by recovery at 37°C for 1 h (Recovery). Expression levels were calculated as ratios to GAPDH mRNA and were normalized to the levels in control cells under thermal stress conditions (42°C for 2 h). Data are shown as the mean±SD (n=3). HSATIII RNAs ratios (%) are indicated.D MA-plot (log2 fold-change over the average expression level) of all detected introns in HSATIII KD and control cells (n=3). The introns with significant changes in their expression levels (adjusted p-value < 0.01) are shown as green dots. Among these introns, up-regulated (log2 fold-change > 1) and down-regulated (log2 fold-change < -1) introns are shown with magenta and light blue dots, respectively. Genes and introns that were experimentally validated in subsequent experiments are indicated as gene symbol-i (intron) #. Total numbers of introns and genes utilized were 144769 and 32623, respectively.Examples of RNA-seq read maps of HSATIII target RNAs. Affected introns and exons are indicated by blue (down-regulated upon HSATIII knockdown)G Examples of RNA-seq read maps of HSATIII target RNAs. Affected introns and exons are indicated by blue (down-regulated upon HSATIII knockdown) and magenta (up-regulated) boxes."}
{"words": ["Figure", "2Validation", "of", "HSATIII", "target", "introns", "by", "qRT", "-", "PCR", ".", "The", "graphs", "show", "the", "relative", "amounts", "of", "the", "intron", "-", "retaining", "(", "IR", ")", "(", "upper", ")", "and", "spliced", "(", "lower", ")", "forms", "in", "control", "and", "HSATIII", "knockdown", "cells", "under", "three", "conditions", ":", "37", "°", "C", "(", "normal", ")", ",", "42", "°", "C", "for", "2", "h", "(", "thermal", "stress", ")", ",", "and", "thermal", "stress", "followed", "by", "recovery", "at", "37", "°", "C", "for", "1", "h", ".", "Expression", "levels", "were", "calculated", "as", "the", "ratio", "of", "each", "RNA", "to", "GAPDH", "mRNA", "and", "were", "normalized", "to", "the", "levels", "in", "control", "cells", "under", "normal", "conditions", "(", "37", "°", "C", ")", ".", "Data", "are", "shown", "as", "the", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "(", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ")", ".", "B", "Nuclear", "localization", "of", "the", "intron", "-", "retaining", "RNAs", ".", "The", "relative", "amounts", "of", "intron", "-", "retaining", "RNAs", "in", "the", "nuclear", "and", "cytoplasmic", "fractions", "were", "quantified", "by", "qRT", "-", "PCR", "and", "are", "represented", "as", "the", "ratio", "(", "%", "of", "the", "total", ")", ".", "GAPDH", "mRNA", "and", "U1", "snRNA", "were", "used", "as", "cytoplasmic", "and", "nuclear", "controls", ",", "respectively", ".", "Data", "are", "shown", "as", "the", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "D", ",", "E", "The", "levels", "of", "HSATIII", "target", "introns", "in", "newly", "synthesized", "RNAs", "within", "1", "h", "after", "thermal", "stress", "removal", ",", "as", "determined", "by", "qRT", "-", "PCR", ".", "The", "graphs", "show", "the", "changes", "in", "the", "expression", "levels", "of", "the", "intron", "-", "retaining", "(", "IR", ")", "(", "D", ")", "and", "spliced", "(", "E", ")", "forms", ".", "Expression", "levels", "were", "calculated", "as", "the", "ratio", "of", "each", "RNA", "to", "GAPDH", "mRNA", "and", "were", "normalized", "to", "the", "level", "in", "the", "control", "cells", ".", "Data", "are", "shown", "as", "the", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "(", "multiple", "t", "-", "test", "modified", "by", "Holm", "-", "Sidak", "'", "s", "method", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Validation of HSATIII target introns by qRT-PCR. The graphs show the relative amounts of the intron-retaining (IR) (upper) and spliced (lower) forms in control and HSATIII knockdown cells under three conditions: 37°C (normal), 42°C for 2 h (thermal stress), and thermal stress followed by recovery at 37°C for 1 h. Expression levels were calculated as the ratio of each RNA to GAPDH mRNA and were normalized to the levels in control cells under normal conditions (37°C). Data are shown as the mean±SD (n=3); *p<0.05 (Sidak's multiple comparison test).B Nuclear localization of the intron-retaining RNAs. The relative amounts of intron-retaining RNAs in the nuclear and cytoplasmic fractions were quantified by qRT-PCR and are represented as the ratio (% of the total). GAPDH mRNA and U1 snRNA were used as cytoplasmic and nuclear controls, respectively. Data are shown as the mean±SD (n=3).D, E The levels of HSATIII target introns in newly synthesized RNAs within 1 h after thermal stress removal, as determined by qRT-PCR. The graphs show the changes in the expression levels of the intron-retaining (IR) (D) and spliced (E) forms. Expression levels were calculated as the ratio of each RNA to GAPDH mRNA and were normalized to the level in the control cells. Data are shown as the mean±SD (n=3); *p<0.05 (multiple t-test modified by Holm-Sidak's method)."}
{"words": ["Figure", "3A", "Splicing", "isoforms", "of", "the", "CLK1", "pre", "-", "mRNA", ".", "The", "retained", "introns", "are", "indicated", "by", "red", "lines", ".", "An", "asterisk", "indicates", "the", "position", "of", "the", "premature", "termination", "codon", "in", "the", "nonsense", "-", "mediated", "mRNA", "decay", "-", "targeted", "isoform", ".", "B", "Time", "course", "analysis", "of", "the", "splicing", "pattern", "of", "CLK1", "pre", "-", "mRNAs", "in", "control", "and", "HSATIII", "knockdown", "(", "HSATIII", "KD", ")", "cells", "by", "semi", "-", "quantitative", "RT", "-", "PCR", ".", "Arrows", "indicate", "the", "positions", "of", "PCR", "primers", ".", "The", "GAPDH", "mRNA", "was", "used", "as", "an", "internal", "control", ".", "C", "Quantification", "of", "the", "data", "shown", "in", "(", "B", ")", ".", "Data", "are", "shown", "as", "the", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "(", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ")", ".", "D", "Thermal", "stress", "-", "induced", "expression", "of", "HSATIII", "in", "CHO", "(", "His9", ")", "cells", ".", "The", "cells", "were", "visualized", "by", "HSATIII", "-", "FISH", "(", "green", ")", ",", "and", "the", "nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "E", "Ectopic", "HSATIII", "-", "induced", "nSB", "assembly", "in", "CHO", "(", "His9", ")", "cells", ".", "The", "nSBs", "(", "yellow", "arrowheads", ")", "were", "visualized", "by", "HSATIII", "-", "FISH", "and", "immunofluorescence", "using", "an", "anti", "-", "SRSF1", "antibody", ".", "The", "nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "F", "Time", "course", "analysis", "of", "the", "splicing", "pattern", "of", "Chinese", "hamster", "Clk1", "pre", "-", "mRNAs", "in", "control", "(", "CHO", ")", "and", "CHO", "(", "His9", ")", "cells", "by", "semi", "-", "quantitative", "RT", "-", "PCR", ".", "Arrows", "indicate", "the", "positions", "of", "PCR", "primers", ".", "The", "GAPDH", "mRNA", "was", "used", "as", "an", "internal", "control", ".", "Time", "course", "analysis", "of", "the", "splicing", "pattern", "of", "Chinese", "hamster", "Clk1", "pre", "-", "mRNAs", "in", "control", "(", "CHO", ")", "and", "CHO", "(", "His9", ")", "cells", "by", "semi", "-", "quantitative", "RT", "-", "PCR", ".", "Arrows", "indicate", "the", "positions", "of", "PCR", "primers", ".", "The", "GAPDH", "mRNA", "was", "used", "as", "an", "internal", "control", ".", "G", "Quantification", "of", "the", "data", "shown", "in", "(", "F", ")", ".", "Data", "are", "shown", "as", "the", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "(", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ")", ".", "H", "The", "effect", "of", "HSATIII", "knockdown", "on", "pooling", "of", "intron", "-", "retaining", "RNAs", "in", "control", "(", "CHO", ")", "and", "CHO", "(", "His9", ")", "cells", "(", "42", "°", "C", "for", "2", "h", "and", "recovery", "for", "2", "h", "at", "37", "°", "C", ")", ".", "Arrows", "indicate", "the", "positions", "of", "PCR", "primers", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Splicing isoforms of the CLK1 pre-mRNA. The retained introns are indicated by red lines. An asterisk indicates the position of the premature termination codon in the nonsense-mediated mRNA decay-targeted isoform. B Time course analysis of the splicing pattern of CLK1 pre-mRNAs in control and HSATIII knockdown (HSATIII KD) cells by semi-quantitative RT-PCR. Arrows indicate the positions of PCR primers. The GAPDH mRNA was used as an internal control. C Quantification of the data shown in (B). Data are shown as the mean±SD (n=3); *p<0.05 (Sidak's multiple comparison test). D Thermal stress-induced expression of HSATIII in CHO (His9) cells. The cells were visualized by HSATIII-FISH (green), and the nuclei were stained with DAPI (blue). Scale bar: 10 μm.E Ectopic HSATIII-induced nSB assembly in CHO (His9) cells. The nSBs (yellow arrowheads) were visualized by HSATIII-FISH and immunofluorescence using an anti-SRSF1 antibody. The nuclei were stained with DAPI. Scale bar: 10 μm.F Time course analysis of the splicing pattern of Chinese hamster Clk1 pre-mRNAs in control (CHO) and CHO (His9) cells by semi-quantitative RT-PCR. Arrows indicate the positions of PCR primers. The GAPDH mRNA was used as an internal control.Time course analysis of the splicing pattern of Chinese hamster Clk1 pre-mRNAs in control (CHO) and CHO (His9) cells by semi-quantitative RT-PCR. Arrows indicate the positions of PCR primers. The GAPDH mRNA was used as an internal control. G Quantification of the data shown in (F). Data are shown as the mean±SD (n=3); *p<0.05 (Sidak's multiple comparison test).H The effect of HSATIII knockdown on pooling of intron-retaining RNAs in control (CHO) and CHO (His9) cells (42°C for 2 h and recovery for 2 h at 37°C). Arrows indicate the positions of PCR primers."}
{"words": ["Figure", "4B", "RT", "-", "PCR", "validation", "of", "the", "specific", "precipitation", "of", "HSATIII", "by", "ChIRP", ".", "The", "NEAT1", "ncRNA", "and", "GAPDH", "mRNA", "were", "used", "as", "negative", "controls", ".", "Input", ":", "100", "%", ".", "C", "Silver", "staining", "of", "the", "coprecipitated", "proteins", ".", "The", "predicted", "mobilities", "of", "five", "known", "nSB", "proteins", "are", "indicated", ".", "Input", ":", "0", ".", "1", "%", ".", "D", "Western", "blot", "analyses", "of", "proteins", "identified", "by", "the", "HSATIII", "-", "ChIRP", "experiment", ".", "Known", "nSB", "proteins", "(", "SAFB", ",", "SRSF1", ",", "SRSF7", ",", "SRSF9", ",", "and", "HNRNPM", ")", "were", "used", "as", "positive", "controls", ",", "and", "ELAVL1", ",", "PSPC1", "and", "α", "-", "tubulin", "were", "used", "as", "negative", "controls", ".", "SRSF3", ",", "SRSF5", ",", "TRA2B", "and", "THRAP3", "are", "newly", "identified", "nSB", "components", ".", "Colocalization", "of", "novel", "nSB", "proteins", "with", "HSATIII", ".", "Endogenous", "TRA2B", "(", "E", ")", "were", "stained", "with", "anti", "-", "TRA2B", "HSATIII", "was", "visualized", "by", "RNA", "-", "FISH", "using", "a", "dig", "-", "labeled", "HSATIII", "ASO", ",", "and", "the", "nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "Colocalization", "of", "novel", "nSB", "proteins", "with", "HSATIII", ".", "THRAP3", "(", "F", ")", ",", "were", "stained", "with", "anti", "-", "THRAP3", ",", "HSATIII", "was", "visualized", "by", "RNA", "-", "FISH", "using", "a", "dig", "-", "labeled", "HSATIII", "ASO", ",", "and", "the", "nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "Colocalization", "of", "novel", "nSB", "proteins", "with", "HSATIII", ".", "FLAG", "-", "tagged", "PPHLN1", "(", "G", ")", "were", "stained", "with", "anti", "-", "FLAG", "antibodies", "HSATIII", "was", "visualized", "by", "RNA", "-", "FISH", "using", "a", "dig", "-", "labeled", "HSATIII", "ASO", ",", "and", "the", "nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B RT-PCR validation of the specific precipitation of HSATIII by ChIRP. The NEAT1 ncRNA and GAPDH mRNA were used as negative controls. Input: 100%.C Silver staining of the coprecipitated proteins. The predicted mobilities of five known nSB proteins are indicated. Input: 0.1%.D Western blot analyses of proteins identified by the HSATIII-ChIRP experiment. Known nSB proteins (SAFB, SRSF1, SRSF7, SRSF9, and HNRNPM) were used as positive controls, and ELAVL1, PSPC1 and α-tubulin were used as negative controls. SRSF3, SRSF5, TRA2B and THRAP3 are newly identified nSB components.Colocalization of novel nSB proteins with HSATIII. Endogenous TRA2B (E) were stained with anti-TRA2B HSATIII was visualized by RNA-FISH using a dig-labeled HSATIII ASO, and the nuclei were stained with DAPI. Scale bar: 10 μm.Colocalization of novel nSB proteins with HSATIII. THRAP3 (F), were stained with anti-THRAP3, HSATIII was visualized by RNA-FISH using a dig-labeled HSATIII ASO, and the nuclei were stained with DAPI. Scale bar: 10 μm.Colocalization of novel nSB proteins with HSATIII. FLAG-tagged PPHLN1 (G) were stained with anti-FLAG antibodies HSATIII was visualized by RNA-FISH using a dig-labeled HSATIII ASO, and the nuclei were stained with DAPI. Scale bar: 10 μm."}
{"words": ["Figure", "5Specific", "interaction", "of", "CLK1", "with", "HSATIII", "during", "thermal", "stress", "recovery", ".", "HSATIII", "-", "ChIRP", "at", "various", "time", "points", "during", "and", "after", "thermal", "stress", "exposure", ".", "Endogenous", "CLK1", ",", "SRSF7", ",", "and", "SRSF9", "were", "detected", "using", "anti", "-", "CLK1", ",", "anti", "-", "SRSF7", ",", "and", "anti", "-", "SRSF9", "antibodies", ",", "respectively", ".", "HSATIII", "was", "detected", "by", "ChIRP", "-", "RNA", "purification", ",", "followed", "by", "RT", "-", "PCR", ".", "Input", ":", "0", ".", "1", "%", "for", "CLK1", ",", "1", "%", "for", "SRSF7", "and", "SRSF9", ",", "and", "100", "%", "for", "HSATIII", ".", "Specific", "interaction", "of", "HSATIII", "with", "CLK1", "proteins", "during", "stress", "recovery", ".", "HSATIII", "-", "ChIRP", "/", "western", "blotting", "was", "performed", "using", "HeLa", "cells", "expressing", "FLAG", "-", "CLK1", "WT", "or", "the", "KR", "mutant", ".", "FLAG", "-", "tagged", "CLK1", "and", "SRSF9", "were", "detected", "by", "western", "blotting", "using", "an", "anti", "-", "FLAG", "and", "an", "anti", "-", "SRSF9", "antibody", ",", "respectively", ".", "HSATIII", "was", "detected", "by", "ChIRP", "followed", "by", "RT", "-", "PCR", ".", "Input", ":", "1", "%", "for", "western", "blotting", ",", "100", "%", "for", "RT", "-", "PCR", ".", "Re", "-", "translocation", "of", "FLAG", "-", "CLK1", "to", "nSBs", "after", "thermal", "stress", "removal", ".", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "a", "FLAG", "-", "CLK1", "expression", "vector", ",", "cultured", "for", "16", "h", ",", "and", "then", "exposed", "to", "thermal", "stress", "(", "42", "°", "C", "for", "2", "h", ")", "with", "or", "without", "recovery", "(", "37", "°", "C", "for", "1", "h", ")", ".", "FLAG", "-", "CLK1", "was", "visualized", "with", "an", "anti", "-", "FLAG", "antibody", ".", "Nuclear", "stress", "bodies", "and", "nuclei", "were", "visualized", "by", "HSATIII", "-", "FISH", "and", "DAPI", "staining", ",", "respectively", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "Box", "plot", "of", "colocalization", "correlation", "coefficients", "between", "HSATIII", "and", "FLAG", "-", "CLK1", "WT", ".", "The", "first", "and", "third", "quartiles", "are", "the", "ends", "of", "the", "box", ",", "the", "median", "is", "indicated", "by", "the", "vertical", "line", "in", "the", "box", ",", "and", "the", "minimum", "and", "maximum", "are", "the", "ends", "of", "the", "whiskers", ".", "Recovery", "phase", "-", "specific", "interaction", "of", "HSATIII", "with", "the", "CLK1", "N", "-", "terminal", "region", ".", "HSATIII", "-", "ChIRP", "/", "western", "blotting", "was", "performed", "on", "HeLa", "cells", "expressing", "FLAG", "-", "CLK1", "∆", "C", "or", "FLAG", "-", "CLK1", "∆", "N", "Asterisk", ":", "an", "unidentified", "partial", "fragment", "of", "FLAG", "-", "CLK1", "∆", "N", ".", "Dependency", "of", "SRSF9", "on", "the", "interaction", "of", "CLK1", "(", "G", ")", "with", "HSATIII", ".", "HSATIII", "-", "ChIRP", "was", "performed", "using", "control", "and", "SRSF9", "-", "depleted", "cells", "expressing", "FLAG", "-", "CLK1", "proteins", "(", "42", "°", "C", "for", "2", "h", "and", "recovery", "for", "1", "h", "at", "37", "°", "C", ")", ".", "Input", ":", "1", "%", ".", "Graphs", "represent", "coprecipitation", "ratios", "of", "FLAG", "-", "CLK1", "proteins", "to", "HSATIII", "in", "the", "control", "and", "SRSF9", "-", "depleted", "cells", ".", "H", "Dependency", "of", "SRSF9", "on", "the", "interaction", "of", "CLK1", "∆", "C", "(", "H", ")", "with", "HSATIII", ".", "HSATIII", "-", "ChIRP", "was", "performed", "using", "control", "and", "SRSF9", "-", "depleted", "cells", "expressing", "FLAG", "-", "CLK1", "proteins", "(", "42", "°", "C", "for", "2", "h", "and", "recovery", "for", "1", "h", "at", "37", "°", "C", ")", ".", "Input", ":", "1", "%", ".", "Graphs", "represent", "coprecipitation", "ratios", "of", "FLAG", "-", "CLK1", "proteins", "to", "HSATIII", "in", "the", "control", "and", "SRSF9", "-", "depleted", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Specific interaction of CLK1 with HSATIII during thermal stress recovery. HSATIII-ChIRP at various time points during and after thermal stress exposure. Endogenous CLK1, SRSF7, and SRSF9 were detected using anti-CLK1, anti-SRSF7, and anti-SRSF9 antibodies, respectively. HSATIII was detected by ChIRP-RNA purification, followed by RT-PCR. Input: 0.1% for CLK1, 1% for SRSF7 and SRSF9, and 100% for HSATIII.Specific interaction of HSATIII with CLK1 proteins during stress recovery. HSATIII-ChIRP/western blotting was performed using HeLa cells expressing FLAG-CLK1 WT or the KR mutant. FLAG-tagged CLK1 and SRSF9 were detected by western blotting using an anti-FLAG and an anti-SRSF9 antibody, respectively. HSATIII was detected by ChIRP followed by RT-PCR. Input: 1% for western blotting, 100% for RT-PCR.Re-translocation of FLAG-CLK1 to nSBs after thermal stress removal. HeLa cells were transfected with a FLAG-CLK1 expression vector, cultured for 16 h, and then exposed to thermal stress (42°C for 2 h) with or without recovery (37°C for 1 h). FLAG-CLK1 was visualized with an anti-FLAG antibody. Nuclear stress bodies and nuclei were visualized by HSATIII-FISH and DAPI staining, respectively. Scale bar: 10 μm.Box plot of colocalization correlation coefficients between HSATIII and FLAG-CLK1 WT. The first and third quartiles are the ends of the box, the median is indicated by the vertical line in the box, and the minimum and maximum are the ends of the whiskers.Recovery phase-specific interaction of HSATIII with the CLK1 N-terminal region. HSATIII-ChIRP/western blotting was performed on HeLa cells expressing FLAG-CLK1∆C or FLAG-CLK1∆N Asterisk: an unidentified partial fragment of FLAG-CLK1∆N.Dependency of SRSF9 on the interaction of CLK1 (G) with HSATIII. HSATIII-ChIRP was performed using control and SRSF9-depleted cells expressing FLAG-CLK1 proteins (42°C for 2 h and recovery for 1 h at 37°C). Input: 1%. Graphs represent coprecipitation ratios of FLAG-CLK1 proteins to HSATIII in the control and SRSF9-depleted cells.H Dependency of SRSF9 on the interaction of CLK1∆C (H) with HSATIII. HSATIII-ChIRP was performed using control and SRSF9-depleted cells expressing FLAG-CLK1 proteins (42°C for 2 h and recovery for 1 h at 37°C). Input: 1%. Graphs represent coprecipitation ratios of FLAG-CLK1 proteins to HSATIII in the control and SRSF9-depleted cells."}
{"words": ["Figure", "6A", "Localization", "of", "SRSF9", "with", "HSATIII", "during", "thermal", "stress", "and", "recovery", ".", "B", "Recovery", "phase", "-", "specific", "colocalization", "of", "CLK1", "and", "SRSF9", ".", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "a", "FLAG", "-", "CLK1", "expression", "vector", ",", "cultured", "for", "16", "h", ",", "and", "exposed", "to", "thermal", "stress", "(", "42", "°", "C", "for", "2", "h", ")", "followed", "by", "recovery", "(", "37", "°", "C", "for", "1", "h", ")", ".", "FLAG", "-", "CLK1", "and", "SRSF9", "were", "co", "-", "stained", "using", "anti", "-", "FLAG", "and", "anti", "-", "SRSF9", "antibodies", ",", "respectively", ",", "and", "the", "nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", ".", "C", "Box", "plot", "of", "colocalization", "correlation", "coefficients", "between", "SRSF9", "and", "FLAG", "-", "CLK1", "WT", ".", "The", "first", "and", "third", "quartiles", "are", "the", "ends", "of", "the", "box", ",", "the", "median", "is", "indicated", "with", "a", "vertical", "line", "in", "the", "box", ",", "and", "the", "minimum", "and", "maximum", "are", "the", "ends", "of", "the", "whiskers", ".", "F", "The", "effect", "of", "HSATIII", "knockdown", "on", "time", "course", "-", "dependent", "changes", "in", "SRSF9", "phosphorylation", ".", "The", "phosphorylation", "states", "were", "estimated", "by", "Phos", "-", "tag", "SDS", "-", "PAGE", ",", "followed", "by", "western", "blotting", "using", "an", "anti", "-", "SRSF9", "antibody", ".", "SRSF9", "detected", "by", "western", "blotting", "of", "a", "normal", "SDS", "-", "PAGE", "gel", "is", "shown", "in", "the", "bottom", "panel", ".", "The", "arrows", "and", "arrowheads", "indicate", "the", "normal", "phosphorylated", "forms", "and", "thermal", "stress", "-", "induced", "hypo", "-", "and", "de", "-", "phosphorylated", "forms", ",", "respectively", ".", "F", "The", "effect", "of", "HSATIII", "knockdown", "on", "time", "course", "-", "dependent", "changes", "in", "SRSF9", "phosphorylation", ".", "The", "phosphorylation", "states", "were", "estimated", "by", "Phos", "-", "tag", "SDS", "-", "PAGE", ",", "followed", "by", "western", "blotting", "using", "an", "anti", "-", "SRSF9", "antibody", ".", "SRSF9", "detected", "by", "western", "blotting", "of", "a", "normal", "SDS", "-", "PAGE", "gel", "is", "shown", "in", "the", "bottom", "panel", ".", "The", "arrows", "and", "arrowheads", "indicate", "the", "normal", "phosphorylated", "forms", "and", "thermal", "stress", "-", "induced", "hypo", "-", "and", "de", "-", "phosphorylated", "forms", ",", "respectively", ".", "G", "Quantification", "of", "the", "data", "shown", "in", "(", "F", ")", ".", "Graphs", "show", "the", "time", "-", "course", "changes", "in", "four", "representative", "SRSF9", "phosphorylated", "forms", "in", "(", "F", ")", ".", "Relative", "levels", "of", "band", "intensity", "were", "calculated", "as", "the", "ratio", "of", "each", "band", "to", "α", "-", "tubulin", "and", "were", "normalized", "to", "those", "of", "control", "at", "37", "°", "C", "(", "bands", "(", "a", ")", "and", "(", "b", ")", ")", "and", "42", "°", "C", "(", "bands", "(", "c", ")", "and", "(", "d", ")", ")", ".", "Since", "band", "(", "d", ")", "partially", "overlapped", "with", "the", "other", "band", "(", "asterisk", "in", "(", "F", ")", ")", "at", "37", "°", "C", "and", "recovery", "4h", ",", "band", "(", "d", ")", "at", "those", "time", "points", "was", "not", "measured", ".", "H", "The", "re", "-", "phosphorylation", "status", "of", "SRSF9", "within", "nSBs", ".", "Phosphorylated", "(", "arrows", ")", "and", "hypo", "-", "and", "de", "-", "phosphorylated", "(", "arrowheads", ")", "SRSF9", "in", "the", "nSB", "fractions", "(", "lanes", "4", ",", "6", ",", "and", "8", ")", "were", "analyzed", "by", "western", "blotting", "on", "Phos", "-", "tag", "gels", ".", "KH", "-", "CB19", "(", "10", "μM", ")", "or", "DMSO", "as", "a", "control", "was", "administrated", "during", "the", "recovery", "period", ".", "The", "lower", "panel", "shows", "a", "shorter", "exposure", "image", "of", "the", "phosphorylated", "forms", ".", "The", "asterisks", "indicate", "bands", "different", "from", "band", "(", "a", ")", "or", "(", "d", ")", ".", "I", "Quantification", "of", "the", "data", "shown", "in", "(", "H", ")", ".", "Relative", "band", "intensities", "were", "calculated", "as", "the", "ratios", "of", "each", "band", "to", "total", "SRSF9", "detected", "by", "western", "blotting", "of", "a", "standard", "SDS", "-", "PAGE", ",", "and", "were", "normalized", "to", "those", "at", "42", "°", "C", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A Localization of SRSF9 with HSATIII during thermal stress and recovery.B Recovery phase-specific colocalization of CLK1 and SRSF9. HeLa cells were transfected with a FLAG-CLK1 expression vector, cultured for 16 h, and exposed to thermal stress (42°C for 2 h) followed by recovery (37°C for 1 h). FLAG-CLK1 and SRSF9 were co-stained using anti-FLAG and anti-SRSF9 antibodies, respectively, and the nuclei were stained with DAPI.C Box plot of colocalization correlation coefficients between SRSF9 and FLAG-CLK1 WT. The first and third quartiles are the ends of the box, the median is indicated with a vertical line in the box, and the minimum and maximum are the ends of the whiskers.F The effect of HSATIII knockdown on time course-dependent changes in SRSF9 phosphorylation. The phosphorylation states were estimated by Phos-tag SDS-PAGE, followed by western blotting using an anti-SRSF9 antibody. SRSF9 detected by western blotting of a normal SDS-PAGE gel is shown in the bottom panel. The arrows and arrowheads indicate the normal phosphorylated forms and thermal stress-induced hypo- and de-phosphorylated forms, respectively.F The effect of HSATIII knockdown on time course-dependent changes in SRSF9 phosphorylation. The phosphorylation states were estimated by Phos-tag SDS-PAGE, followed by western blotting using an anti-SRSF9 antibody. SRSF9 detected by western blotting of a normal SDS-PAGE gel is shown in the bottom panel. The arrows and arrowheads indicate the normal phosphorylated forms and thermal stress-induced hypo- and de-phosphorylated forms, respectively. G Quantification of the data shown in (F). Graphs show the time-course changes in four representative SRSF9 phosphorylated forms in (F). Relative levels of band intensity were calculated as the ratio of each band to α-tubulin and were normalized to those of control at 37°C (bands (a) and (b)) and 42°C (bands (c) and (d)). Since band (d) partially overlapped with the other band (asterisk in (F)) at 37°C and recovery 4h, band (d) at those time points was not measured. H The re-phosphorylation status of SRSF9 within nSBs. Phosphorylated (arrows) and hypo- and de-phosphorylated (arrowheads) SRSF9 in the nSB fractions (lanes 4, 6, and 8) were analyzed by western blotting on Phos-tag gels. KH-CB19 (10 μM) or DMSO as a control was administrated during the recovery period. The lower panel shows a shorter exposure image of the phosphorylated forms. The asterisks indicate bands different from band (a) or (d). I Quantification of the data shown in (H). Relative band intensities were calculated as the ratios of each band to total SRSF9 detected by western blotting of a standard SDS-PAGE, and were normalized to those at 42°C."}
{"words": ["Figure", "7A", ",", "B", "Validation", "of", "the", "effect", "of", "SRSF9", "on", "retention", "/", "splicing", "of", "HSATIII", "target", "introns", "by", "qRT", "-", "PCR", ".", "The", "relative", "expression", "levels", "of", "intron", "-", "retaining", "(", "IR", ")", "forms", "(", "A", ")", "and", "spliced", "forms", "(", "B", ")", "of", "newly", "transcribed", "RNAs", "during", "the", "recovery", "period", "are", "shown", ".", "Expression", "levels", "were", "calculated", "as", "the", "ratio", "of", "each", "RNA", "to", "GAPDH", "mRNA", "and", "were", "normalized", "to", "the", "control", ".", "C", ",", "D", "Time", "course", "analysis", "of", "the", "splicing", "patterns", "of", "CLK1", "and", "TAF1D", "intron", "-", "retaining", "RNAs", "in", "control", "and", "HSATIII", "knockdown", "cells", "by", "semi", "-", "quantitative", "RT", "-", "PCR", ".", "Arrows", "indicate", "the", "positions", "of", "primers", "for", "RT", "-", "PCR", ".", "GAPDH", "mRNA", "was", "used", "as", "an", "internal", "control", ".", "The", "experiment", "was", "performed", "in", "triplicate", ".", "Quantification", "of", "the", "data", "shown", "in", "(", "C", ")", ",", "F", "Validation", "of", "the", "requirement", "of", "CLK1", "catalytic", "activity", "for", "promotion", "of", "intron", "retention", "by", "qRT", "-", "PCR", ".", "Data", "are", "shown", "as", "the", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "G", "The", "diagrams", "show", "the", "domain", "structures", "of", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "mutant", "(", "mut", ")", "SRSF9", ",", "in", "which", "all", "SR", "/", "SP", "dipeptides", "were", "replaced", "by", "AR", "/", "AP", ".", "FLAG", "-", "SRSF9", "-", "WT", "and", "FLAG", "-", "SRSF9", "-", "mut", "were", "extracted", "from", "transfected", "HeLa", "cells", "under", "normal", "(", "37", "°", "C", ")", "and", "thermal", "stress", "(", "42", "°", "C", "for", "2", "h", ")", "conditions", ",", "separated", "in", "a", "Phos", "-", "tag", "gel", ",", "and", "detected", "by", "western", "blot", "using", "an", "anti", "-", "FLAG", "antibody", ".", "The", "arrowhead", "indicates", "the", "thermal", "stress", "-", "induced", "de", "-", "phosphorylated", "form", "of", "FLAG", "-", "SRSF9", "-", "WT", ".", "The", "role", "of", "phosphorylation", "of", "SRSF9", "on", "splicing", "of", "the", "TAF1D", "(", "H", ")", "splicing", "reporter", "plasmid", "was", "transfected", "into", "HeLa", "cells", "along", "with", "a", "siRNA", "(", "control", "or", "SRSF9", "-", "specific", ")", "and", "a", "siRNA", "-", "resistant", "SRSF9", "-", "WT", "or", "SRSF9", "-", "mut", "expression", "plasmid", "(", "or", "pEGFP", "-", "C1", "vector", "as", "the", "empty", "vehicle", "(", "-", ")", ")", "48", "h", "before", "the", "assay", ".", "Semi", "-", "quantitative", "RT", "-", "PCR", "analyses", "revealed", "the", "splicing", "patterns", "of", "the", "reporter", "RNAs", "purified", "from", "the", "thermal", "stress", "-", "exposed", "cells", "(", "42", "°", "C", "for", "2", "h", "and", "37", "°", "C", "for", "1", "h", ")", ".", "The", "positions", "of", "the", "PCR", "primers", "are", "indicated", "by", "arrows", ".", "Graphs", "represent", "the", "relative", "changes", "in", "the", "spliced", "/", "unspliced", "ratios", ",", "normalized", "to", "the", "control", "sample", "with", "control", "siRNA", "and", "empty", "plasmid", "(", "-", ")", ".", "I", "The", "role", "of", "phosphorylation", "of", "SRSF9", "on", "splicing", "of", "the", "DNAJB9", "(", "I", ")", "reporters", ".", "Each", "splicing", "reporter", "plasmid", "was", "transfected", "into", "HeLa", "cells", "along", "with", "a", "siRNA", "(", "control", "or", "SRSF9", "-", "specific", ")", "and", "a", "siRNA", "-", "resistant", "SRSF9", "-", "WT", "or", "SRSF9", "-", "mut", "expression", "plasmid", "(", "or", "pEGFP", "-", "C1", "vector", "as", "the", "empty", "vehicle", "(", "-", ")", ")", "48", "h", "before", "the", "assay", ".", "Semi", "-", "quantitative", "RT", "-", "PCR", "analyses", "revealed", "the", "splicing", "patterns", "of", "the", "reporter", "RNAs", "purified", "from", "the", "thermal", "stress", "-", "exposed", "cells", "(", "42", "°", "C", "for", "2", "h", "and", "37", "°", "C", "for", "1", "h", ")", ".", "The", "positions", "of", "the", "PCR", "primers", "are", "indicated", "by", "arrows", ".", "Graphs", "represent", "the", "relative", "changes", "in", "the", "spliced", "/", "unspliced", "ratios", ",", "normalized", "to", "the", "control", "sample", "with", "control", "siRNA", "and", "empty", "plasmid", "(", "-", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A, B Validation of the effect of SRSF9 on retention/splicing of HSATIII target introns by qRT-PCR. The relative expression levels of intron-retaining (IR) forms (A) and spliced forms (B) of newly transcribed RNAs during the recovery period are shown. Expression levels were calculated as the ratio of each RNA to GAPDH mRNA and were normalized to the control.C, D Time course analysis of the splicing patterns of CLK1 and TAF1D intron-retaining RNAs in control and HSATIII knockdown cells by semi-quantitative RT-PCR. Arrows indicate the positions of primers for RT-PCR. GAPDH mRNA was used as an internal control. The experiment was performed in triplicate. Quantification of the data shown in (C),F Validation of the requirement of CLK1 catalytic activity for promotion of intron retention by qRT-PCR. Data are shown as the mean±SD (n=3).G The diagrams show the domain structures of wild-type (WT) and mutant (mut) SRSF9, in which all SR/SP dipeptides were replaced by AR/AP. FLAG-SRSF9-WT and FLAG-SRSF9-mut were extracted from transfected HeLa cells under normal (37°C) and thermal stress (42°C for 2 h) conditions, separated in a Phos-tag gel, and detected by western blot using an anti-FLAG antibody. The arrowhead indicates the thermal stress-induced de-phosphorylated form of FLAG-SRSF9-WT.The role of phosphorylation of SRSF9 on splicing of the TAF1D (H) splicing reporter plasmid was transfected into HeLa cells along with a siRNA (control or SRSF9-specific) and a siRNA-resistant SRSF9-WT or SRSF9-mut expression plasmid (or pEGFP-C1 vector as the empty vehicle (-)) 48 h before the assay. Semi-quantitative RT-PCR analyses revealed the splicing patterns of the reporter RNAs purified from the thermal stress-exposed cells (42°C for 2 h and 37°C for 1 h). The positions of the PCR primers are indicated by arrows. Graphs represent the relative changes in the spliced/unspliced ratios, normalized to the control sample with control siRNA and empty plasmid (-).I The role of phosphorylation of SRSF9 on splicing of the DNAJB9 (I) reporters. Each splicing reporter plasmid was transfected into HeLa cells along with a siRNA (control or SRSF9-specific) and a siRNA-resistant SRSF9-WT or SRSF9-mut expression plasmid (or pEGFP-C1 vector as the empty vehicle (-)) 48 h before the assay. Semi-quantitative RT-PCR analyses revealed the splicing patterns of the reporter RNAs purified from the thermal stress-exposed cells (42°C for 2 h and 37°C for 1 h). The positions of the PCR primers are indicated by arrows. Graphs represent the relative changes in the spliced/unspliced ratios, normalized to the control sample with control siRNA and empty plasmid (-)."}
{"words": ["Figure", "1Time", "-", "lapse", "imaging", "of", "an", "oocyte", "expressing", "CENP", "-", "C", "-", "EGFP", "(", "centromeres", ",", "green", ")", "and", "H2B", "-", "mCherry", "(", "chromatin", ",", "red", ")", ".", "Upper", "row", "shows", "maximum", "intensity", "z", "projection", "images", "from", "representative", "timepoints", "of", "four", "stages", "from", "anaphase", "I", "onset", "to", "CSF", "-", "dependent", "MII", "arrest", ".", "The", "3D", "positions", "of", "centromeres", "are", "shown", "as", "black", "dots", "in", "a", "side", "view", "(", "along", "the", "spindle", "equator", ",", "middle", "row", ")", "and", "top", "view", "(", "perpendicular", "to", "the", "equator", "plane", ",", "bottom", "row", ")", ".", "Tracks", "of", "individual", "centromeres", "are", "color", "-", "coded", "according", "to", "the", "speed", ",", "as", "indicated", "by", "the", "colour", "bar", ".", "Time", "is", "shown", "after", "anaphase", "I", "onset", "(", "min", ":", "sec", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "5", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Time-lapse imaging of an oocyte expressing CENP-C-EGFP (centromeres, green) and H2B-mCherry (chromatin, red). Upper row shows maximum intensity z projection images from representative timepoints of four stages from anaphase I onset to CSF-dependent MII arrest. The 3D positions of centromeres are shown as black dots in a side view (along the spindle equator, middle row) and top view (perpendicular to the equator plane, bottom row). Tracks of individual centromeres are color-coded according to the speed, as indicated by the colour bar. Time is shown after anaphase I onset (min:sec). Scale bars, 5 μm."}
{"words": ["Figure", "2Chromosome", "parameters", "are", "shown", "in", "A", "-", "C", "on", "the", "vertical", "axis", ",", "and", "time", "after", "anaphase", "I", "onset", "is", "shown", "in", "min", "on", "the", "horizontal", "axis", ".", "Thin", "grey", "lines", "in", "A", "-", "C", "represent", "individual", "chromosomes", ";", "the", "distantly", "observed", "chromosome", "is", "highlighted", "by", "dashed", "line", ";", "the", "mean", "value", "for", "each", "timepoint", "is", "indicated", "by", "thick", "black", "line", ".", "The", "stages", "between", "anaphase", "I", "and", "metaphase", "II", "are", "color", "-", "coded", "and", "labelled", "on", "the", "top", "of", "the", "charts", ".", "On", "the", "schemes", "above", "the", "charts", "in", "(", "A", ")", "and", "(", "C", ")", ",", "chromosomes", "are", "red", "with", "green", "centromeres", ".", "Changes", "in", "the", "distance", "to", "the", "centre", "for", "all", "chromosomes", "in", "a", "representative", "oocyte", "undergoing", "transition", "from", "anaphase", "I", "to", "metaphase", "II", "from", "Fig", "1", ".", "The", "black", "arrow", "on", "the", "scheme", "above", "the", "chart", "indicates", "chromosome", "-", "centre", "distance", ".", "Chromosome", "parameters", "are", "shown", "in", "A", "-", "C", "on", "the", "vertical", "axis", ",", "and", "time", "after", "anaphase", "I", "onset", "is", "shown", "in", "min", "on", "the", "horizontal", "axis", ".", "Thin", "grey", "lines", "in", "A", "-", "C", "represent", "individual", "chromosomes", ";", "the", "distantly", "observed", "chromosome", "is", "highlighted", "by", "dashed", "line", ";", "the", "mean", "value", "for", "each", "timepoint", "is", "indicated", "by", "thick", "black", "line", ".", "The", "stages", "between", "anaphase", "I", "and", "metaphase", "II", "are", "color", "-", "coded", "and", "labelled", "on", "the", "top", "of", "the", "charts", ".", "Changes", "in", "the", "speed", "of", "all", "chromosomes", "observed", "for", "the", "oocyte", "from", "Fig", "1", ".", "Chromosome", "parameters", "are", "shown", "in", "A", "-", "C", "on", "the", "vertical", "axis", ",", "and", "time", "after", "anaphase", "I", "onset", "is", "shown", "in", "min", "on", "the", "horizontal", "axis", ".", "Thin", "grey", "lines", "in", "A", "-", "C", "represent", "individual", "chromosomes", ";", "the", "distantly", "observed", "chromosome", "is", "highlighted", "by", "dashed", "line", ";", "the", "mean", "value", "for", "each", "timepoint", "is", "indicated", "by", "thick", "black", "line", ".", "The", "stages", "between", "anaphase", "I", "and", "metaphase", "II", "are", "color", "-", "coded", "and", "labelled", "on", "the", "top", "of", "the", "charts", ".", "On", "the", "schemes", "above", "the", "charts", "in", "(", "A", ")", "and", "(", "C", ")", ",", "chromosomes", "are", "red", "with", "green", "centromeres", ".", "(", "C", ")", "Changes", "in", "inter", "-", "centromere", "distance", "(", "indicated", "on", "a", "scheme", "by", "the", "black", "arrow", ")", ",", "observed", "for", "the", "oocyte", "from", "Fig", "1", ".", "Kinetochore", "-", "MT", "attachments", "at", "the", "prometaphase", "II", "stage", "were", "visualized", "using", "an", "anti", "-", "tubulin", "antibody", "(", "white", ")", ",", "an", "anti", "-", "centromeric", "ACA", "antibody", "(", "green", ")", "and", "DAPI", "to", "label", "chromatin", "(", "red", ")", ".", "The", "image", "represents", "maximum", "intensity", "projection", "through", "all", "z", "-", "planes", "containing", "MTs", ".", "Representative", "chromosomes", "displaying", "syntelic", ",", "amphitelic", "or", "merotelic", "/", "lateral", "attachments", "are", "enclosed", "in", "white", "frames", "and", "their", "enlarged", "single", "z", "-", "plane", "images", "are", "shown", "to", "the", "right", ".", "PB", ":", "polar", "body", ".", "Scale", "bar", ",", "10μm", ".", "Chromosomes", "with", "syntelic", "(", "red", ")", ",", "amphitelic", "(", "green", ")", "and", "merotelic", "/", "lateral", "(", "grey", ")", "attachments", "were", "plotted", "according", "to", "their", "inter", "-", "centromere", "distance", "(", "on", "the", "horizontal", "axis", ")", "and", "distance", "to", "spindle", "equator", "(", "vertical", "axis", ")", ".", "Data", "shown", "for", "156", "chromosomes", "taken", "from", "8", "prometaphase", "II", "oocytes", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Chromosome parameters are shown in A-C on the vertical axis, and time after anaphase I onset is shown in min on the horizontal axis. Thin grey lines in A-C represent individual chromosomes; the distantly observed chromosome is highlighted by dashed line; the mean value for each timepoint is indicated by thick black line. The stages between anaphase I and metaphase II are color-coded and labelled on the top of the charts. On the schemes above the charts in (A) and (C), chromosomes are red with green centromeres. Changes in the distance to the centre for all chromosomes in a representative oocyte undergoing transition from anaphase I to metaphase II from Fig 1. The black arrow on the scheme above the chart indicates chromosome-centre distance.Chromosome parameters are shown in A-C on the vertical axis, and time after anaphase I onset is shown in min on the horizontal axis. Thin grey lines in A-C represent individual chromosomes; the distantly observed chromosome is highlighted by dashed line; the mean value for each timepoint is indicated by thick black line. The stages between anaphase I and metaphase II are color-coded and labelled on the top of the charts. Changes in the speed of all chromosomes observed for the oocyte from Fig 1.Chromosome parameters are shown in A-C on the vertical axis, and time after anaphase I onset is shown in min on the horizontal axis. Thin grey lines in A-C represent individual chromosomes; the distantly observed chromosome is highlighted by dashed line; the mean value for each timepoint is indicated by thick black line. The stages between anaphase I and metaphase II are color-coded and labelled on the top of the charts. On the schemes above the charts in (A) and (C), chromosomes are red with green centromeres. (C) Changes in inter-centromere distance (indicated on a scheme by the black arrow), observed for the oocyte from Fig 1.Kinetochore-MT attachments at the prometaphase II stage were visualized using an anti-tubulin antibody (white), an anti-centromeric ACA antibody (green) and DAPI to label chromatin (red). The image represents maximum intensity projection through all z-planes containing MTs. Representative chromosomes displaying syntelic, amphitelic or merotelic/lateral attachments are enclosed in white frames and their enlarged single z-plane images are shown to the right. PB: polar body. Scale bar, 10μm. Chromosomes with syntelic (red), amphitelic (green) and merotelic/lateral (grey) attachments were plotted according to their inter-centromere distance (on the horizontal axis) and distance to spindle equator (vertical axis). Data shown for 156 chromosomes taken from 8 prometaphase II oocytes."}
{"words": ["Figure", "3Time", "-", "lapse", "imaging", "of", "a", "representative", "MII", "oocyte", "with", "a", "normal", "segregation", "pattern", "(", "i", ".", "e", ".", "all", "20", "chromosomes", "show", "synchronous", "equational", "chromatid", "separation", "at", "anaphase", "onset", ",", "leaving", "no", "chromatids", "behind", "at", "the", "midzone", ")", ",", "expressing", "CENP", "-", "C", "-", "EGFP", "(", "centromeres", ",", "green", ")", "and", "H2B", "-", "mCherry", "(", "chromatin", ",", "red", ")", ".", "Upper", "row", "shows", "maximum", "intensity", "z", "projection", "images", "from", "representative", "timepoints", "at", "metaphase", "II", "and", "anaphase", "II", ".", "Number", "next", "to", "the", "circles", "enclosing", "segregating", "chromatids", "denotes", "amount", "of", "chromatids", "segregated", "to", "each", "of", "the", "poles", ".", "The", "3D", "positions", "of", "centromeres", "are", "shown", "as", "black", "dots", "in", "a", "side", "view", "(", "along", "the", "spindle", "equator", ",", "middle", "row", ")", "and", "top", "view", "(", "perpendicular", "to", "the", "equator", "plane", ",", "bottom", "row", ")", ".", "Tracks", "of", "individual", "centromeres", "are", "color", "-", "coded", "according", "to", "their", "speed", ",", "as", "indicated", "by", "the", "colour", "bar", ".", "Time", "is", "shown", "relative", "to", "anaphase", "II", "onset", "(", "min", ":", "sec", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "5", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Time-lapse imaging of a representative MII oocyte with a normal segregation pattern (i.e. all 20 chromosomes show synchronous equational chromatid separation at anaphase onset, leaving no chromatids behind at the midzone), expressing CENP-C- EGFP (centromeres, green) and H2B-mCherry (chromatin, red). Upper row shows maximum intensity z projection images from representative timepoints at metaphase II and anaphase II. Number next to the circles enclosing segregating chromatids denotes amount of chromatids segregated to each of the poles. The 3D positions of centromeres are shown as black dots in a side view (along the spindle equator, middle row) and top view (perpendicular to the equator plane, bottom row). Tracks of individual centromeres are color-coded according to their speed, as indicated by the colour bar. Time is shown relative to anaphase II onset (min:sec). Scale bars, 5 μm."}
{"words": ["Figure", "4Chromosome", "parameters", "obtained", "for", "a", "representative", "oocyte", "with", "normal", "segregation", "pattern", "are", "shown", "in", "A", "-", "D", "on", "the", "vertical", "axis", ",", "and", "time", "in", "min", "on", "the", "horizontal", "axis", "relative", "to", "the", "anaphase", "II", "onset", ".", "Thin", "grey", "lines", "in", "A", "-", "D", "represent", "individual", "chromosomes", ";", "thick", "black", "line", "in", "C", "-", "D", "shows", "the", "mean", "value", "for", "each", "timepoint", ".", "On", "the", "schemes", "near", "the", "charts", "chromosomes", "are", "red", "with", "green", "centromeres", ";", "spindle", "equator", "in", "A", "and", "spindle", "axis", "in", "B", "-", "C", "are", "indicated", "by", "dashed", "lines", ".", "Changes", "in", "distance", "to", "the", "equator", "plane", "for", "all", "chromosomes", "in", "the", "representative", "oocyte", "with", "normal", "segregation", "pattern", ",", "shown", "in", "Fig", "3", ".", "The", "analysed", "distance", "is", "indicated", "by", "a", "black", "arrowed", "line", "on", "the", "scheme", "above", "the", "chart", ".", "Changes", "in", "distance", "to", "the", "spindle", "axis", "(", "shown", "on", "the", "scheme", "by", "a", "black", "arrowed", "line", ")", "for", "all", "chromosomes", "in", "oocyte", "from", "Fig", "3", ".", "Changes", "in", "chromosome", "orientation", "for", "all", "chromosomes", "in", "oocyte", "from", "Fig", "3", ".", "The", "orientation", "is", "characterized", "by", "the", "angle", "(", "highlighted", "black", ")", "between", "the", "spindle", "axis", "and", "the", "line", "connecting", "the", "sister", "centromeres", "(", "black", "solid", "line", "on", "the", "scheme", ")", ".", "Chromosome", "parameters", "obtained", "for", "a", "representative", "oocyte", "with", "normal", "segregation", "pattern", "are", "shown", "in", "A", "-", "D", "on", "the", "vertical", "axis", ",", "and", "time", "in", "min", "on", "the", "horizontal", "axis", "relative", "to", "the", "anaphase", "II", "onset", ".", "Thin", "grey", "lines", "in", "A", "-", "D", "represent", "individual", "chromosomes", ";", "thick", "black", "line", "in", "C", "-", "D", "shows", "the", "mean", "value", "for", "each", "timepoint", ".", "(", "D", ")", "Changes", "in", "inter", "-", "centromere", "distance", ",", "shown", "on", "the", "scheme", "by", "black", "arrowed", "line", ",", "for", "all", "chromosomes", "in", "oocyte", "from", "Fig", "3", ".", "Kinetochore", "-", "MT", "attachments", "in", "oocytes", "released", "from", "the", "CSF", "-", "dependent", "metaphase", "arrest", "were", "visualized", "using", "an", "anti", "-", "tubulin", "antibody", "(", "white", ")", ",", "an", "anti", "-", "centromeric", "ACA", "antibody", "(", "green", ")", "and", "DAPI", "to", "label", "chromatin", "(", "red", ")", ".", "The", "image", "represents", "maxiumum", "intensity", "projection", "through", "all", "z", "-", "planes", "containing", "MTs", ".", "Single", "z", "-", "planes", "of", "representative", "chromosomes", "displaying", "amphitelic", "or", "merotelic", "/", "lateral", "attachments", "are", "shown", "to", "the", "right", ".", "Scale", "bar", ",", "10μm", ".", "Chromosomes", "with", "amphitelic", "(", "green", ")", "and", "merotelic", "/", "lateral", "(", "grey", ")", "attachments", "were", "plotted", "according", "to", "their", "inter", "-", "centromere", "distance", "(", "on", "the", "horizontal", "axis", ")", "and", "distance", "to", "spindle", "equator", "(", "vertical", "axis", ")", ".", "The", "inter", "-", "centromere", "distance", "in", "fixed", "oocytes", "is", "1", ".", "2", "±", "0", ".", "2", "μm", "for", "amphitelic", "and", "1", ".", "0", "±", "0", ".", "2", "μm", "for", "merotelic", "attachments", "(", "Mean", "±", "SD", ")", ".", "Data", "shown", "for", "95", "chromosomes", "taken", "from", "5", "oocytes", "released", "from", "the", "CSF", "-", "dependent", "metaphase", "II", "arrest", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Chromosome parameters obtained for a representative oocyte with normal segregation pattern are shown in A-D on the vertical axis, and time in min on the horizontal axis relative to the anaphase II onset. Thin grey lines in A-D represent individual chromosomes; thick black line in C-D shows the mean value for each timepoint. On the schemes near the charts chromosomes are red with green centromeres; spindle equator in A and spindle axis in B-C are indicated by dashed lines. Changes in distance to the equator plane for all chromosomes in the representative oocyte with normal segregation pattern, shown in Fig 3. The analysed distance is indicated by a black arrowed line on the scheme above the chart. Changes in distance to the spindle axis (shown on the scheme by a black arrowed line) for all chromosomes in oocyte from Fig 3. Changes in chromosome orientation for all chromosomes in oocyte from Fig 3. The orientation is characterized by the angle (highlighted black) between the spindle axis and the line connecting the sister centromeres (black solid line on the scheme).Chromosome parameters obtained for a representative oocyte with normal segregation pattern are shown in A-D on the vertical axis, and time in min on the horizontal axis relative to the anaphase II onset. Thin grey lines in A-D represent individual chromosomes; thick black line in C-D shows the mean value for each timepoint. (D) Changes in inter-centromere distance, shown on the scheme by black arrowed line, for all chromosomes in oocyte from Fig 3.Kinetochore-MT attachments in oocytes released from the CSF-dependent metaphase arrest were visualized using an anti-tubulin antibody (white), an anti-centromeric ACA antibody (green) and DAPI to label chromatin (red). The image represents maxiumum intensity projection through all z-planes containing MTs. Single z-planes of representative chromosomes displaying amphitelic or merotelic/lateral attachments are shown to the right. Scale bar, 10μm. Chromosomes with amphitelic (green) and merotelic/lateral (grey) attachments were plotted according to their inter-centromere distance (on the horizontal axis) and distance to spindle equator (vertical axis). The inter-centromere distance in fixed oocytes is 1.2±0.2 μm for amphitelic and 1.0±0.2 μm for merotelic attachments (Mean±SD). Data shown for 95 chromosomes taken from 5 oocytes released from the CSF-dependent metaphase II arrest."}
{"words": ["Figure", "5A", "time", "-", "lapse", "imaging", "of", "a", "representative", "MII", "oocyte", "with", "visible", "lagging", "chromatid", "at", "midzone", "during", "anaphase", "II", "expressing", "CENP", "-", "C", "-", "EGFP", "(", "centromeres", ",", "green", ")", "and", "H2B", "-", "mCherry", "(", "chromatin", ",", "red", ")", ".", "Upper", "row", "shows", "maximum", "intensity", "z", "projection", "images", "from", "representative", "timepoints", "at", "metaphase", "II", "and", "anaphase", "II", ".", "A", "lagging", "chromatid", "is", "indicated", "by", "a", "blue", "arrowhead", ".", "Number", "next", "to", "the", "circles", "enclosing", "the", "segregating", "chromatids", "denotes", "number", "of", "chromatids", "at", "each", "pole", ".", "The", "bottom", "row", "depicts", "3D", "positions", "for", "centromeres", "of", "normally", "segregating", "chromosomes", "as", "black", "dots", ",", "and", "centromeres", "of", "laggard", "-", "producing", "chromosome", "as", "red", "dots", "in", "a", "side", "view", "along", "the", "spindle", "equator", ".", "One", "of", "the", "centromeres", "is", "left", "behind", "at", "anaphase", "(", "blue", "arrowhead", ")", ",", "but", "will", "segregate", "equationally", ".", "Tracks", "of", "individual", "centromeres", "are", "color", "-", "coded", "according", "to", "the", "speed", ",", "as", "indicated", "by", "the", "colour", "bar", ".", "Time", "is", "shown", "relative", "to", "anaphase", "II", "onset", "(", "min", ":", "sec", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "5", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A time-lapse imaging of a representative MII oocyte with visible lagging chromatid at midzone during anaphase II expressing CENP-C- EGFP (centromeres, green) and H2B-mCherry (chromatin, red). Upper row shows maximum intensity z projection images from representative timepoints at metaphase II and anaphase II. A lagging chromatid is indicated by a blue arrowhead. Number next to the circles enclosing the segregating chromatids denotes number of chromatids at each pole. The bottom row depicts 3D positions for centromeres of normally segregating chromosomes as black dots, and centromeres of laggard-producing chromosome as red dots in a side view along the spindle equator. One of the centromeres is left behind at anaphase (blue arrowhead), but will segregate equationally. Tracks of individual centromeres are color-coded according to the speed, as indicated by the colour bar. Time is shown relative to anaphase II onset (min:sec). Scale bars, 5 μm."}
{"words": ["Figure", "6Chromosome", "parameters", "obtained", "for", "laggard", "-", "producing", "chromosomes", "are", "shown", "in", "A", "-", "D", "on", "the", "vertical", "axis", ",", "time", "in", "min", "on", "the", "horizontal", "axis", "relative", "to", "the", "anaphase", "II", "onset", ".", "Light", "blue", "lines", "indicate", "12", "laggard", "-", "producing", "chromosomes", "with", "correct", "(", "equational", ")", "chromatid", "segregation", ";", "darker", "line", "highlights", "one", "chromosome", "with", "chromatid", "non", "-", "disjunction", ".", "On", "the", "schemes", "near", "the", "charts", "chromosomes", "are", "red", "with", "green", "centromeres", ";", "spindle", "equator", "in", "A", "and", "spindle", "axis", "in", "B", "-", "C", "are", "indicated", "by", "black", "dashed", "lines", ".", "Changes", "in", "the", "distance", "to", "the", "equator", "plane", "(", "shown", "by", "a", "black", "arrowed", "line", "on", "the", "scheme", ")", "for", "13", "laggard", "-", "producing", "chromosomes", ".", "All", "laggard", "-", "producing", "chromosomes", "are", "positioned", "above", "the", "equator", "at", "the", "start", "of", "analysis", "period", ".", "Black", "dotted", "lines", "indicate", "the", "average", "thickness", "of", "the", "metaphase", "plate", ".", "Changes", "in", "the", "distance", "to", "spindle", "axis", "(", "shown", "by", "a", "black", "arrowed", "line", "on", "the", "scheme", ")", "for", "13", "laggard", "-", "producing", "chromosomes", ".", "Black", "dotted", "line", "indicates", "the", "average", "radius", "of", "the", "metaphase", "plate", ".", "Changes", "in", "the", "angle", "to", "the", "spindle", "axis", "(", "highlighted", "in", "black", "on", "the", "scheme", ")", "for", "13", "laggard", "-", "producing", "chromosomes", ".", "Dashed", "line", "on", "the", "chart", "indicates", "the", "mean", "angle", "for", "normally", "segregating", "chromosomes", ".", "Changes", "in", "the", "inter", "-", "centromere", "distances", "(", "shown", "by", "black", "arrowed", "line", "on", "the", "scheme", ")", "for", "13", "laggard", "-", "producing", "chromosomes", ".", "Dashed", "line", "indicates", "the", "mean", "inter", "-", "centromere", "distance", "for", "normally", "segregating", "chromosomes", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Chromosome parameters obtained for laggard-producing chromosomes are shown in A-D on the vertical axis, time in min on the horizontal axis relative to the anaphase II onset. Light blue lines indicate 12 laggard-producing chromosomes with correct (equational) chromatid segregation; darker line highlights one chromosome with chromatid non-disjunction. On the schemes near the charts chromosomes are red with green centromeres; spindle equator in A and spindle axis in B-C are indicated by black dashed lines. Changes in the distance to the equator plane (shown by a black arrowed line on the scheme) for 13 laggard-producing chromosomes. All laggard-producing chromosomes are positioned above the equator at the start of analysis period. Black dotted lines indicate the average thickness of the metaphase plate. Changes in the distance to spindle axis (shown by a black arrowed line on the scheme) for 13 laggard-producing chromosomes. Black dotted line indicates the average radius of the metaphase plate. Changes in the angle to the spindle axis (highlighted in black on the scheme) for 13 laggard-producing chromosomes. Dashed line on the chart indicates the mean angle for normally segregating chromosomes. Changes in the inter-centromere distances (shown by black arrowed line on the scheme) for 13 laggard-producing chromosomes. Dashed line indicates the mean inter-centromere distance for normally segregating chromosomes."}
{"words": ["f1", "(", "a", ")", "RT", "-", "PCR", "analysis", "of", "LC3", ",", "IL", "-", "8", ",", "CHOP", "and", "GADD34", "in", "U2OS", "cells", "subjected", "to", "glutamine", "deprivation", "(", "−", "Q", ")", "or", "exposed", "to", "TPG", "(", "1", "μM", ")", ".", "(", "(", "b", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "ER", "stress", "-", "and", "autophagy", "-", "related", "proteins", "in", "U2OS", "cells", "subjected", "to", "glutamine", "deprivation", "or", "TPG", "treatment", ".", "Samples", "are", "run", "in", "triplicate", ".", "(", "c", ")", "Cytokine", "array", "analysis", "of", "conditioned", "media", "from", "U2OS", "and", "A549", "cells", "grown", "in", "the", "presence", "(", "+", "Q", ")", "or", "absence", "(", "−", "Q", ")", "of", "glutamine", ".", "(", "d", ")", "IL", "-", "8", "enzyme", "-", "linked", "immunosorbent", "assay", "of", "conditioned", "media", "from", "U2OS", "and", "A549", "cells", "grown", "in", "the", "presence", "(", "+", "Q", ")", "or", "absence", "(", "−", "Q", ")", "of", "glutamine", ".", "Error", "bars", "in", "all", "figures", "represent", "s", ".", "d", ".", "of", "three", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f1(a) RT-PCR analysis of LC3, IL-8, CHOP and GADD34 in U2OS cells subjected to glutamine deprivation (−Q) or exposed to TPG (1 μM). ((b) Immunoblot analysis of ER stress- and autophagy-related proteins in U2OS cells subjected to glutamine deprivation or TPG treatment. Samples are run in triplicate.(c) Cytokine array analysis of conditioned media from U2OS and A549 cells grown in the presence (+Q) or absence (−Q) of glutamine.(d) IL-8 enzyme-linked immunosorbent assay of conditioned media from U2OS and A549 cells grown in the presence (+Q) or absence (−Q) of glutamine. Error bars in all figures represent s.d. of three biological replicates."}
{"words": ["f2", "(", "a", ")", "Autophagosomes", "were", "visualized", "in", "U2OS", "cells", "stably", "expressing", "a", "GFP", "-", "LC3", "reporter", "construct", ".", "GFP", "-", "labelled", "puncta", "were", "examined", "after", "24", " ", "h", "in", "the", "presence", "(", "+", "Q", ")", "or", "absence", "(", "−", "Q", ")", "of", "glutamine", ",", "with", "or", "without", "co", "-", "addition", "of", "100", " ", "nM", "CCI", "-", "779", "(", "CCI", ")", "and", "400", " ", "nM", "BafA1", ".", "Scale", "bar", ",", "10", " ", "μm", ".", "(", "b", ")", "Graphical", "summary", "of", "experiments", "performed", "as", "described", "in", "a", ".", "Percentage", "of", "cells", "with", ">", "10", "puncta", "per", "cell", "from", "three", "independent", "experiments", "is", "depicted", ".", "Bars", "represent", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "from", "three", "independent", "experiments", "(", ">", "50", "cells", "per", "experiment", ")", ".", "The", "statistical", "significance", "(", "P", "value", ")", "was", "determined", "by", "a", "two", "-", "tailed", ",", "paired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "P0", ".", "05", ".", "(", "c", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "U2OS", "cells", "subjected", "to", "glutamine", "deprivation", "with", "or", "without", "400", " ", "nM", "BafA1", ".", "Cells", "were", "pretreated", "with", "BafA1", "for", "1", " ", "h", "before", "and", "during", "exposure", "to", "glutamine", "-", "deficient", "medium", ".", "Autophagic", "activity", "was", "monitored", "by", "detection", "of", "p62", "and", "LC3", "-", "II", "proteins", ".", "d", ")", "U2OS", "mCherry", "-", "GFP", "-", "LC3", "cells", "were", "cultured", "in", "the", "presence", "(", "+", "Q", ")", "or", "absence", "(", "−", "Q", ")", "of", "glutamine", "for", "18", " ", "h", ".", "Red", "vesicles", "denote", "autolysosomes", ",", "whereas", "yellow", "vesicles", "represent", "autophagosomes", ".", "Bars", "indicate", "numbers", "of", "yellow", "vesicles", "(", "autophagosomes", ")", "or", "red", "vesicles", "(", "autolysosomes", ")", "per", "cell", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "e", ")", "Images", "of", "U2OS", "mCherry", "-", "GFP", "-", "LC3", "cells", "cultured", "for", "18", " ", "h", "in", "the", "presence", "(", "+", "Q", ")", "or", "absence", "(", "−", "Q", ")", "of", "glutamine", ".", "Scale", "bar", ",", "10", " ", "μm", ".", "(", "f", ")", "Phagophore", "formation", "in", "mCherry", "-", "ULK1", ".", "Scale", "bar", ",", "10", " ", "μm", ".", "(", "g", ")", "mCherry", "-", "ATG5", "-", "expressing", "U2OS", "cells", "after", "24", " ", "h", "in", "the", "presence", "(", "+", "Q", ")", "or", "absence", "(", "−", "Q", ")", "of", "glutamine", ".", "Scale", "bar", ",", "10", " ", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f2(a) Autophagosomes were visualized in U2OS cells stably expressing a GFP-LC3 reporter construct. GFP-labelled puncta were examined after 24 h in the presence (+Q) or absence (−Q) of glutamine, with or without co-addition of 100 nM CCI-779 (CCI) and 400 nM BafA1. Scale bar, 10 μm. (b) Graphical summary of experiments performed as described in a. Percentage of cells with >10 puncta per cell from three independent experiments is depicted. Bars represent mean±s.d. from three independent experiments (>50 cells per experiment). The statistical significance (P value) was determined by a two-tailed, paired Student's t-test. *P0.05.(c) Immunoblot analysis of U2OS cells subjected to glutamine deprivation with or without 400 nM BafA1. Cells were pretreated with BafA1 for 1 h before and during exposure to glutamine-deficient medium. Autophagic activity was monitored by detection of p62 and LC3-II proteins.d) U2OS mCherry-GFP-LC3 cells were cultured in the presence (+Q) or absence (−Q) of glutamine for 18 h. Red vesicles denote autolysosomes, whereas yellow vesicles represent autophagosomes. Bars indicate numbers of yellow vesicles (autophagosomes) or red vesicles (autolysosomes) per cell±s.d. (e) Images of U2OS mCherry-GFP-LC3 cells cultured for 18 h in the presence (+Q) or absence (−Q) of glutamine. Scale bar, 10 μm.(f) Phagophore formation in mCherry-ULK1. Scale bar, 10 μm. (g) mCherry-ATG5-expressing U2OS cells after 24 h in the presence (+Q) or absence (−Q) of glutamine. Scale bar, 10 μm."}
{"words": ["f3", "(", "a", ")", "Colocalization", "of", "lysosomes", "(", "Lysotracker", "Green", ")", "with", "phagophores", "(", "mCherry", "-", "ULK1", "and", "mCherry", "-", "glutamine", "puncta", ")", "in", "glutamine", "-", "deprived", "U2OS", "cells", ".", "Scale", "bar", ",", "25", " ", "μm", ".", "(", "b", ")", "Colocalization", "of", "LAMP1", "-", "positive", "lysosomes", "with", "GFP", "-", "LC3", "-", "labelled", "autophagosomes", "after", "glutamine", "deprivation", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "400", " ", "nM", "BafA1", "in", "U2OS", "cells", ".", "Scale", "bar", ",", "15", " ", "μm", ".", "(", "c", ")", "Immunofluorescence", "images", "of", "U2OS", "cells", "stained", "for", "p62", "expression", "and", "LAMP1", "following", "glutamine", "deprivation", "and", "BafA1", "treatment", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", ".", "Scale", "bar", ",", "15", " ", "μm", ".", "(", "d", ")", "Immunofluorescence", "images", "of", "cells", "stained", "with", "LAMP1", "(", "lysosomes", ")", "and", "the", "Golgi", "marker", ",", "RCAS1", ",", "following", "glutamine", "deprivation", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", ".", "Scale", "bar", ",", "15", " ", "μm", ".", "(", "e", ")", "U2OS", "cells", "were", "treated", "for", "24", " ", "h", "with", "cell", "culture", "medium", "containing", "the", "indicated", "amino", "acids", ".", "Cell", "lysates", "were", "immunoblotted", "to", "detect", "changes", "in", "S6K", "phosphorylation", "and", "p62", ".", "(", "(", "f", ")", "Immunofluorescence", "staining", "for", "LAMP1", "(", "green", ")", "and", "mTOR", "(", "red", ")", "in", "U2OS", "cells", "subjected", "to", "glutamine", "deprivation", "(", "24", "h", ")", ",", "in", "the", "presence", "of", "100", " ", "nM", "WYE", "-", "125132", "(", "WYE", "-", "132", ")", ".", "−", "AA", "denotes", "cells", "deprived", "of", "all", "amino", "acids", ".", "Scale", "bar", ",", "15", " ", "μm", ".", "Error", "bars", "in", "all", "figures", "represent", "s", ".", "d", ".", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "Ess", ".", ",", "essential", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f3(a) Colocalization of lysosomes (Lysotracker Green) with phagophores (mCherry-ULK1 and mCherry-glutamine puncta) in glutamine-deprived U2OS cells. Scale bar, 25 μm.(b) Colocalization of LAMP1-positive lysosomes with GFP-LC3-labelled autophagosomes after glutamine deprivation in the absence or presence of 400 nM BafA1 in U2OS cells. Scale bar, 15 μm.(c) Immunofluorescence images of U2OS cells stained for p62 expression and LAMP1 following glutamine deprivation and BafA1 treatment. Nuclei were stained with DAPI. Scale bar, 15 μm.(d) Immunofluorescence images of cells stained with LAMP1 (lysosomes) and the Golgi marker, RCAS1, following glutamine deprivation. Nuclei were stained with DAPI. Scale bar, 15 μm.(e) U2OS cells were treated for 24 h with cell culture medium containing the indicated amino acids. Cell lysates were immunoblotted to detect changes in S6K phosphorylation and p62. ((f) Immunofluorescence staining for LAMP1 (green) and mTOR (red) in U2OS cells subjected to glutamine deprivation (24 h), in the presence of 100 nM WYE-125132 (WYE-132). −AA denotes cells deprived of all amino acids. Scale bar, 15 μm. Error bars in all figures represent s.d. of three biological replicates. Ess., essential."}
{"words": ["f4", "(", "a", ")", "Immunoblot", "of", "autophagy", "-", "related", "proteins", "in", "U2OS", "cells", "expressing", "a", "control", "TALEN", "(", "U2OS", "-", "TAL2", "-", "C1", ")", "or", "two", "independent", "subcloned", "TALEN", "cell", "lines", "targeting", "ATG7", "(", "U2OS", "-", "TAL2", "-", "A7", ",", "U2OS", "-", "TAL2", "-", "A8", ")", ".", "p62", "long", "and", "short", "refer", "to", "either", "long", "or", "short", "exposure", "times", "during", "film", "development", ".", "(", "b", ")", "U2OS", "cells", "expressing", "an", "ATG7", "-", "TALEN", "(", "TAL2", "-", "ATG7", ")", "or", "control", "TALEN", "(", "TAL2", "-", "CTL", ")", "were", "subjected", "to", "glutamine", "starvation", "for", "6", "days", "followed", "by", "6", "days", "recovery", "in", "glutamine", "-", "replete", "medium", ".", "Cells", "were", "then", "stained", "with", "SRB", "and", "absorbance", "was", "read", "at", "540", " ", "nM", ".", "Graph", "shows", "average", "results", "from", "five", "clonal", "sub", "-", "lines", "for", "each", "condition", ".", "The", "statistical", "significance", "(", "P", "value", ")", "was", "determined", "by", "a", "two", "-", "tailed", ",", "paired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "P0", ".", "05", ".", "(", "c", ")", "Representative", "images", "of", "SRB", "-", "stained", "clones", "in", "bd", ")", "IL", "-", "8", "enzyme", "-", "linked", "immunosorbent", "assay", "(", "ELISA", ")", "of", "U2OS", "-", "TAL2", "-", "CTL", "-", "C1", "(", "control", ")", "and", "U2OS", "-", "TAL2", "-", "ATG7", "-", "A8", "(", "ATG7", "knockout", ")", "following", "24", "h", "glutamine", "deprivation", ".", "(", "e", ")", "IL", "-", "8", "U2OS", "of", "U2OS", "parental", "cells", "starved", "of", "glutamine", "for", "the", "indicated", "times", "with", "or", "without", "BafA1", ".", "Error", "bars", "in", "all", "figures", "represent", "s", ".", "d", ".", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "OD", ",", "optical", "density", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f4(a) Immunoblot of autophagy-related proteins in U2OS cells expressing a control TALEN (U2OS-TAL2-C1) or two independent subcloned TALEN cell lines targeting ATG7 (U2OS-TAL2-A7, U2OS-TAL2-A8). p62 long and short refer to either long or short exposure times during film development.(b) U2OS cells expressing an ATG7-TALEN (TAL2-ATG7) or control TALEN (TAL2-CTL) were subjected to glutamine starvation for 6 days followed by 6 days recovery in glutamine-replete medium. Cells were then stained with SRB and absorbance was read at 540 nM. Graph shows average results from five clonal sub-lines for each condition. The statistical significance (P value) was determined by a two-tailed, paired Student's t-test. P0.05. (c) Representative images of SRB-stained clones in bd) IL-8 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of U2OS-TAL2-CTL-C1 (control) and U2OS-TAL2-ATG7-A8 (ATG7 knockout) following 24 h glutamine deprivation.(e) IL-8 U2OS of U2OS parental cells starved of glutamine for the indicated times with or without BafA1. Error bars in all figures represent s.d. of three biological replicates. OD, optical density."}
{"words": ["f5", "(", "a", ")", "immunofluorescence", "microscopy", "images", "of", "U2OS", "cells", "stained", "for", "LAMP1", "and", "the", "Golgi", "marker", "RCAS1", "after", "24", " ", "h", "glutamine", "deprivation", "with", "or", "without", "treatment", "with", "1", " ", "μM", "BrefA", "or", "100", " ", "nM", "WYE", "-", "125132", ".", "Scale", "bar", ",", "15", " ", "μm", ".", "(", "b", ")", "Cytokine", "array", "analysis", "of", "conditioned", "medium", "from", "U2OS", "cells", "subjected", "to", "glutamine", "deprivation", "in", "the", "presence", "of", "1", " ", "μM", "BrefA", "or", "100", " ", "nM", "WYE", "-", "125132", ".", "(", "c", ")", "IL", "-", "8", "enzyme", "-", "linked", "immunosorbent", "assay", "in", "U2OS", "cells", "after", "24", " ", "h", "glutamine", "deprivation", "with", "or", "without", "CCI", "-", "779", "or", "WYE", "-", "125132", ".", "(", "d", ")", "RT", "-", "PCR", "analysis", "of", "IL", "-", "8", "mRNA", "expression", "in", "U2OS", "cells", "after", "24", " ", "h", "glutamine", "deprivation", "with", "or", "without", "CCI", "-", "779", "or", "WYE", "-", "125132", ".", "Error", "bars", "in", "all", "figures", "represent", "s", ".", "d", ".", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "OD", ",", "optical", "density", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f5(a) immunofluorescence microscopy images of U2OS cells stained for LAMP1 and the Golgi marker RCAS1 after 24 h glutamine deprivation with or without treatment with 1 μM BrefA or 100 nM WYE-125132. Scale bar, 15 μm.(b) Cytokine array analysis of conditioned medium from U2OS cells subjected to glutamine deprivation in the presence of 1 μM BrefA or 100 nM WYE-125132.(c) IL-8 enzyme-linked immunosorbent assay in U2OS cells after 24 h glutamine deprivation with or without CCI-779 or WYE-125132.(d) RT-PCR analysis of IL-8 mRNA expression in U2OS cells after 24 h glutamine deprivation with or without CCI-779 or WYE-125132. Error bars in all figures represent s.d. of three biological replicates. OD, optical density."}
{"words": ["f6", "(", "a", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "autophagy", ",", "ER", "stress", "-", "and", "mTOR", "-", "related", "proteins", ",", "and", "JNK", "in", "U2OS", "cells", "after", "24", " ", "h", "glutamine", "deprivation", "with", "or", "without", "CCI", "-", "779", ".", "(", "b", ")", "RT", "-", "PCR", "analysis", "of", "IL", "-", "8", "mRNA", "expression", "in", "U2OS", "cells", "transfected", "with", "two", "different", "siRNAs", "targeting", "JNK", "(", "JNK", "#", "1", "and", "JNK", "#", "2", ")", "and", "subjected", "to", "24", " ", "h", "glutamine", "deprivation", ".", "(", "c", ")", "IL", "-", "8", "enzyme", "-", "linked", "immunosorbent", "assay", "(", "ELISA", ")", "of", "conditioned", "media", "from", "the", "experiment", "described", "in", "b", ".", "(", "d", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "JNK", "protein", "expression", "in", "JNK", "siRNA", "-", "treated", "cells", ".", "e", ")", "RT", "-", "PCR", "analysis", "of", "IL", "-", "8", "expression", "in", "U2OS", "cells", "after", "24", " ", "h", "glutamine", "deprivation", "with", "or", "without", "the", "JNK", "inhibitor", "SP600125", "(", "JNKi", ")", ".", "(", "f", ")", "IL", "-", "8", "ELISA", "of", "conditioned", "medium", "from", "the", "experiment", "described", "in", "e", ".", "(", "g", ")", "IL", "-", "8", "ELISA", "of", "U2OS", "cells", "transfected", "with", "two", "different", "siRNAs", "targeting", "IRE1", "(", "IRE", "-", "A", "and", "IRE", "-", "B", ")", "and", "subjected", "to", "glutamine", "deprivation", "for", "24", " ", "h", ".", "(", "h", ")", "RT", "-", "PCR", "analysis", "of", "IL", "-", "8", "mRNA", "expression", "from", "experiment", "described", "in", "g", ".", "(", "i", ")", "RT", "-", "PCR", "analysis", "of", "CHOP", "mRNA", "expression", "from", "experiment", "described", "in", "g", ".", "(", "j", ")", "RT", "-", "PCR", "analysis", "of", "IRE1", "mRNA", "expression", "from", "experiment", "described", "in", "g", ".", "(", "k", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "experiment", "described", "in", "g", "showing", "phosphorylation", "of", "JNK", ".", "Error", "bars", "in", "all", "figures", "represent", "s", ".", "d", ".", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "OD", ",", "optical", "density", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f6(a) Immunoblot analysis of autophagy, ER stress- and mTOR-related proteins, and JNK in U2OS cells after 24 h glutamine deprivation with or without CCI-779.(b) RT-PCR analysis of IL-8 mRNA expression in U2OS cells transfected with two different siRNAs targeting JNK (JNK #1 and JNK #2) and subjected to 24 h glutamine deprivation.(c) IL-8 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) of conditioned media from the experiment described in b.(d) Immunoblot analysis of JNK protein expression in JNK siRNA-treated cells.e) RT-PCR analysis of IL-8 expression in U2OS cells after 24 h glutamine deprivation with or without the JNK inhibitor SP600125 (JNKi).(f) IL-8 ELISA of conditioned medium from the experiment described in e.(g) IL-8 ELISA of U2OS cells transfected with two different siRNAs targeting IRE1 (IRE-A and IRE-B) and subjected to glutamine deprivation for 24 h.(h) RT-PCR analysis of IL-8 mRNA expression from experiment described in g. (i) RT-PCR analysis of CHOP mRNA expression from experiment described in g. (j) RT-PCR analysis of IRE1 mRNA expression from experiment described in g.(k) Immunoblot analysis of experiment described in g showing phosphorylation of JNK. Error bars in all figures represent s.d. of three biological replicates. OD, optical density."}
{"words": ["f7", "(", "a", ")", "IL", "-", "8", "enzyme", "-", "linked", "immunosorbent", "assay", "(", "ELISA", ")", "on", "U2OS", "cells", "starved", "of", "glutamine", "or", "treated", "with", "BPTES", "(", "10", " ", "μM", ")", "for", "24", " ", "h", ".", "(", "b", ")", "RT", "-", "PCR", "analysis", "of", "IL", "-", "8", "and", "CHOP", "mRNA", "expression", "in", "U2OS", "cells", "starved", "of", "glutamine", "for", "24", " ", "h", "and", "co", "-", "treated", "with", "DMαKG", ".", "(", "c", ")", "Metabolite", "analysis", "of", "U2OS", "cells", "starved", "of", "glutamine", ",", "treated", "with", "BPTES", "or", "glutamine", "-", "starved", "co", "-", "treated", "with", "DMαKG", ".", "(", "d", ")", "IL", "-", "8", "ELISA", "of", "U2OS", "cells", "starved", "of", "glutamine", "or", "treated", "with", "BPTES", "for", "24", " ", "h", "and", "co", "-", "treated", "with", "DMαKG", ".", "(", "e", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "pS6K", "and", "pJNK", "in", "U2OS", "cells", "starved", "of", "glutamine", "for", "24", " ", "h", "and", "co", "-", "treated", "with", "DMαKG", ".", "Error", "bars", "in", "all", "figures", "represent", "s", ".", "d", ".", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "OD", ",", "optical", "density", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f7(a) IL-8 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) on U2OS cells starved of glutamine or treated with BPTES (10 μM) for 24 h.(b) RT-PCR analysis of IL-8 and CHOP mRNA expression in U2OS cells starved of glutamine for 24 h and co-treated with DMαKG.(c) Metabolite analysis of U2OS cells starved of glutamine, treated with BPTES or glutamine-starved co-treated with DMαKG.(d) IL-8 ELISA of U2OS cells starved of glutamine or treated with BPTES for 24 h and co-treated with DMαKG.(e) Immunoblot analysis of pS6K and pJNK in U2OS cells starved of glutamine for 24 h and co-treated with DMαKG. Error bars in all figures represent s.d. of three biological replicates. OD, optical density."}
{"words": ["Figure", "2Representative", "density", "plots", "of", "Ca2", "+", "flux", "from", "conjugated", "OptoCAR", "‑", "T", "cells", "over", "time", "at", "37ºC", ".", "Conjugated", "cells", "were", "stimulated", "with", "dimerizer", "addition", "for", "0", "(", "F", ")", ",", "5", "(", "G", ")", ",", "10", "(", "H", ")", ",", "15", "(", "I", ")", "or", "30", "(", "J", ")", "minutes", "prior", "to", "disrupting", "signaling", "by", "illuminating", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Representative density plots of Ca2+ flux from conjugated OptoCAR‑T cells over time at 37ºC. Conjugated cells were stimulated with dimerizer addition for 0 (F), 5 (G), 10 (H), 15 (I) or 30 (J) minutes prior to disrupting signaling by illuminating cells."}
{"words": ["Figure", "3OptoCAR", "‑", "T", "cells", "were", "conjugated", "with", "ligand", "-", "presenting", "cells", "and", "activated", "as", "in", "the", "upper", "regime", "shown", "in", "(", "A", ")", ".", "The", "median", "of", "ppERK", "intensity", "distribution", "was", "plotted", "with", "time", ",", "after", "subtraction", "of", "background", "intensity", ".", "Bars", "show", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "An", "equivalent", "experiment", "was", "performed", "as", "in", "(", "B", ")", "but", "following", "the", "middle", "regime", "shown", "in", "(", "A", ")", ",", "with", "sample", "illumination", "after", "5", "minutes", "for", "the", "remainder", "of", "the", "dataset", ".", "Indicated", "half", "-", "life", "was", "calculated", "from", "the", "time", "taken", "for", "the", "median", "ppERK", "to", "decrease", "to", "50", "%", "of", "maximum", ".", "Bars", "show", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "An", "equivalent", "experiment", "was", "performed", "as", "in", "(", "B", ")", "but", "following", "the", "lower", "regime", "shown", "in", "(", "A", ")", ",", "with", "sample", "illumination", "after", "5", "minutes", "for", "3", "minutes", ".", "Bars", "show", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3OptoCAR‑T cells were conjugated with ligand-presenting cells and activated as in the upper regime shown in (A). The median of ppERK intensity distribution was plotted with time, after subtraction of background intensity. Bars show mean ± SEM (n=3). An equivalent experiment was performed as in (B) but following the middle regime shown in (A), with sample illumination after 5 minutes for the remainder of the dataset. Indicated half-life was calculated from the time taken for the median ppERK to decrease to 50% of maximum. Bars show mean ± SEM (n=4). An equivalent experiment was performed as in (B) but following the lower regime shown in (A), with sample illumination after 5 minutes for 3 minutes. Bars show mean ± SEM (n=3)."}
{"words": ["Figure", "4Representative", "fluorescent", "Western", "blot", "showing", "the", "dynamics", "of", "FOS", "phosphorylation", "(", "p", "-", "FOSS32", ")", "on", "light", "-", "modulated", "control", ".", "Conjugated", "OptoCAR", "‑", "T", "cells", "were", "stimulated", "for", "a", "defined", "period", "after", "dimerizer", "addition", "(", "denoted", "above", "blots", ")", "before", "either", "being", "left", "in", "the", "dark", "(", "dark", "line", ")", "or", "illuminated", "(", "blue", "line", ")", ".", "Full", "blot", "image", "with", "total", "protein", "normalization", "control", "shown", "in", "Figure", "EV3A", ".", "Representative", "fluorescent", "Western", "blot", "showing", "the", "dynamics", "of", "FOS", "expression", "(", "FOSTotal", ")", "on", "light", "-", "modulated", "control", ",", "from", "the", "same", "dataset", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "Full", "blot", "image", "with", "total", "protein", "normalization", "control", "shown", "in", "Figure", "EV3B", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Representative fluorescent Western blot showing the dynamics of FOS phosphorylation (p-FOSS32) on light-modulated control. Conjugated OptoCAR‑T cells were stimulated for a defined period after dimerizer addition (denoted above blots) before either being left in the dark (dark line) or illuminated (blue line). Full blot image with total protein normalization control shown in Figure EV3A. Representative fluorescent Western blot showing the dynamics of FOS expression (FOSTotal) on light-modulated control, from the same dataset as in (A). Full blot image with total protein normalization control shown in Figure EV3B."}
{"words": ["Figure", "5RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "relative", "mRNA", "levels", "for", "four", "representative", "genes", "following", "OptoCAR", "-", "mediated", "T", "cell", "activation", ".", "OptoCAR", "‑", "T", "cell", "conjugates", "were", "activated", "in", "the", "dark", "(", "signaling", "competent", ")", "state", "for", "a", "period", "of", "3", "hours", "before", "light", "-", "mediated", "disruption", "of", "signaling", "(", "open", "circles", ")", "or", "maintained", "for", "a", "further", "60", "minutes", "in", "the", "dark", "(", "filled", "circles", ")", ".", "The", "relative", "mRNA", "values", "were", "calculated", "by", "subtracting", "baseline", "value", "before", "scaling", "to", "mean", "output", "between", "3", "-", "4", "hours", ".", "Individual", "datasets", "are", "presented", "as", "gray", "lines", ",", "with", "bars", "showing", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Raw", "cRQ", "plots", "for", "all", "datasets", "are", "provided", "in", "Appendix", "Fig", "S2", "and", "RQ", "values", "can", "be", "found", "in", "Dataset", "EV1", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5RT-qPCR analysis of relative mRNA levels for four representative genes following OptoCAR-mediated T cell activation. OptoCAR‑T cell conjugates were activated in the dark (signaling competent) state for a period of 3 hours before light-mediated disruption of signaling (open circles) or maintained for a further 60 minutes in the dark (filled circles). The relative mRNA values were calculated by subtracting baseline value before scaling to mean output between 3-4 hours. Individual datasets are presented as gray lines, with bars showing mean ± SEM (n=3). Raw cRQ plots for all datasets are provided in Appendix Fig S2 and RQ values can be found in Dataset EV1."}
{"words": ["Figure", "6Single", "pulses", "of", "varying", "duration", "were", "applied", "to", "OptoCAR", "‑", "T", "cells", "and", "the", "geometric", "mean", "of", "GFP", "expression", "was", "measured", "for", "all", "pulse", "lengths", "24", "hours", "after", "initiation", "of", "signaling", ",", "with", "illumination", "started", "once", "the", "signal", "pulse", "had", "ended", ".", "All", "values", "have", "been", "corrected", "for", "background", "GFP", "fluorescence", "from", "non", "-", "activated", "OptoCAR", "‑", "T", "cells", "and", "shown", "relative", "to", "the", "output", "at", "24", "hours", ".", "A", "representative", "dataset", "is", "provided", "in", "Figure", "EV4F", ".", "Bars", "show", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "3", ")", "Equivalent", "datasets", "as", "in", "(", "B", ")", "for", "the", "geometric", "mean", "of", "CD69", "upregulation", ".", "A", "representative", "dataset", "is", "provided", "in", "Figure", "EV4F", ".", "Bars", "show", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "3", ")"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Single pulses of varying duration were applied to OptoCAR‑T cells and the geometric mean of GFP expression was measured for all pulse lengths 24 hours after initiation of signaling, with illumination started once the signal pulse had ended. All values have been corrected for background GFP fluorescence from non-activated OptoCAR‑T cells and shown relative to the output at 24 hours. A representative dataset is provided in Figure EV4F. Bars show mean ± SEM (n=3) Equivalent datasets as in (B) for the geometric mean of CD69 upregulation. A representative dataset is provided in Figure EV4F. Bars show mean ± SEM (n=3)"}
{"words": ["Figure", "7The", "cRQ", "values", "from", "RT", "-", "qPCR", "of", "indicated", "cells", ".", "Total", "RNA", "was", "extracted", "and", "CD137", "mRNA", "levels", "measured", "relative", "to", "that", "from", "HEK293T", "cells", ".", "Conjugated", "OptoCARCD19", "‑", "T", "cells", "were", "also", "assayed", "either", "before", "or", "after", "24", "hours", "stimulation", "in", "the", "dark", "state", ".", "Individual", "values", "from", "three", "biological", "replicates", "are", "shown", ",", "with", "mean", "depicted", "by", "bar", "plot", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7The cRQ values from RT-qPCR of indicated cells. Total RNA was extracted and CD137 mRNA levels measured relative to that from HEK293T cells. Conjugated OptoCARCD19‑T cells were also assayed either before or after 24 hours stimulation in the dark state. Individual values from three biological replicates are shown, with mean depicted by bar plot."}
{"words": ["Figure", "2Determination", "of", "maximum", "growth", "rate", "(", "Vmax", ")", "using", "a", "label", "-", "free", "cell", "count", "-", "based", "proliferation", "assay", ".", "Representative", "growth", "curves", "of", "WT", "and", "NUP58", "mutant", "clone", "F", "are", "plotted", "using", "a", "semi", "-", "log", "scale", "displaying", "total", "numbers", "of", "cells", "over", "time", ".", "Growth", "rates", "were", "calculated", "across", "the", "entire", "duration", "of", "the", "experiment", "using", "a", "sliding", "window", "of", "three", "timepoints", ".", "Western", "blot", "for", "NUP58", "protein", "expression", "in", "mutant", "clones", "(", "B", "-", "E", ")", "and", "control", "cells", "(", "clone", "A", "and", "WT", ")", ".", "Whole", "-", "cell", "lysate", "hybridized", "with", "customized", "antibody", "1", "(", "Ab1", ",", "top", "panel", ")", "and", "antibody", "2", "(", "Ab2", ",", "bottom", "panel", ")", ".", "Actin", "was", "used", "as", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Determination of maximum growth rate (Vmax) using a label-free cell count-based proliferation assay. Representative growth curves of WT and NUP58 mutant clone F are plotted using a semi-log scale displaying total numbers of cells over time. Growth rates were calculated across the entire duration of the experiment using a sliding window of three timepoints.Western blot for NUP58 protein expression in mutant clones (B-E) and control cells (clone A and WT). Whole-cell lysate hybridized with customized antibody 1 (Ab1, top panel) and antibody 2 (Ab2, bottom panel). Actin was used as loading control."}
{"words": ["Figure", "3Representation", "of", "the", "highest", "growth", "rates", "(", "Vmax", ")", "for", "each", "technical", "replicate", "for", "each", "indicated", "cell", "line", ".", "Each", "dot", "represents", "a", "technical", "replicate", "(", "WT", "n", "=", "35", ",", "C1", "n", "=", "27", ",", "C2", "n", "=", "28", ",", "C3", "n", "=", "34", ",", "C4", "n", "=", "32", ",", "C5", "n", "=", "35", ",", "C6", "n", "=", "38", ")", "of", "one", "independent", "experimental", "replicate", "performed", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Representation of the highest growth rates (Vmax) for each technical replicate for each indicated cell line. Each dot represents a technical replicate (WT n=35, C1 n=27, C2 n=28, C3 n=34, C4 n=32, C5 n=35, C6 n=38) of one independent experimental replicate performed."}
{"words": ["Figure", "4Western", "blot", "for", "NUP58", "protein", "expression", "in", "mutant", "clones", "and", "control", "cells", ".", "Whole", "-", "cell", "lysate", "hybridized", "with", "customized", "antibody", "1", "(", "Ab1", ",", "top", "panel", ")", "and", "antibody", "2", "(", "Ab2", ",", "bottom", "panel", ")", ".", "Blots", "were", "loaded", "with", "wild", "-", "type", "HAP1", "cell", "line", "(", "WT", ")", ",", "empty", "vector", "(", "EV", ")", ",", "non", "-", "targeting", "siRNA", "(", "siNT", ")", "and", "NUP58", "targeting", "siRNA", "(", "siNUP58", ")", ",", "followed", "by", "NUP58", "mutant", "clones", "(", "C1", "/", "C2", "/", "C3", "/", "C4", "in", "left", "panels", ",", "C5", "/", "C6", "in", "right", "panels", ")", ".", "Actin", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "Asterisks", "indicate", "possible", "NUP58", "alternative", "isoforms", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Western blot for NUP58 protein expression in mutant clones and control cells. Whole-cell lysate hybridized with customized antibody 1 (Ab1, top panel) and antibody 2 (Ab2, bottom panel). Blots were loaded with wild-type HAP1 cell line (WT), empty vector (EV), non-targeting siRNA (siNT) and NUP58 targeting siRNA (siNUP58), followed by NUP58 mutant clones (C1 / C2 / C3 / C4 in left panels, C5 / C6 in right panels). Actin was used as loading control. Asterisks indicate possible NUP58 alternative isoforms."}
{"words": ["Figure", "5Cellular", "viability", "expressed", "as", "number", "of", "viable", "colonies", "following", "Cas9", "-", "induced", "gene", "editing", "of", "NUP58", "in", "WT", "cell", "line", "and", "in", "a", "cell", "line", "stably", "overexpressing", "KPNB1", "-", "KPNA4", "-", "eGFP", "(", "KAPs", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Cellular viability expressed as number of viable colonies following Cas9-induced gene editing of NUP58 in WT cell line and in a cell line stably overexpressing KPNB1-KPNA4-eGFP (KAPs)."}
{"words": ["Figure", "6Improvement", "in", "active", "nuclear", "import", "upon", "cell", "passaging", ".", "Dots", "represent", "analysed", "cells", "(", "WT", "P3", "n", "=", "16", ",", "WT", "P19", "n", "=", "25", ",", "C5", "P1", "n", "=", "24", ",", "C5", "P3", "n", "=", "27", ",", "C5", "P19", "n", "=", "23", ")", "of", "one", "independent", "experimental", "replicate", "performed", ".", "NUP58", "protein", "expression", "in", "C5", "at", "P1", "and", "P19", ".", "Blots", "were", "performed", "using", "Antibody", "1", "(", "Ab1", ",", "top", ")", "or", "Antibody", "2", "(", "Ab2", ",", "bottom", ")", ".", "Actin", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "The", "band", "corresponding", "to", "the", "full", "-", "length", "NUP58", "is", "indicated", "by", "a", "black", "arrow", "with", "possible", "alternative", "isoform", "by", "an", "asterisk", ".", "Cellular", "viability", "following", "Cas9", "-", "induced", "gene", "editing", "of", "native", "NUP58", "(", "left", ")", "or", "NUP85", "(", "right", ")", "in", "WT", "cell", "line", "(", "black", "circles", ")", "and", "in", "a", "cell", "line", "overexpressing", "NUP58", "mutant", "isoform", "(", "grey", "circles", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Improvement in active nuclear import upon cell passaging. Dots represent analysed cells (WT P3 n=16, WT P19 n=25, C5 P1 n=24, C5 P3 n=27, C5 P19 n=23) of one independent experimental replicate performed.NUP58 protein expression in C5 at P1 and P19. Blots were performed using Antibody 1 (Ab1, top) or Antibody 2 (Ab2, bottom). Actin was used as loading control. The band corresponding to the full-length NUP58 is indicated by a black arrow with possible alternative isoform by an asterisk.Cellular viability following Cas9-induced gene editing of native NUP58 (left) or NUP85 (right) in WT cell line (black circles) and in a cell line overexpressing NUP58 mutant isoform (grey circles)."}
{"words": ["Figure", "7Diagram", "at", "the", "top", "represents", "G", "-", "banding", "pattern", "of", "chromosome", "13", "and", "highlights", "chromosome", "locations", "of", "tested", "genes", "(", "NUP58", ",", "GRK1", ",", "ADPRHL1", ")", ".", "Graph", "at", "the", "bottom", "reports", "qPCR", "results", "for", "indicated", "genes", "preformed", "on", "the", "gDNA", "of", "indicated", "samples", "at", "the", "indicated", "passage", "number", ".", "Representative", "images", "of", "NUP58", "gene", "-", "specific", "FISH", "hybridization", "for", "control", "HAP1", "cell", "lines", "(", "WT", "P3", "-", "WT", "P19", ")", "and", "mutant", "C5", "at", "P19", ".", "Each", "dot", "represents", "a", "NUP58", "locus", "of", "cluster", "thereof", ".", "Scale", "bar", ",", "31", ".", "3"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Diagram at the top represents G-banding pattern of chromosome 13 and highlights chromosome locations of tested genes (NUP58, GRK1, ADPRHL1). Graph at the bottom reports qPCR results for indicated genes preformed on the gDNA of indicated samples at the indicated passage number.Representative images of NUP58 gene-specific FISH hybridization for control HAP1 cell lines (WT P3-WT P19) and mutant C5 at P19. Each dot represents a NUP58 locus of cluster thereof. Scale bar, 31.3 μm"}
{"words": ["Figure", "1A", "-", "O", "UAS", ".", "RNAi", "lines", "were", "driven", "with", "eyeless", ".", "Gal4gmr", ".", "Gal4", "for", "expression", "during", "eye", "development", "or", "nubbin", "-", "Gal4", "for", "expression", "during", "wing", "development", ".", "(", "A", ",", "B", ")", "Control", "adult", "Drosophilaeye", "(", "A", ")", "and", "wing", "(", "B", ")", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "α", "-", "spectrin", "RNAi", "results", "in", "overgrowth", "of", "the", "eye", "(", "C", ")", "and", "wing", "(", "D", ")", ".", "(", "E", ",", "F", ")", "βH", "-", "spectrin", "/", "karst", "RNAi", "results", "in", "overgrowth", "of", "the", "eye", "(", "E", ")", "and", "wing", "(", "F", ")", ".", "(", "G", ",", "H", ")", "β", "-", "spectrin", "RNAi", "does", "not", "affect", "eye", "size", "(", "G", ")", "or", "wing", "size", "(", "H", ")", ".", "(", "I", ",", "J", ")", "kibra", "RNAi", "results", "in", "overgrowth", "of", "the", "eye", "(", "I", ")", "and", "wing", "(", "J", ")", ".", "(", "K", ",", "L", ")", "α", "-", "spectrin", ",", "kibra", "double", "RNAi", "results", "in", "stronger", "overgrowth", "of", "the", "eye", "(", "K", ")", "and", "wing", "(", "L", ")", ".", "(", "M", ",", "N", ")", "βH", "-", "spectrin", "/", "wing", ",", "kibra", "double", "RNAi", "results", "in", "stronger", "overgrowth", "of", "the", "eye", "(", "M", ")", "and", "wing", "(", "N", ")", ".", "(", "O", ")", "Quantification", "of", "female", "wing", "sizes", "by", "pixel", "area", ",", "5", "wings", "per", "genotype", "were", "measured", ".", "Error", "bars", "show", "standard", "deviation", ".", "P", "-", "RThe", "eyeless", "FLP", "MARCM", "system", "was", "used", "to", "generate", "clonally", "mutant", "flyeyes", ".", "eyes", "mutant", "eyes", "(", "Q", ")", "overgrow", "slightly", "compared", "to", "controls", "(", "P", ")", ",", "while", "α", "-", "spectrin", "mutant", "eyes", "expressing", "α", "-", "spectrin", "RNAi", "(", "R", ")", "overgrow", "strongly", "compared", "to", "controls", "(", "P", ")", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", ",", "250", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A-O UAS.RNAi lines were driven with eyeless.Gal4gmr.Gal4 for expression during eye development or nubbin-Gal4 for expression during wing development. (A, B) Control adult Drosophilaeye (A) and wing (B). (C, D) α-spectrin RNAi results in overgrowth of the eye (C) and wing (D). (E, F) βH-spectrin/karst RNAi results in overgrowth of the eye (E) and wing (F). (G, H) β-spectrin RNAi does not affect eye size (G) or wing size (H). (I, J) kibra RNAi results in overgrowth of the eye (I) and wing (J). (K, L) α-spectrin, kibra double RNAi results in stronger overgrowth of the eye (K) and wing (L). (M, N) βH-spectrin/wing, kibra double RNAi results in stronger overgrowth of the eye (M) and wing (N). (O) Quantification of female wing sizes by pixel area, 5 wings per genotype were measured. Error bars show standard deviation.P-RThe eyeless FLP MARCM system was used to generate clonally mutant flyeyes. eyes mutant eyes (Q) overgrow slightly compared to controls (P), while α-spectrin mutant eyes expressing α-spectrin RNAi (R) overgrow strongly compared to controls (P).Data information: Scale bars, 250 μm."}
{"words": ["Figure", "2A", "-", "F", "The", "eyeless", "FLP", "MARCM", "system", "was", "used", "to", "generate", "mutant", "eyes", "that", "also", "express", "UAS", ".", "RNAi", "targeting", "the", "Spectrin", "cytoskeleton", ".", "Pupalretinas", "were", "examined", "at", "42", "-", "46", "h", "after", "puparium", "formation", "(", "APF", ")", ".", "Cellmembranes", "were", "marked", "with", "Dlg", "staining", ".", "(", "A", ")", "Control", "pupalretina", "showing", "cone", "cells", "surrounded", "by", "interommatidial", "cells", ".", "(", "B", ")", "kibra", "mutant", "pupalretina", "displaying", "additional", "interommatidial", "cells", ".", "(", "C", ")", "Pupalretina", "expressing", "α", "-", "spectrin", "RNAi", "showing", "additional", "interommatidial", "cells", ".", "(", "D", ")", "kibra", "mutant", "pupalretinas", "expressing", "α", "-", "spectrin", "RNAi", "showing", "many", "additional", "interommatidial", "cells", ".", "(", "E", ",", "F", ")", "Clones", "of", "α", "-", "spectrin", "mutant", "cells", "(", "GFP", "negative", ")", "(", "E", ")", "and", "βH", "-", "spectrin", "/", "karst", "mutant", "cells", "(", "GFP", "negative", ")", "(", "F", ")", "show", "extra", "interommatidial", "cells", ".", "Scale", "bars", ",", "20", "μm", ".", "G", "-", "K", "UAS", ".", "RNAi", "lines", "were", "driven", "with", "hh", ".", "Gal4", "UAS", ".", "GFP", "for", "expression", "in", "the", "posterior", "compartment", "and", "contained", "the", "ex", ".", "lacZ", "reporter", "transgene", ".", "(", "G", ")", "Control", "wing", "showing", "a", "normal", "ex", ".", "lacZ", "expression", "pattern", ",", "which", "is", "low", "at", "the", "dorsal", "-", "ventral", "boundary", "but", "high", "in", "the", "proximal", "regions", "of", "the", "wing", "disc", ".", "(", "H", ")", "RNAi", "knock", "-", "down", "of", "α", "-", "Spectrin", "results", "in", "a", "mild", "up", "-", "regulation", "of", "ex", ".", "lacZ", "in", "the", "posterior", "compartment", ".", "(", "I", ")", "RNAi", "knock", "-", "down", "of", "kibra", "results", "in", "a", "mild", "up", "-", "regulation", "of", "ex", ".", "lacZ", "in", "the", "posterior", "compartment", ".", "(", "J", ")", "Dual", "RNAi", "knock", "-", "down", "of", "both", "α", "-", "spectrin", "and", "kibra", "results", "in", "enhanced", "up", "-", "regulation", "of", "ex", ".", "lacZ", "in", "the", "posterior", "compartment", ".", "(", "K", ")", "RNAi", "knock", "-", "down", "of", "hippo", "results", "in", "an", "up", "-", "regulation", "of", "ex", ".", "lacZ", "in", "the", "posterior", "compartment", ".", "Scale", "bars", ",", "50", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A-F The eyeless FLP MARCM system was used to generate mutant eyes that also express UAS.RNAi targeting the Spectrin cytoskeleton. Pupalretinas were examined at 42-46 h after puparium formation (APF). Cellmembranes were marked with Dlg staining. (A) Control pupalretina showing cone cells surrounded by interommatidial cells. (B) kibra mutant pupalretina displaying additional interommatidial cells. (C) Pupalretina expressing α-spectrin RNAi showing additional interommatidial cells. (D) kibra mutant pupalretinas expressing α-spectrin RNAi showing many additional interommatidial cells. (E, F) Clones of α-spectrin mutant cells (GFP negative) (E) and βH-spectrin/karst mutant cells (GFP negative) (F) show extra interommatidial cells. Scale bars, 20 μm.G-K UAS.RNAi lines were driven with hh.Gal4 UAS.GFP for expression in the posterior compartment and contained the ex.lacZ reporter transgene. (G) Control wing showing a normal ex.lacZ expression pattern, which is low at the dorsal-ventral boundary but high in the proximal regions of the wing disc. (H) RNAi knock-down of α-Spectrin results in a mild up-regulation of ex.lacZ in the posterior compartment. (I) RNAi knock-down of kibra results in a mild up-regulation of ex.lacZ in the posterior compartment. (J) Dual RNAi knock-down of both α-spectrin and kibra results in enhanced up-regulation of ex.lacZ in the posterior compartment. (K) RNAi knock-down of hippo results in an up-regulation of ex.lacZ in the posterior compartment. Scale bars, 50 μm."}
{"words": ["Figure", "3A", "Co", "-", "IP", "of", "V5", "-", "tagged", "Expanded", "with", "the", "FLAG", "-", "tagged", "N", "-", "terminal", "region", "of", "Karst", "/", "βH", "-", "Spectrin", ",", "but", "not", "other", "Karst", "truncation", "constructs", ".", "B", ",", "C", "Expanded", "co", "-", "localises", "with", "Karst", "at", "the", "apical", "membrane", "of", "wing", "imaginal", "disc", "cells", "(", "apical", "view", ",", "B", ";", "cross", "section", ",", "C", ")", ".", "D", "Control", "nubbin", ".", "Gal4", "expressing", "wing", ".", "E", "Overexpression", "of", "Ex", "activates", "Hippo", "signalling", "to", "produce", "a", "small", "wing", ".", "F", "RNAi", "knock", "-", "down", "of", "α", "-", "Spectrin", "results", "in", "an", "overgrown", "wing", ".", "G", "Overexpression", "of", "Ex", "blocks", "the", "effect", "of", "α", "-", "Spectrin", "RNAi", ".", "H", "RNAi", "knock", "-", "down", "of", "βH", "-", "spectrin", "/", "karst", "results", "in", "an", "overgrown", "wing", ".", "I", "Overexpression", "of", "Ex", "blocks", "the", "effect", "of", "βH", "-", "spectrin", "/", "karst", "RNAi", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Co-IP of V5-tagged Expanded with the FLAG-tagged N-terminal region of Karst/βH-Spectrin, but not other Karst truncation constructs.B, C Expanded co-localises with Karst at the apical membrane of wing imaginal disc cells (apical view, B; cross section, C).D Control nubbin.Gal4 expressing wing.E Overexpression of Ex activates Hippo signalling to produce a small wing.F RNAi knock-down of α-Spectrin results in an overgrown wing.G Overexpression of Ex blocks the effect of α-Spectrin RNAi.H RNAi knock-down of βH-spectrin/karst results in an overgrown wing.I Overexpression of Ex blocks the effect of βH-spectrin/karst RNAi."}
{"words": ["Figure", "4The", "apical", "α", "-", "βHSpectrincytoskeleton", "may", "be", "mechanosensory", "in", "the", "wing", "imaginal", "discA", "Schematic", "diagram", "of", "central", "compression", "and", "circumferencial", "stretching", "in", "the", "third", "instarwing", "pouch", ".", "B", "-", "D", "Third", "instarwing", "imaginal", "disc", "stained", "for", "beta", "-", "galactosidase", "expressed", "from", "the", "expanded", ".", "lacZ", "reporter", "gene", "(", "B", ")", ",", "Crb", "(", "C", ")", "and", "Kst", "-", "YFP", "(", "D", ")", ".", "Quantification", "of", "line", "intensity", "shown", "below", ".", "Note", "inverse", "correlation", "of", "Crb", "and", "Kst", "-", "YFP", "with", "ex", ".", "lacZ", ".", "Scale", "bars", ",", "50", "μm", ".", "E", ",", "F", "Zoom", "of", "Kst", "-", "YFP", "cells", "under", "compression", "(", "E", ")", "and", "under", "stretch", "(", "F", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "G", "Schematic", "diagram", "of", "the", "effect", "of", "force", "on", "the", "apical", "spectrin", "cytoskeleton", "leading", "to", "declustering", "of", "Crumbs", "complexes", "and", "reduced", "Hippo", "signalling", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4The apical α-βHSpectrincytoskeleton may be mechanosensory in the wing imaginal discA Schematic diagram of central compression and circumferencial stretching in the third instarwing pouch.B-D Third instarwing imaginal disc stained for beta-galactosidase expressed from the expanded.lacZ reporter gene (B), Crb (C) and Kst-YFP (D). Quantification of line intensity shown below. Note inverse correlation of Crb and Kst-YFP with ex.lacZ. Scale bars, 50 μm.E, F Zoom of Kst-YFP cells under compression (E) and under stretch (F). Scale bars, 10 μm.G Schematic diagram of the effect of force on the apical spectrin cytoskeleton leading to declustering of Crumbs complexes and reduced Hippo signalling."}
{"words": ["Figure", "5B", "Control", "nub", ".", "Gal4", "wing", ".", "C", ",", "D", "Expression", "of", "UAS", ".", "CrbExTM", "-", "GFP", "with", "Gal4", ".", "Gal4", "(", "C", ")", "or", "UAS", ".", "Wts", "with", "nub", ".", "Gal4", "(", "D", ")", "results", "in", "a", "small", "wing", ".", "E", "RNAi", "knock", "-", "down", "of", "α", "-", "Spectrin", "results", "in", "an", "overgrown", "wing", ".", "F", ",", "G", "Expression", "of", "UAS", ".", "CrbExTM", "-", "GFP", "(", "F", ")", "or", "UAS", ".", "Wts", "(", "G", ")", "blocks", "the", "effect", "of", "α", "-", "Spectrin", "RNAi", ".", "H", "RNAi", "knock", "-", "down", "of", "βH", "-", "spectrin", "/", "karst", "results", "in", "an", "overgrown", "wing", ".", "I", ",", "J", "Expression", "of", "UAS", ".", "CrbExTM", "-", "GFP", "(", "I", ")", "or", "UAS", ".", "Wts", "(", "J", ")", "blocks", "the", "effect", "of", "α", "-", "Spectrin", "RNAi", ".", "K", ",", "L", "RNAi", "knock", "-", "down", "of", "Wts", "results", "in", "a", "strongly", "overgrown", "wing", "(", "K", ")", "and", "expression", "of", "UAS", ".", "CrbExTM", "-", "GFP", "does", "not", "block", "the", "effect", "of", "wts", "RNAi", "(", "L", ")", ".", "M", ",", "N", "RNAi", "knock", "-", "down", "of", "Ajuba", "results", "in", "a", "small", "wing", "(", "M", ")", ",", "and", "expression", "of", "UAS", ".", "CrbExTM", "-", "GFP", "enhances", "the", "effect", "of", "ajuba", "RNAi", "(", "N", ")", ".", "O", "Quantification", "of", "various", "wing", "sizes", ".", "Error", "bars", "show", "standard", "deviation", ".", "P", ",", "Q", "Localisation", "of", "Wts", "-", "GFP", "(", "P", ")", "and", "E", "-", "cadherin", "(", "Q", ")", "in", "the", "third", "instar", "wing", "imaginal", "disc", ".", "R", "Quantification", "of", "line", "intensity", "in", "(", "P", ")", "and", "(", "Q", ")", ".", "No", "increased", "Wts", "-", "GFP", "intensity", "is", "observed", "in", "proximal", "regions", "where", "cells", "are", "subject", "to", "stretching", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5B Control nub.Gal4 wing.C, D Expression of UAS.CrbExTM-GFP with Gal4.Gal4 (C) or UAS.Wts with nub.Gal4 (D) results in a small wing.E RNAi knock-down of α-Spectrin results in an overgrown wing.F, G Expression of UAS.CrbExTM-GFP (F) or UAS.Wts (G) blocks the effect of α-Spectrin RNAi.H RNAi knock-down of βH-spectrin/karst results in an overgrown wing.I, J Expression of UAS.CrbExTM-GFP (I) or UAS.Wts (J) blocks the effect of α-Spectrin RNAi.K, L RNAi knock-down of Wts results in a strongly overgrown wing (K) and expression of UAS.CrbExTM-GFP does not block the effect of wts RNAi (L).M, N RNAi knock-down of Ajuba results in a small wing (M), and expression of UAS.CrbExTM-GFP enhances the effect of ajuba RNAi (N).O Quantification of various wing sizes. Error bars show standard deviation.P, Q Localisation of Wts-GFP (P) and E-cadherin (Q) in the third instar wing imaginal disc.R Quantification of line intensity in (P) and (Q). No increased Wts-GFP intensity is observed in proximal regions where cells are subject to stretching."}
{"words": ["Figure", "6A", "Control", "egg", "chamber", "stained", "for", "DAPI", "to", "mark", "nuclei", ".", "B", "Overexpression", "of", "Yki3SA", "stimulates", "follicle", "cell", "proliferation", "(", "MARCM", "clone", ",", "GFP", "positive", ")", ".", "C", "-", "F", "Mutation", "of", "βH", "-", "spectrin", "/", "karst", "(", "C", ")", "or", "crb", "(", "D", ")", "does", "not", "increase", "follicle", "cell", "proliferation", "(", "GFP", "negative", "clone", ")", ",", "while", "mutation", "of", "α", "-", "spectrin", "(", "E", ")", "or", "β", "-", "spectrin", "(", "F", ")", "stimulates", "follicle", "cell", "proliferation", "(", "GFP", "negative", "clone", ")", ".", "G", "Control", "egg", "chamber", "stained", "for", "Cut", ",", "a", "marker", "of", "proliferating", "cells", "that", "is", "normally", "down", "-", "regulated", "after", "stage", "6", "of", "oogenesis", ".", "H", "-", "K", "Mutation", "of", "βH", "-", "spectrin", "/", "karst", "(", "H", ")", "or", "crb", "(", "I", ")", "does", "not", "increase", "Cut", "expression", "in", "follicle", "cells", "(", "GFP", "negative", "clone", ")", ",", "while", "mutation", "of", "α", "-", "spectrin", "(", "J", ")", "or", "β", "-", "spectrin", "(", "K", ")", "stimulates", "Cut", "expression", "in", "posterior", "follicle", "cells", "(", "GFP", "negative", "clone", ")", ".", "L", "Control", "egg", "chamber", "showing", "ex", ".", "lacZ", "reporter", "gene", "expression", ".", "M", "-", "P", "Mutation", "of", "βH", "-", "spectrin", "/", "karst", "(", "M", ")", "or", "crb", "(", "N", ")", "does", "not", "increase", "ex", ".", "lacZ", "expression", "in", "follicle", "cells", "(", "GFP", "negative", "clone", ")", ",", "while", "mutation", "of", "α", "-", "spectrin", "(", "O", ")", "or", "β", "-", "spectrin", "(", "P", ")", "stimulates", "ex", ".", "lacZ", "expression", "in", "posterior", "follicle", "cells", "(", "GFP", "negative", "clone", ")", ".", "Q", "Wild", "-", "type", "follicle", "cells", "showing", "normal", "hexagonal", "packing", "of", "epithelial", "membranes", ".", "R", "Mutation", "of", "β", "-", "spectrin", "disrupts", "the", "normal", "hexagonal", "packing", ",", "suggesting", "a", "role", "in", "maintaining", "membrane", "tension", ".", "S", "Clone", "of", "β", "-", "spectrin", "mutant", "cells", "(", "GFP", "negative", ")", "showing", "differential", "membrane", "tension", "at", "the", "interface", "with", "wild", "-", "type", "cells", "(", "GFP", "positive", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A Control egg chamber stained for DAPI to mark nuclei.B Overexpression of Yki3SA stimulates follicle cell proliferation (MARCM clone, GFP positive).C-F Mutation of βH-spectrin/karst (C) or crb (D) does not increase follicle cell proliferation (GFP negative clone), while mutation of α-spectrin (E) or β-spectrin (F) stimulates follicle cell proliferation (GFP negative clone).G Control egg chamber stained for Cut, a marker of proliferating cells that is normally down-regulated after stage 6 of oogenesis.H-K Mutation of βH-spectrin/karst (H) or crb (I) does not increase Cut expression in follicle cells (GFP negative clone), while mutation of α-spectrin (J) or β-spectrin (K) stimulates Cut expression in posterior follicle cells (GFP negative clone).L Control egg chamber showing ex.lacZ reporter gene expression.M-P Mutation of βH-spectrin/karst (M) or crb (N) does not increase ex.lacZ expression in follicle cells (GFP negative clone), while mutation of α-spectrin (O) or β-spectrin (P) stimulates ex.lacZ expression in posterior follicle cells (GFP negative clone).Q Wild-type follicle cells showing normal hexagonal packing of epithelial membranes.R Mutation of β-spectrin disrupts the normal hexagonal packing, suggesting a role in maintaining membrane tension.S Clone of β-spectrin mutant cells (GFP negative) showing differential membrane tension at the interface with wild-type cells (GFP positive)."}
{"words": ["Figure", "7Basolateralα", "-", "β", "Spectrins", "are", "required", "to", "restrict", "cellproliferation", "in", "theDrosophila", "intestinal", "epitheliumA", "Control", "myo1A", ".", "Gal4UAS", ".", "GFP", "adult", "midgut", "stained", "for", "phospho", "-", "histone", "H3", "to", "mark", "mitotic", "stem", "cells", ".", "B", "-", "E", "RNAi", "knock", "-", "down", "of", "βH", "-", "spectrin", "/", "karst", "(", "B", ")", "or", "crumbs", "(", "C", ")", "does", "not", "increase", "stem", "cellproliferation", ",", "while", "RNAi", "knock", "-", "down", "of", "β", "-", "spectrin", "(", "D", ")", "or", "α", "-", "spectrin", "(", "E", ")", "strongly", "stimulates", "stem", "cellproliferation", ".", "F", "Overexpression", "of", "Yki", "strongly", "stimulates", "stem", "cellproliferation", ".", "G", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "PH3", "-", "positive", "mitotic", "cells", ".", "N", ">", "13", "samples", ".", "Statistical", "analysis", "performed", "using", "the", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Error", "bars", "show", "standard", "deviation", ".", "*", "*", "*", "P", "-", "value", "≤", "0", ".", "001", ".", "H", "-", "K", "A", "Hippo", "reporter", "DIAP1", "-", "HRE", "-", "GFP", "is", "normally", "expressed", "in", "sporadic", "stem", "cells", ".", "Its", "expression", "is", "not", "affected", "by", "RNAi", "knock", "-", "down", "of", "βH", "-", "spectrin", "/", "karst", "(", "I", ")", ",", "but", "is", "up", "-", "regulated", "in", "many", "stem", "cells", "by", "RNAi", "knock", "-", "down", "of", "α", "-", "spectrin", "(", "J", ")", "or", "by", "overexpression", "of", "Yki", "(", "K", ")", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Basolateralα-β Spectrins are required to restrict cellproliferation in theDrosophila intestinal epitheliumA Control myo1A.Gal4UAS.GFP adult midgut stained for phospho-histone H3 to mark mitotic stem cells.B-E RNAi knock-down of βH-spectrin/karst (B) or crumbs (C) does not increase stem cellproliferation, while RNAi knock-down of β-spectrin (D) or α-spectrin (E) strongly stimulates stem cellproliferation.F Overexpression of Yki strongly stimulates stem cellproliferation.G Quantification of the number of PH3-positive mitotic cells. N > 13 samples. Statistical analysis performed using the two-tailed Student's t-test. Error bars show standard deviation. ***P-value ≤ 0.001.H-K A Hippo reporter DIAP1-HRE-GFP is normally expressed in sporadic stem cells. Its expression is not affected by RNAi knock-down of βH-spectrin/karst (I), but is up-regulated in many stem cells by RNAi knock-down of α-spectrin (J) or by overexpression of Yki (K).Data information: Scale bars, 100 μm."}
{"words": ["Figure", "8A", "Control", "Caco", "-", "2", "epithelial", "cells", "plated", "a", "low", "density", "show", "strong", "nuclear", "YAP", "localisation", ".", "B", "Control", "Caco", "-", "2", "epithelial", "cells", "plated", "at", "high", "density", "show", "relocalisation", "of", "YAP", "to", "the", "cytoplasm", ".", "C", ",", "D", "siRNA", "knock", "-", "down", "of", "SPTAN1", "(", "C", ")", "or", "SPTBN1", "(", "D", ")", "prevents", "relocalisation", "of", "YAP", "to", "the", "cytoplasm", ".", "E", "Quantification", "of", "YAP", "localisation", "in", "(", "B", "-", "D", ")", ".", "F", "Western", "blotting", "reveals", "that", "SPTAN1", "or", "SPTBN1", "are", "required", "for", "normal", "levels", "of", "YAP", "phosphorylation", ",", "and", "of", "LATS1", "phosphorylation", ".", "G", "siRNAs", "against", "SPTAN1", "or", "SPTBN1", "efficiently", "deplete", "their", "target", "proteins", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8A Control Caco-2 epithelial cells plated a low density show strong nuclear YAP localisation.B Control Caco-2 epithelial cells plated at high density show relocalisation of YAP to the cytoplasm.C, D siRNA knock-down of SPTAN1 (C) or SPTBN1 (D) prevents relocalisation of YAP to the cytoplasm.E Quantification of YAP localisation in (B-D).F Western blotting reveals that SPTAN1 or SPTBN1 are required for normal levels of YAP phosphorylation, and of LATS1 phosphorylation.G siRNAs against SPTAN1 or SPTBN1 efficiently deplete their target proteins."}
{"words": ["Figure", "1B", ".", "Immunoblot", "of", "parental", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "UPF3B", "mutant", "cell", "lines", "showing", "levels", "of", "proteins", "on", "the", "right", ".", "In", "3BΔ2BD", ",", "a", "smaller", "UPF3B", "protein", "with", "deletion", "of", "amino", "acids", "20", "-", "155", "(", "UPF3BΔ20", "-", "155", ")", "is", "expressed", ".", "Relative", "Expression", "(", "Rel", "Exp", ")", "of", "this", "deletion", "protein", "as", "compared", "to", "the", "full", "-", "length", "UPF3B", "along", "with", "standard", "error", "of", "mean", "(", "SEM", ")", "are", "indicated", "below", "lane", "2", ".", "UPF3B", "antibody", "recognizes", "antigen", "outside", "the", "deleted", "region", "in", "3BΔ2BD", ".", "HNRNPA1", "is", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "ND", "=", "UPF3B", "levels", "not", "determined", ".", "C", ".", "Cumulative", "Distribution", "Function", "(", "CDF", ")", "plots", "of", "PTC", "+", "isoforms", "and", "PTC", "-", "isoforms", "from", "the", "same", "set", "of", "genes", ".", "X", "-", "axis", "represents", "fold", "change", "in", "3BΔ2BD", "versus", "WT", "cells", "each", "with", "control", "knockdown", "(", "siNC", ")", ".", "Number", "of", "transcripts", "in", "each", "set", "(", "n", ")", "and", "p", "-", "value", "from", "Kolmogorov", "-", "Smirnov", "(", "KS", ")", "test", "comparing", "the", "two", "distributions", "are", "shown", ".", "D", ".", "Bar", "plots", "from", "isoform", "specific", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "showing", "average", "fold", "change", "(", "y", "-", "axis", ")", "of", "PTC", "+", "and", "PTC", "-", "isoforms", "from", "genes", "indicated", "on", "the", "bottom", "in", "WT", "and", "the", "two", "UPF3B", "mutant", "cells", "identified", "in", "the", "legend", "on", "the", "top", "right", ".", "For", "each", "isoform", ",", "levels", "in", "mutant", "cells", "are", "compared", "to", "the", "levels", "in", "WT", "cells", "(", "set", "to", "1", ")", ".", "E", ".", "Cumulative", "Distribution", "Function", "(", "CDF", ")", "plots", "of", "NMD", "+", "isoforms", "and", "NMD", "-", "isoforms", ".", "X", "-", "axis", "represents", "fold", "change", "in", "3BΔ2BD", "versus", "WT", "cells", "each", "with", "control", "knockdown", "(", "siNC", ")", ".", "Number", "of", "transcripts", "in", "each", "set", "(", "n", ")", "and", "p", "-", "value", "from", "Kolmogorov", "-", "Smirnov", "(", "KS", ")", "test", "comparing", "the", "two", "distributions", "are", "shown", ".", "F", ".", "Cumulative", "Distribution", "Function", "(", "CDF", ")", "plots", "of", "PTC", "+", "isoforms", "and", "PTC", "-", "isoforms", "from", "same", "set", "of", "genes", ".", "X", "-", "axis", "represents", "fold", "change", "in", "UPF1", "knockdown", "(", "siUPF1", ")", "versus", "control", "knockdown", "(", "siNC", ")", "in", "3BΔ2BD", "cells", ".", "Number", "of", "transcripts", "in", "each", "set", "(", "n", ")", "and", "p", "-", "value", "from", "Kolmogorov", "-", "Smirnov", "(", "KS", ")", "test", "comparing", "the", "two", "distributions", "are", "shown", ".", "G", ".", "Cumulative", "Distribution", "Function", "(", "CDF", ")", "plots", "of", "NMD", "+", "isoforms", "and", "NMD", "-", "isoforms", ".", "X", "-", "axis", "represents", "fold", "change", "in", "UPF1", "knockdown", "(", "siUPF1", ")", "versus", "control", "knockdown", "(", "siNC", ")", "in", "3BΔ2BD", "cells", ".", "Number", "of", "transcripts", "in", "each", "set", "(", "n", ")", "and", "p", "-", "value", "from", "Kolmogorov", "-", "Smirnov", "(", "KS", ")", "test", "comparing", "the", "two", "distributions", "are", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B. Immunoblot of parental wild-type (WT) and UPF3B mutant cell lines showing levels of proteins on the right. In 3BΔ2BD, a smaller UPF3B protein with deletion of amino acids 20-155 (UPF3BΔ20-155) is expressed. Relative Expression (Rel Exp) of this deletion protein as compared to the full-length UPF3B along with standard error of mean (SEM) are indicated below lane 2. UPF3B antibody recognizes antigen outside the deleted region in 3BΔ2BD. HNRNPA1 is used as a loading control. ND = UPF3B levels not determined.C. Cumulative Distribution Function (CDF) plots of PTC+ isoforms and PTC- isoforms from the same set of genes. X-axis represents fold change in 3BΔ2BD versus WT cells each with control knockdown (siNC). Number of transcripts in each set (n) and p-value from Kolmogorov-Smirnov (KS) test comparing the two distributions are shown.D. Bar plots from isoform specific RT-qPCR analysis showing average fold change (y-axis) of PTC+ and PTC- isoforms from genes indicated on the bottom in WT and the two UPF3B mutant cells identified in the legend on the top right. For each isoform, levels in mutant cells are compared to the levels in WT cells (set to 1).E. Cumulative Distribution Function (CDF) plots of NMD+ isoforms and NMD- isoforms. X-axis represents fold change in 3BΔ2BD versus WT cells each with control knockdown (siNC). Number of transcripts in each set (n) and p-value from Kolmogorov-Smirnov (KS) test comparing the two distributions are shown. F. Cumulative Distribution Function (CDF) plots of PTC+ isoforms and PTC- isoforms from same set of genes. X-axis represents fold change in UPF1 knockdown (siUPF1) versus control knockdown (siNC) in 3BΔ2BD cells. Number of transcripts in each set (n) and p-value from Kolmogorov-Smirnov (KS) test comparing the two distributions are shown. G. Cumulative Distribution Function (CDF) plots of NMD+ isoforms and NMD- isoforms. X-axis represents fold change in UPF1 knockdown (siUPF1) versus control knockdown (siNC) in 3BΔ2BD cells. Number of transcripts in each set (n) and p-value from Kolmogorov-Smirnov (KS) test comparing the two distributions are shown."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Immunoblots", "showing", "levels", "of", "proteins", "on", "the", "right", "in", "input", "or", "FLAG", "immunoprecipitates", "(", "IP", ")", "from", "WT", "and", "UPF3B", "mutant", "cells", "expressing", "endogenously", "FLAG", "-", "tagged", "UPF1", "protein", "as", "indicated", "above", "each", "lane", ".", "The", "presence", "of", "RNase", "A", "during", "FLAG", "-", "IP", "is", "indicated", "above", "each", "lane", ".", "B", ".", "Immunoblots", "showing", "levels", "of", "proteins", "(", "right", ")", "in", "input", "and", "IP", "with", "normal", "rabbit", "IgG", "(", "IgG", "-", "IP", ")", "or", "antibody", "targeting", "EIF4A3", "(", "EIF4A3", "-", "IP", ")", "from", "WT", "and", "UPF3B", "mutant", "cells", ".", "C", ",", "D", ".", "CDF", "plots", "of", "(", "C", ")", "PTC", "+", "and", "PTC", "-", "isoforms", ",", "(", "D", ")", "NMD", "+", "and", "NMD", "-", "isoforms", ".", "X", "-", "axis", "represents", "fold", "change", "upon", "UPF3A", "knockdown", "(", "siUPF3A", ")", "versus", "negative", "control", "knockdown", "(", "siNC", ")", "in", "WT", "cells", ".", "Number", "of", "transcripts", "in", "each", "set", "(", "n", ")", "and", "p", "-", "value", "from", "KS", "test", "comparing", "the", "two", "distributions", "are", "shown", "on", "each", "plot", ".", "E", ",", "F", ".", "CDF", "plots", "of", "(", "E", ")", "PTC", "+", "and", "PTC", "-", "isoforms", ",", "(", "F", ")", "NMD", "+", "and", "NMD", "-", "isoforms", ".", "X", "-", "axis", "represents", "fold", "change", "upon", "UPF3A", "knockdown", "(", "siUPF3A", ")", "versus", "negative", "control", "knockdown", "(", "siNC", ")", "in", "3BΔ2BD", "cells", ".", "Number", "of", "transcripts", "in", "each", "set", "(", "n", ")", "and", "p", "-", "value", "from", "KS", "test", "comparing", "the", "two", "distributions", "are", "shown", "on", "each", "plot", ".", "G", ",", "H", ".", "CDF", "plots", "of", "UPF3B", "-", "dependent", "(", "G", ")", "and", "-", "independent", "(", "H", ")", "PTC", "+", "isoforms", "and", "their", "respective", "PTC", "-", "isoforms", ".", "X", "-", "axis", "represents", "fold", "change", "upon", "UPF3A", "knockdown", "(", "siUPF3A", ")", "versus", "negative", "control", "knockdown", "(", "siNC", ")", "in", "3BΔ2BD", "cells", ".", "Number", "of", "transcripts", "in", "each", "set", "(", "n", ")", "and", "p", "-", "value", "from", "KS", "test", "comparing", "the", "two", "distributions", "are", "shown", "on", "each", "plot", ".", "I", ".", "CDF", "plots", "of", "UPF3B", "-", "dependent", "and", "UPF3B", "-", "independent", "NMD", "+", "isoforms", "as", "compared", "to", "NMD", "-", "isoforms", ".", "X", "-", "axis", "represents", "fold", "change", "upon", "UPF3A", "knockdown", "(", "siUPF3A", ")", "versus", "negative", "control", "knockdown", "(", "siNC", ")", "in", "3BΔ2BD", "cells", ".", "Number", "of", "transcripts", "in", "each", "set", "(", "n", ")", "and", "p", "-", "value", "from", "KS", "test", "comparing", "the", "two", "distributions", "are", "shown", "on", "each", "plot", ".", "J", ".", "Bar", "plot", "showing", "average", "fold", "change", "as", "measured", "by", "isoform", "specific", "RT", "-", "qPCR", "of", "PTC", "+", "and", "PTC", "-", "isoform", "from", "genes", "indicated", "on", "the", "bottom", "in", "WT", "and", "two", "independent", "clones", "of", "3AKO", ",", "3BΔ2BD", ",", "3BKO", ",", "and", "3DKO", "cells", ".", "Relative", "levels", "from", "each", "replicate", "are", "shown", "by", "white", "circles", ".", "Error", "bars", "indicate", "standard", "errors", "of", "means", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Immunoblots showing levels of proteins on the right in input or FLAG immunoprecipitates (IP) from WT and UPF3B mutant cells expressing endogenously FLAG-tagged UPF1 protein as indicated above each lane. The presence of RNase A during FLAG-IP is indicated above each lane.B. Immunoblots showing levels of proteins (right) in input and IP with normal rabbit IgG (IgG-IP) or antibody targeting EIF4A3 (EIF4A3-IP) from WT and UPF3B mutant cells.C, D. CDF plots of (C) PTC+ and PTC-isoforms, (D) NMD+ and NMD- isoforms. X-axis represents fold change upon UPF3A knockdown (siUPF3A) versus negative control knockdown (siNC) in WT cells. Number of transcripts in each set (n) and p-value from KS test comparing the two distributions are shown on each plot. E, F. CDF plots of (E) PTC+ and PTC-isoforms, (F) NMD+ and NMD- isoforms. X-axis represents fold change upon UPF3A knockdown (siUPF3A) versus negative control knockdown (siNC) in 3BΔ2BD cells. Number of transcripts in each set (n) and p-value from KS test comparing the two distributions are shown on each plot. G, H. CDF plots of UPF3B-dependent (G) and -independent (H) PTC+ isoforms and their respective PTC- isoforms. X-axis represents fold change upon UPF3A knockdown (siUPF3A) versus negative control knockdown (siNC) in 3BΔ2BD cells. Number of transcripts in each set (n) and p-value from KS test comparing the two distributions are shown on each plot.I. CDF plots of UPF3B-dependent and UPF3B-independent NMD+ isoforms as compared to NMD- isoforms. X-axis represents fold change upon UPF3A knockdown (siUPF3A) versus negative control knockdown (siNC) in 3BΔ2BD cells. Number of transcripts in each set (n) and p-value from KS test comparing the two distributions are shown on each plot.J. Bar plot showing average fold change as measured by isoform specific RT-qPCR of PTC+ and PTC- isoform from genes indicated on the bottom in WT and two independent clones of 3AKO, 3BΔ2BD, 3BKO, and 3DKO cells. Relative levels from each replicate are shown by white circles. Error bars indicate standard errors of means."}
{"words": ["Figure", "3B", ".", "Immunoblot", "showing", "levels", "of", "EJC", "and", "UPF", "proteins", "(", "on", "the", "right", ")", "in", "input", "or", "FLAG", "-", "IP", "samples", "from", "3DKO", "#", "2", "cells", "stably", "expressing", "different", "FLAG", "-", "tagged", "proteins", "indicated", "above", "each", "lane", ".", "D", ".", "Immunoblot", "showing", "EJC", "/", "UPF", "proteins", "(", "on", "the", "right", ")", "in", "input", "or", "FLAG", "-", "IP", "samples", "from", "3DKO", "#", "2", "cells", "stably", "expressing", "FLAG", "-", "tagged", "proteins", "given", "above", "each", "lane", "(", "hUPF3B", "=", "human", "UPF3B", ";", "hUPF3B", "-", "h3AC", "=", "human", "UPF3B", "protein", "with", "C", "-", "terminal", "domain", "from", "human", "UPF3A", ";", "hUPF3B", "-", "m3AC", "=", "human", "UPF3B", "protein", "with", "C", "-", "terminal", "domain", "from", "mouse", "UPF3A", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B. Immunoblot showing levels of EJC and UPF proteins (on the right) in input or FLAG-IP samples from 3DKO#2 cells stably expressing different FLAG-tagged proteins indicated above each lane. D. Immunoblot showing EJC/UPF proteins (on the right) in input or FLAG-IP samples from 3DKO#2 cells stably expressing FLAG-tagged proteins given above each lane (hUPF3B = human UPF3B; hUPF3B-h3AC = human UPF3B protein with C-terminal domain from human UPF3A; hUPF3B-m3AC = human UPF3B protein with C-terminal domain from mouse UPF3A)."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "Northern", "blots", "showing", "levels", "of", "β", "-", "globin", "reporter", "mRNAs", "in", "wild", "-", "type", "HeLa", "Tet", "-", "off", "cells", "and", "UPF3B", "knockout", "HeLa", "Tet", "-", "off", "cells", ".", "β39", "is", "a", "tetracycline", "(", "Tet", ")", "-", "inducible", "reporter", "with", "a", "PTC", "at", "codon", "39", "whose", "levels", "are", "shown", "at", "different", "timepoints", "after", "transcriptional", "shut", "-", "off", "(", "chase", ")", "as", "indicated", "above", "each", "lane", ".", "β", "-", "GAP", "is", "a", "stable", ",", "constitutively", "-", "expressed", ",", "longer", "β", "-", "globin", "mRNA", "used", "as", "transfection", "control", ".", "Proteins", "overexpressed", "(", "OE", ")", "in", "each", "condition", "are", "indicated", "on", "top", "and", "reporter", "mRNA", "half", "-", "lives", "(", "t1", "/", "2", ")", "along", "with", "standard", "errors", "of", "means", "are", "on", "the", "bottom", ".", "C", ".", "Northern", "blot", "showing", "steady", "-", "state", "levels", "of", "β39", "NMD", "reporter", "and", "β", "-", "GAP", "control", "in", "HeLa", "Tet", "-", "off", "UPF3B", "knockout", "cells", "upon", "transient", "overexpression", "of", "wild", "-", "type", "UPF3", "proteins", "or", "different", "UPF3A", "chimeric", "proteins", "indicated", "above", "each", "lane", ".", "Below", "each", "lane", ",", "relative", "fold", "-", "change", "(", "Rel", "FC", ")", "indicates", "β39", "reporter", "levels", "(", "normalized", "to", "β", "-", "GAP", "control", ")", "as", "compared", "to", "the", "normalized", "β39", "reporter", "levels", "in", "UPF3B", "expressing", "cells", ".", "D", ".", "Immunoblot", "showing", "levels", "of", "EJC", "proteins", "or", "HNRNPA1", "in", "input", "or", "EIF4A3", "-", "IP", "from", "3DKO", "#", "2", "cells", "stably", "expressing", "different", "UPF3", "proteins", "or", "EGFP", "as", "a", "control", "as", "indicated", "above", "each", "lane", ".", "Relative", "IP", "of", "FLAG", "-", "tagged", "proteins", "are", "quantified", "against", "EIF4A3", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. Northern blots showing levels of β-globin reporter mRNAs in wild-type HeLa Tet-off cells and UPF3B knockout HeLa Tet-off cells. β39 is a tetracycline (Tet)-inducible reporter with a PTC at codon 39 whose levels are shown at different timepoints after transcriptional shut-off (chase) as indicated above each lane. β-GAP is a stable, constitutively-expressed, longer β-globin mRNA used as transfection control. Proteins overexpressed (OE) in each condition are indicated on top and reporter mRNA half-lives (t1/2) along with standard errors of means are on the bottom.C. Northern blot showing steady-state levels of β39 NMD reporter and β-GAP control in HeLa Tet-off UPF3B knockout cells upon transient overexpression of wild-type UPF3 proteins or different UPF3A chimeric proteins indicated above each lane. Below each lane, relative fold-change (Rel FC) indicates β39 reporter levels (normalized to β-GAP control) as compared to the normalized β39 reporter levels in UPF3B expressing cells.D. Immunoblot showing levels of EJC proteins or HNRNPA1 in input or EIF4A3-IP from 3DKO#2 cells stably expressing different UPF3 proteins or EGFP as a control as indicated above each lane. Relative IP of FLAG-tagged proteins are quantified against EIF4A3."}
{"words": ["Figure", "5A", ",", "B", ".", "CDF", "plots", "of", "(", "A", ")", "PTC", "+", "and", "PTC", "-", "isoforms", ",", "(", "B", ")", "NMD", "+", "and", "NMD", "-", "isoforms", ".", "X", "-", "axis", "represents", "fold", "change", "upon", "UPF1", "knockdown", "(", "siUPF1", ")", "versus", "negative", "control", "knockdown", "(", "siNC", ")", "in", "3DKO", "#", "2", "cells", ".", "Number", "of", "transcripts", "in", "each", "set", "(", "n", ")", "and", "p", "-", "value", "from", "KS", "test", "comparing", "the", "two", "distributions", "are", "shown", "on", "each", "plot", ".", "D", ",", "E", ".", "CDF", "plots", "of", "UPF3A", "/", "3B", "-", "independent", "(", "UPF3A", "/", "3B", "-", "indep", ".", ",", "D", ")", "and", "-", "dependent", "(", "UPF3A", "/", "3B", "-", "dep", ".", ",", "E", ")", "PTC", "+", "isoforms", "and", "their", "respective", "PTC", "-", "isoforms", ".", "X", "-", "axis", "represents", "fold", "change", "upon", "UPF1", "knockdown", "(", "siUPF1", ")", "versus", "negative", "control", "knockdown", "(", "siNC", ")", "in", "3DKO", "#", "2", "cells", ".", "Number", "of", "transcripts", "in", "each", "set", "(", "n", ")", "and", "p", "-", "value", "from", "KS", "test", "comparing", "the", "two", "distributions", "are", "shown", "on", "each", "plot", ".", "F", ".", "CDF", "plots", "of", "UPF3A", "/", "3B", "-", "dependent", "(", "UPF3A", "/", "3B", "-", "dep", ".", ")", ",", "UPF3A", "/", "3B", "-", "independent", "(", "UPF3A", "/", "3B", "-", "indep", ".", ")", "NMD", "+", "isoforms", "and", "NMD", "-", "isoforms", ".", "X", "-", "axis", "represents", "fold", "change", "upon", "UPF1", "knockdown", "(", "siUPF1", ")", "versus", "negative", "control", "knockdown", "(", "siNC", ")", "in", "3DKO", "#", "2", "cells", ".", "Number", "of", "transcripts", "in", "each", "set", "(", "n", ")", "and", "p", "-", "value", "from", "KS", "test", "comparing", "the", "two", "distributions", "are", "shown", "on", "each", "plot", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A, B. CDF plots of (A) PTC+ and PTC-isoforms, (B) NMD+ and NMD- isoforms. X-axis represents fold change upon UPF1 knockdown (siUPF1) versus negative control knockdown (siNC) in 3DKO#2 cells. Number of transcripts in each set (n) and p-value from KS test comparing the two distributions are shown on each plot.D, E. CDF plots of UPF3A/3B-independent (UPF3A/3B-indep., D) and -dependent (UPF3A/3B-dep., E) PTC+ isoforms and their respective PTC- isoforms. X-axis represents fold change upon UPF1 knockdown (siUPF1) versus negative control knockdown (siNC) in 3DKO#2 cells. Number of transcripts in each set (n) and p-value from KS test comparing the two distributions are shown on each plot.F. CDF plots of UPF3A/3B-dependent (UPF3A/3B-dep.), UPF3A/3B-independent (UPF3A/3B-indep.) NMD+ isoforms and NMD- isoforms. X-axis represents fold change upon UPF1 knockdown (siUPF1) versus negative control knockdown (siNC) in 3DKO#2 cells. Number of transcripts in each set (n) and p-value from KS test comparing the two distributions are shown on each plot."}
{"words": ["Figure", "6A", ",", "B", ".", "Western", "blots", "showing", "levels", "of", "EJC", "proteins", "or", "HNRNPA1", "(", "control", ")", "in", "input", ",", "IgG", "IP", "or", "EIF4A3", "IP", "following", "overexpression", "(", "OE", ")", "of", "CASC3", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "EJC", "binding", "deficient", "(", "HDAA", ")", "mutant", "proteins", "in", "(", "A", ")", "HeLa", "Tet", "-", "off", "cells", ",", "and", "(", "B", ")", "3BKO", "#", "3", "HeLa", "Tet", "-", "off", "cells", ".", "Ramps", "above", "lanes", "indicate", "expression", "levels", "of", "the", "CASC3", "proteins", ".", "C", ".", "Western", "blots", "showing", "levels", "of", "EJC", "/", "UPF", "proteins", "and", "HNRNPA1", "in", "input", "and", "FLAG", "followed", "by", "EIF4A3", "tandem", "IP", "from", "HCT116", "cells", "expressing", "the", "FLAG", "-", "tagged", "endogenous", "protein", "indicated", "above", "each", "lane", ".", "Quantifications", "of", "UPF3B", "and", "CASC3", "protein", "enrichment", "from", "two", "replicates", "are", "shown", "at", "the", "bottom", ".", "D", ".", "Meta", "-", "exon", "plot", "showing", "read", "distributions", "within", "the", "100", "nucleotide", "(", "nt", ")", "window", "from", "the", "exon", "3", "′", "end", "in", "RIPiT", "-", "Seq", "replicates", "of", "MAGOH", ":", "EIF4A3", ",", "UPF3B", ":", "EIF4A3", ",", "and", "CASC3", ":", "EIF4A3", ".", "The", "black", "vertical", "line", "indicates", "the", "-", "24", "nt", "position", ".", "F", ".", "Scatter", "plot", "comparing", "log2", "-", "transformed", "fold", "change", "in", "occupancy", "of", "CASC3", ":", "EIF4A3", "EJC", "as", "compared", "to", "MAGOH", ":", "EIF4A3", "EJC", "(", "x", "-", "axis", ")", "and", "UPF3B", ":", "EIF4A3", "EJC", "compared", "to", "MAGOH", ":", "EIF4A3", "EJC", ".", "Each", "dot", "represents", "a", "gene", "where", "gene", "-", "level", "occupancy", "of", "each", "EJC", "composition", "was", "quantified", "at", "the", "canonical", "position", "for", "EJC", "footprints", ".", "Pearson", "correlation", "coefficient", "is", "shown", "on", "the", "top", "left", ".", "G", ".", "Box", "plots", "comparing", "occupancy", "of", "a", "specific", "EJC", "composition", "on", "mRNA", "(", "indicated", "on", "y", "-", "axis", ";", "normalized", "by", "gene", "expression", "from", "RNA", "-", "Seq", ")", "between", "genes", "of", "different", "NMD", "efficiency", ".", "Up", ",", "no", ",", "and", "down", "stands", "for", "upregulation", ",", "no", "obvious", "change", "or", "downregulation", "of", "a", "representative", "PTC", "+", "isoform", "for", "each", "gene", "(", "see", "material", "and", "methods", ")", "that", "is", "used", "to", "reflect", "overall", "NMD", "efficiency", "for", "each", "gene", ".", "In", "the", "box", "plots", ",", "central", "band", "represents", "the", "median", ",", "boxes", "represent", "the", "interquartile", "range", "(", "IQR", ")", ",", "whiskers", "indicate", "maximum", "(", "top", ")", "and", "minimum", "(", "bottom", ")", "values", "(", "1", ".", "5", "-", "times", "the", "highest", "or", "lowest", "IQR", "values", ",", "respectively", ")", ",", "and", "circles", "represent", "the", "outliers", ".", "p", "-", "values", "are", "from", "Wilcoxon", "signed", "-", "rank", "test", "comparing", "the", "two", "indicated", "distributions", ".", "H", ".", "Box", "plots", "as", "in", "G", "comparing", "specific", "EJC", "composition", "occupancy", "relative", "to", "EJC", "core", "occupancy", "(", "normalized", "by", "MAGOH", ":", "EIF4A3", "RIPiT", "-", "Seq", ")", "between", "genes", "of", "different", "NMD", "efficiency", ".", "Up", ",", "no", ",", "down", ",", "central", "band", ",", "boxes", ",", "and", "whiskers", "are", "as", "in", "G", ".", "I", ".", "Bar", "plots", "showing", "fold", "changes", "measured", "by", "isoform", "specific", "RT", "-", "qPCR", "of", "PTC", "+", "and", "PTC", "-", "isoform", "from", "genes", "indicated", "on", "the", "bottom", "in", "WT", "and", "CASC3", "-", "KO", "HCT116", "cells", ".", "Relative", "levels", "from", "each", "replicate", "are", "shown", "by", "white", "circles", ".", "Error", "bars", "indicate", "standard", "error", "of", "means", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A, B. Western blots showing levels of EJC proteins or HNRNPA1 (control) in input, IgG IP or EIF4A3 IP following overexpression (OE) of CASC3 wild-type (WT) and EJC binding deficient (HDAA) mutant proteins in (A) HeLa Tet-off cells, and (B) 3BKO#3 HeLa Tet-off cells. Ramps above lanes indicate expression levels of the CASC3 proteins.C. Western blots showing levels of EJC/UPF proteins and HNRNPA1 in input and FLAG followed by EIF4A3 tandem IP from HCT116 cells expressing the FLAG-tagged endogenous protein indicated above each lane. Quantifications of UPF3B and CASC3 protein enrichment from two replicates are shown at the bottom.D. Meta-exon plot showing read distributions within the 100 nucleotide (nt) window from the exon 3′ end in RIPiT-Seq replicates of MAGOH:EIF4A3, UPF3B:EIF4A3, and CASC3:EIF4A3. The black vertical line indicates the -24 nt position.F. Scatter plot comparing log2-transformed fold change in occupancy of CASC3:EIF4A3 EJC as compared to MAGOH:EIF4A3 EJC (x-axis) and UPF3B:EIF4A3 EJC compared to MAGOH:EIF4A3 EJC. Each dot represents a gene where gene-level occupancy of each EJC composition was quantified at the canonical position for EJC footprints. Pearson correlation coefficient is shown on the top left.G. Box plots comparing occupancy of a specific EJC composition on mRNA (indicated on y-axis; normalized by gene expression from RNA-Seq) between genes of different NMD efficiency. Up, no, and down stands for upregulation, no obvious change or downregulation of a representative PTC+ isoform for each gene (see material and methods) that is used to reflect overall NMD efficiency for each gene. In the box plots, central band represents the median, boxes represent the interquartile range (IQR), whiskers indicate maximum (top) and minimum (bottom) values (1.5-times the highest or lowest IQR values, respectively), and circles represent the outliers. p-values are from Wilcoxon signed-rank test comparing the two indicated distributions.H. Box plots as in G comparing specific EJC composition occupancy relative to EJC core occupancy (normalized by MAGOH:EIF4A3 RIPiT-Seq) between genes of different NMD efficiency. Up, no, down, central band, boxes, and whiskers are as in G.I. Bar plots showing fold changes measured by isoform specific RT-qPCR of PTC+ and PTC- isoform from genes indicated on the bottom in WT and CASC3-KO HCT116 cells. Relative levels from each replicate are shown by white circles. Error bars indicate standard error of means."}
{"words": ["Figure", "1Cell", "viability", "analysis", "using", "CellTiter", "-", "Glo", "of", "BN175", "cells", "treated", "with", "the", "indicated", "agents", "for", "24", "hrs", "and", "48", "hrs", "(", "n", "=", "4", "biological", "replicates", ")", ".", "Cell", "viability", "values", "are", "displayed", "as", "a", "percentage", "of", "the", "relative", "untreated", "control", ".", "DMSO", "(", "Unt", ")", ",", "TNF", "(", "10", "ng", "/", "ml", ")", ",", "SM", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", "and", "Mel", "(", "3", ".", "3", "µM", ")", ".", "SM", "represents", "SM", "-", "164", ".", "Error", "bars", "represent", "SD", "and", "statistical", "analysis", "was", "performed", "with", "an", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "0001", ".", "TNF", "-", "induced", "complex", "-", "II", "immuno", "-", "precipitation", ".", "BN175", "cells", "were", "treated", "with", "the", "indicated", "agents", "for", "8", "hrs", ".", "FADD", "immuno", "-", "precipitation", "was", "performed", "followed", "by", "western", "blot", "analysis", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ",", "shown", "is", "a", "representative", "experiment", ")", ".", "DMSO", "(", "Unt", ")", ",", "zVAD", "(", "10", "µM", ")", ",", "TNF", "(", "10", "ng", "/", "ml", ")", ",", "SM", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", "and", "Mel", "(", "3", ".", "3", "µM", ")", ".", "Proximity", "ligation", "assay", "between", "Ripk1", "and", "Casp", "-", "8", "performed", "in", "BN175", "cells", "upon", "treatment", "with", "the", "indicated", "agents", "for", "8", "hrs", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ",", "shown", "are", "representative", "images", ")", ".", "Scale", "bar", "represents", "10", "μm", ".", "DMSO", "(", "Unt", ")", ",", "zVAD", "(", "10", "µM", ")", ",", "TNF", "(", "10", "ng", "/", "ml", ")", ",", "SM", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", "and", "Mel", "(", "3", ".", "3", "µM", ")", ".", "DEVDase", "activity", "assay", "of", "BN175", "cells", "treated", "with", "the", "indicated", "drugs", "for", "6", "hrs", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "DMSO", "(", "Unt", ")", ",", "TNF", "(", "10", "ng", "/", "ml", ")", ",", "SM", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", "and", "Mel", "(", "3", ".", "3", "µM", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "SD", "and", "statistical", "analysis", "was", "performed", "with", "an", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "0001", ".", "Cell", "viability", "analysis", "using", "CellTiter", "-", "Glo", "of", "BN175", "CRISPR", "/", "Cas9", "Ripk1", "and", "Casp", "-", "8", "knockouts", "(", "KO", ")", "cells", "treated", "with", "the", "indicated", "agents", "for", "18", "and", "48", "hrs", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "Cell", "viability", "values", "are", "displayed", "as", "a", "percentage", "of", "the", "relative", "untreated", "control", ".", "SM", "represents", "SM", "-", "164", ".", "Error", "bars", "represent", "SD", "and", "a", "one", "-", "way", "Anova", "was", "performed", "to", "compare", "the", "mean", "value", "of", "each", "treatment", "to", "the", "treated", "BN175", "CRISPR", "/", "Cas9", "control", "(", "Ctrl", ")", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Cell viability analysis using CellTiter-Glo of BN175 cells treated with the indicated agents for 24 hrs and 48 hrs (n = 4 biological replicates). Cell viability values are displayed as a percentage of the relative untreated control. DMSO (Unt), TNF (10 ng/ml), SM (100 ng/ml) and Mel (3.3 µM). SM represents SM-164. Error bars represent SD and statistical analysis was performed with an unpaired t-test, **** P ≤ 0.0001.TNF-induced complex-II immuno-precipitation. BN175 cells were treated with the indicated agents for 8 hrs. FADD immuno-precipitation was performed followed by western blot analysis (n = 3 biological replicates, shown is a representative experiment). DMSO (Unt), zVAD (10 µM), TNF (10 ng/ml), SM (100 ng/ml) and Mel (3.3 µM).Proximity ligation assay between Ripk1 and Casp-8 performed in BN175 cells upon treatment with the indicated agents for 8 hrs (n = 3 biological replicates, shown are representative images). Scale bar represents 10 μm. DMSO (Unt), zVAD (10 µM), TNF (10 ng/ml), SM (100 ng/ml) and Mel (3.3 µM).DEVDase activity assay of BN175 cells treated with the indicated drugs for 6 hrs (n = 3 biological replicates). DMSO (Unt), TNF (10 ng/ml), SM (100 ng/ml) and Mel (3.3 µM). Error bars represent SD and statistical analysis was performed with an unpaired t-test, **** P ≤ 0.0001.Cell viability analysis using CellTiter-Glo of BN175 CRISPR/Cas9 Ripk1 and Casp-8 knockouts (KO) cells treated with the indicated agents for 18 and 48 hrs (n = 3 biological replicates). Cell viability values are displayed as a percentage of the relative untreated control. SM represents SM-164. Error bars represent SD and a one-way Anova was performed to compare the mean value of each treatment to the treated BN175 CRISPR/Cas9 control (Ctrl), **** P ≤ 0.0001."}
{"words": ["Figure", "2TNF", "-", "induced", "complex", "-", "II", "immuno", "-", "precipitation", ".", "HT1080", "cells", "were", "treated", "with", "the", "indicated", "agents", "for", "8", "hrs", ".", "CASP", "-", "8", "immuno", "-", "precipitation", "was", "performed", "followed", "by", "western", "blot", "analysis", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ",", "shown", "is", "a", "representative", "experiment", ")", ".", "DMSO", "(", "Unt", ")", ",", "zVAD", "(", "10", "µM", ")", ",", "TNF", "(", "10", "ng", "/", "ml", ")", "and", "SM", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", ".", "Cell", "death", "analysis", "measured", "by", "Celigo", "of", "PI", "-", "positive", "HT1080", "cells", ",", "cells", "were", "treated", "with", "the", "indicated", "agents", "for", "24", "hrs", ".", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "DMSO", "(", "Unt", ")", ",", "zVAD", "(", "10", "µM", ")", ",", "TNF", "(", "10", "ng", "/", "ml", ")", "and", "SM", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", ".", "SM", "represents", "SM", "-", "164", ".", "Error", "bars", "represent", "SD", "and", "an", "unpaired", "t", "-", "test", "was", "performed", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "0001", ".", "Cell", "death", "analysis", "by", "Celigo", "of", "PI", "-", "positive", "HT1080", "cells", "treated", "with", "the", "indicated", "agents", "for", "72", "hrs", "following", "siCTRL", ",", "siRIPK1", "or", "siCASP", "-", "8", "knockdown", "for", "48", "hrs", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "DMSO", "(", "Unt", ")", ",", "TNF", "(", "10", "ng", "/", "ml", ")", "and", "SM", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", ".", "SM", "represents", "SM", "-", "164", ".", "Error", "bars", "represent", "SD", "and", "a", "one", "-", "way", "Anova", "was", "performed", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "0001", ".", "TNF", "-", "induced", "complex", "-", "II", "immuno", "-", "precipitation", ".", "A375", "cells", "were", "treated", "with", "the", "indicated", "agents", "for", "6", "hrs", ".", "Caspase", "-", "8", "immuno", "-", "precipitation", "was", "performed", "followed", "by", "western", "blot", "analysis", ".", "DMSO", "(", "Unt", ")", ",", "zVAD", "(", "10", "µM", ")", ",", "TNF", "(", "10", "ng", "/", "ml", ")", "and", "SM", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ",", "shown", "is", "a", "representative", "experiment", ")", ".", "Cell", "death", "analysis", "by", "Celigo", "of", "PI", "-", "positive", "A375", "treated", "with", "the", "indicated", "agents", "for", "12", "hrs", ".", "DMSO", "(", "Unt", ")", ",", "zVAD", "(", "10", "µM", ")", ",", "TNF", "(", "10", "ng", "/", "ml", ")", "and", "SM", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", ".", "SM", "represents", "SM", "-", "164", ".", "Error", "bars", "represent", "SD", ".", "Displayed", "are", "representative", "results", "from", "n", "=", "3", ",", "and", "statistical", "analysis", "was", "performed", "with", "an", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "0001", ".", "Cell", "viability", "analysis", "using", "CellTiter", "-", "Glo", "of", "A375", "cells", "treated", "with", "the", "indicated", "drugs", "for", "24", "hrs", "following", "siCTRL", ",", "siRIPK1", "or", "siCASP", "-", "8", "knockdown", "for", "48hrs", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "Cell", "viability", "values", "are", "displayed", "as", "a", "percentage", "of", "the", "relative", "untreated", "control", ".", "DMSO", "(", "Unt", ")", ",", "TNF", "(", "10", "ng", "/", "ml", ")", "and", "SM", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", ".", "SM", "represents", "SM", "-", "164", ".", "Error", "bars", "represent", "SD", "and", "a", "one", "-", "way", "Anova", "was", "performed", "to", "compare", "the", "mean", "value", "of", "each", "treatment", "to", "the", "treated", "A375", "siCTRL", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "0001", ".", "Cell", "death", "analysis", "by", "Celigo", "of", "PI", "-", "positive", "MeWo", "(", "G", ")", ",", "DO4", "(", "H", ")", "or", "SW", "-", "872", "(", "I", ")", "cells", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "the", "indicated", "agents", "for", "24", "hrs", "(", "MeWO", "and", "SW", "-", "872", ")", "or", "12", "hrs", "(", "DO4", ")", ".", "DMSO", "(", "Unt", ")", ",", "zVAD", "(", "10", "µM", ")", ",", "TNF", "(", "10", "ng", "/", "ml", ")", "and", "SM", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", "SM", "represents", "SM", "-", "164", ".", "Error", "bars", "represent", "SD", ".", "Displayed", "are", "representative", "results", "from", "n", "=", "3", ",", "and", "statistical", "analysis", "was", "performed", "with", "an", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "0001", ".", "Cell", "death", "analysis", "by", "Celigo", "of", "PI", "-", "positive", "HS", "-", "ES", "-", "2R", "Cells", "were", "treated", "with", "the", "indicated", "agents", "for", "48", "hrs", "(", "HS", "-", "ES", "-", "2R", ")", "DMSO", "(", "Unt", ")", ",", "zVAD", "(", "10", "µM", ")", ",", "TNF", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", "and", "SM", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", "SM", "represents", "SM", "-", "164", ".", "Error", "bars", "represent", "SD", ".", "Displayed", "are", "representative", "results", "from", "n", "=", "3", ",", "and", "statistical", "analysis", "was", "performed", "with", "an", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "001", ".", "Cell", "death", "analysis", "by", "Celigo", "of", "PI", "-", "positive", "HS", "-", "SY", "-", "II", "cells", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "the", "indicated", "agents", "for", "24", "hrs", "(", "HS", "-", "SY", "-", "II", ")", ".", "DMSO", "(", "Unt", ")", ",", "TNF", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", "and", "SM", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", "SM", "represents", "SM", "-", "164", ".", "Error", "bars", "represent", "SD", ".", "Displayed", "are", "representative", "results", "from", "n", "=", "3", ",", "and", "statistical", "analysis", "was", "performed", "with", "an", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "001", ".", "Cell", "Death", "analysis", "by", "IncuCyte", "Zoom", "of", "CellTox", "Green", "-", "positive", "MET1", "(", "L", ")", ",", "MET2", "(", "M", ")", "and", "IC8", "(", "N", ")", "cells", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "the", "indicated", "agents", "for", "40", "hrs", ".", "DMSO", "(", "Unt", ")", ",", "zVAD", "(", "10", "µM", ")", ",", "TNF", "(", "10", "ng", "/", "ml", ")", "and", "SM", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", "SM", "represents", "SM", "-", "164", ".", "Error", "bars", "represent", "SD", ".", "Displayed", "are", "representative", "results", "from", "n", "=", "6", ",", "and", "statistical", "analysis", "was", "performed", "with", "a", "one", "-", "way", "Anova", ",", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2TNF-induced complex-II immuno-precipitation. HT1080 cells were treated with the indicated agents for 8 hrs. CASP-8 immuno-precipitation was performed followed by western blot analysis (n = 3 biological replicates, shown is a representative experiment). DMSO (Unt), zVAD (10 µM), TNF (10 ng/ml) and SM (100 ng/ml).Cell death analysis measured by Celigo of PI-positive HT1080 cells, cells were treated with the indicated agents for 24 hrs. (n = 3 biological replicates). DMSO (Unt), zVAD (10 µM), TNF (10 ng/ml) and SM (100 ng/ml). SM represents SM-164. Error bars represent SD and an unpaired t-test was performed, **** P ≤ 0.0001.Cell death analysis by Celigo of PI-positive HT1080 cells treated with the indicated agents for 72 hrs following siCTRL, siRIPK1 or siCASP-8 knockdown for 48 hrs (n = 3 biological replicates). DMSO (Unt), TNF (10 ng/ml) and SM (100 ng/ml). SM represents SM-164. Error bars represent SD and a one-way Anova was performed, **** P ≤ 0.0001.TNF-induced complex-II immuno-precipitation. A375 cells were treated with the indicated agents for 6 hrs. Caspase-8 immuno-precipitation was performed followed by western blot analysis. DMSO (Unt), zVAD (10 µM), TNF (10 ng/ml) and SM (100 ng/ml) (n = 3 biological replicates, shown is a representative experiment).Cell death analysis by Celigo of PI-positive A375 treated with the indicated agents for 12 hrs. DMSO (Unt), zVAD (10 µM), TNF (10 ng/ml) and SM (100 ng/ml). SM represents SM-164. Error bars represent SD. Displayed are representative results from n=3, and statistical analysis was performed with an unpaired t-test, **** P ≤ 0.0001.Cell viability analysis using CellTiter-Glo of A375 cells treated with the indicated drugs for 24 hrs following siCTRL, siRIPK1 or siCASP-8 knockdown for 48hrs (n = 3 biological replicates). Cell viability values are displayed as a percentage of the relative untreated control. DMSO (Unt), TNF (10 ng/ml) and SM (100 ng/ml). SM represents SM-164. Error bars represent SD and a one-way Anova was performed to compare the mean value of each treatment to the treated A375 siCTRL, **** P ≤ 0.0001.Cell death analysis by Celigo of PI-positive MeWo (G), DO4 (H) or SW-872 (I) cells. Cells were treated with the indicated agents for 24 hrs (MeWO and SW-872) or 12 hrs (DO4). DMSO (Unt), zVAD (10 µM), TNF (10 ng/ml) and SM (100 ng/ml) SM represents SM-164. Error bars represent SD. Displayed are representative results from n=3, and statistical analysis was performed with an unpaired t-test, **** P ≤ 0.0001.Cell death analysis by Celigo of PI-positive HS-ES-2R Cells were treated with the indicated agents for 48 hrs (HS-ES-2R) DMSO (Unt), zVAD (10 µM), TNF (100 ng/ml) and SM (100 ng/ml) SM represents SM-164. Error bars represent SD. Displayed are representative results from n=3, and statistical analysis was performed with an unpaired t-test, *** P ≤ 0.001.Cell death analysis by Celigo of PI-positive HS-SY-II cells. Cells were treated with the indicated agents for 24 hrs (HS-SY-II). DMSO (Unt), TNF (100 ng/ml) and SM (100 ng/ml) SM represents SM-164. Error bars represent SD. Displayed are representative results from n=3, and statistical analysis was performed with an unpaired t-test, *** P ≤ 0.001.Cell Death analysis by IncuCyte Zoom of CellTox Green-positive MET1 (L), MET2 (M) and IC8 (N) cells. Cells were treated with the indicated agents for 40 hrs. DMSO (Unt), zVAD (10 µM), TNF (10 ng/ml) and SM (100 ng/ml) SM represents SM-164. Error bars represent SD. Displayed are representative results from n=6, and statistical analysis was performed with a one-way Anova, *** P ≤ 0.001, **** P ≤ 0.0001."}
{"words": ["Figure", "3Measurements", "of", "tumour", "volume", "of", "the", "respective", "cohorts", "(", "n", "=", "6", "animals", "per", "cohort", ")", ".", "SM", "represents", "Birinapant", ".", "Error", "bars", "represent", "SD", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "with", "an", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "001", ".", "The", "addition", "of", "SM", "to", "the", "standard", "-", "of", "-", "care", "treatment", "ILP", "-", "TNF", "/", "Mel", "significantly", "prolonged", "survival", "compared", "to", "either", "modality", "alone", "(", "n", "=", "6", "rats", "per", "cohort", ")", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "with", "a", "log", "-", "rank", "test", ",", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "01", ".", "Median", "TNF", "/", "Mel", "is", "0", ".", "4472", "and", "TNF", "/", "Mel", "/", "SM", "is", "1", ".", "154", ".", "TNF", "/", "Mel", "25th", "percentile", "limit", "0", ".", "02887", "and", "75th", "percentile", "limit", "0", ".", "7627", ".", "TNF", "/", "Mel", "/", "SM", "25th", "percentile", "limit", "1", ".", "136", "and", "75th", "percentile", "limit", "1", ".", "67", ".", "TNF", "/", "Mel", "Min", "error", "bar", "-", "0", ".", "2389", "and", "Max", "0", ".", "7687", ".", "TNF", "/", "SM", "/", "Mel", "Min", "error", "bar", "1", ".", "12", "and", "Max", "1", ".", "813", ".", "Error", "bars", "represent", "SD", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "with", "an", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "01", ".", "DEVDase", "activity", "assay", "of", "parental", "BN175", "cells", "and", "drug", "-", "tolerant", "tumour", "cell", "lines", "isolated", "from", "ILP", "-", "TNF", "/", "Mel", "/", "SM", "treated", "animals", "(", "124", ",", "133", ",", "136", ")", ",", "treated", "with", "the", "indicated", "drugs", "for", "6", "hrs", "(", "n", "=", "4", "biological", "repeats", ")", ".", "DMSO", "(", "Unt", ")", ",", "Mel", "(", "3", ".", "3", "µM", ")", ",", "TNF", "(", "10", "ng", "/", "ml", ")", "and", "SM", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", ".", "Cell", "viability", "analysis", "using", "CellTiter", "-", "Glo", "of", "BN175", "parental", "and", "124", ",", "133", "and", "136", "cells", "treated", "with", "the", "indicated", "drugs", "for", "24", "hrs", "(", "n", "=", "3", "biological", "repeats", ")", ".", "DMSO", "(", "Unt", ")", ",", "Mel", "(", "3", ".", "3", "µM", ")", ",", "TNF", "(", "10", "ng", "/", "ml", ")", "and", "SM", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", ".", "SM", "represents", "SM", "-", "164", ".", "Error", "bars", "represent", "SD", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "with", "a", "one", "-", "way", "Anova", ",", "ns", "=", "not", "significant", ".", "Cell", "viability", "analysis", "using", "CellTiter", "-", "Glo", "of", "BN175", "CRISPR", "/", "Cas9", "Ripk1", "and", "Casp", "-", "8", "KO", "cells", "treated", "with", "the", "indicated", "agents", "for", "24", "hrs", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "Cell", "viability", "values", "are", "displayed", "as", "a", "percentage", "of", "the", "relative", "untreated", "control", ".", "DMSO", "(", "Unt", ")", ",", "SM", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", "and", "Riboxxol", "(", "1", "µg", "/", "ml", ")", ".", "SM", "represents", "SM", "-", "164", ".", "Error", "bars", "represent", "SD", "and", "a", "one", "-", "way", "Anova", "was", "performed", "to", "compare", "the", "mean", "value", "of", "each", "treatment", "to", "the", "treated", "BN175", "CRISPR", "/", "Cas9", "control", "(", "Ctrl", ")", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Measurements of tumour volume of the respective cohorts (n = 6 animals per cohort). SM represents Birinapant. Error bars represent SD. Statistical analysis was performed with an unpaired t-test, * P ≤ 0.05, *** P ≤ 0.001.The addition of SM to the standard-of-care treatment ILP-TNF/Mel significantly prolonged survival compared to either modality alone (n = 6 rats per cohort). Statistical analysis was performed with a log-rank test, ** P ≤ 0.01.Median TNF/Mel is 0.4472 and TNF/Mel/SM is 1.154. TNF/Mel 25th percentile limit 0.02887 and 75th percentile limit 0.7627. TNF/Mel/SM 25th percentile limit 1.136 and 75th percentile limit 1.67. TNF/Mel Min error bar -0.2389 and Max 0.7687. TNF/SM/Mel Min error bar 1.12 and Max 1.813. Error bars represent SD. Statistical analysis was performed with an unpaired t-test, ** P ≤ 0.01.DEVDase activity assay of parental BN175 cells and drug-tolerant tumour cell lines isolated from ILP-TNF/Mel/SM treated animals (124, 133, 136), treated with the indicated drugs for 6 hrs (n = 4 biological repeats). DMSO (Unt), Mel (3.3 µM), TNF (10 ng/ml) and SM (100 ng/ml).Cell viability analysis using CellTiter-Glo of BN175 parental and 124, 133 and 136 cells treated with the indicated drugs for 24 hrs (n = 3 biological repeats). DMSO (Unt), Mel (3.3 µM), TNF (10 ng/ml) and SM (100 ng/ml). SM represents SM-164. Error bars represent SD. Statistical analysis was performed with a one-way Anova, ns=not significant.Cell viability analysis using CellTiter-Glo of BN175 CRISPR/Cas9 Ripk1 and Casp-8 KO cells treated with the indicated agents for 24 hrs (n = 3 biological replicates). Cell viability values are displayed as a percentage of the relative untreated control. DMSO (Unt), SM (100 ng/ml) and Riboxxol (1 µg/ml). SM represents SM-164. Error bars represent SD and a one-way Anova was performed to compare the mean value of each treatment to the treated BN175 CRISPR/Cas9 control (Ctrl), **** P ≤ 0.0001."}
{"words": ["Figure", "4Flow", "cytometry", "analysis", "of", "tumours", "collected", "on", "Day", "10", "following", "treatment", "(", "n", "=", "3", "animals", "per", "group", ")", ".", "ILP", "with", "TNF", "/", "Mel", "/", "SM", "significantly", "increased", "infiltration", "by", "CD3", "+", "lymphocytes", "(", "B", ")", "and", "CD3", "-", "CD161", "+", "NK", "cells", "(", "C", ")", ".", "Flow", "cytometry", "analysis", "of", "tumours", "collected", "on", "Day", "10", "following", "treatment", "(", "n", "=", "3", "animals", "per", "group", ")", ".", "While", "ILP", "treatment", "with", "TNF", "/", "Mel", "significantly", "reduced", "Granzyme", "B", "positive", "NK", "cells", "(", "D", ")", ",", "the", "numbers", "of", "Granzyme", "B", "positive", "NK", "cells", "were", "restored", "to", "normal", "levels", "upon", "co", "-", "treatment", "with", "SM", "(", "TNF", "/", "Mel", "/", "SM", ")", ".", "Flow", "cytometry", "analysis", "of", "tumours", "collected", "on", "Day", "10", "following", "treatment", "(", "n", "=", "3", "animals", "per", "group", ")", ".", "Importantly", ",", "ILP", "-", "mediated", "treatment", "with", "TNF", "/", "Mel", "/", "SM", "significantly", "increased", "the", "numbers", "of", "CD3", "+", "CD8", "+", "cytotoxic", "T", "cells", "(", "E", ")", ".", "Flow", "cytometry", "analysis", "of", "tumours", "collected", "on", "Day", "10", "following", "treatment", "(", "n", "=", "3", "animals", "per", "group", ")", ".", "ILP", "-", "TNF", "/", "Mel", "/", "SM", "significantly", "upregulated", "Granzyme", "B", "in", "CD3", "+", "CD8", "+", "CD161", "-", "cytoxtoxic", "T", "cellsILP", "-", "TNF", "/", "Mel", "/", "SM", "significantly", "reduced", "infiltration", "by", "CD3", "+", "CD4", "+", "Foxp3", "-", "T", "cells", "whilst", "(", "G", ")", "increasing", "infiltrations", "by", "CD3", "+", "CD4", "+", "Foxp3", "+", "T", "regulatory", "cells", "(", "H", ")", ".", "A", "non", "-", "significant", "increase", "in", "T", "regulatory", "cell", "ICOS", "expression", "was", "also", "noted", "(", "I", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Flow cytometry analysis of tumours collected on Day 10 following treatment (n = 3 animals per group). ILP with TNF/Mel/SM significantly increased infiltration by CD3+ lymphocytes (B) and CD3-CD161+ NK cells (C).Flow cytometry analysis of tumours collected on Day 10 following treatment (n = 3 animals per group). While ILP treatment with TNF/Mel significantly reduced Granzyme B positive NK cells (D), the numbers of Granzyme B positive NK cells were restored to normal levels upon co-treatment with SM (TNF/Mel/SM).Flow cytometry analysis of tumours collected on Day 10 following treatment (n = 3 animals per group). Importantly, ILP-mediated treatment with TNF/Mel/SM significantly increased the numbers of CD3+CD8+ cytotoxic T cells (E).Flow cytometry analysis of tumours collected on Day 10 following treatment (n = 3 animals per group). ILP-TNF/Mel/SM significantly upregulated Granzyme B in CD3+CD8+CD161- cytoxtoxic T cellsILP-TNF/Mel/SM significantly reduced infiltration by CD3+CD4+Foxp3- T cells whilst (G) increasing infiltrations by CD3+CD4+Foxp3+ T regulatory cells (H).A non-significant increase in T regulatory cell ICOS expression was also noted (I)."}
{"words": ["Figure", "5Measurements", "of", "tumour", "volume", "of", "the", "respective", "cohorts", "(", "n", "=", "6", "animals", "per", "cohort", ")", ".", "SM", "represents", "Birinapant", ".", "Error", "bars", "represent", "SD", ".", "The", "addition", "of", "either", "anti", "-", "CTLA", "-", "4", "or", "anti", "-", "PD", "-", "1", "antibodies", "prolonged", "survival", "in", "comparison", "to", "ILP", "-", "TNF", "/", "Mel", "/", "SM", "alone", "(", "n", "=", "6", "animals", "per", "cohort", ")", ".", "SM", "represents", "Birinapant", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "with", "a", "log", "-", "rank", "test", ",", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ".", "Tumours", "were", "collected", "4", "days", "after", "the", "ILP", "procedure", "and", "analysed", "by", "flow", "cytometry", "(", "n", "=", "3", "per", "cohort", ")", ".", "The", "addition", "of", "anti", "-", "CTLA", "-", "4", "antibodies", "led", "to", "a", "significant", "increase", "in", "CD4", "+", "Foxp3", "-", "helper", "T", "cells", "(", "C", ")", "accompanied", "by", "a", "depletion", "of", "CD4", "+", "Foxp3", "+", "regulatory", "T", "cells", "(", "D", ")", ".", "SM", "represents", "Birinapant", ".", "Tumours", "were", "collected", "4", "days", "after", "the", "ILP", "procedure", "and", "analysed", "by", "flow", "cytometry", "(", "n", "=", "3", "per", "cohort", ")", ".", "The", "addition", "of", "anti", "-", "PD", "-", "1", "antibodies", "led", "to", "an", "increase", "in", "Granzyme", "B", "(", "GzmB", ")", "expression", "on", "NK", "cells", "(", "E", ")", ".", "SM", "represents", "Birinapant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Measurements of tumour volume of the respective cohorts (n = 6 animals per cohort). SM represents Birinapant. Error bars represent SD.The addition of either anti-CTLA-4 or anti-PD-1 antibodies prolonged survival in comparison to ILP-TNF/Mel/SM alone (n = 6 animals per cohort). SM represents Birinapant. Statistical analysis was performed with a log-rank test, * P ≤ 0.05.Tumours were collected 4 days after the ILP procedure and analysed by flow cytometry (n = 3 per cohort). The addition of anti-CTLA-4 antibodies led to a significant increase in CD4+ Foxp3- helper T cells (C) accompanied by a depletion of CD4+ Foxp3+ regulatory T cells (D). SM represents Birinapant.Tumours were collected 4 days after the ILP procedure and analysed by flow cytometry (n = 3 per cohort). The addition of anti-PD-1 antibodies led to an increase in Granzyme B (GzmB) expression on NK cells (E). SM represents Birinapant."}
{"words": ["Figure", "6Tumour", "volumes", "at", "the", "time", "of", "surgery", "following", "ILP", "-", "TNF", "/", "Mel", "or", "ILP", "-", "TNF", "/", "Mel", "/", "SM", "(", "n", "=", "6", "animals", "per", "cohort", ")", ".", "SM", "represents", "Birinapant", ".", "Error", "bars", "represent", "SD", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "with", "an", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "*", "*", ",", "P", "≤", "0", ".", "0001", ".", "Individual", "growth", "curves", "following", "surgery", "indicated", "improved", "control", "following", "ILP", "-", "TNF", "/", "Mel", "/", "SM", "(", "n", "=", "6", "animals", "per", "cohort", ")", ".", "Tumour", "volume", "on", "re", "-", "challenge", "with", "BN175", "sarcoma", "on", "contralateral", "limb", "of", "long", "-", "term", "survivors", "following", "ILP", "-", "TNF", "/", "Mel", "or", "ILP", "-", "TNF", "/", "Mel", "/", "SM", "(", "n", "=", "3", "animals", "per", "TNF", "/", "Mel", "cohort", "and", "n", "=", "5", "per", "TNF", "/", "Mel", "/", "SM", "cohort", ")", ".", "Unless", "otherwise", "stated", ",", "SM", "represents", "Birinapant", ".", "Error", "bars", "represent", "S", ".", "D", ".", "ILP", "-", "TNF", "/", "Mel", "/", "SM", "significantly", "delayed", "growth", "leading", "to", "prolonged", "survival", "on", "re", "-", "challenge", "(", "n", "=", "3", "animals", "per", "TNF", "/", "Mel", "cohort", "and", "n", "=", "5", "per", "TNF", "/", "Mel", "/", "SM", "cohort", ")", ".", "SM", "represents", "Birinapant", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "with", "a", "log", "-", "rank", "test", ",", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Tumour volumes at the time of surgery following ILP-TNF/Mel or ILP-TNF/Mel/SM (n=6 animals per cohort). SM represents Birinapant. Error bars represent SD. Statistical analysis was performed with an unpaired t-test, ****, P ≤ 0.0001.Individual growth curves following surgery indicated improved control following ILP-TNF/Mel/SM (n=6 animals per cohort).Tumour volume on re-challenge with BN175 sarcoma on contralateral limb of long-term survivors following ILP-TNF/Mel or ILP-TNF/Mel/SM (n=3 animals per TNF/Mel cohort and n=5 per TNF/Mel/SM cohort). Unless otherwise stated, SM represents Birinapant. Error bars represent S.D.ILP-TNF/Mel/SM significantly delayed growth leading to prolonged survival on re-challenge (n=3 animals per TNF/Mel cohort and n=5 per TNF/Mel/SM cohort). SM represents Birinapant. Statistical analysis was performed with a log-rank test, * P ≤ 0.05."}
{"words": ["Figure", "1Impaired", "wound", "closure", "in", "αSMA", "-", "TK", "mice", ".", "(", "A", ")", "IHC", "for", "αSMA", "+", "cells", "in", "wound", "tissue", "sections", "at", "day", "6", "post", "-", "wounding", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "µm", ".", "Black", "boxes", "denote", "zoomed", "regions", "displayed", "in", "bottom", "panels", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "αSMA", "+", "cells", "at", "day", "6", "post", "-", "wounding", ".", "WT", ",", "N", "=", "6", ";", "TK", ",", "N", "=", "5", "biological", "replicates", ".", "Two", "-", "tailed", "non", "-", "parametric", "Mann", "-", "Whitney", "test", "performed", ".", "(", "F", ")", "Expression", "levels", "of", "ACTA2", "in", "normal", "and", "diabetic", "human", "wound", "tissue", ".", "RNA", "-", "seq", "reads", "are", "derived", "from", "(", "Davis", "et", "al", ".", ",", "2020", ",", "Data", "ref", ":", "Davis", "et", "al", ",", "2020", ")", ".", "Normal", ",", "N", "=", "3", ";", "diabetic", ",", "N", "=", "4", "biological", "replicates", ".", "Data", "are", "presented", "as", "a", "box", "and", "whisker", "plot", "of", "min", "to", "max", "values", ".", "Unpaired", "t", "-", "test", "performed", ".", "(", "J", "-", "O", ")", "Impaired", "granulation", "tissue", "formation", "and", "angiogenesis", "in", "αSMA", "-", "TK", "mice", ".", "(", "J", ")", "Representative", "H", "&", "E", "images", "of", "wound", "tissue", "sections", "at", "day", "17", "post", "-", "wounding", ".", "Granulation", "areas", "are", "marked", "by", "black", "lines", ",", "triangles", "(", "open", ":", "incomplete", "closure", ",", "filled", ":", "closed", "wounds", ")", "denote", "the", "epithelial", "tongues", ".", "Epi", ",", "epidermis", ";", "derm", ",", "dermis", "regions", "denoted", ".", "Scale", "bar", ":", "200", "μm", ".", "(", "K", ")", "Granulation", "tissue", "thickness", "measured", "on", "digital", "images", "and", "normalized", "to", "the", "average", "values", "in", "the", "WT", "control", "(", "set", "to", "100", "%", ")", ".", "NA", "(", "not", "assessed", ")", "reflects", "the", "lack", "of", "granulation", "in", "αSMA", "-", "TK", "mice", ".", "WT", ",", "N", "=", "5", ";", "TK", ",", "N", "=", "4", "biological", "replicates", ".", "(", "L", ")", "Immunofluorescent", "staining", "for", "CD31", "(", "red", ")", "and", "nuclei", "(", "blue", ")", "on", "wound", "tissue", "sections", "at", "day", "17", "post", "-", "wounding", ".", "White", "boxes", "denote", "zoomed", "regions", "depicted", "in", "right", "panels", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "(", "M", ")", "Quantification", "of", "CD31", "+", "cells", "per", "visual", "field", "normalized", "to", "WT", "mice", ".", "WT", ",", "N", "=", "3", ";", "TK", ",", "N", "=", "5", "biological", "replicates", ".", "(", "N", ")", "IHC", "for", "hypoxyprobe", "(", "brown", ")", "on", "wound", "tissue", "sections", "at", "day", "17", "post", "-", "wounding", ".", "Black", "boxes", "denote", "zoomed", "regions", "depicted", "in", "right", "panels", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "(", "O", ")", "Quantification", "of", "hypoxyprobe", "area", "per", "visual", "field", "normalized", "to", "WT", "mice", ".", "WT", ",", "N", "=", "5", ";", "TK", ",", "N", "=", "6", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Impaired wound closure in αSMA-TK mice. (A) IHC for αSMA+ cells in wound tissue sections at day 6 post-wounding. Representative images are shown. Scale bar, 50 µm. Black boxes denote zoomed regions displayed in bottom panels. (B) Quantification of αSMA+ cells at day 6 post-wounding. WT, N=6; TK, N=5 biological replicates. Two-tailed non-parametric Mann-Whitney test performed.(F) Expression levels of ACTA2 in normal and diabetic human wound tissue. RNA-seq reads are derived from (Davis et al., 2020, Data ref: Davis et al, 2020). Normal, N=3; diabetic, N=4 biological replicates. Data are presented as a box and whisker plot of min to max values. Unpaired t-test performed.(J-O) Impaired granulation tissue formation and angiogenesis in αSMA-TK mice. (J) Representative H&E images of wound tissue sections at day 17 post-wounding. Granulation areas are marked by black lines, triangles (open: incomplete closure, filled: closed wounds) denote the epithelial tongues. Epi, epidermis; derm, dermis regions denoted. Scale bar: 200 μm. (K) Granulation tissue thickness measured on digital images and normalized to the average values in the WT control (set to 100%). NA (not assessed) reflects the lack of granulation in αSMA-TK mice. WT, N=5; TK, N=4 biological replicates. (L) Immunofluorescent staining for CD31 (red) and nuclei (blue) on wound tissue sections at day 17 post-wounding. White boxes denote zoomed regions depicted in right panels. Scale bar, 100 μm. (M) Quantification of CD31+ cells per visual field normalized to WT mice. WT, N=3; TK, N=5 biological replicates. (N) IHC for hypoxyprobe (brown) on wound tissue sections at day 17 post-wounding. Black boxes denote zoomed regions depicted in right panels. Scale bar, 100 μm. (O) Quantification of hypoxyprobe area per visual field normalized to WT mice. WT, N=5; TK, N=6 biological replicates."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "D", ")", "Representative", "FACS", "plots", "of", "digested", "skin", "from", "bone", "marrow", "(", "BM", ")", "transplanted", "αSMA", "-", "RFP", "mice", "17", "days", "post", "-", "wounding", ".", "(", "E", ")", "FACS", "quantification", "of", "αSMA", "-", "RFP", "+", "cells", "in", "wounds", "of", "BM", "transplanted", "mice", ".", "αSMA", "-", "RFP", "with", "αSMA", "-", "RFP", "BM", ",", "N", "=", "2", ";", "WT", "with", "αSMA", "-", "RFP", "BM", ",", "N", "=", "3", ";", "αSMA", "-", "RFP", "with", "WT", "BM", ",", "N", "=", "4", "biological", "replicates", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", "performed", "comparing", "WT", "with", "αSMA", "-", "RFP", "BM", "and", "αSMA", "-", "RFP", "with", "WT", "BM", "to", "αSMA", "-", "RFP", "with", "αSMA", "-", "RFP", "BM", ".", "(", "(", "H", "-", "J", ")", "Multispectral", "imaging", "of", "changes", "in", "fibroblast", "subsets", "during", "wound", "repair", ".", "(", "H", ")", "Representative", "images", "(", "20x", "magnification", ")", "of", "orthogonal", "wound", "tissue", "sections", "at", "day", "6", "post", "-", "wounding", "displaying", "αSMA", ",", "FAP", ",", "and", "FSP1", "overlaid", "with", "DAPI", "in", "the", "wound", "bed", ".", "Subcutaneous", "(", "subq", ")", ",", "dermis", "(", "derm", ")", ",", "epidermis", "(", "epi", ")", ",", "and", "scar", "regions", "are", "denoted", ".", "Individual", "αSMA", ",", "FAP", ",", "and", "FSP1", "channel", "images", "overlaid", "with", "DAPI", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "µm", ".", "(", "I", ")", "Analysis", "of", "multiplex", "immunostaining", "of", "full", "thickness", "skin", "wounds", "performed", "at", "indicated", "time", "points", ".", "Data", "are", "presented", "as", "the", "fractional", "area", "of", "each", "image", "positive", "for", "the", "indicated", "markers", "and", "negative", "for", "CD31", ".", "Day", "0", ",", "N", "=", "2", ";", "Day", "6", ",", "N", "=", "4", ";", "Day", "9", ",", "N", "=", "3", ";", "Day", "14", ",", "N", "=", "3", ";", "Day", "21", ",", "N", "=", "3", ";", "Day", "32", ",", "N", "=", "4", "biological", "replicates", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "with", "Dunnett", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", "performed", ".", "(", "J", ")", "Percent", "overlap", "of", "αSMA", "with", "FAP", "and", "FSP1", "throughout", "wound", "healing", ".", "αSMA", "+", "denotes", "cells", "positive", "for", "αSMA", "but", "not", "FAP", "or", "FSP1", ".", "Day", "0", ",", "N", "=", "2", ";", "Day", "6", ",", "N", "=", "4", ";", "Day", "9", ",", "N", "=", "3", ";", "Day", "14", ",", "N", "=", "3", ";", "Day", "21", ",", "N", "=", "3", ";", "Day", "32", ",", "N", "=", "4", "biological", "replicates", ".", "(", "L", ")", "Representative", "H", "&", "E", "images", "of", "wound", "tissue", "sections", "at", "day", "17", "post", "-", "wounding", ".", "Granulation", "areas", "are", "marked", "by", "black", "lines", ".", "Scale", "bar", ",", "200", "μm", ".", "(", "M", ")", "Granulation", "tissue", "thickness", "measured", "on", "digital", "images", "and", "normalized", "to", "the", "average", "values", "in", "the", "WT", "control", ".", "WT", ",", "N", "=", "3", ";", "FAP", "-", "TK", ",", "N", "=", "3", ";", "WT", ",", "N", "=", "17", ",", "FSP1", "-", "TK", ",", "N", "=", "9", "biological", "replicates", ".", "(", "N", ")", "Immunofluorescent", "staining", "for", "CD31", "(", "red", ")", "and", "nuclei", "on", "wound", "tissue", "sections", "at", "day", "17", "post", "-", "wounding", ".", "White", "boxes", "denote", "zoomed", "regions", "depicted", "in", "right", "panels", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "(", "O", ")", "Quantification", "of", "CD31", "+", "cells", "per", "visual", "field", "normalized", "to", "WT", "mice", ".", "WT", ",", "N", "=", "4", ";", "FAP", "-", "TK", ",", "N", "=", "4", ";", "WT", ",", "N", "=", "3", ";", "FSP1", "-", "TK", ",", "N", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "(", "P", ")", "IHC", "for", "hypoxyprobe", "(", "brown", ")", "on", "wound", "tissue", "sections", "at", "day", "17", "post", "-", "wounding", ".", "Black", "boxes", "denote", "zoomed", "regions", "depicted", "in", "right", "panels", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "(", "Q", ")", "Quantification", "of", "hypoxyprobe", "area", "per", "visual", "field", "normalized", "to", "WT", "mice", ".", "WT", ",", "N", "=", "3", ";", "FAP", "-", "TK", ",", "N", "=", "3", ";", "WT", ",", "N", "=", "3", ";", "FSP1", "-", "TK", ",", "N", "=", "4", "biological", "replicates", ".", "(", "R", ")"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(D) Representative FACS plots of digested skin from bone marrow (BM) transplanted αSMA-RFP mice 17 days post-wounding. (E) FACS quantification of αSMA-RFP+ cells in wounds of BM transplanted mice. αSMA-RFP with αSMA-RFP BM, N=2; WT with αSMA -RFP BM, N=3; αSMA-RFP with WT BM, N=4 biological replicates. One-way ANOVA with Tukey's multiple comparison test performed comparing WT with αSMA-RFP BM and αSMA-RFP with WT BM to αSMA-RFP with αSMA-RFP BM. ((H-J) Multispectral imaging of changes in fibroblast subsets during wound repair. (H) Representative images (20x magnification) of orthogonal wound tissue sections at day 6 post-wounding displaying αSMA, FAP, and FSP1 overlaid with DAPI in the wound bed. Subcutaneous (subq), dermis (derm), epidermis (epi), and scar regions are denoted. Individual αSMA, FAP, and FSP1 channel images overlaid with DAPI. Scale bar, 50 µm. (I) Analysis of multiplex immunostaining of full thickness skin wounds performed at indicated time points. Data are presented as the fractional area of each image positive for the indicated markers and negative for CD31. Day 0, N=2; Day 6, N=4; Day 9, N=3; Day 14, N=3; Day 21, N=3; Day 32, N=4 biological replicates. One-way ANOVA with Dunnett's multiple comparison test performed. (J) Percent overlap of αSMA with FAP and FSP1 throughout wound healing. αSMA+ denotes cells positive for αSMA but not FAP or FSP1. Day 0, N=2; Day 6, N=4; Day 9, N=3; Day 14, N=3; Day 21, N=3; Day 32, N=4 biological replicates.(L) Representative H&E images of wound tissue sections at day 17 post-wounding. Granulation areas are marked by black lines. Scale bar, 200 μm. (M) Granulation tissue thickness measured on digital images and normalized to the average values in the WT control. WT, N=3; FAP-TK, N=3; WT, N=17, FSP1-TK, N=9 biological replicates. (N) Immunofluorescent staining for CD31 (red) and nuclei on wound tissue sections at day 17 post-wounding. White boxes denote zoomed regions depicted in right panels. Scale bar, 100 μm. (O) Quantification of CD31+ cells per visual field normalized to WT mice. WT, N=4; FAP-TK, N=4; WT, N=3; FSP1-TK, N=3 biological replicates. (P) IHC for hypoxyprobe (brown) on wound tissue sections at day 17 post-wounding. Black boxes denote zoomed regions depicted in right panels. Scale bar, 100 μm. (Q) Quantification of hypoxyprobe area per visual field normalized to WT mice. WT, N=3; FAP-TK, N=3; WT, N=3; FSP1-TK, N=4 biological replicates. (R) W"}
{"words": ["Figure", "3", "(", "C", ")", "Enrichment", "plot", "of", "genes", "in", "αSMA", "C1", "(", "left", "panel", ")", ".", "Violin", "plots", "for", "genes", "enriched", "in", "αSMA", "C1", "(", "right", "panels", ")", ".", "(", "D", ")", "Enrichment", "plot", "of", "genes", "in", "αSMA", "C2", "(", "left", "panel", ")", ".", "Violin", "plots", "for", "genes", "enriched", "in", "αSMA", "C2", "(", "right", "panels", ")", ".", "(", "E", ")", "Enrichment", "plot", "of", "genes", "in", "αSMA", "C3", "(", "left", "panel", ")", ".", "Violin", "plots", "of", "enriched", "genes", "in", "the", "αSMA", "C3", "cluster", "(", "right", "panels", ")", ".", "Raw", "scRNA", "-", "seq", "data", "are", "derived", "from", "(", "Haensel", "et", "al", ".", ",", "2020", ",", "Data", "ref", ":", "Haensel", "et", "al", "2020", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(C) Enrichment plot of genes in αSMA C1 (left panel). Violin plots for genes enriched in αSMA C1 (right panels). (D) Enrichment plot of genes in αSMA C2 (left panel). Violin plots for genes enriched in αSMA C2 (right panels). (E) Enrichment plot of genes in αSMA C3 (left panel). Violin plots of enriched genes in the αSMA C3 cluster (right panels). Raw scRNA-seq data are derived from (Haensel et al., 2020, Data ref: Haensel et al 2020). Da"}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "IHC", "for", "collagen", "I", "on", "wound", "tissue", "sections", "at", "day", "17", "post", "-", "wounding", "(", "brown", "stain", ")", ".", "Black", "boxes", "denote", "zoomed", "regions", "depicted", "in", "bottom", "panels", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "collagen", "I", "positive", "area", "normalized", "to", "the", "average", "area", "in", "WT", "controls", ".", "WT", ",", "N", "=", "5", ";", "TK", ",", "N", "=", "5", "biological", "replicates", ".", "(", "C", ")", "Polarized", "light", "images", "of", "picrosirius", "red", "stained", "wound", "tissues", "at", "day", "17", "post", "-", "wounding", ".", "Red", ":", "collagen", "fibers", ".", "White", "boxes", "denote", "zoomed", "regions", "depicted", "in", "bottom", "panels", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "µm", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "collagen", "fiber", "(", "picrosirius", "red", ")", "percent", "area", "normalized", "to", "the", "average", "area", "in", "WT", "controls", ".", "WT", ",", "N", "=", "3", ";", "TK", ",", "N", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "(", "E", "-", "(", "E", "-", "H", ")", "Reduced", "collagen", "deposition", "in", "Col1α1cKO", "wounds", ".", "(", "E", ")", "IHC", "for", "collagen", "I", "on", "wound", "tissue", "sections", "at", "day", "14", "post", "-", "wounding", "(", "brown", "stain", ")", ".", "Black", "boxes", "denote", "zoomed", "regions", "depicted", "in", "bottom", "panels", ".", "Scale", "bar", ":", "25", "μm", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "collagen", "I", "positive", "area", "normalized", "to", "the", "average", "area", "in", "WT", "controls", ".", "WT", ",", "N", "=", "7", ";", "Col1α1cKO", ",", "N", "=", "4", "biological", "replicates", ".", "(", "G", ")", "Polarized", "light", "images", "of", "picrosirius", "red", "stained", "wound", "tissues", "at", "day", "14", "post", "-", "wounding", ".", "Red", ":", "collagen", "fibers", ".", "White", "boxes", "denote", "zoomed", "regions", "depicted", "in", "bottom", "panels", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "µm", ".", "(", "H", ")", "Quantification", "of", "collagen", "fiber", "percent", "area", "and", "fiber", "width", "normalized", "to", "the", "average", "area", "and", "width", ",", "respectively", ",", "in", "WT", "controls", ".", "WT", ",", "N", "=", "4", ";", "Col1α1cKO", ",", "N", "=", "5", "biological", "replicates", ".", "(", "J", "-", "M", ")", "Reepithelization", "and", "vascularization", "in", "WT", "and", "Col1α1cKO", "mice", ".", "(", "J", ")", "Representative", "images", "of", "keratin", "5", "(", "Krt5", ",", "red", ")", "stained", "wounds", "at", "day", "14", "post", "-", "wounding", ".", "White", "boxes", "denote", "zoomed", "regions", "depicted", "in", "right", "panels", ".", "Scale", "bar", ",", "500", "µm", ".", "(", "K", ")", "Quantification", "of", "epidermal", "thickness", ".", "WT", ",", "N", "=", "6", ";", "Col1α1cKO", ",", "N", "=", "5", "biological", "replicates", ".", "(", "L", ")", "Immunofluorescent", "staining", "for", "CD31", "(", "red", ")", "and", "nuclei", "(", "blue", ")", "on", "wound", "tissue", "sections", "at", "day", "14", "post", "-", "wounding", ".", "White", "boxes", "denote", "zoomed", "regions", "depicted", "in", "right", "panels", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "μm", ".", "(", "M", ")", "Quantification", "of", "CD31", "+", "area", "per", "visual", "field", "normalized", "to", "WT", "mice", ".", "WT", ",", "N", "=", "6", ";", "Col1α1cKO", ",", "N", "=", "5", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) IHC for collagen I on wound tissue sections at day 17 post-wounding (brown stain). Black boxes denote zoomed regions depicted in bottom panels. Scale bar: 50 μm. (B) Quantification of collagen I positive area normalized to the average area in WT controls. WT, N=5; TK, N=5 biological replicates. (C) Polarized light images of picrosirius red stained wound tissues at day 17 post-wounding. Red: collagen fibers. White boxes denote zoomed regions depicted in bottom panels. Scale bar, 50 µm. (D) Quantification of collagen fiber (picrosirius red) percent area normalized to the average area in WT controls. WT, N=3; TK, N=3 biological replicates. (E-(E-H) Reduced collagen deposition in Col1α1cKO wounds. (E) IHC for collagen I on wound tissue sections at day 14 post-wounding (brown stain). Black boxes denote zoomed regions depicted in bottom panels. Scale bar: 25 μm. (F) Quantification of collagen I positive area normalized to the average area in WT controls. WT, N=7; Col1α1cKO, N=4 biological replicates. (G) Polarized light images of picrosirius red stained wound tissues at day 14 post-wounding. Red: collagen fibers. White boxes denote zoomed regions depicted in bottom panels. Scale bar, 50 µm. (H) Quantification of collagen fiber percent area and fiber width normalized to the average area and width, respectively, in WT controls. WT, N=4; Col1α1cKO, N=5 biological replicates.(J-M) Reepithelization and vascularization in WT and Col1α1cKO mice. (J) Representative images of keratin 5 (Krt5, red) stained wounds at day 14 post-wounding. White boxes denote zoomed regions depicted in right panels. Scale bar, 500 µm. (K) Quantification of epidermal thickness. WT, N=6; Col1α1cKO, N=5 biological replicates. (L) Immunofluorescent staining for CD31 (red) and nuclei (blue) on wound tissue sections at day 14 post-wounding. White boxes denote zoomed regions depicted in right panels. Scale bar, 20 μm. (M) Quantification of CD31+ area per visual field normalized to WT mice. WT, N=6; Col1α1cKO, N=5 biological replicates."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "C", ")", "IF", "for", "β1", "integrin", "(", "red", ")", "and", "αSMA", "(", "green", ")", "on", "wound", "tissue", "sections", "at", "day", "17", "post", "-", "wounding", ".", "White", "boxes", "denote", "zoomed", "regions", "depicted", "in", "right", "panels", ".", "Scale", "bar", ":", "20", "μm", ".", "(", "F", "-", "K", ")", "Reepithelization", ",", "granulation", "tissue", "formation", ",", "and", "vascularization", "in", "WT", "and", "Itgb1cKO", "mice", ".", "(", "F", ")", "Representative", "images", "of", "keratin", "5", "(", "Krt5", ",", "red", ")", "stained", "wounds", "at", "day", "14", "post", "-", "wounding", ".", "White", "boxes", "denote", "zoomed", "regions", "depicted", "in", "right", "panels", ".", "Scale", "bar", ",", "500", "µm", ".", "(", "G", ")", "Quantification", "of", "epidermal", "thickness", ".", "WT", ",", "N", "=", "4", ";", "Itgb1cKO", ",", "N", "=", "6", "biological", "replicates", ".", "(", "H", ")", "Immunofluorescent", "staining", "for", "CD31", "(", "red", ")", "and", "nuclei", "(", "blue", ")", "on", "wound", "tissue", "sections", "at", "day", "14", "post", "-", "wounding", ".", "White", "boxes", "denote", "zoomed", "regions", "depicted", "in", "right", "panels", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "μm", ".", "(", "I", ")", "Quantification", "of", "CD31", "+", "area", "per", "visual", "field", "normalized", "to", "WT", "mice", ".", "WT", ",", "N", "=", "6", ";", "Itgb1cKO", ",", "N", "=", "6", "biological", "replicates", ".", "(", "J", ")", "Polarized", "light", "images", "of", "picrosirius", "red", "stained", "wound", "tissues", "at", "day", "14", "post", "-", "wounding", ".", "Red", ":", "collagen", "fibers", ".", "White", "boxes", "denote", "zoomed", "regions", "depicted", "in", "right", "panels", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "µm", ".", "(", "K", ")", "Quantification", "of", "collagen", "fiber", "percent", "area", "normalized", "to", "the", "average", "area", "in", "WT", "controls", ".", "WT", ",", "N", "=", "6", ";", "Itgb1cKO", ",", "N", "=", "6", "biological", "replicates", ".", "(", "L", ")", "Quantification", "of", "collagen", "fiber", "width", "normalized", "to", "the", "average", "width", "in", "WT", "controls", ".", "WT", ",", "N", "=", "6", ";", "Itgb1cKO", ",", "N", "=", "6", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(C) IF for β1 integrin (red) and αSMA (green) on wound tissue sections at day 17 post-wounding. White boxes denote zoomed regions depicted in right panels. Scale bar: 20 μm.(F-K) Reepithelization, granulation tissue formation, and vascularization in WT and Itgb1cKO mice. (F) Representative images of keratin 5 (Krt5, red) stained wounds at day 14 post-wounding. White boxes denote zoomed regions depicted in right panels. Scale bar, 500 µm. (G) Quantification of epidermal thickness. WT, N=4; Itgb1cKO, N=6 biological replicates. (H) Immunofluorescent staining for CD31 (red) and nuclei (blue) on wound tissue sections at day 14 post-wounding. White boxes denote zoomed regions depicted in right panels. Scale bar, 20 μm. (I) Quantification of CD31+ area per visual field normalized to WT mice. WT, N=6; Itgb1cKO, N=6 biological replicates. (J) Polarized light images of picrosirius red stained wound tissues at day 14 post-wounding. Red: collagen fibers. White boxes denote zoomed regions depicted in right panels. Scale bar, 50 µm. (K) Quantification of collagen fiber percent area normalized to the average area in WT controls. WT, N=6; Itgb1cKO, N=6 biological replicates. (L) Quantification of collagen fiber width normalized to the average width in WT controls. WT, N=6; Itgb1cKO, N=6 biological replicates. D"}
{"words": ["Figure", "1Neurosphere", "assays", "were", "performed", "using", "mouse", "E14", ".", "5", "primary", "neural", "progenitors", "transduced", "with", "a", "retroviral", "vector", "expressing", "Ttyh1XTT", "assays", "were", "performed", "using", "mouse", "E14", ".", "5", "primary", "neural", "progenitors", "transduced", "with", "a", "retroviral", "vector", "expressing", "Ttyh1Neurosphere", "assays", "were", "performed", "using", "mouse", "E14", ".", "5", "primary", "neural", "progenitors", "transduced", "with", "a", "short", "hairpin", "RNA", "specific", "to", "Ttyh1", "(", "shTtyh1", ")", "XTT", "assays", "were", "performed", "using", "mouse", "E14", ".", "5", "primary", "neural", "progenitors", "transduced", "with", "a", "short", "hairpin", "RNA", "specific", "to", "Ttyh1", "(", "shTtyh1", ")", "Ttyh1", "-", "expressing", "cells", "in", "E15", ".", "5", "embryonic", "brains", "that", "were", "intraventricularly", "electroporated", "at", "E13", ".", "5", "were", "immunostained", "using", "an", "anti", "-", "GFP", "primary", "(", "reporter", "gene", ")", "and", "Alexa", "Fluor", "488", "-", "conjugated", "secondary", "antibodies", ".", "GFP", "immunofluorescence", "(", "green", ")", "was", "merged", "with", "DAPI", "-", "counterstained", "images", "(", "blue", ")", ".", "VZ", ",", "ventricular", "zone", ";", "SVZ", ",", "subventricular", "zone", ";", "IZ", ",", "intermediate", "zone", ";", "CP", ",", "cortical", "plate", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "μm", ".", "Quantification", "of", "(", "E", ")", "Double", "-", "immunolabeling", "of", "E15", ".", "5", "brain", "sections", "electroporated", "in", "utero", "with", "Ttyh1", "-", "expressing", "plasmid", "at", "E13", ".", "5", "using", "anti", "-", "GFP", "(", "green", ")", "and", "Sox2", "(", "red", ")", "antibodies", ",", "and", "Alexa", "Fluor", "488", "-", "and", "555", "-", "conjugated", "secondary", "antibodies", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "Double", "-", "immunolabeling", "of", "E15", ".", "5", "brain", "sections", "electroporated", "in", "utero", "with", "Ttyh1", "-", "expressing", "plasmid", "at", "E13", ".", "5", "using", "anti", "-", "GFP", "(", "green", ")", "and", "Sox2", "(", "red", ")", "antibodies", ",", "and", "Alexa", "Fluor", "488", "-", "and", "555", "-", "conjugated", "secondary", "antibodies", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "Quantification", "of", "(", "G", ")", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Immunolabeling", "of", "E14", ".", "5", "brain", "sections", "electroporated", "in", "utero", "with", "shTtyh1", "alone", "or", "in", "combination", "with", "a", "shTtyh1", "-", "resistant", "Ttyh1", "(", "Ttyh1res", ")", "expression", "vector", "at", "E13", ".", "5", "using", "anti", "-", "GFP", "and", "Alexa", "Fluor", "488", "-", "conjugated", "secondary", "antibodies", ".", "The", "DAPI", "nuclear", "counterstain", "is", "shown", "in", "blue", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "μm", ".", "Quantification", "of", "(", "I", ")"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Neurosphere assays were performed using mouse E14.5 primary neural progenitors transduced with a retroviral vector expressing Ttyh1XTT assays were performed using mouse E14.5 primary neural progenitors transduced with a retroviral vector expressing Ttyh1Neurosphere assays were performed using mouse E14.5 primary neural progenitors transduced with a short hairpin RNA specific to Ttyh1 (shTtyh1)XTT assays were performed using mouse E14.5 primary neural progenitors transduced with a short hairpin RNA specific to Ttyh1 (shTtyh1)Ttyh1-expressing cells in E15.5 embryonic brains that were intraventricularly electroporated at E13.5 were immunostained using an anti-GFP primary (reporter gene) and Alexa Fluor 488-conjugated secondary antibodies. GFP immunofluorescence (green) was merged with DAPI-counterstained images (blue). VZ, ventricular zone; SVZ, subventricular zone; IZ, intermediate zone; CP, cortical plate. Scale bar: 100 μm. Quantification of (E)Double-immunolabeling of E15.5 brain sections electroporated in utero with Ttyh1-expressing plasmid at E13.5 using anti-GFP (green) and Sox2 (red) antibodies, and Alexa Fluor 488- and 555-conjugated secondary antibodies. Scale bar: 50 μm.Double-immunolabeling of E15.5 brain sections electroporated in utero with Ttyh1-expressing plasmid at E13.5 using anti-GFP (green) and Sox2 (red) antibodies, and Alexa Fluor 488- and 555-conjugated secondary antibodies. Scale bar: 50 μm. Quantification of (G) (n = 3).Immunolabeling of E14.5 brain sections electroporated in utero with shTtyh1 alone or in combination with a shTtyh1-resistant Ttyh1 (Ttyh1res) expression vector at E13.5 using anti-GFP and Alexa Fluor 488-conjugated secondary antibodies. The DAPI nuclear counterstain is shown in blue. Scale bar: 100 μm. Quantification of (I)"}
{"words": ["Figure", "2Two", "days", "after", "E14", ".", "5", "primary", "neural", "progenitor", "cells", "were", "transduced", "with", "retroviral", "vectors", "expressing", "(", "A", ")", "Ttyh1", "mRNA", "expression", "levels", "of", "each", "indicated", "Notch", "target", "gene", "were", "measured", "by", "qPCRTwo", "days", "after", "E14", ".", "5", "primary", "neural", "progenitor", "cells", "were", "transduced", "with", "shTtyh1", ",", "mRNA", "expression", "levels", "of", "each", "indicated", "Notch", "target", "gene", "were", "measured", "by", "qPCREffects", "of", "dominant", "negative", "MAML1", "(", "dnMAML1", ")", "on", "Ttyh1", "-", "enhanced", "Notch", "target", "gene", "expression", "were", "tested", "by", "qPCR", "using", "E14", ".", "5", "primary", "neural", "progenitors", "at", "2", "days", "posttransduction", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "The", "dnMAML1", "plasmid", "was", "introduced", "with", "the", "Ttyh1", "vector", "into", "embryonic", "brains", "at", "E13", ".", "5", "and", "cell", "localization", "was", "analyzed", "at", "E15", ".", "5", "by", "anti", "-", "GFP", "immunostaining", ".", "GFP", "and", "DAPI", "signals", "are", "shown", "in", "green", "and", "blue", ",", "respectively", ".", "VZ", ",", "ventricular", "zone", ";", "SVZ", ",", "subventricular", "zone", ";", "IZ", ",", "intermediate", "zone", ";", "CP", ",", "cortical", "plate", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "μm", ".", "E", "Quantification", "of", "GFP", "+", "cell", "positions", "in", "(", "D", ")", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "The", "NICD", "plasmid", "was", "electroporated", "with", "the", "Ttyh1", "knockdown", "vector", "(", "shTtyh1", ")", "into", "embryonic", "brains", "at", "E13", ".", "5", "and", "cell", "localization", "was", "analyzed", "at", "E14", ".", "5", "by", "anti", "-", "GFP", "immunostaining", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "μm", ".", "G", "Quantification", "of", "GFP", "+", "cell", "positions", "in", "(", "F", ")", "(", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Two days after E14.5 primary neural progenitor cells were transduced with retroviral vectors expressing (A) Ttyh1 mRNA expression levels of each indicated Notch target gene were measured by qPCRTwo days after E14.5 primary neural progenitor cells were transduced with shTtyh1, mRNA expression levels of each indicated Notch target gene were measured by qPCREffects of dominant negative MAML1 (dnMAML1) on Ttyh1-enhanced Notch target gene expression were tested by qPCR using E14.5 primary neural progenitors at 2 days posttransduction (n = 4).The dnMAML1 plasmid was introduced with the Ttyh1 vector into embryonic brains at E13.5 and cell localization was analyzed at E15.5 by anti-GFP immunostaining. GFP and DAPI signals are shown in green and blue, respectively. VZ, ventricular zone; SVZ, subventricular zone; IZ, intermediate zone; CP, cortical plate. Scale bar: 100 μm. E Quantification of GFP+ cell positions in (D) (n = 3). The NICD plasmid was electroporated with the Ttyh1 knockdown vector (shTtyh1) into embryonic brains at E13.5 and cell localization was analyzed at E14.5 by anti-GFP immunostaining. Scale bar: 100 μm. G Quantification of GFP+ cell positions in (F) (n = 3). "}
{"words": ["Figure", "3Effects", "of", "Ttyh1", "expression", "on", "the", "generation", "of", "NICD", "at", "2", "days", "posttransduction", "of", "E14", ".", "5", "neural", "progenitor", "cells", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "using", "an", "anti", "-", "NICD", "antibody", ".", "Quantification", "of", "band", "intensitiesEffects", "of", "Ttyh1", "knockdown", "(", "C", ")", "on", "the", "generation", "of", "NICD", "at", "2", "days", "posttransduction", "of", "E14", ".", "5", "neural", "progenitor", "cells", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "using", "an", "anti", "-", "NICD", "antibody", ".", "(", "B", ",", "D", ")", "Quantification", "of", "band", "intensitiesTtyh1", "-", "transduced", "E14", ".", "5", "neural", "progenitors", "were", "incubated", "with", "DAPT", "for", "2", "days", ",", "then", "cells", "were", "harvested", "and", "lysates", "were", "used", "for", "luciferase", "assay", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Effects", "of", "Ttyh1", "-", "knockdown", "on", "γ", "-", "secretase", "activity", "was", "also", "assessed", "using", "E14", ".", "5", "neural", "progenitor", "cellsTtyh1", "-", "transduced", "E14", ".", "5", "neural", "progenitors", "were", "incubated", "for", "2", "days", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "DAPT", ",", "and", "samples", "were", "prepared", "for", "Western", "blotting", "using", "anti", "-", "NICD", "antibodyTtyh1", "-", "transduced", "E14", ".", "5", "neural", "progenitors", "were", "incubated", "for", "2", "days", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "DAPT", ",", "and", "samples", "were", "prepared", "for", "qPCR", "for", "Notch", "target", "genes", "(", "I", ")", "The", "indicated", "plasmids", "were", "electroporated", "into", "E13", ".", "5", "brains", ",", "and", "brain", "samples", "were", "harvested", "at", "E15", ".", "5", "for", "anti", "-", "GFP", "immunolabeling", ".", "GFP", "and", "DAPI", "signals", "are", "shown", "in", "green", "and", "blue", ",", "respectively", ".", "Quantification", "of", "GFP", "+", "cell", "localization", "in", "(", "J", ")", "dnPS1", ",", "dominant", "negative", "presenilin", "1", ";", "VZ", ",", "ventricular", "zone", ";", "SVZ", ",", "subventricular", "zone", ";", "IZ", ",", "intermediate", "zone", ";", "CP", ",", "cortical", "plate", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Effects of Ttyh1 expression on the generation of NICD at 2 days posttransduction of E14.5 neural progenitor cells were analyzed by Western blotting using an anti-NICD antibody. Quantification of band intensitiesEffects of Ttyh1 knockdown (C) on the generation of NICD at 2 days posttransduction of E14.5 neural progenitor cells were analyzed by Western blotting using an anti-NICD antibody. (B, D) Quantification of band intensitiesTtyh1-transduced E14.5 neural progenitors were incubated with DAPT for 2 days, then cells were harvested and lysates were used for luciferase assay (n = 3).Effects of Ttyh1-knockdown on γ-secretase activity was also assessed using E14.5 neural progenitor cellsTtyh1-transduced E14.5 neural progenitors were incubated for 2 days in the presence or absence of DAPT, and samples were prepared for Western blotting using anti-NICD antibodyTtyh1-transduced E14.5 neural progenitors were incubated for 2 days in the presence or absence of DAPT, and samples were prepared for qPCR for Notch target genes (I)The indicated plasmids were electroporated into E13.5 brains, and brain samples were harvested at E15.5 for anti-GFP immunolabeling. GFP and DAPI signals are shown in green and blue, respectively. Quantification of GFP+ cell localization in (J) dnPS1, dominant negative presenilin 1; VZ, ventricular zone; SVZ, subventricular zone; IZ, intermediate zone; CP, cortical plate. Scale bar: 100 μm."}
{"words": ["Figure", "4Effects", "of", "the", "ion", "selectivity", "-", "perturbing", "R371Q", "mutation", "in", "Ttyh1", "E14", ".", "5", "neural", "progenitor", "cells", "were", "transduced", "with", "retroviral", "vectors", "expressing", "each", "indicated", "gene", ",", "and", "2", "days", "posttransduction", ",", "cells", "were", "harvested", "for", "qPCR", "analyses", "of", "Notch", "target", "mRNAs", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Effects", "of", "the", "ion", "selectivity", "-", "perturbing", "R371Q", "mutation", "in", "other", "Ttyh", "family", "members", "on", "Notch", "-", "dependent", "transcription", ".", "E14", ".", "5", "neural", "progenitor", "cells", "were", "transduced", "with", "retroviral", "vectors", "expressing", "each", "indicated", "gene", ",", "and", "2", "days", "posttransduction", ",", "cells", "were", "harvested", "for", "qPCR", "analyses", "of", "Notch", "target", "mRNAs", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Immunolabeling", "of", "E15", ".", "5", "brain", "sections", "electroporated", "in", "utero", "with", "indicated", "plasmids", "at", "E13", ".", "5", "using", "anti", "-", "GFP", "and", "Alexa", "Fluor", "488", "-", "conjugated", "secondary", "antibodies", ".", "GFP", "immunofluorescence", "(", "green", ")", "was", "merged", "with", "DAPI", "-", "counterstained", "images", "(", "blue", ")", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "GFP", "+", "cell", "localization", "in", "(", "C", ")", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "VZ", ",", "ventricular", "zone", ";", "SVZ", ",", "subventricular", "zone", ";", "IZ", ",", "intermediate", "zone", ";", "CP", ",", "cortical", "plate", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "μm", ".", "series", "of", "Ttyh1", "mutants", "with", "deletions", "in", "the", "C", "-", "terminal", "cytoplasmic", "tail", "region", ",", "and", "(", "F", ")", "their", "effects", "on", "cell", "distribution", "assessed", "by", "intraventricular", "in", "utero", "electroporation", "at", "E13", ".", "5", "followed", "by", "immunolabeling", "at", "E15", ".", "5", "using", "anti", "-", "GFP", "antibody", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Effects of the ion selectivity-perturbing R371Q mutation in Ttyh1 E14.5 neural progenitor cells were transduced with retroviral vectors expressing each indicated gene, and 2 days posttransduction, cells were harvested for qPCR analyses of Notch target mRNAs (n = 3).Effects of the ion selectivity-perturbing R371Q mutation in other Ttyh family members on Notch-dependent transcription. E14.5 neural progenitor cells were transduced with retroviral vectors expressing each indicated gene, and 2 days posttransduction, cells were harvested for qPCR analyses of Notch target mRNAs (n = 3).Immunolabeling of E15.5 brain sections electroporated in utero with indicated plasmids at E13.5 using anti-GFP and Alexa Fluor 488-conjugated secondary antibodies. GFP immunofluorescence (green) was merged with DAPI-counterstained images (blue). (D) Quantification of GFP+ cell localization in (C) (n = 3). VZ, ventricular zone; SVZ, subventricular zone; IZ, intermediate zone; CP, cortical plate. Scale bar: 100 μm.series of Ttyh1 mutants with deletions in the C-terminal cytoplasmic tail region , and (F) their effects on cell distribution assessed by intraventricular in utero electroporation at E13.5 followed by immunolabeling at E15.5 using anti-GFP antibody. Scale bar: 100 μm."}
{"words": ["Figure", "5Representative", "Western", "blots", "showing", "coimmunoprecipitation", "(", "coIP", ")", "of", "HA", "-", "tagged", "Rer1", "with", "Myc", "-", "tagged", "Ttyh1", "using", "the", "HEK293T", "cell", "line", ".", "WCL", ",", "whole", "-", "cell", "lysates", ".", "Venus", "fluorescent", "protein", "-", "based", "bimolecular", "fluorescence", "complementation", "analysis", "of", "Ttyh1", "and", "Rer1", "interaction", "(", "green", ")", "in", "living", "COS", "-", "7", "cells", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "Ttyh1", "and", "Rer1", "were", "tagged", "with", "N", "-", "and", "C", "-", "terminal", "fragments", "of", "the", "Venus", "fluorescent", "protein", "(", "VN", "and", "VC", ")", ",", "respectively", ".", "DsRed2", "-", "ER", "was", "cotransfected", "to", "label", "the", "endoplasmic", "reticulum", "(", "ER", ",", "red", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "25", "μm", ".", "CoIP", "assays", "were", "performed", "with", "anti", "-", "Ttyh1", "and", "anti", "-", "Rer1", "antibodies", "to", "show", "endogenous", "interaction", "between", "Ttyh1", "and", "Rer1", "in", "U373MG", "cells", ".", "Western", "blot", "analyses", "of", "endogenous", "Rer1", "proteins", "were", "performed", "at", "2", "days", "posttransduction", "using", "E14", ".", "5", "primary", "neural", "progenitor", "cells", "transduced", "with", "retroviral", "vectors", "expressing", "(", "D", ")", "Ttyh1", "Quantification", "of", "relative", "band", "intensitiesD", "-", "G", "Western", "blot", "analyses", "of", "endogenous", "Rer1", "proteins", "were", "performed", "at", "2", "days", "posttransduction", "using", "E14", ".", "5", "primary", "neural", "progenitor", "cells", "transduced", "with", "retroviral", "vectors", "expressing", "shTtyh1", ".", "Quantification", "of", "relative", "band", "intensitiesCell", "extracts", "from", "primary", "neural", "progenitor", "cells", "transduced", "with", "Ttyh1", "retroviruses", "in", "the", "presence", "of", "DMSO", "vehicle", "or", "a", "proteasome", "inhibitor", "lactacystin", "(", "10", "μM", ")", ",", "were", "immunoblotted", "with", "an", "antibody", "to", "Rer1", ".", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "Ttyh1", "-", "Myc", "and", "Rer1", "-", "HA", "expression", "plasmids", ",", "and", "after", "24", "h", ",", "cells", "were", "treated", "with", "cycloheximide", "(", "CHX", ")", "(", "100", "μg", "/", "ml", ")", "and", "then", "harvested", "at", "the", "indicated", "time", "intervals", ".", "Cell", "lysates", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "using", "anti", "-", "HA", "antibody", ".", "(", "J", ")", "Quantification", "of", "band", "intensities", "in", "(", "I", ")", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "γ", "-", "secretase", "-", "dependent", "luciferase", "activity", "was", "measured", "using", "primary", "neural", "progenitor", "cells", "transduced", "with", "Ttyh1", "with", "or", "without", "Rer1", "retroviral", "vectors", "at", "2", "days", "posttransduction", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Effects", "of", "Rer1", "expression", "on", "Ttyh1", "activity", "in", "vivo", "were", "examined", "by", "in", "utero", "electroporation", "into", "E13", ".", "5", "brains", "and", "subsequent", "GFP", "immunofluorescence", "of", "E15", ".", "5", "brain", "sections", ".", "GFP", "and", "DAPI", "signals", "are", "shown", "in", "green", "and", "blue", ",", "respectively", ".", "(", "M", ")", "Distribution", "of", "GFP", "+", "cells", "in", "each", "brain", "layer", "in", "(", "L", ")", "was", "quantified", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "VZ", ",", "ventricular", "zone", ";", "SVZ", ",", "subventricular", "zone", ";", "IZ", ",", "intermediate", "zone", ";", "CP", ",", "cortical", "plate", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Representative Western blots showing coimmunoprecipitation (coIP) of HA-tagged Rer1 with Myc-tagged Ttyh1 using the HEK293T cell line. WCL, whole-cell lysates.Venus fluorescent protein-based bimolecular fluorescence complementation analysis of Ttyh1 and Rer1 interaction (green) in living COS-7 cells by fluorescence microscopy. Ttyh1 and Rer1 were tagged with N- and C-terminal fragments of the Venus fluorescent protein (VN and VC), respectively. DsRed2-ER was cotransfected to label the endoplasmic reticulum (ER, red). Scale bar: 25 μm.CoIP assays were performed with anti-Ttyh1 and anti-Rer1 antibodies to show endogenous interaction between Ttyh1 and Rer1 in U373MG cells.Western blot analyses of endogenous Rer1 proteins were performed at 2 days posttransduction using E14.5 primary neural progenitor cells transduced with retroviral vectors expressing (D) Ttyh1 Quantification of relative band intensitiesD-G Western blot analyses of endogenous Rer1 proteins were performed at 2 days posttransduction using E14.5 primary neural progenitor cells transduced with retroviral vectors expressing shTtyh1. Quantification of relative band intensitiesCell extracts from primary neural progenitor cells transduced with Ttyh1 retroviruses in the presence of DMSO vehicle or a proteasome inhibitor lactacystin (10 μM), were immunoblotted with an antibody to Rer1.HEK293T cells were transfected with Ttyh1-Myc and Rer1-HA expression plasmids, and after 24 h, cells were treated with cycloheximide (CHX) (100 μg/ml) and then harvested at the indicated time intervals. Cell lysates were analyzed by Western blotting using anti-HA antibody. (J) Quantification of band intensities in (I) (n = 3).γ-secretase-dependent luciferase activity was measured using primary neural progenitor cells transduced with Ttyh1 with or without Rer1 retroviral vectors at 2 days posttransduction (n = 3).Effects of Rer1 expression on Ttyh1 activity in vivo were examined by in utero electroporation into E13.5 brains and subsequent GFP immunofluorescence of E15.5 brain sections. GFP and DAPI signals are shown in green and blue, respectively. (M) Distribution of GFP+ cells in each brain layer in (L) was quantified (n = 3). VZ, ventricular zone; SVZ, subventricular zone; IZ, intermediate zone; CP, cortical plate. Scale bar: 100 μm."}
{"words": ["f1", "(", "b", ",", "c", ")", "Effects", "of", "miR", "-", "212", "and", "miR", "-", "132", "precursors", "and", "inhibitors", "(", "anti", ")", "on", "cardiomyocyte", "cell", "size", "as", "compared", "with", "the", "effects", "of", "scrambled", "(", "Scr", ")", "controls", "(", "n", "=", "5", "-", "13", ")", ".", "Representative", "images", "used", "for", "quantification", "of", "cardiomyocyte", "cell", "size", "are", "shown", "in", "c", ".", "(", "d", ")", "Effects", "of", "various", "pro", "-", "hypertrophic", "stimuli", "on", "miR", "-", "212", "and", "miR", "-", "132", "expression", "in", "neonatal", "cardiomyocytes", "(", "n", "=", "6", "-", "10", ")", ".", "(", "e", ")", "miR", "-", "212", "and", "miR", "-", "132", "expression", "levels", "during", "pressure", "-", "induced", "left", "ventricular", "hypertrophy", "3", "and", "21", "days", "after", "transaortic", "constriction", "(", "TAC", ")", "surgery", "of", "mice", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "(", "f", ")", "Cardiomyocyte", "diameters", "after", "Sham", "operation", "or", "3", ",", "14", "and", "35", "days", "after", "TAC", "(", "n", "=", "4", "per", "group", ")", ".", "(", "g", ",", "h", ")", "miR", "-", "212", "and", "miR", "-", "132", "expression", "(", "normalized", "to", "sno", "-", "202", "levels", ")", "in", "fractionated", "cardiomyocytes", "and", "cardiac", "fibroblasts", "derived", "from", "adult", "mice", "after", "3", "and", "35", "days", "of", "TAC", ".", "All", "values", "represent", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "P0", ".", "05", ";", "*", "*", "P0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P0", ".", "005", ".", "Scale", "bar", "in", "c", "represents", "50", "μm", ".", "ACTN2", ",", "α", "-", "cardiac", "actinin", ";", "Ang", "II", ",", "angiotensin", "-", "2", ";", "a", ".", "u", ".", ",", "arbitrary", "unit", ";", "d", ",", "day", ";", "DAPI", ",", "4", "′", ",", "6", "-", "diamidino", "-", "2", "-", "phenylindole", ";", "FC", ",", "fold", "change", ";", "NS", ",", "no", "significant", "difference", ";", "P", "/", "I", ",", "phenylephrine", "/", "isoprenaline", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f1(b,c) Effects of miR-212 and miR-132 precursors and inhibitors (anti) on cardiomyocyte cell size as compared with the effects of scrambled (Scr) controls (n=5-13). Representative images used for quantification of cardiomyocyte cell size are shown in c.(d) Effects of various pro-hypertrophic stimuli on miR-212 and miR-132 expression in neonatal cardiomyocytes (n=6-10).(e) miR-212 and miR-132 expression levels during pressure-induced left ventricular hypertrophy 3 and 21 days after transaortic constriction (TAC) surgery of mice (n=4).(f) Cardiomyocyte diameters after Sham operation or 3, 14 and 35 days after TAC (n=4 per group).(g,h) miR-212 and miR-132 expression (normalized to sno-202 levels) in fractionated cardiomyocytes and cardiac fibroblasts derived from adult mice after 3 and 35 days of TAC. All values represent mean±s.e.m. *P0.05; **P0.01; ***P0.005. Scale bar in c represents 50 μm. ACTN2, α-cardiac actinin; Ang II, angiotensin-2; a.u., arbitrary unit; d, day; DAPI, 4′,6-diamidino-2-phenylindole; FC, fold change; NS, no significant difference; P/I, phenylephrine/isoprenaline."}
{"words": ["f2", "(", "b", ")", "Expression", "levels", "of", "miR", "-", "212", "and", "miR", "-", "132", "in", "heart", "samples", "of", "individual", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "miR", "-", "212", "/", "132", "transgenic", "(", "TG", ")", "mice", "as", "assayed", "by", "RT", "-", "PCR", "analysis", "against", "the", "mature", "forms", "of", "corresponding", "microRNAs", ".", "Rnu6b", "was", "used", "as", "housekeeping", "control", ".", "(", "c", ")", "Survival", "rate", "of", "two", "different", "miR", "-", "212", "/", "132", "TG", "mouse", "families", "(", "TG", "-", "Fam23", ",", "TG", "-", "Fam43", ")", "versus", "WT", "controls", "was", "analysed", "by", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "assay", "(", "n", "=", "87", ",", "65", "and", "53", "for", "WT", ",", "TG", "-", "Fam23", "and", "TG", "-", "Fam43", ",", "respectively", ")", ".", "(", "d", ")", "Morphology", "of", "explanted", "hearts", "from", "TG", "and", "WT", "mice", "at", "10", "weeks", "after", "birth", ".", "Scale", "bar", ",", "1", "cm", ".", "(", "e", ",", "f", ")", "Heart", "-", "to", "-", "body", "-", "weight", "ratios", "(", "e", ")", "and", "cardiomyocyte", "diameter", "(", "f", ")", "in", "8", "-", "week", "-", "old", "α", "-", "MHC", "-", "miR", "-", "212", "/", "132", "transgenic", "mice", "compared", "with", "their", "wild", "-", "type", "littermates", "(", "n", "=", "5", "-", "7", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "(", "g", "-", "i", ")", "Echocardiography", "analysis", "of", "cardiac", "dimensions", "and", "function", "for", "α", "-", "MHC", "-", "miR", "-", "212", "/", "132", "TG", "mice", "and", "WT", "controls", "(", "n", "=", "16", "-", "18", ")", "(", "g", ")", "end", "-", "systolic", "area", ",", "(", "h", ")", "end", "-", "diastolic", "area", ",", "(", "i", ")", "fractional", "shortening", ".", "All", "values", "in", "e", "-", "i", "represent", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "P0", ".", "05", ";", "*", "*", "P0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P0", ".", "005", ".", "DAPI", ",", "4", "′", ",", "6", "-", "diamidino", "-", "2", "-", "phenylindole", ";", "WGA", ",", "wheat", "germ", "agglutinin", "(", "membrane", "stain", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f2(b) Expression levels of miR-212 and miR-132 in heart samples of individual wild-type (WT) and miR-212/132 transgenic (TG) mice as assayed by RT-PCR analysis against the mature forms of corresponding microRNAs. Rnu6b was used as housekeeping control.(c) Survival rate of two different miR-212/132 TG mouse families (TG-Fam23, TG-Fam43) versus WT controls was analysed by Kaplan-Meier survival assay (n=87, 65 and 53 for WT, TG-Fam23 and TG-Fam43, respectively).(d) Morphology of explanted hearts from TG and WT mice at 10 weeks after birth. Scale bar, 1 cm.(e,f) Heart-to-body-weight ratios (e) and cardiomyocyte diameter (f) in 8-week-old α-MHC-miR-212/132 transgenic mice compared with their wild-type littermates (n=5-7). Scale bar, 50 μm.(g-i) Echocardiography analysis of cardiac dimensions and function for α-MHC-miR-212/132 TG mice and WT controls (n=16-18) (g) end-systolic area, (h) end-diastolic area, (i) fractional shortening. All values in e-i represent mean±s.e.m. *P0.05; **P0.01; ***P0.005. DAPI, 4′,6-diamidino-2-phenylindole; WGA, wheat germ agglutinin (membrane stain)."}
{"words": ["f3", "(", "a", ")", "Heart", "-", "to", "-", "body", "-", "weight", "ratios", "for", "12", "-", "week", "-", "old", "miR", "-", "212", "/", "132", "null", "(", "KO", ")", "and", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "mice", "(", "n", "=", "5", "-", "6", ")", ".", "(", "b", ")", "Cardiomyocyte", "cell", "size", "of", "neonatal", "miR", "-", "212", "/", "132", "null", "and", "WT", "mice", "(", "n", "=", "5", "-", "6", "isolations", ")", ".", "(", "c", "-", "f", ")", "Heart", "-", "to", "-", "body", "-", "weight", "ratios", "(", "c", ")", "in", "Sham", "-", "operated", "WT", "mice", "and", "miR", "-", "212", "/", "132", "null", "and", "WT", "mice3", "weeks", "after", "TAC", "surgery", "(", "n", "=", "4", "-", "7", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "(", "c", "-", "f", ")", "cardiomyocyte", "diameter", "(", "d", ")", ",", "cardiac", "fibrosis", "(", "e", ")", "in", "Sham", "-", "operated", "WT", "mice", "and", "miR", "-", "212", "/", "132", "null", "and", "WT", "mice3", "weeks", "after", "TAC", "surgery", "(", "n", "=", "4", "-", "7", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "(", "c", "-", "f", ")", "lung", "wet", "weight", "(", "f", ")", "in", "Sham", "-", "operated", "WT", "mice", "and", "miR", "-", "212", "/", "132", "null", "and", "WT", "mice", "3", "weeks", "after", "TAC", "surgery", "(", "n", "=", "4", "-", "7", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "(", "g", "-", "i", ")", "Echocardiography", "analysis", "of", "cardiac", "dimensions", "and", "function", "in", "Sham", "-", "operated", "WT", "mice", "and", "miR", "-", "212", "/", "132", "null", "and", "WT", "mice", "3", "weeks", "after", "TAC", "(", "n", "=", "4", "-", "11", ")", ".", "(", "g", ")", "End", "-", "diastolic", "area", ",", "(", "h", ")", "end", "-", "systolic", "area", "and", "(", "i", ")", "fractional", "shortening", ".", "All", "values", "represent", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "P0", ".", "05", ";", "*", "*", "P0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P0", ".", "005", ";", "#", "P0", ".", "05", "compared", "with", "WT", "TAC", ";", "#", "#", "#", "P0", ".", "005", "compared", "with", "WT", "TAC", ";", "PSR", ",", "picrosirius", "red", "(", "collagen", "stain", ")", ".", "DAPI", ",", "4", "′", ",", "6", "-", "diamidino", "-", "2", "-", "phenylindole", ";", "WGA", ",", "wheat", "germ", "agglutinin", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f3(a) Heart-to-body-weight ratios for 12-week-old miR-212/132 null (KO) and wild-type (WT) mice (n=5-6).(b) Cardiomyocyte cell size of neonatal miR-212/132 null and WT mice (n=5-6 isolations).(c-f) Heart-to-body-weight ratios (c) in Sham-operated WT mice and miR-212/132 null and WT mice3 weeks after TAC surgery (n=4-7). Scale bar, 50 μm.(c-f) cardiomyocyte diameter (d), cardiac fibrosis (e) in Sham-operated WT mice and miR-212/132 null and WT mice3 weeks after TAC surgery (n=4-7). Scale bar, 50 μm.(c-f) lung wet weight (f) in Sham-operated WT mice and miR-212/132 null and WT mice 3 weeks after TAC surgery (n=4-7). Scale bar, 50 μm.(g-i) Echocardiography analysis of cardiac dimensions and function in Sham-operated WT mice and miR-212/132 null and WT mice 3 weeks after TAC (n=4-11). (g) End-diastolic area, (h) end-systolic area and (i) fractional shortening. All values represent mean±s.e.m. *P0.05; **P0.01; ***P0.005; #P0.05 compared with WT TAC; ###P0.005 compared with WT TAC; PSR, picrosirius red (collagen stain). DAPI, 4′,6-diamidino-2-phenylindole; WGA, wheat germ agglutinin."}
{"words": ["f4", "(", "a", ")", "Luciferase", "activity", "levels", "upon", "cotransfection", "of", "a", "luciferase", "construct", "containing", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "or", "mutated", "(", "Mut", ".", ")", "3", "′", "UTR", "of", "FoxO3", "with", "scrambled", "(", "Scr", ")", "control", "(", "Ctrl", ")", ",", "pre", "-", "miR", "-", "132", "or", "pre", "-", "miR", "-", "212", "(", "n", "=", "9", ")", ".", "(", "b", ",", "c", ")", "Expression", "levels", "of", "FoxO3", "on", "mRNA", "(", "b", ")", "and", "protein", "levels", "(", "c", ")", "in", "hearts", "of", "WT", "and", "α", "-", "MHC", "-", "miR", "-", "212", "/", "-", "132", "transgenic", "(", "TG", ")", "mice", ".", "M", ":", "Size", "marker", "(", "n", "=", "9", "-", "13", ")", ".", "(", "d", ")", "FoxO3", "mRNA", "levels", "in", "neonatal", "rat", "cardiomyocytes", "transfected", "with", "Scr", "Ctrl", ",", "anti", "-", "miR", "-", "212", "and", "anti", "-", "miR", "-", "132", "after", "phenylephrine", "(", "PE", ",", "10", "μM", ")", "treatment", "(", "n", "=", "6", "-", "9", ";", "P", "-", "values", "against", "Scr", "+", "PE", ")", ".", "(", "e", "-", "g", ")", "Expression", "levels", "of", "atrogin", "-", "1", "(", "e", ")", "and", "Mcip1", "(", "f", ")", "and", "calcineurin", "phosphatase", "activity", "levels", "(", "g", ")", "in", "hearts", "of", "WT", "and", "α", "-", "MHC", "-", "miR", "-", "212", "/", "132", "TG", "mice", "(", "n", "=", "5", "-", "9", ")", ".", "(", "h", ")", "Luciferase", "activity", "levels", "showing", "the", "NFAT", "transcriptional", "activity", "in", "cardiomyocytes", "transfected", "with", "Scr", "Ctrl", ",", "pre", "-", "miR", "-", "132", "or", "pre", "-", "miR", "-", "212", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "(", "i", ",", "j", ")", "Mcip1", ".", "4", "(", "i", ")", "and", "atrogin", "-", "1", "(", "j", ")", "mRNA", "levels", "in", "WT", "and", "miR", "-", "212", "/", "132", "null", "(", "KO", ")", "mice", "3", "weeks", "after", "transaortic", "constriction", "(", "TAC", ")", "or", "Sham", "operation", "(", "n", "=", "5", "-", "7", "per", "group", ")", ".", "All", "values", "represent", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "P0", ".", "05", ";", "*", "*", "P0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P0", ".", "005", ".", "#", "P0", ".", "05", "compared", "with", "WT", "TAC", ".", "FC", ",", "fold", "change", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f4(a) Luciferase activity levels upon cotransfection of a luciferase construct containing wild-type (WT) or mutated (Mut.) 3′UTR of FoxO3 with scrambled (Scr) control (Ctrl), pre-miR-132 or pre-miR-212 (n=9).(b,c) Expression levels of FoxO3 on mRNA (b) and protein levels (c) in hearts of WT and α-MHC-miR-212/-132 transgenic (TG) mice. M: Size marker (n=9-13).(d) FoxO3 mRNA levels in neonatal rat cardiomyocytes transfected with Scr Ctrl, anti-miR-212 and anti-miR-132 after phenylephrine (PE, 10 μM) treatment (n=6-9; P-values against Scr+PE).(e-g) Expression levels of atrogin-1 (e) and Mcip1 (f) and calcineurin phosphatase activity levels (g) in hearts of WT and α-MHC-miR-212/132 TG mice (n=5-9).(h) Luciferase activity levels showing the NFAT transcriptional activity in cardiomyocytes transfected with Scr Ctrl, pre-miR-132 or pre-miR-212 (n=5).(i,j) Mcip1.4 (i) and atrogin-1 (j) mRNA levels in WT and miR-212/132 null (KO) mice 3 weeks after transaortic constriction (TAC) or Sham operation (n=5-7 per group). All values represent mean±s.e.m. *P0.05; **P0.01; ***P0.005. #P0.05 compared with WT TAC. FC, fold change."}
{"words": ["f5", "(", "a", ")", "mRNA", "expression", "levels", "of", "autophagic", "marker", "genes", "in", "hearts", "of", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "α", "-", "MHC", "-", "miR", "-", "212", "/", "132", "transgenic", "(", "TG", ")", "mice", "(", "n", "=", "9", "-", "10", ")", ".", "(", "b", ",", "c", ")", "Ratio", "of", "LC3II", "to", "LC3I", "(", "b", ")", "and", "p62", "protein", "levels", "(", "c", ")", "in", "WT", ",", "miR", "-", "212", "/", "132", "null", "(", "KO", ")", "and", "α", "-", "MHC", "miR", "-", "212", "/", "132", "TG", "mice", ".", "M", ":", "Size", "marker", "(", "n", "=", "4", "-", "12", ")", ".", "(", "d", ",", "e", ")", "Representative", "images", "(", "d", ")", "and", "quantification", "(", "e", ")", "of", "LC3", ":", "mCherry", "puncta", "(", "in", "red", ")", "in", "control", "and", "miR", "-", "212", "/", "132", "-", "overexpressing", "TG", "H9c2", "cells", "under", "normal", "and", "serum", "/", "glucose", "-", "deprivation", "conditions", "(", "n", "=", "30", ")", ".", "Nuclei", "are", "stained", "in", "blue", "with", "Hoechst33342", ".", "(", "f", ",", "g", ")", "Representative", "electron", "microscopy", "images", "(", "f", ")", "and", "quantification", "(", "g", ")", "of", "autophagic", "vacuoles", "in", "control", "and", "miR", "-", "212", "/", "132", "-", "overexpressing", "TG", "H9c2", "cells", "under", "normal", "and", "serum", "/", "glucose", "-", "deprivation", "conditions", "(", "n", "=", "20", ")", ".", "(", "h", ",", "i", ")", "Representative", "FACS", "plots", "(", "h", ")", "and", "quantification", "(", "i", ")", "of", "percent", "increase", "of", "autophagic", "flux", "in", "control", "and", "miR", "-", "212", "/", "132", "-", "overexpressing", "TG", "H9c2", "cells", "under", "normal", "and", "serum", "/", "glucose", "-", "deprivation", "conditions", "(", "n", "=", "3", "-", "4", "experiments", ")", ".", "All", "values", "represent", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "P0", ".", "05", ";", "*", "*", "P0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P0", ".", "005", ".", "Scale", "bars", ",", "50", "μm", "in", "d", "and", "2", "μm", "in", "f", ".", "FC", ",", "fold", "change", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f5(a) mRNA expression levels of autophagic marker genes in hearts of wild-type (WT) and α-MHC-miR-212/132 transgenic (TG) mice (n=9-10).(b,c) Ratio of LC3II to LC3I (b) and p62 protein levels (c) in WT, miR-212/132 null (KO) and α-MHC miR-212/132 TG mice. M: Size marker (n=4-12).(d,e) Representative images (d) and quantification (e) of LC3:mCherry puncta (in red) in control and miR-212/132-overexpressing TG H9c2 cells under normal and serum/glucose-deprivation conditions (n=30). Nuclei are stained in blue with Hoechst33342.(f,g) Representative electron microscopy images (f) and quantification (g) of autophagic vacuoles in control and miR-212/132-overexpressing TG H9c2 cells under normal and serum/glucose-deprivation conditions (n=20).(h,i) Representative FACS plots (h) and quantification (i) of percent increase of autophagic flux in control and miR-212/132-overexpressing TG H9c2 cells under normal and serum/glucose-deprivation conditions (n=3-4 experiments). All values represent mean±s.e.m. *P0.05; **P0.01; ***P0.005. Scale bars, 50 μm in d and 2 μm in f. FC, fold change."}
{"words": ["f6", "(", "a", ")", "Schematic", "representation", "of", "starvation", "experiment", "in", "mice", ".", "The", "white", "and", "grey", "parts", "on", "the", "time", "line", "represent", "the", "day", "and", "night", "phases", ",", "respectively", ".", "The", "arrow", "shows", "the", "start", "and", "duration", "of", "the", "starvation", "and", "the", "indicated", "time", "points", "of", "starvation", "are", "when", "animals", "are", "scored", "for", "body", "conditioning", "index", ".", "(", "b", ")", "LC3II", "to", "LC3I", "ratios", "in", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "mice", "fed", "with", "normal", "diet", "and", "WT", ",", "miR", "-", "212", "/", "132", "−", "/", "−", "null", "and", "α", "-", "MHC", "miR", "-", "212", "/", "132", "transgenic", "(", "TG", ")", "mice", "under", "starvation", "for", "31", "h", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "(", "c", ")", "Electron", "microscopy", "from", "ultrathin", "sections", "of", "resin", "-", "embedded", "heart", "biopsies", "of", "fed", "and", "starved", "WT", ",", "miR", "-", "212", "/", "132", "null", "(", "KO", ")", "and", "cardiomyocyte", "-", "specific", "miR", "-", "212", "/", "132", "-", "overexpressing", "(", "TG", ")", "mice", ".", "White", "spots", "around", "the", "mitochondria", "(", "dark", "grey", "structures", ")", "are", "autophagic", "vacuoles", ".", "The", "electron", "-", "dense", "black", "spots", "shown", "with", "white", "arrows", "are", "autophagosomes", ".", "Scale", "bars", ",", "4", "μm", ".", "(", "d", ")", "p", "-", "mTOR", "/", "mTOR", "ratios", "in", "WT", "and", "miR", "-", "212", "/", "132", "TG", "H9c2", "cells", "24", "h", "after", "normal", "and", "starvation", "(", "serum", "/", "glucose", "-", "deprived", ")", "conditions", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "(", "e", ")", "p", "-", "mTOR", "/", "mTOR", "ratios", "in", "hearts", "of", "WT", "and", "α", "-", "MHC", "miR", "-", "212", "/", "132", "TG", "mice", "fed", "with", "normal", "diet", "or", "31", "h", "after", "starvation", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "M", ",", "size", "marker", ".", "All", "values", "represent", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "*", "P0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P0", ".", "005", ";", "#", "P", "=", "0", ".", "11", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f6(a) Schematic representation of starvation experiment in mice. The white and grey parts on the time line represent the day and night phases, respectively. The arrow shows the start and duration of the starvation and the indicated time points of starvation are when animals are scored for body conditioning index.(b) LC3II to LC3I ratios in wild-type (WT) mice fed with normal diet and WT, miR-212/132−/− null and α-MHC miR-212/132 transgenic (TG) mice under starvation for 31 h (n=4).(c) Electron microscopy from ultrathin sections of resin-embedded heart biopsies of fed and starved WT, miR-212/132 null (KO) and cardiomyocyte-specific miR-212/132-overexpressing (TG) mice. White spots around the mitochondria (dark grey structures) are autophagic vacuoles. The electron-dense black spots shown with white arrows are autophagosomes. Scale bars, 4 μm.(d) p-mTOR/mTOR ratios in WT and miR-212/132 TG H9c2 cells 24 h after normal and starvation (serum/glucose-deprived) conditions (n=6).(e) p-mTOR/mTOR ratios in hearts of WT and α-MHC miR-212/132 TG mice fed with normal diet or 31 h after starvation (n=4). M, size marker. All values represent mean±s.e.m. **P0.01; ***P0.005; #P=0.11."}
{"words": ["f7", "(", "a", "-", "c", ")", "Heart", "-", "to", "-", "body", "-", "weight", "ratios", "(", "a", ")", ",", "cardiomyocyte", "diameters", "(", "b", ")", "and", "cardiac", "fibrosis", "(", "c", ")", "in", "Sham", "-", "operated", "mice", "and", "mice", "treated", "with", "intravenous", "injection", "of", "either", "scrambled", "control", "(", "Scr", ")", "or", "miR", "-", "132", "inhibitors", "(", "Ant", "-", "132", ")", "after", "TAC", ".", "These", "mice", "were", "analysed", "3", "weeks", "after", "TAC", "(", "n", "=", "4", "-", "11", ")", ".", "PSR", ",", "picrosirius", "red", "staining", ".", "(", "d", "-", "f", ")", "Echocardiography", "analysis", "of", "cardiac", "dimensions", "and", "function", "in", "Sham", "-", "operated", "mice", "and", "mice", "treated", "with", "intravenous", "injection", "of", "either", "control", "(", "Scr", ")", "or", "miR", "-", "132", "inhibitors", "(", "Ant", "-", "132", ")", "after", "TAC", ".", "These", "mice", "were", "analysed", "3", "weeks", "after", "TAC", "for", "(", "d", ")", "fractional", "shortening", ",", "(", "e", ")", "end", "-", "diastolic", "area", "and", "(", "f", ")", "end", "-", "systolic", "area", "(", "n", "=", "4", "-", "9", ")", ".", "(", "g", "-", "i", ")", "Cardiac", "FoxO3", "protein", "levels", "in", "mice", "treated", "with", "intravenous", "injection", "of", "either", "control", "(", "Scr", ")", "or", "miR", "-", "132", "inhibitors", "(", "Ant", "-", "132", ")", "3", "weeks", "after", "TAC", "and", "treatment", "(", "n", "=", "4", "-", "8", ")", ".", "M", ":", "size", "marker", ".", "All", "values", "represent", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "P0", ".", "05", ";", "*", "*", "P0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P0", ".", "005", ";", "#", "P0", ".", "05", "against", "TAC", "-", "control", ";", "#", "#", "P0", ".", "01", "against", "TAC", "-", "control", ";", "#", "#", "#", "P0", ".", "005", "against", "TAC", "-", "control", ".", "Scale", "bars", ",", "50", "μm", ".", "DAPI", ",", "4", "′", ",", "6", "-", "diamidino", "-", "2", "-", "phenylindole", ";", "FC", ",", "fold", "change", ";", "WGA", ",", "wheat", "germ", "agglutinin", ".", "(", "g", "-", "i", ")", "calcineurin", "activity", "(", "h", ")", "and", "Mcip1", ".", "4", "mRNA", "levels", "(", "i", ")", "in", "mice", "treated", "with", "intravenous", "injection", "of", "either", "control", "(", "Scr", ")", "or", "miR", "-", "132", "inhibitors", "(", "Ant", "-", "132", ")", "3", "weeks", "after", "TAC", "and", "treatment", "(", "n", "=", "4", "-", "8", ")", ".", "M", ":", "size", "marker", ".", "All", "values", "represent", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "P0", ".", "05", ";", "*", "*", "P0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P0", ".", "005", ";", "#", "P0", ".", "05", "against", "TAC", "-", "control", ";", "#", "#", "P0", ".", "01", "against", "TAC", "-", "control", ";", "#", "#", "#", "P0", ".", "005", "against", "TAC", "-", "control", ".", "Scale", "bars", ",", "50", "μm", ".", "DAPI", ",", "4", "′", ",", "6", "-", "diamidino", "-", "2", "-", "phenylindole", ";", "FC", ",", "fold", "change", ";", "WGA", ",", "wheat", "germ", "agglutinin", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f7(a-c) Heart-to-body-weight ratios (a), cardiomyocyte diameters (b) and cardiac fibrosis (c) in Sham-operated mice and mice treated with intravenous injection of either scrambled control (Scr) or miR-132 inhibitors (Ant-132) after TAC. These mice were analysed 3 weeks after TAC (n=4-11). PSR, picrosirius red staining.(d-f) Echocardiography analysis of cardiac dimensions and function in Sham-operated mice and mice treated with intravenous injection of either control (Scr) or miR-132 inhibitors (Ant-132) after TAC. These mice were analysed 3 weeks after TAC for (d) fractional shortening, (e) end-diastolic area and (f) end-systolic area (n=4-9).(g-i) Cardiac FoxO3 protein levels in mice treated with intravenous injection of either control (Scr) or miR-132 inhibitors (Ant-132) 3 weeks after TAC and treatment (n=4-8). M: size marker. All values represent mean±s.e.m. *P0.05; **P0.01; ***P0.005; #P0.05 against TAC-control; ##P0.01 against TAC-control; ###P0.005 against TAC-control. Scale bars, 50 μm. DAPI, 4′,6-diamidino-2-phenylindole; FC, fold change; WGA, wheat germ agglutinin.(g-i) calcineurin activity (h) and Mcip1.4 mRNA levels (i) in mice treated with intravenous injection of either control (Scr) or miR-132 inhibitors (Ant-132) 3 weeks after TAC and treatment (n=4-8). M: size marker. All values represent mean±s.e.m. *P0.05; **P0.01; ***P0.005; #P0.05 against TAC-control; ##P0.01 against TAC-control; ###P0.005 against TAC-control. Scale bars, 50 μm. DAPI, 4′,6-diamidino-2-phenylindole; FC, fold change; WGA, wheat germ agglutinin."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Examples", "of", "chromosome", "arms", "exhibiting", "features", "of", "telomeric", "semiconservative", "(", "Semi", ")", "replication", ",", "conservative", "(", "Consrv", ")", "replication", "of", "the", "entire", "telomere", "(", "E", ")", "and", "conservative", "replication", "of", "part", "of", "the", "telomere", "(", "P", ")", ".", "Idealized", "chromosome", "diagrams", "(", "left", ")", "and", "actual", "microscopy", "images", "(", "right", ")", "are", "shown", ".", "D", "-", "FISH", ",", "denaturing", "FISH", ";", "ND", "-", "CO", "-", "FISH", "(", "non", "-", "denaturing", "CO", "-", "FISH", ")", ".", "(", "B", ")", "Percentages", "of", "chromosome", "arms", "exhibiting", "conservative", "(", "Consrv", ")", "replication", "of", "the", "entire", "telomere", "(", "E", ")", ",", "conservative", "replication", "of", "part", "of", "the", "telomere", "(", "P", ")", "and", "conservative", "replication", "of", "either", "the", "entire", "telomere", "of", "part", "of", "it", "(", "E", "+", "P", ")", ".", "NE", ",", "U2OS", "cells", "expressing", "normal", "levels", "of", "cyclin", "E", ";", "OE", ",", "U2OS", "cells", "overexpressing", "cyclin", "E", "for", "four", "days", ".", "Bars", "represent", "means", "and", "standard", "errors", "of", "the", "mean", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Cyclin", "E", "overexpression", "resulted", "in", "higher", "percentages", "of", "conservatively", "replicated", "telomeres", ":", "P", "<", "0", ".", "025", "for", "Consrv", "(", "P", ")", "and", "P", "<", "0", ".", "05", "for", "Consrv", "(", "E", "+", "P", ")", ",", "as", "calculated", "using", "the", "paired", "t", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Examples of chromosome arms exhibiting features of telomeric semiconservative (Semi) replication, conservative (Consrv) replication of the entire telomere (E) and conservative replication of part of the telomere (P). Idealized chromosome diagrams (left) and actual microscopy images (right) are shown. D-FISH, denaturing FISH; ND-CO-FISH (non-denaturing CO-FISH).(B) Percentages of chromosome arms exhibiting conservative (Consrv) replication of the entire telomere (E), conservative replication of part of the telomere (P) and conservative replication of either the entire telomere of part of it (E+P). NE, U2OS cells expressing normal levels of cyclin E; OE, U2OS cells overexpressing cyclin E for four days. Bars represent means and standard errors of the mean from three independent experiments. Cyclin E overexpression resulted in higher percentages of conservatively replicated telomeres: P<0.025 for Consrv (P) and P<0.05 for Consrv (E+P), as calculated using the paired t test."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Decrease", "in", "the", "fraction", "of", "chromosome", "arms", "exhibiting", "conservative", "(", "Consrv", ")", "DNA", "replication", "of", "the", "entire", "telomere", "length", "or", "part", "of", "the", "telomere", "(", "E", "+", "P", ")", "in", "U2OS", "cells", "after", "depletion", "of", "POLD3", "or", "POLD4", "by", "siRNA", ".", "si", "Ctrl", ",", "control", "siRNA", ";", "NE", ",", "cells", "expressing", "normal", "levels", "of", "cyclin", "E", ";", "OE", ",", "cells", "overexpressing", "cyclin", "E", "for", "four", "days", ".", "Bars", "represent", "means", "and", "standard", "errors", "of", "the", "mean", "from", "two", "independent", "experiments", ".", "For", "statistical", "comparisons", "the", "effects", "of", "PolD3", "and", "Pold4", "depletion", "were", "examined", "after", "grouping", "together", "the", "data", "from", "the", "NE", "and", "OE", "cells", ".", "PolD3", "depletion", "reduced", "the", "fraction", "of", "conservatively", "replicated", "telomeres", "at", "a", "level", "of", "P", "=", "0", ".", "072", ";", "whereas", "for", "PolD4", "depletion", "the", "decrease", "was", "significant", "at", "a", "level", "of", "P", "<", "0", ".", "025", ",", "as", "calculated", "using", "the", "paired", "t", "test", ".", "(", "B", ")", "Decreased", "telomere", "length", "following", "PolD3", "or", "PolD4", "depletion", "in", "U2OS", "cells", "expressing", "normal", "levels", "of", "cyclin", "E", "(", "NE", ")", "or", "overexpressing", "cyclin", "E", "(", "OE", ")", ".", "The", "cells", "were", "transfected", "with", "control", "siRNA", "(", "si", "Ctrl", ")", "or", "siRNAs", "targeting", "POLD3", "or", "POLD4", "and", ",", "five", "days", "later", ",", "fixed", "and", "examined", "for", "telomere", "length", "by", "Q", "-", "FISH", ".", "Bars", "indicate", "means", "and", "standard", "error", "of", "the", "mean", "from", "more", "than", "2", ",", "600", "telomeres", "examined", "per", "condition", ".", "The", "differences", "between", "control", "and", "PolD3", "or", "PolD4", "-", "depleted", "cells", "were", "significant", "(", "P", "<", "10", "-", "6", ")", "for", "both", "NE", "and", "OE", "cells", ",", "as", "determined", "by", "unpaired", "t", "tests", ".", "(", "C", ")", "Decreased", "telomere", "length", "following", "PolD3", "or", "PolD4", "depletion", "in", "parental", "U2OS", "cells", ".", "The", "cells", "were", "transfected", "with", "control", "siRNA", "(", "si", "Ctrl", ")", "or", "siRNAs", "targeting", "POLD3", "or", "POLD4", "and", ",", "five", "days", "later", ",", "fixed", "and", "examined", "for", "telomere", "length", "by", "Q", "-", "FISH", ".", "Bars", "indicate", "means", "and", "standard", "error", "of", "the", "mean", "from", "more", "than", "2", ",", "800", "telomeres", "examined", "per", "condition", ".", "The", "differences", "between", "control", "and", "PolD3", "or", "PolD4", "-", "depleted", "cells", "were", "significant", "(", "P", "<", "10", "-", "6", ")", ",", "as", "determined", "by", "unpaired", "t", "tests", ".", "(", "D", ")", "Increased", "frequency", "of", "chromosome", "end", "-", "to", "-", "end", "fusions", "following", "POLD3", "or", "POLD4", "depletion", ".", "U2OS", "cells", "expressing", "normal", "levels", "of", "cyclin", "E", "(", "NE", ")", "or", "overexpressing", "cyclin", "E", "for", "four", "days", "(", "OE", ")", "were", "transfected", "with", "control", "siRNA", "(", "siCtrl", ")", "os", "siRNAs", "targeting", "POLD3", "or", "POLD4", ".", "For", "each", "condition", ",", "25", "metaphases", "were", "examined", "(", "representing", "about", "1", ",", "900", "high", "quality", "chromosome", "arms", "per", "condition", ")", ";", "the", "percentage", "of", "chromosome", "fusions", "was", "determined", "for", "each", "metaphase", "and", "used", "to", "calculate", "means", "and", "standard", "errors", "of", "the", "mean", ".", "For", "statistical", "analysis", ",", "the", "number", "of", "chromosome", "end", "-", "to", "-", "end", "fusions", "were", "compared", "by", "chi", "square", "tests", "among", "the", "various", "conditions", ".", "Cyclin", "E", "overexpression", "led", "to", "a", "higher", "number", "of", "fusions", "(", "P", "<", "0", ".", "0005", ")", ";", "PolD3", "and", "PolD4", "depletion", "also", "led", "to", "a", "higher", "number", "of", "fusions", "(", "P", "<", "0", ".", "001", "and", "P", "<", "0", ".", "025", ",", "respectively", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Decrease in the fraction of chromosome arms exhibiting conservative (Consrv) DNA replication of the entire telomere length or part of the telomere (E+P) in U2OS cells after depletion of POLD3 or POLD4 by siRNA. si Ctrl, control siRNA; NE, cells expressing normal levels of cyclin E; OE, cells overexpressing cyclin E for four days. Bars represent means and standard errors of the mean from two independent experiments. For statistical comparisons the effects of PolD3 and Pold4 depletion were examined after grouping together the data from the NE and OE cells. PolD3 depletion reduced the fraction of conservatively replicated telomeres at a level of P=0.072; whereas for PolD4 depletion the decrease was significant at a level of P<0.025, as calculated using the paired t test.(B) Decreased telomere length following PolD3 or PolD4 depletion in U2OS cells expressing normal levels of cyclin E (NE) or overexpressing cyclin E (OE). The cells were transfected with control siRNA (si Ctrl) or siRNAs targeting POLD3 or POLD4 and, five days later, fixed and examined for telomere length by Q-FISH. Bars indicate means and standard error of the mean from more than 2,600 telomeres examined per condition. The differences between control and PolD3 or PolD4-depleted cells were significant (P<10-6) for both NE and OE cells, as determined by unpaired t tests.(C) Decreased telomere length following PolD3 or PolD4 depletion in parental U2OS cells. The cells were transfected with control siRNA (si Ctrl) or siRNAs targeting POLD3 or POLD4 and, five days later, fixed and examined for telomere length by Q-FISH. Bars indicate means and standard error of the mean from more than 2,800 telomeres examined per condition. The differences between control and PolD3 or PolD4-depleted cells were significant (P<10-6), as determined by unpaired t tests.(D) Increased frequency of chromosome end-to-end fusions following POLD3 or POLD4 depletion. U2OS cells expressing normal levels of cyclin E (NE) or overexpressing cyclin E for four days (OE) were transfected with control siRNA (siCtrl) os siRNAs targeting POLD3 or POLD4. For each condition, 25 metaphases were examined (representing about 1,900 high quality chromosome arms per condition); the percentage of chromosome fusions was determined for each metaphase and used to calculate means and standard errors of the mean. For statistical analysis, the number of chromosome end-to-end fusions were compared by chi square tests among the various conditions. Cyclin E overexpression led to a higher number of fusions (P<0.0005); PolD3 and PolD4 depletion also led to a higher number of fusions (P<0.001 and P<0.025, respectively)."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Immunoblotting", "analysis", "of", "Neuro2a", "(", "N2a", ")", "cells", "expressing", "Sig1R", "-", "FLAG", "variants", ".", "B", ".", "Cycloheximide", "chase", "analysis", "on", "N2a", "cells", "expressing", "Sig1R", "-", "FLAG", ".", "Quantitative", "data", "of", "immunoblotting", "for", "the", "levels", "of", "Sig1R", "-", "FLAGprotein", "and", "its", "variants", "during", "the", "cyclohexamide", "chase", "were", "plotted", "as", "mean", "±", "SEM", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "upper", "panel", ")", ".", "Representative", "immunoblots", "for", "the", "levels", "of", "Sig1R", "-", "FLAGproteins", "were", "shown", "(", "lower", "panel", ")", ".", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", ":", "p", "=", "0", ".", "0216", "in", "E102Q", "vs", ".", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", ";", "#", "#", ":", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "#", ":", "p", "<", "0", ".", "05", "in", "L95fs", "vs", ".", "WT", ".", "A", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "subsequent", "post", "hoc", "Tukey", "'", "s", "test", ".", "C", ".", "N2a", "cells", "transfected", "with", "Sig1R", "-", "FLAG", "variants", "were", "incubated", "with", "MG", "-", "132", "(", "10", "µM", ")", "or", "the", "combination", "of", "E64d", "and", "pepstatin", "A", "(", "5", "µg", "/", "mL", "each", ")", "(", "E64d", "/", "PepA", ")", "for", "8", "h", ".", "The", "relative", "mean", "levels", "of", "Sig1R", "-", "FLAG", "variants", "determined", "by", "immunoblotting", "from", "three", "independent", "experiments", "were", "plotted", "as", "mean", "±", "SEM", "(", "upper", "panel", ")", ".", "The", "representative", "immunoblots", "were", "shown", "(", "lower", "panel", ")", ".", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", "vs", ".", "no", "inhibitor", "control", ".", "A", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "subsequent", "post", "hoc", "Tukey", "'", "s", "test", ".", "E", "and", "F", ".", "Subcellular", "localization", "of", "inositol", "1", ",", "4", ",", "5", "-", "triphosphate", "receptor", "type", "1", "(", "IP3R1", ")", "and", "type", "3", "(", "IP3R3", ")", "in", "N2a", "cells", "stably", "expressing", "human", "IP3R3", "(", "N2a", "-", "IP3R3", "cells", ",", "E", ")", ".", "IP3R1", "and", "IP3R3", "in", "the", "isolated", "fractions", "were", "identified", "by", "immunoblotting", "with", "the", "specific", "antibodies", "as", "indicated", ".", "Proper", "fractionation", "of", "these", "samples", "was", "confirmed", "by", "the", "fraction", "specific", "markers", "as", "indicated", ".", "E", "and", "F", ".", "Subcellular", "localization", "of", "inositol", "1", ",", "4", ",", "5", "-", "triphosphate", "receptor", "type", "1", "(", "IP3R1", ")", "and", "type", "3", "(", "IP3R3", ")", "in", "HeLa", "cells", "(", "F", ")", ".", "IP3R1", "and", "IP3R3", "in", "the", "isolated", "fractions", "were", "identified", "by", "immunoblotting", "with", "the", "specific", "antibodies", "as", "indicated", ".", "Proper", "fractionation", "of", "these", "samples", "was", "confirmed", "by", "the", "fraction", "specific", "markers", "as", "indicated", ".", "G", ".", "Interaction", "of", "IP3R3", "with", "wild", "-", "type", "Sig1R", "or", "E102Q", "ALS", "-", "linked", "Sig1R", "mutant", ".", "Sig1R", "-", "FLAG", "variants", "were", "transfected", "in", "N2a", "-", "IP3R3", "cells", ",", "and", "IP3R3", "was", "co", "-", "immunoprecipitated", "using", "an", "anti", "-", "FLAG", "antibody", "and", "identified", "by", "immunoblotting", "with", "the", "specific", "antibodies", "as", "indicated", ".", "H", ".", "Suppression", "of", "Sig1R", "by", "siRNA", ".", "Lysates", "of", "N2a", "cells", "transfected", "with", "control", "siRNA", "(", "siCtrl", ")", "or", "siRNA", "against", "Sig1R", "(", "siSig1R", ")", "for", "24", "h", "were", "blotted", ".", "Similar", "results", "were", "obtained", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Paired", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ".", "I", "and", "J", ".", "Cytoplasmic", "calcium", "(", "Ca2", "+", ")", "flux", "in", "N2a", "or", "human", "IP3R3", "stably", "expressing", "N2a", "(", "N2a", "-", "IP3R3", ")", "cells", ".", "siCtrl", "or", "siSig1R", "was", "transfected", "to", "N2a", "or", "N2a", "-", "IP3R3", "cells", ",", "then", "cytoplasmicCa2", "+", "flux", "were", "determined", "with", "fluo", "-", "4", "and", "Case12", "-", "mito", ",", "respectively", ".", "The", "fluorescent", "intensity", "was", "normalized", "to", "the", "intensity", "in", "resting", "state", "at", "0", "s", ",", "and", "plotted", "as", "mean", "±", "SD", ".", "I", "and", "J", ".", "mitochondrial", "(", "J", ")", "calcium", "(", "Ca2", "+", ")", "flux", "in", "N2a", "or", "human", "IP3R3", "stably", "expressing", "N2a", "(", "N2a", "-", "IP3R3", ")", "cells", ".", "siCtrl", "or", "siSig1R", "was", "transfected", "to", "N2a", "or", "N2a", "-", "IP3R3", "cells", ",", "then", "mitochondrial", "Ca2", "+", "flux", "were", "determined", "with", "fluo", "-", "4", "and", "Case12", "-", "mito", ",", "respectively", ".", "The", "fluorescent", "intensity", "was", "normalized", "to", "the", "intensity", "in", "resting", "state", "at", "0", "s", ",", "and", "plotted", "as", "mean", "±", "SD", ".", "K", "and", "L", ".", "Cytoplasmic", "(", "K", ")", "or", "mitochondrial", "(", "L", ")", "Ca2", "+", "flux", "in", "N2a", "-", "IP3R3", "cells", ".", "siCtrl", "or", "siSig1R", "was", "transfected", "with", "or", "without", "the", "Sig1R", "-", "FLAG", "variants", ".", "The", "data", "are", "obtained", "and", "plotted", "as", "described", "above", ".", "n", "=", "10", "each", ".", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", "(", "I", "-", "L", ")", ".", "Two", "-", "way", "ANOVA", "with", "subsequent", "post", "hoc", "Tukey", "'", "s", "test", "(", "I", "-", "J", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Immunoblotting analysis of Neuro2a (N2a) cells expressing Sig1R-FLAG variants.B. Cycloheximide chase analysis on N2a cells expressing Sig1R-FLAG. Quantitative data of immunoblotting for the levels of Sig1R-FLAGprotein and its variants during the cyclohexamide chase were plotted as mean ± SEM of three independent experiments (upper panel). Representative immunoblots for the levels of Sig1R-FLAGproteins were shown (lower panel). **: p < 0.01, *: p = 0.0216 in E102Q vs. wild-type (WT); ##: p < 0.01, #: p < 0.05 in L95fs vs. WT. A one-way ANOVA with subsequent post hoc Tukey's test.C. N2a cells transfected with Sig1R-FLAG variants were incubated with MG-132 (10 µM) or the combination of E64d and pepstatin A (5 µg/mL each) (E64d/PepA) for 8 h. The relative mean levels of Sig1R-FLAG variants determined by immunoblotting from three independent experiments were plotted as mean ± SEM (upper panel). The representative immunoblots were shown (lower panel). *: p < 0.05 vs. no inhibitor control. A one-way ANOVA with subsequent post hoc Tukey's test.E and F. Subcellular localization of inositol 1,4,5-triphosphate receptor type 1 (IP3R1) and type 3 (IP3R3) in N2a cells stably expressing human IP3R3 (N2a-IP3R3 cells, E). IP3R1 and IP3R3 in the isolated fractions were identified by immunoblotting with the specific antibodies as indicated. Proper fractionation of these samples was confirmed by the fraction specific markers as indicated.E and F. Subcellular localization of inositol 1,4,5-triphosphate receptor type 1 (IP3R1) and type 3 (IP3R3) in HeLa cells (F). IP3R1 and IP3R3 in the isolated fractions were identified by immunoblotting with the specific antibodies as indicated. Proper fractionation of these samples was confirmed by the fraction specific markers as indicated.G. Interaction of IP3R3 with wild-type Sig1R or E102Q ALS-linked Sig1R mutant. Sig1R-FLAG variants were transfected in N2a-IP3R3 cells, and IP3R3 was co-immunoprecipitated using an anti-FLAG antibody and identified by immunoblotting with the specific antibodies as indicated.H. Suppression of Sig1R by siRNA. Lysates of N2a cells transfected with control siRNA (siCtrl) or siRNA against Sig1R (siSig1R) for 24 h were blotted. Similar results were obtained from three independent experiments. Paired t-test was used for statistical analysis.I and J. Cytoplasmic calcium (Ca2+) flux in N2a or human IP3R3 stably expressing N2a (N2a-IP3R3) cells. siCtrl or siSig1R was transfected to N2a or N2a-IP3R3 cells, then cytoplasmicCa2+ flux were determined with fluo-4 and Case12-mito, respectively. The fluorescent intensity was normalized to the intensity in resting state at 0 s, and plotted as mean ± SD.I and J. mitochondrial (J) calcium (Ca2+) flux in N2a or human IP3R3 stably expressing N2a (N2a-IP3R3) cells. siCtrl or siSig1R was transfected to N2a or N2a-IP3R3 cells, then mitochondrial Ca2+ flux were determined with fluo-4 and Case12-mito, respectively. The fluorescent intensity was normalized to the intensity in resting state at 0 s, and plotted as mean ± SD.K and L. Cytoplasmic (K) or mitochondrial (L) Ca2+ flux in N2a-IP3R3 cells. siCtrl or siSig1R was transfected with or without the Sig1R-FLAG variants. The data are obtained and plotted as described above. n = 10 each. **: p < 0.01, *: p < 0.05 (I-L). Two-way ANOVA with subsequent post hoc Tukey's test (I-J)."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "The", "levels", "of", "Sig1R", "in", "the", "lumbar", "spinal", "cord", "(", "LSC", ")", "or", "brain", "of", "Sig1R", "−", "/", "−", ",", "Sig1R", "+", "/", "−", ",", "or", "Sig1R", "+", "/", "+", "mice", "at", "5", "months", "old", ".", "Representative", "immunoblots", "obtained", "from", "three", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "Asterisk", "denotes", "non", "-", "specific", "bands", ".", "B", "and", "C", ".", "Sig1R", "-", "deficient", "SOD1G85Rmice", "(", "SOD1G85R", "/", "Sig1R", "−", "/", "−", ")", "exhibited", "accelerated", "onset", "of", "the", "disease", "(", "B", ")", "and", "shortened", "survival", "time", "(", "C", ")", "compared", "to", "SOD1G85Rmice", "with", "one", "or", "two", "copies", "of", "Sig1R", "(", "SOD1G85R", "/", "Sig1R", "+", "/", "−", ",", "SOD1G85R", "/", "Sig1R", "+", "/", "+", ")", ".", "Open", "circles", "indicate", "Sig1R", "knockout", "mice", "(", "Sig1R", "−", "/", "−", ")", "that", "never", "developed", "motor", "neuron", "disease", "but", "that", "were", "sacrificed", "at", "396", "days", "of", "age", "(", "n", "=", "8", ")", ".", "Mean", "onset", "or", "survival", "times", "of", "mice", "with", "±", "SD", "are", "shown", "on", "the", "top", "of", "Kaplan", "-", "Meyer", "curves", ".", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "log", "-", "rank", "test", ".", "n", "=", "14", "(", "SOD1G85R", "/", "Sig1R", "+", "/", "+", ")", ",", "29", "(", "SOD1G85R", "/", "Sig1R", "+", "/", "−", ")", ",", "17", "(", "SOD1G85R", "/", "Sig1R", "−", "/", "−", ")", ".", "D", "and", "E", ".", "Body", "weights", "were", "lost", "earlier", "both", "in", "male", "(", "D", ")", "and", "female", "(", "E", ")", "of", "SOD1G85R", "/", "Sig1R", "−", "/", "−", "mice", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", "in", "SOD1G85R", "/", "Sig1R", "+", "/", "+", "vs", ".", "SOD1G85R", "/", "Sig1R", "−", "/", "−", ",", "†", ":", "p", "<", "0", ".", "05", "in", "SOD1G85R", "/", "Sig1R", "+", "/", "−", "vs", ".", "SOD1G85R", "/", "Sig1R", "−", "/", "−", ".", "n", "=", "8", "(", "SOD1G85R", "/", "Sig1R", "+", "/", "+", ")", ",", "13", "(", "SOD1G85R", "/", "Sig1R", "+", "/", "−", ")", ",", "8", "(", "SOD1G85R", "/", "Sig1R", "−", "/", "−", ")", "in", "male", "(", "D", ")", ",", "and", "n", "=", "6", "(", "SOD1G85R", "/", "Sig1R", "+", "/", "+", ")", ",", "16", "(", "SOD1G85R", "/", "Sig1R", "+", "/", "−", ")", ",", "9", "(", "SOD1G85R", "/", "Sig1R", "−", "/", "−", ")", "in", "female", "(", "E", ")", ".", "The", "used", "animals", "were", "the", "same", "in", "the", "panels", "B", "and", "C", ".", "The", "animals", "used", "in", "the", "panels", "D", "and", "E", "were", "the", "same", "in", "the", "panels", "B", "and", "C", ".", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", "in", "SOD1G85R", "/", "Sig1R", "+", "/", "+", "vs", ".", "SOD1G85R", "/", "Sig1R", "−", "/", "−", ",", "†", ":", "p", "<", "0", ".", "05", "in", "SOD1G85R", "/", "Sig1R", "+", "/", "−", "vs", ".", "SOD1G85R", "/", "Sig1R", "−", "/", "−", ".", "Two", "-", "way", "ANOVA", "with", "subsequent", "post", "hoc", "Tukey", "'", "s", "test", ".", "F", ".", "Decreased", "performance", "on", "the", "rotarod", "test", "was", "observed", "in", "SOD1G85R", "/", "Sig1R", "−", "/", "−", "mice", ".", "The", "test", "was", "performed", "at", "0", "-", "30", "rpm", "with", "0", ".", "1", "rpm", "/", "s", "acceleration", "every", "week", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "0001", "in", "SOD1G85R", "/", "Sig1R", "+", "/", "+", "vs", ".", "SOD1G85R", "/", "Sig1R", "−", "/", "−", ",", "†", "†", ":", "p", "<", "0", ".", "0001", "in", "SOD1G85R", "/", "Sig1R", "+", "/", "−", "vs", ".", "SOD1G85R", "/", "Sig1R", "−", "/", "−", ".", "The", "used", "animals", "were", "the", "same", "in", "the", "panels", "B", "-", "E", ".", "Two", "-", "way", "ANOVA", "with", "subsequent", "post", "hoc", "Tukey", "'", "s", "test", ".", "G", "and", "H", ".", "Motor", "function", "of", "WT", "(", "Sig1R", "+", "/", "+", ")", "and", "Sig1R", "knockout", "(", "Sig1R", "−", "/", "−", ")", "mice", "at", "5", "or", "12", "months", "old", "was", "evaluated", "by", "the", "rotarod", "test", "(", "0", "-", "30", "rpm", ",", "accelerated", "at", "0", ".", "1", "rpm", "/", "s", ")", ".", "Average", "time", "on", "the", "rotating", "rod", "was", "plotted", ".", "Error", "bars", "denote", "SD", ".", "Unpaired", "t", "-", "tests", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. The levels of Sig1R in the lumbar spinal cord (LSC) or brain of Sig1R−/−, Sig1R+/−, or Sig1R+/+ mice at 5 months old. Representative immunoblots obtained from three independent experiments are shown. Asterisk denotes non-specific bands.B and C. Sig1R-deficient SOD1G85Rmice (SOD1G85R/Sig1R−/−) exhibited accelerated onset of the disease (B) and shortened survival time (C) compared to SOD1G85Rmice with one or two copies of Sig1R (SOD1G85R/Sig1R+/−, SOD1G85R/Sig1R+/+). Open circles indicate Sig1R knockout mice (Sig1R−/−) that never developed motor neuron disease but that were sacrificed at 396 days of age (n = 8). Mean onset or survival times of mice with ±SD are shown on the top of Kaplan-Meyer curves. **: p < 0.01, *: p < 0.05, log-rank test. n = 14 (SOD1G85R/Sig1R+/+), 29 (SOD1G85R/Sig1R+/−), 17 (SOD1G85R/Sig1R−/−).D and E. Body weights were lost earlier both in male (D) and female (E) of SOD1G85R/ Sig1R−/−mice. Data are shown as mean ± SD. *: p < 0.05 in SOD1G85R/Sig1R+/+ vs. SOD1G85R/Sig1R−/−, †: p < 0.05 in SOD1G85R/Sig1R+/− vs. SOD1G85R/Sig1R−/−. n = 8 (SOD1G85R/Sig1R+/+), 13 (SOD1G85R/Sig1R+/−), 8 (SOD1G85R/Sig1R−/−) in male (D), and n = 6 (SOD1G85R/Sig1R+/+), 16 (SOD1G85R/Sig1R+/−), 9 (SOD1G85R/Sig1R−/−) in female (E). The used animals were the same in the panels B and C. The animals used in the panels D and E were the same in the panels B and C. *: p < 0.05 in SOD1G85R/Sig1R+/+ vs. SOD1G85R/Sig1R−/−, †: p < 0.05 in SOD1G85R/Sig1R+/− vs. SOD1G85R/Sig1R−/−. Two-way ANOVA with subsequent post hoc Tukey's test.F. Decreased performance on the rotarod test was observed in SOD1G85R/ Sig1R−/−mice. The test was performed at 0-30 rpm with 0.1 rpm/s acceleration every week. Data are shown as mean ± SD. **: p < 0.0001 in SOD1G85R/Sig1R+/+ vs. SOD1G85R/Sig1R−/−, † †: p < 0.0001 in SOD1G85R/Sig1R+/− vs. SOD1G85R/Sig1R−/−. The used animals were the same in the panels B-E. Two-way ANOVA with subsequent post hoc Tukey's test.G and H. Motor function of WT (Sig1R+/+) and Sig1R knockout (Sig1R−/−) mice at 5 or 12 months old was evaluated by the rotarod test (0-30 rpm, accelerated at 0.1 rpm/s). Average time on the rotating rod was plotted. Error bars denote SD. Unpaired t-tests."}
{"words": ["Figure", "4A", "and", "B", ".", "N2a", "cells", "expressing", "SOD1WT", ",", "SOD1G85R", "or", "SOD1G93A", "(", "A", ")", ",", "or", "spinal", "cords", "of", "WT", "or", "mutant", "SOD1", "transgenic", "mice", "at", "end", "-", "stage", "(", "B", ")", "were", "fractionated", "as", "described", "in", "Materials", "and", "methods", "section", "(", "Cyto", ":", "cytoplasm", ",", "P1", ":", "nuclei", "and", "debris", ",", "Mito", ":", "mitochondria", ",", "MAM", ":", "mitochondria", "-", "associate", "membrane", ",", "P3", ":", "microsomal", "fraction", ")", ".", "Proper", "fractionation", "was", "confirmed", "by", "the", "fraction", "specific", "markers", "as", "indicated", ",", "and", "also", "shown", "in", "Fig", "EV1", "A", "-", "E", ".", "An", "asterisk", "denotes", "non", "-", "specific", "bands", ".", "C", ".", "Tissue", "and", "cell", "-", "type", "specific", "accumulation", "of", "mutant", "SOD1", "at", "the", "MAM", ".", "Brain", ",", "liver", ",", "or", "primary", "astrocytes", "from", "SOD1G93Amice", "were", "fractionated", "and", "blotted", "as", "in", "Figures", "4A", "and", "B", "(", "Upper", "panel", ")", ".", "Quantification", "of", "SOD1", "proteins", "at", "the", "MAM", "relative", "to", "ones", "in", "the", "cytoplasm", "was", "performed", "from", "immunoblotting", "data", "with", "an", "anti", "-", "human", "SOD1", "antibody", "in", "(", "B", ")", "and", "the", "top", "panel", "of", "(", "C", ")", ",", "and", "the", "data", "are", "plotted", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "Lower", "panel", ")", ".", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", "vs", ".", "SOD1WTspinal", "cord", ".", "A", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "subsequent", "post", "hoc", "Tukey", "'", "s", "test", ".", "Proper", "fractionation", "of", "these", "samples", "was", "confirmed", "in", "Fig", "EV", "1F", "-", "H", ".", "D", ".", "Mutant", "SOD1", "prevented", "association", "of", "ER", "with", "mitochondria", ".", "Isolated", "ER", "(", "P3", ":", "microsomal", "fraction", ")", "and", "mitochondria", "of", "N2a", "cells", "expressing", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "or", "G85R", "(", "85", ")", "SOD1", "for", "48", "h", "were", "mixed", "and", "incubated", ".", "Mitochondrial", "pellets", "after", "centrifugation", "were", "analyzed", "by", "immunoblotting", "using", "anti", "-", "PDI", "(", "ER", "marker", ")", "and", "anti", "-", "VDAC", "(", "mitochondrial", "marker", ")", ",", "respectively", ".", "All", "these", "results", "were", "confirmed", "by", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A and B. N2a cells expressing SOD1WT, SOD1G85R or SOD1G93A (A), or spinal cords of WT or mutant SOD1 transgenic mice at end-stage (B) were fractionated as described in Materials and methods section (Cyto: cytoplasm, P1: nuclei and debris, Mito: mitochondria, MAM: mitochondria-associate membrane, P3: microsomal fraction). Proper fractionation was confirmed by the fraction specific markers as indicated, and also shown in Fig EV1 A-E. An asterisk denotes non-specific bands.C. Tissue and cell-type specific accumulation of mutant SOD1 at the MAM. Brain, liver, or primary astrocytes from SOD1G93Amice were fractionated and blotted as in Figures 4A and B (Upper panel). Quantification of SOD1 proteins at the MAM relative to ones in the cytoplasm was performed from immunoblotting data with an anti-human SOD1 antibody in (B) and the top panel of (C), and the data are plotted as mean ± SEM from three independent experiments (Lower panel). **: p < 0.01 vs. SOD1WTspinal cord. A one-way ANOVA with subsequent post hoc Tukey's test.Proper fractionation of these samples was confirmed in Fig EV 1F-H.D. Mutant SOD1 prevented association of ER with mitochondria. Isolated ER (P3: microsomal fraction) and mitochondria of N2a cells expressing wild-type (WT) or G85R (85) SOD1 for 48 h were mixed and incubated. Mitochondrial pellets after centrifugation were analyzed by immunoblotting using anti-PDI (ER marker) and anti-VDAC (mitochondrial marker), respectively. All these results were confirmed by three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "5A", "and", "B", ".", "Time", "course", "analyses", "of", "mutant", "SOD1", "levels", "at", "the", "MAM", "in", "SOD1G93Amousespinal", "cords", "(", "A", ")", "and", "brains", "(", "B", ")", ".", "Immunoblots", "show", "levels", "of", "mutant", "SOD1", "protein", "in", "the", "indicated", "fractions", "at", "various", "time", "points", "(", "left", "panels", ")", ".", "Quantitative", "data", "at", "the", "right", "were", "plotted", "as", "mean", "±", "SEM", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Arrows", "indicate", "a", "rapid", "reduction", "in", "SOD1", "level", "at", "the", "MAM", "just", "following", "the", "onset", "of", "disease", ".", "C", "and", "D", ".", "Time", "course", "analyses", "of", "mutant", "SOD1", "accumulation", "at", "the", "MAM", "in", "SOD1G85R", "(", "C", ")", "and", "SOD1G37R", "(", "D", ")", "mousespinal", "cords", ".", "Quantitative", "data", "from", "three", "independent", "experiments", "were", "plotted", "(", "bottom", ")", ".", "The", "arrows", "in", "the", "bottom", "panel", "are", "the", "same", "as", "in", "A", "and", "B", ".", "E", ".", "Time", "course", "analyses", "of", "MAM", "-", "specific", "proteins", "at", "MAM", "and", "in", "the", "whole", "lysates", "of", "SOD1G93Amousespinal", "cords", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A and B. Time course analyses of mutant SOD1 levels at the MAM in SOD1G93Amousespinal cords (A) and brains (B). Immunoblots show levels of mutant SOD1 protein in the indicated fractions at various time points (left panels). Quantitative data at the right were plotted as mean ± SEM of three independent experiments. Arrows indicate a rapid reduction in SOD1 level at the MAM just following the onset of disease.C and D. Time course analyses of mutant SOD1 accumulation at the MAM in SOD1G85R (C) and SOD1G37R (D) mousespinal cords. Quantitative data from three independent experiments were plotted (bottom). The arrows in the bottom panel are the same as in A and B.E. Time course analyses of MAM-specific proteins at MAM and in the whole lysates of SOD1G93Amousespinal cords."}
{"words": ["Figure", "6A", "-", "I", ".", "Immunofluorescence", "staining", "of", "spinal", "cords", "and", "brains", "from", "non", "-", "transgenic", "(", "Non", "-", "Tg", ")", ",", "SOD1", "transgenic", ",", "or", "Sig1R", "−", "/", "−", "mice", ".", "Transverse", "sections", "of", "mousespinal", "cords", "(", "A", ",", "D", "-", "I", ")", "or", "sagittal", "sections", "of", "mouse", "brains", "(", "B", ",", "C", ")", "were", "stained", "using", "anti", "-", "Sig1R", "(", "white", ")", ",", "βIII", "-", "tubulin", "(", "red", ")", "and", "IP3R3", "(", "green", ")", "antibodies", ".", "Note", "that", "Sig1R", "and", "IP3R3", "are", "co", "-", "localized", "in", "the", "motor", "neurons", "of", "the", "anterior", "horn", "(", "A", ")", "and", "the", "hypoglossal", "nucleus", "(", "B", ")", ",", "and", "IP3R3", "was", "not", "expressed", "in", "hippocampal", "neurons", "(", "C", ")", ".", "Mutant", "SOD1", "induced", "aggregation", "of", "Sig1R", "and", "mislocalization", "of", "IP3R3", "in", "anterior", "horn", "neurons", "(", "D", "-", "G", ")", ",", "while", "their", "abnormalities", "were", "not", "observed", "in", "SOD1WTmotor", "neurons", "(", "H", ")", ".", "Mislocalization", "of", "IP3R3", "was", "also", "observed", "in", "Sig1R", "−", "/", "−", "mouse", "spinal", "cords", "(", "I", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "50", "µm", ".", "J", "and", "K", ".", "Representative", "electron", "micrographs", "of", "the", "MAM", "(", "J", ")", "(", "double", "-", "headed", "arrows", ")", "in", "motor", "neurons", "of", "12", "months", "-", "old", "Non", "-", "Tg", ",", "SOD1G85R", "or", "Sig1R", "−", "/", "−", "mice", ".", "Note", "that", "ER", "-", "mitochondria", "contacted", "areas", "were", "reduced", "in", "both", "SOD1G85R", "or", "Sig1R", "−", "/", "−", "mice", ".", "Quantification", "of", "the", "mitochondria", "surface", "associated", "to", "ER", "was", "calculated", "in", "K", ".", "For", "quantification", ",", "13", "-", "19", "motor", "neurons", "and", "224", "-", "316", "mitochondria", "with", "MAM", "in", "each", "animal", "(", "n", "=", "2", ")", "were", "analyzed", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "Double", "asterisk", "means", "p", "<", "0", ".", "0001", "vs", "Non", "-", "Tg", ".", "A", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "subsequent", "post", "hoc", "Tukey", "'", "s", "test", ".", "Scale", "bars", ":", "300", "nm", ".", "L", ".", "The", "levels", "for", "IP3R3", "and", "calreticulin", "were", "decreased", "in", "the", "MAM", "fractions", "of", "Sig1R", "−", "/", "−", "mouse", "brains", ".", "MAM", "fractions", "and", "whole", "tissue", "lysates", "of", "Sig1R", "+", "/", "+", "or", "Sig1R", "−", "/", "−", "mouse", "brains", "were", "immunoblotted", ".", "Representative", "blots", "from", "three", "independent", "experiments", "are", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A-I. Immunofluorescence staining of spinal cords and brains from non-transgenic (Non-Tg), SOD1 transgenic, or Sig1R−/−mice. Transverse sections of mousespinal cords (A, D-I) or sagittal sections of mouse brains (B, C) were stained using anti-Sig1R (white), βIII-tubulin (red) and IP3R3 (green) antibodies. Note that Sig1R and IP3R3 are co-localized in the motor neurons of the anterior horn (A) and the hypoglossal nucleus (B), and IP3R3 was not expressed in hippocampal neurons (C). Mutant SOD1 induced aggregation of Sig1R and mislocalization of IP3R3 in anterior horn neurons (D-G), while their abnormalities were not observed in SOD1WTmotor neurons (H). Mislocalization of IP3R3 was also observed in Sig1R−/−mouse spinal cords (I). Scale bars: 50 µm.J and K. Representative electron micrographs of the MAM (J) (double-headed arrows) in motor neurons of 12 months-old Non-Tg, SOD1G85R or Sig1R−/−mice. Note that ER-mitochondria contacted areas were reduced in both SOD1G85R or Sig1R−/−mice. Quantification of the mitochondria surface associated to ER was calculated in K. For quantification, 13-19 motor neurons and 224-316 mitochondria with MAM in each animal (n = 2) were analyzed. Data are expressed as mean ± SEM. Double asterisk means p < 0.0001 vs Non-Tg. A one-way ANOVA with subsequent post hoc Tukey's test. Scale bars: 300 nm.L. The levels for IP3R3 and calreticulin were decreased in the MAM fractions of Sig1R−/−mouse brains. MAM fractions and whole tissue lysates of Sig1R+/+ or Sig1R−/−mouse brains were immunoblotted. Representative blots from three independent experiments are shown."}
{"words": ["Figure", "7A", ".", "N2a", "cells", "were", "transfected", "with", "WT", "or", "mutant", "SOD1", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "IP3R3", ".", "Plotted", "viability", "of", "the", "cells", "measured", "by", "a", "neurotoxicity", "assay", "revealed", "that", "IP3R3", "is", "involved", "in", "cell", "vulnerability", "against", "mutant", "SOD1", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", ",", "triplicated", "in", "each", "experiment", ".", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "B", "-", "G", ".", "Calpain", "activity", "(", "B", "-", "D", ")", "were", "measured", "in", "N2a", "-", "IP3R3", "cells", "expressing", "Sig1R", "-", "FLAG", "(", "B", "and", "E", ")", ",", "SOD1", "(", "C", "and", "F", ")", ",", "or", "both", "(", "D", "and", "G", ")", ".", "Mean", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", "is", "plotted", ".", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "B", "-", "G", ".", "intracellular", "ATP", "levels", "(", "E", "-", "G", ")", "were", "measured", "in", "N2a", "-", "IP3R3", "cells", "expressing", "Sig1R", "-", "FLAG", "(", "B", "and", "E", ")", ",", "SOD1", "(", "C", "and", "F", ")", ",", "or", "both", "(", "D", "and", "G", ")", ".", "Mean", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", "is", "plotted", ".", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "H", "and", "I", ".", "Calpain", "activity", "in", "vivo", "was", "determined", "by", "the", "cleavage", "of", "spectrin", "αII", ".", "Calpain", "-", "cleaved", "150", "kDa", "fragment", "of", "spectrin", "αII", "in", "mouselumbar", "spinal", "cord", "or", "brain", "(", "H", ")", "was", "normalized", "to", "β", "-", "actin", "(", "I", ")", ".", "Quantitative", "data", "in", "immunoblotting", "analyses", "are", "plotted", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A. N2a cells were transfected with WT or mutant SOD1 in the presence or absence of IP3R3. Plotted viability of the cells measured by a neurotoxicity assay revealed that IP3R3 is involved in cell vulnerability against mutant SOD1. Data are expressed as mean ± SEM from three independent experiments, triplicated in each experiment. **: p < 0.01, *: p < 0.05.B-G. Calpain activity (B-D) were measured in N2a-IP3R3 cells expressing Sig1R-FLAG (B and E), SOD1 (C and F), or both (D and G). Mean ± SEM from three independent experiments is plotted. *: p < 0.05.B-G. intracellular ATP levels (E-G) were measured in N2a-IP3R3 cells expressing Sig1R-FLAG (B and E), SOD1 (C and F), or both (D and G). Mean ± SEM from three independent experiments is plotted. *: p < 0.05.H and I. Calpain activity in vivo was determined by the cleavage of spectrin αII. Calpain-cleaved 150 kDa fragment of spectrin αII in mouselumbar spinal cord or brain (H) was normalized to β-actin (I). Quantitative data in immunoblotting analyses are plotted as mean ± SEM from three independent experiments. **: p < 0.01."}
{"words": ["Figure", "8A", "and", "B", ".", "Cytoplasmic", "(", "A", ")", "or", "mitochondrial", "(", "B", ")", "Ca2", "+", "flux", "was", "measured", "in", "N2a", "-", "IP3R3", "cells", "treated", "with", "PRE", "-", "084", "(", "5", "µM", ")", "or", "NE", "-", "100", "(", "5", "µM", ")", "for", "1", "h", "prior", "to", "fluorescent", "imaging", ".", "Cytoplasmic", "and", "mitochondrialCa2", "+", "flux", "were", "detected", "by", "fluo", "-", "4", "and", "Case12", "-", "mito", ",", "respectively", ".", "The", "fluorescent", "intensity", "was", "normalized", "by", "the", "resting", "state", "at", "0", "s", ",", "and", "plotted", "as", "mean", "±", "SD", ".", "n", "=", "10", "each", ".", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "Two", "-", "way", "ANOVA", "with", "subsequent", "post", "hoc", "Tukey", "'", "s", "test", ".", "C", "and", "D", ".", "Calpain", "activity", "were", "measured", "in", "N2a", "-", "IP3R3", "cells", "treated", "with", "PRE", "-", "084", "(", "5", "µM", ")", "or", "NE", "-", "100", "(", "5", "µM", ")", "for", "24", "h", ".", "Data", "are", "plotted", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", "vs", ".", "mock", "control", ".", "A", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "subsequent", "post", "hoc", "Tukey", "'", "s", "test", ".", "C", "and", "D", ".", "intracellular", "ATP", "levels", "were", "measured", "in", "N2a", "-", "IP3R3", "cells", "treated", "with", "PRE", "-", "084", "(", "5", "µM", ")", "or", "NE", "-", "100", "(", "5", "µM", ")", "for", "24", "h", ".", "Data", "are", "plotted", "as", "mean", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", "vs", ".", "mock", "control", ".", "A", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "subsequent", "post", "hoc", "Tukey", "'", "s", "test", ".", "E", "and", "F", ".", "SOD1G93Amice", "were", "intraperitoneally", "administered", "with", "saline", "or", "PRE", "-", "084", "(", "0", ".", "25", "mg", "/", "kg", ",", "3", "times", "per", "week", ")", "from", "postnatal", "day", "35", "to", "95", ".", "Lumbar", "spinal", "cord", "sections", "were", "stained", "by", "using", "anti", "-", "Sig1R", "(", "white", ")", ",", "IP3R3", "(", "green", ")", ",", "and", "βIII", "-", "tubulin", "(", "red", ")", "at", "95", "days", "old", ".", "Arrowheads", "indicate", "the", "neurons", "with", "normal", "distribution", "of", "Sig1R", "and", "IP3R3", ".", "Scale", "bars", ":", "50", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8A and B. Cytoplasmic (A) or mitochondrial (B) Ca2+ flux was measured in N2a-IP3R3 cells treated with PRE-084 (5 µM) or NE-100 (5 µM) for 1 h prior to fluorescent imaging. Cytoplasmic and mitochondrialCa2+ flux were detected by fluo-4 and Case12-mito, respectively. The fluorescent intensity was normalized by the resting state at 0 s, and plotted as mean ± SD. n = 10 each. **: p < 0.01, *: p < 0.05. Two-way ANOVA with subsequent post hoc Tukey's test.C and D. Calpain activity were measured in N2a-IP3R3 cells treated with PRE-084 (5 µM) or NE-100 (5 µM) for 24 h. Data are plotted as mean ± SEM from three independent experiments. *: p < 0.05 vs. mock control. A one-way ANOVA with subsequent post hoc Tukey's test.C and D. intracellular ATP levels were measured in N2a-IP3R3 cells treated with PRE-084 (5 µM) or NE-100 (5 µM) for 24 h. Data are plotted as mean ± SEM from three independent experiments. *: p < 0.05 vs. mock control. A one-way ANOVA with subsequent post hoc Tukey's test.E and F. SOD1G93Amice were intraperitoneally administered with saline or PRE-084 (0.25 mg/kg, 3 times per week) from postnatal day 35 to 95. Lumbar spinal cord sections were stained by using anti-Sig1R (white), IP3R3 (green), and βIII-tubulin (red) at 95 days old. Arrowheads indicate the neurons with normal distribution of Sig1R and IP3R3. Scale bars: 50 µm."}
{"words": ["Figure", "1A", ",", "B", ",", "Immunostaining", "for", "CD31", "+", "blood", "vessels", "in", "control", "(", "ctrl", ",", "A", ")", "and", "Gpr124KO", "(", "B", ")", "forebrains", ".", "Note", "the", "normal", "vasculature", "in", "the", "cortical", "hem", "(", "asterisk", ")", "of", "Gpr124KO", "mice", ".", "C", ",", "D", ",", "Immunostaining", "for", "Pax6", "in", "control", "(", "C", ")", "and", "Gpr124KO", "(", "D", ")", "forebrains", "to", "reveal", "the", "lateral", "extension", "of", "the", "neocortex", "(", "dashed", "line", ")", "between", "the", "cortical", "hem", "(", "arrowhead", ")", "and", "the", "lateral", "ganglionic", "eminence", "(", "arrow", ")", ".", "E", ",", "Quantification", "of", "the", "lateral", "extension", "of", "the", "cortex", "in", "control", "and", "Gpr124KO", "brains", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "10", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "F", ",", "G", "Staining", "for", "EdU", "(", "red", ")", "and", "Ki67", "(", "green", ")", "in", "control", "(", "F", ")", "and", "Gpr124KO", "(", "G", ")", "cortices", "at", "E13", ".", "5", ",", "24", "hours", "after", "EdU", "injection", ".", "H", ",", "Quantification", "of", "Ki67", "+", "NPCs", "in", "the", "VZ", "(", "blue", ")", ",", "SVZ", "/", "CP", "(", "grey", ")", "and", "of", "Ki67", "-", "neurons", "(", "cyan", ")", "generated", "from", "EdU", "-", "labeled", "NPCs", "in", "control", "and", "Gpr124KO", "embryos", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "4", "(", "control", ")", "and", "N", "=", "3", "(", "Gpr124KO", ")", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "Full", ",", "dotted", "and", "dashed", "lines", "indicate", "basal", "and", "apical", "boundaries", "of", "the", "cortex", "or", "boundaries", "of", "the", "cortical", "zones", ",", "respectively", ".", "CP", ",", "cortical", "plate", ";", "IZ", ",", "intermediate", "zone", ";", "SVZ", ",", "subventricular", "zone", ";", "VZ", ",", "ventricular", "zone", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "µmI", ",", "J", ",", "Immunostaining", "for", "Tbr2", "(", "red", ")", "and", "Pax6", "(", "green", ")", "in", "control", "(", "I", ")", "and", "Gpr124KO", "(", "J", ")", "cortices", ".", "K", ",", "Quantification", "of", "newborn", "BPs", "in", "the", "VZ", "of", "control", "and", "Gpr124KO", "cortices", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "4", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "Full", ",", "dotted", "and", "dashed", "lines", "indicate", "basal", "and", "apical", "boundaries", "of", "the", "cortex", "or", "boundaries", "of", "the", "cortical", "zones", ",", "respectively", ".", "CP", ",", "cortical", "plate", ";", "IZ", ",", "intermediate", "zone", ";", "SVZ", ",", "subventricular", "zone", ";", "VZ", ",", "ventricular", "zone", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "µmL", ",", "M", ",", "Immunostaining", "for", "Tbr2", "(", "red", ")", "and", "Ngn1", "(", "green", ")", "in", "control", "(", "L", ")", "and", "Gpr124KO", "(", "M", ")", "cortices", ".", "N", ",", "O", "Quantification", "of", "neurogenic", "(", "Ngn1", "+", ")", "RGs", "and", "BPs", "(", "N", ")", "or", "expanding", "(", "Tbr2", "-", "Ngn1", "-", ")", "RGs", "(", "O", ")", "in", "control", "and", "Gpr124KO", "cortices", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "4", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "Note", "that", "the", "fraction", "of", "total", "BPs", "is", "significantly", "reduced", "(", "Fig", "1K", ")", "while", "the", "fraction", "of", "Ngn1", "+", "BPs", "is", "insignificantly", "reduced", "(", "Fig", "1N", ")", ",", "because", "the", "proportion", "of", "Ngn1", "+", "Tbr2", "+", "cells", "within", "all", "BPs", "is", "slightly", ",", "though", "statisically", "insignificantly", "higher", "in", "the", "Gpr124KObrains", "(", "see", "Fig", "S2M", ")", ".", "Full", ",", "dotted", "and", "dashed", "lines", "indicate", "basal", "and", "apical", "boundaries", "of", "the", "cortex", "or", "boundaries", "of", "the", "cortical", "zones", ",", "respectively", ".", "CP", ",", "cortical", "plate", ";", "IZ", ",", "intermediate", "zone", ";", "SVZ", ",", "subventricular", "zone", ";", "VZ", ",", "ventricular", "zone", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "µmP", ",", "Q", "Stainings", "for", "Tbr2", "(", "red", ")", "and", "for", "Tis21", "-", "GFP", "expression", "(", "green", ")", "in", "control", "(", "P", ")", "and", "Gpr124KO", "(", "Q", ")", "cortices", ".", "R", ",", "S", "Quantification", "of", "neurogenic", "(", "Tis21", "-", "GFP", "+", ")", "RGs", "and", "BPs", "(", "R", ")", "or", "expanding", "(", "Tbr2", "-", "Tis21", "-", "GFP", "-", ")", "RGs", "(", "S", ")", "in", "control", "and", "Gpr124KO", "cortices", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "4", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "Full", ",", "dotted", "and", "dashed", "lines", "indicate", "basal", "and", "apical", "boundaries", "of", "the", "cortex", "or", "boundaries", "of", "the", "cortical", "zones", ",", "respectively", ".", "CP", ",", "cortical", "plate", ";", "IZ", ",", "intermediate", "zone", ";", "SVZ", ",", "subventricular", "zone", ";", "VZ", ",", "ventricular", "zone", ".", "Scale", "bar", ":", "100"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A,B, Immunostaining for CD31+ blood vessels in control (ctrl, A) and Gpr124KO (B) forebrains. Note the normal vasculature in the cortical hem (asterisk) of Gpr124KO mice.C,D, Immunostaining for Pax6 in control (C) and Gpr124KO (D) forebrains to reveal the lateral extension of the neocortex (dashed line) between the cortical hem (arrowhead) and the lateral ganglionic eminence (arrow). E, Quantification of the lateral extension of the cortex in control and Gpr124KO brains (mean±SEM; N=10; *** p<0.001).F,G Staining for EdU (red) and Ki67 (green) in control (F) and Gpr124KO (G) cortices at E13.5, 24 hours after EdU injection. H, Quantification of Ki67+ NPCs in the VZ (blue), SVZ/CP (grey) and of Ki67- neurons (cyan) generated from EdU-labeled NPCs in control and Gpr124KO embryos (mean±SEM; N=4 (control) and N=3 (Gpr124KO); * p<0.05, ** p<0.01). Full, dotted and dashed lines indicate basal and apical boundaries of the cortex or boundaries of the cortical zones, respectively. CP, cortical plate; IZ, intermediate zone; SVZ, subventricular zone; VZ, ventricular zone. Scale bar: 100 µmI,J, Immunostaining for Tbr2 (red) and Pax6 (green ) in control (I) and Gpr124KO (J) cortices. K, Quantification of newborn BPs in the VZ of control and Gpr124KO cortices (mean±SEM; N=4; * p<0.05). Full, dotted and dashed lines indicate basal and apical boundaries of the cortex or boundaries of the cortical zones, respectively. CP, cortical plate; IZ, intermediate zone; SVZ, subventricular zone; VZ, ventricular zone. Scale bar: 100 µmL,M, Immunostaining for Tbr2 (red) and Ngn1 (green) in control (L) and Gpr124KO (M) cortices. N,O Quantification of neurogenic (Ngn1+) RGs and BPs (N) or expanding (Tbr2- Ngn1-) RGs (O) in control and Gpr124KO cortices (mean±SEM; N=4; * p<0.05, *** p<0.001). Note that the fraction of total BPs is significantly reduced (Fig 1K) while the fraction of Ngn1+BPs is insignificantly reduced (Fig 1N), because the proportion of Ngn1+Tbr2+ cells within all BPs is slightly, though statisically insignificantly higher in the Gpr124KObrains (see Fig S2M). Full, dotted and dashed lines indicate basal and apical boundaries of the cortex or boundaries of the cortical zones, respectively. CP, cortical plate; IZ, intermediate zone; SVZ, subventricular zone; VZ, ventricular zone. Scale bar: 100 µmP,Q Stainings for Tbr2 (red) and for Tis21-GFP expression (green) in control (P) and Gpr124KO (Q) cortices. R,S Quantification of neurogenic (Tis21-GFP+) RGs and BPs (R) or expanding (Tbr2- Tis21-GFP-) RGs (S) in control and Gpr124KO cortices (mean±SEM; N=4; *** p<0.001). Full, dotted and dashed lines indicate basal and apical boundaries of the cortex or boundaries of the cortical zones, respectively. CP, cortical plate; IZ, intermediate zone; SVZ, subventricular zone; VZ, ventricular zone. Scale bar: 100 µm"}
{"words": ["Figure", "2A", ",", "B", ",", "Staining", "for", "Isolectin", "B4", "+", "blood", "vessels", "in", "control", "(", "A", ")", "and", "Gpr124ECcKO", "(", "B", ")", "forebrains", ".", "Asterisks", "mark", "the", "lateral", "ventricles", ".", "C", ",", "D", ",", "Staining", "for", "pimonidazole", "(", "PIMO", ",", "green", ")", "and", "Isolectin", "B4", "+", "blood", "vessels", "(", "red", ")", "in", "ctrl", "(", "C", ")", "and", "Gpr124ECcKO", "(", "D", ")", "cortices", ".", "E", ",", "F", ",", "Immunostaining", "for", "Pax6", "in", "control", "(", "E", ")", "and", "Gpr124ECcKO", "(", "F", ")", "forebrain", "sections", "to", "reveal", "the", "lateral", "extension", "of", "the", "neocortex", "(", "dashed", "line", ")", "between", "the", "cortical", "hem", "(", "arrowhead", ")", "and", "the", "lateral", "ganglionic", "eminence", "(", "arrow", ")", ".", "G", ",", "Quantification", "the", "lateral", "extension", "of", "the", "cortex", "in", "control", "and", "Gpr124ECcKObrains", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "6", "for", "ctrl", "and", "N", "=", "8", "for", "Gpr124ECcKO", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "H", ",", "I", ",", "Staining", "for", "EdU", "(", "red", ")", "and", "Ki67", "(", "green", ")", "in", "control", "(", "H", ")", "and", "Gpr124ECcKO", "(", "I", ")", "cortices", "at", "E13", ".", "5", ",", "24", "hours", "after", "EdU", "injection", ".", "J", ",", "Quantification", "of", "Ki67", "+", "NPCs", "in", "the", "in", "VZ", "(", "blue", ")", ",", "SVZ", "/", "CP", "(", "grey", ")", "and", "of", "Ki67", "-", "neurons", "(", "cyan", ")", "generated", "from", "EdU", "-", "labeled", "NPCs", "in", "control", "and", "Gpr124ECcKO", "embryos", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "4", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "Full", ",", "dotted", "and", "dashed", "lines", "indicate", "basal", "and", "apical", "boundaries", "of", "the", "cortex", "or", "boundaries", "of", "the", "cortical", "zones", ",", "respectively", ".", "CP", ",", "cortical", "plate", ";", "IZ", ",", "intermediate", "zone", ";", "SVZ", ",", "subventricular", "zone", ";", "VZ", ",", "ventricular", "zone", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "µmK", ",", "L", ",", "Immunostaining", "for", "Tbr2", "(", "red", ")", "and", "Ngn1", "(", "green", ")", "in", "control", "(", "K", ")", "and", "Gpr124KO", "(", "L", ")", "cortices", ".", "M", "-", "O", ",", "Quantification", "of", "neurogenic", "(", "Ngn1", "+", ")", "RGs", "and", "BPs", "(", "M", ")", ",", "newborn", "BPs", "(", "N", ")", "or", "expanding", "(", "Tbr2", "-", "Ngn1", "-", ")", "RGs", "(", "O", ")", "in", "control", "and", "Gpr124ECcKO", "cortices", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "4", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "Full", ",", "dotted", "and", "dashed", "lines", "indicate", "basal", "and", "apical", "boundaries", "of", "the", "cortex", "or", "boundaries", "of", "the", "cortical", "zones", ",", "respectively", ".", "CP", ",", "cortical", "plate", ";", "IZ", ",", "intermediate", "zone", ";", "SVZ", ",", "subventricular", "zone", ";", "VZ", ",", "ventricular", "zone", ".", "Scale", "bar", ":", "100"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A,B, Staining for Isolectin B4+ blood vessels in control (A) and Gpr124ECcKO (B) forebrains. Asterisks mark the lateral ventricles.C,D, Staining for pimonidazole (PIMO, green) and Isolectin B4+ blood vessels (red) in ctrl (C) and Gpr124ECcKO (D) cortices.E,F, Immunostaining for Pax6 in control (E) and Gpr124ECcKO (F) forebrain sections to reveal the lateral extension of the neocortex (dashed line) between the cortical hem (arrowhead) and the lateral ganglionic eminence (arrow). G, Quantification the lateral extension of the cortex in control and Gpr124ECcKObrains (mean±SEM; N=6 for ctrl and N=8 for Gpr124ECcKO; * p<0.05).H,I, Staining for EdU (red) and Ki67 (green) in control (H) and Gpr124ECcKO (I) cortices at E13.5, 24 hours after EdU injection. J, Quantification of Ki67+ NPCs in the in VZ (blue), SVZ/CP (grey) and of Ki67- neurons (cyan) generated from EdU-labeled NPCs in control and Gpr124ECcKO embryos (mean±SEM; N=4; * p<0.05, ** P<0.01). Full, dotted and dashed lines indicate basal and apical boundaries of the cortex or boundaries of the cortical zones, respectively. CP, cortical plate; IZ, intermediate zone; SVZ, subventricular zone; VZ, ventricular zone. Scale bar: 100 µmK,L, Immunostaining for Tbr2 (red) and Ngn1 (green) in control (K) and Gpr124KO (L) cortices. M-O, Quantification of neurogenic (Ngn1+) RGs and BPs (M), newborn BPs (N) or expanding (Tbr2- Ngn1-) RGs (O) in control and Gpr124ECcKO cortices (mean±SEM; N=4; * p<0.05, ** p<0.01). Full, dotted and dashed lines indicate basal and apical boundaries of the cortex or boundaries of the cortical zones, respectively. CP, cortical plate; IZ, intermediate zone; SVZ, subventricular zone; VZ, ventricular zone. Scale bar: 100 µm"}
{"words": ["Figure", "3A", ",", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "NSC", "-", "specific", "markers", "(", "Fabp7", ",", "Hes5", ")", "and", "neuronal", "markers", "(", "Dcx", ",", "Tubb3", ")", "in", "the", "Prom1", "+", "fraction", ",", "presented", "as", "fold", "change", "compared", "to", "the", "Prom1", "-", "fraction", ")", "from", "WT", "cortices", "at", "E14", ".", "5", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "3", "for", "Dcx", ";", "N", "=", "6", "for", "all", "other", "genes", ")", ".", "F", ",", "Western", "blot", "for", "HIF", "-", "1", "(", "top", ")", ",", "HIF", "-", "2", "(", "middle", ")", "and", "a", "-", "tubulin", "as", "loading", "control", "(", "bottom", ")", "using", "forebrain", "lysates", "from", "E13", ".", "5", "control", "(", "left", ")", "or", "Gpr124KOembryos", "(", "middle", ")", ".", "HIF", "-", "1", "/", "2", "-", "transfected", "HEK293", "cells", "served", "as", "positive", "control", "(", "right", ")", ".", "G", ",", "Quantification", "of", "HIF", "-", "1", "band", "intensities", "shown", "in", "panel", "F", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "3", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "H", ",", "I", ",", "Immunostaining", "for", "HIF", "-", "1α", "(", "red", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", "in", "control", "(", "H", ",", "H", "'", ",", "H", "'", "'", ")", "and", "Gpr124KO", "(", "I", ",", "I", "'", ",", "I", "'", "'", ")", "cortices", ".", "Panels", "H", "'", ",", "H", "'", "'", ",", "I", "'", "and", "I", "'", "'", "are", "magnifications", "of", "the", "boxed", "areas", "in", "panels", "I", "and", "J", ",", "showing", "HIF", "-", "1α", "signal", "alone", "(", "H", "'", ",", "I", "'", ")", "or", "together", "with", "DAPI", "(", "H", "'", "'", ",", "I", "'", "'", ")", ".", "Asterisks", "indicate", "autofluorescent", "blood", "cells", ".", "The", "dashed", "line", "indicates", "the", "basal", "boundary", "of", "the", "VZ", ".", "Scale", "bar", "=", "100", "µm", ".", "Full", ",", "dotted", "and", "dashed", "lines", "indicate", "basal", "and", "apical", "boundaries", "of", "the", "cortex", "or", "boundaries", "of", "the", "cortical", "zones", ",", "respectively", ".", "CP", ",", "cortical", "plate", ";", "IZ", ",", "intermediate", "zone", ";", "SVZ", ",", "subventricular", "zone", ";", "VZ", ",", "ventricular", "zone", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "µmJ", ",", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "HIF", "-", "1", "target", "gene", "expression", "in", "VZ", "cells", "from", "the", "cortex", "of", "control", "and", "Gpr124KO", "E13", ".", "5", "embryos", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "4", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "SVZ", ",", "subventricular", "zone", ";", "VZ", ",", "ventricular", "zone", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A, qRT-PCR analysis of NSC-specific markers (Fabp7, Hes5) and neuronal markers (Dcx, Tubb3) in the Prom1+ fraction, presented as fold change compared to the Prom1- fraction) from WT cortices at E14.5 (mean±SEM; N=3 for Dcx; N=6 for all other genes).F, Western blot for HIF-1 (top), HIF-2 (middle) and a-tubulin as loading control (bottom) using forebrain lysates from E13.5 control (left) or Gpr124KOembryos (middle). HIF-1/2-transfected HEK293 cells served as positive control (right). G, Quantification of HIF-1 band intensities shown in panel F (mean±SEM; N=3; ** p<0.01).H,I, Immunostaining for HIF-1α (red) and DAPI (blue) in control (H, H', H'') and Gpr124KO (I,I',I'') cortices. Panels H',H'',I' and I'' are magnifications of the boxed areas in panels I and J, showing HIF-1α signal alone (H',I') or together with DAPI (H'',I''). Asterisks indicate autofluorescent blood cells. The dashed line indicates the basal boundary of the VZ. Scale bar = 100 µm. Full, dotted and dashed lines indicate basal and apical boundaries of the cortex or boundaries of the cortical zones, respectively. CP, cortical plate; IZ, intermediate zone; SVZ, subventricular zone; VZ, ventricular zone. Scale bar: 100 µmJ, qRT-PCR analysis of HIF-1 target gene expression in VZ cells from the cortex of control and Gpr124KO E13.5 embryos (mean±SEM; N=4; *** p<0.001). SVZ, subventricular zone; VZ, ventricular zone."}
{"words": ["Figure", "4A", "-", "F", ",", "Staining", "for", "Isolectin", "B4", "(", "A", "-", "C", ")", "and", "oxidized", "thiols", "(", "D", "-", "F", ")", "in", "WT", "cortices", "at", "E10", ".", "5", "(", "A", ",", "D", ")", ",", "E11", ".", "5", "(", "B", ",", "E", ")", "and", "E12", ".", "5", "(", "C", ",", "F", ")", ".", "Panels", "D", "-", "F", "are", "pseudocolor", "conversions", "of", "staining", "intensity", "(", "from", "low", "[", "purple", "]", "to", "high", "[", "red", "]", ")", ".", "Arrowheads", "denote", "the", "position", "of", "the", "vascular", "front", ".", "G", "-", "I", ",", "Immunostaining", "for", "HIF", "-", "1α", "(", "red", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", "in", "WT", "cortices", "at", "E10", ".", "5", "(", "G", "-", "G", "'", "'", ")", ",", "E11", ".", "5", "(", "H", "-", "H", "'", "'", ")", "and", "E12", ".", "5", "(", "I", "-", "I", "'", "'", ")", ".", "Panels", "G", "'", ",", "G", "'", "'", ",", "H", "'", ",", "H", "'", "'", ",", "I", "'", "and", "I", "'", "'", "are", "magnifications", "of", "the", "boxed", "areas", "in", "their", "respective", "original", "panels", ".", "Arrows", "point", "to", "the", "border", "of", "lateral", "and", "dorsal", "cortex", ".", "J", "-", "L", ",", "Immunostaining", "for", "Glut1", "of", "WT", "cortices", "at", "E10", ".", "0", "(", "J", ")", ",", "E11", ".", "5", "(", "K", ")", "and", "E12", ".", "5", "(", "L", ")", ".", "Dashed", "lines", "indicate", "the", "apical", "border", "of", "the", "cortex", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "µm", "(", "D", ",", "F", ",", "G", ",", "H", ",", "I", ",", "J", "-", "L", ")", "or", "50", "µm", "(", "I", "'", "'", ")", ",", "respectively", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A-F, Staining for Isolectin B4 (A-C) and oxidized thiols (D-F) in WT cortices at E10.5 (A,D), E11.5 (B,E) and E12.5 (C,F). Panels D-F are pseudocolor conversions of staining intensity (from low [purple] to high [red]). Arrowheads denote the position of the vascular front.G-I, Immunostaining for HIF-1α (red) and DAPI (blue) in WT cortices at E10.5 (G-G''), E11.5 (H-H'') and E12.5 (I-I''). Panels G',G'',H',H'',I' and I'' are magnifications of the boxed areas in their respective original panels. Arrows point to the border of lateral and dorsal cortex.J-L, Immunostaining for Glut1 of WT cortices at E10.0 (J), E11.5 (K) and E12.5 (L). Dashed lines indicate the apical border of the cortex. Scale bar: 100 µm (D,F,G,H,I, J-L) or 50 µm (I''), respectively."}
{"words": ["Figure", "5A", ",", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "HIF", "-", "1", "and", "HIF", "-", "1", "target", "gene", "expression", "in", "cortices", "from", "E13", ".", "5", "WT", "and", "HIF", "-", "1αCC", "+", "/", "-", "embryos", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "8", "for", "WT", "and", "N", "=", "5", "for", "HIF", "-", "1αCC", "+", "/", "-", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "B", ",", "C", ",", "Staining", "for", "EdU", "(", "red", ")", "and", "Ki67", "(", "green", ")", "in", "WT", "(", "B", ")", "and", "HIF", "-", "1αCC", "+", "/", "-", "(", "C", ")", "cortices", "at", "E13", ".", "5", ",", "24", "hours", "after", "EdU", "injection", ".", "D", ",", "Quantification", "of", "Ki67", "+", "NPCs", "in", "the", "in", "VZ", "(", "blue", ")", ",", "SVZ", "/", "CP", "(", "grey", ")", "and", "of", "Ki67", "-", "neurons", "(", "cyan", ")", "generated", "from", "EdU", "-", "labeled", "NPCs", "in", "control", "and", "HIF", "-", "1αCC", "+", "/", "-", "brains", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "4", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "Full", ",", "dotted", "and", "dashed", "lines", "indicate", "basal", "and", "apical", "boundaries", "of", "the", "cortex", "or", "boundaries", "of", "the", "cortical", "zones", ",", "respectively", ".", "CP", ",", "cortical", "plate", ";", "IZ", ",", "intermediate", "zone", ";", "SVZ", ",", "subventricular", "zone", ";", "VZ", ",", "ventricular", "zone", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "µmE", ",", "F", ",", "Immunostaining", "for", "Tbr2", "(", "red", ")", "and", "Ngn1", "(", "green", ")", "in", "WT", "(", "E", ")", "or", "HIF", "-", "1αCC", "+", "/", "-", "(", "F", ")", "cortices", "at", "E13", ".", "5", ".", "G", "-", "I", "Quantification", "of", "neurogenic", "(", "Ngn1", "+", ")", "RGs", "and", "BPs", "(", "G", ")", ",", "newborn", "BPs", "(", "H", ")", "or", "expanding", "(", "Tbr2", "-", "Ngn1", "-", ")", "RGs", "(", "I", ")", "in", "control", "and", "HIF", "-", "1αCC", "+", "/", "-", "cortices", "at", "E13", ".", "5", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "5", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "Full", ",", "dotted", "and", "dashed", "lines", "indicate", "basal", "and", "apical", "boundaries", "of", "the", "cortex", "or", "boundaries", "of", "the", "cortical", "zones", ",", "respectively", ".", "CP", ",", "cortical", "plate", ";", "IZ", ",", "intermediate", "zone", ";", "SVZ", ",", "subventricular", "zone", ";", "VZ", ",", "ventricular", "zone", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "µmJ", ",", "Whole", "mount", "image", "of", "brains", "from", "WT", "or", "HIF", "-", "1αCC", "+", "/", "-", "mice", "at", "P5", ".", "K", "Quantification", "of", "cortex", "area", "in", "brain", "sections", "from", "P5", "WT", "or", "HIF", "-", "1αCC", "+", "/", "-", "mice", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "8", "(", "WT", ")", "or", "N", "=", "6", "(", "HIF", "-", "1αCC", "+", "/", "-", ")", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "L", ",", "M", ",", "Staining", "with", "Hoechst", "33248", "in", "P5", "WT", "(", "L", ")", "or", "HIF", "-", "1αCC", "+", "/", "-", "(", "M", ")", "cortices", ".", "N", ",", "Quantification", "of", "cortical", "thickness", "of", "WT", "and", "HIF", "-", "1αCC", "+", "/", "-", "cortices", ".", "The", "double", "arrow", "denotes", "the", "measured", "thickness", "of", "the", "cortex", ".", "N", ",", "Quantification", "of", "cortical", "thickness", "of", "WT", "and", "HIF", "-", "1αCC", "+", "/", "-", "cortices", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "8", "(", "WT", ")", "or", "N", "=", "6", "(", "HIF", "-", "1αCC", "+", "/", "-", ")", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "O", "-", "Q", ",", "Epifluorescent", "images", "of", "the", "E16", ".", "5", "cortex", ",", "3", "days", "after", "in", "utero", "electroporation", "(", "IUE", ")", "with", "EGFP", "alone", "(", "ctrl", ",", "O", ")", ",", "wild", "type", "HIF", "-", "1", "+", "EGFP", "(", "P", ")", "or", "mutant", "HIF", "-", "1ΔC", "+", "EGFP", "(", "Q", ")", ".", "O", "'", ",", "P", "'", "and", "Q", "'", "are", "magnifications", "of", "the", "boxed", "area", "in", "their", "respective", "original", "panel", ".", "R", ",", "Quantification", "of", "EGFP", "+", "cells", "in", "the", "cortical", "zones", "VZ", "/", "SVZ", ",", "IZ", "and", "CP", "shown", "in", "O", "-", "Q", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "5", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "Full", ",", "dotted", "and", "dashed", "lines", "indicate", "basal", "and", "apical", "boundaries", "of", "the", "cortex", "or", "boundaries", "of", "the", "cortical", "zones", ",", "respectively", ".", "CP", ",", "cortical", "plate", ";", "IZ", ",", "intermediate", "zone", ";", "SVZ", ",", "subventricular", "zone", ";", "VZ", ",", "ventricular", "zone", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "µmS", "-", "U", ",", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "NSC", "marker", "(", "S", ";", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "5", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ")", ",", "neurogenic", "markers", "(", "T", ";", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "5", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ",", "and", "HIF", "target", "genes", "(", "U", ";", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "5", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", "in", "expanding", "NPCs", "(", "eNPCs", ")", "and", "neurogenic", "NPCs", "(", "nNPCs", ")", ".", "Gene", "expression", "was", "normalized", "to", "the", "levels", "in", "eNPCs", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A, qRT-PCR analysis of HIF-1 and HIF-1 target gene expression in cortices from E13.5 WT and HIF-1αCC+/-embryos (mean±SEM; N=8 for WT and N=5 for HIF-1αCC+/-; * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001).B,C, Staining for EdU (red) and Ki67 (green) in WT (B) and HIF-1αCC+/- (C) cortices at E13.5, 24 hours after EdU injection. D, Quantification of Ki67+NPCs in the in VZ (blue), SVZ/CP (grey) and of Ki67-neurons (cyan) generated from EdU-labeled NPCs in control and HIF-1αCC+/-brains (mean±SEM; N=4; * p<0.05). Full, dotted and dashed lines indicate basal and apical boundaries of the cortex or boundaries of the cortical zones, respectively. CP, cortical plate; IZ, intermediate zone; SVZ, subventricular zone; VZ, ventricular zone. Scale bar: 100 µmE,F, Immunostaining for Tbr2 (red) and Ngn1 (green) in WT (E) or HIF-1αCC+/- (F) cortices at E13.5. G-I Quantification of neurogenic (Ngn1+) RGs and BPs (G), newborn BPs (H) or expanding (Tbr2-Ngn1-) RGs (I) in control and HIF-1αCC+/-cortices at E13.5 (mean±SEM; N=5; * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001). Full, dotted and dashed lines indicate basal and apical boundaries of the cortex or boundaries of the cortical zones, respectively. CP, cortical plate; IZ, intermediate zone; SVZ, subventricular zone; VZ, ventricular zone. Scale bar: 100 µmJ, Whole mount image of brains from WT or HIF-1αCC+/-mice at P5. K Quantification of cortex area in brain sections from P5 WT or HIF-1αCC+/-mice (mean±SEM; N=8 (WT) or N=6 (HIF-1αCC+/-); * p<0.05).L,M, Staining with Hoechst 33248 in P5 WT (L) or HIF-1αCC+/- (M) cortices. N, Quantification of cortical thickness of WT and HIF-1αCC+/-cortices. The double arrow denotes the measured thickness of the cortex. N, Quantification of cortical thickness of WT and HIF-1αCC+/-cortices (mean±SEM; N=8 (WT) or N=6 (HIF-1αCC+/-); *** p<0.001).O-Q, Epifluorescent images of the E16.5 cortex, 3 days after in utero electroporation (IUE) with EGFP alone (ctrl, O), wild type HIF-1+EGFP (P) or mutant HIF-1ΔC+EGFP (Q). O',P' and Q' are magnifications of the boxed area in their respective original panel. R, Quantification of EGFP+ cells in the cortical zones VZ/SVZ, IZ and CP shown in O-Q (mean±SEM; N=5; ** p< 0.01,* p<0.05). Full, dotted and dashed lines indicate basal and apical boundaries of the cortex or boundaries of the cortical zones, respectively. CP, cortical plate; IZ, intermediate zone; SVZ, subventricular zone; VZ, ventricular zone. Scale bar: 100 µmS-U, qRT-PCR analysis of NSC marker (S; mean±SEM; N=5; * P<0.05), neurogenic markers (T; mean±SEM; N=5; *** p< 0.001, * p<0.05), and HIF target genes (U; mean±SEM; N=5; ** p< 0.01,* p<0.05) in expanding NPCs (eNPCs) and neurogenic NPCs (nNPCs). Gene expression was normalized to the levels in eNPCs."}
{"words": ["Figure", "6B", "-", "E", ",", "Staining", "for", "pimonodazole", "(", "PIMO", ",", "green", ")", "and", "Isolectin", "B4", "(", "IB4", ",", "red", ")", "in", "Gpr124KO", "(", "B", ",", "C", ")", "and", "control", "(", "D", ",", "E", ")", "cortices", "after", "exposure", "of", "the", "pregnant", "dams", "to", "21", "%", "O2", "(", "B", ",", "D", ")", "or", "80", "%", "O2", "(", "C", ",", "E", ")", ".", "Compared", "to", "the", "pimonidazole", "staining", "in", "panels", "B", ",", "C", ",", "the", "intensity", "of", "this", "staining", "is", "much", "weaker", "in", "panels", "D", ",", "E", ".", "For", "reasons", "of", "clarity", ",", "the", "pimonidazole", "staining", "in", "panels", "D", ",", "E", "was", "therefore", "enhanced", ",", "equally", "in", "both", "panels", ".", "F", ",", "G", ",", "Immunostaining", "for", "HIF", "-", "1", "(", "red", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", "in", "Gpr124KOcortices", "after", "exposure", "of", "the", "pregnant", "dams", "to", "21", "%", "O2", "(", "F", ")", "or", "80", "%", "O2", "(", "G", ")", ".", "Full", ",", "dotted", "and", "dashed", "lines", "indicate", "basal", "and", "apical", "boundaries", "of", "the", "cortex", "or", "boundaries", "of", "the", "cortical", "zones", ",", "respectively", ".", "CP", ",", "cortical", "plate", ";", "IZ", ",", "intermediate", "zone", ";", "SVZ", ",", "subventricular", "zone", ";", "VZ", ",", "ventricular", "zone", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "µmH", ",", "I", ",", "Immunostaining", "for", "Tbr2", "(", "red", ")", "and", "Ngn1", "(", "green", ")", "in", "Gpr124KO", "cortices", "after", "exposure", "of", "the", "pregnant", "dams", "to", "21", "%", "O2", "(", "H", ")", "or", "80", "%", "O2", "(", "I", ")", ".", "J", "-", "L", "Quantification", "of", "neurogenic", "(", "Ngn1", "+", ")", "RGs", "and", "BPs", "(", "J", ")", ",", "newborn", "BPs", "(", "K", ")", "or", "expanding", "(", "Tbr2", "-", "Ngn1", "-", ")", "RGs", "(", "L", ")", "in", "Gpr124KO", "cortices", "after", "exposure", "of", "the", "pregnant", "dams", "to", "21", "%", "O2", "or", "80", "%", "O2", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "4", "for", "21", "%", "O2", "and", "N", "=", "5", "for", "80", "%", "O2", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "M", ",", "N", ",", "Immunostaining", "for", "Tbr2", "(", "red", ")", "and", "Ngn1", "(", "green", ")", "in", "control", "cortices", "after", "exposure", "of", "the", "pregnant", "dams", "to", "21", "%", "O2", "(", "M", ")", "or", "80", "%", "O2", "(", "N", ")", ".", "O", "-", "Q", "Quantification", "of", "neurogenic", "(", "Ngn1", "+", ")", "RGs", "and", "BPs", "(", "O", ")", ",", "newborn", "BPs", "(", "P", ")", "or", "expanding", "(", "Tbr2", "-", "Ngn1", "-", ")", "RGs", "(", "Q", ")", "in", "control", "cortices", "after", "exposure", "of", "the", "pregnant", "dams", "to", "21", "%", "O2", "or", "80", "%", "O2", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "5", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "Full", ",", "dotted", "and", "dashed", "lines", "indicate", "basal", "and", "apical", "boundaries", "of", "the", "cortex", "or", "boundaries", "of", "the", "cortical", "zones", ",", "respectively", ".", "CP", ",", "cortical", "plate", ";", "IZ", ",", "intermediate", "zone", ";", "SVZ", ",", "subventricular", "zone", ";", "VZ", ",", "ventricular", "zone", ".", "Scale", "bar", ":", "100"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6B-E, Staining for pimonodazole (PIMO, green) and Isolectin B4 (IB4,red) in Gpr124KO (B,C) and control (D,E) cortices after exposure of the pregnant dams to 21% O2 (B,D) or 80% O2 (C,E). Compared to the pimonidazole staining in panels B,C, the intensity of this staining is much weaker in panels D,E. For reasons of clarity, the pimonidazole staining in panels D,E was therefore enhanced, equally in both panels.F,G, Immunostaining for HIF-1 (red) and DAPI (blue) in Gpr124KOcortices after exposure of the pregnant dams to 21% O2 (F) or 80% O2 (G). Full, dotted and dashed lines indicate basal and apical boundaries of the cortex or boundaries of the cortical zones, respectively. CP, cortical plate; IZ, intermediate zone; SVZ, subventricular zone; VZ, ventricular zone. Scale bar: 100 µmH,I, Immunostaining for Tbr2 (red) and Ngn1 (green) in Gpr124KO cortices after exposure of the pregnant dams to 21% O2 (H) or 80% O2 (I). J-L Quantification of neurogenic (Ngn1+) RGs and BPs (J), newborn BPs (K) or expanding (Tbr2- Ngn1-) RGs (L) in Gpr124KO cortices after exposure of the pregnant dams to 21% O2 or 80% O2 (mean±SEM; N=4 for 21% O2 and N=5 for 80% O2; * p<0.05, ** p<0.01). M,N, Immunostaining for Tbr2 (red) and Ngn1 (green) in control cortices after exposure of the pregnant dams to 21% O2 (M) or 80% O2 (N). O-Q Quantification of neurogenic (Ngn1+) RGs and BPs (O), newborn BPs (P) or expanding (Tbr2-Ngn1-) RGs (Q) in control cortices after exposure of the pregnant dams to 21% O2 or 80% O2 (mean±SEM; N=5; ** p<0.01). Full, dotted and dashed lines indicate basal and apical boundaries of the cortex or boundaries of the cortical zones, respectively. CP, cortical plate; IZ, intermediate zone; SVZ, subventricular zone; VZ, ventricular zone. Scale bar: 100 µm"}
{"words": ["Figure", "7A", ",", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "glycolytic", "enzymes", "in", "Prom1", "+", "VZ", "cells", "and", "their", "Prom1", "-", "differentiated", "progeny", "(", "BPs", "and", "neurons", ")", "in", "WT", "cortices", "at", "E14", ".", "5", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "3", "(", "Hk2", ",", "Gapdh", ")", ";", "N", "=", "6", "(", "Eno1", ";", "Ldha", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "B", ",", "Measurement", "of", "lactate", "secretion", "from", "proliferating", "NSCs", ",", "and", "of", "NSCs", "differentiating", "for", "3", "days", "(", "switch", "to", "neurogenesis", ")", "or", "for", "7", "days", "(", "fully", "differentiated", ")", ",", "normalized", "to", "cellular", "protein", "content", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "6", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "C", ",", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "Pfkfb3", "expression", "in", "proliferating", "NSCs", ",", "transduced", "with", "scr", "or", "Pfkfb3shRNA", "#", "1", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "4", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "D", ",", "Measurement", "of", "lactate", "secretion", "from", "proliferating", "NSCs", "transduced", "with", "scr", "or", "Pfkfb3shRNA", "#", "1", ",", "normalized", "to", "cellular", "protein", "content", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "3", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "E", ",", "Measurement", "of", "mitochondrial", "respiration", "rate", "(", "oxygen", "consumption", "rate", ",", "OCRMITO", ";", "see", "supplemental", "methods", ")", "in", "proliferating", "NSCs", ",", "transduced", "with", "scr", "or", "Pfkfb3shRNA", "#", "1", ",", "normalized", "to", "cellular", "protein", "content", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "3", ";", "N", ".", "S", ".", ",", "not", "significant", ")", ".", "F", "-", "H", ",", "Epifluorescent", "images", "of", "the", "E15", ".", "5", "cortex", ",", "3", "days", "after", "in", "utero", "electroporation", "(", "IUE", ")", "with", "EGFP", "+", "scr", "shRNA", "(", "F", ")", ",", "EGFP", "+", "Pfkfb3", "shRNA", "#", "1", "(", "G", ")", "or", "EGFP", "+", "Pfkfb3", "shRNA", "#", "2", "(", "H", ")", ".", "J", ",", "Quantification", "of", "EGFP", "+", "cells", "in", "the", "cortical", "zones", "VZ", "/", "SVZ", ",", "IZ", "and", "CP", "shown", "in", "panels", "F", "-", "H", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "4", "for", "scr", "and", "N", "=", "5", "for", "Pfkfb3", "shRNAs", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "K", "-", "M", ",", "Epifluorescent", "images", "of", "the", "mouse", "cortex", "after", "in", "utero", "electroporation", "(", "IUE", ")", "with", "HIF", "-", "1α", "and", "scr", "shRNA", "(", "K", ")", "or", "with", "HIF", "-", "1α", "and", "two", "different", "Pfkfb3", "shRNAs", "(", "L", ",", "M", ")", "at", "E16", ".", "5", ",", "3", "days", "after", "transfection", ".", "N", ",", "Quantification", "of", "EGFP", "+", "cells", "in", "the", "cortical", "zones", "VZ", "/", "SVZ", ",", "IZ", "and", "CP", "shown", "in", "K", "-", "M", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "N", "=", "5", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "Full", ",", "dotted", "and", "dashed", "lines", "indicate", "basal", "and", "apical", "boundaries", "of", "the", "cortex", "or", "boundaries", "of", "the", "cortical", "zones", ",", "respectively", ".", "CP", ",", "cortical", "plate", ";", "IZ", ",", "intermediate", "zone", ";", "SVZ", ",", "subventricular", "zone", ";", "VZ", ",", "ventricular", "zone", ".", "Scale", "bar", ":", "100"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A, qRT-PCR analysis of glycolytic enzymes in Prom1+ VZ cells and their Prom1- differentiated progeny (BPs and neurons) in WT cortices at E14.5 (mean±SEM; N=3 (Hk2, Gapdh); N=6 (Eno1; Ldha; ** p<0.01).B, Measurement of lactate secretion from proliferating NSCs, and of NSCs differentiating for 3 days (switch to neurogenesis) or for 7 days (fully differentiated), normalized to cellular protein content (mean±SEM; N=6; *** p<0.001).C, qRT-PCR analysis of Pfkfb3 expression in proliferating NSCs, transduced with scr or Pfkfb3shRNA#1 (mean±SEM; N=4; * p<0.05).D, Measurement of lactate secretion from proliferating NSCs transduced with scr or Pfkfb3shRNA#1, normalized to cellular protein content (mean±SEM; N=3; * p<0.05).E, Measurement of mitochondrial respiration rate (oxygen consumption rate, OCRMITO; see supplemental methods) in proliferating NSCs, transduced with scr or Pfkfb3shRNA#1, normalized to cellular protein content (mean±SEM; N=3; N.S., not significant).F-H, Epifluorescent images of the E15.5 cortex, 3 days after in utero electroporation (IUE) with EGFP + scr shRNA (F), EGFP + Pfkfb3 shRNA#1 (G) or EGFP + Pfkfb3 shRNA#2 (H). J, Quantification of EGFP+ cells in the cortical zones VZ/SVZ, IZ and CP shown in panels F-H (mean±SEM; N=4 for scr and N=5 for Pfkfb3 shRNAs; * p<0.05, ** p< 0.01, *** p< 0.001). K-M, Epifluorescent images of the mouse cortex after in utero electroporation (IUE) with HIF-1α and scr shRNA (K) or with HIF-1α and two different Pfkfb3 shRNAs (L,M) at E16.5, 3 days after transfection. N, Quantification of EGFP+ cells in the cortical zones VZ/SVZ, IZ and CP shown in K-M (mean±SEM; N=5; * p<0.05, ** p< 0.01, *** p< 0.001). Full, dotted and dashed lines indicate basal and apical boundaries of the cortex or boundaries of the cortical zones, respectively. CP, cortical plate; IZ, intermediate zone; SVZ, subventricular zone; VZ, ventricular zone. Scale bar: 100 µm"}
{"words": ["Figure", "1A", "Affinity", "measurements", "by", "biolayer", "interferometry", "(", "BLI", ")", "of", "bipNbs", "NM1267", "and", "NM1268", ".", "NM1267", "and", "NM1268", "were", "applied", "with", "concentrations", "ranging", "from", "5", "-", "0", ".", "625", "nM", "and", "20", "‑", "2", ".", "5", "nM", ",", "respectively", "(", "illustrated", "with", "gradually", "lighter", "shades", ")", "on", "immobilized", "RBD", "derived", "from", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "B", ".", "1", "(", "RBDB", ".", "1", ")", ".", "Global", "1", ":", "1", "fits", "are", "illustrated", "as", "dashed", "lines", ".", "Global", "1", ":", "1", "fits", "are", "illustrated", "as", "dashed", "lines", "and", "binding", "affinity", "(", "KD", ")", ",", "association", "(", "kon", ")", "and", "dissociation", "constant", "(", "koff", ")", "determined", "for", "the", "individual", "bipNbs", "are", "summarized", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A Affinity measurements by biolayer interferometry (BLI) of bipNbs NM1267 and NM1268. NM1267 and NM1268 were applied with concentrations ranging from 5-0.625 nM and 20‑2.5 nM, respectively (illustrated with gradually lighter shades) on immobilized RBD derived from SARS-CoV-2 B.1 (RBDB.1). Global 1:1 fits are illustrated as dashed lines. Global 1:1 fits are illustrated as dashed lines and binding affinity (KD), association (kon) and dissociation constant (koff) determined for the individual bipNbs are summarized."}
{"words": ["Figure", "2A", "-", "P", "Affinity", "measurements", "by", "BLI", "of", "bipNb", "NM1267", "and", "NM1268", "on", "recently", "identified", "RBD", "variants", "B", ".", "1", ".", "1", ".", "7", "(", "Alpha", ")", "(", "A", ",", "I", ")", ",", "B", ".", "1", ".", "351", "(", "Beta", ")", "(", "B", ",", "J", ")", ",", "P1", "(", "Gamma", ")", "(", "C", ",", "K", ")", ",", "B", ".", "1", ".", "617", ".", "2", "(", "Delta", ")", "(", "D", ",", "L", ")", ",", "B", ".", "1", ".", "429", "(", "Epsilon", ")", "(", "E", ",", "M", ")", ",", "P3", "(", "Theta", ")", "(", "F", ",", "N", ")", ",", "B", ".", "1", ".", "617", ".", "1", "(", "Kappa", ")", "(", "G", ",", "O", ")", "and", "A", ".", "23", ".", "1", "(", "H", ",", "P", ")", ".", "NM1267", "and", "NM1268", "were", "applied", "with", "concentrations", "ranging", "from", "5", "-", "0", ".", "625", "nM", "and", "20", "‑", "2", ".", "5", "nM", ",", "respectively", "(", "illustrated", "with", "gradually", "lighter", "shades", ")", "on", "immobilized", "RBD", "variants", ".", "Global", "1", ":", "1", "fits", "are", "illustrated", "as", "dashed", "lines", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A-P Affinity measurements by BLI of bipNb NM1267 and NM1268 on recently identified RBD variants B.1.1.7 (Alpha) (A, I), B.1.351 (Beta) (B, J), P1 (Gamma) (C, K), B.1.617.2 (Delta) (D, L), B.1.429 (Epsilon) (E, M), P3 (Theta) (F, N), B.1.617.1 (Kappa) (G, O) and A.23.1 (H, P). NM1267 and NM1268 were applied with concentrations ranging from 5-0.625 nM and 20‑2.5 nM, respectively (illustrated with gradually lighter shades) on immobilized RBD variants. Global 1:1 fits are illustrated as dashed lines."}
{"words": ["Figure", "3A", "-", "F", "Neutralization", "potency", "of", "NM1267", "and", "NM1268", "were", "analyzed", "in", "Caco", "‑", "2", "cells", "using", "the", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "B", ".", "1", "(", "A", ",", "D", ")", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "B", ".", "1", ".", "351", "(", "Beta", ")", "(", "B", ",", "E", ")", "and", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "B", ".", "1", ".", "617", ".", "2", "(", "Delta", ")", "(", "C", ",", "F", ")", ".", "Infection", "normalized", "to", "virus", "-", "only", "infection", "control", "is", "illustrated", "as", "percent", "of", "infection", "(", "infection", "[", "%", "]", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "of", "three", "(", "n", "=", "3", ")", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A-F Neutralization potency of NM1267 and NM1268 were analyzed in Caco‑2 cells using the SARS-CoV-2 B.1 (A, D) SARS-CoV-2 B.1.351 (Beta) (B, E) and SARS-CoV-2 B.1.617.2 (Delta) (C, F). Infection normalized to virus-only infection control is illustrated as percent of infection (infection [%]). Data are presented as mean ± SEM of three (n = 3) biological replicates."}
{"words": ["Figure", "4C", "Hemizygous", "K18", "-", "hACE2", "mice", "were", "treated", "intranasally", "with", "20", "µg", "of", "NM1251", "(", "n", "=", "15", ")", "or", "NM1267", "(", "n", "=", "12", ")", "seven", "hours", "prior", "to", "infection", "with", "3", "*", "103", "PFU", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "B", ".", "1", ".", "survival", "were", "monitored", "for", "14", "days", ".", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "by", "log", "-", "rank", "testD", "Nasal", "swabs", "were", "collected", "from", "six", "mice", "per", "group", "(", "n", "=", "6", ")", "at", "the", "indicated", "time", "points", "and", "viral", "load", "was", "determined", "by", "plaque", "-", "assay", ".", "Bars", "represent", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "by", "unpaired", "t"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4C Hemizygous K18-hACE2 mice were treated intranasally with 20 µg of NM1251 (n = 15) or NM1267 (n = 12) seven hours prior to infection with 3*103 PFU SARS-CoV-2 B.1. survival were monitored for 14 days. , ****P < 0.0001, by log-rank testD Nasal swabs were collected from six mice per group (n = 6) at the indicated time points and viral load was determined by plaque-assay. Bars represent mean ± SEM. **P < 0.01, by unpaired t test"}
{"words": ["Figure", "5Histopathological", "analysis", "of", "mice", ",", "which", "were", "intranasally", "treated", "with", "bipNb", "NM1267", "or", "control", "Nb", "NM1251", "and", "subsequently", "infected", "with", "3", "*", "103", "PFU", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "B", ".", "1", ".", "A", "-", "B", "Serial", "tissue", "sections", "revealed", "severe", "inflammation", "(", "H", "&", "E", ")", "and", "numerous", "widespread", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "RNA", "positive", "alveolar", "epithelia", "cells", "and", "macrophages", "(", "in", "situ", "hybridization", "(", "ISH", ")", ")", "in", "lungs", "of", "infected", ",", "control", "-", "treated", "mice", ".", "In", "infected", "and", "NM1267", "-", "treated", "animals", "no", "inflammation", "or", "only", "small", "focal", "areas", "with", "inflammation", "and", "a", "few", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "RNA", "positive", "cells", "were", "observed", ".", "Scale", "bars", "represent", "1", "mm", "and", "200", "µm", ",", "respectively", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Histopathological analysis of mice, which were intranasally treated with bipNb NM1267 or control Nb NM1251 and subsequently infected with 3*103 PFU SARS-CoV-2 B.1. A-B Serial tissue sections revealed severe inflammation (H&E) and numerous widespread SARS-CoV-2 RNA positive alveolar epithelia cells and macrophages (in situ hybridization (ISH)) in lungs of infected, control-treated mice. In infected and NM1267-treated animals no inflammation or only small focal areas with inflammation and a few SARS-CoV-2 RNA positive cells were observed. Scale bars represent 1 mm and 200 µm, respectively."}
{"words": ["Figure", "6B", ",", "Hemizygous", "K18", "-", "hACE2", "mice", "were", "treated", "intranasally", "with", "20", "µg", "of", "NM1251", "(", "n", "=", "8", ")", ",", "NM1267", "(", "n", "=", "9", ")", "or", "NM1268", "(", "n", "=", "9", ")", "seven", "hours", "prior", "to", "infection", "with", "3", "*", "103", "PFU", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "B", ".", "1", ".", "617", ".", "2", "(", "Delta", ")", ".", "Weight", "loss", "were", "monitored", "for", "14", "days", ".", "Dashed", "line", "indicates", "humane", "endpoint", "and", "symbols", "represent", "mean", "±", "SEM", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "in", "orange", "between", "NM1251", "and", "NM1267", "and", "in", "purple", "between", "NM1251", "and", "NM1268", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "1", "in", "black", "between", "NM1267", "and", "NM1268", ",", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparison", "testC", "Hemizygous", "K18", "-", "hACE2", "mice", "were", "treated", "intranasally", "with", "20", "µg", "of", "NM1251", "(", "n", "=", "8", ")", ",", "NM1267", "(", "n", "=", "9", ")", "or", "NM1268", "(", "n", "=", "9", ")", "seven", "hours", "prior", "to", "infection", "with", "3", "*", "103", "PFU", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "B", ".", "1", ".", "617", ".", "2", "(", "Delta", ")", ".", "survival", "were", "monitored", "for", "14", "days", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "in", "orange", "between", "NM1251", "and", "NM1267", "and", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "in", "purple", "between", "NM1251", "and", "NM1268", ",", "by", "log", "-", "rank"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6B, Hemizygous K18-hACE2 mice were treated intranasally with 20 µg of NM1251 (n = 8), NM1267 (n = 9) or NM1268 (n = 9) seven hours prior to infection with 3*103 PFU SARS-CoV-2 B.1.617.2 (Delta). Weight loss were monitored for 14 days. Dashed line indicates humane endpoint and symbols represent mean ± SEM ****P < 0.0001 in orange between NM1251 and NM1267 and in purple between NM1251 and NM1268, *P < 0.1 in black between NM1267 and NM1268, by two-way ANOVA with Sidak's multiple comparison testC Hemizygous K18-hACE2 mice were treated intranasally with 20 µg of NM1251 (n = 8), NM1267 (n = 9) or NM1268 (n = 9) seven hours prior to infection with 3*103 PFU SARS-CoV-2 B.1.617.2 (Delta). survival were monitored for 14 days. ***P < 0.001 in orange between NM1251 and NM1267 and ****P < 0.0001 in purple between NM1251 and NM1268, by log-rank test"}
{"words": ["Figure", "1", "B", ",", "C", "Relative", "abundance", "of", "sgRNAs", "in", "cell", "populations", "with", "high", "versus", "low", "signal", "were", "visualized", "as", "log2", "fold", "chances", "for", "basal", "as", "well", "as", "activated", "autophagy", "conditions", "for", "(", "B", ")", "p62", "or", "(", "C", ")", "NDP52", ".", "Entire", "data", "is", "reported", "in", "Dataset", "EV1", "D", "-", "F", "Validation", "of", "TMEM41B", ".", "H4", "Cas9", "cells", "were", "infected", "with", "sgRNAs", "targeting", "TMEM41B", "or", "a", "non", "-", "targeting", "(", "NT", ")", "control", ",", "treated", "with", "500", "nM", "AZD8055", ",", "50nM", "Bafilomycin", "A1", "(", "BafA1", ")", "or", "DMSO", "vehicle", "control", "for", "24", "h", ",", "and", "analyzed", "by", "immunoblotting", ".", "(", "E", ",", "F", ")", "p62", "and", "NDP52", "band", "intensities", "are", "depicted", "as", "total", "levels", "relative", "to", "vehicle", "control", "in", "H4", "Cas9", "NT", "cells", "(", "E", ")", ",", "or", "as", "flux", "by", "calculating", "the", "ratio", "in", "BafA1", "-", "treated", "cells", "versus", "vehicle", "control", "(", "F", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "6", "independent", "experiments", ")", "with", "paired", "t", "-", "test", "values", "G", "LAMP1", "and", "p62", "were", "co", "-", "stained", "and", "imaged", "using", "an", "LSM700", "confocal", "microscope", ".", "Arrowheads", "point", "at", "p62", "-", "filled", "and", "empty", "LAMP1", "-", "positive", "organelles", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "µm", "H", "LAMP1", "-", "positive", "organelles", "were", "manually", "quantified", "for", "containing", "a", "p62", "-", "filled", "or", "empty", "lumen", ".", "A", "total", "of", "50", "-", "60", "LAMP1", "-", "positive", "organelles", "were", "analyzed", "in", "each", "experiment", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", "with", "paired", "t", "-", "test", "values", "I", "HeLa", "cells", "were", "transduced", "with", "Cas9", "and", "TMEM41B", "or", "NT", "sgRNAs", "followed", "by", "infection", "with", "luciferase", "-", "expressing", "S", ".", "typhimurium", ".", "Luciferase", "readings", "were", "taken", "up", "to", "8", ".", "5", "h", "post", "-", "infection", ".", "Results", "from", "one", "representative", "experiment", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "8", "technical", "replicates", ")"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1 B, C Relative abundance of sgRNAs in cell populations with high versus low signal were visualized as log2 fold chances for basal as well as activated autophagy conditions for (B) p62 or (C) NDP52. Entire data is reported in Dataset EV1  D-F Validation of TMEM41B. H4 Cas9 cells were infected with sgRNAs targeting TMEM41B or a non-targeting (NT) control, treated with 500 nM AZD8055, 50nM Bafilomycin A1 (BafA1) or DMSO vehicle control for 24 h, and analyzed by immunoblotting. (E, F) p62 and NDP52 band intensities are depicted as total levels relative to vehicle control in H4 Cas9 NT cells (E), or as flux by calculating the ratio in BafA1-treated cells versus vehicle control (F). Data are presented as mean ± SD (n=6 independent experiments) with paired t-test values  G LAMP1 and p62 were co-stained and imaged using an LSM700 confocal microscope. Arrowheads point at p62-filled and empty LAMP1-positive organelles. Scale bar: 5 µm  H LAMP1-positive organelles were manually quantified for containing a p62-filled or empty lumen. A total of 50-60 LAMP1-positive organelles were analyzed in each experiment. Data are presented as mean ± SD (n=3 independent experiments) with paired t-test values  I HeLa cells were transduced with Cas9 and TMEM41B or NT sgRNAs followed by infection with luciferase-expressing S. typhimurium. Luciferase readings were taken up to 8.5 h post-infection. Results from one representative experiment are presented as mean ± SD (n=8 technical replicates) "}
{"words": ["Figure", "2", "A", "H4", "Cas9", "cells", "were", "infected", "with", "sgRNAs", "targeting", "ATG7", ",", "TMEM41B", "or", "NT", "control", ",", "treated", "with", "500", "nM", "AZD8055", "or", "vehicle", "control", "for", "24", "h", ",", "and", "analyzed", "by", "immunoblotting", ".", "B", "Ratio", "of", "LC3", "-", "II", "to", "LC3", "-", "I", "band", "intensities", "are", "depicted", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "6", "independent", "experiments", ")", "with", "Wilcoxon", "test", "values", "C", "H4", "Cas9", "TMEM41B", "and", "NT", "control", "cells", "were", "probed", "by", "LC3B", "immunostaining", "and", "imaged", "with", "an", "automated", "CV7000", "confocal", "microscope", ".", "Scale", "bar", ":", "20", "μm", ".", "D", "The", "number", "of", "LC3", "puncta", "per", "cell", "was", "quantified", "using", "Yokogawa", "Analysis", "Software", "(", "YAS", ")", "and", "depicted", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "technical", "replicates", ")", "E", "LC3", "and", "WIPI2", "were", "co", "-", "stained", "and", "imaged", "using", "an", "LSM700", "confocal", "microscope", ".", "Arrowheads", "point", "at", "co", "-", "localized", "LC3", "and", "WIPI2", "puncta", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "µm", "F", "The", "number", "of", "WIPI2", "puncta", "positive", "for", "LC3", "was", "quantified", "using", "ImageJ", "and", "depicted", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "5", "technical", "replicates", ")", ".", "G", "The", "total", "number", "of", "WIPI2", "puncta", "per", "cell", "was", "quantified", "using", "the", "Harmony", "software", "on", "images", "acquired", "with", "an", "automated", "Operetta", "microscope", ".", "Data", "are", "depicted", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "technical", "replicates", ")", " ", "H", "H4", " ", "Cas9", " ", "TMEM41B", "and", "NT", "control", "cells", "were", "infected", "with", "a", "RFP", "-", "DFCP1", "expression", "construct", "for", "72h", ",", "fixed", ",", "stained", "with", "LC3", "antibodies", "and", "imaged", "with", "an", "automated", "CV7000", "confocal", "microscope", ".", "Arrowheads", "point", "at", "co", "-", "localized", "LC3", "and", "RFP", "-", "DFCP1", " ", "puncta", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "µm", ".", " ", "I", "The", "number", "of", "RFP", "-", "DFCP1", " ", "puncta", "positive", "for", "LC3", "was", "quantified", "using", "ImageJ", "and", "depicted", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "10", "technical", "replicates", ")", " ", " ", "J", "mCherry", "-", "GFP", "-", "LC3", "was", "expressed", "in", "H4", " ", "Cas9", " ", "TMEM41B", "KO", "and", "NT", "control", "cells", "which", "were", "treated", "with", "50nM", "BafA1", "or", "vehicle", "control", "for", "24", "h", ",", "fixed", "and", "imaged", ".", "Scale", "bar", ":", "20", "μm", ".", "The", "number", "of", "mCherry", "-", "and", "GFP", "-", "positive", "puncta", "per", "cell", "was", "quantified", "using", "YAS", "and", "are", "depicted", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "technical", "replicates", ")", " "], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2 A H4 Cas9 cells were infected with sgRNAs targeting ATG7, TMEM41B or NT control, treated with 500 nM AZD8055 or vehicle control for 24 h, and analyzed by immunoblotting. B Ratio of LC3-II to LC3-I band intensities are depicted as mean ± SD (n=6 independent experiments) with Wilcoxon test values  C H4 Cas9 TMEM41B and NT control cells were probed by LC3B immunostaining and imaged with an automated CV7000 confocal microscope. Scale bar: 20 μm. D The number of LC3 puncta per cell was quantified using Yokogawa Analysis Software (YAS) and depicted as mean ± SD (n=3 technical replicates)  E LC3 and WIPI2 were co-stained and imaged using an LSM700 confocal microscope. Arrowheads point at co-localized LC3 and WIPI2 puncta. Scale bar: 5 µm  F The number of WIPI2 puncta positive for LC3 was quantified using ImageJ and depicted as mean ± SD (n=5 technical replicates). G The total number of WIPI2 puncta per cell was quantified using the Harmony software on images acquired with an automated Operetta microscope. Data are depicted as mean ± SD (n=3 technical replicates)  H H4 Cas9 TMEM41B and NT control cells were infected with a RFP-DFCP1 expression construct for 72h, fixed, stained with LC3 antibodies and imaged with an automated CV7000 confocal microscope. Arrowheads point at co-localized LC3 and RFP-DFCP1 puncta. Scale bar: 5 µm. I The number of RFP-DFCP1 puncta positive for LC3 was quantified using ImageJ and depicted as mean ± SD (n=10 technical replicates)  J mCherry-GFP-LC3 was expressed in H4 Cas9 TMEM41B KO and NT control cells which were treated with 50nM BafA1 or vehicle control for 24 h, fixed and imaged. Scale bar: 20 μm. The number of mCherry- and GFP-positive puncta per cell was quantified using YAS and are depicted as mean ± SD (n=3 technical replicates) "}
{"words": ["Figure", "3", "A", "H4", "Cas9", "cells", "stably", "expressing", "NT", ",", "TMEM41B", "or", "ATG7", "sgRNAs", "were", "stained", "with", "BODIPY", "493", ",", "NBD", "cholesterol", "or", "BODIPY", "FL", "C12", "probes", "for", "2", "h", "at", "37", "°", "C", "and", "imaged", "live", "with", "an", "automated", "CV7000", "confocal", "microscope", ".", "Puncta", "area", "per", "cell", "was", "quantified", "using", "YAS", "and", "depicted", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "4", "technical", "replicates", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "20", "μm", "B", "H4", "Cas9", "TMEM41B", "KO", "and", "NT", "control", "cells", "were", "treated", "overnight", "with", "400", "μM", "BSA", "-", "conjugated", "oleic", "acid", "or", "0", ".", "1", "%", "BSA", "as", "vehicle", "control", ",", "stained", "for", "2", "h", "with", "HCS", "LipidTox", "Green", "Neutral", "Lipid", "Stain", "and", "imaged", "with", "an", "automated", "Operetta", "microscope", ".", "Scale", "bar", ":", "20", "μm", "C", "Lipid", "droplet", "size", ",", "number", "and", "mean", "fluorescence", "intensity", "was", "quantified", "using", "Harmony", "software", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "technical", "replicates", ")", ".", "An", "average", "of", "1500", "cells", "was", "analyzed", "per", "replicate", "D", "H4", "Cas9", "TMEM41B", "KO", "and", "NT", "control", "cells", "were", "probed", "by", "ADRP", "immunostaining", "and", "imaged", "with", "an", "automated", "CV7000", "confocal", "microscope", ".", "Scale", "bar", ":", "20", "μm", ".", "E", "Size", "of", "ADRP", "droplets", "was", "quantified", "with", "YAS", "and", "depicted", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "technical", "replicates", ")", " ", "F", "Protein", "level", "of", "ADRP", "was", "probed", "by", "immunoblotting", "in", "H4", " ", "Cas9", " ", "TMEM41B", "KO", "and", "NT", "control", "cells", ".", " ", "G", "ADRP", "band", "intensities", "were", "quantified", "and", "depicted", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "4", "independent", "experiments", ")", "with", "paired", "t", "-", "test", "values", " "], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3 A H4 Cas9 cells stably expressing NT, TMEM41B or ATG7 sgRNAs were stained with BODIPY 493, NBD cholesterol or BODIPY FL C12 probes for 2 h at 37°C and imaged live with an automated CV7000 confocal microscope. Puncta area per cell was quantified using YAS and depicted as mean ± SD (n=4 technical replicates). Scale bar: 20 μm  B H4 Cas9 TMEM41B KO and NT control cells were treated overnight with 400 μM BSA-conjugated oleic acid or 0.1% BSA as vehicle control, stained for 2 h with HCS LipidTox Green Neutral Lipid Stain and imaged with an automated Operetta microscope. Scale bar: 20 μm  C Lipid droplet size, number and mean fluorescence intensity was quantified using Harmony software. Data are presented as mean ± SD (n=3 technical replicates). An average of 1500 cells was analyzed per replicate  D H4 Cas9 TMEM41B KO and NT control cells were probed by ADRP immunostaining and imaged with an automated CV7000 confocal microscope. Scale bar: 20 μm. E Size of ADRP droplets was quantified with YAS and depicted as mean ± SD (n=3 technical replicates)  F Protein level of ADRP was probed by immunoblotting in H4 Cas9 TMEM41B KO and NT control cells. G ADRP band intensities were quantified and depicted as mean ± SD (n=4 independent experiments) with paired t-test values "}
{"words": ["Figure", "4", " ", "A", "H4", " ", "Cas9", " ", "TMEM41B", "KO", "and", "NT", "control", "cells", "were", "pulsed", "with", "the", "fatty", "acid", "analog", "Red", "C12", ",", "chased", "in", "complete", "medium", "or", "upon", "serum", "-", "deprivation", ",", "and", "stained", "with", "MitoTracker", ".", "Cells", "were", "imaged", "live", "with", "an", "automated", "CV7000", "confocal", "microscope", ".", "Scale", "bar", ":", "20", "μm", " ", " ", "C", "-", "E", "H4", " ", "Cas9", " ", "TMEM41B", "KO", "and", "NT", "control", "cells", "were", "plated", "in", "XF96", "plates", "and", "analyzed", "using", "a", "Seahorse", "Bioscience", "XF96", ".", "(", "C", ")", "Basal", "oxygen", "consumption", "rates", "(", "OCR", ")", "and", "extra", "cellular", "acidification", "rates", "(", "ECAR", ")", "were", "measured", "in", "cells", "grown", "in", "complete", "medium", ".", "OCR", "/", "ECAR", "ratio", "is", "also", "reported", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "30", "-", "32", "technical", "replicates", ")", "from", "one", "representative", "experiment", " ", "(", "D", ")", "OCR", "was", "measured", "in", "cells", "grown", "in", "substrate", "-", "limited", "medium", "and", "treated", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "Etomoxir", "(", "Eto", ")", ".", "Oligomycin", "(", "OA", ")", ",", "FCCP", "(", "FC", ")", "and", "a", "mixture", "of", "rotenone", "and", "antimycin", "A", "(", "RA", ")", "was", "added", "as", "indicated", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "69", "technical", "replicates", ")", "(", "E", ")", "Endogenous", "FA", "utilization", "was", "calculating", "by", "subtracting", "basal", "normalized", "OCR", "values", "of", "Eto", "-", "treated", "cells", "from", "untreated", "cells", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "69", "technical", "replicates", ")"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4 A H4 Cas9 TMEM41B KO and NT control cells were pulsed with the fatty acid analog Red C12, chased in complete medium or upon serum-deprivation, and stained with MitoTracker. Cells were imaged live with an automated CV7000 confocal microscope. Scale bar: 20 μm  C-E H4 Cas9 TMEM41B KO and NT control cells were plated in XF96 plates and analyzed using a Seahorse Bioscience XF96. (C) Basal oxygen consumption rates (OCR) and extra cellular acidification rates (ECAR) were measured in cells grown in complete medium. OCR/ECAR ratio is also reported. Data are presented as mean ± SEM (n=30-32 technical replicates) from one representative experiment (D) OCR was measured in cells grown in substrate-limited medium and treated in the absence or presence of Etomoxir (Eto). Oligomycin (OA), FCCP (FC) and a mixture of rotenone and antimycin A (RA) was added as indicated. Data are shown as mean ± SEM (n= 69 technical replicates)(E) Endogenous FA utilization was calculating by subtracting basal normalized OCR values of Eto-treated cells from untreated cells. Data are shown as mean ± SEM (n= 69 technical replicates)"}
{"words": ["Figure", "5", " ", "A", "H4", " ", "Cas9", "cells", "stably", "expressing", "N", "-", "terminally", "(", "Myc", "-", "TMEM41B", ")", "or", "C", "-", "terminally", "Myc", "-", "tagged", "TMEM41B", "(", "TMEM41B", "-", "Myc", ")", "were", "probed", "by", "calnexin", "(", "CANX", ")", "and", "Myc", "tag", "immunostaining", "and", "imaged", "with", "an", "automated", "CV7000", "confocal", "microscope", ".", "Scale", "bar", ":", "20", "μm", " ", " ", "B", "-", "D", "Endogenous", "TMEM41B", "locus", "was", "tagged", "with", "C", "-", "terminal", "Myc", "using", "CRISPR", "-", "directed", "homologous", "recombination", "in", "HeLa", "cells", ".", "HeLa", "knock", "-", "in", "(", "KI", ")", "cells", "were", "compared", "to", "parental", "HeLa", "(", "-", ")", "and", "HeLa", "cells", "stably", "transduced", "with", "a", "TMEM41B", "-", "Myc", "over", "-", "expression", "(", "OE", ")", "construct", ".", "(", "B", ")", "Confocal", "micrographs", "of", "cells", "stained", "with", "antibodies", "against", "CANX", "and", "Myc", "confirming", "ER", "localization", "of", "both", "KI", "and", "OE", "TMEM41B", "-", "Myc", ".", "Scale", "bar", "represents", "20", "μm", " ", "μm", ".", "(", "C", ")", "Immunoblot", "analysis", "confirming", "expression", "of", "both", "KI", "and", "OE", "TMEM41B", "-", "Myc", "(", "D", ")", "PCR", "analysis", "with", "primers", "binding", "to", "TMEM41B", "last", "intron", "and", "to", "Myc", "tag", "confirming", "successful", "targeting", "of", "the", "endogenous", "TMEM41B", "locus", "with", "Myc", "(", "band", "labeled", "with", "asterisk", ")", ".", "M", "=", "size", "marker", " ", "E", "H4", " ", "Cas9", "cells", "and", "H4", " ", "Cas9", "cells", "stably", "expressing", "Myc", "-", "TMEM41B", "or", "TMEM41B", "-", "Myc", "were", "lysed", "and", "subjected", "to", "anti", "-", "Myc", "IP", ".", "Eluates", "were", "analyzed", "by", "mass", "spectrometry", ".", "Enrichment", "of", "proteins", "in", "IPs", "from", "Myc", "-", "TMEM41B", "or", "TMEM41B", "-", "Myc", "cells", "versus", "H4", " ", "Cas9", "cells", "is", "depicted", "as", "log2", "fold", "changes", ".", "Entire", "data", "is", "reported", "in", "Dataset", "EV2", " "], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5 A H4 Cas9 cells stably expressing N-terminally (Myc-TMEM41B) or C-terminally Myc-tagged TMEM41B (TMEM41B-Myc) were probed by calnexin (CANX) and Myc tag immunostaining and imaged with an automated CV7000 confocal microscope. Scale bar: 20 μm  B-D Endogenous TMEM41B locus was tagged with C-terminal Myc using CRISPR-directed homologous recombination in HeLa cells. HeLa knock-in (KI) cells were compared to parental HeLa (-) and HeLa cells stably transduced with a TMEM41B-Myc over-expression (OE) construct. (B) Confocal micrographs of cells stained with antibodies against CANX and Myc confirming ER localization of both KI and OE TMEM41B-Myc. Scale bar represents 20 μm μm. (C) Immunoblot analysis confirming expression of both KI and OE TMEM41B-Myc(D) PCR analysis with primers binding to TMEM41B last intron and to Myc tag confirming successful targeting of the endogenous TMEM41B locus with Myc (band labeled with asterisk). M=size marker E H4 Cas9 cells and H4 Cas9 cells stably expressing Myc-TMEM41B or TMEM41B-Myc were lysed and subjected to anti-Myc IP. Eluates were analyzed by mass spectrometry. Enrichment of proteins in IPs from Myc-TMEM41B or TMEM41B-Myc cells versus H4 Cas9 cells is depicted as log2 fold changes. Entire data is reported in Dataset EV2 "}
{"words": ["Figure", "1", "(", "a", ")", "Synchronization", "dynamics", "of", "a", "population", "of", "HeLa", "cells", "within", "almost", "3", "complete", "cell", "cycles", "measured", "via", "PI", "staining", "followed", "by", "FACS", "analysis", ".", "The", "increase", "in", "cell", "number", "following", "each", "mitosis", "is", "shown", "by", "an", "overlaid", "curve", "(", "in", "orange", ";", "mean", "and", "s", ".", "d", ".", "of", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "b", ")", "Computational", "modelling", "of", "the", "synchronization", "loss", ",", "considering", "11", "%", "cell", "-", "cell", "variation", "in", "doubling", "time", ",", "shows", "that", "the", "simulated", "fraction", "of", "the", "cells", "in", "G1", ",", "S", ",", "and", "G2", "/", "M", "in", "the", "synchronized", "cells", "throughout", "the", "cell", "cycle", "(", "straight", "lines", ")", "match", "experimental", "measurements", "(", "marked", "with", "asterisk", ")", ".", "(", "c", ")", "The", "measured", "average", "cell", "volume", "in", "the", "synchronized", "cell", "population", "(", "red", ";", "mean", "and", "s", ".", "d", ".", "of", "n", "=", "3", ";", "in", "Equation", "6", ")", ",", "the", "deconvoluted", "signal", "(", "in", "case", "of", "no", "synchronization", "loss", ";", "green", ";", "in", "Equation", "6", ")", ",", "and", "the", "simulated", "average", "cell", "volume", "considering", "the", "loss", "in", "synchronization", "(", "black", ";", "matching", "the", "measured", "concentration", "data", ";", "Equation", "6", ")", ".", "(", "d", ")", "The", "measured", "concentration", "of", "CTP", "in", "synchronized", "cells", "shown", "in", "red", "(", "mean", "and", "s", ".", "d", ".", "of", "n", "=", "5", ";", ")", "in", "Equation", "7", ";", "the", "deconvoluted", "concentration", "dynamics", ",", "in", "case", "of", "no", "synchronization", "loss", "(", "green", ";", "in", "Equation", "7", ")", ";", "and", "the", "expected", "concentration", "dynamics", "based", "on", "the", "deconvoluted", "concentrations", "and", "considering", "the", "loss", "in", "synchronization", ",", "matching", "the", "measured", "concentrations", "(", "black", ";", "Equation", "7", ")", ".", "The", "measured", "concentrations", "converge", "towards", "the", "steady", "-", "state", "concentrations", "measured", "in", "non", "-", "synchronized", "cells", "(", "horizontal", "blue", "line", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(a) Synchronization dynamics of a population of HeLa cells within almost 3 complete cell cycles measured via PI staining followed by FACS analysis. The increase in cell number following each mitosis is shown by an overlaid curve (in orange; mean and s.d. of n=3).(b) Computational modelling of the synchronization loss, considering 11% cell-cell variation in doubling time, shows that the simulated fraction of the cells in G1, S, and G2/M in the synchronized cells throughout the cell cycle (straight lines) match experimental measurements (marked with asterisk).(c) The measured average cell volume in the synchronized cell population (red; mean and s.d. of n=3; in Equation 6), the deconvoluted signal (in case of no synchronization loss; green; in Equation 6), and the simulated average cell volume considering the loss in synchronization (black; matching the measured concentration data; Equation 6).(d) The measured concentration of CTP in synchronized cells shown in red (mean and s.d. of n=5; ) in Equation 7; the deconvoluted concentration dynamics, in case of no synchronization loss (green; in Equation 7); and the expected concentration dynamics based on the deconvoluted concentrations and considering the loss in synchronization, matching the measured concentrations (black; Equation 7). The measured concentrations converge towards the steady-state concentrations measured in non-synchronized cells (horizontal blue line)."}
{"words": ["Figure", "2Figure", "2", ":", "Oscillation", "in", "metabolite", "concentrations", "throughout", "the", "cell", "cycle", "in", "HeLa", "cells", ".", "The", "figure", "shows", "metabolites", "found", "to", "significantly", "oscillate", "throughout", "the", "cell", "cycle", "(", "concentrations", "normalized", "per", "metabolite", ";", "maximal", "concentration", "in", "red", ";", "minimal", "concentration", "in", "blue", ")", ".", "The", "amplitude", "of", "the", "oscillations", "is", "shown", "on", "the", "right", ".", "Metabolites", "are", "color", "-", "coded", "according", "to", "metabolic", "pathways", ":", "Energy", "/", "redox", "cofactors", "(", "purple", ")", ";", "amino", "acids", "(", "blue", ")", ";", "glycolytic", "metabolites", "(", "red", ")", ";", "TCA", "cycle", "metabolites", "(", "green", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Figure 2: Oscillation in metabolite concentrations throughout the cell cycle in HeLa cells. The figure shows metabolites found to significantly oscillate throughout the cell cycle (concentrations normalized per metabolite; maximal concentration in red; minimal concentration in blue). The amplitude of the oscillations is shown on the right. Metabolites are color-coded according to metabolic pathways: Energy/redox cofactors (purple); amino acids (blue); glycolytic metabolites (red); TCA cycle metabolites (green)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "c", "-", "e", ")", "Measured", "relative", "fraction", "of", "the", "m", "+", "2", "labeling", "of", "TCA", "cycle", "intermediates", "after", "feeding", "[", "U", "-", "13C", "]", "-", "glucose", "(", "red", ";", "mean", "and", "s", ".", "d", ".", "of", "n", "=", "3", ")", ",", "the", "deconvoluted", "signal", "(", "green", ")", ",", "and", "the", "expected", "labeling", "dynamics", "considering", "the", "loss", "in", "synchronization", "(", "black", ";", "representing", "TCA", "cycle", "oxidation", "of", "glucose", "-", "derived", "acetyl", "-", "CoA", ")", ".", "(", "c", "-", "e", ")", "Measured", "relative", "fraction", "of", "the", "m", "+", "2", "labeling", "of", "TCA", "cycle", "intermediates", "after", "feeding", "[", "U", "-", "13C", "]", "-", "glucose", "(", "red", ";", "mean", "and", "s", ".", "d", ".", "of", "n", "=", "3", ")", ",", "the", "deconvoluted", "signal", "(", "green", ")", ",", "and", "the", "expected", "labeling", "dynamics", "considering", "the", "loss", "in", "synchronization", "(", "black", ";", "representing", "TCA", "cycle", "oxidation", "of", "glucose", "-", "derived", "acetyl", "-", "CoA", ")", ".", "(", "c", "-", "e", ")", "Measured", "relative", "fraction", "of", "the", "m", "+", "2", "labeling", "of", "TCA", "cycle", "intermediates", "after", "feeding", "[", "U", "-", "13C", "]", "-", "glucose", "(", "red", ";", "mean", "and", "s", ".", "d", ".", "of", "n", "=", "3", ")", ",", "the", "deconvoluted", "signal", "(", "green", ")", ",", "and", "the", "expected", "labeling", "dynamics", "considering", "the", "loss", "in", "synchronization", "(", "black", ";", "representing", "TCA", "cycle", "oxidation", "of", "glucose", "-", "derived", "acetyl", "-", "CoA", ")", ".", "(", "f", ")", "Oscillations", "in", "citrate", "m", "+", "4", "labeling", "after", "feeding", "[", "U", "-", "13C", "]", "-", "glutamine", "(", "mean", "and", "s", ".", "d", ".", "of", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "g", ")", "Oscillations", "in", "the", "total", "citrate", "concentration", "throughout", "the", "cell", "cycle", "(", "mean", "and", "s", ".", "d", ".", "of", "n", "=", "5", ")", ".", "(", "h", ")", "The", "measured", "lactate", "secretion", "flux", "in", "synchronized", "cells", "shown", "in", "red", "(", "mean", "and", "s", ".", "d", ".", "of", "n", "=", "5", ";", "in", "Equation", "9", ";", ")", ";", "the", "deconvoluted", "secretion", "flux", "dynamics", ",", "in", "case", "of", "no", "synchronization", "loss", "(", "green", ";", "in", "Equation", "10", ")", ";", "and", "the", "expected", "secretion", "flux", "based", "on", "the", "deconvoluted", "fluxes", "and", "considering", "the", "loss", "in", "synchronization", ",", "matching", "the", "measured", "fluxes", "(", "black", ";", "Equation", "10", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(c-e) Measured relative fraction of the m+2 labeling of TCA cycle intermediates after feeding [U-13C]-glucose (red; mean and s.d. of n=3), the deconvoluted signal (green), and the expected labeling dynamics considering the loss in synchronization (black; representing TCA cycle oxidation of glucose-derived acetyl-CoA).(c-e) Measured relative fraction of the m+2 labeling of TCA cycle intermediates after feeding [U-13C]-glucose (red; mean and s.d. of n=3), the deconvoluted signal (green), and the expected labeling dynamics considering the loss in synchronization (black; representing TCA cycle oxidation of glucose-derived acetyl-CoA).(c-e) Measured relative fraction of the m+2 labeling of TCA cycle intermediates after feeding [U-13C]-glucose (red; mean and s.d. of n=3), the deconvoluted signal (green), and the expected labeling dynamics considering the loss in synchronization (black; representing TCA cycle oxidation of glucose-derived acetyl-CoA).(f) Oscillations in citrate m+4 labeling after feeding [U-13C]-glutamine (mean and s.d. of n=3).(g) Oscillations in the total citrate concentration throughout the cell cycle (mean and s.d. of n=5).(h) The measured lactate secretion flux in synchronized cells shown in red (mean and s.d. of n=5; in Equation 9;); the deconvoluted secretion flux dynamics, in case of no synchronization loss (green; in Equation 10); and the expected secretion flux based on the deconvoluted fluxes and considering the loss in synchronization, matching the measured fluxes (black; Equation 10)."}
{"words": ["Figure", "4Oscillations", "in", "aspartate", "(", "a", ")", "concentrations", "throughout", "the", "cell", "cycle", "when", "feeding", "[", "U", "-", "13C", "]", "-", "glutamine", "(", "representing", "oxidative", "TCA", "cycle", "activity", ")", ".", "Oscillations", "in", "malate", "(", "b", ")", "concentrations", "throughout", "the", "cell", "cycle", "when", "feeding", "[", "U", "-", "13C", "]", "-", "glutamine", "(", "representing", "oxidative", "TCA", "cycle", "activity", ")", ".", "(", "c", ")", "Uniform", "malate", "m", "+", "4", "labeling", "throughout", "the", "cell", "cycle", "(", "combined", "with", "the", "increase", "in", "malate", "concentration", "in", "S", "phase", "representing", "increased", "oxidative", "TCA", "cycle", "flux", "in", "S", "phase", ")", ".", "(", "d", ")", "Oscillations", "in", "pyrimidines", "m", "+", "3", "labeling", "throughout", "the", "cell", "cycle", "when", "feeding", "[", "U", "-", "13C", "]", "-", "glutamine", "(", "representing", "de", "novo", "pyrimidine", "biosynthesis", ")", ".", "(", "e", ")", "Oscillations", "in", "lactate", "m", "+", "3", "labeling", "throughout", "the", "cell", "cycle", "when", "feeding", "[", "U", "-", "13C", "]", "-", "glutamine", "(", "representing", "malic", "enzyme", "activity", ")", ".", "(", "f", ")", "Oscillations", "in", "malate", "m", "+", "3", "throughout", "the", "cell", "cycle", "when", "feeding", "[", "U", "-", "13C", "]", "-", "glucose", "(", "representing", "pyruvate", "carboxylase", "activity", ")", ".", "(", "g", ")", "Oscillations", "in", "citrate", "m", "+", "5", "when", "feeding", "[", "U", "-", "13C", "]", "-", "glutamine", "throughout", "the", "cell", "cycle", "(", "representing", "reductive", "IDH", "flux", ")", ".", "(", "h", ")", "Oscillations", "in", "acetyl", "-", "CoA", "m", "+", "2", "when", "feeding", "[", "U", "-", "13C", "]", "-", "glucose", ",", "representing", "oxidative", "glucose", "metabolism", ".", "Oscillations", "in", "acetyl", "-", "CoA", "m", "+", "2", "when", "feeding", "[", "U", "-", "13C", "]", "-", "glutamine", ",", "representing", "reductive", "glutamine", "metabolism", "(", "i", ")", ".", "For", "measurements", "of", "metabolite", "concentrations", "(", "a", "-", "b", ")", ",", "red", "marks", "represent", "mean", "and", "s", ".", "d", ".", "of", "n", "=", "5", ".", "For", "measurements", "of", "fractional", "isotopic", "labeling", "(", "c", "-", "i", ")", ",", "red", "marks", "represent", "mean", "and", "s", ".", "d", ".", "of", "n", "=", "3", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Oscillations in aspartate (a)concentrations throughout the cell cycle when feeding [U-13C]-glutamine (representing oxidative TCA cycle activity).Oscillations in malate (b) concentrations throughout the cell cycle when feeding [U-13C]-glutamine (representing oxidative TCA cycle activity).(c) Uniform malate m+4 labeling throughout the cell cycle (combined with the increase in malate concentration in S phase representing increased oxidative TCA cycle flux in S phase).(d) Oscillations in pyrimidines m+3 labeling throughout the cell cycle when feeding [U-13C]-glutamine (representing de novo pyrimidine biosynthesis).(e) Oscillations in lactate m+3 labeling throughout the cell cycle when feeding [U-13C]-glutamine (representing malic enzyme activity).(f) Oscillations in malate m+3 throughout the cell cycle when feeding [U-13C]-glucose (representing pyruvate carboxylase activity).(g) Oscillations in citrate m+5 when feeding [U-13C]-glutamine throughout the cell cycle (representing reductive IDH flux).(h) Oscillations in acetyl-CoA m+2 when feeding [U-13C]-glucose, representing oxidative glucose metabolism.Oscillations in acetyl-CoA m+2 when feeding [U-13C]-glutamine, representing reductive glutamine metabolism (i). For measurements of metabolite concentrations (a-b), red marks represent mean and s.d. of n=5. For measurements of fractional isotopic labeling (c-i), red marks represent mean and s.d. of n=3."}
{"words": ["Figure", "5Figure", "5", ":", "Complementary", "oscillations", "of", "glucose", "versus", "glutamine", "-", "derived", "fluxes", "in", "TCA", "cycle", ".", "(", "a", "-", "i", ")", "Oscillations", "in", "metabolic", "flux", "throughout", "the", "cell", "cycle", "(", "in", "mM", "/", "h", ")", ",", "computed", "based", "on", "metabolic", "modelling", "of", "measured", "oscillations", "in", "metabolite", "concentrations", "and", "isotopic", "labeling", "(", "red", "and", "green", "marks", "represent", "optimal", "estimates", "of", "transient", "flux", "with", "95", "%", "c", ".", "i", ".", ")", ".", "Blue", "lines", "represent", "average", "fluxes", "inferred", "in", "a", "non", "-", "synchronized", "cell", "population", ".", "As", "shown", ",", "glucose", "-", "derived", "flux", "into", "TCA", "cycle", "peak", "in", "late", "G1", "phase", ",", "while", "oxidative", "and", "reductive", "glutamine", "metabolism", "dominates", "S", "phase", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Figure 5: Complementary oscillations of glucose versus glutamine-derived fluxes in TCA cycle. (a-i) Oscillations in metabolic flux throughout the cell cycle (in mM/h), computed based on metabolic modelling of measured oscillations in metabolite concentrations and isotopic labeling (red and green marks represent optimal estimates of transient flux with 95% c.i.). Blue lines represent average fluxes inferred in a non-synchronized cell population. As shown, glucose-derived flux into TCA cycle peak in late G1 phase, while oxidative and reductive glutamine metabolism dominates S phase."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "a", "-", "b", ")", "One", "hour", "treatment", "of", "synchronized", "cells", "with", "DCA", "inhibits", "the", "oscillations", "in", "citrate", "m", "+", "2", "(", "a", ")", "from", "isotopic", "glucose", "(", "representing", "glycolytic", "flux", "into", "TCA", "cycle", ")", ".", "(", "a", "-", "b", ")", "One", "hour", "treatment", "of", "synchronized", "cells", "with", "DCA", "inhibits", "the", "oscillations", "in", "acetyl", "-", "CoA", "m", "+", "2", "(", "b", ")", "from", "isotopic", "glucose", "(", "representing", "glycolytic", "flux", "into", "TCA", "cycle", ")", ".", "It", "further", "inhibits", "oscillations", "in", "citrate", "m", "+", "5", "/", "m", "+", "4", "ratio", "(", "c", ")", "from", "isotopic", "glutamine", "(", "representing", "oxidative", "versus", "reductive", "TCA", "cycle", "flux", ")", ".", "It", "further", "inhibits", "oscillations", "in", "acetyl", "-", "CoA", "m", "+", "2", "(", "d", ")", "from", "isotopic", "glutamine", "(", "representing", "oxidative", "versus", "reductive", "TCA", "cycle", "flux", ")", ".", "(", "e", ")", "The", "fraction", "of", "cells", "in", "G1", ",", "S", ",", "and", "G2", "/", "M", "phases", "in", "synchronized", "HeLa", "cells", "after", "3", "hour", "treatment", "with", "DCA", "(", "normalized", "by", "measurements", "in", "untreated", "control", "cells", ")", ".", "(", "f", ")", "The", "fraction", "of", "cells", "in", "G1", ",", "S", ",", "and", "G2", "/", "M", "phases", "in", "non", "-", "synchronized", " ", "HeLa", "and", "HCT", "-", "116", "cells", "after", "24", "hour", "treatment", "with", "DCA", "(", "normalized", "by", "measurements", "in", "untreated", "control", "cells", ")", ".", "As", "shown", ",", "DCA", "significantly", "increases", "the", "fraction", "of", "cells", "in", "S", "phase", ",", "inhibiting", "cellular", "progression", "into", "G2", "phase", ";", "showing", "mean", "and", "s", ".", "d", ".", "of", "n", "=", "3", "for", "all", "isotopic", "labeling", "forms", "and", "FACS", "measurements", "(", "a", "-", "f", ")", ".", "Statistical", "significance", "of", "changes", "in", "the", "fraction", "of", "cells", "in", "each", "cell", "cycle", "phase", "following", "DCA", "treatment", "is", "calculated", "based", "on", "two", "-", "tailed", ",", "unequal", "variance", "t", "-", "test", "(", "e", "-", "f", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(a-b) One hour treatment of synchronized cells with DCA inhibits the oscillations in citrate m+2 (a) from isotopic glucose (representing glycolytic flux into TCA cycle).(a-b) One hour treatment of synchronized cells with DCA inhibits the oscillations in acetyl-CoA m+2 (b) from isotopic glucose (representing glycolytic flux into TCA cycle).It further inhibits oscillations in citrate m+5/m+4 ratio (c) from isotopic glutamine (representing oxidative versus reductive TCA cycle flux).It further inhibits oscillations in acetyl-CoA m+2 (d) from isotopic glutamine (representing oxidative versus reductive TCA cycle flux).(e) The fraction of cells in G1, S, and G2/M phases in synchronized HeLa cells after 3 hour treatment with DCA (normalized by measurements in untreated control cells).(f) The fraction of cells in G1, S, and G2/M phases in non-synchronized HeLa and HCT-116 cells after 24 hour treatment with DCA (normalized by measurements in untreated control cells). As shown, DCA significantly increases the fraction of cells in S phase, inhibiting cellular progression into G2 phase; showing mean and s.d. of n=3 for all isotopic labeling forms and FACS measurements (a-f). Statistical significance of changes in the fraction of cells in each cell cycle phase following DCA treatment is calculated based on two-tailed, unequal variance t-test (e-f)."}
{"words": ["Figure", "4B", "-", "D", "BSP", "amyloid", "aggregation", "in", "vitro", "is", "pH", "-", "dependent", "in", "10", "mM", "EDTA", "(", "B", ")", ",", "protein", "concentration", "-", "dependent", "in", "10", "mM", "EDTA", "and", "at", "pH", "4", ".", "5", "(", "C", ")", "and", "strongly", "inhibited", "by", "millimolar", "Ca2", "+", "at", "various", "protein", "concentrations", "(", "D", ")", ".", "E", "-", "H", "TEM", "images", "showing", "fibril", "morphology", "of", "BSP12", "(", "E", ")", ",", "BSP123", "(", "F", ")", ",", "BSP3", "(", "G", ")", ",", "BSP45", "(", "H", ")", ".", "I", "-", "J", "Amyloid", "aggregation", "by", "BSP", "subconstructs", ".", "BSP12", "exhibits", "more", "prominent", "aggregation", "propensity", "than", "BSP3", "and", "BSP45", "in", "10", "mM", "EDTA", "and", "at", "pH", "4", ".", "5", "(", "I", ")", ".", "The", "conjunction", "of", "module", "3", "with", "modules", "1", "and", "2", "promotes", "aggregation", "(", "J", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B-D BSP amyloid aggregation in vitro is pH-dependent in 10 mM EDTA (B), protein concentration-dependent in 10 mM EDTA and at pH 4.5 (C) and strongly inhibited by millimolar Ca2+ at various protein concentrations (D).E-H TEM images showing fibril morphology of BSP12 (E), BSP123 (F), BSP3 (G), BSP45 (H).I-J Amyloid aggregation by BSP subconstructs. BSP12 exhibits more prominent aggregation propensity than BSP3 and BSP45 in 10 mM EDTA and at pH 4.5 (I). The conjunction of module 3 with modules 1 and 2 promotes aggregation (J)."}
{"words": ["Figure", "5B", "Representative", "fluorescence", "microscopy", "images", "of", "BSP", "and", "its", "subconstructs", "(", "20", "μM", ")", "at", "varying", "pHs", ".", "PEG", "8K", "concentration", "is", "2", "%", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "μm", ".", "E", "Quantification", "of", "droplet", "area", "is", "shown", "for", "each", "protein", "under", "various", "Ca2", "+", "concentration", "conditions", ".", "Each", "sample", "is", "quantified", "by", "total", "area", "(", "left", ")", "and", "mean", "area", "(", "right", ")", ".", "Each", "experiment", "was", "repeated", "three", "times", ",", "data", "shown", "as", "mean", "±", "SD", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5B Representative fluorescence microscopy images of BSP and its subconstructs (20 μM) at varying pHs. PEG 8K concentration is 2 %. Scale bar, 20 μm.E Quantification of droplet area is shown for each protein under various Ca2+ concentration conditions. Each sample is quantified by total area (left) and mean area (right). Each experiment was repeated three times, data shown as mean ± SD."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Identified", "acetylated", "histone", "peptides", "plotted", "against", "their", "log2", "SILAC", "ratio", "(", "1h", "after", "16", "J", "/", "m2", "UV", "/", "mock", ")", ",", "ranked", "by", "SILAC", "ratio", "(", "C", ")", "Western", "blot", "of", "acid", "extracted", "histones", "and", "WCE", "from", "HeLa", "cells", ",", "treated", "with", "HATi", "(", "CTK7A", ",", "100", "μM", "and", "CPTH2", ",", "50", "μM", ")", "or", "HDACi", "(", "TSA", ",", "1", "μM", ")", "for", "4h", "or", "mock", "treated", "as", "indicated", "(", "D", ")", "A", "representative", "western", "blot", "of", "histone", " ", "acetylation", "levels", "of", "HeLa", "cells", "lysed", "at", "indicated", "time", "points", "after", "UV", "-", "irradiation", "(", "16", "J", "/", "m2", ")", ".", "Blots", "were", "stained", "with", "α", "-", "acetyl", "-", "lysine", "(", "top", "panels", ",", "high", "and", "low", "exposure", ")", ",", "α", "-", "histone", "H4", "(", "middle", "panel", ")", "and", "α", "-", "tubulin", "(", "bottom", "panel", ")", "(", "F", ")", "Representative", "western", "blots", "of", "HeLa", "WCE", "from", "different", "time", "points", "after", "UV", "-", "C", "irradiation", "(", "16J", "/", "m2", ")", "using", "the", "indicated", "histone", "modification", "specific", "antibodies", ".", "Histone", "H4", "and", "tubulin", "were", "used", "as", "loading"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Identified acetylated histone peptides plotted against their log2 SILAC ratio (1h after 16 J/m2 UV/mock), ranked by SILAC ratio(C) Western blot of acid extracted histones and WCE from HeLa cells, treated with HATi (CTK7A, 100 μM and CPTH2, 50 μM) or HDACi (TSA, 1 μM) for 4h or mock treated as indicated(D) A representative western blot of histone acetylation levels of HeLa cells lysed at indicated time points after UV-irradiation (16 J/m2). Blots were stained with α-acetyl-lysine (top panels, high and low exposure), α-histone H4 (middle panel) and α-tubulin (bottom panel)(F) Representative western blots of HeLa WCE from different time points after UV-C irradiation (16J/m2) using the indicated histone modification specific antibodies. Histone H4 and tubulin were used as loading controls"}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Representative", "western", "blots", "of", "histone", "acetylation", "levels", "of", "HeLa", "cells", "lysed", "at", "indicated", "time", "points", "after", "UV", "irradiation", "(", "16", "J", "/", "m2", ",", "left", "panel", ")", ",", "α", "-", "amanitin", "(", "second", "panel", ",", "100", "µg", "/", "ml", ")", ",", "THZ1", "(", "third", "panel", ",", "1", "μM", ")", "or", "flavopiridol", "(", "right", "panel", ",", "1", "μM", ")", "treatment", ".", "Blots", "were", "stained", "with", "α", "-", "acetyl", "-", "lysine", "(", "top", "panel", ")", ",", "α", "-", "histone", "H4", "(", "middle", "panel", ")", "and", "α", "-", "tubulin", "(", "bottom", "panel", ")", "(", "C", ")", "Representative", "western", "blots", "of", "histone", " ", "acetylation", "levels", "of", "HeLa", "cells", "pre", "-", "treated", "with", "transcription", "inhibitors", "(", "mock", "(", "left", ")", ",", "THZ1", "(", "middle", ",", "1", "μM", ")", "or", "flavopiridol", "(", "right", ",", "1", "μM", ")", "an", "hour", "before", "UV", "irradiation", "and", "lysed", "at", "the", "indicated", "time", "points", "after", "UV", "(", "16J", "/", "m2", ")", ".", "Blots", "were", "stained", "with", "the", "indicated"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Representative western blots of histone acetylation levels of HeLa cells lysed at indicated time points after UV irradiation (16 J/m2, left panel), α-amanitin (second panel, 100 µg/ml), THZ1 (third panel, 1 μM) or flavopiridol (right panel, 1 μM) treatment. Blots were stained with α-acetyl-lysine (top panel), α-histone H4 (middle panel) and α-tubulin (bottom panel)(C) Representative western blots of histone acetylation levels of HeLa cells pre-treated with transcription inhibitors (mock (left), THZ1 (middle, 1 μM) or flavopiridol (right, 1 μM) an hour before UV irradiation and lysed at the indicated time points after UV (16J/m2). Blots were stained with the indicated antibodies"}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Representative", "western", "blots", "of", "histone", "acetylation", "levels", "of", "HeLa", "cells", "obtained", "at", "the", "indicated", "time", "points", "after", "UV", "irradiation", "(", "16", "J", "/", "m2", ")", ",", "HU", "/", "AraC", "treatment", "(", "100", "mM", "/", "10", "μM", ")", "or", "MMC", "treatment", "(", "10", "µg", "/", "ml", ")", ".", "Blots", "were", "stained", "with", "α", "-", "acetyl", "-", "lysine", "(", "top", "panel", ")", ",", "α", "-", "histone", "H4", "(", "middle", "panel", ")", "and", "α", "-", "tubulin", "(", "bottom", "panel", ")", "(", "C", ")", "Representative", "Western", "blots", ",", "stained", "with", "the", "indicated", "antibodies", "of", "HeLa", "cells", "pre", "-", "treated", "o", "/", "n", "with", "an", "S", "-", "phase", "inhibitor", "(", "PHA", "767491", "hydrochloride", ",", "10", "μM", ")", "and", "lysed", "at", "indicated", "time", "points", "after", "UV", "(", "16", "J", "/", "m2", ")"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Representative western blots of histone acetylation levels of HeLa cells obtained at the indicated time points after UV irradiation (16 J/m2), HU/AraC treatment (100 mM/10 μM) or MMC treatment (10 µg/ml). Blots were stained with α-acetyl-lysine (top panel), α-histone H4 (middle panel) and α-tubulin (bottom panel)(C) Representative Western blots, stained with the indicated antibodies of HeLa cells pre-treated o/n with an S-phase inhibitor (PHA 767491 hydrochloride, 10 μM) and lysed at indicated time points after UV (16 J/m2)"}
{"words": ["Figure", "1A", "Treatment", "scheme", "of", "experimental", "timeline", "and", "Immunofluorescence", "staining", "of", "telogen", "backskin", "hair", "follicles", "(", "HF", ")", "for", "Integrin", "α6", "(", "Itgα6", ",", "red", ")", ",", "active", "Caspase", "3", "(", "aCas3", ",", "green", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", "in", "control", "(", "Ctr", ")", "and", "Bcl", "-", "2", "inhibitor", "(", "ABT", "-", "199", ")", "treated", "mice", ".", "B", ":", "bulge", ",", "CH", ":", "club", "hair", ",", "DP", ":", "dermal", "papilla", ",", "HF", ":", "hair", "follicle", ",", "HG", ":", "secondary", "hair", "germ", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "µm", "B", "Quantification", "of", "backskin", "HF", "with", "aCas3", "+", "cells", "in", "bulge", ",", "hair", "germ", "and", "dermal", "papilla", "of", "Ctr", "and", "ABT", "-", "199", "treated", "mice", "(", "n", "=", "4", "mice", "biological", "replicates", ";", "mean", "±", "standard", "deviation", "(", "SD", ")", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "ns", "=", "not", "significant", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", "test", ")", ".", "nd", "=", "not", "detected", ".", "C", ",", "D", "Treatment", "scheme", ",", "FACS", "plot", "(", "C", ")", "and", "quantification", "(", "D", ")", "of", "keratinocytes", "stained", "for", "CD34", "and", "Itgα6", "after", "6", "days", "of", "treatment", "with", "vehicle", "solution", "(", "Ctr", ")", "or", "ABT", "-", "199", "(", "n", "=", "6", "biological", "replicates", ";", "mean", "±", "standard", "deviation", "(", "SD", ")", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "ns", "=", "not", "significant", ",", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "suprabasal", "(", "sbBSC", ",", "CD34", "+", "/", "Itgα6low", ")", ",", "basal", "(", "bBSC", ",", "CD34", "+", "/", "Itgα6high", ")", "BSCs", "and", "n", "-", "B", "(", "non", "-", "bulge", "epidermal", "cells", ")", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A Treatment scheme of experimental timeline and Immunofluorescence staining of telogen backskin hair follicles (HF) for Integrin α6 (Itgα6, red), active Caspase 3 (aCas3, green) and DAPI (blue) in control (Ctr) and Bcl-2 inhibitor (ABT-199) treated mice. B: bulge, CH: club hair, DP: dermal papilla, HF: hair follicle, HG: secondary hair germ. Scale bar, 50 µm B Quantification of backskin HF with aCas3+ cells in bulge, hair germ and dermal papilla of Ctr and ABT-199 treated mice (n=4 mice biological replicates; mean ± standard deviation (SD); *** p<0.001, ns=not significant, two-way ANOVA test). nd=not detected. C,D Treatment scheme, FACS plot (C) and quantification (D) of keratinocytes stained for CD34 and Itgα6 after 6 days of treatment with vehicle solution (Ctr) or ABT-199 (n=6 biological replicates; mean ± standard deviation (SD); ** p<0.01, ns=not significant, two-tailed unpaired Student's t-test). suprabasal (sbBSC, CD34+/Itgα6low), basal (bBSC, CD34+/Itgα6high) BSCs and n-B (non-bulge epidermal cells). ** p<0.005."}
{"words": ["Figure", "2B", "Treatment", "scheme", "of", "experimental", "timeline", "and", "histology", "of", "backskin", "sections", "of", "control", "(", "Ctr", ")", "and", "ABT", "-", "199", "treated", "mice", ".", "Scale", "bar", ",", "200", "µm", ".", "D", "qRT", "-", "PCR", "for", "mRNA", "expression", "of", "the", "transcription", "factors", "Lef1", "and", "Runx1", "in", "epidermis", "of", "ABT", "-", "199", "treated", "and", "control", "(", "Ctr", ")", "mice", "at", "P77", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ";", "mean", "±", "standard", "error", "of", "mean", "(", "SEM", ")", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "ns", "=", "not", "significant", ",", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B Treatment scheme of experimental timeline and histology of backskin sections of control (Ctr) and ABT-199 treated mice. Scale bar, 200 µm.D qRT-PCR for mRNA expression of the transcription factors Lef1 and Runx1 in epidermis of ABT-199 treated and control (Ctr) mice at P77 (n=3 biological replicates; mean ± standard error of mean (SEM); ** p<0.01, ns=not significant, two-tailed unpaired Student's t-test)."}
{"words": ["Figure", "3C", "qRT", "-", "PCR", "for", "mRNA", "expression", "of", "the", "anoikis", "-", "related", "markers", "Bim", "and", "Bmf", "in", "sorted", "n", "-", "B", "(", "non", "-", "bulge", ")", ",", "bBSC", "(", "basal", "BSCs", ")", "and", "sbBSC", "(", "suprabasal", "BSCs", ")", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ";", "mean", "±", "standard", "error", "of", "mean", "(", "SEM", ")", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "ns", "=", "not", "significant", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3C qRT-PCR for mRNA expression of the anoikis-related markers Bim and Bmf in sorted n-B (non-bulge), bBSC (basal BSCs) and sbBSC (suprabasal BSCs) (n=3 biological replicates; mean ± standard error of mean (SEM); * p<0.05, ns=not significant, two-way ANOVA test)."}
{"words": ["Figure", "4C", "FACS", "plot", "and", "quantification", "of", "keratinocytes", "stained", "for", "CD34", "and", "Itgα6", "in", "8", "week", "old", "control", "(", "Ctr", ")", "and", "Bcl", "-", "2EOE", "mice", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ";", "mean", "±", "standard", "deviation", "(", "SD", ")", ";", "ns", "=", "not", "significant", ",", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "suprabasal", "(", "sbBSC", ",", "CD34", "+", "/", "Itgα6low", ")", ",", "basal", "(", "bBSC", ",", "CD34", "+", "/", "Itgα6high", ")", "BSCs", ".", "D", "Immunofluorescence", "staining", "of", "telogen", "backskin", "HF", "for", "BrdU", "incorporation", "(", "1", "h", "pulse", ",", "green", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", "in", "8", "week", "old", "control", "(", "Ctr", ")", "and", "Bcl", "-", "2EOE", "mice", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4C FACS plot and quantification of keratinocytes stained for CD34 and Itgα6 in 8 week old control (Ctr) and Bcl-2EOE mice (n=3 biological replicates; mean ± standard deviation (SD); ns=not significant, two-tailed unpaired Student's t-test). suprabasal (sbBSC, CD34+/Itgα6low), basal (bBSC, CD34+/Itgα6high) BSCs.D Immunofluorescence staining of telogen backskin HF for BrdU incorporation (1 h pulse, green) and DAPI (blue) in 8 week old control (Ctr) and Bcl-2EOE mice. Scale bar, 50 µm."}
{"words": ["Figure", "5A", "Histology", "of", "P19", "catagen", "backskin", "HF", "of", "control", "(", "Ctr", ")", "and", "Bcl", "-", "2EOE", "mice", ".", "RS", ":", "retracting", "strand", ",", "Scale", "bar", ",", "50", "µm", ".", "B", "Analysis", "of", "length", "and", "width", "of", "retracting", "strands", "of", "control", "(", "Ctr", ")", "and", "Bcl", "-", "2EOE", "mice", "(", "n", "=", "4", ";", "multiple", "measurements", "/", "biological", "replicate", ";", "whiskers", ":", "min", "and", "max", ";", "boxes", ":", "median", "±", "first", "and", "third", "quartile", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "C", "Itgα6", "and", "aCas3", "Immunofluorescence", "staining", "of", "catagen", "tailskin", "HF", "of", "control", "(", "Ctr", ")", "and", "Bcl", "-", "2EOE", "mice", "(", "n", "=", "4", "biological", "replicates", ")", ".", "Dashed", "lines", ":", "retracting", "strands", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "µm", ".", "D", "Quantification", "of", "aCas3", "+", "cells", "in", "the", "RS", "of", "P19", "Ctr", "and", "Bcl", "-", "2EOE", "mice", "(", "n", "=", "4", "biological", "replicates", ";", "mean", "±", "standard", "deviation", "(", "SD", ")", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "HF", ":", "hair", "follicle", ".", "F", ",", "G", "qRT", "-", "PCR", "for", "mRNA", "expression", "of", "the", "quiescence", "-", "related", "markers", "Bmp6", "(", "F", ")", "and", "Fgf18", "(", "G", ")", "in", "epidermis", "of", "control", "(", "Ctr", ")", "and", "Bcl", "-", "2EOE", "mice", "(", "P27", ")", ",", "(", "n", "=", "4", "biological", "replicates", ";", "mean", "±", "standard", "error", "of", "mean", "(", "SEM", ")", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A Histology of P19 catagen backskin HF of control (Ctr) and Bcl-2EOE mice. RS: retracting strand, Scale bar, 50 µm. B Analysis of length and width of retracting strands of control (Ctr) and Bcl-2EOE mice (n=4; multiple measurements/biological replicate; whiskers: min and max; boxes: median ± first and third quartile; **** p<0.0001, two-tailed unpaired Student's t-test). C Itgα6 and aCas3 Immunofluorescence staining of catagen tailskin HF of control (Ctr) and Bcl-2EOE mice (n=4 biological replicates). Dashed lines: retracting strands. Scale bar, 100 µm. D Quantification of aCas3+ cells in the RS of P19 Ctr and Bcl-2EOE mice (n=4 biological replicates; mean ± standard deviation (SD); **** p<0.0001, two-tailed unpaired Student's t-test). HF: hair follicle. F,G qRT-PCR for mRNA expression of the quiescence-related markers Bmp6 (F) and Fgf18 (G) in epidermis of control (Ctr) and Bcl-2EOE mice (P27), (n=4 biological replicates; mean ± standard error of mean (SEM); * p<0.05, *** p<0.001, two-tailed unpaired Student's t-test)."}
{"words": ["Figure", "6B", "Immunofluorescence", "staining", "of", "epidermal", "tail", "whole", "mounts", "of", "control", "(", "Ctr", ")", ",", "K15ΔNLef1", "and", "K15ΔNLef1", ";", "Bcl", "-", "2EOE", "mice", ",", "stained", "for", "keratin", "15", "(", "Krt15", ",", "green", ")", ",", "activated", "Caspase", "3", "(", "aCas3", ",", "red", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Note", "increased", "number", "of", "aCas", "+", "cells", "in", "the", "bulge", "of", "K15ΔNLef1", "mice", "(", "arrows", ")", ".", "B", ":", "bulge", ",", "HG", ":", "secondary", "hair", "germ", ",", "SG", ":", "sebaceous", "gland", ".", "Scale", "bar", ",", "100µm", ".", "D", "Immunofluorescence", "staining", "of", "epidermal", "tail", "whole", "mounts", "of", "control", "(", "Ctr", ")", ",", "K15ΔNLef1", "and", "K15ΔNLef1", ";", "Bcl", "-", "2EOE", "mice", ",", "stained", "for", "keratin", "15", "(", "Krt15", ",", "green", ")", ",", "BrdU", "(", "1", "h", "pulse", ",", "red", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Note", "increased", "number", "of", "BrdU", "+", "cells", "in", "the", "bulge", "of", "K15ΔNLef1", "mice", "(", "arrows", ")", ".", "B", ":", "bulge", ",", "HG", ":", "secondary", "hair", "germ", ",", "SG", ":", "sebaceous", "gland", ".", "Scale", "bar", ","], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6B Immunofluorescence staining of epidermal tail whole mounts of control (Ctr), K15ΔNLef1 and K15ΔNLef1;Bcl-2EOE mice, stained for keratin 15 (Krt15, green), activated Caspase 3 (aCas3, red) and DAPI (blue). Note increased number of aCas+ cells in the bulge of K15ΔNLef1 mice (arrows). B: bulge, HG: secondary hair germ, SG: sebaceous gland. Scale bar, 100µm.D Immunofluorescence staining of epidermal tail whole mounts of control (Ctr), K15ΔNLef1 and K15ΔNLef1;Bcl-2EOE mice, stained for keratin 15 (Krt15, green), BrdU (1 h pulse, red) and DAPI (blue). Note increased number of BrdU+ cells in the bulge of K15ΔNLef1 mice (arrows). B: bulge, HG: secondary hair germ, SG: sebaceous gland. Scale bar, 100µm"}
{"words": ["Figure", "7B", ",", "C", "Tumour", "incidence", "(", "B", ")", "and", "frequency", "(", "C", ")", "in", "Ctr", ",", "Bcl", "-", "2EOE", ",", "K15ΔNLef1", "and", "K15ΔNLef1", ";", "Bcl", "-", "2EOE", "mice", "(", "n", "=", "10", "biological", "replicates", ";", "mean", "±", "standard", "error", "of", "mean", "(", "SEM", ")", ")", ".", "D", "Histology", "of", "sebaceous", "tumours", "of", "K15ΔNLef1", "and", "K15ΔNLef1", ";", "Bcl", "-", "2EOE", "mice", ".", "Scale", "bar", ",", "100µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7B,C Tumour incidence (B) and frequency (C) in Ctr, Bcl-2EOE, K15ΔNLef1 and K15ΔNLef1;Bcl-2EOE mice (n=10 biological replicates; mean ± standard error of mean (SEM)).D Histology of sebaceous tumours of K15ΔNLef1 and K15ΔNLef1;Bcl-2EOE mice. Scale bar, 100µm."}
{"words": ["Figure", "1", "A", ")", "Hek293T", "cells", "expressing", "Lamplight", "-", "1D4", "(", "anti", "-", "1D4", "=", "green", ",", "DAPI", "=", "blue", ",", "Top", ")", "and", "schematic", "of", "BRET", "assay", ",", "measuring", "interaction", "of", "liberated", "Gβγ", "-", "Venus", "with", "GRK3", "fragment", "-", "Nanoluciferase", "(", "Bottom", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "20µm", ".", "B", ")", "Lamplight", "-", "driven", "response", "to", "increasing", "intensity", "1s", "405nm", "light", "C", ")", "405nm", "irradiance", "response", "curve", "D", ")", "Response", "to", "1s", "405nm", "(", "blue", "line", ")", "and", "525nm", "light", "(", "green", "line", ")", "E", ")", "Response", "to", "405nm", "(", "blue", "line", ")", "followed", "by", "525nm", "light", "of", "different", "intensities", "(", "green", "line", ")", "G", ")", "Response", "to", "405nm", "alone", "or", "with", "525nm", "light", "H", "-", "I", ")", "Representative", "time", "courses", "of", "Lamplight", "-", "driven", "responses", "to", "8s", "mixed", "stimuli", "(", "grey", "bar", ")", "with", "different", "405nm", ":", "525nm", "ratios", "from", "1", "(", "100", "%", "405nm", ")", "to", "0", "(", "100", "%", "525nm", ")", "from", "(", "H", ")", "dark", "or", "(", "I", ")", "after", "8s", "405nm", "light", "(", "blue", "bar", ")", "J", ")", "Sustained", "Lamplight", "-", "driven", "activity", "(", "mean", "BRET", "ratio", "20", "-", "80s", "after", "stimulus", ")", "after", "exposure", "to", "mixed", "stimuli", "from", "dark", "(", "ON", ")", "or", "405nm", "light", "-", "adapted", "state", "(", "OFF", ")", ".", "Lamplight", "data", "fit", "with", "linear", "trendline", ".", "Best", "fitting", "parameters", "for", "ON", ",", "slope", "=", "0", ".", "311", ",", "Y", "-", "intercept", "=", "0", ".", "04", ",", "R2", "=", "0", ".", "85", ".", "For", "OFF", ",", "slope", "=", "0", ".", "30", ",", "Y", "-", "intercept", "=", "0", ".", "07", ",", "R2", "=", "0", ".", "69", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1 A) Hek293T cells expressing Lamplight-1D4 (anti-1D4 = green, DAPI = blue, Top) and schematic of BRET assay, measuring interaction of liberated Gβγ-Venus with GRK3 fragment-Nanoluciferase (Bottom). Scale bar = 20µm. B) Lamplight-driven response to increasing intensity 1s 405nm light C) 405nm irradiance response curve D) Response to 1s 405nm (blue line) and 525nm light (green line) E) Response to 405nm (blue line) followed by 525nm light of different intensities (green line) G) Response to 405nm alone or with 525nm light  H-I) Representative time courses of Lamplight-driven responses to 8s mixed stimuli (grey bar) with different 405nm: 525nm ratios from 1 (100% 405nm) to 0 (100% 525nm) from (H) dark or (I) after 8s 405nm light (blue bar) J) Sustained Lamplight-driven activity (mean BRET ratio 20-80s after stimulus) after exposure to mixed stimuli from dark (ON) or 405nm light-adapted state (OFF). Lamplight data fit with linear trendline. Best fitting parameters for ON, slope = 0.311, Y-intercept = 0.04, R2 = 0.85. For OFF, slope = 0.30, Y-intercept = 0.07, R2 = 0.69). "}
{"words": ["Figure", "2", "B", ")", "Representative", "trace", "of", "hyperpolarisation", "to", "405nm", "light", "in", "a", "Lamplight", "-", "expressing", "SCN", "neuron", "C", ")", "Hyperpolarisation", "to", "405nm", "was", "observed", "over", "a", "range", "of", "intensities", ".", "Recordings", "from", "3", "different", "cells", "across", "2", "SCN", "slices", "D", ")", "Representative", "trace", "showing", "hyperpolarisation", "was", "sustained", "during", "dark", "after", "405nm", "light", "(", "5s", ")", "and", "reversed", "by", "525nm", "light", "(", "15s", ")", "E", ")", "Hyperpolarisation", "and", "depolarisation", "of", "a", "Lamplight", "-", "expressing", "neuron", "by", "405nm", "and", "525nm", "light", ",", "respectively", ",", "across", "multiple", "stimulus", "presentations", "F", ")", "Three", "example", "traces", "from", "a", "single", "cell", "exposed", "to", "405nm", "followed", "by", "525nm", "light", ".", "Individual", "traces", "were", "fit", "with", "exponential", "decay", "(", "405nm", ",", "blue", ")", "or", "association", "curves", "(", "525nm", ",", "green", ")", "for", "6", "trials", "across", "2", "cells", "G", ",", "H", ")", "Parameters", "from", "best", "-", "fit", "curves", "used", "to", "calculate", "(", "G", ")", "latency", "(", "ms", ")", "and", "(", "H", ")", "half", "-", "life", "(", "ms", ")", ".", "I", ")", "Simultaneous", "525nm", "and", "405nm", "light", "prevents", "spike", "silencing", "J", ")", "Constant", "405nm", "light", "(", "12", ".", "9", "log", "photons", ")", "presented", "with", "525nm", "light", "of", "decreasing", "intensity", "from", "14", ".", "9", "-", "12", ".", "9log", "photons", "in", "6", "steps", "of", "10s", "(", "left", ")", "or", "20s", "(", "right", ")", ".", "525nm", "light", "antagonised", "the", "405nm", "-", "driven", "hyperpolarisation", "for", "all", "intensities", "except", "12", ".", "9log", "photons"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2 B) Representative trace of hyperpolarisation to 405nm light in a Lamplight-expressing SCN neuron C) Hyperpolarisation to 405nm was observed over a range of intensities. Recordings from 3 different cells across 2 SCN slices  D) Representative trace showing hyperpolarisation was sustained during dark after 405nm light (5s) and reversed by 525nm light (15s)  E) Hyperpolarisation and depolarisation of a Lamplight-expressing neuron by 405nm and 525nm light, respectively, across multiple stimulus presentations  F) Three example traces from a single cell exposed to 405nm followed by 525nm light. Individual traces were fit with exponential decay (405nm, blue) or association curves (525nm, green) for 6 trials across 2 cells G, H) Parameters from best-fit curves used to calculate (G) latency (ms) and (H) half-life (ms). I) Simultaneous 525nm and 405nm light prevents spike silencing J) Constant 405nm light (12.9 log photons) presented with 525nm light of decreasing intensity from 14.9 - 12.9log photons in 6 steps of 10s (left) or 20s (right). 525nm light antagonised the 405nm-driven hyperpolarisation for all intensities except 12.9log photons "}
{"words": ["Figure", "3", "A", ")", "L7Cre", "rd1", "retina", "expressing", "Lamplight", "-", "T2A", "-", "mCherry", "AAV", ".", "Anti", "-", "mCherry", "staining", "(", "white", ")", "was", "widespread", "(", "Left", ",", "scale", "bar", "=", "500µm", ")", ".", "Fluorescent", "cell", "bodies", "found", "in", "different", "focal", "planes", "consistent", "with", "expression", "in", "ganglion", "(", "Top", "Right", ",", "scale", "bar", "=", "50µm", ")", "and", "bipolar", "cells", "(", "Bottom", "Right", ",", "scale", "bar", "=", "50µm", ")", ".", "B", ")", "Representative", "single", "unit", "showing", "characteristic", "ipRGC", "response", ".", "C", ")", "Three", "Lamplight", "response", "categories", "-", "transient", "excitation", "(", "N", "=", "35", "biological", "replicates", ")", ",", "transient", "inhibition", "(", "N", "=", "6", "biological", "replicates", ")", ",", "and", "sustained", "inhibition", "(", "N", "=", "8", "biological", "replicates", ")", ".", "Left", "panel", "shows", "representative", "single", "unit", "response", "to", "2s", "405nm", "or", "525nm", "light", ".", "Mean", "baseline", "normalised", "firing", "(", "grey", "shading", "shows", "SEM", ")", "is", "shown", "in", "centre", "left", "(", "for", "entire", "recording", ",", "500ms", "bins", ")", ",", "centre", "right", "and", "far", "right", "panels", "(", "during", "405nm", "and", "525nm", "stimuli", ",", "respectively", "100ms", "bins", ",", "N", "as", "above", ",", "except", "N", "=", "5", "biological", "replicates", "for", "sustained", "response", "to", "525nm", ")", ".", "D", ")", "Representative", "single", "unit", "showing", "light", "responses", "over", "20", "stimulus", "repeats", ".", "E", ")", "Distribution", "of", "response", "latencies", "for", "3", "Lamplight", "-", "driven", "responses", "to", "405nm", ",", "as", "well", "as", "reversal", "caused", "by", "525nm", "in", "sustained", "inhibition", "units", ".", "Two", "outliers", "with", "slow", "latency", "(", ">", "2", ".", "5s", ")", "in", "transient", "excitation", "group", "are", "likely", "responding", "to", "stimulus", "offset", "(", "N", "=", "35", "for", "Transient", "Excitation", ",", "N", "=", "6", "for", "Transient", "Inhibition", ",", "N", "=", "7", "for", "Sustained", "Inhibition", "and", "N", "=", "5", "for", "Sustained", "Excitation", ",", "all", "biological", "replicates", ")", ".", "F", ")", "Inhibition", "responses", "were", "smaller", "and", "less", "sustained", "for", "mixed", "stimuli", "(", "50", "%", "405nm", ",", "50", "%", "525nm", ")", "compared", "to", "405nm", "only", "(", "N", "=", "14", "biological", "replicates", ")", ".", "G", ")", "Excitation", "responses", "were", "attenuated", "for", "mixed", "stimuli", "compared", "to", "405nm", "only", ".", "Left", "panel", "shows", "representative", "retinal", "single", "unit", "(", "N", "=", "35", "biological", "replicates", ")", ".", "Data", "information", ":", "For", "(", "F", "-", "G", ")", "Left", "panel", "shows", "representative", "single", "unit", ".", "Right", "panel", "shows", "distribution", "of", "difference", "in", "firing", "rate", "for", "405nm", "vs", "mixed", "stimulus", ".", "All", "representative", "single", "units", "show", "perievent", "rasters", "(", "first", "trial", "at", "top", ")", "and", "firing", "rate", "histograms", "(", "Bin", "size", "=", "500ms", ")", ".", "Timing", "of", "light", "stimuli", "shown", "by", "shaded", "vertical", "bars", ".", "All", "light", "stimuli", "are", "16", "log", "total", "Lamplight", "effective", "photons", "/", "cm2", "/", "s", ".", "Error", "bars", "show", "SEM", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "One", "-", "sample", "t", "-", "test", "compared", "to", "zero", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3 A) L7Cre rd1 retina expressing Lamplight-T2A-mCherry AAV. Anti-mCherry staining (white) was widespread (Left, scale bar = 500µm). Fluorescent cell bodies found in different focal planes consistent with expression in ganglion (Top Right, scale bar = 50µm) and bipolar cells (Bottom Right, scale bar = 50µm). B) Representative single unit showing characteristic ipRGC response. C) Three Lamplight response categories - transient excitation (N = 35 biological replicates), transient inhibition (N = 6 biological replicates), and sustained inhibition (N = 8 biological replicates). Left panel shows representative single unit response to 2s 405nm or 525nm light. Mean baseline normalised firing (grey shading shows SEM) is shown in centre left (for entire recording, 500ms bins), centre right and far right panels (during 405nm and 525nm stimuli, respectively 100ms bins, N as above, except N = 5 biological replicates for sustained response to 525nm).D) Representative single unit showing light responses over 20 stimulus repeats. E) Distribution of response latencies for 3 Lamplight-driven responses to 405nm, as well as reversal caused by 525nm in sustained inhibition units. Two outliers with slow latency (>2.5s) in transient excitation group are likely responding to stimulus offset (N = 35 for Transient Excitation, N = 6 for Transient Inhibition, N = 7 for Sustained Inhibition and N = 5 for Sustained Excitation, all biological replicates).  F) Inhibition responses were smaller and less sustained for mixed stimuli (50% 405nm, 50% 525nm) compared to 405nm only (N = 14 biological replicates). G) Excitation responses were attenuated for mixed stimuli compared to 405nm only. Left panel shows representative retinal single unit (N = 35 biological replicates). Data information: For (F-G) Left panel shows representative single unit. Right panel shows distribution of difference in firing rate for 405nm vs mixed stimulus. All representative single units show perievent rasters (first trial at top) and firing rate histograms (Bin size = 500ms). Timing of light stimuli shown by shaded vertical bars. All light stimuli are 16 log total Lamplight effective photons/cm2/s. Error bars show SEM. * p<0.05, *** p < 0.001 (One-sample t-test compared to zero). "}
{"words": ["Figure", "1", "(", "E", "-", "G", ")", "Primary", "cortical", "neurons", "from", "E15", "cerebral", "cortices", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "plasmids", ",", "incubated", "for", "two", "days", "in", "vitro", "and", "treated", "with", "Tf", "-", "555", "for", "30", "minutes", "before", "fixation", ".", "Cells", "were", "immunostained", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "The", "images", "are", "obtained", "with", "high", "-", "resolution", "microscopy", "(", "Nikon", ")", ".", "Blue", "alone", "channels", "are", "shown", "in", "black", "and", "white", "images", ".", "Lower", "panels", "in", "(", "E", ")", "and", "(", "F", ")", "are", "high", "magnification", "images", "indicated", "by", "white", "or", "blue", "rectangles", "in", "upper", "panels", ".", "The", "graph", "in", "(", "G", ")", "shows", "the", "Pearson", "'", "s", "correlation", "coefficient", "of", "Tf", "-", "555", "and", "Rab11", "or", "APPL1", ".", "Each", "score", "represents", "the", "mean", "with", "the", "individual", "points", ".", "Control", ":", "n", "=", "23", "cells", ",", "Rab21", "-", "sh115", ":", "n", "=", "18", "cells", ",", "Rab5", "-", "sh232", "(", "Tf", "-", "Rab11", ")", ":", "n", "=", "23", "cells", ",", "Rab5", "-", "sh232", "(", "Tf", "-", "APPL1", ")", ":", "n", "=", "22", "cells", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(E-G) Primary cortical neurons from E15 cerebral cortices were transfected with the indicated plasmids, incubated for two days in vitro and treated with Tf-555 for 30 minutes before fixation. Cells were immunostained with the indicated antibodies. The images are obtained with high-resolution microscopy (Nikon). Blue alone channels are shown in black and white images. Lower panels in (E) and (F) are high magnification images indicated by white or blue rectangles in upper panels. The graph in (G) shows the Pearson's correlation coefficient of Tf-555 and Rab11 or APPL1. Each score represents the mean with the individual points. Control: n = 23 cells, Rab21-sh115: n = 18 cells, Rab5-sh232 (Tf - Rab11): n = 23 cells, Rab5-sh232 (Tf - APPL1): n = 22 cells."}
{"words": ["Figure", "2Cerebral", "cortices", "at", "E17", ",", "electroporated", "with", "the", "indicated", "plasmids", "plus", "pCAG", "-", "EGFP", "at", "E14", ".", "(", "C", ")", "The", "ratio", "of", "locomoting", "neurons", "with", "more", "than", "three", "primary", "neurites", "in", "the", "IZ", ".", "Each", "score", "represents", "the", "mean", "with", "the", "individual", "points", ".", "Control", ":", "n", "=", "4", "brains", "(", "60", "cells", ")", ",", "Rab21", "-", "sh115", ":", "n", "=", "3", "brains", "(", "65", "cells", ")", ",", "Rab5", "-", "sh232", ":", "n", "=", "4", "brains", "(", "111", "cells", ")", ".", "(", "E", ")", "Time", "-", "lapse", "imaging", "of", "control", "and", "Rab21", "-", "sh115", "-", "electroporated", "cells", "in", "cortical", "slices", "from", "E16", "cerebral", "cortices", ",", "electroporated", "with", "the", "indicated", "plasmids", "at", "E14", ".", "After", "formation", "of", "the", "leading", "process", ",", "control", "neurons", "rapidly", "eliminated", "their", "immature", "neurites", "(", "yellow", "arrows", ")", ",", "whereas", "the", "Rab21", "-", "knockdown", "neurons", "retained", "the", "immature", "neurites", "(", "white", "arrows", ")", "for", "long", "periods", ".", "Time", "interval", "of", "each", "frame", "is", "30", "min", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Cerebral cortices at E17, electroporated with the indicated plasmids plus pCAG-EGFP at E14. (C) The ratio of locomoting neurons with more than three primary neurites in the IZ. Each score represents the mean with the individual points. Control: n = 4 brains (60 cells), Rab21-sh115: n = 3 brains (65 cells), Rab5-sh232: n = 4 brains (111 cells).(E) Time-lapse imaging of control and Rab21-sh115-electroporated cells in cortical slices from E16 cerebral cortices, electroporated with the indicated plasmids at E14. After formation of the leading process, control neurons rapidly eliminated their immature neurites (yellow arrows), whereas the Rab21-knockdown neurons retained the immature neurites (white arrows) for long periods. Time interval of each frame is 30 min."}
{"words": ["Figure", "3Primary", "cortical", "neurons", "from", "E15", "cerebral", "cortices", "were", "transfected", "with", "pCAG", "-", "PM", "-", "mAG1", "(", "green", ")", "and", "incubated", "for", "two", "days", "in", "vitro", ".", "Cells", "were", "immunostained", "with", "the", "indicated", "antibodies", "(", "red", "and", "blue", "/", "white", ")", ".", "The", "transfected", "PM", "-", "mAG1", "is", "a", "marker", "for", "the", "plasma", "membrane", ".", "The", "images", "are", "obtained", "with", "high", "-", "resolution", "microscopy", "(", "Nikon", ")", "and", "the", "lower", "panels", "are", "high", "magnification", "images", "near", "the", "plasma", "membrane", ".", "Blue", "alone", "channels", "are", "shown", "in", "black", "and", "white", "images", ".", "Each", "score", "represents", "the", "mean", "of", "ratios", "with", "the", "individual", "points", ".", "Rab5", ":", "n", "=", "18", "cells", "(", "middle", "and", "right", ")", ",", "Rab21", ":", "n", "=", "31", "cells", "(", "left", "and", "middle", ")", "or", "20", "cells", "(", "right", ")", ",", "Caveolin", "-", "1", ":", "n", "=", "43", "cells", "(", "left", ")", ".", "(", "H", "-", "I", ")", "HeLa", "cells", "were", "immunostained", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "The", "images", "are", "obtained", "with", "high", "-", "resolution", "microscopy", "(", "Nikon", ")", ".", "The", "graph", "in", "(", "I", ")", "shows", "the", "Pearson", "'", "s", "correlation", "coefficient", "between", "caveolin", "-", "1", "and", "Rab5", "or", "Rab21", ".", "Each", "score", "represents", "the", "mean", "of", "ratios", "with", "the", "individual", "points", ".", "Rab5", ":", "n", "=", "80", "cells", ",", "Rab21", ":", "n", "=", "62", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Primary cortical neurons from E15 cerebral cortices were transfected with pCAG-PM-mAG1 (green) and incubated for two days in vitro. Cells were immunostained with the indicated antibodies (red and blue/white). The transfected PM-mAG1 is a marker for the plasma membrane. The images are obtained with high-resolution microscopy (Nikon) and the lower panels are high magnification images near the plasma membrane. Blue alone channels are shown in black and white images. Each score represents the mean of ratios with the individual points. Rab5: n = 18 cells (middle and right), Rab21: n = 31 cells (left and middle) or 20 cells (right), Caveolin-1: n = 43 cells (left).(H-I) HeLa cells were immunostained with the indicated antibodies. The images are obtained with high-resolution microscopy (Nikon). The graph in (I) shows the Pearson's correlation coefficient between caveolin-1 and Rab5 or Rab21. Each score represents the mean of ratios with the individual points. Rab5: n = 80 cells, Rab21: n = 62 cells."}
{"words": ["Figure", "4Primary", "cortical", "neurons", "from", "E15", "cerebral", "cortices", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "plasmids", "plus", "pCAG", "-", "EGFP", ",", "incubated", "for", "two", "days", "in", "vitro", "and", "treated", "with", "BODIPY", "-", "LacCer", "(", "LacCer", ")", "(", "green", ")", "(", "A", "-", "B", ")", "for", "30", "minutes", "before", "fixation", ".", "White", "arrows", "in", "(", "A", ")", "indicate", "the", "perinuclear", "accumulation", "of", "LacCer", ".", "Blue", "alone", "channels", "are", "shown", "in", "black", "and", "white", "images", ".", "The", "graphs", "in", "(", "B", ")", "show", "the", "ratio", "of", "cells", "with", "perinuclear", "accumulation", "of", "LacCer", "(", "B", ")", "which", "was", "quantified", "in", "a", "blinded", "counting", ".", "Each", "score", "represents", "the", "mean", "with", "the", "individual", "points", ".", "B", ":", "n", "=", "5", "biological", "replicates", "(", "Control", ":", "115", "cells", ",", "Cav1", "-", "sh490", ":", "127", "cells", ",", "Rab21", "-", "sh115", ":", "136", "cells", ",", "Rab5", "-", "sh232", ":", "216", "cells", ",", "Rab21", "-", "sh115", "+", "wt", "-", "Rab21", ":", "132", "cells", ")"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Primary cortical neurons from E15 cerebral cortices were transfected with the indicated plasmids plus pCAG-EGFP , incubated for two days in vitro and treated with BODIPY-LacCer (LacCer) (green) (A-B) for 30 minutes before fixation. White arrows in (A) indicate the perinuclear accumulation of LacCer. Blue alone channels are shown in black and white images. The graphs in (B) show the ratio of cells with perinuclear accumulation of LacCer (B) which was quantified in a blinded counting. Each score represents the mean with the individual points. B: n = 5 biological replicates (Control: 115 cells, Cav1-sh490: 127 cells, Rab21-sh115: 136 cells, Rab5-sh232: 216 cells, Rab21-sh115 + wt-Rab21: 132 cells)"}
{"words": ["Figure", "5Primary", "cortical", "neurons", "from", "E15", "cerebral", "cortices", "were", "transfected", "with", "pCAG", "-", "PM", "-", "mAG1", ",", "incubated", "for", "two", "days", "in", "vitro", "and", "stained", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Blue", "alone", "channels", "are", "shown", "in", "black", "and", "white", "images", ".", "Arrowheads", "indicate", "accumulation", "of", "N", "-", "cadherin", "at", "the", "plasma", "membrane", ".", "Lower", "panels", "in", "(", "D", ")", "are", "high", "magnification", "images", "indicated", "by", "white", "or", "blue", "rectangles", ".", "The", "images", "are", "obtained", "with", "high", "-", "resolution", "microscopy", "(", "Nikon", ")", ".", "Immature", "neurons", "in", "the", "IZ", "of", "the", "cerebral", "cortices", "at", "E17", ",", "electroporated", "with", "the", "indicated", "plasmids", "plus", "pCAG", "-", "PM", "-", "mAG1", "and", "pCAG", "-", "HA", "-", "N", "-", "cadherin", "at", "E14", ".", "Frozen", "sections", "were", "immunostained", "with", "anti", "-", "mAG1", "and", "anti", "-", "HA", "antibodies", ".", "Arrow", "and", "arrowheads", "indicate", "the", "accumulation", "of", "HA", "-", "N", "-", "cadherin", "at", "the", "perinuclear", "regions", "or", "the", "plasma", "membrane", ",", "respectively", ".", "Control", ":", "n", "=", "77", "cells", "from", "3", "biological", "replicates", ",", "Rab21", "-", "sh115", ":", "n", "=", "108", "cells", "from", "3", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Primary cortical neurons from E15 cerebral cortices were transfected with pCAG-PM-mAG1, incubated for two days in vitro and stained with the indicated antibodies. Blue alone channels are shown in black and white images. Arrowheads indicate accumulation of N-cadherin at the plasma membrane. Lower panels in (D) are high magnification images indicated by white or blue rectangles. The images are obtained with high-resolution microscopy (Nikon).Immature neurons in the IZ of the cerebral cortices at E17, electroporated with the indicated plasmids plus pCAG-PM-mAG1 and pCAG-HA-N-cadherin at E14. Frozen sections were immunostained with anti-mAG1 and anti-HA antibodies. Arrow and arrowheads indicate the accumulation of HA-N-cadherin at the perinuclear regions or the plasma membrane, respectively. Control: n = 77 cells from 3 biological replicates, Rab21-sh115: n = 108 cells from 3 biological replicates."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", "-", "B", ")", "Primary", "cortical", "neurons", "from", "E15", "cerebral", "cortices", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "plasmids", "plus", "pCAG", "-", "PM", "-", "mAG1", "(", "green", ")", "and", "incubated", "for", "two", "days", "in", "vitro", ".", "Immunocytochemical", "analyses", "with", "anti", "-", "caveolin", "-", "1", "(", "red", ")", "antibody", "were", "performed", ".", "The", "images", "are", "obtained", "with", "high", "-", "resolution", "microscopy", "(", "Nikon", ")", ".", "The", "graph", "in", "(", "B", ")", "indicates", "the", "ratio", "of", "the", "caveolin", "-", "1", "staining", "signals", "in", "the", "plasma", "membrane", "to", "total", "fluorescence", "intensities", "of", "caveolin", "-", "1", "in", "each", "immature", "neuron", ".", "Each", "score", "represents", "the", "mean", "of", "ratios", "with", "the", "individual", "points", ".", "Control", ":", "n", "=", "20", "cells", ",", "Rab21", "-", "sh115", ":", "n", "=", "22", "cells", ",", "Rab21", "-", "sh115", "+", "wt", "-", "Rab21", ":", "n", "=", "23", "cells", ".", "Overexpression", "of", "wt", "-", "Rab21", "resulted", "in", "neuronal", "cell", "death", ",", "which", "making", "it", "difficult", "to", "determine", "the", "accurate", "DNA", "concentration", "of", "wt", "-", "Rab21", "in", "the", "rescue", "experiments", ".", "(", "H", "-", "I", ")", "Primary", "cortical", "neurons", "from", "E15", "cerebral", "cortices", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "plasmids", ",", "incubated", "for", "two", "days", "in", "vitro", ",", "treated", "with", "Bafilomycin", "A1", "(", "Baf", "A1", ")", "for", "6", "h", "and", "stained", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "The", "images", "are", "obtained", "with", "high", "-", "resolution", "microscopy", "(", "Nikon", ")", "and", "the", "lower", "panels", "are", "high", "magnification", "images", "of", "the", "lysosomes", ",", "indicated", "by", "white", "or", "blue", "rectangles", ".", "Blue", "alone", "channels", "are", "shown", "in", "black", "and", "white", "images", ".", "The", "graph", "in", "(", "I", ")", "shows", "the", "Pearson", "'", "s", "correlation", "coefficient", "between", "caveolin", "-", "1", "and", "Lamp1", ",", "a", "lysosomal", "marker", ",", "in", "control", "and", "Rab21", "-", "sh115", "-", "transfected", "neurons", ".", "Each", "score", "represents", "the", "mean", "of", "ratios", "with", "the", "individual", "points", ".", "Control", ":", "n", "=", "31", "cells", ",", "Rab21", "-", "sh115", ":", "n", "=", "22", "cells", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A-B) Primary cortical neurons from E15 cerebral cortices were transfected with the indicated plasmids plus pCAG-PM-mAG1 (green) and incubated for two days in vitro. Immunocytochemical analyses with anti-caveolin-1 (red) antibody were performed. The images are obtained with high-resolution microscopy (Nikon). The graph in (B) indicates the ratio of the caveolin-1 staining signals in the plasma membrane to total fluorescence intensities of caveolin-1 in each immature neuron. Each score represents the mean of ratios with the individual points. Control: n = 20 cells, Rab21-sh115: n = 22 cells, Rab21-sh115 + wt-Rab21: n = 23 cells. Overexpression of wt-Rab21 resulted in neuronal cell death, which making it difficult to determine the accurate DNA concentration of wt-Rab21 in the rescue experiments.(H-I) Primary cortical neurons from E15 cerebral cortices were transfected with the indicated plasmids, incubated for two days in vitro, treated with Bafilomycin A1 (Baf A1) for 6 h and stained with the indicated antibodies. The images are obtained with high-resolution microscopy (Nikon) and the lower panels are high magnification images of the lysosomes, indicated by white or blue rectangles. Blue alone channels are shown in black and white images. The graph in (I) shows the Pearson's correlation coefficient between caveolin-1 and Lamp1, a lysosomal marker, in control and Rab21-sh115-transfected neurons. Each score represents the mean of ratios with the individual points. Control: n = 31 cells, Rab21-sh115: n = 22 cells."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Locomoting", "neurons", "in", "the", "upper", "IZ", "of", "the", "cerebral", "cortices", "at", "E17", ",", "electroporated", "with", "the", "indicated", "plasmids", "plus", "pCAG", "-", "EGFP", "at", "E14", ".", "(", "B", ")", "The", "ratio", "of", "locomoting", "neurons", "with", "more", "than", "three", "primary", "neurites", ".", "Each", "score", "represents", "the", "mean", "of", "ratios", "with", "the", "individual", "points", ".", "Control", ":", "n", "=", "4", "brains", ",", "Rab21", "-", "sh115", ":", "n", "=", "5", "brains", ",", "Rab21", "-", "sh115", "+", "Caveolin", "-", "1", ":", "n", "=", "6", "brains", ".", "(", "C", ")", "The", "box", "-", "and", "-", "whisker", "plot", "shows", "average", "leading", "process", "length", "of", "the", "locomoting", "neurons", "in", "the", "IZ", ".", "Control", ":", "n", "=", "115", "cells", ",", "Rab21", "-", "sh115", ":", "n", "=", "188", "cells", ",", "Rab21", "-", "sh115", "+", "Caveolin", "-", "1", ":", "n", "=", "185", "cells", ".", "(", "(", "D", "-", "E", ")", "Cerebral", "cortices", "at", "P0", ",", "electroporated", "with", "the", "indicated", "plasmids", "plus", "pCAG", "-", "EGFP", "at", "E14", ".", "The", "lower", "graphs", "in", "(", "D", ")", "and", "the", "graph", "in", "(", "E", ")", "show", "the", "estimation", "of", "cell", "migration", ",", "as", "measured", "by", "EGFP", "fluorescence", "intensities", "in", "distinct", "regions", "of", "the", "cerebral", "cortices", "using", "Leica", "SP5", "software", ".", "Each", "bar", "in", "the", "graph", "in", "(", "E", ")", "represents", "the", "mean", "percentage", "of", "relative", "intensities", ".", "Rab21", "-", "sh115", ":", "n", "=", "4", "brains", ",", "Rab21", "-", "sh115", "+", "CAG", "-", "wt", "-", "caveolin", "-", "1", ":", "n", "=", "6", "brains", ".", "II", "-", "IV", ":", "layers", "II", "-", "IV", "of", "the", "cortical", "plate", ",", "V", "-", "VI", ":", "layers", "V", "-", "VI", "of", "the", "cortical", "plate", ",", "IZ", ":", "intermediate", "zone", ",", "WM", ":", "white", "matter", ",", "SVZ", "/", "VZ", ":", "subventricular", "zone", "/", "ventricular", "zone", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Locomoting neurons in the upper IZ of the cerebral cortices at E17, electroporated with the indicated plasmids plus pCAG-EGFP at E14. (B) The ratio of locomoting neurons with more than three primary neurites. Each score represents the mean of ratios with the individual points. Control: n = 4 brains, Rab21-sh115: n = 5 brains, Rab21-sh115+Caveolin-1: n = 6 brains. (C) The box-and-whisker plot shows average leading process length of the locomoting neurons in the IZ. Control: n = 115 cells, Rab21-sh115: n = 188 cells, Rab21-sh115+Caveolin-1: n = 185 cells. ((D-E) Cerebral cortices at P0, electroporated with the indicated plasmids plus pCAG-EGFP at E14. The lower graphs in (D) and the graph in (E) show the estimation of cell migration, as measured by EGFP fluorescence intensities in distinct regions of the cerebral cortices using Leica SP5 software. Each bar in the graph in (E) represents the mean percentage of relative intensities. Rab21-sh115: n = 4 brains, Rab21-sh115+CAG-wt-caveolin-1: n = 6 brains. II-IV: layers II-IV of the cortical plate, V-VI: layers V-VI of the cortical plate, IZ: intermediate zone, WM: white matter, SVZ/VZ: subventricular zone/ventricular zone."}
{"words": ["Figure", "1B", ".", "Analyses", "of", "Hog1", "phosphorylation", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "phospho", "-", "p38", "(", "Hog1", "-", "P", ")", "and", "anti", "-", "Hog1", "(", "total", "Hog1", ")", "antibodies", ".", "Cells", "of", "the", "indicated", "genotypes", "were", "stimulated", "with", "the", "indicated", "concentrations", "of", "NaCl", "for", "the", "indicated", "time", ".", "Strains", "used", "are", "TM257", ",", "KT207", "and", "KY594", "-", "1", ".", "C", ".", "Analyses", "of", "Hog1", "phosphorylation", "by", "Phos", "-", "tag", "band", "-", "shift", "assay", ".", "Yeast", "strain", "KY594", "-", "1", "was", "stimulated", "with", "the", "indicated", "concentrations", "of", "NaCl", "for", "5", "min", ".", "The", "percentages", "of", "phosphorylated", "Hog1", "[", "Hog1", "-", "P", "(", "%", ")", "]", "were", "calculated", "as", "explained", "in", "Materials", "and", "Methods", ",", "and", "are", "shown", "beneath", "the", "panel", ".", "Data", "information", ":", "Representative", "results", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "D", ".", "Analyses", "of", "Hog1", "phosphorylation", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "phospho", "-", "p38", "(", "Hog1", "-", "P", ")", "and", "anti", "-", "Hog1", "(", "total", "Hog1", ")", "antibodies", ".", "Yeast", "strain", "KT219", "was", "transformed", "with", "the", "indicated", "STE11", "mutant", "gene", "carried", "by", "a", "single", "-", "copy", "plasmid", "that", "is", "expressed", "from", "the", "STE11", "promoter", ":", "vec", ",", "vector", ";", "WT", ",", "wild", "-", "type", ";", "DDD", ",", "S281D", "/", "S285D", "/", "T286D", ".", "Cells", "were", "incubated", "with", "(", "+", ")", "or", "without", "(", "-", ")", "1", "M", "NaCl", "for", "5", "min", ".", "E", "-", "H", ".", "Analyses", "of", "Hog1", "phosphorylation", "by", "Phos", "-", "tag", "band", "-", "shift", "assay", ".", "Yeast", "strains", "(", "E", ")", "KY603", "-", "3", ";", "(", "F", ")", "TM142", ";", "(", "G", ")", "TM257", ";", "and", "(", "H", ")", "FP54", "were", "stimulated", "with", "the", "indicated", "concentrations", "of", "NaCl", "for", "5", "min", ".", "Data", "information", ":", "Representative", "results", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "I", ".", "Comparison", "of", "the", "NaCl", "dose", "-", "responses", "of", "Hog1", "activation", "by", "various", "strains", ".", "Phos", "-", "tag", "band", "-", "shift", "assays", "were", "independently", "repeated", "three", "times", ",", "and", "average", "values", "were", "plotted", ".", "Data", "information", ":", "(", "I", ")", "Error", "bars", "are", "SEM", "(", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B. Analyses of Hog1 phosphorylation by immunoblotting with anti-phospho-p38 (Hog1-P) and anti-Hog1 (total Hog1) antibodies. Cells of the indicated genotypes were stimulated with the indicated concentrations of NaCl for the indicated time. Strains used are TM257, KT207 and KY594-1.C. Analyses of Hog1 phosphorylation by Phos-tag band-shift assay. Yeast strain KY594-1 was stimulated with the indicated concentrations of NaCl for 5 min. The percentages of phosphorylated Hog1 [Hog1-P (%)] were calculated as explained in Materials and Methods, and are shown beneath the panel. Data information: Representative results from three independent experiments.D. Analyses of Hog1 phosphorylation by immunoblotting with anti-phospho-p38 (Hog1-P) and anti-Hog1 (total Hog1) antibodies. Yeast strain KT219 was transformed with the indicated STE11 mutant gene carried by a single-copy plasmid that is expressed from the STE11 promoter: vec, vector; WT, wild-type; DDD, S281D/S285D/T286D. Cells were incubated with (+) or without (-) 1 M NaCl for 5 min.E-H. Analyses of Hog1 phosphorylation by Phos-tag band-shift assay. Yeast strains (E) KY603-3; (F) TM142; (G) TM257; and (H) FP54 were stimulated with the indicated concentrations of NaCl for 5 min. Data information: Representative results from three independent experiments.I. Comparison of the NaCl dose-responses of Hog1 activation by various strains. Phos-tag band-shift assays were independently repeated three times, and average values were plotted. Data information: (I) Error bars are SEM (n=3)."}
{"words": ["Figure", "2A", "-", "C", ".", "Immunoblot", "analyses", "of", "Hog1", "phosphorylation", ".", "Yeast", "strains", "(", "A", ")", "KT235", ";", "(", "B", ")", "KT209", ";", "and", "(", "C", ")", "KT234", "were", "stimulated", "with", "the", "indicated", "concentrations", "of", "NaCl", "for", "10", "min", ",", "and", "phosphorylated", "Hog1", "(", "Hog1", "-", "P", ")", "and", "total", "Hog1", "in", "cell", "lysates", "were", "detected", "by", "immunoblotting", ".", "The", "relevant", "genotypes", "of", "the", "strains", "are", "indicated", "in", "the", "top", "row", "of", "each", "panel", ",", "and", "are", "schematically", "shown", "in", "the", "diagrams", "at", "left", ".", "The", "second", "row", "from", "the", "top", "indicates", "the", "genes", "carried", "by", "a", "single", "-", "copy", "plasmid", "that", "are", "expressed", "from", "their", "own", "promoters", ".", "vec", ",", "vector", ";", "WT", ",", "wild", "-", "type", ".", "D", ".", "Phos", "-", "tag", "band", "-", "shift", "analyses", "of", "Hog1", "phosphorylation", ".", "The", "yeast", "strain", "KT234", "carrying", "the", "single", "-", "copy", "expression", "plasmid", "YCplac22I", "'", "-", "Pbs2", "S514D", "/", "T518D", "was", "stimulated", "with", "the", "indicated", "concentrations", "of", "NaCl", "for", "5", "min", ".", "E", ".", "Comparison", "of", "the", "NaCl", "dose", "-", "responses", "of", "Hog1", "activation", "by", "constitutively", "-", "active", "Ste11", "-", "Q301P", "and", "constitutively", "-", "active", "Pbs2", "-", "DD", ".", "Phos", "-", "tag", "band", "-", "shift", "assays", "were", "independently", "repeated", "three", "times", ",", "and", "the", "average", "values", "were", "plotted", ".", "Data", "information", ":", "(", "E", ")", "Error", "bars", "are", "SEM", "(", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A-C. Immunoblot analyses of Hog1 phosphorylation. Yeast strains (A) KT235; (B) KT209; and (C) KT234 were stimulated with the indicated concentrations of NaCl for 10 min, and phosphorylated Hog1 (Hog1-P) and total Hog1 in cell lysates were detected by immunoblotting. The relevant genotypes of the strains are indicated in the top row of each panel, and are schematically shown in the diagrams at left. The second row from the top indicates the genes carried by a single-copy plasmid that are expressed from their own promoters. vec, vector; WT, wild-type.D. Phos-tag band-shift analyses of Hog1 phosphorylation. The yeast strain KT234 carrying the single-copy expression plasmid YCplac22I'-Pbs2 S514D/T518D was stimulated with the indicated concentrations of NaCl for 5 min.E. Comparison of the NaCl dose-responses of Hog1 activation by constitutively-active Ste11-Q301P and constitutively-active Pbs2-DD. Phos-tag band-shift assays were independently repeated three times, and the average values were plotted. Data information: (E) Error bars are SEM (n=3)."}
{"words": ["Figure", "3C", ".", "Immunoblot", "analyses", "of", "Hog1", "phosphorylation", ".", "The", "yeast", "strain", "KT235", "was", "transformed", "with", "pRS416", "-", "FLAG", "-", "Hog1", "(", "WT", ")", "or", "its", "indicated", "deletion", "derivatives", ".", "FLAG", "-", "Hog1", "was", "immunoprecipitated", "(", "IP", ")", ",", "and", "immunoblotted", "(", "IB", ")", "with", "anti", "-", "phospho", "-", "p38", "(", "for", "Hog1", "-", "P", ";", "upper", "panel", ")", "or", "anti", "-", "FLAG", "(", "for", "total", "FLAG", "-", "Hog1", ";", "lower", "panel", ")", "D", "-", "G", ".", "Phos", "-", "tag", "band", "-", "shift", "assay", "of", "Hog1", "phosphorylation", ".", "Yeast", "strain", "(", "D", "-", "E", ")", "KT235", "or", "(", "F", "-", "G", ")", "KT290", "carrying", "the", "single", "-", "copy", "expression", "plasmid", "YCplac22I", "'", "-", "Pbs2", "S514D", "/", "T518D", "was", "transformed", "with", "either", "pRS416", "-", "Hog1", "(", "WT", ")", "or", "its", "indicated", "mutant", "derivatives", ",", "and", "was", "treated", "with", "the", "indicated", "concentrations", "of", "NaCl", "for", "5", "min", ".", "(", "D", ")", "and", "(", "F", ")", "show", "typical", "results", ",", "and", "(", "E", ")", "and", "(", "G", ")", "summarizes", "the", "averages", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "(", "E", ",", "G", "Error", "bars", "are", "SEM", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "H", ".", "Phos", "-", "tag", "band", "-", "shift", "assay", "of", "Hog1", "phosphorylation", ".", "The", "yeast", "strain", "FP4", "was", "transformed", "with", "the", "single", "-", "copy", "expression", "plasmid", "pRS416", "-", "Hog1", "(", "WT", ")", "or", "pRS416", "-", "Hog1", "-", "ΔL16", ",", "and", "was", "treated", "with", "the", "indicated", "concentrations", "of", "NaCl", "for", "5", "min", ".", "The", "averages", "of", "three", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "Data", "information", ":", "Error", "bars", "are", "SEM", "(", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3C. Immunoblot analyses of Hog1 phosphorylation. The yeast strain KT235 was transformed with pRS416-FLAG-Hog1 (WT) or its indicated deletion derivatives. FLAG-Hog1 was immunoprecipitated (IP), and immunoblotted (IB) with anti-phospho-p38 (for Hog1-P; upper panel) or anti-FLAG (for total FLAG-Hog1; lower panel)D-G. Phos-tag band-shift assay of Hog1 phosphorylation. Yeast strain (D-E) KT235 or (F-G) KT290 carrying the single-copy expression plasmid YCplac22I'-Pbs2 S514D/T518D was transformed with either pRS416-Hog1 (WT) or its indicated mutant derivatives, and was treated with the indicated concentrations of NaCl for 5 min. (D) and (F) show typical results, and (E) and (G) summarizes the averages of three independent experiments. Data information: (E, G Error bars are SEM (n=3).H. Phos-tag band-shift assay of Hog1 phosphorylation. The yeast strain FP4 was transformed with the single-copy expression plasmid pRS416-Hog1 (WT) or pRS416-Hog1-ΔL16, and was treated with the indicated concentrations of NaCl for 5 min. The averages of three independent experiments are shown. Data information: Error bars are SEM (n=3)."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "Phos", "-", "tag", "band", "-", "shift", "analyses", "of", "osmostress", "-", "induced", "Hog1", "phosphorylation", ".", "The", "yeast", "strain", "FP4", "(", "hog1Δ", ")", "was", "transformed", "with", "the", "single", "-", "copy", "expression", "plasmid", "pRS416", "-", "Hog1", "-", "ΔL16", ",", "and", "was", "stimulated", "with", "the", "indicated", "concentrations", "of", "NaCl", "for", "5", "min", ".", "B", ".", "Averages", "of", "three", "independent", "experiments", "from", "A", "were", "plotted", ".", "Results", "for", "Hog1", "-", "WT", "(", "from", "Fig", "1I", ")", "are", "included", "for", "comparison", ".", "Data", "information", ":", "Representative", "results", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "are", "SEM", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "C", "-", "D", ".", "the", "yeast", "strain", "KT259", "(", "ste11Δ", "hog1Δ", ")", "was", "used", ".", "Data", "information", ":", "Representative", "results", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "are", "SEM", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "E", "-", "F", ".", "the", "yeast", "strain", "KY523", "(", "ssk2", "/", "22Δ", "hog1Δ", ")", "was", "used", ".", "Data", "information", ":", "Representative", "results", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "are", "SEM", "(", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. Phos-tag band-shift analyses of osmostress-induced Hog1 phosphorylation. The yeast strain FP4 (hog1Δ) was transformed with the single-copy expression plasmid pRS416-Hog1-ΔL16, and was stimulated with the indicated concentrations of NaCl for 5 min. B. Averages of three independent experiments from A were plotted. Results for Hog1-WT (from Fig 1I) are included for comparison. Data information: Representative results from three independent experiments. Error bars are SEM (n=3).C-D. the yeast strain KT259 (ste11Δ hog1Δ) was used. Data information: Representative results from three independent experiments. Error bars are SEM (n=3).E-F. the yeast strain KY523 (ssk2/22Δ hog1Δ) was used. Data information: Representative results from three independent experiments. Error bars are SEM (n=3)."}
{"words": ["Figure", "5Detection", "of", "Pbs2", "phosphorylation", "at", "S514", "The", "yeast", "strains", "KT003", "(", "pbs2Δ", ")", ",", "KT005", "(", "ste11Δ", "pbs2Δ", ")", ",", "TM280", "(", "ssk2", "/", "22Δ", "pbs2Δ", ")", "and", "KT043", "(", "ste11Δ", "ssk2", "/", "22Δ", "pbs2Δ", ")", "were", "transformed", "with", "YCplac22I", "'", "-", "Pbs2", "-", "HA", ",", "and", "were", "treated", "with", "the", "indicated", "concentrations", "of", "NaCl", "for", "5", "min", ".", "Pbs2", "-", "HA", "was", "immunoprecipitated", "from", "cell", "extract", ",", "and", "phosphorylated", "Pbs2", "was", "analyzed", "by", "(", "A", ")", "Phos", "-", "tag", "band", "-", "shift", "assay", "In", "(", "A", ")", ",", "the", "positions", "of", "Pbs2", "-", "HA", "phosphorylated", "(", "S514", "-", "P", ")", "and", "unphosphorylated", "(", "S514", "-", "OH", ")", "at", "S514", "are", "indicated", ".", "Detection", "of", "Pbs2", "phosphorylation", "at", "T518", ".", "The", "yeast", "strains", "KT003", "(", "pbs2Δ", ")", ",", "KT005", "(", "ste11Δ", "pbs2Δ", ")", ",", "TM280", "(", "ssk2", "/", "22Δ", "pbs2Δ", ")", "and", "KT043", "(", "ste11Δ", "ssk2", "/", "22Δ", "pbs2Δ", ")", "were", "transformed", "with", "YCplac22I", "'", "-", "Pbs2", "-", "HA", ",", "and", "were", "treated", "with", "the", "indicated", "concentrations", "of", "NaCl", "for", "5", "min", ".", "Pbs2", "-", "HA", "was", "immunoprecipitated", "from", "cell", "extract", ",", "and", "phosphorylated", "Pbs2", "was", "analyzed", "by", "(", "B", ")", "anti", "-", "phospho", "-", "T518", "immunoblotting", ".", "C", "-", "F", ".", "NaCl", "dose", "-", "response", "analyses", "of", "Pbs2", "phosphorylation", ".", "(", "C", "-", "D", ")", "KT005", "(", "ste11Δ", "pbs2Δ", ")", "and", "(", "E", "-", "F", ")", "TM280", "(", "ssk2", "/", "22Δ", "pbs2Δ", ")", "were", "transformed", "with", "YCplac22I", "'", "-", "Pbs2", "-", "HA", ",", "and", "were", "treated", "with", "the", "indicated", "concentrations", "of", "NaCl", "for", "5", "min", ".", "(", "C", "and", "E", ")", "S514", "phosphorylation", "was", "analyzed", "using", "the", "Phos", "-", "tag", "band", "-", "shift", "assay", ".", "PC", ";", "Positive", "Control", ".", "(", "D", "and", "F", ")", "T518", "phosphorylation", "was", "analyzed", "using", "anti", "-", "phospho", "-", "T518", "immunoblotting", ".", "G", "-", "H", ".", "Average", "values", "of", "three", "independent", "experiments", "from", "(", "C", "-", "D", ")", "and", "(", "E", "-", "F", ")", ",", "respectively", ",", "were", "plotted", ".", "AU", ",", "arbitrary", "unit", ".", "Data", "information", ":", "(", "C", "-", "F", ")", "Representative", "results", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "G", "-", "H", ")", "Error", "bars", "are", "SEM", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "I", ".", "Detection", "of", "di", "-", "phosphorylated", "Pbs2", ".", "KT005", "(", "ste11Δ", "pbs2Δ", ")", "transformed", "with", "YCplac22I", "'", "-", "Pbs2", "-", "HA", "was", "treated", "with", "the", "indicated", "concentrations", "of", "NaCl", "for", "5", "min", ".", "Pbs2", "-", "HA", "was", "immunoprecipitated", "from", "cell", "extracts", ",", "and", "subjected", "to", "Phos", "-", "tag", "SDS", "-", "PAGE", ".", "Blots", "of", "these", "gels", "were", "probed", "with", "(", "upper", "panel", ")", "anti", "-", "phospho", "-", "T518", "or", "(", "lower", "panel", ")", "anti", "-", "HA", ".", "J", ".", "Same", "as", "in", "(", "I", ")", ",", "except", "that", "the", "yeast", "strain", "KT003", "(", "pbs2Δ", ")", "was", "used", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Detection of Pbs2 phosphorylation at S514 The yeast strains KT003 (pbs2Δ), KT005 (ste11Δ pbs2Δ), TM280 (ssk2/22Δ pbs2Δ) and KT043 (ste11Δ ssk2/22Δ pbs2Δ) were transformed with YCplac22I'-Pbs2-HA, and were treated with the indicated concentrations of NaCl for 5 min. Pbs2-HA was immunoprecipitated from cell extract, and phosphorylated Pbs2 was analyzed by (A) Phos-tag band-shift assay In (A), the positions of Pbs2-HA phosphorylated (S514-P) and unphosphorylated (S514-OH) at S514 are indicated.Detection of Pbs2 phosphorylation at T518. The yeast strains KT003 (pbs2Δ), KT005 (ste11Δ pbs2Δ), TM280 (ssk2/22Δ pbs2Δ) and KT043 (ste11Δ ssk2/22Δ pbs2Δ) were transformed with YCplac22I'-Pbs2-HA, and were treated with the indicated concentrations of NaCl for 5 min. Pbs2-HA was immunoprecipitated from cell extract, and phosphorylated Pbs2 was analyzed by (B) anti-phospho-T518 immunoblotting.C-F. NaCl dose-response analyses of Pbs2 phosphorylation. (C-D) KT005 (ste11Δ pbs2Δ) and (E-F) TM280 (ssk2/22Δ pbs2Δ) were transformed with YCplac22I'-Pbs2-HA, and were treated with the indicated concentrations of NaCl for 5 min. (C and E) S514 phosphorylation was analyzed using the Phos-tag band-shift assay. PC; Positive Control. (D and F) T518 phosphorylation was analyzed using anti-phospho-T518 immunoblotting. G-H. Average values of three independent experiments from (C-D) and (E-F), respectively, were plotted. AU, arbitrary unit. Data information: (C-F) Representative results from three independent experiments. (G-H) Error bars are SEM (n=3).I. Detection of di-phosphorylated Pbs2. KT005 (ste11Δ pbs2Δ) transformed with YCplac22I'-Pbs2-HA was treated with the indicated concentrations of NaCl for 5 min. Pbs2-HA was immunoprecipitated from cell extracts, and subjected to Phos-tag SDS-PAGE. Blots of these gels were probed with (upper panel) anti-phospho-T518 or (lower panel) anti-HA. J. Same as in (I), except that the yeast strain KT003 (pbs2Δ) was used. "}
{"words": ["Figure", "6B", ".", "Phos", "-", "tag", "band", "-", "shift", "analyses", "of", "osmostress", "-", "induced", "Hog1", "phosphorylation", ".", "KT005", "(", "ste11Δ", "pbs2Δ", ")", "was", "transformed", "with", "YCplac22I", "'", "-", "Pbs2", "-", "HA", "(", "WT", ")", "or", "its", "indicated", "mutant", "derivatives", ".", "Cells", "were", "stimulated", "with", "(", "+", ")", "or", "without", "(", "-", ")", "0", ".", "6", "M", "NaCl", "for", "5", "min", ".", "C", "-", "F", ".", "Phos", "-", "tag", "band", "-", "shift", "analyses", "of", "Hog1", "phosphorylation", ".", "KT291", "(", "ste11Δ", "pbs2Δ", "hog1Δ", ")", "was", "transformed", "with", "(", "C", "and", "D", ")", "pRS416", "-", "Hog1", "or", "(", "E", "and", "F", ")", "pRS416", "-", "Hog1", "-", "ΔL16", ",", "together", "with", "(", "C", "and", "E", ")", "YCplac22I", "'", "-", "Pbs2", "-", "S514A", "-", "HA", "or", "(", "D", "and", "F", ")", "YCplac22I", "'", "-", "Pbs2", "-", "T518A", "-", "HA", ".", "Cells", "were", "stimulated", "with", "the", "indicated", "concentrations", "of", "NaCl", "for", "5", "min", ".", "G", "-", "H", ".", "Average", "values", "of", "three", "independent", "experiments", "from", "(", "C", "and", "E", ")", "and", "(", "D", "and", "F", ")", ",", "respectively", ",", "are", "plotted", ".", "Data", "information", ":", "(", "C", "-", "F", ")", "Representative", "results", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "G", "-", "H", ")", "Error", "bars", "are", "SEM", "(", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6B. Phos-tag band-shift analyses of osmostress-induced Hog1 phosphorylation. KT005 (ste11Δ pbs2Δ) was transformed with YCplac22I'-Pbs2 -HA (WT) or its indicated mutant derivatives. Cells were stimulated with (+) or without (-) 0.6 M NaCl for 5 min.C-F. Phos-tag band-shift analyses of Hog1 phosphorylation. KT291 (ste11Δ pbs2Δ hog1Δ) was transformed with (C and D) pRS416-Hog1 or (E and F) pRS416-Hog1-ΔL16, together with (C and E) YCplac22I'-Pbs2-S514A-HA or (D and F) YCplac22I'-Pbs2-T518A-HA. Cells were stimulated with the indicated concentrations of NaCl for 5 min. G-H. Average values of three independent experiments from (C and E) and (D and F), respectively, are plotted. Data information: (C-F) Representative results from three independent experiments. (G-H) Error bars are SEM (n=3)."}
{"words": ["Figure", "7A", "Phos", "-", "tag", "band", "-", "shift", "assay", "of", "Hog1", "phosphorylation", ".", "KT235", "(", "ΔS", "/", "O", "/", "H", "/", "M", "ssk2", "/", "22Δ", "hog1Δ", "STE11", "-", "Q301P", ")", "was", "transformed", "with", "pRS416", "-", "Hog1", "(", "WT", ")", "or", "its", "indicated", "mutant", "derivatives", ".", "Cell", "extracts", "were", "prepared", "from", "fresh", "cultures", "without", "applying", "osmostress", ".", "For", "each", "HOG1", "mutant", "plasmid", ",", "three", "independent", "cultures", "were", "assayed", ".", "Data", "information", ":", "Error", "bars", "are", "SEM", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "B", ".", "the", "yeast", "strains", "KT260", "(", "ssk2", "/", "22Δ", "ste11Δ", "hog1Δ", ")", ",", "KT235", "(", "ΔS", "/", "O", "/", "H", "/", "M", "ssk2", "/", "22Δ", "hog1Δ", "STE11", "-", "Q301P", ")", ",", "and", "KT248", "(", "ΔS", "/", "O", "/", "H", "/", "M", "ssk2", "/", "22Δ", "hog1Δ", "pbs2Δ", ")", "carrying", "YCplac22I", "'", "-", "Pbs2", "-", "DD", ",", "were", "used", ".", "Data", "information", ":", "Error", "bars", "are", "SEM", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "C", ".", "KT250", "(", "ΔS", "/", "O", "/", "H", "/", "M", "ssk2", "/", "22Δ", "hog1Δ", "STE11", "-", "WT", ")", "and", "KT235", "(", "ΔS", "/", "O", "/", "H", "/", "M", "ssk2", "/", "22Δ", "hog1Δ", "STE11", "-", "Q301P", ")", "were", "transformed", "with", "pRS416", "-", "Hog1", "(", "WT", ")", "or", "pRS416", "-", "Hog1", "-", "N149H", "D162G", "(", "N149H", "D162G", ")", "together", "with", "pRS414", "-", "8xCRE", "-", "lacZ", ".", "Expression", "of", "the", "Hog1", "reporter", "gene", "8xCRE", "-", "lacZ", "in", "the", "absence", "of", "osmostress", "was", "assayed", ".", "Data", "information", ":", "(", "C", ")", "Error", "bars", "are", "SEM", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "D", ".", "KT248", "(", "ΔS", "/", "O", "/", "H", "/", "M", "ssk2", "/", "22Δ", "hog1Δ", "pbs2Δ", ")", "was", "transformed", "with", "pRS416", "-", "Hog1", "(", "WT", ")", "or", "its", "indicated", "mutant", "derivatives", "together", "with", "pRS414", "-", "8xCRE", "-", "lacZ", ".", "Expression", "of", "the", "Hog1", "reporter", "gene", "8xCRE", "-", "lacZ", "in", "the", "absence", "of", "osmostress", "was", "assayed", ".", "Data", "information", ":", "Error", "bars", "are", "SEM", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "E", "-", "F", ".", "Phos", "-", "tag", "band", "-", "shift", "assay", "of", "Hog1", "phosphorylation", ".", "Yeast", "strains", "of", "the", "indicated", "genotypes", "(", "shown", "below", "the", "graph", ")", "were", "transformed", "with", "pRS416", "-", "Hog1", "(", "WT", ")", "or", "its", "indicated", "mutant", "derivatives", "(", "shown", "inside", "the", "graph", ")", ".", "Strain", "used", ":", "(", "E", ")", "FP4", ",", "KT259", ",", "KT260", ",", "KT292", ",", "and", "KY523", ";", "and", "(", "F", ")", "KY523", ",", "KT293", ",", "KT294", ",", "and", "KT295", ".", "N", "/", "H", ",", "N149H", ";", "D", "/", "G", ",", "D162G", ".", "Data", "information", ":", "Error", "bars", "are", "SEM", "(", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A Phos-tag band-shift assay of Hog1 phosphorylation. KT235 (ΔS/O/H/M ssk2/22Δ hog1Δ STE11-Q301P) was transformed with pRS416-Hog1 (WT) or its indicated mutant derivatives. Cell extracts were prepared from fresh cultures without applying osmostress. For each HOG1 mutant plasmid, three independent cultures were assayed. Data information: Error bars are SEM (n=3).B. the yeast strains KT260 (ssk2/22Δ ste11Δ hog1Δ), KT235 (ΔS/O/H/M ssk2/22Δ hog1Δ STE11-Q301P), and KT248 (ΔS/O/H/M ssk2/22Δ hog1Δ pbs2Δ) carrying YCplac22I'-Pbs2-DD, were used. Data information: Error bars are SEM (n=3).C. KT250 (ΔS/O/H/M ssk2/22Δ hog1Δ STE11-WT) and KT235 (ΔS/O/H/M ssk2/22Δ hog1Δ STE11-Q301P) were transformed with pRS416-Hog1 (WT) or pRS416-Hog1-N149H D162G (N149H D162G) together with pRS414-8xCRE-lacZ. Expression of the Hog1 reporter gene 8xCRE-lacZ in the absence of osmostress was assayed. Data information: (C) Error bars are SEM (n=4).D. KT248 (ΔS/O/H/M ssk2/22Δ hog1Δ pbs2Δ) was transformed with pRS416-Hog1 (WT) or its indicated mutant derivatives together with pRS414-8xCRE-lacZ. Expression of the Hog1 reporter gene 8xCRE-lacZ in the absence of osmostress was assayed. Data information: Error bars are SEM (n=3).E-F. Phos-tag band-shift assay of Hog1 phosphorylation. Yeast strains of the indicated genotypes (shown below the graph) were transformed with pRS416-Hog1 (WT) or its indicated mutant derivatives (shown inside the graph). Strain used: (E) FP4, KT259, KT260, KT292, and KY523; and (F) KY523, KT293, KT294, and KT295. N/H, N149H; D/G, D162G. Data information: Error bars are SEM (n=3)."}
{"words": ["Figure", "8A", ".", "KT299", "(", "MATa", "hkr1Δ", "msb2Δ", "ssk2", "/", "22Δ", ")", "was", "exposed", "to", "the", "indicated", "concentrations", "of", "α", "-", "factor", "for", "15", "min", "in", "the", "absence", "of", "osmostress", ".", "Phosphorylation", "of", "Fus3", "and", "Kss1", "was", "detected", "by", "immunoblotting", ".", "B", ".", "KT299", "(", "MATa", "ssk2", "/", "22Δ", "hkr1Δ", "msb2Δ", ")", "was", "exposed", "to", "the", "indicated", "concentrations", "of", "α", "-", "factor", "for", "15", "min", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "0", ".", "8", "M", "NaCl", ",", "and", "Hog1", "phosphorylation", "was", "determined", "using", "the", "Phos", "-", "tag", "band", "-", "shift", "assay", ".", "Data", "information", ":", "(", "B", ")", "Representative", "results", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "C", ".", "Average", "values", "of", "four", "independent", "experiments", "were", "plotted", ".", "Data", "information", ":", "Error", "bars", "are", "SEM", "(", "C", ")", "n", "=", "4D", ".", "HM06", "-", "1", "(", "MATa", "ΔS", "/", "O", "/", "H", "/", "M", "ssk2", "/", "22Δ", ")", "was", "exposed", "to", "the", "indicated", "concentrations", "(", "log", "scale", ")", "of", "α", "-", "factor", "for", "15", "min", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "1", ".", "0", "M", "NaCl", ",", "and", "Hog1", "phosphorylation", "was", "determined", "using", "the", "Phos", "-", "tag", "band", "-", "shift", "assay", ".", "Average", "values", "of", "three", "or", "more", "independent", "experiments", "were", "plotted", ".", "Data", "information", ":", "Error", "bars", "are", "SEM", ":", "(", "D", ")", ",", "n", "=", "3", "or", "moreE", ".", "KT306", "(", "MATa", "hkr1Δ", "msb2Δ", "ssk2", "/", "22Δ", "hog1Δ", ")", "was", "transformed", "with", "pRS416", "-", "Hog1", "(", "WT", ")", "or", "pRS416", "-", "Hog1", "-", "N149H", "D162G", "(", "N", "/", "H", "D", "/", "G", ")", ",", "and", "was", "exposed", "to", "10", "μM", "α", "-", "factor", "for", "the", "indicated", "time", "in", "the", "absence", "of", "osmostress", ",", "and", "Hog1", "phosphorylation", "was", "determined", "using", "the", "Phos", "-", "tag", "band", "-", "shift", "assay", ".", "Average", "of", "three", "independent", "experiments", "are", "plotted", ".", "Data", "information", ":", "Error", "bars", "are", "SEM", "(", "E", ")", "n", "=", "3", ".", "G", ".", "Typical", "FRET", "(", "YFP", "/", "CFP", "ratio", ")", "images", "showing", "p38", "activation", ".", "HeLa", "cells", "carrying", "the", "p38", "reporter", "PerKy", "-", "p38", "(", "Tomida", "et", "al", ".", ",", "2015", ")", "were", "stably", "transfected", "with", "an", "expression", "vector", "for", "the", "indicated", "p38α", "mutant", "proteins", ".", "FRET", "analysis", "was", "performed", "as", "described", "in", "Materials", "and", "Methods", ".", "H", ".", "Distribution", "of", "p38", "activity", "in", "individual", "cells", "from", "sets", "(", "a", ")", "-", "(", "d", ")", "in", "(", "G", ")", ".", "Data", "information", ":", "(", "G", ")", "Scale", "bars", ":", "20", "μm", ".", "(", "H", ")", "Statistics", ",", "Student", "'", "s", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8A. KT299 (MATa hkr1Δ msb2Δ ssk2/22Δ) was exposed to the indicated concentrations of α-factor for 15 min in the absence of osmostress. Phosphorylation of Fus3 and Kss1 was detected by immunoblotting.B. KT299 (MATa ssk2/22Δ hkr1Δ msb2Δ) was exposed to the indicated concentrations of α-factor for 15 min in the presence or absence of 0.8 M NaCl, and Hog1 phosphorylation was determined using the Phos-tag band-shift assay. Data information: (B) Representative results from three independent experiments.C. Average values of four independent experiments were plotted. Data information: Error bars are SEM (C) n=4D. HM06-1 (MATa ΔS/O/H/M ssk2/22Δ) was exposed to the indicated concentrations (log scale) of α-factor for 15 min in the presence or absence of 1.0 M NaCl, and Hog1 phosphorylation was determined using the Phos-tag band-shift assay. Average values of three or more independent experiments were plotted. Data information: Error bars are SEM: (D), n=3 or moreE. KT306 (MATa hkr1Δ msb2Δ ssk2/22Δ hog1Δ) was transformed with pRS416-Hog1 (WT) or pRS416-Hog1-N149H D162G (N/H D/G), and was exposed to 10 μM α-factor for the indicated time in the absence of osmostress, and Hog1 phosphorylation was determined using the Phos-tag band-shift assay. Average of three independent experiments are plotted. Data information: Error bars are SEM (E) n=3.G. Typical FRET (YFP/CFP ratio) images showing p38 activation. HeLa cells carrying the p38 reporter PerKy-p38 (Tomida et al., 2015) were stably transfected with an expression vector for the indicated p38α mutant proteins. FRET analysis was performed as described in Materials and Methods. H. Distribution of p38 activity in individual cells from sets (a) - (d) in (G). Data information: (G) Scale bars: 20 μm. (H) Statistics, Student's two-tailed t-test."}
{"words": ["Figure", "9A", ".", "An", "example", "of", "the", "time", "-", "course", "experiments", "for", "the", "osmostress", "-", "induced", "Hog1", "phosphorylation", ".", "The", "yeast", "strain", "KY603", "-", "3", "(", "ΔS", "/", "O", "/", "H", "/", "M", "ssk2", "/", "22Δ", "STE11", "-", "Q301P", ")", "was", "stimulated", "with", "1", ".", "0", "M", "NaCl", "for", "the", "indicated", "times", ",", "and", "the", "percentage", "of", "phosphorylated", "Hog1", "(", "Hog1", "-", "P", ")", "was", "determined", "using", "a", "Phos", "-", "tag", "band", "-", "shift", "assay", ".", "Compilations", "of", "the", "time", "-", "courses", "of", "osmostress", "-", "induced", "Hog1", "activation", "in", "(", "B", ")", "KY603", "-", "3", "(", "ΔS", "/", "O", "/", "H", "/", "M", "ssk2", "/", "22Δ", "STE11", "-", "Q301P", ")", ",", "For", "clarity", ",", "time", "-", "course", "curves", "are", "shown", "in", "two", "panels", "for", "lower", "and", "higher", "ranges", "of", "NaCl", "concentrations", ".", "Data", "information", ":", "For", "each", "data", "point", ",", "n", "=", "1", "or", "more", ".", "Compilations", "of", "the", "time", "-", "courses", "of", "osmostress", "-", "induced", "Hog1", "activation", "in", "(", "C", ")", "TM257", "(", "ssk2", "/", "22Δ", ")", ",", "and", "(", "D", ")", "TM142", "(", "wild", "-", "type", ")", ".", "For", "clarity", ",", "time", "-", "course", "curves", "are", "shown", "in", "two", "panels", "for", "lower", "and", "higher", "ranges", "of", "NaCl", "concentrations", ".", "The", "color", "chart", "below", "(", "D", ")", "indicates", "the", "concentrations", "of", "NaCl", "used", ".", "Data", "information", ":", "For", "each", "data", "point", ",", "n", "=", "1", "or", "more", ".", "E", ".", "Effects", "of", "Hog1", "kinase", "activity", "and", "osmostress", "-", "induced", "glycerol", "accumulation", "on", "the", "time", "-", "courses", "of", "Hog1", "activation", ".", "Cells", "were", "stimulated", "with", "0", ".", "4", "M", "NaCl", "(", "left", "panel", ")", "or", "1", ".", "6", "M", "NaCl", "(", "right", "panel", ")", "for", "the", "indicated", "times", ",", "and", "the", "percentage", "of", "phosphorylated", "Hog1", "was", "determined", "using", "Phos", "-", "tag", "band", "-", "shift", "assay", ".", "Strains", "used", "were", ":", "TM142", "(", "WT", ")", ",", "KT254", "(", "gpd1Δ", "gpd2Δ", "stl1Δ", ")", ",", "and", "TM232", "(", "hog1Δ", ")", "carrying", "pRS416", "-", "HOG1", "-", "K52S", "K53N", ".", "K", "/", "S", "K", "/", "N", ",", "K52S", "K53N", ";", "gpd1", "/", "2", ",", "gpd1Δ", "gpd2Δ", ".", "Data", "information", ":", "(", "E", ")", "Error", "bars", "are", "SEM", "(", "n", "=", "3", "or", "more", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 9A. An example of the time-course experiments for the osmostress-induced Hog1 phosphorylation. The yeast strain KY603-3 (ΔS/O/H/M ssk2/22Δ STE11-Q301P) was stimulated with 1.0 M NaCl for the indicated times, and the percentage of phosphorylated Hog1 (Hog1-P) was determined using a Phos-tag band-shift assay.Compilations of the time-courses of osmostress-induced Hog1 activation in (B) KY603-3 (ΔS/O/H/M ssk2/22Δ STE11-Q301P), For clarity, time-course curves are shown in two panels for lower and higher ranges of NaCl concentrations. Data information: For each data point, n=1 or more.Compilations of the time-courses of osmostress-induced Hog1 activation in (C) TM257 (ssk2/22Δ), and (D) TM142 (wild-type). For clarity, time-course curves are shown in two panels for lower and higher ranges of NaCl concentrations. The color chart below (D) indicates the concentrations of NaCl used. Data information: For each data point, n=1 or more.E. Effects of Hog1 kinase activity and osmostress-induced glycerol accumulation on the time-courses of Hog1 activation. Cells were stimulated with 0.4 M NaCl (left panel) or 1.6 M NaCl (right panel) for the indicated times, and the percentage of phosphorylated Hog1 was determined using Phos-tag band-shift assay. Strains used were: TM142 (WT), KT254 (gpd1Δ gpd2Δ stl1Δ), and TM232 (hog1Δ) carrying pRS416-HOG1-K52S K53N. K/S K/N, K52S K53N; gpd1/2, gpd1Δ gpd2Δ. Data information: (E) Error bars are SEM (n=3 or more)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Representative", "kymographs", "showing", "tetramethylrhodamine", "(", "TMR", ")", "-", "labeled", "DDB", "movement", "on", "each", "type", "of", "recombinant", "MT", "lattice", ",", "as", "indicated", ".", "Scale", "bars", ",", "5", "μm", "and", "25", "sec", ".", "Pink", "arrowhead", "marks", "a", "diffusive", "DDB", "complex", ".", "See", "also", "Movie", "EV1", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "DDB", "velocity", "on", "MT", "lattices", "lacking", "each", "of", "the", "tubulin", "-", "CTTs", "(", "n", "≥", "100", "DDB", "complexes", "per", "condition", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "No", "statistical", "difference", "was", "observed", "between", "WT", "and", "mutant", "MTs", "(", "P", "≥", "0", ".", "1", ",", "unpaired", "t", "test", ")", "(", "C", "-", "D", ")", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "processive", "(", "C", ")", ",", "or", "diffusive", "(", "D", ")", "DDB", "complexes", "relative", "to", "WT", "MTs", "in", "the", "same", "chamber", "(", "n", "≥", "10", "MTs", "quantified", "for", "each", "condition", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "Processive", "(", "unidirectional", "motion", "exceeding", "0", ".", "5", "μm", ")", "and", "diffusive", "(", "back", "-", "and", "-", "forth", "motion", ")", "events", "were", "scored", "in", "a", "field", "of", "view", "and", "then", "divided", "by", "the", "lengths", "of", "MTs", "and", "time", ",", "thus", "normalizing", "to", "a", "value", "of", "number", "of", "motility", "events", "per", "μm", "MT", "per", "sec", ".", "Error", "bars", "SD", ".", "(", "E", "-", "F", ")", "TIRF", "images", "of", "1", "nM", "TMR", "-", "labeled", "GST", "-", "hDyn", "(", "2", "mM", "ATP", ")", "(", "E", ")", ",", "or", "0", ".", "3", "nM", "TMR", "-", "labeled", "p150", "(", "F", ")", "molecules", "(", "green", ")", "bound", "to", "either", "Δα", "-", "CTT", "(", "top", ")", ",", "or", "Δβ", "-", "CTT", "MTs", "(", "bottom", ")", ".", "Pink", "arrows", "show", "mutant", "MTs", "in", "both", "the", "raw", ",", "and", "SD", "map", "images", ",", "highlighting", "differences", "in", "binding", "between", "WT", "and", "mutant", "MTs", "that", "are", "apparent", "in", "the", "SD", "map", ".", "Right", ",", "standard", "deviation", "maps", "from", "an", "entire", "time", "sequence", "reveal", "ensemble", "binding", "and", "dissociation", "events", "that", "lead", "to", "variations", "in", "pixel", "intensities", "(", "see", "Methods", ")", ".", "Scale", "bars", "are", "5", "μm", ".", "(", "G", ")", "Quantification", "of", "mean", "fluorescence", "intensity", "(", "arbitrary", "units", ")", "per", "μm", "MT", "for", "GST", "-", "hDyn", "(", "2", "mM", "ATP", ")", "or", "p150", "bound", "to", "the", "indicated", "mutant", "MT", "relative", "to", "WT", "MTs", "in", "the", "same", "chamber", ".", "Image", "shows", "first", "frame", "from", "time", "series", ".", "The", "intensity", "of", "GST", "-", "hDyn", "was", "quantified", "from", "maximum", "intensity", "projections", "of", "the", "entire", "time", "sequence", "due", "to", "transient", "binding", "of", "GST", "-", "hDyn", "to", "the", "MT", "(", "n", "≥", "10", "MTs", "quantified", "for", "each", "condition", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "SD", ".", "P", "value", "(", "unpaired", "t", "test", ")", "of", "Δα", "-", "CTT", "vs", ".", "Δβ", "-", "CTT", "MTs", "=", "0", ".", "5208", "for", "GST", "-", "hDyn", ",", "and", "≤", "0", ".", "0001", "for", "p150", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Representative kymographs showing tetramethylrhodamine (TMR)-labeled DDB movement on each type of recombinant MT lattice, as indicated. Scale bars, 5 μm and 25 sec. Pink arrowhead marks a diffusive DDB complex. See also Movie EV1. (B) Quantification of DDB velocity on MT lattices lacking each of the tubulin-CTTs (n ≥ 100 DDB complexes per condition from at least three independent experiments). No statistical difference was observed between WT and mutant MTs (P ≥ 0.1, unpaired t test) (C-D) Quantification of the number of processive (C), or diffusive (D) DDB complexes relative to WT MTs in the same chamber (n ≥ 10 MTs quantified for each condition from at least three independent experiments). Processive (unidirectional motion exceeding 0.5 μm) and diffusive (back-and-forth motion) events were scored in a field of view and then divided by the lengths of MTs and time, thus normalizing to a value of number of motility events per μm MT per sec. Error bars SD.(E-F) TIRF images of 1 nM TMR-labeled GST-hDyn (2 mM ATP) (E), or 0.3 nM TMR-labeled p150 (F) molecules (green) bound to either Δα-CTT (top), or Δβ-CTT MTs (bottom). Pink arrows show mutant MTs in both the raw, and SD map images, highlighting differences in binding between WT and mutant MTs that are apparent in the SD map. Right, standard deviation maps from an entire time sequence reveal ensemble binding and dissociation events that lead to variations in pixel intensities (see Methods). Scale bars are 5 μm. (G) Quantification of mean fluorescence intensity (arbitrary units) per μm MT for GST-hDyn (2 mM ATP) or p150 bound to the indicated mutant MT relative to WT MTs in the same chamber. Image shows first frame from time series. The intensity of GST-hDyn was quantified from maximum intensity projections of the entire time sequence due to transient binding of GST-hDyn to the MT (n ≥ 10 MTs quantified for each condition from at least three independent experiments). Error bars represent SD. P value (unpaired t test) of Δα-CTT vs. Δβ-CTT MTs = 0.5208 for GST-hDyn, and ≤ 0.0001 for p150."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "TIRF", "image", "of", "TMR", "-", "labeled", "DDB", "molecules", "(", "green", ")", "bound", "to", "either", "tyrosinated", "(", "red", ")", "or", "detyrosinated", "(", "blue", ")", "MTs", ".", "A", "standard", "deviation", "map", "of", "the", "whole", "time", "sequence", "is", "shown", ",", "revealing", "the", "preferential", "association", "of", "DDB", "with", "tyrosinated", "MTs", "versus", "detyrosinated", "MTs", "(", "pink", "arrow", ")", ".", "Representative", "kymographs", "of", "DDB", "movement", "are", "shown", "from", "each", "type", "of", "MT", "present", "in", "the", "same", "chamber", ".", "Scale", "bars", "are", "5", "μm", "and", "25", "sec", ".", "See", "also", "Movie", "EV2", ".", "(", "B", "-", "C", ")", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "processive", "(", "B", ")", "or", "diffusive", "(", "C", ")", "DDB", "complexes", "per", "μm", "MT", "per", "sec", "on", "detyrosinated", "MTs", "relative", "to", "tyrosinated", "MTs", "in", "the", "same", "chamber", "(", "n", "≥", "20", "MTs", "quantified", "for", "each", "condition", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "SD", ".", "Data", "from", "Δα", "-", "CTT", "MTs", "(", "Fig", ".", "1", ")", "are", "re", "-", "plotted", "for", "comparison", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "the", "frequency", "of", "processive", "DDB", "molecules", "as", "a", "function", "of", "the", "amount", "of", "tyrosinated", "tubulin", "incorporated", "into", "the", "lattice", "normalized", "to", "fully", "tyrosinated", "MTs", ".", "Data", "points", "from", "two", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "(", "E", ")", "TIRF", "images", "of", "0", ".", "3", "nM", "TMR", "-", "labeled", "p150", "(", "top", ")", "or", "1", "nM", "TMR", "-", "labeled", "GST", "-", "hDyn", "(", "bottom", ")", "molecules", "(", "green", ")", "bound", "to", "either", "tyrosinated", "(", "red", ")", "or", "detyrosinated", "(", "blue", ")", "MTs", ".", "Right", ",", "standard", "deviation", "maps", "of", "protein", "binding", "over", "an", "entire", "time", "sequence", "and", "kymographs", "from", "either", "tyrosinated", "or", "detyrosinated", "MTs", "are", "shown", ".", "Scale", "bars", "are", "5", "μm", "and", "25", "sec", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "mean", "fluorescence", "intensity", "(", "arbitrary", "units", ")", "per", "μm", "MT", "for", "TMR", "-", "labeled", "GST", "-", "hDyn", "(", "2", "mM", "ATP", ")", "or", "p150", "bound", "to", "the", "indicated", "mutant", "MT", "relative", "to", "WT", "MTs", "in", "the", "same", "chamber", ".", "The", "intensity", "of", "GST", "-", "hDyn", "was", "quantified", "from", "maximum", "intensity", "projections", "of", "the", "entire", "time", "sequence", "due", "to", "transient", "binding", "of", "GST", "-", "hDyn", "to", "the", "MT", ".", "(", "n", "≥", "10", "MTs", "quantified", "for", "each", "condition", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "SD", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) TIRF image of TMR-labeled DDB molecules (green) bound to either tyrosinated (red) or detyrosinated (blue) MTs. A standard deviation map of the whole time sequence is shown, revealing the preferential association of DDB with tyrosinated MTs versus detyrosinated MTs (pink arrow). Representative kymographs of DDB movement are shown from each type of MT present in the same chamber. Scale bars are 5 μm and 25 sec. See also Movie EV2. (B-C) Quantification of the number of processive (B) or diffusive (C) DDB complexes per μm MT per sec on detyrosinated MTs relative to tyrosinated MTs in the same chamber (n ≥ 20 MTs quantified for each condition from three independent experiments). Error bars represent SD. Data from Δα-CTT MTs (Fig. 1) are re-plotted for comparison. (D) Quantification of the frequency of processive DDB molecules as a function of the amount of tyrosinated tubulin incorporated into the lattice normalized to fully tyrosinated MTs. Data points from two independent experiments are shown.(E) TIRF images of 0.3 nM TMR-labeled p150 (top) or 1 nM TMR-labeled GST-hDyn (bottom) molecules (green) bound to either tyrosinated (red) or detyrosinated (blue) MTs. Right, standard deviation maps of protein binding over an entire time sequence and kymographs from either tyrosinated or detyrosinated MTs are shown. Scale bars are 5 μm and 25 sec. (F) Quantification of mean fluorescence intensity (arbitrary units) per μm MT for TMR-labeled GST-hDyn (2 mM ATP) or p150 bound to the indicated mutant MT relative to WT MTs in the same chamber. The intensity of GST-hDyn was quantified from maximum intensity projections of the entire time sequence due to transient binding of GST-hDyn to the MT. (n ≥ 10 MTs quantified for each condition from at least three independent experiments). Error bars represent SD."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Immunoblot", "of", "brain", "tubulin", "with", "or", "without", "carboxypeptidase", "A", "(", "CPA", ")", ".", "Note", "CPA", "specifically", "removes", "the", "α", "-", "tubulin", "C", "-", "terminal", "tyrosine", "without", "affecting", "other", "PTMs", ".", "(", "B", ")", "TIRF", "image", "of", "TMR", "-", "labeled", "DDB", "molecules", "(", "green", ")", "on", "either", "WT", "(", "red", ")", "or", "CPA", "-", "treated", "(", "blue", ")", "pig", "brain", "MTs", ".", "Standard", "deviation", "map", "of", "the", "entire", "time", "sequence", "shows", "DDB", "preference", "for", "WT", "MTs", "and", "kymographs", "from", "either", "WT", "or", "CPA", "-", "treated", "are", "shown", ".", "Scale", "bars", "are", "5", "μm", "and", "25", "sec", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "processive", "DDB", "complexes", "per", "μm", "MT", "per", "sec", "on", "the", "CPA", "-", "treated", "MTs", ",", "relative", "to", "WT", "MTs", "in", "the", "same", "chamber", "(", "n", "≥", "7", "MTs", "of", "each", "type", "quantified", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "SD", ".", "(", "D", ")", "TIRF", "images", "of", "0", ".", "3nM", "TMR", "-", "labeled", "p150", "(", "top", ")", "or", "1nM", "TMR", "-", "labeled", "GST", "-", "hDyn", "(", "bottom", ")", "molecules", "(", "green", ")", "bound", "to", "either", "WT", "(", "red", ")", ",", "or", "CPA", "-", "treated", "MTs", "(", "blue", ")", ".", "Right", ",", "standard", "deviation", "maps", "of", "protein", "binding", "over", "an", "entire", "time", "sequence", "and", "kymographs", "from", "either", "WT", "or", "CPA", "-", "treated", "are", "shown", ".", "Scale", "bars", "are", "5", "μm", "and", "25", "sec", "for", "p150", ",", "and", "5", "μm", "and", "12", "sec", "for", "GST", "-", "hDyn", "(", "E", ")", "Quantification", "of", "mean", "fluorescence", "intensity", "(", "arbitrary", "units", ")", "per", "μm", "MT", "for", "TMR", "-", "labeled", "GST", "-", "hDyn", "(", "2mM", "ATP", ")", "or", "p150", "bound", "to", "CPA", "-", "treated", "MTs", "relative", "to", "WT", "MTs", "in", "the", "same", "chamber", ".", "The", "intensity", "of", "GST", "-", "hDyn", "was", "quantified", "from", "maximum", "intensity", "projections", "of", "the", "entire", "time", "sequence", "due", "to", "transient", "binding", "of", "GST", "-", "hDyn", "to", "the", "MT", "(", "n", "≥", "10", "MTs", "quantified", "for", "each", "condition", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "SD", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Immunoblot of brain tubulin with or without carboxypeptidase A (CPA). Note CPA specifically removes the α-tubulin C-terminal tyrosine without affecting other PTMs.(B) TIRF image of TMR-labeled DDB molecules (green) on either WT (red) or CPA-treated (blue) pig brain MTs. Standard deviation map of the entire time sequence shows DDB preference for WT MTs and kymographs from either WT or CPA-treated are shown. Scale bars are 5 μm and 25 sec. (C) Quantification of the number of processive DDB complexes per μm MT per sec on the CPA-treated MTs, relative to WT MTs in the same chamber (n ≥ 7 MTs of each type quantified from at least three independent experiments). Error bars represent SD.(D) TIRF images of 0.3nM TMR-labeled p150 (top) or 1nM TMR-labeled GST-hDyn (bottom) molecules (green) bound to either WT (red), or CPA-treated MTs (blue). Right, standard deviation maps of protein binding over an entire time sequence and kymographs from either WT or CPA-treated are shown. Scale bars are 5 μm and 25 sec for p150, and 5 μm and 12 sec for GST-hDyn (E) Quantification of mean fluorescence intensity (arbitrary units) per μm MT for TMR-labeled GST-hDyn (2mM ATP) or p150 bound to CPA-treated MTs relative to WT MTs in the same chamber. The intensity of GST-hDyn was quantified from maximum intensity projections of the entire time sequence due to transient binding of GST-hDyn to the MT (n ≥ 10 MTs quantified for each condition from at least three independent experiments). Error bars represent SD."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Schematic", "of", "the", "p150", "constructs", "used", ".", "The", "p135", "isoform", "lacks", "the", "CAP", "-", "Gly", "domain", ",", "but", "retains", "part", "of", "the", "adjacent", "basic", "domain", "(", "red", ")", "and", "coiled", "-", "coil", "domains", "(", "blue", ")", ".", "Right", ",", "Coomassie", "blue", "stained", "gel", "of", "the", "purified", "p150", "and", "p135", "proteins", ".", "Molecular", "weight", "markers", "are", "indicated", ".", "(", "B", ")", "TIRF", "image", "of", "either", "p150", "(", "0", ".", "3", "nM", ")", ",", "or", "p135", "(", "0", ".", "3", "or", "6", "nM", ")", "bound", "to", "either", "WT", "(", "red", ")", ",", "or", "CPA", "-", "treated", "porcine", "MTs", "(", "blue", ")", ".", "Note", ":", "no", "binding", "of", "p135", "is", "observed", "at", "comparable", "concentrations", "to", "p150", "indicating", "the", "lower", "binding", "affinity", "of", "this", "isoform", ".", "Proteins", "were", "visualized", "by", "fluorescence", "from", "the", "GFP", "tag", "fused", "to", "each", "construct", ".", "(", "C", ")", "Still", "images", "from", "a", "TIRF", "time", "-", "series", "of", "p135", "(", "green", ")", "binding", "to", "either", "WT", "(", "red", ")", ",", "or", "CPA", "-", "treated", "porcine", "MTs", "(", "blue", ")", ".", "Right", ",", "standard", "deviation", "map", "of", "p135", "binding", "shows", "no", "preference", "for", "either", "type", "of", "MT", ",", "and", "quantification", "of", "mean", "fluorescence", "intensity", "(", "arbitrary", "units", ")", "per", "μm", "MT", "for", "p135", "bound", "to", "CPA", "-", "treated", "MTs", "relative", "to", "WT", "MTs", "in", "the", "same", "chamber", "(", "n", "≥", "10", "MTs", "quantified", "for", "each", "condition", "from", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "Scale", "bars", "are", "5", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Schematic of the p150 constructs used. The p135 isoform lacks the CAP-Gly domain, but retains part of the adjacent basic domain (red) and coiled-coil domains (blue). Right, Coomassie blue stained gel of the purified p150 and p135 proteins. Molecular weight markers are indicated.(B) TIRF image of either p150 (0.3 nM), or p135 (0.3 or 6 nM) bound to either WT (red), or CPA-treated porcine MTs (blue). Note: no binding of p135 is observed at comparable concentrations to p150 indicating the lower binding affinity of this isoform. Proteins were visualized by fluorescence from the GFP tag fused to each construct.(C) Still images from a TIRF time-series of p135 (green) binding to either WT (red), or CPA-treated porcine MTs (blue). Right, standard deviation map of p135 binding shows no preference for either type of MT, and quantification of mean fluorescence intensity (arbitrary units) per μm MT for p135 bound to CPA-treated MTs relative to WT MTs in the same chamber (n ≥ 10 MTs quantified for each condition from three independent experiments). Scale bars are 5 μm."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "B", ")", "Example", "of", "a", "chimeric", "MT", "generated", "from", "recombinant", "yeast", "tubulin", "containing", "tyrosinated", "(", "red", ")", "and", "detyrosinated", "(", "blue", ")", "sections", ".", "Most", "TMR", "-", "labeled", "DDB", "molecules", "(", "green", ")", "move", "processively", "through", "the", "annealed", "junction", "between", "the", "two", "types", "of", "MT", "lattice", "(", "65", "%", ",", "n", "=", "836", "processive", "complexes", ",", "65", "MT", "-", "MT", "junctions", ",", "three", "independent", "experiments", ")", ".", "Diffusive", "DDB", "molecules", "(", "white", "arrow", ")", "are", "primarily", "observed", "on", "the", "tyrosinated", "section", "of", "the", "MT", "and", "do", "not", "diffuse", "across", "the", "boundary", ".", "Right", ",", "video", "frames", "showing", "a", "processive", "DDB", "complex", "(", "pink", "arrowhead", ")", "moving", "across", "the", "junction", "(", "yellow", "arrowhead", ")", "of", "tyrosinated", "and", "detryosinated", "MT", ".", "The", "(", "+", ")", "and", "(", "-", ")", "signs", "denote", "MT", "polarity", "inferred", "from", "the", "directionality", "of", "DDB", "movement", ".", "Scale", "bars", "are", "5", "μm", "and", "25", "sec", ".", "See", "also", "Movie", "EV3", ".", "(", "C", ")", "TIRF", "images", "of", "low", "(", "0", ".", "3", "nM", ")", "and", "high", "(", "10", "nM", ")", "concentrations", "of", "TMR", "-", "labeled", "p150", "(", "green", ")", "bound", "to", "chimeric", "yeast", "MTs", "containing", "tyrosinated", "(", "red", ")", "and", "detyrosinated", "(", "blue", ")", "sections", "of", "MT", ".", "Representative", "kymographs", "below", "show", "diffusive", "behavior", "of", "p150", "molecules", "on", "the", "MT", ".", "Note", "that", "p150", "rarely", "diffuses", "into", "the", "detyrosinated", "section", "of", "MT", ",", "even", "at", "high", "concentrations", ".", "Scale", "bars", "are", "5", "μm", "and", "10", "sec", ".", "(", "D", "-", "E", ")", "TIRFimages", "and", "kymographs", "of", "annealed", "WT", "and", "CPA", "-", "treated", "porcineMTs", "(", "D", ")", ",", "or", "annealed", "WT", "MTs", "(", "E", ")", ".", "The", "majority", "of", "DDB", "complexes", "(", "78", "%", ",", "n", "=", "960", "processive", "complexes", ",", "45", "MT", "-", "MT", "junctions", ",", "three", "independent", "experiments", ")", "move", "processively", "across", "the", "boundary", "between", "WT", "and", "CPA", "-", "MTs", "(", "D", ")", ".", "Note", "TMR", "-", "labeled", "DDB", "complexes", "(", "green", ")", "in", "(", "E", ")", "traverse", "the", "annealed", "boundary", "without", "pausing", "(", "93", "%", ",", "n", "=", "677", "processive", "complexes", ",", "45", "MT", "-", "MT", "junctions", ",", "three", "independent", "experiments", ")", ",", "suggesting", "that", "the", "annealed", "junction", "does", "not", "affect", "DDB", "motility", ".", "(", "F", ")", "TIRF", "image", "and", "kymograph", "from", "a", "chimeric", "MT", "composed", "of", "WT", "(", "red", ")", "and", "subtilisin", "-", "treated", "porcine", "MTs", "(", "blue", ")", ".", "Note", "some", "DDB", "complexes", "(", "pink", "arrows", ")", "traverse", "the", "boundary", "and", "continue", "moving", "along", "the", "subtilisin", "-", "treated", "section", "of", "the", "MT", "(", "41", "%", ",", "n", "=", "709", "processive", "complexes", ",", "56", "MT", "-", "MT", "junctions", ",", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "All", "scale", "bars", "in", "D", "-", "F", "are", "5", "μm", "and", "25", "sec", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(B) Example of a chimeric MT generated from recombinant yeast tubulin containing tyrosinated (red) and detyrosinated (blue) sections. Most TMR-labeled DDB molecules (green) move processively through the annealed junction between the two types of MT lattice (65%, n=836 processive complexes, 65 MT-MT junctions, three independent experiments). Diffusive DDB molecules (white arrow) are primarily observed on the tyrosinated section of the MT and do not diffuse across the boundary. Right, video frames showing a processive DDB complex (pink arrowhead) moving across the junction (yellow arrowhead) of tyrosinated and detryosinated MT. The (+) and (-) signs denote MT polarity inferred from the directionality of DDB movement. Scale bars are 5 μm and 25 sec. See also Movie EV3.(C) TIRF images of low (0.3 nM) and high (10 nM) concentrations of TMR-labeled p150 (green) bound to chimeric yeast MTs containing tyrosinated (red) and detyrosinated (blue) sections of MT. Representative kymographs below show diffusive behavior of p150 molecules on the MT. Note that p150 rarely diffuses into the detyrosinated section of MT, even at high concentrations. Scale bars are 5 μm and 10 sec.(D-E) TIRFimages and kymographs of annealed WT and CPA-treated porcineMTs(D), or annealed WT MTs(E). The majority of DDB complexes (78%, n=960 processive complexes, 45 MT-MT junctions, three independent experiments) move processively across the boundary between WT and CPA-MTs(D). Note TMR-labeled DDB complexes (green) in (E) traverse the annealed boundary without pausing (93%, n=677 processive complexes, 45 MT-MT junctions, three independent experiments), suggesting that the annealed junction does not affect DDB motility.(F) TIRF image and kymograph from a chimeric MT composed of WT (red) and subtilisin-treated porcine MTs (blue). Note some DDB complexes (pink arrows) traverse the boundary and continue moving along the subtilisin-treated section of the MT (41%, n=709 processive complexes, 56 MT-MT junctions, 3 independent experiments). All scale bars in D-F are 5 μm and 25 sec."}
{"words": ["Figure", "1", ".", "(", "A", ")", "UASp", "-", "GFP", "-", "mCherry", "-", "DrAtg8a", "/", "+", ";", "nosGAL4", "/", "+", "flies", "conditioned", "on", "yeast", "paste", "had", "diffuse", "GFP", "-", "mCherry", "-", "DrAtg8a", "staining", "in", "midstage", "egg", "chambers", ".", "(", "B", ")", "Nondegenerating", "midstage", "egg", "chambers", "from", "starved", "flies", "contained", "autophagosomes", "(", "yellow", ")", "and", "autolysosomes", "(", "red", ")", ".", "(", "C", "and", "D", ")", "Egg", "chambers", "early", "in", "the", "degeneration", "process", "showed", "follicle", "cells", "that", "take", "up", "portions", "of", "the", "nurse", "cell", "cytoplasm", "(", "C", ")", "followed", "by", "condensation", "and", "fragmentation", "of", "the", "nurse", "cell", "nuclei", "and", "further", "uptake", "of", "the", "nurse", "cell", "cytoplasm", "into", "follicle", "cells", "(", "D", ")", ".", "(", "E", ")", "Late", "stage", "degenerating", "egg", "chambers", "lose", "all", "GFP", "staining", "and", "fluoresce", "red", ".", "(", "F", ")", "Fed", "Dcp", "-", "1Prev1", "/", "Dcp", "-", "1Prev1", ";", "UASp", "-", "GFP", "-", "mCherry", "-", "DrAtg8a", "/", "nosGAL4", "flies", "showed", "diffuse", "GFP", "-", "mCherry", "-", "DrAtg8a", "staining", "in", "the", "germline", ".", "(", "G", ")", "Starved", "Dcp", "-", "1Prev1", "/", "Dcp", "-", "1Prev1", ";", "UASp", "-", "GFP", "-", "mCherry", "-", "DrAtg8a", "/", "nosGAL4", "flies", "showed", "reduced", "autolysosomes", "in", "degenerating", "midstage", "egg", "chambers", ".", "(", "H", "and", "I", ")", "Fed", "flies", "overexpressing", "truncated", "Dcp", "-", "1", "(", "tDcp", "-", "1", ")", "in", "the", "germline", "showed", "increased", "autophagosomes", "and", "autolysosomes", "in", "nondegenerating", "midstage", "egg", "chambers", "(", "H", ")", "and", "also", "contained", "degenerating", "midstage", "egg", "chambers", "that", "lose", "all", "GFP", "fluorescence", "and", "fluoresce", "red", "(", "I", ")", ".", "Bars", ":", "(", "main", "images", ")", "25", "µm", ";", "(", "insets", ")", "12", ".", "5", "µm", ".", "Insets", "in", "A", "-", "I", "show", "diffuse", "cytoplasmic", "staining", "of", "Atg8a", "or", "autophagosomes", "and", "autolysosomes", ".", "(", "J", "and", "K", ")", "The", "percentages", "of", "autolysosomes", "(", "autolysosomes", "/", "total", "autophagic", "structures", ")", "were", "manually", "calculated", "in", "at", "least", "eight", "egg", "chambers", "for", "each", "genotype", "as", "indicated", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "means", "±", "SD", ".", "Statistical", "testing", "was", "performed", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "a", "Dunnet", "post", "test", "(", "*", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "0001", ")", "or", "a", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", "(", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "005", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1.(A) UASp-GFP-mCherry-DrAtg8a/+;nosGAL4/+ flies conditioned on yeast paste had diffuse GFP-mCherry-DrAtg8a staining in midstage egg chambers. (B) Nondegenerating midstage egg chambers from starved flies contained autophagosomes (yellow) and autolysosomes (red). (C and D) Egg chambers early in the degeneration process showed follicle cells that take up portions of the nurse cell cytoplasm (C) followed by condensation and fragmentation of the nurse cell nuclei and further uptake of the nurse cell cytoplasm into follicle cells (D). (E) Late stage degenerating egg chambers lose all GFP staining and fluoresce red.(F) Fed Dcp-1Prev1/Dcp-1Prev1;UASp-GFP-mCherry-DrAtg8a/nosGAL4 flies showed diffuse GFP-mCherry-DrAtg8a staining in the germline. (G) Starved Dcp-1Prev1/Dcp-1Prev1;UASp-GFP-mCherry-DrAtg8a/nosGAL4 flies showed reduced autolysosomes in degenerating midstage egg chambers. (H and I) Fed flies overexpressing truncated Dcp-1 (tDcp-1) in the germline showed increased autophagosomes and autolysosomes in nondegenerating midstage egg chambers (H) and also contained degenerating midstage egg chambers that lose all GFP fluorescence and fluoresce red (I). Bars: (main images) 25 µm; (insets) 12.5 µm. Insets in A-I show diffuse cytoplasmic staining of Atg8a or autophagosomes and autolysosomes. (J and K) The percentages of autolysosomes (autolysosomes/total autophagic structures) were manually calculated in at least eight egg chambers for each genotype as indicated. Error bars represent the means ± SD. Statistical testing was performed using one-way ANOVA with a Dunnet post test (****, P < 0.0001) or a two-tailed Student's t test (**, P < 0.005)."}
{"words": ["Figure", "2", ".", "(", "A", ")", "Drosophila", "S2", "cells", "stably", "expressing", "GFP", "-", "RFP", "-", "Atg8a", "showed", "an", "increase", "in", "the", "percentage", "of", "cells", "containing", "two", "or", "more", "autolysosomes", "after", "starvation", ",", "which", "was", "blocked", "after", "Bafilomycin", "A1", "(", "BafA1", ")", "treatment", ".", "At", "least", "50", "cells", "were", "manually", "quantitated", "in", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "a", "Dunnett", "post", "test", "(", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "(", "B", ")", "Representative", "images", "of", "S2", "-", "GFP", "-", "RFP", "-", "Atg8a", "cells", "after", "the", "indicated", "treatments", ".", "(", "C", ")", "S2", "-", "GFP", "-", "RFP", "-", "Atg8a", "cells", "were", "treated", "with", "dsRNAs", "and", "subjected", "to", "fed", "or", "starvation", "conditions", "as", "indicated", ".", "At", "least", "50", "cells", "were", "manually", "quantitated", "in", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "a", "Dunnett", "post", "test", "(", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "0001", ")", ".", "(", "D", ")", "Representative", "images", "of", "S2", "-", "GFP", "-", "RFP", "-", "Atg8a", "cells", "after", "the", "indicated", "RNAi", "treatments", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "means", "±", "SD", ".", "Bars", ",", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2.(A) Drosophila S2 cells stably expressing GFP-RFP-Atg8a showed an increase in the percentage of cells containing two or more autolysosomes after starvation, which was blocked after Bafilomycin A1 (BafA1) treatment. At least 50 cells were manually quantitated in three independent experiments (n = 3). Statistical significance was determined using one-way ANOVA with a Dunnett post test (**, P < 0.01). (B) Representative images of S2-GFP-RFP-Atg8a cells after the indicated treatments.(C) S2-GFP-RFP-Atg8a cells were treated with dsRNAs and subjected to fed or starvation conditions as indicated. At least 50 cells were manually quantitated in three independent experiments (n = 3). Statistical significance was determined using one-way ANOVA with a Dunnett post test (**, P < 0.01; ***, P < 0.001; ****, P < 0.0001). (D) Representative images of S2-GFP-RFP-Atg8a cells after the indicated RNAi treatments. Error bars represent the means ± SD. Bars, 10 µm."}
{"words": ["Figure", "3", ".", "(", "A", ")", "Nondegenerating", "midstage", "egg", "chambers", "from", "fed", "w1118flies", "showed", "Ref", "(", "2", ")", "P", "staining", "in", "follicle", "cells", "and", "nurse", "cells", ".", "(", "B", ")", "Starved", "w1118flies", "contained", "degenerating", "midstage", "egg", "chambers", "with", "reduced", "Ref", "(", "2", ")", "P", ".", "(", "D", ")", "Starved", "Atg7flies", "showed", "an", "accumulation", "of", "Ref", "(", "2", ")", "P", "in", "the", "follicle", "cells", "and", "nurse", "cells", "of", "degenerating", "midstage", "egg", "chambers", ".", "(", "E", ")", "Starved", "Dcp", "-", "1Prev1flies", "contained", "increased", "levels", "of", "Ref", "(", "2", ")", "P", "in", "degenerating", "midstage", "egg", "chambers", ".", "(", "C", ")", "A", "representative", "Western", "blot", "of", "ovaries", "from", "w1118", "and", "Atg7d77", "/", "d14", "flies", "subjected", "to", "fed", "or", "starvation", "conditions", "for", "4", "d", ".", "Ref", "(", "2", ")", "P", "was", "detected", "by", "immunoblotting", ".", "Actin", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "Densitometry", "was", "performed", "to", "quantitate", "Ref", "(", "2", ")", "P", "protein", "levels", "relative", "to", "actin", ".", "Graph", "represents", "±", "SD", "from", "five", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "using", "a", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "*", ",", "P", "=", "0", ".", "004", "for", "fed", "samples", ";", "*", ",", "P", "=", "0", ".", "008", "for", "starved", "samples", ".", "(", "F", ")", "A", "representative", "Western", "blot", "of", "ovaries", "from", "w1118", "and", "Dcp", "-", "1Prev1", "flies", "that", "were", "subjected", "to", "fed", "or", "starvation", "conditions", "for", "4", "d", ".", "Ref", "(", "2", ")", "P", "was", "detected", "by", "immunoblotting", ".", "Actin", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "Densitometry", "was", "performed", "to", "quantitate", "Ref", "(", "2", ")", "P", "protein", "levels", "relative", "to", "actin", ".", "Graph", "represents", "±", "SD", "from", "five", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "5", ")"], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3.(A) Nondegenerating midstage egg chambers from fed w1118flies showed Ref(2)P staining in follicle cells and nurse cells. (B) Starved w1118flies contained degenerating midstage egg chambers with reduced Ref(2)P.(D) Starved Atg7flies showed an accumulation of Ref(2)P in the follicle cells and nurse cells of degenerating midstage egg chambers. (E) Starved Dcp-1Prev1flies contained increased levels of Ref(2)P in degenerating midstage egg chambers.(C) A representative Western blot of ovaries from w1118 and Atg7d77/d14 flies subjected to fed or starvation conditions for 4 d. Ref(2)P was detected by immunoblotting. Actin served as a loading control. Densitometry was performed to quantitate Ref(2)P protein levels relative to actin. Graph represents ± SD from five independent experiments (n = 5). Statistical significance was determined using a two-tailed Student's t test. *, P = 0.004 for fed samples; *, P = 0.008 for starved samples.(F) A representative Western blot of ovaries from w1118 and Dcp-1Prev1 flies that were subjected to fed or starvation conditions for 4 d. Ref(2)P was detected by immunoblotting. Actin served as a loading control. Densitometry was performed to quantitate Ref(2)P protein levels relative to actin. Graph represents ± SD from five independent experiments (n = 5)"}
{"words": ["Figure", "4", ".", "(", "A", "and", "B", ")", "l", "(", "2", ")", "mbn", "cells", "were", "labeled", "with", "antibodies", "to", "Dcp", "-", "1", "and", "ATPsyn", "-", "α", "(", "A", ")", "or", "MitoTracker", "red", "(", "MTR", ";", "B", ")", ".", "Merged", "images", "show", "colocalization", "between", "Dcp", "-", "1", "and", "the", "mitochondria", ".", "Boxes", "represent", "zoomed", "images", ".", "Bars", ":", "(", "main", "images", ")", "5", "µm", ";", "(", "zoomed", "images", ")", "1", ".", "25", "µm", ".", "(", "C", ")", "Western", "blot", "from", "l", "(", "2", ")", "mbn", "cells", "subjected", "to", "nutrient", "-", "rich", "or", "starvation", "conditions", "for", "6", "h", ".", "Cells", "were", "separated", "into", "cytosolic", "(", "C", ")", "and", "mitochondrial", "enriched", "(", "M", ")", "fractions", ".", "(", "D", ")", "Ovaries", "from", "fed", "w1118", "flies", "were", "separated", "into", "cytosolic", "and", "membrane", "-", "enriched", "fractions", "and", "probed", "with", "antibodies", "to", "VDAC", ",", "Tubulin", ",", "ATPsyn", "-", "α", ",", "and", "Dcp", "-", "1", ".", "(", "E", "and", "F", ")", "Intact", "and", "lysed", "mitochondria", "(", "E", ")", "or", "intact", "mitochondria", "isolated", "from", "l", "(", "2", ")", "mbn", "cells", "(", "F", ")", "were", "treated", "with", "proteinase", "K", "(", "PK", ")", ".", "The", "effects", "of", "proteinase", "K", "treatment", "were", "assessed", "by", "antibodies", "to", "VDAC", ",", "ATPsyn", "-", "α", ",", "Pink1", ",", "and", "Dcp", "-", "1", ".", "(", "E", "and", "F", ")", "Intact", "and", "lysed", "mitochondria", "(", "E", ")", "or", "intact", "mitochondria", "isolated", "from", "l", "(", "2", ")", "mbn", "cells", "(", "F", ")", "were", "treated", "with", "proteinase", "K", "(", "PK", ")", ".", "The", "effects", "of", "proteinase", "K", "treatment", "were", "assessed", "by", "antibodies", "to", "VDAC", ",", "ATPsyn", "-", "α", ",", "Pink1", ",", "and", "Dcp", "-", "1", ".", "(", "G", ")", "Control", "and", "Dcp", "-", "1", "RNAi", "-", "treated", "cells", "were", "subjected", "to", "nutrient", "-", "rich", "or", "starvation", "conditions", "and", "stained", "with", "NAO", ".", "Mean", "fluorescence", "was", "measured", "by", "flow", "cytometry", ".", "Graph", "represents", "±", "SEM", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4.(A and B) l(2)mbn cells were labeled with antibodies to Dcp-1 and ATPsyn-α (A) or MitoTracker red (MTR; B). Merged images show colocalization between Dcp-1 and the mitochondria. Boxes represent zoomed images. Bars: (main images) 5 µm; (zoomed images) 1.25 µm.(C) Western blot from l(2)mbn cells subjected to nutrient-rich or starvation conditions for 6 h. Cells were separated into cytosolic (C) and mitochondrial enriched (M) fractions.(D) Ovaries from fed w1118 flies were separated into cytosolic and membrane-enriched fractions and probed with antibodies to VDAC, Tubulin, ATPsyn-α, and Dcp-1.(E and F) Intact and lysed mitochondria (E) or intact mitochondria isolated from l(2)mbn cells (F) were treated with proteinase K (PK). The effects of proteinase K treatment were assessed by antibodies to VDAC, ATPsyn-α, Pink1, and Dcp-1.(E and F) Intact and lysed mitochondria (E) or intact mitochondria isolated from l(2)mbn cells (F) were treated with proteinase K (PK). The effects of proteinase K treatment were assessed by antibodies to VDAC, ATPsyn-α, Pink1, and Dcp-1.(G) Control and Dcp-1 RNAi-treated cells were subjected to nutrient-rich or starvation conditions and stained with NAO. Mean fluorescence was measured by flow cytometry. Graph represents ± SEM of three independent experiments (n = 3)."}
{"words": ["Figure", "5", ".", "(", "A", ")", "l", "(", "2", ")", "mbn", "cells", "were", "labeled", "with", "the", "ATPsyn", "-", "α", ",", "and", "mitochondrial", "morphology", "was", "scored", "as", "fragmented", ",", "normal", ",", "or", "elongated", ".", "(", "B", ")", "Cells", "were", "treated", "with", "control", "or", "Dcp", "-", "1", "dsRNA", "and", "subjected", "to", "nutrient", "-", "rich", "media", "or", "1", "h", "of", "starvation", ".", "Quantifications", "represent", "the", "percentage", "of", "cells", "with", "elongated", "mitochondria", "divided", "by", "the", "total", "number", "of", "cells", "examined", ".", "At", "least", "100", "cells", "were", "examined", "manually", "in", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "mean", "±", "SD", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "a", "Bonferroni", "post", "test", "(", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "(", "C", ")", "Mitochondrial", "targeted", "GFP", "(", "mitoGFP", ")", "was", "expressed", "in", "the", "germline", "using", "the", "nosGAL4", "driver", ".", "Staining", "shows", "mitoGFP", ",", "Armadillo", ",", "and", "DNA", ".", "(", "D", ")", "Mitochondria", "were", "scored", "as", "healthy", "(", "H", ")", ",", "clustered", "(", "C", ")", ",", "or", "elongated", "and", "overly", "connected", "(", "E", ")", ".", "All", "of", "mitochondria", "from", "fed", "UASp", "-", "mitoGFP", "/", "+", ";", "nosGAL4", "/", "+", "flies", "were", "scored", "as", "healthy", ".", "n", "=", "15", "egg", "chambers", "manually", "scored", ".", "(", "E", ")", "mitoGFP", "was", "expressed", "in", "Dcp", "-", "1Prev1", "flies", "using", "the", "nosGAL4", "driver", ".", "(", "F", ")", "54", "%", "of", "egg", "chambers", "from", "UASp", "-", "mitoGFP", "/", "+", ";", "Dcp", "-", "1Prev1", "/", "Dcp", "-", "1Prev1", ";", "nosGAL4", "/", "+", "flies", "contained", "elongated", "mitochondria", ",", "39", "%", "contained", "mitochondria", "that", "were", "scored", "as", "healthy", ",", "and", "7", "%", "contained", "clustered", "mitochondria", ".", "n", "=", "28", "egg", "chambers", "manually", "scored", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5.(A) l(2)mbn cells were labeled with the ATPsyn-α, and mitochondrial morphology was scored as fragmented, normal, or elongated. (B) Cells were treated with control or Dcp-1 dsRNA and subjected to nutrient-rich media or 1 h of starvation. Quantifications represent the percentage of cells with elongated mitochondria divided by the total number of cells examined. At least 100 cells were examined manually in three independent experiments (n = 3). Error bars represent the mean ± SD. Statistical significance was determined using one-way ANOVA with a Bonferroni post test (*, P < 0.05; **, P < 0.01).(C) Mitochondrial targeted GFP (mitoGFP) was expressed in the germline using the nosGAL4 driver. Staining shows mitoGFP, Armadillo, and DNA. (D) Mitochondria were scored as healthy (H), clustered (C), or elongated and overly connected (E). All of mitochondria from fed UASp-mitoGFP/+;nosGAL4/+ flies were scored as healthy. n = 15 egg chambers manually scored. (E) mitoGFP was expressed in Dcp-1Prev1 flies using the nosGAL4 driver. (F) 54% of egg chambers from UASp-mitoGFP/+;Dcp-1Prev1/Dcp-1Prev1;nosGAL4/+ flies contained elongated mitochondria, 39% contained mitochondria that were scored as healthy, and 7% contained clustered mitochondria. n = 28 egg chambers manually scored."}
{"words": ["Figure", "6", ".", "(", "A", ")", "Total", "cellular", "ATP", "levels", "were", "measured", "in", "l", "(", "2", ")", "mbn", "cells", "treated", "with", "control", "or", "Dcp", "-", "1", "dsRNA", ".", "Data", "represent", "±", "SEM", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "using", "a", "two", "-", "tailed", "Students", "t", "test", "(", "*", ",", "P", "=", "0", ".", "02", ")", ".", "(", "B", ")", "Total", "cellular", "ATP", "levels", "were", "measured", "in", "ovaries", "from", "fed", "or", "starved", "w1118", "and", "Dcp", "-", "1Prev1", "flies", ".", "Data", "represent", "±", "SEM", "of", "five", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "using", "a", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", "(", "*", "*", ",", "P", "=", "0", ".", "014", ";", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "(", "C", ")", "Fed", "or", "starved", "w1118", "and", "Dcp", "-", "1Prev1", "flies", "were", "treated", "with", "DMSO", "or", "25", "µg", "/", "ml", "oligomycin", "A", ",", "and", "Ref", "(", "2", ")", "P", "levels", "were", "assessed", "by", "immunoblot", "analysis", ".", "Actin", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "Densitometry", "was", "performed", "to", "quantitate", "protein", "levels", "relative", "to", "actin", ".", "Graph", "represents", "±", "SD", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "using", "a", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", "(", "*", ",", "P", "=", "0", ".", "02", ")", ".", "(", "D", "and", "E", ")", "Control", "UASp", "-", "GFP", "-", "mCherry", "-", "DrAtg8a", "/", "+", ";", "nosGAL4", "/", "+", "flies", "(", "D", ")", "and", "Dcp", "-", "1Prev1", "/", "Dcp", "-", "1Prev1", ";", "UASp", "-", "GFP", "-", "mCherry", "-", "DrAtg8a", "/", "nosGAL4", "flies", "(", "E", ")", "were", "subjected", "to", "starvation", "conditions", "supplemented", "with", "DMSO", "or", "25", "µg", "/", "ml", "oligomycin", "A", ".", "Bars", ",", "25", "µm", ".", "Quantifications", "show", "percentage", "of", "autolysosomes", "(", "autolysosomes", "/", "total", "autophagic", "structures", ")", ".", "At", "least", "eight", "egg", "chambers", "were", "manually", "quantitated", "per", "genotype", "per", "condition", "(", "n", "=", "8", ")", ".", "Statistical", "testing", "was", "determined", "using", "a", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "*", "*", "*", ",", "P", "=", "0", ".", "0002", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6.(A) Total cellular ATP levels were measured in l(2)mbn cells treated with control or Dcp-1 dsRNA. Data represent ± SEM of three independent experiments (n = 3). Statistical significance was determined using a two-tailed Students t test (*, P = 0.02).(B) Total cellular ATP levels were measured in ovaries from fed or starved w1118 and Dcp-1Prev1 flies. Data represent ± SEM of five independent experiments (n = 5). Statistical significance was determined using a two-tailed Student's t test (**, P = 0.014; ***, P < 0.001).(C) Fed or starved w1118 and Dcp-1Prev1 flies were treated with DMSO or 25 µg/ml oligomycin A, and Ref(2)P levels were assessed by immunoblot analysis. Actin served as a loading control. Densitometry was performed to quantitate protein levels relative to actin. Graph represents ± SD from three independent experiments (n = 3). Statistical significance was determined using a two-tailed Student's t test (*, P = 0.02).(D and E) Control UASp-GFP-mCherry-DrAtg8a/+;nosGAL4/+ flies (D) and Dcp-1Prev1/Dcp-1Prev1;UASp-GFP-mCherry-DrAtg8a/nosGAL4 flies (E) were subjected to starvation conditions supplemented with DMSO or 25 µg/ml oligomycin A. Bars, 25 µm. Quantifications show percentage of autolysosomes (autolysosomes/total autophagic structures). At least eight egg chambers were manually quantitated per genotype per condition (n = 8). Statistical testing was determined using a two-tailed Student's t test. ***, P = 0.0002."}
{"words": ["Figure", "7", ".", "(", "A", ")", "A", "representative", "Western", "blot", "showing", "SesB", "and", "ATPsyn", "-", "α", "levels", "from", "fed", "or", "starved", "l", "(", "2", ")", "mbn", "cells", "treated", "with", "control", "or", "Dcp", "-", "1", "RNAi", ".", "Actin", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "Densitometry", "was", "performed", "to", "quantitate", "protein", "levels", "relative", "to", "actin", ".", "Graphs", "represent", "±", "SD", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "using", "a", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", "(", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "(", "B", ")", "A", "representative", "Western", "blot", "of", "ovaries", "from", "fed", "or", "starved", "w1118", "or", "Dcp", "-", "1Prev1", "flies", ".", "SesB", "and", "ATPsyn", "-", "α", "were", "detected", "by", "immunoblotting", ".", "Actin", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "Densitometry", "was", "performed", "to", "quantitate", "protein", "levels", "relative", "to", "actin", ".", "Graphs", "represent", "±", "SD", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "using", "a", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", "(", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "(", "C", ")", "Purified", "catalytically", "active", "Dcp", "-", "1FL", ",", "but", "not", "catalytically", "inactive", "Dcp", "-", "1C", "<", "A", ",", "cleaved", "in", "vitro", "translated", "Drice", ".", "Cleavage", "of", "in", "vitro", "translated", "SesB", "was", "not", "detected", ".", "(", "D", ")", "V5", "-", "tagged", "Dcp", "-", "1C", "<", "A", "or", "V5", "vector", "only", "control", "was", "expressed", "in", "l", "(", "2", ")", "mbn", "cells", "and", "subjected", "to", "nutrient", "-", "full", "or", "starvation", "conditions", "for", "2", "h", ".", "After", "IP", "with", "anti", "-", "V5", "antibodies", ",", "lysates", "were", "separated", "by", "SDS", "-", "PAGE", ".", "Proteins", "were", "visualized", "with", "colloidal", "Coomassie", "stain", ".", "(", "E", ")", "FLAG", "-", "SesB", "or", "a", "vector", "only", "control", "was", "expressed", "in", "l", "(", "2", ")", "mbn", "cells", "and", "was", "immunoprecipitated", "with", "FLAG", "-", "agarose", ".", "Immunoblots", "show", "the", "interaction", "between", "FLAG", "-", "SesB", "and", "endogenous", "pro", "-", "Dcp", "-", "1", ".", "The", "asterisk", "represents", "a", "nonspecific", "band", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7.(A) A representative Western blot showing SesB and ATPsyn-α levels from fed or starved l(2)mbn cells treated with control or Dcp-1 RNAi. Actin served as a loading control. Densitometry was performed to quantitate protein levels relative to actin. Graphs represent ± SD from three independent experiments (n = 3). Statistical significance was determined using a two-tailed Student's t test (*, P < 0.05).(B) A representative Western blot of ovaries from fed or starved w1118 or Dcp-1Prev1 flies. SesB and ATPsyn-α were detected by immunoblotting. Actin served as a loading control. Densitometry was performed to quantitate protein levels relative to actin. Graphs represent ± SD from three independent experiments (n = 3). Statistical significance was determined using a two-tailed Student's t test (*, P < 0.05).(C) Purified catalytically active Dcp-1FL, but not catalytically inactive Dcp-1C<A, cleaved in vitro translated Drice. Cleavage of in vitro translated SesB was not detected.(D) V5-tagged Dcp-1C<A or V5 vector only control was expressed in l(2)mbn cells and subjected to nutrient-full or starvation conditions for 2 h. After IP with anti-V5 antibodies, lysates were separated by SDS-PAGE. Proteins were visualized with colloidal Coomassie stain.(E) FLAG-SesB or a vector only control was expressed in l(2)mbn cells and was immunoprecipitated with FLAG-agarose. Immunoblots show the interaction between FLAG-SesB and endogenous pro-Dcp-1. The asterisk represents a nonspecific band."}
{"words": ["Figure", "8", ".", "(", "A", ")", "Ovaries", "from", "fed", "SesBOrg", "flies", "show", "reduced", "Ref", "(", "2", ")", "P", "staining", "in", "degenerating", "midstage", "egg", "chamber", "(", "arrow", ")", ".", "(", "B", ")", "Ovaries", "from", "fed", "w1118", "and", "SesBOrg", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "using", "Ref", "(", "2", ")", "P", ".", "Actin", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "Results", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "C", ")", "SesBOrg", "flies", "expressing", "GFP", "-", "mCherry", "-", "DrAtg8a", "in", "the", "germline", "showed", "increased", "autophagosomes", "and", "autolysosomes", "in", "nondegenerating", "(", "left", ")", "and", "degenerating", "(", "right", ")", "midstage", "egg", "chambers", ".", "Insets", "show", "autophagosomes", "and", "autolysosomes", "(", "left", ")", "and", "autolysosomes", "(", "right", ")", "in", "SesBOrg", "midstage", "egg", "chambers", ".", "(", "D", ")", "Quantitation", "of", "percentages", "of", "autolysosomes", "(", "autolysosomes", "/", "total", "autophagic", "structures", ")", "in", "nondegenerating", "ovaries", "from", "fed", "w1118", "and", "SesBOrg", "flies", ".", "10", "egg", "chambers", "were", "manually", "examined", "per", "genotype", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "means", "±", "SD", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "using", "a", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", "(", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "0001", ")", ".", "(", "E", ")", "Degenerating", "midstage", "egg", "chambers", "(", "arrows", ")", "from", "fed", "SesBOrg", "flies", "are", "TUNEL", "positive", ".", "(", "F", ")", "Degenerating", "midstage", "egg", "chambers", "from", "starved", "control", "SesBOrg", "/", "FM7a", ";", "Dcp", "-", "1Prev1", "/", "Dcp", "-", "1Prev1flies", "contained", "persisting", "nurse", "cellnuclei", "and", "increased", "Ref", "(", "2", ")", "P", ".", "n", "=", "117", "ovarioles", "examined", ".", "Box", "represents", "zoomed", "image", ".", "(", "G", ")", "Degenerating", "midstage", "egg", "chambers", "from", "fed", "SesBOrg", ";", "Dcp", "-", "1Prev1flies", "contained", "condensed", "and", "fragmented", "nurse", "cellnuclei", "and", "low", "levels", "of", "Ref", "(", "2", ")", "P", ".", "Box", "represents", "zoomed", "image", ".", "n", "=", "156", "ovarioles", "examined", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8.(A) Ovaries from fed SesBOrg flies show reduced Ref(2)P staining in degenerating midstage egg chamber (arrow).(B) Ovaries from fed w1118 and SesBOrg were analyzed by Western blotting using Ref(2)P. Actin served as a loading control. Results are representative of three independent experiments (n = 3).(C) SesBOrg flies expressing GFP-mCherry-DrAtg8a in the germline showed increased autophagosomes and autolysosomes in nondegenerating (left) and degenerating (right) midstage egg chambers. Insets show autophagosomes and autolysosomes (left) and autolysosomes (right) in SesBOrg midstage egg chambers.(D) Quantitation of percentages of autolysosomes (autolysosomes/total autophagic structures) in nondegenerating ovaries from fed w1118 and SesBOrg flies. 10 egg chambers were manually examined per genotype. Error bars represent the means ± SD. Statistical significance was determined using a two-tailed Student's t test (***, P < 0.0001).(E) Degenerating midstage egg chambers (arrows) from fed SesBOrg flies are TUNEL positive.(F) Degenerating midstage egg chambers from starved control SesBOrg/FM7a;Dcp-1Prev1/Dcp-1Prev1flies contained persisting nurse cellnuclei and increased Ref(2)P. n = 117 ovarioles examined. Box represents zoomed image. (G) Degenerating midstage egg chambers from fed SesBOrg;Dcp-1Prev1flies contained condensed and fragmented nurse cellnuclei and low levels of Ref(2)P. Box represents zoomed image. n = 156 ovarioles examined."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "Immunoblotting", "and", "quantification", "of", "brown", "preadipocytes", "(", "WT", "-", "1", ")", "stimulated", "with", "insulin", "at", "different", "doses", "for", "5", "min", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "The", "molecular", "weight", "corresponded", "to", "the", "I", "-", "Afadin", "isoform", ".", "(", "C", ")", "Immunoblotting", "of", "mature", "brown", "adipocytes", "(", "WT", "-", "1", ")", "stimulated", "with", "insulin", "(", "100nM", ")", "for", "5", "min", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "(", "D", ")", "Immunoblotting", "of", "immortalized", "human", "mature", "white", "and", "brown", "adipocytes", "stimulated", "with", "insulin", "for", "5", "min", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "E", ")", "Immunoblotting", "and", "quantification", "of", "primary", "human", "mature", "white", "adipocytes", "stimulated", "with", "insulin", "for", "5", "min", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "F", ")", "Immunoblotting", "and", "quantification", "of", "isolated", "brown", "adipose", "tissue", "(", "BAT", ")", "from", "male", "C57BL", "/", "6J", "mice", "injected", "with", "5U", "insulin", "for", "5", "min", "(", "n", "=", "4", "-", "6", ")", ".", "(", "G", ")", "Quantification", "of", "immunoblotting", "of", "isolated", "BAT", ",", "subcutaneous", "white", "adipose", "tissue", "(", "sWAT", ")", "and", "visceral", "white", "adipose", "tissue", "(", "vWAT", ")", "from", "male", "C57BL", "/", "6J", "mice", "after", "fasting", "or", "re", "-", "feeding", "for", "2", "/", "6", "hrs", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "(", "H", ")", "Immunoblotting", "and", "quantification", "of", "total", "and", "Afadin", "S1795", "phosphorylation", "in", "adipose", "tissue", "depots", "from", "12", "-", "week", "old", "C57BL", "/", "6", "male", "mice", "fed", "with", "either", "chow", "(", "CD", ")", "or", "high", "-", "fat", "diet", "(", "HFD", ")", "for", "6", "-", "weeks", "injected", "with", "vehicle", "or", "insulin", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "(", "I", ")", "Immunoblotting", "and", "quantification", "of", "Afadin", "S1718", "phosphorylation", "in", "human", "Stromal", "vascular", "fractions", "(", "SVF", ")", "from", "lean", ",", "obese", "or", "Type", "2", "Diabetic", "(", "T2DM", ")", "subjects", "stimulated", "or", "not", "with", "insulin", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "Representative", "Western", "blots", "are", "shown", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "+", "SEM", ";", "Student", "'", "s", "unpaired", "t", "-", "test", "and", "ANOVA", "with", "Tukey", "or", "Dunnet", "'", "s", "post", "hoc", "test", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "NS", "=", "no", "significance", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B) Immunoblotting and quantification of brown preadipocytes (WT-1) stimulated with insulin at different doses for 5 min (n=3). The molecular weight corresponded to the I-Afadin isoform.(C) Immunoblotting of mature brown adipocytes (WT-1) stimulated with insulin (100nM) for 5 min (n=4).(D) Immunoblotting of immortalized human mature white and brown adipocytes stimulated with insulin for 5 min (n=3).(E) Immunoblotting and quantification of primary human mature white adipocytes stimulated with insulin for 5 min (n=3).(F) Immunoblotting and quantification of isolated brown adipose tissue (BAT) from male C57BL/6J mice injected with 5U insulin for 5 min (n=4-6).(G) Quantification of immunoblotting of isolated BAT, subcutaneous white adipose tissue (sWAT) and visceral white adipose tissue (vWAT) from male C57BL/6J mice after fasting or re-feeding for 2/6 hrs (n=6).(H) Immunoblotting and quantification of total and Afadin S1795 phosphorylation in adipose tissue depots from 12-week old C57BL/6 male mice fed with either chow (CD) or high-fat diet (HFD) for 6-weeks injected with vehicle or insulin (n=6).(I) Immunoblotting and quantification of Afadin S1718 phosphorylation in human Stromal vascular fractions (SVF) from lean, obese or Type 2 Diabetic (T2DM) subjects stimulated or not with insulin (n=6). Representative Western blots are shown. Data are presented as means + SEM; Student's unpaired t-test and ANOVA with Tukey or Dunnet's post hoc test: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, NS= no significance."}
{"words": ["Figure", "2Protein", "lysates", "from", "10", "-", "13", "-", "week", "old", "CTRL", "and", "FAKO", "(", "Mllt4", "-", "/", "-", ")", "mice", "following", "retro", "-", "orbital", "injection", "of", "insulin", "(", "1U", ")", "were", "immunoblotted", "and", "quantified", ".", "BAT", ";", "Immunoblotting", "of", "Afadin", "S1795", "phosphorylation", "(", "n", "=", "4", "-", "5", ")", ".", "Protein", "lysates", "from", "10", "-", "13", "-", "week", "old", "CTRL", "and", "FAKO", "(", "Mllt4", "-", "/", "-", ")", "mice", "following", "retro", "-", "orbital", "injection", "of", "insulin", "(", "1U", ")", "were", "immunoblotted", "and", "quantified", ".", "BAT", "quantification", "of", "Afadin", "S1795", "phosphorylation", "(", "n", "=", "4", "-", "5", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "+", "SEM", ";", "ANOVA", "with", "Tukey", "or", "Dunnet", "'", "s", "post", "hoc", "test", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "NS", "=", "no", "significance", ".", "Protein", "lysates", "from", "10", "-", "13", "-", "week", "old", "CTRL", "and", "FAKO", "(", "Mllt4", "-", "/", "-", ")", "mice", "following", "retro", "-", "orbital", "injection", "of", "insulin", "(", "1U", ")", "were", "immunoblotted", "and", "quantified", ".", "sWAT", ";", "Immunoblotting", "of", "Afadin", "S1795", "phosphorylation", "(", "n", "=", "4", "-", "5", ")", ".", "Protein", "lysates", "from", "10", "-", "13", "-", "week", "old", "CTRL", "and", "FAKO", "(", "Mllt4", "-", "/", "-", ")", "mice", "following", "retro", "-", "orbital", "injection", "of", "insulin", "(", "1U", ")", "were", "immunoblotted", "and", "quantified", ".", "sWAT", ";", "quantification", "of", "Afadin", "S1795", "phosphorylation", "(", "n", "=", "4", "-", "5", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "+", "SEM", ";", "ANOVA", "with", "Tukey", "or", "Dunnet", "'", "s", "post", "hoc", "test", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "NS", "=", "no", "significance", ".", "Protein", "lysates", "from", "10", "-", "13", "-", "week", "old", "CTRL", "and", "FAKO", "(", "Mllt4", "-", "/", "-", ")", "mice", "following", "retro", "-", "orbital", "injection", "of", "insulin", "(", "1U", ")", "were", "immunoblotted", "and", "quantified", ".", "Liver", ";", "Immunoblotting", "of", "Afadin", "S1795", "phosphorylation", "(", "n", "=", "4", "-", "5", ")", ".", "Protein", "lysates", "from", "10", "-", "13", "-", "week", "old", "CTRL", "and", "FAKO", "(", "Mllt4", "-", "/", "-", ")", "mice", "following", "retro", "-", "orbital", "injection", "of", "insulin", "(", "1U", ")", "were", "immunoblotted", "and", "quantified", ".", "Liver", "quantification", "of", "Afadin", "S1795", "phosphorylation", "(", "n", "=", "4", "-", "5", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "+", "SEM", ";", "ANOVA", "with", "Tukey", "or", "Dunnet", "'", "s", "post", "hoc", "test", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "NS", "=", "no", "significance", ".", "Protein", "lysates", "from", "10", "-", "13", "-", "week", "old", "CTRL", "and", "FAKO", "(", "Mllt4", "-", "/", "-", ")", "mice", "following", "retro", "-", "orbital", "injection", "of", "insulin", "(", "1U", ")", "were", "immunoblotted", "and", "quantified", ".", "(", "G", ")", "Quantifications", "of", "phosphorylated", "Insulin", "Receptor", "β", "and", "phosphorylated", "Akt", "across", "the", "three", "tissues", "(", "n", "=", "4", "-", "5", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "+", "SEM", ";", "ANOVA", "with", "Tukey", "or", "Dunnet", "'", "s", "post", "hoc", "test", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "NS", "=", "no", "significance", ".", "Protein", "lysates", "from", "10", "-", "13", "-", "week", "old", "CTRL", "and", "FAKO", "(", "Mllt4", "-", "/", "-", ")", "mice", "following", "retro", "-", "orbital", "injection", "of", "insulin", "(", "1U", ")", "were", "immunoblotted", "and", "quantified", ".", "(", "H", ")", "Quantifications", "of", "Total", "IRβ", "/", "tubulin", "in", "BAT", ",", "sWAT", "and", "Liver", "(", "n", "=", "5", "-", "6", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "+", "SEM", ";", "ANOVA", "with", "Tukey", "or", "Dunnet", "'", "s", "post", "hoc", "test", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "NS", "=", "no", "significance", ".", "Protein", "lysates", "from", "10", "-", "13", "-", "week", "old", "CTRL", "and", "FAKO", "(", "Mllt4", "-", "/", "-", ")", "mice", "following", "retro", "-", "orbital", "injection", "of", "insulin", "(", "1U", ")", "were", "immunoblotted", "and", "quantified", ".", "(", "I", ")", "Insulin", "-", "induced", "lipogenesis", "in", "isolated", "mature", "adipocytes", "from", "CTRL", "and", "FAKO", "(", "Mllt4", "-", "/", "-", ")", "mice", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "+", "SEM", ";", "ANOVA", "with", "Tukey", "or", "Dunnet", "'", "s", "post", "hoc", "test", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "NS", "=", "no", "significance", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Protein lysates from 10-13-week old CTRL and FAKO (Mllt4-/-) mice following retro-orbital injection of insulin (1U) were immunoblotted and quantified. BAT; Immunoblotting of Afadin S1795 phosphorylation (n=4-5).Protein lysates from 10-13-week old CTRL and FAKO (Mllt4-/-) mice following retro-orbital injection of insulin (1U) were immunoblotted and quantified. BAT quantification of Afadin S1795 phosphorylation (n=4-5). Data are presented as means + SEM; ANOVA with Tukey or Dunnet's post hoc test: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, NS= no significance.Protein lysates from 10-13-week old CTRL and FAKO (Mllt4-/-) mice following retro-orbital injection of insulin (1U) were immunoblotted and quantified. sWAT; Immunoblotting of Afadin S1795 phosphorylation (n=4-5).Protein lysates from 10-13-week old CTRL and FAKO (Mllt4-/-) mice following retro-orbital injection of insulin (1U) were immunoblotted and quantified. sWAT; quantification of Afadin S1795 phosphorylation (n=4-5). Data are presented as means + SEM; ANOVA with Tukey or Dunnet's post hoc test: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, NS= no significance.Protein lysates from 10-13-week old CTRL and FAKO (Mllt4-/-) mice following retro-orbital injection of insulin (1U) were immunoblotted and quantified. Liver; Immunoblotting of Afadin S1795 phosphorylation (n=4-5).Protein lysates from 10-13-week old CTRL and FAKO (Mllt4-/-) mice following retro-orbital injection of insulin (1U) were immunoblotted and quantified. Liver quantification of Afadin S1795 phosphorylation (n=4-5). Data are presented as means + SEM; ANOVA with Tukey or Dunnet's post hoc test: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, NS= no significance.Protein lysates from 10-13-week old CTRL and FAKO (Mllt4-/-) mice following retro-orbital injection of insulin (1U) were immunoblotted and quantified. (G) Quantifications of phosphorylated Insulin Receptor β and phosphorylated Akt across the three tissues (n=4-5). Data are presented as means + SEM; ANOVA with Tukey or Dunnet's post hoc test: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, NS= no significance.Protein lysates from 10-13-week old CTRL and FAKO (Mllt4-/-) mice following retro-orbital injection of insulin (1U) were immunoblotted and quantified. (H) Quantifications of Total IRβ/tubulin in BAT, sWAT and Liver (n=5-6). Data are presented as means + SEM; ANOVA with Tukey or Dunnet's post hoc test: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, NS= no significance.Protein lysates from 10-13-week old CTRL and FAKO (Mllt4-/-) mice following retro-orbital injection of insulin (1U) were immunoblotted and quantified. (I) Insulin-induced lipogenesis in isolated mature adipocytes from CTRL and FAKO (Mllt4-/-) mice (n=5). Data are presented as means + SEM; ANOVA with Tukey or Dunnet's post hoc test: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, NS= no significance."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "CRISPR", "/", "nCas9", "-", "mediated", "ablation", "of", "Afadin", "protein", "levels", "in", "a", "clonal", "cell", "population", "termed", "Afdn", "-", "KO", ".", "(", "B", ")", "Oil", "red", "O", "staining", "and", "gene", "expression", "of", "selected", "adipogenic", "genes", "in", "WT", "-", "1", "and", "Afdn", "-", "KO", "differentiated", "adipocytes", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "+", "SEM", ";", "Student", "'", "s", "unpaired", "t", "-", "test", "and", "ANOVA", "with", "Tukey", "or", "Dunnet", "'", "s", "post", "hoc", "test", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "NS", "=", "no", "significance", ".", "(", "C", ")", "Wild", "-", "type", ",", "Afdn", "-", "KO", "and", "Afdn", "-", "KO", "with", "re", "-", "expression", "FLAG", "-", "tagged", "WT", "I", "-", "Afadin", "or", "a", "non", "-", "phosphorylable", "form", "(", "S1795A", ")", "stimulated", "with", "vehicle", "or", "insulin", "(", "n", "=", "4", ")", "for", "Immunoblotting", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "insulin", "-", "induced", "Akt", "phosphorylation", "from", "immunoblots", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "+", "SEM", ";", "Student", "'", "s", "unpaired", "t", "-", "test", "and", "ANOVA", "with", "Tukey", "or", "Dunnet", "'", "s", "post", "hoc", "test", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "NS", "=", "no", "significance", ".", "(", "E", ")", "Real", "-", "time", "measurement", "and", "(", "F", ")", "quantification", "of", "insulin", "-", "induced", "fatty", "-", "acid", "uptake", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Representative", "Western", "blots", "are", "shown", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "+", "SEM", ";", "Student", "'", "s", "unpaired", "t", "-", "test", "and", "ANOVA", "with", "Tukey", "or", "Dunnet", "'", "s", "post", "hoc", "test", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "NS", "=", "no", "significance", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) CRISPR/nCas9-mediated ablation of Afadin protein levels in a clonal cell population termed Afdn-KO.(B) Oil red O staining and gene expression of selected adipogenic genes in WT-1 and Afdn-KO differentiated adipocytes (n=3). Data are presented as means + SEM; Student's unpaired t-test and ANOVA with Tukey or Dunnet's post hoc test: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, NS= no significance.(C) Wild-type, Afdn-KO and Afdn-KO with re-expression FLAG-tagged WT I-Afadin or a non-phosphorylable form (S1795A) stimulated with vehicle or insulin (n=4) for Immunoblotting.(D) Quantification of insulin-induced Akt phosphorylation from immunoblots. Data are presented as means + SEM; Student's unpaired t-test and ANOVA with Tukey or Dunnet's post hoc test: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, NS= no significance.(E) Real-time measurement and (F) quantification of insulin-induced fatty-acid uptake (n=4). Representative Western blots are shown. Data are presented as means + SEM; Student's unpaired t-test and ANOVA with Tukey or Dunnet's post hoc test: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, NS= no significance."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "C", ")", "Acetylated", "α", "-", "tubulin", "levels", "in", "cell", "lines", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "+", "SEM", ";", "Student", "'", "s", "unpaired", "t", "-", "test", "and", "ANOVA", "with", "Tukey", "or", "Dunnet", "'", "s", "post", "hoc", "test", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "NS", "=", "no", "significance", ".", "(", "D", ")", "Acetylated", "α", "-", "tubulin", "levels", "in", "isolated", "mature", "adipocytes", "from", "CTRL", "and", "FAKO", "(", "Mllt4", "-", "/", "-", ")", "mice", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "+", "SEM", ";", "Student", "'", "s", "unpaired", "t", "-", "test", "and", "ANOVA", "with", "Tukey", "or", "Dunnet", "'", "s", "post", "hoc", "test", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "NS", "=", "no", "significance", ".", "(", "E", ")", "IR", "abundance", "measured", "by", "immunoblotting", "following", "4", "hours", "pre", "-", "incubation", "with", "the", "HDAC6", "inhibitor", "(", "Tubastatin", "A", ")", "in", "differentiated", "adipocytes", "exposed", "to", "insulin", "(", "100nM", ")", "stimulation", "for", "15", "min", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "+", "SEM", ";", "Student", "'", "s", "unpaired", "t", "-", "test", "and", "ANOVA", "with", "Tukey", "or", "Dunnet", "'", "s", "post", "hoc", "test", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "NS", "=", "no", "significance", ".", "(", "F", ")", "Immunolocalization", "of", "IR", "(", "green", ")", "and", "HDAC6", "(", "red", ")", "in", "Afdn", "-", "KO", "and", "Afdn", "-", "KO", "with", "re", "-", "expression", "FLAG", "-", "tagged", "WT", "Afadin", "or", "S1795A", "Afadin", "in", "mature", "adipocytes", "stimulated", "with", "insulin", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Co", "-", "localization", "was", "detected", "by", "the", "appearance", "of", "white", "pixels", "where", "the", "red", "and", "green", "overlap", ".", "Scale", "bars", ":", "25", " ", "µm", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "The", "ratio", "of", "IR", "co", "-", "localized", "with", "HDAC6", "(", "Mandler", "'", "s", "co", "-", "localization", "coefficient", ")", "was", "quantified", "(", "98", "-", "112", "individual", "cells", "from", "two", "independent", "experiments", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "+", "SEM", ";", "Student", "'", "s", "unpaired", "t", "-", "test", "and", "ANOVA", "with", "Tukey", "or", "Dunnet", "'", "s", "post", "hoc", "test", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "NS", "=", "no", "significance", ".", "(", "G", ")", "Immunoprecipitation", "of", "IR", "followed", "by", "immunoblotting", "using", "an", "anti", "-", "acetyl", "-", "Lys", "antibody", "in", "adipocytes", "lacking", "Afadin", "or", "re", "-", "expressing", "Afadin", ",", "with", "or", "without", "insulin", "stimulation", "(", "n", "=", "1", ")", ".", "Representative", "Western", "blots", "are", "shown", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "+", "SEM", ";", "Student", "'", "s", "unpaired", "t", "-", "test", "and", "ANOVA", "with", "Tukey", "or", "Dunnet", "'", "s", "post", "hoc", "test", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "NS", "=", "no", "significance", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(C) Acetylated α-tubulin levels in cell lines (n=3). Data are presented as means + SEM; Student's unpaired t-test and ANOVA with Tukey or Dunnet's post hoc test: *p<0.05, **p<0.01, NS= no significance.(D) Acetylated α-tubulin levels in isolated mature adipocytes from CTRL and FAKO (Mllt4-/-) mice (n=4). Data are presented as means + SEM; Student's unpaired t-test and ANOVA with Tukey or Dunnet's post hoc test: *p<0.05, **p<0.01, NS= no significance.(E) IR abundance measured by immunoblotting following 4 hours pre-incubation with the HDAC6 inhibitor (Tubastatin A) in differentiated adipocytes exposed to insulin (100nM) stimulation for 15 min (n=4). Data are presented as means + SEM; Student's unpaired t-test and ANOVA with Tukey or Dunnet's post hoc test: *p<0.05, **p<0.01, NS= no significance.(F) Immunolocalization of IR (green) and HDAC6 (red) in Afdn-KO and Afdn-KO with re-expression FLAG-tagged WT Afadin or S1795A Afadin in mature adipocytes stimulated with insulin. Nuclei were stained with DAPI (blue). Co-localization was detected by the appearance of white pixels where the red and green overlap. Scale bars: 25 µm. Representative images are shown. The ratio of IR co-localized with HDAC6 (Mandler's co-localization coefficient) was quantified (98-112 individual cells from two independent experiments). Data are presented as means + SEM; Student's unpaired t-test and ANOVA with Tukey or Dunnet's post hoc test: *p<0.05, **p<0.01, NS= no significance.(G) Immunoprecipitation of IR followed by immunoblotting using an anti-acetyl-Lys antibody in adipocytes lacking Afadin or re-expressing Afadin, with or without insulin stimulation (n=1). Representative Western blots are shown. Data are presented as means + SEM; Student's unpaired t-test and ANOVA with Tukey or Dunnet's post hoc test: *p<0.05, **p<0.01, NS= no significance."}
{"words": ["Figure", "5Seven", "-", "week", "old", "CTRL", "and", "FAKO", "(", "Mllt4", "-", "/", "-", ")", "mice", "were", "given", "control", "diet", "(", "CD", ")", "or", "high", "-", "fat", "diet", "(", "HFD", ")", "for", "16", "weeks", "(", "n", "=", "5", "-", "6", ")", ".", "(", "A", ")", "Body", "weight", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "+", "SEM", ";", "ANOVA", "with", "Tukey", "or", "Dunnet", "'", "s", "post", "hoc", "test", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "NS", "=", "no", "significance", ".", "Seven", "-", "week", "old", "CTRL", "and", "FAKO", "(", "Mllt4", "-", "/", "-", ")", "mice", "were", "given", "control", "diet", "(", "CD", ")", "or", "high", "-", "fat", "diet", "(", "HFD", ")", "for", "16", "weeks", "(", "n", "=", "5", "-", "6", ")", ".", "(", "B", ")", "Body", "composition", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "+", "SEM", ";", "ANOVA", "with", "Tukey", "or", "Dunnet", "'", "s", "post", "hoc", "test", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "NS", "=", "no", "significance", ".", "Seven", "-", "week", "old", "CTRL", "and", "FAKO", "(", "Mllt4", "-", "/", "-", ")", "mice", "were", "given", "control", "diet", "(", "CD", ")", "or", "high", "-", "fat", "diet", "(", "HFD", ")", "for", "16", "weeks", "(", "n", "=", "5", "-", "6", ")", ".", "(", "C", ")", "Sirius", "Red", "staining", "of", "representative", "embedded", "BAT", ",", "sWAT", "and", "vWAT", "from", "mice", "on", "HFD", "and", "quantification", "of", "adipocyte", "areas", "(", "~", "1000", "adipocytes", "/", "genotype", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "+", "SEM", ";", "ANOVA", "with", "Tukey", "or", "Dunnet", "'", "s", "post", "hoc", "test", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "NS", "=", "no", "significance", ".", "Seven", "-", "week", "old", "CTRL", "and", "FAKO", "(", "Mllt4", "-", "/", "-", ")", "mice", "were", "given", "control", "diet", "(", "CD", ")", "or", "high", "-", "fat", "diet", "(", "HFD", ")", "for", "16", "weeks", "(", "n", "=", "5", "-", "6", ")", ".", "(", "D", ")", "IPGTT", "after", "12", "weeks", "of", "diet", "and", "AUC", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "+", "SEM", ";", "ANOVA", "with", "Tukey", "or", "Dunnet", "'", "s", "post", "hoc", "test", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "NS", "=", "no", "significance", ".", "Seven", "-", "week", "old", "CTRL", "and", "FAKO", "(", "Mllt4", "-", "/", "-", ")", "mice", "were", "given", "control", "diet", "(", "CD", ")", "or", "high", "-", "fat", "diet", "(", "HFD", ")", "for", "16", "weeks", "(", "n", "=", "5", "-", "6", ")", ".", "(", "E", ")", "ITT", "after", "13", "weeks", "of", "diet", "and", "AUC", "Data", "are", "presented", "as", "means", "+", "SEM", ";", "ANOVA", "with", "Tukey", "or", "Dunnet", "'", "s", "post", "hoc", "test", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "NS", "=", "no", "significance", ".", "Seven", "-", "week", "old", "CTRL", "and", "FAKO", "(", "Mllt4", "-", "/", "-", ")", "mice", "were", "given", "high", "-", "fat", "diet", "(", "HFD", ")", "for", "16", "weeks", "(", "n", "=", "5", "-", "6", ")", ".", "(", "F", ")", "normalized", "to", "basal", "insulin", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "+", "SEM", ";", "ANOVA", "with", "Tukey", "or", "Dunnet", "'", "s", "post", "hoc", "test", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "NS", "=", "no", "significance", ".", "Seven", "-", "week", "old", "CTRL", "and", "FAKO", "(", "Mllt4", "-", "/", "-", ")", "mice", "were", "given", "control", "diet", "(", "CD", ")", "or", "high", "-", "fat", "diet", "(", "HFD", ")", "for", "16", "weeks", "(", "n", "=", "5", "-", "6", ")", ".", "(", "G", ")", "Plasma", "insulin", "levels", "5", "min", "after", "an", "IPGTT", "performed", "after", "18", "weeks", "of", "diet", ".", "Data", "are", "presented", "as", "means", "+", "SEM", ";", "ANOVA", "with", "Tukey", "or", "Dunnet", "'", "s", "post", "hoc", "test", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "NS", "=", "no", "significance", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Seven-week old CTRL and FAKO (Mllt4-/-) mice were given control diet (CD) or high-fat diet (HFD) for 16 weeks (n=5-6). (A) Body weight. Data are presented as means + SEM; ANOVA with Tukey or Dunnet's post hoc test: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, NS= no significance.Seven-week old CTRL and FAKO (Mllt4-/-) mice were given control diet (CD) or high-fat diet (HFD) for 16 weeks (n=5-6). (B) Body composition. Data are presented as means + SEM; ANOVA with Tukey or Dunnet's post hoc test: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, NS= no significance.Seven-week old CTRL and FAKO (Mllt4-/-) mice were given control diet (CD) or high-fat diet (HFD) for 16 weeks (n=5-6). (C) Sirius Red staining of representative embedded BAT, sWAT and vWAT from mice on HFD and quantification of adipocyte areas (~1000 adipocytes/genotype). Data are presented as means + SEM; ANOVA with Tukey or Dunnet's post hoc test: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, NS= no significance.Seven-week old CTRL and FAKO (Mllt4-/-) mice were given control diet (CD) or high-fat diet (HFD) for 16 weeks (n=5-6). (D) IPGTT after 12 weeks of diet and AUC. Data are presented as means + SEM; ANOVA with Tukey or Dunnet's post hoc test: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, NS= no significance.Seven-week old CTRL and FAKO (Mllt4-/-) mice were given control diet (CD) or high-fat diet (HFD) for 16 weeks (n=5-6). (E) ITT after 13 weeks of diet and AUC Data are presented as means + SEM; ANOVA with Tukey or Dunnet's post hoc test: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, NS= no significance.Seven-week old CTRL and FAKO (Mllt4-/-) mice were given high-fat diet (HFD) for 16 weeks (n=5-6). (F) normalized to basal insulin. Data are presented as means + SEM; ANOVA with Tukey or Dunnet's post hoc test: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, NS= no significance.Seven-week old CTRL and FAKO (Mllt4-/-) mice were given control diet (CD) or high-fat diet (HFD) for 16 weeks (n=5-6). (G) Plasma insulin levels 5 min after an IPGTT performed after 18 weeks of diet. Data are presented as means + SEM; ANOVA with Tukey or Dunnet's post hoc test: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, NS= no significance."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "C", ")", "Temporal", "analysis", "of", "antigen", "-", "specific", "CD8", "+", "T", "cell", "responses", ".", "Peripheral", "blood", "was", "obtained", "on", "days", "4", ",", "7", ",", "14", ",", "21", ",", "42", "and", "88", "post", "-", "immunisation", "with", "WT", "(", "triangles", ";", "n", "=", "3", "-", "9", ")", ",", "CSPSIINFEKL", "(", "orange", "squares", ";", "n", "=", "4", "-", "8", ")", "or", "UIS4SIINFEKL", "(", "blue", "circles", ";", "n", "=", "4", "-", "10", ")", "sporozoites", ",", "or", "no", "parasites", "(", "diamonds", ";", "n", "=", "2", "-", "5", ")", "and", "stained", "for", "Kb", "-", "SIINFEKL", "+", "CD11ahi", "CD8", "+", "T", "cells", ".", "Line", "graph", "shows", "mean", "values", "(", "±", "SEM", ")", "from", "representative", "experiments", ".", "(", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "Welch", "'", "s", "t", "-", "test", "comparing", "CSPSIINFEKL", "and", "UIS4SIINFEKL", ")", ".", "See", "Appendix", "Table", "S1", "for", "the", "number", "of", "mice", "used", "per", "timepoint", "and", "per", "group", ".", "See", "Appendix", "Table", "S4", "for", "exact", "p", "-", "values", ".", "(", "D", "-", "H", ")", "C57BL", "/", "6", "mice", "(", "n", "=", "4", "per", "group", ")", ",", "which", "received", "2x106", "CFSE", "-", "labelled", "OT", "-", "I", "splenocytes", ",", "were", "immunised", "with", "10", ",", "000", "γ", "-", "radiation", "attenuated", "WT", ",", "CSPSIINFEKL", "or", "UIS4SIINFEKL", "sporozoites", "intravenously", ".", "5", "days", "later", ",", "mice", "were", "sacrificed", ",", "spleens", "harvested", "and", "splenocytes", "assessed", "for", "(", "D", ")", "CFSE", "dilution", "of", "CD8", "+", "T", "cells", ",", "(", "E", ")", "CFSE", "dilution", "of", "antigen", "experienced", "Kb", "-", "SIINFEKL", "+", "CD11ahi", "CD8", "+", "T", "cells", "and", "stained", "ex", "vivo", "(", "F", "-", "H", ")", "for", "effector", "CD8", "+", "T", "cell", "surface", "markers", ".", "Shown", "are", "flow", "cytometry", "plots", "of", "Kb", "-", "SIINFEKL", "co", "-", "staining", "with", "markers", "of", "effector", "phenotypes", ":", "(", "F", ")", "CD11ahi", ",", "(", "G", ")", "CD62Llo", "and", "(", "H", ")", "CD49dhi", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(C) Temporal analysis of antigen-specific CD8+ T cell responses. Peripheral blood was obtained on days 4, 7, 14, 21, 42 and 88 post-immunisation with WT (triangles; n=3-9), CSPSIINFEKL (orange squares; n=4-8) or UIS4SIINFEKL (blue circles; n=4-10) sporozoites, or no parasites (diamonds; n=2-5) and stained for Kb-SIINFEKL+ CD11ahi CD8+ T cells. Line graph shows mean values (±SEM) from representative experiments. (*, p<0.05; **, p<0.01; ***, p<0.001; Welch's t-test comparing CSPSIINFEKL and UIS4SIINFEKL). See Appendix Table S1 for the number of mice used per timepoint and per group. See Appendix Table S4 for exact p-values.(D-H) C57BL/6 mice (n=4 per group), which received 2x106 CFSE-labelled OT-I splenocytes, were immunised with 10,000 γ-radiation attenuated WT, CSPSIINFEKL or UIS4SIINFEKL sporozoites intravenously. 5 days later, mice were sacrificed, spleens harvested and splenocytes assessed for (D) CFSE dilution of CD8+ T cells, (E) CFSE dilution of antigen experienced Kb-SIINFEKL+ CD11ahi CD8+ T cells and stained ex vivo (F-H) for effector CD8+ T cell surface markers. Shown are flow cytometry plots of Kb-SIINFEKL co-staining with markers of effector phenotypes: (F) CD11ahi, (G) CD62Llo and (H) CD49dhi."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", "Proportions", "and", "numbers", "of", "(", "B", "-", "Kb", "-", "SIINFEKL", "+", "CD8", "+", "T", "cells", "were", "enumerated", ",", "or", "(", "E", "-", "IFN", "-", "γ", "-", "secreting", "CD8", "+", "T", "cells", "following", "restimulation", "ex", "vivo", "with", "SIINFEKL", "peptide", "were", "quantified", ".", "Flow", "cytometry", "plots", "show", "representative", "percentages", "of", "CD8", "+", "T", "cells", "co", "-", "stained", "with", "CD11a", "and", "(", "B", ")", "Kb", "-", "SIINFEKL", "or", "(", "E", ")", "IFN", "-", "γ", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(B Proportions and numbers of (B- Kb-SIINFEKL+ CD8+ T cells were enumerated, or (E- IFN-γ-secreting CD8+ T cells following restimulation ex vivo with SIINFEKL peptide were quantified. Flow cytometry plots show representative percentages of CD8+ T cells co-stained with CD11a and (B) Kb-SIINFEKL or (E) IFN-γ."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "B", "-", "C57BL", "/", "6", "mice", "received", "10", ",", "000", "γ", "-", "radiation", "attenuated", "WT", ",", "CSPSIINFEKL", "or", "UIS4SIINFEKL", "sporozoites", ",", "either", "intravenously", "(", "n", "=", "6", "-", "8", "mice", "per", "group", ")", "or", "(", "E", "-", "intradermally", "(", "n", "=", "4", "mice", "per", "group", ")", ".", "Additional", "control", "mice", "did", "not", "receive", "sporozoites", "(", "n", "=", "6", "-", "8", "intravenously", ",", "n", "=", "4", "intradermally", ")", ".", "Spleens", "and", "livers", "were", "harvested", "either", "at", "day", "14", "(", "n", "=", "5", "livers", "and", "n", "=", "6", "spleens", "for", "intravenous", "immunisation", ")", "or", "day", "42", "(", "n", "=", "8", "for", "intravenous", "immunisation", ")", ",", "and", "IFN", "-", "γ", "-", "secreting", "lymphocytes", "following", "restimulation", "ex", "vivo", "with", "SIINFEKL", "peptide", "were", "quantified", ".", "Flow", "cytometry", "plots", "show", "representative", "percentages", "of", "CD8", "+", "T", "cells", "co", "-", "stained", "with", "IFN", "-", "γ", "and", "CD11a", "(", "B", ",", "E", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(B- C57BL/6 mice received 10,000 γ-radiation attenuated WT, CSPSIINFEKL or UIS4SIINFEKL sporozoites, either intravenously (n=6-8 mice per group) or (E- intradermally (n=4 mice per group). Additional control mice did not receive sporozoites (n=6-8 intravenously, n=4 intradermally). Spleens and livers were harvested either at day 14 (n=5 livers and n=6 spleens for intravenous immunisation) or day 42 (n=8 for intravenous immunisation), and IFN-γ-secreting lymphocytes following restimulation ex vivo with SIINFEKL peptide were quantified. Flow cytometry plots show representative percentages of CD8+ T cells co-stained with IFN-γ and CD11a (B, E)."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "C", ")", "The", "upper", "panel", "of", "bar", "charts", "show", "the", "percentage", "of", "CD11ahi", "IFN", "-", "γ", "+", "CD8", "+", "T", "cells", "and", "the", "lower", "panel", "the", "absolute", "cell", "counts", ".", "Bar", "charts", "show", "mean", "values", "(", "±", "SEM", ")", "from", "representative", "experiments", "(", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ")", ".", "See", "Appendix", "Table", "S4", "for", "exact", "p", "-", "values", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(C) The upper panel of bar charts show the percentage of CD11ahi IFN-γ+ CD8+ T cells and the lower panel the absolute cell counts. Bar charts show mean values (±SEM) from representative experiments (***, p<0.001; one-way ANOVA with Tukey's multiple comparison test). See Appendix Table S4 for exact p-values."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "B", ",", "C", ")", "Flow", "cytometry", "(", "B", ")", "and", "scatter", "plots", "(", "C", ")", "represent", "CD8", "+", "T", "cells", "derived", "from", "peripheral", "blood", "co", "-", "stained", "with", "IFN", "-", "γ", "and", "CD11a", ",", "following", "ex", "vivo", "restimulation", "with", "SIINFEKL", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "two", "experiments", "performed", "with", "scatter", "plots", "showing", "mean", "values", "(", "±", "SEM", ")", ".", "(", "D", ")", "Protective", "efficacy", "as", "measured", "by", "quantitative", "real", "-", "time", "PCR", ".", "Groups", "of", "mice", "were", "vaccinated", "as", "described", "and", "challenged", "19", "days", "later", "with", "10", ",", "000", "WT", "(", "n", "=", "7", "non", "-", "vaccinated", ",", "n", "=", "9", "vaccinated", ")", ",", "CSPSIINFEKL", "(", "n", "=", "6", "non", "-", "vaccinated", ",", "n", "=", "4", "vaccinated", ")", "or", "UIS4SIINFEKL", "sporozoites", "(", "n", "=", "3", "non", "-", "vaccinated", ",", "n", "=", "11", "vaccinated", ")", ".", "42", "hours", "later", "livers", "were", "removed", ",", "and", "parasite", "load", "was", "assessed", "by", "qPCR", ".", "Plots", "show", "the", "relative", "parasite", "load", "of", "mice", "in", "each", "condition", "(", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ")", ".", "See", "Appendix", "Table", "S4", "for", "exact", "p", "-", "values", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "representative", "of", "two", "experiments", "performed", "with", "scatter", "plots", "showing", "mean", "values", "(", "±", "SEM", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(B, C) Flow cytometry (B) and scatter plots (C) represent CD8+ T cells derived from peripheral blood co-stained with IFN-γ and CD11a, following ex vivo restimulation with SIINFEKL. Data information: Data are representative of two experiments performed with scatter plots showing mean values (±SEM).(D) Protective efficacy as measured by quantitative real-time PCR. Groups of mice were vaccinated as described and challenged 19 days later with 10,000 WT (n=7 non-vaccinated, n=9 vaccinated), CSPSIINFEKL (n=6 non-vaccinated, n=4 vaccinated) or UIS4SIINFEKL sporozoites (n=3 non-vaccinated, n=11 vaccinated). 42 hours later livers were removed, and parasite load was assessed by qPCR. Plots show the relative parasite load of mice in each condition (**, p<0.01; Mann-Whitney U test). See Appendix Table S4 for exact p-values. Data information: Data are representative of two experiments performed with scatter plots showing mean values (±SEM)."}
{"words": ["Figure", "1Representative", "images", "of", "γH2AX", "immuno", "-", "FISH", "in", "troponin", "-", "C", "/", "α", "-", "actinin", "(", "top", "left", "and", "bottom", "left", "panels", ",", "respectively", ")", "positive", "mouse", "CMs", "(", "white", "-", "troponin", "-", "C", "/", "α", "-", "actinin", ";", "red", "-", "telo", "-", "FISH", ";", "green", "-", "γH2AX", ")", ".", "Images", "are", "Z", "-", "projections", "of", "0", ".", "1μm", "stacks", "taken", "with", "a", "100x", "oil", "objective", ".", "Scale", "bar", ":", "20μm", ".", "Right", "panels", "represent", "a", "single", "Z", "-", "plane", "where", "co", "-", "localisation", "between", "a", "γH2AX", "foci", "and", "telomere", "was", "observed", ",", "Scale", "bars", "1μm", ".", "(", "Below", ")", "3D", "reconstruction", "of", "Immuno", "-", "FISH", "using", "STED", "microscopy", "for", "γH2A", ".", "X", "and", "telomeres", "in", "a", "CM", "from", "30", "month", "old", "mice", ".", "Scale", "bars", "as", "indicated", "and", "scale", "the", "same", "for", "both", "individual", "TAF", "examples", "using", "STED", ".", "Mean", "number", "of", "TAF", "α", "-", "actinin", "positive", "CMs", "from", "C57BL", "/", "6", "mice", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SEM", "of", "n", "=", "4", "-", "7", "mice", "per", "age", "group", ".", "α", "-", "actinin", "positive", "CMs", "from", "C57BL", "/", "6", "mice", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SEM", "of", "n", "=", "4", "-", "7", "mice", "per", "age", "group", ".", "100", "α", "-", "actinin", "positive", "CMs", "were", "quantified", "per", "mouse", ".", "Mean", "number", "of", "total", "γH2A", ".", "X", "foci", "in", "α", "-", "actinin", "positive", "CMs", "from", "C57BL", "/", "6", "mice", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SEM", "of", "n", "=", "4", "-", "7", "mice", "per", "age", "group", ".", "100", "α", "-", "actinin", "positive", "CMs", "were", "quantified", "per", "mouse", ".", "%", "of", "γH2A", ".", "X", "foci", "-", "positive", "nuclei", "(", "E", ")", "in", "α", "-", "actinin", "positive", "CMs", "from", "C57BL", "/", "6", "mice", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SEM", "of", "n", "=", "4", "-", "7", "mice", "per", "age", "group", ".", "100", "α", "-", "actinin", "positive", "CMs", "were", "quantified", "per", "mouse", ".", "Fold", "enrichment", "of", "γH2AX", "at", "telomere", "repeats", "by", "real", "-", "time", "PCR", ".", "Graph", "represents", "fold", "enrichment", "of", "γH2AX", "at", "telomeric", "repeats", "between", "IgG", "control", ",", "3", "and", "30", "month", "old", "whole", "mouse", "hearts", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SEM", "of", "n", "=", "3", "mice", "per", "age", "group", ".", "Quantitative", "PCR", "-", "ELISA", "TRAP", "assay", "comparing", "telomerase", "activity", "of", "3", "and", "30", "month", "old", "C57BL", "/", "6", "mice", "whole", "heart", "lysates", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SEM", "of", "n", "=", "4", "mice", "per", "age", "group", ".", "Histograms", "displaying", "distributions", "of", "telomere", "intensity", "in", "CMs", "analysed", "by", "3D", "Q", "-", "FISH", "in", "young", "(", "4", "months", ")", "and", "old", "(", "30", "months", ")", "wild", "-", "type", "mice", ".", "Data", "are", "from", "n", "=", "3", "mice", ".", ">", "100", "CMs", "were", "analysed", "per", "mouse", ".", "%", "of", "telomere", "FISH", "signal", "loss", "in", "30", "months", "old", "wild", "-", "type", "mice", "and", "late", "generation", "Terc", "-", "/", "-", "mice", "(", "6", "months", "old", ")", "in", "comparison", "to", "4", "months", "old", "wild", "-", "type", "mice", ".", "Data", "are", "from", "n", "=", "3", "mice", ".", ">", "100", "CMs", "were", "analysed", "per", "mouse", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Representative images of γH2AX immuno-FISH in troponin-C/α-actinin (top left and bottom left panels, respectively) positive mouse CMs (white - troponin-C/α-actinin; red - telo-FISH; green - γH2AX). Images are Z-projections of 0.1μm stacks taken with a 100x oil objective. Scale bar: 20μm. Right panels represent a single Z-plane where co-localisation between a γH2AX foci and telomere was observed, Scale bars 1μm. (Below) 3D reconstruction of Immuno-FISH using STED microscopy for γH2A.X and telomeres in a CM from 30 month old mice. Scale bars as indicated and scale the same for both individual TAF examples using STED.Mean number of TAF α-actinin positive CMs from C57BL/6 mice. Data are mean ± SEM of n=4-7 mice per age group.α-actinin positive CMs from C57BL/6 mice. Data are mean ± SEM of n=4-7 mice per age group. 100 α-actinin positive CMs were quantified per mouse.Mean number of total γH2A.X foci in α-actinin positive CMs from C57BL/6 mice. Data are mean ± SEM of n=4-7 mice per age group. 100 α-actinin positive CMs were quantified per mouse.% of γH2A.X foci -positive nuclei (E) in α-actinin positive CMs from C57BL/6 mice. Data are mean ± SEM of n=4-7 mice per age group. 100 α-actinin positive CMs were quantified per mouse.Fold enrichment of γH2AX at telomere repeats by real-time PCR. Graph represents fold enrichment of γH2AX at telomeric repeats between IgG control, 3 and 30 month old whole mouse hearts. Data are mean ± SEM of n=3 mice per age group.Quantitative PCR-ELISA TRAP assay comparing telomerase activity of 3 and 30 month old C57BL/6 mice whole heart lysates. Data are mean ± SEM of n=4 mice per age group.Histograms displaying distributions of telomere intensity in CMs analysed by 3D Q-FISH in young (4 months) and old (30 months) wild-type mice. Data are from n=3 mice. > 100 CMs were analysed per mouse.% of telomere FISH signal loss in 30 months old wild-type mice and late generation Terc-/- mice (6 months old) in comparison to 4 months old wild-type mice. Data are from n=3 mice. >100 CMs were analysed per mouse."}
{"words": ["Figure", "2Representative", "images", "of", "mouse", "embryonic", "cardiomyocytes", "at", "days", "0", ",", "3", ",", "5", "and", "10", "days", "following", "10Gy", "X", "-", "irradiation", ".", "Left", "panels", "represent", "troponin", "C", "-", "positive", "embryonic", "cardiomyocytes", "(", "troponin", "C", "-", "magenta", ";", "DAPI", "-", "light", "blue", ")", ".", "Middle", "panels", "display", "γH2AX", "foci", "(", "green", ")", "and", "telomeres", "(", "red", ")", "in", "Z", "projections", "of", "0", ".", "1µm", "slices", ",", "with", "white", "arrows", "indicating", "co", "-", "localisation", ".", "Co", "-", "localising", "foci", "are", "amplified", "in", "the", "right", "-", "hand", "panels", "(", "amplified", "images", "represent", "a", "single", "Z", "-", "plane", "where", "co", "-", "localisation", "was", "observed", ")", ".", "Scale", "bars", "represent", "10μm", ".", "Scale", "bars", "in", "single", "plane", "images", "500nm", ".", "(", "Left", ")", "Mean", "number", "of", "both", "TAF", "and", "non", "-", "TAF", "in", "troponin", "I", "-", "positive", "mouse", "embryonic", "cardiomyocytes", "at", "days", "0", ",", "3", ",", "5", "and", "10", "following", "10Gy", "X", "-", "irradiation", ".", "Data", "are", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", "of", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ";", "30", "-", "50", "troponin", "positive", "cardiomyocytes", "were", "analysed", "per", "experiment", ".", "(", "Right", ")", "Mean", "percentage", "of", "γH2AX", "foci", "co", "-", "localising", "with", "telomeres", "(", "%", "TAF", ")", "in", "troponin", "C", "-", "positive", "mouse", "embryonic", "cardiomyocytes", "at", "days", "0", ",", "3", ",", "5", "and", "10", "following", "10Gy", "X", "-", "irradiation", ".", "Statistical", "analysis", "performed", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "(", "Holm", "-", "Sidak", "method", ")", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ".", "Significant", "differences", "were", "found", "for", "mean", "number", "of", "non", "-", "TAF", ",", "but", "not", "for", "mean", "number", "of", "TAF", ".", "Mean", "number", "of", "both", "TAF", "and", "non", "-", "TAF", "in", "neonatal", "rat", "cardiomyocytes", "at", "days", "0", ",", "3", ",", "5", ",", "10", "days", "following", "treatment", "for", "24h", "with", "H2O2", ".", "Data", "are", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", "of", "n", "=", "3", ".", ">", "50", "cells", "were", "quantified", "per", "condition", ".", "(", "Left", ")", "Representative", "images", "of", "γH2AX", "immuno", "-", "FISH", "in", "H9C2", "myoblasts", "3", "days", "10Gy", "X", "-", "irradiation", "(", "red", "-", "telo", "-", "FISH", ";", "green", "-", "γH2AX", ")", ".", "White", "arrows", "identify", "areas", "shown", "in", "higher", "magnification", "panels", ".", "(", "Right", ")", "Mean", "number", "of", "both", "TAF", "and", "non", "-", "TAF", "in", "H9C2", "myoblasts", "at", "days", "3", "and", "5", "following", "10Gy", "X", "-", "irradiation", ".", "Data", "are", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", "of", "n", "=", "3", ".", ">", "50", "cells", "were", "quantified", "per", "condition", ".", "Statistical", "analysis", "performed", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "(", "Holm", "-", "Sidak", "method", ")", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Scale", "bars", "represent", "1μm", ".", "Scale", "bars", "in", "single", "plane", "images", "500nm", ".", "Representative", "time", "-", "lapse", "images", "of", "H9C2", "rat", "cardiomyoblasts", "expressing", "AcGFP", "-", "53BP1", "from", "3", "days", "after", "10Gy", "irradiation", "at", "the", "indicated", "times", "(", "mins", ")", ".", "Images", "are", "maximum", "intensity", "projections", "with", "a", "6", ".", "7µm", "focal", "depth", ".", "Kaplan", "-", "Meyer", "survival", "curves", "for", "AcGFP", "-", "53BP1c", "DDR", "foci", "in", "H9C2", "cells", "3", "days", "after", "10Gy", "irradiation", "at", "10", "minute", "intervals", "for", "24", "hours", ".", ">", "500", "foci", "from", "10", "cells", "were", "tracked", "per", "condition", ".", "Schematic", "illustration", "showing", "1", "month", "old", "C57BL", "/", "6", "mice", "treated", "with", "2Gy", "whole", "body", "X", "-", "irradiation", ",", "followed", "by", "a", "recovery", "period", "of", "11", "months", "before", "culling", "at", "12", "months", "of", "age", ".", "Mean", "number", "of", "TAF", "in", "α", "-", "actinin", "positive", "cardiomyocytes", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SEM", "of", "n", "=", "3", "mice", "per", "group", ".", "90", "α", "-", "actinin", "positive", "cardiomyocytes", "were", "quantified", "per", "condition", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Representative images of mouse embryonic cardiomyocytes at days 0, 3, 5 and 10 days following 10Gy X-irradiation. Left panels represent troponin C-positive embryonic cardiomyocytes (troponin C - magenta; DAPI - light blue). Middle panels display γH2AX foci (green) and telomeres (red) in Z projections of 0.1µm slices, with white arrows indicating co-localisation. Co-localising foci are amplified in the right-hand panels (amplified images represent a single Z-plane where co-localisation was observed). Scale bars represent 10μm. Scale bars in single plane images 500nm.(Left) Mean number of both TAF and non-TAF in troponin I-positive mouse embryonic cardiomyocytes at days 0, 3, 5 and 10 following 10Gy X-irradiation. Data are mean ±S.E.M of n=3 independent experiments; 30-50 troponin positive cardiomyocytes were analysed per experiment. (Right) Mean percentage of γH2AX foci co-localising with telomeres (% TAF) in troponin C-positive mouse embryonic cardiomyocytes at days 0, 3, 5 and 10 following 10Gy X-irradiation. Statistical analysis performed using one-way ANOVA (Holm-Sidak method); * P<0.05. Significant differences were found for mean number of non-TAF, but not for mean number of TAF.Mean number of both TAF and non-TAF in neonatal rat cardiomyocytes at days 0, 3, 5, 10 days following treatment for 24h with H2O2. Data are mean ±S.E.M of n=3. >50 cells were quantified per condition.(Left) Representative images of γH2AX immuno-FISH in H9C2 myoblasts 3 days 10Gy X-irradiation (red - telo-FISH; green - γH2AX). White arrows identify areas shown in higher magnification panels. (Right) Mean number of both TAF and non-TAF in H9C2 myoblasts at days 3 and 5 following 10Gy X-irradiation. Data are mean ±S.E.M of n=3. >50 cells were quantified per condition. Statistical analysis performed using one-way ANOVA (Holm-Sidak method); ***P<0.001. Scale bars represent 1μm. Scale bars in single plane images 500nm.Representative time-lapse images of H9C2 rat cardiomyoblasts expressing AcGFP-53BP1 from 3 days after 10Gy irradiation at the indicated times (mins). Images are maximum intensity projections with a 6.7µm focal depth.Kaplan-Meyer survival curves for AcGFP-53BP1c DDR foci in H9C2 cells 3 days after 10Gy irradiation at 10 minute intervals for 24 hours. >500 foci from 10 cells were tracked per condition.Schematic illustration showing 1 month old C57BL/6 mice treated with 2Gy whole body X-irradiation, followed by a recovery period of 11 months before culling at 12 months of age. Mean number of TAF in α-actinin positive cardiomyocytes. Data are mean ± SEM of n=3 mice per group. 90 α-actinin positive cardiomyocytes were quantified per condition."}
{"words": ["Figure", "3Representative", "images", "of", "rat", "neonatal", "CMs", "4", "days", "following", "transfection", "with", "a", "FLAG", "-", "tagged", "TRF1", "-", "FokI", "-", "D450A", "(", "top", "row", ")", "or", "TRF1", "-", "FokI", "(", "middle", "and", "bottom", "row", ")", "fusion", "protein", "(", "cell", "treatments", "the", "same", "for", "all", "subsequent", "panels", "in", "Figure", ")", "(", "red", "-", "telo", "-", "FISH", ";", "green", "-", "γH2A", ".", "X", ")", ".", "Images", "are", "z", "-", "projections", "of", "0", ".", "1µm", "stacks", "taken", "with", "100X", "objective", ".", "White", "arrows", "indicate", "co", "-", "localisation", "between", "telomeres", "and", "γH2A", ".", "X", ",", "with", "co", "-", "localising", "foci", "amplified", "in", "the", "right", "panels", "(", "taken", "from", "single", "z", "-", "planes", "where", "co", "-", "localisation", "was", "found", ")", ".", "Scale", "bar", "represents", "3", ".", "5μm", ".", "Scale", "bar", "in", "magnified", "images", "showing", "individual", "co", "-", "localisation", "500nm", ".", "%", "of", "γH2A", ".", "X", "foci", "co", "-", "localising", "with", "telomeres", "(", "B", ")", "in", "FLAG", "-", "tagged", "TRF1", "-", "FokI", "-", "D450A", "-", "and", "TRF1", "-", "FokI", "-", "expressing", "CMs", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SEM", "of", "n", "=", "4", "independent", "experiments", ".", ">", "50", "cells", "were", "analysed", "per", "condition", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "by", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "mean", "number", "of", "Telomere", "-", "associated", "Foci", "(", "TAF", ")", "(", "C", ")", "in", "FLAG", "-", "tagged", "TRF1", "-", "FokI", "-", "D450A", "-", "and", "TRF1", "-", "FokI", "-", "expressing", "CMs", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SEM", "of", "n", "=", "4", "independent", "experiments", ".", ">", "50", "cells", "were", "analysed", "per", "condition", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "by", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Histograms", "displaying", "telomere", "intensity", "for", "telomeres", "co", "-", "localising", "or", "not", "co", "-", "localising", "with", "γH2AX", "foci", ".", "Red", "dotted", "lines", "represent", "median", ".", "Mann", "-", "Whitney", "test", "show", "no", "significant", "difference", "in", "telomere", "intensity", "between", "TAF", "and", "non", "-", "TAF", ".", "Mean", "%", "of", "FLAG", "-", "labelled", "CMs", "positive", "for", "SA", "-", "β", "-", "Gal", "activity", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SEM", "of", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", ">", "100", "cells", "were", "quantified", "per", "condition", ".", "Statistical", "analysis", "performed", "using", "two", "tailed", "t", "test", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "Expression", "of", "p21", "mRNA", "(", "as", "a", "function", "of", "β", "-", "actin", "and", "Gapdh", ")", "by", "real", "-", "time", "PCR", "in", "TRF1", "-", "FokI", "-", "D450A", "and", "TRF1", "-", "FokI", "expressing", "CMs", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SEM", "of", "n", "=", "6", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "analysis", "performed", "using", "two", "tailed", "t", "test", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Mean", "±", "SEM", "cell", "surface", "area", "(", "μm2", ")", "of", "FLAG", "-", "labelled", "CMs", "expressing", "TRF1", "-", "FokI", "-", "D450A", "and", "TRF1", "-", "FokI", ".", "Statistical", "analysis", "performed", "using", "two", "tailed", "t", "test", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Scale", "bar", "represents", "50μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Representative images of rat neonatal CMs 4 days following transfection with a FLAG-tagged TRF1-FokI-D450A (top row) or TRF1-FokI (middle and bottom row) fusion protein (cell treatments the same for all subsequent panels in Figure) (red - telo-FISH; green - γH2A.X). Images are z-projections of 0.1µm stacks taken with 100X objective. White arrows indicate co-localisation between telomeres and γH2A.X, with co-localising foci amplified in the right panels (taken from single z-planes where co-localisation was found). Scale bar represents 3.5μm. Scale bar in magnified images showing individual co-localisation 500nm.% of γH2A.X foci co-localising with telomeres (B) in FLAG-tagged TRF1-FokI-D450A- and TRF1-FokI-expressing CMs. Data are mean ± SEM of n=4 independent experiments. >50 cells were analysed per condition. Statistical analysis was performed by two-tailed t-test ***P<0.001.mean number of Telomere-associated Foci (TAF) (C) in FLAG-tagged TRF1-FokI-D450A- and TRF1-FokI-expressing CMs. Data are mean ± SEM of n=4 independent experiments. >50 cells were analysed per condition. Statistical analysis was performed by two-tailed t-test ***P<0.001.Histograms displaying telomere intensity for telomeres co-localising or not co-localising with γH2AX foci. Red dotted lines represent median. Mann-Whitney test show no significant difference in telomere intensity between TAF and non-TAF.Mean % of FLAG-labelled CMs positive for SA-β-Gal activity. Data are mean ± SEM of n=3 independent experiments. >100 cells were quantified per condition. Statistical analysis performed using two tailed t test; **P<0.01.Expression of p21 mRNA (as a function of β-actin and Gapdh) by real-time PCR in TRF1-FokI-D450A and TRF1-FokI expressing CMs. Data are mean ± SEM of n=6 independent experiments. Statistical analysis performed using two tailed t test; ***P<0.001.Mean± SEM cell surface area (μm2) of FLAG-labelled CMs expressing TRF1-FokI-D450A and TRF1-FokI. Statistical analysis performed using two tailed t test; ***P<0.001. Scale bar represents 50μm."}
{"words": ["Figure", "4Real", "-", "time", "PCR", "gene", "expression", "analysis", "in", "isolated", "mouse", "CMs", "from", "C57BL", "/", "6", "mice", ".", "Mean", "%", "of", "p21", "-", "positive", "CM", "nuclei", "from", "3", ",", "15", ",", "and", "30", "month", "old", "C57BL", "/", "6", "mice", "by", "immunohistochemistry", "(", "IHC", ")", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SEM", "of", "n", "=", "4", "per", "age", "group", ".", ">", "100", "CMs", "were", "quantified", "per", "age", "group", ".", "Mean", "%", "of", "3", "and", "24", "month", "old", "mouse", "CMs", "staining", "positive", "for", "SA", "-", "β", "-", "Gal", "in", "vivo", "with", "representative", "images", "above", "(", "blue", "-", "SA", "-", "β", "-", "Gal", ";", "green", "-", "troponin", "C", ";", "red", "-", "WGA", ")", ".", "Black", "arrows", "indicate", "SA", "-", "β", "-", "Gal", "expression", "in", "a", "troponin", "C", "expressing", "CM", ".", "Statistical", "analysis", "performed", "using", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SEM", "from", "the", "analysis", "of", ">", "500", "CMs", "per", "mouse", ",", "4", "mice", "per", "age", "group", ".", "Scale", "bar", "20µm", ".", "Mean", "%", "of", "SADS", "-", "positive", "CM", "nuclei", "from", "3", "and", "30", "month", "old", "mouse", "CMs", "positive", "for", "SADS", "in", "vivo", ",", "as", "detected", "by", "centromere", "-", "FISH", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SEM", "of", "n", "=", "4", "per", "age", "group", ".", ">", "200", "CMs", "per", "mouse", "were", "quantified", ".", "SASP", "heatmap", ":", "Pearson", "correlation", "clustered", "heatmap", "showing", "a", "curated", "list", "of", "known", "SASP", "genes", "(", "top", "panel", ")", "or", "a", "selection", "of", "secreted", "SASP", "proteins", "(", "bottom", "panel", ")", "in", "young", "(", "3", "months", ")", "and", "old", "(", "20", "months", ")", "mouse", "CMs", "(", "n", "=", "5", "per", "age", "group", ")", ".", "The", "colour", "intensity", "represents", "column", "Z", "-", "score", ",", "where", "red", "indicates", "highly", "and", "blue", "lowly", "expressed", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Real-time PCR gene expression analysis in isolated mouse CMs from C57BL/6 mice.Mean % of p21-positive CM nuclei from 3, 15, and 30 month old C57BL/6 mice by immunohistochemistry (IHC). Data are mean ± SEM of n=4 per age group. >100 CMs were quantified per age group.Mean % of 3 and 24 month old mouse CMs staining positive for SA-β-Gal in vivo with representative images above (blue - SA-β-Gal; green - troponin C; red - WGA). Black arrows indicate SA-β-Gal expression in a troponin C expressing CM. Statistical analysis performed using two-tailed t-test; *P<0.05. Data are mean ± SEM from the analysis of >500 CMs per mouse, 4 mice per age group. Scale bar 20µm.Mean % of SADS-positive CM nuclei from 3 and 30 month old mouse CMs positive for SADS in vivo, as detected by centromere-FISH. Data are mean ± SEM of n=4 per age group. >200 CMs per mouse were quantified.SASP heatmap: Pearson correlation clustered heatmap showing a curated list of known SASP genes (top panel) or a selection of secreted SASP proteins (bottom panel) in young (3 months) and old (20 months) mouse CMs (n=5 per age group). The colour intensity represents column Z-score, where red indicates highly and blue lowly expressed."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "Above", ")", "RNA", "-", "sequencing", "of", "purified", "CMs", "from", "4", "mice", "per", "age", "group", "reveal", "age", "-", "dependent", "increased", "expression", "of", "3", "secreted", "proteins", "Edn3", ",", "Tgfb2", ",", "and", "Gdf15", ";", "the", "colour", "intensity", "represents", "column", "Z", "-", "score", ",", "where", "red", "indicates", "highly", "and", "blue", "lowly", "expressed", ".", "(", "Below", ")", "mRNA", "expression", "of", "Edn3", ",", "Tgfb2", ",", "and", "Gdf15", "was", "independently", "validated", "by", "RT", "-", "PCR", "in", "young", "and", "old", "isolated", "adult", "CMs", ".", "Data", "are", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", "of", "n", "=", "8", "mice", "per", "group", ".", "Representative", "images", "of", "immunofluorescent", "staining", "against", "α", "-", "SMA", "and", "EdU", "in", "neonatal", "fibroblasts", "cultured", "in", "the", "presence", "of", "CM", "from", "young", "and", "old", "CMs", ".", "Quantification", "of", "%", "of", "EdU", "incorporation", "(", "D", ")", "in", "neonatal", "fibroblasts", "after", "treatment", "for", "48h", "with", "CM", "from", "young", "and", "old", "CM", ".", "Data", "are", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", "of", "n", "=", "3", "-", "4", "mice", "per", "age", "group", ";", ">", "200", "cells", "were", "quantified", "per", "condition", ".", "%", "of", "a", "-", "SMA", "positive", "cells", "(", "E", ")", "in", "neonatal", "fibroblasts", "after", "treatment", "for", "48h", "with", "CM", "from", "young", "and", "old", "CM", ".", "Data", "are", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", "of", "n", "=", "3", "-", "4", "mice", "per", "age", "group", ";", ">", "200", "cells", "were", "quantified", "per", "condition", ".", "Representative", "micrographs", "of", "neonatal", "fibroblasts", "and", "CMs", "treated", "with", "recombinant", "proteins", ":", "Tgfb2", ",", "Edn3", ",", "and", "Gdf15", "for", "48h", "and", "immunostained", "against", "α", "-", "SMA", "and", "EdU", "(", "fibroblasts", ")", "and", "α", "-", "actinin", "(", "CMs", ")", ".", "Quantification", "of", "α", "-", "SMA", "(", "G", ")", "in", "neonatal", "CMs", "following", "treatment", "with", "the", "indicated", "recombinant", "proteins", ".", "Data", "are", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", "of", "n", "=", "3", "-", "4", "independent", "experiments", ".", "EdU", "positive", "neonatal", "fibroblasts", "(", "H", ")", "in", "neonatal", "CMs", "following", "treatment", "with", "the", "indicated", "recombinant", "proteins", ".", "Data", "are", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", "of", "n", "=", "3", "-", "4", "independent", "experiments", ".", "surface", "area", "(", "μm2", ")", "(", "I", ")", "in", "neonatal", "CMs", "following", "treatment", "with", "the", "indicated", "recombinant", "proteins", ".", "Data", "are", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", "of", "n", "=", "3", "-", "4", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(Above) RNA-sequencing of purified CMs from 4 mice per age group reveal age-dependent increased expression of 3 secreted proteins Edn3, Tgfb2, and Gdf15; the colour intensity represents column Z-score, where red indicates highly and blue lowly expressed. (Below) mRNA expression of Edn3, Tgfb2, and Gdf15 was independently validated by RT-PCR in young and old isolated adult CMs. Data are mean ±S.E.M of n=8 mice per group.Representative images of immunofluorescent staining against α-SMA and EdU in neonatal fibroblasts cultured in the presence of CM from young and old CMs.Quantification of % of EdU incorporation (D) in neonatal fibroblasts after treatment for 48h with CM from young and old CM. Data are mean ±S.E.M of n=3-4 mice per age group; >200 cells were quantified per condition.% of a-SMA positive cells (E) in neonatal fibroblasts after treatment for 48h with CM from young and old CM. Data are mean ±S.E.M of n=3-4 mice per age group; >200 cells were quantified per condition.Representative micrographs of neonatal fibroblasts and CMs treated with recombinant proteins: Tgfb2, Edn3, and Gdf15 for 48h and immunostained against α-SMA and EdU (fibroblasts) and α-actinin (CMs).Quantification of α-SMA (G) in neonatal CMs following treatment with the indicated recombinant proteins. Data are mean ±S.E.M of n=3-4 independent experiments.EdU positive neonatal fibroblasts (H) in neonatal CMs following treatment with the indicated recombinant proteins. Data are mean ±S.E.M of n=3-4 independent experiments.surface area (μm2) (I) in neonatal CMs following treatment with the indicated recombinant proteins. Data are mean ±S.E.M of n=3-4 independent experiments."}
{"words": ["Figure", "6Mito", "and", "ETC", "genes", "with", "GSEA", "analysis", ":", "Clustered", "heatmap", "showing", "all", "genes", "associated", "with", "the", "\"", "Mitochondrion", "\"", "GO", "term", "in", "young", "and", "old", ",", "mouse", "CMs", "as", "observed", "by", "the", "GSEA", "pre", "-", "ranked", "list", "enrichment", "analysis", "(", "normalised", "enrichment", "score", ":", "-", "1", ".", "70", ";", "FDR", "q", "-", "value", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "Alongside", "this", "is", "a", "column", "clustered", "heatmap", "displaying", "a", "list", "of", "genes", "from", "the", "electron", "transport", "chain", "(", "ETC", ")", "GO", "ontology", ".", "In", "both", "instances", ",", "genes", "are", "by", "column", "and", "samples", "by", "row", "with", "the", "colour", "intensity", "representing", "column", "Z", "-", "score", ",", "where", "red", "indicates", "highly", "and", "blue", "lowly", "expressed", ".", "Real", "-", "time", "PCR", "gene", "expression", "analysis", "of", "MAO", "-", "A", ",", "MnSOD", "and", "catalase", "in", "isolated", "mouse", "CMs", "from", "young", "(", "3", "months", ")", "and", "old", "(", "20", "months", ")", "mice", ".", "Mean", "%", "of", "4", "-", "HNE", "-", "(", "top", ")", "or", "8oxodG", "-", "(", "bottom", ")", "positive", "CMs", "from", "3", "month", "(", "young", ")", "or", "30", "month", "(", "old", ")", "aged", "mice", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SEM", "of", "n", "=", "4", "per", "age", "group", ".", "100", "CMs", "were", "quantified", "per", "age", "group", ".", "Mean", "%", "of", "TAF", "-", "positive", "nuclei", "(", "left", "graphs", ")", "or", "mean", "%", "of", "TAF", "(", "right", "graphs", ")", "in", "wild", "-", "type", "(", "control", ")", "compared", "to", "MAO", "-", "A", "transgenic", "mice", "with", "or", "without", "drinking", "water", "supplemented", "with", "1", ".", "5g", "/", "kg", "/", "day", "NAC", "from", "the", "age", "of", "4", "to", "24", "weeks", "Data", "are", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", "of", "n", "=", "3", "-", "4", "per", "group", ".", ">", "100", "CMs", "were", "quantified", "per", "age", "group", ".", "Mean", "%", "of", "TAF", "-", "positive", "nuclei", "(", "left", "graphs", ")", "or", "mean", "%", "of", "TAF", "(", "right", "graphs", ")", "in", "MnSOD", "+", "/", "+", "vs", "MnSOD", "-", "/", "+", ",", "Data", "are", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", "of", "n", "=", "3", "-", "4", "per", "group", ".", ">", "100", "CMs", "were", "quantified", "per", "age", "group", ".", "Mean", "%", "of", "TAF", "-", "positive", "nuclei", "(", "left", "graphs", ")", "or", "mean", "%", "of", "TAF", "(", "right", "graphs", ")", "in", "Catalase", "+", "/", "+", "vs", ".", "Catalase", "-", "/", "-", ",", "Data", "are", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", "of", "n", "=", "3", "-", "4", "per", "group", ".", ">", "100", "CMs", "were", "quantified", "per", "age", "group", ".", "Mean", "%", "of", "TAF", "-", "positive", "nuclei", "(", "left", "graphs", ")", "or", "mean", "%", "of", "TAF", "(", "right", "graphs", ")", "in", "WT", "vs", ".", "POLG", "double", "mutant", "mice", ".", "Data", "are", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", "of", "n", "=", "3", "-", "4", "per", "group", ".", ">", "100", "CMs", "were", "quantified", "per", "age", "group", ".", "Schematic", "depicting", "isolated", "mouse", "adult", "CMs", "isolated", "from", "4", "animals", "were", "treated", "with", "or", "without", "100nM", "rotenone", "either", "in", "the", "presence", "of", "5mM", "NAC", "or", "vehicle", "control", "(", "pre", "-", "treated", "for", "30", "minutes", "before", "rotenone", "treatment", ")", ",", "for", "24", "h", "before", "fixation", ".", "Mean", "number", "of", "TAF", "(", "top", "graph", ")", "and", "mean", "%", "of", "TAF", "-", "positive", "nuclei", "(", "bottom", "graph", ")", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SEM", "from", "4", "separate", "CM", "cultures", "isolated", "from", "3", "month", "-", "old", "mice", ".", "50", "CMs", "were", "quantified", "per", "condition", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Mito and ETC genes with GSEA analysis: Clustered heatmap showing all genes associated with the \"Mitochondrion\" GO term in young and old, mouse CMs as observed by the GSEA pre-ranked list enrichment analysis (normalised enrichment score: -1.70; FDR q-value < 0.05). Alongside this is a column clustered heatmap displaying a list of genes from the electron transport chain (ETC) GO ontology. In both instances, genes are by column and samples by row with the colour intensity representing column Z-score, where red indicates highly and blue lowly expressed.Real-time PCR gene expression analysis of MAO-A, MnSOD and catalase in isolated mouse CMs from young (3 months) and old (20 months) mice.Mean % of 4-HNE- (top) or 8oxodG- (bottom) positive CMs from 3 month (young) or 30 month (old) aged mice. Data are mean ± SEM of n=4 per age group. 100 CMs were quantified per age group.Mean % of TAF-positive nuclei (left graphs) or mean % of TAF (right graphs) in wild-type (control) compared to MAO-A transgenic mice with or without drinking water supplemented with 1.5g/kg/day NAC from the age of 4 to 24 weeks Data are mean ±S.E.M of n=3-4 per group. >100 CMs were quantified per age group.Mean % of TAF-positive nuclei (left graphs) or mean % of TAF (right graphs) in MnSOD+/+ vs MnSOD-/+, Data are mean ±S.E.M of n=3-4 per group. >100 CMs were quantified per age group.Mean % of TAF-positive nuclei (left graphs) or mean % of TAF (right graphs) in Catalase+/+ vs. Catalase-/-, Data are mean ±S.E.M of n=3-4 per group. >100 CMs were quantified per age group.Mean % of TAF-positive nuclei (left graphs) or mean % of TAF (right graphs) in WT vs. POLG double mutant mice. Data are mean ±S.E.M of n=3-4 per group. >100 CMs were quantified per age group.Schematic depicting isolated mouse adult CMs isolated from 4 animals were treated with or without 100nM rotenone either in the presence of 5mM NAC or vehicle control (pre-treated for 30 minutes before rotenone treatment), for 24 h before fixation. Mean number of TAF (top graph) and mean % of TAF-positive nuclei (bottom graph). Data are mean ± SEM from 4 separate CM cultures isolated from 3 month-old mice. 50 CMs were quantified per condition."}
{"words": ["Figure", "7Examples", "of", "individual", "short", "axis", "cine", "-", "MR", "images", "of", "3", "or", "20", "month", "old", "mouse", "hearts", ".", "Ejection", "fraction", "and", "LV", "thickness", "was", "calculated", "based", "on", "manual", "measurements", "of", "Left", "ventricle", "epicardial", "and", "endocardial", "borders", ".", "%", "change", "in", "wall", "thickening", "calculation", "based", "on", "wall", "thickness", "at", "the", "4", "points", "indicated", ".", "Measurements", "were", "made", "in", "all", "cine", "slices", "at", "end", "diastole", "and", "end", "systole", ".", "Graphs", "representing", "data", "obtained", "from", "MRI", "analysis", "of", ">", "7", "animals", "per", "age", "group", ".", "Data", "are", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "Asterisks", "denote", "a", "statistical", "significance", "at", "P", "<", "0", ".", "05", "using", "Mann", "Whitney", "U", "-", "test", ".", "Scale", "bars", "represent", "5mm", ".", "Comparison", "between", "mean", "number", "of", "TAF", "per", "CM", "and", "CM", "area", "in", "22", "month", "old", "animals", ".", "Data", "are", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "of", "n", "=", "4", ".", ">", "100", "CMs", "were", "quantified", "per", "mouse", ".", "Comparison", "between", "the", "%", "of", "p16", "-", "or", "eGFP", "-", "positive", "CMs", "by", "RNA", "-", "in", "situ", "hybridization", "per", "plane", "in", "INK", "-", "ATTAC", "mice", "(", "28", "-", "29", "month", "old", ")", "treated", "with", "vehicle", "or", "AP20187", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SEM", "of", "n", "=", "5", "per", "age", "group", ".", "100", "CMs", "were", "analysed", "per", "mouse", ".", "Mean", "number", "of", "TAF", "(", "left", "graph", ")", "and", "mean", "%", "of", "TAF", "-", "positive", "nuclei", "(", "right", "graph", ")", "in", "CMs", ".", "Data", "are", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "of", "n", "=", "6", "per", "age", "group", ".", "100", "CMs", "were", "analysed", "per", "mouse", ".", "Mean", "CM", "area", "μm2", ".", "Data", "are", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "of", "n", "=", "6", "per", "age", "group", ",", ">", "150", "CMs", "analysed", "per", "mouse", ".", "%", "of", "fibrotic", "area", "evaluated", "by", "Sirius", "Red", "staining", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Examples of individual short axis cine-MR images of 3 or 20 month old mouse hearts. Ejection fraction and LV thickness was calculated based on manual measurements of Left ventricle epicardial and endocardial borders. % change in wall thickening calculation based on wall thickness at the 4 points indicated. Measurements were made in all cine slices at end diastole and end systole. Graphs representing data obtained from MRI analysis of >7 animals per age group. Data are mean ± S.E.M. Asterisks denote a statistical significance at P<0.05 using Mann Whitney U-test. Scale bars represent 5mm.Comparison between mean number of TAF per CM and CM area in 22 month old animals. Data are mean ± S.E.M. of n=4. >100 CMs were quantified per mouse.Comparison between the % of p16- or eGFP-positive CMs by RNA-in situ hybridization per plane in INK-ATTAC mice (28-29 month old) treated with vehicle or AP20187. Data are mean ± SEM of n=5 per age group. 100 CMs were analysed per mouse.Mean number of TAF (left graph) and mean % of TAF-positive nuclei (right graph) in CMs. Data are mean ± S.E.M. of n=6 per age group. 100 CMs were analysed per mouse.Mean CM area μm2. Data are mean ±S.E.M. of n=6 per age group, >150 CMs analysed per mouse.% of fibrotic area evaluated by Sirius Red staining."}
{"words": ["Figure", "8Quantification", "of", "mean", "number", "of", "TAF", "and", "%", "of", "TAF", "-", "positive", "CMs", "in", "24", "months", "old", "wild", "-", "type", "mice", "treated", "with", "vehicle", "or", "navitoclax", "(", "50mg", "/", "kg", "/", "day", ")", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SEM", "of", "n", "=", "5", "-", "8", "mice", "per", "group", ".", "More", "than", "100", "CMs", "were", "quantified", "per", "animal", ".", "CM", "cross", "-", "sectional", "area", "in", "24", "months", "old", "wild", "-", "type", "mice", "treated", "with", "vehicle", "or", "navitoclax", ".", "(", "Left", ")", "Representative", "images", "of", "Sirius", "red", "staining", "and", "(", "right", ")", "%", "of", "fibrosis", "area", "in", "24", "month", "-", "old", "mice", "treated", "or", "not", "with", "navitoclax", ".", "MRI", "analysis", "of", "ejection", "fraction", "(", "EF", "%", ")", "in", "24", "month", "-", "old", "mice", "treated", "or", "not", "with", "navitoclax", ".", "Data", "are", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", "of", "n", "=", "6", "mice", "per", "treatment", "group", ".", "left", "ventricle", "mass", "(", "LVmass", ")", "index", "in", "24", "month", "-", "old", "mice", "treated", "or", "not", "with", "navitoclax", ".", "Data", "are", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", "of", "n", "=", "6", "mice", "per", "treatment", "group", ".", "%", "of", "ventricle", "wall", "thickness", "(", "%", "WTC", ")", "in", "24", "month", "-", "old", "mice", "treated", "or", "not", "with", "navitoclax", ".", "Data", "are", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", "of", "n", "=", "6", "mice", "per", "treatment", "group", ".", "Examples", "of", "confocal", "microscopy", "images", "of", "CMs", "positive", "for", "CM", "marker", "troponin", "C", "(", "TropC", ")", ",", "EdU", ",", "Ki67", "and", "Aurora", "B", "from", "navitoclax", "treated", "animals", ".", "(", "Upper", "Right", "panel", ")", "white", "arrows", "identify", "two", "nuclei", "in", "the", "same", "CM", "that", "have", "incorporated", "EdU", ".", "(", "Lower", "Right", "panel", ")", "white", "arrow", "identify", "EdU", "expressing", "Aurora", "B", "symmetrically", "between", "two", "nuclei", ".", "Scale", "bars", "represent", "20µm", ".", "Quantification", "of", "EdU", "positive", "CMs", "(", "mono", "-", "or", "multi", "-", "nucleated", ")", "in", "vehicle", "and", "navitoclax", "treated", "animals", ".", "Data", "are", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", "of", "n", "=", "5", "-", "6", "mice", "per", "group", ".", "%", "of", "Ki67", "positive", "CMs", "in", "29", "month", "old", "INK", "-", "ATTAC", "mice", "treated", "with", "vehicle", "or", "AP20187", ".", "Data", "are", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", "of", "n", "=", "4", "-", "6", "mice", "per", "group", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8Quantification of mean number of TAF and % of TAF-positive CMs in 24 months old wild-type mice treated with vehicle or navitoclax (50mg/kg/day). Data are mean± SEM of n=5-8 mice per group. More than 100 CMs were quantified per animal.CM cross-sectional area in 24 months old wild-type mice treated with vehicle or navitoclax.(Left) Representative images of Sirius red staining and (right) % of fibrosis area in 24 month-old mice treated or not with navitoclax.MRI analysis of ejection fraction (EF%) in 24 month-old mice treated or not with navitoclax. Data are mean±S.E.M of n=6 mice per treatment group.left ventricle mass (LVmass) index in 24 month-old mice treated or not with navitoclax. Data are mean±S.E.M of n=6 mice per treatment group.% of ventricle wall thickness (%WTC) in 24 month-old mice treated or not with navitoclax. Data are mean±S.E.M of n=6 mice per treatment group.Examples of confocal microscopy images of CMs positive for CM marker troponin C (TropC), EdU, Ki67 and Aurora B from navitoclax treated animals. (Upper Right panel) white arrows identify two nuclei in the same CM that have incorporated EdU. (Lower Right panel) white arrow identify EdU expressing Aurora B symmetrically between two nuclei. Scale bars represent 20µm.Quantification of EdU positive CMs (mono- or multi-nucleated) in vehicle and navitoclax treated animals. Data are mean±S.E.M of n=5-6 mice per group.% of Ki67 positive CMs in 29 month old INK-ATTAC mice treated with vehicle or AP20187. Data are mean±S.E.M of n=4-6 mice per group."}
{"words": ["Figure", "2Cloning", "and", "characterization", "of", "APG9", ".", "A", ",", "Wild", "-", "type", "(", "WT", ";", "SEY6210", ")", ",", "apg9", "(", "THY154", ")", ",", "apg9Δ", "(", "JKY007", ")", ",", "and", "the", "apg9Δ", "strain", "transformed", "with", "single", "copy", "(", "CEN", ";", "pAPG9", "(", "414", ")", ")", "or", "multicopy", "(", "2μ", ";", "pAPG9", "(", "424", ")", ")", "plasmids", "encoding", "APG9", "were", "grown", "to", "log", "phase", "in", "SMD", ".", "Protein", "extracts", "were", "prepared", "and", "analyzed", "by", "immunoblot", "using", "antiserum", "to", "API", "as", "described", "in", "Materials", "and", "Methods", ".", "The", "positions", "of", "precursor", "and", "mature", "API", "are", "indicated", ".", "The", "APG9", "gene", "complements", "the", "prAPI", "accumulation", "phenotype", "of", "the", "apg9Δ", "mutant", ".", "B", ",", "WT", "(", "SEY6210", ")", ",", "apg9Δ", "(", "JKY007", ")", ",", "and", "the", "apg9Δ", "strain", "transformed", "with", "pAPG9", "(", "414", ")", "centromeric", "plasmid", "were", "grown", "in", "SMD", "and", "transferred", "to", "SD", "(", "−", "N", ")", "as", "described", "in", "Materials", "and", "Methods", ".", "Aliquots", "were", "removed", "at", "the", "indicated", "times", "and", "spread", "onto", "YPD", "plates", "in", "triplicate", ".", "Numbers", "of", "viable", "colonies", "were", "determined", "after", "two", "to", "three", "days", ".", "The", "APG9", "gene", "complements", "the", "starvation", "-", "sensitive", "phenotype", "of", "the", "apg9Δ", "mutant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Cloning and characterization of APG9. A, Wild-type (WT; SEY6210), apg9 (THY154), apg9Δ (JKY007), and the apg9Δ strain transformed with single copy (CEN; pAPG9(414)) or multicopy (2μ; pAPG9(424)) plasmids encoding APG9 were grown to log phase in SMD. Protein extracts were prepared and analyzed by immunoblot using antiserum to API as described in Materials and Methods. The positions of precursor and mature API are indicated. The APG9 gene complements the prAPI accumulation phenotype of the apg9Δ mutant.B, WT (SEY6210), apg9Δ (JKY007), and the apg9Δ strain transformed with pAPG9(414) centromeric plasmid were grown in SMD and transferred to SD(−N) as described in Materials and Methods. Aliquots were removed at the indicated times and spread onto YPD plates in triplicate. Numbers of viable colonies were determined after two to three days. The APG9 gene complements the starvation-sensitive phenotype of the apg9Δ mutant."}
{"words": ["Figure", "3Apg9p", "is", "an", "unglycosylated", ",", "integral", "membrane", "protein", ".", "A", ",", "Wild", "-", "type", "(", "WT", ";", "SEY6210", ")", ",", "apg9Δ", "(", "JKY007", ")", ",", "and", "the", "apg9Δ", "strain", "transformed", "with", "single", "copy", "(", "CEN", ")", "or", "multicopy", "(", "2μ", ")", "plasmids", "encoding", "APG9", "were", "grown", "to", "log", "phase", "in", "SMD", ".", "Protein", "extracts", "were", "prepared", "and", "analyzed", "by", "immunoblot", "using", "antiserum", "to", "Apg9p", ".", "Apg9p", "is", "detected", "as", "an", "∼", "125", "-", "kD", "protein", ".", ".", "B", ",", "Hydrophobicity", "analysis", "of", "Apg9p", "based", "on", "the", "Kyte", "-", "Doolittle", "algorithm", "(", "Kyte", "and", "Doolittle", "1982", ")", "predicts", "six", "to", "eight", "transmembrane", "domains", ".", "C", ",", "Cells", "of", "wild", "-", "type", "strain", "YW5", "-", "1B", "were", "grown", "in", "YPD", ",", "converted", "to", "spheroplasts", ",", "and", "osmotically", "lysed", "as", "described", "in", "Materials", "and", "Methods", ".", "After", "a", "preclearing", "step", "to", "remove", "cell", "debris", ",", "the", "lysates", "were", "incubated", "with", "or", "without", "1", "%", "Triton", "X", "-", "100", "on", "ice", "for", "30", "min", ",", "as", "indicated", ".", "Centrifugation", "at", "10", ",", "000", "g", "for", "1", "h", "separated", "the", "lysate", "into", "supernatant", "(", "S", ")", "and", "pellet", "(", "P", ")", "fractions", ",", "which", "were", "analyzed", "by", "immunoblots", "with", "antiserum", "to", "Apg9p", ".", "Apg9p", "is", "found", "in", "the", "low", "-", "speed", "pellet", "in", "the", "absence", "of", "Triton", "X", "-", "100", ".", "Detergent", "extraction", "completely", "solubilizes", "Apg9p", "and", "causes", "it", "to", "appear", "in", "the", "supernatant", "fractionD", ",", "Strain", "CTD1", "harboring", "a", "multicopy", "3", "×", "HA", "APG9", "plasmid", "was", "grown", "in", "YPD", "and", "converted", "to", "spheroplasts", "as", "described", "in", "Materials", "and", "Methods", ".", "A", "crude", "lysate", "was", "prepared", "and", "treated", "with", "or", "without", "endo", "H", "as", "indicated", "overnight", "at", "37", "°", "C", "and", "analyzed", "by", "immunoblots", "with", "anti", "-", "HA", "antibodies", "or", "anti", "-", "CPY", "serum", ".", "Endo", "H", "treatment", "removes", "the", "N", "-", "linked", "glycosyl", "residues", "of", "CPY", ",", "causing", "a", "shift", "in", "its", "electrophoretic", "mobility", ".", "In", "contrast", ",", "Apg9p", "is", "not", "glycosylated", "and", "remains", "unchanged", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "endo", "H", "treatment", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Apg9p is an unglycosylated, integral membrane protein. A, Wild-type (WT; SEY6210), apg9Δ (JKY007), and the apg9Δ strain transformed with single copy (CEN) or multicopy (2μ) plasmids encoding APG9 were grown to log phase in SMD. Protein extracts were prepared and analyzed by immunoblot using antiserum to Apg9p. Apg9p is detected as an ∼125-kD protein.. B, Hydrophobicity analysis of Apg9p based on the Kyte-Doolittle algorithm (Kyte and Doolittle 1982) predicts six to eight transmembrane domains.C, Cells of wild-type strain YW5-1B were grown in YPD, converted to spheroplasts, and osmotically lysed as described in Materials and Methods. After a preclearing step to remove cell debris, the lysates were incubated with or without 1% Triton X-100 on ice for 30 min, as indicated. Centrifugation at 10,000 g for 1 h separated the lysate into supernatant (S) and pellet (P) fractions, which were analyzed by immunoblots with antiserum to Apg9p. Apg9p is found in the low-speed pellet in the absence of Triton X-100. Detergent extraction completely solubilizes Apg9p and causes it to appear in the supernatant fractionD, Strain CTD1 harboring a multicopy 3×HA APG9 plasmid was grown in YPD and converted to spheroplasts as described in Materials and Methods. A crude lysate was prepared and treated with or without endo H as indicated overnight at 37°C and analyzed by immunoblots with anti-HA antibodies or anti-CPY serum. Endo H treatment removes the N-linked glycosyl residues of CPY, causing a shift in its electrophoretic mobility. In contrast, Apg9p is not glycosylated and remains unchanged in the presence or absence of endo H treatment."}
{"words": ["Figure", "4Apg9p", "does", "not", "comigrate", "with", "typical", "endomembrane", "markers", "in", "sucrose", "density", "gradients", ".", "A", "and", "B", ",", "Strain", "STY1", "(", "pep4Δ", ")", "was", "grown", "in", "YPD", "to", "log", "-", "phase", ",", "and", "osmotically", "lysed", ".", "Lysates", "were", "precleared", ",", "loaded", "on", "a", "sucrose", "density", "gradient", "ranging", "from", "18", "-", "55", "%", "(", "wt", "/", "wt", ")", ",", "and", "centrifuged", "for", "2", ".", "5", "h", "at", "174", ",", "000", "g", "as", "described", "in", "Materials", "and", "Methods", ".", "Fractions", "were", "collected", "from", "the", "top", "(", "fraction", "number", "1", ")", "to", "the", "bottom", "(", "fraction", "number", "16", ")", ".", "Fractions", "were", "subjected", "to", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblot", "with", "antiserum", "against", "Apg9p", "and", ":", "in", "A", ",", "Kex2p", "(", "trans", "Golgi", "network", ")", ",", "Pho8p", "(", "vacuole", ")", ",", "and", "Pma1p", "(", "plasma", "membrane", ")", ";", "and", "in", "B", ",", "Sec12p", "(", "ER", ")", "and", "Pep12p", "(", "endosome", ")", ".", "The", "graphs", "in", "panels", "A", "and", "B", "are", "from", "the", "same", "gradient", ",", "but", "are", "presented", "separately", "for", "clarity", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Apg9p does not comigrate with typical endomembrane markers in sucrose density gradients. A and B, Strain STY1 (pep4Δ) was grown in YPD to log-phase, and osmotically lysed. Lysates were precleared, loaded on a sucrose density gradient ranging from 18-55% (wt/wt), and centrifuged for 2.5 h at 174,000 g as described in Materials and Methods. Fractions were collected from the top (fraction number 1) to the bottom (fraction number 16). Fractions were subjected to SDS-PAGE and immunoblot with antiserum against Apg9p and: in A, Kex2p (trans Golgi network), Pho8p (vacuole), and Pma1p (plasma membrane); and in B, Sec12p (ER) and Pep12p (endosome). The graphs in panels A and B are from the same gradient, but are presented separately for clarity."}
{"words": ["Figure", "5Apg9p", "does", "not", "comigrate", "with", "prAPI", "in", "a", "strain", "that", "accumulates", "Cvt", "/", "autophagic", "vesicles", ".", "Strain", "TK415", "(", "ypt7Δ", ")", "was", "grown", "in", "YPD", "to", "log", "-", "phase", ",", "and", "osmotically", "lysed", ".", "Lysates", "were", "precleared", ",", "centrifuged", "at", "100", ",", "000", "g", "for", "1", "h", ",", "and", "the", "pellet", "fraction", "resuspended", "and", "centrifuged", "a", "second", "time", ".", "The", "resulting", "pellet", "fraction", "was", "subsequently", "loaded", "on", "a", "sucrose", "density", "gradient", "ranging", "from", "18", "-", "55", "%", "(", "wt", "/", "wt", ")", ",", "and", "centrifuged", "for", "16", "h", "at", "174", ",", "000", "g", "as", "described", "in", "Materials", "and", "Methods", ".", "16", "fractions", "were", "collected", "starting", "from", "the", "top", "and", "subjected", "to", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblot", "with", "antisera", "against", "Apg9p", "and", "API", ".", "The", "graph", "represents", "an", "average", "of", "two", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Apg9p does not comigrate with prAPI in a strain that accumulates Cvt/autophagic vesicles. Strain TK415 (ypt7Δ) was grown in YPD to log-phase, and osmotically lysed. Lysates were precleared, centrifuged at 100,000 g for 1 h, and the pellet fraction resuspended and centrifuged a second time. The resulting pellet fraction was subsequently loaded on a sucrose density gradient ranging from 18-55% (wt/wt), and centrifuged for 16 h at 174,000 g as described in Materials and Methods. 16 fractions were collected starting from the top and subjected to SDS-PAGE and immunoblot with antisera against Apg9p and API. The graph represents an average of two experiments."}
{"words": ["Figure", "6Apg9p", "localizes", "to", "large", "perivacuolar", "punctate", "structures", ".", "Immunofluorescence", "microscopy", "of", "strains", "CTD1", "(", "apg9Δ", ")", ",", "KSL12C", "(", "vps4Δ", ")", ",", "and", "SKD6", "-", "1D", "(", "apg6Δ", ")", "transformed", "with", "the", "multicopy", "plasmid", "3", "×", "HA", "APG9", ".", "Cells", "were", "grown", "in", "YPD", "to", "log", "phase", "(", "vegetative", ")", ",", "and", "incubated", "further", "in", "SD", "(", "−", "N", ")", "medium", "with", "1", "mM", "PMSF", "for", "3", "h", "(", "starvation", ")", ".", "The", "cells", "were", "fixed", "with", "formaldehyde", "and", "examined", "by", "immunofluorescence", "microscopy", "as", "described", "in", "Materials", "and", "Methods", ".", "Anti", "-", "HA", "and", "FITC", "-", "conjugated", "antibodies", "mark", "Apg9p", "(", "left", ")", ",", "and", "the", "vacuole", "can", "be", "visualized", "by", "Nomarski", "optics", "(", "middle", ")", ".", "An", "overlay", "is", "shown", "in", "the", "right", "panels", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Apg9p localizes to large perivacuolar punctate structures. Immunofluorescence microscopy of strains CTD1 (apg9Δ), KSL12C (vps4Δ), and SKD6-1D (apg6Δ) transformed with the multicopy plasmid 3×HA APG9. Cells were grown in YPD to log phase (vegetative), and incubated further in SD(−N) medium with 1 mM PMSF for 3 h (starvation). The cells were fixed with formaldehyde and examined by immunofluorescence microscopy as described in Materials and Methods. Anti-HA and FITC-conjugated antibodies mark Apg9p (left), and the vacuole can be visualized by Nomarski optics (middle). An overlay is shown in the right panels."}
{"words": ["Figure", "7In", "vivo", "examination", "of", "the", "Apg9pGFP", "fusion", "protein", ".", "Wild", "-", "type", "(", "SEY6210", ")", "cells", "expressing", "Apg9pGFP", "from", "a", "multicopy", "plasmid", "were", "grown", "in", "SMD", "to", "midlog", "phase", "and", "labeled", "with", "FM", "4", "-", "64", "to", "stain", "the", "vacuoles", "as", "described", "in", "Materials", "and", "Methods", ".", "The", "labeled", "cells", "were", "viewed", "directly", "with", "a", "Leica", "DM", "IRB", "confocal", "microscope", ".", "Large", ",", "punctate", "Apg9pGFP", "structures", "appear", "juxtaposed", "to", "the", "FM", "4", "-", "64", "-", "labeled", "vacuole", "membranes", ".", "In", "addition", ",", "smaller", "punctate", "structures", "appear", "throughout", "the", "cytoplasm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7In vivo examination of the Apg9pGFP fusion protein. Wild-type (SEY6210) cells expressing Apg9pGFP from a multicopy plasmid were grown in SMD to midlog phase and labeled with FM 4-64 to stain the vacuoles as described in Materials and Methods. The labeled cells were viewed directly with a Leica DM IRB confocal microscope. Large, punctate Apg9pGFP structures appear juxtaposed to the FM 4-64-labeled vacuole membranes. In addition, smaller punctate structures appear throughout the cytoplasm."}
{"words": ["Figure", "8Ultrastructural", "localization", "of", "Apg9p", "for", "immunoelectron", "microscopy", ".", "Strain", "STY1", "(", "pep4Δ", ")", "expressing", "3", "×", "HA", "Apg9p", "was", "grown", "in", "YPD", "to", "log", "phase", "and", "transferred", "to", "SD", "(", "−", "N", ")", "medium", "for", "2", "h", ".", "The", "cells", "were", "fixed", "and", "stained", "with", "anti", "-", "HA", "antibody", "and", "5", "-", "nm", "colloidal", "gold", "-", "conjugated", "goat", "anti", "-", "mouse", "IgG", "as", "described", "in", "Materials", "and", "Methods", ".", "A", ",", "Section", "showing", "autophagic", "bodies", "in", "the", "vacuole", "lumen", ".", "B", ",", "Section", "showing", "a", "cytosolic", "autophagosome", ".", "Apg9p", "is", "seen", "in", "patches", "near", "the", "vacuole", ",", "but", "not", "on", "autophagic", "bodies", "or", "autophagosomes", ".", "AB", ",", "autophagic", "body", ";", "AP", ",", "autophagosome", ";", "N", ",", "nucleus", ";", "V", ",", "vacuole", ";", "VM", ",", "vacuolar", "membrane", ".", "Arrows", "point", "to", "areas", "of", "concentrated", "Apg9p", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8Ultrastructural localization of Apg9p for immunoelectron microscopy. Strain STY1 (pep4Δ) expressing 3×HA Apg9p was grown in YPD to log phase and transferred to SD(−N) medium for 2 h. The cells were fixed and stained with anti-HA antibody and 5-nm colloidal gold-conjugated goat anti-mouse IgG as described in Materials and Methods. A, Section showing autophagic bodies in the vacuole lumen. B, Section showing a cytosolic autophagosome. Apg9p is seen in patches near the vacuole, but not on autophagic bodies or autophagosomes. AB, autophagic body; AP, autophagosome; N, nucleus; V, vacuole; VM, vacuolar membrane. Arrows point to areas of concentrated Apg9p."}
{"words": ["Figure", "9Vesicle", "accumulation", "test", "and", "kinetic", "analysis", "of", "prAPI", "import", "in", "the", "temperature", "conditional", "Apg9p", "mutant", ".", "A", ",", "Morphological", "analysis", "of", "apg9Δ", "indicates", "an", "import", "defect", "at", "an", "early", "step", "in", "the", "pathway", ".", "Wild", "-", "type", "(", "YW5", "-", "1B", ")", "and", "apg9Δ", "(", "CTD1", ")", "cells", "were", "grown", "in", "YPD", "(", "vegetative", ")", "or", "transferred", "to", "SD", "(", "−", "N", ")", "(", "starvation", ")", "for", "3", "h", "in", "the", "presence", "of", "PMSF", "(", "starvation", ")", "and", "examined", "by", "DIC", "(", "Nomarski", ")", "microscopy", "(", "Zeiss", "Axioplan", ")", ".", "PMSF", "inhibits", "the", "degradation", "of", "autophagic", "bodies", ".", "Under", "starvation", "conditions", ",", "wild", "-", "type", "cells", "accumulate", "autophagic", "bodies", "when", "vesicle", "breakdown", "is", "blocked", ".", "However", ",", "under", "the", "same", "conditions", ",", "apg9Δ", "cells", "do", "not", "accumulate", "autophagic", "bodies", ",", "indicating", "that", "Apg9p", "is", "required", "for", "a", "step", "before", "vesicle", "fusion", "and", "release", "of", "the", "autophagic", "body", "into", "the", "vacuolar", "lumen", ".", "The", "apg9Δ", "strain", "transformed", "with", "the", "APG9", "plasmid", "shows", "the", "same", "result", "as", "wild", "-", "type", "(", "data", "not", "shown", ")", ".", "B", ",", "The", "apg9ts", "strain", "is", "tightly", "blocked", "for", "prAPI", "import", "at", "nonpermissive", "temperature", ".", "Wild", "-", "type", "(", "SEY6210", ")", "and", "apg9Δ", "(", "JKY007", ")", "cells", "transformed", "with", "the", "apg9ts", "centromeric", "plasmid", "were", "incubated", "at", "24", "and", "38", "°", "C", "for", "5", "min", ",", "pulse", "-", "labeled", "for", "10", "min", ",", "and", "then", "subjected", "to", "nonradioactive", "chase", "reactions", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Samples", "at", "each", "time", "point", "were", "immunoprecipitated", "with", "antiserum", "to", "API", "and", "resolved", "by", "SDS", "-", "PAGE", "as", "described", "in", "Materials", "and", "Methods", ".", "API", "-", "immunoprecipitated", "bands", "were", "quantified", "by", "a", "Molecular", "Dynamics", "STORM", "PhosphorImager", "and", "the", "results", "are", "presented", "in", "the", "graph", ".", "The", "percent", "mature", "API", "was", "determined", "by", "dividing", "the", "mature", "API", "value", "over", "the", "sum", "of", "the", "precursor", "and", "mature", "API", "values", "for", "each", "time", "point", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 9Vesicle accumulation test and kinetic analysis of prAPI import in the temperature conditional Apg9p mutant. A, Morphological analysis of apg9Δ indicates an import defect at an early step in the pathway. Wild-type (YW5-1B) and apg9Δ (CTD1) cells were grown in YPD (vegetative) or transferred to SD(−N) (starvation) for 3 h in the presence of PMSF (starvation) and examined by DIC (Nomarski) microscopy (Zeiss Axioplan). PMSF inhibits the degradation of autophagic bodies. Under starvation conditions, wild-type cells accumulate autophagic bodies when vesicle breakdown is blocked. However, under the same conditions, apg9Δ cells do not accumulate autophagic bodies, indicating that Apg9p is required for a step before vesicle fusion and release of the autophagic body into the vacuolar lumen. The apg9Δ strain transformed with the APG9 plasmid shows the same result as wild-type (data not shown). B, The apg9ts strain is tightly blocked for prAPI import at nonpermissive temperature. Wild-type (SEY6210) and apg9Δ (JKY007) cells transformed with the apg9ts centromeric plasmid were incubated at 24 and 38°C for 5 min, pulse-labeled for 10 min, and then subjected to nonradioactive chase reactions for the indicated times. Samples at each time point were immunoprecipitated with antiserum to API and resolved by SDS-PAGE as described in Materials and Methods. API-immunoprecipitated bands were quantified by a Molecular Dynamics STORM PhosphorImager and the results are presented in the graph. The percent mature API was determined by dividing the mature API value over the sum of the precursor and mature API values for each time point."}
{"words": ["Figure", "10Analysis", "of", "the", "apg9ts", "strain", "indicates", "Apg9p", "is", "directly", "required", "for", "the", "vesicle", "formation", "step", ".", "A", ",", "The", "nature", "of", "prAPI", "binding", "and", "pelleting", "in", "the", "apg9ts", "strain", ".", "Spheroplasts", "of", "apg9ts", "were", "labeled", "for", "10", "min", "and", "chased", "for", "30", "min", "at", "38", "°", "C", ".", "The", "spheroplasts", "were", "osmotically", "lysed", "in", "a", "buffer", "containing", "no", "salt", "(", "20", "mM", "Pipes", ",", "pH", "6", ".", "8", ")", "or", "a", "physiological", "concentration", "of", "salt", "(", "100", "mM", "KOAc", ",", "50", "mM", "KCl", ",", "5", "mM", "MgCl2", ",", "20", "mM", "Pipes", ",", "pH", "6", ".", "8", ")", "and", "pelleted", "at", "5", ",", "000", "g", ".", "All", "samples", "were", "immunoprecipitated", "with", "antiserum", "to", "API", "and", "the", "cytosolic", "marker", "PGK", ".", "apg9ts", "retains", "the", "salt", "dependent", "binding", "and", "pelleting", "of", "prAPI", ".", "B", ",", "prAPI", "in", "the", "apg9ts", "strain", "accumulates", "in", "both", "a", "membrane", "-", "associated", "state", "and", "a", "large", "pelletable", "complex", ".", "Spheroplasts", "of", "apg9ts", "and", "ypt7Δ", "were", "labeled", "for", "10", "min", "and", "chased", "for", "30", "min", "at", "38", "°", "C", ".", "The", "labeled", "spheroplasts", "were", "then", "osmotically", "lysed", "and", "separated", "into", "supernatant", "(", "S", ")", "and", "pellet", "(", "P", ")", "fractions", "by", "centrifugation", "at", "5", ",", "000", "g", "for", "5", "min", ".", "An", "aliquot", "was", "removed", "for", "the", "total", "lysate", "control", "(", "T", ")", ".", "The", "pellet", "fraction", "(", "P", ")", "was", "resuspended", "in", "15", "%", "Ficoll", "-", "400", "in", "gradient", "buffer", "(", "20", "mM", "Pipes", ",", "5", "mM", "MgCl2", ",", "complete", "EDTA", "-", "free", "protease", "inhibitor", "cocktail", ")", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "Triton", "X", "-", "100", "and", "overlaid", "with", "13", "and", "2", "%", "Ficoll", "-", "400", "in", "gradient", "buffer", ".", "The", "step", "gradients", "were", "centrifuged", "at", "13", ",", "000", "g", "for", "10", "min", ".", "Membrane", "-", "containing", "float", "(", "F", ")", ",", "nonfloat", "(", "NF", ")", ",", "and", "pellet", "(", "P2", ")", "fractions", "were", "immunoprecipitated", "with", "antiserum", "to", "API", "as", "described", "in", "Materials", "and", "Methods", ".", "The", "position", "of", "prAPI", "is", "indicated", ".", "C", ",", "prAPI", "in", "the", "apg9ts", "strain", "is", "protease", "accessible", ".", "Spheroplasts", "isolated", "from", "apg9ts", "and", "ypt7Δ", "cells", "were", "pulse", "-", "labeled", "for", "10", "min", "and", "chased", "for", "30", "min", "at", "38", "°", "C", ".", "The", "labeled", "spheroplasts", "were", "then", "osmotically", "lysed", "and", "separated", "into", "low", "-", "speed", "supernatant", "(", "S", ")", "and", "pellet", "(", "P", ")", "fractions", "after", "a", "5", ",", "000", "g", "centrifugation", "step", ".", "The", "pellet", "fractions", "were", "subjected", "to", "protease", "treatment", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "0", ".", "2", "%", "Triton", "X", "-", "100", "as", "described", "in", "Materials", "and", "Methods", ".", "The", "resulting", "samples", "were", "immunoprecipitated", "with", "antiserum", "to", "API", "and", "PGK", ".", "The", "immunoprecipitated", "bands", "were", "quantified", "by", "a", "Molecular", "Dynamics", "STORM", "PhosphorImager", ".", "The", "percent", "protease", "-", "protected", "prAPI", "was", "determined", "by", "dividing", "the", "value", "for", "prAPI", "in", "the", "protease", "-", "treated", "sample", "by", "the", "value", "for", "total", "prAPI", "before", "protease", "treatment", ".", "The", "percent", "PGK", "was", "determined", "by", "dividing", "the", "supernatant", "(", "S", ")", "or", "pellet", "(", "P", ")", "value", "over", "the", "sum", "of", "the", "S", "and", "P", "values", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 10Analysis of the apg9ts strain indicates Apg9p is directly required for the vesicle formation step. A, The nature of prAPI binding and pelleting in the apg9ts strain. Spheroplasts of apg9ts were labeled for 10 min and chased for 30 min at 38°C. The spheroplasts were osmotically lysed in a buffer containing no salt (20 mM Pipes, pH 6.8) or a physiological concentration of salt (100 mM KOAc, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 20 mM Pipes, pH 6.8) and pelleted at 5,000 g. All samples were immunoprecipitated with antiserum to API and the cytosolic marker PGK. apg9ts retains the salt dependent binding and pelleting of prAPI. B, prAPI in the apg9ts strain accumulates in both a membrane-associated state and a large pelletable complex. Spheroplasts of apg9ts and ypt7Δ were labeled for 10 min and chased for 30 min at 38°C. The labeled spheroplasts were then osmotically lysed and separated into supernatant (S) and pellet (P) fractions by centrifugation at 5,000 g for 5 min. An aliquot was removed for the total lysate control (T). The pellet fraction (P) was resuspended in 15% Ficoll-400 in gradient buffer (20 mM Pipes, 5 mM MgCl2, complete EDTA-free protease inhibitor cocktail) in the presence or absence of Triton X-100 and overlaid with 13 and 2% Ficoll-400 in gradient buffer. The step gradients were centrifuged at 13,000 g for 10 min. Membrane-containing float (F), nonfloat (NF), and pellet (P2) fractions were immunoprecipitated with antiserum to API as described in Materials and Methods. The position of prAPI is indicated. C, prAPI in the apg9ts strain is protease accessible. Spheroplasts isolated from apg9ts and ypt7Δ cells were pulse-labeled for 10 min and chased for 30 min at 38°C. The labeled spheroplasts were then osmotically lysed and separated into low-speed supernatant (S) and pellet (P) fractions after a 5,000 g centrifugation step. The pellet fractions were subjected to protease treatment in the absence or presence of 0.2% Triton X-100 as described in Materials and Methods. The resulting samples were immunoprecipitated with antiserum to API and PGK. The immunoprecipitated bands were quantified by a Molecular Dynamics STORM PhosphorImager. The percent protease-protected prAPI was determined by dividing the value for prAPI in the protease-treated sample by the value for total prAPI before protease treatment. The percent PGK was determined by dividing the supernatant (S) or pellet (P) value over the sum of the S and P values."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "b", ")", "Volcano", "plots", "of", "up", "(", "red", ")", "and", "down", "(", "blue", ")", "regulated", "genes", "(", "compared", "to", "healthy", "control", "samples", ")", "in", "S", ".", "Typhi", "and", "S", ".", "Paratyphi", "A", "positive", "individuals", "(", "Nepal", "and", "Oxford", ")", ".", "Black", "numbers", "indicate", "the", "up", "-", "and", "down", "-", "regulated", "genes", "compared", "to", "healthy", "controls", ".", "(", "d", "-", "e", ")", "Scatter", "plots", "of", "BTMs", "enriched", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", "in", "blood", "-", "culture", "positive", "samples", "in", "Nepal", "(", "y", "-", "axis", ")", "versus", "Oxford", "(", "x", "-", "axis", ")", "for", "typhoid", "fever", "(", "d", ")", "and", "paratyphoid", "fever", "(", "e", ")", ".", "For", "further", "details", "on", "BTMs", "refer", "to", "reference", "(", "Chaussabel", "et", "al", ".", ",", "2014", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(b) Volcano plots of up (red) and down (blue) regulated genes (compared to healthy control samples) in S. Typhi and S. Paratyphi A positive individuals (Nepal and Oxford). Black numbers indicate the up- and down-regulated genes compared to healthy controls.(d-e) Scatter plots of BTMs enriched (p>0.05) in blood-culture positive samples in Nepal (y-axis) versus Oxford (x-axis) for typhoid fever (d) and paratyphoid fever (e). For further details on BTMs refer to reference (Chaussabel et al., 2014)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "a", ")", "Single", "-", "sample", "GSEA", "Normalised", "Enrichment", "Scores", "(", "NES", ")", "of", "IFN", "and", "DC", "BTMs", "of", "individuals", "with", "blood", "-", "culture", "confirmed", "enteric", "fever", "in", "Nepal", "and", "Oxford", ".", "(", "b", ")", "Heatmap", "of", "the", "500", "most", "variably", "expressed", "genes", "in", "samples", "of", "the", "Nepali", "cohort", ".", "Bar", "graph", "on", "top", "of", "the", "heatmap", "shows", "temperature", "of", "each", "individual", "at", "the", "time", "of", "sampling", ".", "Three", "samples", "labelled", "as", "'", "03NP", "-", "CONT", "'", "are", "samples", "that", "grew", "bacterial", "contaminants", "and", "were", "thus", "excluded", "from", "the", "entire", "analysis", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(a) Single-sample GSEA Normalised Enrichment Scores (NES) of IFN and DC BTMs of individuals with blood-culture confirmed enteric fever in Nepal and Oxford.(b) Heatmap of the 500 most variably expressed genes in samples of the Nepali cohort. Bar graph on top of the heatmap shows temperature of each individual at the time of sampling. Three samples labelled as '03NP-CONT' are samples that grew bacterial contaminants and were thus excluded from the entire analysis."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "d", ")", "Combined", "expression", "score", "for", "samples", "based", "on", "the", "5", "-", "gene", "signature", "for", "samples", "in", "the", "discovery", "cohort", "(", "top", ")", "and", "validation", "cohort", "(", "bottom", ")", ".", "Ox", ".", "CTRL", ":", "Oxford", "controls", "(", "D0", ")", ";", "CTRL", ":", "Nepali", "control", "samples", ".", "PTB", ":", "pulmonary", "TB", ";", "DENV", ":", "Dengue", "samples", ";", "bsPf", ":", "blood", "-", "stage", "P", ".", "falciparum", ";", "SPT", ":", "S", ".", "Paratyphi", "A", ";", "ST", ":", "S", ".", "Typhi", ".", "ST", "and", "SPT", "samples", "are", "derived", "from", "the", "challenge", "models", "as", "well", "as", "from", "Nepal", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(d) Combined expression score for samples based on the 5-gene signature for samples in the discovery cohort (top) and validation cohort (bottom). Ox.CTRL: Oxford controls (D0); CTRL: Nepali control samples. PTB: pulmonary TB; DENV: Dengue samples; bsPf: blood-stage P. falciparum; SPT: S. Paratyphi A; ST: S. Typhi. ST and SPT samples are derived from the challenge models as well as from Nepal."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "b", ")", "Dot", "plot", "of", "prediction", "probability", "of", "being", "class", "EF", "versus", "the", "expression", "score", "calculated", "on", "the", "bases", "of", "the", "5", "-", "gene", "signature", "(", "based", "on", "gene", "array", "data", ")", ".", "(", "c", ")", "qPCR", "gene", "expression", "scores", "of", "the", "5", "-", "gene", "signature", "(", "∆", "∆", "CT", "over", "PPIA", ")", "for", "CTRLs", ",", "03NP", "-", "sEF", ",", "03NP", "-", "SPT", "and", "03NP", "-", "ST", "samples", "from", "Nepal", ".", "Yellow", "diamonds", "in", "the", "03NP", "-", "sEF", "category", "represent", "the", "9", "patients", "classified", "as", "EF", "based", "on", "the", "random", "forest", "algorithm", ".", "(", "d", ")", "qPCR", "expression", "values", "(", "∆", "∆", "Ct", "over", "PPIA", ")", "of", "the", "5", "-", "gene", "signature", "in", "control", "samples", "(", "Oxford", "and", "Nepal", ")", ",", "S", ".", "Paratyphi", "A", "(", "03NP", "-", "SPT", ")", "or", "S", ".", "Typhi", "(", "03NP", "-", "ST", ")", "in", "Nepal", ",", "samples", "at", "day", "7", "after", "challenge", "of", "participants", "who", "stayed", "well", "following", "challenge", "with", "S", ".", "Typhi", "(", "nD7", ")", ",", "or", "typhoid", "diagnosis", "after", "challenge", "(", "TD", ")", "in", "the", "Vi", "-", "TCV", "study", "(", "e", ")", "Combined", "qPCR", "expression", "score", "of", "the", "5", "-", "gene", "signature", ".", "Black", "arrows", "indicate", "outlier", "samples", ".", "(", "f", ")", "Temperature", "and", "CRP", "for", "samples", "of", "which", "data", "was", "available", "(", "CRP", "was", "only", "measured", "in", "the", "Oxford", "CHIM", ")", ".", "D0", "=", "pre", "-", "challenge", "baseline", "Vi", "-", "TCV", "study", ";", "nD7", "=", "day", "7", "samples", "of", "participants", "who", "stayed", "well", "following", "challenge", "(", "Vi", "-", "TCV", "study", ")", ";", "SPT", "=", "S", ".", "Paratyphi", "A", "(", "03NP", ")", ";", "ST", "=", "S", ".", "Typhi", "(", "03NP", ")", ";", "TD", "=", "Typhoid", "diagnosis", "(", "Vi", "-", "TCV", "study", ")", ".", "(", "g", ")", "Spearman", "'", "s", "rank", "correlation", "of", "the", "5", "-", "gene", "combined", "expression", "score", "and", "(", "left", ")", "temperature", "(", "only", "nD7", "and", "TD", "samples", "from", "the", "Oxford", "CHIM", "-", "Vi", "-", "TCV", "and", "SPT", "and", "ST", "cases", "from", "Nepal", "at", "presentation", "to", "hospital", "were", "included", ")", "and", "(", "right", ")", "CRP", "(", "CRP", "was", "only", "available", "for", "Oxford", "CHIM", "-", "Vi", "-", "TCV", "samples", "and", "we", "excluded", "D0", "baseline", "measures", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(b) Dot plot of prediction probability of being class EF versus the expression score calculated on the bases of the 5-gene signature (based on gene array data).(c) qPCR gene expression scores of the 5-gene signature (∆∆CT over PPIA) for CTRLs, 03NP-sEF, 03NP-SPT and 03NP-ST samples from Nepal. Yellow diamonds in the 03NP-sEF category represent the 9 patients classified as EF based on the random forest algorithm.(d) qPCR expression values (∆∆Ct over PPIA) of the 5-gene signature in control samples (Oxford and Nepal), S. Paratyphi A (03NP-SPT) or S. Typhi (03NP-ST) in Nepal, samples at day 7 after challenge of participants who stayed well following challenge with S. Typhi (nD7), or typhoid diagnosis after challenge (TD) in the Vi-TCV study(e) Combined qPCR expression score of the 5-gene signature. Black arrows indicate outlier samples.(f) Temperature and CRP for samples of which data was available (CRP was only measured in the Oxford CHIM). D0 = pre-challenge baseline Vi-TCV study; nD7 = day 7 samples of participants who stayed well following challenge (Vi-TCV study); SPT = S. Paratyphi A (03NP); ST = S. Typhi (03NP); TD = Typhoid diagnosis (Vi-TCV study). (g) Spearman's rank correlation of the 5-gene combined expression score and (left) temperature (only nD7 and TD samples from the Oxford CHIM - Vi-TCV and SPT and ST cases from Nepal at presentation to hospital were included) and (right) CRP (CRP was only available for Oxford CHIM - Vi-TCV samples and we excluded D0 baseline measures)."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "NLK", "but", "not", "kinase", "-", "negative", "NLK", "(", "Flag", "-", "NLK", "-", "KM", ";", "K155M", ")", "caused", "mobility", "shift", "of", "EGFP", "-", "YAP", ".", "EGFP", "-", "YAP", "was", "transfected", "with", "empty", "vector", ",", "Flag", "-", "NLK", "-", "WT", ",", "or", "Flag", "-", "NLK", "-", "KM", "into", "HEK293T", "cells", ".", "Mobility", "shift", "was", "shown", "by", "immunoblotting", ".", "B", ".", "NLK", "phosphorylates", "YAP", "in", "vitro", ".", "Flag", "-", "NLK", "-", "WT", ",", "or", "Flag", "-", "NLK", "-", "KM", "was", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "Flag", "antibody", "from", "cell", "lysates", "of", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "each", "plasmid", "and", "subjected", "to", "in", "vitro", "kinase", "assay", "with", "bacterially", "purified", "GST", "-", "YAP", "in", "the", "presence", "of", "[", "32P", "-", "ATP", "]", ".", "Phosphorylation", "of", "GST", "-", "YAP", "and", "autophosphorylation", "of", "NLK", "were", "examined", "by", "autoradiography", "(", "top", "panel", ")", ",", "and", "Coomassie", "Blue", "staining", "showed", "similar", "levels", "of", "GST", "-", "YAP", "and", "Flag", "-", "NLK", "(", "bottom", "panel", ")", ".", "C", ".", "NLK", "interacts", "with", "YAP", "at", "the", "endogenous", "level", ".", "Immunoprecipitates", "from", "HEK293T", "cell", "lysates", "with", "indicated", "antibody", "were", "blotted", "with", "anti", "-", "YAP", "or", "anti", "-", "NLK", "antibody", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. NLK but not kinase-negative NLK (Flag-NLK-KM; K155M) caused mobility shift of EGFP-YAP. EGFP-YAP was transfected with empty vector, Flag-NLK-WT, or Flag-NLK-KM into HEK293T cells. Mobility shift was shown by immunoblotting.B. NLK phosphorylates YAP in vitro. Flag-NLK-WT, or Flag-NLK-KM was immunoprecipitated with anti-Flag antibody from cell lysates of HEK293T cells transfected with each plasmid and subjected to in vitro kinase assay with bacterially purified GST-YAP in the presence of [32P-ATP]. Phosphorylation of GST-YAP and autophosphorylation of NLK were examined by autoradiography (top panel), and Coomassie Blue staining showed similar levels of GST-YAP and Flag-NLK (bottom panel).C. NLK interacts with YAP at the endogenous level. Immunoprecipitates from HEK293T cell lysates with indicated antibody were blotted with anti-YAP or anti-NLK antibody."}
{"words": ["Figure", "2B", ".", "NLK", "-", "WT", "but", "not", "NLK", "-", "KM", "reduces", "Ser127", "phosphorylation", "of", "endogenous", "YAP", ".", "Cell", "lysates", "from", "HEK293", "cells", "transfected", "with", "empty", "vector", "(", "-", ")", ",", "Flag", "-", "NLK", "-", "WT", ",", "or", "Flag", "-", "NLK", "-", "KM", "were", "immunoblotted", "with", "antibodies", "shown", "in", "the", "figure", "(", "left", "panel", ")", ".", "The", "ratio", "of", "p", "-", "YAP", "(", "S127", ")", "or", "p", "-", "YAP", "(", "S397", ")", "/", "total", "-", "YAP", "of", "three", "independent", "western", "blots", "was", "quantified", "(", "right", "panel", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "sem", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "Student", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ".", "C", ".", "Deficiency", "of", "NLK", "leads", "to", "increased", "YAP", "phosphorylation", "at", "Ser127", ".", "Lysates", "from", "wild", "type", "and", "two", "independent", "NLK", "knockout", "HEK293", "cells", "were", "immunoblotted", "with", "antibodies", "indicated", "in", "the", "figure", "(", "left", "panel", ")", ".", "The", "ratio", "of", "p", "-", "YAP", "(", "S127", ")", "or", "p", "-", "YAP", "(", "S397", ")", "/", "total", "-", "YAP", "of", "three", "independent", "western", "blots", "was", "quantified", "(", "right", "panel", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "sem", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "and", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "Student", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", ".", "D", ".", "Ectopic", "expression", "of", "NLK", "attenuates", "YAP", "phosphorylation", "at", "Ser127", "while", "increases", "phosphorylation", "at", "Ser128", ".", "Cell", "lysates", "from", "HEK293", "cells", "transfected", "with", "empty", "vector", "(", "-", ")", ",", "Flag", "-", "NLK", "-", "WT", ",", "or", "Flag", "-", "NLK", "-", "KM", "were", "immunoblotted", "with", "antibodies", "shown", "in", "the", "figure", ".", "E", ".", "Substitution", "of", "Ser127", "with", "alanine", "enhances", "phosphorylation", "at", "Ser128", ",", "and", "vice", "versa", ".", "Cell", "lysates", "from", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "empty", "vector", "(", "-", ")", ",", "EGFP", "-", "YAP", ",", "EGFP", "-", "YAP", "-", "S127A", ",", "or", "EGFP", "-", "YAP", "-", "S128A", "were", "immunoblotted", "with", "antibodies", "shown", "in", "the", "figure", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B. NLK-WT but not NLK-KM reduces Ser127 phosphorylation of endogenous YAP. Cell lysates from HEK293 cells transfected with empty vector (-), Flag-NLK-WT, or Flag-NLK-KM were immunoblotted with antibodies shown in the figure (left panel). The ratio of p-YAP(S127) or p-YAP(S397)/total-YAP of three independent western blots was quantified (right panel). Data are presented as mean ± sem. **P < 0.01. Student t-test was used for statistical analysis.C. Deficiency of NLK leads to increased YAP phosphorylation at Ser127. Lysates from wild type and two independent NLK knockout HEK293 cells were immunoblotted with antibodies indicated in the figure (left panel). The ratio of p-YAP(S127) or p-YAP(S397)/total-YAP of three independent western blots was quantified (right panel). Data are presented as mean ± sem. *P < 0.05 and **P < 0.01. Student t-test was used for statistical analysis.D. Ectopic expression of NLK attenuates YAP phosphorylation at Ser127 while increases phosphorylation at Ser128. Cell lysates from HEK293 cells transfected with empty vector (-), Flag-NLK-WT, or Flag-NLK-KM were immunoblotted with antibodies shown in the figure.E. Substitution of Ser127 with alanine enhances phosphorylation at Ser128, and vice versa. Cell lysates from HEK293T cells transfected with empty vector (-), EGFP-YAP, EGFP-YAP-S127A, or EGFP-YAP-S128A were immunoblotted with antibodies shown in the figure."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "Ectopic", "expression", "of", "NLK", "attenuates", "interaction", "between", "YAP", "and", "14", "-", "3", "-", "3", ".", "Lysates", "from", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "plasmids", "indicated", "in", "the", "figure", "were", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "HA", "antibody", "and", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "GFP", "antibody", "(", "top", "two", "panels", ")", ".", "Whole", "cell", "lysates", "(", "WCL", ")", "were", "immunoblotted", "with", "antibodies", "shown", "in", "the", "figure", "(", "bottom", "three", "panels", ")", ".", "B", ".", "Deficiency", "of", "NLK", "leads", "to", "increased", "interaction", "between", "YAP", "and", "14", "-", "3", "-", "3", ".", "Lysates", "from", "NLK", "knockout", "HEK293", "cells", "were", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "YAP", "antibody", "and", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "14", "-", "3", "-", "3", "antibody", "(", "top", "two", "panels", ")", ".", "WCL", "were", "immunoblotted", "with", "antibodies", "indicated", "in", "the", "figure", "(", "bottom", "three", "panels", ")", ".", "C", ".", "Phosphorylation", "status", "of", "Ser127", "or", "Ser128", "determines", "interaction", "between", "14", "-", "3", "-", "3", "and", "YAP", ".", "Lysates", "from", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "plasmids", "indicated", "in", "the", "figure", "were", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "Flag", "antibody", "and", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "HA", "antibodies", "(", "top", "two", "panels", ")", ".", "Lysates", "were", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "HA", "or", "anti", "-", "Flag", "antibodies", "(", "bottom", "two", "panels", ")", ".", "\"", "n", ".", "s", ".", "\"", "arrow", "indicates", "a", "non", "-", "specific", "band", "also", "visible", "in", "the", "non", "-", "transfected", "lane", ".", "D", ".", "Phosphorylation", "status", "of", "Ser127", "or", "Ser128", "determines", "subcellular", "localization", "of", "YAP", ".", "Immunofluorescence", "analysis", "was", "performed", "in", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "EGFP", "-", "YAP", ",", "EGFP", "-", "YAP", "-", "S127A", ",", "EGFP", "-", "YAP", "-", "S128A", ",", "or", "EGFP", "-", "YAP", "-", "S128D", "at", "high", "cell", "density", ".", "Figure", "shows", "a", "representative", "of", "multiple", "areas", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "Hoechst", "33342", ".", "Scale", "bars", ":", "20", "μm", ".", "E", ".", "NLK", "knockout", "leads", "to", "increased", "cytoplasmic", "localization", "of", "endogenous", "YAP", ".", "Immunoblot", "analysis", "shows", "significant", "reduction", "of", "NLK", "level", "in", "NLK", "knockout", "HEK293", "cell", "pools", "(", "top", "panel", ")", ".", "E", ".", "NLK", "knockout", "leads", "to", "increased", "cytoplasmic", "localization", "of", "endogenous", "YAP", ".", "To", "determine", "subcellular", "localization", "of", "YAP", "indirect", "immunofluorescence", "analysis", "was", "performed", "in", "NLK", "knockout", "HEK293", "cell", "pools", "(", "bottom", "panel", ")", ".", "Figure", "shows", "a", "representative", "of", "multiple", "areas", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", ".", "Scale", "bars", ":", "20", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. Ectopic expression of NLK attenuates interaction between YAP and 14-3-3. Lysates from HEK293T cells transfected with plasmids indicated in the figure were immunoprecipitated with anti-HA antibody and immunoblotted with anti-GFP antibody (top two panels). Whole cell lysates (WCL) were immunoblotted with antibodies shown in the figure (bottom three panels).B. Deficiency of NLK leads to increased interaction between YAP and 14-3-3. Lysates from NLK knockout HEK293 cells were immunoprecipitated with anti-YAP antibody and immunoblotted with anti-14-3-3 antibody (top two panels). WCL were immunoblotted with antibodies indicated in the figure (bottom three panels).C. Phosphorylation status of Ser127 or Ser128 determines interaction between 14-3-3 and YAP. Lysates from HEK293T cells transfected with plasmids indicated in the figure were immunoprecipitated with anti-Flag antibody and immunoblotted with anti-HA antibodies (top two panels). Lysates were immunoblotted with anti-HA or anti-Flag antibodies (bottom two panels). \"n.s.\" arrow indicates a non-specific band also visible in the non-transfected lane.D. Phosphorylation status of Ser127 or Ser128 determines subcellular localization of YAP. Immunofluorescence analysis was performed in HeLa cells transfected with EGFP-YAP, EGFP-YAP-S127A, EGFP-YAP-S128A, or EGFP-YAP-S128D at high cell density. Figure shows a representative of multiple areas. Nuclei were stained with Hoechst 33342. Scale bars: 20 μm.E. NLK knockout leads to increased cytoplasmic localization of endogenous YAP. Immunoblot analysis shows significant reduction of NLK level in NLK knockout HEK293 cell pools (top panel).E. NLK knockout leads to increased cytoplasmic localization of endogenous YAP. To determine subcellular localization of YAP indirect immunofluorescence analysis was performed in NLK knockout HEK293 cell pools (bottom panel). Figure shows a representative of multiple areas. Nuclei were stained with DAPI. Scale bars: 20 μm."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "Localization", "of", "endogenous", "YAP", "and", "NLK", "in", "low", "(", "LD", ")", "or", "high", "density", "(", "HD", ")", "MCF10A", "(", "upper", "panel", ")", "or", "NIH3T3", "cells", "(", "bottom", "panel", ")", "was", "examined", "by", "indirect", "immunofluorescence", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", ".", "Scale", "bars", ":", "20", "μm", ".", "B", ".", "Level", "of", "NLK", "decreases", "in", "a", "cell", "density", "-", "dependent", "manner", ".", "Lysates", "from", "low", "(", "LD", ")", "and", "high", "density", "(", "HD", ")", "of", "MCF10A", ",", "HEK293T", ",", "and", "NIH3T3", "cells", "were", "immunoblotted", "with", "antibodies", "indicated", "in", "the", "figure", ".", "C", ".", "Level", "of", "endogenous", "NLK", "mRNA", "is", "unaffected", ",", "whereas", "the", "expression", "of", "YAP", "target", "genes", "was", "reduced", ",", "at", "high", "cell", "density", ".", "Quantitative", "real", "-", "time", "PCR", "analyses", "for", "expression", "of", "AMOTL2", ",", "CTGF", ",", "CYR61", ",", "and", "NLK", "in", "low", "(", "LD", ")", "and", "high", "density", "(", "HD", ")", "NIH3T3", "cells", "were", "performed", ".", "Quantification", "of", "AMOTL2", ",", "CTGF", ",", "CYR61", ",", "and", "NLK", "mRNA", "was", "normalized", "with", "the", "level", "of", "Gapdh", ".", "Data", "represent", "average", "values", "from", "a", "representative", "of", "multiple", "experiments", "performed", "in", "triplicate", ".", "Error", "bars", "indicate", "standard", "deviations", "of", "triplicate", "measurements", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "sem", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "and", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "005", ".", "Student", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. Localization of endogenous YAP and NLK in low (LD) or high density (HD) MCF10A (upper panel) or NIH3T3 cells (bottom panel) was examined by indirect immunofluorescence. Nuclei were stained with DAPI. Scale bars: 20 μm.B. Level of NLK decreases in a cell density-dependent manner. Lysates from low (LD) and high density (HD) of MCF10A, HEK293T, and NIH3T3 cells were immunoblotted with antibodies indicated in the figure.C. Level of endogenous NLK mRNA is unaffected, whereas the expression of YAP target genes was reduced, at high cell density. Quantitative real-time PCR analyses for expression of AMOTL2, CTGF, CYR61, and NLK in low (LD) and high density (HD) NIH3T3 cells were performed. Quantification of AMOTL2, CTGF, CYR61, and NLK mRNA was normalized with the level of Gapdh. Data represent average values from a representative of multiple experiments performed in triplicate. Error bars indicate standard deviations of triplicate measurements. Data are presented as mean ± sem. *P < 0.05 and ***P < 0.005. Student t-test was used for statistical analysis."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "Knockout", "of", "NLK", "reduces", "the", "interaction", "between", "endogenous", "YAP", "and", "TEAD", ".", "Lysates", "from", "NLK", "knockout", "HEK293", "cells", "were", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "TEAD1", "antibody", "and", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "TEAD1", "antibody", "or", "anti", "-", "YAP", "antibody", "(", "top", "panel", ")", ".", "Whole", "cell", "lysates", "(", "WCL", ")", "were", "immunoblotted", "with", "antibodies", "indicated", "in", "the", "figure", ".", "B", ".", "Phosphorylation", "status", "of", "Ser127", "or", "Ser128", "determines", "interaction", "between", "TEAD1", "and", "YAP", ".", "Lysates", "from", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "plasmids", "indicated", "in", "the", "figure", "were", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "Flag", "antibody", "and", "immunoblotted", "with", "indicated", "antibodies", "in", "the", "figure", ".", "C", ".", "Downregulation", "of", "nemo", "with", "RNAi", "achieved", "in", "the", "posterior", "compartment", "of", "wing", "imaginal", "discs", "(", "co", "-", "expression", "of", "GFP", "serves", "to", "mark", "the", "posterior", "compartment", ")", "using", "the", "hh", "-", "Gal4", "driver", "results", "in", "decreased", "expression", "of", "the", "Yorkie", "target", "gene", "DIAP1", ".", "Two", "different", "RNAi", "constructs", "produce", "similar", "effect", ".", "Panels", "below", "show", "Z", "-", "stacks", "of", "magnified", "areas", "around", "the", "A", "/", "P", "border", "(", "left", ")", ".", "Quantification", "of", "DIAP1", "levels", "achieved", "upon", "posterior", "-", "downregulation", "of", "nemo", ",", "measured", "as", "normalized", "posterior", "-", "to", "-", "anterior", "levels", "and", "compared", "to", "similar", "expression", "of", "GFP", ".", "Data", "are", "present", "as", "mean", "±", "sem", ",", "n", "=", "8", "discs", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ".", "Student", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", "(", "right", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "50", "µm", ".", "D", ".", "Yorkie", "is", "epistatic", "to", "Nemo", ":", "co", "-", "overexpression", "of", "the", "constitutively", "active", "mutant", "yki", "[", "S168A", "]", "together", "with", "nmo", "-", "RNAi", "produces", "typical", "yki", "[", "S168A", "]", "phenotypes", ":", "severe", "overgrowth", "of", "the", "affected", "area", "with", "concomitant", "increase", "in", "yki", "target", "gene", "expression", "(", "DIAP1", ")", ".", "Due", "to", "lethality", "of", "the", "hh", "-", "Gal4", "-", "driven", "co", "-", "overexpression", ",", "another", "posterior", "driver", "en", "-", "Gal4", "was", "used", "instead", ";", "anti", "-", "Hh", "staining", "(", "green", ")", "was", "used", "to", "mark", "the", "posterior", "compartment", "(", "left", "panel", ")", ".", "Quantification", "posterior", "DIAP1", "levels", "in", "UAS", "-", "RNAi", "-", "nemo", ";", "en", "-", "Gal4", "and", "UAS", "-", "yki", "[", "S168A", "]", ";", "en", "-", "Gal4", ",", "presented", "as", "in", "(", "C", ")", ";", "n", "=", "3", "-", "6", "discs", ".", "Posterior", "DIAP1", "levels", "in", "UAS", "-", "RNAi", "-", "nemo", ";", "en", "-", "Gal4", "are", "also", "significantly", "different", "from", "control", "UAS", "-", "GFP", ";", "en", "-", "Gal4", "discs", "(", "right", "panel", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "sem", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "005", ".", "Student", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", "(", "right", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "50", "µm", ".", "E", ".", "Mutant", "forms", "of", "YAP", "which", "have", "different", "phosphorylation", "status", "of", "Ser127", "or", "S128", "differentially", "rescue", "retarded", "wound", "healing", "caused", "by", "NLK", "knockout", ".", "HEK293", "wild", "type", "or", "HEK293", "NLK", "knockout", "cells", "were", "transfected", "with", "indicated", "plasmids", "(", "\"", "EV", "\"", "stands", "for", "\"", "empty", "vector", "\"", ")", ",", "and", "the", "wounded", "areas", "after", "0", "and", "24", "hr", "were", "measured", "by", "using", "the", "TScratch", "program", "(", "left", "panel", ")", ".", "Graphs", "show", "percentage", "of", "unfilled", "areas", "at", "24", "hr", "compared", "to", "0", "hr", ",", "and", "average", "values", "from", "a", "representative", "of", "multiple", "experiments", "performed", "in", "triplicate", "(", "right", "-", "top", "panel", ")", ".", "Lysates", "were", "immunoblotted", "with", "antibodies", "indicated", "in", "the", "figure", "(", "right", "-", "bottom", "panel", ")", ".", "Error", "bars", "indicate", "standard", "deviations", "of", "triplicate", "measurements", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "sem", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ".", "Student", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "statistical", "analysis", "(", "right", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "200", "μm", ".", "E", ".", "Mutant", "forms", "of", "YAP", "which", "have", "different", "phosphorylation", "status", "of", "Ser127", "or", "S128", "differentially", "rescue", "retarded", "wound", "healing", "caused", "by", "NLK", "knockout", ".", "HEK293", "wild", "type", "or", "HEK293", "NLK", "knockout", "cells", "were", "transfected", "with", "indicated", "plasmids", "(", "\"", "EV", "\"", "stands", "for", "\"", "empty", "vector", "\"", ")", ",", "and", "the", "wounded", "areas", "after", "0", "and", "24", "hr", "were", "measured", "by", "using", "the", "TScratch", "program", "(", "left", "panel", ")", ".", "Graphs", "show", "percentage", "of", "unfilled", "areas", "at", "24", "hr", "compared", "to", "0", "hr", ",", "and", "average", "values", "from", "a", "representative", "of", "multiple", "experiments", "performed", "in", "triplicate", "(", "right", "-", "top", "panel", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. Knockout of NLK reduces the interaction between endogenous YAP and TEAD. Lysates from NLK knockout HEK293 cells were immunoprecipitated with anti-TEAD1 antibody and immunoblotted with anti-TEAD1 antibody or anti-YAP antibody (top panel). Whole cell lysates (WCL) were immunoblotted with antibodies indicated in the figure.B. Phosphorylation status of Ser127 or Ser128 determines interaction between TEAD1 and YAP. Lysates from HEK293T cells transfected with plasmids indicated in the figure were immunoprecipitated with anti-Flag antibody and immunoblotted with indicated antibodies in the figure.C. Downregulation of nemo with RNAi achieved in the posterior compartment of wing imaginal discs (co-expression of GFP serves to mark the posterior compartment) using the hh-Gal4 driver results in decreased expression of the Yorkie target gene DIAP1. Two different RNAi constructs produce similar effect. Panels below show Z-stacks of magnified areas around the A/P border (left). Quantification of DIAP1 levels achieved upon posterior-downregulation of nemo, measured as normalized posterior-to-anterior levels and compared to similar expression of GFP. Data are present as mean ± sem, n=8 discs. *P < 0.05. Student t-test was used for statistical analysis (right). Scale bars: 50 µm.D. Yorkie is epistatic to Nemo: co-overexpression of the constitutively active mutant yki[S168A] together with nmo-RNAi produces typical yki[S168A] phenotypes: severe overgrowth of the affected area with concomitant increase in yki target gene expression (DIAP1). Due to lethality of the hh-Gal4-driven co-overexpression, another posterior driver en-Gal4 was used instead; anti-Hh staining (green) was used to mark the posterior compartment (left panel). Quantification posterior DIAP1 levels in UAS-RNAi-nemo; en-Gal4 and UAS-yki[S168A]; en-Gal4, presented as in (C); n= 3-6 discs. Posterior DIAP1 levels in UAS-RNAi-nemo; en-Gal4 are also significantly different from control UAS-GFP; en-Gal4 discs (right panel). Data are presented as mean ± sem. ***P < 0.005. Student t-test was used for statistical analysis (right). Scale bars: 50 µm.E. Mutant forms of YAP which have different phosphorylation status of Ser127 or S128 differentially rescue retarded wound healing caused by NLK knockout. HEK293 wild type or HEK293 NLK knockout cells were transfected with indicated plasmids (\"EV\" stands for \"empty vector\"), and the wounded areas after 0 and 24 hr were measured by using the TScratch program (left panel). Graphs show percentage of unfilled areas at 24 hr compared to 0 hr, and average values from a representative of multiple experiments performed in triplicate (right-top panel). Lysates were immunoblotted with antibodies indicated in the figure (right-bottom panel). Error bars indicate standard deviations of triplicate measurements. Data are presented as mean ± sem. *P < 0.05. Student t-test was used for statistical analysis (right). Scale bars: 200 μm.E. Mutant forms of YAP which have different phosphorylation status of Ser127 or S128 differentially rescue retarded wound healing caused by NLK knockout. HEK293 wild type or HEK293 NLK knockout cells were transfected with indicated plasmids (\"EV\" stands for \"empty vector\"), and the wounded areas after 0 and 24 hr were measured by using the TScratch program (left panel). Graphs show percentage of unfilled areas at 24 hr compared to 0 hr, and average values from a representative of multiple experiments performed in triplicate (right-top panel)."}
{"words": ["Figure", "1Immunoblot", "analysis", "of", "ADAR1", "p110", ",", "ADAR1", "p150", "and", "ADAR2", "expression", "in", "various", "organs", "isolated", "from", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "mice", ".", "The", "expression", "of", "GAPDH", "is", "shown", "as", "a", "reference", ".", "The", "relative", "expression", "of", "ADAR1", "p150", "mRNA", "(", "B", ")", "and", "total", "ADAR1", "mRNA", "(", "C", ")", "in", "sorted", "DN", ",", "DP", ",", "4SP", "and", "8SP", "thymocytes", "isolated", "from", "WT", "mice", ".", "The", "relative", "expression", "of", "ADAR1", "p150", "mRNA", "(", "B", ")", "and", "total", "ADAR1", "mRNA", "(", "C", ")", "were", "normalized", "to", "the", "level", "of", "expression", "in", "DN", "thymocytes", "(", "DN", "values", "set", "to", "1", ")", ".", "Values", "represent", "the", "relative", "gene", "expression", "normalized", "to", "GAPDH", "mRNA", "and", "are", "displayed", "as", "the", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "5", ";", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "The", "relative", "expression", "of", "type", "I", "interferon", "-", "stimulated", "genes", "(", "ISGs", ")", "in", "sorted", "DN", ",", "DP", ",", "4SP", "and", "8SP", "thymocytes", "isolated", "from", "WT", "mice", ".", "Values", "represent", "the", "relative", "gene", "expression", "normalized", "to", "GAPDH", "mRNA", "and", "are", "displayed", "as", "the", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "3", ";", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "The", "relative", "expression", "of", "ISGs", "was", "normalized", "against", "the", "level", "of", "expression", "in", "DN", "thymocytes", "(", "DN", "values", "set", "to", "1", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Immunoblot analysis of ADAR1 p110, ADAR1 p150 and ADAR2 expression in various organs isolated from wild-type (WT) mice. The expression of GAPDH is shown as a reference.The relative expression of ADAR1 p150 mRNA (B) and total ADAR1 mRNA (C) in sorted DN, DP, 4SP and 8SP thymocytes isolated from WT mice. The relative expression of ADAR1 p150 mRNA (B) and total ADAR1 mRNA (C) were normalized to the level of expression in DN thymocytes (DN values set to 1). Values represent the relative gene expression normalized to GAPDH mRNA and are displayed as the mean ± SEM (n = 5; Mann-Whitney U-test, *p < 0.05, **p < 0.01).The relative expression of type I interferon-stimulated genes (ISGs) in sorted DN, DP, 4SP and 8SP thymocytes isolated from WT mice. Values represent the relative gene expression normalized to GAPDH mRNA and are displayed as the mean ± SEM (n = 3; Mann-Whitney U-test, *p < 0.05). The relative expression of ISGs was normalized against the level of expression in DN thymocytes (DN values set to 1)."}
{"words": ["Figure", "2Total", "number", "of", "thymocytes", "in", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "CD4", "+", "cell", "-", "specific", "Adar1", "knockout", "(", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", ")", "mice", ".", "Thymocytes", "isolated", "from", "WT", "and", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "mice", "were", "stained", "with", "anti", "-", "CD4", "and", "anti", "-", "CD8", "antibodies", "and", "analyzed", "by", "flow", "cytometry", ".", "Representative", "images", "are", "shown", "(", "B", ")", ".", "The", "percentages", "of", "DN", ",", "DP", ",", "4SP", ",", "and", "8SP", "thymocytes", "were", "compared", "between", "WT", "and", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "mice", "(", "C", ")", ".", "Thymocytes", "isolated", "from", "WT", "and", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "mice", "were", "stained", "with", "anti", "-", "CD4", ",", "anti", "-", "CD8", "and", "anti", "-", "TCRβ", "antibodies", "and", "were", "gated", "by", "the", "high", "expression", "of", "TCRβ", "(", "TCRβhigh", ")", ".", "Representative", "images", "are", "shown", "(", "D", ")", ".", "The", "percentages", "of", "DN", ",", "DP", ",", "4SP", ",", "and", "8SP", "thymocytes", "were", "compared", "between", "WT", "and", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "mice", "(", "E", ")", ".", "Thymocytes", "isolated", "from", "WT", "and", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "mice", "were", "stained", "with", "anti", "-", "CD4", ",", "anti", "-", "CD8", ",", "anti", "-", "CD69", "and", "anti", "-", "MHC", "-", "I", "antibodies", "and", "were", "gated", "on", "4SP", "thymocytes", ".", "Representative", "images", "are", "shown", "(", "upper", "panel", ")", ".", "The", "percentages", "of", "CD69", "+", "MHC", "-", "I", "-", "(", "SM", ")", ",", "CD69", "+", "MHC", "-", "I", "+", "(", "M1", ")", ",", "and", "CD69", "-", "MHC", "-", "I", "-", "(", "M2", ")", "thymocytes", "were", "compared", "between", "WT", "and", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "mice", "(", "lower", "panel", ")", ".", "Thymocytes", "isolated", "from", "WT", "and", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "mice", "were", "stained", "with", "antibodies", "against", "CD5", "and", "analyzed", "by", "flow", "cytometry", ".", "Representative", "flow", "cytometric", "images", "for", "DP", "and", "4SP", "thymocytes", "are", "shown", "(", "upper", "panel", ")", ".", "The", "percentages", "of", "CD5", "-", "DP", "and", "4SP", "thymocytes", "were", "compared", "between", "WT", "and", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "mice", "(", "lower", "panel", ")", ".", "Thymocytes", "isolated", "from", "WT", "and", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "mice", "were", "stained", "with", "anti", "-", "CD4", ",", "anti", "-", "CD8", ",", "anti", "-", "CD25", "and", "anti", "-", "Foxp3", "antibodies", "and", "were", "gated", "on", "4SP", "thymocytes", ".", "Representative", "images", "are", "shown", "(", "upper", "panel", ")", ".", "The", "percentages", "of", "CD25", "+", "Foxp3", "+", "4SP", "thymocytes", "(", "thymic", "Treg", "cells", ")", "were", "compared", "between", "WT", "and", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "mice", "(", "lower", "panel", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Total number of thymocytes in wild-type (WT) and CD4+ cell-specific Adar1 knockout (Cd4cre A1fl/fl) mice.Thymocytes isolated from WT and Cd4cre A1fl/fl mice were stained with anti-CD4 and anti-CD8 antibodies and analyzed by flow cytometry. Representative images are shown (B).The percentages of DN, DP, 4SP, and 8SP thymocytes were compared between WT and Cd4cre A1fl/fl mice (C).Thymocytes isolated from WT and Cd4cre A1fl/fl mice were stained with anti-CD4, anti-CD8 and anti-TCRβ antibodies and were gated by the high expression of TCRβ (TCRβhigh). Representative images are shown (D).The percentages of DN, DP, 4SP, and 8SP thymocytes were compared between WT and Cd4cre A1fl/fl mice (E).Thymocytes isolated from WT and Cd4cre A1fl/fl mice were stained with anti-CD4, anti-CD8, anti-CD69 and anti-MHC-I antibodies and were gated on 4SP thymocytes. Representative images are shown (upper panel). The percentages of CD69+MHC-I- (SM), CD69+MHC-I+ (M1), and CD69-MHC-I- (M2) thymocytes were compared between WT and Cd4cre A1fl/fl mice (lower panel).Thymocytes isolated from WT and Cd4cre A1fl/fl mice were stained with antibodies against CD5 and analyzed by flow cytometry. Representative flow cytometric images for DP and 4SP thymocytes are shown (upper panel). The percentages of CD5- DP and 4SP thymocytes were compared between WT and Cd4cre A1fl/fl mice (lower panel).Thymocytes isolated from WT and Cd4cre A1fl/fl mice were stained with anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25 and anti-Foxp3 antibodies and were gated on 4SP thymocytes. Representative images are shown (upper panel). The percentages of CD25+Foxp3+ 4SP thymocytes (thymic Treg cells) were compared between WT and Cd4cre A1fl/fl mice (lower panel)."}
{"words": ["Figure", "3CD4", "+", "cell", "-", "specific", "Adar1", "knockout", "(", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", ")", "mice", "were", "crossed", "with", "HY", "-", "TCR", "+", "mice", "to", "generate", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "HY", "-", "TCR", "+", "mice", ".", "Thymocytes", "isolated", "from", "male", "(", "A", ")", "and", "female", "(", "B", ")", "HY", "-", "TCR", "+", "or", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "HY", "-", "TCR", "+", "mice", "were", "stained", "with", "anti", "-", "CD4", "and", "anti", "-", "CD8", "antibodies", "and", "analyzed", "by", "flow", "cytometry", ".", "Representative", "images", "are", "shown", "(", "left", "panels", ")", ".", "The", "absolute", "number", "of", "DP", "and", "8SP", "thymocytes", "were", "compared", "between", "HY", "-", "TCR", "+", "and", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "HY", "-", "TCR", "+", "mice", "(", "right", "panels", ")", ".", "Thymocytes", "isolated", "from", "WT", "and", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "mice", "were", "labeled", "with", "Cell", "Proliferation", "Dye", "and", "then", "stimulated", "with", "plate", "-", "bound", "anti", "-", "CD3", "and", "anti", "-", "CD28", "antibodies", "for", "4", "days", ".", "Apoptotic", "(", "Annexin", "V", "+", ")", "and", "proliferating", "thymocytes", "(", "reduced", "intensity", "of", "Proliferation", "Dye", ")", "were", "determined", "by", "flow", "cytometry", ".", "Representative", "flow", "cytometric", "images", "are", "shown", "(", "left", "panel", ")", ".", "The", "percentages", "of", "either", "Annexin", "V", "+", "or", "Annexin", "V", "-", "proliferating", "thymocytes", "were", "compared", "between", "WT", "(", "n", "=", "5", ")", "and", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "(", "n", "=", "4", ")", "mice", "(", "right", "panel", ")", ".", "The", "relative", "expression", "of", "anti", "-", "apoptotic", "genes", "in", "sorted", "4SP", "thymocytes", "isolated", "from", "WT", "and", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "mice", ".", "Values", "represent", "the", "relative", "gene", "expression", "normalized", "to", "Actinβ", "mRNA", "and", "are", "displayed", "as", "the", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "3", ";", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "N", ".", "S", ".", ";", "not", "significant", ")", ".", "The", "mean", "value", "for", "the", "relative", "expression", "of", "each", "anti", "-", "apoptotic", "gene", "in", "WT", "4SP", "thymocytes", "was", "set", "as", "one", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "total", "and", "phosphorylated", "ZAP70", "and", "PLCγ1", "expression", "in", "anti", "-", "CD3", "-", "stimulated", "thymocytes", "isolated", "from", "WT", "and", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "mice", ".", "The", "expression", "of", "GAPDH", "is", "shown", "as", "a", "reference", ".", "Representative", "images", "are", "shown", "(", "left", "panel", ")", ".", "The", "band", "intensity", "of", "p", "-", "ZAP70", "and", "p", "-", "PLCγ1", "was", "normalized", "to", "that", "of", "total", "ZAP70", "and", "PLCγ1", ","], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3CD4+ cell-specific Adar1 knockout (Cd4cre A1fl/fl) mice were crossed with HY-TCR+ mice to generate Cd4cre A1fl/fl HY-TCR+ mice. Thymocytes isolated from male (A) and female (B) HY-TCR+ or Cd4cre A1fl/fl HY-TCR+ mice were stained with anti-CD4 and anti-CD8 antibodies and analyzed by flow cytometry. Representative images are shown (left panels). The absolute number of DP and 8SP thymocytes were compared between HY-TCR+ and Cd4cre A1fl/fl HY-TCR+ mice (right panels).Thymocytes isolated from WT and Cd4cre A1fl/fl mice were labeled with Cell Proliferation Dye and then stimulated with plate-bound anti-CD3 and anti-CD28 antibodies for 4 days. Apoptotic (Annexin V+) and proliferating thymocytes (reduced intensity of Proliferation Dye) were determined by flow cytometry. Representative flow cytometric images are shown (left panel). The percentages of either Annexin V+ or Annexin V- proliferating thymocytes were compared between WT (n = 5) and Cd4cre A1fl/fl (n = 4) mice (right panel).The relative expression of anti-apoptotic genes in sorted 4SP thymocytes isolated from WT and Cd4cre A1fl/fl mice. Values represent the relative gene expression normalized to Actinβ mRNA and are displayed as the mean ± SEM (n = 3; Mann-Whitney U-test, *p < 0.05, N.S.; not significant). The mean value for the relative expression of each anti-apoptotic gene in WT 4SP thymocytes was set as one.Immunoblot analysis of total and phosphorylated ZAP70 and PLCγ1 expression in anti-CD3-stimulated thymocytes isolated from WT and Cd4cre A1fl/fl mice. The expression of GAPDH is shown as a reference. Representative images are shown (left panel). The band intensity of p-ZAP70 and p-PLCγ1 was normalized to that of total ZAP70 and PLCγ1, respectively"}
{"words": ["Figure", "4Incidence", "of", "spontaneous", "colitis", "observed", "in", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "CD4", "+", "cell", "-", "specific", "Adar1", "knockout", "(", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", ")", "mice", "(", "n", "=", "11", "for", "each", "group", ";", "Representative", "images", "of", "HE", "staining", "of", "the", "colon", "dissected", "from", "a", "WT", "and", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "mouse", ".", "Scale", "bar", ",", "200", "μm", ".", "Lymphocytes", "isolated", "from", "the", "colonic", "lamina", "propria", "of", "WT", "and", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "mice", "were", "stained", "with", "anti", "-", "IFNγ", ",", "anti", "-", "IL17", "or", "anti", "-", "Foxp3", "antibodies", "together", "with", "anti", "-", "CD4", "antibodies", "and", "analyzed", "by", "flow", "cytometry", ".", "Representative", "images", "are", "shown", "(", "left", "panel", ")", ".", "The", "absolute", "number", "of", "IFNγ", "-", ",", "IL17", "-", ",", "or", "Foxp3", "-", "expressing", "CD4", "+", "T", "cells", "were", "compared", "between", "WT", "and", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "mice", "(", "right", "panel", ")", ".", "Splenocytes", "isolated", "from", "WT", "and", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "mice", "were", "stained", "with", "anti", "-", "IFNγ", "and", "anti", "-", "IL17", "together", "with", "anti", "-", "CD4", "antibodies", "and", "were", "gated", "on", "CD4", "+", "cells", ".", "Representative", "flow", "cytometry", "images", "are", "shown", "(", "upper", "panel", ")", ".", "The", "percentages", "of", "IFNγ", "-", "and", "IL17", "-", "secreting", "CD4", "+", "T", "cells", "were", "compared", "between", "WT", "and", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "mice", "(", "lower", "panel", ")", ".", "Splenocytes", "isolated", "from", "WT", "and", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "mice", "were", "stained", "with", "anti", "-", "Foxp3", "together", "with", "anti", "-", "CD4", "antibodies", "and", "were", "gated", "on", "CD4", "+", "cells", ".", "Representative", "flow", "cytometry", "images", "are", "shown", "(", "upper", "panel", ")", ".", "The", "percentages", "of", "Foxp3", "-", "expressing", "CD4", "+", "T", "cells", "were", "compared", "between", "WT", "and", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "mice", "(", "lower", "panel", ")", ".", "Effector", "T", "(", "Teff", ")", "cells", "isolated", "from", "the", "spleen", "of", "a", "WT", "mouse", "were", "stimulated", "with", "soluble", "anti", "-", "CD3", "(", "5", "μg", "/", "ml", ")", "in", "the", "presence", "of", "mitomycin", "C", "-", "treated", "splenocytes", "and", "were", "cultured", "with", "regulatory", "T", "(", "Treg", ")", "cells", "isolated", "from", "WT", "and", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "mice", "at", "the", "indicated", "ratios", ".", "After", "72", "h", ",", "the", "proliferative", "activity", "was", "measured", ".", "Values", "are", "displayed", "as", "the", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "3", "for", "each", "group", ";", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", ",", "N", ".", "S", ".", ";", "not", "significant", ")", ".", "The", "mean", "value", "for", "the", "suppression", "of", "proliferative", "activity", "of", "Teff", "cells", "in", "a", "condition", "without", "Treg", "cells", "was", "set", "as", "0", "%", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Incidence of spontaneous colitis observed in wild-type (WT) and CD4+ cell-specific Adar1 knockout (Cd4cre A1fl/fl) mice (n = 11 for each group;Representative images of HE staining of the colon dissected from a WT and Cd4cre A1fl/fl mouse. Scale bar, 200 μm.Lymphocytes isolated from the colonic lamina propria of WT and Cd4cre A1fl/fl mice were stained with anti-IFNγ, anti-IL17 or anti-Foxp3 antibodies together with anti-CD4 antibodies and analyzed by flow cytometry. Representative images are shown (left panel). The absolute number of IFNγ-, IL17-, or Foxp3-expressing CD4+ T cells were compared between WT and Cd4cre A1fl/fl mice (right panel).Splenocytes isolated from WT and Cd4cre A1fl/fl mice were stained with anti-IFNγ and anti-IL17 together with anti-CD4 antibodies and were gated on CD4+ cells. Representative flow cytometry images are shown (upper panel). The percentages of IFNγ- and IL17-secreting CD4+ T cells were compared between WT and Cd4cre A1fl/fl mice (lower panel).Splenocytes isolated from WT and Cd4cre A1fl/fl mice were stained with anti-Foxp3 together with anti-CD4 antibodies and were gated on CD4+ cells. Representative flow cytometry images are shown (upper panel). The percentages of Foxp3-expressing CD4+ T cells were compared between WT and Cd4cre A1fl/fl mice (lower panel).Effector T (Teff) cells isolated from the spleen of a WT mouse were stimulated with soluble anti-CD3 (5 μg/ml) in the presence of mitomycin C-treated splenocytes and were cultured with regulatory T (Treg) cells isolated from WT and Cd4cre A1fl/fl mice at the indicated ratios. After 72 h, the proliferative activity was measured. Values are displayed as the mean ± SEM (n = 3 for each group; Mann-Whitney U-test, N.S.; not significant). The mean value for the suppression of proliferative activity of Teff cells in a condition without Treg cells was set as 0%."}
{"words": ["Figure", "5RNA", "editing", "in", "the", "3", "′", "UTR", "(", "C", ")", "and", "intronic", "region", "(", "D", ")", "of", "each", "gene", "indicated", "in", "the", "figures", "with", "their", "chromosomal", "location", "was", "validated", "by", "direct", "Sanger", "sequencing", "and", "the", "frequency", "of", "editing", "was", "compared", "among", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "DP", ",", "WT", "4SP", "thymocytes", ",", "and", "4SP", "thymocytes", "isolated", "from", "CD4", "+", "cell", "-", "specific", "Adar1", "knockout", "(", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", ")", "mice", ".", "The", "relative", "expression", "of", "each", "interferon", "-", "stimulated", "gene", "(", "ISG", ")", "indicated", "in", "the", "figure", "in", "sorted", "DP", "and", "4SP", "thymocytes", "isolated", "from", "WT", "and", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "mice", ".", "Values", "represent", "the", "relative", "gene", "expression", "normalized", "to", "GAPDH", "mRNA", "and", "are", "displayed", "as", "the", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "3", ";", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "The", "mean", "value", "for", "the", "relative", "expression", "of", "each", "ISG", "in", "WT", "DP", "thymocytes", "was", "set", "as", "one", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "total", "and", "phosphorylated", "STAT1", "expression", "in", "thymocytes", "isolated", "from", "WT", "and", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "mice", "(", "n", "=", "2", "for", "each", "group", ")", ".", "The", "expression", "of", "GAPDH", "is", "shown", "as", "a", "reference", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5RNA editing in the 3′UTR (C) and intronic region (D) of each gene indicated in the figures with their chromosomal location was validated by direct Sanger sequencing and the frequency of editing was compared among wild-type (WT) DP, WT 4SP thymocytes, and 4SP thymocytes isolated from CD4+ cell-specific Adar1 knockout (Cd4cre A1fl/fl) mice.The relative expression of each interferon-stimulated gene (ISG) indicated in the figure in sorted DP and 4SP thymocytes isolated from WT and Cd4cre A1fl/fl mice. Values represent the relative gene expression normalized to GAPDH mRNA and are displayed as the mean ± SEM (n = 3; Mann-Whitney U-test, *p < 0.05). The mean value for the relative expression of each ISG in WT DP thymocytes was set as one.Immunoblot analysis of total and phosphorylated STAT1 expression in thymocytes isolated from WT and Cd4cre A1fl/fl mice (n = 2 for each group). The expression of GAPDH is shown as a reference."}
{"words": ["Figure", "6CD4", "+", "cell", "-", "specific", "Adar1", "knockout", "(", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", ")", "mice", "were", "crossed", "with", "MDA5", "knockout", "(", "Ifih1", "-", "/", "-", ")", "mice", "to", "generate", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "Ifih1", "-", "/", "-", "mice", ".", "Thymocytes", "isolated", "from", "Ifih1", "-", "/", "-", "and", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "Ifih1", "-", "/", "-", "mice", "were", "stained", "with", "anti", "-", "CD4", ",", "anti", "-", "CD8", "and", "anti", "-", "TCRβ", "antibodies", "and", "analyzed", "by", "flow", "cytometry", ".", "Representative", "images", "are", "shown", "(", "left", "panel", ")", ".", "The", "percentage", "of", "DN", ",", "DP", ",", "4SP", "and", "8SP", "thymocytes", "were", "compared", "among", "Ifih1", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "Ifih1", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "5", ")", "and", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "(", "n", "=", "7", ")", "mice", "(", "right", "panel", ")", ".", "The", "same", "data", "shown", "in", "Fig", "2C", "was", "used", "for", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "mice", ".", "The", "relative", "expression", "of", "each", "interferon", "-", "stimulated", "gene", "(", "ISG", ")", "indicated", "in", "the", "figure", "in", "sorted", "4SP", "thymocytes", "isolated", "from", "Ifih1", "-", "/", "-", "and", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "Ifih1", "-", "/", "-", "mice", ".", "Values", "represent", "the", "relative", "gene", "expression", "normalized", "to", "GAPDH", "mRNA", "and", "are", "displayed", "as", "the", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "3", ";", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "The", "mean", "value", "for", "the", "relative", "expression", "of", "each", "ISG", "in", "Ifih1", "-", "/", "-", "4SP", "thymocytes", "was", "set", "as", "one", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "total", "and", "phosphorylated", "ZAP70", "and", "PLCγ1", "expression", "in", "anti", "-", "CD3", "-", "stimulated", "thymocytes", "isolated", "from", "Ifih1", "-", "/", "-", "and", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "Ifih1", "-", "/", "-", "mice", ".", "The", "expression", "of", "GAPDH", "is", "shown", "as", "a", "reference", ".", "Representative", "images", "are", "shown", "(", "left", "panel", ")", ".", "The", "band", "intensity", "of", "p", "-", "ZAP70", "and", "p", "-", "PLCγ1", "was", "normalized", "to", "that", "of", "total", "ZAP70", "and", "PLCγ1", ",", "respectively", "and", "displayed", "as", "the", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "3", ";", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", ",", "N", ".", "S", ".", ";", "not", "significant", ")", "(", "right", "panel", ")", "by", "setting", "the", "mean", "value", "of", "stimulated", "Ifih1", "-", "/", "-", "samples", "at", "60", "sec", "as", "1", ".", "Thymocytes", "isolated", "from", "Ifih1", "-", "/", "-", "and", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "Ifih1", "-", "/", "-", "mice", "were", "stimulated", "with", "plate", "-", "bound", "anti", "-", "CD3", "(", "5", "μg", "/", "ml", ")", "and", "anti", "-", "CD28", "(", "1", "μg", "/", "ml", ")", "antibodies", "for", "72", "h", "and", "the", "proliferative", "activity", "was", "measured", ".", "Values", "are", "displayed", "as", "the", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "3", "for", "each", "group", ";", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "The", "mean", "value", "for", "the", "activity", "of", "Ifih1", "-", "/", "-", "thymocytes", "in", "an", "unstimulated", "condition", "was", "set", "as", "one", ".", "For", "comparative", "analysis", ",", "the", "same", "data", "shown", "in", "Appendix", "Fig", "S1B", "was", "used", "for", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "mice", ".", "Thymocytes", "isolated", "from", "Ifih1", "-", "/", "-", "and", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "Ifih1", "-", "/", "-", "mice", "were", "stained", "with", "anti", "-", "CD4", ",", "anti", "-", "CD8", ",", "anti", "-", "CD69", "and", "anti", "-", "MHC", "-", "I", "antibodies", "and", "were", "gated", "on", "4SP", "thymocytes", ".", "Representative", "images", "are", "shown", "(", "upper", "panel", ")", ".", "The", "percentages", "of", "CD69", "+", "MHC", "-", "I", "-", "(", "SM", ")", ",", "CD69", "+", "MHC", "-", "I", "+", "(", "M1", ")", ",", "and", "CD69", "-", "MHC", "-", "I", "-", "(", "M2", ")", "thymocytes", "were", "compared", "among", "Ifih1", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "Ifih1", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "3", ")", "and", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "(", "n", "=", "3", ")", "mice", "(", "lower", "panel", ")", ".", "The", "same", "data", "shown", "in", "Fig", "2F", "was", "used", "for", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "mice", ".", "Thymocytes", "isolated", "from", "Ifih1", "-", "/", "-", "and", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "Ifih1", "-", "/", "-", "mice", "were", "stained", "with", "anti", "-", "CD4", ",", "anti", "-", "CD8", ",", "anti", "-", "CD25", "and", "anti", "-", "Foxp3", "antibodies", "and", "were", "gated", "on", "4SP", "thymocytes", ".", "Representative", "images", "are", "shown", "(", "upper", "panel", ")", ".", "The", "percentages", "of", "CD25", "+", "Foxp3", "+", "4SP", "thymocytes", "(", "thymic", "Treg", "cells", ")", "were", "compared", "among", "Ifih1", "-", "/", "-", ",", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "Ifih1", "-", "/", "-", "and", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "mice", "(", "lower", "panel", ")", ".", "The", "same", "data", "shown", "in", "Fig", "2H", "was", "used", "for", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "mice", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6CD4+ cell-specific Adar1 knockout (Cd4cre A1fl/fl) mice were crossed with MDA5 knockout (Ifih1-/-) mice to generate Cd4cre A1fl/fl Ifih1-/- mice. Thymocytes isolated from Ifih1-/- and Cd4cre A1fl/fl Ifih1-/- mice were stained with anti-CD4, anti-CD8 and anti-TCRβ antibodies and analyzed by flow cytometry. Representative images are shown (left panel). The percentage of DN, DP, 4SP and 8SP thymocytes were compared among Ifih1-/- (n = 4), Cd4cre A1fl/fl Ifih1-/- (n = 5) and Cd4cre A1fl/fl (n = 7) mice (right panel). The same data shown in Fig 2C was used for Cd4cre A1fl/fl mice.The relative expression of each interferon-stimulated gene (ISG) indicated in the figure in sorted 4SP thymocytes isolated from Ifih1-/- and Cd4cre A1fl/fl Ifih1-/- mice. Values represent the relative gene expression normalized to GAPDH mRNA and are displayed as the mean ± SEM (n = 3; Mann-Whitney U-test, *p < 0.05). The mean value for the relative expression of each ISG in Ifih1-/- 4SP thymocytes was set as one.Immunoblot analysis of total and phosphorylated ZAP70 and PLCγ1 expression in anti-CD3-stimulated thymocytes isolated from Ifih1-/- and Cd4cre A1fl/fl Ifih1-/- mice. The expression of GAPDH is shown as a reference. Representative images are shown (left panel). The band intensity of p-ZAP70 and p-PLCγ1 was normalized to that of total ZAP70 and PLCγ1, respectively and displayed as the mean ± SEM (n = 3; Mann-Whitney U-test, N.S.; not significant) (right panel) by setting the mean value of stimulated Ifih1-/- samples at 60 sec as 1.Thymocytes isolated from Ifih1-/- and Cd4cre A1fl/fl Ifih1-/- mice were stimulated with plate-bound anti-CD3 (5 μg/ml) and anti-CD28 (1 μg/ml) antibodies for 72 h and the proliferative activity was measured. Values are displayed as the mean ± SEM (n = 3 for each group; Mann-Whitney U-test, *p < 0.05). The mean value for the activity of Ifih1-/- thymocytes in an unstimulated condition was set as one. For comparative analysis, the same data shown in Appendix Fig S1B was used for Cd4cre A1fl/fl mice.Thymocytes isolated from Ifih1-/- and Cd4cre A1fl/fl Ifih1-/- mice were stained with anti-CD4, anti-CD8, anti-CD69 and anti-MHC-I antibodies and were gated on 4SP thymocytes. Representative images are shown (upper panel). The percentages of CD69+MHC-I- (SM), CD69+MHC-I+ (M1), and CD69-MHC-I- (M2) thymocytes were compared among Ifih1-/- (n = 5), Cd4cre A1fl/fl Ifih1-/- (n = 3) and Cd4cre A1fl/fl (n = 3) mice (lower panel). The same data shown in Fig 2F was used for Cd4cre A1fl/fl mice.Thymocytes isolated from Ifih1-/- and Cd4cre A1fl/fl Ifih1-/- mice were stained with anti-CD4, anti-CD8, anti-CD25 and anti-Foxp3 antibodies and were gated on 4SP thymocytes. Representative images are shown (upper panel). The percentages of CD25+Foxp3+ 4SP thymocytes (thymic Treg cells) were compared among Ifih1-/-, Cd4cre A1fl/fl Ifih1-/- and Cd4cre A1fl/fl mice (lower panel). The same data shown in Fig 2H was used for Cd4cre A1fl/fl mice."}
{"words": ["Figure", "7Splenocytes", "isolated", "from", "Ifih1", "-", "/", "-", "and", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "Ifih1", "-", "/", "-", "mice", "were", "stained", "with", "anti", "-", "IFNγ", "and", "anti", "-", "IL17", "together", "with", "anti", "-", "CD4", "antibodies", "and", "were", "gated", "on", "CD4", "+", "cells", ".", "Representative", "flow", "cytometry", "images", "are", "shown", "(", "left", "panel", ")", ".", "The", "percentages", "of", "IFNγ", "-", "and", "IL17", "-", "secreting", "CD4", "+", "T", "cells", "were", "compared", "among", "Ifih1", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "Ifih1", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "5", ")", "and", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "mice", "(", "n", "=", "6", ")", "(", "right", "panel", ")", ".", "The", "same", "data", "shown", "in", "Fig", "4E", "was", "used", "for", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "mice", ".", "No", "incidence", "of", "spontaneous", "colitis", "observed", "in", "Ifih1", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "5", ")", "and", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "Ifih1", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "11", ")", "mice", ".", "For", "side", "-", "by", "-", "side", "comparison", "with", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "miceRepresentative", "images", "of", "HE", "staining", "of", "colon", "dissected", "from", "an", "Ifih1", "-", "/", "-", "and", "a", "Cd4cre", "A1fl", "/", "fl", "Ifih1", "-", "/", "-", "mouse", ".", "Scale", "bar", ",", "200", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Splenocytes isolated from Ifih1-/- and Cd4cre A1fl/fl Ifih1-/- mice were stained with anti-IFNγ and anti-IL17 together with anti-CD4 antibodies and were gated on CD4+ cells. Representative flow cytometry images are shown (left panel). The percentages of IFNγ- and IL17-secreting CD4+ T cells were compared among Ifih1-/- (n = 4), Cd4cre A1fl/fl Ifih1-/- (n = 5) and Cd4cre A1fl/fl mice (n = 6) (right panel). The same data shown in Fig 4E was used for Cd4cre A1fl/fl mice.No incidence of spontaneous colitis observed in Ifih1-/- (n = 5) and Cd4cre A1fl/fl Ifih1-/- (n = 11) mice. For side-by-side comparison with Cd4cre A1fl/fl miceRepresentative images of HE staining of colon dissected from an Ifih1-/- and a Cd4cre A1fl/fl Ifih1-/- mouse. Scale bar, 200 μm."}
{"words": ["Figure", "1A", "Indicated", "tail", "-", "anchored", "(", "TA", ")", "proteins", "were", "in", "vitro", "translated", "in", "rabbit", "reticulocyte", "lysate", "(", "RRL", ")", "using", "RNAs", "containing", "a", "stop", "codon", ".", "Translations", "were", "carried", "out", "in", "the", "presence", "of", "2", "μM", "HisTrx", "or", "HisTrx", "-", "SGTA", "(", "HT", "-", "SGTA", ")", ",", "followed", "by", "incubation", "with", "HisPur", "Cobalt", "resin", "Bound", "proteins", "were", "eluted", "at", "high", "imidazole", "concentration", ",", "samples", "resolved", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "results", "visualised", "by", "phosphorimaging", ".", "Sec61β", "3R", "carries", "three", "Arg", "residues", "within", "Sec61β", "transmembrane", "domain", "(", "TMD", ")", "which", "abolish", "its", "hydrophobic", "character", "and", "was", "used", "as", "a", "negative", "control", "for", "SGTA", "binding", ".", "A", "schematic", "representation", "of", "a", "TA", "-", "protein", "is", "also", "shown", ".", "Open", "circles", "indicate", "TA", "-", "proteins", "selectively", "bound", "by", "HisTrx", "-", "SGTA", ".", "RAMP4", "-", "stress", "-", "associated", "endoplasmic", "reticulum", "protein", "1", ";", "Syb2", "-", "synaptobrevin", "2", ";", "Synt5", "-", "syntaxin", "5", ".", "B", "As", "for", "(", "A", ")", "but", "total", "translation", "products", "(", "input", ")", "were", "resolved", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "results", "visualised", "by", "phosphorimaging", ".", "When", "total", "products", "are", "analysed", "high", "amounts", "of", "haemoglobin", "in", "the", "RRL", "distort", "the", "migration", "of", "Sec61β", "and", "its", "variant", ".", "RNAs", "coding", "for", "C99", "variants", "and", "containing", "a", "stop", "codon", "introduced", "either", "after", "the", "complete", "coding", "sequence", "or", "before", "the", "predicted", "TMD", "were", "used", ".", "E", "As", "for", "(", "D", ")", "but", "total", "translation", "products", "were", "subjected", "to", "immunoprecipation", "with", "either", "anti", "-", "C99", "antibody", "(", "for", "the", "full", "-", "length", "variants", ")", "or", "with", "anti", "-", "β", "-", "amyloid", "antibody", "(", "for", "products", "lacking", "the", "TMD", ")", ".", "A", "filled", "square", "indicates", "inefficiently", "translated", "APP", "-", "C99", "-", "TMD", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "β", "-", "amyloid", "antibody", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A Indicated tail-anchored (TA) proteins were in vitro translated in rabbit reticulocyte lysate (RRL) using RNAs containing a stop codon. Translations were carried out in the presence of 2 μM HisTrx or HisTrx-SGTA (HT-SGTA), followed by incubation with HisPur Cobalt resin Bound proteins were eluted at high imidazole concentration, samples resolved by SDS-PAGE and results visualised by phosphorimaging. Sec61β 3R carries three Arg residues within Sec61β transmembrane domain (TMD) which abolish its hydrophobic character and was used as a negative control for SGTA binding. A schematic representation of a TA-protein is also shown. Open circles indicate TA-proteins selectively bound by HisTrx-SGTA. RAMP4 - stress-associated endoplasmic reticulum protein 1; Syb2 - synaptobrevin 2; Synt5 - syntaxin 5. B As for (A) but total translation products (input) were resolved by SDS-PAGE and results visualised by phosphorimaging. When total products are analysed high amounts of haemoglobin in the RRL distort the migration of Sec61β and its variant. RNAs coding for C99 variants and containing a stop codon introduced either after the complete coding sequence or before the predicted TMD were used. E As for (D) but total translation products were subjected to immunoprecipation with either anti-C99 antibody (for the full-length variants) or with anti-β-amyloid antibody (for products lacking the TMD). A filled square indicates inefficiently translated APP-C99-TMD immunoprecipitated with anti-β-amyloid antibody. "}
{"words": ["Figure", "2A", "Full", "-", "length", "polypeptides", "were", "translated", "in", "the", "presence", "of", "2", "μM", "HisTrx", "or", "HisTrx", "-", "SGTA", "using", "RNAs", "lacking", "a", "stop", "codon", "and", "either", "stabilised", "at", "the", "ribosome", "with", "cycloheximide", "(", "CHX", ")", "or", "released", "with", "puromycin", "(", "puro", ")", ".", "Reactions", "were", "incubated", "with", "HisPur", "Cobalt", "resin", ",", "bound", "proteins", "eluted", "at", "high", "imidazole", "concentration", ",", "resolved", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "visualised", "by", "phosphorimaging", "Filled", "circles", "indicate", "slower", "migrating", "species", "of", "radiolabelled", "products", "selectively", "enriched", "in", "CHX", "-", "treated", "samples", ".", "total", "translation", "reactions", "were", "treated", "with", "RNaseA", "and", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "C99", "antibodyFollowing", "in", "vitro", "translation", "of", "the", "indicated", "proteins", "in", "the", "presence", "of", "2", "μM", "HisTrx", "-", "SGTA", "and", "recovery", "on", "HisPur", "Cobalt", "resin", "the", "eluted", "fractions", "were", "subjected", "to", "RNaseA", "treatment", "(", "C", ")", "-", "tRNA", "\"", "and", "\"", "+", "tRNA", "\"", "indicate", "tRNA", "-", "lacking", "and", "tRNA", "-", "bound", "protein", "species", ",", "respectively", ".", "D", "Following", "in", "vitro", "translation", "of", "the", "indicated", "proteins", "in", "the", "presence", "of", "2", "μM", "HisTrx", "-", "SGTA", "and", "recovery", "on", "HisPur", "Cobalt", "resin", "precipitation", "with", "hexadecyltrimethylammonium", "bromide", "(", "CTAB", ")", "(", "D", ")", ";", "-", "tRNA", "\"", "and", "\"", "+", "tRNA", "\"", "indicate", "tRNA", "-", "lacking", "and", "tRNA", "-", "bound", "protein", "species", ",", "respectively", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Full-length polypeptides were translated in the presence of 2 μM HisTrx or HisTrx-SGTA using RNAs lacking a stop codon and either stabilised at the ribosome with cycloheximide (CHX) or released with puromycin (puro). Reactions were incubated with HisPur Cobalt resin, bound proteins eluted at high imidazole concentration, resolved by SDS-PAGE and visualised by phosphorimaging Filled circles indicate slower migrating species of radiolabelled products selectively enriched in CHX-treated samples.total translation reactions were treated with RNaseA and immunoprecipitated with anti-C99 antibodyFollowing in vitro translation of the indicated proteins in the presence of 2 μM HisTrx-SGTA and recovery on HisPur Cobalt resin the eluted fractions were subjected to RNaseA treatment (C) -tRNA\" and \"+ tRNA\" indicate tRNA-lacking and tRNA-bound protein species, respectively.D Following in vitro translation of the indicated proteins in the presence of 2 μM HisTrx-SGTA and recovery on HisPur Cobalt resin precipitation with hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) (D) ;-tRNA\" and \"+ tRNA\" indicate tRNA-lacking and tRNA-bound protein species, respectively."}
{"words": ["Figure", "3B", "Variants", "of", "PPLssKO", "-", "C99", "were", "translated", "in", "the", "presence", "of", "2", "μM", "HisTrx", "-", "SGTA", "using", "templates", "lacking", "a", "stop", "codon", "and", "terminating", "either", "before", "(", "\"", "-", "TMD", "\"", ")", "or", "at", "indicated", "amino", "acid", "distance", "after", "the", "TMD", ".", "Pull", "-", "down", "with", "HisPur", "Cobalt", "resin", "was", "carried", "out", "as", "described", "in", "Materials", "and", "Methods", ",", "eluted", "material", "resolved", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "results", "visualised", "by", "phosphorimaging", ".", "tRNA", "-", "bound", "species", "were", "verified", "by", "treating", "PPLssKO", "-", "C99", "variant", "terminating", "immediately", "after", "the", "TMD", "(", "TMD", "+", "0", ")", "with", "RNaseA", "(", "lane", "9", ")", ".", "translation", "reactions", "were", "carried", "out", "using", "RNAs", "coding", "for", "the", "indicated", "TA", "-", "proteins", "and", "lacking", "a", "stop", "codon", ".", "Sec61β", "3R", "was", "used", "as", "a", "control", "protein", "without", "a", "functional", "TMD", ".", "Filled", "circles", "indicate", "tRNA", "-", "bound", "TA", "-", "protein", "species", "recovered", "with", "HisTrx", "-", "SGTA", ".", "D", "Rabbit", "reticulocyte", "lysate", "was", "left", "untreated", "(", "\"", "untreat", ".", "\"", ")", ",", "incubated", "with", "control", "immobilised", "antibodies", "(", "\"", "contr", ".", "depl", ".", "\"", ")", "or", "immunodepleted", "of", "Hbs1L", ",", "a", "factor", "that", "together", "with", "Pelota", "and", "ABCE1", "[", "4", "]", ",", "mediates", "splitting", "of", "ribosomes", "stalled", "on", "truncated", "mRNAs", "(", "see", "diagram", ")", ".", "These", "lysates", "were", "used", "to", "translate", "FLAG", "-", "tagged", "Sec61β", "from", "an", "mRNA", "lacking", "a", "stop", "codon", "in", "the", "presence", "of", "2", "μM", "HisTrx", "or", "HisTrx", "-", "SGTA", "and", "samples", "were", "processed", "as", "described", "for", "(", "B", ")", ".", "E", "tRNA", "-", "bound", "species", "of", "FLAG", "-", "tagged", "Sec61β", "from", "experiment", "shown", "in", "panel", "(", "D", ")", "were", "quantified", "and", "expressed", "relative", "to", "the", "value", "obtained", "for", "the", "control", "-", "depleted", "RRL", ".", "Shown", "is", "the", "mean", "with", "standard", "error", "of", "mean", "for", "n", "=", "4", "biological", "replicates", ".", "Statistical", "significance", "was", "calculated", "using", "unpaired", "t", "test", "with", "Welch", "'", "s", "correction", ".", "ns", "-", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B Variants of PPLssKO-C99 were translated in the presence of 2 μM HisTrx-SGTA using templates lacking a stop codon and terminating either before (\"-TMD\") or at indicated amino acid distance after the TMD. Pull-down with HisPur Cobalt resin was carried out as described in Materials and Methods, eluted material resolved by SDS-PAGE and results visualised by phosphorimaging. tRNA-bound species were verified by treating PPLssKO-C99 variant terminating immediately after the TMD (TMD + 0) with RNaseA (lane 9).translation reactions were carried out using RNAs coding for the indicated TA-proteins and lacking a stop codon. Sec61β 3R was used as a control protein without a functional TMD. Filled circles indicate tRNA-bound TA-protein species recovered with HisTrx-SGTA.D Rabbit reticulocyte lysate was left untreated (\"untreat.\"), incubated with control immobilised antibodies (\"contr. depl.\") or immunodepleted of Hbs1L, a factor that together with Pelota and ABCE1 [4], mediates splitting of ribosomes stalled on truncated mRNAs (see diagram). These lysates were used to translate FLAG-tagged Sec61β from an mRNA lacking a stop codon in the presence of 2 μM HisTrx or HisTrx-SGTA and samples were processed as described for (B).E tRNA-bound species of FLAG-tagged Sec61β from experiment shown in panel (D) were quantified and expressed relative to the value obtained for the control-depleted RRL. Shown is the mean with standard error of mean for n=4 biological replicates. Statistical significance was calculated using unpaired t test with Welch's correction. ns - not significant."}
{"words": ["Figure", "4Sec61β", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "the", "3R", "variant", "tagged", "at", "their", "N", "-", "terminus", "with", "the", "FLAG", "epitope", "were", "translated", "in", "RRL", "from", "RNAs", "lacking", "a", "stop", "codon", ".", "Ribosome", "-", "nascent", "chain", "complexes", "(", "RNCs", ")", "were", "recovered", "using", "anti", "-", "FLAG", "affinity", "resin", ",", "beads", "were", "washed", ",", "bound", "proteins", "eluted", "with", "3xFLAG", "peptide", "and", "RNCs", "isolated", "by", "pelleting", "through", "a", "sucrose", "cushion", "Samples", "were", "resolved", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblotted", "for", "endogenous", "rabbit", "SGTA", ",", "FLAG", "-", "tagged", "translation", "products", ",", "proteins", "of", "the", "40S", "(", "Rps3", ")", "and", "60S", "(", "Rpl17", ")", "ribosomal", "subunits", "or", "analysed", "by", "phosphorimaging", "(", "35S", ")", ".", "The", "3xFLAG", "peptide", "eluted", "material", "(", "lanes", "4", "and", "5", ")", "corresponds", "to", "~", "10", "%", "of", "the", "sedimented", "RNCs", "(", "lanes", "7", "and", "8", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Sec61β wild-type (WT) and the 3R variant tagged at their N-terminus with the FLAG epitope were translated in RRL from RNAs lacking a stop codon. Ribosome-nascent chain complexes (RNCs) were recovered using anti-FLAG affinity resin, beads were washed, bound proteins eluted with 3xFLAG peptide and RNCs isolated by pelleting through a sucrose cushion Samples were resolved by SDS-PAGE and immunoblotted for endogenous rabbit SGTA, FLAG-tagged translation products, proteins of the 40S (Rps3) and 60S (Rpl17) ribosomal subunits or analysed by phosphorimaging (35S). The 3xFLAG peptide eluted material (lanes 4 and 5) corresponds to ~10% of the sedimented RNCs (lanes 7 and 8)."}
{"words": ["Figure", "5A", ",", "B", "PPL", "-", "C99", "-", "TMD", "(", "A", ")", "and", "PPL", "-", "C99FL", "(", "B", ")", "were", "in", "vitro", "translated", "in", "RRL", "from", "mRNAs", "lacking", "a", "stop", "codon", "in", "the", "presence", "of", "2", "μM", "HisTrx", "or", "HisTrx", "-", "SGTA", "and", "ε", "-", "TDBA", "-", "Lys", "-", "tRNA", "analogue", ".", "Reactions", "were", "irradiated", "with", "the", "UV", "light", "to", "induce", "photo", "-", "cross", "-", "linking", ",", "RNCs", "isolated", "and", "adducts", "immunoprecipitated", "with", "mouse", "anti", "-", "SRP54", ",", "mouse", "anti", "-", "SGTA", "or", "a", "control", "antibody", "as", "described", "in", "Materials", "and", "Methods", ".", "Samples", "were", "resolved", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "results", "visualised", "by", "phosphorimaging", ".", "C", "-", "terminal", "40", "amino", "acid", "residues", "located", "in", "the", "ribosomal", "exit", "tunnel", "are", "indicated", ".", "\"", "x", "SRP54", "\"", "and", "\"", "x", "HisTrx", "-", "SGTA", "\"", "indicate", "cross", "-", "linking", "adducts", "between", "the", "translated", "nascent", "chain", "and", "endogenous", "SRP54", "or", "recombinant", "HisTrx", "-", "SGTA", ",", "respectively", ".", "Arrows", "indicate", "unmodified", "translation", "products", ".", "C", "PPL", "-", "C99FL", "variants", "lacking", "a", "stop", "codon", "and", "carrying", "the", "indicated", "Lys", "to", "Arg", "substitutions", "were", "in", "vitro", "translated", "in", "the", "presence", "of", "2", "μM", "HisTrx", "-", "SGTA", ".", "Reactions", "were", "processed", "using", "chicken", "anti", "-", "SGTA", "antibody", "for", "immunoprecipitation", "of", "SGTA", "adducts", ".", "D", "Cross", "-", "linking", "adducts", "between", "ribosome", "-", "stalled", "PPL", "-", "C99FL", "lysine", "mutants", "and", "recombinant", "HisTrx", "-", "SGTA", "shown", "in", "panel", "(", "C", ")", "were", "quantified", ",", "any", "differences", "in", "translation", "efficiency", "accounted", "for", "and", "cross", "-", "linking", "efficiency", "expressed", "relative", "to", "the", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "protein", ".", "Shown", "is", "the", "mean", "with", "standard", "error", "of", "mean", "for", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "Statistical", "significance", "was", "calculated", "using", "unpaired", "t", "test", "with", "Welch", "'", "s", "correction", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A, B PPL-C99-TMD (A) and PPL-C99FL (B) were in vitro translated in RRL from mRNAs lacking a stop codon in the presence of 2 μM HisTrx or HisTrx-SGTA and ε-TDBA-Lys-tRNA analogue. Reactions were irradiated with the UV light to induce photo-cross-linking, RNCs isolated and adducts immunoprecipitated with mouse anti-SRP54, mouse anti-SGTA or a control antibody as described in Materials and Methods. Samples were resolved by SDS-PAGE and results visualised by phosphorimaging. C-terminal 40 amino acid residues located in the ribosomal exit tunnel are indicated. \"x SRP54\" and \"x HisTrx-SGTA\" indicate cross-linking adducts between the translated nascent chain and endogenous SRP54 or recombinant HisTrx-SGTA, respectively. Arrows indicate unmodified translation products.C PPL-C99FL variants lacking a stop codon and carrying the indicated Lys to Arg substitutions were in vitro translated in the presence of 2 μM HisTrx-SGTA. Reactions were processed using chicken anti-SGTA antibody for immunoprecipitation of SGTA adducts. D Cross-linking adducts between ribosome-stalled PPL-C99FL lysine mutants and recombinant HisTrx-SGTA shown in panel (C) were quantified, any differences in translation efficiency accounted for and cross-linking efficiency expressed relative to the wild-type (WT) protein. Shown is the mean with standard error of mean for n=3 biological replicates. Statistical significance was calculated using unpaired t test with Welch's correction."}
{"words": ["Figure", "6A", ",", "B", "PPL", "-", "C99FL", "lacking", "a", "stop", "codon", "was", "in", "vitro", "translated", "in", "RRL", "in", "the", "presence", "of", "canine", "pancreatic", "microsomes", "or", "buffer", "control", "in", "reactions", "supplemented", "with", "ε", "-", "TDBA", "-", "Lys", "-", "tRNA", "analogue", ".", "Reactions", "were", "carried", "out", "in", "the", "presence", "(", "A", ")", "or", "absence", "(", "B", ")", "of", "2", "μM", "HisTrx", "-", "SGTA", ".", "Samples", "were", "subjected", "to", "UV", "light", "-", "induced", "photo", "-", "cross", "-", "linking", "and", "processed", "as", "described", "for", "Fig", "5", ".", "\"", "x", "SRP54", "\"", "and", "\"", "x", "HisTrx", "-", "SGTA", "\"", "indicate", "cross", "-", "linking", "adducts", "between", "the", "translated", "nascent", "chain", "and", "endogenous", "SRP54", "or", "recombinant", "HisTrx", "-", "SGTA", ",", "respectively", ",", "whilst", "\"", "endo", ".", "SGTA", "\"", "indicates", "cross", "-", "linking", "adducts", "with", "endogenous", "SGTA", ".", "Cross", "-", "linking", "products", "between", "stalled", "PPL", "-", "C99FL", "and", "SGTA", "are", "also", "indicated", "with", "arrowheads", ",", "whilst", "arrows", "indicate", "unmodified", "translation", "products", ".", "C", ",", "D", "chemical", "cross", "-", "linking", "using", "DSS", "reagent", "was", "carried", "out", ".", "E", "DSS", "-", "mediated", "HisTrx", "-", "SGTA", "cross", "-", "linking", "efficiency", "to", "PPL", "-", "C99FL", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "ER", "-", "derived", "microsomes", "was", "quantified", ".", "For", "each", "repeat", ",", "intensity", "of", "the", "cross", "-", "linked", "SGTA", "adduct", "in", "the", "absence", "of", "microsomes", "was", "set", "as", "100", "%", ".", "Shown", "is", "the", "mean", "with", "standard", "error", "of", "mean", "for", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "Statistical", "significance", "was", "calculated", "using", "unpaired", "t", "test", "with", "Welch", "'", "s", "correction", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A, B PPL-C99FL lacking a stop codon was in vitro translated in RRL in the presence of canine pancreatic microsomes or buffer control in reactions supplemented with ε-TDBA-Lys-tRNA analogue. Reactions were carried out in the presence (A) or absence (B) of 2 μM HisTrx-SGTA. Samples were subjected to UV light-induced photo-cross-linking and processed as described for Fig 5. \"x SRP54\" and \"x HisTrx-SGTA\" indicate cross-linking adducts between the translated nascent chain and endogenous SRP54 or recombinant HisTrx-SGTA, respectively, whilst \"endo. SGTA\" indicates cross-linking adducts with endogenous SGTA. Cross-linking products between stalled PPL-C99FL and SGTA are also indicated with arrowheads, whilst arrows indicate unmodified translation products.C, D chemical cross-linking using DSS reagent was carried out. E DSS-mediated HisTrx-SGTA cross-linking efficiency to PPL-C99FL in the absence or presence of ER-derived microsomes was quantified. For each repeat, intensity of the cross-linked SGTA adduct in the absence of microsomes was set as 100%. Shown is the mean with standard error of mean for n=3 biological replicates. Statistical significance was calculated using unpaired t test with Welch's correction."}
{"words": ["Figure", "7A", "Indicated", "precursor", "proteins", "were", "translated", "in", "vitro", "using", "RRL", "supplemented", "with", "20", "μM", "HA", "-", "tagged", "ubiquitin", "and", "2", "μM", "of", "either", "HisTrx", "or", "HisTrx", "-", "SGTA", ".", "RNCs", "were", "isolated", ",", "ubiquitinated", "nascent", "chains", "recovered", "using", "anti", "-", "HA", "agarose", ",", "samples", "resolved", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "analysed", "by", "phosphorimaging", ".", "Ubiquitinated", "precursor", "protein", "species", "were", "assigned", "based", "on", "SDS", "-", "PAGE", "electrophoretic", "mobility", "and", "are", "indicated", "in", "red", ".", "A", "schematic", "diagram", "of", "the", "proteins", "used", "is", "shown", "and", "the", "~", "40", "residues", "of", "the", "nascent", "chain", "located", "in", "the", "ribosomal", "exit", "tunnel", "are", "indicated", ".", "\"", "ss", "\"", "-", "signal", "sequence", ",", "\"", "TMD", "\"", "-", "transmembrane", "domain", ".", "B", "Individual", ",", "clearly", "resolved", "ubiquitinated", "species", "of", "the", "indicated", "proteins", "(", "labelled", "1", "to", "4", ")", "were", "quantified", "and", "their", "intensity", "in", "HisTrx", "-", "SGTA", "containing", "samples", "shown", "relative", "to", "samples", "supplemented", "with", "HisTrx", "control", "protein", ".", "Shown", "is", "the", "mean", "with", "standard", "error", "of", "mean", "for", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "Statistical", "significance", "was", "calculated", "using", "unpaired", "t", "test", "with", "Welch", "'", "s", "correction", ".", "ns", "-", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A Indicated precursor proteins were translated in vitro using RRL supplemented with 20 μM HA-tagged ubiquitin and 2 μM of either HisTrx or HisTrx-SGTA. RNCs were isolated, ubiquitinated nascent chains recovered using anti-HA agarose, samples resolved by SDS-PAGE and analysed by phosphorimaging. Ubiquitinated precursor protein species were assigned based on SDS-PAGE electrophoretic mobility and are indicated in red. A schematic diagram of the proteins used is shown and the ~40 residues of the nascent chain located in the ribosomal exit tunnel are indicated. \"ss\" - signal sequence, \"TMD\" - transmembrane domain.B Individual, clearly resolved ubiquitinated species of the indicated proteins (labelled 1 to 4) were quantified and their intensity in HisTrx-SGTA containing samples shown relative to samples supplemented with HisTrx control protein. Shown is the mean with standard error of mean for n=3 biological replicates. Statistical significance was calculated using unpaired t test with Welch's correction. ns - not significant."}
{"words": ["Figure", "1G", "Verify", "the", "mobility", "of", "GFP", "(", "control", ")", "mRNA", "and", "GFP", "-", "MdCAX3", "mRNA", "by", "RT", "-", "PCR", "in", "Mx", "leaf", ",", "stem", ",", "and", "root", ".", "The", "recombinant", "vectors", "(", "F", ")", "were", "transformed", "into", "A", ".", "tumefaciens", "GV3101", "and", "introduced", "into", "Mx", "leaves", "by", "vacuum", "infiltration", ".", "H", "GFP", "fluorescence", "image", "of", "the", "Mx", "roots", "under", "different", "treatment", ".", "Nuclei", "were", "labeled", "using", "DAPI", ".", "Scale", "Bar", ":", "100", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1G Verify the mobility of GFP (control) mRNA and GFP-MdCAX3 mRNA by RT-PCR in Mx leaf, stem, and root. The recombinant vectors (F) were transformed into A. tumefaciens GV3101 and introduced into Mx leaves by vacuum infiltration.H GFP fluorescence image of the Mx roots under different treatment. Nuclei were labeled using DAPI. Scale Bar: 100 μm."}
{"words": ["Figure", "3H", "Ratio", "(", "488", "/", "440", ")", "image", "of", "BCECF", "fluorescence", "in", "the", "roots", "of", "MdCAX3", "-", "suppressed", "in", "leaves", "Md", "/", "Mx", ".", "Scale", "bars", ":", "100", "μm", ".", "I", "Rhizosphere", "acidification", "of", "MdCAX3", "-", "suppressed", "in", "leaves", "Md", "/", "Mx", ".", "Bromocresol", "purple", "was", "used", "as", "a", "pH", "indicator", "for", "visualization", ".", "Scale", "bars", ":", "1", "cm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3H Ratio (488/440) image of BCECF fluorescence in the roots of MdCAX3-suppressed in leaves Md/Mx. Scale bars: 100 μm.I Rhizosphere acidification of MdCAX3-suppressed in leaves Md/Mx. Bromocresol purple was used as a pH indicator for visualization. Scale bars: 1 cm."}
{"words": ["Figure", "4F", "GUS", "staining", "in", "N", ".", "benthamiana", "leaves", "after", "transient", "co", "-", "expression", "of", "pro35S", ":", ":", "GFP", "with", "proMxCXIP1", ":", "GUS", "or", "proMbCXIP1", ":", "GUS", ",", "and", "co", "-", "expression", "with", "pBI101", ":", "GUS", "as", "a", "control", ".", "G", "Interaction", "between", "MdCXIP1", "and", "MdCAX3", "tested", "by", "yeast", "two", "-", "hybrid", "(", "Y2H", ")", "assays", ".", "A", "dilution", "series", "of", "NMY51", "yeast", "cells", "co", "-", "expressing", "MdCXIP1", "and", "MdCAX3", "cultured", "on", "SD", "/", "II", "and", "SDIV", "screening", "media", ".", "pPBT3", "-", "N", "(", "empty", "vector", ")", "co", "-", "expressed", "with", "MdCXIP1", "was", "used", "as", "a", "negative", "control", ".", "X", "-", "gal", "was", "used", "in", "SD", "/", "-", "Trp", "/", "-", "Leu", "/", "-", "His", "/", "-", "Ade", "screening", "medium", "to", "further", "test", "for", "possible", "interactions", ".", "I", "Interaction", "between", "MdCXIP1", "and", "the", "MdCAX3", "N", "-", "terminal", "autoinhibitory", "domain", "in", "an", "in", "vitro", "pull", "-", "down", "assay", ".", "The", "His", "-", "MdCXIP1", ",", "GST", "and", "GST", "-", "N", "-", "MdCAX3", "fusion", "proteins", "were", "expressed", "in", "the", "Escherichia", "coli", "BL21", "strain", ",", "and", "the", "GST", "protein", "alone", "was", "used", "as", "a", "negative", "control", ".", "'", "+", "'", "indicates", "presence", "and", "\"", "−", "\"", "indicates", "absence", ".", "IB", ",", "immunoblot", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4F GUS staining in N. benthamiana leaves after transient co-expression of pro35S::GFP with proMxCXIP1:GUS or proMbCXIP1:GUS, and co-expression with pBI101:GUS as a control.G Interaction between MdCXIP1 and MdCAX3 tested by yeast two-hybrid (Y2H) assays. A dilution series of NMY51 yeast cells co-expressing MdCXIP1 and MdCAX3 cultured on SD/II and SDIV screening media. pPBT3-N (empty vector) co-expressed with MdCXIP1 was used as a negative control. X-gal was used in SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade screening medium to further test for possible interactions.I Interaction between MdCXIP1 and the MdCAX3 N-terminal autoinhibitory domain in an in vitro pull-down assay. The His-MdCXIP1, GST and GST-N-MdCAX3 fusion proteins were expressed in the Escherichia coli BL21 strain, and the GST protein alone was used as a negative control. '+' indicates presence and \"−\" indicates absence. IB, immunoblot."}
{"words": ["Figure", "5C", "Fluorescence", "ratio", "(", "488", "/", "440", "nm", "excitations", ")", "of", "BCECF", "fluorescence", "in", "the", "roots", "of", "MdCAX3", "and", "MdCXIP1", "co", "-", "overexpressing", "Mb", ".", "The", "central", "band", "represents", "the", "median", "and", "the", "box", "ranges", "showing", "the", "interquartile", "range", "and", "covers", "the", "central", "50", "%", "of", "the", "data", ".", "The", "whiskers", "showing", "the", "minimum", "and", "maximum", "of", "the", "data", ".", "Three", "biological", "replicates", ";", "3", "roots", "were", "quantified", "for", "each", "replicate", ".", "Asterisks", "indicate", "statistically", "significant", "differences", "(", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "ANOVA", ",", "Tukey", "correction", ")", ".", "D", "Ratio", "(", "488", "/", "440", ")", "image", "of", "BCECF", "fluorescence", "in", "MdCAX3", "and", "MdCXIP1", "co", "-", "overexpressing", "Mb", ".", "Scale", "Bar", ":", "100", "μm", ".", "E", "Rhizosphere", "acidification", "in", "MdCAX3", "and", "MdCXIP1", "co", "-", "overexpressing", "Mb", ".", "Bromocresol", "purple", "was", "used", "as", "a", "pH", "indicator", "for", "visualization", ".", "Scale", "Bar", ":", "1", "cm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5C Fluorescence ratio (488/440 nm excitations) of BCECF fluorescence in the roots of MdCAX3 and MdCXIP1 co-overexpressing Mb. The central band represents the median and the box ranges showing the interquartile range and covers the central 50% of the data. The whiskers showing the minimum and maximum of the data. Three biological replicates; 3 roots were quantified for each replicate. Asterisks indicate statistically significant differences (***, P < 0.001; ANOVA, Tukey correction).D Ratio (488/440) image of BCECF fluorescence in MdCAX3 and MdCXIP1 co-overexpressing Mb. Scale Bar: 100 μm. E Rhizosphere acidification in MdCAX3 and MdCXIP1 co-overexpressing Mb. Bromocresol purple was used as a pH indicator for visualization. Scale Bar: 1 cm."}
{"words": ["Figure", "6D", "Cellular", "localization", "of", "Zn2", "+", "(", "blue", ")", "in", "Mx", "and", "MdCAX3", "-", "suppressed", "Mx", "roots", "under", "Fe", "deficient", "conditions", ".", "Arrowhead", "indicates", "the", "cytoplasm", ".", "Scale", "Bars", ":", "20", "μm", ".", "E", "Fluorescence", "intensity", "detection", "at", "the", "position", "indicated", "by", "the", "long", "and", "narrow", "arrow", "in", "the", "Fig", "6D", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6D Cellular localization of Zn2+ (blue) in Mx and MdCAX3-suppressed Mx roots under Fe deficient conditions. Arrowhead indicates the cytoplasm. Scale Bars: 20 μm. E Fluorescence intensity detection at the position indicated by the long and narrow arrow in the Fig 6D."}
{"words": ["Figure", "1D", "Volcano", "plot", "showing", "differentially", "expressed", "genes", "(", "adj", ".", "P", ".", "Val", "<", "0", ".", "05", ")", "between", "ethanol", "-", "and", "R5020", "-", "treated", "mouse", "mammary", "organoids", ",", "n", "=", "3", ".", "Genes", "with", "log2", "(", "FC", ")", ">", "2", "are", "highlighted", "in", "red", ",", "genes", "with", "log2FC", "<", "-", "2", "in", "blue", ".", "Names", "of", "genes", "with", "-", "log10", "(", "adj", ".", "P", ".", "Val", ")", ">", "10", "and", "abs", "(", "log2", "(", "FC", ")", ")", ">", "2", "are", "indicated", ".", "H", ",", "I", "Bar", "graphs", "showing", "relative", "Rankl", "and", "Wnt4", "transcript", "levels", "normalized", "to", "36B4", "expression", "in", "C57Bl6", "-", "derived", "mammary", "organoids", "treated", "for", "6", "hours", "with", "R5020", "(", "H", ")", "or", "LNG", "(", "I", ")", "and", "either", "10", "μM", "or", "100", "μM", "enzalutamide", ",", "n", "=", "3", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1D Volcano plot showing differentially expressed genes (adj. P.Val < 0.05) between ethanol- and R5020-treated mouse mammary organoids, n=3. Genes with log2(FC) > 2 are highlighted in red, genes with log2FC < -2 in blue. Names of genes with -log10 (adj.P.Val) > 10 and abs(log2(FC)) > 2 are indicated.H, I Bar graphs showing relative Rankl and Wnt4 transcript levels normalized to 36B4 expression in C57Bl6-derived mammary organoids treated for 6 hours with R5020 (H) or LNG (I) and either 10 μM or 100 μM enzalutamide, n=3 independent experiments."}
{"words": ["Figure", "2G", "Scatter", "plot", "showing", "the", "genes", "which", "are", "commonly", "altered", "upon", "R5020", "stimulation", "(", "adj", ".", "P", "-", "value", "<", "0", ".", "05", ")", "in", "both", "mouse", "and", "human", "organoids", "relative", "to", "their", "CTRL", "samples", ".", "Color", "scale", "as", "a", "function", "of", "the", "averaged", "human", "and", "mouse", "logFC", "values", ".", "The", "red", "dashed", "lines", "represent", "an", "adj", ".", "P", "-", "value", "threshold", "of", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2G Scatter plot showing the genes which are commonly altered upon R5020 stimulation (adj. P-value < 0.05) in both mouse and human organoids relative to their CTRL samples. Color scale as a function of the averaged human and mouse logFC values. The red dashed lines represent an adj. P-value threshold of 0.001."}
{"words": ["Figure", "3D", "Stereo", "micrographs", "of", "whole", "mounted", "mammary", "glands", "12", "weeks", "after", "injection", "of", "HBECs", ".", "Scale", "bar", ",", "2", "mm", ".", "Inset", ",", "arrows", "point", "to", "mouse", "ducts", "distended", "by", "the", "presence", "of", "HBECs", ".", "Scale", "bar", ",", "0", ".", "8", "mm", ".", "I", "Representative", "co", "-", "IF", "micrographs", "of", "a", "cross", "-", "sectioned", "\"", "humanized", "\"", "mouse", "milk", "duct", "5", "months", "after", "intraductal", "injection", "for", "AR", ",", "ERα", "and", "PR", ",", "in", "red", ",", "and", "human", "E", "-", "CAD", ",", "in", "green", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "K", "Bar", "graphs", "showing", "the", "threshold", "cycles", "of", "semi", "quantitative", "RT", "-", "PCR", "with", "human", "-", "specific", "primers", "on", "RNA", "from", "virgin", "(", "n", "=", "4", ")", "and", "pregnant", "(", "n", "=", "3", ")", "mice", "xenografted", "with", "human", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3D Stereo micrographs of whole mounted mammary glands 12 weeks after injection of HBECs. Scale bar, 2 mm. Inset, arrows point to mouse ducts distended by the presence of HBECs. Scale bar, 0.8 mm.I Representative co-IF micrographs of a cross-sectioned \"humanized\" mouse milk duct 5 months after intraductal injection for AR, ERα and PR, in red, and human E-CAD, in green. Scale bar, 50 μm.K Bar graphs showing the threshold cycles of semi quantitative RT-PCR with human-specific primers on RNA from virgin (n=4) and pregnant (n=3) mice xenografted with human cells."}
{"words": ["Figure", "4Progestin", "plasma", "levels", "in", "treated", "mice", "(", "n", "=", "10", ",", "14", ",", "18", ",", "7", ",", "6", ",", "10", ")", "and", "in", "women", "(", "n", "=", "20", ",", "11", ",", "3", ",", "4", ",", "6", ",", "8", ")", "on", "hormonal", "contraceptives", "measured", "by", "LC", "-", "MS", ",", "shown", "as", "means", "±", "SD", ",", "as", "well", "as", "values", "reported", "in", "the", "literature", "(", "Cmax", ")", ".", "The", "active", "form", "of", "DSG", ",", "3", "-", "ketodesogestrel", "was", "measured", ".", "Progestin", "plasma", "levels", "in", "treated", "mice", "(", "n", "=", "10", ",", "14", ",", "18", ",", "7", ",", "6", ",", "10", ")", "and", "in", "women", "(", "n", "=", "20", ",", "11", ",", "3", ",", "4", ",", "6", ",", "8", ")", "on", "hormonal", "contraceptives", "measured", "by", "LC", "-", "MS", ",", "shown", "as", "means", "±", "SD", ",", "as", "well", "as", "values", "reported", "in", "the", "literature", "(", "Cmax", ")", ".", "The", "active", "form", "of", "DSG", ",", "3", "-", "ketodesogestrel", "was", "measured", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Progestin plasma levels in treated mice (n=10, 14, 18, 7, 6, 10) and in women (n=20, 11, 3, 4, 6, 8) on hormonal contraceptives measured by LC-MS, shown as means ± SD, as well as values reported in the literature (Cmax). The active form of DSG, 3-ketodesogestrel was measured.Progestin plasma levels in treated mice (n=10, 14, 18, 7, 6, 10) and in women (n=20, 11, 3, 4, 6, 8) on hormonal contraceptives measured by LC-MS, shown as means ± SD, as well as values reported in the literature (Cmax). The active form of DSG, 3-ketodesogestrel was measured."}
{"words": ["Figure", "5E", "Representative", "micrographs", "showing", "co", "-", "IF", "with", "anti", "-", "KI67", "(", "red", ")", ",", "and", "anti", "-", "hECAD", "(", "green", ")", "of", "xenografted", "milk", "ducts", "after", "21", "days", "treatment", "with", "vehicle", "or", "LNG", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "F", "Violin", "plot", "showing", "the", "percentage", "of", "KI67", "and", "hECAD", "double", "+", "cells", "of", "total", "hECAD", "+", "cells", ",", "dots", "represent", "individual", "sectors", "counted", "in", "3", "different", "glands", ",", "control", "(", "n", "=", "30", ")", "or", "LNG", "(", "n", "=", "28", ")", ",", "median", "(", "red", ")", ",", "statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "non", "-", "parametric", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "G", "Bar", "plot", "showing", "relative", "transcript", "levels", "of", "MKI67", "in", "xenografted", "glands", "from", "control", "(", "n", "=", "6", ")", "and", "LNG", "-", "treated", "(", "n", "=", "3", ")", "mice", ",", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Representative", "micrographs", "showing", "co", "-", "IF", "with", "anti", "-", "KI67", "(", "red", ")", "and", "anti", "-", "hECAD", "(", "green", ")", "of", "histological", "sections", "from", "glands", "xenografted", "with", "HBECs", "from", "mammoplasty", "M310", "exposed", "to", "vehicle", "or", "progestins", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "J", "Violin", "plot", "showing", "the", "percentage", "of", "KI67", "and", "hECAD", "double", "+", "cells", "of", "total", "hECAD", "+", "cells", "in", "M310", "derived", "HBECs", ",", "dots", "represent", "individual", "sectors", "counted", "in", "different", "glands", ",", "median", "(", "red", ")", ",", "CTRL", "(", "n", "=", "180", ")", ",", "P4", "(", "n", "=", "134", ")", ",", "DSG", "(", "n", "=", "52", ")", ",", "GSN", "(", "n", "=", "161", ")", ",", "LNG", "(", "n", "=", "32", ")", ",", "CMA", "(", "n", "=", "56", ")", ",", "CPA", "(", "n", "=", "42", ")", ",", "DSP", "(", "n", "=", "100", ")", ".", "Statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "fitting", "a", "generalized", "linear", "mixed", "model", "with", "gamma", "distributions", "using", "the", "CTRL", "group", "as", "reference", ".", "K", "Violin", "plot", "showing", "the", "percentage", "of", "KI67", "and", "hECAD", "double", "+", "cells", "of", "total", "hECAD", "+", "HBECs", "derived", "from", "11", "different", "patients", "upon", "21", "days", "of", "CTRL", "(", "n", "=", "360", ")", ",", "P4", "(", "n", "=", "180", ")", ",", "DSG", "(", "n", "=", "147", ")", ",", "GSN", "(", "n", "=", "298", ")", ",", "LNG", "(", "n", "=", "284", ")", ",", "CMA", "(", "n", "=", "115", ")", ",", "CPA", "(", "n", "=", "156", ")", ",", "DSP", "(", "n", "=", "123", ")", "treatment", ".", "Red", "lines", "show", "medians", ".", "L", "Violin", "plot", "showing", "percentage", "of", "AR", "+", "intraductally", "-", "engrafted", "HBECs", "derived", "from", "11", "different", "patients", "upon", "21", "days", "of", "CTRL", "(", "n", "=", "258", ")", ",", "P4", "(", "n", "=", "97", ")", ",", "DSG", "(", "n", "=", "173", ")", ",", "GSN", "(", "n", "=", "159", ")", ",", "LNG", "(", "n", "=", "168", ")", ",", "CMA", "(", "n", "=", "68", ")", ",", "CPA", "(", "n", "=", "76", ")", ",", "DSP", "(", "n", "=", "135", ")", "pellets", ".", "Statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "fitting", "a", "generalized", "linear", "mixed", "model", "with", "gamma", "distributions", ",", "with", "batches", "and", "patients", "as", "random", "variables", "and", "CTRL", "as", "reference", ",", "median", "in", "red", ".", "J", "-", "L", "dashed", "line", "shows", "0", "%", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5E Representative micrographs showing co-IF with anti-KI67 (red), and anti-hECAD (green) of xenografted milk ducts after 21 days treatment with vehicle or LNG. Scale bar, 50 μm. F Violin plot showing the percentage of KI67 and hECAD double+ cells of total hECAD+ cells, dots represent individual sectors counted in 3 different glands, control (n=30) or LNG (n=28), median (red), statistical significance was assessed by non-parametric Mann-Whitney test. G Bar plot showing relative transcript levels of MKI67 in xenografted glands from control (n=6) and LNG-treated (n=3) mice, Student's t-test. Representative micrographs showing co-IF with anti-KI67 (red) and anti-hECAD (green) of histological sections from glands xenografted with HBECs from mammoplasty M310 exposed to vehicle or progestins. Scale bar, 50 μm. J Violin plot showing the percentage of KI67 and hECAD double+ cells of total hECAD+ cells in M310 derived HBECs, dots represent individual sectors counted in different glands, median (red), CTRL (n=180), P4 (n=134), DSG (n=52), GSN (n=161), LNG (n=32), CMA (n=56), CPA (n=42), DSP (n=100). Statistical significance was assessed by fitting a generalized linear mixed model with gamma distributions using the CTRL group as reference. K Violin plot showing the percentage of KI67 and hECAD double+ cells of total hECAD+ HBECs derived from 11 different patients upon 21 days of CTRL (n=360), P4 (n=180), DSG (n=147), GSN (n=298), LNG (n=284), CMA (n=115), CPA (n=156), DSP (n=123) treatment. Red lines show medians. L Violin plot showing percentage of AR+ intraductally-engrafted HBECs derived from 11 different patients upon 21 days of CTRL (n=258), P4 (n=97), DSG (n=173), GSN (n=159), LNG (n=168), CMA (n=68), CPA (n=76), DSP (n=135) pellets. Statistical significance was assessed by fitting a generalized linear mixed model with gamma distributions, with batches and patients as random variables and CTRL as reference, median in red. J-L dashed line shows 0%. "}
{"words": ["Figure", "6A", "-", "F", "Micrographs", "of", "H", "&", "E", "stained", "tissue", "sections", "from", "mouse", "mammary", "glands", "engrafted", "with", "HBECS", "and", "exposed", "to", "LNG", "or", "vehicle", "for", "6", "months", ".", "In", "control", "mice", "(", "A", ",", "B", ")", "most", "ducts", "have", "a", "narrow", "lumen", "and", "a", "thin", "wall", "due", "to", "limited", "growth", "of", "human", "cells", "(", "A", ")", ";", "a", "few", "mildly", "dilated", "ducts", "exhibit", "a", "cellular", "proliferation", "made", "out", "of", "multiple", "small", "acini", "burgeoning", "at", "the", "external", "side", "of", "their", "wall", "(", "B", ",", "arrows", ")", ".", "In", "LNG", "-", "treated", "mice", "(", "C", "-", "F", ")", "the", "peripheral", "acinar", "proliferation", "is", "diffuse", ",", "marked", "in", "some", "foci", "(", "C", ")", ",", "and", "associated", "with", "a", "variable", "degree", "of", "duct", "dilatation", "from", "mild", "(", "C", ",", "arrow", ")", "up", "to", "true", "cysts", "formation", "(", "D", ")", ".", "Proliferating", "human", "epithelial", "cells", "showing", "apocrine", "changes", "(", "e", ".", "g", ".", "abundant", "eosinophilic", "cytoplasm", "and", "central", "round", "nuclei", ")", "partly", "fill", "the", "ductal", "lumen", "with", "a", "complex", "architecture", "of", "micropapillae", "(", "E", ")", "and", "bridges", "(", "F", ",", "arrows", ")", ".", "Scalebars", ",", "50", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A-F Micrographs of H&E stained tissue sections from mouse mammary glands engrafted with HBECS and exposed to LNG or vehicle for 6 months. In control mice (A, B) most ducts have a narrow lumen and a thin wall due to limited growth of human cells (A); a few mildly dilated ducts exhibit a cellular proliferation made out of multiple small acini burgeoning at the external side of their wall (B, arrows). In LNG-treated mice (C-F) the peripheral acinar proliferation is diffuse, marked in some foci (C), and associated with a variable degree of duct dilatation from mild (C, arrow) up to true cysts formation (D). Proliferating human epithelial cells showing apocrine changes (e.g. abundant eosinophilic cytoplasm and central round nuclei) partly fill the ductal lumen with a complex architecture of micropapillae (E) and bridges (F, arrows). Scalebars, 50 μm."}
{"words": ["Figure", "7A", "-", "C", "Graphs", "showing", "in", "vivo", "growth", "of", "HBECs", "from", "different", "donors", "as", "measured", "by", "radiance", "after", "treatment", "with", "LNG", ",", "ENZ", ",", "or", "LNG", "and", "ENZ", ",", "means", "of", "radiance", "in", "individual", "glands", "±", "SEM", ",", "n", "=", "8", "-", "10", "per", "treatment", ",", "Wilcoxon", "matched", "-", "pairs", "test", ".", "Right", ":", "Dot", "plot", "showing", "plasma", "levels", "of", "progesterone", "(", "P", ")", ",", "testosterone", "(", "T", ")", "and", "LNG", "in", "individual", "xenografted", "animals", ".", "D", "Graph", "showing", "in", "vivo", "growth", "of", "HBECs", "from", "a", "20", "-", "year", "-", "old", "patient", "transduced", "with", "either", "sh", "scramble", "or", "shAR", "and", "treated", "with", "LNG", ".", "Points", "show", "means", "of", "radiance", "in", "individual", "glands", "±", "SEM", ";", "n", "=", "8", "-", "10", "per", "treatment", ".", "Wilcoxon", "matched", "-", "pairs", "test", ".", "E", "Representative", "micrographs", "showing", "co", "-", "IF", "with", "anti", "-", "GFP", "(", "red", ")", ",", "and", "anti", "-", "AR", "(", "green", ")", "antibodies", "on", "histological", "sections", "from", "glands", "xenografted", "with", "HBECs", "transduced", "either", "with", "sh", "scramble", "or", "shAR", "-", "expressing", "lentivirus", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "F", "Violin", "plot", "showing", "the", "percentage", "of", "AR", "-", "and", "GFP", "-", "double", "+", "cells", "of", "total", "GFP", "+", "cells", "in", "sh", "scramble", "(", "n", "=", "6", ")", "and", "shAR", "(", "n", "=", "12", ")", "conditions", ",", "dots", "represent", "individual", "sectors", "counted", ",", "median", "(", "red", ")", ".", "Statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "fitting", "a", "generalized", "linear", "mixed", "model", "with", "gamma", "distributions", "using", "CTRL", "as", "reference", ".", "Red", "line", "shows", "median", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A-C Graphs showing in vivo growth of HBECs from different donors as measured by radiance after treatment with LNG, ENZ, or LNG and ENZ, means of radiance in individual glands ± SEM, n= 8-10 per treatment, Wilcoxon matched-pairs test. Right: Dot plot showing plasma levels of progesterone (P), testosterone (T) and LNG in individual xenografted animals.D Graph showing in vivo growth of HBECs from a 20-year-old patient transduced with either sh scramble or shAR and treated with LNG. Points show means of radiance in individual glands ± SEM; n= 8-10 per treatment. Wilcoxon matched-pairs test.E Representative micrographs showing co-IF with anti-GFP (red), and anti-AR (green) antibodies on histological sections from glands xenografted with HBECs transduced either with sh scramble or shAR-expressing lentivirus. Scale bar, 50 μm. F Violin plot showing the percentage of AR- and GFP-double+ cells of total GFP+ cells in sh scramble (n=6) and shAR (n=12) conditions, dots represent individual sectors counted, median (red). Statistical significance was assessed by fitting a generalized linear mixed model with gamma distributions using CTRL as reference. Red line shows median. "}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Heatmap", "of", "genes", "in", "the", "livers", "of", "HFD", "-", "feeding", "induced", "NAFL", "mice", "and", "WD", "/", "CCl4", "-", "treatment", "induced", "NASH", "mice", ".", "n", "=", "5", ".", "The", "color", "gradient", "represents", "log2", "(", "Fold", "change", ")", ".", "(", "B", ")", "Relative", "mRNA", "levels", "of", "KLF10", "in", "the", "livers", "from", "NAFL", "and", "NASH", "mice", ".", "n", "=", "5", ".", "Results", "represent", "three", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "-", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t", "test", "(", "C", ")", "Protein", "levels", "of", "KLF10", "examined", "by", "western", "blots", "(", "left", ")", "and", "its", "expression", "was", "normalized", "to", "the", "β", "-", "actin", "(", "right", ")", ".", "n", "=", "3", ".", "Results", "represent", "three", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "-", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t", "test", "(", "D", ")", "Representative", "immunohistochemistry", "of", "KLF10", "protein", "expression", "in", "the", "liver", "sections", "from", "NAFL", "and", "NASH", "mice", ".", "The", "bar", "chart", "showed", "the", "fold", "change", "of", "KLF10", "positive", "cells", "per", "field", "(", "NASH", "vs", ".", "NAFL", ")", ".", "n", "=", "5", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "-", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t", "test", "(", "E", ")", "Correlations", "between", "KLF10", "and", "NAS", ",", "inflammation", "score", ",", "fibrosis", "scores", ",", "and", "hepatic", "triglyceride", "contents", "(", "TG", ")", "from", "NAFL", "mice", "(", "n", "=", "7", ")", "and", "NASH", "mice", "(", "n", "=", "8", ")", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "-", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Spearman", "'", "s", "correlation", "(", "E", "(", "F", ")", "H", "&", "E", "staining", ",", "Sirius", "red", "staining", ",", "and", "KLF10", "immunofluorescence", "staining", "of", "liver", "sections", "from", "NAFL", "and", "NASH", "patients", ".", "n", "=", "3", ".", "(", "G", ")", "Gene", "expression", "analysis", "in", "liver", "tissues", "from", "NAFL", "and", "NASH", "patients", "using", "GEO", "datasets", "(", "GSE48452", "and", "GSE61260", ")", "from", "NCBI", "database", ".", "In", "the", "dataset", "GSE48452", ",", "n", "=", "17", "for", "NAFL", "patients", "and", "n", "=", "15", "for", "NASH", "patients", ".", "In", "the", "dataset", "GSE61260", ",", "n", "=", "21", "for", "NAFL", "patients", "and", "n", "=", "24", "for", "NASH", "patients", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "-", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t", "test", "G", ")", ".", "(", "H", ")", "Spearman", "correlations", "between", "KLF10", "expression", "and", "NAS", "in", "liver", "tissues", "from", "NAFL", "and", "NASH", "patients", "using", "GEO", "datasets", "(", "GSE48452", ")", ".", "Left", "panel", ",", "n", "=", "32", "(", "including", "17", "NAFL", "patients", "and", "15", "NASH", "patients", ")", ".", "Right", "panel", ",", "n", "=", "21", "(", "including", "6", "NAFL", "and", "15", "NASH", "patients", ")", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "-", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Spearman", "'", "s", "correlation", "H", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Heatmap of genes in the livers of HFD-feeding induced NAFL mice and WD/CCl4-treatment induced NASH mice. n=5. The color gradient represents log2(Fold change).(B) Relative mRNA levels of KLF10 in the livers from NAFL and NASH mice. n=5. Results represent three independent experiments. Data information: * P <0.05, ** P <0.01-. Results are shown as mean ± SD. Student's t test(C) Protein levels of KLF10 examined by western blots (left) and its expression was normalized to the β-actin (right). n=3. Results represent three independent experiments. Data information: * P <0.05, ** P <0.01-. Results are shown as mean ± SD. Student's t test(D) Representative immunohistochemistry of KLF10 protein expression in the liver sections from NAFL and NASH mice. The bar chart showed the fold change of KLF10 positive cells per field (NASH vs. NAFL). n=5. Data information: * P <0.05, ** P <0.01-. Results are shown as mean ± SD. Student's t test(E) Correlations between KLF10 and NAS, inflammation score, fibrosis scores, and hepatic triglyceride contents (TG) from NAFL mice (n=7) and NASH mice (n=8). Data information: * P <0.05, ** P <0.01-. Results are shown as mean ± SD. Spearman's correlation (E(F) H&E staining, Sirius red staining, and KLF10 immunofluorescence staining of liver sections from NAFL and NASH patients. n=3.(G) Gene expression analysis in liver tissues from NAFL and NASH patients using GEO datasets (GSE48452 and GSE61260) from NCBI database. In the dataset GSE48452, n=17 for NAFL patients and n=15 for NASH patients. In the dataset GSE61260, n=21 for NAFL patients and n=24 for NASH patients. Data information: * P <0.05, ** P <0.01-. Results are shown as mean ± SD. Student's t test G).(H) Spearman correlations between KLF10 expression and NAS in liver tissues from NAFL and NASH patients using GEO datasets (GSE48452). Left panel, n=32 (including 17 NAFL patients and 15 NASH patients). Right panel, n=21 (including 6 NAFL and 15 NASH patients). Data information: * P <0.05, ** P <0.01-. Results are shown as mean ± SD. Spearman's correlation H)."}
{"words": ["Figure", "28", "-", "week", "-", "old", "male", "C57BL", "/", "6J", "mice", "were", "administered", "with", "AAV", "-", "GFP", "or", "AAV", "-", "Klf10", "through", "tail", "vein", "injection", ",", "and", "then", "kept", "on", "WD", "/", "CCl4", "for", "12", "weeks", ".", "n", "=", "5", "per", "group", ".", "(", "B", ")", "Protein", "levels", "of", "KLF10", "in", "the", "livers", "(", "left", ")", "and", "its", "expression", "was", "normalized", "to", "the", "β", "-", "actin", "(", "right", ")", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t", "test8", "-", "week", "-", "old", "male", "C57BL", "/", "6J", "mice", "were", "administered", "with", "AAV", "-", "GFP", "or", "AAV", "-", "Klf10", "through", "tail", "vein", "injection", ",", "and", "then", "kept", "on", "WD", "/", "CCl4", "for", "12", "weeks", ".", "n", "=", "5", "per", "group", ".", "(", "C", ")", "H", "&", "E", "staining", "of", "liver", "sections", ".", "8", "-", "week", "-", "old", "male", "C57BL", "/", "6J", "mice", "were", "administered", "with", "AAV", "-", "GFP", "or", "AAV", "-", "Klf10", "through", "tail", "vein", "injection", ",", "and", "then", "kept", "on", "WD", "/", "CCl4", "for", "12", "weeks", ".", "n", "=", "5", "per", "group", ".", "(", "D", ")", "CD68", "immunofluorescence", "staining", "of", "liver", "sections", "(", "left", ")", "and", "its", "quantitation", "(", "right", ")", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t", "test8", "-", "week", "-", "old", "male", "C57BL", "/", "6J", "mice", "were", "administered", "with", "AAV", "-", "GFP", "or", "AAV", "-", "Klf10", "through", "tail", "vein", "injection", ",", "and", "then", "kept", "on", "WD", "/", "CCl4", "for", "12", "weeks", ".", "n", "=", "5", "per", "group", ".", "(", "E", ")", "Body", "weight", "(", "BW", ")", ",", "liver", "/", "body", "weight", "ratio", ",", "serum", "AST", "and", "ALT", "levels", ",", "and", "hepatic", "TG", "contents", "of", "two", "groups", "of", "mice", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t", "test8", "-", "week", "-", "old", "male", "C57BL", "/", "6J", "mice", "were", "administered", "with", "AAV", "-", "GFP", "or", "AAV", "-", "Klf10", "through", "tail", "vein", "injection", ",", "and", "then", "kept", "on", "WD", "/", "CCl4", "for", "12", "weeks", ".", "n", "=", "5", "per", "group", ".", "(", "F", ")", "Sirius", "red", "staining", "of", "liver", "sections", "(", "left", ")", "and", "its", "quantitation", "(", "right", ")", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t", "test8", "-", "week", "-", "old", "male", "C57BL", "/", "6J", "mice", "were", "administered", "with", "AAV", "-", "GFP", "or", "AAV", "-", "Klf10", "through", "tail", "vein", "injection", ",", "and", "then", "kept", "on", "WD", "/", "CCl4", "for", "12", "weeks", ".", "n", "=", "5", "per", "group", ".", "(", "G", ")", "Relative", "mRNA", "levels", "of", "genes", "involved", "in", "the", "hepatic", "inflammation", "and", "fibrosis", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t", "test8", "-", "week", "-", "old", "male", "C57BL", "/", "6J", "mice", "were", "administered", "with", "AAV", "-", "GFP", "or", "AAV", "-", "Klf10", "through", "tail", "vein", "injection", ",", "and", "then", "kept", "on", "WD", "/", "CCl4", "for", "12", "weeks", ".", "n", "=", "5", "per", "group", ".", "(", "H", ")", "Protein", "levels", "of", "TNF", "-", "α", "in", "the", "livers", "(", "left", ")", "and", "its", "expression", "was", "normalized", "to", "the", "β", "-", "actin", "(", "right", ")", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t", "test8", "-", "week", "-", "old", "male", "C57BL", "/", "6J", "mice", "were", "administered", "with", "AAV", "-", "GFP", "or", "AAV", "-", "Klf10", "through", "tail", "vein", "injection", ",", "and", "then", "kept", "on", "HFD", "-", "feeding", "for", "12", "weeks", ".", "n", "=", "5", "per", "group", ".", "(", "J", ")", "Protein", "levels", "of", "KLF10", "in", "the", "livers", "(", "left", ")", "and", "its", "expression", "was", "normalized", "to", "β", "-", "actin", "(", "right", ")", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t", "test8", "-", "week", "-", "old", "male", "C57BL", "/", "6J", "mice", "were", "administered", "with", "AAV", "-", "GFP", "or", "AAV", "-", "Klf10", "through", "tail", "vein", "injection", ",", "and", "then", "kept", "on", "HFD", "-", "feeding", "for", "12", "weeks", ".", "n", "=", "5", "per", "group", ".", "(", "K", ")", "H", "&", "E", "staining", "of", "liver", "sections", ".", "8", "-", "week", "-", "old", "male", "C57BL", "/", "6J", "mice", "were", "administered", "with", "AAV", "-", "GFP", "or", "AAV", "-", "Klf10", "through", "tail", "vein", "injection", ",", "and", "then", "kept", "on", "HFD", "-", "feeding", "for", "12", "weeks", ".", "n", "=", "5", "per", "group", ".", "(", "L", ")", "CD68", "immunofluorescence", "staining", "of", "liver", "sections", "(", "left", ")", "and", "its", "quantitation", "(", "right", ")", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t", "test8", "-", "week", "-", "old", "male", "C57BL", "/", "6J", "mice", "were", "administered", "with", "AAV", "-", "GFP", "or", "AAV", "-", "Klf10", "through", "tail", "vein", "injection", ",", "and", "then", "kept", "on", "HFD", "-", "feeding", "for", "12", "weeks", ".", "n", "=", "5", "per", "group", ".", "(", "M", ")", "Body", "weight", "(", "BW", ")", ",", "liver", "/", "body", "weight", "ratio", ",", "serum", "AST", "and", "ALT", "levels", ",", "and", "hepatic", "TG", "contents", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t", "test8", "-", "week", "-", "old", "male", "C57BL", "/", "6J", "mice", "were", "administered", "with", "AAV", "-", "GFP", "or", "AAV", "-", "Klf10", "through", "tail", "vein", "injection", ",", "and", "then", "kept", "on", "HFD", "-", "feeding", "for", "12", "weeks", ".", "n", "=", "5", "per", "group", ".", "(", "N", ")", "Sirius", "red", "staining", "of", "liver", "sections", "(", "left", ")", "and", "its", "quantitation", "(", "right", ")", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t", "test8", "-", "week", "-", "old", "male", "C57BL", "/", "6J", "mice", "were", "administered", "with", "AAV", "-", "GFP", "or", "AAV", "-", "Klf10", "through", "tail", "vein", "injection", ",", "and", "then", "kept", "on", "HFD", "-", "feeding", "for", "12", "weeks", ".", "n", "=", "5", "per", "group", ".", "(", "O", ")", "Relative", "mRNA", "levels", "of", "genes", "involved", "in", "the", "hepatic", "inflammation", "and", "fibrosis", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t", "test8", "-", "week", "-", "old", "male", "C57BL", "/", "6J", "mice", "were", "administered", "with", "AAV", "-", "GFP", "or", "AAV", "-", "Klf10", "through", "tail", "vein", "injection", ",", "and", "then", "kept", "on", "HFD", "-", "feeding", "for", "12", "weeks", ".", "n", "=", "5", "per", "group", ".", "(", "P", ")", "Protein", "levels", "of", "TNF", "-", "α", "in", "the", "livers", "(", "left", ")", "and", "its", "expression", "was", "normalized", "to", "the", "β", "-", "actin", "(", "right", ")", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 28-week-old male C57BL/6J mice were administered with AAV-GFP or AAV -Klf10 through tail vein injection, and then kept on WD/CCl4 for 12 weeks. n=5 per group. (B) Protein levels of KLF10 in the livers (left) and its expression was normalized to the β-actin (right). Data information: * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001. Results are shown as mean ± SD. Student's t test8-week-old male C57BL/6J mice were administered with AAV-GFP or AAV -Klf10 through tail vein injection, and then kept on WD/CCl4 for 12 weeks. n=5 per group. (C) H&E staining of liver sections.8-week-old male C57BL/6J mice were administered with AAV-GFP or AAV -Klf10 through tail vein injection, and then kept on WD/CCl4 for 12 weeks. n=5 per group. (D) CD68 immunofluorescence staining of liver sections (left) and its quantitation (right). Data information: * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001. Results are shown as mean ± SD. Student's t test8-week-old male C57BL/6J mice were administered with AAV-GFP or AAV -Klf10 through tail vein injection, and then kept on WD/CCl4 for 12 weeks. n=5 per group. (E) Body weight (BW), liver/body weight ratio, serum AST and ALT levels, and hepatic TG contents of two groups of mice. Data information: * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001. Results are shown as mean ± SD. Student's t test8-week-old male C57BL/6J mice were administered with AAV-GFP or AAV -Klf10 through tail vein injection, and then kept on WD/CCl4 for 12 weeks. n=5 per group. (F) Sirius red staining of liver sections (left) and its quantitation (right). Data information: * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001. Results are shown as mean ± SD. Student's t test8-week-old male C57BL/6J mice were administered with AAV-GFP or AAV -Klf10 through tail vein injection, and then kept on WD/CCl4 for 12 weeks. n=5 per group. (G) Relative mRNA levels of genes involved in the hepatic inflammation and fibrosis. Data information: * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001. Results are shown as mean ± SD. Student's t test8-week-old male C57BL/6J mice were administered with AAV-GFP or AAV -Klf10 through tail vein injection, and then kept on WD/CCl4 for 12 weeks. n=5 per group. (H) Protein levels of TNF-α in the livers (left) and its expression was normalized to the β-actin (right). Data information: * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001. Results are shown as mean ± SD. Student's t test8-week-old male C57BL/6J mice were administered with AAV-GFP or AAV -Klf10 through tail vein injection, and then kept on HFD-feeding for 12 weeks. n=5 per group. (J) Protein levels of KLF10 in the livers (left) and its expression was normalized to β-actin (right). Data information: * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001. Results are shown as mean ± SD. Student's t test8-week-old male C57BL/6J mice were administered with AAV-GFP or AAV -Klf10 through tail vein injection, and then kept on HFD-feeding for 12 weeks. n=5 per group. (K) H&E staining of liver sections.8-week-old male C57BL/6J mice were administered with AAV-GFP or AAV -Klf10 through tail vein injection, and then kept on HFD-feeding for 12 weeks. n=5 per group. (L) CD68 immunofluorescence staining of liver sections (left) and its quantitation (right). Data information: * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001. Results are shown as mean ± SD. Student's t test8-week-old male C57BL/6J mice were administered with AAV-GFP or AAV -Klf10 through tail vein injection, and then kept on HFD-feeding for 12 weeks. n=5 per group. (M) Body weight (BW), liver/body weight ratio, serum AST and ALT levels, and hepatic TG contents. Data information: * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001. Results are shown as mean ± SD. Student's t test8-week-old male C57BL/6J mice were administered with AAV-GFP or AAV -Klf10 through tail vein injection, and then kept on HFD-feeding for 12 weeks. n=5 per group. (N) Sirius red staining of liver sections (left) and its quantitation (right). Data information: * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001. Results are shown as mean ± SD. Student's t test8-week-old male C57BL/6J mice were administered with AAV-GFP or AAV -Klf10 through tail vein injection, and then kept on HFD-feeding for 12 weeks. n=5 per group. (O) Relative mRNA levels of genes involved in the hepatic inflammation and fibrosis. Data information: * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001. Results are shown as mean ± SD. Student's t test8-week-old male C57BL/6J mice were administered with AAV-GFP or AAV -Klf10 through tail vein injection, and then kept on HFD-feeding for 12 weeks. n=5 per group. (P) Protein levels of TNF-α in the livers (left) and its expression was normalized to the β-actin (right). Data information: * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001. Results are shown as mean ± SD. Student's t test"}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Heatmap", "of", "genes", "in", "mouse", "primary", "hepatocytes", "transfected", "with", "lentivirus", "vectors", "expressing", "KLF10", "(", "KLF10OE", ")", "or", "empty", "vector", "(", "Ctrl", ")", ",", "P", "＜", "0", ".", "001", ".", "n", "=", "5", "per", "group", ".", "The", "color", "gradient", "represents", "log2", "(", "Fold", "change", ")", ".", "(", "B", ")", "Relative", "mRNA", "(", "n", "=", "5", ")", "and", "protein", "(", "n", "=", "3", ")", "levels", "of", "zDHHC7", "in", "MPHs", "expressing", "KLF10", "or", "empty", "vector", "(", "Ctrl", ")", ".", "The", "protein", "level", "of", "KLF10", "or", "zDHHC7", "was", "normalized", "to", "β", "-", "actin", ".", "Results", "represent", "three", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t", "test", "(", "B", "(", "C", "-", "D", ")", "Spearman", "correlations", "between", "KLF10", "and", "zDHHC7", "in", "liver", "tissues", "from", "NASH", "and", "NAFL", "patients", "using", "GEO", "datasets", "(", "GSE48452", "and", "GSE61260", ")", ".", "In", "the", "dataset", "GSE61260", "(", "C", ")", ",", "n", "=", "83", "(", "including", "38", "healthy", "controls", ",", "21", "NAFL", "patients", "and", "24", "NASH", "patients", ")", ".", "In", "the", "dataset", "GSE48452", "(", "D", ")", ",", "n", "=", "73", "(", "including", "41", "healthy", "controls", ",", "17", "NAFL", "patients", "and", "15", "NASH", "patients", ")", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Spearman", "'", "s", "correlation", "(", "C", ",", "D", ")", ".", "(", "E", ")", "Relative", "mRNA", "levels", "of", "DHHCs", "family", "in", "HepG2", "cells", "overexpressing", "KLF10", "or", "empty", "vector", "(", "ctrl", ")", ".", "n", "=", "5", ".", "Results", "represent", "three", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t", "test", "(", "F", ")", "Protein", "levels", "of", "zDHHC7", "in", "the", "livers", "of", "HFD", "mice", "or", "WD", "/", "CCl4", "mice", "The", "protein", "level", "of", "zDHHC7", "was", "normalized", "to", "the", "β", "-", "actin", ".", "n", "=", "5", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t", "test", "(", "H", ")", "The", "transcriptional", "activity", "of", "wild", "-", "type", "or", "mutant", "zDHHC7", "promoter", "in", "HepG2", "cells", ".", "n", "=", "3", ".", "Results", "represent", "three", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t", "test", "(", "I", ")", "Chromatin", "immunoprecipitation", "analysis", "of", "KLF10", "binding", "activity", "at", "the", "zDHHC7", "promoter", ".", "Soluble", "chromatin", "was", "prepared", "from", "the", "livers", "of", "WD", "/", "CCl4", "treatment", "-", "induced", "NASH", "mice", "and", "immunoprecipitated", "with", "antibodies", "against", "KLF10", "or", "against", "IgG", ".", "The", "final", "DNA", "extractions", "were", "amplified", "using", "pairs", "of", "primers", "that", "cover", "the", "regions", "of", "zDHHC7", "and", "GAPDH", "gene", "promoters", ".", "(", "J", ")", "Quantitative", "real", "-", "time", "RCR", "results", "of", "ChIP", "assays", ".", "IgG", ",", "immunoglobulin", "G", ".", "n", "=", "3", ".", "Results", "represent", "three", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t", "test", "J", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Heatmap of genes in mouse primary hepatocytes transfected with lentivirus vectors expressing KLF10 (KLF10OE) or empty vector (Ctrl), P＜0.001. n=5 per group. The color gradient represents log2(Fold change).(B) Relative mRNA (n=5) and protein (n=3) levels of zDHHC7 in MPHs expressing KLF10 or empty vector (Ctrl). The protein level of KLF10 or zDHHC7 was normalized to β-actin. Results represent three independent experiments. Data information: * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001. Results are shown as mean ± SD. Student's t test (B(C-D) Spearman correlations between KLF10 and zDHHC7 in liver tissues from NASH and NAFL patients using GEO datasets (GSE48452 and GSE61260). In the dataset GSE61260 (C), n=83 (including 38 healthy controls, 21 NAFL patients and 24 NASH patients). In the dataset GSE48452 (D), n=73 (including 41 healthy controls, 17 NAFL patients and 15 NASH patients). Data information: * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001. Results are shown as mean ± SD. Spearman's correlation (C, D).(E) Relative mRNA levels of DHHCs family in HepG2 cells overexpressing KLF10 or empty vector (ctrl). n=5. Results represent three independent experiments. Data information: * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001. Results are shown as mean ± SD. Student's t test(F) Protein levels of zDHHC7 in the livers of HFD mice or WD/CCl4 mice The protein level of zDHHC7 was normalized to the β-actin. n=5. Data information: * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001. Results are shown as mean ± SD. Student's t test(H) The transcriptional activity of wild-type or mutant zDHHC7 promoter in HepG2 cells. n=3. Results represent three independent experiments. Data information: * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001. Results are shown as mean ± SD. Student's t test(I) Chromatin immunoprecipitation analysis of KLF10 binding activity at the zDHHC7 promoter. Soluble chromatin was prepared from the livers of WD/CCl4 treatment-induced NASH mice and immunoprecipitated with antibodies against KLF10 or against IgG. The final DNA extractions were amplified using pairs of primers that cover the regions of zDHHC7 and GAPDH gene promoters. (J) Quantitative real-time RCR results of ChIP assays. IgG, immunoglobulin G. n=3. Results represent three independent experiments. Data information: * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001. Results are shown as mean ± SD. Student's t test J)."}
{"words": ["Figure", "4The", "liver", "tissues", "were", "collected", "from", "WD", "/", "CCl4", "-", "treated", "mice", "expressing", "KLF10", "or", "control", "(", "A", ")", "Representative", "immunofluorescence", "staining", "of", "CD36", "and", "β", "-", "catenin", ".", "The", "arrows", "represent", "the", "colocalization", "of", "CD36", "and", "β", "-", "catenin", ".", "The", "liver", "tissues", "were", "collected", "from", "WD", "/", "CCl4", "-", "treated", "mice", "expressing", "KLF10", "or", "control", "(", "B", ")", "Quantitative", "results", "of", "CD36", "colocalization", "rate", ".", "n", "=", "5", ".", "Results", "represent", "three", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t", "test", "(", "BThe", "liver", "tissues", "were", "collected", "from", "WD", "/", "CCl4", "-", "treated", "mice", "expressing", "KLF10", "or", "control", "(", "C", ")", "Expression", "of", "CD36", "in", "whole", "livers", "and", "plasma", "membrane", "fractions", ".", "Protein", "levels", "were", "normalized", "to", "the", "β", "-", "actin", "or", "ATP1a1", ",", "respectively", ".", "n", "=", "5", ".", "Results", "represent", "three", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t", "testThe", "liver", "tissues", "were", "collected", "from", "WD", "/", "CCl4", "-", "treated", "mice", "expressing", "KLF10", "or", "control", "(", "D", ")", "Protein", "levels", "of", "palmitoylated", "CD36", "in", "mouse", "livers", ".", "(", "E", ")", "Quantitative", "results", "of", "CD36", "colocalization", "rate", ".", "n", "=", "3", ".", "Results", "represent", "three", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t", "test", "E", ",", "The", "liver", "tissues", "were", "collected", "from", "HFD", "-", "fed", "mice", "expressing", "KLF10", "or", "control", "(", "F", ")", "Representative", "immunofluorescence", "staining", "of", "CD36", "and", "β", "-", "catenin", ".", "The", "arrows", "represent", "the", "colocalization", "of", "CD36", "and", "β", "-", "catenin", ".", "The", "liver", "tissues", "were", "collected", "from", "HFD", "-", "fed", "mice", "expressing", "KLF10", "or", "control", "(", "G", ")", "Quantitative", "results", "of", "CD36", "colocalization", "rate", ".", "Results", "represent", "three", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t", "testThe", "liver", "tissues", "were", "collected", "from", "HFD", "-", "fed", "mice", "expressing", "KLF10", "or", "control", "(", "H", ")", "Expression", "of", "CD36", "in", "whole", "livers", "and", "plasma", "membrane", "fractions", ".", "Protein", "levels", "were", "normalized", "to", "the", "β", "-", "actin", "or", "ATP1a1", ",", "respectively", ".", "n", "=", "5", ".", "Results", "represent", "three", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t", "testThe", "liver", "tissues", "were", "collected", "from", "HFD", "-", "fed", "mice", "expressing", "KLF10", "or", "control", "(", "I", ")", "Protein", "levels", "of", "palmitoylated", "CD36", "in", "mouse", "livers", ".", "(", "J", ")", "Quantitative", "results", "of", "CD36", "colocalization", "rate", ".", "n", "=", "3", ".", "Results", "represent", "three", "independent", "experiments", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t", "test", "J", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4The liver tissues were collected from WD/CCl4-treated mice expressing KLF10 or control (A) Representative immunofluorescence staining of CD36 and β-catenin. The arrows represent the colocalization of CD36 and β-catenin.The liver tissues were collected from WD/CCl4-treated mice expressing KLF10 or control (B) Quantitative results of CD36 colocalization rate. n=5. Results represent three independent experiments. Data information: * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001. Results are shown as mean ± SD. Student's t test (BThe liver tissues were collected from WD/CCl4-treated mice expressing KLF10 or control (C) Expression of CD36 in whole livers and plasma membrane fractions. Protein levels were normalized to the β-actin or ATP1a1, respectively. n=5. Results represent three independent experiments. Data information: * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001. Results are shown as mean ± SD. Student's t testThe liver tissues were collected from WD/CCl4-treated mice expressing KLF10 or control (D) Protein levels of palmitoylated CD36 in mouse livers. (E) Quantitative results of CD36 colocalization rate. n=3. Results represent three independent experiments. Data information: * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001. Results are shown as mean ± SD. Student's t test E,The liver tissues were collected from HFD-fed mice expressing KLF10 or control (F) Representative immunofluorescence staining of CD36 and β-catenin. The arrows represent the colocalization of CD36 and β-catenin.The liver tissues were collected from HFD-fed mice expressing KLF10 or control (G) Quantitative results of CD36 colocalization rate. Results represent three independent experiments. Data information: * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001. Results are shown as mean ± SD. Student's t testThe liver tissues were collected from HFD-fed mice expressing KLF10 or control (H) Expression of CD36 in whole livers and plasma membrane fractions. Protein levels were normalized to the β-actin or ATP1a1, respectively. n=5. Results represent three independent experiments. Data information: * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001. Results are shown as mean ± SD. Student's t testThe liver tissues were collected from HFD-fed mice expressing KLF10 or control (I) Protein levels of palmitoylated CD36 in mouse livers. (J) Quantitative results of CD36 colocalization rate. n=3. Results represent three independent experiments. Data information: * P < 0.05, ** P < 0.01, *** P < 0.001. Results are shown as mean ± SD. Student's t test J)."}
{"words": ["Figure", "5HepG2", "cells", "were", "transfected", "with", "lentivirus", "vectors", "expressing", "shRNA", "targeting", "KLF10", "or", "negative", "control", "(", "Ctrl", ")", ".", "n", "=", "3", ".", "Results", "represent", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "A", ")", "Protein", "level", "of", "KLF10", ",", "and", "its", "normalization", "to", "β", "-", "actin", ".", "HepG2", "cells", "were", "transfected", "with", "lentivirus", "vectors", "expressing", "shRNA", "targeting", "KLF10", "or", "negative", "control", "(", "Ctrl", ")", ".", "n", "=", "3", ".", "Results", "represent", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "B", ")", "Protein", "levels", "of", "palmitoylated", "CD36", ".", "Data", "information", ":", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t", "test", "(", "BHepG2", "cells", "were", "transfected", "with", "lentivirus", "vectors", "expressing", "shRNA", "targeting", "KLF10", "or", "negative", "control", "(", "Ctrl", ")", ".", "n", "=", "3", ".", "Results", "represent", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "C", ")", "CD36", "protein", "expression", "the", "plasma", "membrane", "fractions", ",", "and", "its", "normalization", "to", "ATP1a1", ".", "Data", "information", ":", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t", "test", "C", ")", ".", "HepG2", "cells", "were", "treated", "with", "2", "-", "BP", "and", "/", "or", "lentivirus", "vectors", "expressing", "KLF10", ".", "n", "=", "3", ".", "Results", "represent", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "D", ")", "Protein", "levels", "of", "KLF10", ",", "and", "its", "normalization", "to", "β", "-", "actin", ".", "Data", "information", ":", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "1", "-", "way", "ANOVAHepG2", "cells", "were", "treated", "with", "2", "-", "BP", "and", "/", "or", "lentivirus", "vectors", "expressing", "KLF10", ".", "n", "=", "3", ".", "Results", "represent", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "E", ")", "Protein", "levels", "of", "palmitoylated", "CD36", ".", "Data", "information", ":", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "1", "-", "way", "ANOVAHepG2", "cells", "were", "treated", "with", "2", "-", "BP", "and", "/", "or", "lentivirus", "vectors", "expressing", "KLF10", ".", "n", "=", "3", ".", "Results", "represent", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "F", ")", "CD36", "protein", "expression", "the", "plasma", "membrane", "fractions", ",", "and", "its", "normalization", "to", "ATP1a1", ".", "Data", "information", ":", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "1", "-", "way", "ANOVAHepG2", "cells", "were", "treated", "with", "2", "-", "BP", "and", "/", "or", "lentivirus", "vectors", "expressing", "KLF10", ".", "n", "=", "3", ".", "Results", "represent", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "G", ")", "BODIPY", "staining", "showing", "the", "lipid", "droplets", ".", "HepG2", "cells", "were", "transfected", "with", "lentiviruses", "expressing", "KLF10", "and", "/", "or", "shRNA", "targeting", "zDHHC7", ".", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "(", "H", ")", "Protein", "levels", "of", "KLF10", "and", "zDHHC7", ",", "and", "its", "normalization", "to", "β", "-", "actin", ".", "Data", "information", ":", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "1", "-", "way", "ANOVAHepG2", "cells", "were", "transfected", "with", "lentiviruses", "expressing", "KLF10", "and", "/", "or", "shRNA", "targeting", "zDHHC7", ".", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "(", "I", ")", "Protein", "levels", "of", "palmitoylated", "CD36", ".", "Data", "information", ":", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "1", "-", "way", "ANOVAHepG2", "cells", "were", "transfected", "with", "lentiviruses", "expressing", "KLF10", "and", "/", "or", "shRNA", "targeting", "zDHHC7", ".", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "(", "J", ")", "Immunofluorescence", "staining", "of", "CD36", "and", "Na", "+", "/", "K", "+", "-", "ATPase", "(", "left", ")", ",", "and", "the", "quantitation", "of", "CD36", "colocalization", "rate", "(", "right", ")", ".", "Data", "information", ":", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "1", "-", "way", "ANOVAHepG2", "cells", "were", "transfected", "with", "lentiviruses", "expressing", "KLF10", "and", "/", "or", "shRNA", "targeting", "zDHHC7", ".", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "(", "K", ")", "BODIPY", "staining", "for", "lipid", "droplets", ".", "HepG2", "cells", "were", "transfected", "with", "lentiviruses", "expressing", "KLF10", "and", "/", "or", "shRNA", "targeting", "zDHHC7", ".", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "(", "L", ")", "Cellular", "TG", "contents", ".", "Data", "information", ":", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "1", "-", "way", "ANOVA", ",", "L", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5HepG2 cells were transfected with lentivirus vectors expressing shRNA targeting KLF10 or negative control (Ctrl). n=3. Results represent three independent experiments. (A) Protein level of KLF10, and its normalization to β-actin.HepG2 cells were transfected with lentivirus vectors expressing shRNA targeting KLF10 or negative control (Ctrl). n=3. Results represent three independent experiments. (B) Protein levels of palmitoylated CD36. Data information: ** P < 0.01. Results are shown as mean ± SD. Student's t test (BHepG2 cells were transfected with lentivirus vectors expressing shRNA targeting KLF10 or negative control (Ctrl). n=3. Results represent three independent experiments. (C) CD36 protein expression the plasma membrane fractions, and its normalization to ATP1a1. Data information: ** P < 0.01. Results are shown as mean ± SD. Student's t test C).HepG2 cells were treated with 2-BP and/or lentivirus vectors expressing KLF10. n=3. Results represent three independent experiments. (D) Protein levels of KLF10, and its normalization to β-actin. Data information: ** P < 0.01. Results are shown as mean ± SD. 1-way ANOVAHepG2 cells were treated with 2-BP and/or lentivirus vectors expressing KLF10. n=3. Results represent three independent experiments. (E) Protein levels of palmitoylated CD36. Data information: ** P < 0.01. Results are shown as mean ± SD. 1-way ANOVAHepG2 cells were treated with 2-BP and/or lentivirus vectors expressing KLF10. n=3. Results represent three independent experiments. (F) CD36 protein expression the plasma membrane fractions, and its normalization to ATP1a1. Data information: ** P < 0.01. Results are shown as mean ± SD. 1-way ANOVAHepG2 cells were treated with 2-BP and/or lentivirus vectors expressing KLF10. n=3. Results represent three independent experiments. (G) BODIPY staining showing the lipid droplets.HepG2 cells were transfected with lentiviruses expressing KLF10 and/or shRNA targeting zDHHC7. n=3 independent experiments. (H) Protein levels of KLF10 and zDHHC7, and its normalization to β-actin. Data information: ** P < 0.01. Results are shown as mean ± SD. 1-way ANOVAHepG2 cells were transfected with lentiviruses expressing KLF10 and/or shRNA targeting zDHHC7. n=3 independent experiments. (I) Protein levels of palmitoylated CD36. Data information: ** P < 0.01. Results are shown as mean ± SD. 1-way ANOVAHepG2 cells were transfected with lentiviruses expressing KLF10 and/or shRNA targeting zDHHC7. n=3 independent experiments. (J) Immunofluorescence staining of CD36 and Na+/K+-ATPase (left), and the quantitation of CD36 colocalization rate (right). Data information: ** P < 0.01. Results are shown as mean ± SD. 1-way ANOVAHepG2 cells were transfected with lentiviruses expressing KLF10 and/or shRNA targeting zDHHC7. n=3 independent experiments. (K) BODIPY staining for lipid droplets.HepG2 cells were transfected with lentiviruses expressing KLF10 and/or shRNA targeting zDHHC7. n=3 independent experiments. (L) Cellular TG contents. Data information: ** P < 0.01. Results are shown as mean ± SD. 1-way ANOVA , L)."}
{"words": ["Figure", "66", "-", "week", "-", "old", "male", "CD36", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "or", "knockout", "mice", "(", "CD36KO", ")", "were", "administered", "with", "AAV", "-", "GFP", "(", "Ctrl", ")", "or", "AAV", "-", "KLF10", "(", "KLF10OE", ")", "through", "tail", "vein", "injection", ",", "and", "then", "kept", "on", "WD", "/", "CCl4", "for", "12", "weeks", ".", "n", "=", "5", "per", "group", ".", "(", "A", ")", "Protein", "levels", "of", "KLF10", "and", "CD36", "in", "the", "liver", "(", "left", ")", ",", "and", "their", "normalization", "to", "β", "-", "actin", "(", "right", ")", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "1", "-", "way", "ANOVA", "(", "A6", "-", "week", "-", "old", "male", "CD36", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "or", "knockout", "mice", "(", "CD36KO", ")", "were", "administered", "with", "AAV", "-", "GFP", "(", "Ctrl", ")", "or", "AAV", "-", "KLF10", "(", "KLF10OE", ")", "through", "tail", "vein", "injection", ",", "and", "then", "kept", "on", "WD", "/", "CCl4", "for", "12", "weeks", ".", "n", "=", "5", "per", "group", ".", "(", "B", ")", "Representative", "immunofluorescence", "staining", "of", "KLF10", "and", "CD36", "(", "left", ")", ",", "and", "the", "quantitative", "results", "(", "right", ")", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "1", "-", "way", "ANOVA6", "-", "week", "-", "old", "male", "CD36", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "or", "knockout", "mice", "(", "CD36KO", ")", "were", "administered", "with", "AAV", "-", "GFP", "(", "Ctrl", ")", "or", "AAV", "-", "KLF10", "(", "KLF10OE", ")", "through", "tail", "vein", "injection", ",", "and", "then", "kept", "on", "WD", "/", "CCl4", "for", "12", "weeks", ".", "n", "=", "5", "per", "group", ".", "(", "C", ")", "H", "&", "E", "and", "Sirius", "red", "staining", "of", "liver", "sections", ".", "(", "D", ")", "Quantitative", "results", "of", "Sirius", "red", "staining", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "1", "-", "way", "ANOVA6", "-", "week", "-", "old", "male", "CD36", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "or", "knockout", "mice", "(", "CD36KO", ")", "were", "administered", "with", "AAV", "-", "GFP", "(", "Ctrl", ")", "or", "AAV", "-", "KLF10", "(", "KLF10OE", ")", "through", "tail", "vein", "injection", ",", "and", "then", "kept", "on", "WD", "/", "CCl4", "for", "12", "weeks", ".", "n", "=", "5", "per", "group", ".", "(", "E", ")", "Body", "weights", "and", "liver", "/", "body", "weight", "ratio", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "1", "-", "way", "ANOVA6", "-", "week", "-", "old", "male", "CD36", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "or", "knockout", "mice", "(", "CD36KO", ")", "were", "administered", "with", "AAV", "-", "GFP", "(", "Ctrl", ")", "or", "AAV", "-", "KLF10", "(", "KLF10OE", ")", "through", "tail", "vein", "injection", ",", "and", "then", "kept", "on", "WD", "/", "CCl4", "for", "12", "weeks", ".", "n", "=", "5", "per", "group", ".", "(", "F", ")", "Hepatic", "TG", "contents", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "1", "-", "way", "ANOVA6", "-", "week", "-", "old", "male", "CD36", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "or", "knockout", "mice", "(", "CD36KO", ")", "were", "administered", "with", "AAV", "-", "GFP", "(", "Ctrl", ")", "or", "AAV", "-", "KLF10", "(", "KLF10OE", ")", "through", "tail", "vein", "injection", ",", "and", "then", "kept", "on", "WD", "/", "CCl4", "for", "12", "weeks", ".", "n", "=", "5", "per", "group", ".", "(", "G", ")", "Serum", "AST", "and", "ALT", "levels", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "1", "-", "way"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 66-week-old male CD36 wild-type (WT) or knockout mice (CD36KO) were administered with AAV-GFP (Ctrl) or AAV-KLF10 (KLF10OE) through tail vein injection, and then kept on WD/CCl4 for 12 weeks. n=5 per group. (A) Protein levels of KLF10 and CD36 in the liver (left), and their normalization to β-actin (right). Data information: * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001. Results are shown as mean ± SD. 1-way ANOVA (A6-week-old male CD36 wild-type (WT) or knockout mice (CD36KO) were administered with AAV-GFP (Ctrl) or AAV-KLF10 (KLF10OE) through tail vein injection, and then kept on WD/CCl4 for 12 weeks. n=5 per group. (B) Representative immunofluorescence staining of KLF10 and CD36 (left), and the quantitative results (right). Data information: * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001. Results are shown as mean ± SD. 1-way ANOVA6-week-old male CD36 wild-type (WT) or knockout mice (CD36KO) were administered with AAV-GFP (Ctrl) or AAV-KLF10 (KLF10OE) through tail vein injection, and then kept on WD/CCl4 for 12 weeks. n=5 per group. (C) H&E and Sirius red staining of liver sections. (D) Quantitative results of Sirius red staining. Data information: * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001. Results are shown as mean ± SD. 1-way ANOVA6-week-old male CD36 wild-type (WT) or knockout mice (CD36KO) were administered with AAV-GFP (Ctrl) or AAV-KLF10 (KLF10OE) through tail vein injection, and then kept on WD/CCl4 for 12 weeks. n=5 per group. (E) Body weights and liver/body weight ratio. Data information: * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001. Results are shown as mean ± SD. 1-way ANOVA6-week-old male CD36 wild-type (WT) or knockout mice (CD36KO) were administered with AAV-GFP (Ctrl) or AAV-KLF10 (KLF10OE) through tail vein injection, and then kept on WD/CCl4 for 12 weeks. n=5 per group. (F) Hepatic TG contents. Data information: * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001. Results are shown as mean ± SD. 1-way ANOVA6-week-old male CD36 wild-type (WT) or knockout mice (CD36KO) were administered with AAV-GFP (Ctrl) or AAV-KLF10 (KLF10OE) through tail vein injection, and then kept on WD/CCl4 for 12 weeks. n=5 per group. (G) Serum AST and ALT levels. Data information: * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001. Results are shown as mean ± SD. 1-way ANOVA"}
{"words": ["Figure", "76", "-", "week", "-", "old", "male", "CD36", "knockout", "mice", "were", "administered", "with", "AAV", "-", "TBG", "-", "wildtype", "-", "CD36", ",", "wildtype", "-", "CD36", "plus", "KLF10", ",", "palmitoylation", "site", "mutant", "CD36", ",", "mutant", "-", "CD36", "plus", "KLF10", "through", "tail", "vein", "injection", ",", "and", "then", "kept", "on", "WD", "/", "CCl4", "for", "12", "weeks", ".", "n", "=", "5", "per", "group", ".", "(", "A", ")", "Serum", "AST", "and", "ALT", "levels", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "1", "-", "way", "ANOVA6", "-", "week", "-", "old", "male", "CD36", "knockout", "mice", "were", "administered", "with", "AAV", "-", "TBG", "-", "wildtype", "-", "CD36", ",", "wildtype", "-", "CD36", "plus", "KLF10", ",", "palmitoylation", "site", "mutant", "CD36", ",", "mutant", "-", "CD36", "plus", "KLF10", "through", "tail", "vein", "injection", ",", "and", "then", "kept", "on", "WD", "/", "CCl4", "for", "12", "weeks", ".", "n", "=", "5", "per", "group", ".", "(", "B", ")", "Hepatic", "TG", "contents", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "1", "-", "way", "ANOVA6", "-", "week", "-", "old", "male", "CD36", "knockout", "mice", "were", "administered", "with", "AAV", "-", "TBG", "-", "wildtype", "-", "CD36", ",", "wildtype", "-", "CD36", "plus", "KLF10", ",", "palmitoylation", "site", "mutant", "CD36", ",", "mutant", "-", "CD36", "plus", "KLF10", "through", "tail", "vein", "injection", ",", "and", "then", "kept", "on", "WD", "/", "CCl4", "for", "12", "weeks", ".", "n", "=", "5", "per", "group", ".", "(", "C", ")", "Body", "weights", "and", "liver", "/", "body", "weight", "ratio", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "1", "-", "way", "ANOVA6", "-", "week", "-", "old", "male", "CD36", "knockout", "mice", "were", "administered", "with", "AAV", "-", "TBG", "-", "wildtype", "-", "CD36", ",", "wildtype", "-", "CD36", "plus", "KLF10", ",", "palmitoylation", "site", "mutant", "CD36", ",", "mutant", "-", "CD36", "plus", "KLF10", "through", "tail", "vein", "injection", ",", "and", "then", "kept", "on", "WD", "/", "CCl4", "for", "12", "weeks", ".", "n", "=", "5", "per", "group", ".", "(", "D", ")", "H", "&", "E", "and", "Sirius", "red", "staining", "of", "liver", "sections", "(", "left", ")", ",", "and", "quantitation", "of", "Sirius", "red", "staining", "(", "right", ")", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "1", "-", "way", "ANOVA6", "-", "week", "-", "old", "male", "CD36", "knockout", "mice", "were", "administered", "with", "AAV", "-", "TBG", "-", "wildtype", "-", "CD36", ",", "wildtype", "-", "CD36", "plus", "KLF10", ",", "palmitoylation", "site", "mutant", "CD36", ",", "mutant", "-", "CD36", "plus", "KLF10", "through", "tail", "vein", "injection", ",", "and", "then", "kept", "on", "WD", "/", "CCl4", "for", "12", "weeks", ".", "n", "=", "5", "per", "group", ".", "(", "E", ")", "Immunofluorescence", "staining", "of", "CD36", "and", "β", "-", "catenin", ".", "(", "F", ")", "Quantitation", "of", "CD36", "positive", "area", ".", "(", "G", ")", "Co", "-", "localization", "rate", "of", "CD36", "and", "β", "-", "catenin", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "1", "-", "way", "ANOVA6", "-", "week", "-", "old", "male", "CD36", "knockout", "mice", "were", "administered", "with", "AAV", "-", "TBG", "-", "wildtype", "-", "CD36", ",", "wildtype", "-", "CD36", "plus", "KLF10", ",", "palmitoylation", "site", "mutant", "CD36", ",", "mutant", "-", "CD36", "plus", "KLF10", "through", "tail", "vein", "injection", ",", "and", "then", "kept", "on", "WD", "/", "CCl4", "for", "12", "weeks", ".", "n", "=", "5", "per", "group", ".", "(", "H", ")", "Protein", "levels", "of", "palmitoylated", "CD36", "in", "mouse", "livers", "(", "left", ")", ",", "and", "its", "quantitative", "results", "(", "right", ")", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "1", "-", "way", "ANOVA6", "-", "week", "-", "old", "male", "CD36", "knockout", "mice", "were", "administered", "with", "AAV", "-", "TBG", "-", "wildtype", "-", "CD36", ",", "wildtype", "-", "CD36", "plus", "KLF10", ",", "palmitoylation", "site", "mutant", "CD36", ",", "mutant", "-", "CD36", "plus", "KLF10", "through", "tail", "vein", "injection", ",", "and", "then", "kept", "on", "WD", "/", "CCl4", "for", "12", "weeks", ".", "n", "=", "5", "per", "group", ".", "(", "I", ")", "CD36", "protein", "expression", "in", "the", "plasma", "membrane", "fractions", ",", "and", "its", "normalization", "to", "ATP1a1", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "1", "-", "way"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 76-week-old male CD36 knockout mice were administered with AAV-TBG-wildtype-CD36, wildtype-CD36 plus KLF10, palmitoylation site mutant CD36, mutant-CD36 plus KLF10 through tail vein injection, and then kept on WD/CCl4 for 12 weeks. n=5 per group. (A) Serum AST and ALT levels. Data information: * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001. Results are shown as mean ± SD. 1-way ANOVA6-week-old male CD36 knockout mice were administered with AAV-TBG-wildtype-CD36, wildtype-CD36 plus KLF10, palmitoylation site mutant CD36, mutant-CD36 plus KLF10 through tail vein injection, and then kept on WD/CCl4 for 12 weeks. n=5 per group. (B) Hepatic TG contents. Data information: * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001. Results are shown as mean ± SD. 1-way ANOVA6-week-old male CD36 knockout mice were administered with AAV-TBG-wildtype-CD36, wildtype-CD36 plus KLF10, palmitoylation site mutant CD36, mutant-CD36 plus KLF10 through tail vein injection, and then kept on WD/CCl4 for 12 weeks. n=5 per group. (C) Body weights and liver/body weight ratio. Data information: * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001. Results are shown as mean ± SD. 1-way ANOVA6-week-old male CD36 knockout mice were administered with AAV-TBG-wildtype-CD36, wildtype-CD36 plus KLF10, palmitoylation site mutant CD36, mutant-CD36 plus KLF10 through tail vein injection, and then kept on WD/CCl4 for 12 weeks. n=5 per group. (D) H&E and Sirius red staining of liver sections (left), and quantitation of Sirius red staining (right). Data information: * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001. Results are shown as mean ± SD. 1-way ANOVA6-week-old male CD36 knockout mice were administered with AAV-TBG-wildtype-CD36, wildtype-CD36 plus KLF10, palmitoylation site mutant CD36, mutant-CD36 plus KLF10 through tail vein injection, and then kept on WD/CCl4 for 12 weeks. n=5 per group. (E) Immunofluorescence staining of CD36 and β-catenin. (F) Quantitation of CD36 positive area. (G) Co-localization rate of CD36 and β-catenin. Data information: * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001. Results are shown as mean ± SD. 1-way ANOVA6-week-old male CD36 knockout mice were administered with AAV-TBG-wildtype-CD36, wildtype-CD36 plus KLF10, palmitoylation site mutant CD36, mutant-CD36 plus KLF10 through tail vein injection, and then kept on WD/CCl4 for 12 weeks. n=5 per group. (H) Protein levels of palmitoylated CD36 in mouse livers (left), and its quantitative results (right). Data information: * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001. Results are shown as mean ± SD. 1-way ANOVA6-week-old male CD36 knockout mice were administered with AAV-TBG-wildtype-CD36, wildtype-CD36 plus KLF10, palmitoylation site mutant CD36, mutant-CD36 plus KLF10 through tail vein injection, and then kept on WD/CCl4 for 12 weeks. n=5 per group. (I) CD36 protein expression in the plasma membrane fractions, and its normalization to ATP1a1. Data information: * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001. Results are shown as mean ± SD. 1-way ANOVA"}
{"words": ["Figure", "8Albumin", "-", "cre", "mice", "were", "crossed", "with", "KLF10flox", "/", "flox", "to", "generate", "hepatocyte", "-", "specific", "KLF10", "knockout", "mice", "(", "KLF10hep", "-", "/", "-", ")", ".", "Then", ",", "8", "-", "week", "-", "old", "male", "KLF10hep", "-", "/", "-", "mice", "and", "KLF10flox", "/", "flox", "were", "treated", "with", "WD", "/", "CCl4", "for", "12", "weeks", ".", "KLF10flox", "/", "flox", "mice", "were", "used", "as", "the", "control", "(", "Ctrl", ")", ".", "n", "=", "5", "per", "group", ".", "(", "A", "-", "B", ")", "Protein", "levels", "of", "KLF10", ",", "zDHHC7", "and", "TNF", "-", "α", "(", "A", ")", ",", "and", "their", "normalization", "to", "β", "-", "actin", "(", "B", ")", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t", "testAlbumin", "-", "cre", "mice", "were", "crossed", "with", "KLF10flox", "/", "flox", "to", "generate", "hepatocyte", "-", "specific", "KLF10", "knockout", "mice", "(", "KLF10hep", "-", "/", "-", ")", ".", "Then", ",", "8", "-", "week", "-", "old", "male", "KLF10hep", "-", "/", "-", "mice", "and", "KLF10flox", "/", "flox", "were", "treated", "with", "WD", "/", "CCl4", "for", "12", "weeks", ".", "KLF10flox", "/", "flox", "mice", "were", "used", "as", "the", "control", "(", "Ctrl", ")", ".", "n", "=", "5", "per", "group", ".", "(", "C", ")", "Body", "weights", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t", "testAlbumin", "-", "cre", "mice", "were", "crossed", "with", "KLF10flox", "/", "flox", "to", "generate", "hepatocyte", "-", "specific", "KLF10", "knockout", "mice", "(", "KLF10hep", "-", "/", "-", ")", ".", "Then", ",", "8", "-", "week", "-", "old", "male", "KLF10hep", "-", "/", "-", "mice", "and", "KLF10flox", "/", "flox", "were", "treated", "with", "WD", "/", "CCl4", "for", "12", "weeks", ".", "KLF10flox", "/", "flox", "mice", "were", "used", "as", "the", "control", "(", "Ctrl", ")", ".", "n", "=", "5", "per", "group", ".", "(", "D", ")", "Liver", "weights", "and", "liver", "/", "body", "weight", "ratio", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t", "testAlbumin", "-", "cre", "mice", "were", "crossed", "with", "KLF10flox", "/", "flox", "to", "generate", "hepatocyte", "-", "specific", "KLF10", "knockout", "mice", "(", "KLF10hep", "-", "/", "-", ")", ".", "Then", ",", "8", "-", "week", "-", "old", "male", "KLF10hep", "-", "/", "-", "mice", "and", "KLF10flox", "/", "flox", "were", "treated", "with", "WD", "/", "CCl4", "for", "12", "weeks", ".", "KLF10flox", "/", "flox", "mice", "were", "used", "as", "the", "control", "(", "Ctrl", ")", ".", "n", "=", "5", "per", "group", ".", "(", "E", ")", "Hepatic", "TG", "contents", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t", "testAlbumin", "-", "cre", "mice", "were", "crossed", "with", "KLF10flox", "/", "flox", "to", "generate", "hepatocyte", "-", "specific", "KLF10", "knockout", "mice", "(", "KLF10hep", "-", "/", "-", ")", ".", "Then", ",", "8", "-", "week", "-", "old", "male", "KLF10hep", "-", "/", "-", "mice", "and", "KLF10flox", "/", "flox", "were", "treated", "with", "WD", "/", "CCl4", "for", "12", "weeks", ".", "KLF10flox", "/", "flox", "mice", "were", "used", "as", "the", "control", "(", "Ctrl", ")", ".", "n", "=", "5", "per", "group", ".", "(", "F", ")", "Serum", "ALT", "and", "AST", "levels", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t", "testAlbumin", "-", "cre", "mice", "were", "crossed", "with", "KLF10flox", "/", "flox", "to", "generate", "hepatocyte", "-", "specific", "KLF10", "knockout", "mice", "(", "KLF10hep", "-", "/", "-", ")", ".", "Then", ",", "8", "-", "week", "-", "old", "male", "KLF10hep", "-", "/", "-", "mice", "and", "KLF10flox", "/", "flox", "were", "treated", "with", "WD", "/", "CCl4", "for", "12", "weeks", ".", "KLF10flox", "/", "flox", "mice", "were", "used", "as", "the", "control", "(", "Ctrl", ")", ".", "n", "=", "5", "per", "group", ".", "(", "G", ")", "H", "&", "E", "staining", "and", "Sirius", "red", "staining", "of", "liver", "sections", ".", "Albumin", "-", "cre", "mice", "were", "crossed", "with", "KLF10flox", "/", "flox", "to", "generate", "hepatocyte", "-", "specific", "KLF10", "knockout", "mice", "(", "KLF10hep", "-", "/", "-", ")", ".", "Then", ",", "8", "-", "week", "-", "old", "male", "KLF10hep", "-", "/", "-", "mice", "and", "KLF10flox", "/", "flox", "were", "treated", "with", "WD", "/", "CCl4", "for", "12", "weeks", ".", "KLF10flox", "/", "flox", "mice", "were", "used", "as", "the", "control", "(", "Ctrl", ")", ".", "n", "=", "5", "per", "group", ".", "(", "H", ")", "Quantitative", "results", "of", "Sirius", "red", "staining", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t", "testAlbumin", "-", "cre", "mice", "were", "crossed", "with", "KLF10flox", "/", "flox", "to", "generate", "hepatocyte", "-", "specific", "KLF10", "knockout", "mice", "(", "KLF10hep", "-", "/", "-", ")", ".", "Then", ",", "8", "-", "week", "-", "old", "male", "KLF10hep", "-", "/", "-", "mice", "and", "KLF10flox", "/", "flox", "were", "treated", "with", "WD", "/", "CCl4", "for", "12", "weeks", ".", "KLF10flox", "/", "flox", "mice", "were", "used", "as", "the", "control", "(", "Ctrl", ")", ".", "n", "=", "5", "per", "group", ".", "(", "I", ")", "Immunofluorescence", "staining", "of", "CD36", "and", "β", "-", "catenin", ".", "The", "arrows", "represent", "the", "colocalization", "of", "CD36", "and", "β", "-", "catenin", ".", "Albumin", "-", "cre", "mice", "were", "crossed", "with", "KLF10flox", "/", "flox", "to", "generate", "hepatocyte", "-", "specific", "KLF10", "knockout", "mice", "(", "KLF10hep", "-", "/", "-", ")", ".", "Then", ",", "8", "-", "week", "-", "old", "male", "KLF10hep", "-", "/", "-", "mice", "and", "KLF10flox", "/", "flox", "were", "treated", "with", "WD", "/", "CCl4", "for", "12", "weeks", ".", "KLF10flox", "/", "flox", "mice", "were", "used", "as", "the", "control", "(", "Ctrl", ")", ".", "n", "=", "5", "per", "group", ".", "(", "J", ")", "Quantitative", "results", "of", "co", "-", "localization", "rate", "of", "CD36", "and", "β", "-", "catenin", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t", "testAlbumin", "-", "cre", "mice", "were", "crossed", "with", "KLF10flox", "/", "flox", "to", "generate", "hepatocyte", "-", "specific", "KLF10", "knockout", "mice", "(", "KLF10hep", "-", "/", "-", ")", ".", "Then", ",", "8", "-", "week", "-", "old", "male", "KLF10hep", "-", "/", "-", "mice", "and", "KLF10flox", "/", "flox", "were", "treated", "with", "WD", "/", "CCl4", "for", "12", "weeks", ".", "KLF10flox", "/", "flox", "mice", "were", "used", "as", "the", "control", "(", "Ctrl", ")", ".", "n", "=", "5", "per", "group", ".", "(", "K", ")", "Protein", "levels", "of", "palmitoylated", "CD36", "in", "mouse", "livers", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t", "testAlbumin", "-", "cre", "mice", "were", "crossed", "with", "KLF10flox", "/", "flox", "to", "generate", "hepatocyte", "-", "specific", "KLF10", "knockout", "mice", "(", "KLF10hep", "-", "/", "-", ")", ".", "Then", ",", "8", "-", "week", "-", "old", "male", "KLF10hep", "-", "/", "-", "mice", "and", "KLF10flox", "/", "flox", "were", "treated", "with", "WD", "/", "CCl4", "for", "12", "weeks", ".", "KLF10flox", "/", "flox", "mice", "were", "used", "as", "the", "control", "(", "Ctrl", ")", ".", "n", "=", "5", "per", "group", ".", "(", "L", ")", "CD36", "protein", "expression", "in", "plasma", "membrane", "fractions", "from", "mouse", "livers", ",", "and", "its", "normalization", "to", "ATP1a1", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t", "testAlbumin", "-", "cre", "mice", "were", "crossed", "with", "KLF10flox", "/", "flox", "to", "generate", "hepatocyte", "-", "specific", "KLF10", "knockout", "mice", "(", "KLF10hep", "-", "/", "-", ")", ".", "Then", ",", "8", "-", "week", "-", "old", "male", "KLF10hep", "-", "/", "-", "mice", "and", "KLF10flox", "/", "flox", "were", "treated", "with", "WD", "/", "CCl4", "for", "12", "weeks", ".", "KLF10flox", "/", "flox", "mice", "were", "used", "as", "the", "control", "(", "Ctrl", ")", ".", "n", "=", "5", "per", "group", ".", "(", "M", ")", "Relative", "mRNA", "level", "of", "genes", "involved", "in", "the", "liver", "inflammation", "and", "fibrosis", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8Albumin-cre mice were crossed with KLF10flox/flox to generate hepatocyte-specific KLF10 knockout mice (KLF10hep-/-). Then, 8-week-old male KLF10hep-/- mice and KLF10flox/flox were treated with WD/CCl4 for 12 weeks. KLF10flox/flox mice were used as the control (Ctrl). n=5 per group. (A-B) Protein levels of KLF10, zDHHC7 and TNF-α (A), and their normalization to β-actin (B). Data information: * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001. Results are shown as mean ± SD. Student's t testAlbumin-cre mice were crossed with KLF10flox/flox to generate hepatocyte-specific KLF10 knockout mice (KLF10hep-/-). Then, 8-week-old male KLF10hep-/- mice and KLF10flox/flox were treated with WD/CCl4 for 12 weeks. KLF10flox/flox mice were used as the control (Ctrl). n=5 per group. (C) Body weights. Data information: * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001. Results are shown as mean ± SD. Student's t testAlbumin-cre mice were crossed with KLF10flox/flox to generate hepatocyte-specific KLF10 knockout mice (KLF10hep-/-). Then, 8-week-old male KLF10hep-/- mice and KLF10flox/flox were treated with WD/CCl4 for 12 weeks. KLF10flox/flox mice were used as the control (Ctrl). n=5 per group. (D) Liver weights and liver/body weight ratio. Data information: * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001. Results are shown as mean ± SD. Student's t testAlbumin-cre mice were crossed with KLF10flox/flox to generate hepatocyte-specific KLF10 knockout mice (KLF10hep-/-). Then, 8-week-old male KLF10hep-/- mice and KLF10flox/flox were treated with WD/CCl4 for 12 weeks. KLF10flox/flox mice were used as the control (Ctrl). n=5 per group. (E) Hepatic TG contents. Data information: * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001. Results are shown as mean ± SD. Student's t testAlbumin-cre mice were crossed with KLF10flox/flox to generate hepatocyte-specific KLF10 knockout mice (KLF10hep-/-). Then, 8-week-old male KLF10hep-/- mice and KLF10flox/flox were treated with WD/CCl4 for 12 weeks. KLF10flox/flox mice were used as the control (Ctrl). n=5 per group. (F) Serum ALT and AST levels. Data information: * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001. Results are shown as mean ± SD. Student's t testAlbumin-cre mice were crossed with KLF10flox/flox to generate hepatocyte-specific KLF10 knockout mice (KLF10hep-/-). Then, 8-week-old male KLF10hep-/- mice and KLF10flox/flox were treated with WD/CCl4 for 12 weeks. KLF10flox/flox mice were used as the control (Ctrl). n=5 per group. (G) H&E staining and Sirius red staining of liver sections.Albumin-cre mice were crossed with KLF10flox/flox to generate hepatocyte-specific KLF10 knockout mice (KLF10hep-/-). Then, 8-week-old male KLF10hep-/- mice and KLF10flox/flox were treated with WD/CCl4 for 12 weeks. KLF10flox/flox mice were used as the control (Ctrl). n=5 per group. (H) Quantitative results of Sirius red staining. Data information: * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001. Results are shown as mean ± SD. Student's t testAlbumin-cre mice were crossed with KLF10flox/flox to generate hepatocyte-specific KLF10 knockout mice (KLF10hep-/-). Then, 8-week-old male KLF10hep-/- mice and KLF10flox/flox were treated with WD/CCl4 for 12 weeks. KLF10flox/flox mice were used as the control (Ctrl). n=5 per group. (I) Immunofluorescence staining of CD36 and β-catenin. The arrows represent the colocalization of CD36 and β-catenin.Albumin-cre mice were crossed with KLF10flox/flox to generate hepatocyte-specific KLF10 knockout mice (KLF10hep-/-). Then, 8-week-old male KLF10hep-/- mice and KLF10flox/flox were treated with WD/CCl4 for 12 weeks. KLF10flox/flox mice were used as the control (Ctrl). n=5 per group. (J) Quantitative results of co-localization rate of CD36 and β-catenin. Data information: * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001. Results are shown as mean ± SD. Student's t testAlbumin-cre mice were crossed with KLF10flox/flox to generate hepatocyte-specific KLF10 knockout mice (KLF10hep-/-). Then, 8-week-old male KLF10hep-/- mice and KLF10flox/flox were treated with WD/CCl4 for 12 weeks. KLF10flox/flox mice were used as the control (Ctrl). n=5 per group. (K) Protein levels of palmitoylated CD36 in mouse livers. Data information: * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001. Results are shown as mean ± SD. Student's t testAlbumin-cre mice were crossed with KLF10flox/flox to generate hepatocyte-specific KLF10 knockout mice (KLF10hep-/-). Then, 8-week-old male KLF10hep-/- mice and KLF10flox/flox were treated with WD/CCl4 for 12 weeks. KLF10flox/flox mice were used as the control (Ctrl). n=5 per group. (L) CD36 protein expression in plasma membrane fractions from mouse livers, and its normalization to ATP1a1. Data information: * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001. Results are shown as mean ± SD. Student's t testAlbumin-cre mice were crossed with KLF10flox/flox to generate hepatocyte-specific KLF10 knockout mice (KLF10hep-/-). Then, 8-week-old male KLF10hep-/- mice and KLF10flox/flox were treated with WD/CCl4 for 12 weeks. KLF10flox/flox mice were used as the control (Ctrl). n=5 per group. (M) Relative mRNA level of genes involved in the liver inflammation and fibrosis. Data information: * P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001. Results are shown as mean ± SD. Student's t test"}
{"words": ["Figure", "1Representative", "microscopic", "views", "of", "Ndrg4", "+", "/", "+", "and", "Ndrg4", "-", "/", "-", "murine", "intestinal", "sections", "(", "n", "=", "4", ",", "12", "months", "of", "age", ")", "reveal", "an", "even", "distribution", "of", "alkaline", "phosphatase", "along", "the", "enterocyte", "brush", "border", ",", "and", "a", "similar", "number", "and", "distribution", "of", "Paneth", "cells", "(", "Lysozyme", ")", "in", "the", "small", "intestine", ";", "and", "neuroendocrine", "(", "Chromogranin", "A", ")", ",", "Goblet", "(", "PAS", "+", ")", ",", "and", "proliferating", "(", "Ki67", ")", "cells", "in", "the", "colon", ".", "Scale", "bars", ",", "50", "µm", ".", "Representative", "microscopic", "views", "of", "the", "myenteric", "plexus", "of", "Ndrg4", "+", "/", "+", "and", "Ndrg4", "-", "/", "-", "murine", "colonic", "sections", "labeled", "with", "either", "TuJ1", "and", "S100", "(", "B", ",", "n", "=", "3", ")", "or", "HuC", "/", "D", "(", "C", ",", "n", "=", "6", ")", "did", "not", "reveal", "structural", "or", "organizational", "differences", "in", "the", "ganglionic", "network", "of", "Ndrg4", "+", "/", "+", "and", "Ndrg4", "-", "/", "-", "mice", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "µm", ".", "Quantification", "of", "the", "enteric", "neuronal", "cell", "number", "(", "HuC", "/", "D", ")", "shows", "a", "similar", "number", "of", "enteric", "neurons", "in", "the", "proximal", "and", "distal", "colon", "of", "Ndrg4", "+", "/", "+", "and", "Ndrg4", "-", "/", "-", "mice", "(", "n", "=", "6", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Representative microscopic views of Ndrg4+/+ and Ndrg4-/- murine intestinal sections (n=4, 12 months of age) reveal an even distribution of alkaline phosphatase along the enterocyte brush border, and a similar number and distribution of Paneth cells (Lysozyme) in the small intestine; and neuroendocrine (Chromogranin A), Goblet (PAS+), and proliferating (Ki67) cells in the colon. Scale bars, 50 µm.Representative microscopic views of the myenteric plexus of Ndrg4+/+ and Ndrg4-/- murine colonic sections labeled with either TuJ1 and S100 (B, n=3) or HuC/D (C, n=6) did not reveal structural or organizational differences in the ganglionic network of Ndrg4+/+ and Ndrg4-/- mice. Scale bars, 100 µm. Quantification of the enteric neuronal cell number (HuC/D) shows a similar number of enteric neurons in the proximal and distal colon of Ndrg4+/+ and Ndrg4-/- mice (n=6)."}
{"words": ["Figure", "2In", "contrast", ",", "Ndrg4fl", "/", "fl", "and", "Ndrg4fl", "/", "fl", "-", "VillinCre", "mice", "have", "a", "similar", "bodyweight", "(", "I", ")", "and", "develop", "an", "equal", "number", "of", "adenomas", "(", "J", ")", "with", "an", "equivalent", "diameter", "(", "K", ",", "L", ")", ".", "N", "=", "13", "vs", ".", "12", "in", "I", ",", "n", "=", "13", "vs", ".", "11", "in", "J", "and", "n", "=", "10", "vs", ".", "8", "in", "K", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2In contrast, Ndrg4fl/fl and Ndrg4fl/fl-VillinCre mice have a similar bodyweight (I) and develop an equal number of adenomas (J) with an equivalent diameter (K,L). N=13 vs. 12 in I, n=13 vs. 11 in J and n=10 vs. 8 in K."}
{"words": ["Figure", "3Compared", "to", "Ndrg4", "+", "/", "+", "ENS", "-", "derived", "medium", ",", "addition", "of", "medium", "derived", "from", "Ndrg4", "-", "/", "-", "ENS", "cultures", "enhances", "the", "relative", "growth", "of", "intestinal", "epithelial", "organoids", "(", "E", ",", "IEOs", ")", "and", "accelerates", "the", "formation", "of", "new", "crypt", "buds", "per", "IEO", "in", "the", "course", "of", "five", "days", "(", "F", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Compared to Ndrg4+/+ ENS-derived medium, addition of medium derived from Ndrg4-/- ENS cultures enhances the relative growth of intestinal epithelial organoids (E, IEOs) and accelerates the formation of new crypt buds per IEO in the course of five days (F)."}
{"words": ["Figure", "4Box", "plot", "showing", "the", "quantitative", "protein", "expression", "results", "of", "nanoLC", "-", "MS", "/", "MS", "analysis", "reveals", "the", "significantly", "higher", "presence", "of", "Nid1", "and", "Fbln2", "in", "the", "Ndrg4", "-", "/", "-", "compared", "to", "the", "Ndrg4", "+", "/", "+", "ENS", "cell", "secretome", "(", "n", "=", "4", ";", "NSAF", ",", "normalized", "spectral", "abundance", "factor", ")", ".", "Data", "are", "analyzed", "with", "R", "version", "3", ".", "5", ".", "2", "and", "the", "ibb", "R", "package", ".", "Each", "dot", "within", "the", "box", "plot", "represents", "the", "NSAF", "of", "an", "individual", "sample", ";", "the", "inside", "band", "reflects", "the", "median", ",", "and", "the", "bottom", "and", "top", "of", "the", "box", "the", "first", "and", "third", "quartile", ",", "respectively", ".", "The", "whiskers", "reflect", "the", "minimum", "and", "maximal", "values", "within", "1", ".", "5", "×", "the", "interquartile", "range", ".", "NSAF", "values", "were", "compared", "using", "the", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ".", "Representative", "immunohistochemistry", "(", "C", ")", "and", "more", "detailed", "immunofluorescence", "(", "D", ",", "E", ")", "labeling", "indicate", "that", "Nid1", "(", "C", ",", "D", ")", "and", "Fbln2", "(", "C", ",", "E", ")", "are", "expressed", "within", "the", "myenteric", "plexus", "and", "by", "primary", "ENS", "-", "cells", "(", "(", "C", ")", ",", "black", "arrowheads", ",", "scale", "bars", ",", "50", "µm", ";", "(", "D", ",", "E", ")", ",", "n", "=", "3", ",", "scale", "bars", ",", "10", "µm", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Box plot showing the quantitative protein expression results of nanoLC-MS/MS analysis reveals the significantly higher presence of Nid1 and Fbln2 in the Ndrg4-/- compared to the Ndrg4+/+ ENS cell secretome (n=4; NSAF, normalized spectral abundance factor). Data are analyzed with R version 3.5.2 and the ibb R package. Each dot within the box plot represents the NSAF of an individual sample; the inside band reflects the median, and the bottom and top of the box the first and third quartile, respectively. The whiskers reflect the minimum and maximal values within 1.5× the interquartile range. NSAF values were compared using the Mann-Whitney U test.Representative immunohistochemistry (C) and more detailed immunofluorescence (D, E) labeling indicate that Nid1 (C, D) and Fbln2 (C, E) are expressed within the myenteric plexus and by primary ENS-cells ((C), black arrowheads, scale bars, 50 µm; (D, E), n=3, scale bars, 10 µm)."}
{"words": ["Figure", "5Representative", "microscopic", "views", "show", "that", "NID1", "and", "FBLN2", "are", "highly", "expressed", "in", "the", "human", "colonic", "ganglia", "(", "Black", "arrowheads", ")", "and", "interconnecting", "nerve", "fibers", ",", "and", "in", "a", "limited", "level", "throughout", "the", "epithelium", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "µm", ".", "Addition", "of", "NID1", "&", "FBLN2", "to", "the", "Matrigel", "®", "dome", "significantly", "enhances", "the", "relative", "growth", "rate", "of", "HIOs", "after", "five", "days", "of", "culture", "as", "compared", "to", "the", "PBS", "control", "condition", ".", "Box", "plot", "reflecting", "the", "quantitative", "nanoLC", "-", "MS", "/", "MS", "analysis", "results", "shows", "the", "up", "-", "regulation", "of", "NID1", "and", "FBLN2", "in", "the", "colorectal", "cancer", "tissue", "secretome", "(", "n", "=", "17", ")", "compared", "to", "the", "normal", "colon", "tissue", "secretome", "(", "n", "=", "17", ")", ".", "Data", "are", "analyzed", "with", "R", "version", "3", ".", "5", ".", "2", "and", "the", "ibb", "R", "package", ".", "Within", "the", "box", "plots", ",", "each", "dot", "represents", "the", "log10", "transformed", "raw", "count", "of", "an", "individual", "sample", ";", "the", "inside", "band", "is", "the", "median", "value", ";", "the", "bottom", "and", "top", "of", "the", "box", "the", "first", "and", "third", "quartile", ",", "respectively", ";", "and", "the", "whiskers", "reflect", "the", "minimum", "and", "maximal", "values", "within", "1", ".", "5", "×", "the", "interquartile", "range", ".", "Representative", "images", "of", "human", "colonic", "cancer", "epithelium", "(", "n", "=", "3", ")", "shows", "a", "high", "scattered", "expression", "of", "NID1", "and", "FBLN2", "within", "the", "cancerous", "epithelium", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Representative microscopic views show that NID1 and FBLN2 are highly expressed in the human colonic ganglia (Black arrowheads) and interconnecting nerve fibers, and in a limited level throughout the epithelium (n=3). Scale bar, 50 µm.Addition of NID1&FBLN2 to the Matrigel® dome significantly enhances the relative growth rate of HIOs after five days of culture as compared to the PBS control condition.Box plot reflecting the quantitative nanoLC-MS/MS analysis results shows the up-regulation of NID1 and FBLN2 in the colorectal cancer tissue secretome (n=17) compared to the normal colon tissue secretome (n=17). Data are analyzed with R version 3.5.2 and the ibb R package. Within the box plots, each dot represents the log10 transformed raw count of an individual sample; the inside band is the median value; the bottom and top of the box the first and third quartile, respectively; and the whiskers reflect the minimum and maximal values within 1.5× the interquartile range.Representative images of human colonic cancer epithelium (n=3) shows a high scattered expression of NID1 and FBLN2 within the cancerous epithelium. Scale bar, 50 μm."}
{"words": ["Figure", "1B", ".", "Kaplan", "-", "Meier", "curve", "represents", "the", "survival", "of", "BALB", "/", "c", "mice", "over", "time", ".", "Four", "BALB", "/", "c", "mice", "in", "each", "experimental", "group", "were", "infected", "i", ".", "v", "with", "104", "L", ".", "monocytogenes", "wild", "-", "type", "(", "EGD", "-", "e", ")", "or", "ΔinlK", "mutant", ".", "C", ".", "The", "L", ".", "monocytogenes", "EGD", "-", "e", "wild", "-", "type", "strain", "(", "WT", ")", ",", "the", "ΔinlK", "mutant", "(", "ΔinlK", ")", "and", "the", "complemented", "strain", "(", "ΔinlK", "+", "pPL2", "inlK", ")", "104", "CFU", "were", "inoculated", "i", ".", "v", "into", "BALB", "/", "c", "mice", ".", "Animals", "were", "euthanized", "24", "h", ",", "48", "h", ",", "72", "h", "or", "96", "h", "after", "infection", "and", "organs", "were", "recovered", ",", "homogenized", ",", "and", "homogenates", "serially", "plated", "on", "BHI", ".", "The", "number", "of", "bacteria", "able", "to", "colonize", "liver", "(", "left", "panel", ")", "and", "spleen", "(", "right", "panel", ")", "is", "expressed", "as", "log10", "CFU", ".", "Four", "animals", "per", "bacterial", "strain", ",", "per", "time", "points", "and", "per", "experiment", "were", "used", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "on", "the", "results", "of", "3", "independent", "experiments", "using", "the", "Student", "t", "test", ".", "P", "values", "of", "<", "0", ".", "05", "were", "considered", "statistically", "different", "and", "are", "labeled", "here", "as", "*", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B. Kaplan-Meier curve represents the survival of BALB/c mice over time. Four BALB/c mice in each experimental group were infected i.v with 104 L. monocytogenes wild-type (EGD-e) or ΔinlK mutant.C. The L. monocytogenes EGD-e wild-type strain (WT), the ΔinlK mutant (ΔinlK) and the complemented strain (ΔinlK+pPL2 inlK) 104 CFU were inoculated i.v into BALB/c mice. Animals were euthanized 24 h, 48 h, 72 h or 96 h after infection and organs were recovered, homogenized, and homogenates serially plated on BHI. The number of bacteria able to colonize liver (left panel) and spleen (right panel) is expressed as log10 CFU. Four animals per bacterial strain, per time points and per experiment were used. Statistical analyses were performed on the results of 3 independent experiments using the Student t test. P values of <0.05 were considered statistically different and are labeled here as *."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "InlK", "amino", "acid", "sequence", ".", "The", "signal", "sequence", "is", "underlined", "and", "the", "different", "regions", "of", "leucine", "rich", "repeats", "(", "LRRs", ")", "are", "outlined", ".", "The", "consensus", "pentapeptide", "LPXTG", "at", "the", "C", "-", "terminal", "end", "is", "boxed", ".", "B", ".", "Detection", "by", "immunofluorescence", "microscopy", "of", "InlK", "over", "-", "expressing", "in", "L", ".", "monocytogenes", "EGD", "-", "e", "(", "WT", ")", ",", "ΔinlK", ",", "WT", "+", "pADc", "-", "inlK", ",", "ΔinlK", "+", "pPRT", "-", "inlK", "and", "the", "ΔsrtA", "mutant", "over", "-", "expressing", "inlK", "(", "ΔsrtA", "+", "pPRT", "-", "inlK", ")", "grown", "in", "BHI", "medium", "using", "the", "rabbit", "polyclonal", "anti", "-", "InlK", "antibody", ".", "InlK", "was", "detected", "at", "the", "surface", "of", "InlK", "over", "-", "expressing", "bacteria", "(", "WT", "+", "pADc", "-", "inlK", "and", "ΔinlK", "+", "pPRT", "-", "inlK", ")", ",", "whereas", "it", "was", "undetectable", "at", "the", "surface", "WT", "bacteria", "or", "at", "the", "surface", "of", "the", "ΔstrA", "mutant", "over", "-", "expressing", "inlK", ".", "C", ".", "Detection", "of", "InlK", "by", "Western", "blot", "on", "total", "lysates", "of", "L", ".", "monocytogenes", "EGD", "-", "e", "(", "WT", ")", ",", "ΔinlK", "and", "ΔinlK", "+", "pPRT", "-", "inlK", "grown", "in", "BHI", "using", "the", "rabbit", "polyclonal", "anti", "-", "InlK", "antibody", ".", "Decreased", "concentrations", "of", "recombinant", "purified", "InlK", "were", "used", "as", "a", "positive", "control", ".", "D", ".", "Detection", "of", "secreted", "InlK", "in", "the", "supernatant", "of", "ΔsrtA", "mutants", "over", "-", "expressing", "InlK", ".", "Western", "blotting", "was", "carried", "out", "on", "trichloroacetic", "acid", "precipitates", "of", "ΔsrtA", "and", "ΔsrtA", "+", "pPRT", "-", "inlK", "culture", "(", "OD600", "=", "1", ")", "supernatants", "using", "the", "rabbit", "polyclonal", "anti", "-", "InlK", "antibody", ".", "E", ".", "Detection", "of", "purified", "recombinant", "InlK", "protein", "with", "rabbit", "polyclonal", "anti", "-", "live", "Listeria", "antibody", ",", "rabbit", "polyclonal", "anti", "-", "killed", "Listeria", "antibody", ",", "rabbit", "polyclonal", "anti", "-", "InlK", "and", "a", "rabbit", "pre", "-", "immune", "serum", ".", "InlK", "was", "detected", "only", "with", "the", "rabbit", "polyclonal", "anti", "-", "live", "Listeria", "antibody", "indicating", "that", "it", "is", "expressed", "during", "the", "in", "vivo", "infectious", "process", ".", "BSA", "was", "used", "as", "control", "protein", ".", "Two", "different", "amounts", "of", "proteins", "were", "tested", "(", "500", "ng", "and", "200", "ng", ")", "to", "access", "signal", "specificity", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. InlK amino acid sequence. The signal sequence is underlined and the different regions of leucine rich repeats (LRRs) are outlined. The consensus pentapeptide LPXTG at the C-terminal end is boxed.B. Detection by immunofluorescence microscopy of InlK over-expressing in L. monocytogenes EGD-e (WT), ΔinlK, WT+pADc-inlK, ΔinlK+pPRT-inlK and the ΔsrtA mutant over-expressing inlK (ΔsrtA+pPRT-inlK) grown in BHI medium using the rabbit polyclonal anti-InlK antibody. InlK was detected at the surface of InlK over-expressing bacteria (WT+pADc-inlK and ΔinlK+pPRT-inlK), whereas it was undetectable at the surface WT bacteria or at the surface of the ΔstrA mutant over-expressing inlK.C. Detection of InlK by Western blot on total lysates of L. monocytogenes EGD-e (WT), ΔinlK and ΔinlK+pPRT-inlK grown in BHI using the rabbit polyclonal anti-InlK antibody. Decreased concentrations of recombinant purified InlK were used as a positive control.D. Detection of secreted InlK in the supernatant of ΔsrtA mutants over-expressing InlK. Western blotting was carried out on trichloroacetic acid precipitates of ΔsrtA and ΔsrtA+pPRT-inlK culture (OD600 = 1) supernatants using the rabbit polyclonal anti-InlK antibody.E. Detection of purified recombinant InlK protein with rabbit polyclonal anti-live Listeria antibody, rabbit polyclonal anti-killed Listeria antibody, rabbit polyclonal anti-InlK and a rabbit pre-immune serum. InlK was detected only with the rabbit polyclonal anti-live Listeria antibody indicating that it is expressed during the in vivo infectious process. BSA was used as control protein. Two different amounts of proteins were tested (500 ng and 200 ng) to access signal specificity."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "Bacterial", "pull", "-", "down", "of", "purified", "GST", "-", "MVP", "with", "the", "L", ".", "monocytogenes", "strains", "WT", "+", "pPRT", "-", "empty", ",", "ΔinlK", "+", "pPRT", "-", "empty", ",", "ΔinlK", "+", "pPRT", "-", "inlK", "and", "WT", "+", "pPRT", "-", "inlJ", ".", "GST", "-", "MVP", "bound", "to", "InlK", "over", "-", "expressing", "bacteria", "(", "ΔinlK", "+", "pPRT", "-", "inlK", ")", "but", "not", "to", "other", "bacteria", ".", "GST", "-", "ScarA", "was", "used", "as", "control", "of", "the", "specificity", "of", "the", "MVP", "precipitation", "by", "InlK", "over", "-", "expressing", "bacteria", ".", "B", ".", "Bacterial", "pull", "-", "down", "of", "MVP", "-", "GFP", "from", "transfected", "HeLa", "cell", "lysates", "with", "the", "L", ".", "monocytogenes", "strains", "WT", "+", "pPRT", "-", "empty", ",", "ΔinlK", "+", "pPRT", "-", "empty", ",", "ΔinlK", "+", "pPRT", "-", "inlK", "and", "WT", "+", "pPRT", "-", "inlJ", ".", "MVP", "-", "GFP", "bound", "to", "InlK", "over", "-", "expressing", "bacteria", "(", "ΔinlK", "+", "pPRT", "-", "inlK", ")", "but", "not", "to", "other", "bacteria", ".", "C", ".", "Co", "-", "immunoprecipitation", "(", "Co", "-", "IP", ")", "of", "purified", "InlK", "(", "20", "µg", ")", "with", "endogenous", "MVP", "of", "HT29", "cells", ".", "The", "right", "panel", "shows", "anti", "-", "MVP", "co", "-", "IP", "performed", "on", "HT29", "cell", "lysates", ".", "The", "left", "panel", "shows", "the", "control", "anti", "-", "MVP", "co", "-", "IP", "performed", "on", "lysis", "buffer", ".", "D", ".", "Detection", "of", "MVP", "recruitment", "at", "the", "surface", "of", "InlK", "over", "-", "expressing", "bacteria", ".", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "MVP", "-", "GFP", "(", "green", ")", ",", "infected", "with", "L", ".", "monocytogenes", "EGD", "-", "e", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", ",", "ΔinlK", "or", "ΔinlK", "+", "pPRT", "-", "inlK", "for", "4", "h", ",", "fixed", "for", "fluorescence", "light", "microscopy", ",", "and", "stained", "with", "anti", "-", "Listeria", "antibodies", "(", "red", ")", ".", "Inset", "regions", "are", "magnified", ".", "The", "scale", "bar", "represents", "1", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. Bacterial pull-down of purified GST-MVP with the L. monocytogenes strains WT+pPRT-empty, ΔinlK+pPRT-empty, ΔinlK+pPRT-inlK and WT+pPRT-inlJ. GST-MVP bound to InlK over-expressing bacteria (ΔinlK+pPRT-inlK) but not to other bacteria. GST-ScarA was used as control of the specificity of the MVP precipitation by InlK over-expressing bacteria.B. Bacterial pull-down of MVP-GFP from transfected HeLa cell lysates with the L. monocytogenes strains WT+pPRT-empty, ΔinlK+pPRT-empty, ΔinlK+pPRT-inlK and WT+pPRT-inlJ. MVP-GFP bound to InlK over-expressing bacteria (ΔinlK+pPRT-inlK) but not to other bacteria.C. Co-immunoprecipitation (Co-IP) of purified InlK (20 µg) with endogenous MVP of HT29 cells. The right panel shows anti-MVP co-IP performed on HT29 cell lysates. The left panel shows the control anti-MVP co-IP performed on lysis buffer.D. Detection of MVP recruitment at the surface of InlK over-expressing bacteria. HeLa cells were transfected with MVP-GFP (green), infected with L. monocytogenes EGD-e wild-type (WT), ΔinlK or ΔinlK+pPRT-inlK for 4 h, fixed for fluorescence light microscopy, and stained with anti-Listeria antibodies (red). Inset regions are magnified. The scale bar represents 1 µm."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "Detection", "of", "MVP", "recruitment", "at", "the", "surface", "of", "intracellular", "InlK", "over", "-", "expressing", "bacteria", ".", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "MVP", "-", "GFP", "(", "red", ")", ",", "infected", "with", "InlK", "expressing", "Listeria", "(", "ΔinlK", "+", "pPRT", "-", "inlK", ")", "for", "4", "h", ",", "fixed", "for", "fluorescence", "light", "microscopy", ".", "Intra", "-", "(", "only", "green", ")", "and", "extracellular", "(", "cyan", " ", "=", " ", "green", "+", "blue", ")", "bacteria", "were", "differentially", "stained", "with", "anti", "-", "Listeria", "antibody", "(", "cf", "Material", "and", "Methods", ")", ".", "Inset", "regions", "are", "magnified", ".", "Arrows", "indicate", "another", "intracellular", "bacterium", "which", "recruit", "MVP", "-", "GFP", ".", "The", "scale", "bar", "represents", "1", "µm", ".", "The", "right", "panel", "represents", "the", "quantification", "of", "the", "intracellular", "bacteria", "that", "recruit", "MVP", "(", "mean", "%", "±", "SEM", "%", ")", "shown", "in", "the", "left", "panel", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "on", "the", "results", "of", "3", "independent", "experiments", "using", "the", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "No", "significant", "difference", "was", "found", "between", "the", "4", "time", "points", ".", "B", ".", "Detection", "of", "MVP", "recruitment", "at", "the", "surface", "of", "intracytosolic", "InlK", "over", "-", "expressing", "bacteria", ".", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "MVP", "-", "tomato", "(", "red", ")", "and", "YFP", "-", "CBD", "(", "green", ")", ",", "infected", "with", "InlK", "over", "-", "expressing", "Listeria", "(", "ΔinlK", "+", "pPRT", "-", "inlK", ")", "for", "4", "h", ",", "fixed", "for", "fluorescence", "light", "microscopy", "and", "stained", "with", "phalloidin", "(", "blue", ")", ".", "MVP", "positive", "bacteria", "were", "also", "labeled", "with", "YFP", "-", "CBD", "revealing", "that", "MVP", "was", "recruited", "by", "intracytosolic", "bacteria", "after", "the", "lysis", "of", "the", "internalization", "vacuole", ".", "Inset", "regions", "are", "magnified", ".", "The", "scale", "bar", "represents", "1", "µm", ".", "C", ".", "Kinetics", "of", "MVP", "and", "actin", "recruitment", "at", "the", "surface", "of", "InlK", "over", "-", "expressing", "bacteria", ".", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "MVP", "-", "tomato", "(", "red", ")", "and", "actin", "-", "GFP", "(", "green", ")", ",", "infected", "with", "InlK", "over", "-", "expressing", "Listeria", "(", "ΔinlK", "+", "pPRT", "-", "inlK", ")", "for", "4", "h", ",", "and", "prepared", "for", "real", "-", "time", "video", "microscopy", ".", "Image", "series", "were", "collected", "every", "15", "min", "for", "2", "h", ".", "The", "left", "part", "shows", "an", "MVP", "positive", "bacterium", "that", "never", "recruits", "actin", ".", "The", "right", "part", "shows", "MVP", "replacement", "by", "actin", "around", "the", "bacterium", ".", "No", "colocalization", "of", "MVP", "-", "Tomato", "and", "actin", "-", "GFP", "was", "detected", ".", "Time", "is", "indicated", "along", "the", "Y", "axis", ".", "The", "entire", "image", "sequence", "can", "be", "viewed", "as", "Video", "S1", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. Detection of MVP recruitment at the surface of intracellular InlK over-expressing bacteria. HeLa cells were transfected with MVP-GFP (red), infected with InlK expressing Listeria (ΔinlK+pPRT-inlK) for 4 h, fixed for fluorescence light microscopy. Intra- (only green) and extracellular (cyan = green+blue) bacteria were differentially stained with anti- Listeria antibody (cf Material and Methods). Inset regions are magnified. Arrows indicate another intracellular bacterium which recruit MVP-GFP. The scale bar represents 1 µm. The right panel represents the quantification of the intracellular bacteria that recruit MVP (mean%±SEM%) shown in the left panel. Statistical analyses were performed on the results of 3 independent experiments using the Student's t test. No significant difference was found between the 4 time points.B. Detection of MVP recruitment at the surface of intracytosolic InlK over-expressing bacteria. HeLa cells were transfected with MVP-tomato (red) and YFP-CBD (green), infected with InlK over-expressing Listeria (ΔinlK+pPRT-inlK) for 4 h, fixed for fluorescence light microscopy and stained with phalloidin (blue). MVP positive bacteria were also labeled with YFP-CBD revealing that MVP was recruited by intracytosolic bacteria after the lysis of the internalization vacuole. Inset regions are magnified. The scale bar represents 1 µm.C. Kinetics of MVP and actin recruitment at the surface of InlK over-expressing bacteria. HeLa cells were transfected with MVP-tomato (red) and actin-GFP (green), infected with InlK over-expressing Listeria (ΔinlK+pPRT-inlK) for 4 h, and prepared for real-time video microscopy. Image series were collected every 15 min for 2 h. The left part shows an MVP positive bacterium that never recruits actin. The right part shows MVP replacement by actin around the bacterium. No colocalization of MVP-Tomato and actin-GFP was detected. Time is indicated along the Y axis. The entire image sequence can be viewed as Video S1."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "Impaired", "recruitment", "of", "p62", "to", "MVP", "positive", "Listeria", ".", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "MVP", "-", "GFP", "(", "green", ")", ",", "infected", "with", "InlK", "over", "-", "expressing", "Listeria", "(", "ΔinlK", "+", "pPRT", "-", "inlK", ")", "for", "4", "h", ",", "fixed", "for", "fluorescence", "light", "microscopy", ",", "and", "stained", "with", "phalloidin", "(", "blue", ")", "and", "anti", "-", "p62", "antibody", "(", "red", ")", ".", "Inset", "regions", "are", "magnified", ".", "Arrows", "indicate", "independent", "bacteria", "The", "scale", "bar", "represents", "1", "µm", ".", "The", "vast", "majority", "of", "MVP", "-", "positive", "bacteria", "were", "completely", "devoid", "of", "anti", "-", "p62", "labeling", "(", "95", ".", "1", "±", "2", ".", "0", "%", ";", "mean", "±", "SEM", "from", "n", "=", "3", "experiments", ")", "but", "4", ".", "9", "±", "2", ".", "0", "%", "(", "mean", "±", "SEM", "from", "n", "=", "3", "experiments", ")", "were", "stained", "at", "one", "pole", "with", "MVP", "and", "at", "the", "other", "pole", "with", "p62", ".", "B", ".", "Impaired", "recruitment", "of", "GFP", "-", "LC3", "on", "MVP", "positive", "Listeria", ".", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "MVP", "-", "tomato", "(", "red", ")", "and", "GFP", "-", "LC3", "(", "green", ")", ",", "infected", "with", "InlK", "over", "-", "expressing", "Listeria", "(", "ΔinlK", "+", "pPRT", "-", "inlK", ")", "for", "4", "h", ",", "fixed", "for", "fluorescence", "light", "microscopy", ",", "and", "stained", "with", "phalloidin", "(", "blue", ")", ".", "Inset", "regions", "are", "magnified", ".", "The", "scale", "bar", "represents", "1", "µm", ".", "MVP", "and", "/", "or", "actin", "positive", "bacteria", "were", "never", "recognized", "by", "GFP", "-", "LC3", ".", "Arrows", "point", "to", "bacteria", "at", "different", "steps", "of", "the", "infection", "process", ":", "1", ")", "InlK", "over", "-", "expressing", "bacterium", "is", "totally", "covered", "by", "MVP", ";", "2", ")", "bacterium", "is", "partially", "labeled", "with", "MVP", "(", "at", "the", "poles", ")", "and", "actin", "(", "at", "the", "center", ")", ";", "3", ")", "bacterium", "is", "completely", "covered", "by", "actin", ";", "4", ")", "bacterium", "is", "enclosed", "in", "an", "GFP", "-", "LC3", "positive", "autophagosome", ".", "C", ".", "Kinetics", "of", "autophagy", "escape", "for", "MVP", "positive", "Listeria", ".", "Jeg3", "cells", "were", "transfected", "with", "MVP", "-", "tomato", "(", "red", ")", "and", "GFP", "-", "LC3", "(", "green", ")", ",", "infected", "with", "InlK", "over", "-", "expressing", "Listeria", "(", "ΔinlK", "+", "pPRT", "-", "inlK", ")", "for", "4", "h", ",", "and", "prepared", "for", "real", "-", "time", "video", "microscopy", ".", "Image", "series", "were", "collected", "every", "5", "min", "for", "2", "h", ".", "Time", "is", "indicated", "along", "the", "Y", "axis", ".", "The", "left", "panel", "shows", "that", "the", "GFP", "-", "LC3", "membranous", "aggregate", "detaches", "from", "the", "MVP", "positive", "Listeria", ".", "The", "entire", "image", "sequence", "can", "be", "viewed", "as", "Video", "S2", ".", "The", "right", "panel", "shows", "that", "the", "GFP", "-", "LC3", "membranous", "aggregate", "on", "MVP", "positive", "bacteria", "does", "not", "lead", "to", "an", "autophagosome", "formation", ",", "whereas", "those", "bacteria", "efficiently", "divided", ".", "The", "entire", "image", "sequence", "can", "be", "viewed", "as", "Video", "S3", ".", "D", ".", "Impaired", "recruitment", "of", "GFP", "-", "LC3", "and", "ubiquitin", "to", "MVP", "positive", "ΔactA", "Listeria", ".", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "MVP", "-", "tomato", "(", "red", ")", "and", "GFP", "-", "LC3", "(", "green", ")", ",", "infected", "with", "InlK", "over", "-", "expressing", "ΔactA", "(", "ΔactA", "+", "pADc", "-", "inlK", ")", "for", "4", "h", ",", "fixed", "for", "fluorescence", "light", "microscopy", ",", "and", "stained", "with", "anti", "-", "ubiquitin", "antibody", "(", "blue", ")", "and", "DAPI", "(", "white", ")", ".", "Inset", "regions", "are", "magnified", ".", "The", "scale", "bar", "represents", "1", "µm", ".", "E", ".", "LC3", "levels", "in", "infected", "RAW", "267", ".", "4", "macrophages", ".", "Left", "panel", ":", "RAW", "267", ".", "4", "macrophages", "were", "infected", "with", "L", ".", "monocytogenes", "EGD", "(", "WT", ")", ",", "ΔactA", "or", "ΔactA", "+", "InlK", "for", "6", "h", ".", "Cell", "total", "lysates", "were", "immunobloted", "for", "LC3", "and", "actin", ".", "Western", "blot", "is", "representative", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "Right", "panel", ":", "Quantification", "of", "the", "relative", "LC3", "-", "II", "level", "(", "mean", "±", "SEM", ")", "shown", "in", "the", "left", "panel", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "on", "the", "results", "of", "3", "independent", "experiments", "using", "the", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "P", "values", "of", "<", "0", ".", "05", "were", "considered", "statistically", "different", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. Impaired recruitment of p62 to MVP positive Listeria. HeLa cells were transfected with MVP-GFP (green), infected with InlK over-expressing Listeria (ΔinlK+pPRT-inlK) for 4 h, fixed for fluorescence light microscopy, and stained with phalloidin (blue) and anti-p62 antibody (red). Inset regions are magnified. Arrows indicate independent bacteria The scale bar represents 1 µm. The vast majority of MVP-positive bacteria were completely devoid of anti-p62 labeling (95.1±2.0%; mean ± SEM from n = 3 experiments) but 4.9±2.0% (mean ± SEM from n = 3 experiments) were stained at one pole with MVP and at the other pole with p62.B. Impaired recruitment of GFP-LC3 on MVP positive Listeria. HeLa cells were transfected with MVP-tomato (red) and GFP-LC3 (green), infected with InlK over-expressing Listeria (ΔinlK+pPRT-inlK) for 4 h, fixed for fluorescence light microscopy, and stained with phalloidin (blue). Inset regions are magnified. The scale bar represents 1 µm. MVP and/or actin positive bacteria were never recognized by GFP-LC3. Arrows point to bacteria at different steps of the infection process: 1) InlK over-expressing bacterium is totally covered by MVP; 2) bacterium is partially labeled with MVP (at the poles) and actin (at the center); 3) bacterium is completely covered by actin; 4) bacterium is enclosed in an GFP-LC3 positive autophagosome.C. Kinetics of autophagy escape for MVP positive Listeria. Jeg3 cells were transfected with MVP-tomato (red) and GFP-LC3 (green), infected with InlK over-expressing Listeria (ΔinlK+pPRT-inlK) for 4 h, and prepared for real-time video microscopy. Image series were collected every 5 min for 2 h. Time is indicated along the Y axis. The left panel shows that the GFP-LC3 membranous aggregate detaches from the MVP positive Listeria. The entire image sequence can be viewed as Video S2. The right panel shows that the GFP-LC3 membranous aggregate on MVP positive bacteria does not lead to an autophagosome formation, whereas those bacteria efficiently divided. The entire image sequence can be viewed as Video S3.D. Impaired recruitment of GFP-LC3 and ubiquitin to MVP positive ΔactA Listeria. HeLa cells were transfected with MVP-tomato (red) and GFP-LC3 (green), infected with InlK over-expressing ΔactA (ΔactA+pADc-inlK) for 4 h, fixed for fluorescence light microscopy, and stained with anti-ubiquitin antibody (blue) and DAPI (white). Inset regions are magnified. The scale bar represents 1 µm.E. LC3 levels in infected RAW 267.4 macrophages. Left panel: RAW 267.4 macrophages were infected with L. monocytogenes EGD (WT), ΔactA or ΔactA+InlK for 6 h. Cell total lysates were immunobloted for LC3 and actin. Western blot is representative from 3 independent experiments. Right panel: Quantification of the relative LC3-II level (mean ± SEM) shown in the left panel. Statistical analyses were performed on the results of 3 independent experiments using the Student's t test. P values of <0.05 were considered statistically different."}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "InlK", "and", "ActA", "expression", "in", "Listeria", "strains", "used", "for", "survival", "assays", ".", "Total", "lysates", "of", "L", ".", "monocytogenes", "EGD", "-", "(", "pADc", "-", "GFP", ")", ",", "EGD", "-", "(", "pADc", "-", "inlK", ")", ",", "ΔactA", "-", "(", "pADc", "-", "GFP", ")", "and", "ΔactA", "-", "(", "pADc", "-", "inlK", ")", "grown", "in", "BHI", "were", "immunoblotted", "using", "anti", "-", "ActA", "and", "anti", "-", "InlK", "antibodies", ".", "B", ".", "Intracellular", "survival", "of", "EGD", "-", "(", "pADc", "-", "GFP", ")", ",", "EGD", "-", "(", "pADc", "-", "inlK", ")", ",", "ΔactA", "-", "(", "pADc", "-", "GFP", ")", "and", "ΔactA", "-", "(", "pADc", "-", "inlK", ")", "in", "RAW", "267", ".", "4", "macrophages", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "on", "the", "results", "of", "3", "independent", "experiments", "using", "the", "Student", "t", "test", ".", "P", "values", "of", "<", "0", ".", "05", "were", "considered", "statistically", "different", "and", "are", "labeled", "here", "as", "*", ".", "C", ".", "Intracellular", "survival", "of", "ΔactA", "-", "(", "pADc", "-", "GFP", ")", "and", "ΔactA", "-", "(", "pADc", "-", "inlK", ")", "in", "MVP", "-", "GFP", "transfected", "Jeg3", "cells", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "on", "the", "results", "of", "3", "independent", "experiments", "using", "the", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "P", "values", "of", "<", "0", ".", "05", "were", "considered", "statistically", "different", "and", "are", "labeled", "here", "as", "*", ".", "D", ".", "Intracellular", "survival", "of", "ΔactA", "-", "(", "pADc", "-", "GFP", ")", "and", "ΔactA", "-", "(", "pADc", "-", "inlK", ")", "in", "MVP", "-", "GFP", "transfected", "HeLa", "cells", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "on", "the", "results", "of", "3", "independent", "experiments", "using", "the", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "P", "values", "of", "<", "0", ".", "05", "were", "considered", "statistically", "different", "and", "are", "labeled", "here", "as", "*", ".", "E", ".", "MVP", "levels", "in", "RAW", "267", ".", "4", "macrophages", "treated", "with", "MVP", "-", "siRNA", ".", "Western", "blot", "is", "representative", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "F", ".", "Intracellular", "survival", "of", "ΔactA", "-", "(", "pADc", "-", "GFP", ")", "and", "ΔactA", "-", "(", "pADc", "-", "inlK", ")", "in", "MVP", "knock", "-", "down", "RAW", "267", ".", "4", "macrophages", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "on", "the", "results", "of", "3", "independent", "experiments", "using", "the", "Student", "t", "test", ".", "P", "values", "of", "<", "0", ".", "05", "were", "considered", "statistically", "different", "and", "are", "labeled", "here", "as", "*", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A. InlK and ActA expression in Listeria strains used for survival assays. Total lysates of L. monocytogenes EGD-(pADc-GFP), EGD-(pADc-inlK), ΔactA-(pADc-GFP) and ΔactA-(pADc-inlK) grown in BHI were immunoblotted using anti-ActA and anti-InlK antibodies.B. Intracellular survival of EGD-(pADc-GFP), EGD-(pADc-inlK), ΔactA-(pADc-GFP) and ΔactA-(pADc-inlK) in RAW 267.4 macrophages. Statistical analyses were performed on the results of 3 independent experiments using the Student t test. P values of <0.05 were considered statistically different and are labeled here as *.C. Intracellular survival of ΔactA-(pADc-GFP) and ΔactA-(pADc-inlK) in MVP-GFP transfected Jeg3 cells. Statistical analyses were performed on the results of 3 independent experiments using the Student's t test. P values of <0.05 were considered statistically different and are labeled here as *.D. Intracellular survival of ΔactA-(pADc-GFP) and ΔactA-(pADc-inlK) in MVP-GFP transfected HeLa cells. Statistical analyses were performed on the results of 3 independent experiments using the Student's t test. P values of <0.05 were considered statistically different and are labeled here as *.E. MVP levels in RAW 267.4 macrophages treated with MVP-siRNA. Western blot is representative from 3 independent experiments.F. Intracellular survival of ΔactA-(pADc-GFP) and ΔactA-(pADc-inlK) in MVP knock-down RAW 267.4 macrophages. Statistical analyses were performed on the results of 3 independent experiments using the Student t test. P values of <0.05 were considered statistically different and are labeled here as *."}
{"words": ["Figure", "1A", "Double", "-", "plotted", "representative", "actograms", "of", "the", "indicated", "genotypes", ".", "Flies", "are", "monitored", "in", "LD", "for", "4", "days", "and", "then", "DD", "for", "7", "days", ".", "Dicer2", "(", "dcr2", ")", "is", "co", "-", "expressed", "to", "enhance", "the", "effects", "of", "RNAi", ".", "White", "boxes", "indicate", "the", "light", "phase", "and", "black", "boxes", "indicate", "the", "dark", "phase", ".", "Gray", "shades", "indicate", "DD", ".", "G4", ",", "GAL4", ";", "U", ",", "UAS", ".", "B", "-", "D", "The", "period", "of", "DD", "locomotor", "rhythms", "of", "flies", "with", "Nipped", "-", "A", "knocked", "down", "and", "controls", ".", "Data", "information", ":", "(", "B", "-", "H", ")", "Error", "bars", "represent", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ".", "Digits", "on", "the", "bars", "are", "the", "number", "of", "flies", "tested", ".", "Percentage", "of", "rhythmicity", "is", "indicated", "above", "the", "bars", ".", "Statistical", "difference", "is", "measured", "using", "One", "-", "way", "ANOVA", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "/", "#", "#", "#", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "compared", "with", "the", "GAL4", "controls", ";", "#", "compared", "with", "the", "UAS", "controls", ".", "White", "bar", "indicates", "UAS", "or", "GAL4", "controls", ".", "Gray", "bar", "indicates", "flies", "with", "Nipped", "-", "A", "knocked", "down", ".", "G4", ",", "GAL4", ";", "U", ",", "UAS", ".", "E", ",", "F", "Using", "temperature", "-", "sensitive", "GAL80", "system", "to", "control", "Nipped", "-", "A", "RNAi", "expression", ".", "(", "E", ")", "The", "period", "of", "DD", "locomotor", "rhythms", "of", "flies", "raised", "at", "18ºC", "and", "tested", "at", "29ºC", ".", "(", "F", ")", "The", "period", "of", "DD", "locomotor", "rhythms", "of", "flies", "raised", "at", "29ºC", "and", "tested", "at", "18ºC", ".", "Data", "information", ":", "(", "B", "-", "H", ")", "Error", "bars", "represent", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ".", "Digits", "on", "the", "bars", "are", "the", "number", "of", "flies", "tested", ".", "Percentage", "of", "rhythmicity", "is", "indicated", "above", "the", "bars", ".", "Statistical", "difference", "is", "measured", "using", "One", "-", "way", "ANOVA", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "/", "#", "#", "#", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "compared", "with", "the", "GAL4", "controls", ";", "#", "compared", "with", "the", "UAS", "controls", ".", "White", "bar", "indicates", "UAS", "or", "GAL4", "controls", ".", "Gray", "bar", "indicates", "flies", "with", "Nipped", "-", "A", "knocked", "down", ".", "G4", ",", "GAL4", ";", "U", ",", "UAS", ".", "G", ",", "H", "The", "period", "of", "DD", "locomotor", "rhythms", "of", "flies", "treated", "with", "RU486", "to", "activate", "the", "pdfG4", "-", "geneswitch", "(", "pdf", "-", "GS", ")", "driver", "(", "G", ")", "or", "vehicle", "control", "(", "H", ")", ".", "Data", "information", ":", "(", "B", "-", "H", ")", "Error", "bars", "represent", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", ".", "Digits", "on", "the", "bars", "are", "the", "number", "of", "flies", "tested", ".", "Percentage", "of", "rhythmicity", "is", "indicated", "above", "the", "bars", ".", "Statistical", "difference", "is", "measured", "using", "One", "-", "way", "ANOVA", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "/", "#", "#", "#", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "compared", "with", "the", "GAL4", "controls", ";", "#", "compared", "with", "the", "UAS", "controls", ".", "White", "bar", "indicates", "UAS", "or", "GAL4", "controls", ".", "Gray", "bar", "indicates", "flies", "with", "Nipped", "-", "A", "knocked", "down", ".", "G4", ",", "GAL4", ";", "U", ",", "UAS", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A Double-plotted representative actograms of the indicated genotypes. Flies are monitored in LD for 4 days and then DD for 7 days. Dicer2 (dcr2) is co-expressed to enhance the effects of RNAi. White boxes indicate the light phase and black boxes indicate the dark phase. Gray shades indicate DD. G4, GAL4; U, UAS.B-D The period of DD locomotor rhythms of flies with Nipped-A knocked down and controls. Data information: (B-H) Error bars represent standard error of the mean (SEM). Digits on the bars are the number of flies tested. Percentage of rhythmicity is indicated above the bars. Statistical difference is measured using One-way ANOVA, P<0.001, Tukey's multiple comparison test, *P<0.05, **P<0.01, ***/###P<0.001, * compared with the GAL4 controls; # compared with the UAS controls. White bar indicates UAS or GAL4 controls. Gray bar indicates flies with Nipped-A knocked down. G4, GAL4; U, UAS.E, F Using temperature-sensitive GAL80 system to control Nipped-A RNAi expression. (E) The period of DD locomotor rhythms of flies raised at 18ºC and tested at 29ºC. (F) The period of DD locomotor rhythms of flies raised at 29ºC and tested at 18ºC. Data information: (B-H) Error bars represent standard error of the mean (SEM). Digits on the bars are the number of flies tested. Percentage of rhythmicity is indicated above the bars. Statistical difference is measured using One-way ANOVA, P<0.001, Tukey's multiple comparison test, *P<0.05, **P<0.01, ***/###P<0.001, * compared with the GAL4 controls; # compared with the UAS controls. White bar indicates UAS or GAL4 controls. Gray bar indicates flies with Nipped-A knocked down. G4, GAL4; U, UAS.G, H The period of DD locomotor rhythms of flies treated with RU486 to activate the pdfG4-geneswitch (pdf-GS) driver (G) or vehicle control (H). Data information: (B-H) Error bars represent standard error of the mean (SEM). Digits on the bars are the number of flies tested. Percentage of rhythmicity is indicated above the bars. Statistical difference is measured using One-way ANOVA, P<0.001, Tukey's multiple comparison test, *P<0.05, **P<0.01, ***/###P<0.001, * compared with the GAL4 controls; # compared with the UAS controls. White bar indicates UAS or GAL4 controls. Gray bar indicates flies with Nipped-A knocked down. G4, GAL4; U, UAS."}
{"words": ["Figure", "2A", "Plots", "of", "relative", "mRNA", "abundance", "vs", "circadian", "time", "(", "CT", ")", "for", "clock", "genes", "determined", "by", "qRT", "-", "PCR", "in", "whole", "head", "extracts", "of", "Nipped", "-", "A", "RNAi", "(", "timG4", "/", "+", ";", "Udcr2", "/", "UNipped", "-", "ARNAi", "-", "1", "/", "+", ")", "and", "control", "(", "timG4", "/", "+", ";", "Udcr2", "/", "+", ")", "collected", "on", "DD1", "(", "tim", "/", "cry", ",", "n", "=", "5", ";", "Pdp1ε", "/", "per", "/", "clk", "/", "cyc", ",", "n", "=", "3", ";", "vri", ",", "n", "=", "6", ")", ".", "For", "each", "time", "series", ",", "the", "value", "of", "the", "lowest", "time", "point", "was", "set", "to", "1", ".", "B", "Western", "blots", "of", "proteins", "from", "whole", "head", "extracts", "of", "Nipped", "-", "A", "RNAi", "and", "control", "flies", "collected", "on", "DD1", "and", "probed", "with", "TIM", ",", "PDP1ε", "and", "PER", "antibodies", ".", "C", "Quantification", "of", "TIM", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "PDP1ε", "(", "n", "=", "3", ")", "and", "PER", "(", "n", "=", "3", ")", "protein", "levels", "of", "blots", "in", "(", "B", ")", ".", "TIM", ",", "PDP1ε", "and", "PER", "protein", "levels", "were", "normalized", "to", "that", "of", "HSP70", ".", "For", "each", "time", "series", ",", "the", "value", "of", "the", "control", "at", "the", "peak", "time", "point", "was", "set", "to", "1", ".", "D", "Brains", "from", "Udcr2", "/", "+", ";", "cryG4", "-", "16", "/", "+", "and", "Udcr2", "/", "+", ";", "cryG4", "-", "16", "/", "UNipped", "-", "ARNAi", "flies", "collected", "at", "CT0", ",", "4", ",", "8", ",", "12", ",", "16", ",", "20", "on", "DD1", "were", "immunostained", "with", "TIM", "(", "green", ")", ",", "PDP1ε", "(", "red", ")", ",", "PER", "(", "green", ")", "and", "PDF", "(", "red", "or", "green", ")", "antisera", ".", "The", "scale", "bar", "represents", "10µm", ".", "E", "Quantification", "of", "TIM", ",", "PDP1ε", "and", "PER", "protein", "levels", "in", "the", "s", "-", "LNvs", "of", "images", "in", "(", "D", ")", "(", "TIM", ":", "CT8", ":", "Udcr2", "/", "+", ";", "cryG4", "-", "16", "/", "+", ",", "n", "=", "89", ";", "Udcr2", "/", "+", ";", "cryG4", "-", "16", "/", "UNipped", "-", "ARNAi", ",", "n", "=", "58", ";", "CT20", ":", "Udcr2", "/", "+", ";", "cryG4", "-", "16", "/", "+", ",", "n", "=", "130", ";", "Udcr2", "/", "+", ";", "cryG4", "-", "16", "/", "UNipped", "-", "ARNAi", ",", "n", "=", "80", ";", "PDP1ε", ":", "CT4", ":", "Udcr2", "/", "+", ";", "cryG4", "-", "16", "/", "+", ",", "n", "=", "46", ";", "Udcr2", "/", "+", ";", "cryG4", "-", "16", "/", "UNipped", "-", "RNAi", ",", "n", "=", "26", ";", "CT16", ":", "Udcr2", "/", "+", ";", "cryG4", "-", "16", "/", "+", ",", "n", "=", "65", ";", "Udcr2", "/", "+", ";", "cryG4", "-", "16", "/", "UNipped", "-", "ARNAi", ",", "n", "=", "41", ";", "PER", ":", "CT0", ":", "Udcr2", "/", "+", ";", "cryG4", "-", "16", "/", "+", ",", "n", "=", "90", ";", "Udcr2", "/", "+", ";", "cryG4", "-", "16", "/", "UNipped", "-", "ARNAi", ",", "n", "=", "58", ";", "CT12", ":", "Udcr2", "/", "+", ";", "cryG4", "-", "16", "/", "+", ",", "n", "=", "86", ";", "Udcr2", "/", "+", ";", "cryG4", "-", "16", "/", "UNipped", "-", "ARNAi", ",", "n", "=", "64", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Plots of relative mRNA abundance vs circadian time (CT) for clock genes determined by qRT-PCR in whole head extracts of Nipped-A RNAi (timG4/+;Udcr2/UNipped-ARNAi-1/+) and control (timG4/+;Udcr2/+) collected on DD1 (tim/cry, n=5; Pdp1ε/per/clk/cyc, n=3; vri, n=6). For each time series, the value of the lowest time point was set to 1.B Western blots of proteins from whole head extracts of Nipped-A RNAi and control flies collected on DD1 and probed with TIM, PDP1ε and PER antibodies. C Quantification of TIM (n=5), PDP1ε (n=3) and PER (n=3) protein levels of blots in (B). TIM, PDP1ε and PER protein levels were normalized to that of HSP70. For each time series, the value of the control at the peak time point was set to 1. D Brains from Udcr2/+;cryG4-16/+ and Udcr2/+;cryG4-16/UNipped-ARNAi flies collected at CT0, 4, 8, 12, 16, 20 on DD1 were immunostained with TIM (green) , PDP1ε (red), PER (green) and PDF (red or green) antisera. The scale bar represents 10µm. E Quantification of TIM, PDP1ε and PER protein levels in the s-LNvs of images in (D) (TIM: CT8: Udcr2/+;cryG4-16/+, n=89; Udcr2/+;cryG4-16/UNipped-ARNAi, n=58; CT20: Udcr2/+;cryG4-16/+, n=130; Udcr2/+;cryG4-16/UNipped-ARNAi, n=80; PDP1ε: CT4: Udcr2/+;cryG4-16/+, n=46; Udcr2/+;cryG4-16/UNipped- RNAi, n=26; CT16: Udcr2/+;cryG4-16/+, n=65; Udcr2/+;cryG4-16/UNipped-ARNAi, n=41; PER: CT0: Udcr2/+;cryG4-16/+, n=90; Udcr2/+;cryG4-16/UNipped-ARNAi, n=58; CT12: Udcr2/+;cryG4-16/+, n=86; Udcr2/+;cryG4-16/UNipped-ARNAi, n=64). "}
{"words": ["Figure", "3A", ",", "B", "The", "period", "of", "DD", "locomotor", "rhythm", "of", "Nipped", "-", "A", "RNAi", "flies", "over", "-", "expressing", "tim", "(", "A", ")", "or", "carrying", "heterozygous", "tim01", "mutation", "(", "B", ")", ".", "Ptim", "is", "a", "tim", "cDNA", "construct", "driven", "by", "tim", "promoter", ".", "Data", "information", ":", "Error", "bars", "represent", "SEM", ".", "Digits", "on", "the", "bar", "are", "the", "number", "of", "flies", "tested", ".", "Percentage", "of", "rhythmicity", "is", "indicated", "above", "the", "bars", ".", "Statistical", "difference", "is", "measured", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "/", "#", "#", "#", "/", "+", "+", "+", "/", "$", "$", "$", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "compared", "with", "the", "G4", "control", ",", "#", "compared", "with", "the", "UAS", "control", ",", "+", "compared", "with", "the", "Nipped", "-", "A", "RNAi", "flies", ",", "$", "compared", "with", "the", "over", "-", "expression", "or", "mutant", "flies", ".", "White", "bar", "indicates", "UAS", "or", "GAL4", "controls", ".", "Dashed", "bar", "indicates", "flies", "with", "genetically", "manipulated", "core", "clock", "gene", ".", "Gray", "bar", "indicates", "flies", "with", "Nipped", "-", "A", "knocked", "down", ".", "Checked", "bar", "indicates", "flies", "with", "both", "genetically", "manipulated", "core", "clock", "gene", "and", "Nipped", "-", "A", "knocked", "down", ".", "G4", ",", "GAL4", ";", "U", ",", "UAS", ".", "C", ",", "D", "The", "period", "of", "DD", "locomotor", "rhythm", "of", "Nipped", "-", "A", "RNAi", "flies", "over", "-", "expressing", "Pdp1ε", "(", "C", ")", "or", "carrying", "heterozygous", "Pdp1ε3135", "mutation", "(", "D", ")", ".", "Data", "information", ":", "Error", "bars", "represent", "SEM", ".", "Digits", "on", "the", "bar", "are", "the", "number", "of", "flies", "tested", ".", "Percentage", "of", "rhythmicity", "is", "indicated", "above", "the", "bars", ".", "Statistical", "difference", "is", "measured", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "/", "#", "#", "#", "/", "+", "+", "+", "/", "$", "$", "$", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "compared", "with", "the", "G4", "control", ",", "#", "compared", "with", "the", "UAS", "control", ",", "+", "compared", "with", "the", "Nipped", "-", "A", "RNAi", "flies", ",", "$", "compared", "with", "the", "over", "-", "expression", "or", "mutant", "flies", ".", "White", "bar", "indicates", "UAS", "or", "GAL4", "controls", ".", "Dashed", "bar", "indicates", "flies", "with", "genetically", "manipulated", "core", "clock", "gene", ".", "Gray", "bar", "indicates", "flies", "with", "Nipped", "-", "A", "knocked", "down", ".", "Checked", "bar", "indicates", "flies", "with", "both", "genetically", "manipulated", "core", "clock", "gene", "and", "Nipped", "-", "A", "knocked", "down", ".", "G4", ",", "GAL4", ";", "U", ",", "UAS", ".", "E", ",", "F", "The", "period", "of", "DD", "locomotor", "rhythm", "of", "Nipped", "-", "A", "RNAi", "flies", "over", "-", "expressing", "per", "(", "E", ")", "or", "carrying", "perL", "mutation", "(", "F", ")", ".", "Data", "information", ":", "Error", "bars", "represent", "SEM", ".", "Digits", "on", "the", "bar", "are", "the", "number", "of", "flies", "tested", ".", "Percentage", "of", "rhythmicity", "is", "indicated", "above", "the", "bars", ".", "Statistical", "difference", "is", "measured", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "/", "#", "#", "#", "/", "+", "+", "+", "/", "$", "$", "$", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "compared", "with", "the", "G4", "control", ",", "#", "compared", "with", "the", "UAS", "control", ",", "+", "compared", "with", "the", "Nipped", "-", "A", "RNAi", "flies", ",", "$", "compared", "with", "the", "over", "-", "expression", "or", "mutant", "flies", ".", "White", "bar", "indicates", "UAS", "or", "GAL4", "controls", ".", "Dashed", "bar", "indicates", "flies", "with", "genetically", "manipulated", "core", "clock", "gene", ".", "Gray", "bar", "indicates", "flies", "with", "Nipped", "-", "A", "knocked", "down", ".", "Checked", "bar", "indicates", "flies", "with", "both", "genetically", "manipulated", "core", "clock", "gene", "and", "Nipped", "-", "A", "knocked", "down", ".", "G4", ",", "GAL4", ";", "U", ",", "UAS", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A, B The period of DD locomotor rhythm of Nipped-A RNAi flies over-expressing tim (A) or carrying heterozygous tim01 mutation (B). Ptim is a tim cDNA construct driven by tim promoter. Data information: Error bars represent SEM. Digits on the bar are the number of flies tested. Percentage of rhythmicity is indicated above the bars. Statistical difference is measured using one-way ANOVA, P<0.001, Tukey's multiple comparison test, *P<0.05, **P<0.01, ***/###/+++/$$$P<0.001, * compared with the G4 control, # compared with the UAS control, + compared with the Nipped-A RNAi flies, $ compared with the over-expression or mutant flies. White bar indicates UAS or GAL4 controls. Dashed bar indicates flies with genetically manipulated core clock gene. Gray bar indicates flies with Nipped-A knocked down. Checked bar indicates flies with both genetically manipulated core clock gene and Nipped-A knocked down. G4, GAL4; U, UAS.C, D The period of DD locomotor rhythm of Nipped-A RNAi flies over-expressing Pdp1ε (C) or carrying heterozygous Pdp1ε3135 mutation (D). Data information: Error bars represent SEM. Digits on the bar are the number of flies tested. Percentage of rhythmicity is indicated above the bars. Statistical difference is measured using one-way ANOVA, P<0.001, Tukey's multiple comparison test, *P<0.05, **P<0.01, ***/###/+++/$$$P<0.001, * compared with the G4 control, # compared with the UAS control, + compared with the Nipped-A RNAi flies, $ compared with the over-expression or mutant flies. White bar indicates UAS or GAL4 controls. Dashed bar indicates flies with genetically manipulated core clock gene. Gray bar indicates flies with Nipped-A knocked down. Checked bar indicates flies with both genetically manipulated core clock gene and Nipped-A knocked down. G4, GAL4; U, UAS.E, F The period of DD locomotor rhythm of Nipped-A RNAi flies over-expressing per (E) or carrying perL mutation (F). Data information: Error bars represent SEM. Digits on the bar are the number of flies tested. Percentage of rhythmicity is indicated above the bars. Statistical difference is measured using one-way ANOVA, P<0.001, Tukey's multiple comparison test, *P<0.05, **P<0.01, ***/###/+++/$$$P<0.001, * compared with the G4 control, # compared with the UAS control, + compared with the Nipped-A RNAi flies, $ compared with the over-expression or mutant flies. White bar indicates UAS or GAL4 controls. Dashed bar indicates flies with genetically manipulated core clock gene. Gray bar indicates flies with Nipped-A knocked down. Checked bar indicates flies with both genetically manipulated core clock gene and Nipped-A knocked down. G4, GAL4; U, UAS."}
{"words": ["Figure", "4A", "Plots", "of", "relative", "mRNA", "abundance", "of", "Nipped", "-", "A", "in", "whole", "head", "extracts", "of", "w1118", "flies", "in", "LD", "and", "DD1", "determined", "by", "qRT", "-", "PCR", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "B", "Left", "panel", ":", "Western", "blots", "of", "proteins", "from", "whole", "heads", "of", "w1118", "and", "Nipped", "-", "A", "RNAi", "flies", "collected", "during", "LD", "or", "DD1", "and", "probed", "with", "NIPPED", "-", "A", "antibody", ".", "Right", "panel", ":", "quantification", "of", "NIPPED", "-", "A", "protein", "levels", "of", "blots", "in", "the", "left", "panel", "(", "LD", ",", "n", "=", "3", ";", "DD1", ",", "n", "=", "5", ")", ".", "C", "Chromatin", "immunoprecipitation", "(", "ChIP", ")", "assays", "to", "detect", "NIPPED", "-", "A", "binding", "at", "E", "-", "box", ",", "transcription", "start", "site", "(", "TSS", ")", "and", "gene", "body", "of", "tim", ",", "Pdp1ε", "and", "per", "using", "w1118", "flies", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "information", ":", "Error", "bars", "represent", "SEM", ".", "Two", "-", "way", "ANOVA", ",", "significant", "effect", "between", "NIPPED", "-", "A", "and", "IgG", "were", "found", "for", "tim", "E", "-", "box", "(", "P", "<", "0", ".", "001", ")", ",", "Pdp1ε", "E", "-", "box", "(", "P", "<", "0", ".", "001", ")", ",", "per", "E", "-", "box", "(", "P", "<", "0", ".", "001", ")", ",", "tim", "TSS", "(", "P", "<", "0", ".", "001", ")", ",", "Pdp1ε", "TSS", "(", "P", "<", "0", ".", "001", ")", ",", "per", "TSS", "(", "P", "<", "0", ".", "001", ")", ",", "tim", "gene", "body", "(", "P", "<", "0", ".", "001", ")", ",", "Pdp1ε", "gene", "body", "and", "per", "gene", "body", "(", "P", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "G4", ",", "GAL4", ";", "U", ",", "UAS", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A Plots of relative mRNA abundance of Nipped-A in whole head extracts of w1118 flies in LD and DD1 determined by qRT-PCR (n=3).B Left panel: Western blots of proteins from whole heads of w1118 and Nipped-A RNAi flies collected during LD or DD1 and probed with NIPPED-A antibody. Right panel: quantification of NIPPED-A protein levels of blots in the left panel (LD, n=3; DD1, n=5).C Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays to detect NIPPED-A binding at E-box, transcription start site (TSS) and gene body of tim, Pdp1ε and per using w1118 flies (n=3). Data information: Error bars represent SEM. Two-way ANOVA, significant effect between NIPPED-A and IgG were found for tim E-box (P<0.001), Pdp1ε E-box (P<0.001), per E-box (P<0.001), tim TSS (P<0.001), Pdp1ε TSS (P<0.001), per TSS (P<0.001), tim gene body (P<0.001), Pdp1ε gene body and per gene body (P<0.001). Student's t-test, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. G4, GAL4; U, UAS."}
{"words": ["Figure", "5A", "Plots", "of", "relative", "pre", "-", "mRNA", "abundance", "of", "tim", "(", "n", "=", "5", ")", "and", "Pdp1ε", "(", "n", "=", "3", ")", "determined", "by", "qRT", "-", "PCR", "in", "the", "whole", "head", "extracts", "of", "Nipped", "-", "A", "RNAi", "(", "timG4", "/", "+", ";", "Udcr2", "/", "UNipped", "-", "ARNAi", "-", "1", ")", "and", "control", "(", "timG4", "/", "+", ";", "Udcr2", "/", "+", ")", "flies", "during", "DD1", ".", "B", "ChIP", "assays", "to", "detect", "ub", "-", "H2B", "binding", "at", "E", "-", "box", ",", "TSS", "and", "gene", "body", "of", "tim", ",", "Pdp1ε", ",", "per", "and", "clk", "in", "Nipped", "-", "A", "RNAi", "(", "timG4", "/", "+", ";", "Udcr2", "/", "UNipped", "-", "ARNAi", "-", "1", ")", "and", "control", "(", "timG4", "/", "+", ";", "Udcr2", "/", "+", ")", "(", "n", "≥", "3", ")", ".", "Data", "information", ":", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ".", "Two", "-", "way", "ANOVA", ",", "significant", "effect", "between", "ub", "-", "H2B", "and", "IgG", "were", "found", "for", "all", "genomic", "regions", "tested", "(", "P", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "Significant", "effect", "of", "genotypes", "were", "found", "for", "tim", "E", "-", "box", "(", "P", "<", "0", ".", "05", ")", ",", "Pdp1ε", "E", "-", "box", "(", "P", "<", "0", ".", "01", ")", ",", "tim", "TSS", "(", "P", "<", "0", ".", "01", ")", "and", "Pdp1ε", "TSS", "(", "P", "<", "0", ".", "001", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A Plots of relative pre-mRNA abundance of tim (n=5) and Pdp1ε (n=3) determined by qRT-PCR in the whole head extracts of Nipped-A RNAi (timG4/+;Udcr2/UNipped-ARNAi-1) and control (timG4/+;Udcr2/+) flies during DD1.B ChIP assays to detect ub-H2B binding at E-box, TSS and gene body of tim, Pdp1ε, per and clk in Nipped-A RNAi (timG4/+;Udcr2/UNipped-ARNAi-1) and control (timG4/+;Udcr2/+) (n≥3). Data information: Student's t-test, *P < 0.05. Two-way ANOVA, significant effect between ub-H2B and IgG were found for all genomic regions tested (P<0.001). Significant effect of genotypes were found for tim E-box (P<0.05), Pdp1ε E-box (P<0.01), tim TSS (P<0.01) and Pdp1ε TSS (P<0.001)."}
{"words": ["Figure", "6A", ",", "B", "The", "period", "(", "A", ")", "and", "power", "(", "B", ")", "of", "DD", "locomotor", "rhythms", "of", "flies", "with", "not", "knocked", "down", "and", "controls", ".", "Digits", "on", "the", "bar", "are", "the", "number", "of", "flies", "tested", ".", "Percentage", "of", "rhythmicity", "is", "indicated", "above", "the", "bars", ".", "Statistical", "difference", "is", "measured", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "/", "#", "#", "#", "/", "+", "+", "+", "/", "$", "$", "$", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "compared", "with", "the", "G4", "control", ",", "#", "compared", "with", "the", "UAS", "control", ",", "+", "compared", "with", "the", "Nipped", "-", "A", "RNAi", "flies", ",", "$", "compared", "with", "the", "not", "overexpression", "flies", ".", "White", "bar", "indicates", "UAS", "or", "GAL4", "controls", ".", "Dashed", "bar", "indicates", "flies", "with", "genetically", "manipulated", "not", ".", "Gray", "bar", "indicates", "flies", "with", "Nipped", "-", "A", "knocked", "down", ".", "Checked", "bar", "indicates", "flies", "with", "both", "genetically", "manipulated", "not", "and", "Nipped", "-", "A", "knocked", "down", ".", "C", "Plots", "of", "relative", "mRNA", "abundance", "vs", "CT", "for", "clock", "genes", "determined", "by", "qRT", "-", "PCR", "in", "whole", "head", "extracts", "of", "not", "RNAi", "(", "timG4", "/", "+", ";", "Udcr2", "/", "UnotRNAi", ")", "and", "control", "(", "timG4", "/", "+", ";", "Udcr2", "/", "+", ")", "collected", "on", "DD1", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "D", "ChIP", "assays", "to", "detect", "ub", "-", "H2B", "binding", "at", "E", "-", "box", ",", "TSS", "and", "gene", "body", "of", "tim", "and", "Pdp1ε", "in", "not", "RNAi", "(", "timG4", "/", "+", ";", "Udcr2", "/", "UnotRNAi", ")", "and", "control", "(", "timG4", "/", "+", ";", "Udcr2", "/", "+", ")", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Statistical", "difference", "is", "measured", "using", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "significant", "effect", "of", "genotypes", "were", "found", "for", "tim", "E", "-", "box", "(", "P", "<", "0", ".", "01", ")", ",", "Pdp1ε", "E", "-", "box", "(", "P", "<", "0", ".", "05", ")", ",", "tim", "TSS", "(", "P", "<", "0", ".", "05", ")", "and", "Pdp1ε", "TSS", "(", "P", "<", "0", ".", "001", ")", "and", "tim", "gene", "body", "(", "P", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "G4", ",", "GAL4", ";", "U", ",", "UAS", ".", "E", ",", "F", "The", "period", "of", "DD", "locomotor", "rhythm", "of", "flies", "when", "knocking", "down", "Nipped", "-", "A", "and", "over", "-", "expressing", "not", ".", "Digits", "on", "the", "bar", "are", "the", "number", "of", "flies", "tested", ".", "Percentage", "of", "rhythmicity", "is", "indicated", "above", "the", "bars", ".", "Statistical", "difference", "is", "measured", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "/", "#", "#", "#", "/", "+", "+", "+", "/", "$", "$", "$", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "compared", "with", "the", "G4", "control", ",", "#", "compared", "with", "the", "UAS", "control", ",", "+", "compared", "with", "the", "Nipped", "-", "A", "RNAi", "flies", ",", "$", "compared", "with", "the", "not", "overexpression", "flies", ".", "White", "bar", "indicates", "UAS", "or", "GAL4", "controls", ".", "Dashed", "bar", "indicates", "flies", "with", "genetically", "manipulated", "not", ".", "Gray", "bar", "indicates", "flies", "with", "Nipped", "-", "A", "knocked", "down", ".", "Checked", "bar", "indicates", "flies", "with", "both", "genetically", "manipulated", "not", "and", "Nipped", "-", "A", "knocked", "down", ".", "G", "The", "period", "of", "DD", "locomotor", "rhythm", "of", "flies", "co", "-", "expressing", "Nipped", "-", "A", "RNAi", "and", "not", "RNAi", ".", "Digits", "on", "the", "bar", "are", "the", "number", "of", "flies", "tested", ".", "Percentage", "of", "rhythmicity", "is", "indicated", "above", "the", "bars", ".", "Statistical", "difference", "is", "measured", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "/", "#", "#", "#", "/", "+", "+", "+", "/", "$", "$", "$", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "compared", "with", "the", "G4", "control", ",", "#", "compared", "with", "the", "UAS", "control", ",", "+", "compared", "with", "the", "Nipped", "-", "A", "RNAi", "flies", ",", "$", "compared", "with", "the", "not", "overexpression", "flies", ".", "White", "bar", "indicates", "UAS", "or", "GAL4", "controls", ".", "Dashed", "bar", "indicates", "flies", "with", "genetically", "manipulated", "not", ".", "Gray", "bar", "indicates", "flies", "with", "Nipped", "-", "A", "knocked", "down", ".", "Checked", "bar", "indicates", "flies", "with", "both", "genetically", "manipulated", "not", "and", "Nipped", "-", "A", "knocked", "down", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A, B The period (A) and power (B) of DD locomotor rhythms of flies with not knocked down and controls. Digits on the bar are the number of flies tested. Percentage of rhythmicity is indicated above the bars. Statistical difference is measured using one-way ANOVA, P<0.001, Tukey's multiple comparison test, **P<0.01, ***/###/+++/$$$P<0.001, * compared with the G4 control, # compared with the UAS control, + compared with the Nipped-A RNAi flies, $ compared with the not overexpression flies. White bar indicates UAS or GAL4 controls. Dashed bar indicates flies with genetically manipulated not. Gray bar indicates flies with Nipped-A knocked down. Checked bar indicates flies with both genetically manipulated not and Nipped-A knocked down.C Plots of relative mRNA abundance vs CT for clock genes determined by qRT-PCR in whole head extracts of not RNAi (timG4/+;Udcr2/UnotRNAi) and control (timG4/+;Udcr2/+) collected on DD1 (n=5).D ChIP assays to detect ub-H2B binding at E-box, TSS and gene body of tim and Pdp1ε in not RNAi (timG4/+;Udcr2/UnotRNAi) and control (timG4/+;Udcr2/+) (n=3). Student's t-test, *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001. Statistical difference is measured using two-way ANOVA, P<0.001, significant effect of genotypes were found for tim E-box (P<0.01), Pdp1ε E-box (P<0.05), tim TSS (P<0.05) and Pdp1ε TSS (P<0.001) and tim gene body (P<0.01). G4, GAL4; U, UAS.E, F The period of DD locomotor rhythm of flies when knocking down Nipped-A and over-expressing not. Digits on the bar are the number of flies tested. Percentage of rhythmicity is indicated above the bars. Statistical difference is measured using one-way ANOVA, P<0.001, Tukey's multiple comparison test, **P<0.01, ***/###/+++/$$$P<0.001, * compared with the G4 control, # compared with the UAS control, + compared with the Nipped-A RNAi flies, $ compared with the not overexpression flies. White bar indicates UAS or GAL4 controls. Dashed bar indicates flies with genetically manipulated not. Gray bar indicates flies with Nipped-A knocked down. Checked bar indicates flies with both genetically manipulated not and Nipped-A knocked down.G The period of DD locomotor rhythm of flies co-expressing Nipped-A RNAi and not RNAi. Digits on the bar are the number of flies tested. Percentage of rhythmicity is indicated above the bars. Statistical difference is measured using one-way ANOVA, P<0.001, Tukey's multiple comparison test, **P<0.01, ***/###/+++/$$$P<0.001, * compared with the G4 control, # compared with the UAS control, + compared with the Nipped-A RNAi flies, $ compared with the not overexpression flies. White bar indicates UAS or GAL4 controls. Dashed bar indicates flies with genetically manipulated not. Gray bar indicates flies with Nipped-A knocked down. Checked bar indicates flies with both genetically manipulated not and Nipped-A knocked down."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "siRNA", "-", "treated", "BMDMs", "were", "infected", "for", "16", "hours", "with", "S", ".", "Typhimurium", "(", "orgA", "-", ")", "and", "LDH", "and", "IL", "-", "1β", "release", "were", "measured", ".", "(", "B", ")", "Cell", "death", "(", "LDH", ")", "and", "IL", "-", "1β", "release", "evaluation", "in", "WT", ",", "Irgm2", "-", "/", "-", ",", "GBPChr3", "-", "/", "-", "and", "Casp11", "-", "/", "-", "BMDMs", "infected", "for", "16", "hours", "with", "different", "Gram", "-", "negative", "bacteria", "(", "MOI", "25", ")", ".", "(", "C", ")", "Western", "blot", "examination", "of", "processed", "caspase", "-", "1", "(", "p20", ")", "and", "gasdermin", "-", "D", "(", "p30", ")", "in", "supernatants", "and", "pro", "-", "caspase", "-", "1", "(", "p45", ")", ",", "pro", "-", "gasdermin", "-", "D", "(", "p55", ")", "and", "GAPDH", "in", "cell", "lysates", "of", "WT", "and", "Irgm2", "-", "/", "-", "BMDMs", "infected", "for", "16", "h", "with", "different", "Gram", "-", "negative", "bacterial", "strains", ".", "(", "D", ")", "IL", "-", "1β", "and", "cell", "death", "(", "%", "LDH", ")", "evaluation", "in", "immortalized", "WT", ",", "Irgm2", "-", "/", "-", ",", "Casp11", "-", "/", "-", "and", "Casp11", "-", "/", "-", "Irgm2", "-", "/", "-", "(", "referred", "as", "sgIrgm2", ")", "BMDMs", "after", "16", "hours", "of", "E", ".", "coli", ",", "S", ".", "Typhimurium", "orgA", "-", "and", "OMV", "treatment", ".", "(", "E", ")", "Cell", "death", "(", "%", "LDH", ")", "evaluation", "in", "IFNγ", "-", "primed", "WT", ",", "Irgm2", "-", "/", "-", "and", "Casp11", "-", "/", "-", "BMDMs", "4", "hours", "after", "electroporation", "or", "not", "with", "1µg", "of", "E", ".", "coli", "LPS", ".", "(", "F", "-", "H", ")", "Survival", "of", "WT", ",", "Casp11", "-", "/", "-", "and", "Irgm2", "-", "/", "-", "mice", "primed", "with", "100µg", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "for", "6", "hours", "and", "injected", "(", "i", ".", "p", ".", ")", "with", "5mg", "/", "k", "-", "1", "LPS", "or", "5", "and", "25", "µg", "of", "OMVs", "(", "n", "=", "6", "animals", "per", "condition", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) siRNA-treated BMDMs were infected for 16 hours with S. Typhimurium (orgA-) and LDH and IL-1β release were measured.(B) Cell death (LDH) and IL-1β release evaluation in WT, Irgm2-/-, GBPChr3-/- and Casp11-/- BMDMs infected for 16 hours with different Gram-negative bacteria (MOI 25).(C) Western blot examination of processed caspase-1 (p20) and gasdermin-D (p30) in supernatants and pro-caspase-1 (p45), pro-gasdermin-D (p55) and GAPDH in cell lysates of WT and Irgm2-/- BMDMs infected for 16 h with different Gram-negative bacterial strains.(D) IL-1β and cell death (% LDH) evaluation in immortalized WT, Irgm2-/-, Casp11-/- and Casp11-/-Irgm2-/- (referred as sgIrgm2) BMDMs after 16 hours of E. coli, S. Typhimurium orgA- and OMV treatment.(E) Cell death (% LDH) evaluation in IFNγ-primed WT, Irgm2-/- and Casp11-/- BMDMs 4 hours after electroporation or not with 1µg of E. coli LPS.(F-H) Survival of WT, Casp11-/- and Irgm2-/- mice primed with 100µg poly(I:C) for 6 hours and injected (i.p.) with 5mg/k-1 LPS or 5 and 25 µg of OMVs (n=6 animals per condition)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Measure", "of", "LDH", "and", "IL", "-", "1β", "release", "in", "WT", ",", "GBPChr3", "-", "/", "-", "and", "Casp11", "-", "/", "-", "BMDMs", "were", "Irgm2", "was", "knocked", "down", "16", "hours", "after", "exposure", "to", "2", ",", "5", "µg", "/", "2", ".", "105", "cells", "of", "OMVs", ".", "Si", "Scramble", "(", "siScr", ".", ")", "refers", "to", "RNAi", "pools", "with", "non", "-", "targeting", "sequences", ".", "(", "B", ")", "Cell", "death", "(", "LDH", ")", "and", "IL", "-", "1β", "release", "evaluation", "in", "Irgm2", "-", "silenced", "WT", "and", "GBPChr3", "-", "/", "-", "BMDMs", "infected", "for", "16", "hours", "with", "either", "S", ".", "Tm", "orgA", "-", "or", "F", ".", "novicida", "(", "MOI", "25", ")", ".", "Si", "Scramble", "(", "siScr", ".", ")", "refers", "to", "RNAi", "pools", "with", "non", "-", "targeting", "sequences", ".", "(", "C", ")", "Florescence", "microscopy", "and", "associated", "quantifications", "of", "GBP", "-", "2", "(", "green", ")", "recruitments", "to", "intracellular", "S", ".", "Tm", "orgA", "-", "-", "mCherry", "(", "MOI", "10", ",", "red", ")", "in", "IFNγ", "-", "primed", "WT", "and", "Irgm2", "-", "/", "-", "BMDMs", ".", "Nucleus", "was", "stained", "with", "Hoechst", "(", "blue", ")", ".", "Confocal", "images", "shown", "are", "from", "one", "experiment", "and", "are", "representative", "of", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ";", "scale", "bars", "5", "µm", ".", "For", "quantifications", ",", "the", "percentage", "of", "GBP", "-", "associated", "bacteria", "was", "quantified", "and", "'", "n", "=", "'", "refers", "to", "the", "number", "of", "intracellular", "bacteria", "counted", "in", "each", "experiment", ";", "quantifications", "from", "n", "=", "3", "independent", "experiments", "were", "then", "plotted", "and", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "(", "D", ")", "Confocal", "fluorescence", "microscopy", "images", "and", "associated", "quantifications", "of", "caspase", "-", "11", "-", "C254G", "-", "GFP", "(", "green", ")", "recruitment", "to", "S", ".", "Tm", "-", "mCherry", "(", "orgA", "-", ",", "red", ")", "in", "IFNγ", "-", "primed", "iWT", ",", "iIrgm2", "-", "/", "-", ",", "iGBPChr3", "-", "/", "-", "and", "iGBPChr3", "-", "/", "-", "/", "sgIrgm2", "BMDMs", "after", "8", "hours", "of", "infection", ".", "Nucleus", "(", "blue", ")", "was", "stained", "with", "Hoescht", ";", "scale", "bar", "5µm", ".", "For", "quantifications", ",", "the", "percentage", "of", "bacteria", "positive", "for", "caspase", "-", "11", "-", "C254G", "-", "GFP", "was", "determined", "by", "combining", "the", "bacterial", "counts", "from", "n", "=", "3", "independent", "experiments", "and", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "001", "for", "the", "indicated", "comparisons", "using", "t", "-", "test", "with", "bonferroni", "correction", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Measure of LDH and IL-1β release in WT, GBPChr3-/- and Casp11-/- BMDMs were Irgm2 was knocked down 16 hours after exposure to 2,5 µg/2.105 cells of OMVs. Si Scramble (siScr.) refers to RNAi pools with non-targeting sequences.(B) Cell death (LDH) and IL-1β release evaluation in Irgm2-silenced WT and GBPChr3-/- BMDMs infected for 16 hours with either S.Tm orgA- or F. novicida (MOI 25). Si Scramble (siScr.) refers to RNAi pools with non-targeting sequences.(C) Florescence microscopy and associated quantifications of GBP-2 (green) recruitments to intracellular S. Tm orgA--mCherry (MOI 10, red) in IFNγ-primed WT and Irgm2-/-BMDMs. Nucleus was stained with Hoechst (blue). Confocal images shown are from one experiment and are representative of n=3 independent experiments; scale bars 5 µm. For quantifications, the percentage of GBP-associated bacteria was quantified and 'n=' refers to the number of intracellular bacteria counted in each experiment; quantifications from n=3 independent experiments were then plotted and expressed as mean ± SEM.(D) Confocal fluorescence microscopy images and associated quantifications of caspase-11-C254G-GFP (green) recruitment to S.Tm-mCherry (orgA-, red) in IFNγ-primed iWT, iIrgm2-/-, iGBPChr3-/- and iGBPChr3-/-/sgIrgm2 BMDMs after 8 hours of infection. Nucleus (blue) was stained with Hoescht; scale bar 5µm. For quantifications, the percentage of bacteria positive for caspase-11-C254G-GFP was determined by combining the bacterial counts from n=3 independent experiments and expressed as mean ± SEM. ***p ≤ 0.001 for the indicated comparisons using t-test with bonferroni correction."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "GFP", "-", "Trap", "coupled", "to", "mass", "spectrometry", "strategy", "used", ".", "The", "volcano", "plot", "represents", "3", "independent", "combined", "experiments", ".", "Threshold", "selection", "of", "enriched", "proteins", "(", "red", "dots", ")", "in", "Irgm2", "-", "GFP", "fraction", "was", "set", "at", "2", "fold", "enrichment", "(", "x", "axis", ")", "and", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", "(", "y", "axis", ")", ".", "Blacks", "and", "Grey", "dots", "indicate", "proteins", "that", "did", "not", "reach", "a", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", "using", "t", "-", "test", "with", "bonferroni", "correction", ".", "Labelled", "proteins", "represent", "the", "top", "6", "enriched", "proteins", "in", "the", "Irgm2", "fraction", ".", "(", "B", ")", "Green", "Florescent", "Protein", "(", "GFP", ")", "-", "Trap", "assay", "of", "the", "presence", "of", "Gate16", "in", "Irgm2", "-", "GFP", "-", "enriched", "fraction", "from", "the", "lysates", "of", "IFNγ", "-", "primed", "iIrgm2", "-", "/", "-", "BMDMs", "complemented", "with", "lentiviral", "constructs", "coding", "for", "a", "fusion", "of", "Irgm2", "withGFP", "(", "Irgm2", "-", "GFP", ")", "or", "GFP", "alone", ".", "Arrows", "show", "the", "presence", "or", "not", "of", "Gate16", ",", "Irgm2", "-", "GFP", "and", "GAPDH", "in", "the", "Irgm2", "-", "GFP", "-", "enriched", "fractions", ",", "flow", "-", "through", "and", "total", "cell", "lysates", ".", "*", "means", "non", "-", "specific", "band", "(", "C", ")", "LDH", "and", "IL", "-", "1β", "release", "from", "siRNA", "-", "treated", "WT", "BMDMs", ",", "and", "then", "exposed", "to", "2", ".", "5", "µg", "/", "2", ".", "105", "cells", "of", "OMVs", "for", "16", "hours", ".", "(", "D", ")", "LDH", "and", "IL", "-", "1β", "release", "from", "WT", ",", "Irgm2", "-", "/", "-", "and", "Casp11", "-", "/", "-", "BMDMs", "silenced", "for", "Gate16", "and", "treated", "for", "16", "hours", "with", "2", ",", "5µg", "/", "2", ".", "105", "cells", "of", "OMVs", ".", "Si", "Scramble", "(", "siScr", ".", ")", "refers", "to", "RNAi", "pools", "with", "non", "-", "targeting", "sequences", ".", "(", "E", ")", "Western", "blot", "examination", "of", "caspase", "-", "11", "and", "processed", "caspase", "-", "1", "(", "p20", ")", "and", "gasdermin", "-", "D", "(", "p30", ")", "in", "supernatants", "and", "pro", "-", "caspase", "-", "1", "(", "p45", ")", ",", "pro", "-", "gasdermin", "-", "D", "(", "p55", ")", ",", "pro", "-", "caspase", "-", "11", ",", "Gate16", "and", "GAPDH", "in", "cell", "lysates", "of", "Gate16", "-", "silenced", "WT", ",", "Irgm2", "-", "/", "-", "and", "GBPChr3", "-", "/", "-", "BMDMs", "exposed", "to", "2", ",", "5", ".", "105µg", "/", "2", ".", "105", "cells", "of", "OMVs", "for", "16", "hours", ".", "Si", "Scramble", "(", "siScr", ".", ")", "refers", "to", "RNAi", "pools", "with", "non", "-", "targeting", "sequences", ".", "(", "F", ")", "Representative", "confocal", "fluorescence", "microscopy", "images", "and", "associated", "quantifications", "of", "caspase", "-", "11", "-", "C254G", "-", "GFP", "(", "green", ")", "recruitment", "to", "S", ".", "Tm", "-", "mCherry", "(", "orgA", "-", ",", "red", ",", "MOI", "10", ")", "in", "IFNγ", "-", "primed", "iWT", "BMDMs", "silenced", "for", "Gate16", "after", "4", "and", "8", "hours", "of", "infection", ".", "Nucleus", "(", "blue", ")", "was", "stained", "with", "Hoechst", ";", "scale", "bar", "5µm", ".", "For", "quantifications", ",", "the", "percentage", "of", "bacteria", "positive", "for", "caspase", "-", "11", "-", "C254G", "-", "GFP", "was", "determined", "by", "combining", "the", "bacterial", "counts", "from", "n", "=", "3", "independent", "experiments", "and", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "001", "for", "the", "indicated", "comparisons", "using", "t", "-", "test", "with", "bonferroni", "correction", ".", "Si", "Scramble", "(", "siScr", ".", ")", "refers", "to", "RNAi", "pools", "with", "non", "-", "targeting", "sequences", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) GFP-Trap coupled to mass spectrometry strategy used. The volcano plot represents 3 independent combined experiments. Threshold selection of enriched proteins (red dots) in Irgm2-GFP fraction was set at 2 fold enrichment (x axis) and p-value <0.05 (y axis). Blacks and Grey dots indicate proteins that did not reach a p-value <0.05 using t-test with bonferroni correction. Labelled proteins represent the top 6 enriched proteins in the Irgm2 fraction.(B) Green Florescent Protein (GFP)-Trap assay of the presence of Gate16 in Irgm2-GFP-enriched fraction from the lysates of IFNγ-primed iIrgm2-/- BMDMs complemented with lentiviral constructs coding for a fusion of Irgm2 withGFP (Irgm2-GFP) or GFP alone. Arrows show the presence or not of Gate16, Irgm2-GFP and GAPDH in the Irgm2-GFP-enriched fractions, flow-through and total cell lysates. * means non-specific band(C) LDH and IL-1β release from siRNA-treated WT BMDMs, and then exposed to 2.5 µg/2.105 cells of OMVs for 16 hours.(D) LDH and IL-1β release from WT, Irgm2-/- and Casp11-/- BMDMs silenced for Gate16 and treated for 16 hours with 2,5µg/2.105 cells of OMVs. Si Scramble (siScr.) refers to RNAi pools with non-targeting sequences.(E) Western blot examination of caspase-11 and processed caspase-1 (p20)and gasdermin-D (p30) in supernatants and pro-caspase-1 (p45), pro-gasdermin-D (p55), pro-caspase-11, Gate16 and GAPDH in cell lysates of Gate16-silenced WT, Irgm2-/- and GBPChr3-/- BMDMs exposed to 2,5.105µg/2.105 cells of OMVs for 16 hours. Si Scramble (siScr.) refers to RNAi pools with non-targeting sequences.(F) Representative confocal fluorescence microscopy images and associated quantifications of caspase-11-C254G-GFP (green) recruitment to S.Tm-mCherry (orgA-, red, MOI 10) in IFNγ-primed iWT BMDMs silenced for Gate16 after 4 and 8 hours of infection. Nucleus (blue) was stained with Hoechst; scale bar 5µm. For quantifications, the percentage of bacteria positive for caspase-11-C254G-GFP was determined by combining the bacterial counts from n=3 independent experiments and expressed as mean ± SEM. **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.001 for the indicated comparisons using t-test with bonferroni correction. Si Scramble (siScr.) refers to RNAi pools with non-targeting sequences."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "LDH", "and", "IL", "-", "1B", "release", "from", "siRNA", "-", "treated", "primary", "human", "Monocyte", "-", "Derived", "Macrophages", "(", "hMDMs", ")", "infected", "with", "S", ".", "Typhimurium", "orgA", "-", "(", "MOI25", ")", "for", "16", "hours", ".", "When", "specified", ",", "the", "caspase", "-", "4", "/", "5", "inhibitor", "Z", "-", "LEVD", "(", "25µM", ")", "or", "the", "NLRP3", "inhibitor", "MCC950", "(", "10µM", ")", "were", "added", "to", "the", "experiments", ".", "(", "B", ")", "LDH", "and", "IL", "-", "1B", "release", "from", "siRNA", "-", "treated", "primary", "human", "Monocyte", "-", "Derived", "Macrophages", "(", "hMDMs", ")", ",", "primed", "with", "IFNγ", "(", "10UI", "/", "mL", ")", "and", "PAM3CSK4", "(", "100ng", "/", "mL", ")", "and", "then", "stimulated", "with", "Nigericin", "(", "20µM", ")", "for", "4", "hours", ".", "When", "specified", ",", "the", "caspase", "-", "4", "/", "5", "inhibitor", "Z", "-", "LEVD", "(", "25µM", ")", "or", "the", "NLRP3", "inhibitor", "MCC950", "(", "10µM", ")", "were", "added", "to", "the", "experiments", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "LDH", "and", "IL", "-", "1B", "release", "from", "siRNA", "-", "treated", "WT", "or", "GBP1", "/", "2", "/", "5", "-", "/", "-", "U937", "Monocytic", "cell", "line", ",", "primed", "with", "IFNγ", "(", "10UI", "/", "mL", ")", "and", "PAM3CSK4", "(", "100ng", "/", "mL", ")", "and", "then", "infected", "with", "(", "C", ")", "with", "S", ".", "Typhimurium", "orgA", "-", "(", "MOI25", ")", "for", "10", "hours", "or", "(", "D", ")", "electroporated", "with", "1µg", "of", "E", ".", "coli", "LPS", "for", "4", "hours", ".", "Φ", "indicates", "that", "no", "LPS", "electroporation", "was", "performed", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) LDH and IL-1B release from siRNA-treated primary human Monocyte-Derived Macrophages (hMDMs) infected with S. Typhimurium orgA- (MOI25) for 16 hours. When specified, the caspase-4/5 inhibitor Z-LEVD (25µM) or the NLRP3 inhibitor MCC950 (10µM) were added to the experiments.(B) LDH and IL-1B release from siRNA-treated primary human Monocyte-Derived Macrophages (hMDMs), primed with IFNγ (10UI/mL) and PAM3CSK4 (100ng/mL) and then stimulated with Nigericin (20µM) for 4 hours. When specified, the caspase-4/5 inhibitor Z-LEVD (25µM) or the NLRP3 inhibitor MCC950 (10µM) were added to the experiments.(C, D) LDH and IL-1B release from siRNA-treated WT or GBP1/2/5-/- U937 Monocytic cell line, primed with IFNγ (10UI/mL) and PAM3CSK4 (100ng/mL) and then infected with (C) with S. Typhimurium orgA- (MOI25) for 10 hours or (D) electroporated with 1µg of E. coli LPS for 4 hours. Φ indicates that no LPS electroporation was performed."}
{"words": ["Figure", "1B", "Analysis", "of", "cell", "differentiation", "(", "left", ")", "and", "proliferation", "(", "right", ")", "in", "the", "intestine", "after", "CDK8", "deletion", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "Olfm4", ",", "Lysozyme", ",", "PAS", "and", "Dclk1", "staining", "was", "used", "to", "reveal", ",", "respectively", ",", "stem", ",", "Paneth", ",", "goblet", "and", "tuft", "cells", ".", "β", "-", "Catenin", "staining", "allows", "detection", "of", "cancer", "cells", "(", "cytoplasmic", "vs", "nuclear", "localisation", ")", ".", "Cell", "proliferation", "was", "assessed", "by", "PCNA", ",", "Ki", "-", "67", "and", "BrdU", "(", "2h", "pulse", ")", "staining", ".", "Scatter", "plots", "represent", "the", "percentage", "of", "the", "area", "stained", "by", "each", "antibody", "(", "relative", "to", "the", "area", "occupied", "by", "hematoxylin", ")", ".", "For", "Paneth", "cells", ",", "BrdU", ",", "PCNA", "and", "Ki67", ",", "only", "crypts", "were", "analysed", ".", "For", "goblet", "cells", ",", "crypts", "and", "villi", "were", "analysed", ".", "For", "Tuft", "cell", "quantification", ",", "Dclk1", "-", "positive", "cells", "were", "counted", "in", "50", "villi", ".", "Colour", "code", "depicts", "small", "intestine", "(", "green", ")", ",", "proximal", "colon", "(", "blue", ")", ",", "and", "distant", "colon", "(", "red", ")", ".", "Mean", "±", "SEM", "is", "shown", ".", "P", "-", "value", "of", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", "is", "indicated", "(", "ns", ",", "not", "significant", ";", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "25μm", "(", "Olfm4", ",", "Lysozyme", ",", "Dclk1", "and", "β", "-", "Catenin", ")", "and", "50μm", "(", "PAS", ",", "BrdU", ",", "Ki", "-", "67", "and", "PCNA", ")", ".", "(", "n", "=", "9", "biological", "replicates", ")", "C", "Analysis", "of", "mouse", "colon", "after", "AOM", "/", "DSS", "treatment", ".", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "neoplastic", "lesions", "(", "n", "=", "10", "for", "Cdk8", "+", "/", "+", ",", "and", "n", "=", "7", "for", "Cdk8", "-", "/", "-", "mice", ")", ".", "P", "-", "value", "of", "unpaired", "t", "-", "test", "is", "indicated", ":", "ns", ",", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ".", "Mean", "±", "SD", "is", "shown", ".", "D", "Quantification", "of", "the", "percentage", "of", "the", "colon", "surface", "occupied", "by", "tumours", ".", "Intestine", "samples", "were", "stained", "for", "β", "-", "Catenin", ",", "and", "tumour", "regions", "with", "nuclear", "β", "-", "Catenin", "localisation", "were", "quantified", "using", "NDP", ".", "view", "software", ".", "Two", "-", "tailed", "p", "-", "value", "of", "unpaired", "t", "-", "test", "is", "indicated", ";", "ns", ",", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ".", "Mean", "±", "SD", "is", "shown", ".", "(", "n", "=", "6", "biological", "replicates", ")", "E", "Example", "of", "IHC", "with", "β", "-", "Catenin", "staining", "of", "tumour", "-", "free", "regions", "with", "membrane", "β", "-", "catenin", "localisation", "(", "left", ")", "and", "tumour", "regions", "with", "nuclear", "β", "-", "catenin", "localisation", "(", "right", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "50μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B Analysis of cell differentiation (left) and proliferation (right) in the intestine after CDK8 deletion as in (A). Olfm4, Lysozyme, PAS and Dclk1 staining was used to reveal, respectively, stem, Paneth, goblet and tuft cells. β-Catenin staining allows detection of cancer cells (cytoplasmic vs nuclear localisation). Cell proliferation was assessed by PCNA, Ki-67 and BrdU (2h pulse) staining. Scatter plots represent the percentage of the area stained by each antibody (relative to the area occupied by hematoxylin). For Paneth cells, BrdU, PCNA and Ki67, only crypts were analysed. For goblet cells, crypts and villi were analysed. For Tuft cell quantification, Dclk1-positive cells were counted in 50 villi. Colour code depicts small intestine (green), proximal colon (blue), and distant colon (red). Mean ± SEM is shown. P-value of unpaired two-tailed t-test is indicated (ns, not significant; p > 0.05). Scale bars, 25μm (Olfm4, Lysozyme, Dclk1 and β-Catenin) and 50μm (PAS, BrdU, Ki-67 and PCNA). (n=9 biological replicates)C Analysis of mouse colon after AOM/DSS treatment. Quantification of the number of neoplastic lesions (n = 10 for Cdk8+/+, and n = 7 for Cdk8 -/- mice). P-value of unpaired t-test is indicated: ns, not significant (p > 0.05). Mean ± SD is shown.D Quantification of the percentage of the colon surface occupied by tumours. Intestine samples were stained for β-Catenin, and tumour regions with nuclear β-Catenin localisation were quantified using NDP.view software. Two-tailed p-value of unpaired t-test is indicated; ns, not significant (p > 0.05). Mean ± SD is shown. (n=6 biological replicates)E Example of IHC with β-Catenin staining of tumour-free regions with membrane β-catenin localisation (left) and tumour regions with nuclear β-catenin localisation (right). Scale bars, 50μm."}
{"words": ["Figure", "2A", "Genotyping", "confirms", "the", "loss", "of", "Cdk8", "exon", "2", "in", "Cdk8", "-", "/", "-", "and", "Cdk8", "-", "/", "-", "/", "Cdk19", "-", "/", "-", "organoids", "after", "7", "days", "of", "OH", "-", "tamoxifen", "treatment", ".", "B", "WB", "of", "organoid", "samples", "after", "7", "days", "of", "OH", "-", "tamoxifen", "treatment", ";", "β", "-", "actin", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "C", "Phase", "contrast", "images", "of", "organoids", "before", "and", "after", "6", "days", "of", "OH", "-", "tamoxifen", "treatment", ".", "Scale", "bars", ",", "150μm", ".", "D", "Quantification", "of", "organoid", "size", "at", "day", "6", ",", "shown", "in", "(", "C", ")", "(", "mean", "±", "SEM", "are", "shown", ")", ".", "P", "-", "value", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "(", "Bonferroni", "test", ")", ":", "(", "*", ")", "p", "≤", "0", ".", "05", ",", "(", "*", "*", "*", ")", "p", "≤", "0", ".", "001", ";", "ns", ",", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ".", "(", "n", "=", "47", "biological", "replicates", ")", "E", "IHC", "staining", "of", "organoids", "(", "day", "7", "of", "OH", "-", "tamoxifen", "treatment", ")", "with", "Ki", "-", "67", "antibody", ".", "Scale", "bars", ",", "100μm", ".", "F", "Quantification", "of", "Ki", "-", "67", "positive", "area", "(", "%", "of", "the", "total", "area", "of", "the", "organoids", ";", "mean", "±", "SEM", ")", "in", "the", "four", "different", "genotypes", "presented", "in", "(", "E", ")", ".", "Areas", "with", "positive", "Ki", "-", "67", "signal", "were", "detected", "and", "quantified", "using", "QuPath", "and", "ImageJ", "programs", ".", "Four", "technical", "replicates", "from", "2", "biological", "replicates", "of", "each", "genotype", "were", "analysed", ".", "Adjusted", "p", "-", "values", "of", "ordinary", "one", "-", "way", "ANOVA", "(", "Bonferroni", "test", ")", "are", "indicated", ":", "(", "*", "*", ")", "p", "-", "values", "≤", "0", ".", "01", ";", "(", "*", ")", "p", "-", "values", "≤", "0", ".", "05", ";", "ns", ",", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Genotyping confirms the loss of Cdk8 exon 2 in Cdk8 -/- and Cdk8 -/-/Cdk19 -/- organoids after 7 days of OH-tamoxifen treatment.B WB of organoid samples after 7 days of OH-tamoxifen treatment; β-actin was used as loading control.C Phase contrast images of organoids before and after 6 days of OH-tamoxifen treatment. Scale bars, 150μm. D Quantification of organoid size at day 6, shown in (C) (mean ± SEM are shown). P-value, one-way ANOVA (Bonferroni test): (*) p ≤ 0.05, (***) p ≤ 0.001; ns, not significant (p > 0.05). (n=47 biological replicates)E IHC staining of organoids (day 7 of OH-tamoxifen treatment) with Ki-67 antibody. Scale bars, 100μm. F Quantification of Ki-67 positive area (% of the total area of the organoids; mean ± SEM) in the four different genotypes presented in (E). Areas with positive Ki-67 signal were detected and quantified using QuPath and ImageJ programs. Four technical replicates from 2 biological replicates of each genotype were analysed. Adjusted p-values of ordinary one-way ANOVA (Bonferroni test) are indicated: (**) p-values ≤ 0.01; (*) p-values ≤ 0.05; ns, not significant (p > 0.05)."}
{"words": ["Figure", "3C", "Left", ",", "IHC", "staining", "of", "WT", "and", "Cdk8", "-", "/", "-", "/", "Cdk19", "-", "/", "-", "organoids", "with", "Olfm4", "(", "stem", "cells", ")", ",", "Lysozyme", "(", "Paneth", "cells", ")", ",", "Muc2", "(", "goblet", "cells", ")", ",", "and", "Dclk1", "(", "tuft", "cells", ")", "antibodies", ".", "Scale", "bars", ",", "50μm", "(", "Olfm4", ",", "Muc2", ",", "Dclk1", ")", "and", "25μm", "(", "Lysozyme", ")", ".", "Right", ",", "quantification", "of", "Olfm4", ",", "Lysozyme", "and", "Muc2", "positive", "area", "(", "%", "of", "the", "total", "organoid", "area", "as", "indicated", "by", "hematoxylin", "staining", ";", "mean", "±", "SEM", ")", ",", "or", "the", "number", "of", "Dclk1", "positive", "cells", "per", "organoid", ".", "P", "-", "value", ",", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ":", "(", "*", "*", "*", ")", "p", "-", "value", "≤", "0", ".", "001", ";", "ns", ",", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ".", "20", "different", "organoids", "from", "2", "biological", "replicates", "of", "each", "genotype", "were", "used", "for", "the", "analysis", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3C Left, IHC staining of WT and Cdk8 -/-/Cdk19 -/- organoids with Olfm4 (stem cells), Lysozyme (Paneth cells), Muc2 (goblet cells), and Dclk1 (tuft cells) antibodies. Scale bars, 50μm (Olfm4, Muc2, Dclk1) and 25μm (Lysozyme). Right, quantification of Olfm4, Lysozyme and Muc2 positive area (% of the total organoid area as indicated by hematoxylin staining; mean ± SEM), or the number of Dclk1 positive cells per organoid. P-value, unpaired two-tailed t-test: (***) p-value ≤ 0.001; ns, not significant (p > 0.05). 20 different organoids from 2 biological replicates of each genotype were used for the analysis."}
{"words": ["Figure", "4D", "WB", "of", "indicated", "proteins", "extracted", "from", "Wt", "and", "Cdk8", "-", "/", "-", "/", "Cdk19", "-", "/", "-", "organoids", ".", "Included", "are", "CFTR", "positive", "and", "negative", "control", "cell", "line", "samples", "obtained", "from", "the", "Cystic", "Fibrosis", "Foundation", "(", "CFF", ")", ".", "Amidoblack", "was", "used", "as", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4D WB of indicated proteins extracted from Wt and Cdk8 -/-/Cdk19 -/- organoids. Included are CFTR positive and negative control cell line samples obtained from the Cystic Fibrosis Foundation (CFF). Amidoblack was used as loading control."}
{"words": ["Figure", "5A", "Histological", "PAS", "staining", "of", "organoids", "treated", "for", "7", "days", "with", "OH", "-", "tamoxifen", ".", "Scale", "bar", ",", "50μm", ".", "B", "Quantification", "of", "PAS", "signal", "(", "%", "of", "total", "organoid", "area", ";", "mean", "±", "SD", "are", "shown", ")", "in", "the", "four", "different", "genotypes", "presented", "in", "(", "A", ")", ".", "Areas", "containing", "positive", "PAS", "staining", "were", "detected", "and", "quantified", "using", "QuPath", "and", "ImageJ", "programs", ".", "Adjusted", "p", "-", "values", "of", "ordinary", "one", "-", "way", "Anova", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", "are", "indicated", ":", "(", "*", "*", "*", ")", "p", "-", "value", "≤", "0", ".", "001", ";", "ns", ":", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ".", "Four", "technical", "replicates", "from", "2", "biological", "replicates", "of", "each", "genotype", "were", "analysed", ".", "C", "Representative", "phase", "contrast", "images", "of", "organoids", "at", "the", "indicated", "time", "points", "after", "7", "days", "of", "OH", "-", "tamoxifen", "treatment", "are", "shown", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "D", "Quantification", "of", "the", "time", "needed", "for", "mucus", "release", "(", "observed", "as", "a", "dark", "staining", "in", "the", "center", "of", "the", "organoid", ";", "mean", "±", "SD", "are", "shown", ")", ".", "Adjusted", "p", "-", "values", "of", "ordinary", "one", "-", "way", "Anova", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", "are", "indicated", ":", "(", "*", "*", "*", ")", "p", "-", "value", "≤", "0", ".", "001", ";", "ns", ":", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ";", "(", "n", "=", "17", "for", "Wt", ",", "11", "for", "Cdk8", "-", "/", "-", ",", "18", "for", "Cdk19", "-", "/", "-", ",", "and", "12", "for", "Cdk8", "-", "/", "-", "/", "Cdk19", "-", "/", "-", ",", "all", "biological", "replicates", ")", ".", "E", "Fluorescence", "confocal", "microscopy", "images", "of", "Calcein", "green", "-", "labeled", "WT", "and", "Cdk8", "-", "/", "-", "/", "Cdk19", "-", "/", "-", "organoids", "treated", "with", "forskolin", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", ".", "F", "Quantification", "of", "forskolin", "-", "induced", "swelling", "in", "WT", "organoids", "treated", "for", "1hour", "or", "24", "hours", "with", "0", ".", "1μM", ",", "1μM", "or", "10μM", "Senexin", "B", "(", "SenB", ")", ",", "as", "indicated", ",", "or", "double", "KO", "organoids", ";", "DMSO", "vehicle", "was", "used", "as", "control", ".", "The", "surface", "area", "of", "individual", "organoids", "at", "different", "time", "points", "relative", "to", "the", "area", "at", "t", "=", "0", "(", "100", "%", ")", "was", "measured", "(", "mean", "±", "SD", ",", "n", "=", "8", "biological", "replicates", ")", ".", "Linear", "regression", "lines", "are", "shown", ".", "H", "WB", "of", "indicated", "proteins", "extracted", "from", "Senexin", "B", "-", "treated", "(", "10μM", ",", "2h", "and", "24h", ")", "organoids", "(", "left", ")", ",", "and", "WT", "and", "Cdk8", "-", "/", "-", "/", "Cdk19", "-", "/", "-", "organoids", "(", "right", ")", ".", "Amidoblack", "was", "used", "as", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A Histological PAS staining of organoids treated for 7 days with OH-tamoxifen. Scale bar, 50μm. B Quantification of PAS signal (% of total organoid area; mean ± SD are shown) in the four different genotypes presented in (A). Areas containing positive PAS staining were detected and quantified using QuPath and ImageJ programs. Adjusted p-values of ordinary one-way Anova followed by Tukey's multiple comparison test are indicated: (***) p-value ≤ 0.001; ns: not significant (p > 0.05). Four technical replicates from 2 biological replicates of each genotype were analysed.C Representative phase contrast images of organoids at the indicated time points after 7 days of OH-tamoxifen treatment are shown. Scale bar, 100 μm. D Quantification of the time needed for mucus release (observed as a dark staining in the center of the organoid; mean ± SD are shown). Adjusted p-values of ordinary one-way Anova followed by Tukey's multiple comparison test are indicated: (***) p-value ≤ 0.001; ns: not significant (p > 0.05); (n= 17 for Wt, 11 for Cdk8 -/-, 18 for Cdk19 -/-, and 12 for Cdk8 -/-/ Cdk19 -/- , all biological replicates).E Fluorescence confocal microscopy images of Calcein green-labeled WT and Cdk8-/-/Cdk19-/- organoids treated with forskolin. Scale bars, 100 μm. F Quantification of forskolin-induced swelling in WT organoids treated for 1hour or 24 hours with 0.1μM, 1μM or 10μM Senexin B (SenB), as indicated, or double KO organoids; DMSO vehicle was used as control. The surface area of individual organoids at different time points relative to the area at t = 0 (100%) was measured (mean ± SD, n=8 biological replicates). Linear regression lines are shown.H WB of indicated proteins extracted from Senexin B-treated (10μM, 2h and 24h) organoids (left), and WT and Cdk8 -/-/ Cdk19 -/- organoids (right). Amidoblack was used as loading control."}
{"words": ["Figure", "6A", "WB", "of", "indicated", "proteins", "extracted", "from", "intestinal", "epithelium", "of", "control", "mice", "or", "mice", "treated", "with", "Senexin", "631", "(", "Snx", "631", ")", "for", "4", "or", "11", "days", ".", "B", "Left", ",", "immunohistochemical", "PAS", "and", "hematoxylin", "staining", "of", "mouse", "small", "intestines", "collected", "at", "4", "and", "11", "days", "of", "Senexin", "631", "(", "Snx", "631", ")", "treatment", ";", "scale", "bars", "50μm", ".", "Right", ",", "quantification", "of", "PAS", "-", "and", "hematoxilin", "(", "Hema", ")", "-", "positive", "area", "(", "mean", "±", "SEM", ")", ",", "using", "QuPath", "and", "ImageJ", "software", ".", "Adjusted", "p", "-", "values", "of", "unpaired", "t", "-", "test", "are", "shown", ":", "(", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "ns", ",", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ".", "8", "mice", "(", "4", "treated", "with", "Senexin", "631", "and", "and", "4", "control", ")", "were", "used", "in", "this", "quantification", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A WB of indicated proteins extracted from intestinal epithelium of control mice or mice treated with Senexin 631 (Snx 631) for 4 or 11 days.B Left, immunohistochemical PAS and hematoxylin staining of mouse small intestines collected at 4 and 11 days of Senexin 631 (Snx 631) treatment; scale bars 50μm. Right, quantification of PAS- and hematoxilin (Hema)-positive area (mean ± SEM), using QuPath and ImageJ software. Adjusted p-values of unpaired t-test are shown: (*) p < 0.05; ns, not significant (p > 0.05). 8 mice (4 treated with Senexin 631 and and 4 control) were used in this quantification."}
{"words": ["Figure", "1", ".", "Changes", "with", "time", "in", "amounts", "of", "SH", "-", "EP", ",", "α", "-", "amylase", ",", "and", "VmPE", "-", "1", "in", "cotyledons", "of", "V", ".", "mungo", "seedlings", "(", "Attached", "cotyledons", ")", "or", "embryo", "axis", "-", "removed", "cotyledons", "of", "V", ".", "mungo", "seeds", "(", "Detached", "cotyledons", ")", ".", "Attached", "or", "detached", "cotyledons", "were", "prepared", "as", "described", "in", "Materials", "and", "methods", ".", "10", "pairs", "of", "cotyledons", "were", "homogenized", "with", "3", "ml", "of", "50", "mM", "Tris", "-", "Cl", "(", "pH", "7", ".", "4", ")", ",", "and", "the", "homogenates", "were", "centrifuged", "at", "15", ",", "000", "g", "for", "10", "min", ".", "Supernatants", "(", "10", "μl", "each", ")", "were", "analyzed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "SH", "-", "EP", ",", "α", "-", "amylase", ",", "or", "VmPE", "-", "1", "antibody", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1.Changes with time in amounts of SH-EP, α-amylase, and VmPE-1 in cotyledons of V. mungo seedlings (Attached cotyledons) or embryo axis-removed cotyledons of V. mungo seeds (Detached cotyledons). Attached or detached cotyledons were prepared as described in Materials and methods. 10 pairs of cotyledons were homogenized with 3 ml of 50 mM Tris-Cl (pH 7.4), and the homogenates were centrifuged at 15,000 g for 10 min. Supernatants (10 μl each) were analyzed by SDS-PAGE immunoblotting with anti-SH-EP, α-amylase, or VmPE-1 antibody."}
{"words": ["Figure", "2", ".", "Subcellular", "distribution", "of", "α", "-", "amylase", "in", "V", ".", "mungo", "cotyledon", "cells", ".", "Microsome", "and", "PSV", "fractions", "were", "prepared", "from", "cotyledons", "of", "day", "3", "seedlings", "as", "described", "in", "Materials", "and", "methods", ".", "Extracts", "from", "dry", "seeds", "and", "day", "3", "cotyledons", ",", "microsomes", ",", "and", "PSV", "fractions", "(", "20", "μg", "protein", "each", ")", "were", "separated", "by", "SDS", "-", "PAGE", ".", "Proteins", "in", "the", "gel", "were", "analyzed", "by", "Coomassie", "Brilliant", "blue", "staining", "(", "A", ")", ",", "or", "by", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "SH", "-", "EP", "antibody", "(", "B", ")", "or", "anti", "-", "α", "-", "amylase", "antibody", "(", "C", ")", ".", "Bracket", "indicates", "the", "polypeptides", "derived", "from", "storage", "globulins", ".", "Arrowhead", "indicates", "α", "-", "amylase", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2.Subcellular distribution of α-amylase in V. mungo cotyledon cells. Microsome and PSV fractions were prepared from cotyledons of day 3 seedlings as described in Materials and methods. Extracts from dry seeds and day 3 cotyledons, microsomes, and PSV fractions (20 μg protein each) were separated by SDS-PAGE. Proteins in the gel were analyzed by Coomassie Brilliant blue staining (A), or by immunoblotting with anti-SH-EP antibody (B) or anti- α-amylase antibody (C). Bracket indicates the polypeptides derived from storage globulins. Arrowhead indicates α-amylase."}
{"words": ["Figure", "3", ".", "Electron", "micrographs", "showing", "the", "immunogold", "localization", "of", "α", "-", "amylase", "in", "attached", "cotyledons", "cells", "(", "A", "-", "E", ")", ",", "detached", "cotyledons", "cells", "(", "F", ")", ",", "or", "control", "for", "immunogold", "labeling", "(", "G", ")", ".", "(", "A", ")", "Anti", "-", "α", "-", "amylase", "antibody", "immunogold", "-", "stained", "PSV", ",", "but", "not", "SG", ".", "(", "B", "and", "C", ")", "Golgi", "complex", "and", "PSVs", "were", "both", "immunogold", "-", "labeled", "with", "anti", "-", "α", "-", "amylase", "antibody", ".", "(", "D", ")", "Immunogold", "localization", "of", "α", "-", "amylase", "(", "15", "-", "nm", "particles", ")", "and", "SH", "-", "EP", "(", "10", "-", "nm", "particles", ")", ".", "α", "-", "Amylase", "and", "SH", "-", "EP", "were", "localized", "in", "PSVs", "and", "KVs", ",", "respectively", ".", "(", "E", ")", "Gold", "particles", "from", "anti", "-", "α", "-", "amylase", "antibody", "were", "detected", "in", "LVs", "as", "well", "as", "PSVs", ".", "(", "F", ")", "PSVs", "in", "detached", "cotyledons", "were", "immunogold", "labeled", "with", "anti", "-", "α", "-", "amylase", "antibody", ".", "(", "G", ")", "Immunogold", "staining", "of", "detached", "cotyledon", "cells", "without", "first", "antibody", "(", "anti", "-", "α", "-", "amylase", "antibody", ")", ".", "No", "gold", "particles", "were", "observed", "in", "the", "cell", ".", "CW", ",", "cell", "wall", ";", "G", ",", "Golgi", "complex", ";", "KV", ",", "KDEL", "-", "tailed", "cysteine", "proteinase", "-", "accumulating", "vesicle", ";", "LV", ",", "lytic", "vacuole", ";", "Mt", ",", "mitochondrion", ";", "PSV", ",", "protein", "storage", "vacuole", ";", "SG", ",", "starch", "granule", ".", "Bars", ",", "200", "nm", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3.Electron micrographs showing the immunogold localization of α-amylase in attached cotyledons cells (A-E), detached cotyledons cells (F), or control for immunogold labeling (G). (A) Anti-α-amylase antibody immunogold-stained PSV, but not SG. (B and C) Golgi complex and PSVs were both immunogold-labeled with anti- α-amylase antibody. (D) Immunogold localization of α-amylase (15-nm particles) and SH-EP (10-nm particles). α-Amylase and SH-EP were localized in PSVs and KVs, respectively. (E) Gold particles from anti-α-amylase antibody were detected in LVs as well as PSVs. (F) PSVs in detached cotyledons were immunogold labeled with anti- α-amylase antibody. (G) Immunogold staining of detached cotyledon cells without first antibody (anti-α-amylase antibody). No gold particles were observed in the cell. CW, cell wall; G, Golgi complex; KV, KDEL-tailed cysteine proteinase-accumulating vesicle; LV, lytic vacuole; Mt, mitochondrion; PSV, protein storage vacuole; SG, starch granule. Bars, 200 nm."}
{"words": ["Figure", "4", ".", "Electron", "micrographs", "showing", "ultrastructures", "of", "cotyledon", "cells", "of", "germinatedV", ".", "mungo", "seeds", "(", "A", "-", "G", ")", ",", "immunogold", "localization", "of", "α", "-", "amylase", "in", "cotyledon", "cells", "(", "H", ")", ",", "and", "ultrastructure", "of", "cells", "of", "detached", "cotyledons", "(", "I", ")", ".", "Toluidine", "blue", "(", "TB", ")", "staining", "of", "sections", "from", "cotyledons", "of", "day", "3", "V", ".", "mungo", "seedlings", ".", "Conversion", "from", "TB", "-", "stained", "cells", "(", "region", "I", ")", "to", "TB", "-", "stainless", "cells", "(", "region", "III", ")", "was", "accompanied", "with", "that", "of", "the", "PSV", "to", "LV", ".", "(", "B", ")", "SGs", "and", "PSVs", "in", "TB", "-", "stained", "cells", "(", "A", ",", "region", "I", ")", ".", "The", "PSV", "was", "filled", "with", "storage", "proteins", ".", "Arrowheads", "indicate", "border", "between", "SGs", "and", "the", "cytoplasm", ".", "(", "C", ")", "SGs", "and", "PSVs", "in", "cotyledons", "at", "region", "II", "in", "A", ".", "Electron", "density", "of", "PSVs", "became", "low", ".", "SGs", "were", "surrounded", "with", "membranous", "structure", "(", "arrows", ")", ".", "LED", "areas", "were", "found", "between", "SGs", "and", "the", "cytoplasm", ".", "(", "D", ")", "SG", "and", "LV", "in", "TB", "-", "stainless", "cells", "(", "region", "III", "in", "A", ")", ".", "The", "PSV", "was", "converted", "to", "the", "LV", "in", "the", "cells", ".", "The", "areas", "around", "SG", "with", "LED", "were", "enlarged", ".", "(", "E", ")", "Ultrastructure", "of", "TB", "-", "stainless", "cells", ".", "SGs", "wrapped", "with", "a", "LED", "area", "contacted", "with", "LVs", "(", "arrowheads", ")", ".", "Vesicles", "with", "similar", "density", "to", "LVs", "were", "observed", ".", "(", "F", ")", "LED", "membranes", "around", "the", "SGs", "fused", "with", "the", "LV", "membranes", "(", "arrow", ")", ".", "(", "G", ")", "SGs", "were", "observed", "in", "LVs", ".", "The", "shape", "of", "SGs", "were", "largely", "different", "from", "those", "in", "B", "-", "E", ".", "(", "H", ")", "An", "Immunogold", "image", "representing", "degradation", "of", "SGs", "by", "α", "-", "amylase", "localized", "in", "LVs", ".", "Gold", "particles", "from", "anti", "-", "α", "-", "amylase", "antibody", "were", "densely", "detected", "in", "the", "peripheral", "region", "of", "SGs", ",", "which", "is", "inserted", "into", "the", "inside", "of", "the", "LV", ".", "(", "I", ")", "PSVs", "were", "not", "converted", "to", "LVs", ",", "and", "SGs", "were", "not", "taken", "up", "into", "PSVs", "in", "the", "cells", "of", "detached", "cotyledons", ".", "Neither", "low", "density", "areas", "around", "SGs", "nor", "vesicles", "with", "similar", "density", "to", "LV", "was", "observed", "in", "the", "cells", ".", "LV", ",", "lytic", "vacuole", ";", "Mt", ",", "mitochondrion", ";", "PSV", ",", "protein", "storage", "vacuole", ";", "SG", ",", "starch", "granule", ".", "Bars", ":", "(", "A", ")", "50", "μm", ";", "(", "E", "and", "G", ")", "2", "μm", ";", "(", "D", ",", "F", ",", "and", "I", ")", "1", "μm", ";", "(", "B", ",", "C", ",", "and", "H", ")", "200", "nm", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4.Electron micrographs showing ultrastructures of cotyledon cells of germinatedV. mungo seeds (A-G), immunogold localization of α-amylase in cotyledon cells (H), and ultrastructure of cells of detached cotyledons (I). Toluidine blue (TB) staining of sections from cotyledons of day 3 V. mungo seedlings. Conversion from TB-stained cells (region I) to TB-stainless cells (region III) was accompanied with that of the PSV to LV. (B) SGs and PSVs in TB-stained cells (A, region I). The PSV was filled with storage proteins. Arrowheads indicate border between SGs and the cytoplasm. (C) SGs and PSVs in cotyledons at region II in A. Electron density of PSVs became low. SGs were surrounded with membranous structure (arrows). LED areas were found between SGs and the cytoplasm. (D) SG and LV in TB-stainless cells (region III in A). The PSV was converted to the LV in the cells. The areas around SG with LED were enlarged. (E) Ultrastructure of TB- stainless cells. SGs wrapped with a LED area contacted with LVs (arrowheads). Vesicles with similar density to LVs were observed. (F) LED membranes around the SGs fused with the LV membranes (arrow). (G) SGs were observed in LVs. The shape of SGs were largely different from those in B-E. (H) An Immunogold image representing degradation of SGs by α-amylase localized in LVs. Gold particles from anti-α-amylase antibody were densely detected in the peripheral region of SGs, which is inserted into the inside of the LV. (I) PSVs were not converted to LVs, and SGs were not taken up into PSVs in the cells of detached cotyledons. Neither low density areas around SGs nor vesicles with similar density to LV was observed in the cells. LV, lytic vacuole; Mt, mitochondrion; PSV, protein storage vacuole; SG, starch granule. Bars: (A) 50 μm; (E and G) 2 μm; (D, F, and I) 1 μm; (B, C, and H) 200 nm."}
{"words": ["Figure", "5", ".", "LysoTracker", "red", "staining", "of", "partially", "broken", "cotyledon", "cells", ",", "SGs", ",", "or", "cotyledon", "sections", ".", "Cotyledon", "cells", ",", "SGs", ",", "and", "sections", "were", "prepared", "from", "day", "3", "attached", "or", "detached", "cotyledons", "and", "stained", "with", "LysoTracker", "red", "as", "described", "in", "Materials", "and", "methods", ".", "(", "A", ")", "Differential", "interface", "-", "contrast", "image", "of", "a", "broken", "cell", ".", "(", "B", ")", "Fluorescent", "image", "of", "A", ".", "(", "C", ")", "Differential", "interface", "-", "contrast", "image", "of", "a", "broken", "cell", ".", "(", "D", ")", "Fluorescent", "image", "of", "C", ".", "(", "E", ")", "Differential", "interface", "-", "contrast", "image", "of", "cells", "of", "a", "section", "from", "attached", "cotyledons", ".", "(", "F", ")", "Fluorescent", "image", "of", "E", ".", "(", "G", ")", "Magnified", "image", "of", "E", ".", "(", "H", ")", "Magnified", "image", "of", "F", ".", "(", "I", ")", "Differential", "interface", "-", "contrast", "image", "of", "an", "SG", ".", "(", "J", ")", "Fluorescent", "image", "of", "I", ".", "(", "K", ")", "Differential", "interface", "-", "contrast", "image", "of", "an", "SG", ".", "(", "L", ")", "Fluorescent", "image", "of", "K", ".", "(", "M", ")", "Differential", "interface", "-", "contrast", "image", "of", "cells", "of", "a", "section", "from", "detached", "cotyledons", ".", "(", "N", ")", "Fluorescent", "image", "of", "M", ".", "(", "O", ")", "Magnified", "image", "of", "M", ".", "(", "P", ")", "Magnified", "image", "of", "O", ".", "Bars", ":", "(", "A", "-", "D", ",", "G", "-", "L", ",", "O", ",", "and", "P", ")", "20", "μm", ";", "(", "E", ",", "F", ",", "M", ",", "and", "N", ")", "50", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5.LysoTracker red staining of partially broken cotyledon cells, SGs, or cotyledon sections. Cotyledon cells, SGs, and sections were prepared from day 3 attached or detached cotyledons and stained with LysoTracker red as described in Materials and methods. (A) Differential interface-contrast image of a broken cell. (B) Fluorescent image of A. (C) Differential interface-contrast image of a broken cell. (D) Fluorescent image of C. (E) Differential interface-contrast image of cells of a section from attached cotyledons. (F) Fluorescent image of E. (G) Magnified image of E. (H) Magnified image of F. (I) Differential interface-contrast image of an SG. (J) Fluorescent image of I. (K) Differential interface-contrast image of an SG. (L) Fluorescent image of K. (M) Differential interface-contrast image of cells of a section from detached cotyledons. (N) Fluorescent image of M. (O) Magnified image of M. (P) Magnified image of O. Bars: (A-D, G-L, O, and P) 20 μm; (E, F, M, and N) 50 μm."}
{"words": ["Figure", "6", ".", "Electron", "micrographs", "showing", "autophagosome", "-", "mediated", "autophagy", "in", "attached", "(", "A", "-", "C", ")", "and", "detached", "(", "D", "and", "E", ")", "cotyledon", "cells", ".", "(", "A", ")", "Two", "autophagosomes", "containing", "cytoplasm", "were", "observed", ".", "Mitochondria", "and", "the", "cytoplasm", "appeared", "to", "be", "enclosed", "with", "an", "ER", "-", "like", "double", "membrane", ".", "(", "B", ")", "An", "autophagosome", "containing", "mitochondria", "and", "cytoplasm", "was", "fused", "with", "LV", "(", "arrowheads", ")", ".", "(", "C", ")", "Autophagic", "body", "containing", "mitochondria", "was", "found", "in", "LV", ".", "(", "D", ")", "An", "autophagosome", "containing", "mitochondria", "and", "cytoplasm", "was", "observed", ".", "The", "PSV", "was", "not", "converted", "into", "the", "LV", ".", "(", "E", ")", "Autophagic", "body", "was", "observed", "in", "the", "PSV", "of", "detached", "cotyledon", "cells", ".", "AB", ",", "autophagic", "body", ";", "AP", ",", "autophagosome", ";", "ER", ",", "endoplasmic", "reticulum", ";", "LV", ",", "lytic", "vacuole", ";", "Mt", ",", "mitochondrion", ";", "PSV", ",", "protein", "storage", "vacuole", ";", "SG", ",", "starch", "granule", ".", "Bars", ",", "200", "nm", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6.Electron micrographs showing autophagosome-mediated autophagy in attached (A-C) and detached (D and E) cotyledon cells. (A) Two autophagosomes containing cytoplasm were observed. Mitochondria and the cytoplasm appeared to be enclosed with an ER-like double membrane. (B) An autophagosome containing mitochondria and cytoplasm was fused with LV (arrowheads). (C) Autophagic body containing mitochondria was found in LV. (D) An autophagosome containing mitochondria and cytoplasm was observed. The PSV was not converted into the LV. (E) Autophagic body was observed in the PSV of detached cotyledon cells. AB, autophagic body; AP, autophagosome; ER, endoplasmic reticulum; LV, lytic vacuole; Mt, mitochondrion; PSV, protein storage vacuole; SG, starch granule. Bars, 200 nm."}
{"words": ["Figure", "1E", "The", "representative", "images", "of", "IF", "-", "IHC", "staining", "of", "E14", ".", "5", "embryonic", "brains", "with", "antibodies", "against", "Iba", "-", "1", "(", "green", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "200", "μm", ".", "F", "Quantification", "of", "numbers", "of", "Iba", "-", "1", "+", "cells", "on", "the", "meningeal", "regions", ".", "Mock", "n", "=", "5", ";", "ZIKV", "n", "=", "7", "embryos", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "G", "The", "representative", "images", "of", "IF", "-", "IHC", "staining", "of", "choroid", "plexus", "of", "E14", ".", "5", "embryonic", "brains", "with", "antibodies", "against", "Iba", "-", "1", "(", "green", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "H", "Quantification", "of", "total", "number", "of", "Iba", "-", "1", "+", "cells", "per", "ChP", "area", ".", "I", "Percentage", "of", "Iba", "-", "1", "+", "cells", "on", "the", "surface", "of", "ChP", ".", "J", "Percentage", "of", "round", "-", "shaped", "Iba", "-", "1", "+", "cells", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "Mock", "n", "=", "5", ";", "ZIKV", "n", "=", "6", "biological", "replicatesK", "The", "representative", "images", "of", "IF", "-", "IHC", "staining", "of", "choroid", "plexus", "of", "E14", ".", "5", "embryonic", "brains", "with", "antibodies", "against", "Iba", "-", "1", "(", "green", ")", ",", "CD68", "(", "red", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "L", "Percentage", "of", "CD68", "+", ";", "Iba", "-", "1", "+", "cells", "out", "of", "total", "Iba", "-", "1", "+", "cells", ".", "Data", "information", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "All", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1E The representative images of IF-IHC staining of E14.5 embryonic brains with antibodies against Iba-1 (green) and DAPI (blue). Scale bar, 200 μm. F Quantification of numbers of Iba-1+ cells on the meningeal regions. Mock n=5; ZIKV n=7 embryos. Data information: *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001, two-tailed unpaired t-test. All data are presented as mean ± SEM.G The representative images of IF-IHC staining of choroid plexus of E14.5 embryonic brains with antibodies against Iba-1 (green) and DAPI (blue). Scale bar, 50 μm. H Quantification of total number of Iba-1+ cells per ChP area. I Percentage of Iba-1+ cells on the surface of ChP. J Percentage of round-shaped Iba-1+ cells. Data information: *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001, two-tailed unpaired t-test. All data are presented as mean ± SEM. Mock n=5; ZIKV n=6 biological replicatesK The representative images of IF-IHC staining of choroid plexus of E14.5 embryonic brains with antibodies against Iba-1 (green), CD68 (red) and DAPI (blue). Scale bar, 50 μm. L Percentage of CD68+; Iba-1+ cells out of total Iba-1+ cells. Data information: *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.0001, two-tailed unpaired t-test. All data are presented as mean ± SEM. "}
{"words": ["Figure", "2B", "Representative", "animal", "tracks", "in", "the", "sociability", "test", ".", "C", "Percentage", "of", "time", "the", "subject", "mice", "spent", "in", "each", "chamber", "in", "the", "sociability", "session", "of", "three", "-", "chamber", "test", ".", "Mock", "(", "n", "=", "11", ")", "stranger", "1", "(", "S1", ")", "chamber", "vs", ".", "empty", "(", "E", ")", "chamber", ";", "ZIKV", "(", "n", "=", "16", ")", "stranger", "1", "chamber", "vs", ".", "empty", "chamber", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "post", "hoc", "test", ".", "D", "Quantification", "of", "time", "spent", "investigating", "the", "stranger", "mouse", "and", "empty", "cage", "during", "sociability", "session", ".", "Mock", "(", "n", "=", "11", ")", "sniffing", "time", "at", "stranger", "1", "mouse", "vs", ".", "empty", "cup", ",", "ZIKV", "(", "n", "=", "16", ")", "sniffing", "time", "at", "stranger", "1", "mouse", "vs", ".", "empty", "cup", ".", "E", "Preference", "indices", "in", "sociability", ".", "Mock", "(", "n", "=", "11", ")", "vs", ".", "ZIKV", "(", "n", "=", "16", ")", ".", "F", "Representative", "animal", "tracks", "in", "the", "social", "memory", "test", ".", "G", "Percentage", "of", "time", "the", "subject", "mice", "spent", "in", "each", "in", "the", "social", "memory", "session", ".", "Mock", "(", "n", "=", "11", ")", "stranger", "1", "(", "S1", ")", "chamber", "vs", ".", "stranger", "2", "(", "S2", ")", "chamber", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "ZIKV", "(", "n", "=", "16", ")", "stranger", "1", "chamber", "vs", ".", "stranger", "2", "chamber", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "post", "hoc", "test", ".", "H", "Quantification", "of", "time", "spent", "investigating", "the", "familiar", "mouse", "and", "novel", "stranger", "mouse", "during", "social", "novelty", "session", ".", "Mock", "(", "n", "=", "11", ")", "sniffing", "time", "at", "stranger", "1", "vs", ".", "stranger", "2", "mouse", ";", "ZIKV", "(", "n", "=", "16", ")", "sniffing", "time", "at", "stranger", "1", "vs", ".", "stranger", "2", "mouse", ".", "I", "Preference", "indices", "in", "the", "social", "novelty", "session", "of", "the", "three", "-", "chamber", "test", ".", "Mock", "(", "n", "=", "11", ")", "vs", ".", "ZIKV", "(", "n", "=", "16", ")", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "were", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", "unless", "described", "otherwise", ";", "n", "represent", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B Representative animal tracks in the sociability test. C Percentage of time the subject mice spent in each chamber in the sociability session of three-chamber test. Mock (n=11) stranger 1 (S1) chamber vs. empty (E) chamber; ZIKV (n=16) stranger 1 chamber vs. empty chamber; one-way ANOVA with Bonferroni post hoc test. D Quantification of time spent investigating the stranger mouse and empty cage during sociability session. Mock (n=11) sniffing time at stranger 1 mouse vs. empty cup, ZIKV (n=16) sniffing time at stranger 1 mouse vs. empty cup. E Preference indices in sociability. Mock (n=11) vs. ZIKV (n=16). F Representative animal tracks in the social memory test. G Percentage of time the subject mice spent in each in the social memory session. Mock (n=11) stranger 1 (S1) chamber vs. stranger 2 (S2) chamber, p< 0.0001; ZIKV (n=16) stranger 1 chamber vs. stranger 2 chamber; one-way ANOVA with Bonferroni post hoc test. H Quantification of time spent investigating the familiar mouse and novel stranger mouse during social novelty session. Mock (n=11) sniffing time at stranger 1 vs. stranger 2 mouse; ZIKV (n=16) sniffing time at stranger 1 vs. stranger 2 mouse. I Preference indices in the social novelty session of the three-chamber test. Mock (n=11) vs. ZIKV (n=16). Data information: All data were presented as mean ± SEM. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001, two-tailed unpaired t-test unless described otherwise; n represent biological replicates."}
{"words": ["Figure", "3B", "Quantitation", "of", "sEPSC", "frequency", "mPFC", "from", "pyramidal", "neurons", "in", "mPFC", ".", "C", "Quantitation", "of", "sEPSC", "amplitude", "of", "mPFC", "pyramidal", "neurons", ".", "Mock", ",", "n", "=", "14", "neurons", "from", "4", "mice", ";", "ZIKV", ",", "n", "=", "15", "neurons", "from", "5", "mice", "in", "B", "and", "C", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "collected", "from", "PL", "and", "IL", "regions", "of", "mPFC", ",", "and", "were", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", "unless", "described", "otherwise", ".", "E", "Quantifications", "of", "sIPSC", "frequency", "from", "pyramidal", "neurons", "in", "mPFC", ".", "F", "Quantifications", "of", "sIPSC", "amplitude", "of", "mPFC", "pyramidal", "neurons", ".", "Mock", ",", "n", "=", "14", "neurons", "from", "5", "mice", ";", "ZIKV", ",", "n", "=", "18", "neurons", "from", "6", "mice", "in", "E", "and", "F", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "collected", "from", "PL", "and", "IL", "regions", "of", "mPFC", ",", "and", "were", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", "unless", "described", "otherwise", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B Quantitation of sEPSC frequency mPFC from pyramidal neurons in mPFC. C Quantitation of sEPSC amplitude of mPFC pyramidal neurons. Mock, n=14 neurons from 4 mice; ZIKV, n= 15 neurons from 5 mice in B and C. Data information: Data were collected from PL and IL regions of mPFC, and were presented as mean ± SEM. *p<0.05, **p<0.01. Two-tailed unpaired t-test unless described otherwise.E Quantifications of sIPSC frequency from pyramidal neurons in mPFC. F Quantifications of sIPSC amplitude of mPFC pyramidal neurons. Mock, n=14 neurons from 5 mice; ZIKV, n= 18 neurons from 6 mice in E and F. Data information: Data were collected from PL and IL regions of mPFC, and were presented as mean ± SEM. *p<0.05, **p<0.01. Two-tailed unpaired t-test unless described otherwise."}
{"words": ["Figure", "4A", "Representative", "images", "of", "PV", "+", ",", "SST", "+", "and", "CAL", "+", "cells", "in", "the", "prelimbic", "(", "PL", ",", "upper", "panel", ")", "and", "infralimbic", "(", "IL", ",", "lower", "panel", ")", "cortex", ".", "Scale", "bars", ":", "200", "μm", ".", "H", "IHC", "staining", "of", "mPFC", "stained", "with", "antibodies", "against", "vGLUT1", ".", "Scale", "bars", ",", "5", "μm", ".", "I", "Quantification", "of", "vGLUT1", "+", "puncta", "numbers", "out", "of", "100", "μm2", "region", ".", "Mock", ",", "n", "=", "4", "mice", ";", "ZIKV", ",", "n", "=", "4", "mice", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", "unless", "described", "otherwise", ".", "J", "IHC", "staining", "of", "mPFC", "stained", "with", "antibodies", "against", "vGAT", ".", "Scale", "bars", ",", "5", "μm", ".", "K", "Quantification", "of", "vGAT", "+", "puncta", "numbers", "out", "of", "100", "μm2", "region", ".", "Mock", ",", "n", "=", "4", "mice", ";", "ZIKV", ",", "n", "=", "4", "mice", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", "unless", "described", "otherwise", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A Representative images of PV+, SST+ and CAL+ cells in the prelimbic (PL, upper panel) and infralimbic (IL, lower panel) cortex. Scale bars: 200 μm.H IHC staining of mPFC stained with antibodies against vGLUT1. Scale bars, 5 μm. I Quantification of vGLUT1+ puncta numbers out of 100 μm2 region. Mock, n=4 mice; ZIKV, n=4 mice. Data information: All data are presented as mean ± SEM. *P<0.05, **P<0.01. Two-tailed unpaired t-test unless described otherwise.J IHC staining of mPFC stained with antibodies against vGAT. Scale bars, 5 μm. K Quantification of vGAT+ puncta numbers out of 100 μm2 region. Mock, n=4 mice; ZIKV, n=4 mice. Data information: All data are presented as mean ± SEM. *P<0.05, **P<0.01. Two-tailed unpaired t-test unless described otherwise. "}
{"words": ["Figure", "5B", "Representative", "confocal", "images", "of", "the", "vHIP", "stained", "with", "mCherry", "(", "red", ")", "and", "c", "-", "Fos", "(", "green", ")", ".", "C", "Quantification", "of", "mCherry", "and", "c", "-", "Fos", "double", "positive", "cells", "out", "of", "total", "mCherry", "-", "positive", "cells", "in", "the", "vHIP", "CA1", "regions", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "Mock", "(", "n", "=", "5", "mice", ")", "vs", ".", "ZIKV", "(", "n", "=", "5", "mice", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0013", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", "unless", "described", "otherwise", ".", "F", "Representative", "EPSC", "traces", "of", "the", "pyramidal", "neurons", "in", "the", "mPFC", ".", "G", "Quantification", "of", "EPSC", "amplitude", "of", "the", "pyramidal", "neurons", "in", "the", "mPFC", "(", "PL", "and", "IL", ")", ".", "Mock", "(", "n", "=", "17", "neurons", "from", "5", "mice", ")", "vs", ".", "ZIKV", "(", "n", "=", "19", "neurons", "from", "5", "mice", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0122", ".", "Data", "information", ":", "Data", "were", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", "unless", "described", "otherwise", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5B Representative confocal images of the vHIP stained with mCherry (red) and c-Fos (green). C Quantification of mCherry and c-Fos double positive cells out of total mCherry-positive cells in the vHIP CA1 regions. Scale bar, 50 μm. Mock (n= 5 mice) vs. ZIKV (n= 5 mice), p=0.0013. Data information: Data were presented as mean ± SEM. *P<0.05, **P<0.01, Two-tailed unpaired t-test unless described otherwise.F Representative EPSC traces of the pyramidal neurons in the mPFC. G Quantification of EPSC amplitude of the pyramidal neurons in the mPFC (PL and IL). Mock (n=17 neurons from 5 mice) vs. ZIKV (n=19 neurons from 5 mice), p=0.0122. Data information: Data were presented as mean ± SEM. *P<0.05, **P<0.01, Two-tailed unpaired t-test unless described otherwise. "}
{"words": ["Figure", "6B", "Representative", "examples", "of", "GFP", "-", "labeled", "presynaptic", "boutons", ".", "Scale", "bars", ":", "2", ".", "5", "μm", ".", "C", "Quantification", "of", "presynaptic", "bouton", "density", "and", "weighted", "size", "in", "the", "mPFC", "(", "PL", "and", "IL", ")", ".", "Mock", ":", "n", "=", "57", "axons", "from", "6", "mice", ";", "ZIKV", ":", "n", "=", "63", "axons", "from", "7", "mice", ".", "D", "Quantification", "of", "presynaptic", "bouton", "weighted", "size", "in", "the", "mPFC", "(", "PL", "and", "IL", ")", ".", "Mock", ":", "n", "=", "2974", "boutons", "from", "6", "mice", ";", "ZIKV", ":", "n", "=", "3486", "boutons", "from", "7", "mice", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "were", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", "unless", "described", "otherwise", ".", "H", "Comparisons", "of", "percentages", "of", "vHIP", "-", "innervated", "mPFC", "(", "PL", "and", "IL", ")", "neuron", "subtypes", ".", "Mock", ",", "n", "=", "4", "mice", ";", "ZIKV", ",", "n", "=", "7", "mice", ".", "P", "=", "0", ".", "5343", "in", "CaMKIIa", ",", "0", ".", "0117", "in", "PV", ",", "0", ".", "7491", "in", "CAL", ",", "0", ".", "4484", "in", "SST", ",", "0", ".", "1519", "in", "other", "uncharacterized", "neuron", "subtypes", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "were", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", "unless", "described", "otherwise", ".", "J", "Representative", "confocal", "images", "of", "CTB488", "-", "labeled", "tdTomato", "-", "positive", "neurons", "in", "the", "vHIP", ".", "White", "arrowheads", "indicate", "CTB488", "single", "positive", "neurons", ".", "Scale", "bars", ":", "200", "μm", ".", "K", "Quantification", "of", "the", "percentage", "of", "tdTomato", ";", "CTB488", "double", "-", "positive", "cells", "out", "of", "total", "CTB488", "-", "positive", "cells", ".", "Mock", ",", "n", "=", "7", "mice", ";", "ZIKV", ",", "n", "=", "7", "mice", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "were", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", "unless", "described", "otherwise", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6B Representative examples of GFP-labeled presynaptic boutons. Scale bars: 2.5 μm. C Quantification of presynaptic bouton density and weighted size in the mPFC (PL and IL). Mock: n= 57 axons from 6 mice; ZIKV: n= 63 axons from 7 mice. D Quantification of presynaptic bouton weighted size in the mPFC (PL and IL). Mock: n= 2974 boutons from 6 mice; ZIKV: n= 3486 boutons from 7 mice. Data information: All data were presented as mean ± SEM. *P<0.05, **P<0.01, Two-tailed unpaired t-test unless described otherwise.H Comparisons of percentages of vHIP-innervated mPFC (PL and IL) neuron subtypes. Mock, n=4 mice; ZIKV, n=7 mice. P= 0.5343 in CaMKIIa, 0.0117 in PV, 0.7491 in CAL, 0.4484 in SST, 0.1519 in other uncharacterized neuron subtypes. Data information: All data were presented as mean ± SEM. *P<0.05, **P<0.01, Two-tailed unpaired t-test unless described otherwise.J Representative confocal images of CTB488-labeled tdTomato-positive neurons in the vHIP. White arrowheads indicate CTB488 single positive neurons. Scale bars: 200 μm. K Quantification of the percentage of tdTomato;CTB488 double-positive cells out of total CTB488-positive cells. Mock, n= 7 mice; ZIKV, n=7 mice. Data information: All data were presented as mean ± SEM. *P<0.05, **P<0.01, Two-tailed unpaired t-test unless described otherwise. "}
{"words": ["Figure", "7C", "Representative", "animal", "tracks", "in", "three", "-", "chamber", "test", ".", "D", "Discrimination", "indices", "of", "the", "social", "memory", "session", "of", "three", "-", "chamber", "test", ".", "mCherry", "mock", ",", "n", "=", "8", "mice", ";", "mCherry", "ZIKV", ",", "n", "=", "10", "mice", ";", "hM4Di", "ZIKV", "n", "=", "10", "mice", ",", "mCherry", "mock", "vs", ".", "mCherry", "ZIKV", "p", "=", "0", ".", "0041", ";", "mCherry", "ZIKV", "vs", ".", "hM4Di", "ZIKV", "p", "=", "0", ".", "0115", ";", "and", "mCherry", "mock", "vs", ".", "hM4Di", "ZIKV", "p", "=", "0", ".", "7076", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "post", "hoc", "test", ".", "E", "Representative", "confocal", "images", "of", "mCherry", "(", "red", ")", "and", "c", "-", "Fos", "(", "green", ")", "double", "-", "labeled", "cells", "in", "the", "vHIP", "CA1", "regions", ".", "Scale", "bars", ",", "50", "μm", ".", "F", ".", "Quantification", "of", "the", "percentage", "of", "c", "-", "fos", ";", "mCherry", "double", "positive", "cells", "out", "of", "total", "mCherry", "cells", ".", "mCherry", "mock", ",", "n", "=", "6", "mice", ";", "mCherry", "ZIKV", ",", "n", "=", "4", "mice", ";", "hM4Di", "ZIKV", "n", "=", "6", "mice", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "post", "hoc", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7C Representative animal tracks in three-chamber test. D Discrimination indices of the social memory session of three-chamber test. mCherry mock, n=8 mice; mCherry ZIKV, n=10 mice; hM4Di ZIKV n=10 mice, mCherry mock vs. mCherry ZIKV p=0.0041; mCherry ZIKV vs. hM4Di ZIKV p=0.0115; and mCherry mock vs. hM4Di ZIKV p=0.7076. Data information: All data are presented as mean ± SEM. *P < 0.05, **P < 0.01, ****P < 0.0001, one-way ANOVA with Tukey post hoc test.E Representative confocal images of mCherry (red) and c-Fos (green) double-labeled cells in the vHIP CA1 regions. Scale bars, 50 μm. F. Quantification of the percentage of c-fos;mCherry double positive cells out of total mCherry cells. mCherry mock, n=6 mice; mCherry ZIKV, n=4 mice; hM4Di ZIKV n=6 mice. Data information: All data are presented as mean ± SEM. *P < 0.05, **P < 0.01, ****P < 0.0001, one-way ANOVA with Tukey post hoc test. "}
{"words": ["Figure", "3", "Therapeutic", "leads", "generated", "using", "PDN", "were", "directly", "tested", "for", "survival", "benefit", "using", "a", "murine", "model", "of", "endotoxemia", ".", "Select", "compounds", "were", "injected", "24", "hours", "before", "and", "on", "the", "day", "of", "LPS", "administration", ",", "using", "routes", "and", "doses", "specified", "in", "the", "methods", ".", "C57bl", "/", "6", "female", "mice", "were", "injected", "with", "a", "high", "-", "lethality", "dose", "of", "E", ".", "coli", "LPS", "(", "38", "-", "40", "μg", "/", "g", ")", "followed", "by", "a", "subcutaneous", "injection", "of", "sterile", "saline", ".", "Significant", "differences", "in", "concentration", "between", "drug", "and", "vehicle", "-", "treated", "pre", "-", "and", "post", "-", "pubertal", "mice", "are", "labeled", "with", "*", "*", "*", "*", "(", "p", "<", "0", ".", "0001", ")", ",", "*", "*", "*", "(", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "(", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ",", "or", "*", "(", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "Percent", "survival", "was", "compared", "using", "a", "log", "rank", "Mantel", "Cox", "test"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3 Therapeutic leads generated using PDN were directly tested for survival benefit using a murine model of endotoxemia. Select compounds were injected 24 hours before and on the day of LPS administration, using routes and doses specified in the methods. C57bl/6 female mice were injected with a high-lethality dose of E. coli LPS (38-40 μg/g) followed by a subcutaneous injection of sterile saline. Significant differences in concentration between drug and vehicle-treated pre- and post-pubertal mice are labeled with **** (p<0.0001), *** (p<0.001, ** (p<0.01), or * (p<0.05). Percent survival was compared using a log rank Mantel Cox test "}
{"words": ["Figure", "1D", ")", "In", "the", "6", "months", "old", "p32cKO", "heart", ",", "p62", "and", "multi", "-", "ubiquitin", "staining", "patterns", "were", "co", "-", "localized", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "µm", ".", "E", ")", "In", "the", "6", "months", "old", "p32cKO", "heart", ",", "the", "staining", "patterns", "of", "p62", "and", "the", "mitochondrial", "marker", "protein", ",", "pyruvate", "dehydrogenase", "(", "PDH", ")", ",", "were", "co", "-", "localized", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "µm", ".", "(", "F", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "ubiquitinated", "proteins", "using", "an", "anti", "-", "multi", "-", "ubiquitin", "antibody", "in", "the", "6", "months", "old", "WT", "and", "p32cKO", "heart", "(", "n", "=", "4", "mice", "per", "group", ")", ".", "Error", "bars", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "performed", "on", "WT", "vs", "p32cKO", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1D) In the 6 months old p32cKO heart, p62 and multi-ubiquitin staining patterns were co-localized. Scale bar, 5 µm. E) In the 6 months old p32cKO heart, the staining patterns of p62 and the mitochondrial marker protein, pyruvate dehydrogenase (PDH), were co-localized. Scale bar, 5 µm.(F) Western blot analysis of ubiquitinated proteins using an anti-multi-ubiquitin antibody in the 6 months old WT and p32cKO heart (n = 4 mice per group). Error bars are presented as mean ± SD. Student's t-test was performed on WT vs p32cKO, ***p < 0.005."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "B", ")", "Autofluorescence", "showing", "lipofuscin", "localization", "around", "the", "nucleus", "in", "the", "6", "months", "old", "p32cKO", "heart", ".", "Tissues", "were", "excited", "at", "a", "wavelength", "of", "540", "(", "upper", "panel", ")", "or", "470", "(", "lower", "panel", ")", "and", "emission", "spectra", "were", "collected", "with", "a", "confocal", "microscope", "at", "wavelengths", "(", "band", "path", ")", "of", "580", "-", "630", "nm", "(", "upper", "panel", ")", "or", "510", "-", "560", "nm", "(", "lower", "panel", ")", ".", "Enlarged", "view", "of", "the", "white", "squares", "is", "shown", "right", ".", "Scale", "bars", ",", "20", "µm", ".", "The", "quantification", "of", "the", "ratio", "of", "autofluorescence", "of", "DAPI", "staining", "is", "presented", "in", "the", "plot", "in", "the", "right", "panel", "as", "mean", "±", "SEM", "(", "three", "months", "old", "mice", ",", "n", "=", "11", ";", "6", "months", "old", "mice", ",", "n", "=", "9", "-", "14", ",", "9", "months", "old", "mice", ",", "n", "=", "9", "-", "15", ",", "12", "months", "old", "mice", ",", "n", "=", "11", "-", "21", ")", ".", "Statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ".", "(", "D", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "Lamp2", "in", "the", "6", "months", "old", "WT", "and", "p32cKO", "hearts", ".", "Quantification", "is", "shown", "in", "the", "lower", "panel", "(", "n", "=", "4", "mice", "per", "group", ")", ".", "GAPDH", "was", "used", "as", "an", "internal", "control", ".", "Error", "bars", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "performed", "on", "WT", "vs", "p32cKO", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(B) Autofluorescence showing lipofuscin localization around the nucleus in the 6 months old p32cKO heart. Tissues were excited at a wavelength of 540 (upper panel) or 470 (lower panel) and emission spectra were collected with a confocal microscope at wavelengths (band path) of 580-630 nm (upper panel) or 510-560 nm (lower panel). Enlarged view of the white squares is shown right. Scale bars, 20 µm. The quantification of the ratio of autofluorescence of DAPI staining is presented in the plot in the right panel as mean ± SEM (three months old mice, n = 11; 6 months old mice, n = 9-14, 9 months old mice, n = 9-15, 12 months old mice, n = 11-21). Statistical significance was assessed by Student's t-test, ***p < 0.005.(D) Western blot analysis of Lamp2 in the 6 months old WT and p32cKO hearts. Quantification is shown in the lower panel (n = 4 mice per group). GAPDH was used as an internal control. Error bars are presented as mean ± SD. Student's t-test was performed on WT vs p32cKO, ***p < 0.005."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "LC", "-", "MS", "/", "MS", "metabolomic", "analysis", "of", "NAD", "+", ",", "NADH", ",", "NADP", "+", ",", "nicotinamide", "and", "NAAD", "in", "the", "6", "months", "old", "WT", "and", "p32cKO", "hearts", ".", "NAD", "+", "and", "NADP", "+", "showed", "significantly", "different", "levels", "between", "WT", "and", "p32cKO", "hearts", "(", "n", "=", "12", ")", ".", "Error", "bars", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "performed", "on", "WT", "vs", "p32cKO", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0002", ".", "(", "B", ")", "Real", "-", "time", "PCR", "analysis", "of", "RNA", "expression", "of", "NAD", "-", "synthesizing", "enzymes", "in", "the", "6", "months", "old", "WT", "and", "p32cKO", "hearts", ".", "Error", "bars", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "performed", "on", "WT", "mice", "vs", "p32cKO", "mice", "(", "n", "=", "6", ")", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "The", "right", "panel", "shows", "the", "NAD", "synthesis", "pathway", "and", "mRNA", "expression", "levels", "are", "indicated", "by", "red", "arrows", ".", "NAM", ":", "nicotinamide", ",", "NA", ":", "nicotinic", "acid", ",", "QA", ":", "quinolic", "acid", ",", "NMN", ":", "nicotinamide", "mononucleotide", ".", "(", "G", ")", "Nmnat3", "mRNA", "expression", "in", "3T3", "-", "L1", "cells", "after", "1", "mM", "CAP", "treatment", "for", "72", "h", ".", "The", "HIF1α", "inhibitor", "(", "20", "or", "50", "µM", ")", "was", "added", "2", "h", "before", "the", "CAP", "treatment", ".", "Error", "bars", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "performed", "on", "WT", "cells", "vs", "WT", "cells", "treated", "CAP", "and", "(", "or", ")", "HIF1α", "inhibitor", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "(", "I", ")", "Nmnat3", "mRNA", "expression", "in", "3T3", "-", "L1", "cells", "after", "150", "µM", "CoCl2", "treatment", "for", "72", "h", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Error", "bars", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) LC-MS/MS metabolomic analysis of NAD+, NADH, NADP+, nicotinamide and NAAD in the 6 months old WT and p32cKO hearts. NAD+ and NADP+ showed significantly different levels between WT and p32cKO hearts (n = 12). Error bars are presented as mean ± SD. Student's t-test was performed on WT vs p32cKO, **p < 0.001, ***p < 0.0002.(B) Real-time PCR analysis of RNA expression of NAD-synthesizing enzymes in the 6 months old WT and p32cKO hearts. Error bars are presented as mean ± SD. Student's t-test was performed on WT mice vs p32cKO mice (n = 6), ***p < 0.005, *p < 0.05. The right panel shows the NAD synthesis pathway and mRNA expression levels are indicated by red arrows. NAM: nicotinamide, NA: nicotinic acid, QA: quinolic acid, NMN: nicotinamide mononucleotide.(G) Nmnat3 mRNA expression in 3T3-L1 cells after 1 mM CAP treatment for 72 h. The HIF1α inhibitor (20 or 50 µM) was added 2 h before the CAP treatment. Error bars are presented as mean ± SD of three independent experiments. Student's t-test was performed on WT cells vs WT cells treated CAP and (or) HIF1α inhibitor,**p < 0.01, *p < 0.05.(I) Nmnat3 mRNA expression in 3T3-L1 cells after 150 µM CoCl2 treatment for 72 h (n = 3). Error bars are presented as mean ± SD of three independent experiments. Statistical significance was assessed by Student's t-test, **p < 0.01."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Lysosomal", "acidification", "is", "impaired", "in", "p32KO", "MEFs", ".", "Representative", "images", "of", "WT", "and", "p32KO", "MEFs", ",", "stained", "with", "dextran", "-", "Oregon", "Green", "(", "488", ")", "and", "dextran", "-", "TMRM", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "µm", ".", "Addition", "of", "1", "mM", "NMN", "for", "48", "h", "to", "p32KO", "MEFs", "rescued", "lysosomal", "acidification", ",", "and", "1", "mM", "CAP", "treatment", "of", "WT", "MEFs", "for", "48", "h", "decreased", "lysosomal", "acidification", ".", "Dextran", "-", "Oregon", "Green", "is", "quenched", "under", "acidic", "pH", ",", "and", "thus", "an", "increased", "green", ":", "red", "ratio", "denotes", "impaired", "lysosomal", "acidification", ".", "The", "average", "±", "SEM", "of", "the", "green", ":", "red", "ratio", "in", "at", "least", "30", "cells", "in", "two", "independent", "experiments", "is", "presented", "in", "the", "plot", "(", "normalized", "to", "WT", "green", "/", "red", "=", "1", ")", ".", "Statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "E", ")", "Nmnat3", "(", "v1", ")", "overexpression", "in", "p32KO", "MEFs", "rescued", "lysosomal", "function", ".", "LysoTracker", "Red", "-", "stained", "p32KO", "MEFs", "were", "quantified", "by", "flow", "cytometry", ".", "Error", "bars", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "of", "4", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Lysosomal acidification is impaired in p32KO MEFs. Representative images of WT and p32KO MEFs, stained with dextran-Oregon Green (488) and dextran-TMRM. Scale bar, 5 µm. Addition of 1 mM NMN for 48 h to p32KO MEFs rescued lysosomal acidification, and 1 mM CAP treatment of WT MEFs for 48 h decreased lysosomal acidification. Dextran-Oregon Green is quenched under acidic pH, and thus an increased green:red ratio denotes impaired lysosomal acidification. The average ± SEM of the green:red ratio in at least 30 cells in two independent experiments is presented in the plot (normalized to WT green/red = 1). Statistical significance was assessed by Student's t-test, *p < 0.05, ***p < 0.001.(E) Nmnat3(v1) overexpression in p32KO MEFs rescued lysosomal function. LysoTracker Red-stained p32KO MEFs were quantified by flow cytometry. Error bars are presented as mean ± SEM of 4 independent experiments. Statistical significance was assessed by Student's t-test, ***p < 0.001."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "WT", "MEFs", "were", "stained", "with", "dextran", "-", "Oregon", "Green", "and", "dextran", "-", "TMRM", "to", "examine", "lysosomal", "acidification", "after", "10", "nM", "FK866", "treatment", ".", "FK866", "decreased", "lysosomal", "acidification", ",", "which", "was", "rescued", "by", "1", "mM", "NMN", "pretreatment", ".", "The", "stained", "MEFs", "were", "quantified", "using", "a", "microscope", "(", "BZ", "-", "X800", ",", "KEYENCE", ")", ".", "Error", "bars", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "F", ")", "To", "examine", "autophagosome", "and", "autolysosome", "formation", ",", "we", "used", "DAPRed", ",", "which", "indicates", "autophagosomes", ",", "and", "DALGreen", ",", "which", "indicates", "autolysosomes", ".", "After", "starvation", ",", "co", "-", "localization", "of", "both", "staining", "agents", "was", "observed", "upon", "FK866", "or", "bafilomycin", "A", "treatment", "in", "WT", "MEF", "cells", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "µm", ".", "Quantification", "is", "shown", "on", "the", "right", ".", "Error", "bars", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) WT MEFs were stained with dextran-Oregon Green and dextran-TMRM to examine lysosomal acidification after 10 nM FK866 treatment. FK866 decreased lysosomal acidification, which was rescued by 1 mM NMN pretreatment. The stained MEFs were quantified using a microscope (BZ-X800, KEYENCE). Error bars are presented as mean ± SEM of three independent experiments. Statistical significance was assessed by one-way ANOVA, ***p < 0.001.(F) To examine autophagosome and autolysosome formation, we used DAPRed, which indicates autophagosomes, and DALGreen, which indicates autolysosomes. After starvation, co-localization of both staining agents was observed upon FK866 or bafilomycin A treatment in WT MEF cells. Scale bars, 10 µm. Quantification is shown on the right. Error bars are presented as mean ± SEM of three independent experiments. Statistical significance was assessed by one-way ANOVA, ***p < 0.001."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "D", ")", "After", "adding", "various", "concentrations", "of", "NaCl", "to", "the", "lysosomal", "fraction", "of", "WT", "MEFs", ",", "the", "membrane", "pellet", "(", "bound", ")", "and", "supernatant", "(", "free", ")", "were", "subjected", "to", "immunoblotting", "with", "GAPDH", "and", "PGK1", "antibodies", ".", "(", "I", ")", "After", "addition", "of", "GAP", ",", "NAD", "and", "Pi", ",", "ATP", "production", "in", "the", "lysosomal", "fraction", "isolated", "by", "MAG10", "was", "measured", "using", "a", "luciferin", "/", "luciferase", "kit", ".", "Iodoacetate", "(", "IA", ";", "4", "µM", ")", "was", "used", "to", "inhibit", "GAPDH", "activity", ".", "Three", "independent", "experiments", "were", "performed", ".", "Error", "bars", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "002", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(D) After adding various concentrations of NaCl to the lysosomal fraction of WT MEFs, the membrane pellet (bound) and supernatant (free) were subjected to immunoblotting with GAPDH and PGK1 antibodies.(I) After addition of GAP, NAD and Pi, ATP production in the lysosomal fraction isolated by MAG10 was measured using a luciferin/luciferase kit. Iodoacetate (IA; 4 µM) was used to inhibit GAPDH activity. Three independent experiments were performed. Error bars are presented as mean ± SEM of three independent experiments. Statistical significance was assessed by one-way ANOVA, **p < 0.002."}
{"words": ["Figure", "1C", "Representative", "plot", "showing", "gating", "strategy", "for", "CD4", "+", "T", "cell", "phenotypes", ".", "Effector", "Memory", "RA", "(", "TEMRA", ")", ":", "CD45RA", "+", "CD62L", "-", ";", "Effector", "Memory", "(", "EM", ")", ":", "CD45RA", "-", "CD62L", "-", ";", "Central", "Memory", "(", "CM", ")", ":", "CD45RA", "-", "CD62L", "+", ";", "Stem", "Cell", "Memory", "(", "TSCM", ")", ":", "CD45RA", "+", "CD62L", "+", ".", "D", "Percentage", "of", "GFP", "+", "cells", "within", "T", "cell", "subpopulations", "17", "days", "after", "CD40LG", "editing", "of", "healthy", "male", "donor", "(", "HD", ";", "n", "=", "11", ")", "or", "patient", "(", "Pt", ";", "n", "=", "1", ")", "derived", "CD4", "+", "T", "cells", ",", "measured", "by", "FACS", "analysis", ".", "Median", "±", "IQR", ".", "E", "Percentage", "of", "GFP", "+", "cells", "or", "HDR", "in", "T", "cells", "from", "(", "D", ")", ".", "Median", "±", "IQR", ".", "F", "Population", "composition", "in", "male", "HD", "or", "patient", "derived", "untreated", "(", "n", "=", "9", "HD", "UT", ",", "1", "Pt", "UT", ")", "or", "bulk", "edited", "T", "cells", "(", "Treat", ")", "from", "(", "D", ")", ".", "For", "each", "subpopulation", ",", "the", "comparisons", "between", "HD", "Treated", "vs", "UT", "were", "performed", "by", "using", "LME", "models", ",", "with", "random", "effects", "defined", "to", "account", "for", "the", "same", "donor", "and", "for", "different", "number", "of", "replicates", "per", "donor", "within", "group", ".", "All", "p", "-", "values", "were", "adjusted", "with", "Bonferroni", "'", "s", "correction", "to", "account", "for", "multiple", "testing", ".", "In", "all", "LME", "models", ",", "the", "percentages", "were", "used", "in", "square", "root", "scale", "to", "meet", "the", "assumption", "of", "normality", "of", "the", "residuals", "of", "the", "model", ".", "Mean", "±", "SEM", ".", "G", "Percentage", "of", "TCRBV", "families", "detected", "by", "spectratyping", ".", "UT", ",", "sorted", "edited", "(", "GFP", "+", ")", ",", "sorted", "non", "-", "edited", "(", "GFP", "-", ")", "CD4", "+", "T", "cells", "derived", "from", "male", "HD", "(", "n", "=", "1", ")", "or", "patient", "(", "Pt", ";", "n", "=", "1", ")", "were", "analyzed", "at", "17", "days", "after", "CD40LG", "editing", ".", "H", "Time", "course", "of", "CD40L", "surface", "expression", "after", "PMA", "/", "Ionomycin", "stimulation", "measured", "by", "Relative", "Fluorescence", "Intensity", "(", "RFI", ",", "normalized", "to", "T0", ";", "left", ")", "and", "percentage", "(", "right", ")", "on", "UT", "(", "n", "=", "3", ")", ",", "edited", "(", "GFP", "+", ")", "or", "unedited", "(", "GFP", "-", ")", "HD", "or", "Pt", "CD4", "+", "T", "cells", "from", "(", "D", ")", "(", "n", "=", "9", "HD", ",", "1", "Pt", ")", ".", "Longitudinal", "comparisons", "between", "HD", "GFP", "+", "vs", "GFP", "-", "were", "performed", "with", "an", "LME", "model", ",", "accounting", "for", "multiple", "donors", "and", "separately", "for", "RFI", "and", "%", "CD40L", "+", "cells", "(", "see", "Appendix", "Supplementary", "Statistical", "Methods", ")", ".", "The", "reported", "statistical", "comparisons", "refer", "only", "to", "8", "hours", "time", "-", "point", "(", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "and", "*", "p", "=", "0", ".", "0450", ",", "respectively", ")", ".", "#", "measured", "on", "the", "small", "fraction", "of", "CD40L", "+", "cells", ".", "Median", "±", "IQR", ".", "I", "Representative", "plots", "showing", "CD40L", "and", "GFP", "expression", "in", "UT", "or", "bulk", "edited", "(", "Tretated", ")", "CD4", "+", "T", "cells", "derived", "from", "male", "HD", "or", "Pt", "from", "(", "D", ")", "at", "8", "hr", "after", "PMA", "/", "Ionomycin", "stimulation", ".", "K", "Left", ":", "IgG", "positive", "spots", "resulting", "from", "B", "-", "T", "cell", "co", "-", "culture", ".", "Right", ":", "IgG", "+", "secreting", "B", "cells", ",", "evaluated", "by", "ELISPOT", "assay", ".", "B", "cells", "were", "isolated", "from", "PB", "of", "HD", "and", "co", "-", "cultured", "with", "male", "HD", "or", "Pt", "sorted", "GFP", "+", ",", "GFP", "-", "and", "UT", "T", "cells", ",", "resting", "(", "R", ")", "or", "stimulated", "with", "beads", "(", "B", ")", "or", "PMA", "/", "Ionomycin", "(", "PI", ")", ".", "B", "cells", "cultured", "alone", "(", "-", ")", "or", "in", "presence", "of", "sCD40L", "(", "+", ")", "were", "used", "as", "negative", "and", "positive", "controls", ",", "respectively", "(", "n", "=", "1", "for", "each", "group", ")", ".", "L", "Left", ":", "Histograms", "representing", "proliferation", "results", "from", "B", "-", "T", "cell", "co", "-", "culture", ".", "Right", ":", "Analysis", "of", "B", "cell", "proliferative", "capacity", "by", "Cell", "Trace", "dilution", "assay", "in", "allogeneic", "sorted", "B", "cells", "isolated", "from", "PB", "of", "HD", "and", "co", "-", "cultured", "with", "HD", "or", "Pt", "T", "cells", "from", "(", "K", ")", ".", "B", "cells", "cultured", "alone", "(", "-", ")", "or", "in", "presence", "of", "sCD40L", "(", "+", ")", "were", "used", "as", "negative", "and", "positive", "controls", ",", "respectively", "(", "n", "=", "2", "for", "each", "group", ")", ".", "Mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1C Representative plot showing gating strategy for CD4+ T cell phenotypes. Effector Memory RA (TEMRA): CD45RA+ CD62L-; Effector Memory (EM): CD45RA-CD62L-; Central Memory (CM): CD45RA-CD62L+; Stem Cell Memory (TSCM): CD45RA+ CD62L+.D Percentage of GFP+ cells within T cell subpopulations 17 days after CD40LG editing of healthy male donor (HD; n=11) or patient (Pt; n=1) derived CD4+ T cells, measured by FACS analysis. Median ± IQR.E Percentage of GFP+ cells or HDR in T cells from (D). Median ± IQR.F Population composition in male HD or patient derived untreated (n=9 HD UT, 1 Pt UT) or bulk edited T cells (Treat) from (D). For each subpopulation, the comparisons between HD Treated vs UT were performed by using LME models, with random effects defined to account for the same donor and for different number of replicates per donor within group. All p-values were adjusted with Bonferroni's correction to account for multiple testing. In all LME models, the percentages were used in square root scale to meet the assumption of normality of the residuals of the model. Mean ± SEM.G Percentage of TCRBV families detected by spectratyping. UT, sorted edited (GFP+), sorted non-edited (GFP-) CD4+ T cells derived from male HD (n=1) or patient (Pt; n=1) were analyzed at 17 days after CD40LG editing.H Time course of CD40L surface expression after PMA/Ionomycin stimulation measured by Relative Fluorescence Intensity (RFI, normalized to T0; left) and percentage (right) on UT (n=3), edited (GFP+) or unedited (GFP-) HD or Pt CD4+ T cells from (D) (n=9 HD, 1 Pt). Longitudinal comparisons between HD GFP+ vs GFP- were performed with an LME model, accounting for multiple donors and separately for RFI and %CD40L+ cells (see Appendix Supplementary Statistical Methods). The reported statistical comparisons refer only to 8 hours time-point (****p<0.0001 and *p=0.0450, respectively). #measured on the small fraction of CD40L+ cells. Median ± IQR.I Representative plots showing CD40L and GFP expression in UT or bulk edited (Tretated) CD4+ T cells derived from male HD or Pt from (D) at 8 hr after PMA/Ionomycin stimulation.K Left: IgG positive spots resulting from B-T cell co-culture. Right: IgG+ secreting B cells, evaluated by ELISPOT assay. B cells were isolated from PB of HD and co-cultured with male HD or Pt sorted GFP+, GFP- and UT T cells, resting (R) or stimulated with beads (B) or PMA/Ionomycin (PI). B cells cultured alone (-) or in presence of sCD40L (+) were used as negative and positive controls, respectively (n=1 for each group).L Left: Histograms representing proliferation results from B-T cell co-culture. Right: Analysis of B cell proliferative capacity by Cell Trace dilution assay in allogeneic sorted B cells isolated from PB of HD and co-cultured with HD or Pt T cells from (K). B cells cultured alone (-) or in presence of sCD40L (+) were used as negative and positive controls, respectively (n=2 for each group). Mean ± SEM."}
{"words": ["Figure", "2B", "Percentage", "of", "NGFR", "+", "cells", "or", "HDR", "at", "17", "days", "after", "CD40LG", "editing", "of", "male", "HD", "bulk", "edited", ",", "sorted", "NGFR", "+", "or", "sorted", "NGFR", "-", "CD4", "+", "T", "cells", "(", "n", "=", "7", "for", "each", "group", ")", ".", "Median", "±", "IQR", ".", "C", "Time", "course", "of", "CD40L", "surface", "expression", "after", "PMA", "/", "Ionomycin", "stimulation", "measured", "by", "RFI", "(", "normalized", "to", "T0", ")", "on", "UT", "(", "n", "=", "2", ")", ",", "edited", "(", "NGFR", "+", ")", "or", "unedited", "(", "NGFR", "-", ")", "HD", "or", "Pt", "derived", "CD4", "+", "T", "cells", "(", "n", "=", "4", "HD", ",", "1", "Pt", ")", ".", "Median", "±", "IQR", ".", "D", "Representative", "plots", "showing", "CD40L", "and", "NGFR", "expression", "in", "UT", "or", "bulk", "edited", "(", "Treated", ")", "CD4", "+", "T", "cells", "derived", "from", "male", "HD", "or", "Pt", "from", "(", "C", ")", "before", "and", "8", "hr", "after", "Pma", "/", "Ionomycin", "stimulation", ".", "E", "Population", "composition", "in", "male", "HD", "bulk", "edited", ",", "sorted", "NGFR", "+", "or", "sorted", "NGFR", "-", "CD4", "+", "T", "cells", "from", "(", "B", ")", "(", "n", "=", "7", "for", "each", "group", ")", ".", "Friedman", "test", "(", "to", "account", "for", "the", "same", "donor", ")", "with", "p", "-", "values", "adjusted", "with", "Bonferroni", "'", "s", "correction", "to", "account", "for", "multiple", "testing", ".", "Mean", "±", "SEM", ".", "F", "Human", "CD45", "+", "cell", "engraftment", "in", "PB", "after", "transplantation", "of", "male", "HD", "UT", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "bulk", "edited", "(", "NGFR", "bulk", ";", "n", "=", "5", ")", "or", "sorted", "NGFR", "+", "(", "n", "=", "5", ")", "CD4", "+", "T", "cells", ".", "Longitudinal", "comparisons", "were", "performed", "with", "an", "LME", "model", ",", "followed", "by", "an", "appropriate", "post", "-", "hoc", "analysis", "(", "see", "Appendix", "Supplementary", "Statistical", "Methods", ")", ".", "The", "reported", "statistical", "comparisons", "refer", "only", "to", "the", "overall", "difference", "among", "groups", ".", "Median", "±", "IQR", ".", "G", "Percentage", "of", "HDR", "within", "human", "cells", "over", "time", ",", "measured", "by", "ddPCR", "in", "PB", "of", "mice", "from", "(", "F", ")", "(", "n", "=", "5", "for", "each", "group", ",", "measured", "in", "engrafted", "mice", "with", "sufficient", "blood", "material", ")", ".", "Longitudinal", "comparisons", "were", "performed", "with", "an", "LME", "model", "with", "time", "treated", "as", "a", "continuous", "variable", "(", "see", "Appendix", "Supplementary", "Statistical", "Methods", ")", ".", "UT", "group", "was", "not", "included", "in", "the", "analysis", ".", "Effect", "of", "the", "time", "and", "the", "eventual", "different", "effect", "of", "the", "time", "in", "the", "groups", "were", "not", "retained", "in", "the", "final", "model", "after", "backward", "variable", "selection", ",", "highlighting", "a", "constant", "(", "and", "significantly", "different", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ")", "behavior", "of", "the", "groups", "over", "time", ".", "Median", "±", "IQR", ".", "H", "Time", "course", "of", "CD40L", "surface", "expression", "after", "PMA", "/", "Ionomycin", "stimulation", "measured", "by", "MFI", "on", "pooled", "CD4", "+", "T", "cells", "retrieved", "from", "spleens", "of", "mice", "from", "(", "F", ")", "(", "n", "=", "1", "for", "each", "group", ",", "except", "for", "NGFR", "-", "unedited", "group", ",", "n", "=", "3", ")", ".", "Median", "±", "IQR", ".", "I", "Dot", "plot", "depicting", "the", "ratio", "between", "expression", "of", "CD40LG", "edited", "mRNA", "(", "codon", "-", "usage", "optimized", ",", "CO", ")", "and", "CD40LG", "wild", "-", "type", "mRNA", "(", "WT", ")", "in", "cells", "edited", "with", "three", "different", "donor", "templates", "from", "Fig", "EV2H", ".", "Three", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", "EF1a", ".", "GFP", ",", "1", "IRES", ".", "NGFR", ",", "3", "IRES", ".", "GFP", ")", ".", "Median", "±", "IQR", ".", "J", "Time", "course", "of", "expression", "of", "WT", "-", "CD40LG", "mRNA", "or", "CO", "-", "CD40LG", "mRNA", ",", "measured", "as", "fold", "change", "(", "FC", ")", "on", "IPO8", "housekeeping", "gene", "and", "normalized", "to", "T0", ".", "Sorted", "edited", "(", "+", ")", "and", "sorted", "unedited", "(", "-", ")", "CD4", "+", "T", "cells", "were", "analyzed", "before", "and", "3", ",", "6", ",", "12", "hr", "after", "Actinomycin", "D", "treatment", "(", "n", "=", "1", "for", "each", "group", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B Percentage of NGFR+ cells or HDR at 17 days after CD40LG editing of male HD bulk edited, sorted NGFR+ or sorted NGFR- CD4+ T cells (n=7 for each group). Median ± IQR.C Time course of CD40L surface expression after PMA/Ionomycin stimulation measured by RFI (normalized to T0) on UT (n=2), edited (NGFR+) or unedited (NGFR-) HD or Pt derived CD4+ T cells (n=4 HD, 1 Pt). Median ± IQR.D Representative plots showing CD40L and NGFR expression in UT or bulk edited (Treated) CD4+ T cells derived from male HD or Pt from (C) before and 8 hr after Pma/Ionomycin stimulation.E Population composition in male HD bulk edited, sorted NGFR+ or sorted NGFR- CD4+ T cells from (B) (n=7 for each group). Friedman test (to account for the same donor) with p-values adjusted with Bonferroni's correction to account for multiple testing. Mean ± SEM.F Human CD45+ cell engraftment in PB after transplantation of male HD UT (n=5), bulk edited (NGFR bulk; n=5) or sorted NGFR+ (n=5) CD4+ T cells. Longitudinal comparisons were performed with an LME model, followed by an appropriate post-hoc analysis (see Appendix Supplementary Statistical Methods). The reported statistical comparisons refer only to the overall difference among groups. Median ± IQR.G Percentage of HDR within human cells over time, measured by ddPCR in PB of mice from (F) (n=5 for each group, measured in engrafted mice with sufficient blood material). Longitudinal comparisons were performed with an LME model with time treated as a continuous variable (see Appendix Supplementary Statistical Methods). UT group was not included in the analysis. Effect of the time and the eventual different effect of the time in the groups were not retained in the final model after backward variable selection, highlighting a constant (and significantly different, ****p<0.0001) behavior of the groups over time. Median ± IQR.H Time course of CD40L surface expression after PMA/Ionomycin stimulation measured by MFI on pooled CD4+ T cells retrieved from spleens of mice from (F) (n=1 for each group, except for NGFR- unedited group, n=3). Median ± IQR.I Dot plot depicting the ratio between expression of CD40LG edited mRNA (codon-usage optimized, CO) and CD40LG wild-type mRNA (WT) in cells edited with three different donor templates from Fig EV2H. Three independent experiments (n=3 EF1a.GFP, 1 IRES.NGFR, 3 IRES.GFP). Median ± IQR.J Time course of expression of WT-CD40LG mRNA or CO-CD40LG mRNA, measured as fold change (FC) on IPO8 housekeeping gene and normalized to T0. Sorted edited (+) and sorted unedited (-) CD4+ T cells were analyzed before and 3, 6, 12 hr after Actinomycin D treatment (n=1 for each group)."}
{"words": ["Figure", "3B", "Representative", "plots", "showing", "hEGFRt", "expression", "in", "bulk", "edited", "CD4", "+", "T", "cells", "derived", "from", "male", "HD", "before", "and", "8", "hr", "after", "Pma", "/", "Ionomycin", "stimulation", ".", "Cells", "were", "edited", "with", "the", "three", "constructs", "depicted", "in", "(", "A", ")", ".", "C", "Representative", "plots", "showing", "EGFR", "expression", "in", "bulk", "edited", "CD4", "+", "T", "cells", "derived", "from", "male", "HD", "at", "3", "days", "after", "treatment", "with", "immunotoxin", "(", "left", ")", ",", "antibody", "(", "middle", ")", "or", "toxin", "(", "right", ")", ".", "D", "Bar", "plot", "showing", "percentage", "of", "EGFR", "+", "T", "cells", "at", "3", "days", "after", "treatment", "with", "5", "nM", "or", "1", "nM", "of", "immunotoxin", ",", "antibody", "or", "toxin", ",", "measured", "by", "FACS", "Analysis", ".", "Friedman", "test", "with", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparisons", ".", "P", "-", "values", "were", "adjusted", "with", "Bonferroni", "'", "s", "correction", "to", "account", "for", "multiple", "comparisons", "(", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0052", "and", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0024", "for", "immunotoxin", "vs", "antibody", "and", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0010", "and", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0024", "for", "immunotoxin", "vs", "toxin", ",", "referring", "to", "EGFRmod1", "and", "EGFRmod2", "respectively", ")", ".", "Different", "dose", "-", "conditions", "were", "used", "as", "a", "unified", "group", "for", "statistical", "analysis", "(", "n", "=", "10", "for", "each", "group", ")", ".", "Median", "±", "IQR", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B Representative plots showing hEGFRt expression in bulk edited CD4+ T cells derived from male HD before and 8 hr after Pma/Ionomycin stimulation. Cells were edited with the three constructs depicted in (A).C Representative plots showing EGFR expression in bulk edited CD4+ T cells derived from male HD at 3 days after treatment with immunotoxin (left), antibody (middle) or toxin (right).D Bar plot showing percentage of EGFR+ T cells at 3 days after treatment with 5 nM or 1 nM of immunotoxin, antibody or toxin, measured by FACS Analysis. Friedman test with Dunn's multiple comparisons. P-values were adjusted with Bonferroni's correction to account for multiple comparisons (**p=0.0052 and **p=0.0024 for immunotoxin vs antibody and **p=0.0010 and **p=0.0024 for immunotoxin vs toxin, referring to EGFRmod1 and EGFRmod2 respectively). Different dose-conditions were used as a unified group for statistical analysis (n=10 for each group). Median ± IQR."}
{"words": ["Figure", "4B", "Percentage", "of", "HDR", "in", "HSPC", "subpopulations", "at", "4", "days", "after", "CD40LG", "editing", ",", "measured", "by", "molecular", "analysis", "(", "ddPCR", ")", ".", "Cells", "were", "edited", "with", "donor", "template", "either", "comprising", "only", "the", "corrective", "cDNA", "(", "NR", ";", "n", "=", "4", ")", ",", "or", "carrying", "the", "selector", "cassette", "IRES", ".", "NGFR", "(", "NGFR", ";", "n", "=", "5", ")", "and", "sorted", "according", "to", "surface", "markers", ":", "CD34", "-", ";", "CD34", "+", "CD133", "-", "CD90", "-", ";", "CD34", "+", "CD133", "+", "CD90", "-", ";", "CD34", "+", "CD133", "+", "CD90", "+", ".", "CD34", "+", "CD133", "+", "CD90", "+", "/", "CD90", "-", "and", "CD34", "+", "CD133", "-", "/", "CD34", "-", "conditions", "were", "used", "as", "unified", "groups", "for", "statistical", "analysis", ".", "The", "comparisons", "between", "the", "groups", "were", "performed", "with", "LME", "models", "accounting", "for", "the", "different", "subpopulations", "included", "in", "the", "analysis", "and", "with", "random", "effects", "defined", "to", "account", "for", "the", "same", "donor", ".", "In", "comparison", "about", "CD34", "+", "CD133", "+", "CD90", "+", "/", "CD90", "-", ",", "the", "percentages", "were", "used", "in", "square", "root", "scale", "to", "meet", "the", "assumption", "of", "normality", "of", "the", "residuals", "of", "the", "model", ".", "For", "CD34", "+", "CD133", "+", "CD90", "+", "/", "CD90", "-", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0035", ",", "for", "CD34", "+", "CD133", "-", "/", "CD34", "-", "p", "=", "0", ".", "2051", ".", "Median", "±", "IQR", ".", "C", "Population", "composition", "in", "UT", "or", "bulk", "edited", "HSPC", "from", "(", "B", ")", "(", "n", "=", "8", "for", "each", "group", ",", "except", "UT", "cells", "from", "NGFR", "group", ",", "n", "=", "7", ")", ".", "Paired", "Wilcoxon", "'", "s", "test", ",", "to", "account", "for", "the", "same", "donor", ",", "with", "p", "-", "values", "adjusted", "with", "Bonferroni", "'", "s", "correction", "to", "account", "for", "multiple", "testing", ".", "Analysis", "was", "performed", "separately", "for", "NR", "and", "NGFR", "groups", ".", "Mean", "±", "SEM", ".", "D", "Human", "CD45", "+", "cell", "engraftment", "in", "PB", "after", "transplantation", "of", "HSPC", "edited", "with", "the", "two", "donor", "templates", "described", "in", "(", "B", ")", "and", "with", "(", "n", "=", "4", ")", "or", "without", "(", "n", "=", "5", ")", "GSE56", ".", "Comparison", "between", "groups", "was", "performed", "by", "NLME", "model", "with", "an", "asymptotic", "model", "(", "see", "Appendix", "Supplementary", "Statistical", "Methods", ")", ".", "The", "reported", "statistical", "comparisons", "refer", "only", "to", "the", "first", "time", "-", "point", "(", "i", ".", "e", ".", "6", "weeks", ";", "*", "p", "=", "0", ".", "0213", "and", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0069", ")", ".", "Group", "transplanted", "with", "HSPC", "treated", "without", "GSE56", "needs", "significantly", "greater", "time", "for", "reaching", "the", "final", "plateau", "with", "respect", "to", "both", "GSE56", "groups", "(", "p", "=", "0", ".", "0034", "for", "NGFR", "+", "GSE56", "and", "p", "=", "0", ".", "0080", "for", "NR", "+", "GSE56", ")", ".", "Median", "±", "IQR", ".", "E", "Percentage", "of", "HDR", "within", "human", "cells", "over", "time", ",", "measured", "by", "ddPCR", "in", "PB", "of", "mice", "from", "(", "D", ")", ".", "Longitudinal", "comparisons", "were", "performed", "with", "an", "LME", "model", "with", "time", "treated", "as", "a", "continuous", "variable", ",", "and", "followed", "by", "an", "appropriate", "post", "-", "hoc", "analysis", "(", "see", "Appendix", "Supplementary", "Statistical", "Methods", ")", ".", "The", "reported", "statistical", "comparisons", "refer", "only", "to", "the", "last", "time", "-", "point", "(", "i", ".", "e", ".", "20", "weeks", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "in", "both", "comparisons", ")", ".", "NR", "+", "GSE56", "group", "shows", "a", "constant", "behavior", "over", "time", "(", "p", "=", "0", ".", "0588", ")", ".", "The", "slope", "of", "the", "linear", "trajectory", "over", "time", "is", "not", "significantly", "different", "between", "GSE56", "groups", "(", "p", "=", "0", ".", "1624", ")", ",", "indicating", "gene", "editing", "stability", "of", "both", "groups", "over", "time", ".", "Mice", "transplanted", "with", "HSPC", "treated", "without", "GSE56", "shows", "significantly", "lower", "slope", "than", "GSE56", "groups", "(", "p", "<", "0", ".", "0001", "in", "respect", "of", "NGFR", "group", ",", "p", "=", "0", ".", "0054", "in", "respect", "of", "NR", "group", ")", ",", "thus", "highlighting", "decreased", "gene", "editing", "efficiency", "over", "time", ".", "Median", "±", "IQR", ".", "Percentage", "of", "HDR", "within", "human", "cells", "in", "(", "F", ")", "PB", ",", "bone", "marrow", ",", "spleen", ",", "thymus", "measured", "by", "ddPCR", "in", "mice", "from", "(", "D", ")", ".", "Median", ".", "Percentage", "of", "HDR", "within", "human", "cells", "within", "BM", "-", "sorted", "human", "subpopulations", "(", "CD19", "+", ",", "CD33", "+", ",", "CD3", "+", ",", "CD34", "+", ")", ",", "measured", "by", "ddPCR", "in", "mice", "from", "(", "D", ")", ".", "Median", ".", "H", "Time", "course", "of", "CD40L", "surface", "expression", "after", "PMA", "/", "Ionomycin", "stimulation", "measured", "by", "MFI", "on", "pooled", "CD4", "+", "T", "cells", "retrieved", "from", "spleen", "of", "mice", "from", "(", "D", ")", "(", "n", "=", "4", "NGFR", "+", ",", "4", "NGFR", "-", ")", ".", "Mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B Percentage of HDR in HSPC subpopulations at 4 days after CD40LG editing, measured by molecular analysis (ddPCR). Cells were edited with donor template either comprising only the corrective cDNA (NR; n=4), or carrying the selector cassette IRES.NGFR (NGFR; n=5) and sorted according to surface markers: CD34-; CD34+CD133-CD90-; CD34+CD133+CD90-; CD34+CD133+CD90+. CD34+CD133+CD90+/CD90- and CD34+CD133-/CD34- conditions were used as unified groups for statistical analysis. The comparisons between the groups were performed with LME models accounting for the different subpopulations included in the analysis and with random effects defined to account for the same donor. In comparison about CD34+CD133+CD90+/CD90-, the percentages were used in square root scale to meet the assumption of normality of the residuals of the model. For CD34+CD133+CD90+/CD90-, **p= 0.0035, for CD34+CD133-/CD34- p=0.2051. Median ± IQR.C Population composition in UT or bulk edited HSPC from (B) (n=8 for each group, except UT cells from NGFR group, n=7). Paired Wilcoxon's test, to account for the same donor, with p-values adjusted with Bonferroni's correction to account for multiple testing. Analysis was performed separately for NR and NGFR groups. Mean ± SEM.D Human CD45+ cell engraftment in PB after transplantation of HSPC edited with the two donor templates described in (B) and with (n=4) or without (n=5) GSE56. Comparison between groups was performed by NLME model with an asymptotic model (see Appendix Supplementary Statistical Methods). The reported statistical comparisons refer only to the first time-point (i.e. 6 weeks; *p=0.0213 and **p=0.0069). Group transplanted with HSPC treated without GSE56 needs significantly greater time for reaching the final plateau with respect to both GSE56 groups (p=0.0034 for NGFR+GSE56 and p=0.0080 for NR+GSE56). Median ± IQR.E Percentage of HDR within human cells over time, measured by ddPCR in PB of mice from (D). Longitudinal comparisons were performed with an LME model with time treated as a continuous variable, and followed by an appropriate post-hoc analysis (see Appendix Supplementary Statistical Methods). The reported statistical comparisons refer only to the last time-point (i.e. 20 weeks; ****p<0.0001 in both comparisons). NR+GSE56 group shows a constant behavior over time (p=0.0588). The slope of the linear trajectory over time is not significantly different between GSE56 groups (p=0.1624), indicating gene editing stability of both groups over time. Mice transplanted with HSPC treated without GSE56 shows significantly lower slope than GSE56 groups (p<0.0001 in respect of NGFR group, p=0.0054 in respect of NR group), thus highlighting decreased gene editing efficiency over time. Median ± IQR.Percentage of HDR within human cells in (F) PB, bone marrow, spleen, thymus measured by ddPCR in mice from (D). Median.Percentage of HDR within human cells within BM-sorted human subpopulations (CD19+, CD33+, CD3+, CD34+), measured by ddPCR in mice from (D). Median.H Time course of CD40L surface expression after PMA/Ionomycin stimulation measured by MFI on pooled CD4+ T cells retrieved from spleen of mice from (D) (n=4 NGFR+, 4 NGFR-). Mean ± SEM."}
{"words": ["Figure", "5B", "Total", "counts", "of", "recipient", "CD3", "+", "cells", "gated", "within", "CD45", ".", "2", "+", "cells", "in", "PB", "of", "experimental", "mice", "(", "n", "=", "4", "CPA", "300", ",", "9", "NC", ")", ".", "Comparison", "between", "groups", "was", "performed", "by", "NLME", "model", "with", "an", "asymptotic", "model", "(", "see", "Appendix", "Supplementary", "Statistical", "Methods", ")", ".", "The", "reported", "statistical", "comparisons", "refer", "only", "to", "day", "1", "(", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ")", ".", "Mean", "±", "SEM", ".", "C", "Total", "counts", "of", "engrafted", "donor", "CD45", ".", "1", ".", "2", "+", "cells", "in", "PB", "of", "mice", "from", "(", "B", ")", ".", "Comparison", "between", "groups", "was", "performed", "by", "NLME", "model", "with", "an", "asymptotic", "model", "(", "see", "Appendix", "Supplementary", "Statistical", "Methods", ")", ".", "The", "reported", "statistical", "comparisons", "refer", "only", "to", "plateau", "(", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0001", ")", ".", "Mean", "±", "SEM", ".", "D", ",", "E", "Percentage", "of", "donor", "CD4", "+", "and", "CD8", "+", "cells", "gated", "within", "CD3", "+", "CD45", ".", "1", ".", "2", "+", "cells", "in", "PB", "of", "CPA", "treated", "(", "D", ")", "or", "NC", "mice", "(", "E", ")", "from", "(", "B", ")", ".", "Mean", "±", "SEM", ".", "F", "TNP", "-", "KLH", "specific", "IgG", "in", "sera", "of", "transplanted", "mice", "collected", "at", "the", "times", "indicated", "in", "(", "A", ")", "(", "n", "=", "7", "CPA", "300", ",", "13", "NC", "for", "first", "boost", "and", "4", "CPA", "300", ",", "9", "NC", "for", "second", "boost", ")", ".", "Sera", "from", "vaccinated", "WT", "(", "n", "=", "5", ")", "and", "CD40lg", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "5", ")", "mice", "were", "used", "as", "positive", "and", "negative", "controls", ",", "respectively", ".", "Two", "independent", "experiments", ".", "Comparisons", "of", "first", "boost", "data", "were", "performed", "with", "an", "LME", "model", ",", "accounting", "for", "multiple", "experiments", ",", "followed", "by", "appropriate", "post", "-", "hoc", "analysis", "(", "see", "Appendix", "Supplementary", "Statistical", "Methods", ")", ".", "The", "reported", "statistical", "comparisons", "refer", "only", "to", "the", "overall", "difference", "among", "groups", "(", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "in", "all", "comparisons", ")", ".", "Median", "±", "IQR", ".", "G", "Average", "area", "of", "PNA", "+", "foci", "in", "splenic", "sections", "of", "experimental", "mice", "from", "(", "B", ")", ",", "calculated", "as", "ratio", "between", "total", "PNA", "+", "area", "and", "number", "of", "PNA", "+", "foci", "/", "cells", ".", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "followed", "by", "post", "-", "hoc", "analysis", "with", "Dunn", "'", "s", "test", "(", "n", "=", "9", "CD40LG", ",", "6", "WT", ",", "18", "NC", ",", "8", "CPA300", ")", ".", "P", "-", "values", "were", "adjusted", "with", "Bonferroni", "'", "s", "correction", "to", "account", "for", "multiple", "comparisons", "(", "*", "p", "=", "0", ".", "0149", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0065", "and", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ")", ".", "Mean", "±", "SEM", ".", "H", "Detection", "of", "splenic", "TNP", "-", "KLH", "specific", "IgM", "(", "left", ")", "and", "IgG", "(", "right", ")", "-", "secreting", "cells", "by", "ELISPOT", "assay", "(", "n", "=", "7", "NC", ",", "4", "CPA300", ",", "3", "WT", ",", "2", "CD40LG", ")", ".", "Spots", "were", "counted", "by", "an", "ELISPOT", "Reader", "using", "a", "size", "range", "of", "0", ".", "005", "-", "1", "mm", ".", "Median", "±", "IQR", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5B Total counts of recipient CD3+ cells gated within CD45.2+ cells in PB of experimental mice (n=4 CPA 300, 9 NC). Comparison between groups was performed by NLME model with an asymptotic model (see Appendix Supplementary Statistical Methods). The reported statistical comparisons refer only to day 1 (****p<0.0001). Mean ± SEM.C Total counts of engrafted donor CD45.1.2+ cells in PB of mice from (B). Comparison between groups was performed by NLME model with an asymptotic model (see Appendix Supplementary Statistical Methods). The reported statistical comparisons refer only to plateau (***p=0.0001). Mean ± SEM.D, E Percentage of donor CD4+ and CD8+ cells gated within CD3+CD45.1.2+ cells in PB of CPA treated (D) or NC mice (E) from (B). Mean ± SEM.F TNP-KLH specific IgG in sera of transplanted mice collected at the times indicated in (A) (n=7 CPA 300, 13 NC for first boost and 4 CPA 300, 9 NC for second boost). Sera from vaccinated WT (n=5) and CD40lg-/- (n=5) mice were used as positive and negative controls, respectively. Two independent experiments. Comparisons of first boost data were performed with an LME model, accounting for multiple experiments, followed by appropriate post-hoc analysis (see Appendix Supplementary Statistical Methods). The reported statistical comparisons refer only to the overall difference among groups (****p<0.0001 in all comparisons). Median ± IQR.G Average area of PNA+ foci in splenic sections of experimental mice from (B), calculated as ratio between total PNA+ area and number of PNA+ foci/cells. Kruskal-Wallis test followed by post-hoc analysis with Dunn's test (n=9 CD40LG, 6 WT, 18 NC, 8 CPA300). P-values were adjusted with Bonferroni's correction to account for multiple comparisons (*p=0.0149, **p=0.0065 and ****p<0.0001). Mean ± SEM.H Detection of splenic TNP-KLH specific IgM (left) and IgG (right) -secreting cells by ELISPOT assay (n=7 NC, 4 CPA300, 3 WT, 2 CD40LG). Spots were counted by an ELISPOT Reader using a size range of 0.005-1 mm. Median ± IQR."}
{"words": ["Figure", "6B", "Total", "counts", "of", "recipient", "CD3", "+", "CD45", ".", "2", "+", "cells", "in", "PB", "of", "mice", "NC", "(", "n", "=", "13", ")", "or", "pre", "-", "conditioned", "with", "300", "mg", "/", "kg", "CPA", "(", "n", "=", "19", ")", ",", "200", "mg", "/", "kg", "CPA", "(", "n", "=", "6", ")", ",", "anti", "-", "lymphocyte", "serum", "(", "ALS", ";", "n", "=", "5", ")", "or", "anti", "-", "CD4", "antibody", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "Three", "independent", "experiments", ".", "Comparisons", "at", "day", "3", "\\", "4", "were", "performed", "with", "an", "LME", "model", ",", "accounting", "for", "multiple", "experiments", ",", "followed", "by", "appropriate", "post", "-", "hoc", "analysis", "(", "see", "Appendix", "Supplementary", "Statistical", "Methods", ";", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0009", "and", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "in", "all", "comparisons", ")", ".", "Mean", "±", "SEM", ".", "C", "Total", "counts", "of", "engrafted", "donor", "CD45", ".", "1", "+", "cells", "in", "PB", "of", "mice", "from", "(", "B", ")", ".", "Three", "independent", "experiment", ".", "Comparisons", "at", "day", "18", "\\", "24", "were", "performed", "with", "an", "LME", "model", ",", "accounting", "for", "multiple", "experiments", ",", "followed", "by", "appropriate", "post", "-", "hoc", "analysis", "(", "see", "Appendix", "Supplementary", "Statistical", "Methods", ";", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0002", "and", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "in", "all", "comparisons", ")", ".", "CPA200", "was", "not", "included", "in", "the", "analysis", "because", "n", "=", "4", ".", "Mean", "±", "SEM", ".", "D", "Analysis", "of", "the", "relationship", "between", "total", "counts", "of", "recipient", "CD3", "+", "cells", "gated", "within", "CD45", ".", "2", "+", "cells", "at", "day", "3", ",", "4", "and", "engrafted", "donor", "CD45", ".", "1", "+", "T", "cells", "at", "18", "\\", "24", "days", ".", "This", "relationship", "was", "modeled", "with", "an", "asymptotic", "NLME", "model", "(", "Appendix", "Supplementary", "Statistical", "Methods", ")", ",", "accounting", "for", "the", "different", "groups", "and", "multiple", "experiments", ".", "From", "the", "estimated", "model", ",", "a", "lower", "value", "of", "recipient", "CD3", "+", "T", "cells", "corresponds", "to", "a", "higher", "value", "of", "engrafted", "donor", "CD4", "+", "T", "cells", "(", "p", "=", "0", ".", "0006", ")", ".", "E", "TNP", "-", "KLH", "specific", "IgG", "concentration", "in", "sera", "of", "mice", "from", "(", "B", ")", "collected", "before", "(", "day", "35", ";", "pre", ")", "and", "after", "(", "day", "49", ";", "post", ")", "the", "first", "boost", "(", "n", "=", "13", "NC", ",", "19", "CPA", "300", ",", "4", "CPA", "200", ",", "5", "ALS", ",", "6", "ANTI", "-", "CD4", ";", "three", "independent", "experiments", ")", "and", "at", "day", "81", "(", "pre", ")", "and", "89", "(", "post", ")", "for", "the", "second", "boost", "(", "n", "=", "4", "NC", ",", "4", "CPA", "300", ",", "4", "CPA", "200", ",", "5", "ALS", ",", "6", "ANTI", "-", "CD4", ")", ".", "Sera", "from", "vaccinated", "WT", "(", "n", "=", "5", ")", "and", "Cd40lg", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "5", ")", "mice", "were", "used", "as", "positive", "and", "negative", "controls", ",", "respectively", ".", "For", "early", "challenge", "data", ",", "comparisons", "were", "performed", "with", "an", "LME", "model", ",", "accounting", "for", "multiple", "experiments", ",", "followed", "by", "appropriate", "post", "-", "hoc", "analysis", "(", "see", "Appendix", "Supplementary", "Statistical", "Methods", ")", ".", "The", "reported", "statistical", "comparisons", "refer", "only", "to", "the", "overall", "difference", "among", "groups", "(", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0002", "and", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "in", "all", "comparisons", ")", ".", "CPA200", "was", "not", "included", "in", "the", "analysis", "because", "n", "=", "4", ".", "WT", "group", ",", "not", "indicated", "in", "the", "figure", ",", "is", "significantly", "different", "from", "all", "groups", "(", "p", "<", "0", ".", "0001", "in", "all", "comparisons", ")", ".", "Of", "note", ",", "regarding", "the", "comparisons", "between", "time", "-", "points", ",", "the", "groups", "CPA", "300", "and", "WT", "show", "a", "significant", "increase", "between", "pre", "and", "post", "values", "(", "p", "<", "0", ".", "0001", "for", "both", ")", ",", "while", "all", "other", "groups", "show", "a", "significant", "decrease", "between", "pre", "and", "post", "values", "(", "p", "<", "0", ".", "0001", "for", "all", "except", "p", "=", "0", ".", "0022", "for", "ANTI", "-", "CD4", ")", ".", "Median", "±", "IQR", ".", "F", "Total", "counts", "of", "recipient", "CD3", "+", "cells", "gated", "within", "CD45", ".", "2", "+", "cells", "after", "transfer", "of", "primed", "donor", "T", "cells", "in", "PB", "of", "mice", "treated", "with", "300", "mg", "/", "kg", "CPA", "(", "n", "=", "11", ")", ",", "200", "mg", "/", "kg", "CPA", "(", "n", "=", "11", ")", "or", "NC", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "Longitudinal", "comparisons", "were", "performed", "by", "LME", "model", "followed", "by", "an", "appropriate", "post", "-", "hoc", "analysis", "(", "Appendix", "Supplementary", "Statistical", "Methods", ")", ".", "The", "reported", "statistical", "comparisons", "refer", "only", "to", "day", "4", "(", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "in", "all", "comparisons", ")", ".", "Mean", "±", "SEM", ".", "G", "Total", "counts", "of", "engrafted", "donor", "CD45", ".", "1", "+", "cells", "in", "PB", "of", "mice", "from", "(", "F", ")", ".", "Longitudinal", "comparisons", "were", "performed", "with", "an", "LME", "model", "followed", "by", "an", "appropriate", "post", "-", "hoc", "analysis", "(", "Appendix", "Supplementary", "Statistical", "Methods", ")", ".", "The", "reported", "statistical", "comparisons", "refer", "only", "to", "day", "25", ".", "At", "day", "215", "a", "significant", "difference", "was", "observed", "between", "CPA", "300", "vs", "NC", "and", "CPA", "300", "vs", "CPA", "200", "(", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "for", "both", ")", ".", "Mean", "±", "SEM", ".", "H", "TNP", "-", "KLH", "specific", "IgG", "concentration", "in", "sera", "of", "mice", "from", "(", "F", ")", "collected", "before", "(", "day", "36", ",", "pre", ")", "and", "after", "(", "day", "50", ",", "post", ")", "the", "first", "boost", "(", "n", "=", "6", "NC", ",", "11", "CPA", "300", ",", "11", "CPA", "200", ")", "and", "at", "day", "212", "(", "pre", ")", "and", "219", "(", "post", ")", "for", "the", "second", "boost", "(", "n", "=", "6", "NC", ",", "11", "CPA", "300", ",", "9", "CPA", "200", ")", ".", "Sera", "from", "vaccinated", "WT", "(", "n", "=", "11", ")", "and", "Cd40lg", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "5", ")", "mice", "were", "used", "as", "positive", "and", "negative", "controls", ",", "respectively", ".", "Comparisons", "were", "performed", "with", "an", "LME", "model", "followed", "by", "an", "appropriate", "post", "-", "hoc", "analysis", ",", "separately", "for", "each", "challenge", "data", "(", "Appendix", "Supplementary", "Statistical", "Methods", ")", ".", "Reported", "statistical", "comparisons", "refer", "to", "the", "overall", "difference", "among", "groups", ",", "for", "early", "challenge", "data", "(", "*", "p", "=", "0", ".", "0282", "and", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0037", ")", ",", "while", "to", "differences", "between", "time", "-", "points", "within", "each", "group", ",", "for", "late", "challenge", "data", "(", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0018", "and", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "in", "both", "comparisons", ")", ".", "Of", "note", ",", "in", "the", "late", "challenge", "data", ",", "no", "significant", "overall", "differences", "were", "observed", "among", "the", "groups", ".", "Median", "±", "IQR", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6B Total counts of recipient CD3+ CD45.2+ cells in PB of mice NC (n=13) or pre-conditioned with 300 mg/kg CPA (n=19), 200 mg/kg CPA (n=6), anti-lymphocyte serum (ALS; n=5) or anti-CD4 antibody (n=6). Three independent experiments. Comparisons at day 3\\4 were performed with an LME model, accounting for multiple experiments, followed by appropriate post-hoc analysis (see Appendix Supplementary Statistical Methods; ***p=0.0009 and ****p<0.0001 in all comparisons). Mean ± SEM.C Total counts of engrafted donor CD45.1+ cells in PB of mice from (B). Three independent experiment. Comparisons at day 18\\24 were performed with an LME model, accounting for multiple experiments, followed by appropriate post-hoc analysis (see Appendix Supplementary Statistical Methods; ***p=0.0002 and ****p<0.0001 in all comparisons). CPA200 was not included in the analysis because n=4. Mean ± SEM.D Analysis of the relationship between total counts of recipient CD3+ cells gated within CD45.2+ cells at day 3, 4 and engrafted donor CD45.1+ T cells at 18\\24 days. This relationship was modeled with an asymptotic NLME model (Appendix Supplementary Statistical Methods), accounting for the different groups and multiple experiments. From the estimated model, a lower value of recipient CD3+ T cells corresponds to a higher value of engrafted donor CD4+ T cells (p=0.0006).E TNP-KLH specific IgG concentration in sera of mice from (B) collected before (day 35; pre) and after (day 49; post) the first boost (n=13 NC, 19 CPA 300, 4 CPA 200, 5 ALS, 6 ANTI-CD4; three independent experiments) and at day 81 (pre) and 89 (post) for the second boost (n=4 NC, 4 CPA 300, 4 CPA 200, 5 ALS, 6 ANTI-CD4). Sera from vaccinated WT (n=5) and Cd40lg-/- (n=5) mice were used as positive and negative controls, respectively. For early challenge data, comparisons were performed with an LME model, accounting for multiple experiments, followed by appropriate post-hoc analysis (see Appendix Supplementary Statistical Methods). The reported statistical comparisons refer only to the overall difference among groups (***p=0.0002 and ****p<0.0001 in all comparisons). CPA200 was not included in the analysis because n=4. WT group, not indicated in the figure, is significantly different from all groups (p<0.0001 in all comparisons). Of note, regarding the comparisons between time-points, the groups CPA 300 and WT show a significant increase between pre and post values (p<0.0001 for both), while all other groups show a significant decrease between pre and post values (p<0.0001 for all except p=0.0022 for ANTI-CD4). Median ± IQR.F Total counts of recipient CD3+ cells gated within CD45.2+ cells after transfer of primed donor T cells in PB of mice treated with 300 mg/kg CPA (n=11), 200 mg/kg CPA (n=11) or NC (n=6). Longitudinal comparisons were performed by LME model followed by an appropriate post-hoc analysis (Appendix Supplementary Statistical Methods). The reported statistical comparisons refer only to day 4 (****p<0.0001 in all comparisons). Mean ± SEM.G Total counts of engrafted donor CD45.1+ cells in PB of mice from (F). Longitudinal comparisons were performed with an LME model followed by an appropriate post-hoc analysis (Appendix Supplementary Statistical Methods). The reported statistical comparisons refer only to day 25. At day 215 a significant difference was observed between CPA 300 vs NC and CPA 300 vs CPA 200 (****p<0.0001 for both). Mean ± SEM.H TNP-KLH specific IgG concentration in sera of mice from (F) collected before (day 36, pre) and after (day 50, post) the first boost (n=6 NC, 11 CPA 300, 11 CPA 200) and at day 212 (pre) and 219 (post) for the second boost (n=6 NC, 11 CPA 300, 9 CPA 200). Sera from vaccinated WT (n=11) and Cd40lg-/- (n=5) mice were used as positive and negative controls, respectively. Comparisons were performed with an LME model followed by an appropriate post-hoc analysis, separately for each challenge data (Appendix Supplementary Statistical Methods). Reported statistical comparisons refer to the overall difference among groups, for early challenge data (*p=0.0282 and **p=0.0037), while to differences between time-points within each group, for late challenge data (**p=0.0018 and ****p<0.0001 in both comparisons). Of note, in the late challenge data, no significant overall differences were observed among the groups. Median ± IQR."}
{"words": ["Figure", "7B", "Total", "counts", "of", "WT", "donor", "CD4", "+", "T", "cells", "in", "mice", "from", "(", "A", ")", "(", "n", "=", "13", "100", "%", "WT", ",", "8", "25", "%", "WT", ",", "14", "10", "%", "WT", ",", "6", "1", "%", ",", "14", "0", "%", "WT", ")", ".", "Two", "representative", "experiments", "shown", "out", "of", "3", ".", "Mean", "±", "SEM", ".", "C", "TNP", "-", "KLH", "specific", "IgG", "concentration", "in", "sera", "of", "mice", "from", "(", "A", ")", "collected", "seven", "days", "before", "(", "pre", ")", "and", "after", "(", "post", ")", "TNP", "-", "KLH", "vaccination", "(", "n", "=", "13", "100", "%", "WT", ",", "13", "25", "%", "WT", ",", "14", "10", "%", "WT", ",", "6", "1", "%", "WT", ",", "14", "0", "%", "WT", ")", ".", "Three", "independent", "experiments", ".", "Comparisons", "were", "performed", "with", "an", "LME", "model", ",", "accounting", "for", "multiple", "experiments", ",", "followed", "by", "an", "appropriate", "post", "-", "hoc", "analysis", "(", "Appendix", "Supplementary", "Statistical", "Methods", ")", ".", "The", "reported", "statistical", "comparisons", "refer", "only", "to", "the", "overall", "difference", "among", "groups", "(", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "in", "all", "comparisons", ")", ".", "Median", "±", "IQR", ".", "D", "Percentage", "of", "PNA", "+", "GL7", "+", "GC", "B", "cells", "within", "the", "spleen", "of", "mice", "from", "(", "A", ")", "(", "n", "=", "16", "100", "%", "WT", ",", "6", "25", "%", "WT", ",", "16", "10", "%", "WT", ",", "11", "1", "%", "WT", ",", "18", "0", "%", "WT", ")", ".", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "followed", "by", "post", "-", "hoc", "analysis", "with", "Dunn", "'", "s", "test", ".", "P", "-", "values", "were", "adjusted", "with", "Bonferroni", "'", "s", "correction", "to", "account", "for", "multiple", "comparisons", "(", "*", "p", "=", "0", ".", "0385", "for", "25", "%", "WT", "vs", "1", "%", "WT", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0129", "for", "100", "%", "WT", "vs", "1", "%", "WT", ",", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0001", "and", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "in", "both", "comparisons", ")", ".", "Median", "±", "IQR", ".", "E", "Quantitation", "of", "P", ".", "murina", "rRNA", "in", "lung", "homogenate", "of", "mice", "from", "(", "A", ")", "transplanted", "with", "different", "ratios", "of", "WT", "HSPC", "cells", "(", "n", "=", "8", "100", "%", "WT", ",", "7", "25", "%", "WT", ",", "7", "10", "%", "WT", ",", "8", "0", "%", "WT", ")", "and", "infected", "with", "the", "pathogen", ".", "Results", "are", "expressed", "in", "P", ".", "murina", "/", "HPRT", "RNA", "copies", ".", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "followed", "by", "post", "-", "hoc", "analysis", "with", "Dunn", "'", "s", "test", ".", "P", "-", "values", "were", "adjusted", "with", "Bonferroni", "'", "s", "correction", "to", "account", "for", "multiple", "comparisons", ".", "Only", "the", "groups", "100", "%", "WT", "and", "0", "%", "WT", "resulted", "to", "be", "significantly", "different", "(", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0028", ")", ".", "Median", "±", "IQR", ".", "F", "Lung", "weight", "of", "mice", "from", "(", "E", ")", ".", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "followed", "by", "post", "-", "hoc", "analysis", "with", "Dunn", "'", "s", "test", ".", "P", "-", "values", "were", "adjusted", "with", "Bonferroni", "'", "s", "correction", "to", "account", "for", "multiple", "comparisons", ".", "Only", "the", "groups", "100", "%", "WT", "and", "0", "%", "WT", "resulted", "to", "be", "significantly", "different", "(", "*", "p", "=", "0", ".", "0254", ")", ".", "Median", "±", "IQR", ".", "G", "Left", ":", "Representative", "pictures", "of", "lung", "tissue", "sections", "stained", "immunohistochemically", "with", "a", "rabbit", "primary", "antibody", "(", "upper", "left", ":", "negative", "sample", ";", "lower", "left", ":", "positive", "sample", ")", ".", "Brown", "areas", "represent", "intra", "-", "alveolar", "aggregates", "of", "P", ".", "murina", "organisms", ".", "Right", ":", "Representative", "pictures", "of", "P", ".", "murina", "organisms", "detected", "by", "immunofluorescence", "in", "lungs", "homogenate", "(", "upper", "right", ":", "negative", "sample", ";", "lower", "right", ":", "positive", "sample", ")", ".", "H", "Quantitation", "of", "P", ".", "Murina", "rRNA", "in", "lung", "homogenate", "of", "mice", "adoptively", "transferred", "(", "n", "=", "9", "CD40LG", "+", "T", "cells", ")", "or", "not", "(", "n", "=", "8", "CD40LG", ")", "with", "in", "vivo", "primed", "CD4", "+", "T", "cells", "in", "absence", "of", "conditioning", "and", "infected", "with", "the", "pathogen", ".", "Results", "are", "expressed", "in", "P", ".", "Murina", "/", "HPRT", "RNA", "copies", ".", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "*", "*", "*", "P", "-", "value", "of", "the", "comparison", "=", "0", ".", "0003", ".", "Median", "±", "IQR", ".", "I", "Lung", "weight", "of", "experimental", "mice", "from", "(", "H", ")", ".", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "*", "*", "P", "-", "value", "of", "the", "comparison", "=", "0", ".", "0055", ".", "Median", "±", "IQR", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7B Total counts of WT donor CD4+ T cells in mice from (A) (n=13 100% WT, 8 25% WT, 14 10% WT, 6 1%, 14 0% WT). Two representative experiments shown out of 3. Mean ± SEM.C TNP-KLH specific IgG concentration in sera of mice from (A) collected seven days before (pre) and after (post) TNP-KLH vaccination (n=13 100% WT, 13 25% WT, 14 10% WT, 6 1% WT, 14 0% WT). Three independent experiments. Comparisons were performed with an LME model, accounting for multiple experiments, followed by an appropriate post-hoc analysis (Appendix Supplementary Statistical Methods). The reported statistical comparisons refer only to the overall difference among groups (****p<0.0001 in all comparisons). Median ± IQR.D Percentage of PNA+GL7+ GC B cells within the spleen of mice from (A) (n=16 100% WT, 6 25% WT, 16 10% WT, 11 1% WT, 18 0% WT). Kruskal-Wallis test followed by post-hoc analysis with Dunn's test. P-values were adjusted with Bonferroni's correction to account for multiple comparisons (*p=0.0385 for 25% WT vs 1% WT, *p=0.0129 for 100% WT vs 1% WT, ***p=0.0001 and ****p<0.0001 in both comparisons). Median ± IQR.E Quantitation of P. murina rRNA in lung homogenate of mice from (A) transplanted with different ratios of WT HSPC cells (n=8 100% WT, 7 25% WT, 7 10% WT, 8 0% WT) and infected with the pathogen. Results are expressed in P.murina/HPRT RNA copies. Kruskal-Wallis test followed by post-hoc analysis with Dunn's test. P-values were adjusted with Bonferroni's correction to account for multiple comparisons. Only the groups 100% WT and 0% WT resulted to be significantly different (**p=0.0028). Median ± IQR.F Lung weight of mice from (E). Kruskal-Wallis test followed by post-hoc analysis with Dunn's test. P-values were adjusted with Bonferroni's correction to account for multiple comparisons. Only the groups 100% WT and 0% WT resulted to be significantly different (*p=0.0254). Median ± IQR.G Left: Representative pictures of lung tissue sections stained immunohistochemically with a rabbit primary antibody (upper left: negative sample; lower left: positive sample). Brown areas represent intra-alveolar aggregates of P. murina organisms. Right: Representative pictures of P. murina organisms detected by immunofluorescence in lungs homogenate (upper right: negative sample; lower right: positive sample).H Quantitation of P. Murina rRNA in lung homogenate of mice adoptively transferred (n=9 CD40LG + T cells) or not (n=8 CD40LG) with in vivo primed CD4+ T cells in absence of conditioning and infected with the pathogen. Results are expressed in P.Murina/HPRT RNA copies. Mann-Whitney test. ***P-value of the comparison = 0.0003. Median ± IQR.I Lung weight of experimental mice from (H). Mann-Whitney test. **P-value of the comparison = 0.0055. Median ± IQR."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Livedo", "reticularis", "in", "the", "left", "abdominal", "lower", "quadrant", "after", "the", "first", "infusion", "in", "Pt", "01", ".", "(", "B", ")", "Small", "clump", "of", "MABs", "observed", "in", "the", "first", "preparation", "of", "MP", "before", "the", "infusion", "of", "Pt", "01", ".", "(", "C", ")", "Livedo", "reticularis", "in", "the", "left", "hand", "of", "Pt02", "after", "the", "first", "infusion", ".", "(", "D", ")", "Brain", "MRI", "acquired", "one", "day", "after", "the", "MAB", "infusion", "showing", "acute", "small", "thalamic", "stroke", "in", "Pt03", ".", "Axial", "diffusion", "-", "weighted", "imaging", "(", "left", ")", "and", "fluid", "-", "attenuated", "inversion", "recovery", "(", "FLAIR", ";", "right", ")", "images", "show", "a", "focal", "spot", "of", "hyperintensity", "within", "the", "right", "thalamus", "consistent", "with", "acute", "stroke", ".", "(", "E", ")", "FLAIR", "MRI", "axial", "image", "obtained", "in", "Pt", "03", "one", "month", "after", "the", "acute", "stroke", ",", "showing", "the", "expected", "evolution", "of", "the", "right", "thalamic", "lesion", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Livedo reticularis in the left abdominal lower quadrant after the first infusion in Pt 01.(B) Small clump of MABs observed in the first preparation of MP before the infusion of Pt 01.(C) Livedo reticularis in the left hand of Pt02 after the first infusion.(D) Brain MRI acquired one day after the MAB infusion showing acute small thalamic stroke in Pt03. Axial diffusion-weighted imaging (left) and fluid-attenuated inversion recovery (FLAIR; right) images show a focal spot of hyperintensity within the right thalamus consistent with acute stroke.(E) FLAIR MRI axial image obtained in Pt 03 one month after the acute stroke, showing the expected evolution of the right thalamic lesion."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Haematoxilin", "and", "Eosin", "staining", "of", "muscle", "biopsies", "from", "Pt", "01", ",", "Pt", "02", "and", "Pt", "03", "performed", "2", "months", "after", "the", "last", "MAB", "infusion", ".", "Images", "show", "diffuse", "increase", "of", "connective", "tissue", ",", "atrophic", "and", "hypertrophic", "fibers", ",", "degenerating", "fibers", ",", "and", "diffuse", "centralization", "of", "nuclei", ".", "(", "B", ")", "Haematoxilin", "and", "Eosin", "staining", "of", "muscle", "biopsies", "from", "Pt", "05", "and", "Pt", "06", "performed", "one", "month", "before", "the", "first", "MAB", "infusion", "and", "2", "months", "after", "the", "last", "MAB", "infusion", ".", "Images", "show", "diffuse", "increase", "of", "connective", "tissue", ",", "atrophic", "and", "hypertrophic", "fibers", ",", "degenerating", "fibers", ",", "and", "diffuse", "centralization", "of", "nuclei", ".", "No", "evident", "differences", "were", "observed", "between", "biopsy", "performed", "after", "and", "before", "treatment", ".", "(", "C", ")", "Immunohistochemistry", "showing", "fetal", "myosin", "expression", "in", "muscle", "biopsy", "of", "DMD", "patients", "performed", "2", "months", "after", "the", "last", "MAB", "infusion", ".", "The", "staining", "was", "performed", "in", "tibialis", "anterior", "muscle", "for", "Pt", "01", ",", "Pt", "02", "and", "Pt", "03", "and", "in", "gastrocnemius", "muscle", "for", "Pt", "05", "and", "Pt", "06", ".", "A", "higher", "number", "of", "positive", "(", "brownish", "staining", ")", "fibers", "(", "representing", "regenerating", "fibers", ")", "were", "observed", "in", "Pt", "02", ",", "Pt", "05", "and", "Pt", "06", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Haematoxilin and Eosin staining of muscle biopsies from Pt 01, Pt 02 and Pt 03 performed 2 months after the last MAB infusion. Images show diffuse increase of connective tissue, atrophic and hypertrophic fibers, degenerating fibers, and diffuse centralization of nuclei.(B) Haematoxilin and Eosin staining of muscle biopsies from Pt 05 and Pt 06 performed one month before the first MAB infusion and 2 months after the last MAB infusion. Images show diffuse increase of connective tissue, atrophic and hypertrophic fibers, degenerating fibers, and diffuse centralization of nuclei. No evident differences were observed between biopsy performed after and before treatment.(C) Immunohistochemistry showing fetal myosin expression in muscle biopsy of DMD patients performed 2 months after the last MAB infusion. The staining was performed in tibialis anterior muscle for Pt 01, Pt 02 and Pt 03 and in gastrocnemius muscle for Pt 05 and Pt 06. A higher number of positive (brownish staining) fibers (representing regenerating fibers) were observed in Pt 02, Pt 05 and Pt 06."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Confocal", "immunofluorescence", "of", "muscle", "biopsy", "from", "Pt", "01", "(", "tibialis", "anterior", "post", "-", "treatment", ")", "stained", "with", "anti", "-", "dystrophin", "dys1", "antibody", "(", "which", "recognizes", "protein", "fragment", "encoded", "by", "exons", "26", "-", "30", ",", "green", "signal", ")", "and", "anti", "laminin", "-", "2", "(", "to", "delineate", "muscle", "fibers", ",", "red", "signal", ")", ";", "dapi", "identifies", "nuclei", "(", "blue", "signal", ")", ".", "In", "the", "left", "image", "only", "anti", "dystrophin", "staining", "is", "shown", ".", "No", "dystrophin", "positive", "fibers", "were", "observed", ".", "(", "B", ")", "Confocal", "immunofluorescence", "of", "muscle", "biopsy", "from", "Pt", "02", "(", "tibialis", "anterior", "post", "-", "treatment", ")", "stained", "with", "anti", "-", "dystrophin", "dys1", "antibody", "(", "green", "signal", ")", "and", "anti", "lamininin", "-", "2", "(", "red", "signal", ")", ";", "dapi", "identifies", "nuclei", "(", "blue", "signal", ")", ".", "In", "the", "left", "image", "only", "anti", "dystrophin", "staining", "is", "shown", ".", "Some", "fiber", "shows", "mild", "and", "discontinuous", "dystrophin", "staining", ".", "(", "C", ")", "Immunofluorescence", "of", "muscle", "biopsy", "from", "Pt", "05", "taken", "before", "(", "left", ",", "gastrocnemius", ")", "and", "after", "treatment", "(", "right", ",", "gastrocnemius", ")", "stained", "with", "anti", "dystrophin", "dys2", "antibody", "(", "which", "recognizes", "exon", "77", "-", "79", ")", ".", "The", "number", "and", "intensity", "of", "dystrophin", "-", "positive", "fibers", "is", "increased", "in", "the", "post", "-", "treatment", "biopsy", ".", "(", "D", ")", "Immunofluorescence", "of", "muscle", "biopsy", "from", "Pt", "06", "taken", "before", "(", "left", ",", "gastrocnemius", ")", "and", "after", "treatment", "(", "right", ",", "gastrocnemius", ")", "stained", "with", "anti", "dystrophin", "dys2", "antibody", ".", "Few", "fibers", "show", "scattered", "dystrophin", "staining", ",", "without", "obvious", "differences", "between", "pre", "and", "post", "-", "treatment", "samples", ".", "(", "E", ")", "Results", "of", "western", "blot", "analysis", "involving", "dystrophin", "antibodies", "dys1", ",", "Mandys18", "and", "Manex46e", "(", "recognizing", "respectively", "exon", "26", "-", "30", ",", "17", "-", "35", ",", "and", "46", ")", ",", "of", "total", "protein", "extracts", "(", "20", "µg", ")", "obtained", "from", "post", "-", "treatment", "biopsy", "specimens", "of", "Pt", "01", "(", "tibialis", "anterior", "muscle", ")", ";", "Ct", "was", "used", "as", "positive", "dystrophin", "control", ".", "Below", ",", "bands", "corresponding", "to", "myosin", "heavy", "chain", "are", "shown", "as", "loading", "control", ".", "No", "bands", "corresponding", "to", "full", "length", "dystrophin", "were", "observed", ".", "A", "schematic", "representation", "of", "the", "deleted", "portion", "of", "the", "dystrophin", "and", "the", "region", "recognized", "by", "used", "antibodies", "is", "depicted", "above", "the", "western", "blot", ".", "(", "F", ")", "Results", "of", "western", "blot", "analysis", "involving", "dystrophin", "antibodies", "Mandys18", "and", "Manex46e", ",", "of", "total", "protein", "extracts", "(", "10", "-", "20", "µg", ")", "obtained", "from", "pre", "-", "treatment", "(", "performed", "at", "time", "of", "diagnosis", ")", "and", "post", "-", "treatment", "biopsy", "specimens", "of", "Pt", "02", "(", "tibialis", "anterior", "muscle", ")", ";", "Ct", "was", "used", "as", "positive", "dystrophin", "control", ".", "Below", ",", "bands", "corresponding", "to", "myosin", "heavy", "chain", "are", "shown", "as", "loading", "control", ".", "One", "faint", "band", "corresponding", "to", "full", "length", "dystrophin", "is", "observed", "only", "in", "the", "post", "-", "treatment", "samples", "with", "both", "Mandys18", "and", "Manex46e", "antibodies", ".", "A", "schematic", "representation", "of", "the", "deleted", "portion", "of", "the", "dystrophin", "and", "the", "region", "recognized", "by", "used", "antibodies", "is", "depicted", "above", "the", "western", "blot", ".", "(", "G", ")", "Results", "of", "western", "blot", "analysis", "involving", "dystrophin", "antibodies", "Mandys106", "(", "recognizing", "exon", "43", ")", "and", "dys1", ",", "of", "total", "protein", "extracts", "(", "80", "µg", ",", "following", "protein", "concentration", "by", "Amicon", "Ultra", "-", "0", ".", "5", "centrifugal", "filter", "devices", ",", "Millipore", ")", "obtained", "from", "pre", "-", "treatment", "and", "post", "-", "treatment", "biopsy", "specimens", "of", "Pt", "05", "(", "gastrocnemius", ")", ";", "Ct", "was", "used", "as", "positive", "dystrophin", "control", ",", "CtDmd", "was", "used", "as", "dystrophin", "negative", "control", ".", "Below", ",", "bands", "corresponding", "to", "myosin", "heavy", "chain", "are", "shown", "as", "loading", "control", ".", "Bands", "corresponding", "approximately", "to", "full", "length", "dystrophin", "are", "observed", "in", "pre", "and", "post", "-", "treatment", "samples", "with", "both", "antibodies", "However", ",", "bands", "in", "post", "-", "treatment", "sample", "appeared", "higher", "in", "amount", ".", "A", "schematic", "representation", "of", "the", "dystrophin", "point", "mutation", "(", "black", "vertical", "bar", ")", "and", "the", "region", "recognized", "by", "used", "antibodies", "is", "depicted", "above", "the", "western", "blot", ".", "(", "H", ")", "Results", "of", "western", "blot", "analysis", "involving", "dystrophin", "antibodies", "Mandys106", "and", "dys1", ",", "of", "total", "protein", "extracts", "(", "80", "µg", ",", "following", "protein", "concentration", "by", "Amicon", "Ultra", "-", "0", ".", "5", "centrifugal", "filter", "devices", ",", "Millipore", ")", "obtained", "from", "pre", "-", "treatment", "and", "post", "-", "treatment", "biopsy", "specimens", "of", "Pt", "06", "(", "gastrocnemius", ")", ";", "Ct", "was", "used", "as", "positive", "dystrophin", "control", ".", "Below", ",", "bands", "corresponding", "to", "myosin", "heavy", "chain", "are", "shown", "as", "loading", "control", ".", "Bands", "corresponding", "approximately", "to", "full", "length", "dystrophin", "are", "observed", "in", "pre", "and", "post", "-", "treatment", "samples", "with", "both", "antibodies", "Bands", "in", "pre", "-", "treatment", "sample", "appeared", "higher", "in", "amount", "as", "compared", "to", "post", "-", "treatment", "sample", ".", "A", "schematic", "representation", "of", "the", "dystrophin", "point", "mutation", "(", "black", "vertical", "bar", ")", "and", "the", "region", "recognized", "by", "used", "antibodies", "is", "depicted", "above", "the", "western", "blot", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Confocal immunofluorescence of muscle biopsy from Pt 01 (tibialis anterior post-treatment) stained with anti-dystrophin dys1 antibody (which recognizes protein fragment encoded by exons 26-30, green signal) and anti laminin-2 (to delineate muscle fibers, red signal); dapi identifies nuclei (blue signal). In the left image only anti dystrophin staining is shown. No dystrophin positive fibers were observed.(B) Confocal immunofluorescence of muscle biopsy from Pt 02 (tibialis anterior post-treatment) stained with anti-dystrophin dys1 antibody (green signal) and anti lamininin-2 (red signal); dapi identifies nuclei (blue signal). In the left image only anti dystrophin staining is shown. Some fiber shows mild and discontinuous dystrophin staining.(C) Immunofluorescence of muscle biopsy from Pt 05 taken before (left, gastrocnemius) and after treatment (right, gastrocnemius) stained with anti dystrophin dys2 antibody (which recognizes exon 77-79). The number and intensity of dystrophin-positive fibers is increased in the post-treatment biopsy.(D) Immunofluorescence of muscle biopsy from Pt 06 taken before (left, gastrocnemius) and after treatment (right, gastrocnemius) stained with anti dystrophin dys2 antibody. Few fibers show scattered dystrophin staining, without obvious differences between pre and post-treatment samples.(E) Results of western blot analysis involving dystrophin antibodies dys1, Mandys18 and Manex46e (recognizing respectively exon 26-30, 17-35, and 46), of total protein extracts (20 µg) obtained from post-treatment biopsy specimens of Pt 01 (tibialis anterior muscle); Ct was used as positive dystrophin control. Below, bands corresponding to myosin heavy chain are shown as loading control. No bands corresponding to full length dystrophin were observed. A schematic representation of the deleted portion of the dystrophin and the region recognized by used antibodies is depicted above the western blot.(F) Results of western blot analysis involving dystrophin antibodies Mandys18 and Manex46e, of total protein extracts (10-20 µg) obtained from pre-treatment (performed at time of diagnosis) and post-treatment biopsy specimens of Pt 02 (tibialis anterior muscle); Ct was used as positive dystrophin control. Below, bands corresponding to myosin heavy chain are shown as loading control. One faint band corresponding to full length dystrophin is observed only in the post-treatment samples with both Mandys18 and Manex46e antibodies. A schematic representation of the deleted portion of the dystrophin and the region recognized by used antibodies is depicted above the western blot.(G) Results of western blot analysis involving dystrophin antibodies Mandys106 (recognizing exon 43) and dys1, of total protein extracts (80 µg, following protein concentration by Amicon Ultra-0.5 centrifugal filter devices, Millipore) obtained from pre-treatment and post-treatment biopsy specimens of Pt 05 (gastrocnemius); Ct was used as positive dystrophin control, CtDmd was used as dystrophin negative control. Below, bands corresponding to myosin heavy chain are shown as loading control. Bands corresponding approximately to full length dystrophin are observed in pre and post-treatment samples with both antibodies However, bands in post-treatment sample appeared higher in amount. A schematic representation of the dystrophin point mutation (black vertical bar) and the region recognized by used antibodies is depicted above the western blot.(H) Results of western blot analysis involving dystrophin antibodies Mandys106 and dys1, of total protein extracts (80 µg, following protein concentration by Amicon Ultra-0.5 centrifugal filter devices, Millipore) obtained from pre-treatment and post-treatment biopsy specimens of Pt 06 (gastrocnemius); Ct was used as positive dystrophin control. Below, bands corresponding to myosin heavy chain are shown as loading control. Bands corresponding approximately to full length dystrophin are observed in pre and post-treatment samples with both antibodies Bands in pre-treatment sample appeared higher in amount as compared to post-treatment sample. A schematic representation of the dystrophin point mutation (black vertical bar) and the region recognized by used antibodies is depicted above the western blot."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Axial", "T1", "-", "weighted", "images", "of", "the", "right", "thighs", "obtained", "in", "patients", "immediately", "before", "(", "upper", "panel", ")", "and", "18", "months", "after", "MAB", "infusion", ".", "Please", "note", "the", "progression", "of", "fatty", "degeneration", "and", "atrophy", "except", "for", "Pt", "05", "where", "no", "evident", "modifications", "can", "be", "detected", ".", "(", "B", ")", "Representative", "percentile", "of", "MRI", "quantitative", "parameters", "in", "transplanted", "patients", "compared", "to", "untreated", "patients", ".", "SIR", "(", "left", "image", ")", "and", "MVI", "(", "right", "image", ")", "of", "the", "quadriceps", ".", "Red", "line", ":", "Pt", "01", ";", "dotted", "green", "line", ":", "Pt", "02", ";", "dotted", "purple", "line", ":", "Pt", "03", ";", "dotted", "dark", "blue", "line", ":", "Pt", "05", ";", "dotted", "light", "blue", "line", ":", "Pt", "06", ")", ".", "Empty", "dots", "correspond", "to", "pre", "-", "treatment", "measures", ".", "Orange", "dots", "correspond", "to", "post", "-", "transplantation", "measurement", ".", "The", "black", "line", "corresponds", "to", "the", "median", ",", "while", "gray", "dotted", "lines", "to", "75", "°", ",", "90", "°", "and", "95", "°", "percentile", ".", "Please", "note", "the", "modification", "of", "the", "trend", "of", "Pt", "05", "after", "treatment", ".", "(", "C", ")", "Representative", "quantile", "spline", "regressions", "of", "post", "-", "transplant", "trend", "amelioration", "of", "MRI", "quantitative", "parameters", "in", "Pt", "05", ".", "Upper", "left", ":", "SIR", "of", "the", "quadriceps", ".", "Lower", "left", ":", "SIR", "of", "thigh", "flexor", "muscles", ".", "Upper", "right", ":", "MVI", "of", "the", "quadriceps", ".", "Lower", "right", ":", "MVI", "of", "the", "semitendinosus", "muscles", ".", "Please", "note", "the", "significant", "modification", "of", "the", "patient", "trend", "(", "red", "lines", ")", "compared", "to", "median", "measurements", "obtained", "with", "85", "MRI", "examinations", "of", "untreated", "patients", ".", "Empty", "dots", "correspond", "to", "pre", "-", "treatment", "measures", ".", "Full", "dots", "correspond", "to", "post", "-", "transplantation", "measurement", ".", "The", "grey", "dotted", "line", "corresponds", "to", "the", "time", "of", "the", "first", "intra", "-", "arterial", "transplantation", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Axial T1-weighted images of the right thighs obtained in patients immediately before (upper panel) and 18 months after MAB infusion. Please note the progression of fatty degeneration and atrophy except for Pt 05 where no evident modifications can be detected. (B) Representative percentile of MRI quantitative parameters in transplanted patients compared to untreated patients. SIR (left image) and MVI (right image) of the quadriceps. Red line: Pt 01; dotted green line: Pt 02; dotted purple line: Pt 03; dotted dark blue line: Pt 05; dotted light blue line: Pt 06). Empty dots correspond to pre-treatment measures. Orange dots correspond to post-transplantation measurement. The black line corresponds to the median, while gray dotted lines to 75°, 90° and 95° percentile. Please note the modification of the trend of Pt 05 after treatment.(C) Representative quantile spline regressions of post-transplant trend amelioration of MRI quantitative parameters in Pt 05. Upper left: SIR of the quadriceps. Lower left: SIR of thigh flexor muscles. Upper right: MVI of the quadriceps. Lower right: MVI of the semitendinosus muscles. Please note the significant modification of the patient trend (red lines) compared to median measurements obtained with 85 MRI examinations of untreated patients. Empty dots correspond to pre-treatment measures. Full dots correspond to post-transplantation measurement. The grey dotted line corresponds to the time of the first intra-arterial transplantation."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "North", "Star", "scale", "measurement", "(", "NSAA", "score", ")", "plotted", "against", "age", "of", "ambulant", "DMD", "patients", "before", ",", "throughout", "and", "after", "MAB", "clinical", "trial", ".", "Arrows", "indicate", "time", "points", "of", "MAB", "infusion", ".", "Dotted", "line", "indicates", "the", "time", "period", "in", "which", "Pt05", "spontaneously", "suspended", "steroids", "treatment", "without", "communication", "to", "parents", "and", "clinicians", ".", "Pt", "02", "and", "Pt", "05", "showed", "score", "stabilization", "throughout", "eight", "months", "of", "MAB", "infusions", ";", "Pt05", "showed", "stabilization", "even", "in", "the", "subsequent", "period", ",", "whereas", "Pt02", "showed", "progressive", "deterioration", "until", "lost", "of", "ambulation", ".", "Pt", "03", "showed", "progressive", "deterioration", "throughout", "MAB", "infusion", "and", "lost", "ambulation", "soon", "after", "the", "end", "of", "the", "trial", ".", "(", "B", ")", "Six", "minute", "walking", "test", "(", "meters", ")", "plotted", "against", "age", "of", "ambulant", "DMD", "patients", "before", ",", "throughout", "and", "after", "MAB", "clinical", "trial", ".", "Arrows", "indicate", "time", "points", "of", "MAB", "infusion", ".", "Dotted", "line", "indicates", "the", "time", "period", "in", "which", "Pt05", "spontaneously", "suspended", "steroids", "treatment", "without", "communication", "to", "parents", "and", "clinicians", ".", "Pt", "02", "and", "Pt", "05", "showed", "score", "stabilization", "throughout", "8", "months", "of", "MAB", "infusions", ";", "Pt05", "showed", "stabilization", "even", "in", "the", "subsequent", "period", ",", "whereas", "Pt", "02", "showed", "progressive", "deterioration", "until", "lost", "of", "ambulation", ".", "Pt", "03", "showed", "progressive", "deterioration", "throughout", "MAB", "infusion", "and", "lost", "ambulation", "soon", "after", "the", "end", "of", "the", "trial", ".", "(", "C", ")", "Time", "to", "run", "10", "meters", "(", "time", ")", "plotted", "against", "age", "of", "ambulant", "DMD", "patients", "before", ",", "throughout", "and", "after", "MAB", "clinical", "trial", ".", "Arrows", "indicate", "time", "points", "of", "MAB", "infusion", ".", "Dotted", "line", "indicates", "the", "time", "period", "in", "which", "Pt", "05", "spontaneously", "suspended", "steroids", "treatment", "without", "communication", "to", "parents", "and", "clinicians", ".", "Pt", "02", "and", "Pt", "05", "showed", "time", "stabilization", "throughout", "8", "months", "of", "MAB", "infusions", ";", "Pt", "05", "showed", "stabilization", "even", "in", "the", "subsequent", "period", ",", "whereas", "Pt", "02", "showed", "progressive", "increase", "of", "time", "until", "lost", "of", "ambulation", ".", "Pt", "03", "showed", "progressive", "increase", "of", "time", "throughout", "MAB", "infusion", "and", "lost", "ambulation", "soon", "after", "the", "end", "of", "the", "trial", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) North Star scale measurement (NSAA score) plotted against age of ambulant DMD patients before, throughout and after MAB clinical trial. Arrows indicate time points of MAB infusion. Dotted line indicates the time period in which Pt05 spontaneously suspended steroids treatment without communication to parents and clinicians. Pt 02 and Pt 05 showed score stabilization throughout eight months of MAB infusions; Pt05 showed stabilization even in the subsequent period, whereas Pt02 showed progressive deterioration until lost of ambulation. Pt 03 showed progressive deterioration throughout MAB infusion and lost ambulation soon after the end of the trial.(B) Six minute walking test (meters) plotted against age of ambulant DMD patients before, throughout and after MAB clinical trial. Arrows indicate time points of MAB infusion. Dotted line indicates the time period in which Pt05 spontaneously suspended steroids treatment without communication to parents and clinicians. Pt 02 and Pt 05 showed score stabilization throughout 8 months of MAB infusions; Pt05 showed stabilization even in the subsequent period, whereas Pt 02 showed progressive deterioration until lost of ambulation. Pt 03 showed progressive deterioration throughout MAB infusion and lost ambulation soon after the end of the trial.(C) Time to run 10 meters (time) plotted against age of ambulant DMD patients before, throughout and after MAB clinical trial. Arrows indicate time points of MAB infusion. Dotted line indicates the time period in which Pt 05 spontaneously suspended steroids treatment without communication to parents and clinicians. Pt 02 and Pt 05 showed time stabilization throughout 8 months of MAB infusions; Pt 05 showed stabilization even in the subsequent period, whereas Pt 02 showed progressive increase of time until lost of ambulation. Pt 03 showed progressive increase of time throughout MAB infusion and lost ambulation soon after the end of the trial."}
{"words": ["Figure", "6Panel", "A", ":", "viral", "and", "donor", "specific", "T", "-", "cell", "responses", "were", "measured", "by", "IFN", "-", "γELISpot", "at", "different", "time", "points", ":", "before", "the", "beginning", "of", "treatment", "(", "PRE", ")", ",", "prior", "to", "each", "infusion", "and", "2", "months", "after", "the", "fourth", "infusion", ".", "Infusions", "are", "indicated", "by", "arrows", ".", "Patient", "'", "s", "peripheral", "blood", "mononuclear", "cells", "(", "PBMC", ")", "were", "challenged", "with", "irradiated", "autologous", "lymphoblastoid", "cell", "lines", "(", "EBV", "line", "host", ")", ",", "with", "cytomegalovirus", "glycin", "extract", "(", "CMV", "antigen", ")", "(", "Gehrz", "et", "al", ",", "1987", ")", "and", "with", "the", "following", "irradiated", "cells", "harvested", "from", "the", "donor", ":", "untreated", "mesoangioblasts", "(", "MABdonor", ")", ",", "MAB", "activated", "by", "48", "hour", "-", "exposure", "to", "500", "IU", "/", "mL", "IFN", "-", "γ", "(", "γMABdonor", ")", ",", "myotubes", "differentiated", "from", "MAB", "(", "myotubesdonor", ")", "and", "PBMC", "(", "PBMCdonor", ")", ".", "Polyclonal", "stimulation", "(", "phytohemagglutinin", ",", "PHA", ")", "was", "used", "as", "positive", "control", ".", "Donor", "PBMC", "were", "challenged", "with", "autologous", "targets", "as", "negative", "controls", ".", "Results", "are", "expressed", "as", "number", "of", "specific", "cells", "/", "105PBMC", "and", "calculated", "according", "to", "the", "following", "formula", ":", "number", "of", "spots", "produced", "by", "patient", "'", "s", "PBMC", "-", "number", "of", "spots", "produced", "by", "donor", "'", "s", "PBMC", ".", "Results", "for", "patientsPt", "01", ",", "Pt", "02", ",", "Pt", "03", ",", "Pt", "05", "and", "Pt", "06", "are", "shown", ".", "Panel", "B", ":", "dystrophin", "specific", "T", "-", "cell", "responses", "were", "measured", "by", "IFN", "-", "γ", "ELISpot", "at", "two", "time", "points", ":", "before", "the", "beginning", "of", "treatment", "(", "PRE", ",", "white", "bar", ")", "and", "2", "months", "after", "the", "fourth", "infusion", "(", "black", "bar", ")", ".", "PBMC", "were", "challenged", "with", "a", "library", "of", "15", "-", "mer", "overlapping", "peptides", "covering", "the", "protein", "sequence", "(", "pool", "1", "-", "8", ")", ".", "Polyclonal", "stimulation", "(", "phytohemagglutinin", ",", "PHA", ")", "was", "used", "as", "positive", "control", ".", "The", "grey", "area", "represents", "the", "threshold", "calculated", "on", "a", "cohort", "of", "healthy", "donors", ".", "Results", "for", "Pt", "01", ",", "Pt", "02", ",", "Pt", "03", ",", "Pt", "05", "and", "Pt", "06", "are", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Panel A: viral and donor specific T-cell responses were measured by IFN-γELISpot at different time points: before the beginning of treatment (PRE), prior to each infusion and 2 months after the fourth infusion. Infusions are indicated by arrows. Patient's peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were challenged with irradiated autologous lymphoblastoid cell lines (EBV line host), with cytomegalovirus glycin extract (CMV antigen)(Gehrz et al, 1987) and with the following irradiated cells harvested from the donor: untreated mesoangioblasts (MABdonor), MAB activated by 48 hour-exposure to 500 IU/mL IFN-γ (γMABdonor), myotubes differentiated from MAB (myotubesdonor) and PBMC (PBMCdonor). Polyclonal stimulation (phytohemagglutinin, PHA) was used as positive control. Donor PBMC were challenged with autologous targets as negative controls. Results are expressed as number of specific cells/105PBMC and calculated according to the following formula: number of spots produced by patient's PBMC - number of spots produced by donor's PBMC. Results for patientsPt 01, Pt 02, Pt 03, Pt 05 and Pt 06 are shown.Panel B: dystrophin specific T-cell responses were measured by IFN-γ ELISpot at two time points: before the beginning of treatment (PRE, white bar) and 2 months after the fourth infusion (black bar). PBMC were challenged with a library of 15-mer overlapping peptides covering the protein sequence (pool 1-8). Polyclonal stimulation (phytohemagglutinin, PHA) was used as positive control. The grey area represents the threshold calculated on a cohort of healthy donors. Results for Pt 01, Pt 02, Pt 03, Pt 05 and Pt 06 are shown."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "ELISA", "assa", "from", "brain", "lysates", "showing", "higher", "PTX3", "expression", "in", "late", "embryonic", "and", "early", "postnatal", "brain", ",", "and", "lower", "in", "the", "adult", "brain", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "(", "A", ")", "ng", "PTX3", "/", "mg", "of", "total", "proteins", ",", "E15", "=", "5", ",", "702", "±", "0", ".", "365", ",", "P0", "=", "4", ".", "904", "±", "0", ".", "865", ",", "P7", "=", "3", ".", "818", "±", "0", ".", "530", ",", "P14", "=", "2", ".", "140", "±", "0", ".", "107", ",", "P28", "=", "3", ".", "125", "±", "0", ".", "525", ",", "P90", "=", "2", ".", "212", "±", "0", ".", "324", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "analysis", "of", "variance", "followed", "by", "post", "hoc", "Tukey", "test", ":", "E15", "vs", "P14", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "001", ",", "E15", "vs", "P28", "*", "p", "=", "0", ".", "022", ",", "E15", "vs", "P90", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "002", ";", "P0", "vs", "P14", "$", "p", "=", "0", ".", "013", ",", "P0", "vs", "P90", "$", "p", "=", "0", ".", "016", ";", "4", "animals", "for", "each", "time", "point", "(", "B", ")", "real", "time", "qPCR", "from", "brain", "lysates", "showing", "higher", "PTX3", "expression", "in", "late", "embryonic", "and", "early", "postnatal", "brain", ",", "and", "lower", "in", "the", "adult", "brain", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "(", "B", ")", "qPCR", "fold", "change", "normalized", "on", "E15", ",", "E15", "=", "1", ".", "037", "±", "0", ".", "154", ",", "P0", "=", "0", ".", "711", "±", "0", ".", "094", ",", "P7", "=", "0", ".", "472", "±", "0", ".", "0524", ",", "P14", "=", "0", ".", "135", "±", "0", ".", "007", ",", "P28", "=", "0", ".", "168", "±", "0", ".", "020", ",", "P90", "=", "0", ".", "183", "±", "0", ".", "029", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "analysis", "of", "variance", "followed", "by", "post", "hoc", "Tukey", "test", ":", "E15", "vs", "P7", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0001", ",", "E15", "vs", "P14", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "E15", "vs", "P2", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "E15", "vs", "P90", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "P0", "vs", "P14", "$", "$", "$", "p", "=", "0", ".", "0007", ",", "P0", "vs", "P28", "$", "$", "p", "=", "0", ".", "001", ",", "P0", "vs", "P90", "$", "$", "p", "=", "0", ".", "002", ";", "4", "animals", "for", "each", "time", "pointQuantitation", "of", "PTX3", "levels", "in", "pure", "astrocyte", "and", "neuronal", "cultures", ".", "(", "C", ")", "ELISA", "assay", "performed", "on", "astrocyte", "and", "neuronal", "culture", "mediu", "Only", "astrocytes", "release", "PTX3", "(", "ELISA", ",", "astro", "=", "3", ".", "699", "±", "1", ".", "129", ",", "neu", "=", "N", ".", "D", ".", ",", "not", "detectable", ".", "3", "independent", "astrocyte", "cultures", "evaluated", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEMQuantitation", "of", "PTX3", "levels", "in", "pure", "astrocyte", "and", "neuronal", "cultures", "(", "D", ")", "rea", "time", "qPCR", "performed", "on", "astrocyte", "and", "neuronal", "lysates", "qPCR", "astro", "=", "1", ".", "167", "±", "0", ".", "288", ";", "neu", "=", "0", ".", "148", "±", "0", ".", "057", ";", "Mann", "-", "Whitney", "test", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0095", ".", "2", "independent", "neuronal", "cultures", "evaluated", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) ELISA assa from brain lysates showing higher PTX3 expression in late embryonic and early postnatal brain, and lower in the adult brain. Data are presented as mean±SEM. (A) ng PTX3/mg of total proteins, E15=5,702±0.365, P0=4.904±0.865, P7=3.818±0.530, P14=2.140±0.107, P28=3.125±0.525, P90=2.212±0.324. One-way ANOVA analysis of variance followed by post hoc Tukey test: E15 vs P14 **p=0.001, E15 vs P28 *p=0.022, E15 vs P90 **p=0.002; P0 vs P14 $p=0.013, P0 vs P90 $p=0.016 ; 4 animals for each time point(B) real time qPCR from brain lysates showing higher PTX3 expression in late embryonic and early postnatal brain, and lower in the adult brain. Data are presented as mean±SEM (B) qPCR fold change normalized on E15, E15=1.037±0.154, P0=0.711±0.094, P7=0.472±0.0524, P14=0.135±0.007, P28=0.168±0.020, P90=0.183±0.029. One-way ANOVA analysis of variance followed by post hoc Tukey test: E15 vs P7 ***p=0.0001, E15 vs P14 **** p<0.0001, E15 vs P2 ****p<0.0001, E15 vs P90 ****p<0.0001; P0 vs P14 $$$p=0.0007, P0 vs P28 $$p=0.001, P0 vs P90 $$p=0.002; 4 animals for each time pointQuantitation of PTX3 levels in pure astrocyte and neuronal cultures. (C) ELISA assay performed on astrocyte and neuronal culture mediu Only astrocytes release PTX3 (ELISA, astro=3.699±1.129, neu=N.D., not detectable. 3 independent astrocyte cultures evaluated Data are presented as mean±SEMQuantitation of PTX3 levels in pure astrocyte and neuronal cultures (D) rea time qPCR performed on astrocyte and neuronal lysates qPCR astro=1.167±0.288; neu=0.148±0.057; Mann-Whitney test **p=0.0095. 2 independent neuronal cultures evaluated. Data are presented as mean±SEM"}
{"words": ["Figure", "2A", ")", "Representative", "mEPSC", "traces", "recorded", "from", "control", "and", "PTX3", "-", "treated", "(", "1µg", "/", "ml", ";", "48hrs", ")", "neurons", ".", "B", ")", "mEPSC", "frequency", "quantitation", "(", "Hz", ",", "Ctr", "=", "0", ".", "618", "±", "0", ".", "069", ";", "PTX3", "=", "1", ".", "991", "±", "0", ".", "313", ";", "Number", "of", "neurons", ":", "Ctr", "=", "22", ",", "PTX3", "=", "16", ";", "3", "independent", "experiments", ",", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "Data", "are", "presented", "as", "a", "distribution", "plus", "mean", "±", "SEM", ")", ".", "C", ")", "mEPSC", "amplitude", "quantitation", "and", "cumulative", "probability", "distribution", "of", "mEPSC", "amplitudes", "(", "pA", ",", "Ctr", "=", "12", ".", "76", "±", "0", ".", "813", ";", "PTX3", "=", "16", ".", "07", "±", "0", ".", "709", ".", "Number", "of", "neurons", ":", "Ctr", "=", "22", ",", "PTX3", "=", "16", ";", "3", "independent", "experiments", ",", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "Data", "are", "presented", "as", "a", "distribution", "plus", "mean", "±", "SEM", ".", "Cumulative", "probability", "distributions", "are", "analyzed", "by", "Kolmogorov", "-", "Smirnov", "testD", ")", "Representative", "images", "showing", "14DIV", "neurons", "stained", "for", "surface", "AMPAR", "(", "GluA", ",", "green", ")", ",", "the", "presynaptic", "protein", "Bassoon", "(", "blue", ")", "and", "tubulin", "(", "red", ")", "in", "the", "different", "tested", "conditions", ".", "Arrowheads", "point", "to", "postsynaptic", "GluA", "clusters", ".", "Inset", ":", "Example", "of", "surface", "synaptic", "AMPARs", "cluster", "(", "GluA", "&", "Bsn", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "µm", ".", "E", ")", "Quantification", "of", "the", "surface", "synaptic", "AMPARs", "(", "GluA", "&", "Bsn", ")", "normalized", "to", "the", "total", "number", "of", "Bsn", "shows", "a", "statistically", "significant", "increase", "after", "TTX", "or", "PTX3", "exposure", "(", "Ctr", "=", "1", "±", "0", ".", "051", ",", "TTX", "=", "1", ".", "512", "±", "0", ".", "080", ",", "PTX3", "=", "1", ".", "294", "±", "0", ".", "081", ",", "PTX3", "heat", "-", "inactivated", "=", "0", ".", "959", "±", "0", ".", "044", ";", "number", "of", "fields", "examined", ":", "27", ",", "36", ",", "37", ",", "22", ",", "19", "respectively", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", "analysis", "of", "variance", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "followed", "by", "post", "hoc", "Tukey", "test", "for", "multiple", "comparison", "as", "indicated", "in", "figure", ";", "3", "independent", "experiments", ",", "data", "are", "presented", "as", "normalized", "mean", "values", "±", "SEM", ")", ".", "F", ")", "1hr", "of", "PTX3", "administration", "is", "not", "sufficient", "to", "elicit", "an", "increase", "in", "synaptic", "GluA", "content", "(", "Ctr", ":", "1", "±", "0", ".", "065", ",", "PTX3", ":", "1", ".", "023", "±", "0", ".", "068", ";", "number", "of", "fields", ":", "Ctr", "=", "26", ",", "PTX3", "=", "26", ";", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "3", "independent", "experiments", ",", "data", "are", "presented", "as", "normalized", "mean", "values", "±", "SEM", ")", "G", ")", "Representative", "mEPSC", "traces", "recorded", "from", "control", ",", "C", "-", "term", "PTX3", "fragment", "or", "N", "-", "term", "PTX3", "fragment", "-", "treated", "cultures", ".", "H", ")", "mEPSC", "frequency", "quantitation", "(", "Hz", ",", "Ctr", "=", "0", ".", "668", "±", "0", ".", "078", ";", "C", "-", "term", "=", "0", ".", "523", "±", "0", ".", "056", ";", "N", "-", "term", "=", "1", ".", "228", "±", "0", ".", "121", ".", "Number", "of", "neurons", ":", "Ctr", "=", "23", ",", "C", "-", "term", "=", "10", ",", "N", "-", "term", "=", "23", ";", "3", "independent", "experiments", ".", "Kruskall", "-", "Wallis", "test", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", "followed", "by", "Dunn", "\"", "s", "test", "as", "indicated", ",", "data", "are", "presented", "as", "a", "distribution", "plus", "mean", "±", "SEM", ")", ".", "I", ")", "mEPSC", "amplitude", "quantitation", "(", "pA", ",", "Ctr", "=", "16", ".", "81", "±", "0", ".", "78", ";", "C", "-", "term", "=", "15", ".", "79", "±", "1", ".", "37", ";", "N", "-", "term", "=", "19", ".", "78", "±", "0", ".", "87", ".", "Number", "of", "neurons", ":", "Ctr", "=", "23", ",", "C", "-", "term", "=", "10", ",", "N", "-", "term", "=", "23", ";", "3", "independent", "experiments", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "analysis", "of", "variance", ",", "p", "=", "0", ".", "013", "followed", "by", "post", "hoc", "Tukey", "test", "as", "indicated", "in", "figure", ",", "data", "are", "presented", "as", "a", "distribution", "plus", "mean", "±", "SEM", ")", "and", "cumulative", "probability", "distribution", "of", "mEPSC", "amplitudes", "(", "Kolmogorov", "-", "SmirnovJ", ")", "Representative", "images", "of", "14DIV", "neurons", "stained", "for", "surface", "AMPARs", "(", "GluA", ",", "green", ")", ",", "the", "presynaptic", "protein", "Bassoon", "(", "blue", ")", "and", "tubulin", "(", "red", ")", "in", "the", "different", "tested", "conditions", ".", "Arrowheads", "point", "to", "postsynaptic", "GluA", "clusters", ".", "Scale", "bar", ":", "5µm", ".", "K", ")", "Quantification", "of", "the", "surface", "synaptic", "AMPARs", "normalized", "to", "the", "total", "number", "of", "Bsn", "shows", "an", "increase", "upon", "N", "-", "terminal", "peptide", "application", ",", "but", "not", "upon", "C", "-", "terminal", "peptide", "exposure", ".", "TTX", "is", "used", "as", "positive", "control", "(", "Ctr", "=", "1", ".", "000", "±", "0", ".", "066", ".", "TTX", "=", "1", ".", "395", "±", "0", ".", "113", ",", "C", "-", "term", "=", "0", ".", "717", "±", "0", ".", "047", ",", "N", "-", "term", "=", "1", ".", "349", "±", "0", ".", "069", ".", "Number", "of", "fields", "examined", ":", "55", ",", "31", ",", "18", ",", "54", ",", "respectively", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", "analysis", "of", "variance", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", "followed", "by", "post", "hoc", "Tukey", "test", "as", "indicated", "in", "figure", ";", "at", "least", "3", "independent", "experiments", ",", "data", "are", "presented", "as", "normalized", "mean", "values", "±", "SEM", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A) Representative mEPSC traces recorded from control and PTX3-treated (1µg/ml; 48hrs) neurons. B) mEPSC frequency quantitation (Hz, Ctr=0.618±0.069; PTX3=1.991±0.313; Number of neurons: Ctr=22, PTX3=16; 3 independent experiments, Mann-Whitney test. Data are presented as a distribution plus mean±SEM). C) mEPSC amplitude quantitation and cumulative probability distribution of mEPSC amplitudes (pA, Ctr=12.76±0.813; PTX3=16.07±0.709. Number of neurons: Ctr=22, PTX3=16; 3 independent experiments, Mann-Whitney test. Data are presented as a distribution plus mean±SEM. Cumulative probability distributions are analyzed by Kolmogorov-Smirnov testD) Representative images showing 14DIV neurons stained for surface AMPAR (GluA, green), the presynaptic protein Bassoon (blue) and tubulin (red) in the different tested conditions. Arrowheads point to postsynaptic GluA clusters. Inset: Example of surface synaptic AMPARs cluster (GluA&Bsn). Scale bar: 5 µm. E) Quantification of the surface synaptic AMPARs (GluA&Bsn) normalized to the total number of Bsn shows a statistically significant increase after TTX or PTX3 exposure (Ctr=1±0.051, TTX=1.512±0.080, PTX3=1.294±0.081, PTX3 heat-inactivated=0.959±0.044; number of fields examined: 27, 36, 37, 22, 19 respectively; one-way ANOVA analysis of variance, p<0.0001, followed by post hoc Tukey test for multiple comparison as indicated in figure; 3 independent experiments, data are presented as normalized mean values±SEM). F) 1hr of PTX3 administration is not sufficient to elicit an increase in synaptic GluA content (Ctr: 1±0.065, PTX3: 1.023±0.068; number of fields: Ctr=26, PTX3=26; unpaired t-test, 3 independent experiments, data are presented as normalized mean values±SEM)G) Representative mEPSC traces recorded from control, C-term PTX3 fragment or N-term PTX3 fragment-treated cultures. H) mEPSC frequency quantitation (Hz, Ctr=0.668±0.078; C-term=0.523±0.056; N-term=1.228±0.121. Number of neurons: Ctr=23, C-term=10, N-term=23; 3 independent experiments. Kruskall-Wallis test, p<0.0001 followed by Dunn\"s test as indicated, data are presented as a distribution plus mean±SEM). I) mEPSC amplitude quantitation (pA, Ctr=16.81±0.78; C-term=15.79±1.37; N-term=19.78±0.87. Number of neurons: Ctr=23, C-term=10, N-term=23; 3 independent experiments. One-way ANOVA analysis of variance, p=0.013 followed by post hoc Tukey test as indicated in figure, data are presented as a distribution plus mean±SEM) and cumulative probability distribution of mEPSC amplitudes (Kolmogorov-SmirnovJ) Representative images of 14DIV neurons stained for surface AMPARs (GluA, green), the presynaptic protein Bassoon (blue) and tubulin (red) in the different tested conditions. Arrowheads point to postsynaptic GluA clusters. Scale bar: 5µm. K) Quantification of the surface synaptic AMPARs normalized to the total number of Bsn shows an increase upon N-terminal peptide application, but not upon C-terminal peptide exposure. TTX is used as positive control (Ctr=1.000±0.066. TTX=1.395±0.113, C-term=0.717±0.047, N-term=1.349±0.069. Number of fields examined: 55, 31, 18, 54, respectively; one-way ANOVA analysis of variance, p<0.0001 followed by post hoc Tukey test as indicated in figure; at least 3 independent experiments, data are presented as normalized mean values±SEM). "}
{"words": ["Figure", "3A", ")", "Low", "and", "high", "magnification", "images", "of", "control", "and", "PTX3", "-", "treated", "neurons", "stained", "for", "the", "PNN", "main", "component", ",", "aggrecan", "(", "red", ")", ",", "the", "synaptic", "proteins", "PSD95", "(", "green", ")", "and", "Bsn", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "5µmB", "-", "D", ")", "PTX3", "application", "induces", "a", "remodeling", "of", "the", "PNN", "in", "culture", ",", "as", "assessed", "by", "the", "increase", "mean", "intensity", "and", "integrated", "density", "value", "of", "the", "synapse", "-", "co", "-", "localizing", "aggrecan", "signal", "whereas", "no", "difference", "in", "the", "total", "area", "of", "aggrecan", "is", "evident", "(", "integrated", "density", ":", "Ctr", "=", "1", "±", "0", ".", "103", ",", "PTX3", "=", "1", ".", "874", "±", "0", ".", "197", ";", "mean", "intensity", ":", "Ctr", "=", "1", ".", "000", "±", "0", ".", "088", ",", "PTX3", "=", "1", ".", "556", "±", "0", ".", "107", ";", "total", "area", ":", "Ctr", "=", "1", "±", "0", ".", "179", ",", "PTX3", "=", "0", ".", "982", "±", "0", ".", "149", ".", "Number", "of", "fields", "examined", ":", "26", "Ctr", ",", "22", "PTX3", ";", "Mann", "-", "Whitney", "test", ";", "3", "independent", "experiments", ",", "data", "are", "presented", "as", "normalized", "mean", "values", "±", "SEM", ")", "E", ")", "Overnight", "treatment", "with", "hyaluronidase", "destroys", "PNN", "as", "shown", "by", "immunofluorescence", "for", "aggrecan", "(", "red", ")", ",", "DAPI", "(", "cyan", ")", "and", "βIII", "-", "tubulin", "(", "green", ")", "and", "confocal", "analysis", ".", "Scale", "bar", ":", "20µmF", ")", "Representative", "images", "showing", "14DIV", "neurons", "stained", "for", "surface", "AMPARs", "(", "GluA", ",", "green", ")", ",", "the", "presynaptic", "protein", "Bassoon", "(", "blue", ")", "and", "tubulin", "(", "red", ")", "in", "the", "different", "tested", "conditions", ".", "Arrowheads", "point", "to", "postsynaptic", "GluA", "clusters", ".", "Scale", "bar", ":", "5µmG", ")", "HAse", "treatment", "blocks", "PTX3", "-", "induced", "synaptic", "surface", "AMPA", "receptors", "clustering", "(", "Ctr", "=", "1", ".", "000", "±", "0", ".", "075", ",", "PTX3", "=", "1", ".", "425", "±", "0", ".", "088", ",", "PTX3", "+", "HAse", "=", "0", ".", "961", "±", "0", ".", "053", ",", "HAse", "=", "1", ".", "080", "±", "0", ".", "087", ".", "Number", "of", "fields", "examined", ":", "37", ",", "23", ",", "53", ",", "28", "respectively", ";", "Kruskall", "-", "Wallis", "test", ",", "p", "=", "0", ".", "0004", "followed", "by", "post", "hoc", "Tukey", "test", "as", "indicated", "in", "figure", ";", "3", "independent", "experiments", ",", "data", "are", "presented", "as", "normalized", "mean", "value", "±", "SEM", ")", "H", ")", "Representative", "images", "showing", "14DIV", "WT", "and", "TSG6", "KO", "neurons", "stained", "for", "surface", "AMPARs", "(", "GluA", ",", "green", ")", ",", "the", "presynaptic", "protein", "Bassoon", "(", "blue", ")", "and", "tubulin", "(", "red", ")", "in", "the", "different", "tested", "conditions", ".", "Arrowheads", "point", "to", "postsynaptic", "GluA", "clusters", ".", "Scale", "bar", ":", "5µmI", ")", "Synaptic", "surface", "GluA", "quantitation", "showing", "no", "effect", "of", "PTX3", "treatment", "in", "TSG6", "KO", "cultures", ".", "On", "the", "contrary", "WT", "cultures", "(", "from", "littermates", ")", "display", "increased", "surface", "GluA", "&", "Bsn", "/", "Bsn", "upon", "PTX3", "treatment", ".", "A", "significant", "enhancement", "of", "surface", "GluA", "receptors", "was", "induced", "by", "TTX", "in", "both", "TSG6", "KO", "and", "WT", "cultures", "(", "WT", "=", "1", "±", "0", ".", "06", ";", "WT", "+", "PTX3", "=", "1", ".", "389", "±", "0", ".", "113", ";", "WT", "+", "TTX", "=", "1", ".", "698", "±", "0", ".", "109", ";", "Number", "of", "fields", "examined", ":", "40", ",", "39", ",", "32", "respectively", ";", "Kruskall", "-", "Wallis", "test", "p", "<", "0", ".", "0001", "followed", "by", "post", "hoc", "Dunn", "\"", "s", "test", ".", "TSG6", "KO", "=", "1", ".", "000", "±", "0", ".", "047", ";", "TSG6", "KO", "+", "PTX3", "=", "0", ".", "979", "±", "0", ".", "048", ";", "TSG6", "KO", "+", "TTX", "=", "1", ".", "363", "±", "0", ".", "077", ".", "Number", "of", "fields", "examined", ":", "54", ",", "57", ",", "29", "respectively", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", "analysis", "of", "variance", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", "followed", "by", "post", "hoc", "Tukey", "test", "as", "indicated", "in", "figure", ".", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "data", "are", "presented", "as", "normalized", "mean", "valuesJ", ")", "Representative", "mEPSC", "traces", "recorded", "from", "WT", "and", "TSG6", "KO", "littermates", "cultures", "treated", "or", "not", "with", "PTX3", "(", "1μg", "/", "ml", "for", "48hrs", ")", ".", "K", ")", "On", "the", "contrary", "of", "WT", "cultures", ",", "mEPSC", "frequency", "quantitation", "shows", "no", "increase", "in", "frequency", "in", "TSG6", "KO", "cultures", "when", "treated", "with", "PTX3", "(", "Normalized", "Frequency", ",", "WT", "Ctr", ":", "1", ".", "000", "±", "0", ".", "074", ";", "Wt", "+", "PTX3", "=", "1", ".", "912", "±", "0", ".", "289", ";", "TSG6", "KO", "Ctr", "=", "1", "±", "0", ".", "079", ";", "TSG6", "KO", "+", "PTX3", "=", "1", ".", "226", "±", "0", ".", "096", ";", "22", ",", "20", ",", "30", ",", "24", "cells", "respectively", ",", "6", "TSG6", "KO", "mice", "and", "4", "WT", "littermates", ".", "One", "way", "ANOVA", "test", "p", "=", "0", ".", "002", "followed", "by", "post", "hoc", "Dunn", "'", "s", "test", ",", "data", "are", "presented", "as", "normalized", "mean", "±", "SEM", "plus", "the", "distribution", ")", ".", "L", ")", "Cumulative", "probability", "plot", "of", "mEPSC", "amplitude", "and", "average", "mEPSC", "amplitude", "quantitation", "(", "inset", ")", "showing", "no", "difference", "in", "amplitude", "(", "WT", "Ctr", ":", "1", ".", "000", "±", "0", ".", "034", ",", "Wt", "+", "PTX3", "=", "1", ".", "069", "±", "0", ".", "046", ",", "TSG6", "KO", "Ctr", "=", "1", ".", "000", "±", "0", ".", "028", ";", "TSG6", "KO", "+", "PTX3", "=", "1", ".", "074", "±", "0", ".", "67", ";", "22", ",", "20", ",", "30", ",", "24", "cells", "respectively", ",", "6", "TSG6", "KO", "mice", "and", "4", "WT", "littermates", ".", "One", "way", "ANOVA", "test", "p", "=", "0", ".", "817", "followed", "by", "post", "hoc", "Dunn", "'", "s", "test", ",", "data", "are", "presented", "as", "normalized", "mean", "±", "SEM", "plus", "the", "distribution", ".", "Cumulative", "distribution", "is", "analyzed", "by", "Kolmogorov", "-", "Smirnov", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A) Low and high magnification images of control and PTX3-treated neurons stained for the PNN main component, aggrecan (red), the synaptic proteins PSD95 (green) and Bsn (blue). Scale bar: 5µmB-D) PTX3 application induces a remodeling of the PNN in culture, as assessed by the increase mean intensity and integrated density value of the synapse-co-localizing aggrecan signal whereas no difference in the total area of aggrecan is evident (integrated density: Ctr=1±0.103, PTX3=1.874±0.197; mean intensity: Ctr=1.000±0.088, PTX3=1.556±0.107; total area: Ctr=1±0.179, PTX3=0.982±0.149. Number of fields examined: 26 Ctr, 22 PTX3; Mann-Whitney test; 3 independent experiments, data are presented as normalized mean values±SEM)E) Overnight treatment with hyaluronidase destroys PNN as shown by immunofluorescence for aggrecan (red), DAPI (cyan) and βIII-tubulin (green) and confocal analysis. Scale bar: 20µmF) Representative images showing 14DIV neurons stained for surface AMPARs (GluA, green), the presynaptic protein Bassoon (blue) and tubulin (red) in the different tested conditions. Arrowheads point to postsynaptic GluA clusters. Scale bar: 5µmG) HAse treatment blocks PTX3-induced synaptic surface AMPA receptors clustering (Ctr=1.000±0.075, PTX3=1.425±0.088, PTX3+HAse=0.961±0.053, HAse=1.080±0.087. Number of fields examined: 37, 23, 53, 28 respectively; Kruskall-Wallis test, p=0.0004 followed by post hoc Tukey test as indicated in figure; 3 independent experiments, data are presented as normalized mean value±SEM)H) Representative images showing 14DIV WT and TSG6 KO neurons stained for surface AMPARs (GluA, green), the presynaptic protein Bassoon (blue) and tubulin (red) in the different tested conditions. Arrowheads point to postsynaptic GluA clusters. Scale bar: 5µmI) Synaptic surface GluA quantitation showing no effect of PTX3 treatment in TSG6 KO cultures. On the contrary WT cultures (from littermates) display increased surface GluA&Bsn/Bsn upon PTX3 treatment. A significant enhancement of surface GluA receptors was induced by TTX in both TSG6 KO and WT cultures (WT=1±0.06; WT+PTX3=1.389±0.113; WT+TTX=1.698±0.109; Number of fields examined: 40, 39, 32 respectively; Kruskall-Wallis test p<0.0001 followed by post hoc Dunn\"s test. TSG6 KO=1.000±0.047; TSG6 KO+PTX3=0.979±0.048; TSG6 KO+TTX=1.363±0.077. Number of fields examined: 54, 57, 29 respectively; one-way ANOVA analysis of variance, p<0.0001 followed by post hoc Tukey test as indicated in figure. n=3 independent experiments, data are presented as normalized mean valuesJ) Representative mEPSC traces recorded from WT and TSG6 KO littermates cultures treated or not with PTX3 (1μg/ml for 48hrs). K) On the contrary of WT cultures, mEPSC frequency quantitation shows no increase in frequency in TSG6 KO cultures when treated with PTX3(Normalized Frequency, WT Ctr: 1.000±0.074; Wt+PTX3=1.912±0.289; TSG6 KO Ctr=1±0.079; TSG6 KO+PTX3=1.226±0.096; 22, 20, 30, 24 cells respectively, 6 TSG6 KO mice and 4 WT littermates. One way ANOVA test p=0.002 followed by post hoc Dunn's test, data are presented as normalized mean±SEM plus the distribution). L) Cumulative probability plot of mEPSC amplitude and average mEPSC amplitude quantitation (inset) showing no difference in amplitude (WT Ctr: 1.000±0.034, Wt+PTX3=1.069±0.046, TSG6 KO Ctr =1.000±0.028; TSG6 KO+PTX3=1.074±0.67; 22, 20, 30, 24 cells respectively, 6 TSG6 KO mice and 4 WT littermates. One way ANOVA test p=0.817 followed by post hoc Dunn's test, data are presented as normalized mean±SEM plus the distribution. Cumulative distribution is analyzed by Kolmogorov-Smirnov test). "}
{"words": ["Figure", "4A", ")", "Representative", "images", "showing", "14DIV", "neurons", "stained", "for", "surface", "AMPARs", "(", "GluA", ",", "green", ")", ",", "the", "presynaptic", "protein", "Bassoon", "(", "blue", ")", "and", "tubulin", "(", "red", ")", "in", "the", "different", "tested", "conditions", ".", "Arrowheads", "point", "to", "postsynaptic", "GluA", "clusters", ".", "Scale", "bar", ":", "5µmB", ")", "Blocking", "β1", "integrins", "activity", "by", "using", "the", "specific", "anti", "-", "β1", "Integrin", "monoclonal", "antibody", "prevents", "the", "PTX3", "-", "induced", "postsynaptic", "AMPARs", "recruitment", "(", "Ctr", "=", "1", ".", "000", "±", "0", ".", "074", ",", "PTX3", "=", "1", ".", "504", "±", "0", ".", "098", ",", "αCD29", "+", "PTX3", "=", "0", ".", "766", "±", "0", ".", "097", ",", "αCD29", "=", "0", ".", "810", "±", "0", ".", "108", ".", "Number", "of", "fields", "examined", ":", "37", ",", "33", ",", "23", ",", "24", "respectively", ";", "one", "way", "ANOVA", "analysis", "of", "variance", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", "followed", "by", "post", "hoc", "Tukey", "test", ";", "3", "independent", "experiments", ",", "data", "are", "presented", "as", "normalized", "mean", "values", "±", "SEM", ")", "C", ")", "Western", "blotting", "analysis", "of", "p", "-", "ERK", "levels", "on", "lysates", "from", "control", "and", "PTX3", "-", "treated", "neurons", "upon", "30", "minutes", "stimulation", "(", "Ctr", "=", "1", "±", "0", ";", "PTX3", "=", "1", ".", "453", "±", "0", ".", "195", ",", "6", "independent", "experiments", ",", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "data", "are", "presented", "normalized", "on", "control", "and", "as", "mean", "±", "SEM", ")", "D", ")", "Representative", "mEPSC", "traces", "recorded", "from", "the", "indicated", "experimental", "conditions", ".", "E", ")", "mEPSC", "frequency", "quantitation", "showing", "that", "pre", "-", "incubation", "with", "PD98059", "(", "30μM", ")", "completely", "prevents", "the", "PTX3", "-", "dependent", "increase", "of", "mEPSC", "frequency", "(", "Hz", ",", "Ctr", "=", "0", ".", "911", "±", "0", ".", "104", ";", "PTX3", "=", "1", ".", "748", "±", "0", ".", "273", ";", "PTX3", "+", "PD", "=", "0", ".", "518", "±", "0", ".", "055", ";", "PD", "=", "0", ".", "491", "±", "0", ".", "104", ".", "Number", "of", "neurons", ":", "Ctr", "=", "14", ",", "PTX3", "=", "14", ",", "PTX3", "+", "PD", "=", "13", ";", "PD", "=", "9", ";", "3", "independent", "experiments", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "analysis", "of", "variance", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", "followed", "by", "post", "hoc", "Tukey", "test", "as", "indicated", "in", "figure", ".", "Data", "are", "presented", "as", "a", "distribution", "plus", "mean", "±", "SEM", ")", ".", "F", ")", "inset", ":", "average", "mEPSC", "amplitude", "quantitation", "(", "pA", ")", ",", "Ctr", "=", "14", ".", "19", "±", "0", ".", "70", ";", "PTX3", "=", "19", ".", "09", "±", "1", ".", "71", ";", "PTX3", "+", "PD", "=", "14", ".", "31", "±", "0", ".", "70", ",", "PD", "=", "16", ".", "51", "±", "1", ".", "17", ".", "Number", "of", "neurons", ":", "Ctr", "=", "14", ",", "PTX3", "=", "14", ",", "PTX3", "+", "PD", "=", "13", ";", "PD", "=", "9", ";", "3", "independent", "experiments", ".", "Kruskall", "-", "Wallis", "test", ",", "p", "=", "0", ".", "015", "followed", "by", "Dunn", "\"", "s", "test", "as", "indicated", "in", "figure", ",", "data", "are", "presented", "as", "a", "distribution", "plus", "mean", "±", "SEM", ".", "Cumulative", "probability", "plot", "of", "mEPSC", "amplitudes", "are", "analyzed", "with", "Kolmogorov", "-", "Smirnov", "test", ":", "Ctr", "vs", "PTX3", ":", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "D", "=", "0", ".", "183", ",", "PTX3", "vs", "PTX3", "+", "PD", ":", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "D", "=", "0", ".", "251", ",", "PTX3", "vs", "PD", ":", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "D", "=", "0G", ")", "Representative", "images", "showing", "14DIV", "neurons", "stained", "for", "surface", "AMPARs", "(", "GluA", ",", "green", ")", ",", "the", "presynaptic", "protein", "Bassoon", "(", "blue", ")", "and", "tubulin", "(", "red", ")", "in", "the", "different", "tested", "conditions", ".", "Arrowheads", "point", "to", "postsynaptic", "GluA", "clusters", ".", "Scale", "bar", ":", "5µmH", ")", "Quantification", "of", "the", "surface", "synaptic", "AMPARs", "normalized", "to", "the", "total", "number", "of", "Bsn", "[", "(", "GluA", "&", "Bsn", ")", "/", "Bsn", "]", "shows", "a", "statistically", "significant", "increase", "after", "PTX3", "exposure", ",", "while", "pre", "-", "incubation", "with", "PD98059", "prevents", "the", "PTX3", "-", "dependent", "increase", "(", "Ctr", "=", "1", "±", "0", ".", "042", ",", "PTX3", "=", "1", ".", "499", "±", "0", ".", "121", ",", "PTX3", "+", "PD", "=", "1", ".", "093", "±", "0", ".", "060", ",", "PD", "=", "1", ".", "017", "±", "0", ".", "117", ";", "number", "of", "fields", "examined", ":", "49", ",", "15", ",", "15", ",", "20", "respectively", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", "analysis", "of", "variance", ",", "p", "=", "0", ".", "0002", "followed", "by", "post", "hoc", "Tukey", "test", "as", "indicated", "in", "figure", ";", "at", "least", "3", "independent", "experiments", ",", "data", "are", "presented", "as", "normalized", "mean", "values", "±", "SEM", ")", "I", ")", "Quantification", "of", "surface", "synaptic", "GluA", "upon", "PTX3", "application", "and", "simultaneous", "inhibition", "of", "β1", "integrin", "and", "ERK1", "/", "2", "signaling", "pathways", "reveals", "no", "additive", "effects", "with", "respect", "to", "single", "αCD29", "or", "PD", "applications", "(", "Ctr", "=", "1", "±", "0", ".", "061", ";", "PTX3", "=", "1", ".", "828", "±", "0", ".", "151", ";", "αCD29", "+", "PD", "+", "PTX3", "=", "0", ".", "766", "±", "0", ".", "070", ";", "PTX3", "+", "αCD29", "=", "1", ".", "043", "±", "0", ".", "073", ";", "PTX3", "+", "PD", "=", "1", ".", "016", "±", "0", ".", "061", ";", "PD", "=", "0", ".", "969", "±", "0", ".", "090", ";", "number", "of", "fields", "examined", ":", "29", ",", "31", ",", "30", ",", "23", ",", "14", ",", "33", "respectively", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", "analysis", "of", "variance", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", "followed", "by", "post", "hoc", "Dunn", "'", "s", "test", "as", "indicated", "in", "figure", ";", "at", "least", "3", "independent", "experiments", ",", "data", "are", "presented", "as", "normalized", "mean", "values", "±", "SEM", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A) Representative images showing 14DIV neurons stained for surface AMPARs (GluA, green), the presynaptic protein Bassoon (blue) and tubulin (red) in the different tested conditions. Arrowheads point to postsynaptic GluA clusters. Scale bar: 5µmB) Blocking β1 integrins activity by using the specific anti-β1 Integrin monoclonal antibody prevents the PTX3-induced postsynaptic AMPARs recruitment (Ctr=1.000±0.074, PTX3=1.504±0.098, αCD29+PTX3=0.766±0.097, αCD29=0.810±0.108. Number of fields examined: 37, 33, 23, 24 respectively; one way ANOVA analysis of variance, p<0.0001 followed by post hoc Tukey test; 3 independent experiments, data are presented as normalized mean values±SEM)C) Western blotting analysis of p-ERK levels on lysates from control and PTX3-treated neurons upon 30 minutes stimulation (Ctr=1±0; PTX3=1.453±0.195, 6 independent experiments, unpaired t-test, data are presented normalized on control and as mean±SEM)D) Representative mEPSC traces recorded from the indicated experimental conditions. E) mEPSC frequency quantitation showing that pre-incubation with PD98059 (30μM) completely prevents the PTX3-dependent increase of mEPSC frequency (Hz, Ctr=0.911±0.104; PTX3=1.748±0.273; PTX3+PD=0.518±0.055; PD=0.491±0.104. Number of neurons: Ctr=14, PTX3=14, PTX3+PD=13; PD=9; 3 independent experiments. One-way ANOVA analysis of variance, p<0.0001 followed by post hoc Tukey test as indicated in figure. Data are presented as a distribution plus mean±SEM). F) inset: average mEPSC amplitude quantitation (pA), Ctr=14.19±0.70; PTX3=19.09±1.71; PTX3+PD=14.31±0.70, PD=16.51±1.17. Number of neurons: Ctr=14, PTX3=14, PTX3+PD=13; PD=9; 3 independent experiments. Kruskall-Wallis test, p=0.015 followed by Dunn\"s test as indicated in figure, data are presented as a distribution plus mean±SEM. Cumulative probability plot of mEPSC amplitudes are analyzed with Kolmogorov-Smirnov test: Ctr vs PTX3: p<0.0001, D=0.183, PTX3 vs PTX3+PD: p<0.0001, D=0.251, PTX3 vs PD: p<0.0001, D=0G) Representative images showing 14DIV neurons stained for surface AMPARs (GluA, green), the presynaptic protein Bassoon (blue) and tubulin (red) in the different tested conditions. Arrowheads point to postsynaptic GluA clusters. Scale bar: 5µmH) Quantification of the surface synaptic AMPARs normalized to the total number of Bsn [(GluA&Bsn)/Bsn] shows a statistically significant increase after PTX3 exposure, while pre-incubation with PD98059 prevents the PTX3-dependent increase (Ctr=1±0.042, PTX3=1.499±0.121, PTX3+PD=1.093±0.060, PD=1.017±0.117; number of fields examined: 49, 15, 15, 20 respectively; one-way ANOVA analysis of variance, p=0.0002 followed by post hoc Tukey test as indicated in figure; at least 3 independent experiments, data are presented as normalized mean values±SEM)I) Quantification of surface synaptic GluA upon PTX3 application and simultaneous inhibition of β1 integrin and ERK1/2 signaling pathways reveals no additive effects with respect to single αCD29 or PD applications (Ctr=1±0.061; PTX3=1.828±0.151; αCD29+PD+PTX3=0.766±0.070; PTX3+αCD29=1.043±0.073; PTX3+PD=1.016±0.061; PD=0.969±0.090; number of fields examined: 29, 31, 30, 23, 14, 33 respectively; one-way ANOVA analysis of variance, p<0.0001 followed by post hoc Dunn's test as indicated in figure; at least 3 independent experiments, data are presented as normalized mean values±SEM)."}
{"words": ["Figure", "5A", ")", "PTX3", "binds", "TSP1", "and", "TSP", "-", "2", "but", "not", "TSP", "-", "4", ".", "Different", "amounts", "of", "human", "recombinant", "PTX3", "were", "incubated", "in", "microplate", "wells", "coated", "with", "purified", "human", "TSP1", "or", "recombinant", "TSP", "-", "2", "and", "TSP", "-", "4", ".", "Binding", "is", "reported", "as", "Absorbance", "at", "450", "nm", "(", "Mean", "±", "SD", ")", ".", "Data", "are", "from", "one", "experiment", "out", "of", "three", "performedB", ")", "N", "-", "terminal", "PTX3", "binds", "TSP1", ".", "Binding", "of", "PTX3", "N", "-", "term", "domain", "was", "performed", "on", "TSP1", "immobilized", "on", "plastic", "wells", ".", "Data", "are", "reported", "as", "Absorbance", "at", "450", "nm", "(", "Mean", "±", "SD", ")", "and", "are", "representative", "of", "one", "out", "of", "two", "experiments", "performedD", ")", "PTX3", "binds", "the", "C", "-", "term", "proteolytic", "fragment", "of", "TSP1", ".", "TSP1", "and", "its", "fragments", "C", "-", "term", ",", "N", "-", "term", ",", "and", "Ca", "-", "1", "(", "type", "III", "repeats", ")", "were", "immobilized", "in", "plastic", "wells", "(", "5µg", "/", "ml", ")", "and", "binding", "of", "PTX3", "is", "reported", "as", "Absorbance", "at", "450", "nm", "(", "Mean", "±", "SD", ")", ".", "Data", "refers", "to", "one", "out", "of", "two", "experiments", "performed", "with", "similar", "resultsE", ")", "PTX3", "and", "its", "N", "-", "terminal", "domain", "bind", "TSP1", "C", "-", "terminal", "globular", "domain", ".", "50", "nM", "of", "P123", "-", "1", "(", "type", "I", "'", "properdin", "'", "repeats", ")", ",", "E123", "-", "1", "(", "Type", "II", "EGF", "repeats", ")", ",", "E123CaG", "-", "1", "(", "type", "II", "repeats", "plus", "type", "III", "repeats", "and", "globular", "C", "terminus", ")", "and", "TSP1", "were", "immobilized", "in", "plastic", "well", ".", "Binding", "with", "PTX3", "or", "N", "-", "terminal", "domain", "(", "both", "at", "220", "nM", ")", "was", "analyzed", ".", "Data", "are", "reported", "as", "Absorbance", "at", "450", "nm", "(", "Mean", "±", "SD", ")", "and", "refers", "to", "one", "out", "of", "two", "experiments", "performed", "with", "similar", "resultsF", ")", "Representative", "images", "of", "14DIV", "control", "and", "PTX3", "-", "treated", "cultures", "stained", "for", "the", "presynaptic", "marker", "bassoon", "(", "blue", ")", "and", "the", "microtubule", "protein", "tubulin", "(", "red", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10μm", ".", "G", ")", "Quantification", "of", "synaptic", "density", "(", "Bsn", "/", "μm", ")", "in", "the", "different", "experimental", "conditions", "(", "Ctr", "=", "0", ".", "385", "±", "0", ".", "029", ",", "PTX3", "=", "0", ".", "407", "±", "0", ".", "032", ",", "TSP1", "=", "0", ".", "721", "±", "0", ".", "039", ",", "PTX3", "+", "TSP1", "=", "0", ".", "707", "±", "0", ".", "037", ",", "E123", "=", "0", ".", "764", "±", "0", ".", "047", ",", "PTX3", "+", "E123", "=", "0", ".", "719", "±", "0", ".", "041", ".", "Number", "of", "fields", "examined", ":", "86", ",", "80", ",", "75", ",", "72", ",", "46", ",", "55", "respectively", ";", "Kruskall", "-", "Wallis", "test", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", "followed", "by", "Dunn", "\"", "s", "test", "as", "indicated", "in", "figure", ";", "at", "least", "3", "independent", "experiments", ",", "data", "are", "presented", "as", "mean", "valuesH", ")", "Representative", "images", "showing", "14DIV", "neurons", "stained", "for", "surface", "AMPAR", "(", "GluA", ",", "green", ")", ",", "the", "presynaptic", "protein", "Bassoon", "(", "blue", ")", "and", "tubulin", "(", "red", ")", "in", "the", "different", "tested", "conditions", ".", "Arrowheads", "point", "to", "postsynaptic", "GluA", "clusters", ".", "Scale", "bar", ":", "5µm", ".", "I", ")", "Quantification", "of", "the", "synaptic", "surface", "GluA", "density", "(", "number", "of", "sGluA", "puncta", "/", "μm", ")", "in", "the", "different", "tested", "conditions", "showing", "that", "GluA", "density", "increases", "in", "neuronal", "cultures", "treated", "with", "PTX3", "or", "E123", "+", "PTX3", "but", "not", "in", "cultures", "treated", "with", "the", "full", "length", "TSP1", "+", "PTX3", "(", "Ctr", "=", "1", ".", "000", "±", "0", ".", "055", ";", "PTX3", "=", "1", ".", "367", "±", "0", ".", "074", ";", "TSP1", "=", "1", ".", "04", "±", "0", ".", "061", ";", "PTX3", "+", "TSP1", "=", "0", ".", "968", "±", "0", ".", "076", ";", "E123", "=", "0", ".", "971", "±", "0", ".", "063", ";", "PTX3", "+", "E123", "=", "1", ".", "613", "±", "0", ".", "077", ".", "Number", "of", "dendrites", "examined", ":", "103", ",", "80", ",", "88", ",", "57", ",", "51", ",", "62", "respectively", ";", "Kruskall", "-", "Wallis", "test", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", "followed", "by", "Dunn", "'", "s", "test", "as", "indicated", "in", "figure", ";", "at", "least", "3", "independent", "experiments", ",", "data", "are", "presented", "as", "normalized", "mean", "values", "±", "SEM", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A) PTX3 binds TSP1 and TSP-2 but not TSP-4. Different amounts of human recombinant PTX3 were incubated in microplate wells coated with purified human TSP1 or recombinant TSP-2 and TSP-4. Binding is reported as Absorbance at 450 nm (Mean±SD). Data are from one experiment out of three performedB) N-terminal PTX3 binds TSP1. Binding of PTX3 N-term domain was performed on TSP1 immobilized on plastic wells. Data are reported as Absorbance at 450 nm (Mean±SD) and are representative of one out of two experiments performedD) PTX3 binds the C-term proteolytic fragment of TSP1. TSP1 and its fragments C-term, N-term, and Ca-1 (type III repeats) were immobilized in plastic wells (5µg/ml) and binding of PTX3 is reported as Absorbance at 450 nm (Mean±SD). Data refers to one out of two experiments performed with similar resultsE) PTX3 and its N-terminal domain bind TSP1 C-terminal globular domain. 50 nM of P123-1 (type I 'properdin' repeats), E123-1 (Type II EGF repeats), E123CaG-1 (type II repeats plus type III repeats and globular C terminus) and TSP1 were immobilized in plastic well. Binding with PTX3 or N-terminal domain (both at 220 nM) was analyzed. Data are reported as Absorbance at 450 nm (Mean±SD) and refers to one out of two experiments performed with similar resultsF) Representative images of 14DIV control and PTX3-treated cultures stained for the presynaptic marker bassoon (blue) and the microtubule protein tubulin (red). Scale bar: 10μm. G) Quantification of synaptic density (Bsn/μm) in the different experimental conditions (Ctr=0.385±0.029, PTX3=0.407±0.032, TSP1=0.721±0.039, PTX3+TSP1=0.707±0.037, E123=0.764±0.047, PTX3+E123=0.719±0.041. Number of fields examined: 86, 80, 75, 72, 46, 55 respectively; Kruskall-Wallis test, p<0.0001 followed by Dunn\"s test as indicated in figure; at least 3 independent experiments, data are presented as mean valuesH) Representative images showing 14DIV neurons stained for surface AMPAR (GluA, green), the presynaptic protein Bassoon (blue) and tubulin (red) in the different tested conditions. Arrowheads point to postsynaptic GluA clusters. Scale bar: 5µm. I) Quantification of the synaptic surface GluA density (number of sGluA puncta/μm) in the different tested conditions showing that GluA density increases in neuronal cultures treated with PTX3 or E123+PTX3 but not in cultures treated with the full length TSP1+PTX3 (Ctr=1.000±0.055; PTX3=1.367±0.074; TSP1=1.04±0.061; PTX3+TSP1=0.968±0.076; E123=0.971±0.063; PTX3+E123=1.613±0.077. Number of dendrites examined: 103, 80, 88, 57, 51, 62 respectively; Kruskall-Wallis test, p<0.0001 followed by Dunn's test as indicated in figure; at least 3 independent experiments, data are presented as normalized mean values±SEM). "}
{"words": ["Figure", "6A", ")", "Representative", "images", "of", "14DIV", "neurons", "stained", "for", "surface", "AMPARs", "(", "GluA", ",", "green", ")", ",", "Bassoon", "(", "blue", ")", "and", "tubulin", "(", "red", ")", "in", "the", "different", "tested", "conditions", ".", "Arrowheads", "point", "to", "postsynaptic", "GluA", "clusters", ".", "Scale", "bar", ":", "5µm", ".", "B", ")", "Quantification", "of", "the", "surface", "synaptic", "AMPARs", "normalized", "to", "the", "total", "number", "of", "Bsn", "shows", "a", "decrease", "of", "the", "surface", "synaptic", "AMPAR", "clusters", "upon", "chronic", "application", "of", "the", "PTX3", "blocking", "antibody", "to", "mixed", "cultures", "(", "Ctr", "=", "1", ".", "000", "±", "0", ".", "063", ",", "PTX3", "block", "=", "0", ".", "694", "±", "0", ".", "069", ",", "isotype", "Ab", "=", "0", ".", "876", "±", "0", ".", "077", ".", "Number", "of", "fields", "examined", ":", "34", ",", "23", ",", "19", "respectively", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", "analysis", "of", "variance", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", "followed", "by", "post", "hoc", "Tukey", "test", "as", "indicated", "in", "figure", ";", "3", "independent", "experiments", ",", "data", "are", "presented", "as", "normalized", "mean", "values", "±", "SEM", ")", "C", ")", "Representative", "images", "of", "14DIV", "WT", "and", "PTX3", "KO", "neurons", "stained", "for", "surface", "AMPARs", "(", "GluA", ",", "green", ")", ",", "Bassoon", "(", "blue", ")", "and", "tubulin", "(", "red", ")", ".", "Arrowheads", "point", "to", "postsynaptic", "GluA", "clusters", ".", "Scale", "bar", ":", "5µm", ".", "D", ")", "Quantification", "of", "the", "surface", "synaptic", "AMPARs", "normalized", "to", "the", "total", "number", "of", "Bsn", "shows", "a", "reduction", "in", "PTX3", "KO", "cultures", "with", "respect", "to", "WT", "(", "WT", "=", "1", "±", "0", ".", "065", ",", "KO", "=", "0", ".", "771", "±", "0", ".", "0", ".", "92", ";", "number", "of", "fields", "examined", ":", "36", "and", "42", "respectively", ";", "Mann", "-", "Whitney", "test", ";", "number", "of", "animals", "5", "WT", "and", "6", "PTX3", "KO", ",", "data", "are", "presented", "as", "normalized", "mean", "values", "±", "SEM", ")", "E", ")", "Examples", "of", "mEPSCs", "recorded", "in", "the", "indicated", "experimental", "conditions", ".", "F", ")", "Quantitation", "of", "mEPSC", "inter", "-", "event", "interval", "showing", "a", "rescue", "of", "mEPSC", "frequency", "in", "PTX3", "KO", "cultures", "treated", "with", "the", "N", "-", "terminal", "fragment", "of", "PTX3", "(", "WT", "=", "1158", "±", "34", ".", "67", ";", "WT", "+", "N", "-", "term", "=", "979", ".", "1", "±", "28", ".", "27", ";", "PTX3", "KO", "=", "1263", "±", "38", ".", "99", ";", "PTX3", "KO", "+", "Nterm", "=", "1008", "±", "30", ".", "14", ".", "Number", "of", "neurons", ":", "WT", ",", "Ctr", "=", "25", ",", "WT", "+", "N", "-", "term", "=", "29", ";", "PTX3", "KO", ",", "Ctr", "=", "24", ";", "PTX3", "KO", "+", "N", "-", "term", "=", "22", ";", "3", "independent", "experiments", ".", "Kruskall", "-", "Wallis", "test", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", "followed", "by", "Dunn", "\"", "s", "test", "as", "indicated", "in", "figure", ",", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ")", ".", "G", ")", "Quantitation", "of", "mEPSC", "amplitude", "showing", "a", "rescue", "in", "PTX3", "KO", "cultures", "treated", "with", "the", "N", "-", "terminal", "fragment", "of", "PTX3", "(", "pA", ",", "WT", "=", "20", ".", "85", "±", "0", ".", "249", "WT", "+", "N", "-", "term", "=", "22", ".", "37", "±", "0", ".", "234", ";", "PTX3", "KO", "=", "20", ".", "31", "±", "0", ".", "264", ";", "PTX3", "KO", "+", "Nterm", "=", "23", ".", "8", "±", "0", ".", "316", ".", "Number", "of", "neurons", ":", "WT", ",", "Ctr", "=", "25", ",", "WT", "+", "N", "-", "term", "=", "29", ";", "PTX3", "KO", ",", "Ctr", "=", "24", ";", "PTX3", "KO", "+", "N", "-", "term", "=", "22", ";", "3", "independent", "experiments", ".", "Kruskall", "-", "Wallis", "test", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", "followed", "by", "Dunn", "\"", "s", "test", "as", "indicated", "in", "figure", ",", "data", "are", "presented", "asH", ")", "Representative", "images", "of", "14DIV", "PTX3", "KO", "neurons", "(", "Ctr", ",", "+", "N", "terminal", "PTX3", ",", "+", "C", "terminal", "PTX3", ")", "stained", "for", "surface", "AMPARs", "(", "GluA", ",", "green", ")", ",", "Bassoon", "(", "blue", ")", "and", "tubulin", "(", "red", ")", ".", "Arrowheads", "point", "to", "postsynaptic", "GluA", "clusters", ".", "Scale", "bar", ":", "5µm", ".", "I", ")", "Quantification", "of", "the", "surface", "synaptic", "AMPARs", "normalized", "to", "the", "total", "number", "of", "Bsn", "shows", "an", "increase", "in", "PTX3", "KO", "treated", "with", "N", "terminal", "fragment", "of", "PTX3", "but", "not", "with", "the", "C", "terminal", "fragment", "(", "PTX3", "KO", "=", "1", ".", "000", "±", "0", ".", "042", ",", "PTX3", "KO", "+", "C", "-", "term", "=", "1", ".", "103", "±", "0", ".", "070", ",", "PTX3", "KO", "+", "N", "-", "term", "=", "1", ".", "428", "±", "0", ".", "061", ".", "Number", "of", "fields", "examined", ":", "63", ",", "38", ",", "57", "respectively", ";", "Kruskall", "-", "Wallis", "test", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", "followed", "by", "Dunn", "\"", "s", "test", ";", "3", "independent", "experiments", ",", "data", "are", "presented", "as", "normalized", "mean", "valuesJ", "-", "L", "(", "J", ")", "Examples", "of", "mEPSCs", "recordings", "in", "WT", "and", "PTX3", "KO", "(", "littermates", ")", "hippocampal", "slices", "at", "P8", "-", "9", "showing", "that", "frequency", "(", "K", ")", "and", "amplitude", "(", "L", ")", "are", "significantly", "decreased", "in", "KO", "neurons", "with", "respect", "to", "WT", "(", "Hz", ":", "WT", "=", "1", ".", "54", "±", "0", ".", "136", ";", "PTX3", "KO", "=", "0", ".", "912", "±", "0", ".", "083", ";", "Mann", "Whitney", "test", ".", "pA", ":", "WT", "=", "16", ".", "57", "±", "1", ".", "334", ";", "PTX3", "KO", "=", "12", ".", "55", "±", "1", ".", "037", ";", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "Data", "are", "presented", "as", "a", "distribution", "plus", "mean", "±", "SEM", ".", "WT", ":", "18", "cells", ",", "4", "mice", ";", "PTX3", "KO", ":", "20", "cells", ",", "5", "mice", ")", "N", ")", "Examples", "of", "mEPSCs", "recordings", "of", "P30", "WT", "and", "PTX3", "KO", "hippocampal", "slices", ".", "O", ")", "Quantification", "of", "mEPSC", "frequency", "showing", "reduced", "frequency", "in", "PTX3", "KO", "mice", "with", "respect", "to", "WT", "(", "Hz", ":", "WT", "=", "2", ".", "27", "±", "0", ".", "115", ";", "PTX3", "KO", "=", "1", ".", "74", "±", "0", ".", "136", ".", "WT", ":", "10", "cells", ",", "4", "mice", ";", "PTX3", "KO", ":", "11", "cells", ",", "5", "mice", ".", "Unpaired", "t", "-", "test", "p", "=", "0", ".", "008", ".", "Data", "are", "presented", "as", "a", "distribution", "plus", "mean", "±", "SEM", ")", ".", "P", ",", "Q", "(", "P", ")", "No", "difference", "in", "the", "average", "amplitude", "is", "evident", "(", "pA", ":", "WT", "=", "11", ".", "95", "±", "0", ".", "589", ";", "PTX3", "KO", "=", "10", ".", "69", "±", "0", ".", "438", ";", "unpaired", "t", "-", "test", "p", "=", "0", ".", "099", ".", "Data", "are", "presented", "as", "a", "distribution", "plus", "mean", "±", "SEM", ".", "WT", ":", "10", "cells", ",", "4", "mice", ";", "PTX3", "KO", ":", "11", "cells", ",", "5", "mice", ")", ";", "however", "the", "cumulative", "probability", "plot", "of", "amplitudes", "(", "Q", ")", "for", "mEPSCs", "in", "WT", "and", "PTX3", "KO", "shows", "that", "there", "is", "a", "significant", "shift", "in", "the", "distribution", "by", "the", "Kolmogorov", "-", "Smirnov", "test", "(", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "D", "=", "0", ".", "112", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A) Representative images of 14DIV neurons stained for surface AMPARs (GluA, green), Bassoon (blue) and tubulin (red) in the different tested conditions. Arrowheads point to postsynaptic GluA clusters. Scale bar: 5µm. B) Quantification of the surface synaptic AMPARs normalized to the total number of Bsn shows a decrease of the surface synaptic AMPAR clusters upon chronic application of the PTX3 blocking antibody to mixed cultures (Ctr=1.000±0.063, PTX3 block=0.694±0.069, isotype Ab=0.876±0.077. Number of fields examined: 34, 23, 19 respectively; one-way ANOVA analysis of variance, p<0.0001 followed by post hoc Tukey test as indicated in figure; 3 independent experiments, data are presented as normalized mean values ±SEM)C) Representative images of 14DIV WT and PTX3 KO neurons stained for surface AMPARs (GluA, green), Bassoon (blue) and tubulin (red). Arrowheads point to postsynaptic GluA clusters. Scale bar: 5µm. D) Quantification of the surface synaptic AMPARs normalized to the total number of Bsn shows a reduction in PTX3 KO cultures with respect to WT (WT=1±0.065, KO=0.771±0.0.92; number of fields examined: 36 and 42 respectively; Mann-Whitney test; number of animals 5 WT and 6 PTX3 KO, data are presented as normalized mean values±SEM)E) Examples of mEPSCs recorded in the indicated experimental conditions. F) Quantitation of mEPSC inter-event interval showing a rescue of mEPSC frequency in PTX3 KO cultures treated with the N-terminal fragment of PTX3 (WT=1158±34.67; WT+N-term=979.1±28.27; PTX3 KO=1263±38.99; PTX3 KO+Nterm=1008±30.14. Number of neurons: WT, Ctr=25, WT+N-term= 29; PTX3 KO, Ctr= 24; PTX3 KO+N-term=22; 3 independent experiments. Kruskall-Wallis test, p<0.0001 followed by Dunn\"s test as indicated in figure, data are presented as mean±SEM). G) Quantitation of mEPSC amplitude showing a rescue in PTX3 KO cultures treated with the N-terminal fragment of PTX3 (pA, WT=20.85±0.249 WT+N-term=22.37±0.234; PTX3 KO=20.31±0.264; PTX3 KO+Nterm=23.8±0.316. Number of neurons: WT, Ctr=25, WT+N-term= 29; PTX3 KO, Ctr= 24; PTX3 KO+N-term=22; 3 independent experiments. Kruskall-Wallis test, p<0.0001 followed by Dunn\"s test as indicated in figure, data are presented asH) Representative images of 14DIV PTX3 KO neurons (Ctr, +N terminal PTX3, +C terminal PTX3) stained for surface AMPARs (GluA, green), Bassoon (blue) and tubulin (red). Arrowheads point to postsynaptic GluA clusters. Scale bar: 5µm. I) Quantification of the surface synaptic AMPARs normalized to the total number of Bsn shows an increase in PTX3 KO treated with N terminal fragment of PTX3 but not with the C terminal fragment (PTX3 KO=1.000±0.042, PTX3 KO+C-term=1.103±0.070, PTX3 KO+N-term=1.428±0.061. Number of fields examined: 63, 38, 57 respectively; Kruskall-Wallis test, p<0.0001 followed by Dunn\"s test; 3 independent experiments, data are presented as normalized mean valuesJ-L (J) Examples of mEPSCs recordings in WT and PTX3 KO (littermates) hippocampal slices at P8-9 showing that frequency (K) and amplitude (L) are significantly decreased in KO neurons with respect to WT (Hz: WT=1.54±0.136; PTX3 KO=0.912±0.083; Mann Whitney test. pA: WT=16.57±1.334; PTX3 KO=12.55±1.037; unpaired t-test. Data are presented as a distribution plus mean±SEM. WT: 18 cells, 4 mice; PTX3 KO: 20 cells, 5 mice)N) Examples of mEPSCs recordings of P30 WT and PTX3 KO hippocampal slices. O) Quantification of mEPSC frequency showing reduced frequency in PTX3 KO mice with respect to WT (Hz: WT=2.27±0.115; PTX3 KO=1.74±0.136. WT: 10 cells, 4 mice; PTX3 KO: 11 cells, 5 mice. Unpaired t-test p=0.008. Data are presented as a distribution plus mean±SEM). P, Q (P) No difference in the average amplitude is evident (pA: WT=11.95±0.589; PTX3 KO=10.69±0.438; unpaired t-test p=0.099. Data are presented as a distribution plus mean±SEM. WT: 10 cells, 4 mice; PTX3 KO: 11 cells, 5 mice); however the cumulative probability plot of amplitudes (Q) for mEPSCs in WT and PTX3 KO shows that there is a significant shift in the distribution by the Kolmogorov-Smirnov test (p <0.0001, D=0.112). "}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "The", "intracellular", "distribution", "of", "DOR", "is", "modified", "by", "starvation", ".", "HeLa", "cells", "were", "transiently", "transfected", "with", "DOR", "and", "incubated", "for", "1", "h", "with", "DMEM", "(", "basal", ")", ",", "HBSS", "(", "starvation", ")", ",", "50", "μM", "chloroquine", "or", "10", "mM", "3MA", ".", "The", "intracellular", "localization", "of", "DOR", "was", "analysed", "by", "immunofluorescence", "and", "is", "shown", "in", "red", ".", "The", "nuclei", "are", "shown", "in", "blue", "(", "DAPI", "staining", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "(", "B", ")", "Endogenous", "DOR", "leaves", "the", "nucleus", "under", "starvation", ".", "C2C12", "myoblasts", "were", "incubated", "for", "30", "min", "at", "37", "°", "C", "with", "DMEM", "(", "basal", ")", "or", "HBSS", "(", "starvation", ")", ".", "DOR", "is", "shown", "in", "red", "and", "nuclei", "are", "in", "blue", "(", "DAPI", "staining", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "5", "μm", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "De", "‐", "activation", "of", "autophagy", "returns", "DOR", "to", "the", "nucleus", ".", "HeLa", "cells", "were", "transiently", "transfected", "with", "DOR", "and", "incubated", "for", "1", "h", "with", "DMEM", "(", "basal", ")", "or", "HBSS", "(", "starvation", ")", ".", "Cells", "were", "then", "incubated", "with", "normal", "DMEM", "for", "an", "additional", "hour", "(", "starvation", "+", "GM", ")", ".", "The", "intracellular", "distribution", "of", "DOR", "was", "determined", "by", "immunofluorescence", ".", "DOR", "is", "shown", "in", "red", "and", "the", "nuclei", "are", "in", "blue", ".", "Scale", "bars", ",", "5", "μm", ".", "Cell", "lysates", "were", "also", "obtained", "and", "western", "blot", "assays", "were", "performed", "with", "specific", "antibodies", ".", "3MA", ",", "3", "‐", "methyladenine", ";", "DAPI", ",", "4", "′", ",", "6", "‐", "diamidino", "‐", "2", "‐", "phenylindole", ";", "DMEM", ",", "Dulbecco", "'", "s", "modified", "Eagle", "medium", ";", "DOR", ",", "diabetes", "‐", "and", "obesity", "‐", "regulated", "gene", ";", "HBSS", ",", "Hank", "'", "s", "balanced", "salt", "solution", ";", "LC3", ",", "microtubule", "‐", "associated", "protein", "1A", "/", "1B", "‐", "light", "chain", "3", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) The intracellular distribution of DOR is modified by starvation. HeLa cells were transiently transfected with DOR and incubated for 1 h with DMEM (basal), HBSS (starvation), 50 μM chloroquine or 10 mM 3MA. The intracellular localization of DOR was analysed by immunofluorescence and is shown in red. The nuclei are shown in blue (DAPI staining). Scale bars, 10 μm.(B) Endogenous DOR leaves the nucleus under starvation. C2C12 myoblasts were incubated for 30 min at 37°C with DMEM (basal) or HBSS (starvation). DOR is shown in red and nuclei are in blue (DAPI staining). Scale bars, 5 μm.(C,D) De‐activation of autophagy returns DOR to the nucleus. HeLa cells were transiently transfected with DOR and incubated for 1 h with DMEM (basal) or HBSS (starvation). Cells were then incubated with normal DMEM for an additional hour (starvation+GM). The intracellular distribution of DOR was determined by immunofluorescence. DOR is shown in red and the nuclei are in blue. Scale bars, 5 μm. Cell lysates were also obtained and western blot assays were performed with specific antibodies. 3MA, 3‐methyladenine; DAPI, 4′,6‐diamidino‐2‐phenylindole; DMEM, Dulbecco's modified Eagle medium; DOR, diabetes‐ and obesity‐regulated gene; HBSS, Hank's balanced salt solution; LC3, microtubule‐associated protein 1A/1B‐light chain 3."}
{"words": ["Figure", "2DOR", "localizes", "to", "autophagosomes", "when", "autophagy", "is", "activated", ".", "(", "A", ")", "Confocal", "images", "of", "HeLa", "cells", "transiently", "transfected", "with", "DOR", "and", "GFP", "‐", "LC3", ",", "and", "incubated", "for", "1h", "with", "DMEM", ",", "HBSS", "(", "starvation", ")", ",", "2", "μM", "rapamycin", "or", "HBSS", "containing", "50", "μM", "chloroquine", ".", "Nuclei", "were", "labelled", "with", "DAPI", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "(", "B", ",", "C", ")", "Confocal", "images", "of", "HeLa", "cells", "transiently", "transfected", "with", "DOR", "or", "GFP", "‐", "LC3", "and", "incubated", "with", "50", "nM", "Lysotracker", "in", "DMEM", "or", "HBSS", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "(", "D", ")", "Confocal", "images", "of", "HeLa", "cells", "transiently", "transfected", "with", "DOR", "and", "LAMP1", "‐", "GFP", ",", "or", "with", "YFP", "‐", "LC3", "and", "LAMP1", "‐", "GFP", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "Contrast", "‐", "corrected", "merge", "RGB", "pictures", "and", "the", "Z", "‐", "projection", "of", "Product", "of", "the", "differences", "from", "the", "mean", "(", "PDM", ")", "images", "are", "shown", "in", "all", "panels", ".", "Colour", "scales", "of", "PDM", "images", "have", "different", "maximal", "values", ",", "so", "the", "different", "conditions", "are", "not", "comparable", "from", "these", "projections", ".", "Product", "of", "the", "differences", "from", "the", "mean", "(", "PDM", ")", "values", "closer", "to", "1", "show", "reliable", "colocalized", "pixels", ".", "DAPI", ",", "4", "′", ",", "6", "‐", "diamidino", "‐", "2", "‐", "phenylindole", ";", "DMEM", ",", "Dulbecco", "'", "s", "modified", "Eagle", "medium", ";", "DOR", ",", "diabetes", "‐", "and", "obesity", "‐", "regulated", "gene", ";", "GFP", ",", "green", "fluorescent", "protein", ";", "HBSS", ",", "Hank", "'", "s", "balanced", "salt", "solution", ";", "LAMP1", ",", "lysosomal", "‐", "associated", "membrane", "protein", "1", ";", "LC3", ",", "microtubule", "‐", "associated", "protein", "1A", "/", "1B", "‐", "light", "chain", "3", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2DOR localizes to autophagosomes when autophagy is activated. (A) Confocal images of HeLa cells transiently transfected with DOR and GFP‐LC3, and incubated for 1h with DMEM, HBSS (starvation), 2 μM rapamycin or HBSS containing 50 μM chloroquine. Nuclei were labelled with DAPI. Scale bars, 10 μm.(B,C) Confocal images of HeLa cells transiently transfected with DOR or GFP‐LC3 and incubated with 50 nM Lysotracker in DMEM or HBSS. Scale bars, 10 μm.(D) Confocal images of HeLa cells transiently transfected with DOR and LAMP1‐GFP, or with YFP‐LC3 and LAMP1‐GFP. Scale bars, 10 μm. Contrast‐corrected merge RGB pictures and the Z‐projection of Product of the differences from the mean (PDM) images are shown in all panels. Colour scales of PDM images have different maximal values, so the different conditions are not comparable from these projections. Product of the differences from the mean (PDM) values closer to 1 show reliable colocalized pixels. DAPI, 4′,6‐diamidino‐2‐phenylindole; DMEM, Dulbecco's modified Eagle medium; DOR, diabetes‐ and obesity‐regulated gene; GFP, green fluorescent protein; HBSS, Hank's balanced salt solution; LAMP1, lysosomal‐associated membrane protein 1; LC3, microtubule‐associated protein 1A/1B‐light chain 3."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "DOR", "gain", "‐", "of", "‐", "function", "accelerates", "the", "degradation", "of", "proteins", "of", "middle", "-", "long", "half", "‐", "life", ".", "Untreated", "HeLa", "cells", "and", "those", "transiently", "transfected", "with", "DOR", "were", "incubated", "in", "DMEM", "or", "HBSS", ".", "*", "Significant", "effects", "of", "starvation", ",", "P0", ".", "01", ";", "τsignificant", "effects", "caused", "by", "DOR", "overexpression", ",", "P0", ".", "01", ".", "(", "B", ")", "DOR", "overexpression", "enhances", "autophagosomal", "formation", ".", "LC3", "‐", "GFP", "‐", "positive", "vacuoles", "were", "counted", "in", "100", "transfected", "HeLa", "cells", "(", "with", "GFP", "‐", "LC3", "and", "TRα1", ",", "or", "GFP", "‐", "LC3", "and", "DOR", ")", ".", "*", "Significant", "effects", "of", "starvation", ",", "P0", ".", "001", ";", "τsignificant", "effects", "of", "DOR", "overexpression", ",", "P0", ".", "001", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "HeLa", "cells", "transiently", "transfected", "with", "empty", "pCDNA3", "or", "DOR", "were", "incubated", "in", "DMEM", "(", "basal", ")", "or", "in", "HBSS", "(", "starvation", ")", ".", "Cells", "were", "processed", "by", "transmission", "electron", "microscopy", ".", "Arrows", "indicate", "autophagosomes", ".", "Insets", "are", "autophagosomes", "(", "diameter", ",", "407", "±", "63", "nm", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "1", "μm", ".", "Autophagosomes", "were", "counted", "in", "50", "randomly", "chosen", "transfected", "cells", ".", "*", "Significant", "effects", "of", "starvation", ",", "P0", ".", "05", ";", "τsignificant", "effects", "of", "DOR", "overexpression", ",", "P0", ".", "05", ".", "DMEM", ";", "Dulbecco", "'", "s", "modified", "Eagle", "medium", ";", "DOR", ",", "diabetes", "‐", "and", "obesity", "‐", "regulated", "gene", ";", "GFP", ",", "green", "fluorescent", "protein", ";", "HBSS", ";", "Hank", "'", "s", "balanced", "salt", "solution", ";", "LC3", ",", "microtubule", "‐", "associated", "protein", "1A", "/", "1B", "‐", "light", "chain", "3", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) DOR gain‐of‐function accelerates the degradation of proteins of middle-long half‐life. Untreated HeLa cells and those transiently transfected with DOR were incubated in DMEM or HBSS. *Significant effects of starvation, P0.01; τsignificant effects caused by DOR overexpression, P0.01.(B) DOR overexpression enhances autophagosomal formation. LC3‐GFP‐positive vacuoles were counted in 100 transfected HeLa cells (with GFP‐LC3 and TRα1, or GFP‐LC3 and DOR). *Significant effects of starvation, P0.001; τsignificant effects of DOR overexpression, P0.001.(C,D) HeLa cells transiently transfected with empty pCDNA3 or DOR were incubated in DMEM (basal) or in HBSS (starvation). Cells were processed by transmission electron microscopy. Arrows indicate autophagosomes. Insets are autophagosomes (diameter, 407±63 nm). Scale bars, 1 μm. Autophagosomes were counted in 50 randomly chosen transfected cells. *Significant effects of starvation, P0.05; τsignificant effects of DOR overexpression, P0.05. DMEM; Dulbecco's modified Eagle medium; DOR, diabetes‐ and obesity‐regulated gene; GFP, green fluorescent protein; HBSS; Hank's balanced salt solution; LC3, microtubule‐associated protein 1A/1B‐light chain 3."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ",", "B", ")", "C2C12", "myoblasts", "were", "previously", "infected", "with", "lentiviruses", "encoding", "scrambled", "RNA", ",", "DOR", "siRNA1", "or", "DOR", "siRNA2", ".", "Endogenous", "LC3", "was", "detected", "by", "immunofluorescence", ".", "LC3", "‐", "positive", "puncta", "were", "counted", "in", "100", "cells", "per", "group", "under", "basal", "conditions", "or", "starved", "for", "20", "min", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "*", "Significant", "effects", "of", "starvation", ",", "P0", ".", "001", ";", "τsignificant", "effects", "caused", "by", "DOR", "knockdown", ",", "P0", ".", "001", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "Scramble", "or", "DOR", "siRNA1", "C2C12", "cells", "were", "processed", "by", "transmission", "electron", "microscopy", ".", "Arrows", "indicate", "autophagosomes", ".", "Insets", "are", "autophagosomes", ".", "Scale", "bars", ",", "1", "μm", ".", "Autophagosomes", "were", "counted", "in", "50", "randomly", "chosen", "cells", ".", "*", "Significant", "effects", "of", "DOR", "repression", ",", "P0", ".", "001", ".", "(", "E", ")", "Scramble", "or", "DOR", "siRNA1", "C2C12", "cells", "were", "incubated", "in", "DMEM", "with", "and", "without", "10", "mM", "3MA", ".", "*", "Significant", "effects", "of", "DOR", "knockdown", ",", "P0", ".", "01", ";", "τsignificant", "effects", "caused", "by", "3MA", ",", "P0", ".", "01", ".", "3MA", ",", "3", "‐", "methyladenine", ";", "DMEM", ",", "Dulbecco", "'", "s", "modified", "Eagle", "medium", ";", "DOR", ",", "diabetes", "‐", "and", "obesity", "‐", "regulated", "gene", ";", "LC3", ",", "microtubule", "‐", "associated", "protein", "1A", "/", "1B", "‐", "light", "chain", "3", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A,B) C2C12 myoblasts were previously infected with lentiviruses encoding scrambled RNA, DOR siRNA1 or DOR siRNA2. Endogenous LC3 was detected by immunofluorescence. LC3‐positive puncta were counted in 100 cells per group under basal conditions or starved for 20 min. Scale bars, 10 μm. *Significant effects of starvation, P0.001; τsignificant effects caused by DOR knockdown, P0.001.(C,D) Scramble or DOR siRNA1 C2C12 cells were processed by transmission electron microscopy. Arrows indicate autophagosomes. Insets are autophagosomes. Scale bars, 1 μm. Autophagosomes were counted in 50 randomly chosen cells. *Significant effects of DOR repression, P0.001.(E) Scramble or DOR siRNA1 C2C12 cells were incubated in DMEM with and without 10 mM 3MA. *Significant effects of DOR knockdown, P0.01; τsignificant effects caused by 3MA, P0.01. 3MA, 3‐methyladenine; DMEM, Dulbecco's modified Eagle medium; DOR, diabetes‐ and obesity‐regulated gene; LC3, microtubule‐associated protein 1A/1B‐light chain 3."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Decrease", "of", "mRNA", "levels", "in", "TubG4", ",", "UAS", "‐", "CG11347", "‐", "RNAi", "animals", "compared", "with", "TubG4", "controls", ".", "All", "measurements", "were", "normalized", "to", "rp49", ".", "*", "Significant", "change", ",", "P0", ".", "05", ".", "(", "B", ")", "Lysotracker", "staining", "of", "fat", "bodies", ".", "No", "Lysotracker", "staining", "is", "observed", "in", "feeding", "early", "third", "‐", "instar", "larvae", ",", "whereas", "Lysotracker", "‐", "positive", "granules", "(", "red", ")", "accumulate", "in", "fat", "body", "cells", "of", "wandering", "late", "third", "‐", "instar", "controls", "(", "upper", "panels", ",", "TubG4", "/", "+", ")", ".", "dDOR", "knockdown", "animals", "(", "TubG4", ",", "UAS", "‐", "CG11347", "‐", "RNAi", "T4", ",", "lower", "panels", ")", "show", "decreased", "staining", "of", "Lysotracker", "‐", "positive", "granules", "in", "wandering", "late", "third", "‐", "instar", "larvae", ".", "Nuclei", "are", "shown", "in", "blue", ".", "Scale", "bars", ",", "50", "μm", ".", "(", "C", ")", "The", "number", "of", "Lysotracker", "‐", "positive", "puncta", "per", "unit", "area", "are", "shown", "for", "each", "genotype", "(", "control", "and", "RNAi", ")", ",", "normalized", "to", "the", "value", "for", "control", "cells", "processed", "in", "parallel", ".", "*", "Significant", "change", ",", "P0", ".", "05", ".", "(", "D", ")", "Transmission", "electron", "microscopy", "images", "of", "fat", "body", "cells", "from", "wandering", "late", "third", "‐", "instar", "larvae", ".", "Developmental", "autophagy", "results", "in", "the", "accumulation", "of", "large", "autolysosomes", "(", "AL", ")", "in", "control", "(", "TubG4", "/", "+", ")", "larvae", ",", "whereas", "only", "a", "few", "autolysosomes", "are", "seen", "in", "CG11347", "RNAi", "fat", "body", "cells", "of", "the", "same", "age", ".", "Control", "and", "RNAi", "fat", "bodies", "present", "lipid", "droplets", "(", "LP", ")", "with", "a", "'", "striped", "'", "appearance", ",", "which", "is", "an", "electron", "microscopy", "artefact", ".", "Scale", "bars", ",", "5", "nm", ".", "dDor", ",", "CG11347", ",", "a", "homologue", "of", "DOR", ";", "DOR", ",", "diabetes", "‐", "and", "obesity", "‐", "regulated", "gene", ";", "mRNA", ",", "messenger", "RNA", ";", "wt", ",", "wild", "type", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Decrease of mRNA levels in TubG4, UAS‐CG11347‐RNAi animals compared with TubG4 controls. All measurements were normalized to rp49. *Significant change, P0.05.(B) Lysotracker staining of fat bodies. No Lysotracker staining is observed in feeding early third‐instar larvae, whereas Lysotracker‐positive granules (red) accumulate in fat body cells of wandering late third‐instar controls (upper panels, TubG4/+). dDOR knockdown animals (TubG4, UAS‐CG11347‐RNAi T4, lower panels) show decreased staining of Lysotracker‐positive granules in wandering late third‐instar larvae. Nuclei are shown in blue. Scale bars, 50 μm. (C) The number of Lysotracker‐positive puncta per unit area are shown for each genotype (control and RNAi), normalized to the value for control cells processed in parallel. *Significant change, P0.05.(D) Transmission electron microscopy images of fat body cells from wandering late third‐instar larvae. Developmental autophagy results in the accumulation of large autolysosomes (AL) in control (TubG4/+) larvae, whereas only a few autolysosomes are seen in CG11347 RNAi fat body cells of the same age. Control and RNAi fat bodies present lipid droplets (LP) with a 'striped' appearance, which is an electron microscopy artefact. Scale bars, 5 nm. dDor, CG11347, a homologue of DOR; DOR, diabetes‐ and obesity‐regulated gene; mRNA, messenger RNA; wt, wild type."}
{"words": ["Figure", "1", "C", ")", ".", "Western", "blot", "of", "LMF1", "-", "partners", "after", "DSP", "crosslinking", "and", "affinity", "tag", "purification", "using", "LMF1", "'", "s", "C", "-", "terminal", "His", "tag", ".", "Tetracycline", "induces", "LMF1", "expression", ".", "Loading", "dye", "with", "50mM", "DTT", "was", "used", "to", "break", "the", "disulfide", "bonds", "between", "LMF1", "and", "its", "interacting", "partners", ".", "LMF1", "complexes", "are", "labeled", "with", "asterisks", "and", "an", "arrow", "points", "to", "LMF1", "D", ")", ".", "Western", "blot", "of", "LMF1", "-", "partners", "after", "pBPA", "photo", "-", "crosslinking", "and", "affinity", "tag", "purification", ".", "The", "DMSO", "panel", "does", "not", "include", "pBPA", "and", "serves", "as", "a", "negative", "control", ".", "Fractions", "were", "eluted", "with", "increasing", "concentrations", "of", "imidazole", ".", "An", "arrow", "points", "to", "LMF1", "E", ")", ".", "SYPRO", "orange", "protein", "stain", "of", "DSP", "crosslinked", "samples", ".", "Samples", "without", "tetracycline", "but", "with", "DSP", "and", "DTT", "(", "negative", "control", ")", ",", "and", "with", "tetracycline", ",", "DSP", "and", "DTT", "were", "sent", "for", "LC", "MS", "/", "MS", ".", "LMF1", "complexes", "are", "labeled", "with", "asterisks", "and", "an", "arrow", "points", "to", "LMF1", "F", ")", ".", "SYPRO", "orange", "stained", "gel", "of", "pBPA", "samples", ".", "An", "arrow", "points", "to", "LMF1"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1 C). Western blot of LMF1-partners after DSP crosslinking and affinity tag purification using LMF1's C-terminal His tag. Tetracycline induces LMF1 expression. Loading dye with 50mM DTT was used to break the disulfide bonds between LMF1 and its interacting partners. LMF1 complexes are labeled with asterisks and an arrow points to LMF1  D). Western blot of LMF1-partners after pBPA photo-crosslinking and affinity tag purification. The DMSO panel does not include pBPA and serves as a negative control. Fractions were eluted with increasing concentrations of imidazole. An arrow points to LMF1  E). SYPRO orange protein stain of DSP crosslinked samples. Samples without tetracycline but with DSP and DTT (negative control), and with tetracycline, DSP and DTT were sent for LC MS/MS. LMF1 complexes are labeled with asterisks and an arrow points to LMF1  F). SYPRO orange stained gel of pBPA samples. An arrow points to LMF1 "}
{"words": ["Figure", "2", "A", "-", "B", ")", ".", "HEK293", "cells", "stably", "expressing", "LPL", "-", "V5", "or", "PL", "-", "V5", "were", "transfected", "with", "scrambled", "negative", "control", "siRNA", "(", "NC", ")", "or", "siRNA", "against", "LMF1", "-", "interacting", "partners", ".", "Media", "fractions", "were", "probed", "for", "the", "lipase", "V5", "tags", ",", "and", "lysate", "fractions", "were", "probed", "for", "V5", "and", "the", "LMF1", "interacting", "-", "partners", ".", "GAPDH", "is", "a", "loading", "controlsiRNA", "knockdowns", "were", "performed", "in", "triplicate", ",", "and", "lipase", "secretion", "was", "quantified", "relative", "to", "NC", "siRNA", ".", "Error", "bars", "indicate", "the", "standard", "error", ".", "Quantification", "of", "the", "percent", "of", "each", "protein", "remaining", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "indicate", "the", "standard", "error", ".", "E", ")", "HEK293", "cells", "stably", "expressing", "LPL", "-", "V5", "or", "PL", "-", "V5", "were", "transfected", "with", "NC", "siRNA", "or", "siRNA", "against", "TRX", ".", "Lipase", "and", "TRX", "levels", "were", "tested", "as", "for", "Fig", "1A", "F", ")", "Txnip", "overexpression", "in", "HEK293", "cells", "stably", "expressing", "LPL", "-", "V5", "or", "PL", "-", "V5", "hinders", "LPL", ",", "but", "not", "PL", ",", "secretion"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2 A-B). HEK293 cells stably expressing LPL-V5 or PL-V5 were transfected with scrambled negative control siRNA (NC) or siRNA against LMF1-interacting partners. Media fractions were probed for the lipase V5 tags, and lysate fractions were probed for V5 and the LMF1 interacting-partners. GAPDH is a loading controlsiRNA knockdowns were performed in triplicate, and lipase secretion was quantified relative to NC siRNA. Error bars indicate the standard error. Quantification of the percent of each protein remaining from three independent experiments. Error bars indicate the standard error. E) HEK293 cells stably expressing LPL-V5 or PL-V5 were transfected with NC siRNA or siRNA against TRX. Lipase and TRX levels were tested as for Fig 1A  F) Txnip overexpression in HEK293 cells stably expressing LPL-V5 or PL-V5 hinders LPL, but not PL, secretion "}
{"words": ["Figure", "3", "A", ")", ".", "A", "Western", "blot", "against", "the", "C", "-", "terminal", "V5", "tags", "of", "both", "lipases", "shows", "that", "LPL", ",", "but", "not", "PL", ",", "forms", "intermolecular", "disulfide", "bonds", "in", "cells", ".", "Lipase", "monomers", "are", "marked", "with", "a", "single", "arrow", ",", "and", "aggregates", "are", "marked", "with", "double", "and", "triple", "arrows", ".", "The", "LPL", "aggregates", "are", "not", "present", "when", "samples", "are", "treated", "with", "DTT", ".", "There", "is", "no", "PL", "in", "the", "pellet", "fraction", "because", "PL", "does", "not", "aggregate", "B", ")", ".", "A", "Western", "blot", "of", "a", "non", "-", "reducing", "gel", "of", "the", "lysate", "and", "pellet", "fraction", "of", "LPL", "grown", "in", "cells", "lacking", "LMF1", "(", "HEK293", "∆", "LMF1", ")", ",", "normal", "HEK293", "cells", "or", "cells", "with", "additional", "LMF1", "(", "+", "LMF1", ")", ".", "LPL", "monomers", "and", "aggregates", "are", "marked", "as", "above", "C", ")", ".", "Co", "-", "translational", "LPL", "folding", "was", "carried", "out", "in", "the", "presence", "of", "SP", "HEK293", "or", "HEK293", "∆", "LMF1", "cells", ".", "At", "the", "indicated", "time", "points", ",", "AMS", "was", "added", "to", "reactions", "to", "differentiate", "reduced", "(", "R", ")", "and", "oxidized", "(", "O", ")", "LPL", ".", "The", "position", "of", "the", "stacker", "layer", "is", "indicated", "The", "amount", "of", "reduced", "/", "total", "LPL", "intensity", "was", "quantified", ".", "Each", "point", "is", "the", "average", "of", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "represent", "the", "standard", "error", ".", "Significance", "was", "determined", "by", "a", "2", "-", "tailed", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "the", "amount", "of", "oxidized", "/", "total", "LPL", "(", "E", ")", "and", "the", "intensity", "of", "the", "stacker", "/", "total", "LPL", "(", "F", ")", "was", "quantified", ".", "Each", "point", "is", "the", "average", "of", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "represent", "the", "standard", "error", ".", "Significance", "was", "determined", "by", "a", "2", "-", "tailed", "student", "'", "s", "t", "-", "test", "G", "and", "H", ")", ".", "Data", "from", "(", "D", "-", "F", ")", "was", "combined", "to", "show", "the", "trends", "in", "LPL", "folding", "over", "time", "for", "reactions", "using", "HEK293", "or", "HEK293", "∆", "LMF1", "cells", ".", "Each", "point", "is", "the", "average", "of", "three", "independent", "experiments", ",", "and", "error", "bars", "represent", "the", "standard", "deviation"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3 A). A Western blot against the C-terminal V5 tags of both lipases shows that LPL, but not PL, forms intermolecular disulfide bonds in cells. Lipase monomers are marked with a single arrow, and aggregates are marked with double and triple arrows. The LPL aggregates are not present when samples are treated with DTT. There is no PL in the pellet fraction because PL does not aggregate  B). A Western blot of a non-reducing gel of the lysate and pellet fraction of LPL grown in cells lacking LMF1 (HEK293∆LMF1), normal HEK293 cells or cells with additional LMF1 (+LMF1). LPL monomers and aggregates are marked as above  C). Co-translational LPL folding was carried out in the presence of SP HEK293 or HEK293∆LMF1 cells. At the indicated time points, AMS was added to reactions to differentiate reduced (R) and oxidized (O) LPL. The position of the stacker layer is indicated The amount of reduced/total LPL intensity was quantified. Each point is the average of three independent experiments, and error bars represent the standard error. Significance was determined by a 2-tailed student's t-test.the amount of oxidized/total LPL (E) and the intensity of the stacker/total LPL (F) was quantified. Each point is the average of three independent experiments, and error bars represent the standard error. Significance was determined by a 2-tailed student's t-test G and H). Data from (D-F) was combined to show the trends in LPL folding over time for reactions using HEK293 or HEK293∆LMF1 cells. Each point is the average of three independent experiments, and error bars represent the standard deviation "}
{"words": ["Figure", "4Differential", "sensitivity", "of", "HEK293", "cells", "containing", "and", "lacking", "LMF1", "(", "A", ")", "to", "drugs", "that", "perturb", "cellular", "redox", "homeostasis", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "BSO", ",", "DTT", ",", "or", "tunicamycin", "as", "described", "in", "materials", "and", "methods", ".", "Treated", "cell", "and", "untreated", "cells", "were", "counted", ",", "and", "the", "fraction", "of", "surviving", "cells", "was", "calculated", ".", "Three", "wells", "were", "counted", "and", "averaged", "for", "each", "data", "point", ",", "and", "three", "independent", "trials", "were", "carried", "out", "per", "condition", ".", "Significance", "was", "determined", "by", "a", "2", "-", "tailed", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Differential", "sensitivity", "of", "cld", "/", "cld", "and", "wt", "/", "cld", "MEFs", "(", "B", ")", "to", "drugs", "that", "perturb", "cellular", "redox", "homeostasis", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "BSO", ",", "DTT", ",", "or", "tunicamycin", "as", "described", "in", "materials", "and", "methods", ".", "Treated", "cell", "and", "untreated", "cells", "were", "counted", ",", "and", "the", "fraction", "of", "surviving", "cells", "was", "calculated", ".", "Three", "wells", "were", "counted", "and", "averaged", "for", "each", "data", "point", ",", "and", "three", "independent", "trials", "were", "carried", "out", "per", "condition", ".", "Significance", "was", "determined", "by", "a", "2", "-", "tailed", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "C", ")", ".", "The", "redox", "sensor", "ERroGFP", "-", "S4", "shows", "that", "HEK293", "∆", "LMF1", "cells", "have", "a", "more", "oxidized", "ER", "than", "HEK293", "and", "HEK293", "+", "LMF1", "cells", "both", "untreated", "and", "when", "stressed", "by", "expression", "of", "LPL", "-", "mCherry", ".", "A", "two", "-", "tailed", "student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "to", "calculate", "the", "significance", "of", "the", "difference", "in", "the", "ratio", "of", "oxidized", "/", "reduced", "GFP", "fluorescence", "intensity", "between", "cell", "types", ".", "Each", "data", "point", "is", "one", "of", "three", "spots", "measured", "per", "cell", ",", "17", "cells", "were", "measured", "per", "condition", ".", "Significance", "was", "determined", "by", "a", "2", "-", "tailed", "student", "'", "s", "t", "-", "test"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Differential sensitivity of HEK293 cells containing and lacking LMF1 (A) to drugs that perturb cellular redox homeostasis. Cells were treated with BSO, DTT, or tunicamycin as described in materials and methods. Treated cell and untreated cells were counted, and the fraction of surviving cells was calculated. Three wells were counted and averaged for each data point, and three independent trials were carried out per condition. Significance was determined by a 2-tailed student's t-test.Differential sensitivity of cld/cld and wt/cld MEFs (B) to drugs that perturb cellular redox homeostasis. Cells were treated with BSO, DTT, or tunicamycin as described in materials and methods. Treated cell and untreated cells were counted, and the fraction of surviving cells was calculated. Three wells were counted and averaged for each data point, and three independent trials were carried out per condition. Significance was determined by a 2-tailed student's t-test. C). The redox sensor ERroGFP-S4 shows that HEK293∆LMF1 cells have a more oxidized ER than HEK293 and HEK293+LMF1 cells both untreated and when stressed by expression of LPL-mCherry. A two-tailed student's t-test was used to calculate the significance of the difference in the ratio of oxidized/reduced GFP fluorescence intensity between cell types. Each data point is one of three spots measured per cell, 17 cells were measured per condition. Significance was determined by a 2-tailed student's t-test "}
{"words": ["Figure", "5", ")", ".", "Secretion", "of", "LPL", "-", "V5", "from", "HEK293", "∆", "LMF1", "cells", "transiently", "transfected", "with", "LMF1", "bearing", "the", "indicated", "cysteine", "to", "alanine", "mutations", ".", "Lipase", "levels", "in", "the", "lysate", "and", "pellet", ",", "and", "LMF1", "levels", "in", "the", "pellet", "(", "α", "-", "HIS", ")", ",", "are", "also", "probed", ".", "GAPDH", "serves", "as", "a", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5). Secretion of LPL-V5 from HEK293∆LMF1 cells transiently transfected with LMF1 bearing the indicated cysteine to alanine mutations. Lipase levels in the lysate and pellet, and LMF1 levels in the pellet (α-HIS), are also probed. GAPDH serves as a loading control."}
{"words": ["Figure", "6α", "-", "His", "Western", "blot", "to", "detect", "the", "redox", "state", "of", "LMF1", ".", "In", "the", "first", "two", "lanes", "samples", "were", "untreated", "and", "resolved", "in", "reducing", "or", "non", "-", "reducing", "loading", "dye", ".", "The", "next", "4", "lanes", "were", "subject", "to", "the", "indicated", "treatments", "prior", "to", "cell", "lysis", "then", "treated", "with", "AMS", "prior", "to", "non", "-", "reducing", "SDS", "-", "PAGE", ".", "α", "-", "His", "Western", "blot", "to", "detect", "acid", "trapped", "partners", "of", "LMF1", ".", "Samples", "were", "TCA", "precipitated", ",", "treated", "with", "NEM", ",", "and", "LMF1", "was", "purified", "via", "its", "C", "-", "terminal", "His", "tag", ".", "Samples", "were", "resolved", "by", "reducing", "or", "nonreducing", "SDS", "-", "PAGE", ".", "The", "lanes", "marked", "-", "LMF1", "are", "HEK293", "∆", "LMF1", "cells", "included", "as", "a", "negative", "control", ".", "Samples", "were", "TCA", "precipitated", ",", "treated", "with", "NEM", ",", "and", "LMF1", "was", "purified", "via", "its", "C", "-", "terminal", "His", "tag", ".", "Samples", "were", "resolved", "by", "reducing", "or", "nonreducing", "SDS", "-", "PAGE", ".", "The", "lanes", "marked", "-", "LMF1", "are", "HEK293", "∆", "LMF1", "cells", "included", "as", "a", "negative", "control", ".", "Samples", "were", "probed", "with", "an", "antibody", "for", "TRX", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6α-His Western blot to detect the redox state of LMF1. In the first two lanes samples were untreated and resolved in reducing or non-reducing loading dye. The next 4 lanes were subject to the indicated treatments prior to cell lysis then treated with AMS prior to non-reducing SDS-PAGE.α-His Western blot to detect acid trapped partners of LMF1. Samples were TCA precipitated, treated with NEM, and LMF1 was purified via its C-terminal His tag. Samples were resolved by reducing or nonreducing SDS-PAGE. The lanes marked -LMF1 are HEK293∆LMF1 cells included as a negative control.Samples were TCA precipitated, treated with NEM, and LMF1 was purified via its C-terminal His tag. Samples were resolved by reducing or nonreducing SDS-PAGE. The lanes marked -LMF1 are HEK293∆LMF1 cells included as a negative control. Samples were probed with an antibody for TRX."}
{"words": ["Figure", "7Bottom", ",", "center", "and", "top", "slices", "from", "a", "z", "-", "stack", "of", "a", "cld", "/", "wt", "or", "cld", "/", "cld", "MEF", "cell", ".", "YPet", "-", "tagged", "fibronectin", "is", "in", "green", "and", "mCherry", "-", "Sec61β", ",", "an", "ER", "marker", ",", "is", "in", "red", ".", "Note", "fibronectin", "assembly", "into", "the", "extracellular", "matrix", "in", "cld", "/", "wt", "cells", ".", "cld", "/", "wt", "cells", "had", "significantly", "higher", "amounts", "of", "fibronectin", "outside", "of", "the", "ER", "than", "cld", "/", "cld", "cells", "by", "a", "two", "-", "tailed", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Bottom", ",", "center", "and", "top", "slices", "show", "that", "LDLR", "is", "retained", "in", "the", "ER", "in", "cells", "HEK293", "∆", "LMF1", "cells", ".", "LDLR", "-", "GFP", "is", "in", "green", "and", "mCherry", "-", "Sec61β", "is", "in", "red", ".", "Note", "the", "clumping", "of", "LDLR", "in", "the", "ER", "in", "HEK293", "∆", "LMF1", "cells", ".", "The", "ratio", "of", "LDLR", "within", "the", "ER", "/", "total", "LDLR", "was", "significantly", "higher", "for", "HEK293", "∆", "LMF1", "cells", "than", "HEK293", "or", "HEK293", "+", "LMF1", "cells", "by", "a", "2", "-", "tailed", "student", "'", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Bottom, center and top slices from a z-stack of a cld/wt or cld/cld MEF cell. YPet-tagged fibronectin is in green and mCherry-Sec61β, an ER marker, is in red. Note fibronectin assembly into the extracellular matrix in cld/wt cells. cld/wt cells had significantly higher amounts of fibronectin outside of the ER than cld/cld cells by a two-tailed student's t-test.Bottom, center and top slices show that LDLR is retained in the ER in cells HEK293∆LMF1 cells. LDLR-GFP is in green and mCherry-Sec61β is in red. Note the clumping of LDLR in the ER in HEK293∆LMF1 cells. The ratio of LDLR within the ER/total LDLR was significantly higher for HEK293∆LMF1 cells than HEK293 or HEK293+LMF1 cells by a 2-tailed student's t-test."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "Lysates", "of", "HK2", "cells", "cultured", "in", "FM", "or", "STV", "(", "2h", ")", "were", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "OFD1", "(", "left", ")", "and", "anti", "-", "ATG13", "(", "right", ")", "antibodies", "or", "IgG", "and", "analyzed", "by", "WB", ";", "ACTIN", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "IP", "=", "immunoprecipitation", ",", "FM", "=", "full", "medium", ",", "STV", "=", "HBSS", "starvation", ".", "B", ".", "Airyscan", "confocal", "analysis", "of", "endogenous", "FIP200", "/", "γTUBULIN", "and", "ATG13", "/", "γTUBULIN", "colocalization", "with", "lentiviral", "delivered", "HA", "-", "OFD1", "in", "HK2", "cells", ".", "Cells", "were", "cultured", "in", "HBSS", "(", "90min", ")", ".", "Green", ",", "FIP200", "and", "ATG13", ";", "red", ",", "HA", "-", "OFD1", ";", "Grey", ",", "γTUBULIN", ";", "blue", ",", "Hoechst", "for", "nuclei", ".", "Insets", "show", "magnifications", "and", "single", "-", "color", "channels", "of", "selected", "areas", ".", "Scale", "bar", "=", "3", ",", "5μm", ".", "C", ".", "Quantification", "of", "HA", "-", "OFD1", "/", "ATG13", "and", "HA", "-", "OFD1", "/", "FIP200", "colocalization", ",", "expressed", "as", "%", "of", "total", "OFD1", "fluorescence", "(", "mean", "±", "SEM", ")", ".", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ";", "n", "=", "53", "cells", "for", "ATG13", "and", "n", "=", "39", "for", "FIP200", "were", "analyzed", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. Lysates of HK2 cells cultured in FM or STV(2h) were immunoprecipitated with anti-OFD1 (left) and anti-ATG13 (right) antibodies or IgG and analyzed by WB; ACTIN was used as loading control. n=3 independent experiments. IP=immunoprecipitation, FM=full medium, STV=HBSS starvation.B. Airyscan confocal analysis of endogenous FIP200/γTUBULIN and ATG13/γTUBULIN colocalization with lentiviral delivered HA-OFD1 in HK2 cells. Cells were cultured in HBSS (90min). Green, FIP200 and ATG13; red, HA-OFD1; Grey, γTUBULIN; blue, Hoechst for nuclei. Insets show magnifications and single-color channels of selected areas. Scale bar=3,5μm. C. Quantification of HA-OFD1/ATG13 and HA-OFD1/FIP200 colocalization, expressed as % of total OFD1 fluorescence (mean ± SEM). n=3 independent experiments; n=53 cells for ATG13 and n=39 for FIP200 were analyzed. "}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Top", ",", "WB", "of", "ULK1", "-", "complex", "components", "in", "wt", "and", "KO", "-", "OFD1", "cells", "assessed", "in", "FM", "(", "-", ")", "or", "STV", "(", "2", ",", "4h", ")", ".", "Bands", "at", "same", "exposure", ",", "noncontiguous", "on", "the", "same", "gel", ".", "Bottom", ",", "ACTIN", "-", "normalized", "protein", "levels", "are", "expressed", "as", "fold", "increase", "compared", "with", "wt", "cells", ",", "represented", "by", "the", "dashed", "line", "(", "mean", " ", "±", "SEM", ")", ";", "n", "=", "5", "independent", "experiments", ".", "FM", "=", "full", "medium", ",", "STV", "=", "HBSS", "starvation", ".", "B", ".", "Top", ",", "wild", "-", "type", "and", "KO", "-", "OFD1", "cells", "were", "incubated", "with", " ", "50µg", "/", "ml", "CHX", ".", "Immunoblots", "were", "probed", "with", "indicated", "antibodies", ".", "Bottom", ",", "quantification", "of", "βTUBULIN", "and", "ACTIN", "-", "normalized", "protein", "levels", "versus", "untreated", "conditions", "(", "-", ")", ",", "data", "are", "expressed", "as", "mean", " ", "±", "SEM", ";", "n", "=", "4", "independent", "experiments", ".", "CHX", "=", "Cycloheximide", ",", "ns", "=", "not", "significative", ".", "C", ".", "Immunofluorescence", "of", "ULK1", "and", "ATG13", "puncta", "in", "wt", "and", "KO", "-", "OFD1", "cells", "cultured", "in", "HBSS", "(", "90min", ")", ".", "Green", ",", "ATG13", "and", "ULK1", ";", "blue", ",", "Hoechst", "for", "nuclei", ".", "Scale", "bar", "=", "10μm", ".", "(", "Right", ")", "Graphs", "display", "quantification", "of", "puncta", "/", "cell", ",", "data", "are", "expressed", "as", "mean", " ", "±", "SEM", ";", "n", "=", "5", "independent", "experiments", ",", "n", "≥", "200", "cells", "/", "antibody", ".", "D", ".", "Western", "Blot", "of", "ULK1", "complex", "components", "in", "KO", "-", "OFD1", "cells", "transfected", "with", "empty", "vector", "(", "Empty", ")", "or", "3xFLAG", "-", "OFD1", "(", "OFD1", ")", ".", "Histograms", "show", "quantification", "of", "band", "intensities", "normalized", "versus", "ACTIN", "expressed", "as", "mean", " ", "±", "SEM", ".", "n", "=", "5", "independent", "experiments", ".", "E", ".", "Western", "Blot", "of", "ULK1", "-", "complex", "components", "in", "KO", "-", "OFD1", "cells", "transfected", "with", "3xFLAG", "-", "OFD1", "(", "OFD1", ")", "or", "empty", "vector", "(", "Empty", ")", "and", "treated", "(", "+", ")", "or", "not", "(", "-", ")", "with", "SAR405", "(", "10μM", ",", "6h", ")", ".", "ACTIN", "is", "the", "loading", "control", ".", "On", "the", "right", ",", "ATG13", "levels", "are", "expressed", "as", "fold", "increase", "compared", "with", "empty", "vector", "(", "mean", " ", "±", "SEM", ")", ";", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "F", ".", "Representative", "confocal", "images", "of", "co", "-", "staining", "of", "3xFLAG", "-", "OFD1", "with", "ATG13", "in", "KO", "-", "OFD1", "cells", "incubated", "in", "HBSS", ",", "treated", "(", "+", ")", "or", "not", "(", "-", ")", "with", "Baf", "-", "A1", "(", "100nM", ",", "90min", ")", ".", "Green", ",", "ATG13", ";", "red", ",", "3xFLAG", "-", "OFD1", ";", "blue", ",", "Hoechst", "for", "nuclei", ".", "Scale", "bar", "=", "10μm", ".", "(", "Right", ")", "ATG13", "puncta", "/", "cell", "are", "quantified", "and", "expressed", "as", "mean", " ", "±", "SEM", ";", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "n", "≥", "100", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Top, WB of ULK1-complex components in wt and KO-OFD1 cells assessed in FM (-) or STV (2,4h). Bands at same exposure, noncontiguous on the same gel. Bottom, ACTIN-normalized protein levels are expressed as fold increase compared with wt cells, represented by the dashed line (mean ± SEM); n=5 independent experiments. FM=full medium, STV=HBSS starvation.B. Top, wild-type and KO-OFD1 cells were incubated with 50µg/ml CHX. Immunoblots were probed with indicated antibodies. Bottom, quantification of βTUBULIN and ACTIN-normalized protein levels versus untreated conditions (-), data are expressed as mean ± SEM; n=4 independent experiments. CHX=Cycloheximide, ns=not significative.C. Immunofluorescence of ULK1 and ATG13 puncta in wt and KO-OFD1 cells cultured in HBSS (90min). Green, ATG13 and ULK1; blue, Hoechst for nuclei. Scale bar=10μm. (Right) Graphs display quantification of puncta/cell, data are expressed as mean ± SEM; n=5 independent experiments, n≥200 cells/antibody.D. Western Blot of ULK1 complex components in KO-OFD1 cells transfected with empty vector (Empty) or 3xFLAG-OFD1 (OFD1). Histograms show quantification of band intensities normalized versus ACTIN expressed as mean ± SEM. n=5 independent experiments.E. Western Blot of ULK1-complex components in KO-OFD1 cells transfected with 3xFLAG-OFD1 (OFD1) or empty vector (Empty) and treated (+) or not (-) with SAR405 (10μM, 6h). ACTIN is the loading control. On the right, ATG13 levels are expressed as fold increase compared with empty vector (mean ± SEM); n=3 independent experiments.F. Representative confocal images of co-staining of 3xFLAG-OFD1 with ATG13 in KO-OFD1 cells incubated in HBSS, treated (+) or not (-) with Baf-A1(100nM, 90min). Green, ATG13; red, 3xFLAG-OFD1; blue, Hoechst for nuclei. Scale bar=10μm. (Right) ATG13 puncta/cell are quantified and expressed as mean ± SEM; n=3 independent experiments, n≥100 cells."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "Middle", ".", "Lysates", "from", "3xFLAG", "-", "OFD1", "overexpressing", "HEK293", "cells", "were", "added", "to", "beads", "with", "immobilized", "GST", "-", "fused", "LC3B", ",", "LC3BF52A", "-", "V53AdG", ",", "dNLC3BdG", "and", "GST", "alone", ".", "Right", ".", "Lysates", "from", "3xFLAG", "-", "OFD1", "(", "OFD1", ")", "and", "empty", "vector", "(", "Empty", ")", "overexpressing", "HEK293", "cells", "were", "added", "to", "GST", "-", "GABARAP", "-", "L1", "and", "GST", ".", "Left", ".", "WB", "of", "total", "lysates", "(", "input", ")", ".", "All", "panels", "display", "WB", "for", "FLAG", ",", "ACTIN", "is", "the", "loading", "control", ".", "B", ".", "Representative", "confocal", "images", "of", "endogenous", "OFD1", "(", "green", ")", "co", "-", "staining", "with", "LC3B", "(", "red", ")", ",", "and", "of", "3xFLAG", "-", "OFD1", "(", "red", ")", "with", "GABARAP", "(", "green", ")", "in", "HK2", "cells", "(", "HBSS", ",", "90min", ")", ".", "Hoechst", "labels", "nuclei", "(", "blue", ")", ".", "Insets", "show", "magnifications", "and", "single", "-", "color", "channels", "of", "selected", "areas", ".", "Scale", "bar", "=", "10μm", ";", "n", "≥", "50", "cells", "/", "sample", ".", "D", ".", "Lysates", "from", "3xFLAG", "-", "OFD1", "(", "OFD1", ")", ",", "3xFLAG", "-", "OFD1", "∆", "LIR", "(", "OFD1", "∆", "LIR", ")", "and", "empty", "vector", "(", "Empty", ")", "overexpressing", "cells", "were", "added", "to", "GST", "-", "GABARAP", "-", "L1", ",", "GST", "-", "LC3B", "and", "GST", ".", "E", ".", "Representative", "confocal", "images", "of", "OFD1", "∆", "LIR", "co", "-", "staining", "with", "LC3B", "(", "left", ")", "and", "GABARAP", "(", "right", ")", "in", "HK2", "cells", "(", "HBSS", ",", "90min", ")", ".", "Green", ",", "LC3B", "and", "GABARAP", ";", "red", ",", "3xFLAG", "-", "OFD1", "∆", "LIR", ";", "blue", ",", "Hoechst", "for", "nuclei", ".", "Scale", "bar", "=", "5μm", ".", "n", "≥", "50", "cells", "/", "sample", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. Middle. Lysates from 3xFLAG-OFD1 overexpressing HEK293 cells were added to beads with immobilized GST-fused LC3B, LC3BF52A-V53AdG, dNLC3BdG and GST alone. Right. Lysates from 3xFLAG-OFD1(OFD1) and empty vector (Empty) overexpressing HEK293 cells were added to GST-GABARAP-L1 and GST. Left. WB of total lysates (input). All panels display WB for FLAG, ACTIN is the loading control.B. Representative confocal images of endogenous OFD1 (green) co-staining with LC3B (red), and of 3xFLAG-OFD1 (red) with GABARAP (green) in HK2 cells (HBSS,90min). Hoechst labels nuclei (blue). Insets show magnifications and single-color channels of selected areas. Scale bar=10μm; n≥50 cells/sample.D. Lysates from 3xFLAG-OFD1(OFD1), 3xFLAG-OFD1∆LIR(OFD1∆LIR) and empty vector (Empty) overexpressing cells were added to GST-GABARAP-L1, GST-LC3B and GST.E. Representative confocal images of OFD1∆LIR co-staining with LC3B (left) and GABARAP (right) in HK2 cells (HBSS,90min). Green, LC3B and GABARAP; red, 3xFLAG-OFD1∆LIR; blue, Hoechst for nuclei. Scale bar=5μm. n≥50 cells/sample."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "Representative", "confocal", "images", "of", "3xFLAG", "-", "OFD1", "(", "OFD1", ")", "and", "3xFLAG", "-", "OFD1", "∆", "LIR", "(", "OFD1", "∆", "LIR", ")", "co", "-", "staining", "with", "ATG13", "in", "KO", "-", "OFD1", "cells", "(", "HBSS", ",", "90min", ")", ".", "Green", ",", "ATG13", ";", "red", ",", "FLAG", ";", "blue", ",", "Hoechst", "for", "nuclei", ".", "Scale", "bar", "=", "10μm", ".", "(", "Right", ")", "ATG13", "puncta", "/", "cell", "are", "quantified", "and", "expressed", "as", "mean", " ", "±", "SEM", ";", "n", "=", "4", "independent", "experiments", ",", "n", "≥", "100", "cells", ".", "B", ".", "Western", "blot", "of", "ATG13", "in", "KO", "-", "OFD1", "cells", "transfected", "with", "3xFLAG", "-", "OFD1", "(", "OFD1", ")", "or", "3xFLAG", "-", "OFD1", "∆", "LIR", "(", "OFD1", "∆", "LIR", ")", "or", "empty", "vector", "(", "Empty", ")", ".", "(", "Right", ")", "ACTIN", "-", "normalized", "ATG13", "protein", "levels", "are", "expressed", "as", "fold", "increase", "compared", "with", "empty", "vector", "(", "mean", " ", "±", "SEM", ")", ";", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "C", ".", "Top", ".", "OFD1", "fragments", "(", "a", ",", "b", "and", "c", ")", ".", "Bottom", "left", ".", "Lysates", "from", "empty", "vector", "(", "Empty", ")", ",", "3xFLAG", "-", "OFD1", "(", "OFD1", ")", ",", "3xFLAG", "-", "OFD1a", "(", "OFD1a", ")", ",", "3xFLAG", "-", "OFD1b", "(", "OFD1b", ")", ",", "3xFLAG", "-", "OFD1c", "(", "OFD1c", ")", "overexpressing", "HEK293", "cells", "were", "added", "to", "GST", "-", "ATG13", ";", "lysates", "from", "3xFLAG", "-", "OFD1", "(", "OFD1", ")", "overexpressing", "HEK293", "cells", "were", "added", "to", "GST", "as", "control", ".", "Right", ".", "WB", "of", "total", "lysates", "(", "input", ")", ".", "All", "panels", "display", "WB", "for", "FLAG", ",", "HSP90", "is", "the", "loading", "control", ".", "LIR", "=", "LC3", "interacting", "region", ".", "D", ".", "Scanning", "confocal", "microscopy", "analysis", "of", "wt", "and", "KO", "-", "OFD1", "cells", "incubated", "in", "HBSS", "(", "8h", ")", ",", "treated", "(", "+", ")", "or", "not", "(", "-", ")", "with", "Baf", "-", "A1", "(", "50nM", ",", "8h", ")", ".", "Green", ",", "LAMP1", ";", "red", ",", "ATG13", ";", "blue", ",", "Hoechst", "for", "nuclei", ".", "Scale", "bar", "=", "6μm", ".", "Insets", "show", "higher", "magnification", "and", "single", "colour", "channels", "of", "the", "boxed", "area", ".", "(", "Bottom", ")", "Bar", "graphs", "show", "quantification", "of", "lysosomes", "containing", "ATG13", "expressed", "as", "%", "of", "total", "amount", "of", "LAMP1", "/", "cell", "(", "mean", "±", "SEM", ")", ".", "n", "=", "30", "WT", "cells", ",", "n", "=", "28", "KO", "-", "OFD1", "cells", "counted", ";", "three", "independent", "experiments", ".", "E", ".", "Time", "course", "of", "OFD1", "levels", "in", "HBSS", "-", "starved", "wt", "HK2", "cells", "treated", "with", "Baf", "-", "A1", "(", "100nM", ")", "and", "collected", "at", "different", "time", "points", ".", "LC3B", "is", "the", "control", "for", "Baf", "-", "A1", "treatment", ".", "(", "Right", ")", "Graphs", "show", "ACTIN", "-", "normalized", "OFD1", "levels", "versus", "FM", "condition", "(", "-", ")", "expressed", "as", "mean", " ", "±", "SEM", ";", "n", "=", "4", "independent", "experiments", ".", "STV", "=", "starvation", ",", "Baf", "-", "A1", "=", "bafilomycin", ",", "Ctrl", "=", "control", ".", "F", ".", "Western", "blot", "of", "FLAG", "in", "KO", "-", "OFD1", "cells", "transfected", "with", "3xFLAG", "-", "OFD1", "(", "OFD1", ")", "or", "3xFLAG", "-", "OFD1", "∆", "LIR", "(", "OFD1", "∆", "LIR", ")", "and", "treated", "or", "not", "(", "-", ")", "with", "Baf", "-", "A1", "(", "100nM", ",", "2h", ")", ".", "(", "Right", ")", "Quantification", "of", "GAPDH", "-", "normalized", "FLAG", "levels", "versus", "untreated", "(", "-", ")", "is", "expressed", "as", "mean", " ", "±", "SEM", ";", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "Baf", "-", "A1", "=", "bafilomycin", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. Representative confocal images of 3xFLAG-OFD1 (OFD1) and 3xFLAG-OFD1∆LIR (OFD1∆LIR) co-staining with ATG13 in KO-OFD1 cells (HBSS,90min). Green, ATG13; red, FLAG; blue, Hoechst for nuclei. Scale bar=10μm. (Right) ATG13 puncta/cell are quantified and expressed as mean ± SEM; n=4 independent experiments, n≥100 cells.B. Western blot of ATG13 in KO-OFD1 cells transfected with 3xFLAG-OFD1 (OFD1) or 3xFLAG-OFD1∆LIR (OFD1∆LIR) or empty vector (Empty). (Right) ACTIN-normalized ATG13 protein levels are expressed as fold increase compared with empty vector (mean ± SEM); n=3 independent experiments.C. Top. OFD1 fragments (a,b and c). Bottom left. Lysates from empty vector (Empty), 3xFLAG-OFD1(OFD1), 3xFLAG-OFD1a (OFD1a), 3xFLAG-OFD1b (OFD1b), 3xFLAG-OFD1c (OFD1c) overexpressing HEK293 cells were added to GST-ATG13; lysates from 3xFLAG-OFD1(OFD1) overexpressing HEK293 cells were added to GST as control. Right. WB of total lysates (input). All panels display WB for FLAG, HSP90 is the loading control. LIR=LC3 interacting region.D. Scanning confocal microscopy analysis of wt and KO-OFD1 cells incubated in HBSS (8h), treated (+) or not (-) with Baf-A1(50nM, 8h). Green, LAMP1; red, ATG13; blue, Hoechst for nuclei. Scale bar=6μm. Insets show higher magnification and single colour channels of the boxed area. (Bottom) Bar graphs show quantification of lysosomes containing ATG13 expressed as % of total amount of LAMP1/cell (mean ± SEM). n=30 WT cells, n=28 KO-OFD1 cells counted; three independent experiments.E. Time course of OFD1 levels in HBSS-starved wt HK2 cells treated with Baf-A1 (100nM) and collected at different time points. LC3B is the control for Baf-A1 treatment. (Right) Graphs show ACTIN-normalized OFD1 levels versus FM condition (-) expressed as mean ± SEM; n=4 independent experiments. STV=starvation, Baf-A1=bafilomycin, Ctrl=control.F. Western blot of FLAG in KO-OFD1 cells transfected with 3xFLAG-OFD1 (OFD1) or 3xFLAG-OFD1∆LIR (OFD1∆LIR) and treated or not (-) with Baf-A1 (100nM,2h). (Right) Quantification of GAPDH-normalized FLAG levels versus untreated (-) is expressed as mean ± SEM; n=3 independent experiments. Baf-A1=bafilomycin."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "Representative", "blots", "of", "ATG13", "(", "left", ")", "and", "VPS34", "(", "right", ")", "phosphorylation", "levels", "in", "wt", "and", "KO", "-", "OFD1", "cells", "transiently", "expressing", "GFP", "-", "ATG13", "and", "FLAG", "-", "VPS34", "in", "FM", ".", "B", ".", "Wild", "-", "type", "and", "KO", "-", "OFD1", "cells", "were", "starved", "in", "HBSS", "with", "/", "without", "Baf", "-", "A1", "(", "100nM", ",", "2h", ")", "and", "chloroquine", "(", "CQ", ")", "(", "50μM", ",", "2h", ")", "and", "total", "lysates", "were", "analyzed", "by", "immunoblotting", "using", "anti", "-", "OFD1", ",", "-", "LC3B", "(", "LC3B", "-", "I", "18", " ", "kDa", "and", "LC3B", "-", "II", "16", " ", "kDa", ")", "and", "-", "ACTIN", "antibodies", ".", "(", "Right", ")", "ACTIN", "-", "normalized", "LC3B", "-", "II", "levels", "are", "expressed", "as", "fold", "change", "versus", "untreated", "conditions", "(", "-", ")", "of", "wt", "cells", ".", "n", "=", "5", "independent", "experiments", ".", "C", ".", "Representative", "images", "of", "LC3B", "and", "WIPI2", "puncta", "in", "wt", "and", "KO", "-", "OFD1", "cells", "(", "HBSS", ",", "90min", ")", ".", "Green", ",", "LC3B", ";", "red", ",", "WIPI2", ";", "blue", ",", "Hoechst", ",", "nuclei", ".", "Scale", "bar", "=", "10μm", ".", "(", "Right", ")", "Quantification", "of", "LC3B", "and", "WIPI2", "puncta", "is", "shown", ".", "≥", "100", "cells", "analyzed", "/", "sample", ",", "n", "=", "5", "independent", "experiments", ".", "D", ".", "Transmission", "electron", "microscopy", "(", "left", ")", "and", "quantification", "(", "right", ")", "of", "autophagic", "vacuoles", "(", "arrows", ")", "in", "wt", "and", "KO", "-", "OFD1", "cells", "(", "HBSS", ",", "90min", ")", ".", "E", ".", "Representative", "images", "of", "siOFD1", "depleted", "and", "control", "(", "Ctrl", ")", "HeLa", "cells", "transiently", "expressing", "mRFP", "-", "eGFP", "-", "LC3B", "(", "HBSS", ",", "90min", ")", ".", "Insets", "show", "higher", "magnification", "of", "colocalization", "in", "selected", "areas", ".", "Scale", "bar", "=", "10μm", ".", "Bottom", ",", "tandem", "structure", "of", "the", "mRFP", "-", "GFP", "-", "LC3B", "construct", "and", "quantification", "of", "RFP", "+", "GFP", "+", "and", "RFP", "+", "GFP", "-", "puncta", "in", "siOFD1", "-", "depleted", "cells", "and", "controls", ",", "cultured", "in", "full", "medium", "(", "FM", ")", "or", "kept", "in", "HBSS", "for", "2h", "(", "STV", ")", "are", "depicted", ".", "n", "≥", "90", "cells", "/", "sample", "analyzed", ",", "n", "=", "5", "independent", "experiments", ".", "F", ".", "Representative", "images", "of", "WIPI2", "staining", "in", "wt", "HK2", "cells", "transiently", "expressing", "eGFP", "-", "OFD1", "(", "HBSS", ",", "90min", ")", ".", "Green", ",", "eGFP", "-", "OFD1", ",", "red", ",", "WIPI2", ";", "blue", ",", "Hoechst", "labels", "nuclei", ".", "On", "the", "right", ",", "quantification", "of", "WIPI2", "puncta", "in", "eGFP", "-", "OFD1", "transfected", "cells", "compared", "with", "non", "-", "transfected", "cells", "(", "Ctrl", ")", "is", "shown", ".", "Scale", "bar", "=", "10μm", ".", "n", "≥", "90", "cells", "analyzed", "/", "sample", ",", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "G", ".", "Representative", "images", "of", "WIPI2", "and", "OFD1", "co", "-", "staining", "in", "KO", "-", "OFD1", "cells", "transfected", "with", "empty", "vector", "(", "Empty", ")", ",", "3xFLAG", "-", "OFD1", "(", "OFD1", ")", "or", "3xFLAG", "-", "OFD1", "∆", "LIR", "(", "OFD1", "∆", "LIR", ")", "(", "HBSS", ",", "90min", ")", ".", "Red", ",", "WIPI2", ";", "green", ",", "OFD1", ";", "blue", ",", "Hoechst", "labels", "nuclei", ".", "Scale", "bars", ":", "10μm", ".", "On", "the", "right", ",", "quantification", "of", "WIPI2", "puncta", ".", "≥", "100", "cells", "analyzed", "/", "sample", ",", "n", "=", "4", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. Representative blots of ATG13 (left) and VPS34 (right) phosphorylation levels in wt and KO-OFD1 cells transiently expressing GFP-ATG13 and FLAG-VPS34 in FM.B. Wild-type and KO-OFD1 cells were starved in HBSS with/without Baf-A1 (100nM, 2h) and chloroquine (CQ) (50μM, 2h) and total lysates were analyzed by immunoblotting using anti-OFD1, -LC3B (LC3B-I 18 kDa and LC3B-II 16 kDa) and -ACTIN antibodies. (Right) ACTIN-normalized LC3B-II levels are expressed as fold change versus untreated conditions (-) of wt cells. n=5 independent experiments.C. Representative images of LC3B and WIPI2 puncta in wt and KO-OFD1 cells (HBSS, 90min). Green, LC3B; red, WIPI2; blue, Hoechst, nuclei. Scale bar=10μm. (Right) Quantification of LC3B and WIPI2 puncta is shown. ≥100 cells analyzed/sample, n=5 independent experiments.D. Transmission electron microscopy (left) and quantification (right) of autophagic vacuoles (arrows) in wt and KO-OFD1 cells (HBSS, 90min).E. Representative images of siOFD1 depleted and control (Ctrl) HeLa cells transiently expressing mRFP-eGFP-LC3B (HBSS, 90min). Insets show higher magnification of colocalization in selected areas. Scale bar=10μm. Bottom, tandem structure of the mRFP-GFP-LC3B construct and quantification of RFP+GFP+ and RFP+GFP- puncta in siOFD1-depleted cells and controls, cultured in full medium (FM) or kept in HBSS for 2h (STV) are depicted. n≥90 cells/sample analyzed, n=5 independent experiments.F. Representative images of WIPI2 staining in wt HK2 cells transiently expressing eGFP-OFD1 (HBSS,90min). Green, eGFP-OFD1, red, WIPI2; blue, Hoechst labels nuclei. On the right, quantification of WIPI2 puncta in eGFP-OFD1 transfected cells compared with non-transfected cells (Ctrl) is shown. Scale bar=10μm. n≥90 cells analyzed/sample, n=3 independent experiments.G. Representative images of WIPI2 and OFD1 co-staining in KO-OFD1 cells transfected with empty vector (Empty), 3xFLAG-OFD1 (OFD1) or 3xFLAG-OFD1∆LIR (OFD1∆LIR) (HBSS,90min). Red, WIPI2; green, OFD1; blue, Hoechst labels nuclei. Scale bars: 10μm. On the right, quantification of WIPI2 puncta. ≥100 cells analyzed/sample, n=4 independent experiments."}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "Western", "blot", "of", "LC3B", "in", "lymphoblasts", "of", "OFD", "type", "I", "patients", "and", "controls", ",", "either", "untreated", "(", "-", ")", "or", "exposed", "to", "Baf", "-", "A1", "(", "10nM", ",", "2h", ")", "(", "+", ")", ".", "Cells", "were", "cultured", "in", "complete", "medium", "(", "FM", ",", "top", ")", "or", "under", "serum", "starvation", "for", "4h", "(", "STV", ",", "bottom", ")", ".", "ACTIN", "and", "GAPDH", "were", "used", "as", "loading", "controls", ".", "B", ".", "(", "Left", ")", "Graphs", "show", "LC3B", "-", "II", "levels", "normalized", "on", "ACTIN", "in", "patients", "lymphoblasts", "and", "controls", "cultured", "in", "complete", "medium", "(", "FM", ")", ".", "(", "Right", ")", "Graphs", "show", "LC3B", "-", "II", "levels", "normalized", "on", "GAPDH", "in", "patients", "lymphoblasts", "and", "controls", "in", "serum", "starvation", "for", "4h", "(", "STV", ")", ".", "Normalized", "LC3B", "-", "II", "levels", "are", "expressed", "as", "fold", "change", "versus", "untreated", "conditions", "(", "-", ")", "of", "control", "cells", ",", "n", "=", "4", "patients", "and", "3", "controls", ".", "C", ".", "Western", "blot", "of", "ATG13", "and", "ATG101", "proteins", "in", "serum", "starved", "lymphoblasts", "from", "controls", "and", "OFD", "type", "I", "patients", ".", "(", "Right", ")", "Protein", "levels", "relative", "to", "ACTIN", "(", "loading", "control", ")", "are", "expressed", "as", "fold", "change", "versus", "controls", ",", "represented", "by", "the", "dashed", "line", ",", "n", "=", "4", "patients", "and", "3", "controls", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A. Western blot of LC3B in lymphoblasts of OFD type I patients and controls, either untreated (-) or exposed to Baf-A1 (10nM, 2h)(+). Cells were cultured in complete medium (FM, top) or under serum starvation for 4h (STV, bottom). ACTIN and GAPDH were used as loading controls.B. (Left) Graphs show LC3B-II levels normalized on ACTIN in patients lymphoblasts and controls cultured in complete medium (FM). (Right) Graphs show LC3B-II levels normalized on GAPDH in patients lymphoblasts and controls in serum starvation for 4h (STV). Normalized LC3B-II levels are expressed as fold change versus untreated conditions (-) of control cells, n=4 patients and 3 controls.C. Western blot of ATG13 and ATG101 proteins in serum starved lymphoblasts from controls and OFD type I patients. (Right) Protein levels relative to ACTIN (loading control) are expressed as fold change versus controls, represented by the dashed line, n=4 patients and 3 controls."}
{"words": ["Figure", "7A", ".", "Western", "blot", "of", "LC3B", "in", "kidney", "homogenates", "from", "leupeptin", "-", "treated", "(", "40mg", "/", "kg", ",", "6h", ")", "fasted", "Ofd1fl", "/", "y", ";", "creKsp", "and", "control", "mice", ".", "(", "Right", ")", "LC3B", "-", "II", "protein", "levels", "normalized", "to", "Actin", "(", "loading", "control", ")", "are", "expressed", "as", "fold", "increase", "versus", "control", "mice", ",", "n", "=", "4", "mice", "/", "group", ".", "B", ".", "Representative", "images", "of", "GFP", "-", "LC3", "puncta", "(", "autophagosomes", ",", "green", ")", "in", "aquaporin2", "-", "positive", "(", "AQP2", ",", "red", ")", "renal", "distal", "tubules", "from", "P8", "Ofd1fl", "/", "y", ";", "creKsp", ";", "GFP", "-", "LC3", "and", "Ofd1fl", "/", "y", ";", "GFP", "-", "LC3", "mice", ".", "Scale", "bar", "=", "10μm", ".", "Hoechst", "labels", "nuclei", ".", "Bar", "graphs", "on", "the", "left", "show", "quantitative", "analysis", "of", "GFP", "-", "LC3", "puncta", ";", "n", "=", "4", "mice", "/", "group", "for", "a", "total", "of", "300", "AQP2", "positive", "nuclei", "/", "group", "analyzed", ".", "C", ".", "Western", "blot", "of", "LC3B", "in", "kidney", "homogenates", "from", "leupeptin", "-", "treated", "(", "40mg", "/", "kg", ",", "6h", ")", "fasted", "Ofd1", "-", "IND", "and", "control", "mice", ".", "(", "Right", ")", "LC3B", "-", "II", "protein", "levels", "relative", "to", "βTubulin", "(", "loading", "control", ")", "are", "expressed", "as", "fold", "increase", "compared", "with", "control", "mice", ",", "n", "=", "5", "mutant", "/", "8", "control", "mice", ".", "D", ".", "Western", "blot", "of", "Atg13", "in", "Ofd1fl", "/", "y", ";", "creKsp", "and", "control", "kidneys", "at", "pre", "-", "cystic", "(", "P8", ",", "left", ")", "and", "cystic", "(", "P22", ",", "right", ")", "stages", ".", "Gapdh", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "Atg13", "protein", "levels", "are", "expressed", "as", "fold", "change", "compared", "with", "control", "mice", ";", "n", "=", "7", "mutant", "/", "5", "control", "mice", "at", "P8", ",", "n", "=", "4mice", "/", "group", "at", "P22", ".", "E", ".", "Haematoxylin", "&", "eosin", "staining", "of", "kidney", "sections", "from", "Ofd1fl", "/", "y", ";", "Atg7", "+", "/", "+", ";", "creKsp", "and", "Ofd1fl", "/", "y", ";", "Atg7fl", "/", "fl", ";", "creKsp", "mice", ".", "(", "Right", ")", "Graph", "shows", "fold", "change", "of", "the", "cysts", "number", "observed", "in", "Ofd1fl", "/", "y", ";", "Atg7fl", "/", "fl", ";", "creKsp", "animals", "compared", "with", "Ofd1fl", "/", "y", ";", "Atg7", "+", "/", "+", ";", "creKsp", ";", "n", "=", "12", "sections", "/", "animal", "were", "analyzed", ";", "n", "=", "6", "mice", "/", "group", ".", "Scale", "bars", "=", "1mm", ".", "F", ".", "Blood", "Urea", "Nitrogen", "was", "quantified", "on", "blood", "withdrawn", "from", "Ofd1fl", "/", "y", ";", "Atg7fl", "/", "fl", ";", "creKsp", ",", "Ofd1fl", "/", "y", ";", "Atg7", "+", "/", "+", ";", "creKsp", "and", "control", "mice", "at", "P45", ".", "n", "=", "8", "mice", "per", "group", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A. Western blot of LC3B in kidney homogenates from leupeptin-treated (40mg/kg, 6h) fasted Ofd1fl/y;creKsp and control mice. (Right) LC3B-II protein levels normalized to Actin (loading control) are expressed as fold increase versus control mice, n=4 mice/group.B. Representative images of GFP-LC3 puncta (autophagosomes, green) in aquaporin2-positive (AQP2, red) renal distal tubules from P8 Ofd1fl/y;creKsp;GFP-LC3 and Ofd1fl/y;GFP-LC3 mice. Scale bar=10μm. Hoechst labels nuclei. Bar graphs on the left show quantitative analysis of GFP-LC3 puncta; n=4 mice/group for a total of 300 AQP2 positive nuclei/group analyzed.C. Western blot of LC3B in kidney homogenates from leupeptin-treated (40mg/kg, 6h) fasted Ofd1-IND and control mice. (Right) LC3B-II protein levels relative to βTubulin (loading control) are expressed as fold increase compared with control mice, n=5 mutant/8 control mice .D. Western blot of Atg13 in Ofd1fl/y;creKsp and control kidneys at pre-cystic (P8, left) and cystic (P22, right) stages. Gapdh was used as loading control. Atg13 protein levels are expressed as fold change compared with control mice; n=7 mutant/5 control mice at P8, n= 4mice/group at P22.E. Haematoxylin & eosin staining of kidney sections from Ofd1fl/y;Atg7+/+;creKsp and Ofd1fl/y;Atg7fl/fl;creKsp mice. (Right) Graph shows fold change of the cysts number observed in Ofd1fl/y;Atg7fl/fl;creKsp animals compared with Ofd1fl/y;Atg7+/+;creKsp; n=12 sections/animal were analyzed; n=6 mice/group. Scale bars=1mm.F. Blood Urea Nitrogen was quantified on blood withdrawn from Ofd1fl/y;Atg7fl/fl;creKsp, Ofd1fl/y;Atg7+/+;creKsp and control mice at P45. n=8 mice per group."}
{"words": ["Figure", "1Agar", "plugs", "containing", "actively", "growing", "cultures", "of", "wild", "type", "S", ".", "sclerotiorum", "(", "strain", "1980", ")", "and", "the", "OA", "deficient", "A2", "mutant", "were", "inoculated", "onto", "Col", "-", "0", "and", "ced", "-", "9", "expressing", "Arabidopsis", "leaves", ".", "(", "A", ")", "Wild", "type", "inoculations", "onto", "Col", "-", "0", "plants", "resulted", "in", "typical", "lesions", "for", "this", "pathogen", "including", "a", "rapid", ",", "spreading", "cell", "death", ";", "however", ",", "infection", "was", "completely", "suppressed", "in", "ced", "-", "9", "expressing", "plants", ".", "The", "expression", "of", "this", "gene", "had", "no", "effect", "on", "the", "A2", "phenotype", ".", "(", "B", ")", "Trypan", "blue", "staining", "indicates", "the", "extent", "of", "cell", "death", "for", "each", "genotype", "/", "strain", "combination", ",", "including", "an", "agar", "plug", "control", ".", "All", "images", "were", "recorded", "48", "hours", "post", "inoculation", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Agar plugs containing actively growing cultures of wild type S. sclerotiorum (strain 1980) and the OA deficient A2 mutant were inoculated onto Col-0 and ced-9 expressing Arabidopsis leaves. (A) Wild type inoculations onto Col-0 plants resulted in typical lesions for this pathogen including a rapid, spreading cell death; however, infection was completely suppressed in ced-9 expressing plants. The expression of this gene had no effect on the A2 phenotype.(B) Trypan blue staining indicates the extent of cell death for each genotype/strain combination, including an agar plug control. All images were recorded 48 hours post inoculation."}
{"words": ["Figure", "2Microscopic", "examination", "of", "cross", "sections", "of", "tomato", "leaves", "at", "the", "leading", "edge", "of", "the", "lesion", "following", "fungal", "inoculation", ".", "S", ".", "sclerotiorum", "A2", "(", "A", ")", "and", "wild", "type", "(", "B", ")", "strains", "were", "inoculated", "onto", "tomato", "leaves", "using", "colonized", "agar", "plugs", ".", "24", "hours", "post", "inoculation", ";", "leaves", "were", "post", "-", "fixed", "in", "osmium", "tetroxide", ",", "and", "embedded", "in", "Spurr", "'", "s", "epoxy", "resin", ".", "A", "microtome", "was", "used", "to", "cut", "400", "nm", "sections", ".", "Toluidine", "blue", "stain", "was", "used", "to", "reveal", "fungal", "hyphae", ".", "H", " ", "=", " ", "hyphae", ".", "The", "dotted", "line", "represents", "the", "leading", "edge", "of", "the", "visible", "lesion", ".", "Images", "were", "collected", "using", "an", "Olympus", "DP", "70", "camera", "and", "processed", "with", "Olympus", "DP", "Controller", "software", ",", "version", "2", ".", "2", ".", "1", ".", "227", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Microscopic examination of cross sections of tomato leaves at the leading edge of the lesion following fungal inoculation.S. sclerotiorum A2 (A) and wild type (B) strains were inoculated onto tomato leaves using colonized agar plugs. 24 hours post inoculation; leaves were post-fixed in osmium tetroxide, and embedded in Spurr's epoxy resin. A microtome was used to cut 400 nm sections. Toluidine blue stain was used to reveal fungal hyphae. H = hyphae. The dotted line represents the leading edge of the visible lesion. Images were collected using an Olympus DP 70 camera and processed with Olympus DP Controller software, version 2.2.1.227."}
{"words": ["Figure", "3S", ".", "sclerotiorum", "A2", "strain", "induces", "autophagic", "structures", "in", "plants", ".", "S", ".", "sclerotiorum", "wild", "type", "and", "A2", "strains", "were", "inoculated", "onto", "tomato", "leaves", "using", "colonized", "agar", "plugs", ".", "24", "hours", "post", "inoculation", ";", "leaves", "were", "stained", "with", "100", "µM", "final", "concentration", "of", "MDC", "(", "Sigma", ")", "in", "PBS", "for", "30", "min", ".", "Fluorescence", "was", "visualized", "using", "an", "Olympus", "IX81", "inverted", "fluorescence", "confocal", "microscope", "(", "Olympus", "systems", ",", "Germany", ")", ",", "with", "an", "excitation", "wavelength", "of", "335", "nm", "and", "an", "emission", "wavelength", "of", "508", "nm", ".", "Images", "were", "collected", "using", "an", "Olympus", "DP", "70", "camera", "and", "processed", "with", "Olympus", "DP", "Controller", "software", ",", "version", "2", ".", "2", ".", "1", ".", "227", ".", "Scale", "bar", " ", "=", " ", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3S. sclerotiorum A2 strain induces autophagic structures in plants.S. sclerotiorum wild type and A2 strains were inoculated onto tomato leaves using colonized agar plugs. 24 hours post inoculation; leaves were stained with 100 µM final concentration of MDC (Sigma) in PBS for 30 min. Fluorescence was visualized using an Olympus IX81 inverted fluorescence confocal microscope (Olympus systems, Germany), with an excitation wavelength of 335 nm and an emission wavelength of 508 nm. Images were collected using an Olympus DP 70 camera and processed with Olympus DP Controller software, version 2.2.1.227. Scale bar = 10 µm."}
{"words": ["Figure", "4Transmission", "Electron", "Microscopy", "(", "TEM", ")", "fungal", "inoculated", "tomato", "leaves", ".", "Representative", "TEM", "images", "from", "four", "independent", "experiments", ".", "(", "A", ",", "G", ")", ";", "Healthy", "non", "-", "inoculated", "leaf", "tissue", ".", "(", "B", "-", "F", ")", "Tomato", "leaves", "inoculated", "with", "the", "OA", "deficient", "A2", "strain", ".", "(", "H", ",", "I", ")", "Tomato", "leaves", "inoculated", "with", "wild", "type", "S", ".", "sclerotiorum", ".", "Arrows", ",", "autolysosomal", "/", "autophagosomal", "-", "like", "structures", ";", "C", ",", "chloroplast", ";", "V", ",", "vacuole", ";", "N", ",", "nucleus", ";", "Circle", ",", "active", "dismantlement", "of", "chloroplast", ";", "Rectangle", ",", "chromatin", "condensation", "within", "the", "nucleus", ".", "Black", "scale", "bars", " ", "=", " ", "2", "µm", ",", "white", "scale", "bars", " ", "=", " ", "1", "µm", ".", "Sections", "were", "examined", "with", "a", "Phillips", "Morgagni", "268", "transmission", "electron", "microscope", "at", "an", "accelerating", "voltage", "of", "80", "kV", ".", "Digital", "images", "were", "recorded", "with", "a", "MegaViewIII", "digital", "camera", "operated", "with", "iTEM", "software", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Transmission Electron Microscopy (TEM) fungal inoculated tomato leaves.Representative TEM images from four independent experiments. (A, G); Healthy non-inoculated leaf tissue. (B-F) Tomato leaves inoculated with the OA deficient A2 strain. (H,I) Tomato leaves inoculated with wild type S. sclerotiorum. Arrows, autolysosomal/autophagosomal-like structures; C, chloroplast; V, vacuole; N, nucleus; Circle, active dismantlement of chloroplast; Rectangle, chromatin condensation within the nucleus. Black scale bars = 2 µm, white scale bars = 1 µm. Sections were examined with a Phillips Morgagni 268 transmission electron microscope at an accelerating voltage of 80 kV. Digital images were recorded with a MegaViewIII digital camera operated with iTEM software."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ",", "B", ")", "Agar", "plugs", "containing", "actively", "growing", "cultures", "of", "the", "OA", "deficient", "A2", "mutant", "were", "inoculated", "onto", "leaves", "of", "Arabidopsis", "Col", "-", "0", "and", "select", "Arabidopsis", "autophagy", "mutant", "plants", ".", "These", "mutants", "showed", "enhanced", "susceptibility", "to", "the", "normally", "non", "-", "pathogenic", "A2", "strain", ".", "Lesion", "diameter", "was", "monitored", "over", "time", "and", "all", "images", "were", "recorded", "48", "hours", "post", "inoculation", ".", "(", "C", ")", "Tomato", "leaves", "were", "either", "pre", "-", "infiltrated", "with", "water", "(", "control", ")", "or", "autophagy", "inhibitors", "Wortmannin", ",", "LY294002", ",", "Chloroquine", "(", "CQ", ")", ",", "and", "3", "-", "methyladenine", "(", "3", "-", "MA", ")", ".", "Agar", "plugs", "containing", "actively", "growing", "A2", "were", "placed", "on", "the", "infiltrated", "leaves", "to", "initiate", "infection", ".", "(", "B", ")", "48", "hours", "post", "inoculation", ";", "Trypan", "blue", "was", "used", "to", "determine", "the", "extent", "of", "fungal", "colonization", "and", "cleared", "with", "acetic", "acid", "and", "ethanol", "(", "1", ":", "3", ",", "v", "/", "v", ")", ".", "Images", "were", "taken", "48", "hours", "post", "inoculation", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A,B) Agar plugs containing actively growing cultures of the OA deficient A2 mutant were inoculated onto leaves of Arabidopsis Col-0 and select Arabidopsis autophagy mutant plants. These mutants showed enhanced susceptibility to the normally non-pathogenic A2 strain. Lesion diameter was monitored over time and all images were recorded 48 hours post inoculation.(C) Tomato leaves were either pre-infiltrated with water (control) or autophagy inhibitors Wortmannin, LY294002, Chloroquine (CQ), and 3-methyladenine (3-MA). Agar plugs containing actively growing A2 were placed on the infiltrated leaves to initiate infection. (B) 48 hours post inoculation; Trypan blue was used to determine the extent of fungal colonization and cleared with acetic acid and ethanol (1: 3, v/v). Images were taken 48 hours post inoculation."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "NBT", "treated", "Arabidopsis", "(", "Col", "-", "0", "and", "two", "independent", "atg8a", "mutant", "lines", ")", "following", "agar", "plug", "inoculation", "with", "the", "A2", "mutant", ".", "Images", "were", "collected", "48", "hours", "post", "inoculation", ".", "Dotted", "lines", "represent", "the", "edge", "of", "the", "observable", "legion", ".", "(", "B", ")", "RT", "-", "PCR", "was", "used", "to", "evaluate", "the", "transcript", "levels", "of", "three", "catalases", "(", "CAT1", ",", "2", ",", "and", "3", ")", "and", "three", "superoxide", "dismutases", "in", "Col", "-", "0", "plants", "following", "inoculation", "with", "wild", "type", "S", ".", "sclerotiorum", "(", "black", "bars", ")", "and", "the", "A2", "mutant", "strain", "(", "grey", "bars", ")", ".", "*", ">", "2", "fold", "change", ",", "*", "*", ">", "5", "fold", "change", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) NBT treated Arabidopsis (Col-0 and two independent atg8a mutant lines) following agar plug inoculation with the A2 mutant. Images were collected 48 hours post inoculation. Dotted lines represent the edge of the observable legion.(B) RT-PCR was used to evaluate the transcript levels of three catalases (CAT1, 2, and 3) and three superoxide dismutases in Col-0 plants following inoculation with wild type S. sclerotiorum (black bars) and the A2 mutant strain (grey bars). *>2 fold change, **>5 fold change."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ",", "B", ")", "Representative", "images", "of", "the", "expression", "of", "NEDD4L", "in", "the", "skins", "from", "IMQ", "-", "treated", "mice", "(", "A", ")", "or", "psoriasis", "patients", "(", "B", ")", "as", "detected", "by", "IHC", "on", "the", "left", ".", "The", "NEDD4L", "expression", "level", "was", "calculated", "by", "multiplying", "the", "staining", "intensity", "score", "and", "the", "extent", "score", "and", "is", "shown", "on", "the", "right", ".", "(", "A", ",", "n", "=", "5", ",", "B", ",", "normal", ",", "n", "=", "15", ",", "psoriasis", ",", "n", "=", "36", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "shown", "as", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "and", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "Scale", "bar", ",", "200", "μm", "(", "100", "×", ")", "or", "50", "μm", "(", "400", "×", ")", ".", "Significant", "differences", "were", "tested", "using", "a", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", "*", "*", "P", "＜", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "＜", "0", ".", "001", ".", "NS", ",", "no", "significance", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "Representative", "images", "of", "the", "expression", "of", "EZH2", "in", "the", "skin", "epidermis", "from", "the", "IMQ", "-", "treated", "mice", "(", "C", ")", "and", "the", "psoriasis", "patients", "(", "D", ")", ".", "The", "number", "of", "EZH2", "-", "positive", "cells", "per", "HPF", "(", "high", "power", "field", ")", "in", "each", "mouse", "and", "patient", "is", "shown", "on", "the", "right", ".", "(", "C", ",", "control", ",", "n", "=", "3", ",", "IMQ", ",", "n", "=", "6", ".", "D", ",", "normal", ",", "n", "=", "13", ",", "psoriasis", ",", "n", "=", "27", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "shown", "as", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "and", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "Scale", "bar", ",", "200", "μm", "(", "100", "×", ")", "or", "50", "μm", "(", "400", "×", ")", ".", "Significant", "differences", "were", "tested", "using", "a", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", "*", "*", "P", "＜", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "＜", "0", ".", "001", ".", "NS", ",", "no", "significance", ".", "(", "E", ")", "WB", "analysis", "of", "NEDD4L", ",", "EZH2", "and", "EZH1", "expression", "in", "the", "EZH2", "-", "specific", "siRNA", "(", "siEZH2", ")", "-", "or", "negative", "control", "siRNA", "(", "siNC", ")", "-", "transfected", "NHEKs", "with", "IMQ", "stimulation", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "shown", "as", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "and", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "Scale", "bar", ",", "200", "μm", "(", "100", "×", ")", "or", "50", "μm", "(", "400", "×", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A, B) Representative images of the expression of NEDD4L in the skins from IMQ-treated mice (A) or psoriasis patients (B) as detected by IHC on the left. The NEDD4L expression level was calculated by multiplying the staining intensity score and the extent score and is shown on the right. (A, n=5, B, normal, n=15, psoriasis, n=36). Data information: Data are shown as the mean ± s.e.m., and are representative of three independent experiments Scale bar, 200 μm (100×) or 50 μm (400×). Significant differences were tested using a two-tailed Student's t test ** P＜0.01, *** P＜0.001. NS, no significance.(C, D) Representative images of the expression of EZH2 in the skin epidermis from the IMQ-treated mice (C) and the psoriasis patients (D). The number of EZH2-positive cells per HPF (high power field) in each mouse and patient is shown on the right. (C, control, n=3, IMQ, n=6. D, normal, n=13, psoriasis, n=27). Data information: Data are shown as the mean ± s.e.m., and are representative of three independent experiments Scale bar, 200 μm (100×) or 50 μm (400×). Significant differences were tested using a two-tailed Student's t test ** P＜0.01, *** P＜0.001. NS, no significance.(E) WB analysis of NEDD4L, EZH2 and EZH1 expression in the EZH2-specific siRNA (siEZH2)- or negative control siRNA (siNC)-transfected NHEKs with IMQ stimulation. Data information: Data are shown as the mean ± s.e.m., and are representative of three independent experiments Scale bar, 200 μm (100×) or 50 μm (400×)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "D", ")", "Representative", "images", "of", "HE", "staining", "of", "the", "back", "tissues", "are", "shown", "on", "the", "left", ".", "The", "epidermal", "thickness", "measured", "using", "the", "scale", "in", "the", "microscope", "is", "shown", "on", "the", "right", ".", "(", "E", ")", "Representative", "images", "of", "Ki67", "staining", "in", "back", "tissues", "are", "shown", "on", "the", "left", ".", "The", "number", "of", "Ki67", "-", "positive", "cells", "per", "HPF", "in", "each", "mouse", "is", "shown", "on", "the", "right", ".", "(", "F", ")", "Representative", "images", "of", "HE", "staining", "of", "the", "ear", "tissues", "are", "shown", "on", "the", "left", ".", "The", "epidermis", "thickness", "measured", "using", "the", "scale", "in", "the", "microscope", "is", "shown", "on", "the", "right", ".", "(", "G", ")", "Representative", "images", "of", "Ki67", "staining", "in", "ear", "tissues", "(", "same", "specimen", "as", "in", "F", ")", "are", "shown", "on", "the", "left", ".", "The", "number", "of", "Ki67", "positive", "cells", "per", "HPF", "in", "each", "mouse", "is", "shown", "on", "the", "right", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "shown", "as", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "and", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "For", "back", "tissues", ",", "scale", "bar", ",", "200", "μm", "(", "100", "×", ")", "or", "50", "μm", "(", "400", "×", ")", ".", "For", "ear", "tissues", ",", "scale", "bar", ",", "200", "μm", "(", "100", "×", ")", "or", "200", "μm", "(", "200", "×", ")", ".", "Significant", "differences", "were", "tested", "using", "a", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", "Control", ",", "n", "=", "3", ",", "IMQ", ",", "n", "=", "6", ".", "*", "*", "P", "＜", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "＜", "0", ".", "001", ".", "NS", ",", "no", "significance", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(D) Representative images of HE staining of the back tissues are shown on the left. The epidermal thickness measured using the scale in the microscope is shown on the right. (E) Representative images of Ki67 staining in back tissues are shown on the left. The number of Ki67-positive cells per HPF in each mouse is shown on the right. (F) Representative images of HE staining of the ear tissues are shown on the left. The epidermis thickness measured using the scale in the microscope is shown on the right. (G) Representative images of Ki67 staining in ear tissues (same specimen as in F) are shown on the left. The number of Ki67 positive cells per HPF in each mouse is shown on the right. Data information: Data are shown as the mean ± s.e.m., and are representative of three independent experiments. For back tissues, scale bar, 200 μm (100×) or 50 μm (400×). For ear tissues, scale bar, 200 μm (100×) or 200 μm (200×). Significant differences were tested using a two-tailed Student's t test Control, n=3, IMQ, n=6. ** P＜0.01, *** P＜0.001. NS, no significance."}
{"words": ["Figure", "3NEDD4L", "was", "knocked", "out", "by", "the", "CRISPR", "Cas9", "method", "in", "NHEKs", ".", "WT", "and", "NEDD4L", "KO", "NHEKs", "were", "infected", "with", "lentivirus", "overexpressing", "NEDD4L", "-", "WT", "or", "NEDD4L", "-", "C943S", "mutants", ".", "cell", "signaling", "pathway", "activation", "induced", "by", "IL", "-", "6", "were", "detected", "by", "WB", "analyses", "Data", "information", ":", "Data", "are", "shown", "as", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "and", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "G", ",", "H", ")", "Primary", "keratinocytes", "were", "separated", "from", "the", "WT", "and", "Nedd4l", "KO", "mice", ".", "(", "G", ")", "WB", "analysis", "of", "the", "protein", "expression", "in", "IL", "-", "6", "-", "induced", "cell", "signaling", "pathway", "activation", ".", "(", "H", ")", "WB", "analysis", "of", "the", "proteins", "in", "the", "IL", "-", "6", "signaling", "pathway", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "shown", "as", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "and", "are", "representative", "of", "three", "independent"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3NEDD4L was knocked out by the CRISPR Cas9 method in NHEKs. WT and NEDD4L KO NHEKs were infected with lentivirus overexpressing NEDD4L-WT or NEDD4L-C943S mutants. cell signaling pathway activation induced by IL-6 were detected by WB analyses Data information: Data are shown as the mean ± s.e.m., and are representative of three independent experiments(G, H) Primary keratinocytes were separated from the WT and Nedd4l KO mice. (G) WB analysis of the protein expression in IL-6-induced cell signaling pathway activation. (H) WB analysis of the proteins in the IL-6 signaling pathway. Data information: Data are shown as the mean ± s.e.m., and are representative of three independent experiments"}
{"words": ["Figure", "4Six", "-", "to", "eight", "-", "weeks", "old", "WT", "and", "Nedd4l", "cKO", "mice", "were", "treated", "with", "IMQ", "for", "6", "consecutive", "days", "and", "at", "the", "beginning", "of", "the", "treatment", ",", "the", "mice", "were", "injected", "intra", "-", "epidermally", "with", "10", "μg", "anti", "-", "GP130", "antibody", "or", "with", "same", "dosage", "of", "isotype", "on", "every", "other", "day", ".", "Representative", "images", "of", "Ki67", "staining", "in", "back", "tissues", "are", "on", "the", "left", ".", "The", "number", "of", "Ki67", "-", "positive", "cells", "per", "HPF", "is", "shown", "on", "the", "right", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "and", "are", "representative", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "Scale", "bar", ",", "200", "μm", "(", "100", "×", ")", "or", "50", "μm", "(", "400", "×", ")", ".", "Significant", "differences", "were", "tested", "using", "a", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", "C", ",", "control", ",", "n", "=", "5", ",", "IMQ", ",", "n", "=", "6", ".", "*", "P", "＜", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "＜", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "＜", "0", ".", "001", ".", "NS", ",", "no", "significance", ".", "Six", "-", "to", "eight", "-", "weeks", "old", "WT", "and", "Nedd4l", "cKO", "mice", "were", "treated", "with", "IMQ", "for", "6", "consecutive", "days", "and", "at", "the", "beginning", "of", "the", "treatment", ",", "the", "mice", "were", "injected", "intra", "-", "epidermally", "with", "10", "μg", "anti", "-", "GP130", "antibody", "or", "with", "same", "dosage", "of", "isotype", "on", "every", "other", "day", ".", "Keratinocyte", "proliferation", "associated", "genes", "in", "the", "skin", "tissues", "are", "detected", "using", "real", "-", "time", "PCR", "analysis", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "and", "are", "representative", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "Scale", "bar", ",", "200", "μm", "(", "100", "×", ")", "or", "50", "μm", "(", "400", "×", ")", ".", "Significant", "differences", "were", "tested", "using", "a", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", "D", ",", "control", ",", "n", "=", "3", ",", "IMQ", ",", "n", "=", "6", ".", "*", "P", "＜", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "＜", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "＜", "0", ".", "001", ".", "NS", ",", "no", "significance", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Six- to eight-weeks old WT and Nedd4l cKO mice were treated with IMQ for 6 consecutive days and at the beginning of the treatment, the mice were injected intra-epidermally with 10 μg anti-GP130 antibody or with same dosage of isotype on every other day. Representative images of Ki67 staining in back tissues are on the left. The number of Ki67-positive cells per HPF is shown on the right. Data information: Data are shown as mean ± s.e.m., and are representative of two independent experiments. Scale bar, 200 μm (100×) or 50 μm (400×). Significant differences were tested using a two-tailed Student's t test C, control, n=5, IMQ, n=6. * P＜0.05, ** P＜0.01, *** P＜0.001. NS, no significance.Six- to eight-weeks old WT and Nedd4l cKO mice were treated with IMQ for 6 consecutive days and at the beginning of the treatment, the mice were injected intra-epidermally with 10 μg anti-GP130 antibody or with same dosage of isotype on every other day. Keratinocyte proliferation associated genes in the skin tissues are detected using real-time PCR analysis. Data information: Data are shown as mean ± s.e.m., and are representative of two independent experiments. Scale bar, 200 μm (100×) or 50 μm (400×). Significant differences were tested using a two-tailed Student's t test D, control, n=3, IMQ, n=6. * P＜0.05, ** P＜0.01, *** P＜0.001. NS, no significance."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Representative", "pictures", "of", "the", "expression", "of", "NEDD4L", ",", "GP130", "and", "p", "-", "STAT3", "in", "the", "epidermis", "of", "a", "normal", "skin", "section", "(", "same", "specimen", ")", "and", "sections", "from", "psoriasis", "patients", ".", "Isotype", "are", "IgG", "antibodies", "from", "same", "species", "served", "as", "negative", "control", ".", "(", "B", ")", "Semiquantitative", "scoring", "of", "NEDD4L", ",", "GP130", "and", "p", "-", "STAT3", "in", "the", "epidermis", "detected", "by", "IHC", ".", "Data", "information", ":", "Each", "symbol", "represents", "one", "patient", "Scale", "bar", ",", "200", "μm", "(", "100", "×", ")", "or", "50", "μm", "(", "400", "×", ")", ".", "All", "data", "are", "shown", "as", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "and", "significant", "differences", "were", "analyzed", "using", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "test", "(", "normal", ",", "n", "=", "15", ",", "psoriasis", ",", "n", "=", "36", ")", ".", "*", "P", "＜", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "＜", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "＜", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Representative pictures of the expression of NEDD4L, GP130 and p-STAT3 in the epidermis of a normal skin section (same specimen) and sections from psoriasis patients. Isotype are IgG antibodies from same species served as negative control. (B) Semiquantitative scoring of NEDD4L, GP130 and p-STAT3 in the epidermis detected by IHC. Data information: Each symbol represents one patient Scale bar, 200 μm (100×) or 50 μm (400×). All data are shown as the mean ± s.e.m., and significant differences were analyzed using two-tailed Student's t test (normal, n=15, psoriasis, n=36). * P＜0.05, ** P＜0.01, *** P＜0.001."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "F", ")", "Full", "length", "Flag", "-", "GP130", ",", "GP130", "-", "aa", "616", "-", "918", ",", "GP130", "-", "aa", "616", "-", "889", ",", "GP130", "-", "aa", "616", "-", "764", ",", "GP130", "-", "aa", "616", "-", "734", "were", "transfected", "with", "Myc", "-", "NEDD4L", "into", "HEK293T", "cells", ",", "and", "whole", "cell", "lysates", "were", "co", "-", "IP", "with", "ANTI", "-", "FLAG", "M2", "magnetic", "beads", ",", "followed", "by", "WB", "with", "anti", "-", "Flag", "or", "anti", "-", "Myc", "antibodies", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(F) Full length Flag-GP130, GP130-aa 616-918, GP130-aa 616-889, GP130-aa 616-764, GP130-aa 616-734 were transfected with Myc-NEDD4L into HEK293T cells, and whole cell lysates were co-IP with ANTI-FLAG M2 magnetic beads, followed by WB with anti-Flag or anti-Myc antibodies."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "C", ")", "WT", "or", "NEDD4L", "KO", "NHEK", "cells", "was", "infected", "with", "lentivirus", "that", "overexpress", "NEDD4L", "-", "WT", ",", "NEDD4L", "WW", "domain", "truncated", "mutant", "(", "NEDD4L", "-", "ΔWW", ")", "or", "its", "enzymatic", "activity", "mutant", "(", "NEDD4L", "-", "C943S", ")", ",", "the", "cells", "were", "followed", "by", "denaturation", "-", "IP", "with", "anti", "-", "GP130", "antibody", "and", "WB", "analysis", "with", "anti", "-", "Ub", "antibodies", ".", "(", "E", ")", "WB", "analysis", "of", "the", "polyubiquitination", "of", "GP130", "in", "HEK293T", "cells", "co", "-", "transfected", "with", "full", "length", "Myc", "-", "NEDD4L", ",", "HA", "-", "Ub", "and", "Flag", "-", "GP130", "or", "its", "lysine", "mutants", "(", "K", "-", "R", ")", "in", "the", "intracellular", "domain", ",", "followed", "by", "denaturation", "-", "IP", "with", "ANTI", "-", "FLAG", "M2", "magnetic", "beads", "and", "WB", "analysis", "with", "anti", "-", "HA", "antibodies", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(C) WT or NEDD4L KO NHEK cells was infected with lentivirus that overexpress NEDD4L-WT, NEDD4L WW domain truncated mutant (NEDD4L-ΔWW) or its enzymatic activity mutant (NEDD4L-C943S), the cells were followed by denaturation-IP with anti-GP130 antibody and WB analysis with anti-Ub antibodies.(E) WB analysis of the polyubiquitination of GP130 in HEK293T cells co-transfected with full length Myc-NEDD4L, HA-Ub and Flag-GP130 or its lysine mutants (K-R) in the intracellular domain, followed by denaturation-IP with ANTI-FLAG M2 magnetic beads and WB analysis with anti-HA antibodies."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", "-", "D", ")", "The", "serial", "dilutions", "of", "post", "-", "second", "immunization", "serum", "samples", "were", "analyzed", "by", "ELISA", "using", "plates", "coated", "with", "purified", "RSV", "rA2", "-", "Line19F", "-", "FFL", "virions", ".", "The", "serum", "samples", "were", "serially", "diluted", ",", "and", "the", "detection", "of", "antibodies", "were", "measured", "by", "optical", "density", "(", "OD", ")", "at", "490", "nm", ".", "End", "-", "point", "titers", "of", "the", "serum", "samples", "were", "determined", "as", "the", "reciprocal", "of", "the", "highest", "dilution", "providing", "an", "absorbance", "twice", "that", "of", "the", "negative", "control", "(", "PBS", "immunized", "animal", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A-D) The serial dilutions of post-second immunization serum samples were analyzed by ELISA using plates coated with purified RSV rA2-Line19F-FFL virions. The serum samples were serially diluted, and the detection of antibodies were measured by optical density (OD) at 490 nm. End-point titers of the serum samples were determined as the reciprocal of the highest dilution providing an absorbance twice that of the negative control (PBS immunized animal)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Lung", "RSV", "titers", "(", "PFU", "/", "gram", "of", "lung", "tissue", ")", "were", "determined", "in", "individual", "lungs", "(", "n", "=", "5", "mice", "per", "group", ")", "collected", "at", "5", "days", "post", "-", "RSV", "infection", ".", "Results", "were", "determined", "and", "presented", "as", "box", "and", "whisker", "plots", ",", "where", "boxes", "extends", "from", "25th", "to", "75th", "percentile", ",", "whiskers", "show", "minimum", "to", "maximum", "value", "and", "central", "band", "represents", "the", "median", "value", "for", "the", "group", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Lung RSV titers (PFU/gram of lung tissue) were determined in individual lungs (n = 5 mice per group) collected at 5 days post-RSV infection. Results were determined and presented as box and whisker plots, where boxes extends from 25th to 75th percentile, whiskers show minimum to maximum value and central band represents the median value for the group."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Serum", "samples", "collected", "from", "individual", "mouse", "(", "M", "1", "-", "5", ")", "immunized", "with", "F", "110", "-", "136", "peptide", "were", "tested", "for", "antibody", "binding", "against", "F", "-", "p27", "(", "110", "-", "136", ")", "peptide", "or", "F", "1", "-", "34", "peptide", "(", "control", ")", "in", "ELISA", ".", "(", "B", ")", "A549", "cells", "were", "infected", "with", "RSV", "(", "MOI", " ", "=", " ", "0", ".", "1", ")", "for", "16", " ", "h", ",", "and", "fixed", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "mock", "control", "rabbit", "sera", "(", "left", "panels", ")", ",", "or", "rabbit", "anti", "-", "sera", "against", "F", "(", "center", "panels", ")", ",", "or", "against", "F", "-", "p27", "(", "110", "-", "136", ")", "peptide", "(", "right", "panels", ")", ",", "followed", "by", "Alexa", "594", "conjugated", "anti", "-", "Rabbit", "IgG", "(", "red", ")", ".", "Nuclei", "are", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "10", "µm", ".", "The", "number", "of", "cells", "positive", "for", "RSV", "-", "F", "(", "middle", "panel", ")", "and", "RSV", "-", "p27", "(", "right", "panel", ")", "upon", "counting", "of", "200", "cells", "were", "used", "to", "calculate", "percentage", "of", "cells", "stained", "for", "each", "antibody", "staining", "are", "shown", "in", "the", "'", "merge", "'", "panel", ".", "The", "experiments", "were", "performed", "twice", "and", "variation", "between", "the", "two", "independent", "expeiremnts", "was", "<", "6", "%", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Serum samples collected from individual mouse (M 1-5) immunized with F 110-136 peptide were tested for antibody binding against F-p27 (110-136) peptide or F 1-34 peptide (control) in ELISA.(B) A549 cells were infected with RSV (MOI = 0.1) for 16 h, and fixed. Cells were treated with mock control rabbit sera (left panels), or rabbit anti-sera against F (center panels), or against F-p27 (110-136) peptide (right panels), followed by Alexa 594 conjugated anti-Rabbit IgG (red). Nuclei are stained with DAPI (blue). Scale bar = 10 µm. The number of cells positive for RSV-F (middle panel) and RSV-p27 (right panel) upon counting of 200 cells were used to calculate percentage of cells stained for each antibody staining are shown in the 'merge' panel. The experiments were performed twice and variation between the two independent expeiremnts was <6%."}
{"words": ["Figure", "5Mice", "lungs", "were", "collected", "from", "PBS", "-", "(", "mock", ")", "vaccinated", "BALB", "/", "c", "mice", "at", "day", "5", "post", "-", "RSV", "infection", ",", "fixed", ",", "paraffin", "embedded", ",", "and", "slides", "were", "processed", "for", "imaging", ".", "Immunohistochemistry", "staining", "of", "lung", "sections", "shows", "RSV", "protein", "localized", "to", "distal", "alveoli", "by", "Control", "rabbit", "sera", "(", "left", "panels", ")", "or", "rabbit", "anti", "-", "sera", "against", "RSV", "F", "protein", "(", "center", "panels", ")", ",", "or", "against", "RSV", "F", "-", "p27", "(", "110", "-", "136", ")", "peptide", "(", "right", "panels", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "100", "µm", ".", "The", "percentage", "of", "cells", "positive", "for", "RSV", "-", "F", "(", "middle", "panel", ")", "and", "RSV", "-", "p27", "(", "right", "panel", ")", "covering", "500", "x", "500", "µm", "of", "lung", "tissue", "for", "each", "mice", "for", "each", "antibody", "staining", "are", "shown", ".", "The", "experiments", "were", "performed", "twice", "and", "variation", "between", "the", "two", "independent", "expeiremnts", "was", "<", "9", "%", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Mice lungs were collected from PBS-(mock) vaccinated BALB/c mice at day 5 post-RSV infection, fixed, paraffin embedded, and slides were processed for imaging. Immunohistochemistry staining of lung sections shows RSV protein localized to distal alveoli by Control rabbit sera (left panels) or rabbit anti-sera against RSV F protein (center panels), or against RSV F-p27 (110-136) peptide (right panels). Scale bar = 100 µm. The percentage of cells positive for RSV-F (middle panel) and RSV-p27 (right panel) covering 500 x 500 µm of lung tissue for each mice for each antibody staining are shown. The experiments were performed twice and variation between the two independent expeiremnts was <9%."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Lung", "tissues", "from", "individual", "mice", "(", "n", "=", "5", ")", "at", "day", "5", "post", "-", "RSV", "challenge", "(", "or", "uninfected", "control", ")", "were", "used", "to", "evaluate", "CD4", "/", "CD8", "T", "cells", "separately", "for", "airway", "and", "distal", "lungs", ".", "Lung", "slides", "were", "fixed", "and", "stained", "with", "DAPI", "to", "visualize", "nuclei", "(", "blue", ")", "and", "either", "anti", "-", "CD4", "(", "green", ")", "or", "anti", "-", "CD8", "(", "red", ")", "T", "cells", ".", "The", "number", "of", "CD4", "/", "CD8", "T", "cells", "were", "determined", "in", "each", "lung", "airway", "and", "distal", "region", ".", "Individual", "CD4", "+", "/", "CD8", "+", "T", "cells", "data", "are", "presented", "as", "number", "of", "positive", "cells", "per", "174", "x", "174", "µm", "of", "lung", "tissue", "for", "each", "mice", ".", "Results", "are", "presented", "as", "box", "and", "whisker", "plots", ",", "where", "boxes", "extends", "from", "25th", "to", "75th", "percentile", ",", "whiskers", "show", "minimum", "to", "maximum", "value", "and", "central", "band", "represents", "the", "median", "value", "for", "the", "group", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Lung tissues from individual mice (n=5) at day 5 post-RSV challenge (or uninfected control) were used to evaluate CD4/CD8 T cells separately for airway and distal lungs. Lung slides were fixed and stained with DAPI to visualize nuclei (blue) and either anti-CD4 (green) or anti-CD8 (red) T cells. The number of CD4/CD8 T cells were determined in each lung airway and distal region. Individual CD4+/CD8+ T cells data are presented as number of positive cells per 174 x 174 µm of lung tissue for each mice. Results are presented as box and whisker plots, where boxes extends from 25th to 75th percentile, whiskers show minimum to maximum value and central band represents the median value for the group."}
{"words": ["Figure", "1B", "Phospholipid", "transport", "/", "synthesis", ",", "as", "measured", "by", "3H", "-", "serine", "incorporation", ",", "in", "human", "fibroblasts", "(", "mean", "±", "SE", ";", "n", "=", "9", ",", "with", "5", "replicates", "/", "experiment", ")", "and", "in", "primary", "mouse", "hippocampal", "neurons", "(", "mean", "±", "SE", ";", "n", "=", "3", ",", "with", "4", "or", "5", "replicates", "/", "experiment", ")", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "vs", "E3", ".", "C", "Comparison", "of", "3H", "-", "serine", "incorporation", "in", "ApoE", "ACM", "-", "treated", "WT", "-", "and", "Mfn2", "-", "KO", "MEFs", "(", "mean", "±", "SE", ";", "n", "=", "3", ",", "with", "3", "replicates", "/", "experiment", ")", ".", "D", "Duramycin", "sensitivity", "in", "ApoE", "ACM", "-", "treated", "fibroblasts", ".", "Note", "increased", "sensitivity", "after", "20", "min", "to", "5", "μM", "duramycin", "in", "ApoE4", "-", "treated", "cells", ",", "which", "was", "blocked", "upon", "the", "addition", "of", "15", "μM", "exogenous", "PtdEtn", "(", "mean", "±", "SD", ";", "n", "=", "3", ",", "with", "3", "replicates", "/", "experiment", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B Phospholipid transport/synthesis, as measured by 3H-serine incorporation, in human fibroblasts (mean±SE; n=9, with 5 replicates/experiment) and in primary mouse hippocampal neurons (mean±SE; n=3, with 4 or 5 replicates/experiment). *, p<0.05 vs E3.C Comparison of 3H-serine incorporation in ApoE ACM-treated WT- and Mfn2-KO MEFs (mean±SE; n=3, with 3 replicates/experiment).D Duramycin sensitivity in ApoE ACM-treated fibroblasts. Note increased sensitivity after 20 min to 5 μM duramycin in ApoE4-treated cells, which was blocked upon the addition of 15 μM exogenous PtdEtn (mean±SD; n=3, with 3 replicates/experiment)."}
{"words": ["Figure", "2B", "Fractions", "from", "the", "discontinuous", "gradient", "were", "blotted", "with", "anti", "-", "ApoE", "(", "WUE", "-", "4", ")", "antibody", ";", "the", "doublet", "is", "a", "characteristic", "feature", "on", "ApoE", "western", "blots", "due", "to", "ApoE", "sialylation", "[", "16", "]", ".", "C", "An", "ApoE", "-", "containing", "fraction", "(", "fraction", "5", "[", "+", "]", ")", ",", "an", "ApoE", "-", "negative", "fraction", "(", "fraction", "3", "[", "-", "]", ")", ",", "and", "recombinant", "lipid", "-", "free", "ApoE", "protein", "were", "applied", "to", "human", "fibroblasts", ".", "Note", "increase", "in", "phospholipid", "synthesis", "using", "an", "ApoE4", "-", "containing", "lipoprotein", "fraction", ",", "but", "not", "with", "either", "an", "ApoE4", "-", "negative", "fraction", "or", "with", "lipoprotein", "-", "free", "recombinant", "ApoE3", "or", "ApoE4", "protein", "(", "mean", "±", "SE", ";", "n", "=", "3", ",", "with", "3", "replicates", "/", "experiment", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B Fractions from the discontinuous gradient were blotted with anti-ApoE (WUE-4) antibody; the doublet is a characteristic feature on ApoE western blots due to ApoE sialylation [16].C An ApoE-containing fraction (fraction 5 [+]), an ApoE-negative fraction (fraction 3 [-]), and recombinant lipid-free ApoE protein were applied to human fibroblasts. Note increase in phospholipid synthesis using an ApoE4-containing lipoprotein fraction, but not with either an ApoE4-negative fraction or with lipoprotein-free recombinant ApoE3 or ApoE4 protein (mean ± SE; n=3, with 3 replicates/experiment)."}
{"words": ["Figure", "3A", "Cholesteryl", "ester", "synthesis", ",", "as", "measured", "by", "3H", "-", "oleate", "incorporation", ".", "Note", "increased", "CE", "in", "ApoE4", "-", "treated", "cells", ",", "whereas", "there", "was", "essentially", "no", "difference", "in", "triglyceride", "(", "TAG", ")", "production", "(", "mean", "±", "SE", ";", "n", "=", "3", ".", "with", "3", "replicates", "/", "experiment", ")", ".", "†", ",", "p", "=", "0", ".", "06", "vs", "E3", ".", "B", "Comparison", "of", "3H", "-", "oleate", "incorporation", "in", "ApoE", "ACM", "-", "treated", "WT", "-", "and", "Mfn2", "-", "KO", "MEFs", "(", "mean", "±", "SE", ";", "n", "=", "3", ",", "with", "5", "replicates", "/", "experiment", ")", ".", "C", "ApoE", "ACM", "-", "treated", "fibroblasts", "were", "stained", "with", "LipidTox", "green", "neutral", "lipid", "stain", ",", "and", "lipid", "droplets", "were", "visualized", "(", "example", "at", "left", ")", "and", "counted", "(", "right", ")", ".", "Note", "significantly", "more", "lipid", "droplets", "in", "ApoE4", "-", "treated", "cells", "(", "mean", "±", "SD", ",", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Cholesteryl ester synthesis, as measured by 3H-oleate incorporation. Note increased CE in ApoE4-treated cells, whereas there was essentially no difference in triglyceride (TAG) production (mean±SE; n=3. with 3 replicates/experiment). †, p=0.06 vs E3.B Comparison of 3H-oleate incorporation in ApoE ACM-treated WT- and Mfn2-KO MEFs (mean±SE; n=3, with 5 replicates/experiment).C ApoE ACM-treated fibroblasts were stained with LipidTox green neutral lipid stain, and lipid droplets were visualized (example at left) and counted (right). Note significantly more lipid droplets in ApoE4-treated cells (mean ± SD, n=3)."}
{"words": ["Figure", "4HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "plasmids", "to", "visualize", "ER", "(", "in", "green", ")", "and", "mitochondria", "(", "in", "red", ")", ",", "and", "then", "were", "treated", "with", "ApoE3", "-", "and", "ApoE4", "-", "ACM", "for", "24", "hours", ".", "Shown", "is", "a", "box", "-", "and", "-", "whisker", "plot", "comparing", "co", "-", "localization", "in", "ApoE3", "ACM", "(", "n", "=", "15", "images", "analyzed", "[", "gray", "circles", ",", "average", "of", "co", "-", "localization", "in", "~", "5", "cells", "in", "each", "image", "field", "]", ")", "compared", "to", "that", "in", "ApoE4", "ACM", "(", "n", "=", "18", "images", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4HeLa cells were transfected with plasmids to visualize ER (in green) and mitochondria (in red), and then were treated with ApoE3- and ApoE4-ACM for 24 hours. Shown is a box-and-whisker plot comparing co-localization in ApoE3 ACM (n = 15 images analyzed [gray circles, average of co-localization in ~5 cells in each image field]) compared to that in ApoE4 ACM (n = 18 images)."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "293T", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "CMV", "-", "renilla", ",", "8X", "-", "TBS", "(", "eight", "repeats", "of", "the", "TEAD", "-", "binding", "-", "sequence", ")", "luciferase", "reporter", ",", "Flag", "-", "YAP", ",", "HA", "-", "TEAD2", "and", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "or", "catalytically", "inactive", "(", "CS", ")", "USP9X", "-", "V5", ".", "One", "day", "after", "transfection", ",", "luciferase", "activity", "was", "measured", "and", "normalized", "with", "respect", "to", "renilla", "activity", ".", "The", "value", "for", "Flag", "-", "YAP", "/", "HA", "-", "TEAD", "-", "transfected", "cells", "(", "2nd", "column", ")", "was", "adjusted", "to", "1", ".", "Shown", "below", "is", "a", "representative", "Western", "blot", "showing", "that", "the", "expression", "levels", "were", "comparable", "between", "samples", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Error", "bars", "indicate", "the", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "paired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "B", ".", "293T", "cells", "were", "transfected", "with", "control", "or", "USP9X", "-", "targeting", "siRNAs", ".", "One", "day", "after", "siRNA", "transfection", ",", "the", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "CMV", "-", "renilla", ",", "8X", "-", "TBS", "luciferase", ",", "Flag", "-", "YAP", "and", "HA", "-", "TEAD2", ".", "Reporter", "activity", "was", "quantified", "as", "described", "in", "(", "A", ")", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Error", "bars", "indicate", "the", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "paired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "C", ".", "RPE", "or", "MCF10A", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "siRNAs", "for", "24", "hours", "and", "then", "re", "-", "seeded", "to", "either", "sparse", "or", "dense", "culture", "conditions", ".", "At", "48", "hours", "after", "siRNA", "transfection", ",", "the", "cells", "were", "harvested", "and", "cell", "extracts", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "for", "the", "indicated", "proteins", ".", "L", ".", "E", ".", ",", "long", "exposure", ",", "S", ".", "E", ".", ",", "short", "exposure", ".", "D", ".", "Cells", "were", "treated", "as", "described", "in", "(", "C", ")", ",", "the", "indicated", "mRNAs", "were", "analyzed", "with", "RT", "-", "qPCR", ",", "and", "the", "results", "were", "normalized", "with", "respect", "to", "the", "β", "-", "actin", "mRNA", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Error", "bars", "indicate", "the", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "paired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "E", ".", "RPE", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "siRNAs", "for", "24", "hours", ",", "and", "then", "co", "-", "transfected", "with", "CMV", "-", "renilla", "and", "8X", "-", "TBS", "luciferase", ".", "One", "day", "after", "the", "latter", "transfection", ",", "the", "cells", "were", "re", "-", "seeded", "to", "either", "sparse", "or", "dense", "conditions", ",", "and", "reporter", "activity", "was", "measured", "at", "24", "hours", "after", "re", "-", "seeding", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Error", "bars", "indicate", "the", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "paired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. 293T cells were co-transfected with CMV-renilla, 8X-TBS (eight repeats of the TEAD-binding-sequence) luciferase reporter, Flag-YAP, HA-TEAD2 and wild-type (WT) or catalytically inactive (CS) USP9X-V5. One day after transfection, luciferase activity was measured and normalized with respect to renilla activity. The value for Flag-YAP/HA-TEAD-transfected cells (2nd column) was adjusted to 1. Shown below is a representative Western blot showing that the expression levels were comparable between samples (n=4). Error bars indicate the S.E.M. (*p< 0.05, **p < 0.01; paired Student's t-test).B. 293T cells were transfected with control or USP9X-targeting siRNAs. One day after siRNA transfection, the cells were co-transfected with CMV-renilla, 8X-TBS luciferase, Flag-YAP and HA-TEAD2. Reporter activity was quantified as described in (A) (n=4). Error bars indicate the S.E.M. (***p < 0.001; paired Student's t-test).C. RPE or MCF10A cells were transfected with the indicated siRNAs for 24 hours and then re-seeded to either sparse or dense culture conditions. At 48 hours after siRNA transfection, the cells were harvested and cell extracts were analyzed by Western blotting for the indicated proteins. L.E., long exposure, S.E., short exposure.D. Cells were treated as described in (C), the indicated mRNAs were analyzed with RT-qPCR, and the results were normalized with respect to the β-actin mRNA (n=4). Error bars indicate the S.E.M. (*p< 0.05, **p < 0.01; paired Student's t-test).E. RPE cells were transfected with the indicated siRNAs for 24 hours, and then co-transfected with CMV-renilla and 8X-TBS luciferase. One day after the latter transfection, the cells were re-seeded to either sparse or dense conditions, and reporter activity was measured at 24 hours after re-seeding (n=3). Error bars indicate the S.E.M. (**p < 0.01; paired Student's t-test)."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Representative", "anti", "-", "YAP", "immunofluorescence", "images", "of", "sparsely", "cultured", "RPE", "cells", "transfected", "with", "the", "indicated", "siRNAs", ".", "Green", ",", "YAP", ".", "Blue", ",", "DAPI", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "B", ".", "The", "nuclear", "YAP", "intensities", "of", "the", "cells", "shown", "in", "(", "A", ")", "were", "quantified", "using", "the", "Image", "J", "software", ".", "At", "least", "70", "cells", "from", "five", "or", "six", "random", "fields", "were", "analyzed", ".", "Quantified", "values", "were", "normalized", "by", "adjusting", "the", "average", "of", "\"", "siControl", "Dense", "cells", "\"", "to", "1", ".", "We", "performed", "two", "independent", "experiments", "and", "obtained", "similar", "results", ".", "Data", "from", "one", "representative", "experiment", "are", "presented", ".", "The", "red", "bar", "indicates", "the", "average", "value", ".", "S", ",", "Sparse", ".", "D", ",", "Dense", "(", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "paired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "C", ".", "Sparsely", "cultured", "RPE", "or", "MCF10A", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "siRNAs", ",", "fractionated", "into", "cytosolic", "and", "nuclear", "extracts", ",", "and", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "for", "the", "indicated", "proteins", ".", "D", ".", "Representative", "anti", "-", "YAP", "immunofluorescence", "images", "of", "densely", "cultured", "RPE", "cells", "transfected", "with", "the", "indicated", "plasmids", ".", "Green", ",", "GFP", "or", "V5", ".", "Red", ",", "YAP", ".", "Blue", ",", "DAPI", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "E", ".", "The", "nuclear", "YAP", "intensities", "of", "transfected", "cells", "in", "(", "D", ")", "were", "quantified", "using", "the", "Image", "J", "software", ".", "At", "least", "70", "cells", "from", "five", "to", "six", "random", "fields", "were", "analyzed", ".", "Quantified", "values", "were", "normalized", "by", "adjusting", "the", "average", "of", "\"", "EGFP", "transfected", "cells", "\"", "to", "1", ".", "Similar", "results", "were", "obtained", "from", "two", "independent", "experiments", ".", "Data", "from", "one", "representative", "experiment", "are", "presented", ".", "The", "red", "bar", "indicates", "the", "average", "value", ".", "(", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "paired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "F", ".", "Densely", "cultured", "stable", "RPE", "clones", "integrated", "with", "empty", "vector", "(", "Vec", ")", ",", "USP9X", "-", "V5", "WT", "or", "CS", "mutant", "were", "fractionated", "into", "cytosolic", "and", "nuclear", "extracts", ",", "and", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "for", "the", "indicated", "proteins", ".", "G", ".", "Densely", "cultured", "RPE", "cells", "transduced", "with", "CRISPR", "-", "SAM", "targeting", "USP9X", "were", "fractionated", "into", "cytosolic", "and", "nuclear", "extracts", ",", "and", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "for", "the", "indicated", "proteins", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Representative anti-YAP immunofluorescence images of sparsely cultured RPE cells transfected with the indicated siRNAs. Green, YAP. Blue, DAPI. Scale bar, 10 μm.B. The nuclear YAP intensities of the cells shown in (A) were quantified using the Image J software. At least 70 cells from five or six random fields were analyzed. Quantified values were normalized by adjusting the average of \"siControl Dense cells\" to 1. We performed two independent experiments and obtained similar results. Data from one representative experiment are presented. The red bar indicates the average value. S, Sparse. D, Dense (***p < 0.001; paired Student's t-test).C. Sparsely cultured RPE or MCF10A cells were transfected with the indicated siRNAs, fractionated into cytosolic and nuclear extracts, and analyzed by Western blotting for the indicated proteins.D. Representative anti-YAP immunofluorescence images of densely cultured RPE cells transfected with the indicated plasmids. Green, GFP or V5. Red, YAP. Blue, DAPI. Scale bar, 10 μm.E. The nuclear YAP intensities of transfected cells in (D) were quantified using the Image J software. At least 70 cells from five to six random fields were analyzed. Quantified values were normalized by adjusting the average of \"EGFP transfected cells\" to 1. Similar results were obtained from two independent experiments. Data from one representative experiment are presented. The red bar indicates the average value. (***p < 0.001; paired Student's t-test).F. Densely cultured stable RPE clones integrated with empty vector (Vec), USP9X-V5 WT or CS mutant were fractionated into cytosolic and nuclear extracts, and analyzed by Western blotting for the indicated proteins.G. Densely cultured RPE cells transduced with CRISPR-SAM targeting USP9X were fractionated into cytosolic and nuclear extracts, and analyzed by Western blotting for the indicated proteins."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "RPE", "cells", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "for", "the", "indicated", "proteins", ".", "B", ".", "Indicated", "stable", "RPE", "clones", "in", "densely", "cultured", "conditions", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "for", "the", "indicated", "proteins", ".", "C", ".", "Densely", "cultured", "RPE", "cells", "transduced", "with", "CRISPR", "-", "SAM", "targeting", "USP9X", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "for", "the", "indicated", "proteins", ".", "D", ".", "RPE", "or", "MCF10A", "cells", "expressing", "the", "control", "or", "USP9X", "shRNA", "were", "transfected", "with", "the", "LATS1", "/", "2", "siRNA", "as", "indicated", ".", "Cells", "were", "re", "-", "seeded", "to", "low", "density", "and", "harvested", "after", "one", "day", ".", "E", ".", "RPE", "cells", "transduced", "with", "Flag", "-", "YAP", "WT", "or", "Flag", "-", "YAP", "5SA", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "siRNAs", ".", "Cells", "were", "re", "-", "seeded", "to", "low", "density", "and", "harvested", "after", "one", "day", ".", "F", ".", "RT", "-", "qPCR", "of", "CTGF", "mRNAs", "in", "the", "cells", "described", "in", "(", "E", ")", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Error", "bars", "indicate", "the", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "paired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. RPE cells were analyzed by Western blotting for the indicated proteins.B. Indicated stable RPE clones in densely cultured conditions were analyzed by Western blotting for the indicated proteins.C. Densely cultured RPE cells transduced with CRISPR-SAM targeting USP9X were analyzed by Western blotting for the indicated proteins.D. RPE or MCF10A cells expressing the control or USP9X shRNA were transfected with the LATS1/2 siRNA as indicated. Cells were re-seeded to low density and harvested after one day.E. RPE cells transduced with Flag-YAP WT or Flag-YAP 5SA were transfected with the indicated siRNAs. Cells were re-seeded to low density and harvested after one day.F. RT-qPCR of CTGF mRNAs in the cells described in (E) (n=3). Error bars indicate the S.E.M. (*p< 0.05, paired Student's t-test)."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "RPE", "or", "MCF10A", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "combinations", "of", "siRNAs", "and", "re", "-", "seeded", "to", "low", "density", ",", "and", "cell", "extracts", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "for", "the", "indicated", "proteins", ".", "B", ".", "The", "cells", "described", "in", "(", "A", ")", "were", "analyzed", "by", "RT", "-", "qPCR", "for", "the", "indicated", "target", "genes", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Error", "bars", "indicate", "the", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "paired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "C", ".", "Sparsely", "cultured", "RPE", "cells", "transfected", "with", "the", "indicated", "siRNAs", "were", "immunoprecipitated", "with", "an", "anti", "-", "AMOTL2", "antibody", "and", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "for", "the", "indicated", "proteins", ".", "WCL", ",", "whole", "cell", "lysates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. RPE or MCF10A cells were transfected with the indicated combinations of siRNAs and re-seeded to low density, and cell extracts were analyzed by Western blotting for the indicated proteins.B. The cells described in (A) were analyzed by RT-qPCR for the indicated target genes (n=4). Error bars indicate the S.E.M. (*p< 0.05, **p < 0.01; paired Student's t-test).C. Sparsely cultured RPE cells transfected with the indicated siRNAs were immunoprecipitated with an anti-AMOTL2 antibody and analyzed by Western blotting for the indicated proteins. WCL, whole cell lysates."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "293T", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "siRNAs", ",", "cultured", "for", "24", "hours", ",", "and", "then", "transfected", "with", "the", "indicated", "DNAs", ".", "48", "hours", "after", "siRNA", "transfection", ",", "the", "cells", "were", "harvested", "and", "ubiquitination", "of", "Flag", "-", "AMOTL2", "was", "examined", ".", "C", ",", "control", "siRNA", ".", "B", ".", "293T", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "combinations", "of", "DNAs", ",", "cultured", "for", "24", "hours", ",", "and", "subjected", "to", "in", "vivo", "ubiquitination", "assays", ".", "C", ".", "RPE", "cells", "transduced", "with", "vector", "(", "control", ")", "or", "Flag", "-", "AMOTL2", "were", "seeded", "under", "sparse", "(", "S", ")", "or", "dense", "(", "D", ")", "conditions", ",", "and", "an", "in", "vivo", "ubiquitination", "assay", "was", "performed", ".", "D", ".", "RPE", "cells", "transduced", "with", "Flag", "-", "AMOTL2", "were", "transfected", "with", "a", "1", ":", "1", "mixture", "of", "the", "two", "USP9X", "siRNAs", ".", "One", "day", "after", "siRNA", "transfection", ",", "the", "cells", "were", "re", "-", "seeded", "to", "the", "sparse", "condition", "and", "an", "in", "vivo", "ubiquitination", "assay", "was", "performed", "after", "one", "day", ".", "E", ".", "293T", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "combinations", "of", "DNAs", ",", "and", "a", "co", "-", "immunoprecipitation", "assay", "was", "performed", ".", "F", ".", "Sparsely", "cultured", "RPE", "or", "MCF10A", "cells", "were", "immunoprecipitated", "with", "an", "anti", "-", "AMOTL2", "antibody", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. 293T cells were transfected with the indicated siRNAs, cultured for 24 hours, and then transfected with the indicated DNAs. 48 hours after siRNA transfection, the cells were harvested and ubiquitination of Flag-AMOTL2 was examined. C, control siRNA.B. 293T cells were transfected with the indicated combinations of DNAs, cultured for 24 hours, and subjected to in vivo ubiquitination assays.C. RPE cells transduced with vector (control) or Flag-AMOTL2 were seeded under sparse (S) or dense (D) conditions, and an in vivo ubiquitination assay was performed.D. RPE cells transduced with Flag-AMOTL2 were transfected with a 1:1 mixture of the two USP9X siRNAs. One day after siRNA transfection, the cells were re-seeded to the sparse condition and an in vivo ubiquitination assay was performed after one day.E. 293T cells were transfected with the indicated combinations of DNAs, and a co-immunoprecipitation assay was performed.F. Sparsely cultured RPE or MCF10A cells were immunoprecipitated with an anti-AMOTL2 antibody."}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "Flag", "-", "AMOTL2", "constructs", "were", "designed", "to", "express", "regions", "spanning", "from", "the", "N", "-", "terminus", "to", "the", "coiled", "-", "coil", "domain", "(", "AA", "1", "-", "306", ")", ",", "the", "coiled", "-", "coil", "domain", "(", "AA", "307", "-", "581", ")", ",", "and", "the", "C", "-", "terminal", "portion", "(", "AA", "582", "-", "781", ")", ".", "These", "constructs", "were", "co", "-", "transfected", "into", "293T", "cells", "with", "Myc", "-", "Ub", ",", "and", "an", "in", "vivo", "ubiquitination", "assay", "was", "conducted", ".", "*", ",", "non", "-", "specific", "band", ".", "B", ".", "The", "SBP", "-", "AMOTL2", "coiled", "-", "coil", "domain", "was", "expressed", "in", "293T", "cells", ",", "subjected", "to", "tandem", "affinity", "purification", ",", "fractionated", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "stained", "with", "Coomassie", "blue", ".", "Bands", "corresponding", "to", "the", "AMOTL2", "coiled", "-", "coil", "domain", "were", "excised", "and", "analyzed", "by", "mass", "spectrometry", "for", "identification", "of", "ubiquitinated", "sites", "(", "K", "-", "G", "-", "G", "linkages", ")", ".", "Shown", "are", "MS", "/", "MS", "spectra", "recoded", "using", "an", "LTQ", "-", "Orbitrap", "mass", "spectrometer", "for", "the", "doubly", "charged", "peptide", ",", "IEK", "*", "LESEIQR", "(", "MH", "+", "=", "1358", ".", "72", ",", "z", "=", "2", "+", ";", "upper", ")", ",", "and", "the", "triply", "charged", "peptide", ",", "LASK", "*", "TQEAQAGSQDMVAK", "(", "MH", "+", "=", "1992", ".", "96", ",", "z", "=", "3", "+", ";", "lower", ")", ".", "These", "peptides", "contain", "the", "K347", "and", "K408", "ubiquitination", "sites", ",", "respectively", "(", "marked", "by", "asterisks", ")", ".", "Fragmented", "ions", "are", "annotated", "according", "to", "the", "nomenclature", "for", "peptide", "fragmentation", "in", "mass", "spectrometry", ".", "C", ".", "The", "indicated", "Flag", "-", "AMOTL2", "WT", "or", "mutant", "proteins", "were", "subjected", "to", "an", "in", "vivo", "ubiquitination", "assay", "in", "293T", "cells", ".", "D", ".", "RPE", "or", "MCF10A", "cells", "were", "transduced", "with", "Flag", "-", "AMOTL2", "WT", "or", "Flag", "-", "AMOTL2", "K347", "/", "408R", ",", "and", "immunoprecipitated", "with", "an", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "Immunoprecipitated", "and", "WCL", "samples", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "for", "the", "indicated", "proteins", ".", "E", ".", "RPE", "or", "MCF10A", "cells", "were", "transduced", "with", "Flag", "-", "AMOTL2", "WT", "or", "Flag", "-", "AMOTL2", "Y213A", ",", "and", "processed", "as", "(", "D", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A. Flag-AMOTL2 constructs were designed to express regions spanning from the N-terminus to the coiled-coil domain (AA 1-306), the coiled-coil domain (AA 307-581), and the C-terminal portion (AA 582-781). These constructs were co-transfected into 293T cells with Myc-Ub, and an in vivo ubiquitination assay was conducted. *, non-specific band.B. The SBP-AMOTL2 coiled-coil domain was expressed in 293T cells, subjected to tandem affinity purification, fractionated by SDS-PAGE and stained with Coomassie blue. Bands corresponding to the AMOTL2 coiled-coil domain were excised and analyzed by mass spectrometry for identification of ubiquitinated sites (K-G-G linkages). Shown are MS/MS spectra recoded using an LTQ-Orbitrap mass spectrometer for the doubly charged peptide, IEK*LESEIQR (MH+ = 1358.72, z = 2+; upper), and the triply charged peptide, LASK*TQEAQAGSQDMVAK (MH+ = 1992.96, z = 3+; lower). These peptides contain the K347 and K408 ubiquitination sites, respectively (marked by asterisks). Fragmented ions are annotated according to the nomenclature for peptide fragmentation in mass spectrometry.C. The indicated Flag-AMOTL2 WT or mutant proteins were subjected to an in vivo ubiquitination assay in 293T cells.D. RPE or MCF10A cells were transduced with Flag-AMOTL2 WT or Flag-AMOTL2 K347/408R, and immunoprecipitated with an anti-Flag antibody. Immunoprecipitated and WCL samples were analyzed by Western blotting for the indicated proteins.E. RPE or MCF10A cells were transduced with Flag-AMOTL2 WT or Flag-AMOTL2 Y213A, and processed as (D)."}
{"words": ["Figure", "7A", ".", "MCF10A", "cells", "expressing", "shRNA", "against", "AMOTL2", "were", "complemented", "with", "shRNA", "-", "resistant", "Flag", "-", "AMOTL2", "WT", "or", "the", "K347", "/", "408R", "mutant", ".", "The", "indicated", "cells", "were", "harvested", "and", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "for", "the", "indicated", "proteins", ".", "B", ".", "mRNAs", "isolated", "from", "cells", "in", "(", "A", ")", "were", "analyzed", "by", "RT", "-", "qPCR", "against", "indicated", "EMT", "marker", "genes", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Error", "bars", "indicate", "the", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "paired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "C", ".", "Transwell", "migration", "assay", "was", "performed", "using", "cells", "in", "(", "A", ")", "(", "n", "=", "8", ")", ".", "We", "analyzed", "5", "random", "fields", "for", "each", "sample", ".", "Error", "bars", "indicate", "the", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "paired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "D", ".", "Representative", "images", "of", "soft", "agar", "assay", "results", "using", "cells", "in", "(", "A", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "1", "mm", ".", "E", ".", "Soft", "agar", "assay", "was", "performed", "using", "cells", "in", "(", "A", ")", "(", "n", "=", "8", ")", ".", "Error", "bars", "indicate", "the", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "paired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A. MCF10A cells expressing shRNA against AMOTL2 were complemented with shRNA-resistant Flag-AMOTL2 WT or the K347/408R mutant. The indicated cells were harvested and analyzed by Western blotting for the indicated proteins.B. mRNAs isolated from cells in (A) were analyzed by RT-qPCR against indicated EMT marker genes (n=4). Error bars indicate the S.E.M. (*p< 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001; paired Student's t-test).C. Transwell migration assay was performed using cells in (A) (n=8). We analyzed 5 random fields for each sample. Error bars indicate the S.E.M. (**p< 0.01, paired Student's t-test).D. Representative images of soft agar assay results using cells in (A). Scale bar, 1 mm.E. Soft agar assay was performed using cells in (A) (n=8). Error bars indicate the S.E.M. (**p < 0.01, ***p < 0.001, paired Student's t-test)."}
{"words": ["Figure", "8B", ",", "C", ".", "293T", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "DNAs", "and", "immunoprecipitated", "with", "an", "anti", "-", "Flag", "antibody", "or", "pulled", "down", "with", "streptavidin", "-", "binding", "beads", ".", "D", ",", "E", ".", "293T", "cells", "were", "transfected", "as", "indicated", "and", "immunoprecipitated", "with", "an", "anti", "-", "HA", "antibody", ".", "LATS2", "immune", "complexes", "were", "subjected", "to", "a", "kinase", "assay", "with", "His", "-", "YAP", "and", "cold", "ATP", ".", "F", ".", "Lats1", "-", "/", "-", ";", "Lats2", "fl", "/", "fl", ";", "SV40", "mouse", "embryonic", "fibroblasts", "complemented", "with", "vector", ",", "LATS2", "WT", "or", "ΔUBA", "mutant", "were", "infected", "with", "empty", "(", "control", ")", "or", "Zeocin", "-", "Cre", "retroviruses", "and", "selected", "with", "400", "μg", "/", "ml", "of", "Zeocin", "for", "4", "days", ".", "Harvested", "cells", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "for", "the", "indicated", "proteins", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8B, C. 293T cells were transfected with the indicated DNAs and immunoprecipitated with an anti-Flag antibody or pulled down with streptavidin-binding beads.D, E. 293T cells were transfected as indicated and immunoprecipitated with an anti-HA antibody. LATS2 immune complexes were subjected to a kinase assay with His-YAP and cold ATP.F. Lats1 -/-; Lats2 fl/fl; SV40 mouse embryonic fibroblasts complemented with vector, LATS2 WT or ΔUBA mutant were infected with empty (control) or Zeocin-Cre retroviruses and selected with 400 μg/ml of Zeocin for 4 days. Harvested cells were analyzed by Western blotting for the indicated proteins."}
{"words": ["Figure", "1Paneth", "cell", "quantification", "on", "Lgr5", "-", "DTReGFP", "duodenum", "(", "Duo", ")", "and", "Ileum", "(", "Ile", ")", ".", "Left", "panel", ":", "Representative", "images", "of", "Lendrum", "'", "s", "staining", "that", "evidence", "Paneth", "cell", "granules", ".", "Arrows", "show", "differentiated", "Paneth", "cells", ".", "Right", "panel", ":", "quantification", "of", "the", "Paneth", "cells", "per", "10", "intervilli", "regions", ".", "Each", "symbol", "indicates", "the", "value", "for", "a", "given", "embryo", ".", "Expression", "analysis", "by", "qRT", "-", "PCR", "of", "the", "indicated", "Paneth", "cell", "markers", "in", "Lgr5", "-", "DTReGFP", "ileums", "(", "n", "=", "8", "WT", ",", "12", "HE", ",", "10", "KO", ")", ".", "X", "-", "gal", "staining", "in", "Axin2Lac", "/", "+", "-", "Lgr5", "-", "GFP", "-", "CreERT2", "WT", "or", "KO", "ileums", ".", "Gene", "expression", "analysis", "by", "qRT", "-", "PCR", "of", "stem", "cell", "markers", "in", "Lgr5", "-", "DTReGFP", "ileums", "(", "n", "=", "3", "WT", ",", "6", "HE", ",", "6", "KO", ")", ".", "FACS", "quantification", "of", "the", "number", "of", "eGFP", "+", "ve", "(", "ISC", ")", "cells", "per", "small", "intestine", "at", "the", "indicated", "developmental", "stages", "in", "Lgr5", "HEs", "and", "Lgr5", "KOs", ".", "Each", "symbol", "indicates", "the", "value", "for", "a", "given", "embryo", ".", "Mean", "value", "for", "each", "group", "is", "depicted", "on", "the", "graph", ".", "Plating", "efficiency", "of", "ex", "vivo", "cultured", "E18", ".", "5", "small", "intestines", "quantified", "6", "days", "after", "initial", "seeding", ".", "Each", "symbol", "indicates", "the", "value", "for", "a", "given", "embryo", ".", "Influence", "of", "mouse", "Rspondin", "1", "concentration", "on", "growth", "of", "replated", "Lgr5", "-", "DTReGFP", "WT", "and", "Lgr5", "KO", "organoids", "after", "5", "days", "of", "culture", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Paneth cell quantification on Lgr5-DTReGFP duodenum (Duo) and Ileum (Ile). Left panel: Representative images of Lendrum's staining that evidence Paneth cell granules. Arrows show differentiated Paneth cells. Right panel: quantification of the Paneth cells per 10 intervilli regions. Each symbol indicates the value for a given embryo.Expression analysis by qRT-PCR of the indicated Paneth cell markers in Lgr5-DTReGFP ileums (n= 8 WT, 12 HE, 10 KO).X-gal staining in Axin2Lac/+-Lgr5-GFP-CreERT2 WT or KO ileums.Gene expression analysis by qRT-PCR of stem cell markers in Lgr5-DTReGFP ileums (n= 3 WT, 6 HE, 6 KO).FACS quantification of the number of eGFP+ve (ISC) cells per small intestine at the indicated developmental stages in Lgr5 HEs and Lgr5 KOs. Each symbol indicates the value for a given embryo. Mean value for each group is depicted on the graph.Plating efficiency of ex vivo cultured E18.5 small intestines quantified 6 days after initial seeding. Each symbol indicates the value for a given embryo.Influence of mouse Rspondin 1 concentration on growth of replated Lgr5-DTReGFP WT and Lgr5 KO organoids after 5 days of culture."}
{"words": ["Figure", "2Paneth", "cell", "quantification", "on", "Lgr5", "-", "DTReGFP", "ileums", ".", "Each", "symbol", "indicates", "the", "value", "for", "a", "given", "embryo", ".", "Immunofluorescence", "showing", "Olfm4", "+", "ve", "cells", "in", "Lgr5", "-", "DTReGFP", "duodenums", ".", "Cell", "membranes", "are", "shown", "with", "b", "-", "catenin", "and", "nuclei", "were", "counterstained", "with", "DAPI", ".", "Quantification", "of", "Olfm4", "+", "ve", "cells", "per", "intervilli", "regions", "in", "duodenum", "and", "ileum", ".", "Each", "symbol", "indicates", "the", "value", "for", "a", "given", "embryo", ".", "Axin2", "expression", "levels", "detected", "by", "RNAscope", "on", "Lgr5", "-", "DTReGFP", "proximal", "intestine", ".", "Gene", "expression", "analysis", "by", "qRT", "-", "PCR", "of", "stem", "cell", "and", "differentiation", "markers", "in", "Lgr5", "-", "DTReGFP", "ileums", "(", "vehicle", "-", "treated", ":", "7", "WT", "and", "7", "KO", ";", "LGK974", "-", "treated", ":", "3", "WT", "and", "7", "KO", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Paneth cell quantification on Lgr5-DTReGFP ileums. Each symbol indicates the value for a given embryo.Immunofluorescence showing Olfm4+ve cells in Lgr5-DTReGFP duodenums. Cell membranes are shown with b-catenin and nuclei were counterstained with DAPI. Quantification of Olfm4+ve cells per intervilli regions in duodenum and ileum. Each symbol indicates the value for a given embryo.Axin2 expression levels detected by RNAscope on Lgr5-DTReGFP proximal intestine.Gene expression analysis by qRT-PCR of stem cell and differentiation markers in Lgr5-DTReGFP ileums (vehicle-treated: 7 WT and 7 KO; LGK974-treated: 3 WT and 7 KO)."}
{"words": ["Figure", "3Representative", "pictures", "of", "lineage", "tracing", "in", "Lgr5", "-", "expressing", "or", "Lgr5", "cKO", "intestine", "after", "10", "days", "of", "chase", "and", "quantification", "of", "the", "number", "of", "traced", "clones", "per", "recombined", "surface", "at", "PN18", "(", "ileum", ")", ".", "Each", "symbol", "indicates", "the", "value", "for", "a", "given", "mouse", ".", "Representative", "immunofluorescence", "pictures", "showing", "Paneth", "cells", "(", "Plyz", "+", "ve", ")", "in", "traced", "clones", "(", "RFP", "+", "ve", ")", "from", "control", "(", "Lgr5Cre", "/", "+", ")", "and", "cKO", "(", "Lgr5Cre", "/", "flox", ")", "PN18", "and", "adult", "ileums", ".", "Arrow", "heads", "point", "to", "Plyz", "+", "ve", "cells", "in", "traced", "clones", ".", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "Paneth", "cell", "number", "per", "recombined", "RFP", "+", "ve", "crypt", "on", "control", "and", "cKO", "ileums", "in", "PN18", ".", "Each", "symbol", "indicates", "the", "value", "for", "a", "given", "mouse", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Representative pictures of lineage tracing in Lgr5-expressing or Lgr5 cKO intestine after 10 days of chase and quantification of the number of traced clones per recombined surface at PN18 (ileum). Each symbol indicates the value for a given mouse.Representative immunofluorescence pictures showing Paneth cells (Plyz+ve) in traced clones (RFP+ve) from control (Lgr5Cre/+) and cKO (Lgr5Cre/flox) PN18 and adult ileums. Arrow heads point to Plyz+ve cells in traced clones. Quantification of the number of Paneth cell number per recombined RFP+ve crypt on control and cKO ileums in PN18. Each symbol indicates the value for a given mouse."}
{"words": ["Figure", "4ISC", "(", "eGFP", "+", "ve", ")", "cells", "were", "FACS", "-", "sorted", "from", "Lgr5", "-", "DTReGFP", "embryos", "at", "E16", ".", "5", "and", "subjected", "to", "RNAseq", "analysis", ".", "Heatmap", "of", "differentially", "regulated", "genes", "in", "HE", "and", "KO", "ISCs", "at", "E16", ".", "5", ".", "Biological", "replicates", "for", "RNAseq", "experiments", "on", "ISC", "Lgr5", "-", "DTReGFP", "E16", ".", "5", "independent", "embryonic", "pools", ",", "each", "obtained", "from", "independent", "litters", "(", "n", "=", "2", "HE", ",", "2", "KO", ")", "Compared", "Hallmarks", "for", "upregulated", "and", "downregulated", "genes", "in", "the", "transcriptome", "of", "E16", ".", "5", "Lgr5", "KOs", "vs", "E16", ".", "5", "HEs", ",", "adult", "HEs", "vs", "E18", ".", "5", "HE", "embryos", "and", "adult", "Lgr5", "-", "Cre", "cKO", "vs", "HEs", ".", "*", "Asterisks", "refer", "to", "given", "pathways", "for", "which", "differentially", "modulated", "genes", "were", "found", "upregulated", "and", "downregulated", ".", "Right", "panels", ":", "GSEA", "showing", "enrichment", "of", "the", "epithelial", "to", "mesenchymal", "transition", "(", "EMT", ")", "data", "set", "in", "E16", ".", "5", "Lgr5", "KOs", "vs", "E16", ".", "5", "HEs", ",", "adult", "HEs", "vs", "E18", ".", "5", "HE", "embryos", ",", "and", "adult", "Lgr5", "cKO", "vs", "adult", "HE", "modulated", "genes", ".", "NES", ":", "Normalized", "Enrichment", "Score", ".", "Biological", "replicates", "for", "RNAseq", "experiments", "on", "ISC", "Lgr5", "-", "DTReGFP", "E16", ".", "5", "independent", "embryonic", "pools", ",", "each", "obtained", "from", "independent", "litters", "(", "n", "=", "2", "HE", ",", "2", "KO", ")", ";", "Lgr5", "-", "DTReGFP", "E18", ".", "5", "individual", "embryos", "(", "n", "=", "2", "HE", ")", "and", "Lgr5", "-", "DTReGFP", "adult", "individual", "animals", "(", "n", "=", "2", "HE", ")", ";", "Lgr5", "-", "Cre", "/", "flox", "adult", "individual", "animals", "(", "n", "=", "2", "HE", ",", "3", "cKO", ")", ".", "Expression", "levels", "of", "genes", "commonly", "downregulated", "in", "ISCs", "of", "Lgr5", "KOs", "vs", "Lgr5", "HEs", "at", "E16", ".", "5", "and", "Lgr5", "adult", "vs", "E18", ".", "5", "HEs", ".", "RPKM", ":", "reads", "per", "kilobase", "of", "transcript", "per", "million", "mapped", "reads", ".", "Below", ":", "GeneOntology", "analysis", "of", "downregulated", "genes", "identified", "in", "the", "Epithelial", "Mesenchymal", "Transition", "Gene", "Set", "(", "Hallmark", "MSigDB", "collection", ")", ".", "Biological", "replicates", "for", "RNAseq", "experiments", "on", "ISC", "Lgr5", "-", "DTReGFP", "E16", ".", "5", "independent", "embryonic", "pools", ",", "each", "obtained", "from", "independent", "litters", "(", "n", "=", "2", "HE", ",", "2", "KO", ")", ";", "Lgr5", "-", "DTReGFP", "E18", ".", "5", "individual", "embryos", "(", "n", "=", "2", "HE", ")", "and", "Lgr5", "-", "DTReGFP", "adult", "individual", "animals", "(", "n", "=", "2", "HE", ")", ";", "Lgr5", "-", "Cre", "/", "flox", "adult", "individual", "animals", "(", "n", "=", "2", "HE", ",", "3", "cKO", ")", ".", "Data", "are", "represented", "as", "means", "±", "sem", "(", "C", ")", ".", "Expression", "profile", "of", "Col1a1", ",", "Zeb2", "and", "Cxcl10", "genes", "detected", "by", "RNAscope", "in", "embryonic", "and", "adult", "intestines", ".", "Insets", "with", "higher", "magnification", "are", "depicted", "on", "the", "right", "of", "each", "corresponding", "picture", ",", "boundaries", "between", "epithelium", "and", "mesenchyme", "are", "shown", "with", "dotted", "lines", "and", "arrows", "point", "to", "epithelial", "expression", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4ISC (eGFP+ve) cells were FACS-sorted from Lgr5-DTReGFP embryos at E16.5 and subjected to RNAseq analysis. Heatmap of differentially regulated genes in HE and KO ISCs at E16.5. Biological replicates for RNAseq experiments on ISC Lgr5-DTReGFP E16.5 independent embryonic pools, each obtained from independent litters (n= 2 HE, 2 KO)Compared Hallmarks for upregulated and downregulated genes in the transcriptome of E16.5 Lgr5 KOs vs E16.5 HEs, adult HEs vs E18.5 HE embryos and adult Lgr5-Cre cKO vs HEs. * Asterisks refer to given pathways for which differentially modulated genes were found upregulated and downregulated. Right panels: GSEA showing enrichment of the epithelial to mesenchymal transition (EMT) data set in E16.5 Lgr5 KOs vs E16.5 HEs, adult HEs vs E18.5 HE embryos, and adult Lgr5 cKO vs adult HE modulated genes. NES: Normalized Enrichment Score. Biological replicates for RNAseq experiments on ISC Lgr5-DTReGFP E16.5 independent embryonic pools, each obtained from independent litters (n= 2 HE, 2 KO); Lgr5-DTReGFP E18.5 individual embryos (n=2 HE) and Lgr5-DTReGFP adult individual animals (n=2 HE); Lgr5-Cre/flox adult individual animals (n= 2 HE, 3 cKO).Expression levels of genes commonly downregulated in ISCs of Lgr5 KOs vs Lgr5 HEs at E16.5 and Lgr5 adult vs E18.5 HEs. RPKM: reads per kilobase of transcript per million mapped reads. Below: GeneOntology analysis of downregulated genes identified in the Epithelial Mesenchymal Transition Gene Set (Hallmark MSigDB collection). Biological replicates for RNAseq experiments on ISC Lgr5-DTReGFP E16.5 independent embryonic pools, each obtained from independent litters (n= 2 HE, 2 KO); Lgr5-DTReGFP E18.5 individual embryos (n=2 HE) and Lgr5-DTReGFP adult individual animals (n=2 HE); Lgr5-Cre/flox adult individual animals (n= 2 HE, 3 cKO). Data are represented as means ± sem (C).Expression profile of Col1a1, Zeb2 and Cxcl10 genes detected by RNAscope in embryonic and adult intestines. Insets with higher magnification are depicted on the right of each corresponding picture, boundaries between epithelium and mesenchyme are shown with dotted lines and arrows point to epithelial expression."}
{"words": ["Figure", "5Expression", "of", "Axin2", ",", "Lgr5", ",", "Lgr4", ",", "Rspo1", ",", "Rspo2", ",", "Rspo3", "and", "Rspo4", "genes", "was", "analyzed", "on", "E15", ",", "E16", ".", "5", "and", "adult", "stages", "by", "RNAscope", ".", "Arrows", "evidence", "expressing", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Expression of Axin2, Lgr5, Lgr4, Rspo1, Rspo2, Rspo3 and Rspo4 genes was analyzed on E15, E16.5 and adult stages by RNAscope. Arrows evidence expressing cells."}
{"words": ["Figure", "6Representative", "pictures", "showing", "the", "influence", "of", "mouse", "Rspondin", "type", "and", "concentration", "on", "growth", "of", "replated", "Lgr5", "-", "DTReGFP", "WT", "and", "Lgr5", "KO", "organoids", "after", "4", "days", "of", "culture", ".", "Arrows", "show", "alive", "elements", "and", "arrow", "heads", "dead", "elements", ".", "Organoid", "morphology", "depends", "on", "Rspondin", "ligand", "type", "and", "concentration", ".", "Left", "panel", ":", "growth", "quantified", "as", "the", "percentage", "of", "elements", "present", "at", "day1", "surviving", "at", "day4", ".", "A", "mean", "of", "100", "elements", "were", "analyzed", "per", "sample", "and", "per", "condition", "(", "n", ":", "4", "WT", ",", "2", "KO", "organoid", "culture", "samples", ",", "each", "originating", "from", "a", "given", "embryo", ")", ".", "Right", "panel", ":", "organoid", "complexity", "measured", "by", "branching", "coefficient", ".", "Each", "symbol", "indicates", "the", "value", "of", "a", "given", "organoid", "(", "analysis", "was", "done", "on", "4", "WT", "and", "2", "KO", "organoid", "culture", "samples", ",", "each", "originating", "from", "a", "given", "embryo", ")", ".", "Heatmap", "showing", "the", "impact", "of", "Rspondin", "type", "and", "concentration", "(", "ng", "/", "ml", ")", "on", "relative", "Wnt", "target", "gene", "expression", "(", "list", "from", "the", "Sansom", "APC", "data", "set", ")", "in", "Lgr5", "-", "DTReGFP", "WT", "and", "KO", "organoids", "analyzed", "by", "RNAseq", "(", "n", "=", "3", "WT", "and", "2", "organoid", "culture", "samples", ",", "each", "originating", "from", "a", "given", "embryo", ")", ".", "Gene", "expression", "analysis", "by", "qRT", "-", "PCR", "of", "stem", "cell", "markers", "in", "Lgr5", "-", "DTREeGFP", "WT", "and", "KO", "organoids", "after", "5", "days", "of", "culture", "(", "expression", "relative", "to", "reference", "genes", ")", ".", "Each", "symbol", "indicates", "the", "value", "for", "an", "organoid", "culture", "originated", "from", "a", "given", "embryo", ".", "Immunofluorescence", "showing", "Olfm4", "+", "ve", "cells", "in", "Lgr5", "-", "DTReGFP", "WT", "and", "KO", "organoids", "cultured", "in", "Rspo2", "conditions", ".", "Epithelium", "is", "delineated", "with", "b", "-", "catenin", "and", "nuclei", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "Merge", ")", ".", "Insets", ":", "white", "arrowheads", "evidence", "Olfm4", "+", "ve", "cells", "concentrated", "in", "organoid", "protrusions", ".", "Quantification", "of", "Olfm4", "+", "ve", "area", "with", "respect", "to", "the", "total", "epithelial", "area", ".", "Each", "symbol", "indicates", "the", "value", "for", "an", "organoid", "culture", "originating", "from", "a", "given", "embryo", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Representative pictures showing the influence of mouse Rspondin type and concentration on growth of replated Lgr5-DTReGFP WT and Lgr5 KO organoids after 4 days of culture. Arrows show alive elements and arrow heads dead elements.Organoid morphology depends on Rspondin ligand type and concentration. Left panel: growth quantified as the percentage of elements present at day1 surviving at day4. A mean of 100 elements were analyzed per sample and per condition (n: 4 WT, 2 KO organoid culture samples, each originating from a given embryo). Right panel: organoid complexity measured by branching coefficient. Each symbol indicates the value of a given organoid (analysis was done on 4 WT and 2 KO organoid culture samples, each originating from a given embryo).Heatmap showing the impact of Rspondin type and concentration (ng/ml) on relative Wnt target gene expression (list from the Sansom APC data set) in Lgr5-DTReGFP WT and KO organoids analyzed by RNAseq (n= 3 WT and 2 organoid culture samples, each originating from a given embryo).Gene expression analysis by qRT-PCR of stem cell markers in Lgr5-DTREeGFP WT and KO organoids after 5 days of culture (expression relative to reference genes). Each symbol indicates the value for an organoid culture originated from a given embryo.Immunofluorescence showing Olfm4+ve cells in Lgr5-DTReGFP WT and KO organoids cultured in Rspo2 conditions. Epithelium is delineated with b-catenin and nuclei counterstained with DAPI (Merge). Insets: white arrowheads evidence Olfm4+ve cells concentrated in organoid protrusions. Quantification of Olfm4+ve area with respect to the total epithelial area. Each symbol indicates the value for an organoid culture originating from a given embryo."}
{"words": ["Figure", "1A", "Representative", "images", "of", "alkaline", "phosphatase", "(", "ALP", ")", ",", "Alizarin", "Red", "S", "(", "ARS", ")", "and", "Van", "Gieson", "'", "s", "staining", "of", "human", " ", "MSCs", "B", ",", "C", "Quantitative", "analyses", "of", "the", "ALP", "activity", "and", "calcium", "mineralization", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "6", ";", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "t", "test", "D", ",", "E", "Quantitative", "RT", "-", "PCR", "and", "western", "blot", "analyses", "of", "the", "expression", "of", "osteogenic", "markers", ".", "Cells", "were", "cultured", "in", "osteogenic", "medium", "for", "5", "days", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "3", ";", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "t", "test", "F", "H", "&", "E", "staining", "of", "the", "MSCs", "-", "mediated", "ectopic", "bone", "formation", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", "G", "Quantitative", "analysis", "of", "bone", " ", "volume", "versus", "total", "tissue", "volume", "(", "BV", "/", "TV", ")", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "6", ".", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", "by", "t"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A Representative images of alkaline phosphatase (ALP), Alizarin Red S (ARS) and Van Gieson's staining of human MSCs B, C Quantitative analyses of the ALP activity and calcium mineralization. Results are shown as mean ± SEM; n=6; **: p<0.01 and ***: p<0.001 by t test D, E Quantitative RT-PCR and western blot analyses of the expression of osteogenic markers. Cells were cultured in osteogenic medium for 5 days. Results are shown as mean ± SEM; n=3; *: p<0.05, **: p<0.01 and ***: p<0.001 by t test F H&E staining of the MSCs-mediated ectopic bone formation. Scale bar, 50 μm G Quantitative analysis of bone volume versus total tissue volume (BV/TV). Results are shown as mean ± SEM; n=6. *: p<0.05 by t test"}
{"words": ["Figure", "4", "A", "Scatter", "plot", "of", "RNA", "-", "seq", "expression", "analysis", ".", "508", "genes", "were", "upregulated", "and", "391", "genes", "were", "downregulated", ".", "Human", "MSCs", "were", "transfected", "with", "USP34", "or", "control", "siRNAs", "and", "cultured", "in", "osteogenic", "medium", "for", "2", "days", ".", "Two", "biological", "replicates", "per", "group", "C", "Heatmap", "of", "representative", "genes", "associated", "with", "BMP2", "signaling", "pathway", "D", "Relative", "activity", "of", "BRE", "luciferase", "assay", ".", "293T", "cells", "were", "depleted", "with", "serum", "overnight", "followed", "by", "a", "treatment", "with", "BMP2", "for", "6", "hours", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "3", ".", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "t", "testE", "Immunoblot", "analysis", "of", "BMP2", "-", "induce", "Sp7", "expression", ".", "Prx1", "-", "Cre", ";", "Usp34f", "/", "f", "and", "Usp34f", "/", "f", "control", "MSCs", "were", "starved", "overnight", "and", "then", "stimulated", "with", "100", "ng", "/", "ml", "BMP2", "for", "24", "hoursF", "Quantitative", "RT", "-", "PCR", "analysis", "of", "BMP2", "-", "induce", "Sp7", " ", "transcription", ".", "Cells", "were", "depleted", "from", "serum", "overnight", "before", "BMP2", "stimulation", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "3", ";", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", "and", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", "by", "t", "testG", "Representative", "images", "of", "ALP", "and", "ARS", " ", "staining", ".", "MSCs", "were", "cultured", "with", "normal", "medium", "supplemented", "with", "100", "ng", "/", "ml", "BMP2", "for", "10", "and", "21", "days", ",", "respectivelyH", ",", "I", "Quantitative", "analyses", "of", "the", "ALP", "activity", "(", "n", "=", "4", ")", "and", "calcium", "mineralization", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "t", "test", "J", ",", "K", "Representative", "microCT", "images", "and", "quantification", "of", "newly", "formed", "bone", "in", "response", "to", "BMP2", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "8", ".", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", "by", "t", "test", ".", "Scale", "bar", ",", "2500", "μm", "L", "H", "&", "E", "staining", "of", "BMP2", "-", "induced", "newly", "formed", "bone", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μmM", "Quantitative", "analysis", "of", "bone", " ", "volume", "versus", "total", "tissue", " ", "volume", "(", "BV", "/", "TV", ")", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "8", ";", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", "by", "t", " ", "test", "N", "H", "&", "E", "staining", "of", "calvarial", "organ", "cultures", "stimulated", "with", "or", "without", "100", "ng", "/", "ml", "BMP2", ".", "Red", "dotted", "lines", "indicate", "the", "interface", "between", "original", "and", "newly", "formed", "bone", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μmO", "Quantitative", "analysis", "of", "newly", "formed", "bone", " ", "volume", "versus", "original", "bone", " ", "volume", "(", "%", ")", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "8", ";", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", "by", "t", " "], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4 A Scatter plot of RNA-seq expression analysis. 508 genes were upregulated and 391 genes were downregulated. Human MSCs were transfected with USP34 or control siRNAs and cultured in osteogenic medium for 2 days. Two biological replicates per group  C Heatmap of representative genes associated with BMP2 signaling pathway D Relative activity of BRE luciferase assay. 293T cells were depleted with serum overnight followed by a treatment with BMP2 for 6 hours. Results are shown as mean ± SEM; n=3. ***: p<0.001 by t testE Immunoblot analysis of BMP2-induce Sp7 expression. Prx1-Cre;Usp34f/f and Usp34f/f control MSCs were starved overnight and then stimulated with 100 ng/ml BMP2 for 24 hoursF Quantitative RT-PCR analysis of BMP2-induce Sp7 transcription. Cells were depleted from serum overnight before BMP2 stimulation. Results are shown as mean ± SEM; n=3; *: p<0.05 and **: p<0.01 by t testG Representative images of ALP and ARS staining. MSCs were cultured with normal medium supplemented with 100 ng/ml BMP2 for 10 and 21 days, respectivelyH, I Quantitative analyses of the ALP activity (n=4) and calcium mineralization (n=5). Results are shown as mean ± SEM; *: p<0.05, **: p<0.01 and ***: p<0.001 by t test J, K Representative microCT images and quantification of newly formed bone in response to BMP2. Results are shown as mean ± SEM; n=8. *: p<0.05 by t test. Scale bar, 2500 μm L H&E staining of BMP2-induced newly formed bone. Scale bar, 50 μmM Quantitative analysis of bone volume versus total tissue volume (BV/TV). Results are shown as mean ± SEM; n=8; **: p<0.01 by t test N H&E staining of calvarial organ cultures stimulated with or without 100 ng/ml BMP2. Red dotted lines indicate the interface between original and newly formed bone. Scale bar, 50 μmO Quantitative analysis of newly formed bone volume versus original bone volume (%). Results are shown as mean ± SEM; n=8; **: p<0.01 by t test"}
{"words": ["Figure", "6A", "Co", "-", "immunoprecipitation", "of", "USP34", "with", "ectopically", "expressed", "FLAG", "-", "tagged", "Smad1", "in", "293T", "cells", "B", "Immunoblot", "analysis", "showing", "decreased", "FLAG", "-", "Smad1", "after", "USP34", "knockdown", "C", "Immunoblot", "of", "Smad1", "-", "linked", "polyUb", ".", "293T", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "FLAG", "-", "Smad1", "overexpression", "plasmid", "and", "USP34", "siRNA", ",", "and", "treated", "with", "10", "µM", "MG132", "for", "4", "hours", "before", "collection", "D", "Immunoblot", "analysis", "of", "the", "degradation", "of", "FLAG", "-", "Smad1", "protein", ".", "293T", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "FLAG", "-", "Smad1", "overexpression", "plasmid", "and", "USP34", "siRNA", ",", "and", "treated", "with", "50", "µg", "/", "ml", "cycloheximide", "(", "CHX", ")", "before", "collection", "at", "designated", "time", "points", ".", "Right", ":", "relative", "quantification", "of", "FLAG", "-", "Smad1", "protein", "levels", "at", "different", "time", "pointsE", "Co", "-", "immunoprecipitation", "of", "USP34", "with", "ectopically", "expressed", "FLAG", "-", "tagged", "RUNX2", "in", "293T", "cellsF", "Co", "-", "immunoprecipitation", "of", "USP34", "with", "endogenous", "RUNX2", "in", "mouse", "MSCsG", "Immunoblot", "of", "RUNX2", "-", "linked", "polyUb", ".", "Differentiated", "mouse", "MSCs", "were", "treated", "with", "10", "µM", "MG132", "for", "4", "hours", "before", "collection", ".", "Prx1", "-", "Cre", "(", "+", ")", "indicates", "MSCs", "isolated", "from", "Prx1", "-", "Cre", ";", "Usp34f", "/", "f", "mice", ",", "and", "Prx1", "-", "Cre", "(", "-", ")", "indicates", "those", "from", "Usp34f", "/", "f", "control", "miceH", "Immunoblot", "analysis", "of", "the", "degradation", "of", "endogenous", "RUNX2", "protein", "in", "MSCs", ".", "Prx1", "-", "Cre", ";", "Usp34f", "/", "f", "and", "Usp34f", "/", "f", "control", "MSCs", "were", "stimulated", "with", "BMP2", ",", "treated", "with", "50", "µg", "/", "ml", "CHX", ",", "and", "collected", "at", "designated", "time", "points", ".", "Right", ":", "relative", "quantification", "of", "RUNX2", "protein", "levels", "at", "different", "time", "pointsI", "Representative", "images", "of", "ALP", "and", "ARS", "staining", ".", "Usp34f", "/", "f", "and", "Prx1", "-", "Cre", ";", "Usp34f", "/", "f", " ", "MSCs", "were", "transduced", "with", "GFP", ",", "Smad1", ",", "Runx2", "or", "Smad1", "+", "Runx2", "adenoviruses", ",", "and", "then", "cultured", "in", "osteogenic", "medium", "for", "5", "and", "10", "days", ",", "respectivelyJ", ",", "K", "Quantitative", "analyses", "of", "the", "ALP", "activity", "and", "calcium", "mineralization", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "8", ";", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "testL", ",", "M", "H", "&", "E", " ", "staining", "and", "quantitative", "analysis", "of", "MSCs", "-", "mediated", "ectopic", "bone", "formation", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "8", ";", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", "and", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", "by", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A Co-immunoprecipitation of USP34 with ectopically expressed FLAG-tagged Smad1 in 293T cells B Immunoblot analysis showing decreased FLAG-Smad1 after USP34 knockdown  C Immunoblot of Smad1-linked polyUb. 293T cells were co-transfected with FLAG-Smad1 overexpression plasmid and USP34 siRNA, and treated with 10 µM MG132 for 4 hours before collection  D Immunoblot analysis of the degradation of FLAG-Smad1 protein. 293T cells were co-transfected with FLAG-Smad1 overexpression plasmid and USP34 siRNA, and treated with 50 µg/ml cycloheximide (CHX) before collection at designated time points. Right: relative quantification of FLAG-Smad1 protein levels at different time pointsE Co-immunoprecipitation of USP34 with ectopically expressed FLAG-tagged RUNX2 in 293T cellsF Co-immunoprecipitation of USP34 with endogenous RUNX2 in mouse MSCsG Immunoblot of RUNX2-linked polyUb. Differentiated mouse MSCs were treated with 10 µM MG132 for 4 hours before collection. Prx1-Cre(+) indicates MSCs isolated from Prx1-Cre;Usp34f/f mice, and Prx1-Cre(-) indicates those from Usp34f/f control miceH Immunoblot analysis of the degradation of endogenous RUNX2 protein in MSCs. Prx1-Cre;Usp34f/f and Usp34f/f control MSCs were stimulated with BMP2, treated with 50 µg/ml CHX, and collected at designated time points. Right: relative quantification of RUNX2 protein levels at different time pointsI Representative images of ALP and ARS staining. Usp34f/f and Prx1-Cre;Usp34f/f MSCs were transduced with GFP, Smad1, Runx2 or Smad1+Runx2 adenoviruses, and then cultured in osteogenic medium for 5 and 10 days, respectivelyJ, K Quantitative analyses of the ALP activity and calcium mineralization. Results are shown as mean ± SEM; n=8; *: p<0.05, **: p<0.01 and ***: p<0.001 by ANOVA with Tukey's post hoc testL, M H&E staining and quantitative analysis of MSCs-mediated ectopic bone formation. Scale bar, 50 μm. Results are shown as mean ± SEM; n=8; *: p<0.05 and **: p<0.01 by ANOVA with Tukey's post hoc test"}
{"words": ["Figure", "7A", "Relative", "activity", "of", "BRE", "luciferase", "assay", ".", "293T", "cells", "were", "depleted", "with", "serum", "overnight", "followed", "by", "a", "treatment", "with", "BMP2", "for", "6", "hours", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "3", ".", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", "by", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "testB", "Immunoblot", "analysis", "of", "BMP2", "-", "induce", "Sp7", "expression", ".", "Prx1", "-", "Cre", ";", "Usp34f", "/", "f", " ", "MSCs", "were", "treated", "with", "Smurf1", "or", "control", "siRNAs", ",", "starved", "overnight", "and", "then", "stimulated", "with", "100", "ng", "/", "ml", "BMP2", "for", "24", "hoursC", "Quantitative", "RT", "-", "PCR", "analysis", "of", "BMP2", "-", "induce", "Sp7", " ", "transcription", ".", "Prx1", "-", "Cre", ";", "Usp34f", "/", "f", " ", "MSCs", "were", "treated", "with", "Smurf1", "or", "control", "siRNAs", ",", "and", "depleted", "from", "serum", "overnight", "before", "BMP2", "stimulation", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "3", ";", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", "and", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", "by", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "testD", "ALP", " ", "staining", "and", "quantitative", "measurement", "of", "ALP", "activity", ".", "MSCs", "were", "cultured", "with", "normal", "medium", "supplemented", "with", "100", "ng", "/", "ml", "BMP2", "for", "5", "days", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "8", ";", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", "by", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", "E", "Representative", "images", "of", "ARS", "staining", "and", "quantification", ".", "Cells", "were", "cultured", "with", "normal", "medium", "supplemented", "with", "100", "ng", "/", "ml", "BMP2", "for", "14", "days", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "8", ";", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "and", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", "by", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", "F", "Representative", "images", "of", "ALP", "and", "ARS", "staining", ".", "Mouse", "MSCs", "were", "treated", "with", "Smurf1", "or", "control", "siRNAs", ",", "and", "cultured", "in", "osteogenic", "medium", "for", "5", "and", "10", "days", ",", "respectivelyG", ",", "H", "Quantitative", "analyses", "of", "the", "ALP", "activity", "and", "calcium", "mineralization", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "8", ";", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", " ", "I", ",", "J", "Quantitative", "RT", "-", "PC", "analyses", "of", "the", "expression", "of", "osteogenic", "markers", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "Smurf1", "or", "control", "siRNAs", ",", "and", "cultured", "in", "osteogenic", "medium", "for", "5", "days", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "3", ";", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "testwestern", "blot", "analyses", "of", "the", "expression", "of", "osteogenic", "markers", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "Smurf1", "or", "control", "siRNAs", ",", "and", "cultured", "in", "osteogenic", "medium", "for", "5", "days", ".", "Results", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "3", ";", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "001", "by", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A Relative activity of BRE luciferase assay. 293T cells were depleted with serum overnight followed by a treatment with BMP2 for 6 hours. Results are shown as mean ± SEM; n=3. *: p<0.05 by ANOVA with Tukey's post hoc testB Immunoblot analysis of BMP2-induce Sp7 expression. Prx1-Cre;Usp34f/f MSCs were treated with Smurf1 or control siRNAs, starved overnight and then stimulated with 100 ng/ml BMP2 for 24 hoursC Quantitative RT-PCR analysis of BMP2-induce Sp7 transcription. Prx1-Cre;Usp34f/f MSCs were treated with Smurf1 or control siRNAs, and depleted from serum overnight before BMP2 stimulation. Results are shown as mean ± SEM; n=3; *: p<0.05 and **: p<0.01 by ANOVA with Tukey's post hoc testD ALP staining and quantitative measurement of ALP activity. MSCs were cultured with normal medium supplemented with 100 ng/ml BMP2 for 5 days. Results are shown as mean ± SEM; n=8; **: p<0.01 by ANOVA with Tukey's post hoc test E Representative images of ARS staining and quantification. Cells were cultured with normal medium supplemented with 100 ng/ml BMP2 for 14 days. Results are shown as mean ± SEM; n=8; *: p<0.05, and **: p<0.01 by ANOVA with Tukey's post hoc test  F Representative images of ALP and ARS staining. Mouse MSCs were treated with Smurf1 or control siRNAs, and cultured in osteogenic medium for 5 and 10 days, respectivelyG, H Quantitative analyses of the ALP activity and calcium mineralization. Results are shown as mean ± SEM; n=8; *: p<0.05, **: p<0.01 and ***: p<0.001 by ANOVA with Tukey's post hoc test I, J Quantitative RT-PC analyses of the expression of osteogenic markers. Cells were treated with Smurf1 or control siRNAs, and cultured in osteogenic medium for 5 days. Results are shown as mean ± SEM; n=3; *: p<0.05, **: p<0.01 and ***: p<0.001 by ANOVA with Tukey's post hoc testwestern blot analyses of the expression of osteogenic markers. Cells were treated with Smurf1 or control siRNAs, and cultured in osteogenic medium for 5 days. Results are shown as mean ± SEM; n=3; *: p<0.05, **: p<0.01 and ***: p<0.001 by ANOVA with Tukey's post hoc test"}
{"words": ["Figure", "1A", ",", "B", ",", "Western", "blotting", "analysis", "of", "proteins", "co", "-", "precipitated", "with", "anti", "-", "FLAG", "antibody", "from", "testis", "extracts", "of", "E15", ".", "5", "wild", "-", "type", "embryos", "and", "transgenic", "embryos", "expressing", "FLAG", "-", "tagged", "NANOS2", "with", "or", "without", "RNase", "(", "A", ")", "or", "from", "extracts", "of", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "FLAG", "-", "tagged", "DND1", "and", "with", "or", "without", "HA", "-", "tagged", "NANOS2", "(", "B", ")", ".", "Precipitates", "were", "analyzed", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "C", ",", "GST", "pull", "-", "down", "assay", "using", "E", ".", "coli", "extracts", "expressing", "GST", ",", "GST", "-", "fused", "NANOS2", ",", "or", "NANOS3", "mixed", "with", "MBP", "-", "tagged", "LacZ", "or", "DND1", ".", "Precipitates", "were", "analyzed", "by", "Coomassie", "Brilliant", "Blue", "(", "CBB", ")", "staining", "or", "western", "blotting", "with", "an", "anti", "-", "MBP", "antibody", ".", "An", "arrowhead", "indicates", "MBP", "-", "DND1", "co", "-", "precipitated", "with", "GST", "-", "tagged", "NANOS2", "or", "NANOS3", ".", "D", ",", "E", ",", "Western", "blotting", "analyses", "of", "proteins", "co", "-", "precipitated", "with", "anti", "-", "FLAG", "antibody", "from", "extracts", "of", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "FLAG", "-", "tagged", "NANOS2", ",", "NANOS2", "(", "ΔN10", ")", ",", "NANOS2", "(", "ΔC10", ")", ",", "NANOS2", "(", "C61A", ",", "C96A", ")", "or", "NANOS3", ",", "and", "HA", "-", "tagged", "DND1", "(", "D", ")", "D", ",", "E", ",", "Western", "blotting", "analyses", "of", "proteins", "co", "-", "precipitated", "with", "anti", "-", "FLAG", "antibody", "from", "extracts", "of", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "FLAG", "-", "tagged", "NANOS2", ",", "NANOS2", "(", "ΔN10", ")", ",", "NANOS2", "(", "ΔC10", ")", ",", "NANOS2", "(", "C61A", ",", "C96A", ")", "or", "NANOS3", ",", "and", "HA", "-", "tagged", "DND1", "(", "D", ")", "or", "with", "FLAG", "-", "tagged", "NANOS2", ",", "NANOS2", "(", "C61A", ")", ",", "NANOS2", "(", "C96A", ")", "or", "NANOS2", "(", "C61A", ",", "C96A", ")", ",", "and", "HA", "-", "tagged", "DND1", "(", "E", ")", ".", "Precipitates", "were", "analyzed", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "F", ",", "GST", "pull", "-", "down", "assay", "using", "E", ".", "coli", "extracts", "expressing", "GST", "-", "fused", "DND1", "mixed", "with", "MBP", "-", "tagged", "LacZ", ",", "NANOS2", ",", "NANOS2", "(", "C61A", ",", "C96A", ")", "or", "NANOS2", "(", "60", "-", "114", ")", ".", "Arrowheads", "indicate", "MBP", "-", "tagged", "NANOS2", "(", "lane", "2", ")", "or", "NANOS2", "(", "60", "-", "114", ")", "(", "lane", "4", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A, B, Western blotting analysis of proteins co-precipitated with anti-FLAG antibody from testis extracts of E15.5 wild-type embryos and transgenic embryos expressing FLAG-tagged NANOS2 with or without RNase (A) or from extracts of HeLa cells transfected with FLAG-tagged DND1 and with or without HA-tagged NANOS2 (B).Precipitates were analyzed with the indicated antibodies. C, GST pull-down assay using E. coli extracts expressing GST, GST-fused NANOS2, or NANOS3 mixed with MBP-tagged LacZ or DND1. Precipitates were analyzed by Coomassie Brilliant Blue (CBB) staining or western blotting with an anti-MBP antibody. An arrowhead indicates MBP-DND1 co-precipitated with GST-tagged NANOS2 or NANOS3.D, E, Western blotting analyses of proteins co-precipitated with anti-FLAG antibody from extracts of HeLa cells transfected with FLAG-tagged NANOS2, NANOS2 (ΔN10), NANOS2 (ΔC10), NANOS2 (C61A, C96A) or NANOS3, and HA-tagged DND1 (D)D, E, Western blotting analyses of proteins co-precipitated with anti-FLAG antibody from extracts of HeLa cells transfected with FLAG-tagged NANOS2, NANOS2 (ΔN10), NANOS2 (ΔC10), NANOS2 (C61A, C96A) or NANOS3, and HA-tagged DND1 (D) or with FLAG-tagged NANOS2, NANOS2 (C61A), NANOS2 (C96A) or NANOS2 (C61A, C96A), and HA-tagged DND1 (E).Precipitates were analyzed with the indicated antibodies. F, GST pull-down assay using E. coli extracts expressing GST-fused DND1 mixed with MBP-tagged LacZ, NANOS2, NANOS2 (C61A, C96A) or NANOS2 (60-114). Arrowheads indicate MBP-tagged NANOS2 (lane 2) or NANOS2 (60-114) (lane 4)."}
{"words": ["Figure", "2Western", "blotting", "analyses", "of", "proteins", "co", "-", "precipitated", "with", "anti", "-", "FLAG", "antibody", "from", "extracts", "of", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "HA", "-", "tagged", "NANOS1", ",", "NANOS2", "or", "NANOS3", ",", "and", "FLAG", "-", "tagged", "DND1", "(", "A", ")", "Western", "blotting", "analyses", "of", "proteins", "co", "-", "precipitated", "with", "anti", "-", "FLAG", "antibody", "from", "extracts", "of", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "HA", "-", "tagged", "NANOS1", ",", "NANOS2", "or", "NANOS3", ",", "and", "FLAG", "-", "tagged", "DND1", "(", "A", ")", "or", "with", "FLAG", "-", "tagged", "PUMILIO1", "or", "PUMILIO2", ",", "and", "HA", "-", "tagged", "NANOS1", ",", "NANOS2", "or", "NANOS3", "with", "or", "without", "MYC", "-", "tagged", "DND1", "(", "B", ")", ".", "C", ",", "Characterization", "of", "antibodies", "against", "PUMILIO1", "and", "PUMILIO2", ".", "Western", "blotting", "analyses", "of", "Flag", "-", "tagged", "PUMILIO1", "and", "PUMILIO2", "in", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "FLAG", "-", "tagged", "PUMILIO1", "or", "PUMILIO2", "using", "antibodies", "against", "FLAG", ",", "PUMILIO1", "or", "PUMILIO2", ".", "Note", "that", "the", "antibodies", "against", "PUMILIO1", "specifically", "recognized", "FLAG", "-", "tagged", "PUMILIO1", "while", "the", "anti", "-", "PUMILIO2", "antibody", "could", "detect", "both", "Flag", "-", "tagged", "PUMILIO1", "and", "PUMILIO2", "but", "less", "actively", ".", "D", ",", "FLAG", "-", "tagged", "NANOS2", "was", "immunoprecipitated", "with", "an", "anti", "-", "FLAG", "antibody", "from", "E15", ".", "5", "testicular", "extracts", "from", "transgenic", "mice", "expressing", "FLAG", "-", "tagged", "NANOS2", ".", "Precipitates", "were", "analyzed", "by", "western", "blotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Note", "that", "co", "-", "precipitation", "of", "both", "PUMILIO1", "and", "PUMILIO2", "were", "not", "detected", "even", "though", "both", "CNOT1", "and", "DND1", "were", "clearly", "co", "-", "precipitated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Western blotting analyses of proteins co-precipitated with anti-FLAG antibody from extracts of HeLa cells transfected with HA-tagged NANOS1, NANOS2 or NANOS3, and FLAG-tagged DND1 (A)Western blotting analyses of proteins co-precipitated with anti-FLAG antibody from extracts of HeLa cells transfected with HA-tagged NANOS1, NANOS2 or NANOS3, and FLAG-tagged DND1 (A) or with FLAG-tagged PUMILIO1 or PUMILIO2, and HA-tagged NANOS1, NANOS2 or NANOS3 with or without MYC-tagged DND1 (B).C, Characterization of antibodies against PUMILIO1 and PUMILIO2. Western blotting analyses of Flag-tagged PUMILIO1 and PUMILIO2 in HeLa cells transfected with FLAG-tagged PUMILIO1 or PUMILIO2 using antibodies against FLAG, PUMILIO1 or PUMILIO2. Note that the antibodies against PUMILIO1 specifically recognized FLAG-tagged PUMILIO1 while the anti-PUMILIO2 antibody could detect both Flag-tagged PUMILIO1 and PUMILIO2 but less actively.D, FLAG-tagged NANOS2 was immunoprecipitated with an anti-FLAG antibody from E15.5 testicular extracts from transgenic mice expressing FLAG-tagged NANOS2. Precipitates were analyzed by western blotting with the indicated antibodies. Note that co-precipitation of both PUMILIO1 and PUMILIO2 were not detected even though both CNOT1 and DND1 were clearly co-precipitated."}
{"words": ["Figure", "3Figure", "3", "|", "DND1", "co", "-", "localizes", "with", "NANOS2", "in", "P", "-", "bodies", ".", "A", "−", "C", ",", "Sections", "of", "male", "gonads", "from", "E15", ".", "5embryos", "were", "immunostained", "with", "antibodies", "against", "DND1", "(", "green", ")", "and", "DCP1a", "(", "red", ")", ".", "D", "−", "F", ",", "Squash", "preparation", "of", "a", "male", "gonocyte", "from", "E16", ".", "5embryoimmunostained", "with", "antibodies", "against", "DND1", "(", "red", ")", "and", "DCP1a", "(", "green", ")", ".", "Arrowheads", "indicate", "co", "-", "localization", "of", "DND1", "and", "DCP1a", ".", "G", "−", "I", ",", "Sections", "of", "male", "gonads", "from", "E15", ".", "5embryos", "were", "immunostained", "with", "antibodies", "against", "DND1", "(", "red", ")", "and", "NANOS2", "(", "green", ")", ".", "Arrowheads", "indicate", "co", "-", "localization", "of", "DND1", "and", "NANOS2", ".", "J", "−", "M", ",", "NIH3T3", "cells", "transfected", "with", "HA", "-", "tagged", "Dnd1", "and", "FLAG", "-", "tagged", "Nanos2", "were", "then", "immunostained", "with", "antibodies", "against", "DND1", "(", "J", ")", "(", "magenta", ")", ",", "NANOS2", "(", "K", ")", "(", "red", ")", ",", "and", "DCP1a", "(", "L", ")", "(", "green", ")", ".", "N", "−", "Y", ",", "Biomolecular", "fluorescence", "complementation", "assay", ".", "NIH3T3", "cells", "transfected", "with", "VENUS", "-", "C", "-", "fused", "Dnd1", "and", "VENUS", "-", "N", "-", "fused", "Nanos2", "(", "N", "−", "U", ")", "or", "Nanos2", "(", "C61A", ",", "C96A", ")", "(", "V", "-", "γ", ")", "were", "immunostained", "with", "antibodies", "against", "DND1", "(", "N", ",", "S", ",", "V", ")", ",", "NANOS2", "(", "O", ",", "W", ",", "α", ")", "or", "DDX6", "(", "R", ",", "Z", ")", ".", "Then", ",", "the", "signals", "of", "VENUS", "fusion", "protein", "were", "visualized", "(", "P", ",", "T", ",", "X", ",", "β", ")", ".", "Arrowheads", "in", "Z", "indicate", "P", "-", "bodies", ".", "DNA", "was", "labeled", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "50", "m", "in", "A", "for", "A", "−", "C", ";", "10", "m", "in", "D", "for", "D", "-", "F", ",", "G", "for", "G", "−", "I", ",", "J", "for", "J", "−", "M", ",", "N", "for", "N", "−", "γ", ".", "Insets", "in", "A", "-", "C", "and", "J", "-", "γ", "show", "an", "enlarged", "vision", "of", "each", "picture", "to", "better", "depict", "localization", "of", "each", "protein", ".", "See", "also", "Fig", ".", "EV2T", "-", "Y", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Figure 3 | DND1 co-localizes with NANOS2 in P-bodies. A−C, Sections of male gonads from E15.5embryos were immunostained with antibodies against DND1 (green) and DCP1a (red). D−F, Squash preparation of a male gonocyte from E16.5embryoimmunostained with antibodies against DND1 (red) and DCP1a (green). Arrowheads indicate co-localization of DND1 and DCP1a. G−I, Sections of male gonads from E15.5embryos were immunostained with antibodies against DND1 (red) and NANOS2 (green). Arrowheads indicate co-localization of DND1 and NANOS2. J−M, NIH3T3 cells transfected with HA-tagged Dnd1 and FLAG-tagged Nanos2 were then immunostained with antibodies against DND1 (J) (magenta), NANOS2 (K) (red), and DCP1a (L) (green). N−Y, Biomolecular fluorescence complementation assay. NIH3T3 cells transfected with VENUS-C-fused Dnd1 and VENUS-N-fused Nanos2 (N−U) or Nanos2 (C61A, C96A) (V-γ) were immunostained with antibodies against DND1 (N, S, V), NANOS2 (O, W, α) or DDX6 (R, Z). Then, the signals of VENUS fusion protein were visualized (P, T, X, β). Arrowheads in Z indicate P-bodies. DNA was labeled with DAPI (blue). Scale bars: 50 m in A for A−C; 10 m in D for D-F, G for G−I, J for J−M, N for N−γ. Insets in A-C and J-γ show an enlarged vision of each picture to better depict localization of each protein. See also Fig. EV2T-Y."}
{"words": ["Figure", "4A", ",", "Western", "blotting", "analyses", "of", "proteins", "in", "testes", "from", "E13", ".", "5", "to", "E16", ".", "5", "embryos", "of", "Dnd1flox", "/", "flox", "or", "Dnd1flox", "/", "flox", "_", "Tg", "(", "Oct4PE", "-", "CreERT2", ")", "each", "administered", "with", "tamoxifen", "at", "E13", ".", "5", "and", "E15", ".", "5", "embryos", "of", "Nanos2", "+", "/", "-", "or", "Nanos2", "-", "/", "-", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "B", "-", "P", ",", "Sections", "of", "testes", "from", "Dnd1flox", "/", "flox", "(", "B", ",", "E", ",", "H", ",", "K", ",", "N", ")", ",", "Dnd1flox", "/", "flox", "_", "Tg", "(", "Oct4PE", "-", "CreERT2", ")", "(", "C", ",", "F", ",", "I", ",", "L", ",", "O", ")", "or", "Nanos2", "-", "/", "-", "(", "D", ",", "G", ",", "J", ",", "M", ",", "P", ")", "embryos", "were", "prepared", "at", "E16", ".", "5", "and", "then", "immunostained", "with", "antibodies", "against", "pH3", "(", "B", "-", "D", ")", ",", "STRA8", "(", "E", "-", "G", ")", ",", "SYCP3", "(", "H", "-", "J", ")", ",", "activated", "-", "Caspase3", "(", "K", "-", "M", ")", "or", "LAMININ", "(", "N", "-", "P", ")", "(", "green", ")", ".", "Germ", "cells", "were", "immunostained", "with", "TRA98", "(", "B", "-", "D", ")", "or", "DAZL", "(", "N", "-", "P", ")", "(", "red", ")", ",", "and", "DNA", "was", "labeled", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Tamoxifen", "was", "administered", "at", "E13", ".", "5", ".", "Scale", "bars", ":", "50", "m", "in", "B", "for", "B", "−", "D", "and", "K", "-", "P", ",", "50", "m", "in", "E", "for", "E", "−", "J", ".", "See", "also", "Fig", ".", "EV3", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A, Western blotting analyses of proteins in testes from E13.5 to E16.5 embryos of Dnd1flox/flox or Dnd1flox/flox_Tg(Oct4PE-CreERT2) each administered with tamoxifen at E13.5 and E15.5 embryos of Nanos2+/- or Nanos2-/- with the indicated antibodies.B-P, Sections of testes from Dnd1flox/flox (B, E, H, K, N), Dnd1flox/flox_Tg(Oct4PE-CreERT2) (C, F, I, L, O) or Nanos2-/- (D, G, J, M, P) embryos were prepared at E16.5 and then immunostained with antibodies against pH3 (B-D), STRA8 (E-G), SYCP3 (H-J), activated-Caspase3 (K-M) or LAMININ (N-P) (green). Germ cells were immunostained with TRA98 (B-D) or DAZL (N-P) (red), and DNA was labeled with DAPI (blue). Tamoxifen was administered at E13.5. Scale bars: 50 m in B for B−D and K-P, 50 m in E for E−J. See also Fig. EV3."}
{"words": ["Figure", "5A", "-", "L", ",", "Sections", "of", "testes", "from", "Dnd1flox", "/", "flox", "(", "A", ",", "B", ",", "C", ",", "G", ",", "H", ",", "I", ",", "M", ",", "N", ",", "O", ")", "and", "Dnd1flox", "/", "flox", "_", "Tg", "(", "Oct4PE", "-", "CreERT2", ")", "(", "D", ",", "E", ",", "F", ",", "J", ",", "K", ",", "L", ",", "P", ",", "Q", ",", "R", ")", "embryos", "were", "prepared", "at", "E16", ".", "5", "and", "then", "immunostained", "with", "antibodies", "against", "NANOS2", "(", "A", ",", "D", ")", "(", "green", ")", ",", "DCP1a", "(", "G", ",", "J", ")", "(", "green", ")", ",", "DDX6", "(", "M", ",", "P", ")", "(", "green", ")", "and", "TRA98", "(", "B", ",", "E", ",", "H", ",", "K", ",", "N", ",", "Q", ")", ".", "DNA", "was", "labeled", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Tamoxifen", "was", "administered", "at", "E13", ".", "5", ".", "Scale", "bars", ":", "50", "m", "in", "A", "for", "A", "−", "F", ";", "50", "m", "in", "G", "for", "G", "-", "L", ";", "50", "m", "in", "M", "for", "M", "-", "R", ".", "Insets", "show", "an", "enlarged", "vision", "of", "each", "picture", "to", "better", "depict", "localization", "of", "NANOS2", ",", "DCP1a", "and", "DDX6", ".", "S", "-", "V", ",", "Immunoprecipitation", "with", "an", "anti", "-", "FLAG", "antibody", "from", "E15", ".", "5", "male", "gonadal", "extracts", "of", "wild", "-", "type", "and", "the", "transgenic", "mouse", "line", "expressing", "FLAG", "-", "tagged", "DND1", "(", "S", ",", "T", ")", ",", "or", "with", "an", "anti", "-", "NANOS2", "antibody", "from", "E15", ".", "5", "male", "gonadal", "extracts", "of", "Dnd1flox", "/", "flox", "mice", "with", "or", "without", "Oct4PE", "-", "CreERT2", "(", "U", ",", "V", ")", ".", "Precipitates", "were", "analyzed", "by", "western", "blotting", "(", "S", ",", "U", ")", "or", "by", "RT", "-", "qPCR", "(", "T", ",", "V", ")", ".", "The", "RT", "-", "qPCR", "data", "are", "shown", "as", "average", "relative", "mRNA", "levels", "±", "SEs", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "W", ",", "X", ",", "Western", "blotting", "analyses", "of", "proteins", "in", "NANOS2", "-", "depleted", "(", "W", ")", "or", "DND1", "-", "depleted", "(", "X", ")", "testis", "extracts", "from", "E15", ".", "5", "embryos", ".", "Proteins", "were", "analyzed", "with", "the", "indicated", "antibodies", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A-L, Sections of testes from Dnd1flox/flox (A, B, C, G, H, I, M, N, O) and Dnd1flox/flox_Tg(Oct4PE-CreERT2) (D, E, F, J, K, L, P, Q, R) embryos were prepared at E16.5 and then immunostained with antibodies against NANOS2 (A, D) (green), DCP1a (G, J) (green), DDX6 (M, P) (green) and TRA98 (B, E, H, K, N, Q). DNA was labeled with DAPI (blue). Tamoxifen was administered at E13.5. Scale bars: 50 m in A for A−F; 50 m in G for G-L; 50 m in M for M-R. Insets show an enlarged vision of each picture to better depict localization of NANOS2, DCP1a and DDX6.S-V, Immunoprecipitation with an anti-FLAG antibody from E15.5 male gonadal extracts of wild-type and the transgenic mouse line expressing FLAG-tagged DND1 (S, T), or with an anti-NANOS2 antibody from E15.5 male gonadal extracts of Dnd1flox/flox mice with or without Oct4PE-CreERT2 (U, V). Precipitates were analyzed by western blotting (S, U) or by RT-qPCR (T, V). The RT-qPCR data are shown as average relative mRNA levels ± SEs (n=3).W, X, Western blotting analyses of proteins in NANOS2-depleted (W) or DND1-depleted (X) testis extracts from E15.5 embryos. Proteins were analyzed with the indicated antibodies."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "Whole", "chromosomes", "imaged", "by", "conventional", "TEM", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", ":", "1µmB", ".", "Slice", "from", "a", "large", "tomographic", "volume", ";", "part", "of", "the", "carbon", "film", "surrounding", "a", "hole", "with", "vitrified", "ice", "containing", "the", "plates", "is", "indicated", "with", "an", "asterisk", ";", "the", "inset", "illustrates", "that", "the", "slice", "of", "a", "plate", "corresponds", "to", "a", "line", "in", "the", "x", "-", "y", "plane", "(", "perpendicular", "to", "the", "direction", "of", "the", "electron", "beam", ")", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", ":", "200", "nmC", "-", "G", "Slices", "from", "different", "tomograms", "and", "the", "corresponding", "3D", "segmentations", "showing", "plates", "with", "different", "sizes", "and", "shapes", ".", "In", "addition", "to", "a", "typical", "slice", "through", "the", "x", "-", "y", "plane", "(", "yellow", ")", ",", "two", "slices", "through", "the", "x", "-", "z", "(", "red", ")", "and", "y", "-", "z", "(", "green", ")", "planes", "(", "orthogonal", "to", "the", "x", "-", "y", "plane", ")", "are", "shown", "in", "(", "C", ")", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", ":", "200", "nm", "D", ")", ",", "100", "nm", "(", "E", "-", "G", ")", ",", "50", "nm", "(", "C", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. Whole chromosomes imaged by conventional TEM. Data information: Scale bars: 1µmB. Slice from a large tomographic volume; part of the carbon film surrounding a hole with vitrified ice containing the plates is indicated with an asterisk; the inset illustrates that the slice of a plate corresponds to a line in the x-y plane (perpendicular to the direction of the electron beam). Data information: Scale bars: 200 nmC-G Slices from different tomograms and the corresponding 3D segmentations showing plates with different sizes and shapes. In addition to a typical slice through the x-y plane (yellow), two slices through the x-z (red) and y-z (green) planes (orthogonal to the x-y plane) are shown in (C). Data information: Scale bars: 200 nm D), 100 nm (E-G), 50 nm (C)."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Nucleosomes", "(", "N", ")", "decorating", "a", "relaxed", "plate", "(", "P1", ")", ";", "insets", "in", "the", "upper", "right", "show", "additional", "examples", ".", "Nucleosomes", "are", "not", "visible", "as", "individual", "units", "in", "typical", "compact", "plates", "(", "P2", ")", ".", "Short", "compact", "interdigitated", "solenoids", "are", "shown", "in", "the", "main", "image", "(", "S", ")", "and", "in", "the", "bottom", "-", "left", "insets", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", ":", "50", "nmB", "-", "E", "Slice", "(", "B", ")", "and", "segmentations", "in", "three", "different", "orientations", "(", "C", ")", "of", "a", "large", "relaxed", "plate", "decorated", "with", "many", "nucleosomes", "on", "its", "right", "side", ".", "Slice", "(", "D", ")", "and", "segmentation", "(", "E", ")", "of", "a", "relaxed", "plate", "forming", "a", "tube", "decorated", "with", "nucleosomes", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", ":", "50", "nm", "insets", ",", "B", "-", "E", ")"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Nucleosomes (N) decorating a relaxed plate (P1); insets in the upper right show additional examples. Nucleosomes are not visible as individual units in typical compact plates (P2). Short compact interdigitated solenoids are shown in the main image (S) and in the bottom-left insets. Data information: Scale bars: 50 nmB-E Slice (B) and segmentations in three different orientations (C) of a large relaxed plate decorated with many nucleosomes on its right side. Slice (D) and segmentation (E) of a relaxed plate forming a tube decorated with nucleosomes. Data information: Scale bars: 50 nm insets, B-E)"}
{"words": ["Figure", "3A", ",", "B", "Plates", "with", "several", "layers", "that", "are", "not", "closely", "appressed", ".", "C", "-", "E", "Large", "multilayer", "plates", "having", "the", "size", "of", "human", "metaphase", "chromatids", "[", "~", "0", ".", "6", "µm", "diameter", "]", "(", "C", ")", ";", "the", "inset", "schematically", "shows", "the", "perpendicular", "orientation", "of", "chromatin", "layers", "with", "respect", "to", "the", "chromatid", "axes", "proposed", "in", "the", "thin", "-", "plate", "model", "In", "other", "slices", "(", "D", ",", "E", ")", ",", "the", "multilayer", "structures", "shown", "in", "(", "C", ")", "are", "more", "compact", "and", "the", "individual", "layers", "are", "not", "visible", "as", "separate", "elements", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", ":", "50", "nm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A,B Plates with several layers that are not closely appressed. C-E Large multilayer plates having the size of human metaphase chromatids [~0.6 µm diameter ] (C); the inset schematically shows the perpendicular orientation of chromatin layers with respect to the chromatid axes proposed in the thin-plate model In other slices (D,E), the multilayer structures shown in (C) are more compact and the individual layers are not visible as separate elements. Data information: Scale bars: 50 nm. "}
{"words": ["Figure", "4A", "-", "C", "Slices", "showing", "lateral", "association", "between", "two", "plates", "and", "the", "corresponding", "3D", "segmentations", ".", "D", ".", "Edge", "-", "to", "-", "edge", "interactions", "form", "cylindrical", "structures", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", ":", "50", "nm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A-C Slices showing lateral association between two plates and the corresponding 3D segmentations. D. Edge-to-edge interactions form cylindrical structures. Data information: Scale bars: 50 nm. "}
{"words": ["Figure", "5A", "-", "C", "The", "cation", "concentrations", "used", "are", "indicated", "for", "each", "experiment", ";", "AU", ",", "arbitrary", "units", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A-C The cation concentrations used are indicated for each experiment; AU, arbitrary units."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "Spike", "-", "binding", "antibodies", "in", "serum", ".", "Binding", "by", "antibodies", "of", "classes", "M", ",", "G", ",", "and", "A", "is", "detected", "with", "secondary", "antibodies", "conjugated", "to", "different", "fluorochromes", ",", "and", "the", "results", "are", "shown", "on", "the", "left", ",", "middle", ",", "and", "right", "plots", ",", "respectively", ".", "Binding", "(", "geometric", "mean", "fluorescence", "intensity", "-", "GMFI", "-", "of", "corresponding", "secondary", "antibody", ")", "to", "TE", "cells", "expressing", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "spike", "protein", "is", "plotted", "on", "the", "vertical", "axis", ",", "and", "binding", "to", "untransfected", "cells", "on", "the", "horizontal", "axis", ".", "Each", "point", "represents", "a", "value", "from", "one", "donor", ".", "Samples", "from", "donors", "with", "no", "known", "exposure", "to", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "antigens", "(", "n", "=", "86", ")", "are", "plotted", "with", "blue", "circles", ",", "recently", "infected", "donors", "(", "n", "=", "34", ")", "with", "red", "circles", ",", "and", "vaccinated", "donors", "(", "n", "=", "14", ")", "with", "green", "diamonds", ".", "Red", "circles", "with", "black", "triangles", "correspond", "to", "donors", "from", "whose", "B", "cells", "monoclonal", "antibodies", "were", "isolated", "(", "n", "=", "5", ",", "P", "values", "are", "derived", "from", "a", "two", "-", "way", "analysis", "of", "variance", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "test", "to", "compare", "the", "specific", "binding", ",", "i", ".", "e", ".", ",", "(", "binding", "to", "spike", "-", "expressing", "cells", ")", "/", "(", "binding", "to", "untransfected", "cells", ")", "between", "conditions", "(", "convalescent", "or", "vaccinated", "against", "unexposed", ")", "within", "each", "antibody", "class", ".", "The", "experiment", "was", "independently", "repeated", "three", "times", ",", "and", "results", "shown", "come", "from", "the", "third", "replicate", ".", "B", ".", "Change", "in", "antibody", "binding", "following", "vaccination", "against", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", ".", "Binding", "of", "antibodies", "from", "sera", "assessed", "in", "the", "experiment", "shown", "in", "(", "A", ")", ",", "is", "shown", "for", "two", "samples", "of", "serum", "from", "each", "of", "7", "donors", ".", "Data", "are", "plotted", "as", "in", "(", "A", ")", "with", "binding", "to", "spike", "-", "expressing", "cells", "on", "the", "vertical", "axis", ",", "and", "to", "untransfected", "cells", "on", "the", "horizontal", ",", "using", "blue", "symbols", "for", "samples", "from", "before", "vaccination", ",", "and", "red", "symbols", "for", "samples", "from", "15", "-", "29", "days", "after", "the", "first", "vaccination", "(", "but", "before", "any", "second", "vaccination", ")", ".", "Black", "lines", "connect", "points", "corresponding", "to", "pre", "/", "post", "pairs", "of", "samples", "from", "each", "donor", ".", "Left", "plot", "shows", "results", "for", "IgM", "and", "right", "plot", "for", "IgG", ".", "C", ".", "Comparison", "of", "post", "-", "vaccination", "increase", "in", "binding", "to", "untransfected", "cells", "between", "IgG", "and", "IgM", ".", "The", "increase", "in", "binding", "to", "untransfected", "TE", "0", "cells", "between", "pre", "-", "and", "post", "-", "vaccination", "samples", "is", "shown", "on", "the", "left", "with", "blue", "symbols", "for", "IgG", "and", "on", "the", "right", "with", "black", "symbols", "for", "IgM", ".", "The", "horizontal", "line", "at", "y", "=", "0", "is", "the", "expected", "result", "when", "no", "increased", "binding", "is", "observed", ".", "P", "value", "is", "derived", "from", "a", "two", "-", "tailed", ",", "Wilcoxon", "matched", "pairs", "signed", "rank", "test", ".", "D", ".", "Comparison", "of", "spike", "-", "specific", "IgM", ",", "as", "measured", "by", "flow", "cytometry", "or", "ELISA", ".", "The", "left", "two", "\"", "FC", "\"", "are", "the", "results", "of", "flow", "cytometry", ",", "and", "the", "left", "verical", "axis", "shows", "the", "ratio", "of", "serum", "IgM", "binding", "to", "spike", "-", "expressing", "cells", ",", "vs", "binding", "to", "non", "-", "expressing", "control", "cells", ",", "as", "plottted", "in", "A", ".", "The", "right", "two", "columns", "show", "spike", "-", "RBD", "-", "specific", "IgM", "as", "measured", "by", "an", "IgM", "-", "capture", "ELISA", ",", "and", "the", "right", "vertical", "axis", "shows", "the", "optical", "densities", "(", "OD", ")", ".", "P", "values", "are", "calculated", "by", "two", "-", "way", "analysis", "of", "variance", ",", "followed", "by", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "The", "entire", "experiment", "was", "repeated", "three", "times", ",", "and", "the", "data", "shown", "are", "derived", "from", "the", "third", "replicate", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. Spike-binding antibodies in serum. Binding by antibodies of classes M, G, and A is detected with secondary antibodies conjugated to different fluorochromes, and the results are shown on the left, middle, and right plots, respectively. Binding (geometric mean fluorescence intensity - GMFI- of corresponding secondary antibody) to TE cells expressing SARS-CoV-2 spike protein is plotted on the vertical axis, and binding to untransfected cells on the horizontal axis. Each point represents a value from one donor. Samples from donors with no known exposure to SARS-CoV-2 antigens (n = 86) are plotted with blue circles, recently infected donors (n = 34) with red circles, and vaccinated donors (n = 14) with green diamonds. Red circles with black triangles correspond to donors from whose B cells monoclonal antibodies were isolated (n = 5, P values are derived from a two-way analysis of variance followed by Tukey's test to compare the specific binding, i.e., (binding to spike-expressing cells)/(binding to untransfected cells) between conditions (convalescent or vaccinated against unexposed) within each antibody class. The experiment was independently repeated three times, and results shown come from the third replicate.B. Change in antibody binding following vaccination against SARS-CoV-2. Binding of antibodies from sera assessed in the experiment shown in (A), is shown for two samples of serum from each of 7 donors. Data are plotted as in (A) with binding to spike-expressing cells on the vertical axis, and to untransfected cells on the horizontal, using blue symbols for samples from before vaccination, and red symbols for samples from 15-29 days after the first vaccination (but before any second vaccination). Black lines connect points corresponding to pre/post pairs of samples from each donor. Left plot shows results for IgM and right plot for IgG. C. Comparison of post-vaccination increase in binding to untransfected cells between IgG and IgM. The increase in binding to untransfected TE 0 cells between pre- and post-vaccination samples is shown on the left with blue symbols for IgG and on the right with black symbols for IgM. The horizontal line at y=0 is the expected result when no increased binding is observed. P value is derived from a two-tailed, Wilcoxon matched pairs signed rank test.D. Comparison of spike-specific IgM, as measured by flow cytometry or ELISA. The left two \"FC\" are the results of flow cytometry, and the left verical axis shows the ratio of serum IgM binding to spike-expressing cells, vs binding to non-expressing control cells, as plottted in A. The right two columns show spike-RBD-specific IgM as measured by an IgM-capture ELISA, and the right vertical axis shows the optical densities (OD). P values are calculated by two-way analysis of variance, followed by Sidak's multiple comparisons test. The entire experiment was repeated three times, and the data shown are derived from the third replicate."}
{"words": ["Figure", "2Phenotypes", "of", "blood", "B", "cells", ".", "B", "cells", "from", "15", "ml", "of", "peripheral", "blood", "from", "each", "of", "three", "convalescent", "donors", "were", "isolated", "by", "negative", "selection", "with", "magnetic", "beads", ",", "exposed", "to", "adherent", "cells", "expressing", "spike", "-", "mCherry", "for", "3", "hours", ",", "then", "retrieved", "and", "labeled", "with", "fluorescent", "antibodies", "and", "measured", "by", "flow", "cytometry", ".", "(", "A", ")", "UMAP", "algorithm", "(", "5000", "randomly", "selected", "cells", "/", "sample", ")", "was", "used", "to", "depict", "the", "major", "B", "cell", "subsets", "clustered", "according", "to", "marker", "expression", ".", "Phenotypes", "of", "blood", "B", "cells", ".", "B", "cells", "from", "15", "ml", "of", "peripheral", "blood", "from", "each", "of", "three", "convalescent", "donors", "were", "isolated", "by", "negative", "selection", "with", "magnetic", "beads", ",", "exposed", "to", "adherent", "cells", "expressing", "spike", "-", "mCherry", "for", "3", "hours", ",", "then", "retrieved", "and", "labeled", "with", "fluorescent", "antibodies", "and", "measured", "by", "flow", "cytometry", ".", "FlowSOM", "-", "based", "B", "cell", "subpopulations", "are", "overlaid", "as", "a", "color", "dimension", ",", "and", "the", "colors", "of", "the", "clusters", "are", "shown", "on", "the", "left", "of", "heatmap", "(", "B", ")", ".", "B", ".", "Heatmap", "showing", "mean", "population", "expression", "levels", "of", "markers", "used", "for", "UMAP", "visualization", "and", "FlowSOM", "-", "clustering", ".", "Colors", "shown", "in", "the", "legend", "on", "the", "left", "are", "also", "used", "in", "the", "UMAP", "representation", "in", "(", "A", ")", ".", "Phenotypes", "of", "blood", "B", "cells", ".", "B", "cells", "from", "15", "ml", "of", "peripheral", "blood", "from", "each", "of", "three", "convalescent", "donors", "were", "isolated", "by", "negative", "selection", "with", "magnetic", "beads", ",", "exposed", "to", "adherent", "cells", "expressing", "spike", "-", "mCherry", "for", "3", "hours", ",", "then", "retrieved", "and", "labeled", "with", "fluorescent", "antibodies", "and", "measured", "by", "flow", "cytometry", ".", "C", ".", "Gating", "strategy", "to", "define", "CD69", "-", "high", ",", "mCherry", "-", "high", ",", "spike", "-", "capturing", "B", "cells", "(", "i", ".", "e", ".", ",", "membrane", "antigen", "capture", "activated", "cells", ",", "MACAC", ",", "red", "box", ")", ".", "Dot", "plot", "shows", "CD69", "and", "mCherry", "fluorescence", "for", "B", "cells", "from", "one", "of", "three", "donors", "gated", "by", "forward", "and", "side", "scatter", ",", "and", "negative", "for", "the", "dye", "used", "to", "mark", "the", "antigen", "donor", "cells", ".", "Phenotypes", "of", "blood", "B", "cells", ".", "B", "cells", "from", "15", "ml", "of", "peripheral", "blood", "from", "each", "of", "three", "convalescent", "donors", "were", "isolated", "by", "negative", "selection", "with", "magnetic", "beads", ",", "exposed", "to", "adherent", "cells", "expressing", "spike", "-", "mCherry", "for", "3", "hours", ",", "then", "retrieved", "and", "labeled", "with", "fluorescent", "antibodies", "and", "measured", "by", "flow", "cytometry", ".", "D", ".", "Relative", "fractions", "of", "different", "B", "cell", "subpopulations", ",", "from", "three", "donors", ",", "as", "shown", "in", "A", "-", "B", ",", "in", "all", "B", "cells", "compared", "to", "within", "MACAC", "B", "cells", ".", "P", "values", "are", "based", "on", "two", "-", "tailed", "t", "-", "tests", "between", "the", "groups", ".", "Correlation", "coefficients", "(", "r", ")", "were", "calculated", "from", "the", "z", "-", "statistic", "of", "the", "Wilcoxon", "-", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "A", "black", "horizontal", "line", "represents", "the", "median", ".", "Boxplots", "represent", "the", "interquartile", "range", "(", "IQR", ")", ".", "Whiskers", "extend", "to", "the", "farthest", "data", "point", "within", "a", "maximum", "of", "1", ".", "5", "×", "IQR", ".", "Every", "point", "represents", "one", "donor", ".", "E", ".", "Gating", "strategy", "in", "MACAC", "sorting", ".", "Single", "cells", "are", "selected", "based", "on", "scatter", ",", "antigen", "-", "expressing", "TE", "spike", "-", "mCherry", "cells", "excluded", "on", "Cell", "Trace", "Violet", "label", ",", "and", "the", "spike", "-", "capturing", "(", "mCherry", "-", "high", ")", ",", "activated", "(", "CD69", "-", "high", ")", "B", "cells", "(", "population", "labeled", "\"", "MACAC", "\"", "in", "red", "on", "the", "right", "-", "most", "plot", ")", "are", "sorted", ".", "The", "middle", "plot", "shows", "B", "cells", "that", "did", "not", "adhere", "to", "the", "TE", "-", "spike", "-", "cherry", "antigen", "-", "expressing", "cells", "(", "putatively", "antigen", "-", "irrelevant", ")", ",", "and", "the", "right", "plot", "those", "that", "did", "(", "putatively", "antigen", "-", "recognizing", ")", ".", "Plots", "show", "data", "from", "one", "of", "five", "convalescent", "donors", "Cells", "in", "the", "MACAC", "gate", "were", "singly", "distributed", "into", "wells", "of", "384", "-", "well", "plates", "and", "cultured", "for", "9", "days", "with", "IL", "-", "21", "and", "CD40L", ",", "and", "then", "the", "single", "well", "culture", "supernatants", "were", "screened", "for", "anti", "-", "spike", "antibody", "binding", "and", "virus", "neutralization", "as", "described", "below", ".", "F", ".", "Results", "of", "single", "well", "supernatant", "screening", "for", "antibody", "binding", "to", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "spike", "protein", ".", "Results", "from", "3266", "wells", "from", "5", "donors", "are", "shown", "for", "IgM", "(", "left", ")", ",", "IgG", "(", "middle", ")", ",", "and", "IgA", "(", "right", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Phenotypes of blood B cells. B cells from 15 ml of peripheral blood from each of three convalescent donors were isolated by negative selection with magnetic beads, exposed to adherent cells expressing spike-mCherry for 3 hours, then retrieved and labeled with fluorescent antibodies and measured by flow cytometry. (A) UMAP algorithm (5000 randomly selected cells/sample) was used to depict the major B cell subsets clustered according to marker expression.Phenotypes of blood B cells. B cells from 15 ml of peripheral blood from each of three convalescent donors were isolated by negative selection with magnetic beads, exposed to adherent cells expressing spike-mCherry for 3 hours, then retrieved and labeled with fluorescent antibodies and measured by flow cytometry. FlowSOM-based B cell subpopulations are overlaid as a color dimension, and the colors of the clusters are shown on the left of heatmap (B). B. Heatmap showing mean population expression levels of markers used for UMAP visualization and FlowSOM-clustering. Colors shown in the legend on the left are also used in the UMAP representation in (A).Phenotypes of blood B cells. B cells from 15 ml of peripheral blood from each of three convalescent donors were isolated by negative selection with magnetic beads, exposed to adherent cells expressing spike-mCherry for 3 hours, then retrieved and labeled with fluorescent antibodies and measured by flow cytometry. C. Gating strategy to define CD69-high, mCherry-high, spike-capturing B cells (i.e., membrane antigen capture activated cells, MACAC, red box). Dot plot shows CD69 and mCherry fluorescence for B cells from one of three donors gated by forward and side scatter, and negative for the dye used to mark the antigen donor cells.Phenotypes of blood B cells. B cells from 15 ml of peripheral blood from each of three convalescent donors were isolated by negative selection with magnetic beads, exposed to adherent cells expressing spike-mCherry for 3 hours, then retrieved and labeled with fluorescent antibodies and measured by flow cytometry. D. Relative fractions of different B cell subpopulations, from three donors, as shown in A-B, in all B cells compared to within MACAC B cells. P values are based on two-tailed t-tests between the groups. Correlation coefficients (r) were calculated from the z-statistic of the Wilcoxon-Mann-Whitney test. A black horizontal line represents the median. Boxplots represent the interquartile range (IQR). Whiskers extend to the farthest data point within a maximum of 1.5× IQR. Every point represents one donor.E. Gating strategy in MACAC sorting. Single cells are selected based on scatter, antigen-expressing TE spike-mCherry cells excluded on Cell Trace Violet label, and the spike-capturing (mCherry-high), activated (CD69-high) B cells (population labeled \"MACAC\" in red on the right-most plot) are sorted. The middle plot shows B cells that did not adhere to the TE-spike-cherry antigen-expressing cells (putatively antigen-irrelevant), and the right plot those that did (putatively antigen-recognizing). Plots show data from one of five convalescent donors Cells in the MACAC gate were singly distributed into wells of 384-well plates and cultured for 9 days with IL-21 and CD40L, and then the single well culture supernatants were screened for anti-spike antibody binding and virus neutralization as described below. F. Results of single well supernatant screening for antibody binding to SARS-CoV-2 spike protein. Results from 3266 wells from 5 donors are shown for IgM (left), IgG (middle), and IgA (right)."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "Example", "of", "neutralization", "of", "chimeric", "VSV", "*", "∆", "G", "-", "S", "∆", "21", "by", "donor", "-", "derived", "IgG", ",", "IgM", "and", "IgA", "antibodies", ".", "100", "pfu", "VSV", "*", "∆", "G", "-", "S", "∆", "21", "was", "mixed", "with", "antibody", "at", "specified", "concentrations", "for", "1", "hour", ",", "then", "added", "to", "Vero", "cells", ".", "After", "24", "hours", ",", "the", "cells", "were", "imaged", ",", "and", "infected", "wells", "identified", "by", "GFP", "expression", ",", "here", "pseudocolored", "with", "GFP", "-", "bright", "shown", "in", "black", "against", "a", "white", "background", ".", "Virus", "neutralization", "is", "manifested", "as", "reduction", "in", "GFP", ".", "Images", "shown", "here", "come", "from", "wells", "infected", "with", "virus", "alone", "(", "left", "column", ")", ",", "virus", "pre", "-", "incubated", "with", "the", "moderately", "neutralizing", "IgG", "1I12", "(", "second", "and", "third", "columns", ")", ",", "the", "potent", "neutralizing", "IgM", "2J17", "(", "fourth", "and", "fitfh", "columns", ")", ",", "or", "with", "the", "moderately", "potent", "IgA", "1B17", "(", "sixth", "and", "seventh", "columns", ")", ".", "Each", "antibody", "was", "tested", "in", "the", "range", "of", "concentrations", "shown", "to", "the", "left", "of", "the", "images", ",", "from", "10000", "down", "to", "0", ".", "1", "ng", "/", "ml", ".", "B", ".", "Neutralization", "curves", "from", "each", "of", "the", "cloned", "antibodies", "using", "plaque", "reduction", "assay", "of", "VSV", "*", "∆", "G", "-", "S", "∆", "21", ".", "The", "horizontal", "axis", "shows", "the", "serial", "dilution", "of", "the", "antibodies", ".", "The", "vertical", "axis", "shows", ",", "for", "each", "well", "exposed", "to", "antibody", ",", "the", "ratio", "of", "infected", "cell", "plaque", "count", "to", "the", "corresponding", "value", "from", "control", "wells", "without", "antibody", ".", "Each", "point", "is", "the", "mean", "of", "9", "values", "pooled", "from", "three", "independent", "experiments", "each", "with", "triplicate", "wells", ".", "Error", "bars", "indicate", "standard", "error", ".", "Antibodies", "tested", "are", "listed", "below", "the", "figure", "and", "include", "3", "IgM", "(", "black", "lines", "and", "symbols", ")", ",", "11", "IgG", "(", "blue", "lines", "and", "symbols", ")", "and", "6", "IgA", "(", "red", "lines", "and", "symbols", ")", ".", "C", ".", "Quantification", "of", "results", "from", "(", "B", ")", ".", "Area", "under", "the", "curve", "is", "plotted", "for", "every", "antibody", "and", "compared", "between", "different", "antibody", "classes", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "test", "(", "mean", "from", "three", "biological", "replicates", "and", "SEM", ")", ".", "Area", "under", "the", "curve", "was", "chosen", "as", "a", "measure", "of", "neutralization", "capacity", ",", "rather", "than", "ND50", "(", "as", "used", "in", "subsequent", "figures", ")", ",", "because", "some", "antibodies", "included", "in", "this", "figure", "exhibited", "no", "neutralization", "at", "the", "concentrations", "tested", ",", "precluding", "the", "calculation", "of", "an", "ND50", ".", "E", ".", "Flow", "cytometric", "determination", "of", "antibody", "-", "dependent", "complement", "deposition", "on", "cells", ".", "Cells", "expressing", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "spike", "protein", "and", "untransfected", "control", "cells", "were", "incubated", "with", "various", "concentrations", "of", "antibody", "in", "the", "presence", "of", "fresh", "human", "serum", "(", "from", "a", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "unexposed", "donor", ")", ".", "Activation", "of", "the", "complement", "cascade", "was", "measured", "by", "flow", "cytometric", "assessment", "of", "complement", "component", "C3b", "deposition", "on", "the", "surface", "of", "the", "cells", ".", "Results", "for", "the", "3", "IgM", ",", "(", "black", ")", ",", "11", "IgG", ",", "(", "blue", ")", ",", "and", "6", "IgA", "antibodies", "(", "red", ")", "are", "shown", ".", "P", "values", "were", "calculated", "by", "two", "-", "way", "analysis", "of", "variance", ",", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "test", ".", "F", ".", "Influence", "of", "complement", "on", "virus", "neutralization", ".", "A", "plaque", "reduction", "neutralization", "assay", "like", "that", "shown", "in", "Fig", "3A", "-", "C", "was", "conducted", "with", "IgM", "2J17", "in", "the", "presence", "of", "either", "fresh", ",", "complement", "-", "sufficient", "human", "serum", ",", "or", "heat", "inactivated", "serum", ".", "The", "concentration", "of", "2J17", "is", "shown", "on", "the", "horizontal", "axis", ".", "The", "vertical", "axis", "shows", ",", "for", "each", "well", "exposed", "to", "antibody", ",", "the", "ratio", "of", "infected", "cell", "plaque", "count", "to", "the", "corresponding", "value", "from", "control", "wells", "with", "serum", "(", "either", "fresh", "or", "inactivated", ")", "but", "without", "antibody", ".", "The", "points", "plotted", "with", "filled", "red", "symbols", "correspond", "to", "the", "condition", "with", "heat", "inactivated", "serum", ",", "and", "the", "open", "blue", "symbols", "results", "with", "fresh", "serum", ".", "Each", "symbol", "corresponds", "to", "the", "mean", "of", "nine", "wells", "pooled", "from", "three", "independent", "experiments", ",", "each", "with", "triplicate", "wells", ".", "Error", "bars", "correspond", "to", "standard", "error", ".", "P", "value", "was", "calculated", "using", "a", "paired", ",", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. Example of neutralization of chimeric VSV*∆G-S∆21 by donor-derived IgG, IgM and IgA antibodies. 100 pfu VSV*∆G-S∆21 was mixed with antibody at specified concentrations for 1 hour, then added to Vero cells. After 24 hours, the cells were imaged, and infected wells identified by GFP expression, here pseudocolored with GFP-bright shown in black against a white background. Virus neutralization is manifested as reduction in GFP. Images shown here come from wells infected with virus alone (left column), virus pre-incubated with the moderately neutralizing IgG 1I12 (second and third columns), the potent neutralizing IgM 2J17 (fourth and fitfh columns), or with the moderately potent IgA 1B17 (sixth and seventh columns). Each antibody was tested in the range of concentrations shown to the left of the images, from 10000 down to 0.1 ng/ml.B. Neutralization curves from each of the cloned antibodies using plaque reduction assay of VSV*∆G-S∆21. The horizontal axis shows the serial dilution of the antibodies. The vertical axis shows, for each well exposed to antibody, the ratio of infected cell plaque count to the corresponding value from control wells without antibody. Each point is the mean of 9 values pooled from three independent experiments each with triplicate wells. Error bars indicate standard error. Antibodies tested are listed below the figure and include 3 IgM (black lines and symbols), 11 IgG (blue lines and symbols) and 6 IgA (red lines and symbols).C. Quantification of results from (B). Area under the curve is plotted for every antibody and compared between different antibody classes by one-way ANOVA followed by Tukey's test (mean from three biological replicates and SEM). Area under the curve was chosen as a measure of neutralization capacity, rather than ND50 (as used in subsequent figures), because some antibodies included in this figure exhibited no neutralization at the concentrations tested, precluding the calculation of an ND50.E. Flow cytometric determination of antibody-dependent complement deposition on cells. Cells expressing SARS-CoV-2 spike protein and untransfected control cells were incubated with various concentrations of antibody in the presence of fresh human serum (from a SARS-CoV-2 unexposed donor). Activation of the complement cascade was measured by flow cytometric assessment of complement component C3b deposition on the surface of the cells. Results for the 3 IgM, (black), 11 IgG, (blue), and 6 IgA antibodies (red) are shown. P values were calculated by two-way analysis of variance, followed by Tukey's test.F. Influence of complement on virus neutralization. A plaque reduction neutralization assay like that shown in Fig 3A-C was conducted with IgM 2J17 in the presence of either fresh, complement-sufficient human serum, or heat inactivated serum. The concentration of 2J17 is shown on the horizontal axis. The vertical axis shows, for each well exposed to antibody, the ratio of infected cell plaque count to the corresponding value from control wells with serum (either fresh or inactivated) but without antibody. The points plotted with filled red symbols correspond to the condition with heat inactivated serum, and the open blue symbols results with fresh serum. Each symbol corresponds to the mean of nine wells pooled from three independent experiments, each with triplicate wells. Error bars correspond to standard error. P value was calculated using a paired, two-tailed t-test."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "The", "effect", "of", "competition", "on", "concentration", "versus", "binding", "curves", "of", "three", "spike", "-", "specific", ",", "class", "-", "switched", "antibodies", ".", "Antibodies", "were", "expressed", "either", "as", "IgM", ",", "as", "originally", "isolated", "(", "black", "symbols", "and", "lines", ")", ",", "or", "artificially", "switched", "to", "IgG1", "(", "blue", "lines", "and", "symbols", ")", ".", "For", "each", "antibody", ",", "identified", "by", "name", "at", "the", "top", "of", "each", "plot", ",", "the", "binding", "of", "the", "antibody", "alone", "(", "\"", "alone", "\"", ",", "open", "symbols", ")", ",", "or", "the", "competitive", "binding", "of", "the", "antibody", "in", "a", "mixture", "of", "IgM", "and", "IgG1", "(", "\"", "compet", ".", "\"", ",", "filled", "symbols", ")", "is", "shown", ".", "In", "the", "competition", "scenario", ",", "each", "of", "the", "two", "classes", "of", "the", "antibody", "were", "added", "together", "at", "the", "concentration", "shown", "on", "the", "horizontal", "axis", ".", "The", "vertical", "axis", "shows", "the", "ratio", "of", "geometric", "mean", "fluorescence", "of", "human", "IgM", ",", "or", "IgG", "on", "spike", "-", "expressing", "cells", "divided", "by", "the", "corresponding", "signal", "on", "spike", "-", "non", "-", "expressing", "control", "cells", ".", "Each", "point", "shows", "the", "mean", "of", "3", "values", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "show", "standard", "error", ".", "P", "value", "was", "calculated", "by", "comparing", "the", "area", "under", "the", "curve", "of", "each", "antibody", "class", "in", "the", "\"", "alone", "\"", "condition", "with", "the", "binding", "of", "the", "\"", "competition", "\"", "condition", "by", "paired", ",", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ".", "B", ".", "Virus", "neutralization", "by", "antibodies", "expressed", "as", "IgM", "or", "IgG1", ".", "A", "plaque", "reduction", "neutralization", "assay", "as", "described", "in", "Fig", "3A", "-", "B", "was", "used", "to", "measure", "neutralization", "by", "the", "three", ",", "donor", "-", "derived", "IgM", "(", "black", "lines", "and", "open", "symbols", ")", "and", "their", "artificially", "class", "-", "switched", "IgG1", "equivalents", "(", "blue", "lines", "and", "filled", "symbols", ")", ".", "Horizontal", "axis", "shows", "the", "antibody", "concentration", "and", "the", "vertical", "axis", "shows", "the", "level", "of", "infection", "expressed", "as", "percentage", "GFP", "expression", "compared", "to", "control", "wells", "with", "no", "antibody", "added", ".", "Each", "point", "shows", "the", "mean", "of", "nine", "replicate", "values", "pooled", "from", "three", "independent", "experiments", ",", "each", "with", "triplicate", "wells", ".", "Error", "bars", "show", "standard", "error", ".", "C", ".", "Comparison", "of", "virus", "neutralization", "by", "antibodies", "expressed", "as", "IgM", "or", "IgG1", "shown", "in", "B", ".", "Area", "under", "the", "curve", "was", "calculated", "from", "each", "of", "the", "three", "independently", "performed", "experiments", ".", "P", "was", "calculated", "by", "paired", ",", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ".", "Virus", "neutralization", "by", "antibodies", "artificially", "class", "switched", "from", "IgA", "or", "IgG1", "to", "IgM", ".", "A", "plaque", "reduction", "neutralization", "assay", "as", "described", "in", "Fig", "3A", "-", "B", "was", "used", "to", "measure", "neutralization", "by", "the", "two", "donor", "-", "derived", "IgA", "(", "pink", "and", "light", "blue", "lines", ")", "and", "one", "donor", "-", "derived", "IgG", "(", "bordeaux", "lines", ")", ".", "The", "antibodies", "expressed", "in", "their", "original", "classes", "(", "IgA", "or", "IgG", ")", "are", "plotted", "with", "filled", "symbols", "of", "the", "same", "colors", "as", "the", "lines", ",", "and", "their", "artificially", "class", "-", "switched", "IgM", "equivalents", "are", "plotted", "with", "open", "symbols", ".", "Horizontal", "axis", "shows", "the", "antibody", "concentration", "and", "the", "vertical", "axis", "shows", "the", "level", "of", "infection", "expressed", "as", "percentage", "GFP", "expression", "compared", "to", "control", "wells", "with", "no", "antibody", "added", ".", "Each", "point", "shows", "the", "mean", "of", "nine", "replicate", "values", "pooled", "from", "three", "independent", "experiments", ",", "each", "with", "triplicate", "wells", ".", "ND50", "was", "calculated", "from", "each", "of", "the", "three", "independently", "performed", "experiments", ".", "P", "was", "calculated", "by", "paired", ",", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", "for", "each", "antibody", "pair", ".", "Affinities", "of", "donor", "-", "derived", "spike", "-", "binding", "IgG1", "(", "n", "=", "8", ")", "and", "donor", "-", "derived", "IgM", "(", "n", "=", "3", ")", "expressed", "as", "IgG1", ",", "measured", "by", "surface", "plasmon", "resonance", ".", "P", "value", "was", "calculated", "by", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. The effect of competition on concentration versus binding curves of three spike-specific, class-switched antibodies. Antibodies were expressed either as IgM, as originally isolated (black symbols and lines), or artificially switched to IgG1 (blue lines and symbols). For each antibody, identified by name at the top of each plot, the binding of the antibody alone (\"alone\", open symbols), or the competitive binding of the antibody in a mixture of IgM and IgG1 (\"compet.\", filled symbols) is shown. In the competition scenario, each of the two classes of the antibody were added together at the concentration shown on the horizontal axis. The vertical axis shows the ratio of geometric mean fluorescence of human IgM, or IgG on spike-expressing cells divided by the corresponding signal on spike-non-expressing control cells. Each point shows the mean of 3 values from three independent experiments. Error bars show standard error. P value was calculated by comparing the area under the curve of each antibody class in the \"alone\" condition with the binding of the \"competition\" condition by paired, two-tailed t-test.B. Virus neutralization by antibodies expressed as IgM or IgG1. A plaque reduction neutralization assay as described in Fig 3A-B was used to measure neutralization by the three, donor-derived IgM (black lines and open symbols) and their artificially class-switched IgG1 equivalents (blue lines and filled symbols). Horizontal axis shows the antibody concentration and the vertical axis shows the level of infection expressed as percentage GFP expression compared to control wells with no antibody added. Each point shows the mean of nine replicate values pooled from three independent experiments, each with triplicate wells. Error bars show standard error. C. Comparison of virus neutralization by antibodies expressed as IgM or IgG1 shown in B. Area under the curve was calculated from each of the three independently performed experiments. P was calculated by paired, two-tailed t-test.Virus neutralization by antibodies artificially class switched from IgA or IgG1 to IgM. A plaque reduction neutralization assay as described in Fig 3A-B was used to measure neutralization by the two donor-derived IgA (pink and light blue lines) and one donor-derived IgG (bordeaux lines). The antibodies expressed in their original classes (IgA or IgG) are plotted with filled symbols of the same colors as the lines, and their artificially class-switched IgM equivalents are plotted with open symbols. Horizontal axis shows the antibody concentration and the vertical axis shows the level of infection expressed as percentage GFP expression compared to control wells with no antibody added. Each point shows the mean of nine replicate values pooled from three independent experiments, each with triplicate wells. ND50 was calculated from each of the three independently performed experiments. P was calculated by paired, two-tailed t-test for each antibody pair.Affinities of donor-derived spike-binding IgG1 (n = 8) and donor-derived IgM (n = 3) expressed as IgG1, measured by surface plasmon resonance. P value was calculated by unpaired two-tailed t-test."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "Heatmap", "of", "antibody", "binding", "to", "spike", "protein", "subdomains", "(", "complete", "spike", "extracellular", "domain", "\"", "spike", "\"", ",", "S1", ",", "S2", ",", "RBD", "and", "NTD", "in", "ELISA", ".", "Color", "gradient", "shown", "on", "right", "represents", "optical", "density", "at", "450", "nm", "(", "OD", ")", ".", "Values", "are", "mean", "OD", "from", "two", "independent", "experiments", ".", "Analogous", "ELISA", "results", "for", "3", "IgM", "and", "their", "IgG1", "-", "class", "-", "switched", "derivativesC", ".", "Flow", "-", "cytometric", "epitope", "binning", "of", "monoclonal", "IgM", ",", "utilizing", "competitive", "displacement", "of", "IgG", "by", "IgM", "with", "identical", "variable", "region", "Cells", "expressing", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "spike", "protein", "and", "untransfected", "control", "cells", "were", "incubated", "with", "each", "of", "3", "neutralizing", "IgM", "antibodies", "artificially", "switched", "to", "IgG1", ",", "either", "alone", ",", "or", "mixed", "with", "one", "of", "the", "3", "antibodies", "expressed", "as", "IgM", ".", "The", "binding", "of", "each", "IgG1", "alone", "is", "shown", "in", "the", "last", "column", "of", "the", "heatmap", ",", "and", "in", "competition", "with", "each", "other", "IgM", "in", "columns", "1", "-", "3", ".", "Color", "shade", "represents", "the", "specific", "IgG", "binding", "(", "ratio", "of", "GMFI", "on", "TE", "spike", "-", "mCherry", "cells", "to", "TE", "0", "cells", ")", ".", "Values", "are", "mean", "GMFI", "ratios", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "When", "IgM", "binds", "the", "same", "epitope", "as", "the", "IgG", "(", "automatically", "the", "case", "when", "the", "source", "antibody", "is", "the", "same", ")", ",", "the", "IgM", "will", "displace", "the", "IgG", ",", "resulting", "in", "a", "reduction", "in", "the", "IgG", "signal", ".", "Asterisks", "mark", "those", "combinations", "of", "antibodies", "with", "a", "statistically", "significant", "decrease", "in", "binding", "of", "the", "IgG1", "in", "the", "presence", "of", "IgM", ",", "compared", "to", "the", "IgG", "alone", "across", "3", "independent", "experiments", ",", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "two", "-", "way", "analysis", "of", "variance", ",", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. Heatmap of antibody binding to spike protein subdomains (complete spike extracellular domain \"spike\", S1, S2, RBD and NTD in ELISA. Color gradient shown on right represents optical density at 450 nm (OD). Values are mean OD from two independent experiments. Analogous ELISA results for 3 IgM and their IgG1-class-switched derivativesC. Flow-cytometric epitope binning of monoclonal IgM, utilizing competitive displacement of IgG by IgM with identical variable region Cells expressing SARS-CoV-2 spike protein and untransfected control cells were incubated with each of 3 neutralizing IgM antibodies artificially switched to IgG1, either alone, or mixed with one of the 3 antibodies expressed as IgM. The binding of each IgG1 alone is shown in the last column of the heatmap, and in competition with each other IgM in columns 1-3. Color shade represents the specific IgG binding (ratio of GMFI on TE spike-mCherry cells to TE 0 cells). Values are mean GMFI ratios from three independent experiments. When IgM binds the same epitope as the IgG (automatically the case when the source antibody is the same), the IgM will displace the IgG, resulting in a reduction in the IgG signal. Asterisks mark those combinations of antibodies with a statistically significant decrease in binding of the IgG1 in the presence of IgM, compared to the IgG alone across 3 independent experiments, (* p<0.05, two-way analysis of variance, followed by Tukey's test)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "D", ")", "Measurement", "of", "intracellular", "ROS", "levels", "by", "fluorescent", "probe", "DCFH", "-", "DA", ",", "and", "the", "fluorescence", "intensity", "of", "ROS", "was", "calculated", ";", "All", "scale", "bars", "are", "20", "μm", ".", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "(", "G", ")", "Liver", "tissues", "were", "obtained", "from", "the", "indicated", "mice", "and", "then", "examined", "using", "transmission", "electron", "microscopy", "(", "Arrowheads", "indicate", "mitochondria", ")", ";", "Scale", "bars", "are", "1", "μm", "and", "5", "μm", ".", "n", "=", "3", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(D) Measurement of intracellular ROS levels by fluorescent probe DCFH-DA, and the fluorescence intensity of ROS was calculated; All scale bars are 20 μm. n=3 biological replicates.(G) Liver tissues were obtained from the indicated mice and then examined using transmission electron microscopy (Arrowheads indicate mitochondria); Scale bars are 1 μm and 5 μm. n = 3 biological replicates."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "B", ")", "Gpx4", "protein", "was", "measured", "in", "liver", "of", "WT", "and", "PPARα", "-", "/", "-", "mice", "fed", "blank", "solvent", "or", "GW7647", ";", "n", "=", "4", "biological", "replicates", ".", "(", "E", ")", "Chromatin", "immunoprecipitation", "assays", "were", "performed", "on", "soluble", "formaldehyde", "-", "crosslinked", "chromatin", "isolated", "from", "untreated", "and", "GW7647", "-", "treated", "WT", "or", "PPARα", "-", "/", "-", "livers", "with", "polyclonal", "anti", "-", "PPARα", "antibodies", "(", "anti", "-", "PPARα", ")", "or", "control", "IgG", ".", "The", "final", "DNA", "extraction", "was", "polymerase", "chain", "reaction", "-", "amplified", "with", "a", "primer", "pair", "that", "covered", "the", "sequence", "in", "intron", "3", "of", "Gpx4", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(B) Gpx4 protein was measured in liver of WT and PPARα-/- mice fed blank solvent or GW7647; n = 4 biological replicates.(E) Chromatin immunoprecipitation assays were performed on soluble formaldehyde-crosslinked chromatin isolated from untreated and GW7647-treated WT or PPARα-/- livers with polyclonal anti-PPARα antibodies (anti-PPARα) or control IgG. The final DNA extraction was polymerase chain reaction-amplified with a primer pair that covered the sequence in intron 3 of Gpx4."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", ")", "Liver", "sections", "were", "obtained", "from", "the", "indicated", "mice", "and", "stained", "with", "probe1", ".", "All", "scale", "bars", "are", "20", "μm", ".", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "(", "D", ")", "TRF", "protein", "was", "measured", "in", "liver", "of", "WT", "and", "PPARα", "-", "/", "-", "mice", "fed", "blank", "solvent", "or", "GW7647", ".", "n", "=", "4", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(B) Liver sections were obtained from the indicated mice and stained with probe1. All scale bars are 20 μm. n = 3 biological replicates.(D) TRF protein was measured in liver of WT and PPARα-/- mice fed blank solvent or GW7647. n = 4 biological replicates."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "E", ")", "Liver", "tissue", "was", "obtained", "from", "the", "indicated", "mice", "and", "then", "examined", "using", "transmission", "electron", "microscopy", "(", "Arrowheads", "indicate", "mitochondria", ")", ".", "Scale", "bars", "are", "1", "μm", "and", "5", "μm", ".", "n", "=", "4", "biological", "replicates", ".", "(", "J", ")", "Measurement", "of", "intracellular", "ROS", "levels", "by", "fluorescent", "probe", "DCFH", "-", "DA", ",", "and", "the", "fluorescence", "intensity", "of", "ROS", "was", "calculated", ".", "All", "scale", "bars", "are", "20", "μm", ".", "n", "=", "3", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(E) Liver tissue was obtained from the indicated mice and then examined using transmission electron microscopy (Arrowheads indicate mitochondria). Scale bars are 1 μm and 5 μm. n = 4 biological replicates.(J) Measurement of intracellular ROS levels by fluorescent probe DCFH-DA, and the fluorescence intensity of ROS was calculated. All scale bars are 20 μm. n = 3 biological replicates."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "E", ")", "Measurement", "of", "intracellular", "ROS", "levels", "by", "fluorescent", "probe", "DCFH", "-", "DA", ",", "and", "the", "fluorescence", "intensity", "of", "ROS", "was", "calculated", ".", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "All", "scale", "bars", "are", "20", "μm", ".", "(", "J", ")", "Measurement", "of", "intracellular", "ROS", "levels", "by", "fluorescent", "probe", "DCFH", "-", "DA", ",", "and", "the", "fluorescence", "intensity", "of", "ROS", "was", "calculated", ".", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "All", "scale", "bars", "are", "20", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(E) Measurement of intracellular ROS levels by fluorescent probe DCFH-DA, and the fluorescence intensity of ROS was calculated. n = 3 biological replicates. All scale bars are 20 μm.(J) Measurement of intracellular ROS levels by fluorescent probe DCFH-DA, and the fluorescence intensity of ROS was calculated. n = 3 biological replicates. All scale bars are 20 μm."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "D", ")", "HaloTag", "pulse", "-", "chase", "analysis", "in", "WT", "MEF", "monitoring", "fluorescent", "Halo", "-", "AATNNN", "during", "up", "to", "6", "h", "of", "chase", "in", "the", "presence", "of", "BafA1", ".", "The", "fluorescent", "JF646", "-", "Halo", "ligand", "and", "the", "polymer", "-", "specific", "2C1", "antibody", "stains", "are", "shown", ".", "(", "E", ")", "Same", "as", "(", "D", ")", "for", "fluorescent", "Halo", "-", "ATZNNN", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "accumulation", "of", "fluorescent", "Halo", "-", "AATNNN", "and", "Halo", "-", "ATZNNN", "within", "LAMP1", "-", "positive", "endolysosomes", ".", "Mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "20", ",", "11", ",", "10", ",", "13", "for", "Halo", "-", "AATNNN", ",", "n", "=", "18", ",", "12", ",", "12", ",", "13", "for", "Halo", "-", "ATZNNN", ".", "Two", "-", "way", "ANOVA", "and", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ",", "ns", "P", ">", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(D) HaloTag pulse-chase analysis in WT MEF monitoring fluorescent Halo-AATNNN during up to 6 h of chase in the presence of BafA1. The fluorescent JF646-Halo ligand and the polymer-specific 2C1 antibody stains are shown. (E) Same as (D) for fluorescent Halo-ATZNNN. (F) Quantification of accumulation of fluorescent Halo-AATNNN and Halo-ATZNNN within LAMP1-positive endolysosomes. Mean ± SEM, n=20, 11, 10, 13 for Halo-AATNNN, n= 18, 12, 12, 13 for Halo-ATZNNN. Two-way ANOVA and Sidak's multiple comparison test, ns P>0.05, *** P<0.001. "}
{"words": ["Figure", "2A", "Confocal", "laser", "scanning", "microscopy", "analyses", "in", "cells", "treated", "with", "BafA1", ".", "Total", "HA", "-", "ATZNNN", "(", "red", ")", "or", "HA", "-", "ATZNNN", "polymers", "(", "magenta", ")", "in", "LAMP1", "-", "positive", "endolysosome", "(", "green", ")", "in", "WT", "MEF", ".", "(", "C", ")", "Same", "as", "(", "A", ")", "in", "Cnx", "-", "KO", "MEF", ".", "(", "D", ")", "Same", "as", "(", "A", ")", "in", "WT", "MEF", "exposed", "to", "kifunensine", "(", "KIF", ")", ".", "(", "E", ")", "Same", "as", "(", "A", ")", "in", "WT", "MEF", "exposed", "to", "Castanospermine", "(", "CST", ")", ".", "(", "F", ")", "Same", "as", "(", "A", ")", "in", "sCNX", "MEF", ".", "(", "G", ")", "Same", "as", "(", "A", ")", "in", "Uggt1", "-", "KO", "MEF", ".", "(", "J", ")", "Halo", "-", "ATZNNN", "in", "Uggt1", "-", "KO", "MEF", "mock", "-", "transfected", "(", "empty", "pcDNA3", "plasmid", ")", ".", "(", "K", ",", "L", ")", "(", "K", ")", "Same", "as", "(", "J", ")", ",", "with", "a", "plasmid", "for", "expression", "of", "active", "or", "(", "L", ")", "inactive", "UGGT1", ".", "(", "M", ")", "Quantification", "of", "Halo", "-", "ATZNNN", "-", "positive", "endolysosomes", "(", "mean", ",", "n", "=", "22", ",", "10", ",", "15", "cells", "for", "panels", "J", "-", "L", ",", "respectively", ")", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "and", "Dunnett", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ",", "ns", "P", ">", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Confocal laser scanning microscopy analyses in cells treated with BafA1. Total HA-ATZNNN (red) or HA-ATZNNN polymers (magenta) in LAMP1-positive endolysosome (green) in WT MEF. (C) Same as (A) in Cnx-KO MEF. (D) Same as (A) in WT MEF exposed to kifunensine (KIF). (E) Same as (A) in WT MEF exposed to Castanospermine (CST). (F) Same as (A) in sCNX MEF. (G) Same as (A) in Uggt1-KO MEF. (J) Halo-ATZNNN in Uggt1-KO MEF mock-transfected (empty pcDNA3 plasmid). (K, L) (K) Same as (J), with a plasmid for expression of active or (L) inactive UGGT1. (M) Quantification of Halo-ATZNNN-positive endolysosomes (mean, n=22, 10, 15 cells for panels J-L, respectively). One-way ANOVA and Dunnett's multiple comparison test, ns P>0.05, **** P<0.0001). "}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", "-", "I", ")", "Confocal", "laser", "scanning", "microscopy", "analyses", "(", "as", "in", "Fig", ".", "2", ")", "in", "WT", "MEF", "treated", "with", "BafA1", ".", "(", "J", ",", "K", ")", "(", "J", ")", "Quantification", "of", "ATZxxx", "-", "positive", "endolysosomes", "and", "(", "K", ")", "of", "ATZxxx", "polymers", "-", "positive", "endolysosomes", "(", "mean", ",", "n", "=", "18", ",", "30", ",", "24", ",", "14", ",", "27", ",", "22", ",", "27", ",", "18", "cells", "for", "HA", "stain", "and", "n", "=", "12", ",", "14", ",", "14", ",", "11", ",", "14", ",", "14", ",", "17", ",", "11", "cells", "for", "2C1", "stain", "of", "panels", "B", "-", "I", ",", "respectively", ")", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "and", "Dunnett", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ",", "ns", "P", ">", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(B-I) Confocal laser scanning microscopy analyses (as in Fig. 2) in WT MEF treated with BafA1. (J, K) (J) Quantification of ATZxxx-positive endolysosomes and (K) of ATZxxx polymers-positive endolysosomes (mean, n= 18, 30, 24, 14, 27, 22, 27, 18 cells for HA stain and n= 12, 14, 14, 11, 14, 14, 17, 11 cells for 2C1 stain of panels B-I, respectively). One-way ANOVA and Dunnett's multiple comparison test, ns P>0.05, **** P<0.0001. "}
{"words": ["Figure", "4", "(", "C", ")", "Co", "-", "immunoprecipitation", "of", "ATZXXX", "(", "Bait", ",", "lower", "panel", ")", "with", "CNX", "(", "upper", "panel", ")", "and", "BiP", "(", "middle", "panel", ")", ".", "Protein", "content", "in", "the", "total", "cell", "extracts", "(", "TCE", ")", "is", "shown", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "(", "C", ")", "for", "CNX", "association", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "(", "E", ")", "Quantification", "of", "(", "C", ")", "for", "BiP", "association", "(", "n", "=", "3", "for", "ATZNNN", "and", "ATZQQN", ";", "n", "=", "4", "for", "ATZQNQ", "and", "ATZQQQ", ")", ".", "Unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "(", "G", ")", "Confocal", "laser", "scanning", "microscopy", "in", "Flp", "-", "In", "3T3", "cells", "stably", "expressing", "ATZNNN", "in", "the", "absence", "of", "BafA1", "(", "to", "allow", "clearance", "of", "misfolded", "model", "proteins", "delivered", "within", "endolysosomes", ")", ".", "Co", "-", "localization", "with", "Calnexin", "(", "CNX", ")", ".", "(", "H", ")", "Same", "as", "(", "G", ")", "for", "BiP", "co", "-", "localization", ".", "(", "I", ")", "Same", "as", "(", "G", ")", "for", "ATZQQQ", ".", "(", "J", ")", "Same", "as", "(", "H", ")", "for", "ATZQQQ", ".", "(", "K", ")", "HaloTag", "pulse", "-", "chase", "analysis", "in", "MEF", "monitoring", "fluorescent", "Halo", "-", "ATZNNN", "during", "up", "to", "24", "h", ".", "(", "L", ")", "Same", "as", "(", "K", ")", "for", "fluorescent", "Halo", "-", "ATZQQQ", ".", "Arrowheads", "show", "select", "clusters", "of", "JF646", "-", "labeled", "Halo", "-", "ATZQQQ", ".", "Arrowheads", "show", "co", "-", "localization", "Halo", "-", "ATZQQQ", ":", "BiP", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(C) Co-immunoprecipitation of ATZXXX (Bait, lower panel) with CNX (upper panel) and BiP (middle panel). Protein content in the total cell extracts (TCE) is shown. (D) Quantification of (C) for CNX association (n=3). Unpaired two-tailed t-test, ** P<0.01*** P<0.001, **** P<0.0001. (E) Quantification of (C) for BiP association (n=3 for ATZNNN and ATZQQN; n=4 for ATZQNQ and ATZQQQ). Unpaired two-tailed t-test, * P<0.005, ** P<0.01, *** P<0.001, **** P<0.0001. (G) Confocal laser scanning microscopy in Flp-In 3T3 cells stably expressing ATZNNN in the absence of BafA1 (to allow clearance of misfolded model proteins delivered within endolysosomes). Co-localization with Calnexin (CNX). (H) Same as (G) for BiP co-localization. (I) Same as (G) for ATZQQQ. (J) Same as (H) for ATZQQQ. (K) HaloTag pulse-chase analysis in MEF monitoring fluorescent Halo-ATZNNN during up to 24 h. (L) Same as (K) for fluorescent Halo-ATZQQQ. Arrowheads show select clusters of JF646-labeled Halo-ATZQQQ. Arrowheads show co-localization Halo-ATZQQQ:BiP. "}
{"words": ["Figure", "1The", "ERMIT", "assay", "relies", "on", "the", "signaling", "properties", "of", "IRE1", ",", "one", "of", "the", "three", "ER", "stress", "sensors", "and", "reports", "for", "a", "dimerization", "event", "occurring", "in", "the", "lumen", "of", "the", "ER", ".", "The", "assay", "can", "be", "applied", "to", "heterodimerization", "or", "homodimerization", "events", ".", "Western", "blot", "showing", "the", "expression", "of", "AGR2", "dimers", "(", "D", ")", "and", "monomers", "(", "M", ")", "in", "HEK293T", "subjected", "to", "DSP", "-", "mediated", "cross", "-", "linking", "and", "that", "were", "previously", "transfected", "with", "either", "a", "control", "siRNA", "(", "siCTL", ")", "or", "a", "siRNA", "targeting", "AGR2", "(", "siAGR2", ")", "for", "24", "h", "(", "C", ")", "Reduced", "or", "non", "-", "reduced", "samples", "were", "resolved", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblotted", "using", "anti", "-", "AGR2", ",", "anti", "-", "ERK1", "antibodies", "(", "for", "loading", "control", ")", ".", "The", "ERMIT", "assay", "relies", "on", "the", "signaling", "properties", "of", "IRE1", ",", "one", "of", "the", "three", "ER", "stress", "sensors", "and", "reports", "for", "a", "dimerization", "event", "occurring", "in", "the", "lumen", "of", "the", "ER", ".", "The", "assay", "can", "be", "applied", "to", "heterodimerization", "or", "homodimerization", "events", ".", "Western", "blot", "showing", "the", "expression", "of", "AGR2", "dimers", "(", "D", ")", "and", "monomers", "(", "M", ")", "in", "HEK293T", "subjected", "to", "DSP", "-", "mediated", "cross", "-", "linking", "and", "that", "were", "previously", "transfected", "with", "either", "a", "control", "siRNA", "(", "siCTL", ")", "or", "treated", "or", "not", "with", "tunicamycin", "(", "Tun", ")", "prior", "to", "cross", "-", "linking", "(", "D", ")", ".", "Reduced", "or", "non", "-", "reduced", "samples", "were", "resolved", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblotted", "using", "anti", "-", "AGR2", "anti", "-", "calnexin", "(", "CANX", ")", "antibodies", "(", "for", "loading", "control", ")", ".", "The", "ERMIT", "assay", "relies", "on", "the", "signaling", "properties", "of", "IRE1", ",", "one", "of", "the", "three", "ER", "stress", "sensors", "and", "reports", "for", "a", "dimerization", "event", "occurring", "in", "the", "lumen", "of", "the", "ER", ".", "The", "assay", "can", "be", "applied", "to", "heterodimerization", "or", "homodimerization", "events", ".", "F", ")", "AGR2", "dimerization", "was", "monitored", "with", "ERMIT", "(", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", ")", ".", "The", "luminescence", "signal", "was", "abrogated", "when", "using", "the", "kinase", "dead", "(", "KD", ")", "constructs", "and", "by", "the", "constructs", "exhibiting", "mutations", "in", "the", "dimerization", "domain", "(", "E60A", "or", "C81S", "or", "double", "mutant", "(", "DM", ")", ")", ".", "The", "graph", "represents", "average", "signal", "normalized", "on", "reporter", "protein", "expression", "±", "SD", "(", "n", "=", "5", ";", "*", "*", ":", "WT", "/", "KD", "(", "p", "=", "0", ".", "002", ")", ",", "E60", "/", "WT", "(", "p", "=", "0", ".", "0034", ")", ",", "E60", "/", "KD", "(", "p", "=", "0", ".", "001", ")", ",", "C81", "/", "KD", "(", "p", "=", "0", ".", "004", ")", ",", "DM", "/", "WT", "(", "p", "=", "0", ".", "0021", ")", "and", "DM", "/", "KD", "(", "p", "=", "0", ".", "0017", ")", ",", "respectively", ";", "*", ":", "C81", "/", "WT", "(", "p", "=", "0", ".", "0098", ")", ")", ".", "The", "ERMIT", "assay", "relies", "on", "the", "signaling", "properties", "of", "IRE1", ",", "one", "of", "the", "three", "ER", "stress", "sensors", "and", "reports", "for", "a", "dimerization", "event", "occurring", "in", "the", "lumen", "of", "the", "ER", ".", "The", "assay", "can", "be", "applied", "to", "heterodimerization", "or", "homodimerization", "events", ".", "G", ")", "Cells", "expressing", "various", "bait", "and", "prey", "constructs", "and", "the", "XBP1", "splicing", "reporter", "or", "the", "XBP1", "splicing", "reporter", "alone", "were", "exposed", "to", "increasing", "concentrations", "of", "DTT", ".", "The", "ERMIT", "signals", "obtained", "with", "both", "baits", "were", "then", "normalized", "to", "that", "of", "XBP1s", "to", "obtain", "results", "independent", "of", "the", "activation", "of", "endogenous", "IRE1", "by", "the", "use", "of", "chemical", "ER", "stressors", "(", "n", "=", "4", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1The ERMIT assay relies on the signaling properties of IRE1, one of the three ER stress sensors and reports for a dimerization event occurring in the lumen of the ER. The assay can be applied to heterodimerization or homodimerization events. Western blot showing the expression of AGR2 dimers (D) and monomers (M) in HEK293T subjected to DSP-mediated cross-linking and that were previously transfected with either a control siRNA (siCTL) or a siRNA targeting AGR2 (siAGR2) for 24 h (C) Reduced or non-reduced samples were resolved by SDS-PAGE and immunoblotted using anti-AGR2, anti-ERK1 antibodies (for loading control).The ERMIT assay relies on the signaling properties of IRE1, one of the three ER stress sensors and reports for a dimerization event occurring in the lumen of the ER. The assay can be applied to heterodimerization or homodimerization events. Western blot showing the expression of AGR2 dimers (D) and monomers (M) in HEK293T subjected to DSP-mediated cross-linking and that were previously transfected with either a control siRNA (siCTL) or treated or not with tunicamycin (Tun) prior to cross-linking (D). Reduced or non-reduced samples were resolved by SDS-PAGE and immunoblotted using anti-AGR2 anti-calnexin (CANX) antibodies (for loading control).The ERMIT assay relies on the signaling properties of IRE1, one of the three ER stress sensors and reports for a dimerization event occurring in the lumen of the ER. The assay can be applied to heterodimerization or homodimerization events. F) AGR2 dimerization was monitored with ERMIT (wild-type (WT)). The luminescence signal was abrogated when using the kinase dead (KD) constructs and by the constructs exhibiting mutations in the dimerization domain (E60A or C81S or double mutant (DM)). The graph represents average signal normalized on reporter protein expression ± SD (n=5; **: WT/KD (p=0.002), E60/WT (p=0.0034), E60/KD (p=0.001), C81/KD (p=0.004), DM/WT (p=0.0021) and DM/KD (p=0.0017), respectively; *: C81/WT (p=0.0098)).The ERMIT assay relies on the signaling properties of IRE1, one of the three ER stress sensors and reports for a dimerization event occurring in the lumen of the ER. The assay can be applied to heterodimerization or homodimerization events. G) Cells expressing various bait and prey constructs and the XBP1 splicing reporter or the XBP1 splicing reporter alone were exposed to increasing concentrations of DTT. The ERMIT signals obtained with both baits were then normalized to that of XBP1s to obtain results independent of the activation of endogenous IRE1 by the use of chemical ER stressors (n = 4)."}
{"words": ["Figure", "2B", ")", "Volcano", "plot", "representing", "the", "statistical", "analysis", "of", "the", "data", "from", "the", "screen", ",", "where", "the", "y", "axis", "represents", "statistical", "criteria", "and", "the", "x", "axis", "the", "fold", "change", "in", "luminescence", "units", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B) Volcano plot representing the statistical analysis of the data from the screen, where the y axis represents statistical criteria and the x axis the fold change in luminescence units."}
{"words": ["Figure", "3A", ")", "Co", "-", "immunoprecipitation", "of", "AGR2", "with", "TMED2", "under", "basal", "and", "tunicamycin", "induced", "ER", "stress", "in", "intestinal", "epithelial", "cells", "treated", "in", "situ", ".", "*", "indicates", "Immunoglobulin", "heavy", "and", "light", "chains", ".", "C", ")", "Changes", "in", "AGR2", "dimer", "and", "monomer", "ratio", "in", "TMED2", "overexpressing", "cells", ".", "DSP", "-", "stabilized", "AGR2", "was", "analyzed", "under", "non", "-", "reducing", "(", "top", "blot", ")", "or", "reducing", "conditions", "(", "bottom", "blot", ")", ".", "D", "=", "dimeric", ",", "M", "=", "monomeric", "AGR2", ".", "E", ")", ":", "Co", "-", "immunoprecipitation", "of", "AGR2", "wild", "-", "type", "(", "WT", ",", "left", "panel", ")", "or", "AGR2", "AA", "mutant", "(", "right", "panel", ")", "with", "TMED2", "in", "HEK293T", "cells", ".", "Immunoprecipitation", "was", "performed", "with", "mouse", "anti", "-", "Flag", "antibody", "to", "pull", "-", "down", "the", "ectopic", "protein", "tag", ".", "F", ")", "Western", "blot", "analysis", "(", "left", "panel", ")", "and", "quantification", "(", "right", "panel", ")", "of", "AGR2", "intracellular", "expression", "upon", "TMED2", "overexpression", ".", "Data", "are", "representative", "of", "4", "independent", "experiments", ".", "Tubulin", "(", "TUB", ")", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "G", ")", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "control", "(", "ev", ")", "or", "TMED2", "plasmid", "and", "then", "used", "in", "the", "ERMIT", "assay", "with", "AGR2", "WT", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "H", ")", "Western", "blot", "analysis", "(", "left", "panel", ")", "and", "quantification", "(", "right", "panel", ")", "of", "AGR2", "intracellular", "expression", "in", "total", "cell", "lysate", "(", "TCL", ")", "upon", "TMED2", "silencing", ".", "Data", "are", "representative", "of", "4", "independent", "experiments", ".", "Tubulin", "(", "TUB", ")", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "I", ")", "HEK293T", "cells", "were", "silencing", "for", "TMED2", "and", "then", "used", "in", "the", "ERMIT", "assay", "with", "AGR2", "WT", "(", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A) Co-immunoprecipitation of AGR2 with TMED2 under basal and tunicamycin induced ER stress in intestinal epithelial cells treated in situ. *indicates Immunoglobulin heavy and light chains.C) Changes in AGR2 dimer and monomer ratio in TMED2 overexpressing cells. DSP-stabilized AGR2 was analyzed under non-reducing (top blot) or reducing conditions (bottom blot). D=dimeric, M=monomeric AGR2.E): Co-immunoprecipitation of AGR2 wild-type (WT, left panel) or AGR2 AA mutant (right panel) with TMED2 in HEK293T cells. Immunoprecipitation was performed with mouse anti-Flag antibody to pull-down the ectopic protein tag.F) Western blot analysis (left panel) and quantification (right panel) of AGR2 intracellular expression upon TMED2 overexpression. Data are representative of 4 independent experiments. Tubulin (TUB) was used as a loading control.G) HEK293T cells were transfected with control (ev) or TMED2 plasmid and then used in the ERMIT assay with AGR2 WT (n=3).H) Western blot analysis (left panel) and quantification (right panel) of AGR2 intracellular expression in total cell lysate (TCL) upon TMED2 silencing. Data are representative of 4 independent experiments. Tubulin (TUB) was used as a loading control.I) HEK293T cells were silencing for TMED2 and then used in the ERMIT assay with AGR2 WT (n=3)."}
{"words": ["Figure", "4A", ")", "The", "ERMIT", "-", "based", "validation", "of", "the", "complex", "formation", "between", "AGR2", "and", "LYPD3", "or", "CD59", ",", "but", "not", "OS9", ".", "The", "monomeric", "AGR2", "E60A", "was", "used", "as", "bait", ",", "while", "LYPD3", ",", "CD59", "and", "OS9", "were", "used", "as", "prays", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "B", "-", "C", ")", "Expression", "and", "subcellular", "localization", "of", "CD59", "-", "GFP", "WT", "and", "C94S", ".", "D", "and", "E", ")", "Co", "-", "immunoprecipitation", "of", "CD59", "-", "GFP", "WT", "or", "CD59", "C94S", "mutant", "with", "AGR2", "WT", "(", "D", ")", "or", "AGR2", "AA", "mutant", "(", "E", ")", "in", "HEK293T", "cells", ".", "F", "-", "I", ")", "FACS", "analysis", "of", "CD59", "WT", "(", "F", "and", "G", ")", "or", "CD59", "C94S", "(", "H", "and", "I", ")", "total", "(", "F", "and", "H", ")", "and", "membrane", "(", "G", "and", "I", ")", "expression", "in", "HEK293T", "cells", "silenced", "for", "AGR2", "(", "siAGR2", ")", "and", "TMED2", "(", "siTMED2", ")", "when", "compared", "to", "control", "(", "siGL2", ")", "cells", "(", "F", "and", "H", ")", "or", "silenced", "for", "TMED2", "(", "siTMED2", ")", "and", "overexpressing", "AGR2", "WT", "or", "AGR2", "AA", "mutant", "(", "G", "and", "I", ")", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "to", "four", "independent", "experiments", ".", "Membranous", "CD59", "expression", "was", "detected", "with", "anti", "-", "GFP", "APC", ".", "ns", ":", "non", "-", "statistically", "significant", ";", "for", "F", "(", "*", ")", ":", "p", "=", "0", ".", "0385", ",", "(", "*", "*", "*", ")", ":", "p", "=", "0", ".", "0003", "(", "left", "panel", ")", "and", "p", "=", "0", ".", "0002", "(", "right", "panel", ")", ",", "respectively", ";", "for", "G", "(", "*", ")", ":", "p", "=", "0", ".", "0334", ",", "(", "*", "*", ")", "p", "=", "0", ".", "0036", "and", "(", "*", "*", "*", ")", "p", "=", "0", ".", "0003", ";", "for", "H", "(", "*", ")", ":", "p", "=", "0", ".", "0171", "and", "(", "*", "*", ")", ":", "p", "=", "0", ".", "0084", ";", "and", "for", "I", "(", "*", "*", ")", "p", "=", "0", ".", "0086", "(", "left", "panel", ")", "and", "p", "=", "0", ".", "0076", "(", "right", "panel", ")", ",", "respectively", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A) The ERMIT-based validation of the complex formation between AGR2 and LYPD3 or CD59, but not OS9. The monomeric AGR2 E60A was used as bait, while LYPD3, CD59 and OS9 were used as prays (n=6).B-C) Expression and subcellular localization of CD59-GFP WT and C94S.D and E) Co-immunoprecipitation of CD59-GFP WT or CD59 C94S mutant with AGR2 WT (D) or AGR2 AA mutant (E) in HEK293T cells.F-I) FACS analysis of CD59 WT (F and G) or CD59 C94S (H and I) total (F and H) and membrane (G and I) expression in HEK293T cells silenced for AGR2 (siAGR2) and TMED2 (siTMED2) when compared to control (siGL2) cells (F and H) or silenced for TMED2 (siTMED2) and overexpressing AGR2 WT or AGR2 AA mutant (G and I). Data are representative of three to four independent experiments. Membranous CD59 expression was detected with anti-GFP APC. ns: non-statistically significant; for F (*): p=0.0385, (***): p=0.0003 (left panel) and p=0.0002 (right panel), respectively; for G (*): p=0.0334, (**) p=0.0036 and (***) p=0.0003; for H (*): p=0.0171 and (**): p=0.0084; and for I (**) p=0.0086 (left panel) and p=0.0076 (right panel), respectively."}
{"words": ["Figure", "5A", ")", "Formation", "of", "GFP", "-", "LC3", "autophagic", "puncta", "in", "TMED2", "overexpressing", "HEK239T", "cells", "as", "monitored", "using", "confocal", "microscopy", "(", "right", "panel", ")", ".", "DAPI", "was", "used", "for", "nuclear", "staining", "visualization", ".", "Percentage", "of", "GFP", "-", "LC3", "puncta", "in", "control", "(", "CTL", ")", "and", "TMED2", "overexpressing", "HEK293T", "cells", "as", "quantified", "from", "three", "independent", "experiments", "by", "counting", "240", "GFP", "-", "LC3", "positive", "cells", "for", "each", "condition", "(", "left", "panel", ")", ".", "(", "*", "*", ")", ":", "p", "=", "0", ".", "0032", ".", "B", ")", "Western", "blot", "detection", "(", "left", "panel", ")", "and", "quantification", "(", "right", "panel", ")", "of", "LC3", "level", "in", "control", "and", "TMED2", "overexpressing", "HEK293T", "cells", "treated", "or", "not", "with", "50", "µM", "chloroquine", "for", "2", "hours", ".", "Actin", "(", "ACT", ")", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "(", "*", ")", ":", "p", "=", "0", ".", "0498", ".", "C", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "AGR2", "expression", "in", "control", "and", "TMED2", "overexpressing", "HEK293T", "cells", "upon", "autophagy", "inhibition", "with", "20", "µM", "and", "10", "µM", "chloroquine", "treatment", ".", "Actin", "(", "ACT", ")", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "D", ")", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "control", "(", "ev", ")", "or", "TMED2", "plasmid", "and", "then", "used", "in", "the", "ERMIT", "assay", "with", "AGR2", "WT", "the", "presence", "of", "gradual", "amounts", "of", "chloroquine", ".", "E", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "secreted", "AGR2", "upon", "TMED2", "overexpression", ".", "eAGR2", ",", "extracellular", "AGR2", ";", "iAGE2", ",", "intracellular", "AGR2", ".", "F", ")", "Representative", "pictures", "of", "extracellular", "vesicles", "(", "EVs", ")", "heterogeneity", "purified", "from", "conditioned", "media", "of", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "control", "(", "ev", ")", "or", "TMED2", "plasmid", "and", "analyzed", "by", "cryo", "-", "electron", "microscopy", ".", "Right", "upper", "panel", ":", "western", "blot", "analysis", "of", "CD63", "in", "total", "medium", "(", "left", ")", "and", "in", "the", "purified", "extracellular", "vesicles", "fraction", "purified", "from", "media", "conditioned", "by", "control", "and", "TMED2", "overexpressing", "cells", "(", "middle", ")", "and", "western", "blot", "analysis", "of", "AGR2", "levels", "(", "right", ")", "in", "extracellular", "vesicles", "enriched", "from", "culture", "media", "conditioned", "by", "control", "and", "TMED2", "overexpressing", "cells", ".", "G", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "secreted", "AGR2", "upon", "TMED2", "silencing", "eAGR2", ",", "extracellular", "AGR2", ";", "iAGE2", ",", "intracellular", "AGR2", ".", "H", ")", "Quantification", "of", "extracellular", "AGR2", "level", "(", "eAGR2", ")", "in", "cells", "silenced", "for", "TMED2", "(", "siTMED2", ")", ",", "compared", "to", "control", "(", "siGL2", ")", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "and", "are", "presented", "as", "extracellular", "-", "to", "-", "intracellular", "AGR2", "ratio", ".", "(", "*", "*", ")", ":", "p", "=", "0", ".", "0029", ".", "I", ")", "Secretion", "of", "AGR2", "wild", "-", "type", "(", "wt", ")", ",", "E60A", "and", "∆", "45", "mutant", "as", "determined", "by", "Western", "blot", ".", "eAGR2", ",", "extracellular", "AGR2", ";", "iAGE2", ",", "intracellular", "AGR2", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A) Formation of GFP-LC3 autophagic puncta in TMED2 overexpressing HEK239T cells as monitored using confocal microscopy (right panel). DAPI was used for nuclear staining visualization. Percentage of GFP-LC3 puncta in control (CTL) and TMED2 overexpressing HEK293T cells as quantified from three independent experiments by counting 240 GFP-LC3 positive cells for each condition (left panel). (**): p=0.0032.B) Western blot detection (left panel) and quantification (right panel) of LC3 level in control and TMED2 overexpressing HEK293T cells treated or not with 50 µM chloroquine for 2 hours. Actin (ACT) served as a loading control. (*): p=0.0498.C) Western blot analysis of AGR2 expression in control and TMED2 overexpressing HEK293T cells upon autophagy inhibition with 20 µM and 10 µM chloroquine treatment. Actin (ACT) served as a loading control.D) HEK293T cells were transfected with control (ev) or TMED2 plasmid and then used in the ERMIT assay with AGR2 WT the presence of gradual amounts of chloroquine.E) Western blot analysis of secreted AGR2 upon TMED2 overexpression. eAGR2, extracellular AGR2; iAGE2, intracellular AGR2.F) Representative pictures of extracellular vesicles (EVs) heterogeneity purified from conditioned media of HEK293T cells transfected with control (ev) or TMED2 plasmid and analyzed by cryo-electron microscopy. Right upper panel: western blot analysis of CD63 in total medium (left) and in the purified extracellular vesicles fraction purified from media conditioned by control and TMED2 overexpressing cells (middle) and western blot analysis of AGR2 levels (right) in extracellular vesicles enriched from culture media conditioned by control and TMED2 overexpressing cells.G) Western blot analysis of secreted AGR2 upon TMED2 silencing eAGR2, extracellular AGR2; iAGE2, intracellular AGR2. H) Quantification of extracellular AGR2 level (eAGR2) in cells silenced for TMED2 (siTMED2), compared to control (siGL2). Data are representative of three independent experiments and are presented as extracellular-to-intracellular AGR2 ratio. (**): p=0.0029.I) Secretion of AGR2 wild-type (wt), E60A and ∆45 mutant as determined by Western blot. eAGR2, extracellular AGR2; iAGE2, intracellular AGR2."}
{"words": ["Figure", "6A", ")", "Representative", "histological", "H", "&", "E", "staining", "of", "sections", "of", "the", "proximal", "colon", "and", "ileum", "of", "WT", "and", "TMED2", "hypomorph", "mice", ".", "B", ")", "Immunohistological", "analysis", "of", "AGR2", "and", "MUC2", "expression", "in", "the", "proximal", "colon", "of", "WT", "and", "TMED2", "hypomorph", "mice", ".", "C", ")", "Semi", "-", "quantitative", "analysis", "of", "AGR2", "and", "MUC2", "expression", "in", "the", "proximal", "colon", "of", "WT", "(", "blank", "bars", ")", "and", "TMED2", "hypomorph", "mice", "(", "black", "bars", ")", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "D", ")", "Freshly", "isolated", "PBMCs", "were", "placed", "in", "Boyden", "chambers", "towards", "media", "conditioned", "by", "cells", "overexpressing", "AGR2", "WT", ",", "E60A", ",", "∆", "45", "or", "AGR2", "AA", "mutants", "and", "incubated", "for", "24", "h", ".", "Migrating", "cells", "were", "then", "characterized", "and", "quantified", "by", "flow", "cytometry", "using", "FCS", "/", "SSC", "parameters", "or", "CD14", "monocyte", "marker", ".", "(", "*", "*", ")", ":", "p", "=", "0", ".", "0016", ".", "E", "and", "F", ")", "Freshly", "isolated", "PBMC", "were", "placed", "in", "Boyden", "chambers", "towards", "media", "conditioned", "by", "cells", "overexpressing", "TMED2", "and", "either", "AGR2", "WT", "(", "E", ")", "or", "AGR2", "AA", "mutant", "(", "F", ")", "and", "incubated", "for", "24", "h", ".", "Migrating", "cells", "were", "then", "characterized", "and", "quantified", "For", "E", "(", "*", ")", ":", "p", "=", "0", ".", "0461", "(", "AGR2WT", "/", "TMED2", ")", "and", "0", ".", "018", "(", "AGR2WT", "/", "TMED2", "+", "blocking", "Ab", ")", "respectively", ";", "(", "*", "*", ")", ":", "p", "=", "0", ".", "0053", "and", "(", "*", "*", "*", ")", ":", "p", "=", "0", ".", "0048", ";", "for", "F", "(", "*", "*", "*", ")", ":", "p", "=", "0", ".", "0007", ".", "G", ")", "Freshly", "isolated", "PBMC", "were", "placed", "in", "Boyden", "chambers", "towards", "media", "conditioned", "by", "cells", "silenced", "for", "TMED2", "and", "incubated", "for", "24", "h", ".", "Migrating", "cells", "were", "then", "characterized", "and", "quantified", "(", "*", ")", ":", "p", "=", "0", ".", "0149", ".", "H", ")", "Freshly", "isolated", "PBMC", "were", "placed", "in", "Boyden", "chambers", "towards", "decreased", "doses", "of", "recombinant", "AGR2", "and", "incubated", "for", "24", "h", ".", "CCL2", "cytokine", "was", "used", "as", "positive", "control", "for", "monocyte", "migration", ".", "ns", ":", "non", "-", "statistically", "significant", ",", "(", "*", ")", ":", "p", "=", "0", ".", "0171", ",", "(", "*", "*", ")", ":", "p", "=", "0", ".", "0084", ",", "(", "*", "*", "*", ")", ":", "p", "=", "0", ".", "0003", ".", "I", ")", "Impact", "of", "AGR2", "blocking", "antibodies", "on", "AGR2", "-", "mediated", "monocytes", "migration", "was", "tested", "using", "Boyden", "chambers", "as", "described", "above", ".", "The", "concentrations", "of", "recombinant", "human", "AGR2", "was", "of", "200", "ng", "/", "ml", "and", "decreasing", "amounts", "of", "antibodies", "were", "used", "from", "20", "µg", "to", "1", "µg", ".", "The", "non", "-", "relevant", "antibody", "(", "Isotype", ")", "was", "used", "at", "the", "maximal", "dose", "of", "20", "µg", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "ns", ":", "non", "-", "statistically", "significant", ",", "(", "*", ")", ":", "p", "=", "0", ".", "0165", "(", "Ab", "=", "20μg", "/", "ml", ")", ",", "0", ".", "0223", "(", "Ab", "=", "10μg", "/", "ml", ")", "and", "0", ".", "0493", "(", "Ab", "=", "5μg", "/", "ml", ")", ",", "respectively", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A) Representative histological H&E staining of sections of the proximal colon and ileum of WT and TMED2 hypomorph mice.B) Immunohistological analysis of AGR2 and MUC2 expression in the proximal colon of WT and TMED2 hypomorph mice.C) Semi-quantitative analysis of AGR2 and MUC2 expression in the proximal colon of WT (blank bars) and TMED2 hypomorph mice (black bars) (n=6).D) Freshly isolated PBMCs were placed in Boyden chambers towards media conditioned by cells overexpressing AGR2 WT, E60A, ∆45 or AGR2 AA mutants and incubated for 24 h. Migrating cells were then characterized and quantified by flow cytometry using FCS/SSC parameters or CD14 monocyte marker. (**): p=0.0016.E and F) Freshly isolated PBMC were placed in Boyden chambers towards media conditioned by cells overexpressing TMED2 and either AGR2 WT (E) or AGR2 AA mutant (F) and incubated for 24 h. Migrating cells were then characterized and quantified For E (*): p=0.0461 (AGR2WT/TMED2) and 0.018 (AGR2WT/TMED2 + blocking Ab) respectively; (**): p=0.0053 and (***): p=0.0048; for F (***): p=0.0007.G) Freshly isolated PBMC were placed in Boyden chambers towards media conditioned by cells silenced for TMED2 and incubated for 24 h. Migrating cells were then characterized and quantified (*): p=0.0149.H) Freshly isolated PBMC were placed in Boyden chambers towards decreased doses of recombinant AGR2 and incubated for 24 h. CCL2 cytokine was used as positive control for monocyte migration. ns: non-statistically significant, (*): p=0.0171, (**): p=0.0084, (***): p=0.0003.I) Impact of AGR2 blocking antibodies on AGR2-mediated monocytes migration was tested using Boyden chambers as described above. The concentrations of recombinant human AGR2 was of 200 ng/ml and decreasing amounts of antibodies were used from 20 µg to 1 µg. The non-relevant antibody (Isotype) was used at the maximal dose of 20 µg. Data are representative of three independent experiments. ns: non-statistically significant, (*): p=0.0165 (Ab=20μg/ml), 0.0223 (Ab=10μg/ml) and 0.0493 (Ab=5μg/ml), respectively."}
{"words": ["Figure", "7A", ")", "Selective", "enrichment", "of", "AGR2", "modulators", "in", "colonic", "Crohn", "'", "s", "disease", "(", "CD", ")", ".", "Percentage", "of", "tested", "genes", "with", "altered", "expression", "in", "colonic", "biopsies", "from", "patients", "with", "Ulcerative", "Colitis", "(", "UC", ",", "n", "=", "8", ")", "and", "colonic", "CD", "(", "CC", ",", "n", "=", "15", ")", "and", "in", "ileal", "biopsies", "from", "patients", "with", "ileo", "-", "colonic", "CD", "(", "IC", ",", "n", "=", "9", ")", ".", "B", ")", "Hierarchical", "clustering", "of", "the", "AGR2", "modulator", "genes", "significantly", "deregulated", "in", "non", "-", "inflamed", "colonic", "mucosa", "from", "patients", "with", "Crohn", "'", "s", "Disease", "(", "CD", ")", "versus", "healthy", "controls", "(", "C", ")", "(", "dChip", "software", "t", "-", "Test", ")", "C", ")", "TMED2", "mRNA", "expression", "in", "healthy", "controls", "(", "CT", ")", ",", "colonic", "Crohn", "'", "s", "disease", "(", "CC", ")", "and", "ulcerative", "colitis", "(", "UC", ")", ".", "D", ")", "Representative", "immunohistological", "analysis", "of", "TMED2", "in", "non", "-", "inflamed", "colonic", "biopsies", "from", "healthy", "controls", "and", "patients", "with", "active", "CD", ".", "E", ")", "Representative", "immunohistological", "analysis", "of", "CD163", "(", "scavenger", "receptor", "present", "in", "macrophages", ")", ",", "AGR2", ",", "and", "TMED2", "in", "non", "-", "inflamed", "colonic", "biopsies", "from", "healthy", "controls", "and", "patients", "with", "active", "or", "quiescent", "CD", ".", "F", ")", "Semi", "-", "quantitative", "analysis", "of", "CD163", ",", "AGR2", ",", "and", "TMED2", "immunostaining", "in", "colonic", "mucosa", "from", "healthy", "controls", "(", "C", ")", "and", "patients", "with", "quiescent", "(", "Q", ")", "or", "active", "(", "A", ")", "CD", ".", "Three", "random", "sections", "from", "each", "patient", "of", "the", "four", "groups", "were", "scored", ".", "Final", "IHC", "scores", "(", "AxB", "range", "to", "0", "-", "9", ")", "combine", "the", "percentage", "of", "positively", "labelled", "cells", ".", "A", ":", "%", "of", "IHC", "positive", "labeled", "cells", "-", "0", "(", "0", "%", ")", ",", "1", "(", "<", "30", "%", ")", ",", "2", "(", "30", "to", "60", "%", ")", ",", "3", "(", ">", "60", "%", ")", ")", "and", "the", "intensity", "of", "the", "reaction", "product", ".", "B", ":", "0", "(", "no", "reaction", ")", ",", "1", "(", "weak", ")", ",", "2", "(", "mild", ")", ",", "3", "(", "strong", ")", "in", "most", "of", "the", "examined", "fields", ".", "All", "values", "are", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A) Selective enrichment of AGR2 modulators in colonic Crohn's disease (CD). Percentage of tested genes with altered expression in colonic biopsies from patients with Ulcerative Colitis (UC, n=8) and colonic CD (CC, n=15) and in ileal biopsies from patients with ileo-colonic CD (IC, n=9).B) Hierarchical clustering of the AGR2 modulator genes significantly deregulated in non-inflamed colonic mucosa from patients with Crohn's Disease (CD) versus healthy controls (C) (dChip software t-Test)C) TMED2 mRNA expression in healthy controls (CT), colonic Crohn's disease (CC) and ulcerative colitis (UC).D) Representative immunohistological analysis of TMED2 in non-inflamed colonic biopsies from healthy controls and patients with active CD.E) Representative immunohistological analysis of CD163 (scavenger receptor present in macrophages), AGR2, and TMED2 in non-inflamed colonic biopsies from healthy controls and patients with active or quiescent CD.F) Semi-quantitative analysis of CD163, AGR2, and TMED2 immunostaining in colonic mucosa from healthy controls (C) and patients with quiescent (Q) or active (A) CD. Three random sections from each patient of the four groups were scored. Final IHC scores (AxB range to 0-9) combine the percentage of positively labelled cells. A: % of IHC positive labeled cells - 0 (0%), 1 (<30%), 2 (30 to 60%), 3 (>60%)) and the intensity of the reaction product. B: 0 (no reaction), 1 (weak), 2 (mild), 3 (strong) in most of the examined fields. All values are mean ± S.E.M."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Quantification", "of", "CXCR4", "+", "cells", "by", "flow", "cytometry", "and", "Sox17", "+", "cells", "by", "immunostaining", "at", "day", "7", "following", "differentiation", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "3", "µM", "CH", ".", "Average", "and", "standard", "deviation", "(", "SD", ")", "of", "eight", "independent", "experiments", ".", "(", "B", ")", "Gene", "expression", "profiling", "by", "RT", "-", "PCR", "at", "day", "7", "differentiation", ".", "Average", "and", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "C", ")", "Immunostaining", "for", "Ecadherin", "(", "left", ")", "and", "FoxA2", "(", "right", ")", "at", "day", "7", "of", "differentiation", "in", "presence", "of", "3", "µM", "CH", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "CXCR4", "+", "by", "flow", "cytometry", "over", "a", "seven", "-", "day", "differentiation", "time", "course", "in", "the", "presence", "of", "3", "µM", "CH", ".", "Average", "and", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "E", ")", "Immunostaining", "for", "Sox17", "at", "day", "4", "to", "day", "7", "of", "differentiation", "in", "the", "continuous", "presence", "or", "absence", "of", "3", "µM", "CH", ".", "Scale", "bars", "=", "200"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Quantification of CXCR4+ cells by flow cytometry and Sox17+ cells by immunostaining at day 7 following differentiation in the presence or absence of 3 µM CH. Average and standard deviation (SD) of eight independent experiments.(B) Gene expression profiling by RT-PCR at day 7 differentiation. Average and SD of three independent experiments.(C) Immunostaining for Ecadherin (left) and FoxA2 (right) at day 7 of differentiation in presence of 3 µM CH.(D) Quantification of CXCR4+ by flow cytometry over a seven-day differentiation time course in the presence of 3 µM CH. Average and SD of three independent experiments.(E) Immunostaining for Sox17 at day 4 to day 7 of differentiation in the continuous presence or absence of 3 µM CH. Scale bars = 200 µM"}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Assay", "of", "Tcf7l1", "mRNA", "by", "RT", "-", "PCR", "for", "the", "first", "4", "days", "of", "differentiation", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "3", "μM", "CH", ".", "Average", "and", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Day2", "*", "p", "=", "0", ".", "048", ",", "Day3", "*", "p", "=", "0", ".", "036", ".", "B", ")", "Immunoblot", "for", "Tcf7l1", "at", "day", "3", "of", "differentiation", "in", "the", "presence", "(", "+", ")", "or", "absence", "(", "-", ")", "of", "3", "μM", "CH", ".", "(", "C", ")", "Assay", "of", "FoxA2", "mRNA", "by", "RT", "-", "PCR", "for", "the", "first", "3", "days", "of", "differentiation", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "3", "µM", "CH", ".", "Average", "and", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "*", "p", "=", "5x10", "-", "7", ".", "(", "D", ")", "ChiP", "-", "seq", "data", "from", "a", "compendium", "of", "transcription", "factor", "ChIP", "-", "seq", "analyses", "(", "Sánchez", "-", "Castillo", "et", "al", ",", "2015", ")", ".", "Gene", "tracks", "represent", "binding", "of", "Tcf7l1", "at", "the", "FoxA2", ",", "Nodal", "and", "Eomesodermin", "(", "Eomes", ")", "gene", "locus", ".", "Red", "lines", "indicate", "the", "regions", "analyzed", "by", "ChIP", "PCR", "for", "Tcf7l1", ".", "(", "E", ")", "ChIP", "for", "Tcf7l1", "followed", "by", "qPCR", "for", "the", "regions", "indicated", "in", "Fig", ".", "2D", ".", "Analysis", "was", "performed", "in", "wild", "-", "type", "ES", "cells", "in", "2i", "culture", "conditions", ".", "Average", "and", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Klf2", "*", "p", "=", "0", ".", "025", ",", "FoxA2", "*", "p", "=", "0", ".", "050", ",", "Eomes", "*", "p", "=", "0", ".", "023", ".", "(", "F", ")", "ChIP", "for", "Tcf7l1", "followed", "by", "qPCR", ".", "Analysis", "was", "performed", "in", "wild", "-", "type", "ES", "cells", "on", "day", "3", "of", "differentiation", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "3", "µM", "CH", ".", "Average", "and", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "FoxA2", "*", "p", "=", "0", ".", "049", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Assay of Tcf7l1 mRNA by RT-PCR for the first 4 days of differentiation in the presence or absence of 3 μM CH. Average and SD of three independent experiments. Day2 *p= 0.048, Day3 *p=0.036.B) Immunoblot for Tcf7l1 at day 3 of differentiation in the presence (+) or absence (-) of 3 μM CH.(C) Assay of FoxA2 mRNA by RT-PCR for the first 3 days of differentiation in the presence or absence of 3 µM CH. Average and SD of three independent experiments. **p=5x10-7.(D) ChiP-seq data from a compendium of transcription factor ChIP-seq analyses (Sánchez-Castillo et al, 2015). Gene tracks represent binding of Tcf7l1 at the FoxA2, Nodal and Eomesodermin (Eomes) gene locus. Red lines indicate the regions analyzed by ChIP PCR for Tcf7l1.(E) ChIP for Tcf7l1 followed by qPCR for the regions indicated in Fig. 2D. Analysis was performed in wild-type ES cells in 2i culture conditions. Average and SD of three independent experiments. Klf2 *p=0.025, FoxA2 *p=0.050, Eomes *p=0.023.(F) ChIP for Tcf7l1 followed by qPCR. Analysis was performed in wild-type ES cells on day 3 of differentiation in the presence or absence of 3 µM CH. Average and SD of three independent experiments. FoxA2 *p = 0.049."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Assay", "of", "FoxA2", "mRNA", "by", "RT", "-", "PCR", "in", "Tcf7l1", "null", "cells", "on", "day", "1", "to", "4", "of", "differentiation", "without", "CH", ".", "Average", "and", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "B", ")", "Gene", "expression", "analysis", "of", "endodermal", "associated", "genes", "by", "RT", "-", "PCR", "in", "control", "wild", "-", "type", "and", "Tcf7l1", "null", "cells", "on", "day", "4", "of", "differentiation", "in", "the", "presence", "and", "absence", "of", "3", "µM", "CH", ".", "Average", "and", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "C", ")", "FoxA2", "(", "green", ")", "and", "Oct4", "(", "red", ")", "immunostaining", "of", "Tcf7l1", "null", "ES", "cells", "on", "day", "4", "of", "differentiation", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "3", "µM", "CH", ".", "DAPI", "staining", "in", "blue", ".", "(", "D", ")", "Assay", "of", "CXCR4", ",", "Hex", "and", "Sox17", "mRNA", "by", "RT", "-", "PCR", "in", "control", "wild", "-", "type", "and", "Tcf7l1", "null", "cells", "on", "day", "6", "of", "differentiation", "in", "the", "presence", "and", "absence", "of", "3", "µM", "CH", ".", "Average", "and", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Assay of FoxA2 mRNA by RT-PCR in Tcf7l1 null cells on day 1 to 4 of differentiation without CH. Average and SD of three independent experiments.(B) Gene expression analysis of endodermal associated genes by RT-PCR in control wild-type and Tcf7l1 null cells on day 4 of differentiation in the presence and absence of 3 µM CH. Average and SD of three independent experiments.(C) FoxA2 (green) and Oct4 (red) immunostaining of Tcf7l1 null ES cells on day 4 of differentiation in the presence or absence of 3 µM CH. DAPI staining in blue.(D) Assay of CXCR4, Hex and Sox17 mRNA by RT-PCR in control wild-type and Tcf7l1 null cells on day 6 of differentiation in the presence and absence of 3 µM CH. Average and SD of three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Assay", "of", "FoxA2", "mRNA", "by", "RT", "-", "PCR", "in", "FoxA2", "-", "Tet", "ES", "cell", "lines", "48", "hr", "after", "treatment", "with", "the", "indicated", "dose", "of", "DOX", ".", "Average", "and", "SD", "of", "two", "independent", "experiments", "from", "2", "independent", "lines", ".", "B", ")", "FoxA2", "immunostaining", "of", "FoxA2", "-", "Tet", "ES", "cells", "48", "hr", "after", "DOX", "treatment", ".", "Left", ",", "no", "DOX", "control", ".", "Middle", "and", "right", ",", "10ng", "/", "ml", "DOX", ".", "DAPI", "staining", "shown", "in", "blue", ".", "Right", "panel", "shows", "middle", "image", "without", "DAPI", "signal", ".", "(", "C", ")", "Assay", "of", "FoxA2", "and", "CXCR4", "mRNA", "by", "RT", "-", "PCR", "on", "day", "3", "of", "differentiation", "with", "DOX", "at", "the", "indicated", "dose", ".", "Average", "and", "SD", "of", "two", "experiments", "from", "two", "independent", "cell", "lines", ".", "(", "D", ")", "Assay", "of", "Sox17", "mRNA", "by", "RT", "-", "PCR", "on", "day", "7", "of", "differentiation", "with", "addition", "of", "3", "µM", "CH", "and", "/", "or", "10", "ng", "/", "ml", "DOX", "at", "the", "indicated", "time", "points", "(", "in", "days", ")", ".", "Average", "and", "SD", "of", "two", "independent", "experiments", "from", "two", "independent", "cell", "lines", ".", "(", "E", ")", "Sox17", "immunostaining", "of", "FoxA2", "-", "Tet", "ES", "cells", "at", "day", "7", "of", "differentiation", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "10", "ng", "/", "ml", "DOX", "and", "the", "presence", "and", "absence", "of", "3", "µM", "CH", "as", "indicated", ".", "Far", "right", "panel", "shows", "image", "to", "its", "left", "without", "DAPI", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Assay of FoxA2 mRNA by RT-PCR in FoxA2-Tet ES cell lines 48 hr after treatment with the indicated dose of DOX. Average and SD of two independent experiments from 2 independent lines.B) FoxA2 immunostaining of FoxA2-Tet ES cells 48 hr after DOX treatment. Left, no DOX control. Middle and right, 10ng/ml DOX. DAPI staining shown in blue. Right panel shows middle image without DAPI signal.(C) Assay of FoxA2 and CXCR4 mRNA by RT-PCR on day 3 of differentiation with DOX at the indicated dose. Average and SD of two experiments from two independent cell lines.(D) Assay of Sox17 mRNA by RT-PCR on day 7 of differentiation with addition of 3 µM CH and/or 10 ng/ml DOX at the indicated time points (in days). Average and SD of two independent experiments from two independent cell lines.(E) Sox17 immunostaining of FoxA2-Tet ES cells at day 7 of differentiation in the presence or absence of 10 ng/ml DOX and the presence and absence of 3 µM CH as indicated. Far right panel shows image to its left without DAPI."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "TOPFlash", "reporter", "activity", "following", "differentiation", "for", "3", "days", "in", "3", "µM", "CH", "or", "100", "ng", "/", "ml", "(", "W100", ")", "or", "200", "ng", "/", "ml", "(", "W200", ")", "recombinant", "Wnt3a", "plus", "500", "ng", "/", "ml", "recombinant", "RSpondin1", ".", "Relative", "luciferase", "units", "are", "normalised", "to", "FOPflash", ".", "Average", "and", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "B", ")", "Assay", "of", "Tcf7l1", "and", "FoxA2", "mRNA", "by", "RT", "-", "PCR", "at", "day", "2", "of", "differentiation", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "3", "µM", "CH", "or", "recombinant", "Wnt3a", "(", "200", "ng", "/", "ml", "plus", "500", "ng", "/", "ml", "RSpondin1", "(", "WR", ")", ")", ".", "Average", "and", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "(", "C", ")", "Assay", "of", "Tcf7l1", "and", "FoxA2", "mRNA", "by", "RT", "-", "PCR", "in", "Ctnnb1", "null", "cells", "at", "day", "1", "and", "3", "of", "differentiation", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "3", "µM", "CH", ".", "Average", "and", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "D", ")", "Immunoblot", "for", "Tcf7l1", "in", "Ctnnb1", "null", "cells", "during", "the", "first", "3", "days", "of", "differentiation", "in", "the", "absence", "(", "-", ")", "or", "presence", "(", "+", ")", "of", "3", "µM", "CH", ".", "Results", "from", "two", "independent", ",", "clonally", "-", "derived", "Ctnnb1", "null", "ES", "cell", "lines", "are", "shown", ".", "Tubulin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) TOPFlash reporter activity following differentiation for 3 days in 3 µM CH or 100 ng/ml (W100) or 200 ng/ml (W200) recombinant Wnt3a plus 500 ng/ml recombinant RSpondin1. Relative luciferase units are normalised to FOPflash. Average and SD of three independent experiments.(B) Assay of Tcf7l1 and FoxA2 mRNA by RT-PCR at day 2 of differentiation in the presence or absence of 3 µM CH or recombinant Wnt3a (200 ng/ml plus 500 ng/ml RSpondin1(WR)). Average and SD of three independent experiments. ** p<0.01.(C) Assay of Tcf7l1 and FoxA2 mRNA by RT-PCR in Ctnnb1 null cells at day 1 and 3 of differentiation in the absence or presence of 3 µM CH. Average and SD of three independent experiments.(D) Immunoblot for Tcf7l1 in Ctnnb1 null cells during the first 3 days of differentiation in the absence (-) or presence (+) of 3 µM CH. Results from two independent, clonally-derived Ctnnb1 null ES cell lines are shown. Tubulin was used as a loading control."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Assay", "of", "cMyc", "mRNA", "by", "RT", "-", "PCR", "in", "wild", "-", "type", "ES", "cells", "at", "day", "1", "to", "3", "of", "differentiation", ".", "Average", "and", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "B", ")", "Immunoblot", "for", "total", "cMyc", "and", "phospho", "Ser62", "(", "pSer62", ")", "cMyc", "during", "the", "first", "3", "days", "of", "differentiation", "in", "the", "absence", "(", "-", ")", "or", "presence", "(", "+", ")", "of", "3", "µM", "CH", ".", "C", ",", "D", ")", "Immunoblot", "for", "the", "destabilized", "form", "of", "cMyc", "protein", "(", "pThr58", ")", "during", "the", "first", "3", "days", "of", "differentiation", "in", "the", "absence", "(", "-", ")", "or", "presence", "(", "+", ")", "of", "3", "µM", "CH", "in", "wild", "-", "type", "and", "Ctnnb1", "null", "cells", "respectively", ".", "C", ",", "D", ")", "Immunoblot", "for", "the", "destabilized", "form", "of", "cMyc", "protein", "(", "pThr58", ")", "during", "the", "first", "3", "days", "of", "differentiation", "in", "the", "absence", "(", "-", ")", "or", "presence", "(", "+", ")", "of", "3", "µM", "CH", "in", "wild", "-", "type", "and", "Ctnnb1", "null", "cells", "respectively", ".", "(", "E", ")", "Assay", "of", "Tcf7l1", "mRNA", "by", "RT", "-", "PCR", "in", "wild", "-", "type", "cells", "at", "day", "2", "of", "differentiation", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "a", "small", "molecule", "inhibitor", "of", "cMyc", "(", "cMyc", "Inhibitor", "II", ";", "Myci", ")", ".", "Treatment", "with", "Myc", "inhibitor", "10058", "-", "F4", "(", "Sigma", ")", "generated", "similar", "results", "(", "data", "not", "shown", ")", ".", "Average", "and", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0002", ".", "(", "F", ")", "Assay", "of", "Tcf7l1", "and", "FoxA2", "mRNA", "by", "RT", "-", "PCR", "in", "cMyc", "null", "/", "nMyc", "heterozygous", "cells", "(", "C", "-", "/", "-", ";", "N", "+", "/", "-", ")", "and", "floxed", "parental", "cells", "(", "cMycfl", "/", "fl", ";", "nMycfl", "/", "fl", "(", "control", ")", ")", "at", "day", "3", "of", "differentiation", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "3", "µM", "CH", ".", "Average", "and", "SD", "of", "four", "or", "six", "independent", "experiments", ".", "Tcf7l1", "*", "p", "=", "0", ".", "01", ",", "FoxA2", "*", "p", "=", "0", ".", "034", ".", "(", "G", ")", "FoxA2", "immunostaining", "of", "control", "and", "cMyc", "null", "/", "nMyc", "heterozygous", "(", "cMyc", "-", "/", "-", ";", "nMyc", "+", "/", "-", ")", "cells", "at", "day", "3", "of", "differentiation", "in", "the", "presence", "of", "3", "µM", "CH", ".", "(", "H", ")", "Assay", "of", "cMyc", "and", "Tcf7l1", "mRNA", "by", "RT", "-", "PCR", "in", "cMycT58A", "inducible", "cell", "lines", "(", "icMycT58A", ")", "24", "hr", "after", "DOX", "treatment", ".", "Average", "of", "2", "independent", "experiments", ".", "(", "I", ")", "Assay", "of", "Tcf7l1", "mRNA", "by", "RT", "-", "PCR", "in", "icMycT58A", "clone", "1", "cell", "line", "at", "day", "3", "of", "differentiation", "in", "the", "absence", "of", "3", "µM", "CH", "following", "cMyc", "induction", "with", "10", "ng", "/", "ml", "DOX", ".", "Average", "and", "SD", "of", "3", "independent", "experiments", ".", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "007", ".", "(", "J", ")", "Immunoblot", "for", "cMyc", "and", "Tcf7l1", "in", "icMycT58A", "clonal", "cell", "line", "1", "48", "hr", "after", "DOX", "induction", "at", "10ng", "/", "ml", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Assay of cMyc mRNA by RT-PCR in wild-type ES cells at day 1 to 3 of differentiation. Average and SD of three independent experiments.(B) Immunoblot for total cMyc and phospho Ser62 (pSer62) cMyc during the first 3 days of differentiation in the absence (-) or presence (+) of 3 µM CH.C,D) Immunoblot for the destabilized form of cMyc protein (pThr58) during the first 3 days of differentiation in the absence (-) or presence (+) of 3 µM CH in wild-type and Ctnnb1 null cells respectively.C,D) Immunoblot for the destabilized form of cMyc protein (pThr58) during the first 3 days of differentiation in the absence (-) or presence (+) of 3 µM CH in wild-type and Ctnnb1 null cells respectively.(E) Assay of Tcf7l1 mRNA by RT-PCR in wild-type cells at day 2 of differentiation in the presence or absence of a small molecule inhibitor of cMyc (cMyc Inhibitor II; Myci). Treatment with Myc inhibitor 10058-F4 (Sigma) generated similar results (data not shown). Average and SD of three independent experiments. **p=0.0002.(F) Assay of Tcf7l1 and FoxA2 mRNA by RT-PCR in cMyc null/nMyc heterozygous cells (C-/-;N+/-) and floxed parental cells (cMycfl/fl;nMycfl/fl (control)) at day 3 of differentiation in the presence or absence of 3 µM CH. Average and SD of four or six independent experiments. Tcf7l1 *p=0.01, FoxA2 *p=0.034.(G) FoxA2 immunostaining of control and cMyc null/nMyc heterozygous (cMyc-/-;nMyc+/-) cells at day 3 of differentiation in the presence of 3 µM CH.(H) Assay of cMyc and Tcf7l1 mRNA by RT-PCR in cMycT58A inducible cell lines (icMycT58A) 24 hr after DOX treatment. Average of 2 independent experiments.(I) Assay of Tcf7l1 mRNA by RT-PCR in icMycT58A clone 1 cell line at day 3 of differentiation in the absence of 3 µM CH following cMyc induction with 10 ng/ml DOX. Average and SD of 3 independent experiments. **p=0.007.(J) Immunoblot for cMyc and Tcf7l1 in icMycT58A clonal cell line 1 48 hr after DOX induction at 10ng/ml."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "B", ")", "ChIP", "for", "cMyc", "performed", "in", "wild", "-", "type", "ES", "cells", "differentiated", "for", "2", "days", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "3", "µM", "CH", ".", "qPCR", "was", "carried", "out", "for", "the", "regions", "indicated", "in", "Fig", ".", "7a", ".", "Average", "and", "SD", "for", "five", "independent", "experiments", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "028", ".", "(", "C", ")", "ChIP", "for", "cMyc", "performed", "in", "wild", "-", "type", "ES", "cells", "differentiated", "for", "2", "days", "in", "the", "presence", "of", "3", "µM", "CH", "plus", "or", "minus", "Myc", "inhibitor", "10058", "-", "F4", ".", "Average", "and", "SD", "for", "three", "independent", "experiments", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "026", ".", "(", "D", ")", "Assay", "for", "Miz1", "mRNA", "by", "RT", "-", "PCR", "for", "the", "first", "three", "days", "of", "differentiation", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "3", "µM", "CH", ".", "Average", "and", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "E", ")", "ChIP", "for", "Miz1", "or", "IgG", "control", "performed", "in", "E14", "ES", "cells", "differentiated", "for", "2", "days", "in", "presence", "of", "3", "µM", "CH", ".", "qPCR", "was", "carried", "out", "for", "the", "regions", "indicated", "in", "Fig", ".", "7a", ".", "Average", "and", "SD", "for", "five", "independent", "experiments", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0015", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(B) ChIP for cMyc performed in wild-type ES cells differentiated for 2 days in the absence or presence of 3 µM CH. qPCR was carried out for the regions indicated in Fig. 7a. Average and SD for five independent experiments, *p=0.028.(C) ChIP for cMyc performed in wild-type ES cells differentiated for 2 days in the presence of 3 µM CH plus or minus Myc inhibitor 10058-F4. Average and SD for three independent experiments, *p=0.026.(D) Assay for Miz1 mRNA by RT-PCR for the first three days of differentiation in the presence or absence of 3 µM CH. Average and SD of three independent experiments.(E) ChIP for Miz1 or IgG control performed in E14 ES cells differentiated for 2 days in presence of 3 µM CH. qPCR was carried out for the regions indicated in Fig. 7a. Average and SD for five independent experiments, **p=0.0015."}
{"words": ["Figure", "1", "WT", "and", "hCDC14APD", "RPE1", "cells", "were", "serum", "starved", "for", "48", "h", "for", "inducing", "ciliogenesis", "prior", "to", "fixation", ".", "Cilia", "were", "stained", "with", "Arl13B", "(", "green", ")", "while", "the", "basal", "bodies", "were", "marked", "with", "C", "-", "Nap1", "(", "red", ")", ".", "DNA", "was", "stained", "with", "DAPI", ".", "Cilia", "in", "the", "magenta", "box", "are", "shown", "enlarged", "on", "the", "right", "picture", "WT", "and", "hCDC14APD", "RPE1", "cells", "were", "serum", "starved", "for", "48", "h", "for", "inducing", "ciliogenesis", "prior", "to", "fixation", ".", "Cilia", "were", "stained", "with", "Arl13B", "(", "green", ")", "while", "the", "basal", "bodies", "were", "marked", "with", "C", "-", "Nap1", "(", "red", ")", ".", "DNA", "was", "stained", "with", "DAPI", "Percent", "of", "ciliated", "cells", ",", "as", "well", "as", "the", "length", "of", "cilia", ",", "was", "quantified", "from", "A", ".", "Cilia", "length", "was", "measured", "by", "a", "semi", "-", "automated", "ImageJ", "macro", "as", "described", "in", "methods", ".", "Data", "points", "are", "the", "average", "of", "three", "independent", "experiments", "with", "N", "=", "150", "cilia", "for", "each", "experiment", "and", "condition", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "mean", "±", "SD", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "0001", ".", "High", "means", "80", "-", "90", "%", "and", "low", "40", "-", "50", "%", "confluency", "of", "RPE1", "cells", "Elongated", "cilia", "phenotype", "was", "confirmed", "by", "siRNA", "-", "mediated", "knockdown", "of", "hCDC14A", ".", "Three", "independent", "experiments", ",", "N", "=", "150", "cilia", "for", "each", "experiment", "and", "condition", ".", "Mean", "±", "SD", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "0001", "hCDC14A", "-", "GFP", "and", "hCDC14AC278S", "-", "GFP", "under", "control", "of", "the", "TetON", "promoter", "were", "stably", "integrated", "into", "RPE1", "cells", ".", "hCDC14A", "-", "GFP", "and", "hCDC14AC278S", "-", "GFP", "localized", "to", "the", "C", "-", "Nap1", "marked", "basal", "body", "upon", "Dox", "induction", ".", "In", "addition", ",", "expression", "of", "hCDC14A", "-", "GFP", "but", "not", "the", "phosphatase", "dead", "hCDC14AC278S", "-", "GFP", "mutant", "inhibited", "cilia", "formation", ".", "Ciliated", "cells", "were", "quantified", "48", "h", "after", "serum", "starvation", "with", "and", "without", "Dox", "addition", ".", "Three", "independent", "experiments", ";", "N", "=", "150", "cilia", "for", "each", "experiment", "and", "condition", ".", "Mean", "±", "SD", ".", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "001", ";", "ns", ":", "not", "significant", "Expression", "of", "hCDC14A", "-", "GFP", "and", "hCDC14AC278S", "-", "GFP", "was", "validated", "by", "immunoblot", "analysis", "with", "anti", "-", "GFP", "antibodies", ".", "GAPDH", "was", "the", "loading", "control", "RPE1", "cells", "over", "-", "expressing", "hCDC14AC278S", "have", "longer", "cilia", "than", "those", "over", "-", "expressing", "hCDC14A", ".", "Three", "independent", "experiments", ",", "N", "=", "100", "cilia", "for", "hCDC14A", "expressing", "cells", "and", "200", "for", "hCDC14AC278S", "expressing", "cells", ".", "Mean", "±", "SD", ".", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "001", "The", "dynamics", "of", "ciliogenesis", "was", "determined", "by", "serum", "starving", "WT", "and", "hCDC14APD", "cells", "for", "different", "time", "-", "points", ".", "The", "cilia", "from", "hCDC14APD", "cells", "continue", "to", "elongate", "even", "after", "48", "h", "of", "starvation", "whereas", "those", "from", "WT", "cells", "reached", "constant", "length", "within", "12", "to", "24", "h", ".", "Three", "independent", "experiments", ";", "N", "=", "150", "cilia", "for", "each", "experiment", "and", "condition", ".", "Mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ";", "P", "≤", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "0001", "In", "a", "time", "course", "experiment", ",", "the", "cilia", "disassembly", "kinetics", "was", "measured", "by", "first", "inducing", "ciliation", "through", "48", "h", "of", "serum", "starvation", "prior", "to", "incubation", "with", "serum", "containing", "media", "for", "different", "time", "points", ".", "Measurement", "of", "cilia", "length", "indicated", "the", "comparable", "rates", "of", "cilia", "disassembly", "in", "RPE1", "WT", "and", "hCDC14APD", "cells", ".", "Cilia", "disassembly", "rates", "are", "shown", "in", "Fig", ".", "EV1D", ".", "Three", "independent", "experiments", ",", "N", "=", "150", "cilia", "for", "each", "experiment", "and", "condition", ".", "Mean", "±", "SEM", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "Images", "of", "cilia", "of", "WT", "RPE1", "and", "hCDC14APD", "RPE1", "cells", "from", "I", ",", "0", ",", "6", "and", "24", "h", "after", "serum", "addition", ".", "Fixed", "cells", "were", "analyzed", "for", "cilia", "length"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1 WT and hCDC14APD RPE1 cells were serum starved for 48 h for inducing ciliogenesis prior to fixation. Cilia were stained with Arl13B (green) while the basal bodies were marked with C-Nap1 (red). DNA was stained with DAPI. Cilia in the magenta box are shown enlarged on the right picture  WT and hCDC14APD RPE1 cells were serum starved for 48 h for inducing ciliogenesis prior to fixation. Cilia were stained with Arl13B (green) while the basal bodies were marked with C-Nap1 (red). DNA was stained with DAPI Percent of ciliated cells, as well as the length of cilia, was quantified from A. Cilia length was measured by a semi-automated ImageJ macro as described in methods. Data points are the average of three independent experiments with N = 150 cilia for each experiment and condition. Error bars represent the mean ± SD. **** P≤ 0.0001. High means 80-90% and low 40-50% confluency of RPE1 cells Elongated cilia phenotype was confirmed by siRNA-mediated knockdown of hCDC14A. Three independent experiments, N = 150 cilia for each experiment and condition. Mean ± SD. **** P≤ 0.0001  hCDC14A-GFP and hCDC14AC278S-GFP under control of the TetON promoter were stably integrated into RPE1 cells. hCDC14A-GFP and hCDC14AC278S-GFP localized to the C-Nap1 marked basal body upon Dox induction. In addition, expression of hCDC14A-GFP but not the phosphatase dead hCDC14AC278S-GFP mutant inhibited cilia formation. Ciliated cells were quantified 48 h after serum starvation with and without Dox addition. Three independent experiments; N = 150 cilia for each experiment and condition. Mean ± SD. *** P≤ 0.001; ns: not significant  Expression of hCDC14A-GFP and hCDC14AC278S-GFP was validated by immunoblot analysis with anti-GFP antibodies. GAPDH was the loading control  RPE1 cells over-expressing hCDC14AC278S have longer cilia than those over-expressing hCDC14A. Three independent experiments, N = 100 cilia for hCDC14A expressing cells and 200 for hCDC14AC278S expressing cells. Mean ± SD. *** P≤ 0.001  The dynamics of ciliogenesis was determined by serum starving WT and hCDC14APD cells for different time-points. The cilia from hCDC14APD cells continue to elongate even after 48 h of starvation whereas those from WT cells reached constant length within 12 to 24 h. Three independent experiments; N = 150 cilia for each experiment and condition. Mean ± SEM. * P≤ 0.05, **; P≤ 0.01; **** P≤ 0.0001 In a time course experiment, the cilia disassembly kinetics was measured by first inducing ciliation through 48 h of serum starvation prior to incubation with serum containing media for different time points. Measurement of cilia length indicated the comparable rates of cilia disassembly in RPE1 WT and hCDC14APD cells. Cilia disassembly rates are shown in Fig. EV1D. Three independent experiments, N = 150 cilia for each experiment and condition. Mean ± SEM. **** P<0.0001  Images of cilia of WT RPE1 and hCDC14APD RPE1 cells from I, 0, 6 and 24 h after serum addition. Fixed cells were analyzed for cilia length "}
{"words": ["Figure", "2TetON", "-", "hCDC14A", "-", "GFP", "RPE1", "cells", "were", "serum", "starved", "for", "48", "h", "prior", "to", "fixation", "and", "immunofluorescence", "microscopy", ".", "hCDC14A", "-", "GFP", "colocalizes", "with", "Phalloidin", "555", "conjugated", "dye", "that", "marks", "F", "-", "actin", "fibers", ".", "The", "boxed", "area", "was", "10", "-", "fold", "enlarged", "and", "displayed", "below", "the", "corresponding", "images", "to", "indicate", "co", "-", "localization", "of", "hCDC14A", "-", "GFP", "and", "F", "-", "actin", ".", "Line", "scan", "inside", "the", "magenta", "colored", "box", "showed", "in", "(", "A", ")", "Sub", "-", "centrosomal", "localization", "of", "hCDC14AC278S", "-", "GFP", "was", "determined", "by", "correlative", "positioning", "of", "the", "GFP", "signal", "with", "the", "proteins", "Arl13B", "and", "IFT88", "(", "cilia", ")", ",", "C", "-", "Nap1", "/", "ninein", "(", "proximal", "end", ")", ",", "CEP164", "(", "distal", "appendage", ")", "and", "ODF2", "/", "ninein", "(", "subdistal", "appendage", ")", ".", "Results", "are", "fitted", "in", "the", "cartoons", "adjacent", "to", "the", "respective", "panels", "for", "better"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2TetON-hCDC14A-GFP RPE1 cells were serum starved for 48 h prior to fixation and immunofluorescence microscopy. hCDC14A-GFP colocalizes with Phalloidin 555 conjugated dye that marks F-actin fibers. The boxed area was 10-fold enlarged and displayed below the corresponding images to indicate co-localization of hCDC14A-GFP and F-actin. Line scan inside the magenta colored box showed in (A)Sub-centrosomal localization of hCDC14AC278S-GFP was determined by correlative positioning of the GFP signal with the proteins Arl13B and IFT88 (cilia), C-Nap1/ninein (proximal end), CEP164 (distal appendage) and ODF2/ ninein (subdistal appendage). Results are fitted in the cartoons adjacent to the respective panels for better visualization"}
{"words": ["Figure", "4hCDC14A", ",", "not", "the", "inactive", "hCDC14AC278S", ",", "dephosphorylates", "the", "serine", "residue", "142", "of", "DBN1", "in", "vivo", ".", "RPE1", "cells", "expressing", "GFP", ",", "hCDC14A", "-", "GFP", ",", "and", "hCDC14AC278S", "-", "GFP", "under", "TetON", "promoter", "were", "serum", "starved", "in", "presence", "or", "absence", "of", "Dox", "for", "48", "h", "prior", "to", "fixation", "for", "immunofluorescence", ".", "DBN1pS142", "was", "detected", "with", "a", "phospho", "-", "specific", "antibody", ".", "DNA", "was", "stained", "with", "DAPI", ".", "Scale", "Bar", "=", "10", "μmImmunoblot", "analysis", "of", "samples", "from", "(", "A", ")", ".", "The", "DBN1pS142", "/", "DBN1", "ratio", "was", "densitometrically", "measured", "from", "the", "Dox", "treated", "samples", "and", "represented", "in", "the", "graph", "next", "to", "the", "immunoblot", ".", "In", "this", "experiment", "two", "GAPDH", "blots", "were", "used", "to", "normalize", "protein", "levels", "because", "DBN1", "and", "DBN1pS142", "were", "analyzed", "in", "separated", "blots", ".", "Three", "independent", "experiments", ".", "Mean", "±", "SD", ".", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "001DBN1S142", "was", "hyper", "-", "phosphorylated", "in", "hCDC14APD", "cell", "lines", "during", "ciliogenesis", "compared", "to", "the", "WT", "control", ".", "In", "this", "experiment", "we", "sequentially", "analyzed", "DBN1pS142", "and", "DBN1", "on", "the", "same", "blot", ".", "The", "specificity", "of", "the", "DBN1pS142", "antibody", "was", "validated", "by", "siRNA", "mediated", "knock", "-", "down", "of", "DBN1", "in", "both", "hCDC14APD", "cells", "and", "GFP", "/", "hCDC14A", "-", "GFP", "/", "hCDC14AC278S", "-", "GFP", "stable", "cell", "lines", ".", "Three", "independent", "experiments", ".", "Mean", "±", "SD", ".", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "001In", "vitro", "dephosphorylation", "of", "DBN1", "by", "purified", "hCDC14A", ".", "DBN1", "-", "GFP", "was", "transfected", "into", "HEK293T", "cells", "and", "expressed", "for", "48", "h", ".", "DBN1", "-", "GFP", "was", "immunoprecipitated", "from", "cell", "lysates", "with", "GFP", "binder", ".", "The", "immunoprecipitated", "phospho", "-", "DBN1", "was", "then", "incubated", "with", "and", "without", "recombinant", "hCDC14A", "in", "vitro", ".", "The", "DBN1pS142", "/", "DBN1", "ratio", "was", "densitometrically", "measured", ".", "Three", "independent", "experiments", ".", "Mean", "±", "SD", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4hCDC14A, not the inactive hCDC14AC278S, dephosphorylates the serine residue 142 of DBN1 in vivo. RPE1 cells expressing GFP, hCDC14A-GFP, and hCDC14AC278S-GFP under TetON promoter were serum starved in presence or absence of Dox for 48 h prior to fixation for immunofluorescence. DBN1pS142 was detected with a phospho-specific antibody. DNA was stained with DAPI. Scale Bar = 10 μmImmunoblot analysis of samples from (A). The DBN1pS142/DBN1 ratio was densitometrically measured from the Dox treated samples and represented in the graph next to the immunoblot. In this experiment two GAPDH blots were used to normalize protein levels because DBN1 and DBN1pS142 were analyzed in separated blots. Three independent experiments. Mean ± SD. ** P≤ 0.01, *** P≤ 0.001DBN1S142 was hyper-phosphorylated in hCDC14APD cell lines during ciliogenesis compared to the WT control. In this experiment we sequentially analyzed DBN1pS142 and DBN1 on the same blot. The specificity of the DBN1pS142 antibody was validated by siRNA mediated knock-down of DBN1 in both hCDC14APD cells and GFP/hCDC14A-GFP/hCDC14AC278S-GFP stable cell lines. Three independent experiments. Mean ± SD. ** P≤ 0.01, *** P≤ 0.001In vitro dephosphorylation of DBN1 by purified hCDC14A. DBN1-GFP was transfected into HEK293T cells and expressed for 48 h. DBN1-GFP was immunoprecipitated from cell lysates with GFP binder. The immunoprecipitated phospho-DBN1 was then incubated with and without recombinant hCDC14A in vitro. The DBN1pS142/DBN1 ratio was densitometrically measured. Three independent experiments. Mean ± SD. **** P≤ 0.0001"}
{"words": ["Figure", "5The", "absence", "of", "DBN1", "protein", "in", "the", "targeted", "clones", "was", "further", "verified", "by", "immunoblotting", "of", "the", "whole", "cell", "lysate", ".", "GAPDH", "is", "the", "loading", "control", ".", "One", "targeted", "clone", "from", "each", "gRNA", "(", "1", ".", "16", ",", "2", ".", "18", ",", "3", ".", "3", ")", "including", "the", "non", "-", "targeted", "clone", "2", ".", "19", "and", "WT", "control", "were", "serum", "starved", "for", "48", "h", "to", "induce", "ciliogenesis", ".", "Subsequently", ",", "cilia", "length", "was", "measured", ".", "The", "cilia", "from", "DBN1", "KO", "cells", "were", "significantly", "longer", "than", "those", "from", "WT", "or", "non", "-", "targeted", "controls", ".", "Three", "independent", "experiments", ";", "N", "=", "150", "cilia", "for", "each", "experiment", "and", "condition", ".", "Mean", "±", "SD", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "0001", ".", "Overexpression", "of", "DBN1", ",", "DBN1S142A", "and", "DBN1S142D", "in", "RPE1", "WT", "cells", ".", "Three", "independent", "experiments", ",", "N", "=", "150", "cilia", "for", "each", "experiment", "and", "condition", ".", "Mean", "±", "SD", ".", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "001", ";", "ns", ":", "not", "specific", ".", "The", "phospho", "-", "inhibitory", "(", "S142A", ")", "version", "of", "DBN1", "rescued", "the", "elongated", "cilia", "of", "DBN1", "KO", "cells", ".", "Three", "independent", "experiments", ",", "N", "=", "150", "cilia", "for", "each", "experiment", "and", "condition", ".", "Mean", "±", "SD", ".", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "001", ";", "ns", ":", "not", "significant", ".", "Pairwise", "comparison", "was", "done", "with", "unpaired", "student", "'", "s", "t", "-", "test", "and", "the", "p", "-", "value", "was", "written", "in", "the", "figure", ".", "Global", "comparison", "was", "done", "with", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "the", "p", "-", "values", "were", "marked", "with", "stars", ".", "The", "overexpressed", "WT", "DBN1", "was", "hyper", "-", "phosphorylated", "in", "cells", "as", "detected", "by", "phospho", "-", "specific", "DBN1pS142", "antibodies", ".", "The", "DBN1pS142", "antibodies", "did", "not", "detect", "the", "overexpressed", "DBN1S142A", "or", "DBN1S142D", ".", "Immunoblot", "analysis", "confirming", "the", "successful", "siRNA", "depletion", "of", "CDK5", "and", "indicating", "hypo", "-", "phosphorylation", "of", "DBN1S142", "in", "response", "to", "CDK5", "depletion", "The", "DBN1pS142", "/", "GAPDH", "ratio", "from", "(", "H", ")", "was", "densitometrically", "measured", ".", "Three", "independent", "experiments", ".", "Mean", "±", "SD", ".", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", "Depletion", "of", "CDK5", "decreased", "the", "cilia", "length", "in", "WT", "cells", ".", "It", "restored", "cilia", "length", "in", "hCDC14APD", "cells", ".", "Three", "independent", "experiments", ";", "N", "=", "150", "cilia", "for", "each", "experiment", "and", "condition", ".", "Mean", "±", "SD", ".", "*", "*", ";", "P", "≤", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "0001", ";", "ns", ":", "not", "significant", ".", "CDK5", "mediated", "cilia", "length", "decrease", "can", "be", "completely", "blocked", "by", "expression", "of", "the", "phospho", "-", "mimetic", "DBN1S142D", "in", "hCDC14APD", "cells", ".", "Three", "independent", "experiments", ";", "150", "cells", "per", "experiment", "and", "condition", ".", "Mean", "±", "SD", ";", "ns", "=", "not", "significant", ";", "*", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5The absence of DBN1 protein in the targeted clones was further verified by immunoblotting of the whole cell lysate. GAPDH is the loading control.One targeted clone from each gRNA (1.16, 2.18, 3.3) including the non-targeted clone 2.19 and WT control were serum starved for 48 h to induce ciliogenesis. Subsequently, cilia length was measured. The cilia from DBN1 KO cells were significantly longer than those from WT or non-targeted controls. Three independent experiments; N = 150 cilia for each experiment and condition. Mean ± SD. **** P≤ 0.0001.Overexpression of DBN1, DBN1S142A and DBN1S142D in RPE1 WT cells. Three independent experiments, N = 150 cilia for each experiment and condition. Mean ± SD. ** P≤ 0.01; *** P≤ 0.001; ns: not specific. The phospho-inhibitory (S142A) version of DBN1 rescued the elongated cilia of DBN1 KO cells. Three independent experiments, N = 150 cilia for each experiment and condition. Mean ± SD. * P≤ 0.05; *** P≤ 0.001; ns: not significant. Pairwise comparison was done with unpaired student's t-test and the p-value was written in the figure. Global comparison was done with one-way ANOVA and the p-values were marked with stars.  The overexpressed WT DBN1 was hyper-phosphorylated in cells as detected by phospho-specific DBN1pS142 antibodies. The DBN1pS142 antibodies did not detect the overexpressed DBN1S142A or DBN1S142D.  Immunoblot analysis confirming the successful siRNA depletion of CDK5 and indicating hypo-phosphorylation of DBN1S142 in response to CDK5 depletion The DBN1pS142/GAPDH ratio from (H) was densitometrically measured. Three independent experiments. Mean ± SD. * P≤ 0.05 Depletion of CDK5 decreased the cilia length in WT cells. It restored cilia length in hCDC14APD cells. Three independent experiments; N = 150 cilia for each experiment and condition. Mean ± SD. **; P≤ 0.01; **** P≤ 0.0001; ns: not significant.CDK5 mediated cilia length decrease can be completely blocked by expression of the phospho-mimetic DBN1S142D in hCDC14APD cells. Three independent experiments; 150 cells per experiment and condition. Mean ± SD; ns = not significant; **** P≤ 0.0001."}
{"words": ["Figure", "6", "Transferrin", "uptake", "was", "measured", "with", "serum", "starvation", "or", "4", "h", "after", "serum", "starvation", "as", "described", "[", "17", "]", ".", "Fluorescent", "transferrin", "was", "added", "for", "45", "min", "to", "the", "cells", ".", "Cells", "were", "analyzed", "after", "washing", ".", "The", "red", "circle", "around", "the", "mother", "centriole", "marker", "CEP164", "indicates", "the", "fluorescence", "intensity", "that", "was", "determined", "for", "(", "B", ")", ".", "The", "encircled", "area", "in", "MERGE", "is", "shown", "2", "-", "fold", "enlarged", "on", "the", "right", "hand", "side", "of", "the", "figure", "Quantification", "of", "(", "A", ")", ".", "The", "fluorescence", "intensities", "of", "transferrin", "within", "a", "2", "μm", "-", "radius", "circle", "surrounding", "the", "CEP164", "signal", "were", "quantified", ".", "An", "ImageJ", "macro", "was", "used", "to", "measure", "the", "intensity", "as", "described", "in", "methods", ".", "Data", "were", "calculated", "from", "a", "total", "of", "120", "cells", "pooled", "from", "two", "independent", "experiments", ".", "Mean", "±", "SD", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "0001", "hCDC14APD", "cells", "showed", "an", "increased", "localization", "of", "myosin", "Va", "containing", "vesicles", "within", "the", "1", "μm", "-", "radius", "of", "the", "basal", "body", "(", "red", "cicle", ")", ".", "The", "encircled", "area", "in", "MERGE", "is", "shown", "4", "-", "fold", "enlarged", "on", "the", "right", "hand", "side", "of", "the", "figure", "Quantification", "of", "C", ".", "Data", "was", "calculated", "from", "a", "total", "of", "180", "cells", "pooled", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Mean", "±", "SD", ".", "*", "P", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "0001", "Arp2", "localization", "in", "REP1", "WT", ",", "hCDC14APD", "and", "DBN1", "KO", "cells", ".", "Signal", "intensity", "was", "measured", "30", "min", "after", "serum", "starvation", ".", "The", "encircled", "area", "in", "MERGE", "is", "shown", "4", "-", "fold", "enlarged", "on", "the", "right", "hand", "side", "of", "the", "figure", "Quantification", "of", "E", ".", "Sub", "-", "centrosomal", "(", "1", "μm", "-", "radius", ";", "red", "circle", "in", "E", ")", "Arp2", "was", "measured", "by", "quantifying", "the", "intensity", "of", "Arp2", "in", "WT", ",", "hCDC14APD", "and", "DBN1", "KO", "cells", ".", "Both", "hCDC14APD", "and", "DBN1", "KO", "cells", "contain", "significantly", "higher", "Arp2", "in", "the", "pericentrosomal", "area", "(", "1", "μm", "-", "radius", ")", "compared", "to", "WT", "cells", "after", "30", "min", "of", "serum", "starvation", ".", "Data", "were", "calculated", "from", "a", "total", "of", "120", "cells", "pooled", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Mean", "±", "SD", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "0001", "Pericentrosomal", "ARP2", "enrichment", "was", "comparable", "in", "the", "RPE1", "DBN1", "KO", "cells", "(", "Tet", "Control", ")", "with", "DBN1", "KO", "cells", "expressing", "different", "DBN1", "versions", "(", "WT", ",", "S142A", ",", "S142D", ")", ".", "Data", "were", "calculated", "from", "a", "total", "of", "200", "cells", "each", "pooled", "from", "two", "independent", "experiments", ".", "Mean", "±", "SD", ".", "ns", ":", "not", "specific"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6 Transferrin uptake was measured with serum starvation or 4 h after serum starvation as described [17]. Fluorescent transferrin was added for 45 min to the cells. Cells were analyzed after washing. The red circle around the mother centriole marker CEP164 indicates the fluorescence intensity that was determined for (B). The encircled area in MERGE is shown 2-fold enlarged on the right hand side of the figure Quantification of (A). The fluorescence intensities of transferrin within a 2 μm-radius circle surrounding the CEP164 signal were quantified. An ImageJ macro was used to measure the intensity as described in methods. Data were calculated from a total of 120 cells pooled from two independent experiments. Mean ± SD. **** P≤ 0.0001  hCDC14APD cells showed an increased localization of myosin Va containing vesicles within the 1 μm-radius of the basal body (red cicle). The encircled area in MERGE is shown 4-fold enlarged on the right hand side of the figure Quantification of C. Data was calculated from a total of 180 cells pooled from three independent experiments. Mean ± SD. * P≤ 0.05, *** P≤ 0.001, **** P≤ 0.0001  Arp2 localization in REP1 WT, hCDC14APD and DBN1 KO cells. Signal intensity was measured 30 min after serum starvation. The encircled area in MERGE is shown 4-fold enlarged on the right hand side of the figure  Quantification of E. Sub-centrosomal (1 μm-radius; red circle in E) Arp2 was measured by quantifying the intensity of Arp2 in WT, hCDC14APD and DBN1 KO cells. Both hCDC14APD and DBN1 KO cells contain significantly higher Arp2 in the pericentrosomal area (1 μm-radius) compared to WT cells after 30 min of serum starvation. Data were calculated from a total of 120 cells pooled from three independent experiments. Mean ± SD. **** P≤ 0.0001  Pericentrosomal ARP2 enrichment was comparable in the RPE1 DBN1 KO cells (Tet Control) with DBN1 KO cells expressing different DBN1 versions (WT, S142A, S142D). Data were calculated from a total of 200 cells each pooled from two independent experiments. Mean ± SD. ns: not specific "}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "CXCL10", "assay", "characteristics", ".", "Standard", "curves", "of", "the", "short", ",", "long", "and", "total", "CXCL10Simoa", "assays", "are", "shown", ".", "For", "each", "curve", ",", "limit", "of", "detection", "(", "LOD", ")", "defined", "as", "blank", "+", "3SD", ",", "are", "shown", "as", "horizontal", "lines", ".", "The", "LOD", "was", "1", ".", "7pg", "/", "ml", "for", "long", "and", "short", "CXCL10", "assays", "and", "0", ".", "22pg", "/", "ml", "for", "total", "CXCL10", ".", "Standard", "curves", "were", "fitted", "using", "the", "4", "Parameter", "Logistic", "non", "-", "linear", "regression", "model", ".", "Samples", "reporting", "a", "signal", "below", "the", "LOD", "were", "replaced", "with", "1pg", "/", "ml", "for", "short", "and", "long", "CXCL10", ".", "Plasma", "from", "healthy", "individuals", "receiving", "(", "B", ")", "placebo", "(", "n", "=", "9", ")", "or", "(", "C", ")", "sitagliptin", "(", "n", "=", "27", ")", "were", "analyzed", "by", "Simoa", ".", "Blood", "samples", "were", "collected", "at", "screening", "visit", "(", "SV", ")", "and", "day", "0", "(", "D0", ")", "before", "treatment", ",", "at", "day", "3", "(", "D3", ")", ",", "day", "14", "(", "W2", ")", "and", "day", "28", "(", "W4", ")", "under", "treatment", "and", "5", "weeks", "after", "treatment", "interruption", "(", "W9", ")", ".", "(", "C", ")", "Plasma", "from", "chronic", "HCVpatients", "receiving", "sitagliptin", "(", "n", "=", "3", ")", "were", "collected", "before", "(", "D0", ")", "and", "weekly", "during", "sitagliptin", "treatment", "(", "W1", "W3", ")", ".", "Antagonist", "CXCL103", "-", "77", "(", "short", "CXCL10", ",", "in", "blue", ")", ",", "agonist", "CXCL101", "-", "77", "(", "long", "CXCL10", ",", "in", "red", ")", "and", "total", "CXCL10", "(", "in", "black", ")", "levels", "are", "shown", ".", "Each", "dot", "represents", "a", "donor", "and", "bars", "are", "at", "the", "median", ".", "Grey", "areas", "highlight", "the", "period", "under", "placebo", "or", "sitagliptin", "treatment", ".", "Statistical", "analysis", "of", "(", "B", ")", "and", "(", "C", ")", "was", "performed", "using", "non", "parametric", "Friedman", "'", "s", "test", ",", "ns", ":", "non", "significant", ",", "*", "*", ":", "P0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", ":", "P0", ".", "001", ".", "For", "(", "C", ")", ",", "additional", "size", "effect", "analysis", "was", "performed", "and", "Cohen", "'", "s", "d", "values", "are", "reported", ".", "No", "statistical", "analysis", "was", "performed", "in", "(", "D", ")", "due", "to", "sample", "size", ",", "nd", ":", "non", "-", "determined", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) CXCL10 assay characteristics. Standard curves of the short, long and total CXCL10Simoa assays are shown. For each curve, limit of detection (LOD) defined as blank+3SD, are shown as horizontal lines. The LOD was 1.7pg/ml for long and short CXCL10 assays and 0.22pg/ml for total CXCL10. Standard curves were fitted using the 4 Parameter Logistic non-linear regression model. Samples reporting a signal below the LOD were replaced with 1pg/ml for short and long CXCL10.Plasma from healthy individuals receiving (B) placebo (n=9) or (C) sitagliptin (n=27) were analyzed by Simoa. Blood samples were collected at screening visit (SV) and day 0 (D0) before treatment, at day 3 (D3), day 14 (W2) and day 28 (W4) under treatment and 5 weeks after treatment interruption (W9). (C) Plasma from chronic HCVpatients receiving sitagliptin (n=3) were collected before (D0) and weekly during sitagliptin treatment (W1 W3). Antagonist CXCL103-77 (short CXCL10, in blue), agonist CXCL101-77 (long CXCL10, in red) and total CXCL10 (in black) levels are shown. Each dot represents a donor and bars are at the median. Grey areas highlight the period under placebo or sitagliptin treatment. Statistical analysis of (B) and (C) was performed using non parametric Friedman's test, ns: non significant, **: P0.01, ****: P0.001. For (C), additional size effect analysis was performed and Cohen's d values are reported. No statistical analysis was performed in (D) due to sample size, nd: non-determined."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "D", ")", "Two", "-", "color", "dSTORM", "imaging", "of", "RIM1", "/", "2", "and", "gephyrin", "in", "cryosections", ".", "From", "left", "to", "right", ":", "rendered", "images", "of", "RIM1", "/", "2", "and", "gephyrin", "clusters", "showing", "the", "aligned", "SSDs", "(", "arrows", ")", ";", "gephyrin", "SSDs", "segmented", "by", "watershed", "outlined", "with", "different", "colors", ";", "RIM1", "/", "2", "SSDs", "outlined", "with", "different", "colors", ";", "binary", "SSDs", "of", "gephyrin", "and", "RIM1", "/", "2", ".", "Inhibitory", "synapses", "were", "identified", "by", "the", "gephyrin", "clusters", "in", "the", "epifluorescence", "images", ".", "Scale", "bar", ":", "200", "nm", ".", "RIM1", "/", "2", "was", "labelled", "with", "Alexa", "647", ",", "gephyrin", "(", "mAb7a", ")", "with", "Cy3B", "in", "these", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(D) Two-color dSTORM imaging of RIM1/2 and gephyrin in cryosections. From left to right: rendered images of RIM1/2 and gephyrin clusters showing the aligned SSDs (arrows); gephyrin SSDs segmented by watershed outlined with different colors; RIM1/2 SSDs outlined with different colors; binary SSDs of gephyrin and RIM1/2. Inhibitory synapses were identified by the gephyrin clusters in the epifluorescence images. Scale bar: 200 nm. RIM1/2 was labelled with Alexa 647, gephyrin (mAb7a) with Cy3B in these experiments."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", "-", "C", ")", "Alignment", "of", "SSDs", "of", "pre", "-", "synaptic", "RIM1", "/", "2", "and", "SSDs", "of", "post", "-", "synaptic", "gephyrin", ",", "GlyRs", ",", "and", "GABAARs", ",", "respectively", ".", "(", "A1", "-", "C1", ")", "Distances", "were", "measured", "between", "the", "intensity", "peaks", "of", "paired", "SSDs", "in", "rendered", "dual", "-", "color", "dSTORM", "images", "(", "yellow", "line", ",", "values", "given", "in", "mean", "±", "SD", ")", ".", "RIM1", "/", "2", "was", "labelled", "with", "Alexa", "647", "and", "gephyrin", "(", "mAb7a", ")", "with", "Cy3B", "in", "(", "A1", ")", ".", "RIM1", "/", "2", "was", "labelled", "with", "Cy3B", ",", "while", "GlyRs", "or", "GABAARs", "were", "labelled", "with", "Alexa", "647", "in", "(", "B1", ")", "and", "(", "C1", ")", ".", "(", "A2", "-", "C2", ")", "Trans", "-", "synaptic", "alignment", "of", "SSDs", "of", "gephyrin", ",", "GlyRs", ",", "GABAARs", "and", "RIM1", "/", "2", ".", "SSDs", "were", "segmented", "by", "H", "-", "watershed", ".", "Data", "are", "plotted", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Number", "of", "synapses", ":", "n", "=", "48", "(", "A1", ",", "A2", ")", "from", "three", "independent", "experiments", "(", "no", "treatment", ")", ",", "n", "=", "30", "(", "B1", ",", "B2", ")", "from", "two", "experiments", "with", "TTX", "treatment", ",", "n", "=", "16", "(", "C1", ",", "C2", ")", "from", "two", "experiments", "with", "TTX", ".", "Only", "synapses", "with", "side", "view", "profiles", "were", "included", ".", "All", "images", "are", "adjusted", "to", "the", "same", "scale", ".", "Scale", "bar", ":", "200", "nm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A-C) Alignment of SSDs of pre-synaptic RIM1/2 and SSDs of post-synaptic gephyrin, GlyRs, and GABAARs, respectively. (A1-C1) Distances were measured between the intensity peaks of paired SSDs in rendered dual-color dSTORM images (yellow line, values given in mean ± SD). RIM1/2 was labelled with Alexa 647 and gephyrin (mAb7a) with Cy3B in (A1). RIM1/2 was labelled with Cy3B, while GlyRs or GABAARs were labelled with Alexa 647 in (B1) and (C1). (A2-C2) Trans-synaptic alignment of SSDs of gephyrin, GlyRs, GABAARs and RIM1/2. SSDs were segmented by H-watershed. Data are plotted as mean ± SD. Number of synapses: n = 48 (A1, A2) from three independent experiments (no treatment), n = 30 (B1, B2) from two experiments with TTX treatment, n = 16 (C1, C2) from two experiments with TTX. Only synapses with side view profiles were included. All images are adjusted to the same scale. Scale bar: 200 nm."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", "-", "B", ")", "Representative", "dSTORM", "images", "of", "GlyRs", "and", "GABAARs", "at", "synapses", "in", "side", "view", "(", "A", ")", "or", "en", "face", "view", "(", "B", ")", ".", "The", "top", "row", "of", "images", "shows", "the", "pointillist", "representation", "of", "the", "detections", ",", "the", "second", "row", "the", "rendered", "images", "and", "the", "bottom", "row", "the", "corresponding", "segmented", "SSDs", ".", "GlyRs", "were", "labelled", "with", "Alexa", "647", "and", "GABAARs", "with", "Cy3B", "in", "these", "experiments", ".", "Scale", "bar", ":", "200", "nm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A-B) Representative dSTORM images of GlyRs and GABAARs at synapses in side view (A) or en face view (B). The top row of images shows the pointillist representation of the detections, the second row the rendered images and the bottom row the corresponding segmented SSDs. GlyRs were labelled with Alexa 647 and GABAARs with Cy3B in these experiments. Scale bar: 200 nm."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Triple", "immuno", "-", "labelling", "of", "gephyrin", ",", "GlyRs", "and", "GABAARs", "at", "mixed", "inhibitory", "synapses", "(", "arrow", ")", "imaged", "with", "conventional", "fluorescence", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Triple immuno-labelling of gephyrin, GlyRs and GABAARs at mixed inhibitory synapses (arrow) imaged with conventional fluorescence microscopy. Scale bar: 5 µm."}
{"words": ["Figure", "5Characterization", "of", "the", "nanoscale", "organization", "of", "GABAARs", "and", "GlyRs", "at", "mixed", "inhibitory", "synapses", ".", "(", "A", ")", "Synaptic", "receptor", "cluster", "rendered", "from", "detections", "of", "both", "GABAARs", "(", "labelled", "with", "Alexa", "647", ")", "and", "GlyRs", "(", "labelled", "with", "Cy3B", ")", ".", "(", "B", ")", "Detections", "of", "GABAARs", "(", "red", "dots", ")", "and", "GlyRs", "(", "blue", "dots", ")", "overlaid", "with", "binary", "synaptic", "mask", "(", "white", ")", ".", "Sub", "-", "synaptic", "characterization", "of", "GABAAR", "and", "GlyR", "domains", ".", "(", "F", ")", "Watershed", "segmentation", "of", "sub", "-", "synaptic", "domains", "(", "SSDs", ")", ".", "Each", "SSD", "is", "shown", "in", "different", "colors", ".", "(", "G", ")", "Detections", "of", "GABAARs", "(", "red", "dots", ")", "and", "GlyRs", "(", "blue", "dots", ")", "overlaid", "with", "SSDs", "(", "white", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Characterization of the nanoscale organization of GABAARs and GlyRs at mixed inhibitory synapses. (A) Synaptic receptor cluster rendered from detections of both GABAARs (labelled with Alexa 647) and GlyRs (labelled with Cy3B). (B) Detections of GABAARs (red dots) and GlyRs (blue dots) overlaid with binary synaptic mask (white).Sub-synaptic characterization of GABAAR and GlyR domains. (F) Watershed segmentation of sub-synaptic domains (SSDs). Each SSD is shown in different colors. (G) Detections of GABAARs (red dots) and GlyRs (blue dots) overlaid with SSDs (white)."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "The", "number", "of", "receptor", "SSDs", ",", "segmented", "from", "the", "combined", "receptor", "clusters", "of", "GABAARs", "and", "GlyRs", ",", "was", "decreased", "after", "4", "-", "AP", "treatment", "(", "MW", "test", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ")", ".", "(", "B", ")", "This", "was", "mostly", "due", "to", "the", "loss", "of", "GABAAR", "SSDs", "that", "were", "segmented", "from", "the", "rendered", "images", "of", "GABAAR", "detections", "only", "(", "MW", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ")", ".", "(", "C", ")", "The", "number", "of", "GlyR", "SSDs", "(", "based", "on", "GlyR", "detections", ")", "were", "only", "marginally", "reduced", "(", "MW", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "Data", "information", ":", "Number", "of", "synapses", ":", "n", "=", "452", "in", "TTX", ",", "n", "=", "583", "in", "4", "-", "AP", "condition", ",", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) The number of receptor SSDs, segmented from the combined receptor clusters of GABAARs and GlyRs, was decreased after 4-AP treatment (MW test, p < 0.0001). (B) This was mostly due to the loss of GABAAR SSDs that were segmented from the rendered images of GABAAR detections only (MW, ****p < 0.0001). (C) The number of GlyR SSDs (based on GlyR detections) were only marginally reduced (MW, **p < 0.01). Data information: Number of synapses: n = 452 in TTX, n = 583 in 4-AP condition, from three independent experiments. Mean ± SEM. "}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", "-", "C", ")", "Reduced", "immuno", "-", "reactivity", "of", "S270", "phosphorylated", "gephyrin", "but", "not", "total", "gephyrin", "levels", "after", "4", "-", "AP", "treatment", ",", "revealed", "by", "conventional", "fluorescence", "microscopy", "(", "KS", "test", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "in", "B1", "and", "p", "<", "0", ".", "0001", "in", "B2", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", "in", "C", ")", ".", "Total", "gephyrin", "was", "probed", "with", "polyclonal", "rabbit", "primary", "antibody", "(", "rbGPHN", ")", ",", "and", "pS270", "phosphorylated", "gephyrin", "with", "monoclonal", "mouse", "primary", "antibody", "(", "m7a", ")", ".", "Number", "of", "synapses", ":", "n", "=", "4040", "in", "TTX", "and", "n", "=", "3818", "in", "4", "-", "AP", "conditions", "from", "two", "independent", "experiments", ".", "Scale", "bar", ":", "2", "µm", ".", "(", "D", "-", "F", ")", "Reduced", "numbers", "of", "pS270", "gephyrin", "(", "m7a", ")", "detections", "were", "recorded", "by", "dSTORM", "for", "the", "entire", "synaptic", "area", "(", "D", ",", "KS", "test", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "The", "number", "of", "detections", "of", "pS270", "gephyrin", "per", "SSD", "(", "E", ",", "KS", ",", "p", "=", "0", ".", "18", ")", "and", "the", "number", "of", "SSDs", "(", "F", ",", "MW", ",", "p", "=", "0", ".", "11", ")", "were", "not", "changed", "by", "4", "-", "AP", "treatment", ".", "Gephyrin", "was", "probed", "with", "mAb7a", "antibody", "and", "Alexa", "647", "dye", ".", "Number", "of", "synapses", ":", "n", "=", "810", "in", "TTX", "and", "n", "=", "727", "in", "4", "-", "AP", "conditions", "from", "three", "independent", "experiments", ";", "(", "F", ")", "mean", "±", "SEM", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "nm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A-C) Reduced immuno-reactivity of S270 phosphorylated gephyrin but not total gephyrin levels after 4-AP treatment, revealed by conventional fluorescence microscopy (KS test, p < 0.001 in B1 and p < 0.0001 in B2, p < 0.0001 in C). Total gephyrin was probed with polyclonal rabbit primary antibody (rbGPHN), and pS270 phosphorylated gephyrin with monoclonal mouse primary antibody (m7a). Number of synapses: n = 4040 in TTX and n = 3818 in 4-AP conditions from two independent experiments. Scale bar: 2 µm.(D-F) Reduced numbers of pS270 gephyrin (m7a) detections were recorded by dSTORM for the entire synaptic area (D, KS test, p < 0.01). The number of detections of pS270 gephyrin per SSD (E, KS, p = 0.18) and the number of SSDs (F, MW, p = 0.11) were not changed by 4-AP treatment. Gephyrin was probed with mAb7a antibody and Alexa 647 dye. Number of synapses: n = 810 in TTX and n = 727 in 4-AP conditions from three independent experiments; (F) mean ± SEM. Scale bar: 100 nm."}
{"words": ["Figure", "1B", ".", "Flow", "cytometry", "analyses", "of", "recipient", "blood", "2", "months", "post", "-", "transplant", ".", "Bi", ".", "Transplanted", "cells", "detected", "by", "GFP", "fluorescence", ".", "Bii", ".", "CD11b", "lebelling", "shows", "a", "large", "proportion", "of", "monocytes", "expressing", "GFP", ".", "C", ".", "Demyelinating", "lesions", "in", "chimeric", "mice", "at", "3", "dpl", ".", "Ci", ".", "Demyelination", "was", "induced", "by", "injecting", "LPC", "in", "the", "spinal", "cord", "white", "matter", ".", "Cii", "-", "Civ", ".", "Co", "-", "immunolabeling", "for", "GFP", ",", "MBP", ",", "and", "a", "mixture", "of", "CD11b", "/", "CD68", ",", "showing", "graft", "-", "derived", "macrophages", "in", "the", "lesion", "(", "identified", "by", "lack", "of", "MBP", "staining", ")", ".", "White", "lines", "indicate", "lesion", "borders", ".", "Scale", "bar", "20", "µm", ".", "MBP", "-", "myelin", "basic", "protein", ";", "GFP", "-", "green", "fluorescent", "protein", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B. Flow cytometry analyses of recipient blood 2 months post-transplant. Bi. Transplanted cells detected by GFP fluorescence. Bii. CD11b lebelling shows a large proportion of monocytes expressing GFP.C. Demyelinating lesions in chimeric mice at 3 dpl. Ci. Demyelination was induced by injecting LPC in the spinal cord white matter. Cii-Civ. Co-immunolabeling for GFP, MBP, and a mixture of CD11b/CD68, showing graft-derived macrophages in the lesion (identified by lack of MBP staining). White lines indicate lesion borders. Scale bar 20 µm. MBP-myelin basic protein; GFP-green fluorescent protein."}
{"words": ["Figure", "2Transduction", "of", "HSCs", ".", "B", ".", "Lower", "numbers", "of", "GFP", "+", "cells", ",", "verified", "using", "flow", "cytometry", ",", "after", "transduction", "with", "Sema3F", "vector", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "Student", "t", "test", ",", "n", "=", "8", "independent", "experiments", ".", "Transduction", "of", "HSCs", ".", "C", ".", "Western", "blot", "showing", "GFP", "expression", "in", "cells", "transduced", "with", "both", "vectors", "and", "Sema3F", "expression", "in", "the", "supernatant", "of", "Sema3F", "-", "transduced", "cells", "only", ".", "E", ".", "Fold", "increase", "in", "cells", "that", "crossed", "the", "membrane", "insert", "compared", "to", "NT", ".", "*", "*", "*", "p", "‹", "0", ".", "0001", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "Multiple", "Comparison", "test", ".", "n", "=", "1", "-", "2", "normalized", "replicates", "from", "3", "-", "5", "independent", "experiments", ".", "Mean", "±", "SEM", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "R", ".", "=", "recombinant", ".", "Super", "=", "supernatant", ".", "Anti", "-", "Nrp2", "=", "Neuropilin2", "function", "blocking", "antibody", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Transduction of HSCs. B. Lower numbers of GFP+ cells, verified using flow cytometry, after transduction with Sema3F vector, ***p<0.0001, Student t test, n=8 independent experiments.Transduction of HSCs. C. Western blot showing GFP expression in cells transduced with both vectors and Sema3F expression in the supernatant of Sema3F-transduced cells only.E. Fold increase in cells that crossed the membrane insert compared to NT. ***p‹0.0001. One-way ANOVA followed by Bonferroni's Multiple Comparison test. n= 1-2 normalized replicates from 3-5 independent experiments. Mean±SEM. ***p<0.0001. R.=recombinant. Super=supernatant. Anti-Nrp2=Neuropilin2 function blocking antibody."}
{"words": ["Figure", "3Expression", "of", "Nrp2", "gene", "by", "OPCs", "is", "maintained", "in", "middle", "-", "age", "(", "12", "month", "(", "m", ")", "old", ")", "mice", ".", "A", ".", "Microarray", "analyses", "results", "for", "Nrp2", "expression", "by", "OPCs", "purified", "using", "FACS", "from", "the", "brains", "of", "2", "months", "versus", "12", "months", "old", "PDGFRα", "−", "GFP", "mice", "(", "n", "=", "3", "-", "4", "independent", "experiments", ")", ".", "Expression", "of", "Nrp2", "gene", "by", "OPCs", "is", "maintained", "in", "middle", "-", "age", "(", "12", "month", "(", "m", ")", "old", ")", "mice", ".", "B", ".", "RNA", "sequencing", "results", "for", "Nrp2", "expression", "by", "oligodendroglia", "-", "enriched", "preparations", "isolated", "from", "the", "spinal", "cords", "of", "2", "month", "versus", "12", "month", "old", "mice", ".", "(", "n", "=", "3", "-", "4", "independent", "experiments", ")", ".", "C", "-", "G", ".", "Sema", "3F", "expression", "in", "demyelinating", "lesions", "at", "4", "dpl", "(", "onset", "of", "OPC", "recruitment", ")", "is", "decreased", "in", "middle", "-", "aged", "(", "12", "m", "old", ")", "and", "old", "(", "18m", "old", ")", "mice", "compared", "to", "young", "mice", "(", "2m", "old", ")", ".", "C", "-", "E", ".", "Colabellings", "for", "Sema3F", "and", "Iba1", "(", "macrophage", "marker", ")", "in", "demyelinating", "lesions", "at", "4", "dpl", "in", "2m", "(", "C", ")", ",", "12m", "(", "D", ")", ",", "and", "18m", "old", "mice", "(", "E", ")", ".", "Arrowheads", "point", "to", "double", "-", "labelled", "cells", ".", "F", ".", "Quantification", "of", "Sema3F", "expressing", "cells", "in", "the", "lesion", ".", "G", ".", "Percentage", "of", "Iba1", "+", "cells", "positive", "for", "Sema3F", ".", "NWM", "-", "normal", "white", "matter", ".", "dpl", "-", "days", "post", "lesion", ".", "n", "=", "4", "-", "8", "mice", "/", "group", ".", "H", ".", "Transwell", "chamber", "assay", "was", "used", "to", "evaluate", "migration", "of", "young", "versus", "middle", "-", "age", "OPCs", "in", "response", "to", "recombinant", "Sema3F", "and", "supernatant", "from", "PGK", "-", "GFP", "-", "T2A", "-", "Sema3F", "transduced", "cells", ".", "OPCs", "of", "both", "ages", "migrate", "in", "response", "to", "recombinant", "Sema3F", "and", "PGK", "-", "GFP", "-", "T2A", "-", "Sema3F", "-", "transduced", "cell", "supernatant", ".", "n", "=", "1", "-", "2", "normalized", "replicates", "from", "2", "-", "5", "independent", "experiments", ".", "Mean", "±", "SEM", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "Multiple", "Comparison", "test", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Scale", "bar", "50", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Expression of Nrp2 gene by OPCs is maintained in middle-age (12 month (m) old) mice. A. Microarray analyses results for Nrp2 expression by OPCs purified using FACS from the brains of 2 months versus 12 months old PDGFRα−GFP mice (n=3-4 independent experiments).Expression of Nrp2 gene by OPCs is maintained in middle-age (12 month (m) old) mice. B. RNA sequencing results for Nrp2 expression by oligodendroglia-enriched preparations isolated from the spinal cords of 2 month versus 12 month old mice. (n=3-4 independent experiments).C-G. Sema 3F expression in demyelinating lesions at 4 dpl (onset of OPC recruitment) is decreased in middle-aged (12 m old) and old (18m old) mice compared to young mice (2m old). C-E. Colabellings for Sema3F and Iba1 (macrophage marker) in demyelinating lesions at 4 dpl in 2m (C), 12m (D),and 18m old mice (E). Arrowheads point to double-labelled cells. F. Quantification of Sema3F expressing cells in the lesion. G. Percentage of Iba1+ cells positive for Sema3F. NWM-normal white matter. dpl-days post lesion. n=4-8 mice/group.H. Transwell chamber assay was used to evaluate migration of young versus middle-age OPCs in response to recombinant Sema3F and supernatant from PGK-GFP-T2A-Sema3F transduced cells. OPCs of both ages migrate in response to recombinant Sema3F and PGK-GFP-T2A-Sema3F-transduced cell supernatant. n= 1-2 normalized replicates from 2-5 independent experiments. Mean±SEM. One-way ANOVA followed by Bonferroni's Multiple Comparison test. *p<0.05, ** p<0.01. Scale bar 50 µm."}
{"words": ["Figure", "4B", ".", "Percentage", "of", "transplanted", "(", "female", ")", "cells", "in", "the", "blood", ".", "n", "=", "18", "-", "19", "mice", "/", "group", ".", "C", ".", "Percentage", "of", "transduced", "(", "GFP", "+", ")", "cells", "in", "the", "blood", ".", "Mean", "±", "SEM", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "n", "=", "22", "-", "25", "mice", "/", "group", ".", "D", ".", "Percentages", "of", "GFP", "+", "cells", "labeled", "with", "CD11b", ",", "CD19", ",", "and", "CD3", ".", "The", "proportion", "of", "GFP", "+", "cells", "labeled", "with", "CD11b", "is", "increased", "in", "Sema3F", "mice", "(", "p", "=", "0", ".", "01", ")", ",", "while", "that", "of", "CD19", "-", "labeled", "cells", "is", "decreased", "(", "p", "=", "0", ".", "0003", ")", ".", "Mean", "±", "SEM", ".", "Unpaired", "Student", "t", "-", "test", ".", "n", "=", "9", "mice", "/", "group", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "E", ".", "Percentages", "of", "total", "blood", "cells", "expressing", "CD11b", ",", "CD19", ",", "and", "CD3", ".", "Red", "dashed", "lines", "indicate", "the", "percentage", "expression", "of", "these", "antigens", "in", "blood", "cells", "of", "control", "mice", ".", "n", "=", "9", "mice", "/", "group", ".", "Mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B. Percentage of transplanted (female) cells in the blood. n=18-19 mice/group.C. Percentage of transduced (GFP+) cells in the blood . Mean±SEM. ***p<0.0001. n=22-25 mice/group.D. Percentages of GFP+ cells labeled with CD11b, CD19, and CD3. The proportion of GFP+ cells labeled with CD11b is increased in Sema3F mice (p=0.01), while that of CD19-labeled cells is decreased (p=0.0003). Mean±SEM. Unpaired Student t-test. n=9 mice/group. *p<0.05,***p<0.001.E. Percentages of total blood cells expressing CD11b, CD19, and CD3. Red dashed lines indicate the percentage expression of these antigens in blood cells of control mice. n=9 mice/group. Mean±SEM."}
{"words": ["Figure", "5A", "-", "F", ".", "Co", "-", "labeling", "for", "GFP", "and", "MBP", "on", "spinal", "cord", "sections", "of", "GFP", "(", "A", "-", "C", ")", "and", "Sema3F", "-", "GFP", "chimeras", "(", "D", "-", "F", ")", "sacrificed", "at", "7", "(", "A", ",", "D", ")", ",", "10", "(", "B", ",", "E", ")", ",", "and", "60", "(", "C", ",", "F", ")", "days", "post", "lesion", "(", "dpl", ")", ".", "Absence", "of", "MBP", "labeling", "in", "A", "-", "B", ",", "D", "-", "E", "indicates", "the", "lesion", "(", "delimited", "by", "yellow", "lines", ")", ".", "Areas", "faintly", "labeled", "with", "MBP", "in", "C", "-", "F", "likely", "represent", "remyelinated", "areas", ".", "G", ".", "Quantification", "of", "GFP", "+", "cells", ".", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "p", "=", "0", ".", "02", ".", "No", "significant", "differences", "between", "GFP", "and", "Sema3F", "at", "any", "of", "the", "time", "points", "(", "Dunn", "'", "s", "post", "test", ";", "Mann", "-", "Whitney", "test", ")", ".", "Decrease", "in", "GFP", "+", "cells", "between", "7", "and", "60", "dpl", "for", "both", "GFP", "and", "Sema3F", "mice", "2m", ".", "H", "-", "M", ".", "Co", "-", "labeling", "for", "GFP", "/", "MBP", "/", "Iba1", "(", "macrophage", "/", "microglia", "marker", ")", "shows", "colocalization", "of", "GFP", "with", "Iba1", ".", "Arrows", "indicate", "double", "-", "labeled", "cells", ".", "N", "-", "P", "Co", "-", "labeling", "for", "GFP", "and", "T", "cell", "marker", "CD3", ".", "Arrows", "indicate", "CD3", "-", "labeled", "cells", ".", "Q", "-", "S", ".", "Co", "-", "labeling", "for", "GFP", "and", "B", "cell", "marker", "CD45R", "/", "B220", ".", "Arrows", "indicate", "CD45R", "/", "B220", "-", "labeled", "cells", ".", "T", ".", "Percentages", "of", "GFP", "+", "cells", "that", "are", "Iba1", "+", ",", "CD3", "+", ",", "and", "CD45R", "/", "B220", "+", ".", "The", "absolute", "majority", "of", "GFP", "+", "cells", "are", "Iba1", "+", ".", "U", ".", "Quantification", "of", "Iba1", "+", ",", "CD3", "+", ",", "and", "B220", "+", "cells", ".", "For", "all", "3", "populations", ",", "no", "significant", "differences", "in", "cell", "numbers", "were", "observed", "between", "GFP", "and", "Sema3F", "mice", ",", "and", "a", "general", "decrease", "was", "observed", "at", "60", "dpl", "compared", "to", "earlier", "time", "points", ".", "V", "-", "Aa", ".", "Co", "-", "labeling", "for", "GFP", "and", "microglial", "marker", "P2Y12", ".", "Purple", "arrows", "indicate", "P2Y12", "+", "cells", ".", "Exclusion", "between", "the", "two", "markers", "is", "obvious", "in", "both", "groups", ".", "Ab", ".", "Quantification", "of", "P2Y12", "+", "cells", ".", "No", "significant", "changes", "are", "observed", "between", "the", "groups", "or", "across", "the", "time", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A-F. Co-labeling for GFP and MBP on spinal cord sections of GFP (A-C) and Sema3F-GFP chimeras (D-F) sacrificed at 7 (A,D), 10 (B,E), and 60 (C,F) days post lesion (dpl). Absence of MBP labeling in A-B,D-E indicates the lesion (delimited by yellow lines). Areas faintly labeled with MBP in C-F likely represent remyelinated areas.G. Quantification of GFP+ cells. Kruskal-Wallis test p=0.02. No significant differences between GFP and Sema3F at any of the time points (Dunn's post test; Mann-Whitney test). Decrease in GFP+ cells between 7 and 60 dpl for both GFP and Sema3F mice 2m.H-M. Co-labeling for GFP/MBP/Iba1 (macrophage/microglia marker) shows colocalization of GFP with Iba1. Arrows indicate double-labeled cells.N-P Co-labeling for GFP and T cell marker CD3. Arrows indicate CD3-labeled cells.Q-S. Co-labeling for GFP and B cell marker CD45R/B220. Arrows indicate CD45R/B220-labeled cells.T. Percentages of GFP+ cells that are Iba1+, CD3+, and CD45R/B220+. The absolute majority of GFP+ cells are Iba1+.U. Quantification of Iba1+, CD3+, and B220+ cells. For all 3 populations, no significant differences in cell numbers were observed between GFP and Sema3F mice, and a general decrease was observed at 60 dpl compared to earlier time points.V-Aa. Co-labeling for GFP and microglial marker P2Y12. Purple arrows indicate P2Y12+ cells. Exclusion between the two markers is obvious in both groups. Ab. Quantification of P2Y12+ cells. No significant changes are observed between the groups or across the time."}
{"words": ["Figure", "6B", "-", "G", ".", "Lesions", "at", "7", "dpl", "in", "GFP", "(", "B", ",", "E", ")", "and", "Sema3F", "(", "C", ",", "F", ")", "mice", ".", "B", "-", "C", ".", "Co", "-", "labeling", "for", "PDGFRα", ",", "MBP", ",", "and", "DAPI", ".", "Arrows", "indicate", "OPCs", "in", "the", "lesion", ".", "Bi", "and", "Ci", "-", "insets", "of", "white", "dotted", "squares", "in", "B", "and", "C", ".", "D", ".", "Higher", "numbers", "of", "PDGFRα", "+", "(", "OPCs", ")", "cells", "in", "Sema3F", "mice", "at", "7", "dpl", "(", "Mann", "Whitney", "test", ":", "p", "=", "0", ".", "0031", ",", "n", "=", "6", "-", "8", "mice", "/", "group", ")", ".", "E", "-", "F", ".", "Co", "-", "labeling", "for", "Olig2", "and", "MBP", ".", "E", "'", "-", "F", "'", ".", "Co", "-", "labeling", "for", "Olig2", "and", "GFP", "of", "the", "lesions", "shown", "in", "E", "-", "F", ".", "3D", "reconstructions", ".", "Proximity", "of", "OPCs", "and", "Sema", "3F", "-", "carrying", "cells", ".", "E", "'", "i", "-", "E", "'", "iii", "and", "F", "'", "i", "-", "F", "'", "iii", "-", "insets", "of", "E", "'", "-", "F", "'", ".", "G", ".", "Higher", "numbers", "of", "Olig2", "+", "(", "oligodendroglial", ")", "cells", "in", "Sema3F", "-", "GFP", "mice", "at", "7", "dpl", "(", "Mann", "Whitney", "test", ":", "p", "=", "0", ".", "0047", ",", "n", "=", "5", "-", "8", "mice", "/", "group", ")", ".", "H", "-", "I", ".", "Immunolabelling", "for", "activated", "OPC", "marker", "Nkx2", ".", "2", ".", "J", ".", "Numbers", "of", "Nkx2", ".", "2", "+", "cells", "are", "increased", "in", "lesions", "of", "Sema3F", "-", "GFP", "mice", "at", "7dpl", "(", "Mann", "Whitney", "test", ":", "p", "=", "0", ".", "014", ",", "n", "=", "6", "-", "7", "mice", "/", "group", ")", ".", "Arrows", "indicate", "Nkx2", ".", "2", "+", "cells", "in", "close", "proximity", "of", "GFP", "+", "cells", ".", "K", "-", "P", ".", "colabelling", "for", "Nkx2", ".", "2", "and", "proliferation", "marker", "Ki67", ".", "Arrows", "indicate", "double", "labeled", "cells", ".", "Q", ".", "Numbers", "of", "Nkx2", ".", "2", "+", "Ki67", "+", "cells", "are", "increased", "at", "7", "dpl", "in", "Sema3F", "-", "GFP", "mice", ".", "Mean", "±", "SEM", ".", "n", "=", "6", "-", "7", "mice", "/", "group", ".", "R", ".", "The", "proportion", "of", "Nkx2", ".", "2", "+", "cells", "co", "-", "expressing", "Ki67", "is", "unchanged", ".", "Mean", "±", "SEM", ".", "n", "=", "6", "-", "7", "mice", "/", "group", ".", "S", "-", "X", ".", "Colabelling", "for", "Olig2", "and", "cleaved", "caspase", "3", ",", "marker", "of", "apoptosis", "indicates", "occasional", "apoptotic", "cells", "in", "both", "groups", "of", "mice", "that", "are", "Olig2", "-", ".", "Arrows", "indicate", "cleaved", "caspase", "3", "+", "cells", ".", "Y", ".", "Numbers", "of", "cleaved", "caspase", "3", "+", "cells", "are", "the", "same", "in", "two", "groups", ".", "Mean", "±", "SEM", ".", "n", "=", "6", "mice", "/", "group", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6B-G. Lesions at 7 dpl in GFP (B,E) and Sema3F (C,F) mice. B-C. Co-labeling for PDGFRα, MBP, and DAPI. Arrows indicate OPCs in the lesion. Bi and Ci-insets of white dotted squares in B and C. D. Higher numbers of PDGFRα+ (OPCs) cells in Sema3F mice at 7 dpl (Mann Whitney test: p=0.0031, n=6-8 mice/group). E-F. Co-labeling for Olig2 and MBP. E'-F'. Co-labeling for Olig2 and GFP of the lesions shown in E-F. 3D reconstructions. Proximity of OPCs and Sema 3F-carrying cells. E'i-E'iii and F'i-F'iii-insets of E'-F'. G. Higher numbers of Olig2+ (oligodendroglial) cells in Sema3F-GFP mice at 7 dpl (Mann Whitney test: p=0.0047, n=5-8 mice/group).H-I. Immunolabelling for activated OPC marker Nkx2.2. J. Numbers of Nkx2.2+ cells are increased in lesions of Sema3F-GFP mice at 7dpl (Mann Whitney test: p=0.014, n=6-7 mice/group). Arrows indicate Nkx2.2+ cells in close proximity of GFP+ cells.K-P. colabelling for Nkx2.2 and proliferation marker Ki67. Arrows indicate double labeled cells. Q. Numbers of Nkx2.2+Ki67+ cells are increased at 7 dpl in Sema3F-GFP mice. Mean±SEM. n=6-7 mice/group. R. The proportion of Nkx2.2+ cells co-expressing Ki67 is unchanged. Mean±SEM. n=6-7 mice/group.S-X. Colabelling for Olig2 and cleaved caspase 3, marker of apoptosis indicates occasional apoptotic cells in both groups of mice that are Olig2-. Arrows indicate cleaved caspase 3+ cells.Y. Numbers of cleaved caspase 3+ cells are the same in two groups. Mean±SEM. n=6 mice/group."}
{"words": ["Figure", "7A", "-", "B", ".", "Labelling", "for", "APC", "/", "CC1", ",", "a", "marker", "of", "oligodendrocytes", ".", "Dotted", "lines", "indicate", "the", "lesion", "border", ".", "APC", "+", "cells", "are", "scarce", "in", "the", "lesions", "of", "GFP", "mice", "(", "A", ")", ".", "B", ".", "APC", "+", "cells", "in", "the", "lesion", "of", "Sema3F", "mice", ".", "C", ".", "Quantification", "of", "APC", "+", "cells", "(", "Mann", "Whitney", "test", ";", "p", "=", "0", ".", "0061", "for", "7", "dpl", ",", "p", "=", "0", ".", "0081", "for", "10", "dpl", ";", "n", "=", "6", "-", "7", "mice", "/", "group", ")", ".", "D", "-", "E", ".", "EM", "images", "of", "the", "lesion", "in", "GFP", "(", "D", ")", "and", "Sema3F", "(", "E", ")", "chimeras", "at", "14", "dpl", ".", "Thin", "myelin", "sheaths", "in", "Sema", "3F", "mice", "(", "yellow", "arrows", ")", ".", "F", ".", "Higher", "power", "image", "of", "a", "new", "myelin", "sheath", "in", "a", "Sema3F", "mouse", ".", "Fi", ".", "Inset", "of", "yellow", "square", "in", "F", ".", "G", ".", "Quantification", "of", "remyelinated", "axons", "(", "Mann", "Whitney", "test", ":", "p", "=", "0", ".", "03", ",", "n", "=", "6", "mice", "/", "group", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "H", ".", "In", "Sema3F", "mice", ",", "oligodendroglial", "cells", "(", "O", ")", "and", "early", "remyelination", "(", "*", ")", "are", "frequently", "observed", "in", "macrophage", "(", "M", ")", "vicinity", ".", "Hi", ".", "Inset", "of", "yellow", "dashed", "square", "in", "H", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A-B. Labelling for APC/CC1, a marker of oligodendrocytes. Dotted lines indicate the lesion border. APC+ cells are scarce in the lesions of GFP mice (A). B. APC+ cells in the lesion of Sema3F mice. C. Quantification of APC+ cells (Mann Whitney test; p=0.0061 for 7 dpl, p=0.0081 for 10 dpl; n= 6-7 mice/group).D-E. EM images of the lesion in GFP (D) and Sema3F (E) chimeras at 14 dpl. Thin myelin sheaths in Sema 3F mice (yellow arrows). F. Higher power image of a new myelin sheath in a Sema3F mouse. Fi. Inset of yellow square in F. G. Quantification of remyelinated axons (Mann Whitney test: p=0.03, n=6 mice/group). *p<0.05. H. In Sema3F mice, oligodendroglial cells (O) and early remyelination (*) are frequently observed in macrophage (M) vicinity. Hi. Inset of yellow dashed square in H."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "Representative", "images", "of", "immunostaining", "demonstrate", "that", "FKRP", "-", "iPSCs", "express", "specific", "pluripotency", "-", "associated", "markers", ",", "including", "NANOG", ",", "OCT4", ",", "Tra", "-", "1", "-", "60", "and", "SSEA4", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", ",", "50", "μm", ".", "(", "C", ")", "FKRP", "-", "iPSCs", "have", "a", "normal", "karyotype", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", ",", "50", "μm", ".", "(", "D", ")", "In", "vitro", "differentiation", "of", "FKRP", "-", "iPSCs", "to", "cells", "representing", "ectoderm", "(", "β", "-", "III", "Tubulin", ",", "Tuj1", ")", ",", "mesoderm", "(", "SMA", ",", "smooth", "muscle", "actin", ")", "and", "endoderm", "(", "AFP", ",", "α", "-", "fetoprotein", ")", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", ",", "50", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B) Representative images of immunostaining demonstrate that FKRP-iPSCs express specific pluripotency-associated markers, including NANOG, OCT4, Tra-1-60 and SSEA4. Data information: Scale bars, 50 μm.(C) FKRP-iPSCs have a normal karyotype. Data information: Scale bars, 50 μm.(D) In vitro differentiation of FKRP-iPSCs to cells representing ectoderm (β-III Tubulin, Tuj1), mesoderm (SMA, smooth muscle actin) and endoderm (AFP, α-fetoprotein). Data information: Scale bars, 50 μm."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "C", ")", "Sequence", "analysis", "shows", "precise", "biallelic", "correction", "of", "the", "FKRP", "mutation", "in", "three", "independently", "corrected", "iPSC", "clones", "(", "5D17", ",", "5D23", "and", "3B17", ")", ",", "compared", "with", "their", "parental", "FKRPA455D", "-", "iPSCs", ".", "Selection", "cassette", "excision", "sites", "are", "identified", "in", "the", "corrected", "-", "iPSC", "lines", ".", "(", "D", ")", "CRISPR", "/", "Cas9", "corrected", "-", "iPSC", "lines", "show", "a", "normal", "karyotype", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(C) Sequence analysis shows precise biallelic correction of the FKRP mutation in three independently corrected iPSC clones (5D17, 5D23 and 3B17), compared with their parental FKRPA455D-iPSCs. Selection cassette excision sites are identified in the corrected-iPSC lines.(D) CRISPR/Cas9 corrected-iPSC lines show a normal karyotype."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", "and", "B", ")", "Representative", "images", "of", "NSCs", "derived", "from", "FKRP", "-", "and", "corrected", "-", "iPSC", "lines", "expressing", "SOX1", ",", "SOX2", "and", "nestin", ".", "(", "C", "and", "D", ")", "Quantification", "of", "percentage", "of", "SOX1", "+", "(", "C", ")", "and", "SOX2", "+", "(", "D", ")", "cells", "in", "culture", ".", "The", "efficiency", "of", "neural", "induction", "is", "more", "than", "99", "%", "in", "FKRP", "-", "and", "corrected", "-", "iPSC", "(", "5D17", ",", "5D23", "and", "3B17", ")", "lines", ".", "Data", "are", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "n", "=", "4", "technical", "replicates", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", ",", "50", "μm", ".", "(", "E", "and", "F", ")", "FKRP", "-", "and", "corrected", "NSC", "lines", "can", "be", "further", "differentiated", "to", "cortical", "neural", "progenitor", "cells", ",", "expressing", "PAX6", ",", "OTX2", "and", "vimentin", ".", "(", "G", "-", "I", ")", "Quantification", "of", "percentage", "of", "PAX6", "+", "(", "G", ")", "and", "OTX2", "+", "(", "H", ")", "cells", "in", "culture", ".", "About", "91", "-", "98", "%", "of", "cells", "derived", "from", "FKRP", ",", "5D17", ",", "5D23", "and", "3B17", "NSC", "lines", "express", "PAX6", "(", "G", ")", ".", "About", "93", "-", "96", "%", "of", "cells", "derived", "from", "FKRP", ",", "5D17", ",", "5D23", "and", "3B17", "NSC", "lines", "express", "OTX2", "(", "H", ")", ".", "Of", "the", "OTX2", "+", "population", ",", "about", "60", "-", "67", "%", "cells", "are", "also", "Ki67", "+", "cycling", "progenitors", "(", "I", ")", ".", "Data", "are", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "n", "=", "4", "technical", "replicates", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", ",", "50", "μm", ".", "(", "J", "and", "K", ")", "Glutamatergic", "projection", "neurons", "derived", "from", "FKRP", "and", "corrected", "(", "5D17", ",", "5D23", "and", "3B17", ")", "progenitor", "cells", ".", "The", "vast", "majority", "of", "neurons", "contain", "vGlut1", "+", "punctae", "in", "their", "neurites", "(", "labelled", "by", "Tuj1", ")", ".", "Right", "panels", "are", "enlarged", "images", "from", "the", "insets", "of", "left", "panels", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", ",", "50", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A and B) Representative images of NSCs derived from FKRP- and corrected-iPSC lines expressing SOX1, SOX2 and nestin. (C and D) Quantification of percentage of SOX1+ (C) and SOX2+ (D) cells in culture. The efficiency of neural induction is more than 99% in FKRP- and corrected-iPSC (5D17, 5D23 and 3B17) lines. Data are mean ± s.d. n = 4 technical replicates. Data information: Scale bars, 50 μm.(E and F) FKRP- and corrected NSC lines can be further differentiated to cortical neural progenitor cells, expressing PAX6, OTX2 and vimentin. (G-I) Quantification of percentage of PAX6+ (G) and OTX2+ (H) cells in culture. About 91-98% of cells derived from FKRP, 5D17, 5D23 and 3B17 NSC lines express PAX6 (G). About 93-96% of cells derived from FKRP, 5D17, 5D23 and 3B17 NSC lines express OTX2 (H). Of the OTX2+ population, about 60-67% cells are also Ki67+ cycling progenitors (I). Data are mean ± s.d. n = 4 technical replicates. Data information: Scale bars, 50 μm.(J and K) Glutamatergic projection neurons derived from FKRP and corrected (5D17, 5D23 and 3B17) progenitor cells. The vast majority of neurons contain vGlut1+ punctae in their neurites (labelled by Tuj1). Right panels are enlarged images from the insets of left panels. Data information: Scale bars, 50 μm."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Molecular", "weight", "of", "glycosylated", "α", "-", "dystroglycan", "(", "IIH6", "epitope", ")", "in", "WT", "-", "iPSC", "derived", "cortical", "neurons", "is", "similar", "to", "that", "in", "the", "mouse", "brain", "(", "~", "120", "kDa", ")", "and", "lower", "than", "that", "in", "the", "mouse", "muscle", "(", "~", "156kDa", ")", ".", "IIH6", "reactivity", "was", "almost", "not", "detected", "in", "cortical", "neurons", "derived", "from", "FKRP", "-", "iPSCs", ".", "Note", "that", "the", "β", "-", "Actin", "antibody", "does", "not", "cross", "-", "react", "with", "the", "muscle", "sample", ".", "(", "B", ")", "Representative", "immunoblots", "show", "that", "targeted", "gene", "correction", "of", "FKRP", "restores", "IIH6", "reactivity", "in", "iPSC", "-", "derived", "cortical", "neurons", ".", "Intensities", "of", "IIH6", "reactivity", "are", "normalized", "to", "β", "-", "Actin", "expression", ",", "indicating", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ";", "t", "-", "test", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", "(", "C", ")", "Representative", "laminin", "overlays", "show", "that", "targeted", "gene", "correction", "restores", "laminin", "-", "binding", "activity", "in", "iPSC", "-", "derived", "cortical", "neurons", ".", "Intensities", "of", "laminin", "-", "binding", "activity", "are", "normalized", "to", "β", "-", "dystroglycan", ",", "indicating", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ";", "t", "-", "test", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Molecular weight of glycosylated α-dystroglycan (IIH6 epitope) in WT-iPSC derived cortical neurons is similar to that in the mouse brain (~120 kDa) and lower than that in the mouse muscle (~156kDa). IIH6 reactivity was almost not detected in cortical neurons derived from FKRP-iPSCs. Note that the β-Actin antibody does not cross-react with the muscle sample.(B) Representative immunoblots show that targeted gene correction of FKRP restores IIH6 reactivity in iPSC-derived cortical neurons. Intensities of IIH6 reactivity are normalized to β-Actin expression, indicating mean ± s.d. (n = 3 biological replicates; t-test; ** p<0.01)(C) Representative laminin overlays show that targeted gene correction restores laminin-binding activity in iPSC-derived cortical neurons. Intensities of laminin-binding activity are normalized to β-dystroglycan, indicating mean ± s.d. (n = 3 biological replicates; t-test; * p<0.05)."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "C", ")", "Dose", "response", "curve", ".", "H2K", "2B4", "cells", "were", "treated", "with", "serial", "dilutions", "of", "11", "hit", "compounds", "for", "24", "h", "and", "fixed", ",", "stained", "and", "imaged", "as", "described", "above", ".", "The", "average", "values", "and", "standard", "deviations", "of", "the", "mean", "fluorescent", "intensities", "of", "technical", "triplicates", "were", "calculated", "and", "a", "non", "-", "linear", "regression", "curve", "was", "fitted", "for", "the", "3", "compounds", "showing", "the", "highest", "increase", "in", "α", "-", "dystroglycan", "glycosylation", "(", "IIH6", "immunostaining", ")", ".", "Representative", "images", "of", "cells", "treated", "with", "5", "µM", "of", "the", "respective", "compounds", "as", "well", "as", "EC50", "values", "are", "shown", ".", "HPFPTzone", ":", "(", "5Z", ")", "-", "5", "-", "[", "(", "3", "-", "ethoxy", "-", "4", "-", "hydroxy", "-", "phenyl", ")", "methylene", "]", "-", "3", "-", "(", "4", "-", "fluorophenyl", ")", "-", "2", "-", "thioxo", "-", "thiazolidin", "-", "4", "-", "one", ".", "4BPPNit", ":", "4", "-", "(", "4", "-", "bromophenyl", ")", "-", "6", "-", "ethylsulfanyl", "-", "2", "-", "oxo", "-", "3", ",", "4", "-", "dihydro", "-", "1H", "-", "pyridine", "-", "5", "-", "carbonitrile", ".", "DPPTzone", ":", "(", "5E", ")", "-", "5", "-", "[", "(", "2", ",", "5", "-", "dimethyl", "-", "1", "-", "phenyl", "-", "pyrrol", "-", "3", "-", "yl", ")", "methylene", "]", "-", "3", "-", "phenyl", "-", "2", "-", "thioxo", "-", "thiazolidin", "-", "4", "-", "one", ".", "Regression", "curve", "and", "EC50", "values", "were", "calculated", "using", "GraphPad", "Prism", "7", "software", ".", "In", "images", "shown", ",", "green", "represents", "glycosylated", "α", "-", "dystroglycan", "and", "blue", "Hoechst", "staining", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "µm", ".", "(", "E", ")", "Flow", "cytometry", "analysis", "confirmed", "that", "4BPPNit", "treatment", "(", "20", "µM", ")", "significantly", "increased", "IIH6", "-", "reactive", "glycan", "in", "mouse", "H2K", "2B4", "cells", ",", "compared", "with", "untreated", "cells", ".", "There", "was", "no", "significant", "difference", "in", "the", "percentage", "of", "IIH6", "-", "positive", "cells", ".", "Values", "indicate", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "n", "=", "6", ",", "triplicates", "of", "2", "independent", "experiments", ";", "t", "-", "test", ";", "NS", ",", "not", "significant", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(C) Dose response curve. H2K 2B4 cells were treated with serial dilutions of 11 hit compounds for 24 h and fixed, stained and imaged as described above. The average values and standard deviations of the mean fluorescent intensities of technical triplicates were calculated and a non-linear regression curve was fitted for the 3 compounds showing the highest increase in α-dystroglycan glycosylation (IIH6 immunostaining). Representative images of cells treated with 5 µM of the respective compounds as well as EC50 values are shown. HPFPTzone: (5Z)-5-[(3-ethoxy-4-hydroxy-phenyl)methylene]-3-(4-fluorophenyl)-2-thioxo-thiazolidin-4-one. 4BPPNit: 4-(4-bromophenyl)-6-ethylsulfanyl-2-oxo-3,4-dihydro-1H-pyridine-5-carbonitrile. DPPTzone: (5E)-5-[(2,5-dimethyl-1-phenyl-pyrrol-3-yl)methylene]-3-phenyl-2-thioxo-thiazolidin-4-one. Regression curve and EC50 values were calculated using GraphPad Prism 7 software. In images shown, green represents glycosylated α-dystroglycan and blue Hoechst staining. Scale bar, 50 µm.(E) Flow cytometry analysis confirmed that 4BPPNit treatment (20 µM) significantly increased IIH6-reactive glycan in mouse H2K 2B4 cells, compared with untreated cells. There was no significant difference in the percentage of IIH6-positive cells. Values indicate mean ± s.e.m. (n= 6, triplicates of 2 independent experiments; t-test; NS, not significant; ** p<0.01)."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "FKRP", "-", "NSCs", "treated", "with", "4BPPNit", "showed", "increased", "IIH6", "reactivity", ",", "compared", "with", "untreated", "control", "cells", ".", "Note", "that", "the", "augmented", "IIH6", "reactivity", "by", "4BPPNit", "is", "much", "weaker", "than", "the", "that", "in", "CRISPR", "-", "corrected", "NSCs", ".", "Under", "the", "same", "exposure", "time", ",", "the", "signal", "intensity", "of", "IIH6", "reactivity", "is", "saturated", "in", "corrected", "-", "NSCs", ".", "Data", "information", ":", "Intensities", "of", "glycosylation", "are", "normalized", "to", "GAPDH", "protein", "expression", ".", "(", "B", ")", "Representative", "immunoblots", "with", "the", "IIH6", "antibody", "using", "FKRP", "-", "and", "corrected", "-", "NSCs", "treated", "with", "4BPPNit", "for", "24", ",", "48", "and", "72", "h", ",", "and", "DMSO", "only", "controls", ".", "Data", "information", ":", "Intensities", "of", "glycosylation", "are", "normalized", "to", "GAPDH", "protein", "expression", ".", "Note", "that", "the", "left", "and", "right", "panels", "of", "the", "immunoblots", "are", "not", "equivalent", "exposure", "time", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "α", "-", "dystroglycan", "glycosylation", "(", "IIH6", ")", ",", "compared", "with", "DMSO", "only", "controls", ".", "Data", "information", ":", "Intensities", "of", "glycosylation", "are", "normalized", "to", "GAPDH", "protein", "expression", ".", "Values", "indicate", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", "or", "4", "biological", "replicates", ";", "One", "-", "way", "ANOVA", ";", "NS", ",", "not", "significant", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "(", "D", ")", "Representative", "immunoblots", "of", "laminin", "-", "binding", "analysis", "using", "FKRP", "-", "and", "corrected", "-", "NSCs", "treated", "with", "4BPPNit", "and", "DMSO", "only", "controls", ".", "(", "E", ")", "Quantification", "of", "laminin", "-", "binding", "activities", ",", "compared", "with", "DMSO", "only", "controls", ".", "Data", "information", ":", "Intensities", "of", "laminin", "-", "binding", "activity", "are", "normalized", "to", "GAPDH", "protein", "expression", ".", "Note", "that", "the", "left", "and", "right", "panels", "of", "the", "immunoblots", "are", "not", "equivalent", "exposure", "time", ".", "Values", "indicate", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", "or", "4", "biological", "replicates", ";", "One", "-", "way", "ANOVA", ";", "NS", ",", "not", "significant", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "(", "F", ")", "Representative", "immunoblots", "with", "the", "AF6868", "antibody", "detecting", "both", "α", "-", "dystroglycan", "core", "protein", "and", "β", "-", "dystroglycan", "in", "FKRP", "-", "and", "corrected", "-", "NSCs", "treated", "with", "4BPPNit", "and", "DMSO", "only", "controls", ".", "(", "G", ")", "Quantification", "of", "α", "-", "dystroglycan", "core", "protein", "and", "β", "-", "dystroglycan", "expression", ",", "compared", "with", "DMSO", "only", "controls", ".", "Data", "information", ":", "Intensities", "of", "protein", "expression", "are", "normalized", "to", "GAPDH", "protein", "expression", ".", "Values", "indicate", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", "or", "4", "biological", "replicates", ";", "One", "-", "way", "ANOVA", ";", "NS", ",", "not", "significant", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) FKRP-NSCs treated with 4BPPNit showed increased IIH6 reactivity, compared with untreated control cells. Note that the augmented IIH6 reactivity by 4BPPNit is much weaker than the that in CRISPR-corrected NSCs. Under the same exposure time, the signal intensity of IIH6 reactivity is saturated in corrected-NSCs. Data information: Intensities of glycosylation are normalized to GAPDH protein expression.(B) Representative immunoblots with the IIH6 antibody using FKRP- and corrected-NSCs treated with 4BPPNit for 24, 48 and 72 h, and DMSO only controls. Data information: Intensities of glycosylation are normalized to GAPDH protein expression. Note that the left and right panels of the immunoblots are not equivalent exposure time.(C) Quantification of α-dystroglycan glycosylation (IIH6), compared with DMSO only controls. Data information: Intensities of glycosylation are normalized to GAPDH protein expression. Values indicate mean ± s.d. (n= 3 or 4 biological replicates; One-way ANOVA; NS, not significant; * p<0.05; ** p<0.01).(D) Representative immunoblots of laminin-binding analysis using FKRP- and corrected-NSCs treated with 4BPPNit and DMSO only controls. (E) Quantification of laminin-binding activities, compared with DMSO only controls. Data information: Intensities of laminin-binding activity are normalized to GAPDH protein expression. Note that the left and right panels of the immunoblots are not equivalent exposure time. Values indicate mean ± s.d. (n= 3 or 4 biological replicates; One-way ANOVA; NS, not significant; * p<0.05; ** p<0.01).(F) Representative immunoblots with the AF6868 antibody detecting both α-dystroglycan core protein and β-dystroglycan in FKRP- and corrected-NSCs treated with 4BPPNit and DMSO only controls. (G) Quantification of α-dystroglycan core protein and β-dystroglycan expression, compared with DMSO only controls.Data information: Intensities of protein expression are normalized to GAPDH protein expression. Values indicate mean ± s.d. (n= 3 or 4 biological replicates; One-way ANOVA; NS, not significant; * p<0.05; ** p<0.01)."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "DAG1", "gene", "expression", "analysis", "in", "FKRP", "-", "and", "corrected", "-", "NSCs", "treated", "with", "4BPPNit", ",", "compared", "with", "DMSO", "only", "controls", ".", "Data", "information", ":", "Gene", "expression", "levels", "are", "normalized", "to", "ACTB", "gene", "expression", ".", "Values", "indicate", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "n", "=", "6", "biological", "replicates", ";", "One", "-", "way", "ANOVA", ";", "NS", ",", "not", "significant", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "(", "B", ")", "FKRP", "gene", "expression", "analysis", "in", "FKRP", "-", "and", "corrected", "-", "NSCs", "treated", "with", "4BPPNit", ",", "compared", "with", "DMSO", "only", "controls", ".", "Data", "information", ":", "Gene", "expression", "levels", "are", "normalized", "to", "ACTB", "gene", "expression", ".", "Values", "indicate", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "n", "=", "6", "biological", "replicates", ";", "One", "-", "way", "ANOVA", ";", "NS", ",", "not", "significant", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "(", "C", ")", "LARGE1", "gene", "expression", "analysis", "in", "FKRP", "-", "and", "corrected", "-", "NSCs", "treated", "with", "4BPPNit", ",", "compared", "with", "DMSO", "only", "controls", ".", "Data", "information", ":", "Gene", "expression", "levels", "are", "normalized", "to", "ACTB", "gene", "expression", ".", "Values", "indicate", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "n", "=", "6", "biological", "replicates", ";", "One", "-", "way", "ANOVA", ";", "NS", ",", "not", "significant", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) DAG1 gene expression analysis in FKRP- and corrected-NSCs treated with 4BPPNit, compared with DMSO only controls. Data information: Gene expression levels are normalized to ACTB gene expression. Values indicate mean ± s.e.m. (n= 6 biological replicates; One-way ANOVA; NS, not significant; * p<0.05; ** p<0.01(B) FKRP gene expression analysis in FKRP- and corrected-NSCs treated with 4BPPNit, compared with DMSO only controls. Data information: Gene expression levels are normalized to ACTB gene expression. Values indicate mean ± s.e.m. (n= 6 biological replicates; One-way ANOVA; NS, not significant; * p<0.05; ** p<0.01).(C) LARGE1 gene expression analysis in FKRP- and corrected-NSCs treated with 4BPPNit, compared with DMSO only controls. Data information: Gene expression levels are normalized to ACTB gene expression. Values indicate mean ± s.e.m. (n= 6 biological replicates; One-way ANOVA; NS, not significant; * p<0.05; ** p<0.01). "}
{"words": ["Figure", "1B", "-", "D", ".", "Mice", "were", "analyzed", "by", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "plot", "(", "B", ")", ",", "the", "percentage", "of", "body", "weight", "(", "C", ")", ",", "and", "the", "clinical", "scores", "(", "D", ")", "of", "WT", "and", "GPx8", "-", "/", "-", "mice", "with", "colitis", "induced", "by", "4", "%", "DSS", "for", "6", "days", "(", "n", "=", "10", "per", "group", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "Student", "'", "s", "two", "‐", "tailed", "t", "‐", "test", ")", ".", "Colons", "treated", "with", "4", "%", "DSS", "for", "5", "days", "were", "collected", "on", "day", "14", ".", "5", "-", "6", "mice", "were", "used", "for", "each", "experiment", ".", "(", "E", ")", "Images", "and", "statistical", "analysis", "of", "colon", "length", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "Student", "'", "s", "two", "‐", "tailed", "t", "‐", "test", ")", ".", "Colons", "treated", "with", "4", "%", "DSS", "for", "5", "days", "were", "collected", "on", "day", "14", ".", ",", "5", "-", "6", "mice", "were", "used", "for", "each", "experiment", ".", "(", "F", ")", "Images", "and", "semiquantitative", "scoring", "of", "hematoxylin", "and", "eosin", "staining", "of", "colon", "sections", ".", "The", "infiltrated", "immune", "cells", "at", "the", "transmural", "extensions", "were", "indicated", "by", "arrowhead", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "Student", "'", "s", "two", "‐", "tailed", "t", "‐", "test", ")", ".", "Colons", "treated", "with", "4", "%", "DSS", "for", "5", "days", "were", "collected", "on", "day", "14", ".", "5", "-", "6", "mice", "were", "used", "for", "each", "experiment", ".", "(", "G", ")", "Colon", "sections", "were", "stained", "with", "markers", "for", "macrophages", "(", "F4", "/", "80", ")", "and", "anti", "-", "GPx8", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "Student", "'", "s", "two", "‐", "tailed", "t", "‐", "test", ")", ".", "Colons", "treated", "with", "4", "%", "DSS", "for", "5", "days", "were", "collected", "on", "day", "14", ".", "(", "H", ")", "Production", "of", "IL", "-", "1β", ",", "IL", "-", "6", "and", "IL", "-", "18", "in", "colon", "tissue", "lysates", "(", "n", "=", "10", "per", "group", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "Student", "'", "s", "two", "‐", "tailed", "t", "‐", "test", ")", ".", "Gut", "microbiome", "was", "shaped", "by", "Gpx8", "deficiency", "under", "standard", "housing", "conditions", ".", "Bray", "Curtis", "dissimilarity", "of", "fecal", "microbiota", "were", "measured", "by", "bacterial", "16S", "RNA", "sequencing", "(", "n", "=", "5", "per", "group", ")", "and", "are", "presented", "by", "a", "heat", "map", ",", "(", "I", ")", ",", "and", "principal", "coordinates", "analysis", ",", "(", "J", ")", ".", "Gut", "microbiome", "was", "shaped", "by", "Gpx8", "deficiency", "under", "standard", "housing", "conditions", ".", "(", "K", ")", "α", "-", "diversity", "indicated", "bacteria", "species", "in", "each", "mouse", "depicted", "by", "richness", "(", "total", "operational", "taxonomic", "units", ",", "OTUs", ")", ",", "the", "Chao1", "richness", "estimator", "(", "Chao1", ")", ",", "and", "the", "abundance", "-", "based", "coverage", "estimator", "(", "ACE", ")", "metrics", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "Student", "'", "s", "two", "‐", "tailed", "t", "‐", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B-D. Mice were analyzed by Kaplan-Meier survival plot (B), the percentage of body weight (C), and the clinical scores (D) of WT and GPx8-/- mice with colitis induced by 4% DSS for 6 days (n = 10 per group). Data information: Data are presented as the mean ± SEM. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 (Student's two‐tailed t‐test).Colons treated with 4% DSS for 5 days were collected on day 14. 5-6 mice were used for each experiment. (E) Images and statistical analysis of colon length. Data information: Data are presented as the mean ± SEM. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 (Student's two‐tailed t‐test).Colons treated with 4% DSS for 5 days were collected on day 14. , 5-6 mice were used for each experiment. (F) Images and semiquantitative scoring of hematoxylin and eosin staining of colon sections. The infiltrated immune cells at the transmural extensions were indicated by arrowhead. Data information: Data are presented as the mean ± SEM. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 (Student's two‐tailed t‐test).Colons treated with 4% DSS for 5 days were collected on day 14. 5-6 mice were used for each experiment. (G) Colon sections were stained with markers for macrophages (F4/80) and anti-GPx8. Data information: Data are presented as the mean ± SEM. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 (Student's two‐tailed t‐test).Colons treated with 4% DSS for 5 days were collected on day 14. (H) Production of IL-1β, IL-6 and IL-18 in colon tissue lysates (n = 10 per group). Data information: Data are presented as the mean ± SEM. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 (Student's two‐tailed t‐test).Gut microbiome was shaped by Gpx8 deficiency under standard housing conditions. Bray Curtis dissimilarity of fecal microbiota were measured by bacterial 16S RNA sequencing (n = 5 per group) and are presented by a heat map, (I), and principal coordinates analysis, (J).Gut microbiome was shaped by Gpx8 deficiency under standard housing conditions. (K) α-diversity indicated bacteria species in each mouse depicted by richness (total operational taxonomic units, OTUs), the Chao1 richness estimator (Chao1), and the abundance-based coverage estimator (ACE) metrics. Data information: Data are presented as the mean ± SEM. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 (Student's two‐tailed t‐test)."}
{"words": ["Figure", "2B", ".", "Colons", "from", "mice", "treated", "with", "clodronate", "or", "control", "liposomes", "and", "subjected", "to", "adoptive", "cell", "transfer", "after", "macrophage", "depletion", "were", "stained", "with", "markers", "for", "macrophages", "(", "F4", "/", "80", ")", ".", "After", "undergoing", "macrophage", "depletion", ",", "C57BL", "/", "6", "mice", "received", "macrophages", "derived", "from", "WT", "(", "WT", "BMDMs", ")", "or", "GPx8", "-", "/", "-", "mice", "(", "GPx8", "-", "/", "-", "BMDMs", ")", "were", "under", "DSS", "-", "induced", "colitis", "(", "n", "=", "6", "-", "9", "per", "group", ")", ".", "(", "C", ")", "The", "percentage", "of", "body", "weight", ".", "(", "D", ")", "The", "clinical", "scores", "of", "mice", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "Student", "'", "s", "one", "‐", "tailed", "t", "‐", "test", ")", ".", "After", "undergoing", "macrophage", "depletion", ",", "C57BL", "/", "6", "mice", "received", "macrophages", "derived", "from", "WT", "(", "WT", "BMDMs", ")", "or", "GPx8", "-", "/", "-", "mice", "(", "GPx8", "-", "/", "-", "BMDMs", ")", "were", "under", "DSS", "-", "induced", "colitis", "(", "n", "=", "6", "-", "9", "per", "group", ")", ".", "Colon", "samples", "from", "BMDMs", "transplanted", "mice", "were", "collected", "on", "day", "7", "under", "colitis", "model", ".", "(", "E", ")", "Statistical", "analysis", "of", "colon", "length", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "Student", "'", "s", "one", "‐", "tailed", "t", "‐", "test", ")", ".", "After", "undergoing", "macrophage", "depletion", ",", "C57BL", "/", "6", "mice", "received", "macrophages", "derived", "from", "WT", "(", "WT", "BMDMs", ")", "or", "GPx8", "-", "/", "-", "mice", "(", "GPx8", "-", "/", "-", "BMDMs", ")", "were", "under", "DSS", "-", "induced", "colitis", "(", "n", "=", "6", "-", "9", "per", "group", ")", ".", "Colon", "samples", "from", "BMDMs", "transplanted", "mice", "were", "collected", "on", "day", "7", "under", "colitis", "model", ".", "(", "F", ")", "Images", "and", "semiquantitative", "scoring", "of", "hematoxylin", "and", "eosin", "staining", "colon", "sections", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "Student", "'", "s", "one", "‐", "tailed", "t", "‐", "test", ")", ".", "After", "undergoing", "macrophage", "depletion", ",", "C57BL", "/", "6", "mice", "received", "macrophages", "derived", "from", "WT", "(", "WT", "BMDMs", ")", "or", "GPx8", "-", "/", "-", "mice", "(", "GPx8", "-", "/", "-", "BMDMs", ")", "were", "under", "DSS", "-", "induced", "colitis", "(", "n", "=", "6", "-", "9", "per", "group", ")", ".", "Colon", "samples", "from", "BMDMs", "transplanted", "mice", "were", "collected", "on", "day", "7", "under", "colitis", "model", ".", "(", "G", ")", "Colon", "sections", "stained", "with", "anti", "-", "F4", "/", "80", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "Student", "'", "s", "one", "‐", "tailed", "t", "‐", "test", ")", ".", "After", "undergoing", "macrophage", "depletion", ",", "C57BL", "/", "6", "mice", "received", "macrophages", "derived", "from", "WT", "(", "WT", "BMDMs", ")", "or", "GPx8", "-", "/", "-", "mice", "(", "GPx8", "-", "/", "-", "BMDMs", ")", "were", "under", "DSS", "-", "induced", "colitis", "(", "n", "=", "6", "-", "9", "per", "group", ")", ".", "D", ")", "Colon", "samples", "from", "BMDMs", "transplanted", "mice", "were", "collected", "on", "day", "7", "under", "colitis", "model", ".", "(", "H", ")", "Production", "of", "IL", "-", "1β", ",", "IL", "-", "6", "and", "IL", "-", "18", "in", "colon", "tissue", "lysates", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "Student", "'", "s", "one", "‐", "tailed", "t", "‐", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B. Colons from mice treated with clodronate or control liposomes and subjected to adoptive cell transfer after macrophage depletion were stained with markers for macrophages (F4/80).After undergoing macrophage depletion, C57BL/6 mice received macrophages derived from WT (WT BMDMs) or GPx8-/- mice (GPx8-/- BMDMs) were under DSS-induced colitis (n = 6-9 per group). (C) The percentage of body weight. (D) The clinical scores of mice. Data information: Data are presented as the mean ± SEM. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 (Student's one‐tailed t‐test).After undergoing macrophage depletion, C57BL/6 mice received macrophages derived from WT (WT BMDMs) or GPx8-/- mice (GPx8-/- BMDMs) were under DSS-induced colitis (n = 6-9 per group). Colon samples from BMDMs transplanted mice were collected on day 7 under colitis model. (E) Statistical analysis of colon length. Data information: Data are presented as the mean ± SEM. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 (Student's one‐tailed t‐test).After undergoing macrophage depletion, C57BL/6 mice received macrophages derived from WT (WT BMDMs) or GPx8-/- mice (GPx8-/- BMDMs) were under DSS-induced colitis (n = 6-9 per group). Colon samples from BMDMs transplanted mice were collected on day 7 under colitis model. (F) Images and semiquantitative scoring of hematoxylin and eosin staining colon sections. Data information: Data are presented as the mean ± SEM. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 (Student's one‐tailed t‐test).After undergoing macrophage depletion, C57BL/6 mice received macrophages derived from WT (WT BMDMs) or GPx8-/- mice (GPx8-/- BMDMs) were under DSS-induced colitis (n = 6-9 per group). Colon samples from BMDMs transplanted mice were collected on day 7 under colitis model. (G) Colon sections stained with anti-F4/80. Data information: Data are presented as the mean ± SEM. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 (Student's one‐tailed t‐test).After undergoing macrophage depletion, C57BL/6 mice received macrophages derived from WT (WT BMDMs) or GPx8-/- mice (GPx8-/- BMDMs) were under DSS-induced colitis (n = 6-9 per group). D) Colon samples from BMDMs transplanted mice were collected on day 7 under colitis model. (H) Production of IL-1β, IL-6 and IL-18 in colon tissue lysates. Data information: Data are presented as the mean ± SEM. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 (Student's one‐tailed t‐test). "}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "Canonical", "NLRP3", "inflammasome", "activation", "was", "not", "altered", "by", "GPx8", "deficiency", ".", "BMDMs", "were", "primed", "for", "6", "h", "with", "0", ".", "5", "μg", "/", "ml", "LPS", "and", "then", "transfected", "with", "LPS", "(", "TF", "LPS", ")", "for", "8", "h", ",", "stimulated", "with", "ATP", "(", "5", "mM", ")", "for", "3", "h", ",", "MSU", "(", "150", "μg", "/", "mL", ")", "for", "8", "h", ",", "or", "nigericin", "(", "5", "μM", ")", "for", "3", "h", ".", "Activation", "of", "inflammasome", "was", "demonstrated", "by", "secreted", "IL", "-", "1β", ".", "Data", "information", ":", "data", "are", "representative", "of", "at", "least", "3", "independent", "experiments", "and", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", ",", "n", "=", "4", "-", "5", ",", "technical", "repeats", ".", "P", ">", "0", ".", "05", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "Student", "'", "s", "two", "‐", "tailed", "t", "‐", "test", ")", ".", "B", ".", "GPx8", "deficiency", "enhanced", "noncanonical", "inflammasome", "activation", ".", "Activation", "of", "the", "noncanonical", "inflammasome", "by", "different", "amounts", "of", "cytoplasmic", "LPS", "was", "verified", "by", "IL", "-", "1β", "(", "left", "panel", ")", "and", "LDH", "release", "(", "right", "panel", ")", ".", "Data", "information", ":", "data", "are", "representative", "of", "at", "least", "3", "independent", "experiments", "and", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", ",", "n", "=", "4", "-", "5", ",", "technical", "repeats", ".", "P", ">", "0", ".", "05", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "Student", "'", "s", "two", "‐", "tailed", "t", "‐", "test", ")", ".", "C", ".", "Upregulation", "of", "noncanonical", "inflammasome", "activation", "by", "GPx8", "deficiency", "occurred", "independently", "of", "TLRs", ".", "BMDMs", "were", "primed", "for", "6", "h", "with", "1", "μg", "/", "ml", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "and", "then", "transfected", "with", "LPS", "for", "8", "h", ".", "Data", "information", ":", "data", "are", "representative", "of", "at", "least", "3", "independent", "experiments", "and", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", ",", "n", "=", "4", "-", "5", ",", "technical", "repeats", ".", "P", ">", "0", ".", "05", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "Student", "'", "s", "two", "‐", "tailed", "t", "‐", "test", ")", ".", "Over", "-", "activation", "of", "noncanonical", "inflammasome", "induced", "by", "GPx8", "deficiency", "in", "BMDMs", "can", "be", "rescued", "by", "ectopically", "-", "expressing", "human", "GPx8", "(", "hGPx8", ")", ".", "(", "D", ")", "Activation", "of", "noncanonical", "inflammasome", "in", "BMDMs", "with", "empty", "vector", "(", "EV", ")", "or", "hGPx8", "was", "verified", "by", "IL", "-", "1β", "(", "left", "panel", ")", "and", "LDH", "release", "(", "right", "panel", ")", ".", "Data", "information", ":", "data", "are", "representative", "of", "at", "least", "3", "independent", "experiments", "and", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", ",", "n", "=", "4", "-", "5", ",", "technical", "repeats", ".", "P", ">", "0", ".", "05", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "Student", "'", "s", "two", "‐", "tailed", "t", "‐", "test", ")", ".", "Over", "-", "activation", "of", "noncanonical", "inflammasome", "induced", "by", "GPx8", "deficiency", "in", "BMDMs", "can", "be", "rescued", "by", "ectopically", "-", "expressing", "human", "GPx8", "(", "hGPx8", ")", ".", "(", "E", ")", "Expression", "of", "hGPx8", "mRNA", "in", "BMDMs", "was", "confirmed", "by", "quantitative", "reverse", "transcriptase", "PCR", ".", "Data", "information", ":", "data", "are", "representative", "of", "at", "least", "3", "independent", "experiments", "and", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", ",", "n", "=", "4", "-", "5", ",", "technical", "repeats", ".", "F", ".", "GPx8", "deficiency", "enhanced", "caspase", "-", "11", "cleavage", "and", "activation", ".", "Levels", "of", "processed", "caspase", "-", "1", "and", "-", "11", "in", "the", "supernatants", "(", "Sup", ")", "and", "full", "-", "length", "caspase", "-", "1", ",", "-", "11", "and", "GAPDH", "in", "the", "cell", "lysates", "(", "Cell", "ext", ")", "were", "determined", "by", "immunoblotting", ".", "Fold", "changes", "of", "protein", "expression", "were", "normalized", "with", "internal", "controls", "and", "are", "indicated", "below", "the", "blots", ".", "G", ".", "RNA", "expression", "of", "caspase", "-", "11", "was", "not", "altered", "by", "GPx8", "deficiency", ".", "Caspase", "-", "11", "RNA", "expression", "of", "BMDMs", "isolated", "from", "GPx8", "-", "/", "-", "mice", "was", "measured", "after", "LPS", "priming", ".", "Data", "information", ":", "ata", "are", "representative", "of", "at", "least", "3", "independent", "experiments", "and", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", ",", "n", "=", "4", "-", "5", ",", "technical", "repeats", ".", "H", ".", "GPx8", "deficiency", "enhanced", "noncanonical", "inflammasome", "activation", "and", "pyroptosis", "in", "vivo", ".", "Colon", "samples", "from", "5", "WT", "or", "GPx8", "-", "/", "-", "mice", "treated", "with", "DSS", "for", "5", "days", "were", "collected", "on", "day", "7", ".", "Levels", "of", "full", "-", "length", "and", "processed", "caspase", "-", "1", ",", "-", "11", "and", "gasdermin", "D", "(", "GSDMD", ")", "in", "tissue", "lysates", "were", "individually", "analyzed", "by", "immunoblots", ".", "GPx8", "-", "/", "-", "mice", "were", "more", "susceptible", "than", "WT", "mice", "to", "endotoxic", "shock", "by", "activation", "of", "the", "noncanonical", "inflammasome", ".", "(", "I", ")", "Survival", "of", "mice", "primed", "with", "ultra", "pure", "LPS", "(", "E", ".", "coli", "O55", ":", "B5", ",", "400", "μg", "/", "kg", ")", "and", "re", "-", "challenged", "6", "h", "later", "with", "LPS", "(", "40", "mg", "/", "kg", ")", "(", "n", "=", "8", "per", "group", ")", ".", "GPx8", "-", "/", "-", "mice", "were", "more", "susceptible", "than", "WT", "mice", "to", "endotoxic", "shock", "by", "activation", "of", "the", "noncanonical", "inflammasome", ".", "(", "J", ")", "Survival", "of", "mice", "primed", "with", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "(", "LMW", "1", "mg", "/", "kg", ")", "and", "re", "-", "challenged", "6", "h", "later", "with", "LPS", "(", "10", "mg", "/", "kg", ")", "(", "n", "=", "9", "per", "group", ")", ".", "GPx8", "-", "/", "-", "mice", "were", "more", "susceptible", "than", "WT", "mice", "to", "endotoxic", "shock", "by", "activation", "of", "the", "noncanonical", "inflammasome", ".", "(", "K", ")", "IL", "-", "1β", "production", "levels", "in", "mice", "sera", "were", "measured", "2", "h", "after", "being", "primed", "with", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "(", "LMW", "1", "mg", "/", "kg", ")", "and", "re", "-", "challenged", "6", "h", "later", "with", "LPS", "(", "1", "mg", "/", "kg", ")", "(", "n", "=", "8", "-", "9", "per", "group", ")", ".", "In", "(", "K", ")", ",", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "NS", ",", "no", "significance", ".", "P", ">", "0", ".", "05", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "Student", "'", "s", "two", "‐", "tailed", "t", "‐", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. Canonical NLRP3 inflammasome activation was not altered by GPx8 deficiency. BMDMs were primed for 6 h with 0.5 μg/ml LPS and then transfected with LPS (TF LPS) for 8 h, stimulated with ATP (5 mM) for 3 h, MSU (150 μg/mL) for 8 h, or nigericin (5 μM) for 3 h. Activation of inflammasome was demonstrated by secreted IL-1β. Data information: data are representative of at least 3 independent experiments and presented as the mean ± SD, n=4-5, technical repeats. P > 0.05; *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 (Student's two‐tailed t‐test).B. GPx8 deficiency enhanced noncanonical inflammasome activation. Activation of the noncanonical inflammasome by different amounts of cytoplasmic LPS was verified by IL-1β (left panel) and LDH release (right panel). Data information: data are representative of at least 3 independent experiments and presented as the mean ± SD, n=4-5, technical repeats. P > 0.05; *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 (Student's two‐tailed t‐test).C. Upregulation of noncanonical inflammasome activation by GPx8 deficiency occurred independently of TLRs. BMDMs were primed for 6 h with 1 μg/ml poly(I:C) and then transfected with LPS for 8 h. Data information: data are representative of at least 3 independent experiments and presented as the mean ± SD, n=4-5, technical repeats. P > 0.05; *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 (Student's two‐tailed t‐test).Over-activation of noncanonical inflammasome induced by GPx8 deficiency in BMDMs can be rescued by ectopically-expressing human GPx8 (hGPx8). (D) Activation of noncanonical inflammasome in BMDMs with empty vector (EV) or hGPx8 was verified by IL-1β (left panel) and LDH release (right panel). Data information: data are representative of at least 3 independent experiments and presented as the mean ± SD, n=4-5, technical repeats. P > 0.05; *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 (Student's two‐tailed t‐test).Over-activation of noncanonical inflammasome induced by GPx8 deficiency in BMDMs can be rescued by ectopically-expressing human GPx8 (hGPx8). (E) Expression of hGPx8 mRNA in BMDMs was confirmed by quantitative reverse transcriptase PCR. Data information: data are representative of at least 3 independent experiments and presented as the mean ± SD, n=4-5, technical repeats.F. GPx8 deficiency enhanced caspase-11 cleavage and activation. Levels of processed caspase-1 and -11 in the supernatants (Sup) and full-length caspase-1, -11 and GAPDH in the cell lysates (Cell ext) were determined by immunoblotting. Fold changes of protein expression were normalized with internal controls and are indicated below the blots.G. RNA expression of caspase-11 was not altered by GPx8 deficiency. Caspase-11 RNA expression of BMDMs isolated from GPx8-/- mice was measured after LPS priming. Data information: ata are representative of at least 3 independent experiments and presented as the mean ± SD, n=4-5, technical repeats.H. GPx8 deficiency enhanced noncanonical inflammasome activation and pyroptosis in vivo. Colon samples from 5 WT or GPx8-/- mice treated with DSS for 5 days were collected on day 7. Levels of full-length and processed caspase-1, -11 and gasdermin D (GSDMD) in tissue lysates were individually analyzed by immunoblots.GPx8-/- mice were more susceptible than WT mice to endotoxic shock by activation of the noncanonical inflammasome. (I) Survival of mice primed with ultra pure LPS (E. coli O55:B5, 400 μg/kg) and re-challenged 6 h later with LPS (40 mg/kg) (n = 8 per group).GPx8-/- mice were more susceptible than WT mice to endotoxic shock by activation of the noncanonical inflammasome. (J) Survival of mice primed with poly(I:C) (LMW 1 mg/kg) and re-challenged 6 h later with LPS (10 mg/kg) (n = 9 per group).GPx8-/- mice were more susceptible than WT mice to endotoxic shock by activation of the noncanonical inflammasome. (K) IL-1β production levels in mice sera were measured 2 h after being primed with poly(I:C) (LMW 1 mg/kg) and re-challenged 6 h later with LPS (1 mg/kg) (n = 8-9 per group). In (K), data are presented as the mean ± SEM. NS, no significance. P > 0.05; *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 (Student's two‐tailed t‐test)."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "Interaction", "of", "GPx8", "with", "human", "caspase", "-", "4", "(", "Casp4", ")", "or", "mouse", "caspase", "-", "11", "(", "Casp11", ")", "was", "confirmed", "by", "co", "-", "IP", "assays", ".", "293T", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "vectors", "expressing", "FLAG", "tagged", "Casp4", "or", "Casp11", ",", "in", "addition", "to", "GPx8", "expressing", "vectors", ".", "Cell", "lysate", "containing", "Casp4", "-", "or", "Casp11", "-", "FLAG", "proteins", "was", "immunoprecipitated", "by", "anti", "-", "FLAG", "Ab", "and", "subsequently", "analyzed", "by", "Western", "blots", "using", "anti", "-", "GPx8", "and", "anti", "-", "FLAG", "Ab", "(", "left", "panel", ")", ".", "GPx8", "and", "its", "interacting", "proteins", "were", "precipitated", "by", "anti", "-", "GPx8", "Ab", "and", "analyzed", "by", "the", "indicated", "Abs", "(", "right", "panel", ")", ".", "B", ".", "Co", "-", "localization", "of", "Myc", "-", "tagged", "GPx8", "(", "red", ")", "and", "endogenous", "caspase", "-", "4", "(", "green", ")", "in", "THP", "-", "1", "cells", ".", "C", ".", "Interaction", "between", "GPx8", "and", "caspase", "-", "4", "in", "THP", "-", "1", "cells", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "priming", "LPS", "was", "demonstrated", "by", "the", "in", "situ", "proximity", "ligation", "assay", "(", "PLA", ")", "(", "red", "dots", ",", "labeled", "by", "arrowheads", ")", ".", "GPx8", "-", "Myc", "stably", "expressing", "THP", "-", "1", "were", "used", "to", "detect", "the", "interaction", "between", "GPx8", "-", "Myc", "and", "endogenous", "caspase", "-", "4", ".", "Untreated", "cells", "(", "Ctrl", ")", "or", "cells", "primed", "with", "LPS", "(", "primed", "LPS", ")", "were", "incubated", "with", "anti", "-", "Myc", "and", "anti", "-", "caspase", "-", "4", "Abs", ",", "according", "to", "the", "manufacturer", "'", "s", "instructions", ",", "and", "the", "nucleus", "was", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Results", "were", "quantified", "by", "counting", "at", "least", "5", "different", "fields", "with", "an", "average", "of", "300", "cells", ".", "Reactions", "without", "primary", "Abs", "were", "used", "as", "the", "control", "for", "the", "PLA", "assay", "(", "PLA", "Ctrl", ")", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "are", "representative", "of", "at", "least", "3", "independent", "experiments", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "Student", "'", "s", "two", "‐", "tailed", "t", "‐", "test", ")", ".", "293T", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "vectors", "expressing", "FLAG", "tagged", "caspase", "-", "4", "(", "WT", "or", "C258S", ")", "in", "addition", "to", "GPx8", "expressing", "vectors", ".", "Cell", "lysate", "was", "immunoprecipitated", "by", "anti", "-", "FLAG", "Ab", "and", "subsequently", "analyzed", "by", "Western", "blots", "using", "anti", "-", "GPx8", "or", "anti", "-", "FLAG", "Ab", ".", "(", "D", ")", "Complexes", "of", "GPx8", "and", "caspase", "-", "4", "were", "demonstrated", "by", "co", "-", "IP", "assays", ".", "Cysteine", "-", "dependent", "covalent", "interactions", "of", "GPx8", "and", "caspase", "-", "4", "(", "C258S", ")", "were", "analyzed", "under", "non", "-", "reducing", "and", "reducing", "conditions", ".", "Disulfide", "-", "linked", "complexes", "of", "Gpx8", "and", "caspase", "-", "4", "are", "indicated", ".", "293T", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "vectors", "expressing", "FLAG", "tagged", "caspase", "-", "4", "(", "WT", "or", "C258S", ")", "in", "addition", "to", "GPx8", "expressing", "vectors", ".", "Cell", "lysate", "was", "immunoprecipitated", "by", "anti", "-", "FLAG", "Ab", "and", "subsequently", "analyzed", "by", "Western", "blots", "using", "anti", "-", "GPx8", "or", "anti", "-", "FLAG", "Ab", ".", "(", "E", ")", "Interactions", "of", "GPx8", "and", "caspase", "-", "4", "in", "response", "to", "H2O2", "treatment", "were", "demonstrated", "by", "co", "-", "IP", "assays", "of", "lysates", "prepared", "from", "293T", "cells", "treated", "with", "H2O2", "(", "200", "μM", ")", ".", "293T", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "vectors", "expressing", "FLAG", "tagged", "caspase", "-", "4", "(", "WT", "or", "C258S", ")", "in", "addition", "to", "GPx8", "expressing", "vectors", ".", "Cell", "lysate", "was", "immunoprecipitated", "by", "anti", "-", "FLAG", "Ab", "and", "subsequently", "analyzed", "by", "Western", "blots", "using", "anti", "-", "GPx8", "or", "anti", "-", "FLAG", "Ab", ".", "(", "F", ")", "C79S", ",", "C108S", ",", "and", "C2S2", "mutants", "of", "GPx8", "abolished", "most", "of", "the", "binding", "to", "caspase", "-", "4", "by", "co", "-", "IP", "assays", ".", "C79", "of", "GPx8", "was", "essential", "for", "its", "inhibitory", "effect", "on", "noncanonical", "inflammasome", "activation", ".", "THP", "-", "1", "cells", "stably", "expressing", "empty", "vector", "(", "EV", ")", ",", "WT", ",", "or", "mutant", "GPx8", "proteins", "were", "confirmed", "by", "immunoblotting", "(", "G", ")", ".", "C79", "of", "GPx8", "was", "essential", "for", "its", "inhibitory", "effect", "on", "noncanonical", "inflammasome", "activation", ".", "(", "H", "and", "I", ")", "Cells", "were", "treated", "with", "12", "-", "O", "-", "tetradecanoylphorbol", "13", "-", "actate", "(", "PMA", ")", "(", "0", ".", "1", "μM", ")", "and", "differentiated", "for", "3", "days", "then", "primed", "and", "transfected", "with", "LPS", ".", "Activation", "of", "the", "noncanonical", "inflammasome", "by", "different", "amounts", "of", "cytoplasmic", "LPS", "was", "verified", "by", "IL", "-", "1β", "(", "H", ")", "and", "LDH", "release", "(", "I", ")", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "are", "representative", "of", "at", "least", "3", "independent", "experiments", ".", "In", "H", "and", "I", ",", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", ",", "n", "=", "4", ",", "technical", "repeats", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "Student", "'", "s", "two", "‐", "tailed", "t", "‐", "test", ")", ".", "J", ".", "E", ".", "coli", "purified", "oxidized", "GPx8", "interacts", "with", "mammalian", "cell", "purified", "FLAG", "tagged", "caspase", "-", "4", "(", "C258S", ")", "to", "form", "a", "disulfide", "-", "linked", "complex", "(", "oxidized", "GPx8", ":", "oGPx8", ";", "reduced", "GPx8", ":", "rGPx8", ")", ".", "Lanes", "2", "and", "3", ",", "GPx8", "pretreated", "with", "1", "and", "5", "mM", "H2O2", ",", "respectively", ".", "Lanes", "4", "and", "5", ",", "Gpx8", "pretreated", "with", "50", "and", "200", "mM", "DTT", ",", "respectively", ".", "Disulfide", "-", "linked", "complexes", "of", "recombinant", "Gpx8", "and", "caspase", "-", "4", "(", "C258S", ")", "are", "indicated", ".", "K", ".", "GPx8", "inhibited", "the", "activation", "of", "caspase", "-", "4", "by", "decreasing", "the", "oligomerization", "of", "caspase", "-", "4", ".", "Oxidized", "GPx8", "and", "caspase", "-", "4", "(", "C258S", ")", "were", "co", "-", "incubated", "for", "30", "min", ".", "Different", "amounts", "of", "LPS", "were", "added", "to", "the", "complex", "and", "incubated", "for", "another", "30", "min", ".", "Oligomerized", "caspase", "-", "4", "was", "analyzed", "by", "native", "blue", "PAGE", "according", "to", "the", "manufacturer", "'", "s", "instructions", ".", "Mock", ":", "without", "GPx8", ";", "oxidized", "GPx8", ":", "oGPx8", ";", "oxidized", "GPx8C79S", ":", "oC79S", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "are", "representative", "of", "at", "least", "3", "independent", "experiments", ".", "In", "K", ",", "quantification", "of", "oligomers", "was", "calculated", "from", "3", "independent", "experiments", "and", "is", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", "of", "percent", "of", "oligomers", "/", "total", "proteins", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "Student", "'", "s", "two", "‐", "tailed", "t", "‐", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. Interaction of GPx8 with human caspase-4 (Casp4) or mouse caspase-11 (Casp11) was confirmed by co-IP assays. 293T cells were co-transfected with vectors expressing FLAG tagged Casp4 or Casp11, in addition to GPx8 expressing vectors. Cell lysate containing Casp4- or Casp11-FLAG proteins was immunoprecipitated by anti-FLAG Ab and subsequently analyzed by Western blots using anti-GPx8 and anti-FLAG Ab (left panel). GPx8 and its interacting proteins were precipitated by anti-GPx8 Ab and analyzed by the indicated Abs (right panel).B. Co-localization of Myc-tagged GPx8 (red) and endogenous caspase-4 (green) in THP-1 cells.C. Interaction between GPx8 and caspase-4 in THP-1 cells in the presence or absence of priming LPS was demonstrated by the in situ proximity ligation assay (PLA) (red dots, labeled by arrowheads). GPx8-Myc stably expressing THP-1 were used to detect the interaction between GPx8-Myc and endogenous caspase-4. Untreated cells (Ctrl) or cells primed with LPS (primed LPS) were incubated with anti-Myc and anti-caspase-4 Abs, according to the manufacturer's instructions, and the nucleus was stained with DAPI (blue). Results were quantified by counting at least 5 different fields with an average of 300 cells. Reactions without primary Abs were used as the control for the PLA assay (PLA Ctrl). Data information: All data are representative of at least 3 independent experiments. *P < 0.05; **P < 0.01; *** P < 0.001 (Student's two‐tailed t‐test).293T cells were co-transfected with vectors expressing FLAG tagged caspase-4 (WT or C258S) in addition to GPx8 expressing vectors. Cell lysate was immunoprecipitated by anti-FLAG Ab and subsequently analyzed by Western blots using anti-GPx8 or anti-FLAG Ab. (D) Complexes of GPx8 and caspase-4 were demonstrated by co-IP assays. Cysteine-dependent covalent interactions of GPx8 and caspase-4 (C258S) were analyzed under non-reducing and reducing conditions. Disulfide-linked complexes of Gpx8 and caspase-4 are indicated.293T cells were co-transfected with vectors expressing FLAG tagged caspase-4 (WT or C258S) in addition to GPx8 expressing vectors. Cell lysate was immunoprecipitated by anti-FLAG Ab and subsequently analyzed by Western blots using anti-GPx8 or anti-FLAG Ab. (E) Interactions of GPx8 and caspase-4 in response to H2O2 treatment were demonstrated by co-IP assays of lysates prepared from 293T cells treated with H2O2 (200 μM).293T cells were co-transfected with vectors expressing FLAG tagged caspase-4 (WT or C258S) in addition to GPx8 expressing vectors. Cell lysate was immunoprecipitated by anti-FLAG Ab and subsequently analyzed by Western blots using anti-GPx8 or anti-FLAG Ab. (F) C79S, C108S, and C2S2 mutants of GPx8 abolished most of the binding to caspase-4 by co-IP assays.C79 of GPx8 was essential for its inhibitory effect on noncanonical inflammasome activation. THP-1 cells stably expressing empty vector (EV), WT, or mutant GPx8 proteins were confirmed by immunoblotting (G).C79 of GPx8 was essential for its inhibitory effect on noncanonical inflammasome activation. (H and I) Cells were treated with 12-O-tetradecanoylphorbol 13-actate (PMA) (0.1 μM) and differentiated for 3 days then primed and transfected with LPS. Activation of the noncanonical inflammasome by different amounts of cytoplasmic LPS was verified by IL-1β (H) and LDH release (I). Data information: All data are representative of at least 3 independent experiments. In H and I, data are presented as the mean ± SD, n=4, technical repeats. *P < 0.05; **P < 0.01; *** P < 0.001 (Student's two‐tailed t‐test).J. E. coli purified oxidized GPx8 interacts with mammalian cell purified FLAG tagged caspase-4 (C258S) to form a disulfide-linked complex (oxidized GPx8: oGPx8; reduced GPx8: rGPx8). Lanes 2 and 3, GPx8 pretreated with 1 and 5 mM H2O2, respectively. Lanes 4 and 5, Gpx8 pretreated with 50 and 200 mM DTT, respectively. Disulfide-linked complexes of recombinant Gpx8 and caspase-4 (C258S) are indicated.K. GPx8 inhibited the activation of caspase-4 by decreasing the oligomerization of caspase-4. Oxidized GPx8 and caspase-4 (C258S) were co-incubated for 30 min. Different amounts of LPS were added to the complex and incubated for another 30 min. Oligomerized caspase-4 was analyzed by native blue PAGE according to the manufacturer's instructions. Mock: without GPx8; oxidized GPx8: oGPx8; oxidized GPx8C79S: oC79S. Data information: All data are representative of at least 3 independent experiments. In K, quantification of oligomers was calculated from 3 independent experiments and is presented as the mean ± SD of percent of oligomers/total proteins. *P < 0.05; **P < 0.01; *** P < 0.001 (Student's two‐tailed t‐test)."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "Casp4C118S", "mutant", "partially", "abolished", "the", "covalent", "disulfide", "-", "link", "with", "GPx8", ".", "Interacting", "GPx8", "were", "co", "-", "immunoprecipitated", "with", "FLAG", "-", "tagged", "caspase", "-", "4", "(", "WT", ",", "C118S", ",", "C329S", "mutants", ")", "and", "analyzed", "under", "reducing", "(", "+", "DTT", ")", "or", "non", "-", "reducing", "(", "-", "DTT", ")", "conditions", ".", "Disulfide", "-", "linked", "complexes", "of", "GPx8", "and", "caspase", "-", "4", "are", "indicated", ".", "Fold", "change", "of", "complexes", "was", "normalized", "with", "internal", "controls", "and", "indicated", "below", "blots", ".", "C118", "of", "caspase", "-", "4", "was", "required", "for", "the", "GPx8", "-", "mediated", "inhibitory", "effect", ".", "THP", "-", "1", "cells", "stably", "expressing", "empty", "vector", "(", "EV", ")", ",", "FLAG", "-", "tagged", "caspase", "-", "4", "(", "WT", ",", "C258S", ",", "C118S", "mutants", ")", ",", "or", "GPx8", "(", "WT", "and", "C79S", "mutants", ")", "were", "confirmed", "by", "immunoblotting", "(", "B", ")", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "shown", "are", "representative", "of", "at", "least", "3", "independent", "experiments", ".", "C118", "of", "caspase", "-", "4", "was", "required", "for", "the", "GPx8", "-", "mediated", "inhibitory", "effect", ".", "(", "C", "-", "D", ")", "Casp4C118S", "completely", "abolished", "the", "inhibition", "of", "noncanonical", "inflammasome", "signaling", "in", "response", "to", "intracellular", "LPS", ".", "THP", "-", "1", "cells", "were", "differentiated", ",", "primed", ",", "and", "transfected", "with", "LPS", ".", "Activation", "of", "the", "noncanonical", "inflammasome", "by", "different", "quantities", "of", "cytoplasmic", "LPS", "is", "confirmed", "by", "the", "production", "of", "IL", "-", "1β", "(", "C", ")", "and", "LDH", "(", "D", ")", ".", "In", "C", "and", "D", ",", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", ",", "n", "=", "4", ",", "technical", "repeats", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "Student", "'", "s", "two", "‐", "tailed", "t", "‐", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. Casp4C118S mutant partially abolished the covalent disulfide-link with GPx8. Interacting GPx8 were co-immunoprecipitated with FLAG-tagged caspase-4 (WT, C118S, C329S mutants) and analyzed under reducing (+DTT) or non-reducing (-DTT) conditions. Disulfide-linked complexes of GPx8 and caspase-4 are indicated. Fold change of complexes was normalized with internal controls and indicated below blots.C118 of caspase-4 was required for the GPx8-mediated inhibitory effect. THP-1 cells stably expressing empty vector (EV), FLAG-tagged caspase-4 (WT, C258S, C118S mutants), or GPx8 (WT and C79S mutants) were confirmed by immunoblotting (B). Data information: All data shown are representative of at least 3 independent experiments.C118 of caspase-4 was required for the GPx8-mediated inhibitory effect. (C-D) Casp4C118S completely abolished the inhibition of noncanonical inflammasome signaling in response to intracellular LPS. THP-1 cells were differentiated, primed, and transfected with LPS. Activation of the noncanonical inflammasome by different quantities of cytoplasmic LPS is confirmed by the production of IL-1β (C) and LDH (D). In C and D, data are presented as the mean ± SD, n=4, technical repeats. ***P < 0.001 (Student's two‐tailed t‐test)."}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "The", "caspase", "-", "4", "/", "11", "and", "-", "1", "inhibitor", ",", "VX", "-", "765", ",", "inhibited", "noncanonical", "inflammasome", "activation", ".", "BMDMs", "isolated", "from", "mice", "were", "primed", "with", "LPS", "for", "5", "-", "6", "h", ",", "treated", "with", "20", "μM", "VX", "-", "765", ",", "and", "transfected", "with", "LPS", "for", "12", "h", ".", "Data", "information", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", ",", "n", "=", "5", ",", "technical", "repeats", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "Student", "'", "s", "two", "‐", "tailed", "t", "‐", "test", ")", ".", "Mice", "were", "injected", "intraperitoneally", "with", "VX", "-", "765", "(", "20", "mg", "/", "kg", ")", "under", "colitis", "model", "and", "analyzed", "by", "a", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "plot", "(", "B", ")", "of", "mice", "with", "colitis", "induced", "by", "4", "%", "DSS", "for", "6", "days", "(", "n", "=", "10", "-", "11", "per", "group", ")", ".", "Data", "information", ":", ",", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "NS", ":", "not", "significant", "(", "P", ">", "0", ".", "05", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "Student", "'", "s", "two", "‐", "tailed", "t", "‐", "test", ")", ".", "Mice", "were", "injected", "intraperitoneally", "with", "VX", "-", "765", "(", "20", "mg", "/", "kg", ")", "under", "colitis", "model", "and", "the", "percentage", "of", "body", "weight", "(", "C", ")", "and", "clinical", "scores", "(", "D", ")", "of", "mice", "with", "colitis", "induced", "by", "4", "%", "DSS", "for", "6", "days", "(", "n", "=", "10", "-", "11", "per", "group", ")", ".", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "NS", ":", "not", "significant", "(", "P", ">", "0", ".", "05", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "Student", "'", "s", "two", "‐", "tailed", "t", "‐", "test", ")", ".", "Mice", "were", "injected", "intraperitoneally", "with", "VX", "-", "765", "(", "20", "mg", "/", "kg", ")", "under", "colitis", "model", "Colon", "samples", "from", "mice", "treated", "with", "4", "%", "DSS", "for", "5", "days", "(", "n", "=", "6", "-", "10", "per", "group", ")", ".", "Full", "-", "length", "and", "cleavage", "forms", "of", "caspase", "-", "11", ",", "caspase", "-", "1", ",", "and", "GSDMD", "(", "E", ")", "in", "colon", "tissue", "lysates", "were", "analyzed", "by", "immunoblots", "on", "day", "7", "after", "DSS", "treatment", ".", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "NS", ":", "not", "significant", "(", "P", ">", "0", ".", "05", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "Student", "'", "s", "two", "‐", "tailed", "t", "‐", "test", ")", ".", "Mice", "were", "injected", "intraperitoneally", "with", "VX", "-", "765", "(", "20", "mg", "/", "kg", ")", "under", "colitis", "model", "Colon", "samples", "from", "mice", "treated", "with", "4", "%", "DSS", "for", "5", "days", "(", "n", "=", "6", "-", "10", "per", "group", ")", ".", "Production", "of", "IL", "-", "1β", "and", "IL", "-", "6", "(", "F", ")", "in", "colon", "tissue", "lysates", "was", "assessed", "on", "day", "14", "after", "treatment", ".", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "NS", ":", "not", "significant", "(", "P", ">", "0", ".", "05", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "Student", "'", "s", "two", "‐", "tailed", "t", "‐", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A. The caspase-4/11 and -1 inhibitor, VX-765, inhibited noncanonical inflammasome activation. BMDMs isolated from mice were primed with LPS for 5-6 h, treated with 20 μM VX-765, and transfected with LPS for 12 h. Data information data are presented as the mean ± SD, n=5, technical repeats. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 (Student's two‐tailed t‐test).Mice were injected intraperitoneally with VX-765 (20 mg/kg) under colitis model and analyzed by a Kaplan-Meier survival plot (B) of mice with colitis induced by 4% DSS for 6 days (n = 10-11 per group). Data information: , data are presented as the mean ± SEM. NS: not significant (P > 0.05). *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 (Student's two‐tailed t‐test).Mice were injected intraperitoneally with VX-765 (20 mg/kg) under colitis model and the percentage of body weight (C) and clinical scores (D) of mice with colitis induced by 4% DSS for 6 days (n = 10-11 per group). data are presented as the mean ± SEM. NS: not significant (P > 0.05). *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 (Student's two‐tailed t‐test).Mice were injected intraperitoneally with VX-765 (20 mg/kg) under colitis model Colon samples from mice treated with 4% DSS for 5 days (n = 6-10 per group). Full-length and cleavage forms of caspase-11, caspase-1, and GSDMD (E) in colon tissue lysates were analyzed by immunoblots on day 7 after DSS treatment. data are presented as the mean ± SEM. NS: not significant (P > 0.05). *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 (Student's two‐tailed t‐test).Mice were injected intraperitoneally with VX-765 (20 mg/kg) under colitis model Colon samples from mice treated with 4% DSS for 5 days (n = 6-10 per group). Production of IL-1β and IL-6 (F) in colon tissue lysates was assessed on day 14 after treatment. data are presented as the mean ± SEM. NS: not significant (P > 0.05). *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 (Student's two‐tailed t‐test)."}
{"words": ["Figure", "7A", ".", "GPx8", "was", "predominantly", "expressed", "in", "macrophages", "of", "UC", "patients", ".", "Colon", "biopsies", "of", "non", "-", "inflamed", "regions", "from", "UC", "patients", "were", "stained", "with", "the", "pan", "-", "macrophage", "marker", ",", "CD68", ",", "or", "the", "monocyte", "/", "macrophage", "activating", "marker", ",", "CD163", ",", "combined", "with", "anti", "-", "GPx8", ".", "Quantification", "of", "double", "-", "positive", "cells", "was", "calculated", "from", "3", "individual", "patients", "and", "is", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SEM", "of", "the", "percentage", "of", "double", "-", "positive", "cells", ".", "The", "total", "cell", "numbers", "are", "the", "sum", "of", "double", "-", "and", "single", "-", "positive", "cells", ".", "B", ".", "Relative", "expression", "levels", "of", "GPx8", ",", "GPx7", "and", "caspase", "-", "4", "in", "non", "-", "inflamed", "biopsy", "specimens", "from", "healthy", "controls", "(", "Ctrl", ")", "(", "n", "=", "14", ")", "and", "UC", "patients", "(", "n", "=", "25", ")", "are", "demonstrated", "by", "immunoblots", ".", "C", ".", "Data", "are", "normalized", "to", "the", "mean", "of", "healthy", "controls", "and", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "Mann", "Whitney", "test", "for", "GPx8", "and", "Student", "'", "s", "two", "‐", "tailed", "t", "‐", "test", "for", "GPx7", "and", "caspase", "-", "4", "expression", "analysis", ".", "Data", "information", ":", "NS", ":", "not", "significant", "(", "P", ">", "0", ".", "05", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "D", ".", "Paired", "GPx8", "and", "caspase", "-", "4", "expression", "from", "each", "individual", "are", "linked", "by", "lines", "and", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "The", "p", "-", "value", "was", "analyzed", "by", "the", "Fisher", "'", "s", "exact", "test", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A. GPx8 was predominantly expressed in macrophages of UC patients. Colon biopsies of non-inflamed regions from UC patients were stained with the pan-macrophage marker, CD68, or the monocyte/macrophage activating marker, CD163, combined with anti-GPx8. Quantification of double-positive cells was calculated from 3 individual patients and is presented as the mean ± SEM of the percentage of double-positive cells. The total cell numbers are the sum of double- and single-positive cells.B. Relative expression levels of GPx8, GPx7 and caspase-4 in non-inflamed biopsy specimens from healthy controls (Ctrl) (n = 14) and UC patients (n = 25) are demonstrated by immunoblots. C. Data are normalized to the mean of healthy controls and presented as the mean ± SEM. Mann Whitney test for GPx8 and Student's two‐tailed t‐test for GPx7 and caspase-4 expression analysis. Data information: NS: not significant (P > 0.05). *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001.D. Paired GPx8 and caspase-4 expression from each individual are linked by lines and presented as the mean ± SEM. The p-value was analyzed by the Fisher's exact test. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001."}
{"words": ["Figure", "1", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "EGFP", "-", "LC3", "puncta", "in", "MCF7", "-", "EGFP", "-", "LC3", "cells", "56", "h", "after", "transfection", "with", "the", "indicated", "siRNAs", ".", "When", "indicated", ",", "cells", "were", "exposed", "to", "100", "nM", "rapamycin", "for", "the", "last", "3", "h", ".", "RPTOR", "(", "raptor", ")", "and", "BECN1", "(", "beclin1", ")", "siRNAs", "served", "as", "positive", "and", "negative", "controls", ",", "respectively", ".", "(", "E", ")", "Autophagic", "flux", "was", "measured", "as", "the", "ratio", "between", "luciferase", "activities", "in", "MCF7", "-", "RLuc", "-", "LC3WT", "and", "MCF7", "-", "RLuc", "-", "LC3G120A", "cells", "transfected", "with", "the", "indicated", "siRNAs", "56", "h", "earlier", "and", "left", "untreated", "or", "treated", "with", "100", "nM", "rapamycin", "for", "the", "last", "3", "h", ".", "Error", "bars", "are", "SDs", "for", "a", "representative", "(", "n", "=", "5", ")", "triplicate", "experiment", "with", "a", "minimum", "of", "4", "×", "10", "randomly", "chosen", "areas", "/", "sample", "analyzed", "(", "D", ")", "or", "three", "independent", "experiments", "(", "F", ")", ".", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "as", "compared", "with", "similarly", "treated", "control", "siRNA", "-", "transfected", "samples", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1.(D) Quantification of EGFP-LC3 puncta in MCF7-EGFP-LC3 cells 56 h after transfection with the indicated siRNAs. When indicated, cells were exposed to 100 nM rapamycin for the last 3 h. RPTOR (raptor) and BECN1 (beclin1) siRNAs served as positive and negative controls, respectively.(E) Autophagic flux was measured as the ratio between luciferase activities in MCF7-RLuc-LC3WT and MCF7-RLuc-LC3G120A cells transfected with the indicated siRNAs 56 h earlier and left untreated or treated with 100 nM rapamycin for the last 3 h. Error bars are SDs for a representative (n = 5) triplicate experiment with a minimum of 4 × 10 randomly chosen areas/sample analyzed (D) or three independent experiments (F). *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001, as compared with similarly treated control siRNA-transfected samples."}
{"words": ["Figure", "2", ".", "(", "A", ")", "Representative", "immunoblots", "of", "indicated", "proteins", "from", "whole", "-", "cell", "lysates", "of", "MCF7", "cells", "transfected", "with", "indicated", "siRNAs", "for", "56", "h", "and", "subjected", "to", "0", "-", "40", "min", "of", "amino", "acid", "starvation", "[", "−", "AA", "]", ")", ".", "(", "B", ")", "Representative", "immunoblots", "of", "the", "indicated", "proteins", "from", "whole", "-", "cell", "lysates", "of", "MCF7", "-", "EGFP", "-", "LC3", "cells", "stably", "infected", "with", "control", "or", "CIP2Ar", "(", "siRNA", "-", "resistant", "CIP2A", ")", "-", "encoding", "lentivirus", ",", "transfected", "with", "the", "indicated", "siRNAs", "for", "53", "h", ",", "and", "treated", "with", "100", "nM", "rapamycin", "(", "Rapa", ")", "for", "0", "-", "20", "min", ".", "(", "C", ")", "MCF7", "-", "EGFP", "-", "LC3", "cells", "stably", "infected", "with", "control", "or", "CIP2Ar", "-", "encoding", "lentivirus", "were", "transfected", "with", "indicated", "siRNAs", "for", "48", "h", "and", "analyzed", "for", "EGFP", "-", "LC3", "puncta", "formation", ".", "(", "D", ")", "MCF7", "-", "EGFP", "-", "LC3", "cells", "transfected", "with", "control", "(", "−", ")", "and", "CIP2A", "siRNAs", "together", "with", "an", "empty", "vector", "(", "−", ")", "or", "MYC", "-", "S62A", "cDNA", "as", "indicated", "were", "analyzed", "56", "h", "later", "for", "EGFP", "-", "LC3", "puncta", "(", "left", ")", "and", "expression", "of", "indicated", "proteins", "(", "right", ")", ".", "(", "E", ")", "Representative", "immunoblots", "(", "left", ")", "of", "indicated", "proteins", "from", "whole", "-", "cell", "lysates", "of", "MCF7", "cells", "treated", "with", "the", "control", "(", "C", ")", ",", "RPTOR", "(", "RP", ")", ",", "or", "CIP2A", "(", "CIP", ")", "siRNAs", "for", "56", "h", "and", "densitometric", "quantification", "of", "three", "independent", "experiments", "(", "right", ")", ".", "Error", "bars", "show", "SDs", "for", "three", "independent", "experiments", ".", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "compared", "with", "Student", "'", "s", "t", "test", "as", "indicated", "(", "C", "and", "D", ")", "or", "with", "control", "siRNA", "-", "transfected", "samples", "(", "E", ")", ".", "Black", "lines", "indicate", "that", "intervening", "lanes", "have", "been", "spliced", "out", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2.(A) Representative immunoblots of indicated proteins from whole-cell lysates of MCF7 cells transfected with indicated siRNAs for 56 h and subjected to 0-40 min of amino acid starvation [−AA]).(B) Representative immunoblots of the indicated proteins from whole-cell lysates of MCF7-EGFP-LC3 cells stably infected with control or CIP2Ar (siRNA-resistant CIP2A)-encoding lentivirus, transfected with the indicated siRNAs for 53 h, and treated with 100 nM rapamycin (Rapa) for 0-20 min.(C) MCF7-EGFP-LC3 cells stably infected with control or CIP2Ar-encoding lentivirus were transfected with indicated siRNAs for 48 h and analyzed for EGFP-LC3 puncta formation.(D) MCF7-EGFP-LC3 cells transfected with control (−) and CIP2A siRNAs together with an empty vector (−) or MYC-S62A cDNA as indicated were analyzed 56 h later for EGFP-LC3 puncta (left) and expression of indicated proteins (right).(E) Representative immunoblots (left) of indicated proteins from whole-cell lysates of MCF7 cells treated with the control (C), RPTOR (RP), or CIP2A (CIP) siRNAs for 56 h and densitometric quantification of three independent experiments (right). Error bars show SDs for three independent experiments. *, P < 0.05; **, P < 0.01; ***, P < 0.001, compared with Student's t test as indicated (C and D) or with control siRNA-transfected samples (E). Black lines indicate that intervening lanes have been spliced out."}
{"words": ["Figure", "3", ".", "(", "A", ",", "top", "left", ")", "Quantification", "of", "EGFP", "-", "LC3", "puncta", "in", "MCF7", "-", "EGFP", "-", "LC3", "cells", "infected", "with", "control", "or", "CIP2A", "lentiviral", "shRNAs", ".", "Representative", "immunofluorescence", "images", "(", "right", ")", "and", "immunoblots", "(", "bottom", ")", "are", "shown", ".", "(", "B", ")", "Mean", "cell", "diameters", "of", "MCF7", "-", "EGFP", "-", "LC3", "cells", "infected", "as", "in", "A", "were", "measured", "with", "a", "cytometer", "(", "NucleoCounter", "NC", "-", "3000", ";", "Chemometec", "AS", ")", "equipped", "with", "Via1", "-", "Cassettes", "(", "Chemometec", "AS", ")", ".", "(", "C", ")", "MCF7", "cells", "infected", "with", "shRNAs", "as", "in", "A", "were", "plated", "in", "equal", "density", "and", "left", "untreated", "or", "treated", "with", "100", "nM", "rapamycin", "(", "Rapa", ")", "for", "72", "h", ".", "The", "viable", "cells", "were", "either", "visualized", "after", "fixation", "and", "crystal", "violet", "staining", "(", "left", ";", "representative", "figure", ",", "n", "=", "4", ")", "or", "trypsinized", "and", "counted", "with", "NucleoCounter", "NC", "-", "3000", "equipped", "with", "Via1", "-", "Cassettes", "(", "right", ")", ".", "(", "D", ")", "MCF7", "cells", "infected", "with", "shRNAs", "as", "in", "A", "were", "left", "untreated", "or", "treated", "with", "2", "nM", "ConA", ",", "2", "µM", "MG132", ",", "5", "µM", "siramesine", "(", "Sira", ")", ",", "or", "100", "µM", "etoposide", "(", "Etop", ")", "for", "48", "h", ",", "and", "the", "metabolic", "activity", "(", "cell", "density", ")", "was", "measured", "by", "the", "MTT", "assay", "(", "left", ")", ",", "and", "cell", "death", "was", "measured", "by", "the", "LDH", "assay", "(", "right", ")", ".", "(", "E", ")", "Light", "microscopy", "pictures", "of", "MCF10A", "cells", "at", "passage", "8", "after", "infection", "with", "control", "or", "CIP2A", "-", "encoding", "lentivirus", ".", "(", "F", ")", "Representative", "immunoblots", "of", "the", "indicated", "proteins", "from", "whole", "-", "cell", "lysates", "of", "MCF10A", "(", "left", ")", "and", "HEK", "-", "293", "(", "right", ")", "cells", "infected", "as", "in", "E", "and", "treated", "with", "100", "nM", "rapamycin", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Black", "lines", "indicate", "that", "intervening", "lanes", "have", "been", "spliced", "out", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3.(A, top left) Quantification of EGFP-LC3 puncta in MCF7-EGFP-LC3 cells infected with control or CIP2A lentiviral shRNAs. Representative immunofluorescence images (right) and immunoblots (bottom) are shown. (B) Mean cell diameters of MCF7-EGFP-LC3 cells infected as in A were measured with a cytometer (NucleoCounter NC-3000; Chemometec AS) equipped with Via1-Cassettes (Chemometec AS).(C) MCF7 cells infected with shRNAs as in A were plated in equal density and left untreated or treated with 100 nM rapamycin (Rapa) for 72 h. The viable cells were either visualized after fixation and crystal violet staining (left; representative figure, n = 4) or trypsinized and counted with NucleoCounter NC-3000 equipped with Via1-Cassettes (right).(D) MCF7 cells infected with shRNAs as in A were left untreated or treated with 2 nM ConA, 2 µM MG132, 5 µM siramesine (Sira), or 100 µM etoposide (Etop) for 48 h, and the metabolic activity (cell density) was measured by the MTT assay (left), and cell death was measured by the LDH assay (right).(E) Light microscopy pictures of MCF10A cells at passage 8 after infection with control or CIP2A-encoding lentivirus.(F) Representative immunoblots of the indicated proteins from whole-cell lysates of MCF10A (left) and HEK-293 (right) cells infected as in E and treated with 100 nM rapamycin for the indicated times. Black lines indicate that intervening lanes have been spliced out."}
{"words": ["Figure", "4", ".", "CIP2A", "expression", "correlates", "with", "mTORC1", "activity", "in", "primary", "human", "breast", "tumors", ".", "TMAs", "including", "33", "normal", "breast", "tissues", "and", "210", "primary", "breast", "carcinoma", "samples", "were", "analyzed", "by", "semiquantitative", "immunohistochemistry", "for", "the", "expression", "of", "the", "indicated", "proteins", "and", "mean", "scores", "(", "arbitrary", "units", "[", "a", ".", "u", ".", "]", ")", "for", "duplicate", "samples", "were", "averaged", "and", "plotted", "according", "to", "mean", "CIP2A", "expression", "(", "left", ")", ".", "The", "red", "lines", "are", "the", "regression", "lines", ",", "and", "the", "stippled", "red", "lines", "define", "the", "95", "%", "confidence", "intervals", ".", "Statistical", "analysis", "of", "data", "was", "performed", "using", "NCSS", "2007", "and", "Prism", "version", "5", ".", "Examples", "of", "the", "staining", "of", "breast", "cancer", "(", "a", ")", "and", "normal", "(", "b", ")", "cores", "indicated", "in", "the", "P", "-", "T389", "-", "S6K1", "/", "CIP2A", "plot", "are", "shown", "on", "the", "right", ".", "rsp", ",", "Spearman", "'", "s", "correlation", "coefficient", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4.CIP2A expression correlates with mTORC1 activity in primary human breast tumors. TMAs including 33 normal breast tissues and 210 primary breast carcinoma samples were analyzed by semiquantitative immunohistochemistry for the expression of the indicated proteins and mean scores (arbitrary units [a.u.]) for duplicate samples were averaged and plotted according to mean CIP2A expression (left). The red lines are the regression lines, and the stippled red lines define the 95% confidence intervals. Statistical analysis of data was performed using NCSS 2007 and Prism version 5. Examples of the staining of breast cancer (a) and normal (b) cores indicated in the P-T389-S6K1/CIP2A plot are shown on the right. rsp, Spearman's correlation coefficient."}
{"words": ["Figure", "5", ".", "(", "A", "and", "B", ")", "In", "vitro", "translated", "full", "-", "length", "CIP2A", "was", "incubated", "with", "purified", "human", "PP2A", "complex", "and", "HA", "-", "Raptor", "(", "A", ")", "or", "HA", "-", "S6K1", "(", "B", ")", "purified", "from", "transiently", "transfected", "MCF7", "cells", ".", "Protein", "complexes", "were", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "HA", "antibody", "and", "analyzed", "by", "immunoblotting", "as", "indicated", ".", "Nonspecific", "IgG", "served", "as", "a", "control", ".", "Note", "that", "human", "reticulocyte", "(", "RC", ")", "lysate", "used", "for", "in", "vitro", "translation", "of", "CIP2A", "contained", "detectable", "amounts", "of", "PP2Ac", ".", "(", "C", ")", "Endogenous", "CIP2A", "protein", "complexes", "immunoprecipitated", "from", "MCF7", "cells", "were", "analyzed", "by", "immunoblotting", "and", "PP2A", "activity", "assay", ".", "Immunoblots", "of", "corresponding", "cell", "lysates", "are", "shown", "on", "the", "right", ".", "(", "D", ")", "Endogenous", "raptor", "protein", "complexes", "immunoprecipitated", "from", "MCF7", "cells", "stably", "infected", "with", "control", "(", "Ctr", ")", "or", "CIP2A", "shRNA", "lentiviruses", "(", "Fig", ".", "3", "A", ")", "and", "starved", "for", "amino", "acids", "for", "20", "min", "when", "indicated", "were", "analyzed", "by", "immunoblotting", "and", "PP2A", "activity", "assay", ".", "Immunoblots", "of", "corresponding", "cell", "lysates", "are", "shown", "on", "the", "right", ".", "(", "E", ")", "Raptor", "protein", "complexes", "immunoprecipitated", "from", "MCF7", "cells", "treated", "with", "control", "(", "C", ")", "or", "PPP2R1A", "(", "R1A", ")", "siRNAs", "for", "56", "h", "were", "analyzed", "by", "immunoblotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Immunoblots", "of", "corresponding", "cell", "lysates", "are", "shown", "on", "the", "left", ".", "(", "F", ")", "HA", "-", "S6K1", "protein", "complexes", "immunoprecipitated", "from", "MCF7", "cells", "stably", "infected", "with", "control", "or", "CIP2A", "shRNA", "lentiviruses", "(", "Fig", ".", "3", "A", ")", ",", "transiently", "transfected", "with", "HA", "-", "RPS6K1", "cDNA", "and", "starved", "for", "amino", "acids", "for", "20", "min", "when", "indicated", ",", "were", "analyzed", "by", "immunoblotting", ".", "Immunoblots", "of", "corresponding", "cell", "lysates", "are", "shown", "on", "the", "right", ".", "(", "G", ")", "Enzymatic", "activity", "of", "a", "purified", "PP2A", "holoenzyme", "incubated", "with", "human", "reticulocyte", "lysate", "with", "or", "without", "in", "vitro", "translated", "full", "-", "length", "CIP2A", ".", "Error", "bars", "are", "SDs", "for", "four", "(", "D", ")", "independent", "experiments", "or", "a", "representative", "triplicate", "experiment", "(", "C", "and", "G", ")", ".", "(", "H", ")", "Representative", "confocal", "microscopy", "images", "of", "untreated", "and", "amino", "acid", "-", "starved", "(", "4", "h", ")", "MCF7", "cells", "stained", "for", "endogenous", "CIP2A", "and", "raptor", ".", "Black", "lines", "indicate", "that", "intervening", "lanes", "have", "been", "spliced", "out", ".", "−", "AA", ",", "amino", "acid", "starvation", ";", "IP", ",", "immunoprecipitation", ";", "a", ".", "u", ".", ",", "arbitrary", "unit", ".", "Bar", ",", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5.(A and B) In vitro translated full-length CIP2A was incubated with purified human PP2A complex and HA-Raptor (A) or HA-S6K1 (B) purified from transiently transfected MCF7 cells. Protein complexes were immunoprecipitated with anti-HA antibody and analyzed by immunoblotting as indicated. Nonspecific IgG served as a control. Note that human reticulocyte (RC) lysate used for in vitro translation of CIP2A contained detectable amounts of PP2Ac.(C) Endogenous CIP2A protein complexes immunoprecipitated from MCF7 cells were analyzed by immunoblotting and PP2A activity assay. Immunoblots of corresponding cell lysates are shown on the right.(D) Endogenous raptor protein complexes immunoprecipitated from MCF7 cells stably infected with control (Ctr) or CIP2A shRNA lentiviruses (Fig. 3 A) and starved for amino acids for 20 min when indicated were analyzed by immunoblotting and PP2A activity assay. Immunoblots of corresponding cell lysates are shown on the right.(E) Raptor protein complexes immunoprecipitated from MCF7 cells treated with control (C) or PPP2R1A (R1A) siRNAs for 56 h were analyzed by immunoblotting with the indicated antibodies. Immunoblots of corresponding cell lysates are shown on the left.(F) HA-S6K1 protein complexes immunoprecipitated from MCF7 cells stably infected with control or CIP2A shRNA lentiviruses (Fig. 3 A), transiently transfected with HA-RPS6K1 cDNA and starved for amino acids for 20 min when indicated, were analyzed by immunoblotting. Immunoblots of corresponding cell lysates are shown on the right.(G) Enzymatic activity of a purified PP2A holoenzyme incubated with human reticulocyte lysate with or without in vitro translated full-length CIP2A. Error bars are SDs for four (D) independent experiments or a representative triplicate experiment (C and G).(H) Representative confocal microscopy images of untreated and amino acid-starved (4 h) MCF7 cells stained for endogenous CIP2A and raptor. Black lines indicate that intervening lanes have been spliced out. −AA, amino acid starvation; IP, immunoprecipitation; a.u., arbitrary unit. Bar, 10 µm."}
{"words": ["Figure", "6", ".", "(", "A", ")", "Representative", "immunoblots", "of", "the", "indicated", "proteins", "from", "whole", "-", "cell", "lysates", "of", "MCF7", "cells", "subjected", "to", "100", "nM", "rapamycin", "or", "amino", "acid", "starvation", "for", "0", "-", "24", "h", ".", "(", "B", ")", "qPCR", "analysis", "of", "CIP2A", "and", "MYC", "mRNA", "levels", "in", "MCF7", "cells", "treated", "as", "in", "A", ".", "AA", "-", "starv", ",", "amino", "acid", "starvation", ";", "a", ".", "u", ".", ",", "arbitrary", "unit", ".", "Error", "bars", "show", "SDs", "for", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "C", ")", "Representative", "immunoblots", "of", "the", "indicated", "proteins", "from", "whole", "-", "cell", "lysates", "of", "MCF7", "cells", "treated", "with", "ULK1", "or", "SQSTM1", "siRNAs", "for", "54", "h", "before", "the", "exposure", "to", "fresh", "medium", "(", "0", ")", "or", "amino", "acid", "starvation", "(", "−", "AA", ")", "for", "12", "h", ".", "Ctr", ",", "control", ".", "(", "D", ")", "Representative", "immunoblots", "of", "the", "indicated", "proteins", "from", "whole", "-", "cell", "lysates", "of", "MCF7", "cells", "treated", "for", "0", "-", "5", "h", "with", "the", "indicated", "combinations", "of", "100", "µM", "cycloheximide", "(", "CHX", ")", ",", "100", "nM", "rapamycin", ",", "and", "2", "nM", "ConA", ".", "(", "E", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "MCF7", "(", "left", "and", "middle", ")", "and", "MCF7", "-", "LC3", "-", "EGFP", "(", "right", ")", "cells", "left", "untreated", "or", "treated", "with", "100", "nM", "rapamycin", "for", "4", "h", "or", "100", "nM", "rapamycin", "and", "2", "nM", "ConA", "for", "8", "h", ",", "fixed", ",", "and", "stained", "with", "antibodies", "against", "CIP2A", ".", "Nuclei", "in", "MCF", "-", "LC3", "-", "EGFP", "cells", "were", "visualized", "with", "Hoechst", ".", "Green", "arrowheads", "indicate", "cells", "with", "many", "LC3", "-", "positive", "puncta", "and", "low", "CIP2A", "levels", ",", "and", "yellow", "arrowheads", "show", "cells", "in", "which", "LC3", "and", "CIP2A", "colocalize", ".", "Bars", ",", "10", "µm", ".", "(", "F", ")", "Representative", "immunoblots", "of", "an", "endogenous", "CIP2A", "protein", "complex", "immunoprecipitated", "from", "lysates", "of", "MCF7", "cells", "left", "untreated", "or", "treated", "for", "4", "h", "with", "100", "nM", "rapamycin", "(", "Rapa", ")", "and", "2", "nM", "ConA", "as", "indicated", ".", "Mouse", "IgG", "served", "as", "a", "negative", "control", ".", "(", "G", ")", "MCF7", "cells", "were", "treated", "with", "100", "nM", "rapamycin", ",", "2", "nM", "ConA", ",", "and", "2", "µM", "MG132", "for", "24", "h", "as", "indicated", ".", "Endogenous", "CIP2A", "was", "immunoprecipitated", "(", "IP", ")", "in", "stringent", "conditions", "(", "no", "coimmunoprecipitation", "of", "p62", ")", "and", "analyzed", "by", "immunoblotting", "using", "antibodies", "against", "CIP2A", ",", "monoubiquitin", ",", "and", "polyubiquitin", ".", "Short", "(", "<", "100", "kD", ")", ",", "medium", "(", ">", "150", "kD", ")", ",", "and", "long", "(", "100", "-", "130", "kD", ")", "exposures", "are", "shown", ".", "(", "H", ")", "Proteins", "from", "MCF7", "cell", "lysates", "were", "immunoprecipitated", "with", "the", "indicated", "antibodies", "in", "stringent", "conditions", "(", "see", "G", ")", "and", "analyzed", "by", "immunoblotting", "for", "CIP2A", "and", "monoubiquitin", ".", "(", "I", ")", "Lysates", "from", "MCF7", "cells", "transfected", "with", "the", "indicated", "ubiquitin", "-", "HA", "constructs", "were", "subjected", "to", "anti", "-", "CIP2A", "immunopurification", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "antibodies", "against", "CIP2A", "and", "HA", ".", "(", "J", ")", "Lysates", "from", "MCF7", "cells", "transfected", "with", "the", "CIP2A", "-", "FLAG", "construct", "(", "Junttila", "et", "al", ".", ",", "2007", ")", "and", "the", "indicated", "ubiquitin", "-", "HA", "constructs", "were", "subjected", "to", "anti", "-", "FLAG", "immunopurification", "in", "denaturing", "conditions", "with", "0", ".", "1", "%", "SDS", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Black", "lines", "indicate", "that", "intervening", "lanes", "have", "been", "spliced", "out", ".", "Ub", ",", "ubiquitin", ";", "WT", ",", "wild", "type", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6.(A) Representative immunoblots of the indicated proteins from whole-cell lysates of MCF7 cells subjected to 100 nM rapamycin or amino acid starvation for 0-24 h.(B) qPCR analysis of CIP2A and MYC mRNA levels in MCF7 cells treated as in A. AA-starv, amino acid starvation; a.u., arbitrary unit. Error bars show SDs for three independent experiments.(C) Representative immunoblots of the indicated proteins from whole-cell lysates of MCF7 cells treated with ULK1 or SQSTM1 siRNAs for 54 h before the exposure to fresh medium (0) or amino acid starvation (−AA) for 12 h. Ctr, control.(D) Representative immunoblots of the indicated proteins from whole-cell lysates of MCF7 cells treated for 0-5 h with the indicated combinations of 100 µM cycloheximide (CHX), 100 nM rapamycin, and 2 nM ConA.(E) Representative confocal images of MCF7 (left and middle) and MCF7-LC3-EGFP (right) cells left untreated or treated with 100 nM rapamycin for 4 h or 100 nM rapamycin and 2 nM ConA for 8 h, fixed, and stained with antibodies against CIP2A. Nuclei in MCF-LC3-EGFP cells were visualized with Hoechst. Green arrowheads indicate cells with many LC3-positive puncta and low CIP2A levels, and yellow arrowheads show cells in which LC3 and CIP2A colocalize. Bars, 10 µm.(F) Representative immunoblots of an endogenous CIP2A protein complex immunoprecipitated from lysates of MCF7 cells left untreated or treated for 4 h with 100 nM rapamycin (Rapa) and 2 nM ConA as indicated. Mouse IgG served as a negative control.(G) MCF7 cells were treated with 100 nM rapamycin, 2 nM ConA, and 2 µM MG132 for 24 h as indicated. Endogenous CIP2A was immunoprecipitated (IP) in stringent conditions (no coimmunoprecipitation of p62) and analyzed by immunoblotting using antibodies against CIP2A, monoubiquitin, and polyubiquitin. Short (<100 kD), medium (>150 kD), and long (100-130 kD) exposures are shown.(H) Proteins from MCF7 cell lysates were immunoprecipitated with the indicated antibodies in stringent conditions (see G) and analyzed by immunoblotting for CIP2A and monoubiquitin.(I) Lysates from MCF7 cells transfected with the indicated ubiquitin-HA constructs were subjected to anti-CIP2A immunopurification followed by immunoblotting with antibodies against CIP2A and HA.(J) Lysates from MCF7 cells transfected with the CIP2A-FLAG construct (Junttila et al., 2007) and the indicated ubiquitin-HA constructs were subjected to anti-FLAG immunopurification in denaturing conditions with 0.1% SDS followed by immunoblotting with the indicated antibodies. Black lines indicate that intervening lanes have been spliced out. Ub, ubiquitin; WT, wild type."}
{"words": ["Figure", "2D", "Bax", "/", "BAK1", "protein", "levels", "were", "detected", "by", "western", "blotting", ".", "G", ",", "Results", "of", "immunoblotting", "with", "immunoprecipitates", "(", "IP", ")", "or", "whole", "-", "cell", "lysates", "from", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "different", "constructs", "as", "indicated", ".", "H", "Results", "of", "immunoblotting", "with", "immunoprecipitates", "(", "IP", ")", "or", "whole", "-", "cell", "lysates", "from", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "different", "constructs", "as", "indicated", ".", "I", "Immublotting", "results", "with", "IP", "or", "input", "(", "whole", "-", "cell", "lysates", ")", "from", "mouse", "midbrain", ",", "SH", "-", "SY5Y", ",", "HEK293T", "or", "HeLa", "cells", "as", "indicated", ".", "The", "α", "-", "ctrl", "represents", "that", "the", "magnetic", "beads", "used", "in", "IP", "were", "not", "pre", "-", "incubated", "with", "any", "antibody", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2D Bax/BAK1 protein levels were detected by western blotting.G, Results of immunoblotting with immunoprecipitates (IP) or whole-cell lysates from HEK293T cells transfected with different constructs as indicated.H Results of immunoblotting with immunoprecipitates (IP) or whole-cell lysates from HEK293T cells transfected with different constructs as indicated.I Immublotting results with IP or input (whole-cell lysates) from mouse midbrain, SH-SY5Y, HEK293T or HeLa cells as indicated. The α-ctrl represents that the magnetic beads used in IP were not pre-incubated with any antibody."}
{"words": ["Figure", "3B", "Results", "of", "immunoblotting", "with", "immunoprecipitates", "(", "IP", ")", "or", "whole", "-", "cell", "lysates", "from", "cells", "transfected", "with", "Bcl", "-", "2", "and", "TMEM175", "or", "its", "mutants", "TMEM175", "-", "V145A", ",", "TMEM175", "-", "R377V", ",", "as", "indicated", ".", "C", "Statistics", "of", "the", "relative", "TMEM175", "protein", "levels", "normalized", "to", "GAPDH", "in", "vector", ",", "TMEM175", ",", "TMEM175", "-", "V145A", "or", "TMEM175", "-", "R377V", "overexpressing", "HEK293T", "cells", ".", "Data", "information", ":", "The", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "Statistical", "significance", "was", "calculated", "with", "two", "-", "sided", "student", "'", "s", "t", "-", "tests", "(", "C", "and", "is", "indicated", "with", "NS", "for", "not", "significant", "(", "P", ">", "0", ".", "05", ")", ",", "*", "*", "for", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "and", "*", "*", "*", "for", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "n", "value", "means", "the", "number", "of", "biological", "replicates", "made", "for", "each", "data", "point", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B Results of immunoblotting with immunoprecipitates (IP) or whole-cell lysates from cells transfected with Bcl-2 and TMEM175 or its mutants TMEM175-V145A, TMEM175-R377V, as indicated. C Statistics of the relative TMEM175 protein levels normalized to GAPDH in vector, TMEM175, TMEM175-V145A or TMEM175-R377V overexpressing HEK293T cells. Data information: The data are presented as the mean ± SEM. Statistical significance was calculated with two-sided student's t-tests (C and is indicated with NS for not significant (P > 0.05), ** for p < 0.01, and *** for p < 0.001. n value means the number of biological replicates made for each data point."}
{"words": ["Figure", "4K", "(", "Upper", ")", "schematic", "diagram", "showing", "the", "strategy", "of", "TMEM175", "-", "KO", "in", "HEK293T", "cells", ".", "92", "bp", "in", "exon", "4", "and", "intron", "4", "were", "removed", "from", "the", "tmem175", "locus", ".", "(", "Lower", ")", "TMEM175", "levels", "in", "the", "WT", "or", "TMEM175", "KO", "cells", "were", "detected", "by", "Western", "-", "blotting", ".", "L", "CM", "-", "H2DCFDA", "(", "green", ")", "indicating", "cellular", "ROS", "levels", "of", "WT", "or", "TMEM175", "KO", "HEK293T", "cells", "pre", "-", "treatment", "with", "vehicle", "or", "10", "μM", "HA14", "-", "1", "for", "20", "min", ".", "Scale", "bars", "=", "10", "μm", ".", "M", "Statistics", "of", "CM", "-", "H2DCFDA", "fluorescence", "intensity", "of", "(", "L", ")", ".", "The", "n", "values", "represent", "the", "cell", "numbers", "counted", "within", "the", "same", "experiment", ".", "Data", "information", ":", "The", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "Statistical", "significance", "was", "calculated", "with", "two", "-", "sided", "student", "'", "s", "t", "-", "tests", "M", ")", "and", "is", "indicated", "with", "NS", "for", "not", "significant", "(", "P", ">", "0", ".", "05", ")", ",", "*", "for", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "for", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "and", "*", "*", "*", "for", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "In", "panel", "M", ",", "n", "value", "means", "the", "number", "of", "technical", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4K (Upper) schematic diagram showing the strategy of TMEM175-KO in HEK293T cells. 92 bp in exon 4 and intron 4 were removed from the tmem175 locus. (Lower) TMEM175 levels in the WT or TMEM175 KO cells were detected by Western-blotting.L CM-H2DCFDA (green) indicating cellular ROS levels of WT or TMEM175 KO HEK293T cells pre-treatment with vehicle or 10 μM HA14-1 for 20 min. Scale bars = 10 μm. M Statistics of CM-H2DCFDA fluorescence intensity of (L). The n values represent the cell numbers counted within the same experiment. Data information: The data are presented as the mean ± SEM. Statistical significance was calculated with two-sided student's t-tests M) and is indicated with NS for not significant (P > 0.05), * for p < 0.05, ** for p < 0.01, and *** for p < 0.001. In panel M, n value means the number of technical replicates."}
{"words": ["Figure", "5F", "Fluorescence", "of", "G3BP1", "excited", "with", "488", "nm", "in", "control", "(", "upper", ")", "and", "TMEM175", "-", "overexpressing", "(", "lower", ")", "cells", ".", "Scale", "bars", "=", "10", "μm", ".", "G", "Statistics", "of", "the", "numbers", "of", "puncta", "per", "cell", "(", "left", ")", "and", "the", "percentage", "of", "cells", "with", "puncta", "in", "(", "F", ")", ".", "We", "counted", "547", "cells", "in", "Vector", "group", "from", "37", "different", "fields", "of", "view", "and", "332", "cells", "in", "TMEM175", "group", "from", "76", "different", "fields", "of", "view", ".", "n", "value", "represents", "the", "number", "of", "different", "fields", "of", "view", "randomly", "selected", "in", "the", "same", "imaging", "experiment", ".", "Data", "information", ":", "The", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "Statistical", "significance", "was", "calculated", "with", "two", "-", "sided", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "and", "is", "indicated", "with", "*", "*", "for", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "and", "*", "*", "*", "for", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "In", "panels", "G", "n", "value", "means", "the", "number", "of", "technical", "replicates", ".", "H", "Co", "-", "localization", "of", "mitochondrial", "indicator", "TOM20", "-", "mCherry", "and", "lysosomal", "indicator", "LysoTracker", "in", "WT", "(", "upper", "row", ")", "or", "TMEM175", "KO", "(", "lower", "row", ")", "HEK293T", "cells", ".", "Co", "-", "localization", "of", "mitochondrion", "and", "lysosome", "is", "observed", "as", "a", "yellow", "colour", "in", "the", "merged", "image", "(", "marked", "by", "white", "arrows", ")", ".", "Scale", "bars", "=", "10", "μm", ".", "I", "The", "number", "of", "merged", "puncta", "per", "cell", "in", "(", "H", ")", ".", "We", "counted", "139", "cells", "in", "WT", "group", "from", "38", "different", "fields", "of", "view", "and", "148", "cells", "in", "TMEM175", "KO", "group", "from", "42", "different", "fields", "of", "view", ".", "n", "value", "represents", "the", "number", "of", "different", "fields", "of", "view", "randomly", "selected", "in", "the", "same", "imaging", "experiment", ".", "Data", "information", ":", "The", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "Statistical", "significance", "was", "calculated", "with", "two", "-", "sided", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "and", "is", "indicated", "with", "*", "*", "for", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "and", "*", "*", "*", "for", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "In", "panels", "I", ",", "n", "value", "means", "the", "number", "of", "technical", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5F Fluorescence of G3BP1 excited with 488 nm in control (upper) and TMEM175-overexpressing (lower) cells. Scale bars = 10 μm. G Statistics of the numbers of puncta per cell (left) and the percentage of cells with puncta in (F). We counted 547 cells in Vector group from 37 different fields of view and 332 cells in TMEM175 group from 76 different fields of view. n value represents the number of different fields of view randomly selected in the same imaging experiment. Data information: The data are presented as the mean ± SEM. Statistical significance was calculated with two-sided student's t-test, and is indicated with ** for p < 0.01, and *** for p < 0.001. In panels G n value means the number of technical replicates.H Co-localization of mitochondrial indicator TOM20-mCherry and lysosomal indicator LysoTracker in WT (upper row) or TMEM175 KO (lower row) HEK293T cells. Co-localization of mitochondrion and lysosome is observed as a yellow colour in the merged image (marked by white arrows). Scale bars = 10 μm. I The number of merged puncta per cell in (H). We counted 139 cells in WT group from 38 different fields of view and 148 cells in TMEM175 KO group from 42 different fields of view. n value represents the number of different fields of view randomly selected in the same imaging experiment. Data information: The data are presented as the mean ± SEM. Statistical significance was calculated with two-sided student's t-test, and is indicated with ** for p < 0.01, and *** for p < 0.001. In panels I, n value means the number of technical replicates."}
{"words": ["Figure", "7A", "Representative", "immunoblots", "for", "TMEM175", "expression", "levels", "in", "the", "midbrains", "of", "mice", "of", "different", "ages", "(", "W", ":", "weeks", ";", "M", ":", "months", ")", ".", "B", "Statistics", "of", "the", "relative", "TMEM175", "protein", "levels", "normalized", "to", "GAPDH", "in", "(", "A", ")", ".", "Data", "information", ":", "The", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "Statistical", "significance", "was", "analyzed", "with", "two", "-", "sided", "student", "'", "s", "t", "-", "tests", ",", "and", "is", "indicated", "with", "NS", "for", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ",", "*", "for", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "for", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "and", "*", "*", "*", "for", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "n", "value", "means", "the", "number", "of", "biological", "replicates", "made", "for", "each", "data", "point", ".", "D", "TMEM175", "mRNA", "levels", "in", "the", "midbrains", "of", "WT", "or", "TMEM175", "KO", "mice", "were", "detected", "by", "RT", "-", "qPCR", "using", "SYBR", "Green", "PCR", "Master", "Mix", ".", "Data", "information", ":", "The", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "Statistical", "significance", "was", "analyzed", "with", "two", "-", "sided", "student", "'", "s", "t", "-", "tests", ",", "and", "is", "indicated", "with", "NS", "for", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ",", "*", "for", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "for", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "and", "*", "*", "*", "for", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "n", "value", "means", "the", "number", "of", "biological", "replicates", "made", "for", "each", "data", "point", ".", "E", "The", "knockout", "of", "TMEM175", "in", "mouse", "was", "verified", "by", "Western", "blot", "of", "brain", "tissues", ".", "F", "Representative", "TMEM175", "basal", "lysosomal", "currents", "recorded", "in", "macrophages", "of", "WT", "or", "TMEM175", "-", "KO", "mice", ".", "Ψ", "is", "lysosomal", "membrane", "potential", "(", "defined", "as", "Vcytosol", "-", "Vlumen", ")", ".", "The", "currents", "were", "elicited", "with", "ramp", "voltage", "protocols", "(", "-", "100", "to", "+", "100", "mV", "in", "1", "s", ",", "Vh", "=", "0", "mV", ")", ".", "G", "Statistics", "of", "the", "current", "amplitudes", "of", "(", "F", ")", ".", "Data", "information", ":", "The", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "Statistical", "significance", "was", "analyzed", "with", "two", "-", "sided", "student", "'", "s", "t", "-", "tests", ",", "and", "is", "indicated", "with", "NS", "for", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ",", "*", "for", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "for", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "and", "*", "*", "*", "for", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "n", "value", "means", "the", "number", "of", "biological", "replicates", "made", "for", "each", "data", "point", ".", "H", ",", "Quantification", "of", "rears", "in", "the", "cylinder", "(", "H", ")", "pre", "-", "and", "post", "-", "MPTP", "treatment", ".", "Data", "information", ":", "The", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "Statistical", "significance", "was", "analyzed", "with", "two", "-", "sided", "student", "'", "s", "t", "-", "tests", ",", "and", "is", "indicated", "with", "NS", "for", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ",", "*", "for", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "for", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "and", "*", "*", "*", "for", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "n", "value", "means", "the", "number", "of", "biological", "replicates", "made", "for", "each", "data", "point", ".", "I", "Quantification", "of", "the", "latency", "to", "fall", "from", "a", "wire", "hang", "apparatus", "(", "I", ")", "pre", "-", "and", "post", "-", "MPTP", "treatment", ".", "Data", "information", ":", "The", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "Statistical", "significance", "was", "analyzed", "with", "two", "-", "sided", "student", "'", "s", "t", "-", "tests", ",", "and", "is", "indicated", "with", "NS", "for", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ",", "*", "for", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "for", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "and", "*", "*", "*", "for", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "n", "value", "means", "the", "number", "of", "biological", "replicates", "made", "for", "each", "data", "point", ".", "J", "Swing", "Duration", "CV", "(", "CV", "%", ")", "(", "Left", "panel", ")", "and", "Ataxia", "Coefficient", "in", "Gait", "tests", "7", "days", "post", "-", "MPTP", ".", "Data", "information", ":", "The", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "Statistical", "significance", "was", "analyzed", "with", "two", "-", "sided", "student", "'", "s", "t", "-", "tests", ",", "and", "is", "indicated", "with", "NS", "for", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ",", "*", "for", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "for", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "and", "*", "*", "*", "for", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "n", "value", "means", "the", "number", "of", "biological", "replicates", "made", "for", "each", "data", "point", ".", "K", "Latency", "to", "fall", "in", "rotarod", "tests", "7", "days", "post", "-", "MPTP", ".", "Data", "information", ":", "The", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "Statistical", "significance", "was", "analyzed", "with", "two", "-", "sided", "student", "'", "s", "t", "-", "tests", ",", "and", "is", "indicated", "with", "NS", "for", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ",", "*", "for", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "for", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "and", "*", "*", "*", "for", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "n", "value", "means", "the", "number", "of", "biological", "replicates", "made", "for", "each", "data", "point", ".", "L", "Immunoblots", "of", "the", "TH", "levels", "post", "-", "MPTP", "treatment", "in", "WT", "and", "TMEM175", "KO", "mouse", "midbrains", ".", "M", "Quantification", "of", "the", "relative", "TH", "levels", "normalized", "to", "GAPDH", "post", "-", "MPTP", ".", "Data", "information", ":", "The", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "Statistical", "significance", "was", "analyzed", "with", "two", "-", "sided", "student", "'", "s", "t", "-", "tests", ",", "and", "is", "indicated", "with", "NS", "for", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ",", "*", "for", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "for", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "and", "*", "*", "*", "for", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "n", "value", "means", "the", "number", "of", "biological", "replicates", "made", "for", "each", "data", "point", ".", "N", "TH", "immunofluorescent", "labeling", "on", "substantia", "nigra", "slices", "of", "WT", "or", "TMEM175", "-", "KO", "mice", "post", "-", "MPTP", "treatment", ".", "Scale", "bars", "=", "100", "μm", ".", "O", "Statistics", "of", "the", "TH", "-", "positive", "neurons", "in", "(", "N", ")", ".", "Data", "information", ":", "The", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "Statistical", "significance", "was", "analyzed", "with", "two", "-", "sided", "student", "'", "s", "t", "-", "tests", ",", "and", "is", "indicated", "with", "NS", "for", "not", "significant", "(", "p", ">", "0", ".", "05", ")", ",", "*", "for", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "for", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "and", "*", "*", "*", "for", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "n", "value", "means", "the", "number", "of", "biological", "replicates", "made", "for", "each", "data", "point", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A Representative immunoblots for TMEM175 expression levels in the midbrains of mice of different ages (W: weeks; M: months). B Statistics of the relative TMEM175 protein levels normalized to GAPDH in (A). Data information: The data are presented as the mean ± SEM. Statistical significance was analyzed with two-sided student's t-tests, and is indicated with NS for not significant (p > 0.05), * for p < 0.05, ** for p < 0.01, and *** for p < 0.001. n value means the number of biological replicates made for each data point.D TMEM175 mRNA levels in the midbrains of WT or TMEM175 KO mice were detected by RT-qPCR using SYBR Green PCR Master Mix. Data information: The data are presented as the mean ± SEM. Statistical significance was analyzed with two-sided student's t-tests, and is indicated with NS for not significant (p > 0.05), * for p < 0.05, ** for p < 0.01, and *** for p < 0.001. n value means the number of biological replicates made for each data point.E The knockout of TMEM175 in mouse was verified by Western blot of brain tissues.F Representative TMEM175 basal lysosomal currents recorded in macrophages of WT or TMEM175-KO mice. Ψ is lysosomal membrane potential (defined as Vcytosol - Vlumen). The currents were elicited with ramp voltage protocols (-100 to +100 mV in 1 s, Vh = 0 mV). G Statistics of the current amplitudes of (F). Data information: The data are presented as the mean ± SEM. Statistical significance was analyzed with two-sided student's t-tests, and is indicated with NS for not significant (p > 0.05), * for p < 0.05, ** for p < 0.01, and *** for p < 0.001. n value means the number of biological replicates made for each data point.H, Quantification of rears in the cylinder (H) pre- and post-MPTP treatment. Data information: The data are presented as the mean ± SEM. Statistical significance was analyzed with two-sided student's t-tests, and is indicated with NS for not significant (p > 0.05), * for p < 0.05, ** for p < 0.01, and *** for p < 0.001. n value means the number of biological replicates made for each data point.I Quantification of the latency to fall from a wire hang apparatus (I) pre- and post-MPTP treatment. Data information: The data are presented as the mean ± SEM. Statistical significance was analyzed with two-sided student's t-tests, and is indicated with NS for not significant (p > 0.05), * for p < 0.05, ** for p < 0.01, and *** for p < 0.001. n value means the number of biological replicates made for each data point.J Swing Duration CV (CV%) (Left panel) and Ataxia Coefficient in Gait tests 7 days post-MPTP. Data information: The data are presented as the mean ± SEM. Statistical significance was analyzed with two-sided student's t-tests, and is indicated with NS for not significant (p > 0.05), * for p < 0.05, ** for p < 0.01, and *** for p < 0.001. n value means the number of biological replicates made for each data point.K Latency to fall in rotarod tests 7 days post-MPTP. Data information: The data are presented as the mean ± SEM. Statistical significance was analyzed with two-sided student's t-tests, and is indicated with NS for not significant (p > 0.05), * for p < 0.05, ** for p < 0.01, and *** for p < 0.001. n value means the number of biological replicates made for each data point.L Immunoblots of the TH levels post-MPTP treatment in WT and TMEM175 KO mouse midbrains. M Quantification of the relative TH levels normalized to GAPDH post-MPTP. Data information: The data are presented as the mean ± SEM. Statistical significance was analyzed with two-sided student's t-tests, and is indicated with NS for not significant (p > 0.05), * for p < 0.05, ** for p < 0.01, and *** for p < 0.001. n value means the number of biological replicates made for each data point.N TH immunofluorescent labeling on substantia nigra slices of WT or TMEM175-KO mice post-MPTP treatment. Scale bars = 100 μm. O Statistics of the TH-positive neurons in (N). Data information: The data are presented as the mean ± SEM. Statistical significance was analyzed with two-sided student's t-tests, and is indicated with NS for not significant (p > 0.05), * for p < 0.05, ** for p < 0.01, and *** for p < 0.001. n value means the number of biological replicates made for each data point."}
{"words": ["Figure", "1", ".", "factor", ".", "a", ",", "Duplicate", "screens", "depicting", "HCoV", "-", "229E", "infection", "(", "24", "hours", "post", "-", "infection", ")", "in", "Huh7", "cells", "ectopically", "expressing", "ISGs", ".", "b", ",", "HCoV", "-", "229E", "infection", "of", "Huh7", "cells", "expressing", "LY6E", "or", "control", "vector", "(", "Empty", ")", ".", "Blue", ":", "DAPI", ",", "green", ":", "HCoV", "-", "229E", "N", "protein", ",", "red", ":", "TagRFP", "encoded", "in", "SCRPSY", "vector", ".", "c", "-", "h", ",", "Effect", "of", "LY6E", "expression", "on", "diverse", "coronaviruses", ".", "Stably", "transduced", "cells", "were", "infected", "with", "HCoV", "-", "229E", "(", "c", ")", ",", "HCoV", "-", "OC43", "(", "d", ")", ",", "MERS", "-", "CoV", "(", "e", ")", ",", "SARS", "-", "CoV", "(", "f", ")", ",", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "(", "g", ")", ",", "MHV", "-", "Gluc", "(", "h", ")", ".", "Viral", "replication", "readouts", "included", ":", "titer", "determination", "by", "plaque", "assay", "(", "c", ")", ",", "infectivity", "by", "nucleoprotein", "staining", "and", "quantitation", "by", "flow", "cytometry", "(", "d", ")", ",", "limiting", "dilution", "assay", "(", "e", ",", "f", ",", "g", ")", ",", "luciferase", "activity", "shown", "as", "relative", "light", "units", "(", "RLU", ")", "(", "h", ",", "j", ",", "l", ")", ".", "i", ",", "Western", "blot", "of", "WT", "A549", "or", "two", "LY6E", "KO", "clones", "(", "#", "3", ",", "#", "4", ")", ".", "j", ",", "HCoV", "-", "229E", "infection", "of", "WT", "or", "LY6E", "KO", "A549", ".", "k", ",", "Western", "blot", "of", "WT", "or", "LY6E", "KO", "A549", "reconstituted", "with", "CRISPR", "-", "resistant", "LY6E", "(", "CR", "LY6E", ")", "or", "control", "vector", "(", "Empty", ")", ".", "l", ",", "HCoV", "-", "229E", "infection", "of", "CR", "LY6E", "-", "reconstituted", "WT", "or", "LY6E", "KO", "A549", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1.factor.a, Duplicate screens depicting HCoV-229E infection (24 hours post-infection) in Huh7 cells ectopically expressing ISGs.b, HCoV-229E infection of Huh7 cells expressing LY6E or control vector (Empty). Blue: DAPI, green: HCoV-229E N protein, red: TagRFP encoded in SCRPSY vector.c-h, Effect of LY6E expression on diverse coronaviruses. Stably transduced cells were infected with HCoV-229E (c), HCoV-OC43 (d), MERS-CoV (e), SARS-CoV (f), SARS-CoV-2 (g), MHV-Gluc (h). Viral replication readouts included: titer determination by plaque assay (c), infectivity by nucleoprotein staining and quantitation by flow cytometry (d), limiting dilution assay (e,f,g), luciferase activity shown as relative light units (RLU) (h,j,l).i, Western blot of WT A549 or two LY6E KO clones (#3, #4).j, HCoV-229E infection of WT or LY6E KO A549.k, Western blot of WT or LY6E KO A549 reconstituted with CRISPR-resistant LY6E (CR LY6E) or control vector (Empty).l, HCoV-229E infection of CR LY6E-reconstituted WT or LY6E KO A549."}
{"words": ["Figure", "2", ".", "formation", ".", "a", "-", "d", ",", "VSV", "pseudoparticles", "(", "PP", ")", "harboring", "spike", "proteins", "from", "HCoV", "-", "229E", "(", "a", ")", ",", "MERS", "-", "CoV", "(", "b", ")", ",", "SARS", "-", "CoV", "(", "c", ")", ",", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "(", "d", ")", "were", "inoculated", "on", "LY6E", "-", "or", "empty", "vector", "-", "expressing", "cells", ".", "Virus", "entry", "efficiency", "was", "quantified", "by", "measuring", "virus", "-", "encoded", "luciferase", "reporter", "activity", ".", "e", ",", "VSV", "pseudoparticles", "expressing", "VSV", "G", "protein", "on", "their", "surface", "and", "encoding", "CoV", "S", "protein", "and", "GFP", "(", "VSV", "*", "ΔG", "(", "CoV", "S", ")", ")", "were", "inoculated", "with", "LY6E", "-", "or", "empty", "vector", "-", "expressing", "Huh7", ".", "Syncytia", "formation", "was", "analyzed", "by", "immunofluorescence", "microscopy", ".", "Blue", ":", "DAPI", ",", "green", ":", "GFP", ",", "red", ":", "TagRFP", "inserted", "in", "SCRPSY", "vector", ".", "f", ",", "Quantification", "of", "VSV", "*", "ΔG", "(", "CoV", "S", ")", "induced", "syncytia", "depicted", "as", "percentage", "syncytia", "area", ".", "Three", "independent", "areas", "were", "analyzed", "per", "biological", "replicate", "(", "circle", ",", "square", ",", "triangle", ")", ".", "h", ",", "Cell", "-", "cell", "fusion", "was", "measured", "by", "co", "-", "incubating", "cells", "transfected", "with", "plasmids", "encoding", "CoV", "S", "proteins", "and", "a", "split", "-", "luciferase", "construct", "(", "DSP1", "-", "7", ")", "together", "with", "CoV", "permissive", "LY6E", "-", "expressing", "or", "control", "cells", "transfected", "with", "the", "second", "fragment", "of", "split", "-", "luciferase", "(", "DSP8", "-", "11", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2.formation.a-d, VSV pseudoparticles (PP) harboring spike proteins from HCoV-229E (a), MERS-CoV (b), SARS-CoV (c), SARS-CoV-2 (d) were inoculated on LY6E- or empty vector-expressing cells. Virus entry efficiency was quantified by measuring virus-encoded luciferase reporter activity.e, VSV pseudoparticles expressing VSV G protein on their surface and encoding CoV S protein and GFP (VSV*ΔG(CoV S)) were inoculated with LY6E- or empty vector-expressing Huh7. Syncytia formation was analyzed by immunofluorescence microscopy. Blue: DAPI, green: GFP, red: TagRFP inserted in SCRPSY vector.f, Quantification of VSV*ΔG(CoV S) induced syncytia depicted as percentage syncytia area. Three independent areas were analyzed per biological replicate (circle, square, triangle).h, Cell-cell fusion was measured by co-incubating cells transfected with plasmids encoding CoV S proteins and a split-luciferase construct (DSP1-7) together with CoV permissive LY6E-expressing or control cells transfected with the second fragment of split-luciferase (DSP8-11)."}
{"words": ["Figure", "3", ".", "virus", ".", "a", "-", "b", ",", "Female", "Ly6efl", "/", "fl", "and", "Ly6eΔHSC", "mice", "were", "injected", "with", "PBS", "or", "MHV", "and", "monitored", "for", "survival", "(", "a", ")", "and", "weight", "loss", "(", "b", ")", ".", "c", "-", "n", ",", "Mice", "were", "assessed", "at", "3", "(", "c", "-", "h", ")", "or", "5", "(", "i", "-", "n", ")", "days", "post", "-", "infection", "for", "serum", "ALT", "(", "c", ",", "i", ")", ",", "viral", "titers", "in", "liver", "(", "d", ",", "j", ")", "and", "spleen", "(", "e", ",", "k", ")", ",", "and", "liver", "necrosis", "and", "inflammation", "(", "f", "-", "h", ",", "l", "-", "n", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3.virus.a-b, Female Ly6efl/fl and Ly6eΔHSC mice were injected with PBS or MHV and monitored for survival (a) and weight loss (b).c-n, Mice were assessed at 3 (c-h) or 5 (i-n) days post-infection for serum ALT (c,i), viral titers in liver (d,j) and spleen (e,k), and liver necrosis and inflammation (f-h, l-n)."}
{"words": ["Figure", "4", ".", "mice", ".", "a", "-", "e", ",", "Transcriptomic", "analysis", "from", "Ly6efl", "/", "fl", "(", "WT", ")", "and", "Ly6eΔHSC", "(", "KO", ")", "mice", ".", "a", "-", "b", ",", "Heat", "maps", "displaying", "significant", "changes", "(", "mean", "RPKM", ">", "0", ".", "5", ";", "fold", "change", ">", "2", ";", "FDR", "≤", "0", ".", "05", ")", "in", "liver", "(", "a", ")", "and", "spleen", "(", "b", ")", ".", "Dendrograms", "are", "normalized", "read", "data", "(", "row", "z", "-", "score", ")", "clustered", "with", "complete", "linkage", "method", "employing", "Spearman", "Rank", "correlation", "distance", "measurement", ".", "d", "-", "e", ",", "Expression", "of", "select", "genes", "in", "liver", "(", "d", ")", "and", "spleen", "(", "e", ")", ".", "f", "-", "g", ",", "Immune", "cell", "counts", "from", "liver", "(", "f", ")", "and", "spleen", "(", "g", ")", ".", "h", ",", "Infection", "of", "cultured", "splenocytes", ".", "For", "a", "-", "e", ",", "n", "=", "3", ".", "For", "f", "-", "g", ",", "n", "=", "8", "MHV", "-", "injected", ",", "n", "=", "4", "PBS", "-", "injected", "from", "two", "pooled", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4.mice.a-e, Transcriptomic analysis from Ly6efl/fl (WT) and Ly6eΔHSC (KO) mice. a-b, Heat maps displaying significant changes (mean RPKM > 0.5; fold change > 2; FDR ≤ 0.05) in liver (a) and spleen (b). Dendrograms are normalized read data (row z-score) clustered with complete linkage method employing Spearman Rank correlation distance measurement.d-e, Expression of select genes in liver (d) and spleen (e).f-g, Immune cell counts from liver (f) and spleen (g).h, Infection of cultured splenocytes. For a-e, n=3. For f-g, n=8 MHV-injected, n=4 PBS-injected from two pooled experiments."}
{"words": ["Figure", "1Schematic", "representation", "of", "the", "upstream", "region", "of", "myogenin", "and", "amplified", "regions", "by", "RT", "-", "PCR", "(", "top", ")", ".", "RT", "-", "PCR", "for", "the", "novel", "transcripts", "at", "the", "upstream", "region", "of", "myogenin", "in", "C2C12", "myotubes", "(", "bottom", ")", ".", "The", "presence", "or", "absence", "of", "reverse", "transcriptase", "(", "RT", ")", "is", "shown", "by", "(", "+", ")", "or", "(", "-", ")", ",", "respectively", ".", "The", "templates", "(", "cDNA", "or", "genomic", "DNA", ")", "are", "indicated", "by", "C", "or", "G", ",", "respectively", ".", "The", "primers", "used", "for", "RT", "-", "PCR", "(", "top", ")", ".", "Strand", "-", "specific", "RT", "-", "PCR", "for", "the", "novel", "transcripts", "at", "the", "upstream", "region", "of", "myogenin", "in", "C2C12", "myotubes", "using", "total", "RNA", "(", "middle", "and", "bottom", ")", "and", "poly", "(", "A", ")", "+", "RNA", "(", "bottom", ")", ".", "Relative", "expression", "of", "indicated", "RNAs", "in", "differentiating", "C2C12", "cells", ".", "The", "presence", "or", "absence", "of", "RT", "is", "shown", "by", "(", "+", ")", "or", "(", "-", ")", ",", "respectively", ".", "PCR", "products", "were", "verified", "by", "sequencing", ".", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "SD", ".", "The", "nuclear", "/", "cytoplasmic", "fractionation", "is", "confirmed", "by", "the", "expression", "of", "H2B", "and", "tubulin", ",", "respectively", ".", "Chromatin", "pellet", "extract", "(", "CPE", ")", "/", "soluble", "nuclear", "extract", "(", "SNE", ")", "ratio", "of", "SRA1", ",", "Malat1", ",", "and", "Myoparr", "in", "C2C12", "myotubes", "on", "a", "log", "scale", ".", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "SD", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Schematic representation of the upstream region of myogenin and amplified regions by RT-PCR (top). RT-PCR for the novel transcripts at the upstream region of myogenin in C2C12 myotubes (bottom). The presence or absence of reverse transcriptase (RT) is shown by (+) or (-), respectively. The templates (cDNA or genomic DNA) are indicated by C or G, respectively.The primers used for RT-PCR (top). Strand-specific RT-PCR for the novel transcripts at the upstream region of myogenin in C2C12 myotubes using total RNA (middle and bottom) and poly(A)+ RNA (bottom).Relative expression of indicated RNAs in differentiating C2C12 cells. The presence or absence of RT is shown by (+) or (-), respectively. PCR products were verified by sequencing. n = 3, mean ± SD. The nuclear/cytoplasmic fractionation is confirmed by the expression of H2B and tubulin, respectively.Chromatin pellet extract (CPE)/soluble nuclear extract (SNE) ratio of SRA1, Malat1, and Myoparr in C2C12 myotubes on a log scale. n = 3, mean ± SD."}
{"words": ["Figure", "2Quantitative", "RT", "-", "PCR", "for", "myogenin", "(", "A", ")", "and", "Myoparr", "(", "B", ")", "during", "myogenesis", "of", "C2C12", "cells", ",", "primary", "mouse", "myoblasts", "(", "growth", "medium", ",", "GM", ")", ",", "and", "mouse", "embryonic", "skeletal", "muscle", "(", "S", ".", "K", ".", ")", ".", "The", "x", "-", "axis", "shows", "days", "after", "differentiation", "induction", "or", "embryonic", "days", ".", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "SD", ".", "qRT", "-", "PCR", "showing", "increased", "Myoparr", "expression", "by", "MyoD", "in", "C3H10T1", "/", "2", "fibroblasts", ".", "n", "=", "4", ",", "mean", "±", "SD", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Welch", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Treatment", "of", "recombinant", "TGF", "-", "β", "for", "24", "h", "decreased", "Myoparr", "expression", "in", "differentiating", "C2C12", "cells", ".", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "SD", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Relative", "luciferase", "activities", "of", "the", "indicated", "promoter", "in", "differentiating", "C2C12", "cells", "by", "exogenous", "MyoD", ".", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "SD", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Relative", "luciferase", "activities", "of", "the", "indicated", "promoter", "with", "/", "without", "E", "-", "box", "mutations", "in", "differentiating", "C2C12", "cells", ".", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "SD", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Relative", "luciferase", "activities", "of", "the", "indicated", "promoter", "with", "/", "without", "E", "-", "box", "mutations", "in", "differentiating", "C2C12", "cells", "by", "TGF", "-", "β", "treatment", ".", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "SD", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Quantitative RT-PCR for myogenin (A) and Myoparr (B) during myogenesis of C2C12 cells, primary mouse myoblasts (growth medium, GM), and mouse embryonic skeletal muscle (S.K.). The x-axis shows days after differentiation induction or embryonic days. n = 3, mean ± SD.qRT-PCR showing increased Myoparr expression by MyoD in C3H10T1/2 fibroblasts. n = 4, mean ± SD. **p < 0.01 (unpaired two-tailed Welch's t-test).Treatment of recombinant TGF-β for 24 h decreased Myoparr expression in differentiating C2C12 cells. n = 3, mean ± SD. *p < 0.05 (unpaired two-tailed Student's t-test).Relative luciferase activities of the indicated promoter in differentiating C2C12 cells by exogenous MyoD. n = 3, mean ± SD. **p < 0.01. (unpaired two-tailed Student's t-test).Relative luciferase activities of the indicated promoter with/without E-box mutations in differentiating C2C12 cells. n = 3, mean ± SD. **p < 0.01. (unpaired two-tailed Student's t-test).Relative luciferase activities of the indicated promoter with/without E-box mutations in differentiating C2C12 cells by TGF-β treatment. n = 3, mean ± SD. *p < 0.05. **p < 0.01. n.s., not significant (unpaired two-tailed Student's t-test)."}
{"words": ["Figure", "3C2C12", "cells", "were", "transfected", "with", "50", "nM", "of", "indicated", "siRNAs", "in", "growth", "medium", ".", "After", "additional", "24", "-", "h", "incubation", "in", "growth", "medium", ",", "cells", "were", "transferred", "to", "differentiation", "medium", ".", "The", "levels", "of", "Myoparr", "and", "myogenin", "expression", "were", "quantified", "by", "qRT", "-", "PCR", "24", "h", "after", "differentiation", "induction", ".", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "SD", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "In", "cases", "of", "unequal", "variances", ",", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Welch", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", ".", "Western", "blot", "showing", "decreased", "expression", "of", "myogenin", "in", "differentiating", "C2C12", "cells", "48", "h", "after", "Myoparr", "KD", ".", "Tubulin", "expression", "served", "as", "an", "internal", "control", ".", "The", "expression", "levels", "of", "myogenin", "and", "Myoparr", "evaluated", "by", "qRT", "-", "PCR", "in", "myogenin", "-", "depleted", "C2C12", "cells", ".", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "SD", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "ChIP", "-", "qPCR", "detection", "of", "Pol", "II", "occupancy", "and", "histone", "modification", "status", "at", "the", "myogenin", "locus", "in", "Myoparr", "-", "depleted", "differentiating", "C2C12", "cells", ".", "The", "data", "were", "normalized", "to", "input", "values", ".", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "SD", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "or", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Welch", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Retrieval", "rate", "of", "Myoparr", "using", "Myoparr", "-", "ChIRP", "probes", "from", "C2C12", "cells", "quantified", "by", "qPCR", "is", "shown", "as", "percent", "of", "input", "values", ".", "GAPDH", "was", "amplified", "as", "a", "negative", "control", ".", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "SD", ".", "ND", ",", "not", "detected", ".", "ChIRP", "-", "qPCR", "detection", "of", "the", "interaction", "between", "endogenous", "Myoparr", "and", "the", "myogenin", "promoter", ".", "The", "myogenin", "3", "´", "UTR", "and", "GAPDH", "promoter", "were", "amplified", "as", "negative", "controls", ".", "The", "data", "were", "normalized", "to", "input", "values", ".", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "SD", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Welch", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "ND", ",", "not", "detected", ".", "Immunocytochemistry", "for", "the", "detection", "of", "myogenin", "at", "24", "h", "(", "G", ")", "or", "MHC", "at", "72", "h", "(", "H", ")", "in", "Myoparr", "-", "depleted", "C2C12", "cells", "after", "differentiation", "induction", ".", "Nuclei", "were", "counterstained", "with", "DAPI", ".", "Bar", ",", "100", "μm", ".", "The", "percentage", "of", "myogenin", "-", "positive", "cells", "or", "fusion", "index", "is", "shown", "as", "percent", "of", "the", "control", ".", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "SD", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "or", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Welch", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Genes", "significantly", "differentially", "expressed", "in", "both", "Myoparr", "-", "and", "myogenin", "-", "depleted", "cells", "show", "correlated", "expression", "(", "R", "=", "0", ".", "63", ",", "log", "2", "ratio", "scale", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3C2C12 cells were transfected with 50 nM of indicated siRNAs in growth medium. After additional 24-h incubation in growth medium, cells were transferred to differentiation medium. The levels of Myoparr and myogenin expression were quantified by qRT-PCR 24 h after differentiation induction. n = 3, mean ± SD. *p < 0.05. n.s., not significant. Statistical analyses were performed using unpaired two-tailed Student's t-test. In cases of unequal variances, unpaired two-tailed Welch's t-test was used.Western blot showing decreased expression of myogenin in differentiating C2C12 cells 48 h after Myoparr KD. Tubulin expression served as an internal control.The expression levels of myogenin and Myoparr evaluated by qRT-PCR in myogenin-depleted C2C12 cells. n = 3, mean ± SD. **p < 0.01. ***p < 0.001 (unpaired two-tailed Student's t-test).ChIP-qPCR detection of Pol II occupancy and histone modification status at the myogenin locus in Myoparr-depleted differentiating C2C12 cells. The data were normalized to input values. n = 3, mean ± SD. *p < 0.05. **p < 0.01 (unpaired two-tailed Student's t-test or unpaired two-tailed Welch's t-test).Retrieval rate of Myoparr using Myoparr-ChIRP probes from C2C12 cells quantified by qPCR is shown as percent of input values. GAPDH was amplified as a negative control. n = 3, mean ± SD. ND, not detected.ChIRP-qPCR detection of the interaction between endogenous Myoparr and the myogenin promoter. The myogenin 3´UTR and GAPDH promoter were amplified as negative controls. The data were normalized to input values. n = 3, mean ± SD. *p < 0.05. ** p < 0.01 (unpaired two-tailed Welch's t-test). ND, not detected.Immunocytochemistry for the detection of myogenin at 24 h (G) or MHC at 72 h (H) in Myoparr-depleted C2C12 cells after differentiation induction. Nuclei were counterstained with DAPI. Bar, 100 μm. The percentage of myogenin-positive cells or fusion index is shown as percent of the control. n = 3, mean ± SD. **p < 0.01. ***p < 0.001 (unpaired two-tailed Student's t-test or unpaired two-tailed Welch's t-test).Genes significantly differentially expressed in both Myoparr- and myogenin-depleted cells show correlated expression (R = 0.63, log 2 ratio scale)."}
{"words": ["Figure", "4Following", "immunoprecipitation", ",", "the", "interaction", "between", "Myoparr", "and", "endogenous", "Ddx17", "was", "confirmed", "by", "immunoblotting", "using", "a", "Ddx17", "-", "specific", "antibody", ".", "Two", "different", "Ddx17", "isoforms", "(", "p72", "and", "p82", ")", "were", "observed", ".", "Determination", "of", "the", "Ddx17", "-", "binding", "region", "of", "Myoparr", "by", "RNA", "pull", "-", "down", "analyses", ".", "Schematic", "diagram", "of", "full", "-", "length", "or", "truncated", "Myoparr", "used", "for", "RNA", "pull", "-", "down", "(", "top", ")", ".", "In", "vitro", "transcribed", "/", "translated", "Ddx17", "protein", "was", "pulled", "down", "by", "indicated", "Myoparr", "and", "then", "detected", "by", "western", "blot", "using", "a", "Ddx17", "antibody", "(", "bottom", ")", ".", "Relative", "luciferase", "activities", "of", "indicated", "constructs", "in", "differentiating", "C2C12", "cells", ".", "Relative", "luciferase", "activities", "of", "indicated", "constructs", "in", "differentiating", "C2C12", "cells", "transfected", "with", "control", "or", "Myoparr", "shRNA", "(", "Myoparr", "KD", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Following immunoprecipitation, the interaction between Myoparr and endogenous Ddx17 was confirmed by immunoblotting using a Ddx17-specific antibody. Two different Ddx17 isoforms (p72 and p82) were observed.Determination of the Ddx17-binding region of Myoparr by RNA pull-down analyses. Schematic diagram of full-length or truncated Myoparr used for RNA pull-down (top). In vitro transcribed/translated Ddx17 protein was pulled down by indicated Myoparr and then detected by western blot using a Ddx17 antibody (bottom).Relative luciferase activities of indicated constructs in differentiating C2C12 cells.Relative luciferase activities of indicated constructs in differentiating C2C12 cells transfected with control or Myoparr shRNA (Myoparr KD)."}
{"words": ["Figure", "5Significantly", "decreased", "MHC", "expression", "in", "Ddx17", "-", "depleted", "C2C12", "cells", "is", "shown", "by", "immunocytochemistry", ".", "Nuclei", "were", "counterstained", "with", "DAPI", ".", "Bar", ",", "100", "μm", ".", "Fusion", "index", "is", "shown", "as", "percent", "of", "the", "control", ".", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "SD", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Immunocytochemistry", "for", "myogenin", "in", "Ddx17", "-", "depleted", "C2C12", "cells", ".", "Bar", ",", "100", "μm", ".", "Myogenin", "-", "positive", "cells", "are", "shown", "as", "percent", "of", "the", "control", ".", "n", "=", "4", ",", "mean", "±", "SD", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Relative", "luciferase", "activities", "of", "the", "-", "1650", "-", "Luc", "by", "the", "combination", "of", "MyoD", "and", "Ddx17", "or", "Ddx17", "mutant", "(", "K142R", ")", ".", "Bars", "indicate", "the", "average", "of", "two", "independent", "experiments", ",", "and", "open", "circles", "represent", "the", "values", "of", "each", "experiment", ".", "Ddx17", "or", "Ddx17", "mutant", "(", "K142R", ")", "was", "pulled", "down", "by", "full", "-", "length", "Myoparr", "and", "then", "detected", "by", "western", "blot", ".", "Reduced", "interaction", "between", "endogenous", "Ddx17", "and", "PCAF", "in", "Myoparr", "-", "depleted", "C2C12", "cells", ".", "After", "Myoparr", "KD", ",", "the", "cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "(", "IP", ")", "with", "a", "Ddx17", "-", "specific", "antibody", "36", "h", "after", "differentiation", "induction", "(", "right", "panel", ")", ".", "Each", "lysate", "was", "loaded", "as", "an", "input", "(", "left", "panel", ")", ".", "Relative", "quantification", "of", "(", "E", ")", "is", "shown", "as", "IP", "/", "input", "ratio", ".", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "SD", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Increased", "interaction", "between", "Ddx17", "and", "PCAF", "by", "Myoparr", ".", "PCAF", "protein", "was", "pulled", "down", "by", "3", "×", "Flag", "-", "Ddx17", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "Myoparr", "using", "a", "Flag", "antibody", "and", "then", "detected", "by", "western", "blot", ".", "ChIP", "-", "qPCR", "detection", "of", "Ddx17", "(", "H", ")", "and", "PCAF", "(", "I", ")", "occupancies", "at", "the", "myogenin", "locus", "in", "Myoparr", "-", "depleted", "differentiating", "C2C12", "cells", ".", "The", "data", "were", "normalized", "to", "input", "values", ".", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "SD", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Significantly decreased MHC expression in Ddx17-depleted C2C12 cells is shown by immunocytochemistry. Nuclei were counterstained with DAPI. Bar, 100 μm. Fusion index is shown as percent of the control. n = 3, mean ± SD. **p < 0.01 (unpaired two-tailed Student's t-test). Immunocytochemistry for myogenin in Ddx17-depleted C2C12 cells. Bar, 100 μm. Myogenin-positive cells are shown as percent of the control. n = 4, mean ± SD. **p < 0.01 (unpaired two-tailed Student's t-test).Relative luciferase activities of the -1650-Luc by the combination of MyoD and Ddx17 or Ddx17 mutant (K142R). Bars indicate the average of two independent experiments, and open circles represent the values of each experiment.Ddx17 or Ddx17 mutant (K142R) was pulled down by full-length Myoparr and then detected by western blot.Reduced interaction between endogenous Ddx17 and PCAF in Myoparr-depleted C2C12 cells. After Myoparr KD, the cell lysates were subjected to immunoprecipitation (IP) with a Ddx17-specific antibody 36 h after differentiation induction (right panel). Each lysate was loaded as an input (left panel). Relative quantification of (E) is shown as IP/input ratio. n = 3, mean ± SD. *p < 0.05. n.s., not significant (unpaired two-tailed Student's t-test).Increased interaction between Ddx17 and PCAF by Myoparr. PCAF protein was pulled down by 3×Flag-Ddx17 in the presence or absence of Myoparr using a Flag antibody and then detected by western blot.ChIP-qPCR detection of Ddx17 (H) and PCAF (I) occupancies at the myogenin locus in Myoparr-depleted differentiating C2C12 cells. The data were normalized to input values. n = 3, mean ± SD. *p < 0.05 (unpaired two-tailed Student's t-test)."}
{"words": ["Figure", "6Heatmap", "displaying", "expression", "changes", "of", "754", "genes", "significantly", "altered", "either", "in", "Myoparr", "-", "or", "Ddx17", "-", "depleted", "cells", "(", "log", "2", "ratio", "scale", ")", ".", "Genes", "significantly", "differentially", "expressed", "in", "both", "Myoparr", "-", "and", "Ddx17", "-", "depleted", "cells", "show", "correlated", "expression", "(", "R", "=", "0", ".", "94", ",", "log", "2", "ratio", "scale", ")", ".", "Myoparr", "and", "Ddx17", "are", "required", "for", "C2C12", "cell", "cycle", "withdrawal", ".", "C2C12", "cells", "transfected", "with", "each", "siRNA", "were", "cultured", "in", "growth", "medium", "for", "24", "h", ".", "After", "differentiation", "induction", ",", "cells", "were", "maintained", "in", "differentiation", "medium", "for", "40", "h", "and", "then", "treated", "with", "EdU", "for", "6", "h", ".", "EdU", "-", "positive", "cells", "are", "shown", "as", "percent", "of", "the", "control", ".", "Nuclei", "were", "counterstained", "with", "Hoechst", "33342", ".", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "SD", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Bar", ",", "100", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Heatmap displaying expression changes of 754 genes significantly altered either in Myoparr- or Ddx17-depleted cells (log 2 ratio scale).Genes significantly differentially expressed in both Myoparr- and Ddx17-depleted cells show correlated expression (R = 0.94, log 2 ratio scale).Myoparr and Ddx17 are required for C2C12 cell cycle withdrawal. C2C12 cells transfected with each siRNA were cultured in growth medium for 24 h. After differentiation induction, cells were maintained in differentiation medium for 40 h and then treated with EdU for 6 h. EdU-positive cells are shown as percent of the control. Nuclei were counterstained with Hoechst 33342. n = 3, mean ± SD. **p < 0.01 (unpaired two-tailed Student's t-test). Bar, 100 μm."}
{"words": ["Figure", "7qRT", "-", "PCR", "for", "pri", "-", "miR", "-", "133b", ",", "pri", "-", "miR", "-", "206", ",", "and", "H19", "expression", "in", "differentiating", "C2C12", "cells", "transfected", "with", "indicated", "siRNAs", ".", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "SD", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "ChIP", "-", "qPCR", "detection", "of", "Pol", "II", "occupancy", "at", "the", "indicated", "promoters", "in", "Myoparr", "-", "depleted", "C2C12", "cells", ".", "The", "data", "were", "normalized", "to", "input", "values", ".", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "SD", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "Myoparr", "KD", "decreased", "Pol", "II", "occupancy", "at", "the", "miR", "-", "133b", "promoter", "with", "a", "marginal", "trend", "toward", "significance", "(", "p", "=", "0", ".", "052", ")", ".", "ChIP", "-", "qPCR", "detection", "of", "Ddx17", "(", "C", ")", "occupancies", "at", "the", "indicated", "promoters", "in", "Myoparr", "-", "depleted", "C2C12", "cells", ".", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "SD", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "ChIP", "-", "qPCR", "detection", "of", "PCAF", "(", "D", ")", "occupancies", "at", "the", "indicated", "promoters", "in", "Myoparr", "-", "depleted", "C2C12", "cells", ".", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "SD", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "qRT", "-", "PCR", "showing", "decreased", "expression", "of", "miR", "-", "133b", "and", "miR", "-", "206", "in", "both", "Myoparr", "-", "and", "Ddx17", "-", "depleted", "C2C12", "cells", ".", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "SD", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Western", "blots", "showing", "increased", "ERK1", "/", "2", "activity", "(", "pERK1", "/", "2", ")", "and", "Cdc6", "expression", "in", "differentiating", "C2C12", "cells", "48", "h", "after", "Myoparr", "and", "Ddx17", "KD", ".", "Tubulin", "expression", "served", "as", "an", "internal", "control", ".", "Increased", "Pola1", "expression", "detected", "by", "qRT", "-", "PCR", ".", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "SD", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7qRT-PCR for pri-miR-133b, pri-miR-206, and H19 expression in differentiating C2C12 cells transfected with indicated siRNAs. n = 3, mean ± SD. *p < 0.05. **p < 0.01.ChIP-qPCR detection of Pol II occupancy at the indicated promoters in Myoparr-depleted C2C12 cells. The data were normalized to input values. n = 3, mean ± SD. *p < 0.05. Myoparr KD decreased Pol II occupancy at the miR-133b promoter with a marginal trend toward significance (p = 0.052).ChIP-qPCR detection of Ddx17 (C) occupancies at the indicated promoters in Myoparr-depleted C2C12 cells. n = 3, mean ± SD. *p < 0.05. **p < 0.01.ChIP-qPCR detection of PCAF (D) occupancies at the indicated promoters in Myoparr-depleted C2C12 cells. n = 3, mean ± SD. *p < 0.05. **p < 0.01.qRT-PCR showing decreased expression of miR-133b and miR-206 in both Myoparr- and Ddx17-depleted C2C12 cells. n = 3, mean ± SD. *p < 0.05. **p < 0.01.Western blots showing increased ERK1/2 activity (pERK1/2) and Cdc6 expression in differentiating C2C12 cells 48 h after Myoparr and Ddx17 KD. Tubulin expression served as an internal control.Increased Pola1 expression detected by qRT-PCR. n = 3, mean ± SD. **p < 0.01."}
{"words": ["Figure", "8Seven", "days", "after", "denervation", ",", "weights", "of", "innervated", "(", "-", ")", "and", "denervated", "(", "+", ")", "tibialis", "anterior", "(", "TA", ")", "muscles", "were", "measured", ".", "n", "=", "4", ",", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Expression", "of", "myogenin", "in", "innervated", "and", "denervated", "TA", "muscles", "detected", "by", "qRT", "-", "PCR", "7", "d", "after", "denervation", ".", "n", "=", "4", ",", "mean", "±", "SD", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Welch", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "qRT", "-", "PCR", "showing", "increased", "Myoparr", "expression", "in", "denervated", "TA", "muscles", "7", "d", "after", "denervation", ".", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "SD", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Immunoblot", "showing", "decreased", "expression", "of", "myogenin", "by", "Myoparr", "depletion", "in", "denervated", "TA", "muscle", "7", "d", "after", "denervation", ".", "Expression", "of", "tubulin", "served", "as", "an", "internal", "control", ".", "Weights", "of", "innervated", "and", "denervated", "TA", "muscles", "electroporated", "either", "with", "control", "or", "Myoparr", "shRNA", ".", "Muscle", "weights", "were", "measured", "7", "d", "after", "denervation", ".", "n", "=", "5", "for", "each", "group", ",", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Representative", "immunostaining", "images", "for", "laminin", "(", "red", ")", "and", "EmGFP", "(", "green", ")", "of", "innervated", "or", "denervated", "TA", "muscles", "electroporated", "with", "control", "or", "Myoparr", "shRNA", ",", "both", "containing", "EmGFP", ".", "Bar", ",", "100", "μm", ".", "Cross", "-", "sectional", "area", "(", "CSA", ")", "of", "electroporated", "EmGFP", "-", "positive", "myofibers", "(", "250", "fibers", "per", "sample", ")", "was", "analyzed", "7", "d", "after", "denervation", ".", "n", "=", "5", "for", "each", "group", ",", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", "(", "unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8Seven days after denervation, weights of innervated (-) and denervated (+) tibialis anterior (TA) muscles were measured. n = 4, mean ± SEM. *p < 0.05 (unpaired two-tailed Student's t-test).Expression of myogenin in innervated and denervated TA muscles detected by qRT-PCR 7 d after denervation. n = 4, mean ± SD. ***p < 0.001 (unpaired two-tailed Welch's t-test). qRT-PCR showing increased Myoparr expression in denervated TA muscles 7 d after denervation. n = 3, mean ± SD. ***p < 0.001 (unpaired two-tailed Student's t-test).Immunoblot showing decreased expression of myogenin by Myoparr depletion in denervated TA muscle 7 d after denervation. Expression of tubulin served as an internal control.Weights of innervated and denervated TA muscles electroporated either with control or Myoparr shRNA. Muscle weights were measured 7 d after denervation. n = 5 for each group, mean ± SEM. ***p < 0.001. n.s., not significant (unpaired two-tailed Student's t-test).Representative immunostaining images for laminin (red) and EmGFP (green) of innervated or denervated TA muscles electroporated with control or Myoparr shRNA, both containing EmGFP. Bar, 100 μm.Cross-sectional area (CSA) of electroporated EmGFP-positive myofibers (250 fibers per sample) was analyzed 7 d after denervation. n = 5 for each group, mean ± SEM. **p < 0.01. n.s., not significant (unpaired two-tailed Student's t-test)."}
{"words": ["Figure", "1A", "Immunofluorescence", "staining", "of", "endothelium", "(", "CD31", ",", "in", "red", ")", ",", "pericytes", "(", "NG2", ",", "in", "green", ")", ",", "smooth", "muscle", "cells", "(", "α", "-", "SMA", ",", "in", "cyan", ")", ",", "and", "nuclei", "(", "DAPI", ",", "in", "blue", ")", "on", "frozen", "sections", "of", "limbmuscles", "injected", "with", "myoblast", "clones", "expressing", "different", "VEGF", "levels", "(", "V", "Low", ",", "V", "Med", ",", "and", "V", "High", ",", "respectively", ")", "and", "treated", "with", "VEGF", "-", "Trap", "or", "saline", "after", "10", "and", "17", "days", ".", "Analysis", "was", "performed", "after", "4", "days", "of", "treatment", "(", "2", "and", "3", "weeks", ",", "respectively", ")", ".", "All", "normal", "vessels", "induced", "by", "low", "and", "medium", "VEGF", "doses", "displayed", "a", "similar", "coverage", "by", "normal", "pericytes", ",", "whereas", "aberrant", "structures", "induced", "by", "high", "VEGF", "were", "covered", "with", "α", "-", "SMA", "-", "positive", "smooth", "muscle", "cells", ".", "Asterisks", "indicate", "muscle", "fibers", ",", "which", "were", "mostly", "sectioned", "in", "longitudinal", "orientation", ",", "although", "some", "cross", "sections", "are", "visible", "depending", "on", "the", "orientation", "of", "muscle", "bundles", ".", "Scale", "bar", "=", "25", "μm", ".", "B", ",", "C", "Quantification", "of", "vessel", "length", "density", "(", "VLD", ")", "on", "the", "same", "samples", "showed", "that", "stabilization", "started", "already", "by", "10", "days", "for", "vessels", "induced", "by", "low", "VEGF", ",", "but", "not", "until", "17", "days", "for", "those", "induced", "by", "medium", "VEGF", ",", "despite", "similar", "pericyte", "coverage", ",", "while", "aberrant", "structures", "induced", "by", "high", "VEGF", "always", "regressed", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "of", "individual", "images", "(", "n", ")", "acquired", "from", "three", "muscles", "/", "group", ";", "2", "weeks", "(", "B", ")", ":", "V", "Low", "saline", ",", "n", "=", "9", ";", "V", "Med", "saline", ",", "n", "=", "13", ";", "V", "High", "saline", ",", "n", "=", "8", ";", "V", "Low", "TRAP", ",", "n", "=", "28", ";", "V", "Med", "TRAP", ",", "n", "=", "22", ";", "V", "High", "TRAP", ",", "n", "=", "30", ";", "3", "weeks", "(", "C", ")", ":", "V", "Low", "saline", ",", "n", "=", "9", ";", "V", "Med", "saline", ",", "n", "=", "11", ";", "V", "High", "saline", ",", "n", "=", "19", ";", "V", "Low", "TRAP", ",", "n", "=", "43", ";", "V", "Med", "TRAP", ",", "n", "=", "14", ";", "V", "High", "TRAP", ",", "n", "=", "19", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "and", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "all", "versus", "Ctrl", ")", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "multiple", "comparisons", "test", ";", "2", "weeks", "(", "B", ")", ":", "V", "Low", "TRAP", "versus", "Ctrl", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "3", "weeks", "(", "C", ")", ":", "V", "Low", "TRAP", "versus", "Ctrl", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "V", "Med", "TRAP", "versus", "Ctrl", "P", "=", "0", ".", "0158", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A Immunofluorescence staining of endothelium (CD31, in red), pericytes (NG2, in green), smooth muscle cells (α-SMA, in cyan), and nuclei (DAPI, in blue) on frozen sections of limbmuscles injected with myoblast clones expressing different VEGF levels (V Low, V Med, and V High, respectively) and treated with VEGF-Trap or saline after 10 and 17 days. Analysis was performed after 4 days of treatment (2 and 3 weeks, respectively). All normal vessels induced by low and medium VEGF doses displayed a similar coverage by normal pericytes, whereas aberrant structures induced by high VEGF were covered with α-SMA-positive smooth muscle cells. Asterisks indicate muscle fibers, which were mostly sectioned in longitudinal orientation, although some cross sections are visible depending on the orientation of muscle bundles. Scale bar = 25 μm.B, C Quantification of vessel length density (VLD) on the same samples showed that stabilization started already by 10 days for vessels induced by low VEGF, but not until 17 days for those induced by medium VEGF, despite similar pericyte coverage, while aberrant structures induced by high VEGF always regressed. Data represent the mean ± SEM of individual images (n) acquired from three muscles/group; 2 weeks (B): V Low saline, n = 9; V Med saline, n = 13; V High saline, n = 8; V Low TRAP,n = 28; V Med TRAP,n = 22; V High TRAP,n = 30; 3 weeks (C): V Low saline, n = 9; V Med saline, n = 11; V High saline, n = 19; V Low TRAP,n = 43; V Med TRAP,n = 14; V High TRAP,n = 19; *P < 0.05 and ***P < 0.001 (all versus Ctrl) by one-way ANOVA with Bonferroni multiple comparisons test; 2 weeks (B): V Low TRAP versus Ctrl P < 0.0001; 3 weeks (C): V Low TRAP versus Ctrl P < 0.0001; V Med TRAP versus Ctrl P = 0.0158."}
{"words": ["Figure", "2Muscles", "were", "harvested", "7", "days", "after", "implantation", "of", "V", "Low", ",", "V", "Med", ",", "and", "V", "High", "clones", "or", "control", "cells", "(", "Ctrl", ")", ".", "Gene", "expression", "of", "Pdgfb", ",", "Ang1", ",", "Ang2", ",", "Tgfb1", ",", "and", "Sema3a", "was", "quantified", "by", "qRT", "-", "PCR", "and", "expressed", "as", "fold", "-", "change", "versus", "control", "muscles", ".", "Data", "represent", "individual", "values", ",", "with", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "3", "or", "4", ",", "as", "indicated", ")", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "and", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "multiple", "comparisons", "test", ",", "after", "data", "normalization", "by", "logarithmic", "transformation", ".", "TGF", "-", "β1", ":", "V", "Low", "versus", "V", "Med", "P", "=", "0", ".", "0047", ";", "V", "Low", "versus", "V", "High", "P", "=", "0", ".", "0379", ";", "Sema3A", ":", "V", "Low", "versus", "V", "High", "P", "=", "0", ".", "0042", ";", "V", "Med", "versus", "V", "High", "P", "=", "0", ".", "0179", ".", "Muscles", "were", "harvested", "7", "days", "after", "implantation", "of", "V", "Low", ",", "V", "Med", ",", "and", "V", "High", "clones", "or", "control", "cells", "(", "Ctrl", ")", ".", "Immunohistochemistry", "for", "Sema3A", "on", "frozen", "muscle", "sections", "confirmed", "a", "decreasing", "protein", "expression", "in", "the", "areas", "implanted", "with", "myoblasts", "producing", "increasing", "VEGF", "doses", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "The", "right", "panels", "represent", "higher", "-", "magnification", "views", "of", "the", "left", "panels", ",", "which", "encompass", "the", "majority", "of", "the", "implantation", "sites", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "μm", ".", "Muscles", "were", "harvested", "7", "days", "after", "implantation", "of", "V", "Low", ",", "V", "Med", ",", "and", "V", "High", "clones", "or", "control", "cells", "(", "Ctrl", ")", ".", "In", "situ", "hybridization", "for", "Sema3A", "(", "green", ")", "and", "CD31", "(", "red", ")", "mRNA", ",", "with", "nuclei", "staining", "by", "DAPI", ",", "on", "frozen", "muscle", "sections", ".", "The", "three", "lower", "panels", "represent", "a", "higher", "-", "magnification", "of", "the", "area", "in", "the", "white", "square", "in", "the", "top", "panel", ",", "as", "a", "merged", "image", "and", "as", "individual", "channels", ":", "arrows", "indicate", "cells", "expressing", "both", "transcripts", "(", "yellow", ")", ",", "only", "Sema3A", "(", "green", ")", ",", "or", "only", "CD31", "(", "red", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "30", "μm", ".", "Quantification", "of", "the", "percentage", "of", "endothelial", "cells", "(", "CD31", "+", ")", "that", "express", "Sema3A", "(", "left", "group", ")", "and", "of", "Sema3A", "-", "expressing", "cells", "that", "are", "endothelial", "(", "CD31", "+", ",", "right", "group", ")", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "of", "12", "individual", "fields", "of", "view", "from", "three", "independent", "muscles", "(", "15", "-", "94", "nuclei", "/", "image", ",", "642", "total", "nuclei", ")", ".", "No", "statistics", "was", "applied", ",", "as", "data", "represent", "complementary", "sets", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Muscles were harvested 7 days after implantation of V Low, V Med, and V High clones or control cells (Ctrl).Gene expression of Pdgfb,Ang1,Ang2,Tgfb1, and Sema3a was quantified by qRT-PCR and expressed as fold-change versus control muscles. Data represent individual values, with mean ± SEM (n = 3 or 4, as indicated); *P < 0.05 and **P < 0.01 by one-way ANOVA with Bonferroni multiple comparisons test, after data normalization by logarithmic transformation. TGF-β1: V Low versus V Med P = 0.0047; V Low versus V High P = 0.0379; Sema3A: V Low versus V High P = 0.0042; V Med versus V High P = 0.0179.Muscles were harvested 7 days after implantation of V Low, V Med, and V High clones or control cells (Ctrl). Immunohistochemistry for Sema3A on frozen muscle sections confirmed a decreasing protein expression in the areas implanted with myoblasts producing increasing VEGF doses (n = 4). The right panels represent higher-magnification views of the left panels, which encompass the majority of the implantation sites. Scale bar = 50 μm.Muscles were harvested 7 days after implantation of V Low, V Med, and V High clones or control cells (Ctrl).In situ hybridization for Sema3A (green) and CD31 (red) mRNA, with nuclei staining by DAPI, on frozen muscle sections. The three lower panels represent a higher-magnification of the area in the white square in the top panel, as a merged image and as individual channels: arrows indicate cells expressing both transcripts (yellow), only Sema3A (green), or only CD31 (red). Scale bar = 30 μm.Quantification of the percentage of endothelial cells (CD31+) that express Sema3A (left group) and of Sema3A-expressing cells that are endothelial (CD31+, right group). Data represent the mean ± SEM of 12 individual fields of view from three independent muscles (15-94 nuclei/image, 642 total nuclei). No statistics was applied, as data represent complementary sets."}
{"words": ["Figure", "3Immunofluorescence", "staining", "of", "endothelial", "cells", "(", "CD31", ",", "in", "red", ")", "and", "NEM", "(", "CD11b", ",", "in", "green", ")", "on", "cryosections", "of", "limb", "muscles", "1", "week", "after", "injection", "with", "V", "Low", ",", "V", "Med", ",", "and", "V", "High", "myoblast", "clones", ".", "Scale", "bar", "=", "100", "μm", ".", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "NEM", "/", "cm", "of", "vessel", "length", "in", "sites", "of", "new", "angiogenesis", "by", "increasing", "VEGF", "doses", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "of", "individual", "images", "(", "n", ")", "acquired", "from", "three", "muscles", "/", "group", ":", "V", "Low", ",", "n", "=", "48", ";", "V", "Med", ",", "n", "=", "39", ";", "V", "High", ",", "n", "=", "94", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "and", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "multiple", "comparisons", "test", ":", "V", "Low", "versus", "V", "Med", "P", "=", "0", ".", "0008", ";", "V", "Low", "versus", "V", "High", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "V", "Med", "versus", "V", "High", "P", "=", "0", ".", "0304", ".", "Endothelial", "cells", "(", "CD31", "+", "quadrant", ")", "and", "NEM", "(", "CD11b", "+", "quadrant", ")", "were", "sorted", "by", "FACS", "from", "muscles", "1", "week", "after", "injection", "with", "the", "same", "myoblast", "clones", ".", "Relative", "gene", "expression", "was", "quantified", "in", "the", "ex", "vivo", "FACS", "-", "purified", "endothelial", "cells", "(", "CD31", "+", ")", "and", "NEM", "(", "CD11b", "+", ")", "and", "expressed", "as", "fold", "-", "change", "versus", "the", "V", "High", "group", ".", "Data", "represent", "individual", "values", ",", "with", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "3", "-", "7", ",", "as", "indicated", ")", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "multiple", "comparisons", "test", ",", "after", "data", "normalization", "by", "logarithmic", "transformation", ";", "Sema3A", ":", "V", "Low", "versus", "V", "High", "P", "=", "0", ".", "0157", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Immunofluorescence staining of endothelial cells (CD31, in red) and NEM (CD11b, in green) on cryosections of limb muscles 1 week after injection with V Low, V Med, and V High myoblast clones. Scale bar = 100 μm.Quantification of the number of NEM/cm of vessel length in sites of new angiogenesis by increasing VEGF doses. Data represent the mean ± SEM of individual images (n) acquired from three muscles/group: V Low, n = 48; V Med, n = 39; V High, n = 94; *P < 0.05 and ***P < 0.001 by one-way ANOVA with Bonferroni multiple comparisons test: V Low versus V Med P = 0.0008; V Low versus V High P < 0.0001; V Med versus V High P = 0.0304.Endothelial cells (CD31+ quadrant) and NEM (CD11b+ quadrant) were sorted by FACS from muscles 1 week after injection with the same myoblast clones.Relative gene expression was quantified in the ex vivo FACS-purified endothelial cells (CD31+) and NEM (CD11b+) and expressed as fold-change versus the V High group. Data represent individual values, with mean ± SEM (n = 3-7, as indicated); **P < 0.01 by one-way ANOVA with Bonferroni multiple comparisons test, after data normalization by logarithmic transformation; Sema3A: V Low versus V High P = 0.0157."}
{"words": ["Figure", "4Mice", ",", "implanted", "with", "control", "cells", "(", "Ctrl", ")", "or", "myoblasts", "expressing", "low", "(", "V", "Low", ")", "or", "medium", "(", "V", "Med", ")", "VEGF", "levels", ",", "were", "treated", "with", "the", "anti", "-", "NRP1A", "antibody", "blocking", "Sema3A", "/", "NRP1", "binding", "(", "AbαNRP1A", ")", "or", "with", "control", "IgG2a", ".", "Analyses", "were", "performed", "after", "1", "week", ".", "A", ",", "B", "Quantification", "of", "recruited", "NEM", "in", "sites", "of", "new", "angiogenesis", "by", "increasing", "VEGF", "doses", ",", "expressed", "as", "number", "of", "CD11b", "+", "cells", "/", "mm2", "of", "area", "(", "A", ")", "or", "/", "cm", "of", "vessel", "length", "(", "B", ")", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "of", "individual", "images", "(", "n", ")", "acquired", "from", "three", "muscles", "/", "group", ".", "(", "A", ")", "Ctrl", "IgG2a", ",", "n", "=", "11", ";", "Ctrl", "AbαNRP1A", ",", "n", "=", "17", ";", "V", "Low", "IgG2a", ",", "n", "=", "24", ";", "V", "Low", "AbαNRP1A", ",", "n", "=", "28", ";", "V", "Med", "IgG2a", ",", "n", "=", "25", ";", "V", "Med", "AbαNRP1A", ",", "n", "=", "34", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "Kruskal", "-", "Wallis", "analysis", "with", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ":", "V", "Low", "IgG2a", "versus", "Ctrl", "IgG2a", "P", "=", "0", ".", "0068", ";", "V", "Low", "IgG2a", "versus", "V", "Low", "AbαNRP1A", "P", "=", "0", ".", "0068", ";", "V", "Med", "IgG2a", "versus", "V", "Med", "AbαNRP1A", "P", "=", "0", ".", "0460", ".", "(", "B", ")", "V", "Low", "IgG2a", "versus", "V", "Low", "AbαNRP1A", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "V", "Low", "IgG2a", "versus", "V", "Med", "IgG2a", "P", "=", "0", ".", "0193", ";", "V", "Med", "IgG2a", "versus", "V", "Med", "AbαNRP1A", "P", "=", "0", ".", "0046", ".", "Mice", ",", "implanted", "with", "control", "cells", "(", "Ctrl", ")", "or", "myoblasts", "expressing", "low", "(", "V", "Low", ")", "or", "medium", "(", "V", "Med", ")", "VEGF", "levels", ",", "were", "treated", "with", "the", "anti", "-", "NRP1A", "antibody", "blocking", "Sema3A", "/", "NRP1", "binding", "(", "AbαNRP1A", ")", "or", "with", "control", "IgG2a", ".", "Analyses", "were", "performed", "after", "1", "week", ".", "C", "Quantification", "of", "vessel", "length", "density", "generated", "by", "increasing", "VEGF", "doses", "after", "the", "different", "treatments", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "of", "individual", "images", "(", "n", ")", "acquired", "from", "three", "muscles", "/", "group", ":", "Ctrl", "IgG2a", ",", "n", "=", "6", ";", "Ctrl", "AbαNRP1A", ",", "n", "=", "6", ";", "V", "Low", "IgG2a", ",", "n", "=", "19", ";", "V", "Low", "AbαNRP1A", ",", "n", "=", "20", ";", "V", "Med", "IgG2a", ",", "n", "=", "20", ";", "V", "Med", "AbαNRP1A", ",", "n", "=", "25", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "Kruskal", "-", "Wallis", "analysis", "with", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ":", "V", "Low", "IgG2a", "versus", "Ctrl", "IgG2a", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "V", "Low", "AbαNRP1A", "versus", "Ctrl", "IgG2a", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "V", "Low", "IgG2a", "versus", "V", "Med", "IgG2a", "P", "=", "0", ".", "0014", ";", "V", "Low", "AbαNRP1A", "versus", "V", "Med", "AbαNRP1A", "P", "=", "0", ".", "0179", ".", "Mice", ",", "implanted", "with", "control", "cells", "(", "Ctrl", ")", "or", "myoblasts", "expressing", "low", "(", "V", "Low", ")", "or", "medium", "(", "V", "Med", ")", "VEGF", "levels", ",", "were", "treated", "with", "the", "anti", "-", "NRP1A", "antibody", "blocking", "Sema3A", "/", "NRP1", "binding", "(", "AbαNRP1A", ")", "or", "with", "control", "IgG2a", ".", "Analyses", "were", "performed", "after", "1", "week", ".", "D", "Tgfb1", "gene", "expression", "in", "total", "skeletal", "muscles", "after", "the", "different", "treatments", ",", "expressed", "as", "fold", "-", "change", "versus", "the", "Ctrl", "IgG2a", "group", ".", "Data", "represent", "individual", "values", ",", "with", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "3", "or", "4", ",", "as", "indicated", ")", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "and", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "multiple", "comparisons", "test", ",", "after", "data", "normalization", "by", "logarithmic", "transformation", ";", "V", "Low", "IgG2a", "versus", "Ctrl", "IgG2a", "P", "=", "0", ".", "0083", ";", "V", "Low", "IgG2a", "versus", "V", "Low", "AbαNRP1A", "P", "=", "0", ".", "0315", ".", "Mice", ",", "implanted", "with", "control", "cells", "(", "Ctrl", ")", "or", "myoblasts", "expressing", "low", "(", "V", "Low", ")", "or", "medium", "(", "V", "Med", ")", "VEGF", "levels", ",", "were", "treated", "with", "the", "anti", "-", "NRP1A", "antibody", "blocking", "Sema3A", "/", "NRP1", "binding", "(", "AbαNRP1A", ")", "or", "with", "control", "IgG2a", ".", "Analyses", "were", "performed", "after", "1", "week", ".", "E", "Immunohistochemistry", "for", "Sema3A", "protein", "on", "frozen", "muscle", "sections", "with", "H", "&", "amp", ";", "amp", ";", "E", "counterstaining", ".", "The", "intensity", "of", "Sema3A", "stain", "was", "quantified", "as", "reciprocal", "intensity", "on", "a", "scale", "out", "of", "250", ".", "Scale", "bar", "=", "100", "μm", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "of", "individual", "images", "(", "n", ")", "acquired", "from", "three", "muscles", "/", "group", ":", "No", "stain", ",", "n", "=", "3", ";", "Ctrl", "IgG2a", ",", "n", "=", "23", ";", "Ctrl", "AbαNRP1A", ",", "n", "=", "12", ";", "V", "Low", "IgG2a", ",", "n", "=", "53", ";", "V", "Low", "AbαNRP1A", ",", "n", "=", "38", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "and", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "Kruskal", "-", "Wallis", "analysis", "with", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ":", "V", "Low", "IgG2a", "versus", "No", "stain", "P", "=", "0", ".", "0007", ";", "V", "Low", "IgG2a", "versus", "Ctrl", "IgG2a", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "V", "Low", "AbαNRP1A", "versus", "Ctrl", "IgG2a", "P", "=", "0", ".", "0142", ";", "V", "Low", "IgG2a", "versus", "V", "Low", "AbαNRP1A", "P", "=", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Mice, implanted with control cells (Ctrl) or myoblasts expressing low (V Low) or medium (V Med) VEGF levels, were treated with the anti-NRP1A antibody blocking Sema3A/NRP1 binding (AbαNRP1A) or with control IgG2a. Analyses were performed after 1 week.A, B Quantification of recruited NEM in sites of new angiogenesis by increasing VEGF doses, expressed as number of CD11b+ cells/mm2 of area (A) or /cm of vessel length (B). Data represent the mean ± SEM of individual images (n) acquired from three muscles/group. (A) Ctrl IgG2a, n = 11; Ctrl AbαNRP1A, n = 17; V Low IgG2a, n = 24; V Low AbαNRP1A, n = 28; V Med IgG2a, n = 25; V Med AbαNRP1A, n = 34; *P < 0.05, **P < 0.01 and ***P < 0.001 by Kruskal-Wallis analysis with Dunn's multiple comparisons test: V Low IgG2a versus Ctrl IgG2a P = 0.0068; V Low IgG2a versus V Low AbαNRP1A P = 0.0068; V Med IgG2a versus V Med AbαNRP1A P = 0.0460. (B) V Low IgG2a versus V Low AbαNRP1A P < 0.0001; V Low IgG2a versus V Med IgG2a P = 0.0193; V Med IgG2a versus V Med AbαNRP1A P = 0.0046.Mice, implanted with control cells (Ctrl) or myoblasts expressing low (V Low) or medium (V Med) VEGF levels, were treated with the anti-NRP1A antibody blocking Sema3A/NRP1 binding (AbαNRP1A) or with control IgG2a. Analyses were performed after 1 week.C Quantification of vessel length density generated by increasing VEGF doses after the different treatments. Data represent the mean ± SEM of individual images (n) acquired from three muscles/group: Ctrl IgG2a, n = 6; Ctrl AbαNRP1A, n = 6; V Low IgG2a, n = 19; V Low AbαNRP1A, n = 20; V Med IgG2a, n = 20; V Med AbαNRP1A, n = 25; *P < 0.05, **P < 0.01 and ***P < 0.001 by Kruskal-Wallis analysis with Dunn's multiple comparisons test: V Low IgG2a versus Ctrl IgG2a P < 0.0001; V Low AbαNRP1A versus Ctrl IgG2a P < 0.0001; V Low IgG2a versus V Med IgG2a P = 0.0014; V Low AbαNRP1A versus V Med AbαNRP1A P = 0.0179.Mice, implanted with control cells (Ctrl) or myoblasts expressing low (V Low) or medium (V Med) VEGF levels, were treated with the anti-NRP1A antibody blocking Sema3A/NRP1 binding (AbαNRP1A) or with control IgG2a. Analyses were performed after 1 week.D Tgfb1 gene expression in total skeletal muscles after the different treatments, expressed as fold-change versus the Ctrl IgG2a group. Data represent individual values, with mean ± SEM (n = 3 or 4, as indicated); *P < 0.05 and **P < 0.01 by one-way ANOVA with Bonferroni multiple comparisons test, after data normalization by logarithmic transformation; V Low IgG2a versus Ctrl IgG2a P = 0.0083; V Low IgG2a versus V Low AbαNRP1A P = 0.0315.Mice, implanted with control cells (Ctrl) or myoblasts expressing low (V Low) or medium (V Med) VEGF levels, were treated with the anti-NRP1A antibody blocking Sema3A/NRP1 binding (AbαNRP1A) or with control IgG2a. Analyses were performed after 1 week.E Immunohistochemistry for Sema3A protein on frozen muscle sections with H&amp;amp;E counterstaining. The intensity of Sema3A stain was quantified as reciprocal intensity on a scale out of 250. Scale bar = 100 μm. Data represent the mean ± SEM of individual images (n) acquired from three muscles/group: No stain, n = 3; Ctrl IgG2a, n = 23; Ctrl AbαNRP1A, n = 12; V Low IgG2a, n = 53; V Low AbαNRP1A, n = 38; *P < 0.05 and ***P < 0.001 by Kruskal-Wallis analysis with Dunn's multiple comparisons test: V Low IgG2a versus No stain P = 0.0007; V Low IgG2a versus Ctrl IgG2a P < 0.0001; V Low AbαNRP1A versus Ctrl IgG2a P = 0.0142; V Low IgG2a versus V Low AbαNRP1A P = 0.0001."}
{"words": ["Figure", "5Relative", "gene", "expression", "of", "Id1", ",", "specifically", "induced", "by", "activated", "SMAD1", "/", "5", ",", "and", "Pai1", ",", "specifically", "induced", "by", "activated", "SMAD2", "/", "3", ",", "in", "total", "muscle", "tissues", "1", "week", "after", "implantation", "with", "V", "Low", "-", ",", "V", "Med", "-", "and", "V", "High", "-", "expressing", "myoblast", "clones", "or", "control", "cells", "(", "Ctrl", ")", ",", "expressed", "as", "fold", "-", "change", "versus", "the", "Ctrl", "group", ".", "Data", "represent", "individual", "values", ",", "with", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "3", "or", "4", ",", "as", "indicated", ")", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "multiple", "comparisons", "test", ",", "after", "data", "normalization", "by", "logarithmic", "transformation", ";", "V", "Low", "versus", "Ctrl", "P", "=", "0", ".", "0002", ";", "V", "Low", "versus", "V", "Med", "P", "=", "0", ".", "005", ";", "V", "Low", "versus", "V", "High", "P", "=", "0", ".", "0016", ".", "Immunofluorescence", "staining", "of", "endothelium", "(", "CD31", ",", "in", "red", ")", ",", "nuclei", "(", "DAPI", ",", "in", "blue", ")", ",", "and", "phosphorylated", "SMAD2", "/", "3", "(", "in", "cyan", ")", "on", "cryosections", "of", "similarly", "injected", "muscles", "confirmed", "that", "endothelial", "SMAD2", "/", "3", "activation", "was", "inhibited", "by", "increasing", "VEGF", "doses", ".", "Scale", "bar", "=", "10", "μm", ";", "n", "=", "3", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Relative gene expression of Id1, specifically induced by activated SMAD1/5, and Pai1, specifically induced by activated SMAD2/3, in total muscle tissues 1 week after implantation with V Low-, V Med- and V High-expressing myoblast clones or control cells (Ctrl), expressed as fold-change versus the Ctrl group. Data represent individual values, with mean ± SEM (n = 3 or 4, as indicated); **P < 0.01 and ***P < 0.001 by one-way ANOVA with Bonferroni multiple comparisons test, after data normalization by logarithmic transformation; V Low versus Ctrl P = 0.0002; V Low versus V Med P = 0.005; V Low versus V High P = 0.0016.Immunofluorescence staining of endothelium (CD31, in red), nuclei (DAPI, in blue), and phosphorylated SMAD2/3 (in cyan) on cryosections of similarly injected muscles confirmed that endothelial SMAD2/3 activation was inhibited by increasing VEGF doses. Scale bar = 10 μm; n = 3."}
{"words": ["Figure", "6A", "-", "C", "Endothelial", "Sema3A", "expression", "is", "directly", "inhibited", "by", "VEGF", "and", "stimulated", "by", "TGF", "-", "β1", "in", "vitro", ".", "Mouse", "aortic", "endothelial", "cells", "were", "stimulated", "with", "increasing", "doses", "of", "recombinant", "VEGF164", "or", "TGF", "-", "β1", "for", "24", "h", ".", "The", "expression", "of", "Sema3a", "and", "Tgfb1", "was", "quantified", "by", "qRT", "-", "PCR", "and", "expressed", "as", "fold", "-", "change", "versus", "the", "non", "-", "stimulated", "cells", ".", "VEGF", "dose", "dependently", "inhibited", "Sema3a", "expression", "(", "A", ")", ",", "but", "did", "not", "affect", "that", "of", "Tgfb1", "(", "B", ")", ",", "while", "TGF", "-", "β1", "upregulated", "Sema3a", "expression", "in", "a", "dose", "-", "dependent", "fashion", "(", "C", ")", ".", "Data", "represent", "individual", "values", ",", "with", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "4", ")", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "multiple", "comparisons", "test", ",", "after", "data", "normalization", "by", "logarithmic", "transformation", ";", "Sema3A", "expression", "upon", "VEGF", "stimulation", ":", "40", "versus", "0", "P", "=", "0", ".", "0041", ";", "TGF", "-", "β1", "upon", "VEGF", "stimulation", ":", "no", "significant", "differences", ";", "Sema3A", "expression", "upon", "TGF", "-", "β1", "stimulation", ":", "1", "versus", "0", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "2", ".", "5", "versus", "0", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "40", "versus", "0", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "D", ",", "E", "Inhibition", "of", "TGF", "-", "β1", "abolishes", "Sema3A", "production", "and", "NEM", "recruitment", "in", "vivo", ".", "Mice", ",", "implanted", "with", "control", "cells", "(", "Ctrl", ")", "or", "myoblasts", "expressing", "low", "(", "V", "Low", ")", "VEGF", "levels", ",", "were", "treated", "with", "a", "TGF", "-", "β1", "blocking", "antibody", ".", "Analyses", "were", "preformed", "after", "1", "week", ".", "(", "D", ")", "Immunohistochemistry", "for", "Sema3A", "protein", "on", "frozen", "muscle", "sections", "with", "H", "&", "amp", ";", "amp", ";", "E", "counterstaining", ".", "The", "intensity", "of", "Sema3A", "stain", "was", "quantified", "as", "reciprocal", "intensity", "on", "a", "scale", "out", "of", "250", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "μm", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "of", "individual", "images", "(", "n", ")", "acquired", "from", "three", "muscles", "/", "group", ":", "No", "stain", ",", "n", "=", "10", ";", "Ctrl", "IgG1", ",", "n", "=", "17", ";", "Ctrl", "AbαTGF", "-", "β1", ",", "n", "=", "16", ";", "V", "Low", "IgG1", ",", "n", "=", "23", ";", "V", "Low", "AbαTGF", "-", "β1", ",", "n", "=", "28", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "Kruskal", "-", "Wallis", "analysis", "with", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ":", "V", "Low", "IgG1", "versus", "No", "stain", "P", "=", "0", ".", "0069", ";", "V", "Low", "IgG1", "versus", "Ctrl", "IgG1", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "V", "Low", "AbαTGF", "-", "β1", "versus", "V", "Low", "IgG1", "P", "=", "0", ".", "0002", ".", "D", ",", "E", "Inhibition", "of", "TGF", "-", "β1", "abolishes", "Sema3A", "production", "and", "NEM", "recruitment", "in", "vivo", ".", "Mice", ",", "implanted", "with", "control", "cells", "(", "Ctrl", ")", "or", "myoblasts", "expressing", "low", "(", "V", "Low", ")", "VEGF", "levels", ",", "were", "treated", "with", "a", "TGF", "-", "β1", "blocking", "antibody", ".", "Analyses", "were", "preformed", "after", "1", "week", ".", "(", "E", ")", "Quantification", "of", "recruited", "NEM", "(", "number", "of", "CD11b", "+", "cells", "/", "mm2", "of", "area", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "25", "μm", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "of", "individual", "images", "(", "n", ")", "acquired", "from", "three", "muscles", "/", "group", ":", "Ctrl", "IgG1", ",", "n", "=", "20", ";", "Ctrl", "AbαTGF", "-", "β1", ",", "n", "=", "19", ";", "V", "Low", "IgG1", ",", "n", "=", "20", ";", "V", "Low", "AbαTGF", "-", "β1", ",", "n", "=", "27", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "Kruskal", "-", "Wallis", "analysis", "with", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ":", "V", "Low", "IgG1", "versus", "Ctrl", "IgG1", "P", "=", "0", ".", "0005", ";", "V", "Low", "AbαTGF", "-", "β1", "versus", "V", "Low", "IgG1", "P", "<", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A-C Endothelial Sema3A expression is directly inhibited by VEGF and stimulated by TGF-β1 in vitro. Mouse aortic endothelial cells were stimulated with increasing doses of recombinant VEGF164 or TGF-β1 for 24 h. The expression of Sema3a and Tgfb1 was quantified by qRT-PCR and expressed as fold-change versus the non-stimulated cells. VEGF dose dependently inhibited Sema3a expression (A), but did not affect that of Tgfb1 (B), while TGF-β1 upregulated Sema3a expression in a dose-dependent fashion (C). Data represent individual values, with mean ± SEM (n = 4); **P < 0.01 and ***P < 0.001 by one-way ANOVA with Bonferroni multiple comparisons test, after data normalization by logarithmic transformation; Sema3A expression upon VEGF stimulation: 40 versus 0 P = 0.0041; TGF-β1 upon VEGF stimulation: no significant differences; Sema3A expression upon TGF-β1 stimulation: 1 versus 0 P < 0.0001; 2.5 versus 0 P < 0.0001; 40 versus 0 P < 0.0001.D, E Inhibition of TGF-β1 abolishes Sema3A production and NEM recruitment in vivo. Mice, implanted with control cells (Ctrl) or myoblasts expressing low (V Low) VEGF levels, were treated with a TGF-β1 blocking antibody. Analyses were preformed after 1 week. (D) Immunohistochemistry for Sema3A protein on frozen muscle sections with H&amp;amp;E counterstaining. The intensity of Sema3A stain was quantified as reciprocal intensity on a scale out of 250. Scale bar = 50 μm. Data represent the mean ± SEM of individual images (n) acquired from three muscles/group: No stain, n = 10; Ctrl IgG1, n = 17; Ctrl AbαTGF-β1, n = 16; V Low IgG1, n = 23; V Low AbαTGF-β1, n = 28. **P < 0.01 and ***P < 0.001 by Kruskal-Wallis analysis with Dunn's multiple comparisons test: V Low IgG1 versus No stain P = 0.0069; V Low IgG1 versus Ctrl IgG1 P < 0.0001; V Low AbαTGF-β1 versus V Low IgG1 P = 0.0002.D, E Inhibition of TGF-β1 abolishes Sema3A production and NEM recruitment in vivo. Mice, implanted with control cells (Ctrl) or myoblasts expressing low (V Low) VEGF levels, were treated with a TGF-β1 blocking antibody. Analyses were preformed after 1 week. (E) Quantification of recruited NEM (number of CD11b+ cells/mm2 of area). Scale bar = 25 μm. Data represent the mean ± SEM of individual images (n) acquired from three muscles/group: Ctrl IgG1, n = 20; Ctrl AbαTGF-β1, n = 19; V Low IgG1, n = 20; V Low AbαTGF-β1, n = 27; ***P < 0.001 by Kruskal-Wallis analysis with Dunn's multiple comparisons test: V Low IgG1 versus Ctrl IgG1 P = 0.0005; V Low AbαTGF-β1 versus V Low IgG1 P < 0.0001."}
{"words": ["Figure", "7A", "-", "C", "Mice", ",", "implanted", "with", "myoblasts", "expressing", "low", "(", "V", "Low", ")", "or", "medium", "(", "V", "Med", ")", "VEGF", "levels", ",", "were", "treated", "on", "days", "4", "and", "6", "after", "cell", "implantation", "with", "intramuscular", "injections", "of", "Sema3A", "-", "Fc", "(", "0", ".", "1", "or", "10", "mg", "/", "kg", "of", "average", "muscle", "tissue", "weight", ")", ",", "or", "with", "control", "Fc", "protein", ".", "(", "A", ")", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "NEM", "/", "cm", "of", "vessel", "length", "in", "sites", "of", "new", "angiogenesis", "after", "1", "week", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "of", "individual", "images", "(", "n", ")", "acquired", "from", "3", "to", "5", "muscles", "/", "group", ":", "V", "Low", "Fc", ",", "n", "=", "21", ";", "V", "Low", "0", ".", "1", "mg", "/", "kg", ",", "n", "=", "22", ";", "V", "Low", "10", "mg", "/", "kg", ",", "n", "=", "28", ";", "V", "Med", "Fc", ",", "n", "=", "20", ";", "V", "Med", "0", ".", "1", "mg", "/", "kg", ",", "n", "=", "30", ";", "V", "Med", "10", "mg", "/", "kg", ",", "n", "=", "25", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "Kruskal", "-", "Wallis", "analysis", "with", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ":", "V", "Low", "Fc", "versus", "V", "Low", "10", "mg", "/", "kg", "P", "=", "0", ".", "0027", ";", "V", "Med", "Fc", "versus", "V", "Med", "0", ".", "1", "mg", "/", "kg", "P", "=", "0", ".", "001", ";", "V", "Med", "Fc", "versus", "V", "Med", "10", "mg", "/", "kg", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "vessel", "length", "density", "(", "VLD", ")", "in", "treated", "muscles", "after", "1", "week", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "of", "individual", "images", "(", "n", ")", "acquired", "from", "3", "to", "4", "muscles", "/", "group", ":", "V", "Low", "Fc", ",", "n", "=", "8", ";", "V", "Low", "0", ".", "1", "mg", "/", "kg", ",", "n", "=", "20", ";", "V", "Low", "10", "mg", "/", "kg", ",", "n", "=", "18", ";", "V", "Med", "Fc", ",", "n", "=", "8", ";", "V", "Med", "0", ".", "1", "mg", "/", "kg", ",", "n", "=", "23", ";", "and", "V", "Med", "10", "mg", "/", "kg", ",", "n", "=", "27", ".", "Data", "were", "subjected", "to", "Kruskal", "-", "Wallis", "analysis", "with", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ",", "and", "no", "significant", "differences", "were", "detected", ".", "(", "C", ")", "Vascular", "stabilization", "rate", "was", "determined", "2", "weeks", "after", "cell", "implantation", "by", "measuring", "vessel", "length", "density", "after", "abrogation", "of", "VEGF", "signaling", "by", "VEGF", "-", "Trap", ".", "Treatment", "with", "10", "mg", "/", "kg", "Sema3A", "-", "Fc", "did", "not", "affect", "the", "stabilization", "of", "angiogenesis", "induced", "by", "low", "VEGF", ",", "but", "significantly", "increased", "the", "resistant", "fraction", "of", "vessels", "induced", "by", "medium", "VEGF", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "of", "individual", "images", "(", "n", ")", "acquired", "from", "3", "to", "4", "muscles", "/", "group", ":", "V", "Low", "Fc", ",", "n", "=", "32", ";", "V", "Low", "Sema3A", ",", "n", "=", "14", ";", "V", "Med", "Fc", ",", "n", "=", "28", ";", "V", "Med", "Sema3A", ",", "n", "=", "33", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "multiple", "comparisons", "test", ":", "V", "Med", "Fc", "versus", "V", "Med", "Sema3A", "P", "=", "0", ".", "0458", ".", "D", "-", "F", "Mice", "received", "intramuscular", "injections", "of", "adenovirus", "expressing", "VEGF", "(", "AdVIC", ")", "or", "CD8", "control", "(", "AdCD8", ")", "and", "were", "treated", "on", "days", "4", "and", "6", "after", "vector", "delivery", "with", "intramuscular", "injections", "of", "Sema3A", "-", "Fc", "(", "10", "mg", "/", "kg", "of", "average", "muscle", "tissue", "weight", ")", "or", "control", "Fc", "protein", ".", "(", "D", ")", "Immunofluorescence", "staining", "of", "endothelium", "(", "CD31", ",", "in", "red", ")", ",", "pericytes", "(", "NG2", ",", "in", "green", ")", ",", "smooth", "muscle", "cells", "(", "α", "-", "SMA", ",", "in", "cyan", ")", ",", "and", "nuclei", "(", "DAPI", ",", "in", "blue", ")", ",", "showing", "vessel", "density", "and", "morphology", "1", "week", "after", "injection", "of", "adenoviral", "vectors", "alone", "(", "no", "treatment", ")", "or", "after", "3", "weeks", "and", "with", "Fc", "or", "Sema3A", "-", "Fc", "treatment", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "μm", ".", "(", "E", ")", "Quantification", "of", "vessel", "length", "density", "(", "VLD", ")", "on", "the", "same", "samples", "shows", "that", "treatment", "with", "Sema3A", "-", "Fc", "accelerated", "stabilization", "of", "vessels", "induced", "by", "transient", "and", "uncontrolled", "VEGF", "expression", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "of", "individual", "images", "(", "n", ")", "acquired", "from", "3", "to", "4", "muscles", "/", "group", ":", "Uninjected", "muscles", ",", "n", "=", "72", ";", "AdCD8", "1", "week", ",", "n", "=", "68", ";", "AdVIC", "1", "week", ",", "n", "=", "53", ";", "AdVIC", "+", "Fc", "3", "weeks", ",", "n", "=", "78", ";", "AdVIC", "+", "Sema3AFc", "3", "weeks", ",", "n", "=", "91", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "Kruskal", "-", "Wallis", "analysis", "with", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ":", "AdCD8", "1", "week", "versus", "AdVIC", "+", "Fc", "3", "weeks", "P", "=", "0", ".", "0037", ";", "all", "other", "comparisons", "indicated", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "D", "-", "F", "Mice", "received", "intramuscular", "injections", "of", "adenovirus", "expressing", "VEGF", "(", "AdVIC", ")", "or", "CD8", "control", "(", "AdCD8", ")", "and", "were", "treated", "on", "days", "4", "and", "6", "after", "vector", "delivery", "with", "intramuscular", "injections", "of", "Sema3A", "-", "Fc", "(", "10", "mg", "/", "kg", "of", "average", "muscle", "tissue", "weight", ")", "or", "control", "Fc", "protein", ".", "(", "F", ")", "Immunofluorescence", "staining", "of", "endothelial", "cells", "(", "CD31", ",", "in", "red", ")", "and", "NEM", "(", "CD11b", ",", "in", "green", ")", "on", "frozen", "sections", "of", "muscles", "3", "weeks", "after", "injection", "of", "adenoviral", "vectors", "and", "with", "Fc", "or", "Sema3A", "-", "Fc", "treatment", ".", "White", "arrows", "indicate", "NEM", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A-C Mice, implanted with myoblasts expressing low (V Low) or medium (V Med) VEGF levels, were treated on days 4 and 6 after cell implantation with intramuscular injections of Sema3A-Fc (0.1 or 10 mg/kg of average muscle tissue weight), or with control Fc protein. (A) Quantification of the number of NEM/cm of vessel length in sites of new angiogenesis after 1 week. Data represent the mean ± SEM of individual images (n) acquired from 3 to 5 muscles/group: V Low Fc, n = 21; V Low 0.1 mg/kg, n = 22; V Low 10 mg/kg, n = 28; V Med Fc, n = 20; V Med 0.1 mg/kg, n = 30; V Med 10 mg/kg, n = 25; **P < 0.01 and ***P < 0.001 by Kruskal-Wallis analysis with Dunn's multiple comparisons test: V Low Fc versus V Low 10 mg/kg P = 0.0027; V Med Fc versus V Med 0.1 mg/kg P = 0.001; V Med Fc versus V Med 10 mg/kg P < 0.0001. (B) Quantification of vessel length density (VLD) in treated muscles after 1 week. Data represent the mean ± SEM of individual images (n) acquired from 3 to 4 muscles/group: V Low Fc, n = 8; V Low 0.1 mg/kg, n = 20; V Low 10 mg/kg, n = 18; V Med Fc, n = 8; V Med 0.1 mg/kg, n = 23; and V Med 10 mg/kg, n = 27. Data were subjected to Kruskal-Wallis analysis with Dunn's multiple comparisons test, and no significant differences were detected. (C) Vascular stabilization rate was determined 2 weeks after cell implantation by measuring vessel length density after abrogation of VEGF signaling by VEGF-Trap. Treatment with 10 mg/kg Sema3A-Fc did not affect the stabilization of angiogenesis induced by low VEGF, but significantly increased the resistant fraction of vessels induced by medium VEGF. Data represent the mean ± SEM of individual images (n) acquired from 3 to 4 muscles/group: V Low Fc, n = 32; V Low Sema3A, n = 14; V Med Fc, n = 28; V Med Sema3A, n = 33; *P < 0.05 by one-way ANOVA with Bonferroni multiple comparisons test: V Med Fc versus V Med Sema3A P = 0.0458.D-F Mice received intramuscular injections of adenovirus expressing VEGF (AdVIC) or CD8 control (AdCD8) and were treated on days 4 and 6 after vector delivery with intramuscular injections of Sema3A-Fc (10 mg/kg of average muscle tissue weight) or control Fc protein. (D) Immunofluorescence staining of endothelium (CD31, in red), pericytes (NG2, in green), smooth muscle cells (α-SMA, in cyan), and nuclei (DAPI, in blue), showing vessel density and morphology 1 week after injection of adenoviral vectors alone (no treatment) or after 3 weeks and with Fc or Sema3A-Fc treatment. Scale bar = 50 μm. (E) Quantification of vessel length density (VLD) on the same samples shows that treatment with Sema3A-Fc accelerated stabilization of vessels induced by transient and uncontrolled VEGF expression. Data represent the mean ± SEM of individual images (n) acquired from 3 to 4 muscles/group: Uninjected muscles, n = 72; AdCD8 1 week, n = 68; AdVIC 1 week, n = 53; AdVIC+Fc 3 weeks, n = 78; AdVIC+Sema3AFc 3 weeks, n = 91; **P < 0.01 and ***P < 0.001 by Kruskal-Wallis analysis with Dunn's multiple comparisons test: AdCD8 1 week versus AdVIC+Fc 3 weeks P = 0.0037; all other comparisons indicated P < 0.0001.D-F Mice received intramuscular injections of adenovirus expressing VEGF (AdVIC) or CD8 control (AdCD8) and were treated on days 4 and 6 after vector delivery with intramuscular injections of Sema3A-Fc (10 mg/kg of average muscle tissue weight) or control Fc protein. (F) Immunofluorescence staining of endothelial cells (CD31, in red) and NEM (CD11b, in green) on frozen sections of muscles 3 weeks after injection of adenoviral vectors and with Fc or Sema3A-Fc treatment. White arrows indicate NEM. Scale bar = 50 μm."}
{"words": ["Figure", "1A", ",", "Representative", "images", "of", "controls", "from", "the", "siRNA", "screen", "for", "HU", "-", "induced", "RPA", "accumulation", ".", "GFP", "-", "RPA1", "and", "RFP", "-", "PCNA", "reporter", "cells", "were", "transfected", "with", "siRNAs", "and", "48", "hrs", "later", "treated", "with", "HU", "(", "3", "mM", ")", "for", "2", "hrs", "prior", "to", "pre", "-", "extraction", ",", "fixation", "and", "imaging", ".", "B", ",", "Gene", "ranking", "based", "on", "siRNA", "scores", "from", "two", "independent", "screens", ".", "219", "genes", "were", "targeted", "by", "three", "individual", "siRNAs", "and", "ranked", "based", "on", "P", "-", "values", "derived", "from", "RSA", "and", "Fisher", "'", "s", "analysis", ".", "Selected", "hits", "are", "highlighted", ".", "C", ",", "Validation", "of", "selected", "genes", "by", "single", "cell", "analysis", "of", "GFP", "-", "RPA1", "intensity", "in", "pre", "-", "extracted", "cells", ".", "Only", "S", "-", "phase", "cells", "positive", "for", "RFP", "-", "PCNA", "were", "analysed", ".", "a", ",", "b", ",", "c", "denote", "independent", "siRNAs", ";", "Ctrl", ",", "Control", ".", "Median", "with", "interquartile", "range", "of", "relative", "intensity", "per", "cell", "is", "shown", ",", "n", ">", "4000", ".", "Mann", "-", "Whitney", ":", "*", "*", "*", "p", "<", "10", "-", "4", ",", "n", ".", "s", ".", "non", "-", "significant", ".", "One", "representative", "experiment", "out", "of", "two", "biological", "replicas", "is", "shown", ".", "D", ",", "Analysis", "of", "DNA", "synthesis", "rate", ".", "Cells", "were", "pulsed", "15", "min", "with", "EdU", "and", "EdU", "intensity", "was", "analysed", "in", "S", "-", "phase", "cells", "positive", "for", "RFP", "-", "PCNA", ".", "EdU", "incorporation", "is", "shown", "relative", "to", "siCtrl", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A, Representative images of controls from the siRNA screen for HU-induced RPA accumulation. GFP-RPA1 and RFP-PCNA reporter cells were transfected with siRNAs and 48 hrs later treated with HU (3 mM) for 2 hrs prior to pre-extraction, fixation and imaging.B, Gene ranking based on siRNA scores from two independent screens. 219 genes were targeted by three individual siRNAs and ranked based on P-values derived from RSA and Fisher's analysis. Selected hits are highlighted.C, Validation of selected genes by single cell analysis of GFP-RPA1 intensity in pre-extracted cells. Only S-phase cells positive for RFP-PCNA were analysed. a, b, c denote independent siRNAs; Ctrl, Control. Median with interquartile range of relative intensity per cell is shown, n > 4000. Mann-Whitney: *** p < 10-4, n.s. non-significant. One representative experiment out of two biological replicas is shown.D, Analysis of DNA synthesis rate. Cells were pulsed 15 min with EdU and EdU intensity was analysed in S-phase cells positive for RFP-PCNA. EdU incorporation is shown relative to siCtrl."}
{"words": ["Figure", "2A", ",", "DNA", "replication", "measured", "by", "EdU", "incorporation", ".", "RPF", "-", "PCNA", "reporter", "cells", "were", "transfected", "with", "indicated", "siRNAs", "and", "pulsed", "with", "EdU", "for", "20", "min", ".", "S", "-", "phase", "cells", "positive", "for", "RFP", "-", "PCNA", "were", "analysed", ".", "n", ">", "150", ".", "Error", "bars", ",", "SD", ";", "n", "=", "3", "biological", "replicas", ".", "B", ",", "Complementation", "analysis", "of", "DNA", "synthesis", ".", "Stable", "cell", "lines", "expressing", "BRPF3", "resistant", "to", "the", "BRPF3", "/", "a", "siRNA", "and", "control", "(", "lacZ", "-", "V5", ")", "were", "siRNA", "transfected", "and", "analysed", "for", "EdU", "incorporation", "as", "in", "A", ".", "Error", "-", "bars", ",", "SD", ";", "n", "=", "6", "biological", "replicas", ".", "Two", "-", "tailed", "t", "test", ",", "*", "*", "p", "<", "10", "-", "2", ".", "C", ",", "Comparison", "of", "native", "BRPF1", "and", "BRPF3", "complexes", "purified", "from", "K562", "cells", ".", "(", "left", ")", "mass", "-", "spec", "analysis", "(", "spectral", "counts", "/", "total", "peptides", "identified", ")", "and", "(", "right", ")", "verification", "of", "associated", "protein", "by", "western", "blot", ".", "D", ",", "Immunoprecipitation", "analysis", "of", "BRPF3", "deletion", "mutants", ".", "One", "representative", "experiment", "out", "of", "two", "is", "shown", ".", "E", ",", "Histone", "acetyltransferase", "assay", "(", "HAT", ")", "with", "purified", "BRPF1", "/", "3", "complexes", "on", "free", "histones", "and", "mononucleosomes", ".", "F", ",", "HAT", "assay", "with", "purified", "BRPF1", "/", "3", "complexes", "on", "H3", "peptides", "unmodified", "or", "acetylated", "(", "ac", ")", "/", "methylated", "(", "me", ")", "at", "K14", "and", "K27", ",", "respectively", ".", "G", ",", "Analysis", "of", "histone", "acetylation", "in", "BRPF3", "depleted", "cells", ".", "(", "left", ")", "Western", "blot", "of", "siRNA", "treated", "U", "-", "2", "-", "OS", "cells", ".", "TSA", "treatment", "(", "1", "hr", ")", "was", "included", "as", "a", "positive", "control", ".", "2x", ",", "double", "amount", "of", "extract", "loaded", "in", "1x", ".", "(", "right", ")", "H3K14", "acetylation", "levels", "quantified", "relative", "to", "total", "H3", ".", "Error", "bars", ",", "SD", ";", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "H", ",", "Complementation", "analysis", "of", "H3K14ac", ".", "Total", "cell", "extracts", "of", "siRNA", "treated", "lacZ", "-", "V5", "and", "BRPF3", "-", "V5", "(", "siBRPF3", "/", "a", "resistant", ")", "expressing", "cells", "were", "analysed", "by", "western", "blotting", ".", "One", "representative", "experiment", "out", "of", "four", "biological", "replicas", "is", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A, DNA replication measured by EdU incorporation. RPF-PCNA reporter cells were transfected with indicated siRNAs and pulsed with EdU for 20 min. S-phase cells positive for RFP-PCNA were analysed. n > 150. Error bars, SD; n= 3 biological replicas.B, Complementation analysis of DNA synthesis. Stable cell lines expressing BRPF3 resistant to the BRPF3/a siRNA and control (lacZ-V5) were siRNA transfected and analysed for EdU incorporation as in A. Error-bars, SD; n = 6 biological replicas. Two-tailed t test, ** p<10-2.C, Comparison of native BRPF1 and BRPF3 complexes purified from K562 cells. (left) mass-spec analysis (spectral counts/total peptides identified) and (right) verification of associated protein by western blot.D, Immunoprecipitation analysis of BRPF3 deletion mutants. One representative experiment out of two is shown.E, Histone acetyltransferase assay (HAT) with purified BRPF1/3 complexes on free histones and mononucleosomes.F, HAT assay with purified BRPF1/3 complexes on H3 peptides unmodified or acetylated (ac)/methylated (me) at K14 and K27, respectively.G, Analysis of histone acetylation in BRPF3 depleted cells. (left) Western blot of siRNA treated U-2-OS cells. TSA treatment (1 hr) was included as a positive control. 2x, double amount of extract loaded in 1x. (right) H3K14 acetylation levels quantified relative to total H3. Error bars, SD; n = 3 biological replicates.H, Complementation analysis of H3K14ac. Total cell extracts of siRNA treated lacZ-V5 and BRPF3-V5 (siBRPF3/a resistant) expressing cells were analysed by western blotting. One representative experiment out of four biological replicas is shown."}
{"words": ["Figure", "3A", "-", "B", ",", "Single", "-", "molecule", "analysis", "of", "DNA", "replication", "by", "DNA", "combing", "of", "siRNA", "transfected", "cells", "pulse", "-", "labelled", "with", "IdU", "(", "10", "min", ")", "and", "CIdU", "(", "20", "min", ")", ".", "(", "A", ")", "Distribution", "of", "inter", "-", "track", "distances", ".", "Bars", "represent", "the", "median", ".", "n", ">", "100", ".", "Mann", "-", "Whitney", ":", "*", "*", "*", "P", "<", "10", "-", "3", ".", "One", "representative", "experiment", "out", "of", "two", "biological", "replicas", "is", "shown", ".", "(", "B", ")", "Size", "distribution", "of", "CldU", "track", "length", ".", "Bars", "represent", "the", "median", ".", "n", ">", "300", ".", "Mann", "-", "Whitney", ":", "*", "*", "*", "P", "<", "10", "-", "3", ".", "One", "representative", "experiment", "out", "of", "two", "biological", "replicas", "is", "shown", ".", "C", ",", "Distribution", "of", "intertrack", "distances", "measured", "by", "IdU", "/", "CIdU", "pulse", "labelling", "and", "DNA", "fiber", "analysis", ".", "Bars", "represent", "the", "median", ".", "n", ">", "110", ".", "Mann", "-", "Whitney", ":", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "10", "-", "4", ".", "One", "representative", "experiment", "out", "of", "two", "biological", "replicas", "is", "shown", ".", "D", ",", "Scatter", "plot", "of", "chromatin", "-", "bound", "GFP", "-", "RPA1", "intensity", "per", "cell", ".", "GFP", "-", "RPA1", "and", "RFP", "-", "PCNA", "reporter", "cells", "were", "transfected", "with", "indicated", "siRNAs", "and", "treated", "2", "hrs", "with", "UCN", "-", "01", "(", "300", "nM", ")", "prior", "to", "pre", "-", "extraction", "and", "fixation", ".", "GFP", "-", "RPA1", "levels", "were", "measured", "in", "PCNA", "positive", "cells", ".", "Lines", "represent", "medians", ".", "n", ">", "150", ".", "t", "-", "tests", ":", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "10", "-", "4", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "a", ".", "u", ".", ",", "arbitrary", "unit", ".", "E", ",", "Analysis", "of", "replication", "factor", "loading", ".", "Soluble", "proteins", "from", "siRNA", "transfected", "cells", "treated", "as", "in", "D", "where", "removed", "by", "CSK", "-", "T", "extraction", "and", "chromatin", "pellets", "analysed", "by", "western", "blotting", ".", "One", "representative", "experiment", "out", "of", "three", "independent", "biological", "replicas", "is", "shown", ".", "F", ",", "Quantification", "of", "chromatin", "-", "bound", "MCM2", "(", "left", ")", "and", "CDC45", "(", "right", ")", "from", "the", "three", "independent", "experiments", "described", "in", "(", "E", ")", ".", "MCM2", "and", "CDC45", "levels", "were", "normalized", "to", "histone", "H4", "levels", "and", "shown", "relative", "to", "untreated", "control", ".", "t", "-", "tests", ":", "*", "*", "*", "P", "<", "10", "-", "3", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "n", ".", "s", ".", "non", "-", "significant", ".", "G", ",", "Analysis", "of", "chromatin", "-", "bound", "proteins", "in", "HBO1", "depleted", "cells", "as", "in", "E", ".", "One", "representative", "experiment", "out", "of", "two", "biological", "replicas", "is", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A-B, Single-molecule analysis of DNA replication by DNA combing of siRNA transfected cells pulse-labelled with IdU (10 min) and CIdU (20 min). (A) Distribution of inter-track distances. Bars represent the median. n > 100. Mann-Whitney: *** P < 10-3. One representative experiment out of two biological replicas is shown. (B) Size distribution of CldU track length. Bars represent the median. n > 300. Mann-Whitney: *** P < 10-3. One representative experiment out of two biological replicas is shown. C, Distribution of intertrack distances measured by IdU/CIdU pulse labelling and DNA fiber analysis. Bars represent the median. n > 110. Mann-Whitney: **** P < 10-4. One representative experiment out of two biological replicas is shown.D, Scatter plot of chromatin-bound GFP-RPA1 intensity per cell. GFP-RPA1 and RFP-PCNA reporter cells were transfected with indicated siRNAs and treated 2 hrs with UCN-01 (300 nM) prior to pre-extraction and fixation. GFP-RPA1 levels were measured in PCNA positive cells. Lines represent medians. n > 150. t-tests: **** P < 10-4, * P < 0.05; a.u., arbitrary unit.E, Analysis of replication factor loading. Soluble proteins from siRNA transfected cells treated as in D where removed by CSK-T extraction and chromatin pellets analysed by western blotting. One representative experiment out of three independent biological replicas is shown. F, Quantification of chromatin-bound MCM2 (left) and CDC45 (right) from the three independent experiments described in (E). MCM2 and CDC45 levels were normalized to histone H4 levels and shown relative to untreated control. t-tests: *** P < 10-3, ** P < 0.01, * P < 0.05, n.s. non-significant.G, Analysis of chromatin-bound proteins in HBO1 depleted cells as in E. One representative experiment out of two biological replicas is shown."}
{"words": ["Figure", "4A", ",", "ChIP", "-", "seq", "analysis", "of", "BRPF3", "binding", "on", "the", "human", "genome", ".", "BRPF3", "enrichment", "signal", "obtained", "by", "ChIP", "-", "seq", "with", "asynchronous", "(", "AS", ")", ",", "synchronized", "(", "S", ")", "and", "released", "into", "HU", "(", "S", "+", "HU", ")", "RKO", "cells", ",", "on", "the", "MCM4", "(", "left", ")", "and", "Lamin", "B2", "(", "right", ")", "replication", "origins", ".", "Signals", "were", "compared", "to", "the", "published", "enrichment", "signals", "for", "ORC1", "in", "HeLa", "cells", "(", "(", "Dellino", "et", "al", ",", "2013", ")", ",", "GSE37583", ")", ",", "HBO1", "in", "RKO", "cells", "(", "Avvakumov", "et", "al", ".", ",", "2012", ",", "GSE33221", ")", ",", "and", "H3K14ac", "in", "IMR90", "cells", "(", "GSM521881", ")", ".", "The", "negative", "control", "IgG", "signal", "shown", "is", "from", "the", "S", "+", "HUchromatin", ".", "B", ",", "Venn", "diagrams", "illustrating", "the", "overlap", "of", "genome", "binding", "sites", "between", "(", "top", ")", "BRPF3", ",", "HBO1", "and", "ORC1", ",", "and", "(", "bottom", ")", "BRPF3", ",", "BRPF1", "/", "2", "and", "ORC1", "in", "human", "cells", ".", "C", ",", "Heatmaps", "of", "BRPF3", ",", "HBO1", "and", "H3K14ac", "ChIP", "-", "seq", "signal", "on", "±", "5kb", "surrounding", "the", "TSS", "of", "genes", ".", "Genes", "were", "sorted", "by", "BRPF3", "abundance", "from", "high", "to", "low", ".", "A", ".", "U", ".", "arbitrary", "unit", ".", "D", ",", "Average", "profiles", "of", "BRPF3", "and", "H3K14ac", "ChIP", "-", "seq", "signal", "on", "±", "2", ".", "5kb", "around", "the", "centre", "of", "(", "top", ")", "BRPF3", "and", "(", "bottom", ")", "ORC1", "genome", "binding", "sites", ".", "E", ",", "ChIP", "-", "qPCR", "analysis", "of", "H3K14ac", "on", "well", "-", "characterized", "replication", "origins", ".", "H3K14ac", "enrichments", "measured", "relative", "to", "IgG", "control", "are", "shown", "relative", "to", "control", "siRNA", "treated", "cells", ".", "Error", "bars", ",", "range", ";", "n", "=", "2", "biological", "replicas", ".", "F", ",", "Expression", "levels", "of", "DNA", "replication", "factors", "were", "not", "altered", "by", "the", "lack", "of", "BRPF3", ".", "Each", "point", "represents", "the", "expression", "levels", "of", "a", "gene", "in", "control", "and", "BRPF3", "depleted", "cells", "(", "GSE65065", ")", ".", "Replication", "factors", "were", "classified", "as", "described", "previously", "(", "Alabert", "et", "al", ",", "2014", ")", ".", "Total", "genes", "(", "grey", ")", ",", "DNA", "replication", "factors", "(", "colors", ")", "and", "BRPF3", "(", "black", ")", "expression", "levels", "are", "shown", ".", "Continuous", "black", "lines", "mark", "1", ".", "5", "fold", "change", "in", "expression", "levels", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A, ChIP-seq analysis of BRPF3 binding on the human genome. BRPF3 enrichment signal obtained by ChIP-seq with asynchronous (AS), synchronized (S) and released into HU (S+HU) RKO cells, on the MCM4 (left) and Lamin B2 (right) replication origins. Signals were compared to the published enrichment signals for ORC1 in HeLa cells ((Dellino et al, 2013), GSE37583), HBO1 in RKO cells (Avvakumov et al., 2012, GSE33221), and H3K14ac in IMR90 cells (GSM521881). The negative control IgG signal shown is from the S+HUchromatin.B, Venn diagrams illustrating the overlap of genome binding sites between (top) BRPF3, HBO1 and ORC1, and (bottom) BRPF3, BRPF1/2 and ORC1 in human cells.C, Heatmaps of BRPF3, HBO1 and H3K14ac ChIP-seq signal on ± 5kb surrounding the TSS of genes. Genes were sorted by BRPF3 abundance from high to low. A.U. arbitrary unit.D, Average profiles of BRPF3 and H3K14ac ChIP-seq signal on ± 2.5kb around the centre of (top) BRPF3 and (bottom) ORC1 genome binding sites.E, ChIP-qPCR analysis of H3K14ac on well-characterized replication origins. H3K14ac enrichments measured relative to IgG control are shown relative to control siRNA treated cells. Error bars, range; n= 2 biological replicas.F, Expression levels of DNA replication factors were not altered by the lack of BRPF3. Each point represents the expression levels of a gene in control and BRPF3 depleted cells (GSE65065). Replication factors were classified as described previously (Alabert et al, 2014). Total genes (grey), DNA replication factors (colors) and BRPF3 (black) expression levels are shown. Continuous black lines mark 1.5 fold change in expression levels."}
{"words": ["Figure", "5A", ",", "Western", "blot", "of", "DNA", "damage", "signalling", "in", "BRPF3", "depleted", "cells", ".", "siRNA", "transfected", "U", "-", "2", "-", "OS", "cells", "were", "treated", "with", "HU", "for", "2", "h", "or", "24", "h", ".", "One", "representative", "experiment", "out", "of", "two", "biological", "experiments", "is", "shown", ".", "B", "-", "C", ",", "Recovery", "from", "replication", "stress", ".", "siRNA", "treated", "cells", "were", "treated", "for", "24", "hrs", "with", "HU", "(", "0", "h", ")", ",", "and", "released", "into", "normal", "medium", "for", "the", "indicated", "times", "(", "see", "also", "Fig", ".", "S6A", ",", "B", ")", ".", "(", "B", ")", "DNA", "replication", "rate", "measured", "by", "EdU", "incorporation", ".", "Cells", "were", "pulsed", "with", "EdU", "for", "15", "min", "and", "gated", "as", "shown", "in", "Figure", "S6A", "to", "analyse", "EdU", "positive", "cells", ".", "n", ">", "1000", ".", "Mann", "-", "Whitney", ":", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "10", "-", "4", ".", "(", "C", ")", "Cell", "cycle", "progression", "measured", "by", "FACS", "analysis", "of", "DNA", "content", ".", "One", "representative", "experiment", "out", "of", "two", "independent", "biological", "replicas", "is", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A, Western blot of DNA damage signalling in BRPF3 depleted cells. siRNA transfected U-2-OS cells were treated with HU for 2 h or 24 h. One representative experiment out of two biological experiments is shown.B-C, Recovery from replication stress. siRNA treated cells were treated for 24 hrs with HU (0 h), and released into normal medium for the indicated times (see also Fig. S6A, B). (B) DNA replication rate measured by EdU incorporation. Cells were pulsed with EdU for 15 min and gated as shown in Figure S6A to analyse EdU positive cells. n > 1000. Mann-Whitney: **** P < 10-4. (C) Cell cycle progression measured by FACS analysis of DNA content. One representative experiment out of two independent biological replicas is shown."}
{"words": ["Figure", "1A549", "cells", "stably", "expressing", "lentivirus", "vector", "containing", "random", "shRNA", "or", "Atg7", "specific", "shRNA", "were", "generated", ".", "(", "A", ")", "Cells", "were", "incubated", "for", "2", "hours", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "50", "nM", "of", "lysosomal", "inhibitor", "chloroquine", "(", "CQ", ")", ".", "Cell", "lysates", "were", "evaluated", "by", "immunoblotting", ".", "A549", "cells", "stably", "expressing", "lentivirus", "vector", "containing", "random", "shRNA", "or", "Atg7", "specific", "shRNA", "were", "generated", ".", "(", "B", ")", "Cells", "were", "infected", ",", "for", "1", "and", "4", "hours", ",", "with", "K", ".", "pneumonia", "at", "MOI", "of", "10", "followed", "by", "1", "hour", "of", "gentamycin", "treatment", ".", "Cell", "lysates", "were", "plated", "in", "LB", "agar", "for", "18", "hours", "and", "CFU", "were", "determined", ".", "Data", "information", ":", "the", "triangles", "and", "dots", "represent", "the", "individual", "test", "(", "three", "technical", "replicates", "per", "individual", "test", ")", "on", "control", "and", "Atg7", "knock", "down", "cells", ".", "The", "bars", "represent", "the", "mean", "CFU", "of", "each", "group", "(", "three", "biological", "replicates", "each", "group", ")", ",", "error", "bars", "represent", "standard", "deviation", ".", "Statistical", "significance", "between", "assays", "were", "calculated", "using", "two", "-", "tailed", "student", "'", "s", "t", "test", "with", "Welch", "'", "s", "correction", ".", "NS", ":", "not", "significant", ";", "*", "p", " ", "≤", " ", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", " ", "≤", " ", "0", ".", "01", ".", "A549", "cells", "stably", "expressing", "lentivirus", "vector", "containing", "random", "shRNA", "or", "Atg7", "specific", "shRNA", "were", "generated", ".", "(", "D", "-", "E", ")", "Cells", "were", "infected", ",", "for", "1", "-", "4", "hours", ",", "with", "WT", "(", "D", ")", "or", "ΔpscD", "P", ".", "aeruginosa", "(", "E", ")", "at", "MOI", "of", "10", ".", "All", "infections", "were", "followed", "by", "1", "hour", "of", "gentamycin", "treatment", ".", "Cell", "lysates", "were", "plated", "in", "LB", "agar", "for", "18", "hours", "and", "CFU", "were", "determined", ".", "Data", "information", ":", ",", "the", "triangles", "and", "dots", "represent", "the", "individual", "test", "(", "three", "technical", "replicates", "per", "individual", "test", ")", "on", "control", "and", "Atg7", "knock", "down", "cells", ".", "The", "bars", "represent", "the", "mean", "CFU", "of", "each", "group", "(", "three", "biological", "replicates", "each", "group", ")", ",", "error", "bars", "represent", "standard", "deviation", ".", "Statistical", "significance", "between", "assays", "were", "calculated", "using", "two", "-", "tailed", "student", "'", "s", "t", "test", "with", "Welch", "'", "s", "correction", ".", "NS", ":", "not", "significant", ";", "*", "p", " ", "≤", " ", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", " ", "≤", " ", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A549 cells stably expressing lentivirus vector containing random shRNA or Atg7 specific shRNA were generated. (A) Cells were incubated for 2 hours in the presence or absence of 50 nM of lysosomal inhibitor chloroquine (CQ). Cell lysates were evaluated by immunoblotting. A549 cells stably expressing lentivirus vector containing random shRNA or Atg7 specific shRNA were generated. (B) Cells were infected, for 1 and 4 hours, with K. pneumonia at MOI of 10 followed by 1 hour of gentamycin treatment. Cell lysates were plated in LB agar for 18 hours and CFU were determined. Data information: the triangles and dots represent the individual test (three technical replicates per individual test) on control and Atg7 knock down cells. The bars represent the mean CFU of each group (three biological replicates each group), error bars represent standard deviation. Statistical significance between assays were calculated using two-tailed student's t test with Welch's correction. NS: not significant; *p ≤ 0.05; **p ≤ 0.01. A549 cells stably expressing lentivirus vector containing random shRNA or Atg7 specific shRNA were generated. (D-E) Cells were infected, for 1-4 hours, with WT (D) or ΔpscD P. aeruginosa (E) at MOI of 10. All infections were followed by 1 hour of gentamycin treatment. Cell lysates were plated in LB agar for 18 hours and CFU were determined. Data information: , the triangles and dots represent the individual test (three technical replicates per individual test) on control and Atg7 knock down cells. The bars represent the mean CFU of each group (three biological replicates each group), error bars represent standard deviation. Statistical significance between assays were calculated using two-tailed student's t test with Welch's correction. NS: not significant; *p ≤ 0.05; **p ≤ 0.01. "}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "A549", "cells", "were", "infected", "with", "WT", "P", ".", "aeruginosa", "for", "various", "time", "points", "and", "cell", "lysates", "were", "evaluated", "by", "immunoblotting", ".", "(", "B", ")", "A549", "cells", "infected", "with", "WT", "or", "ΔpscD", "P", ".", "aeruginosa", "for", "4", "hours", "or", "left", "uninfected", "(", "NI", ")", "in", "the", "presence", "of", "lysosomal", "inhibitor", "CQ", "(", "50", "nM", ")", ".", "The", "cell", "lysates", "were", "evaluated", "by", "immunoblotting", ".", "(", "C", ")", "A549", "cells", "stably", "expressing", "GFP", "-", "LC3", "were", "left", "non", "-", "infected", "or", "infected", ",", "for", "4", "hours", ",", "with", "WT", "or", "ΔpscD", "P", ".", "aeruginosa", ",", "and", "evaluated", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "Cell", "nuclei", "were", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", "and", "autophagosome", "were", "visualized", "as", "green", "puncta", ".", "Graph", "represents", "quantitative", "analysis", "of", "GFP", "-", "LC3", "positive", "autophagosome", "per", "cell", ",", "scale", "bars", ":", "10", "µm", ".", "Each", "bar", "represents", "mean", "value", "of", "three", "independent", "experiments", ",", "error", "bars", "represent", "standard", "deviation", ".", "Statistical", "significance", "between", "assays", "was", "determined", "using", "One", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Dunn", "'", "s", "Multiple", "Comparison", "Test", ".", "*", "*", "p", " ", "≤", " ", "0", ".", "01", ".", "(", "D", "-", "E", ")", "A549", "cells", "were", "treated", "for", "16", "hours", "with", "rapamycin", "0", ".", "8", "μg", "/", "ml", "or", "DMSO", ",", "then", "infected", "with", "either", "WT", "(", "D", ")", "or", "ΔpscD", "P", ".", "aeruginosa", "and", "followed", "by", "1", "hour", "of", "gentamycin", "treatment", "(", "E", ")", ".", "The", "circles", "and", "squares", "represent", "the", "individual", "test", "(", "three", "technical", "replicates", "per", "individual", "test", ")", "with", "DMSO", "and", "rapamycin", "treatment", ".", "The", "bars", "represent", "the", "means", "of", "CFU", "from", "three", "independent", "experiments", ",", "error", "bars", "represent", "standard", "deviation", ".", "The", "significance", "of", "differences", "between", "different", "drug", "treatment", "was", "determined", "using", "two", "-", "tailed", "student", "'", "s", "t", "test", "with", "Welch", "'", "s", "correction", ".", "NS", ":", "not", "significant", ";", "*", "p", " ", "≤", " ", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", " ", "≤", " ", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) A549 cells were infected with WT P. aeruginosa for various time points and cell lysates were evaluated by immunoblotting.(B) A549 cells infected with WT or ΔpscD P. aeruginosa for 4 hours or left uninfected (NI) in the presence of lysosomal inhibitor CQ (50 nM). The cell lysates were evaluated by immunoblotting.(C) A549 cells stably expressing GFP-LC3 were left non-infected or infected, for 4 hours, with WT or ΔpscD P. aeruginosa, and evaluated by fluorescence microscopy. Cell nuclei were counterstained with DAPI (blue) and autophagosome were visualized as green puncta. Graph represents quantitative analysis of GFP-LC3 positive autophagosome per cell, scale bars: 10 µm. Each bar represents mean value of three independent experiments, error bars represent standard deviation. Statistical significance between assays was determined using One-way ANOVA followed by Dunn's Multiple Comparison Test. **p ≤ 0.01.(D-E) A549 cells were treated for 16 hours with rapamycin 0.8 μg/ml or DMSO, then infected with either WT (D) or ΔpscD P. aeruginosa and followed by 1 hour of gentamycin treatment (E). The circles and squares represent the individual test (three technical replicates per individual test) with DMSO and rapamycin treatment. The bars represent the means of CFU from three independent experiments, error bars represent standard deviation. The significance of differences between different drug treatment was determined using two-tailed student's t test with Welch's correction. NS: not significant; *p ≤ 0.05; **p ≤ 0.01."}
{"words": ["Figure", "3A549", "cells", "were", "infected", "with", "one", "of", "several", "P", ".", "aeruginosa", "mutants", ".", "Cell", "lysates", "were", "evaluated", "by", "immunoblotting", ".", "(", "B", ")", "primary", "human", "bronchial", "epithelial", "cells", "were", "infected", "with", "one", "of", "several", "P", ".", "aeruginosa", "mutants", ".", "Cell", "lysates", "were", "evaluated", "by", "immunoblotting", ".", "(", "C", ")", "A549", "cells", ",", "stably", "expressing", "GFP", "-", "LC3", ",", "were", "infected", "with", "WT", "or", "P", ".", "aeruginosa", "mutants", "and", "evaluated", "by", "fluorescence", "microscopy", ",", "scale", "bars", ":", "10", "µm", ".", "GFP", "-", "LC3", "puncta", "representing", "the", "autophagosomes", "was", "quantified", "and", "presented", "in", "the", "graph", ".", "Each", "bar", "represents", "mean", "value", "from", "three", "independent", "experiments", "and", "error", "bars", "represent", "standard", "deviation", ".", "Statistical", "significance", "between", "assays", "was", "determined", "using", "One", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Dunn", "'", "s", "Multiple", "Comparison", "Test", ".", "*", "p", " ", "≤", " ", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", " ", "≤", " ", "0", ".", "01", ".", "P", ".", "aeruginosa", "mutant", "strains", "legend", ":", "ΔSTY", "(", "mutant", "deficient", "for", "the", "three", "cytotoxins", ")", ",", "WT", "(", "contains", "all", "cytotoxin", ")", ",", "ΔS", "(", "deficient", "for", "ExoS", "but", "still", "express", "ExoT", "and", "ExoY", ")", ",", "ΔTY", "(", "express", "ExoS", "but", "deficient", "for", "ExoT", "and", "ExoY", ")", ".", "(", "D", ",", "E", ")", "A549", "cells", ",", "stably", "expressing", "GFP", "-", "LC3", ",", "were", "infected", "for", "4", "hours", "with", "WT", "or", "with", "one", "of", "P", ".", "aeruginosa", "mutants", "(", "ΔSTY", ",", "ΔS", "and", "ΔTY", ")", "and", "evaluated", "by", "fluorescence", "microscopy", "(", "D", ")", ".", "P", ".", "aeruginosa", "were", "visualized", "using", "specific", "antibody", "(", "red", ")", "and", "the", "colocalized", "bacteria", "signals", "with", "GFP", "-", "LC3", "puncta", "(", "green", ")", "were", "merged", "and", "presented", "as", "yellow", ".", "Scale", "bars", ":", "10", "µm", ".", "(", "E", ")", "Quantitative", "analysis", "of", "co", "-", "localization", "of", "internalized", "P", ".", "aeruginosa", "with", "GFP", "-", "LC3", "positive", "puncta", ".", "The", "colocalization", "of", "these", "two", "signals", "was", "quantified", "with", "10", "independent", "visual", "fields", "of", "more", "than", "100", "cells", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "significance", "between", "assays", "was", "determined", "using", "One", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Dunn", "'", "s", "Multiple", "Comparison", "Test", ".", "*", "p", " ", "≤", " ", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", " ", "≤", " ", "0", ".", "01", ".", "(", "F", ")", "Representative", "transmission", "electron", "microscopy", "images", "of", "A549", "cells", "infected", "with", "P", ".", "aeruginosa", "containing", "ExoS", "(", "ΔTY", ")", "or", "deficient", "for", "the", "three", "T3SS", "effector", "proteins", "(", "ΔSTY", ")", "for", "4", "hours", ".", "ΔSTY", "P", ".", "aeruginosa", "(", "white", "star", ")", "was", "engulfed", "by", "multiple", "membrane", "autophagosomes", "(", "black", "arrow", ")", ".", "ΔTY", "P", ".", "aeruginosa", "(", "white", "star", ")", "were", "found", "in", "cytoplasm", "with", "single", "membrane", "surrounded", ",", "scale", "bars", ":", "0", ".", "5", "µm", ".", "(", "G", ")", "A549", "cells", ",", "stably", "expressing", "lentiviral", "vectors", "containing", "random", "shRNA", "or", "Atg7", "shRNA", ",", "were", "infected", "with", "WT", "or", "P", ".", "aeruginosa", "mutants", "(", "ΔSTY", ",", "ΔTY", "and", "ΔS", ")", "at", "MOI", "of", "10", ".", "All", "infections", "were", "followed", "by", "1", "hours", "of", "gentamycin", "treatment", ".", "Cell", "lysates", "were", "plated", "in", "LB", "agar", "for", "18", "hours", "and", "CFU", "were", "determined", ".", "Data", "information", ":", "The", "triangles", "and", "dots", "represent", "the", "individual", "test", "(", "three", "technical", "replicates", "per", "individual", "test", ")", "on", "control", "and", "Atg7", "knock", "down", "cells", "from", "three", "biological", "replicates", ".", "The", "bars", "represent", "the", "means", "of", "CFU", "of", "each", "group", "(", "three", "biological", "replicates", "each", "group", ")", ",", "error", "bars", "represent", "standard", "deviation", ".", "The", "significance", "of", "differences", "between", "different", "assay", "was", "determined", "using", "two", "-", "tailed", "student", "'", "s", "t", "test", "with", "Welch", "'", "s", "correction", ",", "NS", ":", "not", "significant", ";", "*", "*", "p", " ", "≤", " ", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A549 cells were infected with one of several P. aeruginosa mutants. Cell lysates were evaluated by immunoblotting.(B) primary human bronchial epithelial cells were infected with one of several P. aeruginosa mutants. Cell lysates were evaluated by immunoblotting.(C) A549 cells, stably expressing GFP-LC3, were infected with WT or P. aeruginosa mutants and evaluated by fluorescence microscopy, scale bars: 10 µm. GFP-LC3 puncta representing the autophagosomes was quantified and presented in the graph. Each bar represents mean value from three independent experiments and error bars represent standard deviation. Statistical significance between assays was determined using One-way ANOVA followed by Dunn's Multiple Comparison Test. *p ≤ 0.05; **p ≤ 0.01. P. aeruginosa mutant strains legend: ΔSTY (mutant deficient for the three cytotoxins), WT (contains all cytotoxin), ΔS (deficient for ExoS but still express ExoT and ExoY), ΔTY (express ExoS but deficient for ExoT and ExoY).(D,E) A549 cells, stably expressing GFP-LC3, were infected for 4 hours with WT or with one of P. aeruginosa mutants (ΔSTY, ΔS and ΔTY) and evaluated by fluorescence microscopy (D). P. aeruginosa were visualized using specific antibody (red) and the colocalized bacteria signals with GFP-LC3 puncta (green) were merged and presented as yellow. Scale bars: 10 µm. (E) Quantitative analysis of co-localization of internalized P. aeruginosa with GFP-LC3 positive puncta. The colocalization of these two signals was quantified with 10 independent visual fields of more than 100 cells. Data represent mean ± SD of three independent experiments. Statistical significance between assays was determined using One-way ANOVA followed by Dunn's Multiple Comparison Test. *p ≤ 0.05; **p ≤ 0.01.(F) Representative transmission electron microscopy images of A549 cells infected with P. aeruginosa containing ExoS (ΔTY) or deficient for the three T3SS effector proteins (ΔSTY) for 4 hours. ΔSTY P. aeruginosa (white star) was engulfed by multiple membrane autophagosomes (black arrow). ΔTY P. aeruginosa (white star) were found in cytoplasm with single membrane surrounded, scale bars: 0.5 µm.(G) A549 cells, stably expressing lentiviral vectors containing random shRNA or Atg7 shRNA, were infected with WT or P. aeruginosa mutants (ΔSTY, ΔTY and ΔS) at MOI of 10. All infections were followed by 1 hours of gentamycin treatment. Cell lysates were plated in LB agar for 18 hours and CFU were determined. Data information: The triangles and dots represent the individual test (three technical replicates per individual test) on control and Atg7 knock down cells from three biological replicates. The bars represent the means of CFU of each group (three biological replicates each group), error bars represent standard deviation. The significance of differences between different assay was determined using two-tailed student's t test with Welch's correction, NS: not significant; **p ≤ 0.01."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Primary", "airway", "epithelial", "cells", "were", "isolated", "from", "tracheas", "of", "Atg7", "+", "/", "+", "and", "Atg7", "-", "/", "-", "mouse", "and", "were", "evaluated", "by", "immunoblotting", ".", "(", "B", ")", "Sections", "of", "tracheas", "from", "Atg7", "+", "/", "+", "and", "Atg7", "-", "/", "-", "mouse", "were", "evaluated", "by", "immunofluorescence", "microscopy", "following", "staining", "of", "nuclear", "DNA", "with", "DAPI", "(", "Blue", ")", ",", "ciliated", "epithelial", "cell", "marker", "β", "-", "tubulin", "IV", "(", "green", ")", "and", "Atg7", "(", "red", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "20", "µm", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "Atg7", "+", "/", "+", "and", "Atg7", "-", "/", "-", "mice", "were", "intranasally", "injected", "with", "3", "x107", "CFU", "of", "WT", ",", "ΔS", ",", "ΔTY", "or", "ΔSTY", "P", ".", "aeruginosa", ".", "After", "24", "hours", ",", "lungs", "(", "C", ")", ",", "spleens", "and", "livers", "(", "D", ")", "were", "harvested", ",", "homogenized", "and", "diluted", "for", "CFU", "counting", ".", "Each", "data", "point", "represents", "bacterial", "count", "(", "Log10", "CFU", "/", "g", ")", "from", "individual", "mouse", ".", "The", "horizontal", "lines", "represent", "the", "mean", "value", "from", "each", "group", "(", "6", "mice", "each", "group", ")", ",", "error", "bars", "represent", "standard", "deviation", ".", "The", "significance", "of", "differences", "between", "different", "drug", "treatment", "was", "determined", "using", "One", "-", "way", "ANOVA", "and", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", ",", "NS", ":", "not", "significant", ";", "*", "p", " ", "≤", " ", "0", ".", "05", "(", "E", ",", "F", ")", "Atg7", "+", "/", "+", "and", "Atg7", "-", "/", "-", "mice", "were", "intranasally", "injected", "with", "PBS", "with", "or", "without", "1", "x109", "CFU", "of", "ΔTY", "(", "E", ")", "ΔSTY", "(", "F", ")", ".", "Mice", "survival", "was", "monitored", "for", "10", "days", "post", "infection", ".", "Kaplan", "-", "Meyer", "survival", "curves", "were", "made", "based", "on", "the", "observation", "of", "12", "-", "18", "mice", "/", "group", "from", "two", "independent", "experiments", ".", "The", "P", "-", "values", "were", "calculated", "using", "the", "log", "-", "rank", "test", "(", "ΔTYAtg7", "+", "/", "+", "vs", "ΔTYAtg7", "-", "/", "-", ",", "P", "=", "0", ".", "2186", ";", "ΔSTYAtg7", "+", "/", "+", "vs", "ΔSTYAtg7", "-", "/", "-", ",", "P", "=", "0", ".", "0145", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Primary airway epithelial cells were isolated from tracheas of Atg7+/+ and Atg7-/- mouse and were evaluated by immunoblotting.(B) Sections of tracheas from Atg7+/+ and Atg7-/- mouse were evaluated by immunofluorescence microscopy following staining of nuclear DNA with DAPI (Blue), ciliated epithelial cell marker β-tubulin IV (green) and Atg7 (red). Scale bars: 20 µm.(C,D) Atg7+/+ and Atg7-/- mice were intranasally injected with 3 x107 CFU of WT, ΔS, ΔTY or ΔSTY P. aeruginosa. After 24 hours, lungs (C), spleens and livers (D) were harvested, homogenized and diluted for CFU counting. Each data point represents bacterial count (Log10 CFU/g) from individual mouse. The horizontal lines represent the mean value from each group (6 mice each group), error bars represent standard deviation. The significance of differences between different drug treatment was determined using One-way ANOVA and Dunn's multiple comparisons test., NS: not significant; *p ≤ 0.05(E,F) Atg7+/+ and Atg7-/- mice were intranasally injected with PBS with or without 1 x109 CFU of ΔTY (E) ΔSTY (F). Mice survival was monitored for 10 days post infection. Kaplan-Meyer survival curves were made based on the observation of 12-18 mice/group from two independent experiments. The P-values were calculated using the log-rank test (ΔTYAtg7+/+ vs ΔTYAtg7-/-, P = 0.2186; ΔSTYAtg7+/+ vs ΔSTYAtg7-/-, P=0.0145)."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", "A549", "cells", "were", "infected", "for", "4", "hours", "with", "ExoS", "-", "deficient", "P", ".", "aeruginosa", "(", "ΔS", ")", ",", "ExoS", "containing", "P", ".", "aeruginosa", "(", "SWT", ")", ",", "P", ".", "aeruginosa", "containing", "ExoS", "with", "loss", "-", "of", "-", "function", "mutations", "in", "the", "GTPase", "activating", "domain", "(", "SG", "-", "A", "+", ")", ",", "in", "the", "ADP", "-", "ribosylation", "domain", "(", "SG", "+", "A", "-", ")", ",", "or", "in", "both", "domains", "(", "SG", "-", "A", "-", ")", ".", "Cell", "lysates", "were", "evaluated", "by", "immunoblotting", ".", "(", "B", ")", "A549", "cells", "were", "transfected", ",", "for", "24hours", ",", "with", "a", "plasmid", "expressing", "empty", "vector", "(", "EV", ")", ",", "WT", "GFP", "-", "ExoS", ",", "a", "GFP", "-", "ExoS", "mutant", "for", "ADPRT", "domain", "(", "SG", "+", "A", "-", ")", "or", "a", "GFP", "-", "ExoS", "mutant", "deficient", "in", "both", "GAP", "and", "ADPRT", "domains", "(", "SG", "-", "A", "-", ")", ".", "Cell", "lysates", "were", "evaluated", "by", "immunoblotting", ".", "(", "C", ")", "A549", "cells", "were", "treated", "for", "24", "hours", "with", "100", "µM", "of", "the", "ADPRT", "activity", "inhibitor", "MIBG", "and", "then", "left", "uninfected", "(", "NI", ")", "or", "infected", "with", "P", ".", "aeruginosa", "containing", "ExoS", "with", "ADPRT", "activity", "only", "(", "SG", "-", "A", "+", ")", ".", "Cell", "lysates", "were", "evaluated", "by", "immunoblotting", ".", "A549", "cells", "were", "infected", "for", "4", "hours", "with", "WT", "or", "P", ".", "aeruginosa", "mutants", "(", "ΔpscD", "Cell", "lysates", "were", "evaluated", "by", "immunoblotting", ".", "A549", "cells", "were", "infected", "for", "4", "hours", "with", "WT", "or", "P", ".", "aeruginosa", "mutants", "STY", ",", "ΔS", "and", "ΔTY", ")", ".", "Cell", "lysates", "were", "evaluated", "by", "immunoblotting", ".", "F", ")", "A549", "cells", "were", "infected", "for", "4", "hours", "with", "ExoS", "-", "deficient", "P", ".", "aeruginosa", "(", "ΔS", ")", ",", "ExoS", "containing", "P", ".", "aeruginosa", "(", "SWT", ")", ",", "P", ".", "aeruginosa", "containing", "ExoS", "with", "loss", "-", "of", "-", "function", "mutations", "in", "the", "GTPase", "activating", "domain", "(", "SG", "-", "A", "+", ")", ",", "in", "the", "ADP", "-", "ribosylation", "domain", "(", "SG", "+", "A", "-", ")", ",", "or", "in", "both", "domains", "(", "SG", "-", "A", "-", ")", ".", "Cell", "lysates", "were", "evaluated", "by", "immunoblotting", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A A549 cells were infected for 4 hours with ExoS-deficient P. aeruginosa (ΔS), ExoS containing P. aeruginosa (SWT), P. aeruginosa containing ExoS with loss-of-function mutations in the GTPase activating domain (SG-A+), in the ADP-ribosylation domain (SG+A-), or in both domains (SG-A-). Cell lysates were evaluated by immunoblotting.(B) A549 cells were transfected, for 24hours, with a plasmid expressing empty vector (EV), WT GFP-ExoS, a GFP-ExoS mutant for ADPRT domain (SG+A-) or a GFP-ExoS mutant deficient in both GAP and ADPRT domains (SG-A-). Cell lysates were evaluated by immunoblotting.(C) A549 cells were treated for 24 hours with 100 µM of the ADPRT activity inhibitor MIBG and then left uninfected (NI) or infected with P. aeruginosa containing ExoS with ADPRT activity only (SG-A+). Cell lysates were evaluated by immunoblotting.A549 cells were infected for 4 hours with WT or P. aeruginosa mutants (ΔpscD Cell lysates were evaluated by immunoblotting.A549 cells were infected for 4 hours with WT or P. aeruginosa mutants STY, ΔS and ΔTY). Cell lysates were evaluated by immunoblotting.F) A549 cells were infected for 4 hours with ExoS-deficient P. aeruginosa (ΔS), ExoS containing P. aeruginosa (SWT), P. aeruginosa containing ExoS with loss-of-function mutations in the GTPase activating domain (SG-A+), in the ADP-ribosylation domain (SG+A-), or in both domains (SG-A-). Cell lysates were evaluated by immunoblotting."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "A549", "cells", "were", "transfected", "with", "empty", "vector", "(", "VE", ")", "and", "vector", "contains", "Ras", "-", "G12V", "for", "24", "hours", ",", "followed", "by", "a", "4", "-", "hours", "infection", "with", "P", ".", "aeruginosa", "ΔSTY", "or", "ΔTY", ".", "Cell", "lysates", "were", "evaluated", "by", "immunoblotting", ".", "(", "B", ")", "A549", "cells", "were", "transfected", ",", "for", "24", "hours", ",", "with", "empty", "vector", "(", "VE", ")", "and", "vectors", "contain", "Ras", "-", "G12V", "or", "Ras", "-", "G12V", "&", "R41K", "followed", "by", "a", "4", "-", "hours", "infection", "with", "P", ".", "aeruginosa", "ΔSTY", "or", "ΔTY", ".", "Cell", "lysates", "were", "evaluated", "by", "immunoblotting", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) A549 cells were transfected with empty vector (VE) and vector contains Ras-G12V for 24 hours, followed by a 4-hours infection with P. aeruginosa ΔSTY or ΔTY. Cell lysates were evaluated by immunoblotting.(B) A549 cells were transfected, for 24 hours, with empty vector (VE) and vectors contain Ras-G12V or Ras-G12V&R41K followed by a 4-hours infection with P. aeruginosa ΔSTY or ΔTY. Cell lysates were evaluated by immunoblotting."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "A549", "cells", "were", "transfected", ",", "for", "48", "hours", ",", "with", "a", "mCherry", "-", "DFCP1", "plasmid", "and", "then", "infected", ",", "for", "4", "hours", ",", "with", "P", ".", "aeruginosa", "(", "WT", ",", "ΔSTY", ",", "ΔS", ",", "ΔTY", ",", "SG", "-", "A", "-", ",", "SG", "-", "A", "+", "or", "SG", "+", "A", "-", ")", "and", "the", "mCherry", "puncta", "number", "per", "cell", "was", "analyzed", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "Representative", "immunofluorescence", "images", "were", "showed", ",", "and", "scale", "bars", "represent", "10", " ", "µm", ".", "(", "B", ")", "Quantitative", "analysis", "of", "mCherry", "-", "DFCP1", "puncta", "by", "visually", "count", "more", "than", "100", "cells", "for", "each", "sample", ".", "Each", "bar", "represents", "mean", "value", "of", "from", "three", "independent", "experiments", "and", "error", "bars", "represent", "standard", "deviation", ".", "The", "significance", "of", "differences", "between", "assays", "was", "determined", "using", "ANOVA", "with", "Dunnett", "multiple", "-", "comparison", "posttest", ",", "NS", ":", "not", "significant", ";", "*", "p", " ", "≤", " ", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", " ", "≤", " ", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) A549 cells were transfected, for 48 hours, with a mCherry-DFCP1 plasmid and then infected, for 4 hours, with P. aeruginosa (WT, ΔSTY, ΔS, ΔTY, SG-A-, SG-A+ or SG+A-) and the mCherry puncta number per cell was analyzed by fluorescence microscopy. Representative immunofluorescence images were showed, and scale bars represent 10 µm. (B) Quantitative analysis of mCherry-DFCP1 puncta by visually count more than 100 cells for each sample. Each bar represents mean value of from three independent experiments and error bars represent standard deviation. The significance of differences between assays was determined using ANOVA with Dunnett multiple-comparison posttest, NS: not significant; *p ≤ 0.05; **p ≤ 0.01. "}
{"words": ["Figure", "8", "(", "A", "A549", "cells", ",", "transfected", "for", "48", "hours", "with", "vector", "encoding", "Flag", "-", "Atg14L", ",", "were", "infected", "with", "P", ".", "aeruginosa", "(", "WT", ",", "ΔSTY", ",", "ΔS", ",", "ΔTY", "Flag", "-", "Atg14L", "-", "Vps34", "complex", "was", "immunoprecipitated", "(", "IP", ")", "by", "Flag", "-", "antibody", "magnetic", "beads", "and", "evaluated", "by", "immunoblotting", ".", "(", "B", ",", "The", "IP", "complexes", "were", "subjected", "to", "in", "vitro", "kinase", "assay", "using", "phosphatidylinositol", "as", "substrate", ".", "The", "products", "radiolabeled", "PI3P", "were", "separated", "by", "TLC", "and", "detected", "by", "autoradiography", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "The", "significance", "of", "differences", "between", "different", "assays", "was", "determined", "using", "One", "-", "way", "ANOVA", "analysis", "followed", "Dunn", "'", "s", "multiple", "-", "comparison", "posttest", ",", "NS", ":", "not", "significant", ";", "*", "p", " ", "≤", " ", "0", ".", "05", ".", "C", ")", "A549", "cells", ",", "transfected", "for", "48", "hours", "with", "vector", "encoding", "Flag", "-", "Atg14L", ",", "were", "infected", "with", "P", ".", "aeruginosa", ",", "ΔSTY", "SG", "-", "A", "-", ",", "SG", "-", "A", "+", "or", "SG", "+", "A", "-", ")", ".", "Flag", "-", "Atg14L", "-", "Vps34", "complex", "was", "immunoprecipitated", "(", "IP", ")", "by", "Flag", "-", "antibody", "magnetic", "beads", "and", "evaluated", "by", "immunoblotting", ".", "D", ")", "The", "IP", "complexes", "were", "subjected", "to", "in", "vitro", "kinase", "assay", "using", "phosphatidylinositol", "as", "substrate", ".", "The", "products", "radiolabeled", "PI3P", "were", "separated", "by", "TLC", "and", "detected", "by", "autoradiography", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "The", "significance", "of", "differences", "between", "different", "assays", "was", "determined", "using", "One", "-", "way", "ANOVA", "analysis", "followed", "Dunn", "'", "s", "multiple", "-", "comparison", "posttest", ",", "NS", ":", "not", "significant", ";", "*", "p", " ", "≤", " ", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(A A549 cells, transfected for 48 hours with vector encoding Flag-Atg14L, were infected with P. aeruginosa (WT, ΔSTY, ΔS, ΔTY Flag-Atg14L-Vps34 complex was immunoprecipitated (IP) by Flag-antibody magnetic beads and evaluated by immunoblotting.(B, The IP complexes were subjected to in vitro kinase assay using phosphatidylinositol as substrate. The products radiolabeled PI3P were separated by TLC and detected by autoradiography. Data are mean ± SD of three independent experiments. The significance of differences between different assays was determined using One-way ANOVA analysis followed Dunn's multiple-comparison posttest, NS: not significant; *p ≤ 0.05.C) A549 cells, transfected for 48 hours with vector encoding Flag-Atg14L, were infected with P. aeruginosa , ΔSTY SG-A-, SG-A+ or SG+A-). Flag-Atg14L-Vps34 complex was immunoprecipitated (IP) by Flag-antibody magnetic beads and evaluated by immunoblotting.D) The IP complexes were subjected to in vitro kinase assay using phosphatidylinositol as substrate. The products radiolabeled PI3P were separated by TLC and detected by autoradiography. Data are mean ± SD of three independent experiments. The significance of differences between different assays was determined using One-way ANOVA analysis followed Dunn's multiple-comparison posttest, NS: not significant; *p ≤ 0.05."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "UBQLN4", "associates", "with", "polyubiquitinated", "proteasomal", "substrates", ".", "Flag", "-", "tagged", "UBQLN4", "protein", "was", "affinity", "-", "purified", "from", "extracts", "of", "HeLa", "cells", "that", "were", "treated", "with", "(", "+", ")", "or", "without", "(", "-", ")", "20", "μM", "MG", "-", "132", "for", "4", "h", "before", "harvesting", ",", "and", "the", "Flag", "-", "precipitates", "(", "IP", ":", "Flag", ")", "were", "blotted", "with", "anti", "-", "polyubiquitin", "(", "FK2", ")", ",", "anti", "-", "BAG6", ",", "and", "anti", "-", "Flag", "antibodies", ".", "Mock", "indicates", "empty", "vector", "transfection", ".", "Note", "that", "UBQLN4", "-", "BAG6", "co", "-", "precipitation", "can", "be", "observed", "exclusively", "in", "the", "presence", "of", "polyubiquitinated", "substrates", ".", "(", "B", ")", "Polyubiquitinated", "proteins", "associated", "with", "UBQLN4", "are", "sensitive", "to", "the", "translation", "inhibitor", "cycloheximide", "(", "CHX", ")", ".", "HeLa", "cells", "expressing", "Flag", "-", "tagged", "UBQLN4", "were", "treated", "with", "5", "μM", "MG", "-", "132", "as", "well", "as", "CHX", "(", "either", "10", "or", "25", "μg", "/", "mL", ")", "for", "4", "h", "as", "indicated", ",", "and", "then", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "with", "an", "anti", "-", "Flag", "antibody", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "(", "D", ")", "HeLa", "cells", "were", "treated", "as", "in", "(", "C", ")", ",", "and", "Flag", "-", "precipitates", "were", "blotted", "as", "in", "(", "B", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) UBQLN4 associates with polyubiquitinated proteasomal substrates. Flag-tagged UBQLN4 protein was affinity-purified from extracts of HeLa cells that were treated with (+) or without (-) 20 μM MG-132 for 4 h before harvesting, and the Flag-precipitates (IP:Flag) were blotted with anti-polyubiquitin (FK2), anti-BAG6, and anti-Flag antibodies. Mock indicates empty vector transfection. Note that UBQLN4-BAG6 co-precipitation can be observed exclusively in the presence of polyubiquitinated substrates.(B) Polyubiquitinated proteins associated with UBQLN4 are sensitive to the translation inhibitor cycloheximide (CHX). HeLa cells expressing Flag-tagged UBQLN4 were treated with 5 μM MG-132 as well as CHX (either 10 or 25 μg/mL) for 4 h as indicated, and then subjected to immunoprecipitation with an anti-Flag antibody as in (A).(D) HeLa cells were treated as in (C), and Flag-precipitates were blotted as in (B)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "UBQLN4", "co", "-", "localizes", "with", "cytoplasmic", "aggregates", "after", "puromycin", "treatment", ".", "HeLa", "cells", "expressing", "Flag", "-", "tagged", "UBQLN4", "were", "treated", "with", "5", "µg", "/", "mL", "puromycin", "for", "2", "h", "and", "then", "followed", "by", "1", "%", "Triton", "X", "-", "100", "extraction", "and", "4", "%", "paraformaldehyde", "fixation", ".", "Fixed", "cells", "were", "stained", "with", "anti", "-", "polyubiquitin", "FK2", "(", "shown", "in", "red", "to", "detect", "ubiquitin", "-", "positive", "cytoplasmic", "aggregates", ",", "ALIS", ")", "and", "anti", "-", "Flag", "antibodies", "(", "shown", "in", "green", ")", ".", "(", "B", ",", "C", ")", "Puromycin", "-", "treated", "cells", "with", "UBQLN4", "siRNA", "contain", "increased", "number", "of", "ALIS", ".", "At", "72", "h", "after", "transfection", "of", "the", "two", "distinct", "siRNA", "duplexes", "for", "UBQLN4", "(", "UBQLN4", "siRNA", "#", "1", "and", "#", "2", ")", "or", "control", "siRNA", "(", "5", "nM", "each", ")", ",", "the", "cells", "were", "treated", "with", "5", "µg", "/", "mL", "puromycin", "for", "2", "h", ",", "and", "then", "subjected", "to", "immunostaining", "with", "an", "anti", "-", "polyubiquitin", "FK2", "antibody", "(", "shown", "in", "green", ",", "B", ")", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "The", "number", "of", "ALIS", "was", "determined", ".", "The", "quantified", "data", "in", "(", "C", ")", "represent", "mean", "±", "SEM", ".", "n", "=", "76", "cells", "for", "control", "siRNA", ",", "n", "=", "89", "cells", "for", "UBQLN4", "siRNA", "#", "1", ",", "and", "n", "=", "81", "cells", "for", "UBQLN4", "siRNA", "#", "2", ".", "P", "‐", "values", "were", "calculated", "by", "Welch", "'", "s", "t", "-", "test", "between", "the", "siRNA", "‐", "transfected", "and", "the", "respective", "control", "condition", "(", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "(", "B", ",", "C", ")", "Puromycin", "-", "treated", "cells", "with", "UBQLN4", "siRNA", "contain", "increased", "number", "of", "ALIS", ".", "At", "72", "h", "after", "transfection", "of", "the", "two", "distinct", "siRNA", "duplexes", "for", "UBQLN4", "(", "UBQLN4", "siRNA", "#", "1", "and", "#", "2", ")", "or", "control", "siRNA", "(", "5", "nM", "each", ")", ",", "the", "cells", "were", "treated", "with", "5", "µg", "/", "mL", "puromycin", "for", "2", "h", ",", "and", "then", "subjected", "to", "immunostaining", "with", "an", "anti", "-", "polyubiquitin", "FK2", "antibody", "(", "shown", "in", "green", ",", "B", ")", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "The", "number", "of", "ALIS", "was", "determined", ".", "The", "quantified", "data", "in", "(", "C", ")", "represent", "mean", "±", "SEM", ".", "n", "=", "76", "cells", "for", "control", "siRNA", ",", "n", "=", "89", "cells", "for", "UBQLN4", "siRNA", "#", "1", ",", "and", "n", "=", "81", "cells", "for", "UBQLN4", "siRNA", "#", "2", ".", "P", "‐", "values", "were", "calculated", "by", "Welch", "'", "s", "t", "-", "test", "between", "the", "siRNA", "‐", "transfected", "and", "the", "respective", "control", "condition", "(", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "(", "D", ")", "Depletion", "of", "UBQLN4", "makes", "HeLa", "cells", "more", "sensitive", "to", "puromycin", "-", "induced", "cell", "death", ".", "After", "48", "h", "of", "UBQLN4", "siRNA", "treatment", ",", "the", "cells", "were", "treated", "with", "5", "µg", "/", "mL", "puromycin", "for", "15", ".", "5", "h", "and", "then", "viability", "was", "measured", ".", "The", "data", "represent", "mean", "±", "SD", "calculated", "from", "3", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "P", "‐", "values", "were", "calculated", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "compared", "with", "puromycin", "-", "treated", "control", "siRNA", "cells", "(", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) UBQLN4 co-localizes with cytoplasmic aggregates after puromycin treatment. HeLa cells expressing Flag-tagged UBQLN4 were treated with 5 µg/mL puromycin for 2 h and then followed by 1% Triton X-100 extraction and 4% paraformaldehyde fixation. Fixed cells were stained with anti-polyubiquitin FK2 (shown in red to detect ubiquitin-positive cytoplasmic aggregates, ALIS) and anti-Flag antibodies (shown in green).(B, C) Puromycin-treated cells with UBQLN4 siRNA contain increased number of ALIS. At 72 h after transfection of the two distinct siRNA duplexes for UBQLN4 (UBQLN4 siRNA#1 and #2) or control siRNA (5 nM each), the cells were treated with 5 µg/mL puromycin for 2 h, and then subjected to immunostaining with an anti-polyubiquitin FK2 antibody (shown in green, B) as in (A). The number of ALIS was determined. The quantified data in (C) represent mean ± SEM. n = 76 cells for control siRNA, n = 89 cells for UBQLN4 siRNA#1, and n = 81 cells for UBQLN4 siRNA #2. P‐values were calculated by Welch's t-test between the siRNA‐transfected and the respective control condition (*P < 0.01).(B, C) Puromycin-treated cells with UBQLN4 siRNA contain increased number of ALIS. At 72 h after transfection of the two distinct siRNA duplexes for UBQLN4 (UBQLN4 siRNA#1 and #2) or control siRNA (5 nM each), the cells were treated with 5 µg/mL puromycin for 2 h, and then subjected to immunostaining with an anti-polyubiquitin FK2 antibody (shown in green, B) as in (A). The number of ALIS was determined. The quantified data in (C) represent mean ± SEM. n = 76 cells for control siRNA, n = 89 cells for UBQLN4 siRNA#1, and n = 81 cells for UBQLN4 siRNA #2. P‐values were calculated by Welch's t-test between the siRNA‐transfected and the respective control condition (*P < 0.01).(D) Depletion of UBQLN4 makes HeLa cells more sensitive to puromycin-induced cell death. After 48 h of UBQLN4 siRNA treatment, the cells were treated with 5 µg/mL puromycin for 15.5 h and then viability was measured. The data represent mean ± SD calculated from 3 independent experiments (n=3). P‐values were calculated by Student's t-test compared with puromycin-treated control siRNA cells (*P < 0.01)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", ")", "IL", "-", "2Rα", "ΔSS", "mislocalized", "to", "the", "cytosolic", "fraction", ".", "HeLa", "cells", ",", "expressing", "Flag", "-", "tagged", "IL", "-", "2Rα", "WT", "or", "ΔSS", ",", "were", "fractionated", "to", "the", "cytosolic", "(", "Cyt", ".", ")", "and", "membrane", "(", "Mem", ".", ")", "fractions", ".", "Tubulin", "was", "used", "as", "a", "cytoplasmic", "marker", ",", "while", "calnexin", "was", "used", "for", "the", "ER", "membrane", "fraction", ".", "(", "C", ")", "IL", "-", "2Rα", "ΔSS", "was", "not", "glycosylated", ".", "Flag", "-", "tagged", "IL", "-", "2Rα", "WT", "or", "ΔSS", "proteins", "was", "expressed", "in", "HeLa", "cells", ",", "and", "immunoprecipitated", "with", "an", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "The", "precipitates", "were", "incubated", "with", "(", "+", ")", "or", "without", "(", "-", ")", "10", "unit", "of", "the", "deglycosylation", "enzyme", "PNGase", "F", "for", "2", "h", ",", "and", "subjected", "to", "western", "blot", "analysis", "with", "an", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "Glycosylated", "and", "non", "-", "glycosylated", "signals", "are", "indicated", ".", "(", "D", ")", "The", "glycosylated", "form", "of", "IL", "-", "2Rα", "WT", "is", "a", "stable", "protein", ",", "while", "mislocalized", "IL", "-", "2Rα", "ΔSS", "is", "degraded", "rapidly", "via", "its", "TMD", ".", "A", "series", "of", "IL", "-", "2Ra", "deletion", "proteins", "were", "expressed", "in", "HeLa", "cells", "and", "then", "chased", "with", "20", "μg", "/", "mL", "CHX", "for", "the", "indicated", "periods", ".", "Actin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "The", "right", "panel", "is", "a", "quantified", "graph", "of", "the", "left", "blot", "signals", "represent", "mean", "±", "SD", "calculated", "from", "4", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "(", "E", ")", "IL", "-", "2Rα", "ΔSS", "is", "degraded", "in", "a", "proteasome", "-", "dependent", "manner", ".", "HeLa", "cells", "expressing", "Flag", "-", "tagged", "IL", "-", "2Rα", "ΔSS", "were", "treated", "with", "20", "μg", "/", "mL", "CHX", "as", "well", "as", "0", ".", "1", "%", "DMSO", "(", "DM", ".", ")", ",", "10", "μM", "MG", "-", "132", "(", "MG", ".", ")", ",", "2", "μM", "Bortezomib", "(", "Bor", ".", ")", ",", "10", "μM", "Leupeptin", "(", "Leu", ".", ")", ",", "0", ".", "1", "μM", "Bafilomycin", "A1", "(", "Baf", ".", ")", ",", "or", "10", "μg", "/", "ml", "Pepstatin", "A", "(", "pep", ".", "A", ")", "/", "E64d", "for", "the", "indicated", "periods", ".", "The", "right", "panel", "indicates", "that", "the", "quantified", "data", "of", "the", "left", "blot", "signals", "represent", "mean", "±", "SD", "calculated", "from", "3", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "F", ")", "The", "Flag", "-", "tagged", "IL", "-", "2Rα", "ΔSS", "mutant", "and", "T7", "-", "tagged", "ubiquitin", "were", "co", "-", "expressed", "in", "HeLa", "cells", "and", "the", "cells", "were", "treated", "with", "(", "+", ")", "or", "without", "(", "-", ")", "10", "μM", "MG", "-", "132", ".", "After", "4", "h", ",", "Flag", "-", "precipitates", "were", "blotted", "with", "anti", "-", "T7", "and", "anti", "-", "Flag", "antibodies", ".", "(", "G", ")", "HeLa", "cells", "expressing", "Flag", "-", "tagged", "IL", "-", "2RaWT", ",", "ΔSS", ",", "and", "ΔSSΔTM", "proteins", "were", "treated", "with", "(", "+", ")", "or", "without", "(", "-", ")", "10", "μM", "MG", "-", "132", ".", "At", "4", "h", "after", "MG", "-", "132", "treatment", ",", "the", "cells", "were", "lysed", "and", "analyzed", "by", "immunoblotting", "using", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Note", "that", "a", "higher", "migrating", "form", "of", "non", "-", "glycosylated", "(", "and", "thus", "defective", ")", "IL", "-", "2Ra", "WT", "(", "indicated", "by", "the", "arrowhead", ")", "is", "detected", "strongly", "in", "the", "presence", "of", "MG", "-", "132", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(B) IL-2Rα ΔSS mislocalized to the cytosolic fraction. HeLa cells, expressing Flag-tagged IL-2Rα WT or ΔSS, were fractionated to the cytosolic (Cyt.) and membrane (Mem.) fractions. Tubulin was used as a cytoplasmic marker, while calnexin was used for the ER membrane fraction.(C) IL-2Rα ΔSS was not glycosylated. Flag-tagged IL-2Rα WT or ΔSS proteins was expressed in HeLa cells, and immunoprecipitated with an anti-Flag antibody. The precipitates were incubated with (+) or without (-) 10 unit of the deglycosylation enzyme PNGase F for 2 h, and subjected to western blot analysis with an anti-Flag antibody. Glycosylated and non-glycosylated signals are indicated.(D) The glycosylated form of IL-2Rα WT is a stable protein, while mislocalized IL-2Rα ΔSS is degraded rapidly via its TMD. A series of IL-2Ra deletion proteins were expressed in HeLa cells and then chased with 20 μg/mL CHX for the indicated periods. Actin was used as a loading control. The right panel is a quantified graph of the left blot signals represent mean ± SD calculated from 4 independent experiments (n=4).(E) IL-2Rα ΔSS is degraded in a proteasome-dependent manner. HeLa cells expressing Flag-tagged IL-2Rα ΔSS were treated with 20 μg/mL CHX as well as 0.1% DMSO (DM.), 10 μM MG-132 (MG.), 2 μM Bortezomib (Bor.), 10 μM Leupeptin (Leu.), 0.1 μM Bafilomycin A1 (Baf.), or 10 μg/ml Pepstatin A (pep. A)/E64d for the indicated periods. The right panel indicates that the quantified data of the left blot signals represent mean ± SD calculated from 3 independent experiments (n=3).(F) The Flag-tagged IL-2Rα ΔSS mutant and T7-tagged ubiquitin were co-expressed in HeLa cells and the cells were treated with (+) or without (-) 10 μM MG-132. After 4 h, Flag-precipitates were blotted with anti-T7 and anti-Flag antibodies.(G) HeLa cells expressing Flag-tagged IL-2RaWT, ΔSS, and ΔSSΔTM proteins were treated with (+) or without (-) 10 μM MG-132. At 4 h after MG-132 treatment, the cells were lysed and analyzed by immunoblotting using the indicated antibodies. Note that a higher migrating form of non-glycosylated (and thus defective) IL-2Ra WT (indicated by the arrowhead) is detected strongly in the presence of MG-132."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ",", "B", ")", "IL", "-", "2Rα", "ΔSS", "is", "stabilized", "in", "UBQLN4", "-", "knockdown", "cells", ".", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "three", "distinct", "siRNA", "duplexes", "for", "UBQLN4", "(", "UBQLN4", "siRNA", "#", "1", "~", "#", "3", ")", "or", "control", "siRNA", ".", "At", "48", "h", "after", "siRNA", "transfection", ",", "Flag", "tagged", "-", "IL", "-", "2Rα", "ΔSS", "was", "expressed", "in", "the", "cells", ".", "At", "24", "h", "after", "IL", "-", "2RaSS", "transfection", ",", "the", "cells", "were", "chased", "with", "20", "μg", "/", "mL", "CHX", "and", "harvested", "at", "the", "indicated", "time", "after", "CHX", "addition", ".", "Anti", "-", "Flag", "signals", "in", "the", "control", "or", "UBQLN4", "siRNA", "-", "treated", "cells", "(", "siRNA", "#", "1", "~", "#", "3", ")", "were", "quantified", "at", "the", "indicated", "time", "points", ".", "The", "data", "represent", "mean", "±", "SEM", "calculated", "from", "4", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "The", "UBQLN4", "signal", "is", "marked", "by", "an", "arrowhead", ",", "while", "the", "band", "just", "below", "it", "(", "indicated", "by", "an", "asterisk", ")", "is", "a", "non", "-", "specific", "band", ",", "since", "this", "signal", "was", "never", "affected", "by", "any", "of", "the", "UBQLN4", "siRNAs", ".", "Actin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "(", "C", ")", "Polyubiquitin", "modification", "of", "IL", "-", "2Rα", "ΔSS", "was", "not", "diminished", ",", "but", "rather", "strengthened", ",", "in", "UBQLN4", "knockdown", "cells", ".", "At", "48", "h", "after", "transfection", "of", "HeLa", "cells", "with", "siRNA", "for", "UBQLN4", "or", "BAG6", ",", "Flag", "-", "tagged", "IL", "-", "2Rα", "ΔSS", "and", "T7", "-", "tagged", "ubiquitin", "were", "expressed", "with", "(", "+", ")", "or", "without", "(", "-", ")", "10", "mM", "MG", "-", "132", ".", "From", "these", "cells", ",", "Flag", "-", "tagged", "IL", "-", "2Rα", "ΔSS", "was", "affinity", "-", "purified", "using", "Hot", "lysis", "analysis", ",", "and", "Flag", "-", "precipitates", "were", "blotted", "with", "an", "anti", "-", "T7", "antibody", "to", "detect", "polyubiquitination", "of", "IL", "-", "2Rα", "ΔSS", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A, B) IL-2Rα ΔSS is stabilized in UBQLN4-knockdown cells. HeLa cells were transfected with three distinct siRNA duplexes for UBQLN4 (UBQLN4 siRNA#1~#3) or control siRNA. At 48 h after siRNA transfection, Flag tagged-IL-2Rα ΔSS was expressed in the cells. At 24 h after IL-2RaSS transfection, the cells were chased with 20 μg/mL CHX and harvested at the indicated time after CHX addition. Anti-Flag signals in the control or UBQLN4 siRNA-treated cells (siRNA#1~#3) were quantified at the indicated time points. The data represent mean ± SEM calculated from 4 independent experiments (n=4). The UBQLN4 signal is marked by an arrowhead, while the band just below it (indicated by an asterisk) is a non-specific band, since this signal was never affected by any of the UBQLN4 siRNAs. Actin was used as a loading control.(C) Polyubiquitin modification of IL-2Rα ΔSS was not diminished, but rather strengthened, in UBQLN4 knockdown cells. At 48 h after transfection of HeLa cells with siRNA for UBQLN4 or BAG6, Flag-tagged IL-2Rα ΔSS and T7-tagged ubiquitin were expressed with (+) or without (-) 10 mM MG-132. From these cells, Flag-tagged IL-2Rα ΔSS was affinity-purified using Hot lysis analysis, and Flag-precipitates were blotted with an anti-T7 antibody to detect polyubiquitination of IL-2Rα ΔSS."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "A", "series", "of", "Flag", "-", "tagged", "truncated", "mutants", "of", "IL", "-", "2Ra", "substrates", "were", "expressed", "in", "HeLa", "cells", "with", "T7", "-", "tagged", "UBQLN4", "and", "treated", "with", "(", "+", ")", "or", "without", "(", "-", ")", "10", "µM", "MG", "-", "132", "for", "4", "h", ".", "Flag", "-", "IL", "-", "2Ra", "substrates", "were", "immunoprecipitated", "and", "their", "co", "-", "precipitation", "with", "UBQLN4", "was", "analyzed", ".", "(", "B", ")", "T7", "-", "UBQLN4", "was", "immunoprecipitated", ",", "and", "its", "interactions", "with", "a", "series", "of", "IL", "-", "2Ra", "proteins", "were", "detected", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) A series of Flag-tagged truncated mutants of IL-2Ra substrates were expressed in HeLa cells with T7-tagged UBQLN4 and treated with (+) or without (-) 10 µM MG-132 for 4 h. Flag-IL-2Ra substrates were immunoprecipitated and their co-precipitation with UBQLN4 was analyzed.(B) T7-UBQLN4 was immunoprecipitated, and its interactions with a series of IL-2Ra proteins were detected."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "B", ")", "UBQLN4", "dominantly", "co", "-", "precipitates", "IL", "-", "2Rα", "ΔSS", "over", "UBQLN1", ".", "Precipitates", "of", "Flag", "-", "tagged", "UBQLN1", "or", "UBQLN4", "from", "HeLa", "cell", "lysates", "were", "probed", "with", "IL", "-", "2Rα", "ΔSS", ".", "(", "C", ")", "The", "complete", "amino", "acid", "sequences", "of", "human", "UBQLN1", "and", "UBQLN4", "were", "analyzed", "using", "the", "disorder", "/", "order", "structure", "prediction", "program", "PONDR", "-", "FIT", ".", "The", "STI", "-", "II", "region", "of", "UBQLN4", "is", "indicated", "by", "the", "red", "box", ",", "and", "that", "of", "UBQLN1", "is", "boxed", "blue", ".", "Note", "that", "the", "disorder", "tendency", "of", "the", "UBL", ",", "STI", "-", "I", ",", "and", "UBA", "regions", "is", "nearly", "identical", "between", "UBQLN1", "and", "UBQLN4", "(", "indicated", "by", "black", "and", "green", "boxes", ")", ",", "while", "that", "of", "the", "STI", "-", "II", "region", "is", "quite", "distinct", ",", "and", "the", "STI", "-", "II", "of", "UBQLN4", "shows", "a", "high", "probability", "of", "an", "ordered", "structure", ".", "The", "numbers", "denote", "the", "corresponding", "amino", "acid", "positions", "in", "these", "proteins", ".", "(", "E", ")", "Substitution", "of", "the", "STI", "-", "II", "sequence", "of", "UBQLN4", "with", "that", "of", "UBQLN1", "(", "designated", "as", "the", "4", "-", "STI", "-", "II", "-", "1", "mutant", "protein", ")", "abolished", "its", "high", "affinity", "to", "the", "IL", "-", "2Rα", "ΔSS", "client", "protein", ".", "(", "F", ")", "Substitution", "of", "the", "STI", "-", "II", "sequence", "of", "UBQLN1", "with", "that", "of", "UBQLN4", "(", "designated", "as", "the", "1", "-", "STI", "-", "II", "-", "4", ")", "did", "not", "enable", "UBQLN1", "to", "recognize", "IL", "-", "2Rα", "ΔSS", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(B) UBQLN4 dominantly co-precipitates IL-2Rα ΔSS over UBQLN1. Precipitates of Flag-tagged UBQLN1 or UBQLN4 from HeLa cell lysates were probed with IL-2Rα ΔSS.(C) The complete amino acid sequences of human UBQLN1 and UBQLN4 were analyzed using the disorder/order structure prediction program PONDR-FIT. The STI-II region of UBQLN4 is indicated by the red box, and that of UBQLN1 is boxed blue. Note that the disorder tendency of the UBL, STI-I, and UBA regions is nearly identical between UBQLN1 and UBQLN4 (indicated by black and green boxes), while that of the STI-II region is quite distinct, and the STI-II of UBQLN4 shows a high probability of an ordered structure. The numbers denote the corresponding amino acid positions in these proteins.(E) Substitution of the STI-II sequence of UBQLN4 with that of UBQLN1 (designated as the 4-STI-II-1 mutant protein) abolished its high affinity to the IL-2Rα ΔSS client protein.(F) Substitution of the STI-II sequence of UBQLN1 with that of UBQLN4 (designated as the 1-STI-II-4) did not enable UBQLN1 to recognize IL-2Rα ΔSS."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "B", ",", "C", "and", "D", ")", "The", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "form", "of", "Flag", "-", "tagged", "UBQLN4", "and", "its", "truncated", "derivatives", "were", "expressed", "in", "HeLa", "cells", "with", "T7", "-", "tagged", "IL", "-", "2RαΔSS", "(", "B", "and", "C", ")", ".", "At", "4", "h", "after", "the", "addition", "of", "10", "μM", "MG", "-", "132", ",", "UBQLN4", "was", "immunoprecipitated", "with", "an", "anti", "-", "Flag", "antibody", "and", "the", "precipitates", "were", "blotted", "with", "an", "anti", "-", "T7", "antibody", ".", "(", "B", ",", "C", "and", "D", ")", "The", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "form", "of", "Flag", "-", "tagged", "UBQLN4", "and", "its", "truncated", "derivatives", "were", "expressed", "in", "HeLa", "cells", "with", "T7", "-", "tagged", "IL", "-", "2Rα", "ΔSS", "(", "B", "and", "C", ")", "and", "T7", "-", "tagged", "ubiquitin", "(", "D", ")", ".", "At", "4", "h", "after", "the", "addition", "of", "10", "μM", "MG", "-", "132", ",", "UBQLN4", "was", "immunoprecipitated", "with", "an", "anti", "-", "Flag", "antibody", "and", "the", "precipitates", "were", "blotted", "with", "an", "anti", "-", "T7", "antibody", ".", "(", "E", ")", "GST", "-", "tagged", "and", "purified", "UBQLN4", "and", "its", "truncated", "derivatives", "(", "ΔUBA", "and", "ΔSTI", "-", "II", ")", "were", "incubated", "with", "K48", "-", "linked", "polyubiquitin", "chains", ".", "After", "in", "vitro", "GST", "pull", "-", "down", ",", "the", "precipitates", "were", "probed", "with", "an", "anti", "-", "polyubiquitin", "(", "FK2", ")", "antibody", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(B, C and D) The wild-type (WT) form of Flag-tagged UBQLN4 and its truncated derivatives were expressed in HeLa cells with T7-tagged IL-2RαΔSS (B and C). At 4 h after the addition of 10 μM MG-132, UBQLN4 was immunoprecipitated with an anti-Flag antibody and the precipitates were blotted with an anti-T7 antibody.(B, C and D) The wild-type (WT) form of Flag-tagged UBQLN4 and its truncated derivatives were expressed in HeLa cells with T7-tagged IL-2Rα ΔSS (B and C) and T7-tagged ubiquitin (D). At 4 h after the addition of 10 μM MG-132, UBQLN4 was immunoprecipitated with an anti-Flag antibody and the precipitates were blotted with an anti-T7 antibody.(E) GST-tagged and purified UBQLN4 and its truncated derivatives (ΔUBA and ΔSTI-II) were incubated with K48-linked polyubiquitin chains. After in vitro GST pull-down, the precipitates were probed with an anti-polyubiquitin (FK2) antibody."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "A", ")", "UBQLN4", "interacts", "with", "non", "-", "glycosylated", "(", "and", "thus", "defective", ")", "IL", "-", "2Ra", "WT", "in", "SRP54", "-", "knockdown", "cells", ".", "After", "treatment", "of", "HeLa", "cells", "with", "SRP54", "siRNA", "(", "10", "nM", ")", "for", "48", "h", ",", "Flag", "-", "tagged", "IL", "-", "2RaWT", "and", "T7", "-", "tagged", "UBQLN4", "proteins", "were", "expressed", ",", "and", "the", "cells", "were", "treated", "with", "(", "+", ")", "or", "without", "(", "-", ")", "10", "µM", "MG", "-", "132", "at", "4", "h", "before", "harvesting", ".", "UBQLN4", "was", "affinity", "-", "purified", "from", "cell", "extracts", "and", "probed", "with", "an", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "Note", "that", "the", "levels", "of", "non", "-", "glycosylated", "IL", "-", "2RaWT", "(", "indicated", "as", "Defective", ")", "increased", ",", "while", "the", "glycosylated", "form", "of", "this", "protein", "(", "indicated", "as", "Assembled", ")", "decreased", "in", "SRP54", "knockdown", "cells", ".", "(", "B", ",", "C", ")", "SRP54", "knockdown", "stimulates", "polyubiquitinated", "proteins", "co", "-", "precipitation", "of", "UBQLN4", ".", "Flag", "-", "tagged", "UBQLN4", "and", "T7", "-", "tagged", "ubiquitin", "were", "expressed", "in", "SRP54", "siRNA", "-", "treated", "cells", ",", "and", "Flag", "precipitates", "were", "probed", "with", "an", "anti", "-", "T7", "antibody", "to", "detect", "polyubiquitinated", "clients", "co", "-", "precipitation", "with", "UBQLN4", "under", "no", "addition", "of", "MG", "-", "132", "(", "B", ")", ".", "Note", "that", "the", "interaction", "of", "UBQLN4", "with", "polyubiquitinated", "substrates", "was", "further", "increased", "in", "SRP54", "knockdown", "cells", "treated", "with", "MG", "-", "132", "for", "4", "h", "before", "harvesting", "(", "C", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(A) UBQLN4 interacts with non-glycosylated (and thus defective) IL-2Ra WT in SRP54-knockdown cells. After treatment of HeLa cells with SRP54 siRNA (10 nM) for 48 h, Flag-tagged IL-2RaWT and T7-tagged UBQLN4 proteins were expressed, and the cells were treated with (+) or without (-) 10 µM MG-132 at 4 h before harvesting. UBQLN4 was affinity-purified from cell extracts and probed with an anti-Flag antibody. Note that the levels of non-glycosylated IL-2RaWT (indicated as Defective) increased, while the glycosylated form of this protein (indicated as Assembled) decreased in SRP54 knockdown cells.(B, C) SRP54 knockdown stimulates polyubiquitinated proteins co-precipitation of UBQLN4. Flag-tagged UBQLN4 and T7-tagged ubiquitin were expressed in SRP54 siRNA-treated cells, and Flag precipitates were probed with an anti-T7 antibody to detect polyubiquitinated clients co-precipitation with UBQLN4 under no addition of MG-132 (B). Note that the interaction of UBQLN4 with polyubiquitinated substrates was further increased in SRP54 knockdown cells treated with MG-132 for 4 h before harvesting (C)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "expression", "of", "FUS", "does", "not", "alter", "expression", "of", "VAPB", ",", "PTPIP51", "or", "mitofusin", "-", "2", "(", "MFN2", ")", "in", "transfected", "NSC34", "cells", ".", "Immunoblots", "of", "NSC34", "cells", "transfected", "with", "EGFP", "as", "a", "control", "(", "CTRL", ")", ",", "or", "wild", "-", "type", "or", "mutant", "EGFP", "-", "FUS", ".", "Transfected", "cells", "were", "purified", "via", "EGFP", "using", "a", "cell", "sorter", "and", "the", "samples", "probed", "on", "immunoblots", "as", "indicated", ".", "On", "the", "FUS", "immunoblot", ",", "samples", "were", "probed", "with", "FUS", "antibody", "to", "show", "endogenous", "and", "transfected", "proteins", ";", "tubulin", "is", "shown", "as", "a", "loading", "control", ".", "(", "B", ")", "representative", "electron", "microscopy", "of", "ER", "-", "mitochondria", "associations", "in", "NSC34", "cells", "transfected", "with", "control", "EGFP", "vector", "(", "CTRL", ")", ",", "EGFP", "-", "FUS", ",", "EGFP", "-", "FUSR521C", "or", "EGFP", "-", "FUSR518K", "as", "indicated", ";", "arrowheads", "with", "loops", "show", "regions", "of", "association", ".", "Scale", "bar", "=", "200", "nm", ".", "Bar", "chart", "shows", "%", "of", "the", "mitochondrial", "surface", "closely", "apposed", "to", "ER", "in", "the", "different", "samples", ".", "Data", "were", "analysed", "by", "one", "-", "way", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ".", "N", "=", "27", "-", "30", "cells", "and", "247", "-", "424", "mitochondria", ",", "error", "bars", "are", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "C", "and", "D", ")", "siRNA", "loss", "of", "FUS", "does", "not", "affect", "ER", "-", "mitochondria", "associations", "or", "alter", "expression", "of", "VAPB", ",", "PTPIP51", "or", "mitofusin", "-", "2", "(", "MFN2", ")", "in", "NSC34", "cells", ".", "(", "C", ")", "immunoblots", "of", "cells", "either", "mock", "transfected", "or", "treated", "with", "control", "(", "CTRL", ")", "or", "FUS", "siRNAs", ";", "GAPDH", "is", "shown", "as", "a", "loading", "control", ".", "(", "C", "and", "D", ")", "siRNA", "loss", "of", "FUS", "does", "not", "affect", "ER", "-", "mitochondria", "associations", "or", "alter", "expression", "of", "VAPB", ",", "PTPIP51", "or", "mitofusin", "-", "2", "(", "MFN2", ")", "in", "NSC34", "cells", ".", "(", "D", ")", "representative", "electron", "microscopy", "of", "ER", "-", "mitochondria", "associations", "in", "control", "(", "CTRL", ")", "and", "FUS", "siRNA", "treated", "cells", ".", "Arrowheads", "with", "loops", "show", "regions", "of", "association", ".", "Scale", "bar", "=", "200", "nm", ".", "Data", "analysed", "by", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "N", "=", "27", "-", "28", "cells", "and", "193", "-", "202", "mitochondria", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) expression of FUS does not alter expression of VAPB, PTPIP51 or mitofusin-2 (MFN2) in transfected NSC34 cells. Immunoblots of NSC34 cells transfected with EGFP as a control (CTRL), or wild-type or mutant EGFP-FUS. Transfected cells were purified via EGFP using a cell sorter and the samples probed on immunoblots as indicated. On the FUS immunoblot, samples were probed with FUS antibody to show endogenous and transfected proteins; tubulin is shown as a loading control.(B) representative electron microscopy of ER-mitochondria associations in NSC34 cells transfected with control EGFP vector (CTRL), EGFP-FUS, EGFP-FUSR521C or EGFP-FUSR518K as indicated; arrowheads with loops show regions of association. Scale bar=200 nm. Bar chart shows % of the mitochondrial surface closely apposed to ER in the different samples. Data were analysed by one-way analysis of variance (ANOVA) followed by Tukey's multiple comparison test. N=27-30 cells and 247-424 mitochondria, error bars are s.e.m.; ***p<0.001.(C and D) siRNA loss of FUS does not affect ER-mitochondria associations or alter expression of VAPB, PTPIP51 or mitofusin-2 (MFN2) in NSC34 cells. (C) immunoblots of cells either mock transfected or treated with control (CTRL) or FUS siRNAs; GAPDH is shown as a loading control.(C and D) siRNA loss of FUS does not affect ER-mitochondria associations or alter expression of VAPB, PTPIP51 or mitofusin-2 (MFN2) in NSC34 cells. (D) representative electron microscopy of ER-mitochondria associations in control (CTRL) and FUS siRNA treated cells. Arrowheads with loops show regions of association. Scale bar=200 nm. Data analysed by unpaired t-test. N=27-28 cells and 193-202 mitochondria."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "FU", "-", "induced", "reductions", "in", "ER", "-", "mitochondria", "associations", "can", "be", "detected", "using", "SIM", ".", "NSC34", "cells", "were", "transfected", "with", "either", "EGFP", "control", "vector", ",", "EGFP", "-", "FUS", ",", "EGFP", "-", "FUSR521C", "or", "EGFP", "-", "FUSR518K", "and", "immunostained", "for", "TOM20", "and", "PDI", "to", "label", "mitochondria", "(", "Mito", ")", "and", "ER", "respectively", ";", "FUS", "were", "detected", "via", "their", "EGFP", "tags", ".", "Merge", "(", "ZOOM", ")", "show", "zoomed", "images", "of", "boxed", "regions", "and", "co", "-", "localisation", "shows", "co", "-", "localised", "pixels", ".", "Scale", "bar", "=", "2", "m", ".", "Bar", "chart", "shows", "ER", "-", "mitochondria", "co", "-", "localisation", "(", "Manders", "coefficient", ")", "normalized", "to", "control", "in", "the", "different", "samples", ".", "Data", "were", "analysed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "hoc", "test", ".", "10", "-", "14", "cells", "were", "analysed", "per", "condition", "from", "3", "independent", "experiments", ";", "error", "bars", "are", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "B", ")", "ER", "-", "mitochondria", "associations", "and", "the", "VAPB", "-", "PTPIP51", "interaction", "are", "disrupted", "by", "wild", "-", "type", "and", "ALS", "/", "FTD", "mutant", "FUS", ".", "NSC34", "cells", "were", "transfected", "with", "EGFP", "control", "vector", "(", "CTRL", ")", ",", "EGFP", "-", "FUS", ",", "EGFP", "-", "FUSR521C", "or", "EGFP", "-", "FUSR518K", "and", "proximity", "ligation", "assays", "performed", "using", "VAPB", "and", "PTPIP51", "antibodies", ".", "FUS", "were", "detected", "via", "their", "EGFP", "tags", ".", "Scale", "bar", "=", "10", "m", ".", "Bar", "chart", "shows", "relative", "number", "of", "proximity", "ligation", "assay", "signals", "/", "cell", ".", "Data", "were", "analysed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "hoc", "test", ";", "n", "=", "47", "-", "53", "cells", "from", "5", "experiments", ".", "Error", "bars", "are", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "C", ")", "overexpression", "of", "FUS", "reduces", "the", "binding", "of", "VAPB", "to", "PTPIP51", "in", "transfected", "cells", ".", "Cells", "were", "transfected", "as", "indicated", "with", "either", "control", "empty", "vector", "(", "CTRL", ")", ",", "HA", "-", "PTPIP51", "+", "CTRL", ",", "or", "HA", "-", "PTPIP51", "+", "either", "EGFP", "-", "FUS", ",", "EGFP", "-", "FUSR521C", "or", "EGFP", "-", "FUSR518K", ".", "PTPIP51", "was", "immunoprecipitated", "using", "the", "HA", "tag", "and", "the", "amounts", "of", "endogenous", "bound", "VAPB", "detected", "by", "immunoblotting", ".", "Both", "inputs", "and", "immunoprecipitations", "(", "IP", ")", "are", "shown", "and", "no", "immunoprecipitating", "VAPB", "signals", "were", "obtained", "in", "the", "absence", "of", "HA", "-", "PTPIP51", ".", "Bar", "chart", "shows", "relative", "levels", "of", "VAPB", "bound", "to", "PTPIP51", "in", "the", "immunoprecipitations", "following", "quantification", "of", "signals", "from", "immunoblots", ".", "VAPB", "signals", "were", "normalized", "to", "immunoprecipitated", "PTPIP51", "-", "HA", "signals", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) FU-induced reductions in ER-mitochondria associations can be detected using SIM. NSC34 cells were transfected with either EGFP control vector, EGFP-FUS, EGFP-FUSR521C or EGFP-FUSR518K and immunostained for TOM20 and PDI to label mitochondria (Mito) and ER respectively; FUS were detected via their EGFP tags. Merge (ZOOM) show zoomed images of boxed regions and co-localisation shows co-localised pixels. Scale bar=2 m. Bar chart shows ER-mitochondria co-localisation (Manders coefficient) normalized to control in the different samples. Data were analysed by one-way ANOVA with Tukey's post-hoc test. 10-14 cells were analysed per condition from 3 independent experiments; error bars are s.e.m., **p<0.01 and ***p<0.001.(B) ER-mitochondria associations and the VAPB-PTPIP51 interaction are disrupted by wild-type and ALS/FTD mutant FUS. NSC34 cells were transfected with EGFP control vector (CTRL), EGFP-FUS, EGFP-FUSR521C or EGFP-FUSR518K and proximity ligation assays performed using VAPB and PTPIP51 antibodies. FUS were detected via their EGFP tags. Scale bar=10 m. Bar chart shows relative number of proximity ligation assay signals/cell. Data were analysed by one-way ANOVA and Tukey's post-hoc test; n=47-53 cells from 5 experiments. Error bars are s.e.m.; ***p<0.001.(C) overexpression of FUS reduces the binding of VAPB to PTPIP51 in transfected cells. Cells were transfected as indicated with either control empty vector (CTRL), HA-PTPIP51+CTRL, or HA-PTPIP51+ either EGFP-FUS, EGFP-FUSR521C or EGFP-FUSR518K. PTPIP51 was immunoprecipitated using the HA tag and the amounts of endogenous bound VAPB detected by immunoblotting. Both inputs and immunoprecipitations (IP) are shown and no immunoprecipitating VAPB signals were obtained in the absence of HA-PTPIP51. Bar chart shows relative levels of VAPB bound to PTPIP51 in the immunoprecipitations following quantification of signals from immunoblots. VAPB signals were normalized to immunoprecipitated PTPIP51-HA signals."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "overexpression", "of", "FUS", "does", "not", "affect", "expression", "of", "VAPB", ",", "PTPIP51", "or", "mitofusin", "-", "2", ".", "Immunoblots", "of", "spinal", "cord", "proteins", "from", "three", "10", "week", "old", "FUS", "transgenic", "mice", "and", "three", "age", "-", "matched", "littermates", "are", "shown", ";", "FUS", "was", "detected", "via", "its", "HA", "-", "tag", ".", "Tubulin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "(", "B", ")", "representative", "electron", "microscopy", "of", "ER", "-", "mitochondria", "associations", "in", "lumbar", "spinal", "cord", "motor", "neurons", "of", "FUS", "transgenic", "mice", "and", "their", "non", "-", "transgenic", "littermates", ";", "arrowheads", "with", "loops", "show", "regions", "of", "association", ".", "Scale", "bar", "is", "200", "nm", ".", "Bar", "chart", "shows", "%", "of", "mitochondrial", "surface", "closely", "apposed", "to", "ER", "in", "the", "two", "samples", ".", "Data", "were", "analysed", "by", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "N", "=", "67", "-", "88", "cells", "and", "438", "-", "749", "mitochondria", ",", "error", "bars", "are", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "C", ")", "ER", "-", "mitochondria", "associations", "and", "the", "VAPB", "-", "PTPIP51", "interaction", "are", "disrupted", "in", "lumbar", "motor", "neurons", "in", "spinal", "cords", "of", "FUS", "transgenic", "mice", ".", "Representative", "images", "of", "proximity", "ligation", "signals", "in", "11", "week", "old", "FUS", "and", "non", "-", "transgenic", "(", "NTg", ")", "littermate", "mice", ".", "Data", "were", "analysed", "by", "unpaired", "t", "-", "test", ";", "N", "=", "40", "cells", "from", "3", "FUS", "and", "3", "non", "-", "transgenic", "littermates", "(", "age", "10", "weeks", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) overexpression of FUS does not affect expression of VAPB, PTPIP51 or mitofusin-2. Immunoblots of spinal cord proteins from three 10 week old FUS transgenic mice and three age-matched littermates are shown; FUS was detected via its HA-tag. Tubulin was used as a loading control.(B) representative electron microscopy of ER-mitochondria associations in lumbar spinal cord motor neurons of FUS transgenic mice and their non-transgenic littermates; arrowheads with loops show regions of association. Scale bar is 200 nm. Bar chart shows % of mitochondrial surface closely apposed to ER in the two samples. Data were analysed by unpaired t-test. N=67-88 cells and 438-749 mitochondria, error bars are s.e.m.; ***p<0.001.(C) ER-mitochondria associations and the VAPB-PTPIP51 interaction are disrupted in lumbar motor neurons in spinal cords of FUS transgenic mice. Representative images of proximity ligation signals in 11 week old FUS and non-transgenic (NTg) littermate mice. Data were analysed by unpaired t-test; N=40 cells from 3 FUS and 3 non-transgenic littermates (age 10 weeks)."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", "and", "B", ")", "FUS", "disrupts", "Ca2", "+", "homeostasis", ".", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "M3R", "and", "either", "control", "vector", "(", "CTRL", ")", ",", "FUS", ",", "FUSR521C", "or", "FUSR518K", "as", "indicated", ".", "Release", "of", "ERCa2", "+", "was", "induced", "by", "treatment", "of", "cells", "with", "OxoM", ".", "(", "A", ")", "shows", "cytosolicCa2", "+", "levels", "with", "representative", "Fluo4", "fluorescence", "traces", "on", "the", "left", "and", "normalized", "peak", "values", "on", "the", "right", ".", "Fluo4", "fluorescence", "shows", "a", "transient", "increase", "in", "cytosolicCa2", "+", "levels", "upon", "OxoM", "treatment", "but", "compared", "to", "control", ",", "wild", "-", "type", "and", "mutant", "FUS", "all", "increase", "peak", "cytosolicCa2", "+", "levels", ".", "(", "B", ")", "shows", "mitochondrialCa2", "+", "levels", "with", "representative", "Rhod2", "fluorescence", "traces", "on", "the", "left", "and", "normalized", "peak", "values", "on", "the", "right", ".", "Data", "were", "analysed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", ".", "(", "A", ")", "N", "=", "49", "-", "52", "cells", "from", "3", "experiments", ";", "(", "B", ")", "N", "=", "50", "-", "52", "cells", "from", "5", "experiments", ",", "error", "bars", "are", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "C", ")", "FUS", "reduces", "mitochondrial", "ATP", "production", ".", "ATP", "levels", "were", "measured", "in", "NSC34", "cells", "transfected", "with", "the", "ATP", "indicator", "AT1", ".", "03", "and", "either", "control", "vector", "(", "CTRL", ")", ",", "HA", "-", "FUS", ",", "HA", "-", "FUSR521C", "or", "HA", "-", "FUSR518K", ".", "Cells", "were", "imaged", "in", "time", "-", "lapse", "prior", "to", "and", "after", "KCN", "treatment", "to", "inhibit", "oxidative", "phosphorylation", ".", "Representative", "traces", "of", "YFP", "/", "CFP", "ratios", "are", "shown", "for", "the", "different", "samples", ";", "initial", "YFP", "/", "CFP", "ratios", "prior", "to", "KCN", "treatment", "and", "those", "after", "KCN", "treatment", "are", "indicated", ".", "The", "fall", "in", "YFP", "/", "CFP", "ratios", "correlates", "with", "ATP", "produced", "by", "oxidative", "phosphorylation", ".", "Bar", "chart", "shows", "relative", "ATP", "levels", "produced", "by", "oxidative", "phosphorylation", "(", "OXPHOS", ")", "in", "the", "different", "samples", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A and B) FUS disrupts Ca2+ homeostasis. HEK293 cells were transfected with M3R and either control vector (CTRL), FUS, FUSR521C or FUSR518K as indicated. Release of ERCa2+ was induced by treatment of cells with OxoM. (A) shows cytosolicCa2+ levels with representative Fluo4 fluorescence traces on the left and normalized peak values on the right. Fluo4 fluorescence shows a transient increase in cytosolicCa2+ levels upon OxoM treatment but compared to control, wild-type and mutant FUS all increase peak cytosolicCa2+ levels. (B) shows mitochondrialCa2+ levels with representative Rhod2 fluorescence traces on the left and normalized peak values on the right. Data were analysed by one-way ANOVA and Tukey's post hoc test. (A) N=49-52 cells from 3 experiments; (B) N=50-52 cells from 5 experiments, error bars are s.e.m.; *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.(C) FUS reduces mitochondrial ATP production. ATP levels were measured in NSC34 cells transfected with the ATP indicator AT1.03 and either control vector (CTRL), HA-FUS, HA-FUSR521C or HA-FUSR518K. Cells were imaged in time-lapse prior to and after KCN treatment to inhibit oxidative phosphorylation. Representative traces of YFP/CFP ratios are shown for the different samples; initial YFP/CFP ratios prior to KCN treatment and those after KCN treatment are indicated. The fall in YFP/CFP ratios correlates with ATP produced by oxidative phosphorylation. Bar chart shows relative ATP levels produced by oxidative phosphorylation (OXPHOS) in the different samples."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "cells", "were", "transfected", "with", "either", "control", "vector", "(", "CTRL", ")", ",", "HA", "-", "FUS", ",", "HA", "-", "FUSR521C", "or", "HA", "FUSR518K", "and", "the", "samples", "probed", "on", "immunoblots", "for", "GSK", "-", "3", "phosphorylated", "on", "serine", "-", "9", "(", "GSK", "-", "3", "-", "S9", ")", ",", "total", "GSK", "-", "3", ",", "FUS", "(", "using", "FUS", "antibody", ")", "and", "tubulin", "as", "a", "loading", "control", ".", "Phosphorylation", "of", "GSK", "-", "3", "serine", "-", "9", "is", "the", "principal", "mechanism", "for", "regulating", "its", "activity", ";", "serine", "-", "9", "phosphorylation", "inhibits", "GSK", "-", "3", "activity", ".", "Bar", "chart", "shows", "relative", "levels", "of", "GSK", "-", "3β", "serine", "-", "9", "phosphorylation", "following", "quantification", "of", "signals", "from", "immunoblots", "and", "normalization", "to", "total", "GSK", "-", "3β", "signals", ".", "Data", "were", "analysed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", ".", "N", "=", "4", ",", "error", "bars", "are", "s", ".", "e", ".", "m", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "(", "B", ")", "immunoblots", "of", "total", "and", "serine", "-", "9", "phosphorylated", "GSK", "-", "3", "in", "spinal", "cords", "from", "three", "10", "week", "-", "old", "FUS", "transgenic", "mice", "and", "their", "non", "-", "transgenic", "littermates", ".", "Samples", "were", "probed", "for", "tubulin", "as", "a", "loading", "control", ".", "Bar", "chart", "shows", "relative", "levels", "of", "GSK", "-", "3β", "serine", "-", "9", "phosphorylation", "following", "quantification", "of", "signals", "from", "immunoblots", "and", "normalization", "to", "total", "GSK", "-", "3β", "signals", ".", "Data", "were", "analysed", "by", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "error", "bars", "are", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "(", "C", ")", "cytosolic", "FUS", "activates", "GSK", "-", "3", "more", "potently", "than", "wild", "type", "FUS", ".", "Cells", "were", "transfected", "with", "EGFP", "control", ",", "EGFP", "-", "FUS", "or", "EGFP", "-", "FUS", "lacking", "its", "C", "-", "terminal", "nuclear", "localization", "signal", "(", "FUSC", ")", ".", "Samples", "were", "probed", "on", "immunoblots", "for", "total", "GSK", "-", "3", ",", "GSK", "-", "3", "phosphorylated", "on", "serine", "-", "9", ",", "FUS", "(", "using", "EGFP", "antibody", ")", "and", "tubulin", "as", "a", "loading", "control", ".", "Bar", "chart", "shows", "relative", "levels", "of", "GSK", "-", "3β", "serine", "-", "9", "phosphorylation", "following", "quantification", "of", "signals", "from", "immunoblots", "and", "normalization", "to", "total", "GSK", "-", "3β", "signals", ".", "Data", "were", "analysed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", ".", "N", "=", "3", ",", "error", "bars", "are", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "D", ")", "cytosolic", "FUS", "reduces", "the", "VAPB", "-", "PTPIP51", "interaction", "more", "potently", "than", "wild", "type", "FUS", ".", "Cells", "were", "transfected", "with", "PTPIP51", "-", "HA", "and", "either", "EGFP", "control", ",", "EGFP", "-", "FUS", "or", "EGFP", "-", "FUSC", ".", "PTPIP51", "was", "immunoprecipitated", "using", "the", "HA", "tag", "and", "bound", "endogenous", "VAPB", "detected", "by", "immunoblotting", ".", "Both", "inputs", "and", "immunoprecipitations", "(", "IP", ")", "are", "shown", ".", "FUS", "was", "detected", "using", "EGFP", "antibody", ".", "Bar", "chart", "shows", "relative", "levels", "of", "VAPB", "bound", "to", "PTPIP51", "in", "the", "immunoprecipitations", "following", "quantification", "of", "signals", "from", "immunoblots", ".", "VAPB", "signals", "were", "normalized", "to", "immunoprecipitated", "PTPIP51", "-", "HA", "signals", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) cells were transfected with either control vector (CTRL), HA-FUS, HA-FUSR521C or HA FUSR518K and the samples probed on immunoblots for GSK-3 phosphorylated on serine-9 (GSK-3-S9), total GSK-3, FUS (using FUS antibody) and tubulin as a loading control. Phosphorylation of GSK-3 serine-9 is the principal mechanism for regulating its activity; serine-9 phosphorylation inhibits GSK-3 activity. Bar chart shows relative levels of GSK-3β serine-9 phosphorylation following quantification of signals from immunoblots and normalization to total GSK-3β signals. Data were analysed by one-way ANOVA and Tukey's post hoc test. N=4, error bars are s.e.m; *p<0.05.(B) immunoblots of total and serine-9 phosphorylated GSK-3 in spinal cords from three 10 week-old FUS transgenic mice and their non-transgenic littermates. Samples were probed for tubulin as a loading control. Bar chart shows relative levels of GSK-3β serine-9 phosphorylation following quantification of signals from immunoblots and normalization to total GSK-3β signals. Data were analysed by unpaired t-test, error bars are s.e.m.; *p<0.05.(C) cytosolic FUS activates GSK-3 more potently than wild type FUS. Cells were transfected with EGFP control, EGFP-FUS or EGFP-FUS lacking its C-terminal nuclear localization signal (FUSC). Samples were probed on immunoblots for total GSK-3, GSK-3 phosphorylated on serine-9, FUS (using EGFP antibody) and tubulin as a loading control. Bar chart shows relative levels of GSK-3β serine-9 phosphorylation following quantification of signals from immunoblots and normalization to total GSK-3β signals. Data were analysed by one-way ANOVA and Tukey's post hoc test. N=3, error bars are s.e.m.; **p<0.01, ***p<0.001.(D) cytosolic FUS reduces the VAPB-PTPIP51 interaction more potently than wild type FUS. Cells were transfected with PTPIP51-HA and either EGFP control, EGFP-FUS or EGFP-FUSC. PTPIP51 was immunoprecipitated using the HA tag and bound endogenous VAPB detected by immunoblotting. Both inputs and immunoprecipitations (IP) are shown. FUS was detected using EGFP antibody. Bar chart shows relative levels of VAPB bound to PTPIP51 in the immunoprecipitations following quantification of signals from immunoblots. VAPB signals were normalized to immunoprecipitated PTPIP51-HA signals."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "representative", "electron", "microscopy", "of", "ER", "-", "mitochondria", "associations", "in", "NSC34", "cells", "treated", "with", "either", "vehicle", "or", "GSK", "-", "3β", "inhibitors", "AR", "-", "A014418", "(", "1", "M", ")", "or", "CT99021", "(", "100", "nM", ")", "for", "16", "h", ".", "Arrowheads", "with", "loops", "show", "regions", "of", "association", ";", "scale", "bar", "=", "200", "nm", ".", "Bar", "charts", "shows", "%", "of", "the", "mitochondrial", "surface", "closely", "apposed", "to", "ER", "in", "the", "different", "samples", ".", "Data", "were", "analysed", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ".", "N", "=", "32", "cells", "and", "181", "-", "210", "mitochondria", ".", "Error", "bars", "are", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "(", "B", ")", "VAPB", "-", "PTPIP51", "proximity", "ligation", "assays", "of", "NSC34", "cells", "treated", "with", "either", "vehicle", "1", "M", "AR", "-", "A014418", "or", "100", "nM", "CT99021", "for", "16", "h", ".", "Cells", "were", "also", "stained", "for", "nuclei", "with", "DAPI", ".", "Bar", "chart", "shows", "relative", "number", "of", "proximity", "ligation", "assay", "signals", "/", "cell", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) representative electron microscopy of ER-mitochondria associations in NSC34 cells treated with either vehicle or GSK-3β inhibitors AR-A014418 (1 M) or CT99021 (100 nM) for 16 h. Arrowheads with loops show regions of association; scale bar=200 nm. Bar charts shows % of the mitochondrial surface closely apposed to ER in the different samples. Data were analysed by one-way ANOVA followed by Tukey's multiple comparison test. N=32 cells and 181-210 mitochondria. Error bars are s.e.m.; *p<0.05.(B) VAPB-PTPIP51 proximity ligation assays of NSC34 cells treated with either vehicle 1 M AR-A014418 or 100 nM CT99021 for 16 h. Cells were also stained for nuclei with DAPI. Bar chart shows relative number of proximity ligation assay signals/cell."}
{"words": ["Figure", "7Representative", "electron", "microscopy", "of", "ER", "-", "mitochondria", "associations", "in", "NSC34", "cells", "transfected", "with", "EGFP", "-", "FUS", ",", "EGFP", "-", "FUSR521C", "or", "EGFP", "-", "FUSR518K", "and", "treated", "with", "vehicle", "or", "1", "mM", "AR", "-", "A014418", "for", "16", "hours", ".", "Arrowheads", "with", "loops", "show", "regions", "of", "association", ";", "scale", "bar", "=", "200", "nm", ".", "Bar", "charts", "shows", "%", "of", "the", "mitochondrial", "surface", "closely", "apposed", "to", "ER", "in", "the", "different", "samples", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Representative electron microscopy of ER-mitochondria associations in NSC34 cells transfected with EGFP-FUS, EGFP-FUSR521C or EGFP-FUSR518K and treated with vehicle or 1 mM AR-A014418 for 16 hours. Arrowheads with loops show regions of association; scale bar=200 nm. Bar charts shows % of the mitochondrial surface closely apposed to ER in the different samples."}
{"words": ["Figure", "8HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "M3R", "and", "either", "control", "vector", "(", "CTRL", ")", ",", "FUS", ",", "FUSR521C", "or", "FUSR518K", "and", "then", "treated", "with", "vehicle", "(", "DMSO", ")", "or", "1", "M", "AR", "-", "A014418", "for", "16", "hours", "as", "indicated", ".", "Release", "of", "ER", "Ca2", "+", "was", "induced", "by", "treatment", "of", "cells", "with", "OxoM", ".", "Representative", "Rhod2", "fluorescence", "traces", "showing", "mitochondrial", "Ca2", "+", "are", "shown", "along", "with", "bar", "chart", "displaying", "normalized", "peak", "values", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8HEK293 cells were transfected with M3R and either control vector (CTRL), FUS, FUSR521C or FUSR518K and then treated with vehicle (DMSO) or 1 M AR-A014418 for 16 hours as indicated. Release of ER Ca2+ was induced by treatment of cells with OxoM. Representative Rhod2 fluorescence traces showing mitochondrial Ca2+ are shown along with bar chart displaying normalized peak values."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "C", ")", "Exemplary", "images", "of", "COS", "-", "7", "cells", "expressing", "PEX", "-", "mRFP", "-", "FKBP", "before", "(", "upper", "panels", ")", "and", "30", "minutes", "after", "(", "middle", "panels", ")", "rapalog", "addition", "in", "the", "presence", "of", "a", "translocating", "motor", "-", "KIF1C", "-", "MDC", "-", "FRB", "and", "a", "non", "-", "translocating", "motor", "-", "KIF3B", "-", "MDC", "-", "FRB", ".", "Yellow", "lines", "indicate", "COS7", "cell", "outline", ".", "Lower", "panel", "represents", "the", "overlay", "of", "sequential", "binarized", "images", "color", "coded", "by", "time", "(", "see", "also", "Appendix", "Figure", "S1", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "20", "µm", "(", "D", ")", "Plots", "representing", "intensity", "time", "traces", "of", "R90", "%", "for", "COS", "-", "7", "cells", "transfected", "with", "PEX", "-", "mRFP", "-", "FKBP", "and", "KIF1C", "-", "MDC", "-", "FRB", "(", "n", "=", "13", ")", "or", "KIF3B", "-", "MDC", "-", "FRB", "(", "n", "=", "10", ")", ".", "R90", "%", "is", "the", "radius", "for", "each", "time", "point", "that", "includes", "90", "%", "of", "the", "total", "fluorescent", "intensity", ".", "Error", "bars", "indicate", "SEM", ".", "E", ")", "Quantitative", "representation", "of", "average", "peroxisome", "displacement", "30", "min", "after", "addition", "of", "rapalog", "for", "COS", "-", "7", "cells", "transfected", "with", "kinesin", "constructs", "summarized", "in", "(", "A", ")", ".", "The", "number", "of", "analyzed", "cells", "is", "summarized", "in", "Appendix", "Table", "S1", ".", "Kinesins", "were", "considered", "translocators", ",", "if", "they", "displaced", "peroxisomes", "≥", "5", "µm", "(", "marked", "with", "a", "blue", "dashed", "line", ")", "in", "30", "minutes", "after", "rapalog", "addition", ".", "Error", "bars", "indicate", "SEM", ".", "(", "F", ")", "Quantitative", "representation", "of", "average", "dispersion", "speed", "of", "peroxisomes", "recruited", "to", "translocating", "kinesins", "as", "calculated", "from", "time", "traces", "of", "R90", "%", "(", "summarized", "in", "Appendix", "figure", "S2", ",", "Appendix", "Table", "S1", ")", ".", "Error", "bars", "indicate", "SEM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(C) Exemplary images of COS-7 cells expressing PEX-mRFP-FKBP before (upper panels) and 30 minutes after (middle panels) rapalog addition in the presence of a translocating motor - KIF1C-MDC-FRB and a non-translocating motor - KIF3B-MDC-FRB. Yellow lines indicate COS7 cell outline. Lower panel represents the overlay of sequential binarized images color coded by time (see also Appendix Figure S1). Scale bar = 20 µm(D) Plots representing intensity time traces of R90% for COS-7 cells transfected with PEX-mRFP-FKBP and KIF1C-MDC-FRB (n =13) or KIF3B-MDC-FRB (n =10). R90% is the radius for each time point that includes 90% of the total fluorescent intensity. Error bars indicate SEM.E) Quantitative representation of average peroxisome displacement 30 min after addition of rapalog for COS-7 cells transfected with kinesin constructs summarized in (A). The number of analyzed cells is summarized in Appendix Table S1. Kinesins were considered translocators, if they displaced peroxisomes ≥ 5 µm (marked with a blue dashed line) in 30 minutes after rapalog addition. Error bars indicate SEM.(F) Quantitative representation of average dispersion speed of peroxisomes recruited to translocating kinesins as calculated from time traces of R90% (summarized in Appendix figure S2, Appendix Table S1). Error bars indicate SEM."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Representative", "maximum", "intensity", "projections", "of", "peroxisome", "distribution", "before", "and", "after", "rapalog", "addition", "in", "DIV14", "hippocampal", "neurons", "expressing", "PEX", "-", "mRFP", "-", "FKBP", ",", "KIF1C", "-", "MDC", "-", "FRB", ",", "KIF21A", "-", "MDC", "-", "FRB", "or", "KIF5B", "-", "MDC", "-", "FRB", ".", "The", "morphology", "of", "transfected", "cell", "is", "visualized", "using", "a", "BFP", "fill", ".", "Axons", "are", "marked", "with", "a", "blue", "line", ".", "Arrows", "mark", "peroxisome", "targeting", "to", "dendrites", "(", "gray", ")", "and", "axon", "(", "blue", ")", "30", "min", "after", "rapalog", "addition", ".", "Scale", "bar", "=", "20", "µm", ".", "(", "B", ")", "Plots", "representing", "intensity", "time", "traces", "of", "dendrites", "and", "axons", "before", "and", "after", "rapalog", "addition", "for", "KIF1C", "-", "MDC", "-", "FRB", "(", "n", "=", "6", "neurons", ")", ",", "KIF21A", "-", "MDC", "-", "FRB", "(", "n", "=", "4", ")", "and", "KIF5B", "-", "MDC", "-", "FRB", "(", "n", "=", "8", ")", ".", "Traces", "were", "normalized", "to", "the", "average", "intensity", "before", "rapalog", "addition", ",", "and", "to", "the", "background", ".", "C", ")", "Quantitative", "representation", "of", "percentage", "of", "DIV14", "neurons", "transfected", "as", "in", "(", "A", ")", "with", "constructs", "showed", "in", "Figure", "1A", ",", "in", "which", "peroxisomes", "after", "addition", "of", "rapalog", "redistributed", "to", "either", "axons", "(", "\"", "a", "\"", ",", "blue", "bars", ")", "or", "to", "axons", "and", "at", "least", "2", "dendrites", "(", "\"", "a", "+", "d", "\"", ",", "red", "bars", ")", ".", "Kinesins", "were", "considered", "\"", "dendrite", "targeting", "\"", "if", "dendrites", "were", "targeted", "in", "≥", "50", "%", "of", "cells", "and", "are", "highlighted", "in", "red", ".", "Kinesin", "constructs", "are", "transfected", "as", "indicated", ";", "the", "number", "of", "analyzed", "cells", "is", "summarized", "in", "Appendix", "Table", "S1", ".", "Error", "bars", "indicate", "SEM", "(", "D", ")", "Representative", "maximum", "intensity", "projections", "of", "peroxisome", "distribution", "before", "and", "after", "rapalog", "addition", "in", "DIV2", "hippocampal", "neurons", "transfected", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "20", "µm", "(", "E", ")", "Percentage", "of", "DIV2", "neurons", "transfected", "with", "KIF1C", "-", "MDC", "-", "FRB", "(", "n", "=", "9", "neurons", ")", ",", "KIF21A", "-", "MDC", "-", "FRB", "(", "n", "=", "14", ")", "and", "KIF5B", "-", "MDC", "-", "FRB", "(", "n", "=", "14", ")", "in", "which", "peroxisomes", "redistributed", "into", "at", "least", "2", "neurites", "after", "addition", "of", "rapalog", "and", "(", "F", ")", "Percentage", "of", "neurites", "of", "DIV2", "neurons", "transfected", "as", "in", "(", "E", ")", "targeted", "with", "peroxisomes", "after", "addition", "of", "rapalog", ".", "Error", "bars", "indicate", "SEM", ";", "Scale", "bars", ":", "20", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Representative maximum intensity projections of peroxisome distribution before and after rapalog addition in DIV14 hippocampal neurons expressing PEX-mRFP-FKBP, KIF1C-MDC-FRB, KIF21A-MDC-FRB or KIF5B-MDC-FRB. The morphology of transfected cell is visualized using a BFP fill. Axons are marked with a blue line. Arrows mark peroxisome targeting to dendrites (gray) and axon (blue) 30 min after rapalog addition. Scale bar = 20 µm.(B) Plots representing intensity time traces of dendrites and axons before and after rapalog addition for KIF1C-MDC-FRB (n = 6 neurons), KIF21A-MDC-FRB (n = 4) and KIF5B-MDC-FRB (n = 8). Traces were normalized to the average intensity before rapalog addition, and to the background.C) Quantitative representation of percentage of DIV14 neurons transfected as in (A) with constructs showed in Figure 1A, in which peroxisomes after addition of rapalog redistributed to either axons (\"a\", blue bars) or to axons and at least 2 dendrites (\"a+d\", red bars). Kinesins were considered \"dendrite targeting\" if dendrites were targeted in ≥ 50% of cells and are highlighted in red. Kinesin constructs are transfected as indicated; the number of analyzed cells is summarized in Appendix Table S1. Error bars indicate SEM(D) Representative maximum intensity projections of peroxisome distribution before and after rapalog addition in DIV2 hippocampal neurons transfected as in (A). Scale bars: 20 µm(E) Percentage of DIV2 neurons transfected with KIF1C-MDC-FRB (n=9 neurons), KIF21A-MDC-FRB (n=14) and KIF5B-MDC-FRB (n=14) in which peroxisomes redistributed into at least 2 neurites after addition of rapalog and (F) Percentage of neurites of DIV2 neurons transfected as in (E) targeted with peroxisomes after addition of rapalog. Error bars indicate SEM; Scale bars: 20 µm."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "a", "hippocampal", "neuron", "(", "DIV14", ")", "immunostained", "for", "MAP2", ",", "β", "-", "III", "-", "tubulin", "and", "DCLK1", ".", "Scale", "bar", "=", "20", "µm", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "the", "average", "ratio", "of", "DCLK1", ",", "MAP1A", ",", "MAP1B", "and", "MAP2", "to", "total", "tubulin", "immunofluorescence", "intensities", "in", "dendrites", "compared", "to", "axons", ".", "Per", "condition", "6", "-", "9", "cells", "were", "analyzed", ".", "Error", "bars", "indicate", "SEM", ".", "(", "C", ")", "Representative", "images", "of", "DIV10", "hippocampal", "neurons", "transfected", "for", "4", "days", "with", "plasmids", "encoding", "β", "-", "gal", "for", "visualizing", "the", "transfected", "cells", "and", "three", "different", "DCLK1", "shRNAs", "or", "DCLK2", "shRNA", "and", "immunostained", "for", "β", "-", "gal", "(", "red", ")", "and", "DCLK1", "(", "green", ")", ".", "(", "D", ")", "Quantitative", "analysis", "of", "normalized", "average", "intensity", "of", "DCLK1", "in", "regions", "of", "interest", "of", "DIV10", "neurons", "transfected", "with", "DCLK1", "sh", "#", "1", "(", "n", "=", "16", "neurons", ")", ",", "DCLK1", "sh", "#", "2", "(", "n", "=", "16", ")", "and", "DCLK1", "sh", "#", "3", "(", "n", "=", "18", ")", ".", "Non", "-", "transfected", "cells", "were", "taken", "as", "a", "control", "(", "n", "=", "48", ")", ".", "N", "=", "2", ".", "Error", "bars", "indicate", "SEM", ";", "*", "*", "*", "-", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "1", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "a", "Tukey", "'", "s", "Multiple", "Comparison", "Test", ")", ".", "(", "E", ")", "Example", "of", "Western", "blot", "analysis", "of", "protein", "extracts", "of", "DIV4", "cortical", "neurons", "electroporated", "on", "DIV0", "with", "pSUPER", "(", "control", ")", "or", "pSUPER", "encoding", "one", "of", "three", "DCLK1", "shRNAs", ".", "Levels", "of", "actin", "were", "used", "as", "an", "equal", "loading", "control", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "protein", "levels", "of", "DCLK1", "of", "samples", "represented", "in", "(", "E", ")", ".", "N", "=", "3", ",", "error", "bars", "indicate", "SEM", ",", "*", "*", "*", "-", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "1", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "a", "Tukey", "'", "s", "Multiple", "Comparison", "Test", ")", ".", "(", "G", ")", "Representative", "maximum", "projections", "of", "peroxisome", "distribution", "in", "DIV14", "neurons", "transfected", "with", "PEX", "-", "mRFP", "-", "FKBP", ",", "KIF1C", "(", "MDC", ")", "-", "FRB", "and", "the", "indicated", "shRNA", "before", "and", "30", "minutes", "after", "rapalog", "addition", ".", "BFP", "fill", "was", "co", "-", "transected", "to", "visualize", "the", "morphology", "of", "transfected", "neuron", ".", "Axons", "are", "marked", "with", "a", "blue", "line", ".", "Arrows", "mark", "dendrite", "(", "gray", ")", "and", "axon", "(", "blue", ")", "targeting", "of", "peroxisomes", "after", "rapalog", "addition", ".", "Scale", "bar", "=", "20", "µm", "(", "H", ")", "Quantitative", "representation", "of", "the", "percentage", "of", "DIV14", "neurons", "transfected", "with", "PEX", "-", "RFP", "together", "with", "either", "KIF1C", ",", "KIF21A", "or", "KIF5B", "and", "an", "indicated", "shRNA", ".", "as", "in", "(", "A", ")", "in", "which", "after", "addition", "of", "rapalog", "peroxisomes", "redistributed", "to", "axons", "(", "\"", "a", "\"", ",", "blue", "bars", ")", ",", "to", "both", "axons", "and", "dendrites", "(", "\"", "a", "+", "d", "\"", ",", "red", "bars", ")", "or", "did", "not", "redistribute", "into", "any", "neuronal", "compartment", "(", "\"", "nt", "\"", "-", "no", "targeting", ",", "gray", "bars", ")", ".", "Per", "condition", "19", "-", "44", "neurons", "were", "analyzed", ";", "N", "=", "2", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Representative confocal images of a hippocampal neuron (DIV14) immunostained for MAP2, β-III-tubulin and DCLK1. Scale bar = 20 µm(B) Quantification of the average ratio of DCLK1, MAP1A, MAP1B and MAP2 to total tubulin immunofluorescence intensities in dendrites compared to axons. Per condition 6-9 cells were analyzed. Error bars indicate SEM.(C) Representative images of DIV10 hippocampal neurons transfected for 4 days with plasmids encoding β-gal for visualizing the transfected cells and three different DCLK1 shRNAs or DCLK2 shRNA and immunostained for β-gal (red) and DCLK1 (green).(D) Quantitative analysis of normalized average intensity of DCLK1 in regions of interest of DIV10 neurons transfected with DCLK1 sh#1 (n = 16 neurons), DCLK1 sh#2 (n=16) and DCLK1 sh#3 (n=18). Non-transfected cells were taken as a control (n = 48). N=2. Error bars indicate SEM; *** - p < 0.001 (1-way ANOVA followed by a Tukey's Multiple Comparison Test).(E) Example of Western blot analysis of protein extracts of DIV4 cortical neurons electroporated on DIV0 with pSUPER (control) or pSUPER encoding one of three DCLK1 shRNAs. Levels of actin were used as an equal loading control.(F) Quantification of protein levels of DCLK1 of samples represented in (E). N = 3, error bars indicate SEM, *** - p < 0.001 (1-way ANOVA followed by a Tukey's Multiple Comparison Test).(G) Representative maximum projections of peroxisome distribution in DIV14 neurons transfected with PEX-mRFP-FKBP, KIF1C (MDC)-FRB and the indicated shRNA before and 30 minutes after rapalog addition. BFP fill was co-transected to visualize the morphology of transfected neuron. Axons are marked with a blue line. Arrows mark dendrite (gray) and axon (blue) targeting of peroxisomes after rapalog addition. Scale bar = 20 µm(H) Quantitative representation of the percentage of DIV14 neurons transfected with PEX-RFP together with either KIF1C, KIF21A or KIF5B and an indicated shRNA. as in (A) in which after addition of rapalog peroxisomes redistributed to axons (\"a\", blue bars), to both axons and dendrites (\"a+d\", red bars) or did not redistribute into any neuronal compartment (\"nt\"-no targeting, gray bars). Per condition 19-44 neurons were analyzed; N = 2."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", "-", "G", ")", "Representative", "frame", "(", "A", ",", "D", ")", "and", "a", "kymograph", "(", "B", ",", "F", ")", "of", "a", "simultaneous", "two", "-", "color", "movie", "of", "a", "hippocampal", "neuron", "expressing", "NPY", "-", "mCherry", "and", "either", "KIF1A", "-", "GFP", "(", "A", ",", "B", ")", ",", "BDNF", "-", "GFP", "(", "D", ")", "or", "TfR", "-", "GFP", "(", "F", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "20", "µm", "(", "A", ",", "D", ")", ",", "5", "µm", "(", "B", ",", "F", ")", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "vesicle", "colocalization", "in", "cells", "described", "in", "(", "A", ",", "B", ")", "The", "quantifications", "indicate", "the", "%", "of", "KIF1Avesicles", "that", "are", "NPY", "positive", "-", "left", "bar", "quantified", "from", "images", "of", "fixed", "cells", "presented", "in", "(", "A", ")", "and", "right", "bar", "quantified", "from", "kymographs", "as", "presented", "in", "(", "B", ")", "(", "only", "moving", "fraction", ")", ".", "(", "E", ")", "Quantification", "of", "vesicle", "colocalization", "in", "cells", "described", "in", "(", "D", ")", "-", "left", "bar", "indicates", "the", "%", "of", "NPYvesicles", "that", "are", "BDNF", "positive", ",", "the", "right", "bar", "indicates", "the", "%", "of", "BDNFvesicles", "that", "are", "NPY", "positive", ".", "(", "G", ")", "Quantification", "of", "vesicle", "colocalization", "in", "cells", "described", "in", "(", "F", ")", ".", "The", "left", "bar", "indicates", "the", "%", "of", "NPYvesicles", "that", "are", "TfR", "positive", ",", "the", "right", "bar", "indicates", "the", "%", "of", "TfR", "that", "are", "NPY", "positive", ".", "(", "H", ",", "I", ")", "Quantification", "of", "run", "lengths", "(", "H", ")", "and", "velocities", "(", "I", ")", "of", "vesicles", "in", "dendrites", "of", "hippocampal", "neurons", "transfected", "at", "DIV10", "-", "14", "for", "4", "days", "with", "either", "NPY", "-", "GFP", "(", "n", "=", "924", "movements", ")", "or", "TfR", "-", "GFP", "(", "n", "=", "286", ")", "or", "KIF1A", "-", "GFP", "(", "n", "=", "174", ")", "together", "with", "a", "morphology", "marker", "BFP", ".", "N", "=", "2", ".", "Error", "bars", "indicate", "SEM", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "1", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "a", "Tukey", "'", "s", "Multiple", "Comparison", "Test", ")", ".", "(", "K", ")", "Representative", "kymographs", "of", "NPY", "-", "GFP", "-", "labeled", "dense", "core", "vesicle", "motility", "in", "primary", "dendrites", "of", "transfected", "neurons", ".", "DIV10", "-", "14", "hippocampal", "neurons", "were", "cotransfected", ",", "for", "4", "days", ",", "with", "plasmids", "encoding", "NPY", "-", "GFP", ",", "BFP", "fill", "and", "a", "KIF21", "shRNA", "mix", "(", "n", "=", "30", ")", ",", "KIF1shRNA", "mix", "(", "n", "=", "31", ")", ",", "KIF1A", "shRNA", "(", "n", "=", "19", ")", ",", "KIF1B", "shRNA", "(", "n", "=", "19", ")", "or", "KIF1C", "shRNA", "(", "n", "=", "11", ")", ".", "pSUPER", "was", "used", "as", "a", "control", "(", "n", "=", "15", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "5", "µm", ".", "(", "L", ")", "Quantification", "of", "the", "average", "number", "of", "dense", "core", "vesicle", "entries", "into", "the", "primary", "dendrite", "in", "100", "s", "after", "photobleaching", ".", "N", "=", "2", "-", "3", ".", "Error", "bars", "indicate", "SEM", ";", "*", "*", "*", "-", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "1", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "a", "Tukey", "'", "s", "Multiple", "Comparison", "Test", ")", ".", "(", "M", ")", "Representative", "kymographs", "of", "TfR", "-", "GFP", "-", "labeled", "recycling", "endosome", "motility", "in", "primary", "dendrites", ".", "DIV10", "-", "14", "Hippocampal", "neurons", "were", "cotransfected", "with", "TfR", "-", "GFP", "together", "with", "a", "BFP", "fill", "and", "a", "KIF1shRNA", "mix", "(", "n", "=", "11", ")", ".", "pSUPER", "was", "used", "as", "a", "control", "(", "n", "=", "20", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "5", "µm", ".", "(", "N", ")", "Quantification", "of", "the", "average", "number", "of", "recycling", "endosome", "entries", "into", "the", "primary", "dendrite", "in", "50", "s", ".", "N", "=", "2", ".", "Error", "bars", "indicate", "SEM", ".", "ns", "-", "not", "significant", "(", "Mann", "-", "Whitney", "test", ")", ".", "(", "O", ")", "Representative", "images", "of", "hippocampal", "neurons", "(", "DIV4", ")", "cotransfected", "with", "an", "empty", "pSUPER", "(", "control", ")", "or", "pSUPER", "encoding", "an", "indicated", "shRNA", "together", "with", "a", "GFP", "fill", "fixed", "at", "DIV8", "and", "immunostained", "for", "MAP2", "and", "sodium", "channels", "(", "AIS", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "µm", ".", "(", "P", ")", "Sholl", "analysis", "of", "cells", "described", "in", "(", "O", ")", "Error", "bars", "indicate", "SEM", ";", "*", "-", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "-", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "and", "*", "*", "*", "-", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "two", "-", "way", "ANOVA", "test", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "post", "hoc", "test", ")", ".", "(", "R", ")", "Analysis", "of", "the", "total", "dendritic", "length", "of", "cells", "described", "in", "(", "O", ")", "Error", "bars", "indicate", "SEM", ";", "*", "-", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "-", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "-", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "1", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "a", "Tukey", "'", "s", "Multiple", "Comparison", "Test", ")", ".", "Per", "condition", "21", "-", "24", "neurons", "(", "n", ")", "were", "analyzed", ";", "N", "=", "2", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A-G) Representative frame (A, D) and a kymograph (B, F) of a simultaneous two-color movie of a hippocampal neuron expressing NPY-mCherry and either KIF1A-GFP (A, B), BDNF-GFP (D) or TfR-GFP (F). Scale bar = 20 µm (A, D), 5 µm (B, F). (C) Quantification of vesicle colocalization in cells described in (A, B) The quantifications indicate the % of KIF1Avesicles that are NPY positive - left bar quantified from images of fixed cells presented in (A) and right bar quantified from kymographs as presented in (B) (only moving fraction). (E) Quantification of vesicle colocalization in cells described in (D) - left bar indicates the % of NPYvesicles that are BDNF positive, the right bar indicates the % of BDNFvesicles that are NPY positive. (G) Quantification of vesicle colocalization in cells described in (F). The left bar indicates the % of NPYvesicles that are TfR positive, the right bar indicates the % of TfR that are NPY positive.(H, I) Quantification of run lengths (H) and velocities (I) of vesicles in dendrites of hippocampal neurons transfected at DIV10-14 for 4 days with either NPY-GFP (n = 924 movements) or TfR-GFP (n = 286) or KIF1A-GFP (n = 174) together with a morphology marker BFP. N = 2. Error bars indicate SEM; *** p < 0.001 (1-way ANOVA followed by a Tukey's Multiple Comparison Test ).(K) Representative kymographs of NPY-GFP-labeled dense core vesicle motility in primary dendrites of transfected neurons. DIV10-14 hippocampal neurons were cotransfected, for 4 days, with plasmids encoding NPY-GFP, BFP fill and a KIF21 shRNA mix (n = 30), KIF1shRNA mix (n = 31), KIF1A shRNA (n = 19), KIF1B shRNA (n = 19) or KIF1C shRNA (n = 11). pSUPER was used as a control (n = 15). Scale bar = 5 µm.(L) Quantification of the average number of dense core vesicle entries into the primary dendrite in 100 s after photobleaching. N = 2-3. Error bars indicate SEM; *** - p < 0.001 (1-way ANOVA followed by a Tukey's Multiple Comparison Test).(M) Representative kymographs of TfR-GFP-labeled recycling endosome motility in primary dendrites. DIV10-14 Hippocampal neurons were cotransfected with TfR-GFP together with a BFP fill and a KIF1shRNA mix (n = 11). pSUPER was used as a control (n = 20). Scale bar = 5 µm.(N) Quantification of the average number of recycling endosome entries into the primary dendrite in 50 s. N = 2. Error bars indicate SEM. ns - not significant (Mann-Whitney test).(O) Representative images of hippocampal neurons (DIV4) cotransfected with an empty pSUPER (control) or pSUPER encoding an indicated shRNA together with a GFP fill fixed at DIV8 and immunostained for MAP2 and sodium channels (AIS). Scale bar = 50 µm.(P) Sholl analysis of cells described in (O) Error bars indicate SEM; * - p < 0.05, ** - p < 0.01, and *** - p < 0.001 (two-way ANOVA test followed by Bonferroni's post hoc test). (R) Analysis of the total dendritic length of cells described in (O) Error bars indicate SEM; * - p < 0.05, ** - p < 0.01 and *** - p < 0.001 (1-way ANOVA followed by a Tukey's Multiple Comparison Test). Per condition 21-24 neurons (n) were analyzed; N = 2."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "B", ")", "Representative", "kymographs", "of", "dense", "-", "core", "vesicle", "motility", "in", "proximal", "dendrites", "of", "transfected", "neurons", ".", "DIV", "10", "-", "14", "hippocampal", "neurons", "were", "co", "-", "transfected", "for", "4", "days", "with", "NPY", "-", "GFP", "and", "pSUPER", "(", "control", ")", "or", "pSUPER", "encoding", "DCLK1", "shRNA", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "DCLK1", "truncation", "constructs", "and", "dense", "core", "vesicle", "motility", "in", "dendrites", "was", "recorded", "during", "live", "-", "cell", "imaging", ".", "Scale", "bar", "=", "5", "µm", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "the", "average", "number", "of", "dense", "-", "core", "vesicle", "entries", "into", "dendrites", "of", "neurons", "transfected", "as", "in", "(", "B", ")", "during", "100", "s", "of", "the", "live", "recording", "after", "photobleaching", ".", "Per", "condition", "10", "-", "32", "cells", "were", "analyzed", ".", "Error", "bars", "indicate", "SEM", ";", "*", "*", "*", "-", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "followed", "by", "post", "hoc", "Dunn", "'", "s", "test", ")", ".", "N", "=", "2", ".", "(", "D", ",", "E", ")", "DIV10", "-", "14", "hippocampal", "neurons", "were", "co", "-", "transfected", "for", "4", "days", "with", "either", "pSUPER", "(", "control", ",", "n", "=", "20", "neurons", ")", "or", "DCLK1", "shRNA", "together", "with", "TfR", "-", "GFP", "(", "n", "=", "16", ")", ".", "(", "D", ")", "Representative", "kymographs", "of", "recycling", "endosome", "motility", "in", "dendrites", ".", "Scale", "bar", "=", "5", "µm", ".", "(", "E", ")", "Quantification", "of", "the", "average", "number", "of", "recycling", "endosome", "entries", "into", "dendrites", "during", "50", "s", "of", "the", "live", "recording", "after", "photobleaching", ".", "Error", "bars", "indicate", "SEM", ";", "ns", "-", "not", "significant", "(", "Mann", "-", "Whitney", "test", ")", ".", "N", "=", "2", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(B) Representative kymographs of dense-core vesicle motility in proximal dendrites of transfected neurons. DIV 10-14 hippocampal neurons were co-transfected for 4 days with NPY-GFP and pSUPER (control) or pSUPER encoding DCLK1 shRNA in the absence or presence of DCLK1 truncation constructs and dense core vesicle motility in dendrites was recorded during live-cell imaging. Scale bar = 5 µm.(C) Quantification of the average number of dense-core vesicle entries into dendrites of neurons transfected as in (B) during 100 s of the live recording after photobleaching. Per condition 10-32 cells were analyzed. Error bars indicate SEM; *** - p < 0.001 (Kruskal-Wallis test followed by post hoc Dunn's test). N = 2.(D, E) DIV10-14 hippocampal neurons were co-transfected for 4 days with either pSUPER (control, n = 20 neurons) or DCLK1 shRNA together with TfR-GFP (n = 16).(D) Representative kymographs of recycling endosome motility in dendrites. Scale bar = 5 µm. (E) Quantification of the average number of recycling endosome entries into dendrites during 50 s of the live recording after photobleaching. Error bars indicate SEM; ns - not significant (Mann-Whitney test). N = 2."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Example", "of", "Western", "blot", "analysis", "of", "DCLK1", "and", "DCX", "levels", "in", "protein", "extracts", "obtained", "from", "DIV1", ",", "DIV7", ",", "DIV14", "and", "DIV21", "hippocampal", "neurons", ".", "(", "B", ")", "Representative", "image", "of", "a", "hippocampal", "neuron", "(", "DIV14", ")", "immunostained", "for", "DCLK1", "and", "β", "-", "III", "-", "tubulin", ".", "Scale", "bar", "=", "20", "µm", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "Representative", "image", "of", "a", "COS", "-", "7", "cell", "transfected", "with", "DCLK1", "-", "GFP", "(", "C", ")", "or", "DCLK1", "(", "ΔKD", ")", "-", "GFP", "(", "D", ")", "and", "stained", "for", "detyrosinated", ",", "tyrosinated", "or", "α", "-", "tubulin", ".", "(", "E", ")", "Representative", "image", "of", "a", "COS", "-", "7", "cell", "transfected", "with", "DCLK1", "-", "GFP", "and", "TagRFP", "-", "EB3", "and", "recorded", "during", "live", "-", "cell", "imaging", ".", "Representative", "GFP", "was", "drawn", "(", "over", "a", "region", "marked", "with", "white", "boxes", ")", "showing", "that", "DCLK1", "-", "GFP", "colocalizes", "with", "EB3", "-", "TagRFP", "-", "T", ".", "Scale", "bars", "=", "20", "um", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Example of Western blot analysis of DCLK1 and DCX levels in protein extracts obtained from DIV1, DIV7, DIV14 and DIV21 hippocampal neurons.(B) Representative image of a hippocampal neuron (DIV14) immunostained for DCLK1 and β-III-tubulin. Scale bar = 20 µm.(C, D) Representative image of a COS-7 cell transfected with DCLK1-GFP (C) or DCLK1(ΔKD)-GFP (D) and stained for detyrosinated, tyrosinated or α-tubulin.(E) Representative image of a COS-7 cell transfected with DCLK1-GFP and TagRFP-EB3 and recorded during live-cell imaging. Representative GFP was drawn (over a region marked with white boxes) showing that DCLK1-GFP colocalizes with EB3-TagRFP-T. Scale bars = 20 um."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Extracts", "of", "DIV", "7", "hippocampal", "neurons", "electroporated", "with", "pSuper", "control", "or", "with", "three", "different", "DCLK1", "shRNAs", "at", "DIV0", ".", "Samples", "were", "analyzed", "by", "western", "blot", "with", "indicated", "antibodies", ".", "(", "B", ",", "E", ")", "Representative", "images", "of", "a", "hippocampal", "cell", "transfected", "at", "DIV10", "with", "RFP", "(", "to", "visualize", "transfected", "cells", ")", ",", "pSUPER", "(", "control", ")", "or", "DCLK1", "shRNA", ",", "fixed", "at", "DIV14", "and", "stained", "for", "EB3", ".", "Black", "lines", "indicate", "the", "neuronal", "soma", "outline", ".", "Scale", "bars", "=", "10", "µm", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "EB3", "comets", "in", "the", "dendrite", "(", "C", ")", "and", "in", "the", "soma", "(", "D", ")", ".", "25", "-", "26", "neurons", "were", "analyzed", "per", "condition", ",", "N", "=", "2", ".", "Error", "bars", "indicate", "SEM", ",", "*", "*", "*", "-", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "-", "p", "<", "0", ",", "01", "(", "unpaired", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "F", "-", "I", ")", "Hippocampal", "neurons", "were", "co", "-", "transfected", "with", "MACF18", "-", "GFP", "and", "pSUPER", "(", "control", ")", "or", "DCLK1", "shRNA", "and", "the", "dynamics", "of", "microtubules", "in", "dendrites", "was", "traced", "using", "life", "-", "cell", "microscopy", ".", "(", "F", ")", "Representative", "kymographs", "of", "dynamic", "microtubules", "ends", "growth", "in", "dendrites", "with", "and", "without", "photoablation", ".", "Scale", "bar", "=", "10", "µm", "(", "C", ")", ".", "(", "G", ",", "I", ")", "Quantification", "of", "the", "fraction", "of", "MACF18", "events", "moving", "retrogradely", "and", "anterogradely", "in", "a", "dendrite", "before", "(", "G", ")", "and", "after", "(", "I", ")", "photoablation", ".", "Eighteen", "neurons", "were", "analyzed", "per", "condition", ";", "N", "=", "2", ".", "(", "H", ")", "Scheme", "of", "live", "-", "cell", "imaging", "after", "photoablation", ".", "(", "J", ",", "K", ")", "Biotin", "pull", "-", "downs", "(", "PD", ")", "from", "extracts", "of", "HEK293", "transfected", "with", "biotin", "-", "tagged", "DCLK1", "and", "(", "J", ")", "KIF1A", "-", "MDC", "-", "HA", "-", "FRB", ",", "KIF1C", "-", "MDC", "-", "HA", "-", "FRB", ",", "KIF5B", "-", "MDC", "-", "HA", "-", "FRB", "constructs", "and", "probed", "for", "HA", "/", "DCLK1", ",", "(", "K", ")", "different", "GFP", "-", "tagged", "KIF1A", "truncation", "constructs", "and", "probed", "for", "GFP", "/", "DCLK1", ".", "The", "ratio", "input", "/", "pellet", "is", "2", "%", "for", "all", "pull", "-", "down", "experiments", ".", "(", "L", ")", "GFP", "pull", "-", "down", "from", "extracts", "of", "HEK293", "transfected", "with", "DCLK1", "fragments", "and", "KIF1A", "-", "MDC", "-", "HA", "-", "FRB", ",", "KIF1C", "-", "MDC", "-", "HA", "-", "FRB", "and", "KIF1C", "-", "MD", "-", "HA", "and", "probed", "for", "HA", "/", "GFP", ".", "LacZ", "-", "HA", "was", "used", "as", "a", "negative", "control", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Extracts of DIV 7 hippocampal neurons electroporated with pSuper control or with three different DCLK1 shRNAs at DIV0. Samples were analyzed by western blot with indicated antibodies.(B, E) Representative images of a hippocampal cell transfected at DIV10 with RFP (to visualize transfected cells), pSUPER (control) or DCLK1 shRNA, fixed at DIV14 and stained for EB3. Black lines indicate the neuronal soma outline. Scale bars = 10 µm.(C, D) Quantification of the number of EB3 comets in the dendrite (C) and in the soma (D). 25-26 neurons were analyzed per condition, N=2. Error bars indicate SEM, *** - p < 0.001, ** - p<0,01 (unpaired t-test).(F-I) Hippocampal neurons were co-transfected with MACF18-GFP and pSUPER (control) or DCLK1 shRNA and the dynamics of microtubules in dendrites was traced using life-cell microscopy. (F) Representative kymographs of dynamic microtubules ends growth in dendrites with and without photoablation. Scale bar = 10 µm (C). (G, I) Quantification of the fraction of MACF18 events moving retrogradely and anterogradely in a dendrite before (G) and after (I) photoablation. Eighteen neurons were analyzed per condition; N=2. (H) Scheme of live-cell imaging after photoablation.(J, K) Biotin pull-downs (PD) from extracts of HEK293 transfected with biotin-tagged DCLK1 and (J) KIF1A-MDC-HA-FRB, KIF1C-MDC-HA-FRB, KIF5B-MDC-HA-FRB constructs and probed for HA/DCLK1, (K) different GFP-tagged KIF1A truncation constructs and probed for GFP/DCLK1. The ratio input/pellet is 2% for all pull-down experiments.(L) GFP pull-down from extracts of HEK293 transfected with DCLK1 fragments and KIF1A-MDC-HA-FRB, KIF1C-MDC-HA-FRB and KIF1C-MD-HA and probed for HA/GFP. LacZ-HA was used as a negative control."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Exomer", "components", "localize", "to", "different", "extent", "to", "the", "TGN", "and", "to", "the", "cytoplasm", ".", "Fluorescence", "images", "of", "cells", "expressing", "GFP", "-", "tagged", "exomer", "components", "and", "TGN", "marker", "Sec7", "-", "DsRed", ".", "The", "brightness", "and", "contrast", "were", "adjusted", "differently", "in", "the", "GFP", "and", "merge", "images", ".", "Bar", ",", "5", "µm", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "the", "relative", "TGN", "to", "cytoplasm", "concentration", "of", "the", "GFP", "-", "tagged", "ChAPs", "in", "the", "cell", ".", "The", "mean", "fluorescence", "at", "the", "TGN", "and", "cytoplasm", "was", "determined", "using", "the", "Icy", "imaging", "software", ".", "20", "-", "30", "individual", "cells", "were", "analysed", ".", "For", "statistical", "significance", "testing", "the", "Student", "'", "s", "T", "test", "was", "used", ".", "(", "C", ")", "FCS", "measures", "the", "in", "vivo", "mobility", "of", "exomer", "components", "in", "the", "cytoplasm", ".", "FCS", "analysis", "was", "performed", "on", "the", "GFP", ",", "Chs5", "-", "GFP", "and", "GFP", "-", "tagged", "ChAPs", "in", "the", "wild", "-", "type", "background", "(", "top", ")", "and", "on", "GFP", "-", "tagged", "ChAPs", "in", "the", "Δchs5", "background", "(", "bottom", ")", ".", "10", "-", "20", "FCS", "measurements", "were", "performed", "for", "each", "condition", "using", "different", "cells", ".", "The", "ACF", "of", "free", "GFP", "is", "fitted", "with", "a", "one", "-", "component", "anomalous", "diffusion", "model", ".", "The", "ACF", "of", "Chs5", "in", "WT", "and", "ChAPs", "in", "WT", "and", "Δchs5", "background", "is", "fitted", "with", "a", "two", "-", "component", "diffusion", "model", ".", "Representative", "ACF", "curves", "(", "thin", "full", "lines", ")", "and", "fits", "(", "thick", "dashed", "lines", ")", "are", "shown", ".", "Estimated", "diffusion", "correlation", "times", ",", "diffusion", "coefficients", "and", "fractions", "are", "shown", "in", "Table", "1", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "the", "Chs5", "independent", "fraction", "of", "ChAPs", "present", "in", "the", "cytoplasm", "based", "on", "the", "measurements", "shown", "in", "(", "C", ")", ".", "(", "E", ")", "Comparison", "of", "the", "residuals", "of", "the", "one", "-", "component", "and", "two", "-", "component", "fit", "(", "arrows", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Exomer components localize to different extent to the TGN and to the cytoplasm. Fluorescence images of cells expressing GFP-tagged exomer components and TGN marker Sec7-DsRed. The brightness and contrast were adjusted differently in the GFP and merge images. Bar, 5 µm.(B) Quantification of the relative TGN to cytoplasm concentration of the GFP-tagged ChAPs in the cell. The mean fluorescence at the TGN and cytoplasm was determined using the Icy imaging software. 20-30 individual cells were analysed. For statistical significance testing the Student's T test was used.(C) FCS measures the in vivo mobility of exomer components in the cytoplasm. FCS analysis was performed on the GFP, Chs5-GFP and GFP-tagged ChAPs in the wild-type background (top) and on GFP-tagged ChAPs in the Δchs5 background (bottom). 10-20 FCS measurements were performed for each condition using different cells. The ACF of free GFP is fitted with a one-component anomalous diffusion model. The ACF of Chs5 in WT and ChAPs in WT and Δchs5 background is fitted with a two-component diffusion model. Representative ACF curves (thin full lines) and fits (thick dashed lines) are shown. Estimated diffusion correlation times, diffusion coefficients and fractions are shown in Table 1.(D) Quantification of the Chs5 independent fraction of ChAPs present in the cytoplasm based on the measurements shown in (C).(E) Comparison of the residuals of the one-component and two-component fit (arrows)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Comparison", "of", "the", "dynamic", "behavior", "of", "the", "GFP", "-", "tagged", "Chs5", "and", "Bch1", "with", "the", "GFP", "-", "tagged", "Sec28", ",", "Cop1", ",", "Clc1", "and", "Apm1", ".", "The", "mean", "of", "20", "-", "30", "FRAP", "measurements", "from", "different", "cells", "is", "shown", ".", "Calculated", "parameters", "are", "shown", "in", "Table", "2", ".", "(", "B", ")", "Binding", "kinetics", "of", "the", "GFP", "-", "tagged", "Chs5", "and", "ChAPs", "at", "the", "TGN", "is", "different", ".", "Data", "processing", "was", "carried", "out", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "the", "relative", "expression", "levels", "of", "the", "exomer", "components", "in", "GFP", "-", "tagged", "strains", ".", "A", "representative", "immunoblot", "of", "yeast", "lysates", "is", "shown", ";", "Pgk1", "serves", "as", "loading", "control", ".", "The", "asterisks", "depict", "the", "analyzed", "bands", ".", "The", "plot", "shows", "average", "and", "SD", "of", "three", "independent", "biological", "experiments", ".", "The", "relative", "expression", "levels", "are", "normalized", "to", "Chs6", "(", "depicted", "by", "the", "red", "line", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Comparison of the dynamic behavior of the GFP-tagged Chs5 and Bch1 with the GFP-tagged Sec28, Cop1, Clc1 and Apm1. The mean of 20-30 FRAP measurements from different cells is shown. Calculated parameters are shown in Table 2.(B) Binding kinetics of the GFP-tagged Chs5 and ChAPs at the TGN is different. Data processing was carried out as in (A).(C) Quantification of the relative expression levels of the exomer components in GFP-tagged strains. A representative immunoblot of yeast lysates is shown; Pgk1 serves as loading control. The asterisks depict the analyzed bands. The plot shows average and SD of three independent biological experiments. The relative expression levels are normalized to Chs6 (depicted by the red line)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Chs5", "is", "necessary", "for", "recruitment", "and", "stable", "binding", "of", "ChAPs", "at", "the", "TGN", ".", "Differential", "centrifugation", "of", "cell", "lysates", "obtained", "from", "Chs6", "-", "GFP", "WT", "and", "Δchs5", "strain", ".", "TCL", ",", "total", "cell", "lysate", ";", "S10", ",", "10", ",", "000", "g", "supernatant", ";", "P10", ",", "10", ",", "000", "g", "pellet", ";", "S100", ",", "100", ",", "000", "g", "supernatant", ";", "P100", ",", "100", ",", "000", "g", "pellet", ".", "Anp1", "serves", "as", "the", "Golgi", "marker", "and", "Pgk1", "as", "the", "cytoplasm", "marker", ".", "A", "representative", "immunoblot", "of", "three", "independent", "biological", "experiments", "is", "shown", ".", "(", "B", ")", "Diffusional", "behavior", "of", "GFP", "-", "tagged", "ChAPs", "in", "the", "cytoplasm", "(", "open", "triangles", ",", "dashed", "line", ")", "and", "at", "the", "TGN", "(", "closed", "circles", ",", "full", "line", ")", ".", "The", "mean", "of", "10", "-", "20", "FRAP", "measurements", "from", "different", "cells", "is", "shown", ".", "Calculated", "diffusion", "coefficients", "are", "shown", "in", "Expanded", "View", "Table", "1", ".", "(", "C", ")", "Chs5", "-", "GFP", "displays", "reduced", "membrane", "association", "in", "the", "absence", "of", "ChAPs", ".", "Differential", "centrifugation", "of", "cell", "lysates", "obtained", "from", "Chs5", "GFP", "WT", "and", "ΔΔΔΔ", "strains", ".", "TCL", ",", "total", "cell", "lysate", ";", "S10", ",", "10", ",", "000", "g", "supernatant", ";", "P10", ",", "10", ",", "000", "g", "pellet", ";", "S100", ",", "100", ",", "000", "g", "supernatant", ";", "P100", ",", "100", ",", "000", "g", "pellet", ".", "Anp1", "serves", "as", "the", "Golgi", "marker", "and", "Pgk1", "as", "the", "cytoplasm", "marker", ".", "A", "representative", "immunoblot", "of", "three", "independent", "biological", "experiments", "is", "shown", ".", "(", "D", ")", "Fluorescence", "images", "of", "cells", "expressing", "Chs5", "-", "GFP", "and", "TGN", "marker", "Sec7", "-", "DsRed", "in", "WT", ",", "ChAP", "and", "strains", ".", "Merged", "images", "depict", "the", "differences", "in", "Chs5", "-", "GFP", "localization", "to", "the", "TGN", ",", "cytoplasm", "and", "distinct", "foci", "(", "arrows", ")", "in", "these", "strains", ".", "The", "brightness", "and", "contrast", "were", "adjusted", "differently", "in", "the", "merged", "images", ".", "Bar", ",", "5", "µm", ".", "(", "E", ")", "Co", "-", "localization", "analysis", "of", "Chs5", "-", "GFP", "and", "TGN", "marker", "Sec7", "-", "DsRed", "in", "WT", ",", "ChAP", "and", "strains", ".", "Mander", "1", "depicts", "the", "relative", "amount", "of", "the", "GFP", "signal", "co", "-", "localizing", "with", "the", "overall", "DsRed", "signal", ",", "and", "Mander", "2", "vice", "versa", ".", "Manders", "coefficients", "were", "obtained", "using", "the", "JACoP", "plug", "-", "in", "for", "ImageJ", "after", "background", "subtraction", "(", "N", "=", "20", ")", "and", "are", "given", "in", "Expanded", "View", "Table", "2", ".", "(", "F", ")", "Binding", "kinetics", "of", "Chs5", "-", "GFP", "at", "the", "TGN", "in", "WT", ",", "ChAP", "and", "strains", ".", "The", "mean", "of", "20", "-", "30", "FRAP", "measurements", "from", "different", "cells", "is", "shown", ".", "Calculated", "parameters", "are", "shown", "in", "Table", "2", ".", "The", "schematic", "cartoons", "depict", "the", "predicted", "majority", "of", "the", "analyzed", "complexes", ".", "The", "violet", "ovals", "represent", "Chs5", "dimer", "and", "circles", "represent", "ChAPs", ":", "green", ":", "Bch1", ",", "red", ":", "Bud7", ",", "dark", "blue", ":", "Bch2", ",", "light", "blue", ":", "Chs6", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Chs5 is necessary for recruitment and stable binding of ChAPs at the TGN. Differential centrifugation of cell lysates obtained from Chs6-GFP WT and Δchs5 strain. TCL, total cell lysate; S10, 10,000 g supernatant; P10, 10,000 g pellet; S100, 100,000 g supernatant; P100, 100,000 g pellet. Anp1 serves as the Golgi marker and Pgk1 as the cytoplasm marker. A representative immunoblot of three independent biological experiments is shown.(B) Diffusional behavior of GFP-tagged ChAPs in the cytoplasm (open triangles, dashed line) and at the TGN (closed circles, full line). The mean of 10-20 FRAP measurements from different cells is shown. Calculated diffusion coefficients are shown in Expanded View Table 1.(C) Chs5-GFP displays reduced membrane association in the absence of ChAPs. Differential centrifugation of cell lysates obtained from Chs5 GFP WT and ΔΔΔΔ strains. TCL, total cell lysate; S10, 10,000 g supernatant; P10, 10,000 g pellet; S100, 100,000 g supernatant; P100, 100,000 g pellet. Anp1 serves as the Golgi marker and Pgk1 as the cytoplasm marker. A representative immunoblot of three independent biological experiments is shown.(D) Fluorescence images of cells expressing Chs5-GFP and TGN marker Sec7-DsRed in WT, ChAP and strains. Merged images depict the differences in Chs5-GFP localization to the TGN, cytoplasm and distinct foci (arrows) in these strains. The brightness and contrast were adjusted differently in the merged images. Bar, 5 µm.(E) Co-localization analysis of Chs5-GFP and TGN marker Sec7-DsRed in WT, ChAP and strains. Mander 1 depicts the relative amount of the GFP signal co-localizing with the overall DsRed signal, and Mander 2 vice versa. Manders coefficients were obtained using the JACoP plug-in for ImageJ after background subtraction (N = 20) and are given in Expanded View Table 2.(F) Binding kinetics of Chs5-GFP at the TGN in WT, ChAP and strains. The mean of 20-30 FRAP measurements from different cells is shown. Calculated parameters are shown in Table 2. The schematic cartoons depict the predicted majority of the analyzed complexes. The violet ovals represent Chs5 dimer and circles represent ChAPs: green:Bch1, red:Bud7, dark blue:Bch2, light blue:Chs6."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", "-", "B", ")", "Overexpression", "of", "Bch2", "in", "absence", "of", "other", "ChAPs", "results", "in", "more", "efficient", "Chs5", "recruitment", "and", "stabilization", "at", "the", "TGN", ".", "Fluorescence", "images", "of", "cells", "expressing", "Chs5", "-", "GFP", "(", "A", ")", "and", "binding", "kinetics", "of", "Chs5", "-", "GFP", "at", "the", "TGN", "(", "B", ")", "in", "WT", ",", "BCH2", "and", "GPD", "-", "BCH2", "strains", ".", "Bar", ",", "5", "µm", ".", "The", "mean", "of", "20", "-", "30", "FRAP", "measurements", "from", "different", "cells", "is", "shown", ".", "Calculated", "parameters", "are", "shown", "in", "Table", "2", ".", "The", "schematic", "cartoons", "depict", "the", "predicted", "majority", "of", "the", "analyzed", "complexes", ";", "Chs5", "dimer", ":", "violet", "ovals", ",", "Bch2", ":", "dark", "blue", "circles", ".", "(", "C", "-", "D", ")", "Overexpression", "of", "Chs6", "in", "absence", "of", "other", "ChAPs", "results", "in", "more", "efficient", "Chs5", "recruitment", "and", "stabilization", "at", "the", "TGN", ".", "(", "C", ")", "Fluorescence", "images", "of", "cells", "expressing", "Chs5", "-", "GFP", "in", "WT", ",", "CHS6", "and", "GPD", "-", "CHS6", "strains", ".", "Bar", ",", "5", "µm", ".", "(", "D", ")", "Binding", "kinetics", "of", "Chs5", "-", "GFP", "at", "the", "TGN", "in", "WT", ",", ",", "CHS6", "and", "GPD", "-", "CHS6", "strains", ".", "Data", "processing", "was", "carried", "out", "as", "in", "(", "A", "-", "B", ")", ".", "The", "schematic", "cartoons", "depict", "the", "predicted", "majority", "of", "the", "analyzed", "complexes", ";", "Chs5", "dimer", ":", "violet", "ovals", ",", "Chs6", ":", "light", "blue", "circles", ".", "(", "E", "-", "G", ")", "Overexpression", "of", "Chs6", "rescues", "Chs3", "export", "in", "absence", "of", "other", "ChAPs", ".", "(", "E", ")", "Fluorescence", "images", "of", "cells", "expressing", "Chs3", "-", "GFP", "in", "WT", ",", "CHS6", "and", "GPD", "-", "CHS6", "strains", ".", "Arrows", "point", "to", "Chs3", "-", "GFP", "signals", "at", "the", "bud", "neck", ".", "Bar", ",", "5", "µm", ".", "The", "inset", "represents", "a", "twofold", "magnification", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "phenotypes", "in", "(", "E", ")", ";", "100", "small", "budded", "and", "100", "large", "budded", "cells", "were", "quantified", "per", "experiment", ".", "Average", "and", "SD", "of", "three", "independent", "biological", "experiments", "is", "shown", ".", "(", "G", ")", "Chs3", "GFP", "GPD", "-", "CHS6", "strain", "was", "sensitive", "to", "calcofluor", "to", "a", "similar", "extent", "as", "the", "WT", "strain", ".", "Plates", "were", "incubated", "at", "30", "°", "C", "for", "2", "-", "3", "days", ".", "A", "representative", "drop", "test", "of", "three", "independent", "biological", "experiments", "is", "shown", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A-B) Overexpression of Bch2 in absence of other ChAPs results in more efficient Chs5 recruitment and stabilization at the TGN. Fluorescence images of cells expressing Chs5-GFP (A) and binding kinetics of Chs5-GFP at the TGN (B) in WT, BCH2 and GPD-BCH2 strains. Bar, 5 µm. The mean of 20-30 FRAP measurements from different cells is shown. Calculated parameters are shown in Table 2. The schematic cartoons depict the predicted majority of the analyzed complexes; Chs5 dimer:violet ovals, Bch2:dark blue circles.(C-D) Overexpression of Chs6 in absence of other ChAPs results in more efficient Chs5 recruitment and stabilization at the TGN. (C) Fluorescence images of cells expressing Chs5-GFP in WT, CHS6 and GPD-CHS6 strains. Bar, 5 µm. (D) Binding kinetics of Chs5-GFP at the TGN in WT, , CHS6 and GPD-CHS6 strains. Data processing was carried out as in (A-B). The schematic cartoons depict the predicted majority of the analyzed complexes; Chs5 dimer: violet ovals, Chs6: light blue circles.(E-G) Overexpression of Chs6 rescues Chs3 export in absence of other ChAPs. (E) Fluorescence images of cells expressing Chs3-GFP in WT, CHS6 and GPD-CHS6 strains. Arrows point to Chs3-GFP signals at the bud neck. Bar, 5 µm. The inset represents a twofold magnification.(F) Quantification of phenotypes in (E); 100 small budded and 100 large budded cells were quantified per experiment. Average and SD of three independent biological experiments is shown.(G) Chs3 GFP GPD-CHS6 strain was sensitive to calcofluor to a similar extent as the WT strain. Plates were incubated at 30°C for 2-3 days. A representative drop test of three independent biological experiments is shown."}
{"words": ["Figure", "5Fluorescence", "images", "of", "cells", "expressing", "Chs5", "-", "GFP", "and", "TGN", "marker", "Sec7DsRed", "(", "A", ")", "and", "binding", "kinetics", "of", "Chs5", "-", "GFP", "at", "the", "TGN", "(", "B", ")", "in", "WT", ",", "CHS6", "and", "CHS6BUD7", "(", "A", ",", "B", ")", "The", "brightness", "and", "contrast", "were", "adjusted", "differently", "in", "the", "merged", "images", ".", "Bar", ",", "5", "µm", ".", "The", "mean", "of", "20", "-", "30", "FRAP", "measurements", "from", "different", "cells", "is", "shown", ".", "Calculated", "parameters", "are", "shown", "in", "Table", "2", ".", "Fluorescence", "images", "of", "cells", "expressing", "Chs5", "-", "GFP", "and", "TGN", "marker", "Sec7DsRed", "(", "C", ")", "and", "binding", "kinetics", "of", "Chs5", "-", "GFP", "at", "the", "TGN", "(", "D", ")", "in", "WT", ",", "or", "CHS6BCH2", "(", "C", ",", "D", ")", "strains", ".", "The", "brightness", "and", "contrast", "were", "adjusted", "differently", "in", "the", "merged", "images", ".", "Bar", ",", "5", "µm", ".", "The", "mean", "of", "20", "-", "30", "FRAP", "measurements", "from", "different", "cells", "is", "shown", ".", "Calculated", "parameters", "are", "shown", "in", "Table", "2", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Fluorescence images of cells expressing Chs5-GFP and TGN marker Sec7DsRed (A) and binding kinetics of Chs5-GFP at the TGN (B) in WT, CHS6 and CHS6BUD7 (A, B) The brightness and contrast were adjusted differently in the merged images. Bar, 5 µm. The mean of 20-30 FRAP measurements from different cells is shown. Calculated parameters are shown in Table 2.Fluorescence images of cells expressing Chs5-GFP and TGN marker Sec7DsRed (C) and binding kinetics of Chs5-GFP at the TGN (D) in WT, or CHS6BCH2 (C, D) strains. The brightness and contrast were adjusted differently in the merged images. Bar, 5 µm. The mean of 20-30 FRAP measurements from different cells is shown. Calculated parameters are shown in Table 2."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", "-", "D", ")", "ChAPs", "are", "differently", "dependent", "on", "each", "other", "in", "terms", "of", "binding", "at", "the", "TGN", ".", "Binding", "kinetics", "of", "GFP", "-", "tagged", "Chs6", "(", "A", ")", ",", "Bud7", "(", "B", ")", ",", "Bch2", "(", "C", ")", "and", "Bch1", "(", "D", ")", "at", "the", "TGN", "in", "the", "presence", "(", "WT", ")", "or", "absence", "of", "the", "other", "ChAPs", "(", ")", ".", "The", "mean", "of", "20", "-", "30", "FRAP", "measurements", "from", "different", "cells", "is", "shown", ".", "Calculated", "parameters", "are", "shown", "in", "Table", "2", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A-D) ChAPs are differently dependent on each other in terms of binding at the TGN. Binding kinetics of GFP-tagged Chs6 (A), Bud7 (B), Bch2 (C) and Bch1 (D) at the TGN in the presence (WT) or absence of the other ChAPs (). The mean of 20-30 FRAP measurements from different cells is shown. Calculated parameters are shown in Table 2."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", "-", "B", ")", "Overexpression", "of", "Bch1", "displaces", "Chs6", "from", "the", "TGN", "and", "impairs", "plasma", "membrane", "localization", "of", "Chs6", "-", "dependent", "cargo", "Chs3", ".", "Fluorescence", "images", "of", "Chs6", "-", "GFP", "(", "A", ")", "and", "Chs3", "-", "GFP", "(", "B", ")", "in", "WT", "and", "GPD", "-", "BCH1", "strains", ".", "Bar", ",", "5", "µm", ".", "Arrows", "point", "to", "Chs3", "-", "GFP", "signals", "at", "the", "bud", "neck", ".", "The", "inset", "represents", "a", "twofold", "magnification", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "the", "phenotypes", "in", "(", "B", ")", ";", "100", "small", "budded", "and", "100", "large", "budded", "cells", "were", "quantified", "per", "experiment", ".", "Average", "and", "SD", "of", "three", "independent", "biological", "experiments", "is", "shown", ".", "(", "D", ")", "Chitin", "production", "is", "reduced", "upon", "Bch1", "overexpression", ".", "Fluorescence", "images", "of", "chitin", "stained", "with", "calcofluor", "in", "Chs3", "-", "GFP", "WT", ",", "chs5", "and", "GPD", "-", "BCH1", "strains", ".", "(", "E", ")", "Overexpression", "of", "Bch1", "does", "not", "impair", "plasma", "membrane", "localization", "of", "the", "Bch1", "-", "dependent", "cargo", "Pin2", ".", "Fluorescence", "images", "of", "Pin2", "-", "GFP", "in", "WT", "and", "GPD", "-", "BCH1", "strains", ".", "(", "F", "-", "I", ")", "Overexpression", "of", "Chs6", "displaces", "Bch1", "and", "Chs5", "from", "the", "TGN", ".", "Fluorescence", "images", "(", "F", "-", "G", ")", "and", "binding", "kinetics", "at", "the", "TGN", "(", "H", "-", "I", ")", "of", "cells", "expressing", "Bch1", "-", "GFP", "(", "F", ",", "H", ")", "and", "Chs5", "-", "GFP", "(", "G", ",", "I", ")", "upon", "overexpression", "of", "Chs6", "under", "GPD", "promoter", "from", "2μ", "plasmid", ".", "The", "insets", "in", "(", "F", ",", "G", ")", "represent", "two", "-", "fold", "magnifications", ".", "The", "arrows", "in", "(", "F", ")", "point", "to", "residual", "Bch1", "staining", "at", "the", "TGN", ".", "The", "mean", "of", "20", "-", "30", "FRAP", "measurements", "from", "different", "cells", "is", "shown", ".", "Calculated", "parameters", "are", "shown", "in", "Table", "2", ".", "Size", "bars", "represent", "5", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A-B) Overexpression of Bch1 displaces Chs6 from the TGN and impairs plasma membrane localization of Chs6-dependent cargo Chs3. Fluorescence images of Chs6-GFP (A) and Chs3-GFP (B) in WT and GPD-BCH1 strains. Bar, 5 µm. Arrows point to Chs3-GFP signals at the bud neck. The inset represents a twofold magnification.(C) Quantification of the phenotypes in (B); 100 small budded and 100 large budded cells were quantified per experiment. Average and SD of three independent biological experiments is shown.(D) Chitin production is reduced upon Bch1 overexpression. Fluorescence images of chitin stained with calcofluor in Chs3-GFP WT, chs5 and GPD-BCH1 strains.(E) Overexpression of Bch1 does not impair plasma membrane localization of the Bch1-dependent cargo Pin2. Fluorescence images of Pin2-GFP in WT and GPD-BCH1 strains.(F-I) Overexpression of Chs6 displaces Bch1 and Chs5 from the TGN. Fluorescence images (F-G) and binding kinetics at the TGN (H-I) of cells expressing Bch1-GFP (F, H) and Chs5-GFP (G, I) upon overexpression of Chs6 under GPD promoter from 2μ plasmid. The insets in (F, G) represent two-fold magnifications. The arrows in (F) point to residual Bch1 staining at the TGN. The mean of 20-30 FRAP measurements from different cells is shown. Calculated parameters are shown in Table 2. Size bars represent 5 µm."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "A", ")", "Overexpression", "of", "Pin2", "enhances", "Chs5", "stabilization", "at", "the", "TGN", ".", "Binding", "kinetics", "of", "Chs5", "GFP", "in", "WT", ",", "bud7bch1", "and", "bud7bch1", "strain", "expressing", "Bch2", "-", "dependent", "cargo", "Pin2", "from", "a", "centromeric", "or", "a", "2μ", "plasmid", ".", "The", "mean", "of", "20", "-", "30", "FRAP", "measurements", "from", "different", "cells", "is", "shown", ".", "Calculated", "parameters", "are", "shown", "in", "Table", "2", ".", "(", "B", ")", "Comparison", "of", "the", "expression", "levels", "of", "the", "endogenous", "Pin2", "with", "the", "levels", "of", "Pin2", "expressed", "from", "a", "centromeric", "or", "a", "2μ", "plasmid", ".", "Pgk1", "serves", "as", "loading", "control", ".", "A", "representative", "immunoblot", "of", "three", "independent", "biological", "experiments", "is", "shown", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(A) Overexpression of Pin2 enhances Chs5 stabilization at the TGN. Binding kinetics of Chs5 GFP in WT, bud7bch1 and bud7bch1 strain expressing Bch2-dependent cargo Pin2 from a centromeric or a 2μ plasmid. The mean of 20-30 FRAP measurements from different cells is shown. Calculated parameters are shown in Table 2.(B) Comparison of the expression levels of the endogenous Pin2 with the levels of Pin2 expressed from a centromeric or a 2μ plasmid. Pgk1 serves as loading control. A representative immunoblot of three independent biological experiments is shown."}
{"words": ["Figure", "1D", ",", "E", "Images", "of", "FRET", "efficiency", "in", "mock", "-", "treated", "(", "-", "ant", ".", "A", ",", "D", ")", "and", "Antimycin", "A", "-", "treated", "(", "+", "ant", ".", "A", ".", ",", "E", ")", "ubi", "-", "AT1", ".", "03NL", "wing", "discs", "at", "time", "point", "2", "h", ".", "A", "rainbow", "colormap", "is", "used", "to", "indicate", "the", "FRET", "efficiency", "levels", ".", "Scale", "bars", "=", "50", "µm", ".", "F", "Line", "graphs", "showing", "the", "FRET", "efficiency", "in", "individual", "mock", "-", "treated", "(", "-", "ant", ".", "A", ",", "n", "=", "26", ")", "and", "ant", ".", "A", "-", "treated", "(", "+", "ant", ".", "A", ".", ",", "n", "=", "19", ")", "ubi", "-", "AT1", ".", "03NL", "wing", "discs", "before", "(", "0", "h", ")", "and", "after", "2", "h", "of", "treatment", ".", "Paired", "t", "-", "test", ",", "ns", "=", "not", "significant", ",", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "001", ".", "G", "-", "J", "Time", "-", "controlled", "knock", "-", "down", "of", "metabolic", "enzymes", "in", "the", "dorsal", "compartment", "of", "ubi", "-", "AT1", ".", "03NL", "wing", "discs", "using", "the", "apGalts", "driver", ".", "Images", "of", "FRET", "efficiency", "in", "control", "(", "G", ")", ",", "apGalts", ">", "PfkRNAi", "(", "H", ")", ",", "apGalts", ">", "GapdhRNAi", "(", "I", ")", ",", "and", "apGalts", ">", "Glo1RNAi", "(", "J", ")", "wing", "discs", "after", "RNAi", "induction", "for", "48", "h", "(", "G", ")", ",", "120", "h", "(", "H", ",", "J", ")", ",", "and", "93", "hours", "(", "I", ")", ".", "A", "rainbow", "colormap", "is", "used", "to", "indicate", "the", "FRET", "efficiency", "levels", ".", "Scale", "bars", "=", "50", "µm", ".", "K", "Line", "graphs", "showing", "the", "FRET", "efficiency", "in", "the", "ventral", "and", "dorsal", "compartment", "of", "individual", "control", "(", "n", "=", "27", ")", ",", "apGalts", ">", "PfkRNAi", "(", "n", "=", "7", ")", ",", "apGalts", ">", "GapdhRNAi", "(", "n", "=", "10", ")", ",", "and", "apGalts", ">", "Glo1RNAi", "(", "n", "=", "6", ")", "wing", "discs", ".", "Loss", "of", "Pfk", ",", "Gapdh", "or", "Glo1", "in", "the", "dorsal", "compartment", "of", "the", "wing", "disc", "reduces", "the", "levels", "of", "ATP", ".", "Paired", "t", "-", "test", ",", "ns", "=", "not", "significant", ",", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "001", ".", "L", "Time", "-", "controlled", "knock", "-", "down", "of", "ecdysoneless", "(", "ecd", ")", "in", "the", "dorsal", "compartment", "of", "ubi", "-", "AT1", ".", "03NL", "wing", "discs", "using", "apGalts", ">", "ecdRNAi", ".", "Image", "of", "FRET", "efficiency", "in", "apGalts", ">", "ecdRNAi", "wing", "disc", "48", "h", "after", "RNAi", "induction", ".", "A", "rainbow", "colormap", "is", "used", "to", "indicate", "the", "FRET", "efficiency", "levels", ".", "Scale", "bars", "=", "50", "µm", ".", "M", "Line", "graph", "showing", "the", "FRET", "in", "the", "dorsal", "and", "ventral", "compartment", "of", "apGalts", ">", "ecdRNAi", "(", "n", "=", "28", ")", "wing", "discs", ".", "Loss", "of", "Ecd", "in", "the", "dorsal", "compartment", "of", "the", "wing", "disc", "reduces", "the", "levels", "of", "ATP", ".", "Paired", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1D, E Images of FRET efficiency in mock-treated (- ant.A, D) and Antimycin A-treated (+ ant. A., E) ubi-AT1.03NL wing discs at time point 2 h. A rainbow colormap is used to indicate the FRET efficiency levels. Scale bars= 50 µm. F Line graphs showing the FRET efficiency in individual mock-treated (- ant. A, n=26) and ant. A-treated (+ ant. A., n=19) ubi-AT1.03NL wing discs before (0 h) and after 2 h of treatment. Paired t-test, ns= not significant, ***p≤0.001. G-J Time-controlled knock-down of metabolic enzymes in the dorsal compartment of ubi-AT1.03NL wing discs using the apGalts driver. Images of FRET efficiency in control (G), apGalts>PfkRNAi (H), apGalts>GapdhRNAi (I), and apGalts>Glo1RNAi (J) wing discs after RNAi induction for 48 h (G), 120 h (H, J), and 93 hours (I). A rainbow colormap is used to indicate the FRET efficiency levels. Scale bars = 50 µm. K Line graphs showing the FRET efficiency in the ventral and dorsal compartment of individual control (n=27), apGalts>PfkRNAi (n=7), apGalts>GapdhRNAi (n=10), and apGalts>Glo1RNAi (n=6) wing discs. Loss of Pfk, Gapdh or Glo1 in the dorsal compartment of the wing disc reduces the levels of ATP. Paired t-test, ns= not significant, **p≤0.01, ***p≤0.001. L Time-controlled knock-down of ecdysoneless (ecd) in the dorsal compartment of ubi-AT1.03NL wing discs using apGalts>ecdRNAi. Image of FRET efficiency in apGalts>ecdRNAi wing disc 48 h after RNAi induction. A rainbow colormap is used to indicate the FRET efficiency levels. Scale bars = 50 µm. M Line graph showing the FRET in the dorsal and ventral compartment of apGalts>ecdRNAi (n=28) wing discs. Loss of Ecd in the dorsal compartment of the wing disc reduces the levels of ATP. Paired t-test, ***p≤0.001. "}
{"words": ["Figure", "2A", "-", "D", "Adult", "wing", "phenotype", "of", "knock", "-", "down", "of", "Gapdh", "(", "C765", ">", "GapdhRNAi", ")", ",", "over", "-", "expression", "of", "full", "-", "length", "Ecd", "(", "C765", ">", "ecd", ")", ",", "over", "-", "expression", "of", "C", "-", "terminally", "truncated", "form", "of", "Ecd", "(", "C765", ">", "ecdDN", ")", ",", "and", "knock", "-", "down", "of", "ecd", "(", "C765", ">", "ecdRNAi", ")", "in", "the", "whole", "wing", "disc", "(", "see", "Appendix", "Fig", "S3A", "for", "the", "expression", "pattern", "of", "C765", "-", "Gal4", ")", ".", "Images", "of", "adult", "wings", "of", "control", "(", "A", ")", ",", "C765", ">", "GapdhRNAi", "(", "A", "'", ")", ",", "C765", ">", "ecd", "(", "B", ")", ",", "C765", ">", "ecdDN", "(", "C", ")", ",", "and", "C765", ">", "ecdRNAi", "(", "D", ")", "male", "flies", ".", "(", "A", "'", "'", ")", "Overlay", "of", "the", "wings", "shown", "in", "A", "and", "A", "'", ".", "(", "C", "'", ")", "Overlay", "of", "control", "wing", "and", "wing", "shown", "in", "C", "and", "C", "'", ".", "Loss", "of", "Ecd", "throughout", "the", "wing", "discs", "produces", "adults", "with", "vestigal", "wings", "(", "D", ")", ".", "In", "contrast", ",", "the", "effects", "of", "ecdDN", "over", "-", "expression", "or", "Gapdh", "knock", "-", "down", "are", "less", "severe", "on", "tissue", "survival", ",", "giving", "rise", "to", "smaller", "wings", "with", "altered", "proportions", ".", "Images", "consist", "of", "a", "series", "of", "tiles", "that", "were", "stitched", "together", "by", "the", "microscope", "software", ".", "Scale", "bar", "=", "500", "μm", ".", "E", ",", "F", "Tukey", "box", "-", "and", "-", "whiskers", "plot", "showing", "quantifications", "of", "the", "area", "(", "E", ")", "and", "shape", "(", "aspect", "ratio", ":", "major", "/", "minor", "axis", ",", "F", ")", "of", "control", ",", "C765", ">", "GapdhRNAi", ",", "C765", ">", "ecd", ",", "and", "C765", ">", "ecdDN", "wings", ".", "Lower", "and", "upper", "hinges", "correspond", "to", "the", "first", "and", "third", "quartiles", ",", "vertical", "lines", "extend", "to", "±", "1", ".", "5", "times", "the", "interquartile", "range", ".", "Sample", "size", "is", "indicated", "for", "each", "perturbation", ".", "Loss", "of", "Gapdh", "or", "over", "-", "expression", "of", "EcdDN", "leads", "to", "smaller", "wings", "that", "are", "increased", "along", "the", "anterior", "-", "posterior", "(", "A", "/", "P", ")", "axis", "compared", "to", "the", "proximal", "-", "distal", "(", "P", "/", "D", ")", "axis", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "followed", "by", "Dunnett", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A-D Adult wing phenotype of knock-down of Gapdh (C765>GapdhRNAi), over-expression of full-length Ecd (C765>ecd), over-expression of C-terminally truncated form of Ecd (C765>ecdDN), and knock-down of ecd (C765>ecdRNAi) in the whole wing disc (see Appendix Fig S3A for the expression pattern of C765-Gal4). Images of adult wings of control (A), C765>GapdhRNAi (A'), C765>ecd (B), C765>ecdDN (C), and C765>ecdRNAi (D) male flies. (A'') Overlay of the wings shown in A and A'. (C') Overlay of control wing and wing shown in C and C'. Loss of Ecd throughout the wing discs produces adults with vestigal wings (D). In contrast, the effects of ecdDN over-expression or Gapdh knock-down are less severe on tissue survival, giving rise to smaller wings with altered proportions. Images consist of a series of tiles that were stitched together by the microscope software. Scale bar= 500 μm. E, F Tukey box-and-whiskers plot showing quantifications of the area (E) and shape (aspect ratio: major/minor axis, F) of control, C765>GapdhRNAi, C765>ecd, and C765>ecdDN wings. Lower and upper hinges correspond to the first and third quartiles, vertical lines extend to ± 1.5 times the interquartile range. Sample size is indicated for each perturbation. Loss of Gapdh or over-expression of EcdDN leads to smaller wings that are increased along the anterior-posterior (A/P) axis compared to the proximal-distal (P/D) axis. Statistical analysis was performed using one-way ANOVA, followed by Dunnett's multiple comparisons test. ***p≤0.001. "}
{"words": ["Figure", "3", "A", "-", "B", "'", "Time", "-", "controlled", "knock", "-", "down", "of", "ecd", "in", "the", "dorsal", "compartment", "of", "the", "wing", "discs", "(", "see", "Fig", "1C", "for", "the", "expression", "pattern", "of", "apGalts", ")", ".", "IF", "of", "control", "(", "A", ",", "A", "'", ")", "and", "apGalts", ">", "ecdRNAi", "(", "B", ",", "B", "'", ")", "wing", "discs", ",", "stained", "for", "the", "Hedgehog", "(", "Hh", ")", "pathway", "components", "Smoothened", "(", "Smo", ",", "A", ",", "B", ")", ",", "and", "Ci155", "(", "A", "'", ",", "B", "'", ")", ".", "Next", "to", "the", "images", "are", "quantifications", "of", "the", "respective", "staining", "in", "the", "dorsal", "versus", "ventral", "compartment", "of", "control", "(", "n", "=", "5", ")", "and", "apGalts", ">", "ecdRNAi", "(", "n", "=", "5", ")", "wing", "discs", ".", "Graphs", "show", "mean", "(", "thick", "line", ")", "±", "SD", "(", "thin", "lines", ")", ".", "Dashed", "yellow", "lines", "indicate", "the", "position", "of", "the", "A", "/", "P", "boundary", ".", "Statistical", "analyses", "(", "t", "-", "test", ")", "revealed", "significant", "differences", "in", "Smo", "and", "Ci155", "expression", "in", "the", "dorsal", "compartment", "between", "control", "and", "apGalts", ">", "ecdRNAi", "(", "Smo", ":", "p", "≤", "0", ".", "001", ",", "Ci155", ":", "p", "≤", "0", ".", "001", ")", "wing", "discs", ".", "Thus", ",", "loss", "of", "Ecd", "elevates", "Smo", "levels", "on", "the", "plasma", "membrane", "and", "increases", "the", "range", "of", "Ci155", "stabilization", "in", "the", "anterior", "compartment", ".", "Wing", "discs", "were", "analyzed", "48", "h", "after", "RNAi", "induction", ".", "Scale", "bars", "=", "50", "μm", ".", "C", "-", "E", "'", "Time", "-", "controlled", "knock", "-", "down", "of", "metabolic", "enzymes", "in", "the", "dorsal", "compartment", "of", "the", "wing", "disc", ".", "IF", "of", "apGalts", ">", "PfkRNAi", ",", "apGalts", ">", "GapdhRNAi", ",", "and", "apGalts", ">", "Glo1RNAi", "wing", "discs", ",", "stained", "for", "Smo", "(", "C", ",", "D", ",", "E", ")", "and", "Ci155", "(", "C", "'", ",", "D", "'", ",", "E", "'", ")", ".", "Next", "to", "the", "images", "are", "quantifications", "of", "the", "respective", "staining", "in", "the", "dorsal", "versus", "ventral", "compartment", "of", "apGalts", ">", "PfkRNAi", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "apGalts", ">", "GapdhRNAi", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "and", "apGalts", ">", "Glo1RNAi", "(", "n", "=", "6", ")", "wing", "discs", ".", "Graphs", "show", "mean", "(", "thick", "line", ")", "±", "SD", "(", "thin", "lines", ")", ".", "Dashed", "yellow", "lines", "indicate", "the", "position", "of", "the", "A", "/", "P", "boundary", ".", "Statistical", "analyses", "(", "t", "-", "test", ")", "revealed", "significant", "differences", "in", "Smo", "and", "Ci155", "expression", "in", "the", "dorsal", "compartment", "between", "control", "and", "apGalts", ">", "PfkRNAi", "(", "Smo", ":", "p", "≤", "0", ".", "001", ",", "Ci155", ":", "p", "≤", "0", ".", "01", ")", ",", "apGalts", ">", "GapdhRNAi", "(", "Smo", ",", "Ci155", ":", "p", "≤", "0", ".", "05", ")", ",", "or", "apGalts", ">", "Glo1RNAi", "(", "Smo", ":", "p", "≤", "0", ".", "001", ",", "Ci155", ":", "p", "≤", "0", ".", "05", ")", "wing", "discs", ".", "Thus", ",", "loss", "of", "Pfk", ",", "Gapdh", "or", "Glo1", "elevates", "Smo", "levels", "on", "the", "plasma", "membrane", "and", "increases", "the", "range", "of", "Ci155", "stabilization", "in", "the", "anterior", "compartment", ".", "Wing", "discs", "were", "analyzed", "120", "h", "after", "RNAi", "induction", ".", "Scale", "bars", "=", "50", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3 A-B' Time-controlled knock-down of ecd in the dorsal compartment of the wing discs (see Fig 1C for the expression pattern of apGalts). IF of control (A, A') and apGalts>ecdRNAi (B, B') wing discs, stained for the Hedgehog (Hh) pathway components Smoothened (Smo, A, B), and Ci155 (A', B'). Next to the images are quantifications of the respective staining in the dorsal versus ventral compartment of control (n=5) and apGalts>ecdRNAi (n=5) wing discs. Graphs show mean (thick line) ± SD (thin lines). Dashed yellow lines indicate the position of the A/P boundary. Statistical analyses (t-test) revealed significant differences in Smo and Ci155 expression in the dorsal compartment between control and apGalts>ecdRNAi (Smo: p≤0.001, Ci155: p≤0.001) wing discs. Thus, loss of Ecd elevates Smo levels on the plasma membrane and increases the range of Ci155 stabilization in the anterior compartment. Wing discs were analyzed 48 h after RNAi induction. Scale bars= 50 μm. C-E' Time-controlled knock-down of metabolic enzymes in the dorsal compartment of the wing disc. IF of apGalts>PfkRNAi, apGalts>GapdhRNAi, and apGalts>Glo1RNAi wing discs, stained for Smo (C, D, E) and Ci155 (C', D', E'). Next to the images are quantifications of the respective staining in the dorsal versus ventral compartment of apGalts>PfkRNAi (n=5), apGalts>GapdhRNAi (n=5), and apGalts>Glo1RNAi (n=6) wing discs. Graphs show mean (thick line) ± SD (thin lines). Dashed yellow lines indicate the position of the A/P boundary. Statistical analyses (t-test) revealed significant differences in Smo and Ci155 expression in the dorsal compartment between control and apGalts>PfkRNAi (Smo: p≤0.001, Ci155: p≤0.01), apGalts>GapdhRNAi (Smo, Ci155: p≤0.05), or apGalts>Glo1RNAi (Smo: p≤0.001, Ci155: p≤0.05) wing discs. Thus, loss of Pfk, Gapdh or Glo1 elevates Smo levels on the plasma membrane and increases the range of Ci155 stabilization in the anterior compartment. Wing discs were analyzed 120 h after RNAi induction. Scale bars= 50 μm."}
{"words": ["Figure", "4A", "-", "D", "'", "'", "'", "IF", "of", "NIH3T3", "cells", "stably", "expressing", "Smo", "-", "mEos2", "treated", "with", "mock", "(", "control", ",", "A", "-", "A", "'", "'", "'", ")", ",", "the", "Smo", "agonist", "(", "+", "SAG", ",", "B", "-", "B", "'", "'", "'", ")", "or", "the", "glycolytic", "inhibitors", "3", "-", "bromopyruvate", "(", "+", "3", "-", "BP", ",", "C", "-", "C", "'", "'", "'", ")", "and", "2", "-", "deoxyglucose", "(", "+", "2", "-", "DG", ",", "D", "-", "D", "'", "'", "'", ")", ".", "DAPI", "staining", ",", "shown", "in", "gray", ",", "was", "used", "to", "visualize", "cell", "nuclei", ".", "Acetylated", "tubulin", "(", "AcTub", ")", ",", "used", "as", "a", "ciliary", "marker", ",", "is", "shown", "in", "magenta", ",", "Smo", "-", "mEos2", "is", "shown", "in", "green", ".", "Zoomed", "-", "in", "images", "of", "cilia", "marked", "by", "white", "arrows", "in", "A", "'", "'", ",", "B", "'", "'", ",", "C", "'", "'", ",", "and", "D", "'", "'", "are", "shown", "in", "A", "'", "'", "'", ",", "B", "'", "'", "'", ",", "C", "'", "'", "'", ",", "and", "D", "'", "'", "'", ".", "Scale", "bars", "=", "5", "μm", ",", "but", "2", "μm", "in", "A", "'", "'", "'", ",", "B", "'", "'", "'", ",", "C", "'", "'", "'", ",", "and", "D", "'", "'", "'", ".", "E", ",", "F", "Box", "plot", "showing", "quantification", "of", "Smo", "-", "mEos2", "ciliary", "localization", "in", "NIH3T3", "cells", "upon", "3", "-", "BP", "(", "E", ")", "and", "2", "-", "DG", "(", "F", ")", "treatment", ",", "respectively", ".", "Lower", "and", "upper", "hinges", "correspond", "to", "the", "first", "and", "third", "quartiles", ",", "vertical", "lines", "extend", "to", "the", "minimum", "and", "maximum", "values", ".", "Sample", "size", "is", "indicated", "for", "each", "perturbation", ".", "Treatment", "with", "glycolytic", "inhibitors", "induces", "Smo", "-", "mEos2", "localization", "to", "the", "primary", "cilium", ".", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A-D''' IF of NIH3T3 cells stably expressing Smo-mEos2 treated with mock (control, A-A'''), the Smo agonist (+ SAG, B-B''') or the glycolytic inhibitors 3-bromopyruvate (+3-BP, C-C''') and 2-deoxyglucose (+ 2-DG, D-D'''). DAPI staining, shown in gray, was used to visualize cell nuclei. Acetylated tubulin (AcTub), used as a ciliary marker, is shown in magenta, Smo-mEos2 is shown in green. Zoomed-in images of cilia marked by white arrows in A'', B'', C'', and D'' are shown in A''', B''', C''', and D'''. Scale bars= 5 μm, but 2 μm in A''', B''', C''', and D'''. E, F Box plot showing quantification of Smo-mEos2 ciliary localization in NIH3T3 cells upon 3-BP (E) and 2-DG (F) treatment, respectively. Lower and upper hinges correspond to the first and third quartiles, vertical lines extend to the minimum and maximum values. Sample size is indicated for each perturbation. Treatment with glycolytic inhibitors induces Smo-mEos2 localization to the primary cilium . t-test, ***p≤0.001."}
{"words": ["Figure", "5", "A", "-", "B", "Time", "-", "controlled", "knock", "-", "down", "of", "ecd", "in", "the", "dorsal", "compartment", "of", "the", "wing", "discs", "(", "see", "Fig", "1C", "for", "the", "expression", "pattern", "of", "apGalts", ")", ".", "IF", "of", "control", "(", "A", ")", "and", "apGalts", ">", "ecdRNAi", "(", "B", ")", "wing", "discs", ",", "stained", "for", "Hh", ".", "Next", "to", "the", "images", "are", "quantifications", "of", "the", "respective", "staining", "in", "the", "dorsal", "versus", "ventral", "compartment", "of", "control", "(", "n", "=", "4", ")", "and", "apGalts", ">", "ecdRNAi", "(", "n", "=", "5", ")", "wing", "discs", ".", "Graphs", "show", "mean", "(", "thick", "line", ")", "±", "SD", "(", "thin", "lines", ")", ".", "Dashed", "yellow", "lines", "indicate", "the", "position", "of", "the", "A", "/", "P", "boundary", ".", "Statistical", "analysis", "(", "t", "-", "test", ")", "revealed", "no", "significant", "differences", "in", "Hh", "expression", "in", "the", "dorsal", "compartment", "between", "control", "and", "apGalts", ">", "ecdRNAi", "wing", "discs", ".", "Thus", ",", "loss", "of", "Ecd", "does", "not", "affect", "Hh", "production", "and", "spreading", ".", "Wing", "discs", "were", "analyzed", "48", "h", "after", "RNAi", "induction", ".", "Scale", "bars", "=", "50", "μm", ".", "C", "-", "F", "Time", "-", "controlled", "knock", "-", "down", "of", "ecd", "in", "the", "dorsal", "compartment", "of", "dispatched", "mutant", "wing", "discs", "(", "dispS037707", ",", "apGalts", ">", "ecdRNAi", ",", "see", "Fig", "1C", "for", "the", "expression", "pattern", "of", "apGalts", ")", ".", "IF", "of", "control", "(", "C", ")", ",", "apGalts", ">", "ecdRNAi", "(", "D", ")", ",", "dispS037707", "(", "E", ")", "and", "dispS037707", ",", "apGalts", ">", "ecdRNAi", "(", "F", ")", "wing", "discs", "expressing", "the", "decapentaplegic", "(", "dpp", ")", "reporter", "gene", "dpp", "-", "lacZ", "(", "dppZ", ")", ",", "stained", "for", "dppZ", ".", "Next", "to", "the", "images", "are", "quantifications", "of", "the", "respective", "stainings", "(", "n", "=", "4", "(", "C", ",", "F", ")", ",", "n", "=", "5", "(", "D", ")", ",", "n", "=", "3", "(", "E", ")", ")", ".", "Graphs", "show", "mean", "(", "thick", "line", ")", "±", "SD", "(", "thin", "lines", ")", ".", "Dashed", "yellow", "lines", "indicate", "the", "position", "of", "the", "A", "/", "P", "boundary", ".", "Statistical", "analyses", "(", "t", "-", "test", ")", "revealed", "a", "significant", "difference", "in", "dppZ", "expression", "in", "the", "dorsal", "compartment", "between", "control", "and", "apGalts", ">", "ecdRNAi", "(", "p", "≤", "0", ".", "01", ")", "(", "C", "vs", "D", ")", ",", "and", "dispS037707", "and", "dispS037707", ",", "apGalts", ">", "ecdRNAi", "(", "p", "≤", "0", ".", "01", ")", "wing", "discs", "(", "E", "vs", "F", ")", ".", "Loss", "of", "Ecd", "elevates", "the", "expression", "of", "dppZ", "in", "a", "broader", "than", "normal", "stripe", ".", "However", ",", "lack", "of", "Ecd", "function", "alone", "is", "not", "sufficient", "to", "trigger", "dpp", "expression", ",", "which", "instead", "depends", "on", "the", "presence", "of", "Hh", ".", "Wing", "discs", "were", "analyzed", "48", "h", "after", "RNAi", "induction", ".", "Scale", "bars", "=", "50", "μm", ".", "G", "-", "J", "IF", "of", "dispS037707", "(", "G", ",", "I", ")", "and", "dispS037707", ",", "apGalts", ">", "ecdRNAi", "(", "H", ",", "J", ")", "wing", "discs", ",", "stained", "for", "Smo", "(", "G", ",", "H", ")", "and", "Ci155", "(", "I", ",", "J", ")", ".", "Next", "to", "the", "images", "are", "quantifications", "of", "the", "respective", "stainings", "(", "n", "=", "2", "(", "G", ",", "H", ")", ",", "n", "=", "3", "(", "I", ")", ",", "n", "=", "4", "(", "J", ")", ")", ".", "Graphs", "show", "mean", "(", "thick", "line", ")", "±", "SD", "(", "thin", "lines", ")", ".", "Dashed", "yellow", "lines", "indicate", "the", "position", "of", "the", "A", "/", "P", "boundary", ".", "Although", "statistical", "analyses", "(", "t", "-", "test", ")", "revealed", "no", "significant", "differences", "in", "Smo", "and", "Ci155", "expression", "in", "the", "dorsal", "compartment", "between", "control", "and", "dispS037707", ",", "apGalts", ">", "ecdRNAi", "wing", "discs", ",", "loss", "of", "Ecd", "slightly", "induces", "an", "increased", "Smo", "accumulation", "and", "Ci155", "stabilization", "independently", "of", "Hh", ".", "Wing", "discs", "were", "analyzed", "48", "h", "after", "RNAi", "induction", ".", "Scale", "bars", "=", "50", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5 A-B Time-controlled knock-down of ecd in the dorsal compartment of the wing discs (see Fig 1C for the expression pattern of apGalts). IF of control (A) and apGalts>ecdRNAi (B) wing discs, stained for Hh. Next to the images are quantifications of the respective staining in the dorsal versus ventral compartment of control (n=4) and apGalts>ecdRNAi (n=5) wing discs. Graphs show mean (thick line) ± SD (thin lines). Dashed yellow lines indicate the position of the A/P boundary. Statistical analysis (t-test) revealed no significant differences in Hh expression in the dorsal compartment between control and apGalts>ecdRNAi wing discs. Thus, loss of Ecd does not affect Hh production and spreading. Wing discs were analyzed 48 h after RNAi induction. Scale bars= 50 μm. C-F Time-controlled knock-down of ecd in the dorsal compartment of dispatched mutant wing discs (dispS037707, apGalts>ecdRNAi, see Fig 1C for the expression pattern of apGalts). IF of control (C), apGalts>ecdRNAi (D), dispS037707 (E) and dispS037707, apGalts>ecdRNAi (F) wing discs expressing the decapentaplegic (dpp) reporter gene dpp-lacZ (dppZ), stained for dppZ. Next to the images are quantifications of the respective stainings (n=4 (C, F), n=5 (D), n=3 (E)). Graphs show mean (thick line) ± SD (thin lines). Dashed yellow lines indicate the position of the A/P boundary. Statistical analyses (t-test) revealed a significant difference in dppZ expression in the dorsal compartment between control and apGalts>ecdRNAi (p≤0.01) (C vs D), and dispS037707 and dispS037707, apGalts>ecdRNAi (p≤0.01) wing discs (E vs F). Loss of Ecd elevates the expression of dppZ in a broader than normal stripe. However, lack of Ecd function alone is not sufficient to trigger dpp expression, which instead depends on the presence of Hh. Wing discs were analyzed 48 h after RNAi induction. Scale bars= 50 μm. G-J IF of dispS037707 (G, I) and dispS037707, apGalts>ecdRNAi (H, J) wing discs, stained for Smo (G, H) and Ci155 (I, J). Next to the images are quantifications of the respective stainings (n=2 (G, H), n=3 (I), n=4 (J)). Graphs show mean (thick line) ± SD (thin lines). Dashed yellow lines indicate the position of the A/P boundary. Although statistical analyses (t-test) revealed no significant differences in Smo and Ci155 expression in the dorsal compartment between control and dispS037707, apGalts>ecdRNAi wing discs, loss of Ecd slightly induces an increased Smo accumulation and Ci155 stabilization independently of Hh. Wing discs were analyzed 48 h after RNAi induction. Scale bars= 50 μm. "}
{"words": ["Figure", "6", "A", "-", "A", "'", "'", "'", "Time", "-", "controlled", "knock", "-", "down", "of", "ecd", "or", "Gapdh", "in", "the", "dorsal", "compartment", "of", "the", "wing", "discs", "(", "see", "Fig", "1C", "for", "the", "expression", "pattern", "of", "apGalts", ")", ".", "The", "plasma", "membrane", "potential", "was", "detected", "using", "DiBAC4", "(", "3", ")", ".", "The", "fluorescence", "intensity", "of", "DiBAC4", "(", "3", ")", "increases", "upon", "plasma", "membrane", "depolarization", ".", "(", "A", ")", "The", "change", "in", "plasma", "membrane", "potential", "upon", "genetic", "perturbation", "was", "quantified", "as", "the", "fold", "change", "in", "the", "ratio", "of", "DiBAC4", "(", "3", ")", "signal", "intensity", "in", "the", "dorsal", "to", "ventral", "compartment", "(", "control", "(", "n", "=", "19", ")", ",", "apGalts", ">", "ecdRNAi", "(", "n", "=", "36", ")", "and", "apGalts", ">", "GapdhRNAi", "(", "n", "=", "18", ")", "wing", "discs", ")", ".", "Error", "bars", "indicate", "±", "SD", ".", "t", "-", "test", ",", "*", "p", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "001", ".", "(", "A", "'", "-", "A", "'", "'", "'", ")", "Representative", "images", "of", "DiBAC4", "(", "3", ")", "assay", "in", "control", "(", "A", "'", ")", ",", "apGalts", ">", "ecdRNAi", "(", "A", "'", "'", ")", ",", "and", "apGalts", ">", "GapdhRNAi", "(", "A", "'", "'", "'", ")", "wing", "discs", "48", "h", "or", "120", "h", "after", "RNAi", "induction", ",", "respectively", ".", "V", "/", "D", "indicates", "the", "boundary", "between", "the", "ventral", "and", "dorsal", "compartments", ".", "Next", "to", "the", "maximal", "projections", "are", "shown", "the", "sum", "projections", "of", "cross", "-", "sections", "along", "the", "A", "/", "P", "axis", ".", "Loss", "of", "Ecd", "or", "Gapdh", "alters", "the", "plasma", "membrane", "potential", ".", "Scale", "bars", "=", "50", "μm", ".", "D", "-", "E", "'", "'", "Dissipation", "of", "the", "plasma", "membrane", "potential", "upon", "treatment", "of", "wing", "discs", "with", "gramicidin", "A", "(", "gA", ")", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "DiBAC4", "(", "3", ")", "signal", "intensity", "in", "mock", "-", "treated", "(", "-", "gA", ",", "n", "=", "7", ")", "and", "gA", "-", "treated", "(", "+", "gA", ",", "n", "=", "5", ")", "wing", "discs", ".", "(", "D", "'", ",", "D", "'", "'", ")", "Representative", "images", "of", "DiBAC4", "(", "3", ")", "assay", "in", "mock", "-", "(", "D", "'", ")", "and", "gA", "-", "treated", "(", "D", "'", "'", ")", "wing", "discs", ".", "Next", "to", "the", "maximal", "projections", "are", "shown", "sum", "projections", "of", "cross", "-", "sections", "along", "the", "A", "/", "P", "axis", ".", "(", "E", ")", "Quantification", "of", "PAC", "-", "NAE", "signal", "intensity", "in", "mock", "-", "(", "n", "=", "7", ")", "and", "gA", "-", "treated", "(", "n", "=", "9", ")", "wing", "discs", ",", "shown", "as", "fold", "change", "from", "control", "(", "mock", "-", "treated", ")", ".", "(", "E", "'", "-", "E", "'", "'", ")", "Representative", "images", "of", "PAC", "-", "NAE", "uptake", "in", "mock", "-", "(", "E", "'", ")", "and", "gA", "-", "treated", "(", "E", "'", "'", ")", "wing", "discs", ".", "GA", "treatment", "strongly", "reduces", "the", "uptake", "of", "PAC", "-", "NAE", ".", "Error", "bars", "indicate", "±", "SD", ".", "t", "-", "test", ",", "*", "p", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "001", ".", "Scale", "bars", "=", "50", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6 A-A''' Time-controlled knock-down of ecd or Gapdh in the dorsal compartment of the wing discs (see Fig 1C for the expression pattern of apGalts). The plasma membrane potential was detected using DiBAC4(3). The fluorescence intensity of DiBAC4(3) increases upon plasma membrane depolarization. (A) The change in plasma membrane potential upon genetic perturbation was quantified as the fold change in the ratio of DiBAC4(3) signal intensity in the dorsal to ventral compartment (control (n=19), apGalts>ecdRNAi (n=36) and apGalts>GapdhRNAi (n=18) wing discs). Error bars indicate ± SD. t-test, *p≤0.05, ***p≤0.001. (A'-A''') Representative images of DiBAC4(3) assay in control (A'), apGalts>ecdRNAi (A''), and apGalts>GapdhRNAi (A''') wing discs 48 h or 120 h after RNAi induction, respectively. V/D indicates the boundary between the ventral and dorsal compartments. Next to the maximal projections are shown the sum projections of cross-sections along the A/P axis. Loss of Ecd or Gapdh alters the plasma membrane potential. Scale bars= 50 μm.D-E'' Dissipation of the plasma membrane potential upon treatment of wing discs with gramicidin A (gA). (D) Quantification of DiBAC4(3) signal intensity in mock-treated (- gA, n=7) and gA-treated (+ gA, n=5) wing discs. (D', D'') Representative images of DiBAC4(3) assay in mock- (D') and gA-treated (D'') wing discs. Next to the maximal projections are shown sum projections of cross-sections along the A/P axis. (E) Quantification of PAC-NAE signal intensity in mock- (n=7) and gA-treated (n=9) wing discs, shown as fold change from control (mock-treated). (E'-E'') Representative images of PAC-NAE uptake in mock- (E') and gA-treated (E'') wing discs. GA treatment strongly reduces the uptake of PAC-NAE. Error bars indicate ± SD. t-test, *p≤0.05, ***p≤0.001. Scale bars= 50 μm."}
{"words": ["f1", "(", "a", ")", "WT", "and", "Pgam5", "KO", "MEFs", "evaluated", "by", "TEM", ".", "The", "black", "arrows", "indicate", "mitochondria", ";", "(", "b", ")", "TEM", "analysis", "after", "12", " ", "h", "CCCP", "treatment", ";", "black", "arrowheads", "indicate", "DMS", ".", "Inset", "shows", "a", "DMS", "with", "an", "encapsulated", "mitochondrion", ".", "The", "black", "arrows", "indicate", "mitochondria", ".", "Scale", "bar", "=", "0", ".", "5", "micron", ";", "(", "c", ")", "WT", "and", "KO", "MEFs", "were", "treated", "with", "CCCP", "for", "0", ",", "3", "or", "6", "h", "and", "cytosolic", "fractions", "were", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "LC", "-", "3", ",", "anti", "-", "p62", "or", "anti", "-", "actin", "as", "indicated", ".", "(", "d", ")", "Similar", "to", "c", ".", "WT", "and", "KO", "MEFs", "were", "treated", "with", "CCCP", "for", "6", "and", "12", " ", "h", "and", "immunoblotted", "for", "anti", "-", "COXIV", ",", "anti", "-", "Tomm20", "or", "anti", "-", "actin", "as", "indicated", ".", "For", "c", "and", "d", ",", "the", "numbers", "below", "each", "lane", "indicate", "the", "fractional", "band", "density", "compared", "with", "the", "0", " ", "h", "time", "point", ",", "which", "has", "been", "set", "at", "1", ".", "0", ";", "(", "e", ")", "Confocal", "photomicrographs", "of", "mt", "-", "Keima", "-", "transduced", "WT", "and", "KO", "MEFs", "treated", "with", "CCCP", "or", "DMSO", "vehicle", "for", "12", " ", "h", "(", "six", "individual", "cells", "from", "each", "group", "were", "scanned", "and", "representative", "cells", "are", "shown", ")", ";", "Intracellular", "mt", "-", "Keima", "excited", "at", "450", " ", "nm", "was", "shown", "in", "green", "colour", ",", "while", "red", "colour", "indicated", "the", "excitation", "by", "550", " ", "nm", "in", "the", "same", "cell", ".", "Scale", "bar", "=", "20", " ", "μm", ".", "(", "f", ")", "Mitochondrial", "extracts", "of", "WT", "and", "Pgam5", "KO", "MEFs", "treated", "with", "DMSO", "(", "−", ")", "or", "CCCP", "(", "+", ")", "for", "3", " ", "h", "and", "analysed", "by", "immunoblot", "as", "above", ".", "(", "Note", "that", "mouse", "PINK1", "antibody", "can", "only", "detect", "the", "full", "-", "length", "PINK1", ")", ".", "Arrow", "indicates", "the", "63", " ", "kDa", "form", "of", "PINK1", ".", "(", "g", ")", "Hela", "cells", "transduced", "with", "either", "nonspecific", "(", "NS", ")", "or", "PGAM5", "shRNA", "viruses", "were", "treated", "with", "CCCP", "for", "3", " ", "h", ",", "and", "mitochondrial", "fractions", "were", "immunoblotted", "for", "the", "proteins", "indicated", ".", "Full", "-", "length", "(", "*", "63", " ", "kDa", ")", "and", "cleaved", "(", "#", "54", " ", "kDa", ")", "PINK1", "are", "indicated", ".", "For", "f", "and", "g", ",", "the", "numbers", "below", "indicate", "the", "full", "-", "length", "PINK1", "band", "density", "compared", "with", "the", "first", "lane", "that", "has", "been", "set", "at", "1", ".", "0", "(", "h", ")", "Confocal", "micrographs", "of", "Hela", "cells", "as", "in", "g", "were", "transfected", "with", "PARKIN", "-", "YFP", "(", "green", ")", "plasmid", "before", "CCCP", "treatment", ",", "then", "(", "i", ")", "treated", "with", "CCCP", "for", "12", " ", "h", ".", "Mitochondria", "were", "stained", "with", "anti", "-", "Tomm20", "(", "red", ")", "4", "'", ",", "6", "-", "diamidino", "-", "2", "-", "phenylindole", "stained", "nucleus", "was", "shown", "in", "blue", ".", "Co", "-", "localization", "was", "indicated", "by", "white", "colour", ".", "Scale", "bar", "=", "10", " ", "μm", ".", "(", "j", ")", "Quantification", "of", "the", "co", "-", "localization", "percentage", "of", "Tomm20", "(", "red", ")", "with", "parkin", "(", "green", ")", "per", "cell", "by", "Imaris", "software", "(", "n", "=", "7", "for", "NS", "and", "PGAM5", "shRNA", "group", "separately", ".", "Results", "are", "presented", "as", "mean", "and", "s", ".", "d", ".", "values", "and", "were", "analysed", "by", "the", "student", "t", "-", "test", ")", ".", "All", "the", "blots", "and", "images", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "DMSO", ",", "dimethylsulphoxide", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f1(a) WT and Pgam5 KO MEFs evaluated by TEM. The black arrows indicate mitochondria; (b) TEM analysis after 12 h CCCP treatment; black arrowheads indicate DMS. Inset shows a DMS with an encapsulated mitochondrion. The black arrows indicate mitochondria. Scale bar=0.5 micron;(c) WT and KO MEFs were treated with CCCP for 0, 3 or 6 h and cytosolic fractions were immunoblotted with anti-LC-3, anti-p62 or anti-actin as indicated.(d) Similar to c. WT and KO MEFs were treated with CCCP for 6 and 12 h and immunoblotted for anti-COXIV, anti-Tomm20 or anti-actin as indicated. For c and d, the numbers below each lane indicate the fractional band density compared with the 0 h time point, which has been set at 1.0;(e) Confocal photomicrographs of mt-Keima-transduced WT and KO MEFs treated with CCCP or DMSO vehicle for 12 h (six individual cells from each group were scanned and representative cells are shown); Intracellular mt-Keima excited at 450 nm was shown in green colour, while red colour indicated the excitation by 550 nm in the same cell. Scale bar=20 μm.(f) Mitochondrial extracts of WT and Pgam5 KO MEFs treated with DMSO (−) or CCCP (+) for 3 h and analysed by immunoblot as above. (Note that mouse PINK1 antibody can only detect the full-length PINK1). Arrow indicates the 63 kDa form of PINK1.(g) Hela cells transduced with either nonspecific (NS) or PGAM5 shRNA viruses were treated with CCCP for 3 h, and mitochondrial fractions were immunoblotted for the proteins indicated. Full-length (*63 kDa) and cleaved (#54 kDa) PINK1 are indicated. For f and g, the numbers below indicate the full-length PINK1 band density compared with the first lane that has been set at 1.0(h) Confocal micrographs of Hela cells as in g were transfected with PARKIN-YFP (green) plasmid before CCCP treatment, then (i) treated with CCCP for 12 h. Mitochondria were stained with anti-Tomm20 (red) 4',6-diamidino-2-phenylindole stained nucleus was shown in blue. Co-localization was indicated by white colour. Scale bar=10 μm. (j) Quantification of the co-localization percentage of Tomm20 (red) with parkin (green) per cell by Imaris software (n=7 for NS and PGAM5 shRNA group separately. Results are presented as mean and s.d. values and were analysed by the student t-test). All the blots and images are representative of three independent experiments. DMSO, dimethylsulphoxide."}
{"words": ["f2", "(", "a", ")", "Mitochondria", "from", "MEFs", "from", "Parl", "WT", "(", "+", "/", "+", ")", "and", "KO", "(", "−", "/", "−", ")", "mice", "were", "treated", "with", "the", "indicated", "doses", "of", "proteinase", "K", "(", "Prot", ".", "K", ")", "for", "30", " ", "min", "on", "ice", "and", "then", "immunoblotted", "for", "the", "indicated", "proteins", ".", "Full", "-", "length", "and", "cleaved", "PGAM5", "bands", "are", "indicated", "with", "arrows", ".", "(", "b", ")", "Pgam5", "WT", "and", "KO", "MEFs", "were", "transduced", "with", "either", "nonspecific", "(", "NS", ")", "or", "Parl", "shRNA", "and", "either", "treated", "(", "+", ")", "or", "not", "(", "−", ")", "with", "CCCP", "for", "3", " ", "h", ".", "Mitochondria", "were", "then", "purified", "and", "analysed", "by", "immunoblot", "for", "the", "indicated", "proteins", ".", "(", "c", ")", "WT", "PINK1", "as", "well", "as", "kinase", "dead", "(", "KD", ")", "or", "Parkinson", "'", "s", "disease", "-", "associated", "PINK1", "mutants", "(", "C92F", ",", "A168P", ",", "H271Q", ",", "G309D", ",", "L347P", ",", "G386S", ",", "R464H", ")", "were", "co", "-", "transfected", "into", "HEK293T", "cells", "with", "the", "same", "amount", "PGAM5", "(", "lane", "1", "-", "9", ")", "or", "GFP", "(", "lane", "10", "-", "18", ")", "expression", "plasmids", "and", "total", "cell", "lysates", "were", "immunoblotting", "for", "PINK1", ",", "PGAM5", "and", "actin", ".", "The", "ratio", "of", "WT", "full", "-", "length", "(", "63", " ", "kDa", ")", "versus", "cleaved", "(", "54", " ", "kDa", ")", "PINK1", "(", "*", "/", "#", ")", "is", "shown", ".", "(", "d", ")", "Anti", "-", "myc", "immunoprecipitates", "(", "IP", ")", "of", "lysates", "from", "293T", "cells", "transfected", "with", "combinations", "of", "myc", "-", "tagged", "PGAM5", "and", "PINK1", "-", "V5", "with", "or", "without", "CCCP", "treatment", "and", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "PINK1", "or", "anti", "-", "myc", ".", "(", "e", ")", "Four", "constructs", "expressing", "either", ":", "(", "1", ")", "no", "PGAM5", "(", "empty", "vector", ")", "or", "(", "2", ")", "amino", "acids", "1", "-", "98", ",", "(", "3", ")", "1", "-", "110", "and", "(", "4", ")", "98", "-", "289", "truncated", "versions", "of", "PGAM5", "(", "left", "panel", ")", ".", "Immunoblot", "of", "HEK293T", "cells", "expressing", "PINK1", "-", "GFP", "and", "myc", "-", "tagged", "PGAM5", "truncation", "mutants", "as", "indicated", "with", "anti", "-", "PINK1", "or", "anti", "-", "myc", "for", "the", "input", "proteins", "as", "well", "as", "the", "anti", "-", "GFP", "IP", "(", "right", "panel", ")", ".", "(", "f", ")", "Co", "-", "transfection", "of", "GFP", ",", "WT", "PGAM5", ",", "2RA", "mutant", "(", "R98A", "and", "R104A", ")", "or", "the", "2HA", "mutant", "(", "H99A", "and", "H105A", ")", "with", "a", "PINK1", "expression", "plasmid", "into", "HEK293T", "cells", "and", "the", "input", "cell", "lysates", "as", "well", "as", "the", "anti", "-", "myc", "IP", "were", "immunoblotted", "with", "antibodies", "against", "PINK1", ",", "PGAM5", "or", "actin", ".", "WT", "PINK1", "was", "expressed", "in", "HEK293T", "cells", "with", "or", "without", "PGAM5", "or", "a", "GFP", "control", "plasmid", "after", "(", "g", ")", "DMSO", "or", "(", "h", ")", "CCCP", "treatment", ".", "Cells", "were", "permeabilized", "with", "digitonin", "or", "Triton", "X", "-", "100", "separately", ",", "followed", "by", "treatment", "with", "the", "indicated", "amounts", "of", "trypsin", "on", "ice", "for", "30", " ", "min", ".", "Cell", "lysates", "were", "immunoblotted", "for", "PINK1", ",", "PGAM5", ",", "Tomm20", "or", "HSP60", "as", "indicated", ".", "Full", "-", "length", "(", "*", "63", " ", "kDa", ")", "and", "cleaved", "(", "#", "54", " ", "kDa", ")", "PINK1", "are", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f2(a) Mitochondria from MEFs from Parl WT (+/+) and KO (−/−) mice were treated with the indicated doses of proteinase K (Prot.K) for 30 min on ice and then immunoblotted for the indicated proteins. Full-length and cleaved PGAM5 bands are indicated with arrows.(b) Pgam5 WT and KO MEFs were transduced with either nonspecific (NS) or Parl shRNA and either treated (+) or not (−) with CCCP for 3 h. Mitochondria were then purified and analysed by immunoblot for the indicated proteins.(c) WT PINK1 as well as kinase dead (KD) or Parkinson's disease-associated PINK1 mutants (C92F, A168P, H271Q, G309D, L347P, G386S, R464H) were co-transfected into HEK293T cells with the same amount PGAM5 (lane 1-9) or GFP (lane 10-18) expression plasmids and total cell lysates were immunoblotting for PINK1, PGAM5 and actin. The ratio of WT full-length (63 kDa) versus cleaved (54 kDa) PINK1 (*/#) is shown.(d) Anti-myc immunoprecipitates (IP) of lysates from 293T cells transfected with combinations of myc-tagged PGAM5 and PINK1-V5 with or without CCCP treatment and immunoblotting with anti-PINK1 or anti-myc.(e) Four constructs expressing either: (1) no PGAM5 (empty vector) or (2) amino acids 1-98, (3) 1-110 and (4) 98-289 truncated versions of PGAM5 (left panel). Immunoblot of HEK293T cells expressing PINK1-GFP and myc-tagged PGAM5 truncation mutants as indicated with anti-PINK1 or anti-myc for the input proteins as well as the anti-GFP IP (right panel).(f) Co-transfection of GFP, WT PGAM5, 2RA mutant (R98A and R104A) or the 2HA mutant (H99A and H105A) with a PINK1 expression plasmid into HEK293T cells and the input cell lysates as well as the anti-myc IP were immunoblotted with antibodies against PINK1, PGAM5 or actin.WT PINK1 was expressed in HEK293T cells with or without PGAM5 or a GFP control plasmid after (g) DMSO or (h) CCCP treatment. Cells were permeabilized with digitonin or Triton X-100 separately, followed by treatment with the indicated amounts of trypsin on ice for 30 min. Cell lysates were immunoblotted for PINK1, PGAM5, Tomm20 or HSP60 as indicated. Full-length (*63 kDa) and cleaved (#54 kDa) PINK1 are shown."}
{"words": ["f4", "(", "a", ")", "Body", "weight", "was", "measured", "in", "5", "-", "month", "-", "old", "and", "12", "-", "month", "-", "old", "female", "Pgam5", "WT", "and", "KO", "mice", ".", "Behavioral", "measurements", "on", "12", "-", "month", "-", "old", "female", "WT", "and", "KO", "mice", "(", "WT", "n", "=", "10", ",", "KO", "n", "=", "8", ")", "were", "as", "follows", ":", "(", "b", ")", "Open", "-", "field", "tests", "including", "time", "spent", "mobile", ",", "time", "spent", "immobile", ",", "whole", "area", "distance", "and", "centre", "area", "distance", ";", "Behavioral", "measurements", "on", "12", "-", "month", "-", "old", "female", "WT", "and", "KO", "mice", "(", "WT", "n", "=", "10", ",", "KO", "n", "=", "8", ")", "were", "as", "follows", ":", "(", "c", ")", "Gait", "length", ",", "gait", "frequency", "in", "steps", "/", "ss", "and", "step", "angle", ";", "(", "d", ")", "rearing", "test", ",", "(", "e", ")", "akinesia", "test", "and", "(", "f", ")", "ladder", "climb", "test", "and", "(", "g", ")", "vertical", "pole", "test", ".", "T", "-", "turn", "indicates", "the", "time", "mice", "spent", "to", "turn", "their", "bodies", "180", "degrees", "from", "the", "head", "up", "start", "position", "before", "descending", "the", "pole", ".", "T", "-", "down", "indicates", "the", "time", "mice", "spent", "to", "descend", "to", "the", "bottom", "of", "pole", ".", "Graphs", "show", "the", "mean", "and", "s", ".", "d", ".", "values", "and", "were", "analysed", "by", "the", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "*", "P0", ".", "05", ",", "*", "*", "P0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P0", ".", "001", ",", "NS", ",", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f4(a) Body weight was measured in 5-month-old and 12-month-old female Pgam5 WT and KO mice.Behavioral measurements on 12-month-old female WT and KO mice (WT n=10, KO n=8) were as follows: (b) Open-field tests including time spent mobile, time spent immobile, whole area distance and centre area distance;Behavioral measurements on 12-month-old female WT and KO mice (WT n=10, KO n=8) were as follows: (c) Gait length, gait frequency in steps/ss and step angle; (d) rearing test, (e) akinesia test and (f) ladder climb test and (g) vertical pole test. T-turn indicates the time mice spent to turn their bodies 180 degrees from the head up start position before descending the pole. T-down indicates the time mice spent to descend to the bottom of pole. Graphs show the mean and s.d. values and were analysed by the student's t-test, *P0.05, **P0.01, ***P0.001, NS, not significant."}
{"words": ["f5High", "-", "performance", "liquid", "chromatography", "-", "electrochemical", "detection", "quantitation", "of", "(", "a", ")", "striatal", "DA", "and", "its", "metabolites", "(", "b", ")", "dihydroxyphenylacetic", "acid", "(", "DOPAC", ")", "(", "c", ")", "Homovanillic", "acid", "(", "HVA", ")", "and", "(", "d", ")", "3MT", "levels", "at", "three", "different", "time", "points", "(", "1", ",", "2", "and", "12", "-", "month", "-", "old", ")", "in", "Pgam5", "WT", "or", "KO", "mice", ".", "(", "e", ")", "Representative", "images", "of", "TH", "-", "immunohistochemistry", "from", "WT", "and", "KO", "mice", ".", "The", "VTA", "region", "is", "indicated", ".", "Stereological", "quantitation", "of", "(", "f", ")", "TH", "and", "(", "g", ")", "Nissl", "-", "positive", "neurons", "in", "the", "SNpc", "(", "n", "=", "4", "mice", "per", "group", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "n", "=", "4", "mice", "per", "group", ".", "(", "two", "-", "way", "analysis", "of", "variance", ",", "*", "*", "*", "P0", ".", "01", ",", "*", "P0", ".", "05", ",", "NS", ",", "not", "significant", ")", ".", "mo", ",", "month", "old", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f5High-performance liquid chromatography-electrochemical detection quantitation of (a) striatal DA and its metabolites (b) dihydroxyphenylacetic acid (DOPAC) (c) Homovanillic acid (HVA) and (d) 3MT levels at three different time points (1, 2 and 12-month-old) in Pgam5 WT or KO mice.(e) Representative images of TH-immunohistochemistry from WT and KO mice. The VTA region is indicated. Stereological quantitation of (f) TH and (g) Nissl-positive neurons in the SNpc (n=4 mice per group). Error bars represent the mean±s.e.m., n=4 mice per group. (two-way analysis of variance, ***P0.01, *P0.05, NS, not significant). mo, month old."}
{"words": ["f6The", "18", "-", "month", "-", "old", "Pgam5", "WT", "and", "KO", "mice", "received", "either", "water", "as", "control", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "or", "5", " ", "mg", " ", "kg", "−", "1", "L", "-", "DOPA", "and", "12", ".", "5", " ", "mg", " ", "kg", "−", "1", "Benserazide", "(", "n", "=", "5", ")", "by", "intraperitoneal", "injection", ".", "Twenty", "minutes", "later", ",", "mice", "were", "subjected", "to", "the", "open", "-", "field", "test", "and", "the", "centre", "area", "time", "in", "seconds", "(", "s", ")", "as", "well", "as", "the", "centre", "area", "distance", "in", "centimeters", "(", "cm", ")", "were", "measured", "as", "described", "in", "the", "Materials", "and", "Methods", ".", "Graphs", "show", "the", "mean", "and", "s", ".", "d", ".", "values", "and", "were", "analysed", "by", "the", "student", "t", "-", "test", ",", "NS", ",", "no", "significance", ";", "*", "P0", ".", "05", ";", "*", "*", "P0", ".", "01", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f6The 18-month-old Pgam5 WT and KO mice received either water as control (n=4), or 5 mg kg−1 L-DOPA and 12.5 mg kg−1 Benserazide (n=5) by intraperitoneal injection. Twenty minutes later, mice were subjected to the open-field test and the centre area time in seconds (s) as well as the centre area distance in centimeters (cm) were measured as described in the Materials and Methods. Graphs show the mean and s.d. values and were analysed by the student t-test, NS, no significance; *P0.05; **P0.01."}
{"words": ["f1", "(", "a", ")", "WT", "and", "dnm1Δ", "cells", "expressing", "Vph1", "-", "RFP", "and", "Idp1", "-", "GFP", "were", "grown", "in", "minimal", "synthetic", "dextrose", "medium", "and", "transferred", "to", "lactate", "medium", "at", "an", "initial", "density", "of", "OD600", "0", ".", "08", ".", "The", "cells", "were", "then", "sampled", "daily", "and", "analysed", "by", "fluorescence", "microscopy", "(", "×", "100", "objective", ")", "during", "stationary", "phase", "mitophagy", "in", "lactate", "medium", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μm", ".", "(", "b", ")", "WT", ",", "dnm1Δ", "and", "dnm1Δ", "mgm1Δ", "mutants", "were", "grown", "in", "SL", "medium", "as", "described", "in", "Methods", ",", "and", "samples", "(", "10", "OD600", "units", ")", "were", "taken", "at", "each", "time", "point", ".", "Protein", "extracts", "were", "prepared", "and", "equal", "protein", "amounts", "(", "20", "μg", ")", "were", "subjected", "to", "SDS", "-", "polyacrylamide", "gel", "electrophoresis", "and", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "GFP", "antibody", ".", "(", "c", ")", "Quantification", "of", "the", "percent", "free", "GFP", "at", "the", "day", "4", "time", "point", "in", "each", "of", "the", "three", "strains", "analysed", "in", "b", ",", "using", "four", "independent", "experiments", "for", "each", "strain", ".", "Error", "bars", "indicate", "s", ".", "d", ".", "analysis", "of", "variance", ",", "P0", ".", "001", ";", "N", "=", "4", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f1(a) WT and dnm1Δ cells expressing Vph1-RFP and Idp1-GFP were grown in minimal synthetic dextrose medium and transferred to lactate medium at an initial density of OD600 0.08. The cells were then sampled daily and analysed by fluorescence microscopy (× 100 objective) during stationary phase mitophagy in lactate medium. Scale bar, 5 μm.(b) WT, dnm1Δ and dnm1Δ mgm1Δ mutants were grown in SL medium as described in Methods, and samples (10 OD600 units) were taken at each time point. Protein extracts were prepared and equal protein amounts (20 μg) were subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and immunoblotting with anti-GFP antibody.(c) Quantification of the percent free GFP at the day 4 time point in each of the three strains analysed in b, using four independent experiments for each strain. Error bars indicate s.d. analysis of variance, P0.001; N=4."}
{"words": ["f2", "(", "c", ")", "Density", "plot", "of", "the", "reproducibility", "of", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f2(c) Density plot of the reproducibility of biological replicates."}
{"words": ["f3", "(", "a", ")", "Ratios", "from", "proteins", "with", "quantifications", "from", "all", "samples", "were", "log2", "transformed", "and", "z", "-", "score", "normalized", ".", "Columns", "containing", "data", "from", "the", "different", "samples", "were", "clustered", "hierarchically", "and", "rows", "that", "contained", "protein", "entries", "were", "clustered", "by", "k", "-", "means", ".", "The", "proteins", "in", "each", "k", "-", "means", "cluster", "were", "tested", "for", "enrichment", "of", "GO", "CC", "(", "indicated", "in", "red", ")", "and", "GO", "BP", "(", "indicated", "in", "blue", ")", "terms", ".", "(", "b", ")", "Proteins", "associated", "with", "different", "cellular", "compartments", "were", "sequentially", "extracted", "and", "the", "average", "of", "their", "ratios", "were", "compared", "with", "averages", "of", "remaining", "proteins", ".", "(", "d", ")", "GO", "BP", "enrichment", "analysis", "of", "proteins", "in", "the", "different", "clusters", "compared", "with", "the", "remaining", "proteins", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f3(a) Ratios from proteins with quantifications from all samples were log2 transformed and z-score normalized. Columns containing data from the different samples were clustered hierarchically and rows that contained protein entries were clustered by k-means. The proteins in each k-means cluster were tested for enrichment of GO CC (indicated in red) and GO BP (indicated in blue) terms.(b) Proteins associated with different cellular compartments were sequentially extracted and the average of their ratios were compared with averages of remaining proteins.(d) GO BP enrichment analysis of proteins in the different clusters compared with the remaining proteins."}
{"words": ["f4A", "comparison", "of", "the", "SILAC", "-", "derived", "abundance", "as", "a", "function", "of", "time", ",", "for", "several", "proteins", "that", "either", "show", "differential", "behaviour", "between", "WT", "and", "the", "mutants", "(", "Idh2", ",", "Idp1", "and", "Aco2", ")", "and", "proteins", "that", "behave", "similarly", "between", "all", "the", "genetic", "backgrounds", "tested", "(", "Hsp78", ")", ".", "Shown", "are", "mean", "protein", "ratios", "(", "two", "replicates", "for", "mutants", ",", "three", "replicates", "for", "WT", ")", ",", "error", "bars", "indicating", "peptide", "-", "based", "relative", "s", ".", "d", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f4A comparison of the SILAC-derived abundance as a function of time, for several proteins that either show differential behaviour between WT and the mutants (Idh2, Idp1 and Aco2) and proteins that behave similarly between all the genetic backgrounds tested (Hsp78). Shown are mean protein ratios (two replicates for mutants, three replicates for WT), error bars indicating peptide-based relative s.d."}
{"words": ["f5WT", "(", "a", ")", ",", "dnm1Δ", "(", "b", ")", "and", "atg1Δ", "cells", "(", "c", ")", "and", "atg32Δ", "cells", "(", "d", ")", "expressing", "chromosomally", "tagged", "GFP", "chimeras", "of", "Aco2", ",", "Idh2", ",", "Idp1", "and", "Hsp78", "were", "incubated", "in", "SL", "medium", "for", "7", "days", ",", "and", "10", "OD600", "units", "were", "sampled", "at", "day", "1", "and", "day", "7", "and", "processed", "for", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "GFP", "antibodies", "as", "described", "in", "the", "Methods", "section", ".", "Positive", "control", "used", "in", "c", "and", "d", "was", "from", "dnm1Δ", "cells", "expressing", "Idp1", "-", "GFP", "from", "a", "plasmid", "at", "4", "-", "day", "incubation", "(", "Fig", ".", "1b", ",", "lane", "4", ")", ".", "Release", "of", "free", "GFP", "in", "WT", "cells", "is", "reproducibly", "variable", "between", "these", "reporters", ",", "and", "varies", "between", "0", "(", "Idh2", ")", "and", "60", "%", "(", "Aco2", ")", ".", "(", "e", ")", "Densitometric", "quantification", "of", "the", "release", "of", "free", "GFP", "(", "as", "%", "of", "total", "signal", ")", "in", "four", "independent", "experiments", ",", "comparing", "the", "results", "between", "WT", "and", "dnm1Δ", "cells", ".", "Bars", "denote", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "4", ")", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f5WT (a), dnm1Δ (b) and atg1Δ cells (c) and atg32Δ cells (d) expressing chromosomally tagged GFP chimeras of Aco2, Idh2, Idp1 and Hsp78 were incubated in SL medium for 7 days, and 10 OD600 units were sampled at day 1 and day 7 and processed for immunoblotting with anti-GFP antibodies as described in the Methods section. Positive control used in c and d was from dnm1Δ cells expressing Idp1-GFP from a plasmid at 4-day incubation (Fig. 1b, lane 4). Release of free GFP in WT cells is reproducibly variable between these reporters, and varies between 0 (Idh2) and 60% (Aco2). (e) Densitometric quantification of the release of free GFP (as % of total signal) in four independent experiments, comparing the results between WT and dnm1Δ cells. Bars denote s.d. (n=4)."}
{"words": ["f6", "(", "a", ")", "Cells", "expressing", "chromosomally", "tagged", "GFP", "chimeras", "of", "Aco2", ",", "Idh2", ",", "Idp1", "and", "Hsp78", "as", "well", "as", "a", "plasmid", "-", "borne", "(", "pDJB12", ")", ",", "mitochondrially", "targeted", "RFP", "(", "mtRFP", ")", "were", "incubated", "in", "SL", "-", "leucine", "medium", "for", "3", "days", "and", "imaged", "daily", ".", "Aco2", "and", "Idp1", "show", "clear", "mitophagic", "targeting", "(", "white", "arrows", "point", "at", "specific", "examples", ")", "by", "day", "3", ",", "whereas", "Idh2", "and", "Hsp78", "show", "weak", "or", "no", "mitophagy", ".", "In", "addition", ",", "Idh2", "and", "Hsp78", "show", "different", "degrees", "of", "segregation", "relative", "to", "the", "mtRFP", "marker", ",", "whereas", "Idp1", "-", "GFP", "and", "Aco2", "-", "GFP", "show", "a", "near", "-", "complete", "co", "-", "localization", "with", "mtRFP", ".", "Scale", "bar", ",", "5", " ", "μm", ".", "(", "b", ")", "Quantification", "of", "the", "frequency", "of", "mitophagy", "from", "a", ";", "the", "percentage", "of", "cells", "showing", "mitophagic", "profiles", "in", "the", "red", "(", "magenta", "bars", ";", "plasmid", "-", "borne", "mtRFP", ")", "or", "green", "(", "turquoise", "bars", ";", "integrated", "C", "-", "terminal", "GFP", "chimerae", ")", "was", "calculated", "for", "each", "GFP", "chimera", ".", "Idp", "-", "GFP", ",", "red", "N", "=", "76", ",", "green", "N", "=", "82", ";", "Aco2", "-", "GFP", ",", "red", "N", "=", "79", ",", "green", "N", "=", "82", ";", "Idh2", "-", "GFP", ",", "red", "N", "=", "72", ",", "green", "N", "=", "72", ";", "Hsp78", "-", "GFP", ",", "red", "N", "=", "70", ",", "green", "N", "=", "70", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f6(a) Cells expressing chromosomally tagged GFP chimeras of Aco2, Idh2, Idp1 and Hsp78 as well as a plasmid-borne (pDJB12), mitochondrially targeted RFP (mtRFP) were incubated in SL-leucine medium for 3 days and imaged daily. Aco2 and Idp1 show clear mitophagic targeting (white arrows point at specific examples) by day 3, whereas Idh2 and Hsp78 show weak or no mitophagy. In addition, Idh2 and Hsp78 show different degrees of segregation relative to the mtRFP marker, whereas Idp1-GFP and Aco2-GFP show a near-complete co-localization with mtRFP. Scale bar, 5 μm. (b) Quantification of the frequency of mitophagy from a; the percentage of cells showing mitophagic profiles in the red (magenta bars; plasmid-borne mtRFP) or green (turquoise bars; integrated C-terminal GFP chimerae) was calculated for each GFP chimera. Idp-GFP, red N=76, green N=82; Aco2-GFP, red N=79, green N=82; Idh2-GFP, red N=72, green N=72; Hsp78-GFP, red N=70, green N=70."}
{"words": ["f7WT", "and", "dnm1Δ", "cells", "expressing", "integrated", "Hsp78", "-", "GFP", "and", "plasmid", "-", "borne", "mtRFP", "were", "grown", "on", "lactate", "medium", "for", "3", "days", ".", "Cells", "were", "imaged", "daily", "and", "the", "images", "were", "analysed", "using", "ImageJ", "as", "described", "in", "Methods", ".", "Graphs", "illustrate", "the", "distribution", "of", "pixels", "associated", "with", "specific", "values", "of", "RFP", "and", "GFP", "channel", "intensities", ",", "respectively", ".", "Diagonal", "concentrations", "of", "dots", "indicate", "spatial", "correlation", "between", "the", "signals", ".", "The", "coloured", "photographic", "panels", "at", "the", "bottom", "illustrate", "the", "increased", "intensity", "correlation", "of", "the", "two", "channels", "at", "the", "3", "-", "day", "time", "point", "in", "the", "dnm1Δ", "mutant", ",", "relative", "to", "the", "WT", "cells", ".", "Scale", "bar", ",", "5", " ", "μm", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f7WT and dnm1Δ cells expressing integrated Hsp78-GFP and plasmid-borne mtRFP were grown on lactate medium for 3 days. Cells were imaged daily and the images were analysed using ImageJ as described in Methods. Graphs illustrate the distribution of pixels associated with specific values of RFP and GFP channel intensities, respectively. Diagonal concentrations of dots indicate spatial correlation between the signals. The coloured photographic panels at the bottom illustrate the increased intensity correlation of the two channels at the 3-day time point in the dnm1Δ mutant, relative to the WT cells. Scale bar, 5 μm."}
{"words": ["Figure", "1B", ",", "C", "Serial", "transplantations", "of", "PR", "+", "/", "+", "and", "PR", "−", "/", "−", "mammary", "epithelia", ".", "(", "B", ")", "Fluorescence", "stereo", "microscopy", "of", "third", "‐", "generation", "mammary", "outgrowths", "derived", "from", "8", "‐", "week", "‐", "old", "PR", "+", "/", "+", ";", "EGFP", "and", "PR", "−", "/", "−", ";", "EGFP", "donor", "mice", ".", "(", "C", ")", "Table", "summarizing", "3", "independent", "serial", "transplant", "experiments", "with", "PR", "+", "/", "+", ";", "EGFP", "and", "PR", "−", "/", "−", ";", "EGFP", ".", "Each", "engrafted", "gland", "is", "represented", "by", "a", "micrograph", ";", "black", "sectors", "represent", "area", "of", "fat", "pad", "filled", "by", "engrafted", "epithelium", ".", "Scale", "bar", ":", "200", "μm", ".", "D", ",", "E", "Serial", "transplantation", "of", "RANKL", "+", "/", "+", "and", "RANKL", "−", "/", "−", "mammary", "epithelia", ".", "(", "D", ")", "Fluorescence", "stereo", "microscopy", "of", "third", "‐", "generation", "mammary", "outgrowths", "derived", "from", "5", "‐", "week", "‐", "old", "RANKL", "+", "/", "+", ";", "EGFP", "and", "RANKL", "−", "/", "−", ";", "EGFP", "donor", "mice", ".", "Insets", ":", "higher", "magnification", "showing", "side", "branches", "present", "in", "the", "WT", "control", "(", "arrowheads", ")", "absent", "from", "RANKL", "−", "/", "−", ";", "EGFP", "epithelium", ".", "(", "E", ")", "Table", "summarizing", "three", "independent", "serial", "transplant", "experiments", "with", "RANKL", "+", "/", "+", ";", "EGFP", "and", "RANKL", "−", "/", "−", ";", "EGFP", "donor", "mice", ".", "Scale", "bar", ":", "200", "μm", ".", "F", ",", "G", "Serial", "transplantation", "of", "Wnt4", "+", "/", "+", "and", "Wnt4", "−", "/", "−", "mammary", "epithelia", ".", "(", "F", ")", "Fluorescence", "stereo", "microscopy", "of", "third", "‐", "generation", "mammary", "outgrowths", "derived", "from", "mammary", "buds", "of", "E12", ".", "5", "and", "E13", ".", "5", "Wnt4", "+", "/", "+", ";", "EGFP", "and", "Wnt4", "−", "/", "−", ";", "EGFP", "embryos", ".", "Scale", "bar", ":", "200", "μm", ".", "(", "G", ")", "Table", "summarizing", "three", "independent", "serial", "transplant", "experiments", "with", "Wnt4", "+", "/", "+", ";", "EGFP", "donor", "mice", ".", "Scale", "bar", ":", "200", "μm", ".", "H", "Box", "plot", "showing", "the", "difference", "between", "percentage", "of", "reconstitution", "between", "WT", "and", "MT", "contralateral", "grafts", "in", "each", "transplant", "generation", ".", "P", "values", "were", "determined", "by", "Mann", "-", "Whitney", "U", "‐", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B, C Serial transplantations of PR+/+ and PR−/− mammary epithelia. (B) Fluorescence stereo microscopy of third‐generation mammary outgrowths derived from 8‐week‐old PR+/+; EGFP and PR−/−; EGFP donor mice. (C) Table summarizing 3 independent serial transplant experiments with PR+/+; EGFP and PR−/−; EGFP. Each engrafted gland is represented by a micrograph; black sectors represent area of fat pad filled by engrafted epithelium. Scale bar: 200 μm.D, E Serial transplantation of RANKL+/+ and RANKL−/− mammary epithelia. (D) Fluorescence stereo microscopy of third‐generation mammary outgrowths derived from 5‐week‐old RANKL+/+; EGFP and RANKL−/−; EGFP donor mice. Insets: higher magnification showing side branches present in the WT control (arrowheads) absent from RANKL−/−; EGFP epithelium. (E) Table summarizing three independent serial transplant experiments with RANKL+/+; EGFP and RANKL−/−; EGFP donor mice. Scale bar: 200 μm.F, G Serial transplantation of Wnt4+/+ and Wnt4−/− mammary epithelia. (F) Fluorescence stereo microscopy of third‐generation mammary outgrowths derived from mammary buds of E12.5 and E13.5 Wnt4+/+; EGFP and Wnt4−/−; EGFP embryos. Scale bar: 200 μm. (G) Table summarizing three independent serial transplant experiments with Wnt4+/+; EGFP donor mice. Scale bar: 200 μm.H Box plot showing the difference between percentage of reconstitution between WT and MT contralateral grafts in each transplant generation. P values were determined by Mann-Whitney U‐test."}
{"words": ["Figure", "2A", "Epifluorescence", "stereo", "microscopy", "of", "inguinal", "mammary", "gland", "from", "a", "5", "‐", "day", "‐", "old", "Wnt4", ":", ":", "Cre", ";", "mT", "/", "mG", "female", "(", "n", "=", "7", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "0", ".", "5", "mm", "and", "0", ".", "1", "mm", "(", "inset", ")", ".", "B", ",", "C", "Histology", "sections", "of", "mammary", "glands", "from", "a", "5", "‐", "day", "‐", "old", "(", "B", ";", "n", "=", "7", ")", "and", "a", "10", "‐", "day", "‐", "old", "(", "C", ";", "n", "=", "5", ")", "Wnt4", ":", ":", "Cre", ";", "mT", "/", "mG", "female", "stained", "by", "double", "immunofluorescence", "microscopy", "for", "EGFP", "(", "green", ")", "and", "PR", "(", "magenta", ",", "not", "detected", ")", ",", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "mm", ".", "D", "-", "F", "EGFP", "(", "green", ")", "and", "PR", "(", "magenta", ")", "co", "‐", "immunofluorescence", "microscopy", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", "on", "histology", "sections", "from", "mT", "/", "mG", ";", "Wnt4", ":", ":", "Cre", "mammary", "glands", "at", "different", "developmental", "stages", ".", "(", "D", ")", "TEB", "of", "a", "4", "‐", "week", "‐", "old", "female", "(", "n", "=", "4", ")", ";", "scale", "bar", ":", "30", "μm", ".", "(", "E", ")", "Ducts", "of", "an", "8", "‐", "week", "‐", "old", "female", "(", "n", "=", "3", ")", ";", "scale", "bar", ":", "100", "μm", ";", "inset", ",", "scale", "bar", ":", "20", "μm", ".", "(", "F", ")", "Duct", "of", "a", "female", "at", "day", "10", ".", "5", "of", "pregnancy", "(", "n", "=", "3", ")", ";", "scale", "bar", ":", "150", "μm", ";", "inset", ",", "scale", "bar", ":", "30", "μm", ".", "G", "-", "I", "EGFP", "(", "green", ")", ",", "PR", "(", "magenta", ")", ",", "and", "p63", "(", "white", ")", "triple", "co", "‐", "immunofluorescence", "microscopy", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", "on", "histological", "sections", "from", "mT", "/", "mG", ";", "Wnt4", ":", ":", "Cre", "mammary", "glands", "at", "different", "developmental", "stages", ".", "(", "G", ")", "Ducts", "of", "5", "‐", "day", "‐", "old", "female", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "H", ")", "TEB", "of", "a", "4", "‐", "week", "‐", "old", "female", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "I", ")", "Duct", "of", "an", "8", "‐", "week", "‐", "old", "female", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "30", "μm", ".", "J", "-", "O", "Epifluorescence", "stereo", "microscopy", "of", "mammary", "glands", "harvested", "from", "15", "‐", "day", "‐", "old", "Wnt4", ":", ":", "GFP", "females", "either", "WT", "(", "n", "=", "18", ")", "(", "J", ",", "M", ")", ",", "ERα", "−", "/", "−", "(", "n", "=", "4", ")", "(", "K", ",", "N", ")", ",", "or", "PR", "−", "/", "−", "(", "n", "=", "3", ")", "(", "L", ",", "O", ")", ".", "dTomato", "expression", "(", "J", "-", "L", ")", ";", "EGFP", "expression", "(", "M", "-", "O", ")", "is", "not", "abrogated", "in", "ERα", "−", "/", "−", "nor", "PR", "−", "/", "−", "epithelia", ".", "Arrowheads", "mark", "the", "main", "duct", "originating", "from", "the", "nipple", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "Q", "Bar", "plots", "showing", "relative", "PR", "and", "Wnt4", "mRNA", "expression", "normalized", "to", "CK18", "mRNA", "in", "mammary", "organoids", "from", "5", "pubertal", "(", "6", "weeks", "old", ")", "and", "3", "adult", "(", "11", "weeks", "old", ")", "mice", "exposed", "for", "6", "h", "to", "vehicle", "(", "C", ")", ",", "17β", "‐", "estradiol", "(", "20", "nmol", ")", "(", "E2", ")", ",", "or", "R5020", "(", "20", "nmol", ")", "(", "P", ")", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "±", "SD", "of", "3", "independent", "experiments", ".", "R", "-", "X", "Epifluorescence", "stereo", "microscopy", "of", "contralateral", "mammary", "glands", "that", "were", "engrafted", "with", "Wnt4", ":", ":", "GFP", "epithelium", "from", "8", "‐", "week", "‐", "old", "females", ",", "either", "PRWT", "(", "R", ",", "T", ",", "V", ",", "X", ")", "or", "PR", "−", "/", "−", "(", "S", ",", "U", ",", "W", ")", ".", "dTomato", "expression", "(", "R", ",", "S", ")", ";", "EGFP", "expression", "(", "T", ",", "U", ")", "double", "epifluorescence", "(", "V", ",", "W", ",", "X", ")", "on", "contralateral", "engrafted", "glands", "3", "weeks", "after", "surgery", "when", "recipients", "were", "6", "weeks", "old", ".", "Representative", "result", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Arrowheads", "point", "to", "TEBs", "(", "V", ",", "X", ")", "or", "to", "origin", "of", "growth", "(", "W", ")", ".", "Scale", "bar", "(", "R", "-", "W", ")", ":", "5", "mm", ",", "(", "X", ")", ":", "1", "mm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Epifluorescence stereo microscopy of inguinal mammary gland from a 5‐day‐old Wnt4::Cre; mT/mG female (n = 7). Scale bars: 0.5 mm and 0.1 mm (inset).B, C Histology sections of mammary glands from a 5‐day‐old (B; n = 7) and a 10‐day‐old (C; n = 5) Wnt4::Cre; mT/mG female stained by double immunofluorescence microscopy for EGFP (green) and PR (magenta, not detected), counterstained with DAPI (blue). Scale bar: 50 mm.D-F EGFP (green) and PR (magenta) co‐immunofluorescence microscopy counterstained with DAPI (blue) on histology sections from mT/mG; Wnt4::Cre mammary glands at different developmental stages. (D) TEB of a 4‐week‐old female (n = 4); scale bar: 30 μm. (E) Ducts of an 8‐week‐old female (n = 3); scale bar: 100 μm; inset, scale bar: 20 μm. (F) Duct of a female at day 10.5 of pregnancy (n = 3); scale bar: 150 μm; inset, scale bar: 30 μm.G-I EGFP (green), PR (magenta), and p63 (white) triple co‐immunofluorescence microscopy counterstained with DAPI (blue) on histological sections from mT/mG; Wnt4::Cre mammary glands at different developmental stages. (G) Ducts of 5‐day‐old female (n = 3). (H) TEB of a 4‐week‐old female (n = 3). (I) Duct of an 8‐week‐old female (n = 3). Scale bars: 30 μm.J-O Epifluorescence stereo microscopy of mammary glands harvested from 15‐day‐old Wnt4::GFP females either WT (n = 18) (J, M), ERα−/− (n = 4) (K, N), or PR−/− (n = 3) (L, O). dTomato expression (J-L); EGFP expression (M-O) is not abrogated in ERα−/− nor PR−/− epithelia. Arrowheads mark the main duct originating from the nipple. Scale bar: 50 μm.Q Bar plots showing relative PR and Wnt4 mRNA expression normalized to CK18 mRNA in mammary organoids from 5 pubertal (6 weeks old) and 3 adult (11 weeks old) mice exposed for 6 h to vehicle (C), 17β‐estradiol (20 nmol) (E2), or R5020 (20 nmol) (P). Bars represent the mean ± SD of 3 independent experiments.R-X Epifluorescence stereo microscopy of contralateral mammary glands that were engrafted with Wnt4::GFP epithelium from 8‐week‐old females, either PRWT (R, T, V, X) or PR−/− (S, U, W). dTomato expression (R, S); EGFP expression (T, U) double epifluorescence (V, W, X) on contralateral engrafted glands 3 weeks after surgery when recipients were 6 weeks old. Representative result from three independent experiments. Arrowheads point to TEBs (V, X) or to origin of growth (W). Scale bar (R-W): 5 mm, (X): 1 mm."}
{"words": ["Figure", "3A", "-", "D", "Representative", "epifluorescence", "stereo", "microscopy", "of", "inguinal", "mammary", "glands", "from", "a", "10", "‐", "day", "‐", "old", "mT", "/", "mG", "(", "A", ",", "C", ")", "and", "MMTV", ":", ":", "Cre", ";", "mT", "/", "mG", "(", "B", ",", "D", ")", "female", "(", "n", "=", "7", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "1", "mm", ".", "E", "Higher", "magnification", "of", "inguinal", "mammary", "gland", "from", "a", "10", "‐", "day", "‐", "old", "MMTV", ":", ":", "Cre", ";", "mT", "/", "mG", "female", ".", "Scale", "bar", ":", "0", ".", "2", "mm", ".", "F", "Immunofluorescence", "microscopy", "for", "EGFP", "(", "green", ")", "on", "a", "mammary", "gland", "section", "from", "a", "10", "‐", "day", "‐", "old", "MMTV", ":", ":", "Cre", ";", "mT", "/", "mG", "female", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", "(", "n", "=", "7", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "30", "μm", ".", "G", "Epifluorescence", "stereo", "microscopy", "of", "mammary", "glands", "from", "10", "‐", "day", "‐", "old", "littermates", "either", "MMTV", ":", ":", "Cre", ";", "mT", "/", "mG", "Wnt4fl", "/", "+", "or", "MMTV", ":", ":", "Cre", ";", "mT", "/", "mG", ";", "Wnt4fl", "/", "fl", ".", "Scale", "bar", ":", "1", "mm", ".", "Arrowhead", "marks", "the", "main", "duct", "originating", "from", "the", "nipple", ".", "H", "Bar", "plot", "showing", "ratio", "of", "branching", "points", "in", "prepubertal", "Cre", "+", ";", "Wnt4fl", "/", "fl", "(", "n", "=", "12", ")", "relative", "to", "Cre", "+", ";", "Wnt4fl", "/", "+", "littermates", "(", "n", "=", "10", ")", ".", "Two", "‐", "tailed", ",", "paired", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", "was", "used", "to", "calculate", "statistical", "significance", ".", "I", "Fluorescence", "stereo", "microscopy", "of", "mammary", "glands", "from", "35", "‐", "day", "‐", "old", "littermates", "either", "MMTV", ":", ":", "Cre", ";", "mT", "/", "m", ";", "Wnt4fl", "/", "+", "or", "MMTV", ":", ":", "Cre", ";", "mT", "/", "m", ";", "Wnt4fl", "/", "fl", ".", "Note", "ductal", "elongation", "is", "delayed", "in", "Wnt4", "‐", "deficient", "mammary", "epithelium", "compared", "to", "Wnt4fl", "/", "+", "control", ".", "LN", ":", "lymph", "node", ".", "Scale", "bar", ":", "4", "mm", ".", "J", ",", "K", "Bar", "plots", "showing", "number", "of", "terminal", "end", "buds", "(", "TEBs", ")", "(", "J", ")", "and", "area", "of", "mammary", "fat", "pad", "filled", "by", "the", "ductal", "system", "(", "K", ")", ".", "Ctrl", "(", "Wnt4fl", "/", "wt", "or", "Wnt4fl", "/", "fl", ";", "Cre", "−", ")", ":", "n", "=", "6", ",", "fl", "/", "+", ";", "Cre", "+", ":", "n", "=", "4", ",", "and", "fl", "/", "fl", ";", "Cre", "+", ":", "n", "=", "7", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", ".", "Two", "‐", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", "was", "used", "to", "calculate", "statistical", "significance", ".", "L", ",", "M", "Bar", "plots", "showing", "BrdU", "incorporation", "index", "in", "inguinal", "mammary", "glands", "of", "4", "‐", "week", "‐", "old", "Wnt4fl", "/", "+", ";", "Cre", "+", "(", "n", "=", "3", ")", "or", "Wnt4fl", "/", "fl", ";", "Cre", "+", "(", "n", "=", "4", ")", "in", "the", "ducts", "(", "L", ")", "and", "in", "the", "TEBs", "(", "M", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "SD", ".", "Two", "‐", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", "was", "used", "to", "calculate", "statistical", "significance", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A-D Representative epifluorescence stereo microscopy of inguinal mammary glands from a 10‐day‐old mT/mG (A, C) and MMTV::Cre; mT/mG (B, D) female (n = 7). Scale bar: 1 mm.E Higher magnification of inguinal mammary gland from a 10‐day‐old MMTV::Cre; mT/mG female. Scale bar: 0.2 mm.F Immunofluorescence microscopy for EGFP (green) on a mammary gland section from a 10‐day‐old MMTV::Cre; mT/mG female counterstained with DAPI (blue) (n = 7). Scale bar: 30 μm.G Epifluorescence stereo microscopy of mammary glands from 10‐day‐old littermates either MMTV::Cre; mT/mG Wnt4fl/+ or MMTV::Cre; mT/mG; Wnt4fl/fl. Scale bar: 1 mm. Arrowhead marks the main duct originating from the nipple.H Bar plot showing ratio of branching points in prepubertal Cre+;Wnt4fl/fl (n = 12) relative to Cre+;Wnt4fl/+ littermates (n = 10). Two‐tailed, paired Student's t‐test was used to calculate statistical significance.I Fluorescence stereo microscopy of mammary glands from 35‐day‐old littermates either MMTV::Cre; mT/m; Wnt4fl/+ or MMTV::Cre; mT/m;Wnt4fl/fl. Note ductal elongation is delayed in Wnt4‐deficient mammary epithelium compared to Wnt4fl/+ control. LN: lymph node. Scale bar: 4 mm.J, K Bar plots showing number of terminal end buds (TEBs) (J) and area of mammary fat pad filled by the ductal system (K). Ctrl (Wnt4fl/wt or Wnt4fl/fl; Cre−): n = 6, fl/+; Cre+: n = 4, and fl/fl; Cre+: n = 7). Data are presented as the mean ± SD. Two‐tailed Student's t‐test was used to calculate statistical significance.L, M Bar plots showing BrdU incorporation index in inguinal mammary glands of 4‐week‐old Wnt4fl/+; Cre+ (n = 3) or Wnt4fl/fl; Cre+ (n = 4) in the ducts (L) and in the TEBs (M). Data are presented as the mean ± SD. Two‐tailed Student's t‐test was used to calculate statistical significance."}
{"words": ["Figure", "4A", "Whole", "‐", "mount", "microscopy", "of", "X", "‐", "gal", "‐", "stained", "Axin2", "+", "/", "lacZ", "in", "E12", ".", "5", "embryo", "showing", "β", "‐", "galactosidase", "expression", "in", "the", "mammary", "buds", "(", "arrows", ")", "(", "n", "=", "8", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "1", "mm", ".", "Arrowheads", "mark", "mammary", "buds", ".", "B", "-", "F", "Whole", "‐", "mount", "microscopy", "of", "X", "‐", "gal", "(", "blue", ")", "‐", "and", "carmine", "alum", "(", "red", ")", "‐", "stained", "mammary", "glands", "harvested", "from", "Axin2", "+", "/", "lacZ", "mice", "at", "distinct", "developmental", "stages", ".", "(", "B", ")", "At", "postnatal", "day", "1", ",", "β", "‐", "galactosidase", "activity", "detected", "in", "the", "nipple", "area", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "1", "mm", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "In", "5", "‐", "week", "‐", "old", "mammary", "glands", ",", "reporter", "activity", "was", "detected", "around", "the", "ducts", "(", "small", "arrows", ")", "and", "in", "the", "neck", "region", "of", "the", "terminal", "end", "buds", "(", "TEBs", ")", "(", "large", "arrows", ")", "(", "C", ")", "(", "n", "=", "8", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "400", "μm", "(", "C", ")", "and", "100", "μm", "(", "D", ")", ".", "(", "E", ")", "At", "8", ".", "5", "day", "of", "pregnancy", ",", "reporter", "expression", "was", "detected", "in", "the", "ducts", ".", "Higher", "magnification", "(", "inset", ")", "suggests", "myoepithelial", "expression", "(", "n", "=", "10", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "1", "mm", ".", "(", "F", ")", "Whole", "‐", "mount", "at", "day", "14", ".", "5", "of", "pregnancy", ":", "reporter", "activity", "is", "limited", "to", "ducts", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "200", "μm", ".", "G", "Histology", "section", "of", "Axin2", ":", ":", "LacZ", "mammary", "gland", "at", "day", "8", ".", "5", "of", "pregnancy", "counterstained", "with", "nuclear", "red", ";", "luminal", "epithelial", "cells", "show", "no", "detectable", "β", "‐", "galactosidase", "activity", "but", "myoepithelial", "cells", "do", ".", "Scale", "bar", ":", "200", "μm", ".", "H", "β", "‐", "galactosidase", "activity", "(", "blue", ")", "colocalizes", "with", "the", "myoepithelial", "marker", "p63", "(", "green", ")", "detected", "by", "immunofluorescence", "microscopy", ".", "Arrows", "point", "to", "myoepithelial", "cells", ".", "L", ",", "lumen", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "μm", ".", "I", "Representative", "whole", "‐", "mount", "stereo", "microscopy", "of", "X", "‐", "gal", "(", "blue", ")", "‐", "and", "carmine", "alum", "(", "magenta", ")", "‐", "stained", "mammary", "gland", "biopsies", "taken", "from", "14", "‐", "week", "‐", "old", "Axin2", ":", ":", "LacZ", "females", "collected", "at", "diestrus", "and", "estrus", ",", "respectively", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "200", "μm", ".", "J", "Relative", "Wnt4", "and", "Axin2", "mRNA", "expression", "in", "mammary", "glands", "from", "three", "mice", "in", "estrus", "versus", "diestrus", "assessed", "by", "semiquantitative", "qRT", "-", "PCR", "normalized", "to", "18S", "rRNA", ".", "Two", "‐", "tailed", ",", "paired", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", "was", "used", "to", "calculate", "statistical", "significance", ".", "K", "Stereo", "microscopy", "of", "X", "‐", "gal", "‐", "and", "carmine", "alum", "‐", "stained", "mammary", "glands", "from", "ovariectomized", "Axin2", ":", ":", "LacZ", "females", "treated", "for", "72", "h", "with", "vehicle", "(", "n", "=", "4", ")", "(", "left", ")", ",", "17", "‐", "β", "‐", "estradiol", "(", "E2", ")", "(", "n", "=", "6", ")", "(", "center", ")", ",", "17", "‐", "β", "‐", "estradiol", "and", "progesterone", "(", "E2", "and", "P", ")", "(", "n", "=", "8", ")", "(", "right", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "200", "μm", ".", "L", ",", "M", "Stereo", "microscopy", "of", "contralateral", "glands", "whole", "‐", "mounted", "and", "X", "‐", "gal", "stained", "after", "engraftment", "with", "mammary", "buds", "from", "Axin2", ":", ":", "LacZ", "transgenic", "and", "Wnt4", "+", "/", "+", "or", "Wnt4", "−", "/", "−", "female", "E12", ".", "5", "and", "E13", ".", "5", "embryos", "(", "L", ")", "or", "Axin2", ":", ":", "LacZ", "transgenic", "and", "either", "PR", "+", "/", "−", "or", "PR", "−", "/", "−", "8", "‐", "week", "‐", "old", "females", "(", "M", ")", ",", "at", "day", "8", ".", "5", "of", "pregnancy", ".", "β", "‐", "galactosidase", "expression", "reflecting", "Axin2", "transcription", "is", "readily", "detected", "in", "PR", "+", "/", "−", "as", "well", "as", "Wnt4", "+", "/", "+", "mammary", "epithelia", "but", "not", "in", "the", "PR", "−", "/", "−", "(", "n", "=", "6", ")", "and", "Wnt4", "−", "/", "−", "counterparts", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "Blue", ":", "X", "‐", "gal", "staining", ";", "magenta", ":", "carmine", "alum", "counterstain", ".", "Scale", "bars", ":", "200", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A Whole‐mount microscopy of X‐gal‐stained Axin2+/lacZ in E12.5 embryo showing β‐galactosidase expression in the mammary buds (arrows) (n = 8). Scale bar: 1 mm. Arrowheads mark mammary buds.B-F Whole‐mount microscopy of X‐gal (blue)‐ and carmine alum (red)‐stained mammary glands harvested from Axin2+/lacZ mice at distinct developmental stages. (B) At postnatal day 1, β‐galactosidase activity detected in the nipple area (n = 6). Scale bar: 1 mm. (C, D) In 5‐week‐old mammary glands, reporter activity was detected around the ducts (small arrows) and in the neck region of the terminal end buds (TEBs) (large arrows) (C) (n = 8). Scale bars: 400 μm (C) and 100 μm (D). (E) At 8.5 day of pregnancy, reporter expression was detected in the ducts. Higher magnification (inset) suggests myoepithelial expression (n = 10). Scale bar: 1 mm. (F) Whole‐mount at day 14.5 of pregnancy: reporter activity is limited to ducts (n = 5). Scale bar: 200 μm.G Histology section of Axin2::LacZ mammary gland at day 8.5 of pregnancy counterstained with nuclear red; luminal epithelial cells show no detectable β‐galactosidase activity but myoepithelial cells do. Scale bar: 200 μm.H β‐galactosidase activity (blue) colocalizes with the myoepithelial marker p63 (green) detected by immunofluorescence microscopy. Arrows point to myoepithelial cells. L, lumen. Scale bar: 100 μm.I Representative whole‐mount stereo microscopy of X‐gal (blue)‐ and carmine alum (magenta)‐stained mammary gland biopsies taken from 14‐week‐old Axin2::LacZ females collected at diestrus and estrus, respectively (n = 3). Scale bar: 200 μm.J Relative Wnt4 and Axin2 mRNA expression in mammary glands from three mice in estrus versus diestrus assessed by semiquantitative qRT-PCR normalized to 18S rRNA. Two‐tailed, paired Student's t‐test was used to calculate statistical significance.K Stereo microscopy of X‐gal‐ and carmine alum‐stained mammary glands from ovariectomized Axin2::LacZ females treated for 72 h with vehicle (n = 4) (left), 17‐β‐estradiol (E2) (n = 6) (center), 17‐β‐estradiol and progesterone (E2 and P) (n = 8) (right). Scale bar: 200 μm.L, M Stereo microscopy of contralateral glands whole‐mounted and X‐gal stained after engraftment with mammary buds from Axin2::LacZ transgenic and Wnt4+/+ or Wnt4−/− female E12.5 and E13.5 embryos (L) or Axin2::LacZ transgenic and either PR+/− or PR−/− 8‐week‐old females (M), at day 8.5 of pregnancy. β‐galactosidase expression reflecting Axin2 transcription is readily detected in PR+/− as well as Wnt4+/+ mammary epithelia but not in the PR−/− (n = 6) and Wnt4−/− counterparts (n = 6). Blue: X‐gal staining; magenta: carmine alum counterstain. Scale bars: 200 μm."}
{"words": ["Figure", "5A", "X", "‐", "gal", "‐", "stained", "whole", "‐", "mounts", "of", "Axin2", ":", ":", "LacZ", "embryos", "at", "E14", ".", "5", "either", "Wnt4", "+", "/", "+", "or", "Wnt4", "−", "/", "−", "(", "n", "=", "5", "or", "4", ",", "respectively", ")", ".", "Arrows", "mark", "mammary", "buds", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "mm", ".", "B", "Whole", "‐", "mount", "analysis", "of", "X", "‐", "gal", "‐", "and", "carmine", "alum", "‐", "stained", "mammary", "glands", "harvested", "from", "6", "‐", "week", "‐", "old", "littermates", "either", "Wnt4fl", "/", "wt", ";", "MMTV", ":", ":", "Cre", "+", ";", "Axin2", "+", "/", "lacZ", "(", "n", "=", "5", ")", "or", "Wnt4fl", "/", "flMMTV", ":", ":", "Cre", "+", ";", "Axin2", "+", "/", "lacZ", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Left", "insets", ":", "higher", "magnification", ";", "right", "insets", ":", "histology", "section", "of", "the", "same", "gland", ".", "Note", "expression", "of", "reporter", "detected", "around", "the", "neck", "of", "TEBs", "in", "Wnt4", "‐", "deficient", "and", "littermate", "control", "is", "comparable", ".", "LN", ",", "lymph", "node", ".", "Scale", "bars", ":", "1", "mm", ",", "and", "inset", "scale", "bar", ":", "100", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A X‐gal‐stained whole‐mounts of Axin2::LacZ embryos at E14.5 either Wnt4+/+or Wnt4−/− (n = 5 or 4, respectively). Arrows mark mammary buds. Scale bar: 5 mm.B Whole‐mount analysis of X‐gal‐ and carmine alum‐stained mammary glands harvested from 6‐week‐old littermates either Wnt4fl/wt;MMTV::Cre+;Axin2+/lacZ (n = 5) or Wnt4fl/flMMTV::Cre+;Axin2+/lacZ (n = 4). Left insets: higher magnification; right insets: histology section of the same gland. Note expression of reporter detected around the neck of TEBs in Wnt4‐deficient and littermate control is comparable. LN, lymph node. Scale bars: 1 mm, and inset scale bar: 100 μm."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", "-", "D", ")", "Serum", "NfL", "concentrations", "of", "preataxic", "(", "green", ")", "and", "ataxic", "(", "red", ")", "SCA3", "subjects", "and", "controls", "(", "blue", ")", "were", "measured", "in", "two", "independent", "cohorts", ",", "each", "with", "a", "different", "Simoa", "approach", ":", "cohort", "#", "1", ",", "recruited", "by", "the", "ESMI", "consortium", "(", "A", ",", "C", ")", ",", "and", "cohort", "#", "2", ",", "recruited", "by", "the", "EuroSCA", "/", "RiSCA", "consortium", "(", "B", ",", "D", ")", ".", "Boxes", "show", "the", "ranges", "between", "lower", "and", "upper", "quartiles", ",", "the", "central", "bands", "show", "the", "medians", ",", "and", "the", "whiskers", "show", "data", "within", "1", ".", "5", "∙", "IQR", "of", "the", "median", ",", "with", "dots", "representing", "outliers", ".", "Groups", "were", "compared", "with", "Mann", "Whitney", "U", "tests", "(", "*", "*", "*", "p", "<", ".", "001", ",", "*", "*", "p", "<", ".", "01", ",", "ns", "p", "≥", ".", "05", ",", "two", "-", "tailed", ",", "Bonferroni", "-", "corrected", ";", "In", "the", "scatter", "plots", ",", "the", "individual", "NfL", "values", "were", "plotted", "as", "a", "function", "of", "subjects", "'", "age", ".", "The", "dashed", "grey", "lines", "visualise", "the", "optimal", "cut", "-", "offs", "for", "differentiating", "ataxic", "SCA3", "subjects", "from", "controls", "in", "each", "cohort", "(", "cohort", "#", "1", ":", "20", ".", "0", "pg", "/", "ml", ",", "98", ".", "7", "%", "sensitivity", ",", "92", ".", "2", "%", "specificity", ";", "cohort", "#", "2", ":", "50", ".", "9", "pg", "/", "ml", ",", "92", ".", "6", "%", "sensitivity", ",", "100", "%", "specificity", ";", "cut", "-", "offs", "were", "derived", "by", "maximising", "Youden", "'", "s", "index", "irrespective", "of", "age", ")", ".", "Note", "the", "logarithmic", "scale", "of", "the", "y", "-", "axes", ".", "(", "E", ",", "F", ")", "Serum", "pNfH", "levels", "of", "preataxic", "and", "ataxic", "SCA3", "subjects", "and", "controls", "were", "also", "measured", "in", "both", "cohorts", ",", "each", "with", "a", "different", "Simoa", "approach", "(", "two", "-", "tailed", "Mann", "Whitney", "U", "tests", ",", "Bonferroni", "-", "corrected", ";"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1 (A-D) Serum NfL concentrations of preataxic (green) and ataxic (red) SCA3 subjects and controls (blue) were measured in two independent cohorts, each with a different Simoa approach: cohort #1, recruited by the ESMI consortium (A, C), and cohort #2, recruited by the EuroSCA/RiSCA consortium (B, D). Boxes show the ranges between lower and upper quartiles, the central bands show the medians, and the whiskers show data within 1.5∙IQR of the median, with dots representing outliers. Groups were compared with Mann Whitney U tests (*** p<.001, ** p<.01, ns p≥.05, two-tailed, Bonferroni-corrected; In the scatter plots, the individual NfL values were plotted as a function of subjects' age. The dashed grey lines visualise the optimal cut-offs for differentiating ataxic SCA3 subjects from controls in each cohort (cohort #1: 20.0 pg/ml, 98.7% sensitivity, 92.2% specificity; cohort #2: 50.9 pg/ml, 92.6% sensitivity, 100% specificity; cut-offs were derived by maximising Youden's index irrespective of age). Note the logarithmic scale of the y-axes.  (E, F) Serum pNfH levels of preataxic and ataxic SCA3 subjects and controls were also measured in both cohorts, each with a different Simoa approach (two-tailed Mann Whitney U tests, Bonferroni-corrected; "}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Serum", "NfL", "levels", "of", "ataxic", "SCA3", "subjects", "significantly", "correlated", "with", "disease", "severity", ",", "as", "quantified", "by", "the", "Scale", "for", "the", "Rating", "and", "Assessment", "of", "Ataxia", "(", "SARA", ")", "score", "(", "r", "=", "0", ".", "43", ",", "p", "<", ".", "001", ",", "Pearson", "'", "s", "correlation", ",", "two", "-", "tailed", "test", ")", ".", "(", "B", ")", "The", "cross", "-", "sectional", "NfL", "levels", "also", "reflected", "longitudinal", "disease", "progression", ",", "as", "quantified", "by", "the", "annual", "SARA", "score", "change", "(", "available", "for", "35", "subjects", ")", ".", "Boxes", "show", "the", "ranges", "between", "lower", "and", "upper", "quartiles", ",", "the", "central", "bands", "show", "the", "medians", ",", "and", "the", "whiskers", "show", "data", "within", "1", ".", "5", "∙", "IQR", "of", "the", "median", ",", "with", "dots", "representing", "outliers", ".", "Subjects", "with", "high", "disease", "progression", "(", "annual", "SARA", "score", "increase", "≥", "0", ".", "71", "points", "/", "year", ",", "n", "=", "18", ",", "median", "split", ")", "had", "significantly", "higher", "serum", "levels", "of", "NfL", "than", "subjects", "with", "low", "disease", "progression", "(", "C", ")", "We", "modelled", "serum", "NfL", "levels", "(", "log", "-", "transformed", ")", "in", "SCA3", "carriers", "(", "n", "=", "123", ")", "with", "the", "predictors", "age", "and", "ATXN3", "CAG", "repeat", "length", ",", "their", "squares", "and", "all", "possible", "interactions", "(", "for", "details", ",", "see", "Results", "and", "Methods", ")", ".", "The", "highly", "significant", "predictors", "(", "age", ",", "its", "square", ",", "and", "repeat", "length", ",", "and", "the", "intercept", ",", "all", "p", "<", ".", "001", ",", "explained", "variance", ":", "R2", "=", "0", ".", "37", ")", "were", "used", "to", "generate", "the", "diagram", ".", "For", "a", "given", "age", ",", "each", "increase", "in", "CAG", "repeat", "count", "was", "associated", "with", "higher", "NfL", "concentrations", ".", "The", "steepness", "of", "the", "slopes", "declined", "with", "increasing", "age", ".", "In", "controls", "(", "black", ",", "n", "=", "125", ")", ",", "the", "relation", "between", "NfL", "level", "(", "log", "-", "transformed", ")", "and", "age", "was", "linear", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2 (A) Serum NfL levels of ataxic SCA3 subjects significantly correlated with disease severity, as quantified by the Scale for the Rating and Assessment of Ataxia (SARA) score (r=0.43, p<.001, Pearson's correlation, two-tailed test).  (B) The cross-sectional NfL levels also reflected longitudinal disease progression, as quantified by the annual SARA score change (available for 35 subjects). Boxes show the ranges between lower and upper quartiles, the central bands show the medians, and the whiskers show data within 1.5∙IQR of the median, with dots representing outliers. Subjects with high disease progression (annual SARA score increase ≥0.71 points/year, n=18, median split) had significantly higher serum levels of NfL than subjects with low disease progression (C) We modelled serum NfL levels (log-transformed) in SCA3 carriers (n=123) with the predictors age and ATXN3 CAG repeat length, their squares and all possible interactions (for details, see Results and Methods). The highly significant predictors (age, its square, and repeat length, and the intercept, all p<.001, explained variance: R2=0.37) were used to generate the diagram. For a given age, each increase in CAG repeat count was associated with higher NfL concentrations. The steepness of the slopes declined with increasing age. In controls (black, n=125), the relation between NfL level (log-transformed) and age was linear."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Serum", "NfL", "levels", "in", "preataxic", "SCA3", "subjects", "(", "cross", "-", "sectional", "data", ")", "were", "plotted", "over", "the", "time", "from", "the", "individually", "estimated", "ataxia", "onset", ".", "NfL", "levels", "increased", "significantly", "with", "proximity", "to", "the", "estimated", "onset", "(", "F", "(", "1", ",", "21", ")", "=", "39", ".", "68", ",", "p", "<", ".", "001", ",", "R2", "=", "0", ".", "64", ")", ".", "For", "benchmarking", "the", "levels", "of", "preataxic", "subjects", ",", "the", "blue", "dashed", "line", "visualises", "the", "optimal", "cut", "-", "off", "for", "differentiating", "ataxic", "SCA3", "subjects", "from", "controls", "in", "the", "pooled", "cohort", "(", "20", ".", "3", "pg", "/", "ml", ",", "99", ".", "0", "%", "sensitivity", ",", "95", ".", "2", "%", "specificity", ")", ".", "(", "B", ")", "To", "determine", "the", "time", "at", "which", "NfL", "levels", "become", "significantly", "increased", "in", "the", "preataxic", "stage", "of", "SCA3", ",", "NfL", "levels", "of", "preataxic", "carriers", "need", "to", "be", "related", "to", "NfL", "levels", "of", "controls", "at", "the", "same", "age", ",", "as", "NfL", "levels", "physiologically", "increase", "with", "age", ".", "For", "each", "preataxic", "subject", ",", "the", "difference", "between", "the", "measured", "NfL", "value", "(", "green", "dot", ")", "and", "the", "NfL", "value", "predicted", "for", "control", "subjects", "of", "the", "same", "age", "(", "solid", "blue", "line", ")", "was", "visualised", "by", "the", "length", "of", "the", "vertical", "green", "line", ".", "Standardisation", "of", "this", "difference", "relative", "to", "the", "NfL", "distribution", "in", "controls", "(", "C", ")", "In", "preataxic", "SCA3", "subjects", ",", "NfL", "z", "-", "scores", "increased", "significantly", "(", "F", "(", "1", ",", "21", ")", "=", "30", ".", "78", ",", "p", "<", ".", "001", ",", "R2", "=", "0", ".", "58", ")", "with", "subjects", "approaching", "the", "expected", "age", "of", "onset", ".", "NfL", "levels", "of", "preataxic", "subjects", "were", "significantly", "increased", "compared", "to", "controls", "(", "i", ".", "e", ".", "z", "-", "score", ">", "1", ".", "96", ")", "7", ".", "5", "years", "before", "the", "expected", "onset", ",", "indicated", "by", "the", "non", "-", "overlapping", "95", "%", "confidence", "intervals", "of", "SCA3", "subjects", "(", "black", "solid", "line", ")", "and", "controls", "(", "blue", "dashed", "line", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3 (A) Serum NfL levels in preataxic SCA3 subjects (cross-sectional data) were plotted over the time from the individually estimated ataxia onset. NfL levels increased significantly with proximity to the estimated onset (F(1,21)=39.68, p<.001, R2=0.64). For benchmarking the levels of preataxic subjects, the blue dashed line visualises the optimal cut-off for differentiating ataxic SCA3 subjects from controls in the pooled cohort (20.3 pg/ml, 99.0% sensitivity, 95.2% specificity).  (B) To determine the time at which NfL levels become significantly increased in the preataxic stage of SCA3, NfL levels of preataxic carriers need to be related to NfL levels of controls at the same age, as NfL levels physiologically increase with age. For each preataxic subject, the difference between the measured NfL value (green dot) and the NfL value predicted for control subjects of the same age (solid blue line) was visualised by the length of the vertical green line. Standardisation of this difference relative to the NfL distribution in controls  (C) In preataxic SCA3 subjects, NfL z-scores increased significantly (F(1,21)=30.78, p<.001, R2=0.58) with subjects approaching the expected age of onset. NfL levels of preataxic subjects were significantly increased compared to controls (i.e. z-score >1.96) 7.5 years before the expected onset, indicated by the non-overlapping 95% confidence intervals of SCA3 subjects (black solid line) and controls (blue dashed line). "}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ",", "B", ")", "Longitudinal", "intraindividual", "stability", "of", "NfL", "(", "A", ")", "and", "pNfH", "(", "B", ")", "serum", "levels", "over", "6", "weeks", ",", "assessed", "in", "both", "ataxic", "(", "red", ")", "and", "preataxic", "(", "green", ")", "SCA3", "and", "control", "(", "blue", ")", "subjects", "(", "n", "=", "21", ")", ".", "Data", "of", "the", "same", "individuals", "are", "linked", "by", "lines", ".", "ICC", ",", "intraclass", "correlation", "coefficient", "(", "estimate", "and", "95", "%", "CI", ")", ".", "(", "C", ")", "Sample", "size", "estimations", "were", "performed", "for", "future", "intervention", "trials", "using", "the", "reduction", "of", "Nf", "levels", "towards", "control", "levels", "as", "outcome", "measure", ".", "The", "estimated", "number", "of", "subjects", "per", "study", "arm", "is", "plotted", "over", "the", "assumed", "therapeutic", "effect", "for", "lowering", "the", "Nf", "level", "in", "SCA3", "subjects", "to", "levels", "observed", "in", "healthy", "controls", "(", "NfL", ":", "dashed", "line", ",", "pNfH", ":", "dotted", "line", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4 (A, B) Longitudinal intraindividual stability of NfL (A) and pNfH (B) serum levels over 6 weeks, assessed in both ataxic (red) and preataxic (green) SCA3 and control (blue) subjects (n=21). Data of the same individuals are linked by lines. ICC, intraclass correlation coefficient (estimate and 95% CI). (C) Sample size estimations were performed for future intervention trials using the reduction of Nf levels towards control levels as outcome measure. The estimated number of subjects per study arm is plotted over the assumed therapeutic effect for lowering the Nf level in SCA3 subjects to levels observed in healthy controls (NfL: dashed line, pNfH: dotted line)."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", "-", "B", ")", "Plasma", "concentrations", "of", "NfL", "(", "A", ")", "and", "pNfH", "(", "B", ")", "were", "measured", "in", "the", "304Q", "knock", "-", "in", "SCA3", "mouse", "model", ".", "Heterozygous", "animals", "become", "symptomatic", "at", "≈", "8", "months", "of", "age", ".", "(", "C", "-", "F", ")", "Tissue", "levels", "of", "soluble", "and", "aggregated", "mutant", "ataxin", "-", "3", "were", "measured", "in", "cerebellum", "(", "C", ",", "E", ")", "and", "frontal", "lobe", "(", "D", ",", "F", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A-B) Plasma concentrations of NfL (A) and pNfH (B) were measured in the 304Q knock-in SCA3 mouse model. Heterozygous animals become symptomatic at ≈8 months of age.(C-F) Tissue levels of soluble and aggregated mutant ataxin-3 were measured in cerebellum (C, E) and frontal lobe (D, F)."}
{"words": ["Figure", "6", "The", "figure", "shows", "the", "degree", "to", "which", "each", "variable", "differs", "between", "heterozygous", "SCA3", "mice", "and", "wildtype", "controls", "for", "a", "given", "age", ".", "For", "each", "variable", ",", "we", "quantified", "the", "deviation", "of", "hetero", "­", "zygous", "mice", "from", "controls", "of", "the", "same", "age", "by", "calculating", "the", "effect", "size", "r", "of", "the", "group", "comparison", "(", "independent", "t", "-", "tests", ")", ".", "An", "effect", "size", "of", "0", "indicates", "that", "the", "value", "in", "heterozygous", "mice", "is", "not", "different", "from", "controls", ",", "while", "an", "effect", "size", "of", "1", "would", "indicate", "strong", "abnormality", ".", "Note", "that", "the", "drop", "in", "the", "effect", "size", "of", "Nf", "levels", "from", "12", "months", "to", "18", "months", "thus", "does", "not", "imply", "a", "putative", "reduction", "of", "Nf", "levels", ",", "but", "rather", "the", "loss", "of", "the", "effect", "in", "mutants", "relative", "to", "controls", ",", "as", "controls", "show", "strong", "age", "-", "related", "Nf", "increases", "at", "18", "months", "of", "age", ".", "Negative", "effect", "size", "values", "were", "set", "to", "0", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6 The figure shows the degree to which each variable differs between heterozygous SCA3 mice and wildtype controls for a given age. For each variable, we quantified the deviation of hetero­zygous mice from controls of the same age by calculating the effect size r of the group comparison (independent t-tests). An effect size of 0 indicates that the value in heterozygous mice is not different from controls, while an effect size of 1 would indicate strong abnormality. Note that the drop in the effect size of Nf levels from 12 months to 18 months thus does not imply a putative reduction of Nf levels, but rather the loss of the effect in mutants relative to controls, as controls show strong age-related Nf increases at 18 months of age. Negative effect size values were set to 0. "}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "We", "assessed", "samples", "of", "cerebellar", "cortex", ",", "deep", "cerebellar", "nuclei", ",", "frontal", "cortex", ",", "pons", "and", "pyramidal", "tract", "by", "immunohistochemistry", "with", "ataxin", "-", "3", "staining", ",", "comparing", "heterozygous", "304Q", "SCA3", "mice", "at", "2", ",", "6", ",", "12", "and", "18", "months", "of", "age", "with", "wildtype", "animals", "at", "18", "months", ".", "ML", ":", "molecular", "layer", ",", "PC", ":", "Purkinje", "cells", ",", "GL", ":", "granular", "layer", ",", "scale", "bars", ":", "20", "µm", ".", "(", "B", ")", "We", "histologically", "assessed", "the", "number", "and", "integrity", "of", "Purkinje", "cells", "in", "the", "cerebellar", "cortex", "by", "NfL", ",", "pNfH", ",", "Nissl", "and", "calbindin", "staining", ",", "comparing", "heterozygous", "304Q", "SCA3", "mice", "at", "2", ",", "6", ",", "12", "and", "18", "months", "of", "age", "with", "wildtype", "animals", ".", "ML", ":", "molecular", "layer", ",", "PC", ":", "Purkinje", "cells", ",", "GL", ":", "granular", "layer", ",", "scale", "bars", ":", "20", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7 (A) We assessed samples of cerebellar cortex, deep cerebellar nuclei, frontal cortex, pons and pyramidal tract by immunohistochemistry with ataxin-3 staining, comparing heterozygous 304Q SCA3 mice at 2, 6, 12 and 18 months of age with wildtype animals at 18 months. ML: molecular layer, PC: Purkinje cells, GL: granular layer, scale bars: 20 µm.  (B) We histologically assessed the number and integrity of Purkinje cells in the cerebellar cortex by NfL, pNfH, Nissl and calbindin staining, comparing heterozygous 304Q SCA3 mice at 2, 6, 12 and 18 months of age with wildtype animals. ML: molecular layer, PC: Purkinje cells, GL: granular layer, scale bars: 20 µm. "}
{"words": ["Figure", "1", ".", "Select", "2D", "class", "averages", "of", "the", "particles", "that", "were", "used", "to", "calculate", "the", "2019", "-", "nCoV", "S", "reconstruction", "(", "left", ")", ".", "Side", "and", "top", "views", "of", "the", "prefusion", "structure", "of", "the", "2019", "-", "nCoV", "S", "protein", "with", "a", "single", "RBD", "in", "the", "\"", "up", "\"", "conformation", "(", "right", ")", ".", "The", "two", "RBD", "\"", "down", "\"", "protomers", "are", "shown", "as", "cryo", "-", "EM", "density", "in", "either", "white", "or", "gray", "and", "the", "RBD", "\"", "up", "\"", "protomer", "is", "shown", "in", "ribbons", ",", "colored", "corresponding", "to", "the", "schematic", "in", "Fig", "1A", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1.Select 2D class averages of the particles that were used to calculate the 2019-nCoV S reconstruction (left). Side and top views of the prefusion structure of the 2019-nCoV S protein with a single RBD in the \"up\" conformation (right). The two RBD \"down\" protomers are shown as cryo-EM density in either white or gray and the RBD \"up\" protomer is shown in ribbons, colored corresponding to the schematic in Fig 1A."}
{"words": ["Figure", "3", ".", "SPR", "sensorgram", "showing", "the", "binding", "kinetics", "for", "human", "ACE2", "and", "immobilized", "2019", "-", "nCoV", "S", ".", "Data", "are", "shown", "as", "black", "lines", "and", "the", "best", "fit", "of", "the", "data", "to", "a", "1", ":", "1", "binding", "model", "is", "shown", "in", "red", ".", "Negative", "-", "stain", "EM", "2D", "class", "averages", "of", "2019", "-", "nCoV", "S", "bound", "by", "ACE2", ".", "Averages", "have", "been", "rotated", "so", "that", "ACE2", "is", "positioned", "above", "the", "2019", "-", "nCoV", "S", "protein", "with", "respect", "to", "the", "viral", "membrane", ".", "A", "cartoon", "depicting", "the", "ACE2", "-", "bound", "2019", "-", "nCoV", "S", "protein", "is", "shown", "(", "right", ")", "with", "ACE2", "in", "blue", "and", "S", "protein", "monomers", "colored", "tan", ",", "pink", "and", "green", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3.SPR sensorgram showing the binding kinetics for human ACE2 and immobilized 2019-nCoV S. Data are shown as black lines and the best fit of the data to a 1:1 binding model is shown in red.Negative-stain EM 2D class averages of 2019-nCoV S bound by ACE2. Averages have been rotated so that ACE2 is positioned above the 2019-nCoV S protein with respect to the viral membrane. A cartoon depicting the ACE2-bound 2019-nCoV S protein is shown (right) with ACE2 in blue and S protein monomers colored tan, pink and green."}
{"words": ["Figure", "4", ".", "A", "biolayer", "interferometry", "sensorgram", "that", "shows", "binding", "to", "ACE2", "by", "the", "2019", "-", "nCoV", "RBD", "-", "SD1", ".", "Binding", "data", "are", "shown", "as", "a", "black", "line", "and", "the", "best", "fit", "of", "the", "data", "to", "a", "1", ":", "1", "binding", "model", "is", "shown", "in", "red", ".", "Biolayer", "interferometry", "to", "measure", "cross", "-", "reactivity", "of", "the", "SARS", "-", "CoV", "RBD", "-", "directed", "antibodies", "S230", ",", "m396", "and", "80R", ".", "Sensortips", "with", "immobilized", "antibodies", "were", "dipped", "into", "wells", "containing", "2019", "-", "nCoV", "RBD", "-", "SD1", "and", "the", "resulting", "data", "are", "shown", "as", "a", "black", "line", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4.A biolayer interferometry sensorgram that shows binding to ACE2 by the 2019-nCoV RBD-SD1. Binding data are shown as a black line and the best fit of the data to a 1:1 binding model is shown in red.Biolayer interferometry to measure cross-reactivity of the SARS-CoV RBD-directed antibodies S230, m396 and 80R. Sensortips with immobilized antibodies were dipped into wells containing 2019-nCoV RBD-SD1 and the resulting data are shown as a black line."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "E", ")", ".", "Relative", "luciferase", "activity", "of", "the", "sensor", "(", "+", ")", "reporter", "or", "sensor", "(", "-", ")", "reporter", "induced", "by", "expression", "vectors", "of", "the", "top", "5", "genes", "identified", "in", "the", "screen", "or", "the", "GFP", "vector", "in", "HEK293", "-", "FT", "cells", ".", "Error", "bars", "show", "SD", ";", "n", "=", "3", ".", "Significance", "was", "assessed", "using", "2", "‐", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ",", "<", "0", ".", "05", "*", ".", "(", "F", ")", ".", "Heat", "map", "of", "relative", "miRNA", "expression", "of", "various", "miRNAs", "in", "HEK", "-", "293FT", "cells", "transfected", "with", "expression", "vectors", "of", "the", "top", "5", "genes", "from", "the", "screen", ",", "or", "the", "ctrl", "(", "GFP", ")", "vector", ".", "Red", "color", "represents", "suppressed", "expression", "compared", "with", "ctrl", "(", "GFP", ")", ".", "n", "=", "3", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(E). Relative luciferase activity of the sensor (+) reporter or sensor (-) reporter induced by expression vectors of the top 5 genes identified in the screen or the GFP vector in HEK293-FT cells. Error bars show SD; n=3. Significance was assessed using 2‐tailed Student's t‐test, < 0.05*.(F). Heat map of relative miRNA expression of various miRNAs in HEK-293FT cells transfected with expression vectors of the top 5 genes from the screen, or the ctrl (GFP) vector. Red color represents suppressed expression compared with ctrl (GFP). n=3."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", ".", "Volcano", "plot", "of", "TaqMan", "array", "showing", "the", "mean", "average", "expression", "and", "p", "-", "value", "of", "miRNA", "expression", "profiles", "between", "TruB1", "KD", "and", "ctrl", "(", "scramble", ")", ".", "N", "=", "3", ".", "Significance", "was", "assessed", "using", "2", "‐", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ".", "MiRNAs", "suppressed", "(", "Relative", "expression", "TruB1", "KD", "/", "ctrl", "<", "0", ".", "8", "and", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "1", ")", "are", "enclosed", "by", "the", "red", "square", ".", "(", "D", ")", ".", "Relative", "expression", "of", "let", "-", "7", "family", "miRNAs", "and", "other", "miRNAs", "in", "HEK293FT", "cells", "with", "TruB1", "KD", "or", "ctrl", "(", "siRNA", ")", "determined", "by", "qRT", "-", "PCR", ".", "Significance", "was", "assessed", "using", "2", "‐", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ",", "<", "0", ".", "05", "*", ".", "Data", "information", ":", "All", "experiments", "were", "performed", "in", "triplicate", ".", "Error", "bars", "show", "SD", ".", "(", "E", ")", ".", "Relative", "expression", "of", "primary", "-", "let", "-", "7", "family", "miRNAs", "as", "in", "(", "D", ")", "determined", "by", "qRT", "-", "PCR", ".", "Significance", "was", "assessed", "using", "2", "‐", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ",", "<", "0", ".", "05", "*", ".", "Data", "information", ":", "All", "experiments", "were", "performed", "in", "triplicate", ".", "Error", "bars", "show", "SD", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A). Volcano plot of TaqMan array showing the mean average expression and p-value of miRNA expression profiles between TruB1 KD and ctrl (scramble). N=3. Significance was assessed using 2‐tailed Student's t‐test. MiRNAs suppressed (Relative expression TruB1 KD / ctrl <0.8 and p-value < 0.1) are enclosed by the red square.(D). Relative expression of let-7 family miRNAs and other miRNAs in HEK293FT cells with TruB1 KD or ctrl (siRNA) determined by qRT-PCR. Significance was assessed using 2‐tailed Student's t‐test, < 0.05*. Data information: All experiments were performed in triplicate. Error bars show SD.(E). Relative expression of primary-let-7 family miRNAs as in (D) determined by qRT-PCR. Significance was assessed using 2‐tailed Student's t‐test, < 0.05*. Data information: All experiments were performed in triplicate. Error bars show SD."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "C", ")", ".", "Relative", "miRNA", "expression", "of", "let", "-", "7a", "in", "HEK", "-", "293", "cells", "infected", "with", "tetracycline", "-", "inducible", "expressing", "lentiviruses", "for", "TruB1", ",", "mt1", ",", "mt2", "or", "GFP", "5", "days", "after", "doxycycline", "treatment", ",", "as", "determined", "by", "qRT", "-", "PCR", ".", "Significance", "was", "assessed", "using", "2", "‐", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ",", "<", "0", ".", "05", "*", ".", "Data", "information", ":", "All", "experiments", "were", "performed", "in", "triplicate", ".", "Error", "bars", "show", "SD", ".", "(", "D", ")", ".", "Northern", "blotting", "for", "let", "-", "7a", "and", "RNU6B", "in", "HeLa", "cells", "infected", "with", "lentiviruses", "encoding", "tetracycline", "-", "inducible", "expression", "of", "TruB1", ",", "mt1", ",", "mt2", ",", "or", "GFP", ",", "5", "days", "after", "doxycycline", "treatment", ".", "(", "G", ")", ".", "Location", "of", "pseudouridine", "sites", "detected", "by", "the", "CMC", "primer", "extension", "method", ".", "Total", "RNA", "purified", "from", "HEK", "-", "293FT", "cells", "were", "treated", "with", "CMC", ".", "CMC", "treated", "RNA", "were", "reverse", "-", "transcribed", "with", "RI", "-", "labelled", "specific", "primers", "for", "tRNAphe", "or", "pri", "-", "let", "-", "7b", ".", "ddATP", "was", "used", "for", "sequence", "control", ".", "Pseudouridines", "are", "indicated", "by", "black", "arrows", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(C). Relative miRNA expression of let-7a in HEK-293 cells infected with tetracycline-inducible expressing lentiviruses for TruB1, mt1, mt2 or GFP 5 days after doxycycline treatment, as determined by qRT-PCR. Significance was assessed using 2‐tailed Student's t‐test, < 0.05*. Data information: All experiments were performed in triplicate. Error bars show SD.(D). Northern blotting for let-7a and RNU6B in HeLa cells infected with lentiviruses encoding tetracycline-inducible expression of TruB1, mt1, mt2, or GFP, 5 days after doxycycline treatment.(G). Location of pseudouridine sites detected by the CMC primer extension method. Total RNA purified from HEK-293FT cells were treated with CMC. CMC treated RNA were reverse-transcribed with RI-labelled specific primers for tRNAphe or pri-let-7b. ddATP was used for sequence control. Pseudouridines are indicated by black arrows."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", ".", "RIP", "analysis", "of", "pri", "-", "let", "-", "7a1", "and", "Flag", "-", "TruB1", "from", "HEK", "-", "293FT", "cells", ".", "RNA", "was", "extracted", "from", "IP", "material", "and", "analyzed", "by", "qRT", "-", "PCR", ".", "HEK", "-", "293FT", "cells", "were", "infected", "with", "lentiviruses", "encoding", "tetracycline", "-", "inducible", "expression", "of", "TruB1", ",", "mt1", ",", "mt2", ",", "or", "GFP", "and", "treated", "with", "doxycycline", ".", "Error", "bars", "show", "SD", ";", "n", "=", "3", ".", "Significance", "was", "assessed", "using", "2", "‐", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ",", "<", "0", ".", "05", "*", ".", "(", "B", ")", ".", "EMSA", "of", "32p", "-", "ATP", "-", "labelled", "pri", "-", "let", "-", "7a1", "or", "pri", "-", "let", "-", "7a1", "loop", "mt", "mixed", "with", "recombinant", "TruB1", ",", "mt1", "or", "mt2", "at", "several", "doses", ".", "RNP", ":", "Ribonucleoprotein", "complexes", ".", "(", "E", ")", ".", "Tag", "densities", "represented", "as", "dots", ".", "Density", "of", "miRNA", "clusters", "in", "HITS", "-", "CLIP", "were", "normalized", "by", "miRNA", "expression", "as", "determined", "by", "TaqMan", "array", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A). RIP analysis of pri-let-7a1 and Flag-TruB1 from HEK-293FT cells. RNA was extracted from IP material and analyzed by qRT-PCR. HEK-293FT cells were infected with lentiviruses encoding tetracycline-inducible expression of TruB1, mt1, mt2, or GFP and treated with doxycycline. Error bars show SD; n=3. Significance was assessed using 2‐tailed Student's t‐test, < 0.05*.(B). EMSA of 32p-ATP-labelled pri-let-7a1 or pri-let-7a1 loop mt mixed with recombinant TruB1, mt1 or mt2 at several doses. RNP: Ribonucleoprotein complexes.(E). Tag densities represented as dots. Density of miRNA clusters in HITS-CLIP were normalized by miRNA expression as determined by TaqMan array."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", ".", "In", "vitro", "processing", "assay", "for", "RI", "-", "labelled", "pri", "-", "let", "-", "7a1", ".", "Autoradiographs", "of", "gels", "showing", "pri", "-", "let", "-", "7a1", "treated", "with", "whole", "cell", "lysate", "(", "WCL", ")", "from", "HEK", "-", "293FT", "cells", "transfected", "with", "GFP", ",", "TruB1", ",", "mt1", ",", "or", "mt2", "(", "overexpression", ",", "left", ")", ",", "and", "TruB1", "KD", "or", "ctrl", "(", "siRNA", ",", "right", ")", ".", "Dicer", "KD", "was", "used", "to", "show", "the", "height", "of", "pre", "-", "let", "-", "7a1", ".", "(", "B", ")", "RI", "intensities", "of", "(", "A", ")", "were", "quantified", "and", "normalized", "to", "ctrl", ".", "Relative", "processing", "rate", "of", "pri", "-", "let", "-", "7a1", "into", "pre", "-", "and", "mature", "-", "are", "shown", ".", "Significance", "was", "assessed", "using", "2", "‐", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ",", "<", "0", ".", "05", "*", ".", "Data", "information", ":", "All", "experiments", "were", "performed", "in", "triplicate", ".", "Error", "bars", "show", "SD", ".", "(", "C", ")", ".", "RIP", "assay", "of", "pri", "-", "let", "-", "7a1", "and", "DGCR8", "from", "HEK", "-", "293FT", "cells", ".", "Western", "blotting", "for", "input", "or", "immunoprecipitate", "(", "IP", ")", "using", "anti", "-", "DGCR8", "antibody", "and", "anti", "-", "actin", "antibody", "are", "shown", "on", "top", ".", "RNA", "was", "extracted", "from", "IP", "material", "and", "analyzed", "by", "qRT", "-", "PCR", "(", "bottom", ")", ".", "Significance", "was", "assessed", "using", "2", "‐", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ",", "<", "0", ".", "05", "*", ".", "(", "D", ")", ".", "RIP", "assay", "of", "pri", "-", "let", "-", "7a1", "and", "Flag", "-", "tagged", "TruB1", "from", "HEK", "-", "293FT", "cells", "with", "Lin28B", "KD", "or", "ctrl", "(", "siRNA", ")", ".", "Western", "blotting", "for", "input", "or", "IP", "material", "using", "anti", "-", "Flag", "antibody", ",", "anti", "-", "Lin28B", "antibody", ",", "and", "anti", "-", "actin", "antibody", "are", "shown", "on", "top", ".", "RNA", "was", "extracted", "from", "IP", "material", "and", "analyzed", "by", "qRT", "-", "PCR", "(", "bottom", ")", ".", "Significance", "was", "assessed", "using", "2", "‐", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ",", "<", "0", ".", "05", "*", ".", "Data", "information", ":", "All", "experiments", "were", "performed", "in", "triplicate", ".", "Error", "bars"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A). In vitro processing assay for RI-labelled pri-let-7a1. Autoradiographs of gels showing pri-let-7a1 treated with whole cell lysate (WCL) from HEK-293FT cells transfected with GFP, TruB1, mt1, or mt2 (overexpression, left), and TruB1 KD or ctrl (siRNA, right). Dicer KD was used to show the height of pre-let-7a1. (B) RI intensities of (A) were quantified and normalized to ctrl. Relative processing rate of pri-let-7a1 into pre- and mature- are shown. Significance was assessed using 2‐tailed Student's t‐test, < 0.05*. Data information: All experiments were performed in triplicate. Error bars show SD.(C). RIP assay of pri-let-7a1 and DGCR8 from HEK-293FT cells. Western blotting for input or immunoprecipitate (IP) using anti-DGCR8 antibody and anti-actin antibody are shown on top. RNA was extracted from IP material and analyzed by qRT-PCR (bottom). Significance was assessed using 2‐tailed Student's t‐test, < 0.05*. (D). RIP assay of pri-let-7a1 and Flag-tagged TruB1 from HEK-293FT cells with Lin28B KD or ctrl (siRNA). Western blotting for input or IP material using anti-Flag antibody, anti-Lin28B antibody, and anti-actin antibody are shown on top. RNA was extracted from IP material and analyzed by qRT-PCR (bottom). Significance was assessed using 2‐tailed Student's t‐test, < 0.05*. Data information: All experiments were performed in triplicate. Error bars show"}
{"words": ["Figure", "6", "(", "B", ")", ".", "Relative", "luciferase", "activity", "of", "KRAS", "reporter", "or", "Ctrl", "(", "empty", ")", "reporter", "in", "HEK293FT", "cells", "infected", "with", "lentiviruses", "expressing", "tetracycline", "-", "inducible", "TruB1", ",", "mt1", ",", "mt2", ",", "or", "GFP", "5", "days", "after", "doxycycline", "treatment", ".", "Significance", "was", "assessed", "using", "2", "‐", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ",", "<", "0", ".", "05", "*", ".", "Data", "information", ":", "All", "experiments", "were", "performed", "in", "triplicate", ".", "Error", "bars", "show", "SD", ".", "(", "D", ")", ".", "Relative", "expression", "of", "let", "-", "7", "families", "determined", "by", "qRT", "-", "PCR", "in", "HEK", "-", "293FT", "cells", "with", "KD", "of", "let", "-", "7", "family", "members", "or", "ctrl", "(", "using", "2", "'", "-", "O", "-", "methylated", "antisense", "inhibitor", ")", ".", "Significance", "was", "assessed", "using", "2", "‐", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ",", "<", "0", ".", "05", "*", ".", "Data", "information", ":", "All", "experiments", "were", "performed", "in", "triplicate", ".", "Error", "bars", "show", "SD", ".", "(", "E", ")", ".", "Real", "-", "time", "glo", "assay", "for", "HEK293FT", "cells", "infected", "with", "lentiviruses", "expressing", "tetracycline", "-", "inducible", "TruB1", "or", "GFP", ",", "5", "days", "after", "doxycycline", "treatment", ",", "with", "or", "without", "KD", "of", "let", "-", "7", "family", "members", ".", "GFP", ":", "GFP", "without", "let", "-", "7", "KD", ".", "WT", ":", "overexpression", "of", "wild", "type", "TruB1", "without", "let", "-", "7", "KD", ".", "WT", "+", "let7", "KD", ":", "WT", ":", "overexpression", "of", "wild", "type", "TruB1", "with", "let", "-", "7", "KD", ".", "GFP", "+", "let", "-", "7KD", ":", "GFP", "with", "let", "-", "7", "KD", ".", "Significance", "was", "assessed", "using", "2", "‐", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ",", "<", "0", ".", "05", "*", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(B). Relative luciferase activity of KRAS reporter or Ctrl (empty) reporter in HEK293FT cells infected with lentiviruses expressing tetracycline-inducible TruB1, mt1, mt2, or GFP 5 days after doxycycline treatment. Significance was assessed using 2‐tailed Student's t‐test, < 0.05*. Data information: All experiments were performed in triplicate. Error bars show SD.(D). Relative expression of let-7 families determined by qRT-PCR in HEK-293FT cells with KD of let-7 family members or ctrl (using 2'-O-methylated antisense inhibitor). Significance was assessed using 2‐tailed Student's t‐test, < 0.05*. Data information: All experiments were performed in triplicate. Error bars show SD.(E). Real-time glo assay for HEK293FT cells infected with lentiviruses expressing tetracycline-inducible TruB1 or GFP, 5 days after doxycycline treatment, with or without KD of let-7 family members. GFP: GFP without let-7 KD. WT: overexpression of wild type TruB1 without let-7 KD. WT + let7 KD: WT: overexpression of wild type TruB1 with let-7 KD. GFP + let-7KD: GFP with let-7 KD. Significance was assessed using 2‐tailed Student's t‐test, < 0.05*."}
{"words": ["Figure", "1Gating", "strategy", "for", "sorting", "of", "EpCAMhighCD24lowSca", "‑", "1", "+", "cells", "and", "rMC", "from", "lung", "homogenate", "of", "adult", "mice", ".", "Time", "-", "course", "of", "epithelial", "stem", "/", "progenitor", "cell", "proliferation", "and", "differentiation", "within", "BALO", "at", "days", "8", ",", "11", "and", "21", "of", "co", "-", "culture", "with", "rMC", ".", "Clonal", "expansion", "of", "EpCAMhighCD24lowSca", "‑", "1", "+", "cells", "derived", "from", "either", "GFP", "-", "expressing", "mice", "or", "tdTomato", "-", "expressing", "ROSAmT", "/", "mG", "mice", "at", "day", "21", "of", "co", "‑", "culture", ".", "Percentages", "of", "SCGB1A1", "+", "SFTPC", "+", "(", "BALO", ")", ",", "SCGB1A1", "+", "SFTPC", "-", "(", "bronchiolospheres", ")", "and", "SCGB1A1", "-", "SFTPC", "+", "(", "alveolospheres", ")", "organoids", "per", "well", "at", "day", "21", "of", "culture", "derived", "from", "EpCAMhighCD24lowSca", "-", "1", "+", "cells", "isolated", "from", "Scgb1a1mCherrySftpcYFP", "reporter", "mice", "(", "n", "=", "4", "biological", "replicates", ")", ".", "Representative", "confocal", "images", "of", "days", "8", "to", "21", "of", "culture", "showing", "endogenous", "SCGB1A1", "and", "SFTPC", "expression", "during", "BALO", "formation", "derived", "from", "EpCAMhighCD24lowSca", "-", "1", "+", "SCGB1A1", "+", "SFTPC", "+", "cells", "isolated", "from", "Scgb1a1mCherrySftpcYFP", "reporter", "mice", ".", "Heat", "map", "(", "left", ")", "and", "tSNE", "plot", "(", "right", ")", "(", "F", ")", "of", "digested", "day", "21", "BALO", "cultures", "depicting", "four", "distinct", "clusters", "(", "C1", ",", "airway", ",", "blue", ";", "C2", ",", "alveolar", ",", "purple", ";", "C3", ",", "MYO", ",", "orange", ",", "and", "C4", ",", "LIF", ",", "green", ")", ".", "Violin", "plots", "of", "selected", "genes", "representing", "airway", "associated", "-", "genes", "(", "G", ")", "(", "Itgb4", ",", "Trp63", ",", "Krt7", ",", "and", "Sox2", ")", "and", "alveoli", "associated", "‑", "genes", "(", "H", ")", "(", "Cxcl15", ",", "Lyz2", ",", "Sftpc", ",", "and", "Hopx", ")", ".", "Each", "violin", "plot", "shows", "the", "frequency", "distribution", "of", "the", "mean", "transcript", "level", "(", "log2", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Gating strategy for sorting of EpCAMhighCD24lowSca‑1+ cells and rMC from lung homogenate of adult mice.Time-course of epithelial stem/progenitor cell proliferation and differentiation within BALO at days 8, 11 and 21 of co-culture with rMC.Clonal expansion of EpCAMhighCD24lowSca‑1+ cells derived from either GFP-expressing mice or tdTomato-expressing ROSAmT/mG mice at day 21 of co‑culture.Percentages of SCGB1A1+SFTPC+ (BALO), SCGB1A1+SFTPC- (bronchiolospheres) and SCGB1A1-SFTPC+ (alveolospheres) organoids per well at day 21 of culture derived from EpCAMhighCD24lowSca-1+ cells isolated from Scgb1a1mCherrySftpcYFP reporter mice (n=4 biological replicates).Representative confocal images of days 8 to 21 of culture showing endogenous SCGB1A1 and SFTPC expression during BALO formation derived from EpCAMhighCD24lowSca-1+SCGB1A1+SFTPC+ cells isolated from Scgb1a1mCherrySftpcYFP reporter mice.Heat map (left) and tSNE plot (right) (F) of digested day 21 BALO cultures depicting four distinct clusters (C1, airway, blue; C2, alveolar, purple; C3, MYO, orange, and C4, LIF, green).Violin plots of selected genes representing airway associated-genes (G) (Itgb4, Trp63, Krt7, and Sox2) and alveoli associated‑genes (H) (Cxcl15, Lyz2, Sftpc, and Hopx). Each violin plot shows the frequency distribution of the mean transcript level (log2)."}
{"words": ["Figure", "2mRNA", "expression", "analysis", "of", "epithelial", "cell", "differentiation", "markers", "Sftpc", "(", "AEC", "II", ")", ",", "Hopx", "(", "AEC", "I", ")", ",", "Foxj1", "(", "ciliated", "cells", ")", ",", "Muc5ac", "(", "secretory", "cells", ")", "and", "p63", "(", "basal", "cells", ")", "in", "BALO", "at", "days", "0", ",", "10", ",", "and", "21", "of", "culture", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", "with", "pooled", "cells", "from", "4", "cultures", "per", "replicate", ")", "Electron", "microscopy", "of", "BALO", "alveoli", "showing", "two", "cuboidal", "epithelial", "cells", "(", "AEC", "II", ")", "connected", "by", "tight", "junctions", "(", "red", "square", ")", "with", "numerous", "mitochondria", "(", "M", ")", "and", "lamellar", "bodies", "(", "LB", ")", ".", "A", "LIF", "with", "numerous", "lipid", "droplets", "(", "*", ")", "and", "a", "MYO", "with", "cisterns", "of", "rough", "ER", "(", "red", "arrow", ")", "are", "located", "at", "the", "basal", "side", "(", "left", ")", ".", "The", "alveolar", "lumen", "is", "filled", "with", "lamellar", "surfactant", "including", "tubular", "myelin", "(", "white", "arrow", ")", "(", "lower", "right", ")", ".", "Exocytosis", "of", "a", "lamellar", "body", "(", "*", ")", "from", "an", "AEC", "II", "(", "upper", "right", ")", ".", "Scale", "bars", "indicate", "500", "nm", ".", "Electron", "microscopy", "of", "bronchiolar", "-", "like", "airway", "depicting", "columnar", "ciliated", "cells", "(", "red", "arrowhead", ")", "with", "basal", "bodies", "(", "black", "arrowhead", ")", "at", "the", "left", "side", "of", "the", "longitudinally", "sectioned", "lumen", ".", "The", "boxed", "area", "indicates", "an", "apical", "junctional", "complex", "between", "two", "ciliated", "cells", ".", "1", "=", "tight", "junction", ",", "2", "=", "adherens", "junction", ".", "Scale", "bar", "indicates", "500", "nm", "(", "in", "insert", ":", "100", "nm", ")", ".", "Staining", "of", "lamellar", "bodies", "in", "BALO", "with", "RFP", "LysoTracker", ".", "Scale", "bars", "represent", "100", "μm", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "the", "surfactant", "proteins", ":", "pro", "-", "SPC", ",", "mature", "SPC", ",", "pro", "-", "SPB", ",", "mature", "SPB", ",", "and", "SPA", "in", "lung", "homogenate", "(", "LH", ")", ",", "AEC", "and", "day", "21", "BALO", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "F", "-", "G", ".", "Alveolar", "diameter", "(", "F", ")", "and", "number", "of", "alveoli", "(", "G", ")", "in", "BALO", "at", "days", "15", ",", "21", ",", "30", "and", "40", "of", "culture", "was", "measured", "from", "n", "=", "5", "BALO", "in", "n", "=", "3", "biological", "replicates", "with", "tdTomato", "+", "rMC", ".", "H", "-", "I", ".", "Representative", "scheme", "and", "images", "of", "day", "40", "BALO", "alveoli", "(", "H", ")", "and", "airway", "(", "I", ")", ".", "BALO", "alveolar", "-", "like", "structures", "(", "H", ")", "are", "shown", "(", "h", "'", ")", "(", "red", "arrowheads", ")", "in", "semithin", "section", "(", "0", ".", "5", "µm", ")", "stained", "with", "Toluidine", "blue", ".", "Scale", "bar", "indicates", "100", "μm", "(", "left", ")", ".", "Electron", "microscopy", "showing", "AEC", "I", "(", "h", "'", "'", ")", "ultrastructure", "within", "BALO", ".", "Scale", "bars", "indicate", "2500", "nm", "(", "center", ")", "and", "1000", "nm", "(", "right", ")", ".", "An", "airway", "-", "like", "structure", "(", "i", "'", ")", "is", "shown", "with", "secretory", "and", "ciliated", "cells", "(", "red", "arrowheads", ")", "in", "semithin", "sections", "(", "0", ".", "5", "µm", ")", "longitudinally", "cut", "and", "stained", "with", "Toluidine", "blue", ".", "Scale", "bar", "indicates", "50", "μm", "(", "far", "left", ")", ".", "Electron", "microscopy", "of", "a", "bronchiolar", "-", "like", "airway", "(", "I", ")", "depicting", "pseudostratified", "epithelium", "(", "i", "'", "'", ")", "with", "a", "basal", "-", "like", "cell", "(", "BC", ")", ",", "not", "reaching", "the", "lumen", "in", "which", "cilia", "(", "C", ")", "are", "seen", ",", "located", "between", "a", "secretory", "(", "SC", ")", "and", "a", "ciliated", "cell", "(", "Ci", ")", ".", "Scale", "bars", "indicate", "1000", "nm", "(", "left", "and", "right", ")", ".", "Mature", "cilia", "(", "i", "'", "'", "'", ")", "in", "BALO", "at", "higher", "magnification", "depicting", "the", "9x2", "+", "2", "structure", "with", "central", "doubled", "microtubules", "(", "insert", ",", "red", "arrowhead", ")", ",", "a", "characteristic", "for", "motile", "cilia", ".", "Scale", "bar", "indicates", "100", "nm", "(", "far", "right", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2mRNA expression analysis of epithelial cell differentiation markers Sftpc (AEC II), Hopx (AEC I), Foxj1 (ciliated cells), Muc5ac (secretory cells) and p63 (basal cells) in BALO at days 0, 10, and 21 of culture (n=3 biological replicates with pooled cells from 4 cultures per replicate)Electron microscopy of BALO alveoli showing two cuboidal epithelial cells (AEC II) connected by tight junctions (red square) with numerous mitochondria (M) and lamellar bodies (LB). A LIF with numerous lipid droplets (*) and a MYO with cisterns of rough ER (red arrow) are located at the basal side (left). The alveolar lumen is filled with lamellar surfactant including tubular myelin (white arrow) (lower right). Exocytosis of a lamellar body (*) from an AEC II (upper right). Scale bars indicate 500 nm.Electron microscopy of bronchiolar-like airway depicting columnar ciliated cells (red arrowhead) with basal bodies (black arrowhead) at the left side of the longitudinally sectioned lumen. The boxed area indicates an apical junctional complex between two ciliated cells. 1 = tight junction, 2 = adherens junction. Scale bar indicates 500 nm (in insert: 100 nm).Staining of lamellar bodies in BALO with RFP LysoTracker. Scale bars represent 100 μm.Western blot analysis of the surfactant proteins: pro-SPC, mature SPC, pro-SPB, mature SPB, and SPA in lung homogenate (LH), AEC and day 21 BALO (n=3 biological replicates).F-G. Alveolar diameter (F) and number of alveoli (G) in BALO at days 15, 21, 30 and 40 of culture was measured from n=5 BALO in n=3 biological replicates with tdTomato+ rMC.H-I. Representative scheme and images of day 40 BALO alveoli (H) and airway (I). BALO alveolar-like structures (H) are shown (h') (red arrowheads) in semithin section (0.5 µm) stained with Toluidine blue. Scale bar indicates 100 μm (left). Electron microscopy showing AEC I (h'') ultrastructure within BALO. Scale bars indicate 2500 nm (center) and 1000 nm (right). An airway-like structure (i') is shown with secretory and ciliated cells (red arrowheads) in semithin sections (0.5 µm) longitudinally cut and stained with Toluidine blue. Scale bar indicates 50 μm (far left). Electron microscopy of a bronchiolar-like airway (I) depicting pseudostratified epithelium (i'') with a basal-like cell (BC), not reaching the lumen in which cilia (C) are seen, located between a secretory (SC) and a ciliated cell (Ci). Scale bars indicate 1000 nm (left and right). Mature cilia (i''') in BALO at higher magnification depicting the 9x2+2 structure with central doubled microtubules (insert, red arrowhead), a characteristic for motile cilia. Scale bar indicates 100 nm (far right)."}
{"words": ["Figure", "3Representative", "images", "of", "day", "21", "BALO", "and", "tdTomato", "+", "rMC", "stained", "with", "LipidTOX", "(", "green", ")", ".", "Scale", "bar", "represents", "100", "μm", ".", "Fluorescence", "images", "of", "αSMA", "(", "green", ")", "and", "neutral", "lipids", "(", "LipidTOX", "red", ")", "staining", "in", "WT", "‑", "derived", "rMC", "and", "BALO", "(", "dotted", "lines", "indicate", "single", "BALO", "or", "insert", ")", "at", "day", "21", "of", "culture", ".", "Scale", "bars", "represent", "50", "μm", "(", "left", ")", "and", "25", "μm", "(", "right", ")", ".", "Representative", "flow", "cytometric", "dot", "plots", "and", "histograms", "of", "PDGFRα", "expression", "in", "rMC", "(", "EpCAM", "-", "CD45", "-", "CD31", "-", "Sca", "-", "1", "+", ")", "isolated", "from", "the", "lung", "homogenate", "of", "PdgfraGFP", "reporter", "mice", ".", "Representative", "images", "of", "BALO", "formation", "at", "day", "8", ",", "15", "and", "21", "of", "co", "-", "culture", ".", "WT", "BASC", "were", "co", "‑", "cultivated", "with", "sorted", "rMC", "(", "total", "PDGFRα", "+", "population", ")", "or", "rMC", "expressing", "either", "low", "or", "high", "levels", "of", "PDGFRα", "‑", "GFP", ".", "Scale", "bars", "represent", "100", "μm", ".", "tSNE", "plots", "and", "violin", "plots", "depicting", "selected", "genes", "representing", "MYO", "(", "Pdgfrα", ",", "Tagln", ",", "Acta2", ",", "Eln", ",", "and", "Axin2", ")", "(", "top", "panels", ")", "and", "LIF", "associated", "-", "genes", "(", "Fgf10", ",", "Apoe", ",", "Serpina3n", ",", "Gsn", ",", "and", "Gas6", ")", "(", "bottom", "panels", ")", ".", "Each", "violin", "plot", "shows", "the", "frequency", "distribution", "of", "the", "mean", "transcript", "level", "(", "log2", ")", ".", "C3", "(", "MYO", ",", "orange", ")", "and", "C4", "(", "LIF", ",", "green", ")", "refer", "to", "the", "scRNA", "-", "Seq", "experiment", "in", "Fig", ".", "1G", ".", "Fluorescence", "image", "of", "αSMA", "+", "PDGFRαhigh", "MYO", "(", "yellow", "arrows", ")", "and", "LipidTOX", "+", "PDGFRαlow", "LIF", "(", "red", "arrows", ")", "from", "sorted", "PDGFRα", "-", "GFP", "rMC", "after", "21", "days", "of", "BALO", "culture", ".", "Scale", "bars", "represent", "50", "μm", "(", "left", ")", "and", "25", "μm", "(", "right", ")", ".", "Fluorescence", "image", "containing", "PDGFRαhigh", "MYO", "from", "sorted", "PDGFRα", "-", "GFP", "rMC", "within", "BALO", "derived", "from", "tdTomato", "+", "mice", "at", "day", "21", "of", "culture", ".", "Scale", "bars", "represent", "100", "μm", "(", "left", ")", "and", "50", "μm", "(", "right", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Representative images of day 21 BALO and tdTomato+ rMC stained with LipidTOX (green). Scale bar represents 100 μm.Fluorescence images of αSMA (green) and neutral lipids (LipidTOX red) staining in WT‑derived rMC and BALO (dotted lines indicate single BALO or insert) at day 21 of culture. Scale bars represent 50 μm (left) and 25 μm (right).Representative flow cytometric dot plots and histograms of PDGFRα expression in rMC (EpCAM-CD45-CD31-Sca-1+) isolated from the lung homogenate of PdgfraGFP reporter mice.Representative images of BALO formation at day 8, 15 and 21 of co-culture. WT BASC were co‑cultivated with sorted rMC (total PDGFRα+ population) or rMC expressing either low or high levels of PDGFRα‑GFP. Scale bars represent 100 μm.tSNE plots and violin plots depicting selected genes representing MYO (Pdgfrα, Tagln, Acta2, Eln, and Axin2) (top panels) and LIF associated-genes (Fgf10, Apoe, Serpina3n, Gsn, and Gas6) (bottom panels). Each violin plot shows the frequency distribution of the mean transcript level (log2). C3 (MYO, orange) and C4 (LIF, green) refer to the scRNA-Seq experiment in Fig. 1G.Fluorescence image of αSMA+PDGFRαhigh MYO (yellow arrows) and LipidTOX+PDGFRαlow LIF (red arrows) from sorted PDGFRα-GFP rMC after 21 days of BALO culture. Scale bars represent 50 μm (left) and 25 μm (right).Fluorescence image containing PDGFRαhigh MYO from sorted PDGFRα-GFP rMC within BALO derived from tdTomato+ mice at day 21 of culture. Scale bars represent 100 μm (left) and 50 μm (right)."}
{"words": ["Figure", "4", "Gating", "strategy", "to", "define", "TR", "‑", "Mac", "from", "BAL", "of", "adult", "tdTomato", "+", "mice", "Representative", "images", "of", "BALO", "after", "microinjection", "of", "tdTomato", "+", "TR", "-", "Mac", "at", "day", "14", ".", "TR", "-", "Mac", "are", "preferentially", "found", "in", "alveoli", "(", "right", ")", ".", "Scale", "bar", "represent", "100", "μm", "(", "left", ")", "and", "50", "μm", "(", "right", ")", "Fluorescence", "confocal", "images", "of", "CD206", ",", "Siglec", "-", "F", ",", "and", "isotype", "control", "staining", "14", "days", "after", "tdTomato", "+", "TR", "‑", "Mac", "microinjection", "in", "a", "day", "28", "BALO", ".", "Scale", "bars", "represent", "100", "μm", "(", "left", ")", "and", "25", "μm", "(", "right", ")", "Electron", "microscopy", "depicting", "filopodium", "of", "TR", "‑", "Mac", "(", "white", "dashed", "lines", ")", "with", "a", "characteristic", "actin", "filament", "bundle", "(", "yellow", "background", ")", "(", "left", "panel", ")", "in", "contact", "with", "AEC", "I", "within", "BALO", "alveolar", "-", "like", "structures", ".", "Uptake", "of", "surfactant", "by", "TR", "-", "mac", "is", "depicted", "by", "a", "(", "*", ")", ".", "Scale", "bar", "indicates", "1000nm", "(", "left", ",", "in", "insert", ":", "500", "nm", ")", "and", "500", "nm", "(", "right", ",", "in", "insert", ":", "250", "nm", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "Cx43", "staining", "in", "tdTomato", "+", "TR", "-", "Mac", "monoculture", "in", "Matrigel", "and", "tdTomato", "+", "TR", "‑", "Mac", "microinjected", "at", "day", "14", "and", "analyzed", "in", "a", "mature", "day", "21", "BALO", ".", "Scale", "bars", "represent", "50", "μm", "(", "overview", ")", "and", "5", "μm", "(", "close", "up", ")", "Heat", "map", "(", "left", ")", "and", "tSNE", "plot", "(", "right", ")", "of", "the", "comparative", "analysis", "of", "digested", "day", "23", "BALO", "cultures", "with", "(", "+", ")", "and", "without", "(", "-", ")", "microinjected", "TR", "‑", "Mac", "depicting", "six", "distinct", "clusters", "(", "C1", ",", "club", "/", "secretory", "cells", ",", "red", ";", "C2", ",", "basal", "cells", ",", "yellow", ";", "C3", ",", "rMC", ",", "green", ";", "C4", ",", "AEC", "II", ",", "blue", ";", "C5", ",", "AEC", "I", ",", "purple", ";", "and", "C6", ",", "ciliated", "cells", ",", "pink", ")", "Expression", "data", "dot", "plots", "of", "genes", "found", "differentially", "regulated", "in", "cluster", "C1", "between", "day", "23", "BALO", "with", "(", "C1", "+", ")", "and", "without", "(", "C1", "-", ")", "microinjected", "TR", "-", "Mac", ".", "The", "circle", "size", "illustrates", "the", "number", "of", "cells", "expressing", "a", "specific", "gene", "Percentage", "of", "terminally", "differentiated", "cells", "(", "AEC", "I", "and", "ciliated", "cells", ")", "in", "day", "23", "BALO", "cultures", "with", "(", "+", ")", "and", "without", "(", "-", ")", "microinjected", "TR", "‑", "Mac"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4 Gating strategy to define TR‑Mac from BAL of adult tdTomato+ mice  Representative images of BALO after microinjection of tdTomato+ TR-Mac at day 14. TR-Mac are preferentially found in alveoli (right). Scale bar represent 100 μm (left) and 50 μm (right)  Fluorescence confocal images of CD206, Siglec-F, and isotype control staining 14 days after tdTomato+ TR‑Mac microinjection in a day 28 BALO. Scale bars represent 100 μm (left) and 25 μm (right)  Electron microscopy depicting filopodium of TR‑Mac (white dashed lines) with a characteristic actin filament bundle (yellow background) (left panel) in contact with AEC I within BALO alveolar-like structures. Uptake of surfactant by TR-mac is depicted by a (*). Scale bar indicates 1000nm (left, in insert: 500 nm) and 500 nm (right, in insert: 250 nm)  Representative confocal images of Cx43 staining in tdTomato+ TR-Mac monoculture in Matrigel and tdTomato+ TR‑Mac microinjected at day 14 and analyzed in a mature day 21 BALO. Scale bars represent 50 μm (overview) and 5 μm (close up)  Heat map (left) and tSNE plot (right) of the comparative analysis of digested day 23 BALO cultures with (+) and without (-) microinjected TR‑Mac depicting six distinct clusters (C1, club/secretory cells, red; C2, basal cells, yellow; C3, rMC, green; C4, AEC II, blue; C5, AEC I, purple; and C6, ciliated cells, pink)  Expression data dot plots of genes found differentially regulated in cluster C1 between day 23 BALO with (C1+) and without (C1-) microinjected TR-Mac. The circle size illustrates the number of cells expressing a specific gene  Percentage of terminally differentiated cells (AEC I and ciliated cells) in day 23 BALO cultures with (+) and without (-) microinjected TR‑Mac "}
{"words": ["Figure", "5Representative", "images", "of", "E11", ".", "5", "lung", "explants", "after", "treatment", "for", "48", "h", "with", "100", "μM", "Scra", "or", "mo142", "-", "3p", "reveals", "reduced", "size", "and", "branching", "morphogenesis", "after", "miR142", "-", "3p", "knockdown", ".", "Organoid", "diameter", "(", "n", "=", "30", "-", "50", "per", "group", ")", "in", "µm", "before", "addition", "of", "4", "μM", "Scra", "or", "mo142", "-", "3p", "at", "day", "6", "(", "control", ")", "and", "5", "days", "after", "treatment", "(", "at", "day", "11", "BALO", "culture", ")", "in", "n", "=", "3", "biological", "replicatesRepresentative", "images", "of", "β", "-", "galactosidase", "staining", "in", "TOPGAL", "epithelium", "(", "C", ")", "BALO", "cultures", "before", "(", "day", "6", ",", "control", ")", "or", "5", "days", "after", "treatment", "with", "either", "4", "μM", "Scra", "or", "mo142", "-", "3p", "(", "day", "11", "of", "co", "-", "culture", ")", ".", "BASC", "and", "rMC", "were", "isolated", "form", "the", "lung", "homogenate", "of", "TOPGAL", "mice", ".", "β", "-", "galactosidase", "+", "rMC", "at", "day", "11", "of", "culture", "are", "indicated", "with", "arrows", ".", "Representative", "images", "of", "β", "-", "galactosidase", "staining", "in", "TOPGAL", "rMC", "(", "D", ")", "BALO", "cultures", "before", "(", "day", "6", ",", "control", ")", "or", "5", "days", "after", "treatment", "with", "either", "4", "μM", "Scra", "or", "mo142", "-", "3p", "(", "day", "11", "of", "co", "-", "culture", ")", ".", "BASC", "and", "rMC", "were", "isolated", "form", "the", "lung", "homogenate", "of", "TOPGAL", "mice", ".", "β", "-", "galactosidase", "+", "rMC", "at", "day", "11", "of", "culture", "are", "indicated", "with", "arrows", ".", "Representative", "transmission", "and", "confocal", "images", "after", "LysoTracker", "staining", "indicating", "branching", "and", "number", "of", "branching", "points", "in", "n", "=", "4", "BALO", "15", "days", "after", "treatment", "with", "4", "μM", "Scra", "or", "mo142", "-", "3p", "(", "day", "21", "of", "co", "-", "culture", ")", "in", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "mRNA", "levels", "of", "epithelial", "and", "mesenchymal", "miR142", "-", "3p", "expression", "in", "Scra", "and", "mo142", "-", "3p", "-", "treated", "organoids", "5", "days", "after", "treatment", "(", "n", "=", "3", "-", "4", "biological", "replicates", "with", "pooled", "cells", "from", "4", "cultures", "per", "replicate", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Representative images of E11.5 lung explants after treatment for 48 h with 100 μM Scra or mo142-3p reveals reduced size and branching morphogenesis after miR142-3p knockdown.Organoid diameter (n=30-50 per group) in µm before addition of 4 μM Scra or mo142-3p at day 6 (control) and 5 days after treatment (at day 11 BALO culture) in n=3 biological replicatesRepresentative images of β-galactosidase staining in TOPGAL epithelium (C) BALO cultures before (day 6, control) or 5 days after treatment with either 4 μM Scra or mo142-3p (day 11 of co-culture). BASC and rMC were isolated form the lung homogenate of TOPGAL mice. β-galactosidase+ rMC at day 11 of culture are indicated with arrows.Representative images of β-galactosidase staining in TOPGAL rMC (D) BALO cultures before (day 6, control) or 5 days after treatment with either 4 μM Scra or mo142-3p (day 11 of co-culture). BASC and rMC were isolated form the lung homogenate of TOPGAL mice. β-galactosidase+ rMC at day 11 of culture are indicated with arrows.Representative transmission and confocal images after LysoTracker staining indicating branching and number of branching points in n=4 BALO 15 days after treatment with 4 μM Scra or mo142-3p (day 21 of co-culture) in n=3 biological replicates.mRNA levels of epithelial and mesenchymal miR142-3p expression in Scra and mo142-3p-treated organoids 5 days after treatment (n=3-4 biological replicates with pooled cells from 4 cultures per replicate)."}
{"words": ["Figure", "6", "Representative", "images", "of", "day", "21", "BALO", "after", "microinjection", "of", "SC35M", "-", "GFP", "IAV", "(", "green", ")", "into", "the", "central", "airway", "-", "like", "(", "*", ")", "after", "0", "and", "12", "h", "pi", "visualizes", "IVA", "spread", "to", "the", "alveolar", "-", "like", "regions", ".", "Dotted", "lines", "illustrate", "BALO", "-", "borders", ".", "Scale", "bars", "represent", "100", "μm", "Quantification", "of", "plaque", "forming", "units", "in", "supernatants", "from", "mock", "or", "SC35M", "IAV", "infected", "BALO", "48", "h", "after", "infection", "(", "n", "=", "5", "biological", "replicates", ")", ".", "N", ".", "D", ".", ":", "not", "-", "detectable", "Relative", "NP", "expression", "in", "PR8", "IAV", "infected", "(", "HA", "+", ")", "or", "non", "-", "infected", "(", "HA", "-", ")", "epithelial", "cells", "isolated", "from", "BALO", "48", "h", "pi", ",", "FACS", "-", "sorted", "according", "to", "EpCAM", "and", "HA", "expression", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", "with", "pooled", "cells", "from", "4", "cultures", "per", "replicate", ")", "Representative", "flow", "cytometric", "data", "showing", "the", "percentage", "of", "EpCAM", "+", "NP", "+", "cells", "in", "mock", "-", "and", "SC35M", "IAV", "‑", "infected", "BALO", "at", "48", "h", "pi", "in", "n", "=", "3", "biological", "replicates", "with", "pooled", "cells", "from", "4", "cultures", "per", "replicate", "Representative", "fluorescence", "images", "of", "a", "day", "21", "distal", "region", "in", "BALO", "generated", "from", "mTmG", "reporter", "mouse", "and", "infected", "by", "SC35M", "-", "Cre", "IAV", "after", "0", ",", "10", ",", "14", "and", "25", "h", ".", "Arrows", "indicate", "cell", "death", ".", "Scale", "bars", "represent", "25", "μm", "and", "10", "μm", "in", "the", "insert", "mRNA", "expression", "of", "Ifnb", "in", "mock", "and", "PR8", "IAV", "-", "infected", "BALO", "at", "48", "h", "pi", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", "with", "pooled", "cells", "from", "4", "cultures", "per", "replicate", ")", "Release", "of", "TNFα", "(", "6", "h", "pi", ")", ",", "IL", "-", "6", "(", "48", "h", "pi", ")", ",", "IL", "-", "1β", "(", "48", "h", "pi", ")", "detected", "by", "Bio", "-", "Plex", "®", "Multiplex", "Immunoassay", "in", "the", "supernatant", "of", "mock", "and", "IAV", "infected", "BALO", "cultures", "with", "and", "without", "TR", "-", "Mac", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6 Representative images of day 21 BALO after microinjection of SC35M-GFP IAV (green) into the central airway-like (*) after 0 and 12 h pi visualizes IVA spread to the alveolar-like regions. Dotted lines illustrate BALO-borders. Scale bars represent 100 μm  Quantification of plaque forming units in supernatants from mock or SC35M IAV infected BALO 48 h after infection (n=5 biological replicates). N.D.: not-detectable  Relative NP expression in PR8 IAV infected (HA+) or non-infected (HA-) epithelial cells isolated from BALO 48 h pi, FACS-sorted according to EpCAM and HA expression (n=3 biological replicates with pooled cells from 4 cultures per replicate)  Representative flow cytometric data showing the percentage of EpCAM+NP+ cells in mock- and SC35M IAV‑infected BALO at 48 h pi in n=3 biological replicates with pooled cells from 4 cultures per replicate  Representative fluorescence images of a day 21 distal region in BALO generated from mTmG reporter mouse and infected by SC35M-Cre IAV after 0, 10, 14 and 25 h. Arrows indicate cell death. Scale bars represent 25 μm and 10 μm in the insert  mRNA expression of Ifnb in mock and PR8 IAV-infected BALO at 48 h pi (n=3 biological replicates with pooled cells from 4 cultures per replicate)  Release of TNFα (6 h pi), IL-6 (48 h pi), IL-1β (48 h pi) detected by Bio-Plex® Multiplex Immunoassay in the supernatant of mock and IAV infected BALO cultures with and without TR-Mac (n=3 biological replicates) "}
{"words": ["Figure", "1Representative", "sections", "of", "WT", "and", "MPSIIIA", "brains", "at", "9", "months", "of", "age", "stained", "for", "astrocytes", "(", "GFAP", ")", "or", "microglia", "(", "isolectin", "B4", ",", "ILB4", ")", ".", "Images", "correspond", "to", "high", "power", "views", "covering", "cortical", "layers", "II", "-", "V", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "(", "n", "=", "4", "mice", "per", "group", ")", ".", "Quantitative", "PCR", "for", "various", "inflammatory", "cytokines", "in", "whole", "brains", "from", "9", "month", "old", "WT", "and", "MPSIIIA", "mice", ".", "Symbols", "above", "bars", "are", "versus", "WT", ".", "(", "n", "=", "6", "mice", "per", "group", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "STDEV", ",", "data", "for", "each", "cytokine", "were", "tested", "by", "unpaired", "t", "-", "test", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Symbols", "above", "bars", "are", "versus", "WT", ".", "Quantification", "of", "IL", "-", "1β", "and", "IL", "-", "1Ra", "levels", "in", "plasma", "from", "human", "healthy", "control", "and", "MPSIII", "patients", "(", "n", "=", "6", "control", "participants", "and", "n", "=", "21", "MPSIII", "patients", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "STDEV", "and", "were", "tested", "by", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "C", ".", "IL", "-", "1β", ",", "control", "vs", ".", "MPSIII", "P", "=", "0", ".", "0407", ";", "D", ".", "IL", "-", "1Ra", ",", "control", "vs", ".", "MPSIII", "P", "=", "0", ".", "0001", ".", "Quantification", "of", "IL", "-", "1β", "and", "IL", "-", "1Ra", "levels", "in", "cerebrospinal", "fluid", "(", "CSF", ")", "from", "control", "and", "MPSIII", "patients", "(", "n", "=", "3", "control", "participants", "and", "n", "=", "21", "MPSIII", "patients", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "STDEV", "and", "were", "tested", "by", "unpaired", "t", "-", "test", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ".", "F", ".", "IL", "-", "1Ra", ",", "control", "vs", ".", "MPSIII", "P", "=", "0", ".", "0167", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Representative sections of WT and MPSIIIA brains at 9 months of age stained for astrocytes (GFAP) or microglia (isolectin B4, ILB4). Images correspond to high power views covering cortical layers II-V. Scale bar, 100 μm. (n=4 mice per group).Quantitative PCR for various inflammatory cytokines in whole brains from 9 month old WT and MPSIIIA mice. Symbols above bars are versus WT. (n=6 mice per group). Data are expressed as mean ± STDEV, data for each cytokine were tested by unpaired t-test; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. Symbols above bars are versus WT.Quantification of IL-1β and IL-1Ra levels in plasma from human healthy control and MPSIII patients (n=6 control participants and n=21 MPSIII patients). Data are expressed as mean ± STDEV and were tested by unpaired t-test. C. IL-1β, control vs. MPSIII P=0.0407; D. IL-1Ra, control vs. MPSIII P=0.0001. Quantification of IL-1β and IL-1Ra levels in cerebrospinal fluid (CSF) from control and MPSIII patients (n=3 control participants and n=21 MPSIII patients). Data are expressed as mean ± STDEV and were tested by unpaired t-test; *P<0.05. F. IL-1Ra, control vs. MPSIII P=0.0167."}
{"words": ["Figure", "2The", "expression", "of", "Il1b", "was", "measured", "in", "whole", "brain", "using", "quantitative", "PCR", "1", "hour", ",", "2", "hours", "and", "6", "hours", "after", "I", ".", "P", ".", "challenge", "(", "n", "=", "6", "mice", "per", "group", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "STDEV", "and", "were", "tested", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "'", "s", "post", "-", "test", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Symbols", "above", "bars", "are", "versus", "PBS", "at", "the", "relevant", "time", "-", "point", ".", "Quantification", "of", "intracellular", "production", "of", "IL", "-", "1β", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", "each", "with", "3", "inter", "-", "experimental", "replicates", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "STDEV", "and", "were", "tested", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "test", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Symbols", "above", "bars", "are", "versus", "PBS", ".", "Quantification", "of", "IL", "-", "1β", "secreted", "into", "the", "media", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", "each", "with", "3", "inter", "-", "experimental", "replicates", ")", ".", "A", "horizontal", "dotted", "line", "represents", "the", "limit", "of", "detection", "of", "the", "ELISA", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "STDEV", "and", "were", "tested", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "test", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Symbols", "above", "bars", "are", "versus", "PBS", ".", "WT", "mixed", "glial", "cultures", "were", "co", "-", "treated", "with", "MPSIIIA", "GAG", "(", "4", "μg", "/", "ml", ")", "and", "/", "or", "the", "TLR4", "inhibitor", "CLI", "-", "095", "(", "1", "μg", "/", "ml", ")", "for", "24", "hours", ".", "The", "intracellular", "production", "of", "IL", "-", "1β", "was", "measured", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", "each", "with", "3", "inter", "-", "experimental", "replicates", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "STDEV", "and", "were", "tested", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "test", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Symbols", "above", "bars", "are", "versus", "MPSIIIA", "GAG", "+", "vehicle", ".", "Multi", "-", "heparinase", "(", "HepM", ")", "and", "/", "or", "chondroitinase", "ABC", "(", "cABC", ")", "digests", "were", "performed", "on", "MPSIIIA", "GAG", ",", "and", "the", "resulting", "oligosaccharides", "applied", "to", "a", "WT", "mixed", "glial", "culture", "for", "24", "hours", "alongside", "heparin", ",", "bovine", "HS", "(", "bHS", ")", ",", "porcine", "DS", "(", "pDS", ")", "and", "WT", "GAG", ".", "The", "intracellular", "production", "of", "IL", "-", "1β", "was", "measured", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", "each", "with", "3", "inter", "-", "experimental", "replicates", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "STDEV", "and", "were", "tested", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "test", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Symbols", "above", "bars", "are", "versus", "MPSIIIA", "GAG", "alone", ".", "MPSIIIA", "GAG", "was", "2", "-", "O", "-", "desulphated", "(", "hashed", "bars", ")", "utilising", "120", "mM", "NaOH", ",", "and", "compositional", "HS", "disaccharide", "analysis", "performed", "via", "RP", "-", "HPLC", "against", "untreated", "MPSIIIA", "GAG", "(", "black", "bars", ")", "to", "validate", "complete", "2", "-", "O", "-", "desulphation", ".", "Percentage", "contribution", "of", "each", "modification", "were", "determined", "(", "n", "=", "3", "GAG", "samples", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "STDEV", "and", "were", "tested", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "'", "s", "post", "-", "test", ";", "2S", "MPSIIIA", "GAG", "vs", ".", "2S", "2", "-", "ODS", "MPSIIIA", "GAG", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "NS", ",", "N", "-", "sulphated", "glucosamine", ";", "2S", ",", "2", "-", "O", "-", "sulphate", "group", ";", "6S", ",", "6", "-", "O", "sulphate", "group", ".", "MPSIIIA", "GAG", "was", "2", "-", "O", "-", "desulphated", "and", "the", "resulting", "oligosaccharides", "applied", "to", "a", "WT", "mixed", "glial", "culture", "for", "24", "hours", ".", "The", "intracellular", "production", "of", "IL", "-", "1β", "was", "measured", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", "each", "with", "3", "inter", "-", "experimental", "replicates", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "STDEV", "and", "were", "tested", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "test", ";", "MPSIIIA", "GAG", "vs", ".", "2ODS", "MPSIIIA", "GAG", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "2ODS", ",", "2", "-", "O", "-", "desulphated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2The expression of Il1b was measured in whole brain using quantitative PCR 1 hour, 2 hours and 6 hours after I.P. challenge (n=6 mice per group). Data are expressed as mean ± STDEV and were tested by two-way ANOVA with Bonferroni's post-test; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. Symbols above bars are versus PBS at the relevant time-point.Quantification of intracellular production of IL-1β (n=3 independent experiments each with 3 inter-experimental replicates). Data are expressed as mean ± STDEV and were tested by one-way ANOVA with Tukey's post-test; ***P<0.001. Symbols above bars are versus PBS. Quantification of IL-1β secreted into the media (n=3 independent experiments each with 3 inter-experimental replicates). A horizontal dotted line represents the limit of detection of the ELISA. Data are expressed as mean ± STDEV and were tested by one-way ANOVA with Tukey's post-test; **P<0.01, ***P<0.001. Symbols above bars are versus PBS.WT mixed glial cultures were co-treated with MPSIIIA GAG (4 μg/ml) and/or the TLR4 inhibitor CLI-095 (1 μg/ml) for 24 hours. The intracellular production of IL-1β was measured (n=3 independent experiments each with 3 inter-experimental replicates). Data are expressed as mean ± STDEV and were tested by one-way ANOVA with Tukey's post-test; ***P<0.001. Symbols above bars are versus MPSIIIA GAG + vehicle.Multi-heparinase (HepM) and/or chondroitinase ABC (cABC) digests were performed on MPSIIIA GAG, and the resulting oligosaccharides applied to a WT mixed glial culture for 24 hours alongside heparin, bovine HS (bHS), porcine DS (pDS) and WT GAG. The intracellular production of IL-1β was measured (n=3 independent experiments each with 3 inter-experimental replicates). Data are expressed as mean ± STDEV and were tested by one-way ANOVA with Tukey's post-test; *P<0.05, ***P<0.001. Symbols above bars are versus MPSIIIA GAG alone.MPSIIIA GAG was 2-O-desulphated (hashed bars) utilising 120 mM NaOH, and compositional HS disaccharide analysis performed via RP-HPLC against untreated MPSIIIA GAG (black bars) to validate complete 2-O-desulphation. Percentage contribution of each modification were determined (n=3 GAG samples). Data are expressed as mean ± STDEV and were tested by two-way ANOVA with Bonferroni's post-test; 2S MPSIIIA GAG vs. 2S 2-ODS MPSIIIA GAG P<0.0001. NS, N-sulphated glucosamine; 2S, 2-O-sulphate group; 6S, 6-O sulphate group.MPSIIIA GAG was 2-O-desulphated and the resulting oligosaccharides applied to a WT mixed glial culture for 24 hours. The intracellular production of IL-1β was measured (n=3 independent experiments each with 3 inter-experimental replicates). Data are expressed as mean ± STDEV and were tested by one-way ANOVA with Tukey's post-test; MPSIIIA GAG vs. 2ODS MPSIIIA GAG P<0.0001. 2ODS, 2-O-desulphated."}
{"words": ["Figure", "3Representative", "sections", "from", "9", "month", "old", "WT", "and", "MPSIIIA", "brains", "showing", "secondary", "storage", "of", "GM2", "ganglioside", ",", "cholesterol", ",", "protein", "aggregates", "and", "amyloid", "beta", "peptide", "1", "-", "40", "and", "1", "-", "42", "within", "cortical", "layers", "II", "to", "V", "/", "VI", ",", "x20", ",", "scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "Inserts", ",", "100x", ",", "scale", "bar", ":", "10μm", ".", "(", "n", "=", "4", "mice", "per", "group", ")", "ATP", "levels", "in", "whole", "brain", "homogenate", "from", "9", "month", "old", "WT", "and", "MPSIIIA", "mice", "(", "n", "=", "6", "mice", "per", "group", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "STDEV", "and", "were", "tested", "by", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "WT", "vs", ".", "MPSIIIA", "P", "<", "0", ".", "02Brain", "transcription", "of", "mRNA", "species", "for", "various", "inflammasome", "components", "(", "n", "=", "6", "mice", "per", "group", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "STDEV", ",", "data", "for", "each", "cytokine", "were", "tested", "by", "unpaired", "t", "-", "test", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Symbols", "above", "bars", "are", "versus", "WTCaspase", "1", "activity", "levels", "in", "whole", "brain", "homogenate", "from", "WT", "and", "MPSIIIA", "mice", "(", "n", "=", "6", "mice", "per", "group", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "STDEV", "and", "were", "tested", "by", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "WT", "vs", ".", "MPSIIIA", "P", "<", "0", ".", "0001WT", "(", "E", "-", "G", ")", "and", "Nlrp3", "-", "/", "-", "(", "H", "-", "J", ")", "mixed", "glia", "were", "primed", "with", "MPSIIIA", "GAG", "or", "LPS", ".", "ATP", "(", "5", "mM", ")", ",", "cholesterol", "crystals", "(", "1", "mg", "/", "ml", ")", "or", "amyloid", "-", "β", "fibrils", "(", "Aβ1", "-", "40", "4", ".", "3", "μM", "and", "Aβ1", "-", "42", "5", "μM", ")", "were", "added", "4", "hours", "post", "-", "priming", "stimulus", ",", "and", "the", "secretion", "of", "IL", "-", "1β", "into", "the", "media", "measured", "via", "ELISA", "after", "a", "further", "20", "hours", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", "each", "with", "3", "inter", "-", "experimental", "replicates", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "STDEV", "and", "were", "tested", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "test", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Representative sections from 9 month old WT and MPSIIIA brains showing secondary storage of GM2 ganglioside, cholesterol, protein aggregates and amyloid beta peptide 1-40 and 1-42 within cortical layers II to V/VI, x20, scale bar: 50 μm. Inserts, 100x, scale bar: 10μm. (n=4 mice per group)ATP levels in whole brain homogenate from 9 month old WT and MPSIIIA mice (n=6 mice per group). Data are expressed as mean ± STDEV and were tested by unpaired t-test. WT vs. MPSIIIA P<0.02Brain transcription of mRNA species for various inflammasome components (n=6 mice per group). Data are expressed as mean ± STDEV, data for each cytokine were tested by unpaired t-test; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. Symbols above bars are versus WTCaspase 1 activity levels in whole brain homogenate from WT and MPSIIIA mice (n=6 mice per group). Data are expressed as mean ± STDEV and were tested by unpaired t-test. WT vs. MPSIIIA P<0.0001WT (E-G) and Nlrp3-/- (H-J) mixed glia were primed with MPSIIIA GAG or LPS. ATP (5 mM), cholesterol crystals (1 mg/ml) or amyloid-β fibrils (Aβ1-40 4.3 μM and Aβ1-42 5 μM) were added 4 hours post-priming stimulus, and the secretion of IL-1β into the media measured via ELISA after a further 20 hours (n=3 independent experiments each with 3 inter-experimental replicates). Data are expressed as mean ± STDEV and were tested by one-way ANOVA with Tukey's post-test; *P<0.05, ***P<0.001"}
{"words": ["Figure", "4The", "biological", "activity", "of", "LV", "-", "mediated", "IL", "-", "1Ra", "was", "assessed", "in", "vitro", ".", "RAW264", ".", "7", "macrophages", "were", "transduced", "with", "LV", ".", "IL1RN", "or", "LV", ".", "GFP", "vectors", "at", "a", "MOI", "of", "10", ".", "After", "72", "hours", "cells", "were", "stimulated", "with", "recombinant", "hIL", "-", "1β", "and", "the", "expression", "of", "TNF", "-", "α", "assessed", "after", "a", "further", "48", "hours", ".", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", "each", "with", "3", "inter", "-", "experimental", "replicates", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "STDEV", "and", "were", "tested", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "'", "s", "post", "-", "test", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Symbols", "above", "bars", "are", "versus", "NTC", "within", "a", "treatment", "group", ".", "A", "portion", "of", "transduced", "HSCs", "were", "plated", "into", "CFU", "assays", ",", "incubated", "for", "12", "days", "and", "CFU", "colonies", "analysed", ".", "Vector", "copy", "number", "were", "quantified", "(", "n", "=", "6", "CFU", "assays", ")", ".", "A", "portion", "of", "transduced", "HSCs", "were", "plated", "into", "CFU", "assays", ",", "incubated", "for", "12", "days", "and", "CFU", "colonies", "analysed", ".", "protein", "production", "of", "secreted", "human", "IL", "-", "1Ra", "were", "quantified", "(", "n", "=", "6", "CFU", "assays", ")", ".", "A", "portion", "of", "transduced", "HSCs", "were", "plated", "into", "CFU", "assays", ",", "incubated", "for", "12", "days", "and", "CFU", "colonies", "analysed", ".", "intracellular", "human", "IL", "-", "1Ra", "were", "quantified", "(", "n", "=", "6", "CFU", "assays", ")", ".", "Donor", "chimerism", "was", "determined", "by", "flow", "cytometry", "at", "4", "months", "of", "age", "(", "2", "months", "post", "-", "transplant", ")", "(", "n", "=", "10", "mice", ")", ".", "based", "on", "peripheral", "blood", "composition", "was", "determined", "by", "flow", "cytometry", "at", "4", "months", "of", "age", "(", "2", "months", "post", "-", "transplant", ")", "(", "n", "=", "10", "mice", ")", ".", "Human", "IL", "-", "1Ra", "expression", "was", "quantified", "in", "the", "plasma", "of", "mice", "at", "6", "months", "of", "age", "(", "4", "months", "post", "-", "transplant", ")", "(", "n", "=", "10", "mice", "per", "group", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "STDEV", "and", "were", "tested", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "test", ";", "WT", "vs", ".", "LV", ".", "IL1RN", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "MPSIIIA", "vs", ".", "LV", ".", "IL1RN", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "Symbols", "above", "bars", "are", "versus", "WT", ".", "Vector", "copy", "number", "was", "evaluated", "in", "brain", ",", "spleen", ",", "liver", ",", "white", "blood", "cells", "(", "WBC", ")", "and", "bone", "marrow", "(", "BM", ")", "of", "mice", "at", "6", "months", "of", "age", "(", "4", "months", "post", "-", "transplant", ")", "(", "n", "=", "10", "mice", "per", "group", ")", ".", "Quantification", "of", "human", "IL", "-", "1Ra", "levels", "in", "the", "brain", "of", "transplanted", "MPSIIIA", "mice", "(", "n", "=", "10", "mice", "per", "group", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "STDEV", "and", "were", "tested", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "test", ";", "WT", "vs", ".", "LV", ".", "IL1RN", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "MPSIIIA", "vs", ".", "LV", ".", "IL1RN", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "Symbols", "above", "bars", "are", "versus", "WT", ".", "Representative", "sections", "from", "6", "-", "month", "old", "MPSIIIA", "and", "LV", ".", "IL1RN", "transplanted", "MPSIIIA", "mice", ".", "Sections", "show", "the", "CA3", "region", "of", "the", "hippocampus", ".", "Cells", "expressing", "high", "levels", "of", "human", "IL", "-", "1Ra", "are", "indicated", "with", "black", "arrows", ".", "40x", ",", "scale", "bar", ",", "50", "μm", "(", "n", "=", "4", "mice", "per", "group", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4The biological activity of LV-mediated IL-1Ra was assessed in vitro. RAW264.7 macrophages were transduced with LV.IL1RN or LV.GFP vectors at a MOI of 10. After 72 hours cells were stimulated with recombinant hIL-1β and the expression of TNF-α assessed after a further 48 hours. (n=3 independent experiments each with 3 inter-experimental replicates). Data are expressed as mean ± STDEV and were tested by two-way ANOVA with Bonferroni's post-test; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001. Symbols above bars are versus NTC within a treatment group.A portion of transduced HSCs were plated into CFU assays, incubated for 12 days and CFU colonies analysed. Vector copy number were quantified (n=6 CFU assays).A portion of transduced HSCs were plated into CFU assays, incubated for 12 days and CFU colonies analysed. protein production of secreted human IL-1Ra were quantified (n=6 CFU assays).A portion of transduced HSCs were plated into CFU assays, incubated for 12 days and CFU colonies analysed. intracellular human IL-1Ra were quantified (n=6 CFU assays).Donor chimerism was determined by flow cytometry at 4 months of age (2 months post-transplant) (n=10 mice).based on peripheral blood composition was determined by flow cytometry at 4 months of age (2 months post-transplant) (n=10 mice).Human IL-1Ra expression was quantified in the plasma of mice at 6 months of age (4 months post-transplant) (n=10 mice per group). Data are expressed as mean ± STDEV and were tested by one-way ANOVA with Tukey's post-test; WT vs. LV.IL1RN P<0.0001; MPSIIIA vs. LV.IL1RN P<0.0001. Symbols above bars are versus WT.Vector copy number was evaluated in brain, spleen, liver, white blood cells (WBC) and bone marrow (BM) of mice at 6 months of age (4 months post-transplant) (n=10 mice per group).Quantification of human IL-1Ra levels in the brain of transplanted MPSIIIA mice (n=10 mice per group). Data are expressed as mean ± STDEV and were tested by one-way ANOVA with Tukey's post-test; WT vs. LV.IL1RN P<0.0001; MPSIIIA vs. LV.IL1RN P<0.0001. Symbols above bars are versus WT.Representative sections from 6-month old MPSIIIA and LV.IL1RN transplanted MPSIIIA mice. Sections show the CA3 region of the hippocampus. Cells expressing high levels of human IL-1Ra are indicated with black arrows. 40x, scale bar, 50 μm (n=4 mice per group)."}
{"words": ["Figure", "5Mice", "were", "placed", "in", "the", "centre", "of", "the", "Y", "-", "maze", "and", "allowed", "to", "explore", "freely", "for", "10", "minutes", ".", "The", "percentage", "of", "spontaneous", "alternations", "in", "the", "Y", "-", "maze", "were", "measured", "to", "assess", "working", "memory", "(", "n", "=", "10", "mice", "per", "group", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "STDEV", "and", "were", "tested", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "test", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01A", "one", "-", "hour", "open", "field", "test", "was", "performed", "and", "path", "length", "measured", "as", "an", "indicator", "of", "hyperactivity", "(", "n", "=", "10", "mice", "per", "group", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "STDEV", "and", "were", "tested", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "test", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Symbols", "above", "bars", "are", "versus"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Mice were placed in the centre of the Y-maze and allowed to explore freely for 10 minutes. The percentage of spontaneous alternations in the Y-maze were measured to assess working memory (n=10 mice per group). Data are expressed as mean ± STDEV and were tested by one-way ANOVA with Tukey's post-test; *P<0.05, **P<0.01A one-hour open field test was performed and path length measured as an indicator of hyperactivity (n=10 mice per group). Data are expressed as mean ± STDEV and were tested by one-way ANOVA with Tukey's post-test; ***P<0.001. Symbols above bars are versus WT"}
{"words": ["Figure", "6Representative", "images", "of", "the", "hippocampus", "and", "cortex", "(", "layers", "II", "-", "V", ")", "from", "control", "and", "treated", "mice", "stained", "with", "anti", "-", "mouse", "glial", "fibrillary", "acidic", "protein", "(", "GFAP", ";", "red", ")", "/", "DAPI", "(", "nuclear", ",", "blue", ")", "to", "identify", "activated", "astrocytes", ",", "20x", ",", "scale", "bar", ":", "50μm", "Representative", "images", "of", "the", "hippocampus", "and", "cortex", "(", "layers", "II", "-", "V", ")", "from", "control", "and", "treated", "mice", "stained", "with", "isolectin", "B4", "(", "ILB4", ")", "to", "identify", "activated", "microglia", ",", "20x", ",", "scale", "bar", ":", "50μThe", "average", "number", "of", "GFAP", "positive", "astrocyte", "cells", "over", "three", "fields", "of", "view", "per", "mouse", "of", "the", "hippocampus", "(", "C", ")", "and", "the", "cortex", "(", "D", ")", "were", "counted", "(", "n", "=", "4", "mice", "per", "group", ",", "average", "of", "3", "fields", "of", "view", "per", "mouse", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "STDEV", "and", "were", "tested", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "test", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Symbols", "above", "bars", "are", "versus", "WTThe", "average", "number", "of", "ILB4", "+", "positive", "microglial", "cells", "over", "three", "fields", "of", "view", "per", "mouse", "of", "the", "hippocampus", "(", "C", ")", "and", "the", "cortex", "(", "D", ")", "were", "counted", "(", "n", "=", "4", "mice", "per", "group", ",", "average", "of", "3", "fields", "of", "view", "per", "mouse", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "STDEV", "and", "were", "tested", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "test", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Symbols", "above", "bars", "are", "versus"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Representative images of the hippocampus and cortex (layers II-V) from control and treated mice stained with anti-mouse glial fibrillary acidic protein (GFAP; red)/DAPI (nuclear, blue) to identify activated astrocytes, 20x, scale bar: 50μm Representative images of the hippocampus and cortex (layers II-V) from control and treated mice stained with isolectin B4 (ILB4) to identify activated microglia, 20x, scale bar: 50μThe average number of GFAP positive astrocyte cells over three fields of view per mouse of the hippocampus (C) and the cortex (D) were counted (n=4 mice per group, average of 3 fields of view per mouse). Data are expressed as mean ± STDEV and were tested by one-way ANOVA with Tukey's post-test; **P<0.01, ***P<0.001. Symbols above bars are versus WTThe average number of ILB4+ positive microglial cells over three fields of view per mouse of the hippocampus (C) and the cortex (D) were counted (n=4 mice per group, average of 3 fields of view per mouse). Data are expressed as mean ± STDEV and were tested by one-way ANOVA with Tukey's post-test; ***P<0.001. Symbols above bars are versus WT"}
{"words": ["Figure", "1Colocalization", "of", "AcGFP", "-", "Siwi", ",", "AcGFP", "-", "BmAgo3", "and", "mCherry", "-", "BmVasa", "in", "BmN4", "cells", ".", "Line", "scans", "(", "white", "line", "in", "the", "enlarged", "region", ")", "show", "that", "Siwi", "-", "D670A", "mutant", "but", "not", "BmAgo3", "-", "D697A", "mutant", "dissociates", "from", "BmVasa", "foci", ".", "Line", "scans", "of", "fluorescence", "intensity", "were", "normalized", "to", "the", "highest", "value", "and", "depicted", "at", "the", "right", "panel", ".", "Scale", "bar", ",", "8", "μm", ".", "Colocalization", "of", "AcGFP", "-", "Siwi", "and", "mCherry", "-", "BmDcp2", "in", "BmN4", "cells", ".", "Line", "scans", "(", "white", "line", "in", "the", "enlarged", "region", ")", "show", "that", "Siwi", "-", "D670A", "mutant", "but", "not", "BmAgo3", "-", "D697A", "mutant", "overlaps", "with", "BmDcp2", "foci", ".", "Line", "scans", "of", "fluorescence", "intensity", "were", "normalized", "to", "the", "highest", "value", "and", "depicted", "at", "the", "right", "panel", ".", "Scale", "bar", ",", "8", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Colocalization of AcGFP-Siwi, AcGFP-BmAgo3 and mCherry-BmVasa in BmN4 cells. Line scans (white line in the enlarged region) show that Siwi-D670A mutant but not BmAgo3-D697A mutant dissociates from BmVasa foci. Line scans of fluorescence intensity were normalized to the highest value and depicted at the right panel. Scale bar, 8 μm.Colocalization of AcGFP-Siwi and mCherry-BmDcp2 in BmN4 cells. Line scans (white line in the enlarged region) show that Siwi-D670A mutant but not BmAgo3-D697A mutant overlaps with BmDcp2 foci. Line scans of fluorescence intensity were normalized to the highest value and depicted at the right panel. Scale bar, 8 μm."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "Left", ")", "Effect", "of", "1", ",", "6", "-", "Hexanediol", "treatment", "on", "AcGFP", "-", "Siwi", "and", "AcGFP", "-", "Siwi", "-", "D670A", "foci", ".", "Z", "-", "stacks", "were", "taken", "prior", "to", "the", "addition", "of", "1", ",", "6", "-", "Hexanediol", "or", "medium", "and", "after", "30", "minutes", "incubation", "at", "RT", ".", "Z", "-", "projections", "of", "the", "middle", "6", "μm", "stacks", "are", "then", "normalized", "and", "pseudo", "-", "colored", "with", "Fire", "LUT", "to", "visualize", "the", "Siwi", "foci", ".", "Scale", "bar", "10", "μm", ".", "Scale", "bars", "represent", "pixel", "intensity", "in", "arbitrary", "units", "(", "A", ".", "U", ".", ")", "(", "Right", ")", "High", "granule", "/", "cell", "intensity", "ratio", "of", "Siwi", "-", "D670A", "persists", "despite", "1", ",", "6", "-", "Hexanediol", "treatment", ".", "Average", "intensity", "ratio", "from", "each", "of", "the", "independent", "Z", "-", "stacks", "(", "n", "=", "30", "per", "set", ")", "is", "quantified", "(", "see", "Materials", "and", "Methods", ")", "and", "depicted", "as", "box", "plots", ".", "Representative", "data", "from", "N", "=", "3", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "P", "-", "values", "were", "calculated", "by", "Asymptotic", "Wilcoxon", "rank", "sum", "test", ".", "Co", "-", "expression", "of", "Siwi", "-", "D670A", "increases", "granule", "-", "to", "-", "cell", "intensity", "ratio", "of", "BmSpnE", "and", "BmQin", "foci", ".", "(", "Upper", ")", "Representative", "Z", "-", "projections", "(", "maximum", "intensity", ")", "of", "mCherry", "-", "BmSpnE", "and", "mCherry", "-", "BmQin", "foci", ".", "AcGFP", "signal", "from", "FITC", "channel", "is", "not", "shown", ".", "Scale", "bar", "8", "μm", ".", "(", "Bottom", ")", "Average", "intensity", "ratio", "from", "each", "of", "the", "independent", "Z", "-", "stacks", "(", "n", "=", "6", "per", "set", ")", "is", "quantified", "(", "see", "Materials", "and", "Methods", ")", "and", "depicted", "as", "box", "plots", ".", "Representative", "data", "from", "N", "≥", "3", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "P", "-", "values", "were", "calculated", "by", "Asymptotic", "Wilcoxon", "rank", "sum", "test", ".", "Depletion", "of", "BmSpnE", "or", "BmQin", "results", "in", "segregation", "of", "Siwi", "-", "D670A", "from", "BmDcp2", "-", "containing", "P", "-", "bodies", ".", "(", "Top", "-", "left", ")", "Representative", "Z", "-", "projections", "(", "Maximum", "intensity", ")", ".", "Scale", "bar", "8", "μm", ".", "(", "Top", "-", "right", ")", "Enlarged", "area", "from", "the", "white", "box", ".", "Scale", "bar", "2", "μm", ".", "(", "Bottom", ")", "Box", "plot", "showing", "that", "depletion", "of", "BmQin", "(", "n", "=", "32", "cells", ")", "or", "BmSpnE", "(", "n", "=", "32", "cells", ")", "reduces", "colocalization", "ratio", "between", "Siwi", "-", "D670A", "and", "BmDcp2", ",", "compared", "to", "control", "(", "dsRLuc", ",", "n", "=", "32", "cells", ")", ".", "Representative", "data", "from", "N", "=", "3", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "Bonferroni", "-", "corrected", "P", "-", "values", "were", "calculated", "by", "Asymptotic", "Wilcoxon", "rank", "sum", "test", ".", "See", "also", "Figure", "EV3", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(Left) Effect of 1,6-Hexanediol treatment on AcGFP-Siwi and AcGFP-Siwi-D670A foci. Z-stacks were taken prior to the addition of 1,6-Hexanediol or medium and after 30 minutes incubation at RT. Z-projections of the middle 6 μm stacks are then normalized and pseudo-colored with Fire LUT to visualize the Siwi foci. Scale bar 10 μm. Scale bars represent pixel intensity in arbitrary units (A.U.) (Right) High granule/cell intensity ratio of Siwi-D670A persists despite 1,6-Hexanediol treatment. Average intensity ratio from each of the independent Z-stacks (n=30 per set) is quantified (see Materials and Methods) and depicted as box plots. Representative data from N = 3 independent experiments are shown. P-values were calculated by Asymptotic Wilcoxon rank sum test.Co-expression of Siwi-D670A increases granule-to-cell intensity ratio of BmSpnE and BmQin foci. (Upper) Representative Z-projections (maximum intensity) of mCherry-BmSpnE and mCherry-BmQin foci. AcGFP signal from FITC channel is not shown. Scale bar 8 μm. (Bottom) Average intensity ratio from each of the independent Z-stacks (n=6 per set) is quantified (see Materials and Methods) and depicted as box plots. Representative data from N ≥ 3 independent experiments are shown. P-values were calculated by Asymptotic Wilcoxon rank sum test.Depletion of BmSpnE or BmQin results in segregation of Siwi-D670A from BmDcp2-containing P-bodies. (Top-left) Representative Z-projections (Maximum intensity). Scale bar 8 μm. (Top-right) Enlarged area from the white box. Scale bar 2 μm. (Bottom) Box plot showing that depletion of BmQin (n=32 cells) or BmSpnE (n=32 cells) reduces colocalization ratio between Siwi-D670A and BmDcp2, compared to control (dsRLuc, n=32 cells). Representative data from N = 3 independent experiments are shown. Bonferroni-corrected P-values were calculated by Asymptotic Wilcoxon rank sum test. See also Figure EV3."}
{"words": ["Figure", "3Depletion", "of", "Siwi", "results", "in", "segregation", "of", "BmQin", "from", "BmDcp2", "-", "containing", "P", "-", "bodies", ".", "Box", "plot", "showing", "that", "depletion", "of", "Siwi", "(", "dsSiwi", ",", "n", "=", "47", "cells", ")", "reduces", "colocalization", "ratio", "between", "BmQin", "and", "BmDcp2", ",", "compared", "to", "control", "(", "dsRLuc", ",", "n", "=", "55", "cells", ")", ".", "Representative", "data", "from", "N", "=", "4", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "Depletion", "of", "Siwi", "results", "in", "segregation", "of", "BmSpnE", "from", "BmDcp2", "-", "containing", "P", "-", "bodies", ".", "Box", "plot", "showing", "that", "depletion", "of", "Siwi", "(", "dsSiwi", ",", "n", "=", "55", "cells", ")", "reduces", "colocalization", "ratio", "between", "BmSpnE", "and", "BmDcp2", ",", "compared", "to", "control", "(", "dsRLuc", ",", "n", "=", "55", "cells", ")", ".", "Representative", "data", "from", "N", "=", "6", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "Depletion", "of", "Siwi", "results", "in", "colocalization", "of", "BmSpnE", "and", "BmVasa", ".", "Box", "plot", "showing", "that", "depletion", "of", "Siwi", "(", "dsSiwi", ",", "n", "=", "18", "cells", ")", "significantly", "up", "-", "regulates", "colocalization", "ratio", "between", "BmSpnE", "and", "BmVasa", ",", "compared", "to", "control", "(", "dsRLuc", ",", "n", "=", "18", "cells", ")", ".", "Representative", "data", "from", "N", "=", "3", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "Depletion", "of", "BmVasa", "results", "in", "segregation", "of", "Siwi", "from", "BmAgo3", "foci", ".", "Box", "plot", "showing", "that", "depletion", "of", "BmVasa", "(", "dsBmVasa", ",", "n", "=", "12", "cells", ")", "down", "-", "regulates", "colocalization", "ratio", "between", "Siwi", "and", "BmAgo3", ",", "compared", "to", "control", "(", "dsRLuc", ",", "n", "=", "12", "cells", ")", ".", "Data", "points", "collected", "from", "N", "=", "2", "independent", "experiments", "are", "shown", "(", "statistical", "test", "is", "not", "performed", "for", "N", "<", "3", "data", ")", ".", "Depletion", "of", "BmVasa", "results", "in", "entanglement", "of", "Siwi", "at", "piP", "-", "bodies", ".", "Interaction", "interfaces", "are", "indicated", "by", "white", "arrows", ".", "Box", "plot", "showing", "that", "depletion", "of", "BmVasa", "(", "dsBmVasa", ",", "n", "=", "45", "cells", ")", "mildly", "up", "-", "regulates", "colocalization", "ratio", "between", "Siwi", "and", "BmDcp2", ",", "compared", "to", "control", "(", "dsRLuc", ",", "n", "=", "49", "cells", ")", ".", "Representative", "data", "from", "N", "=", "5", "independent", "experiments", "are", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Depletion of Siwi results in segregation of BmQin from BmDcp2-containing P-bodies. Box plot showing that depletion of Siwi (dsSiwi, n=47 cells) reduces colocalization ratio between BmQin and BmDcp2, compared to control (dsRLuc, n=55 cells). Representative data from N = 4 independent experiments are shown. Depletion of Siwi results in segregation of BmSpnE from BmDcp2-containing P-bodies. Box plot showing that depletion of Siwi (dsSiwi, n=55 cells) reduces colocalization ratio between BmSpnE and BmDcp2, compared to control (dsRLuc, n=55 cells). Representative data from N = 6 independent experiments are shown. Depletion of Siwi results in colocalization of BmSpnE and BmVasa. Box plot showing that depletion of Siwi (dsSiwi, n=18 cells) significantly up-regulates colocalization ratio between BmSpnE and BmVasa, compared to control (dsRLuc, n=18 cells). Representative data from N = 3 independent experiments are shown. Depletion of BmVasa results in segregation of Siwi from BmAgo3 foci. Box plot showing that depletion of BmVasa (dsBmVasa, n=12 cells) down-regulates colocalization ratio between Siwi and BmAgo3, compared to control (dsRLuc, n=12 cells). Data points collected from N = 2 independent experiments are shown (statistical test is not performed for N < 3 data). Depletion of BmVasa results in entanglement of Siwi at piP-bodies. Interaction interfaces are indicated by white arrows. Box plot showing that depletion of BmVasa (dsBmVasa, n=45 cells) mildly up-regulates colocalization ratio between Siwi and BmDcp2, compared to control (dsRLuc, n=49 cells). Representative data from N = 5 independent experiments are shown."}
{"words": ["Figure", "4Co", "-", "expression", "of", "BmVasa", "-", "E339Q", "/", "Siwi", "-", "D670A", "results", "in", "aggregates", "with", "larger", "sizes", ".", "Representative", "Z", "-", "projections", "(", "Maximum", "intensity", ")", "of", "mutant", "aggregates", ".", "Scale", "bar", "1", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Co-expression of BmVasa-E339Q/Siwi-D670A results in aggregates with larger sizes. Representative Z-projections (Maximum intensity) of mutant aggregates. Scale bar 1 μm."}
{"words": ["Figure", "5Split", "violin", "plots", "of", "piRNA", "expression", "fold", "change", "between", "AcGFP", "(", "control", ")", "and", "piRNA", "factor", "(", "s", ")", "overexpressed", "libraries", ".", "Overexpression", "of", "Siwi", "-", "D670A", ",", "BmVasa", "-", "E339Q", "and", "both", "mutants", "increase", "non", "-", "TE", "-", "derived", "piRNA", "(", "red", ",", "626", "genes", ")", "while", "TE", "-", "derived", "piRNA", "(", "blue", ",", "818", "genes", ")", "does", "not", "change", ".", "Bonferroni", "-", "corrected", "P", "-", "values", "and", "the", "effect", "sizes", "(", "r", ")", "were", "calculated", "by", "Asymptotic", "Wilcoxon", "rank", "sum", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Split violin plots of piRNA expression fold change between AcGFP (control) and piRNA factor(s) overexpressed libraries. Overexpression of Siwi-D670A, BmVasa-E339Q and both mutants increase non-TE-derived piRNA (red, 626 genes) while TE-derived piRNA (blue, 818 genes) does not change. Bonferroni-corrected P-values and the effect sizes (r) were calculated by Asymptotic Wilcoxon rank sum test."}
{"words": ["Figure", "1Fig", "1", ":", "Urinary", " ", "triclosan", "levels", "are", "elevated", "in", "TC", " ", "mothers", "following", "6", "months", "of", "exposure", ".", "Summaries", "are", "provided", "as", "the", "interquartile", "range", "with", "median", "of", "triclosan", "molecules", "in", "a", "picogram", "/", "microliter", "(", "pg", "/", "L", ")", ".", "Urinary", " ", "triclosan", "measurements", "are", "available", "for", "38", "mothers", "(", "17", "TC", ",", "21", "nTC", ")", "and", "33", "infants", "(", "15", "TC", ",", "18", "nTC", ")", ".", "The", "p", "-", "value", "for", "the", "mothers", "in", "Figure", "1", "(", "represented", "by", "*", "*", "*", ")", "is", "p", "=", "5", ".", "07e", "-", "5", "(", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Fig 1: Urinary triclosan levels are elevated in TC mothers following 6 months of exposure. Summaries are provided as the interquartile range with median of triclosan molecules in a picogram/microliter (pg/L). Urinary triclosan measurements are available for 38 mothers (17 TC, 21 nTC) and 33 infants (15 TC, 18 nTC). The p-value for the mothers in Figure 1 (represented by ***) is p=5.07e-5 (Mann-Whitney U test)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "PCoA", "of", "Bray", "-", "Curtis", "dissimilarity", "for", "all", "(", "n", "=", "221", ")", "samples", "shows", "that", "gut", " ", "communities", "cluster", "by", "mothers", "and", "infants", ".", "(", "B", ")", "PCoA", "separated", "by", "time", "and", "treatment", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) PCoA of Bray-Curtis dissimilarity for all (n=221) samples shows that gut communities cluster by mothers and infants.(B) PCoA separated by time and treatment."}
{"words": ["Figure", "3Fig", "3", ":", "TC", "randomization", "does", "not", "decrease", "gut", "microbial", "diversity", "in", "infants", "or", "mothers", ".", "Shannon", "diversity", "measures", "are", "plotted", "as", "the", "interquartile", "range", "with", "median", "for", "each", "TC", "exposure", "class", "and", "time", "point", "grouping", "for", "infants", "and", "mothers", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Fig 3: TC randomization does not decrease gut microbial diversity in infants or mothers. Shannon diversity measures are plotted as the interquartile range with median for each TC exposure class and time point grouping for infants and mothers."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Differentially", "abundant", "taxa", "between", "nTC", "and", "TC", "households", ".", "Values", "left", "of", "the", "grey", "line", "indicate", "an", "enrichment", "in", "nTC", "household", "and", "values", "to", "the", "right", "indicate", "an", "enrichment", "in", "TC", "households", ".", "(", "A", ")", "Analyses", "are", "separated", "by", "mothers", "and", "infants", "for", "all", "samples", "across", "the", "3", "time", "points", "(", "FDR", "adjusted", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "Differentially", "abundant", "taxa", "are", "displayed", "for", "(", "B", ")", "infantsat", "per", "visit", "(", "FDR", "adjusted", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "Differentially", "abundant", "taxa", "are", "displayed", "for", "(", "C", ")", "mothers", "at", "per", "visit", "(", "FDR", "adjusted", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Differentially abundant taxa between nTC and TC households. Values left of the grey line indicate an enrichment in nTC household and values to the right indicate an enrichment in TC households. (A) Analyses are separated by mothers and infants for all samples across the 3 time points (FDR adjusted p-value < 0.01).Differentially abundant taxa are displayed for (B) infantsat per visit (FDR adjusted p-value < 0.05).Differentially abundant taxa are displayed for(C) mothers at per visit (FDR adjusted p-value < 0.05)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Adult", "muscles", "were", "transfected", "with", "YFP", "‐", "LC3", "and", "with", "pDsRed2", "‐", "Mito", ".", "Animals", "were", "starved", "for", "24", "h", "or", "denervated", "for", "7", "days", ".", "Muscles", "were", "exposed", "and", "observed", "in", "situ", "using", "confocal", "in", "vivo", "microscopy", ".", "At", "least", "five", "animals", "per", "condition", "have", "been", "studied", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "μm", ".", "(", "B", ")", "Adult", "muscles", "were", "transfected", "with", "YFP", "‐", "LC3", "and", "with", "pDsRed2", "‐", "Mito", ".", "Lysosomes", "were", "inhibited", "by", "treating", "mice", "with", "50", "mg", "/", "kg", "of", "chloroquine", "for", "7", "days", ".", "Chloroquine", "treatment", "started", "at", "the", "day", "of", "denervation", "and", "lasted", "for", "7", "days", ",", "whereas", "for", "fasting", "experiments", "at", "the", "6th", "day", "of", "chloroquine", "injection", "food", "was", "removed", "for", "24", "h", ".", "Muscles", "were", "exposed", "and", "observed", "in", "situ", "using", "confocal", "in", "vivo", "microscopy", ".", "At", "least", "five", "animals", "per", "condition", "have", "been", "studied", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Adult muscles were transfected with YFP‐LC3 and with pDsRed2‐Mito. Animals were starved for 24 h or denervated for 7 days. Muscles were exposed and observed in situ using confocal in vivo microscopy. At least five animals per condition have been studied. Scale bar, 20 μm.(B) Adult muscles were transfected with YFP‐LC3 and with pDsRed2‐Mito. Lysosomes were inhibited by treating mice with 50 mg/kg of chloroquine for 7 days. Chloroquine treatment started at the day of denervation and lasted for 7 days, whereas for fasting experiments at the 6th day of chloroquine injection food was removed for 24 h. Muscles were exposed and observed in situ using confocal in vivo microscopy. At least five animals per condition have been studied. Scale bar, 20 μm."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Imaging", "of", "FoxO3", "‐", "mediated", "modification", "of", "the", "mitochondrial", "network", "in", "soleus", "muscle", "of", "living", "mice", ".", "Adult", "soleus", "muscles", "were", "transfected", "with", "pDsRed2", "‐", "Mito", "and", "either", "c", ".", "a", ".", "FoxO3", "or", "mock", "vector", "(", "control", ")", ".", "Two", "weeks", "later", ",", "muscles", "were", "exposed", "and", "observed", "in", "situ", "using", "two", "‐", "photon", "microscopy", ".", "At", "least", "five", "animals", "per", "condition", "were", "studied", ".", "(", "B", ")", "Overexpression", "of", "c", ".", "a", ".", "FoxO3", "induces", "mitochondrial", "changes", "and", "removal", "through", "autophagy", ".", "Muscle", "fibres", "were", "transfected", "by", "electroporation", "with", "YFP", "‐", "LC3", ",", "pDsRed2", "‐", "Mito", "and", "either", "c", ".", "a", ".", "FoxO3", "or", "mock", "vector", ".", "Two", "weeks", "later", ",", "fluorescent", "fibres", "were", "analysed", "for", "mitochondrial", "distribution", "by", "confocal", "microscopy", ".", "A", "higher", "magnification", "of", "the", "square", "is", "depicted", "on", "the", "right", "panels", ".", "White", "arrows", "point", "autophagosomes", "engulfing", "the", "mitochondria", ".", "(", "C", ")", "Overexpression", "of", "c", ".", "a", ".", "FoxO3", "induces", "reduction", "in", "myofibre", "size", "and", "decrease", "in", "SDH", "staining", ".", "Left", "image", ":", "immunostaining", "for", "FoxO3", "shows", "atrophic", "fibres", ",", "which", "over", "‐", "expressed", "FoxO3", "(", "red", ")", "and", "are", "labelled", "by", "asterisks", ".", "Nuclei", "are", "stained", "by", "Hoechst", "(", "blue", ")", ".", "Right", "image", ":", "histochemistry", "for", "succinate", "dehydrogenase", "(", "SDH", ")", "on", "serial", "section", ".", "Note", "that", "fibres", "positive", "for", "FoxO3", "are", "negative", "for", "SDH", "staining", "(", "asterisks", ")", ".", "(", "D", ")", "Electron", "micrograph", "of", "a", "control", "and", "c", ".", "a", ".", "FoxO3", "‐", "expressing", "fibres", ".", "Muscles", "were", "processed", "with", "standard", "fixation", "‐", "embedding", "procedure", ".", "Black", "and", "white", "arrows", "indicate", "subsarcolemmal", "and", "intermyofibrillar", "mitochondria", ",", "respectively", ".", "Note", "that", "subsarcolemmal", "mitochondria", "are", "reduced", "in", "FoxO3", "overexpressing", "fibres", ",", "whereas", "intermyofibrillar", "mitochondria", "are", "smaller", "and", "paler", "than", "control", "ones", ".", "Red", "arrowheads", "show", "a", "vesicle", "containing", "mitochondria", ".", "The", "image", "is", "representative", "of", "the", "FoxO3", "‐", "transfected", "fibres", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Imaging of FoxO3‐mediated modification of the mitochondrial network in soleus muscle of living mice. Adult soleus muscles were transfected with pDsRed2‐Mito and either c.a.FoxO3 or mock vector (control). Two weeks later, muscles were exposed and observed in situ using two‐photon microscopy. At least five animals per condition were studied.(B) Overexpression of c.a.FoxO3 induces mitochondrial changes and removal through autophagy. Muscle fibres were transfected by electroporation with YFP‐LC3, pDsRed2‐Mito and either c.a.FoxO3 or mock vector. Two weeks later, fluorescent fibres were analysed for mitochondrial distribution by confocal microscopy. A higher magnification of the square is depicted on the right panels. White arrows point autophagosomes engulfing the mitochondria.(C) Overexpression of c.a.FoxO3 induces reduction in myofibre size and decrease in SDH staining. Left image: immunostaining for FoxO3 shows atrophic fibres, which over‐expressed FoxO3 (red) and are labelled by asterisks. Nuclei are stained by Hoechst (blue). Right image: histochemistry for succinate dehydrogenase (SDH) on serial section. Note that fibres positive for FoxO3 are negative for SDH staining (asterisks).(D) Electron micrograph of a control and c.a.FoxO3‐expressing fibres. Muscles were processed with standard fixation‐embedding procedure. Black and white arrows indicate subsarcolemmal and intermyofibrillar mitochondria, respectively. Note that subsarcolemmal mitochondria are reduced in FoxO3 overexpressing fibres, whereas intermyofibrillar mitochondria are smaller and paler than control ones. Red arrowheads show a vesicle containing mitochondria. The image is representative of the FoxO3‐transfected fibres."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "RNAi", "‐", "mediated", "knockdown", "of", "Fis1", "showed", "by", "western", "blot", "assay", ".", "MEF", "cells", "were", "transfected", "with", "vectors", "expressing", "four", "different", "Fis", "shRNAs", ".", "For", "in", "vivo", "experiments", "Fis", "(", "4", ")", "was", "used", ".", "Efficiency", "of", "protein", "knockdown", "is", "indicated", "in", "Supplementary", "Table", "S2", ".", "(", "B", ")", "Blockade", "of", "Fis1", "and", "of", "Bnip3", "by", "RNAi", "reduces", "muscle", "loss", "during", "fasting", ".", "Adult", "skeletal", "muscles", "were", "transfected", "with", "specific", "shRNAs", "for", "mouse", "Fis1", "(", "oligo", "4", ")", "and", "mouse", "Bnip3", "or", "co", "‐", "transfected", "and", "8", "days", "later", "mice", "were", "starved", "for", "48", "h", ".", "Cross", "‐", "sectional", "area", "(", "CSA", ")", "of", "transfected", "fibres", ",", "identified", "by", "GFP", ",", "was", "measured", "as", "described", "earlier", "(", "*", "P0", ".", "01", ")", "n", "=", "450", ".", "(", "C", ")", "RNAi", "of", "Fis1", "and", "Bnip3", "significantly", "prevents", "MuRF", "‐", "1", "and", "atrogin", "‐", "1", "promoters", "activation", "during", "starvation", ".", "TA", "muscles", "were", "transfected", "with", "either", "5", "kb", "of", "the", "MuRF", "‐", "1", "promoter", "(", "left", "panel", ")", "or", "3", ".", "5", "kb", "of", "atrogin", "‐", "1", "promoter", "(", "right", "panel", ")", "with", "or", "without", "shRNAs", "vectors", "against", "Fis", "and", "Bnip3", ".", "In", "fasting", "experiments", ",", "after", "7", "days", "from", "transfection", "mice", "were", "starved", "for", "24", "h", ".", "A", "renilla", "‐", "luciferase", "construct", "(", "pRL", "‐", "TK", ")", "was", "co", "‐", "transfected", "to", "normalized", "for", "transfection", "efficiency", ".", "The", "activation", "of", "MuRF", "‐", "1", "and", "atrogin", "‐", "1", "promoters", "was", "determined", "by", "firefly", "activity", "and", "normalize", "for", "the", "renilla", ".", "Each", "condition", "represents", "the", "average", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "*", "P0", ".", "05", ")", ".", "(", "D", ")", "Muscle", "atrophy", "induced", "by", "FoxO3", "is", "reduced", "by", "d", ".", "n", ".", "DRP1", ".", "Adult", "skeletal", "muscles", "were", "transfected", "with", "HA", "‐", "tagged", "c", ".", "a", ".", "FoxO3", "with", "or", "without", "d", ".", "n", ".", "DRP1", "and", "examined", "after", "2", "weeks", ".", "CSA", "of", "transfected", "fibres", ",", "identified", "by", "anti", "‐", "HA", "immunofluorescence", ",", "was", "measured", "as", "described", "earlier", "(", "*", "P0", ".", "001", ")", "n", "=", "400", ".", "(", "E", ")", "Blockade", "of", "the", "fission", "machinery", "by", "d", ".", "n", ".", "DRP1", "or", "Bnip3", "inhibition", "by", "RNAi", "reduces", "FoxO3", "‐", "mediated", "autophagosome", "formation", ".", "Animals", "were", "transfected", "with", "YFP", "‐", "LC3", ",", "c", ".", "a", ".", "FoxO3", "in", "presence", "or", "absence", "of", "d", ".", "n", ".", "DRP1", "or", "shRNAs", "against", "Bnip3", ".", "Twelve", "days", "later", ",", "muscles", "were", "collected", "and", "analysed", "for", "fluorescent", "vesicles", "formation", "(", "*", "P0", ".", "001", ")", "n", "=", "450", ".", "(", "F", ")", "FoxO3", "‐", "dependent", "activation", "of", "MuRF", "‐", "1", "and", "atrogin", "‐", "1", "is", "significantly", "reduced", "by", "inhibition", "of", "the", "fission", "machinery", ".", "MuRF", "‐", "1", "promoter", "(", "left", "panel", ")", "or", "atrogin", "‐", "1", "promoter", "(", "right", "panel", ")", "was", "co", "‐", "transfected", "into", "adult", "TA", "muscle", "with", "or", "without", "c", ".", "a", ".", "FoxO3", "and", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "d", ".", "n", ".", "DRP1", ".", "A", "renilla", "‐", "luciferase", "vector", "was", "co", "‐", "transfected", "to", "normalize", "for", "transfection", "efficiency", ".", "Eight", "days", "later", ",", "firefly", "and", "renilla", "‐", "luciferase", "activity", "was", "determined", ".", "Each", "condition", "represents", "the", "average", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "*", "P0", ".", "05", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) RNAi‐mediated knockdown of Fis1 showed by western blot assay. MEF cells were transfected with vectors expressing four different Fis shRNAs. For in vivo experiments Fis (4) was used. Efficiency of protein knockdown is indicated in Supplementary Table S2.(B) Blockade of Fis1 and of Bnip3 by RNAi reduces muscle loss during fasting. Adult skeletal muscles were transfected with specific shRNAs for mouse Fis1 (oligo 4) and mouse Bnip3 or co‐transfected and 8 days later mice were starved for 48 h. Cross‐sectional area (CSA) of transfected fibres, identified by GFP, was measured as described earlier (*P0.01) n=450.(C) RNAi of Fis1 and Bnip3 significantly prevents MuRF‐1 and atrogin‐1 promoters activation during starvation. TA muscles were transfected with either 5 kb of the MuRF‐1 promoter (left panel) or 3.5 kb of atrogin‐1 promoter (right panel) with or without shRNAs vectors against Fis and Bnip3. In fasting experiments, after 7 days from transfection mice were starved for 24 h. A renilla‐luciferase construct (pRL‐TK) was co‐transfected to normalized for transfection efficiency. The activation of MuRF‐1 and atrogin‐1 promoters was determined by firefly activity and normalize for the renilla. Each condition represents the average of at least three independent experiments±s.e.m. (*P0.05).(D) Muscle atrophy induced by FoxO3 is reduced by d.n.DRP1. Adult skeletal muscles were transfected with HA‐tagged c.a.FoxO3 with or without d.n.DRP1 and examined after 2 weeks. CSA of transfected fibres, identified by anti‐HA immunofluorescence, was measured as described earlier (*P0.001) n=400.(E) Blockade of the fission machinery by d.n.DRP1 or Bnip3 inhibition by RNAi reduces FoxO3‐mediated autophagosome formation. Animals were transfected with YFP‐LC3, c.a.FoxO3 in presence or absence of d.n.DRP1 or shRNAs against Bnip3. Twelve days later, muscles were collected and analysed for fluorescent vesicles formation (*P0.001) n=450.(F) FoxO3‐dependent activation of MuRF‐1 and atrogin‐1 is significantly reduced by inhibition of the fission machinery. MuRF‐1 promoter (left panel) or atrogin‐1 promoter (right panel) was co‐transfected into adult TA muscle with or without c.a.FoxO3 and in the presence or absence of d.n.DRP1. A renilla‐luciferase vector was co‐transfected to normalize for transfection efficiency. Eight days later, firefly and renilla‐luciferase activity was determined. Each condition represents the average of at least three independent experiments±s.e.m. (*P0.05)."}
{"words": ["Figure", "4Overexpression", "of", "DRP1", "/", "Fis1", "and", "Bnip3", "proteins", "induces", "changes", "in", "the", "mitochondrial", "network", "in", "vivo", ".", "In", "vivo", "imaging", "of", "the", "mitochondrial", "network", "was", "performed", "in", "muscles", "expressing", "Bnip3", ",", "an", "atrophy", "‐", "related", "gene", "under", "FoxO3", "control", ",", "and", "DRP1", "/", "Fis1", "proteins", ".", "Adult", "muscles", "were", "transfected", "with", "plasmids", "encoding", "mitochondrially", "targeted", "yellow", "fluorescent", "protein", "(", "mtM13", "‐", "YFP", ")", "and", "either", "mock", "vector", ",", "Bnip3", ",", "HA", "‐", "DRP1", ",", "Fis1", "or", "DRP1", "/", "Fis1", ".", "Seven", "days", "later", "(", "for", "Bnip3", ")", "or", "12", "days", "later", "(", "for", "DRP1", "and", "Fis1", ")", ",", "muscles", "were", "observed", "in", "vivo", "with", "confocal", "microscopy", ".", "TMRM", "was", "injected", "into", "the", "muscles", "to", "monitor", "mitochondria", ",", "which", "retain", "membrane", "potential", ".", "Muscles", "transfected", "with", "mtM13", "‐", "YFP", "and", "mock", "vector", "showed", "the", "orderly", "pattern", "of", "intermyofibrillar", "and", "subsarcolemmal", "mitochondria", "(", "upper", "panel", "‐", "IMF", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "20", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Overexpression of DRP1/Fis1 and Bnip3 proteins induces changes in the mitochondrial network in vivo. In vivo imaging of the mitochondrial network was performed in muscles expressing Bnip3, an atrophy‐related gene under FoxO3 control, and DRP1/Fis1 proteins. Adult muscles were transfected with plasmids encoding mitochondrially targeted yellow fluorescent protein (mtM13‐YFP) and either mock vector, Bnip3, HA‐DRP1, Fis1 or DRP1/Fis1. Seven days later (for Bnip3) or 12 days later (for DRP1 and Fis1), muscles were observed in vivo with confocal microscopy. TMRM was injected into the muscles to monitor mitochondria, which retain membrane potential. Muscles transfected with mtM13‐YFP and mock vector showed the orderly pattern of intermyofibrillar and subsarcolemmal mitochondria (upper panel‐IMF). Scale bar: 20 μm."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Adult", "TA", "muscles", "were", "transfected", "with", "either", "DRP1", ",", "Fis1", ",", "DRP1", "and", "Fis1", "or", "mock", "vector", ".", "Muscles", "were", "collected", "12", "or", "21", "days", "after", "transfection", "and", "cross", "‐", "sectional", "area", "of", "transfected", "fibres", ",", "identified", "by", "immunofluorescence", ",", "was", "measured", "as", "described", "earlier", "(", "*", "P0", ".", "001", ")", "n", "=", "400", ".", "(", "B", ")", "Bnip3", "or", "Bnip3", "l", "expression", "for", "7", "days", "causes", "a", "20", "%", "reduction", "of", "the", "cross", "‐", "sectional", "area", ".", "TA", "muscles", "were", "transfected", "with", "Bnip3", ",", "Bnip3l", "or", "mock", "vector", ".", "Cross", "‐", "sectional", "area", "of", "transfected", "fibres", ",", "identified", "by", "immunofluorescence", ",", "was", "analysed", "(", "*", "P0", ".", "001", ")", "n", "=", "500", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "LC3", "‐", "positive", "autophagic", "vesicles", "in", "adult", "muscles", "co", "‐", "tranfected", "with", "YFP", "‐", "LC3", "and", "DRP1", ",", "Fis1", "or", "DRP1", "/", "Fis1", "expression", "plasmids", "or", "mock", "vector", ".", "(", "D", ")", "Mutations", "in", "BH3", "domain", "of", "Bnip3", "(", "Bnip3BH3mut", ")", "do", "not", "affect", "BNIP3", "‐", "mediated", "autophagy", ".", "Adult", "muscles", "were", "co", "‐", "transfected", "with", "YFP", "‐", "LC3", "and", "Bnip3", "or", "Bnip3BH3mut", "expression", "plasmids", "and", "LC3", "‐", "positive", "vesicles", "were", "quantified", ".", "(", "E", ")", "Bnip3", "‐", "mediated", "atrophy", "is", "not", "modified", "by", "mutating", "the", "BH3", "domain", "(", "Bnip3BH3mut", ")", ".", "Adult", "TA", "muscles", "were", "transfected", "with", "Bnip3", "or", "Bnip3BH3mut", "expression", "plasmids", "and", "cross", "‐", "sectional", "area", "was", "quantified", "7", "days", "later", "and", "plotted", "as", "%", "of", "controls", "(", "*", "P0", ".", "001", ")", "n", "=", "440", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Adult TA muscles were transfected with either DRP1, Fis1, DRP1 and Fis1 or mock vector. Muscles were collected 12 or 21 days after transfection and cross‐sectional area of transfected fibres, identified by immunofluorescence, was measured as described earlier (*P0.001) n=400.(B) Bnip3 or Bnip3 l expression for 7 days causes a 20% reduction of the cross‐sectional area. TA muscles were transfected with Bnip3, Bnip3l or mock vector. Cross‐sectional area of transfected fibres, identified by immunofluorescence, was analysed (*P0.001) n=500.(C) Quantification of LC3‐positive autophagic vesicles in adult muscles co‐tranfected with YFP‐LC3 and DRP1, Fis1 or DRP1/Fis1 expression plasmids or mock vector.(D) Mutations in BH3 domain of Bnip3 (Bnip3BH3mut) do not affect BNIP3‐mediated autophagy. Adult muscles were co‐transfected with YFP‐LC3 and Bnip3 or Bnip3BH3mut expression plasmids and LC3‐positive vesicles were quantified.(E) Bnip3‐mediated atrophy is not modified by mutating the BH3 domain (Bnip3BH3mut). Adult TA muscles were transfected with Bnip3 or Bnip3BH3mut expression plasmids and cross‐sectional area was quantified 7 days later and plotted as % of controls (*P0.001) n=440."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "In", "vivo", "imaging", "of", "the", "mitochondrial", "network", "was", "performed", "in", "muscles", "expressing", "Fis1K148R", ".", "Adult", "muscles", "were", "transfected", "with", "plasmids", "encoding", "mitochondrially", "targeted", "yellow", "fluorescent", "protein", "(", "mtM13", "‐", "YFP", ")", "and", "Fis1K148R", ".", "Twelve", "days", "later", "muscles", "were", "observed", "in", "vivo", "with", "confocal", "microscopy", ".", "TMRM", "was", "injected", "into", "the", "muscles", "to", "monitor", "mitochondria", ",", "which", "retain", "membrane", "potential", ".", "Mitochondrial", "network", "was", "greatly", "altered", "but", "mitochondrial", "membrane", "potential", "was", "conserved", ".", "(", "B", ")", "FDB", "muscle", "fibres", "were", "transfected", "by", "electroporation", "in", "vivo", ".", "Eight", "days", "later", "adult", "fibres", "were", "isolated", "and", "placed", "in", "cell", "culture", ".", "Adult", "fibres", "were", "loaded", "with", "TMRM", "(", "5", "nM", ")", "for", "30", "min", "at", "37", "°", "C", ".", "TMRM", "accumulates", "in", "the", "mitochondria", "that", "maintain", "mitochondrial", "membrane", "potential", ".", "Oligomycin", "(", "Olm", ",", "5", "μM", ")", "and", "the", "protonophore", "FCCP", "(", "4", "μM", ")", "were", "added", "at", "the", "indicated", "time", "points", ".", "TMRM", "staining", "were", "monitored", "in", "at", "least", "10", "fibres", "per", "construct", "(", "*", "P0", ".", "001", ")", ".", "(", "C", ")", "hFisK148R", "‐", "transfected", "muscles", "were", "collected", "12", "and", "21", "days", "after", "transfection", ".", "Cross", "‐", "sectional", "area", "of", "transfected", "fibres", ",", "identified", "by", "anti", "‐", "myc", "immunofluorescence", ",", "was", "quantified", "(", "n", "=", "550", ")", ".", "(", "D", ")", "Fis1", "‐", "dependent", "activation", "of", "MuRF", "‐", "1", ".", "MuRF", "‐", "1", "promoter", "was", "co", "‐", "transfected", "into", "adult", "TA", "muscle", "with", "or", "without", "Fis1", "or", "Fis1K148R", ".", "A", "renilla", "‐", "luciferase", "vector", "was", "co", "‐", "transfected", "to", "normalize", "for", "transfection", "efficiency", ".", "Eight", "days", "later", ",", "firefly", "and", "renilla", "‐", "luciferase", "activity", "was", "determined", ".", "Each", "condition", "represents", "the", "average", "of", "at", "least", "five", "independent", "experiments", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "*", "P0", ".", "05", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A)In vivo imaging of the mitochondrial network was performed in muscles expressing Fis1K148R. Adult muscles were transfected with plasmids encoding mitochondrially targeted yellow fluorescent protein (mtM13‐YFP) and Fis1K148R. Twelve days later muscles were observed in vivo with confocal microscopy. TMRM was injected into the muscles to monitor mitochondria, which retain membrane potential. Mitochondrial network was greatly altered but mitochondrial membrane potential was conserved.(B) FDB muscle fibres were transfected by electroporation in vivo. Eight days later adult fibres were isolated and placed in cell culture. Adult fibres were loaded with TMRM (5 nM) for 30 min at 37°C. TMRM accumulates in the mitochondria that maintain mitochondrial membrane potential. Oligomycin (Olm, 5 μM) and the protonophore FCCP (4 μM) were added at the indicated time points. TMRM staining were monitored in at least 10 fibres per construct (*P0.001).(C) hFisK148R‐transfected muscles were collected 12 and 21 days after transfection. Cross‐sectional area of transfected fibres, identified by anti‐myc immunofluorescence, was quantified (n=550).(D) Fis1‐dependent activation of MuRF‐1. MuRF‐1 promoter was co‐transfected into adult TA muscle with or without Fis1 or Fis1K148R. A renilla‐luciferase vector was co‐transfected to normalize for transfection efficiency. Eight days later, firefly and renilla‐luciferase activity was determined. Each condition represents the average of at least five independent experiments±s.e.m. (*P0.05)."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Left", "panel", ":", "mitochondrial", "fission", "activates", "AMPK", ".", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "a", "mock", "vector", "(", "control", ")", ",", "Bnip3", ",", "DRP1", ",", "Fis1", "or", "co", "‐", "transfected", "with", "DRP1", "and", "Fis1", ".", "Cells", "were", "collected", "24", "h", "later", "and", "lysates", "were", "analysed", "by", "immunoblotting", ".", "Right", "panel", ":", "immunoblotting", "analysis", "shows", "AMPK", "phosphorylation", "in", "EDL", "and", "soleus", "muscles", "during", "muscle", "atrophy", ".", "P", "‐", "AMPK", "/", "AMPK", "ratio", "analysed", "by", "densitometric", "analysis", "is", "indicated", "below", "the", "panels", ".", "(", "B", "-", "E", ")", "Inhibition", "of", "AMPK", "blocks", "Bnip3", "‐", "and", "DRP1", "/", "Fis1", "‐", "mediated", "atrophy", ".", "(", "B", ")", "Adult", "TA", "muscles", "were", "transfected", "with", "Bnip3", "together", "with", "d", ".", "n", ".", "AMPK", "or", "mock", "vector", "and", "cross", "‐", "sectional", "area", "was", "measured", "(", "*", "P0", ".", "001", ")", "n", "=", "480", ".", "(", "C", ")", "Adult", "TA", "muscles", "were", "transfected", "with", "DRP1", "and", "Fis1", "together", "with", "d", ".", "n", ".", "AMPK", "or", "mock", "vector", ".", "Twelve", "days", "later", "muscles", "were", "collected", "and", "cross", "‐", "sectional", "area", "was", "quantified", "(", "*", "P0", ".", "001", ")", "n", "=", "400", ".", "(", "D", ",", "E", ")", "RNAi", "‐", "mediated", "knockdown", "of", "AMPK", "α", "1", "and", "α", "2", "inhibits", "Bnip3", "‐", "and", "DRP1", "/", "Fis1", "‐", "dependent", "atrophy", ".", "Mouse", "TA", "muscles", "were", "co", "‐", "transfected", "with", "Bnip3", "or", "DRP1", "and", "Fis1", "and", "pSuper", "vectors", "expressing", "shRNAs", "against", "lacZ", "(", "control", ")", "or", "AMPK", ".", "Twelve", "days", "later", ",", "TA", "muscles", "were", "collected", "and", "the", "cross", "‐", "sectional", "area", "was", "quantified", "(", "*", "P0", ".", "001", ")", "n", "=", "450", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Left panel: mitochondrial fission activates AMPK. HEK293 cells were transfected with a mock vector (control), Bnip3, DRP1, Fis1 or co‐transfected with DRP1 and Fis1. Cells were collected 24 h later and lysates were analysed by immunoblotting. Right panel: immunoblotting analysis shows AMPK phosphorylation in EDL and soleus muscles during muscle atrophy. P‐AMPK/AMPK ratio analysed by densitometric analysis is indicated below the panels. (B-E) Inhibition of AMPK blocks Bnip3‐ and DRP1/Fis1‐mediated atrophy.(B) Adult TA muscles were transfected with Bnip3 together with d.n.AMPK or mock vector and cross‐sectional area was measured (*P0.001) n=480.(C) Adult TA muscles were transfected with DRP1 and Fis1 together with d.n.AMPK or mock vector. Twelve days later muscles were collected and cross‐sectional area was quantified (*P0.001) n=400.(D, E) RNAi‐mediated knockdown of AMPK α 1 and α 2 inhibits Bnip3‐ and DRP1/Fis1‐dependent atrophy. Mouse TA muscles were co‐transfected with Bnip3 or DRP1 and Fis1 and pSuper vectors expressing shRNAs against lacZ (control) or AMPK. Twelve days later, TA muscles were collected and the cross‐sectional area was quantified (*P0.001) n=450."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "A", ")", "Quantitative", "PCR", "analysis", "was", "performed", "in", "triplicates", "using", "specific", "oligonucleotides", "(", "see", "Supplementary", "Table", "1", ")", "(", "*", "P0", ".", "01", ")", ".", "(", "B", ")", "Immunoblotting", "analysis", "shows", "that", "AICAR", "treatment", "causes", "phosphorylation", "of", "AMPK", "and", "the", "downstream", "target", "ACC", "but", "does", "not", "affect", "phosphorylation", "of", "AKT", "and", "FoxO3", ".", "(", "C", ")", "FoxO3", "binding", "to", "atrogin", "‐", "1", "and", "MuRF", "‐", "1", "promoters", ",", "as", "determined", "by", "ChIP", ",", "is", "induced", "by", "AICAR", "treatment", ".", "(", "D", ")", "RNAi", "‐", "mediated", "knockdown", "of", "FoxO3", "inhibits", "DRP1", "/", "Fis1", "‐", "dependent", "atrophy", ".", "Mouse", "TA", "muscles", "were", "co", "‐", "transfected", "with", "DRP1", "and", "Fis1", "and", "pSuper", "vectors", "expressing", "shRNAs", "against", "either", "lacZ", "(", "control", ")", "or", "FoxO3", ".", "Twelve", "days", "later", ",", "muscles", "were", "collected", "and", "the", "cross", "‐", "sectional", "area", "was", "quantified", "(", "*", "P0", ".", "001", ")", "n", "=", "450", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(A) Quantitative PCR analysis was performed in triplicates using specific oligonucleotides (see Supplementary Table 1) (*P0.01).(B) Immunoblotting analysis shows that AICAR treatment causes phosphorylation of AMPK and the downstream target ACC but does not affect phosphorylation of AKT and FoxO3.(C) FoxO3 binding to atrogin‐1 and MuRF‐1 promoters, as determined by ChIP, is induced by AICAR treatment.(D) RNAi‐mediated knockdown of FoxO3 inhibits DRP1/Fis1‐dependent atrophy. Mouse TA muscles were co‐transfected with DRP1 and Fis1 and pSuper vectors expressing shRNAs against either lacZ (control) or FoxO3. Twelve days later, muscles were collected and the cross‐sectional area was quantified (*P0.001) n=450."}
{"words": ["Figure", "1A", "Purified", "TAP", "-", "tagged", "Rik1", "-", "containing", "complexes", "analyzed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "silver", "staining", ".", "mock", ":", "a", "mock", "purification", "from", "an", "untagged", "strain", ".", "Proteins", "identified", "by", "LC", "-", "MS", "/", "MS", "are", "indicated", "at", "right", ",", "with", "the", "number", "of", "identified", "unique", "peptides", "in", "parentheses", ".", "B", "In", "vitro", "ubiquitylation", "assays", "using", "biotinylated", "ubiquitin", ",", "purified", "CLRC", ",", "and", "recombinant", "S", ".", "pombe", "histone", "H3", "as", "the", "substrate", ".", "Proteins", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "(", "WB", ")", "using", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Asterisks", "indicate", "ubiquitylated", "histone", "H3", "species", ".", "C", "Ubiquitylation", "assays", "using", "recombinant", "histone", "H3", ",", "the", "N", "-", "terminal", "tail", "of", "histone", "H3", "(", "residues", "1", "-", "36", ")", "fused", "with", "GST", "(", "H3N", "-", "GST", ")", ",", "or", "GST", "alone", "as", "the", "substrate", ".", "Both", "fission", "yeast", "(", "sp", ")", "and", "human", "(", "hs", ")", "full", "-", "length", "H3", "proteins", "and", "H3N", "-", "GST", "fusion", "proteins", "were", "examined", ".", "The", "proteins", "were", "analyzed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "followed", "by", "either", "silver", "staining", "or", "Western", "blotting", "with", "an", "anti", "-", "biotin", "antibody", ".", "Asterisks", "indicate", "ubiquitylated", "histone", "H3", "species", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A Purified TAP-tagged Rik1-containing complexes analyzed by SDS-PAGE and silver staining. mock: a mock purification from an untagged strain. Proteins identified by LC-MS/MS are indicated at right, with the number of identified unique peptides in parentheses.B In vitro ubiquitylation assays using biotinylated ubiquitin, purified CLRC, and recombinant S. pombe histone H3 as the substrate. Proteins were analyzed by Western blotting (WB) using the indicated antibodies. Asterisks indicate ubiquitylated histone H3 species.C Ubiquitylation assays using recombinant histone H3, the N-terminal tail of histone H3 (residues 1-36) fused with GST (H3N-GST), or GST alone as the substrate. Both fission yeast (sp) and human (hs) full-length H3 proteins and H3N-GST fusion proteins were examined. The proteins were analyzed by SDS-PAGE followed by either silver staining or Western blotting with an anti-biotin antibody. Asterisks indicate ubiquitylated histone H3 species."}
{"words": ["Figure", "2A", "Ubiquitylation", "assay", "using", "H3N", "-", "GST", ".", "The", "components", "included", "in", "the", "assay", "and", "the", "ubiquitylated", "H3N", "-", "GST", "species", "are", "indicated", "at", "right", ".", "B", "MS", "/", "MS", "spectrum", "of", "the", "histone", "H3", "peptide", "corresponding", "to", "residues", "10", "-", "17", ".", "The", "observed", "y", "and", "b", "ions", "and", "fragment", "map", "are", "shown", ".", "C", "Ubiquitylation", "assay", "using", "biotinylated", "ubiquitin", "and", "recombinant", "wild", "-", "type", "H3N", "-", "GST", "(", "WT", ")", "and", "arginine", "-", "substituted", "H3N", "-", "GST", "mutants", "as", "substrates", ".", "Proteins", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "and", "silver", "staining", ".", "mock", ":", "reaction", "without", "substrate", ".", "Asterisks", "indicate", "ubiquitylated", "H3N", "-", "GST", "proteins", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Ubiquitylation assay using H3N-GST. The components included in the assay and the ubiquitylated H3N-GST species are indicated at right.B MS/MS spectrum of the histone H3 peptide corresponding to residues 10-17. The observed y and b ions and fragment map are shown.C Ubiquitylation assay using biotinylated ubiquitin and recombinant wild-type H3N-GST (WT) and arginine-substituted H3N-GST mutants as substrates. Proteins were analyzed by Western blotting and silver staining. mock: reaction without substrate. Asterisks indicate ubiquitylated H3N-GST proteins."}
{"words": ["Figure", "3A", "Chromatin", "precipitated", "with", "anti", "-", "H3K4me2", "or", "anti", "-", "H3K9me2", "antibodies", "was", "analyzed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "silver", "staining", ".", "The", "input", "sample", "and", "mock", "precipitation", "using", "total", "mouse", "IgG", "are", "also", "shown", ".", "The", "gel", "slices", "indicated", "by", "boxes", "were", "excised", "and", "subjected", "to", "LC", "-", "MS", "/", "MS", "analysis", ".", "MS", "/", "MS", "spectrum", "of", "the", "histone", "H3", "peptide", "corresponding", "to", "residues", "9", "-", "17", ".", "The", "observed", "y", "and", "b", "ions", "and", "fragment", "map", "are", "shown", ".", "C", "Summary", "of", "the", "ubiquitylated", "peptides", "identified", "by", "LC", "-", "MS", "/", "MS", ".", "D", "Relative", "abundance", "of", "ubiquitylated", "lysine", "residues", "in", "chromatin", "-", "associated", "histone", "H3", "fractions", ".", "Chromatin", "precipitated", "with", "anti", "-", "H3K4me2", "or", "anti", "-", "H3K9me2", "antibodies", "was", "subjected", "to", "LC", "-", "MS", "/", "MS", "analysis", ",", "and", "the", "abundance", "of", "ubiquitylated", "lysine", "residues", "in", "each", "fraction", "is", "shown", "Since", "short", "peptides", "cleaved", "at", "unmodified", "lysine", "residues", "could", "not", "be", "efficiently", "detected", "in", "the", "LC", "-", "MS", "/", "MS", "analysis", ",", "these", "data", "do", "not", "accurately", "reflect", "the", "abundance", "including", "unmodified", "lysines", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Chromatin precipitated with anti-H3K4me2 or anti-H3K9me2 antibodies was analyzed by SDS-PAGE and silver staining. The input sample and mock precipitation using total mouse IgG are also shown. The gel slices indicated by boxes were excised and subjected to LC-MS/MS analysis.MS/MS spectrum of the histone H3 peptide corresponding to residues 9-17. The observed y and b ions and fragment map are shown. C Summary of the ubiquitylated peptides identified by LC-MS/MS. D Relative abundance of ubiquitylated lysine residues in chromatin-associated histone H3 fractions. Chromatin precipitated with anti-H3K4me2 or anti-H3K9me2 antibodies was subjected to LC-MS/MS analysis, and the abundance of ubiquitylated lysine residues in each fraction is shown Since short peptides cleaved at unmodified lysine residues could not be efficiently detected in the LC-MS/MS analysis, these data do not accurately reflect the abundance including unmodified lysines."}
{"words": ["Figure", "4B", "Heterochromatic", "silencing", "assays", "of", "wild", "-", "type", "and", "mutant", "Hht1", "-", "FH", "strains", ".", "Silencing", "at", "the", "mating", "-", "type", "Kint2", ":", ":", "ura4", "+", "was", "evaluated", ".", "Ten", "-", "fold", "serial", "dilutions", "of", "the", "indicated", "strains", "were", "spotted", "onto", "non", "-", "selective", "medium", "(", "N", "/", "S", ")", ",", "medium", "lacking", "uracil", "(", "-", "Ura", ")", ",", "and", "medium", "containing", "5", "-", "FOA", "(", "5", "-", "FOA", ")", ".", "C", "ChIP", "analysis", "of", "H3K9me2", "levels", "associated", "with", "the", "mating", "-", "type", "loci", ",", "relative", "to", "the", "control", "act1", "+", "locus", ".", "Error", "bars", "indicate", "standard", "errors", "from", "three", "technical", "replicates", ".", "D", "ChIP", "analysis", "of", "Rik1", "-", "myc", "levels", "associated", "with", "the", "mating", "-", "type", "cenH", "and", "centromeric", "dg", "loci", ",", "relative", "to", "the", "control", "act1", "+", "locus", ".", "Error", "bars", "indicate", "standard", "errors", "from", "three", "technical", "replicates", ".", "E", "Heterochromatic", "silencing", "assays", "comparing", "the", "effects", "of", "H3", "lysine", "substitution", "mutants", ".", "Silencing", "at", "the", "mating", "-", "type", "kint2", ":", ":", "ura4", "+", "was"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B Heterochromatic silencing assays of wild-type and mutant Hht1-FH strains. Silencing at the mating-type Kint2::ura4+ was evaluated. Ten-fold serial dilutions of the indicated strains were spotted onto non-selective medium (N/S), medium lacking uracil (-Ura), and medium containing 5-FOA (5-FOA).C ChIP analysis of H3K9me2 levels associated with the mating-type loci, relative to the control act1+ locus. Error bars indicate standard errors from three technical replicates.D ChIP analysis of Rik1-myc levels associated with the mating-type cenH and centromeric dg loci, relative to the control act1+ locus. Error bars indicate standard errors from three technical replicates.E Heterochromatic silencing assays comparing the effects of H3 lysine substitution mutants. Silencing at the mating-type kint2::ura4+ was evaluated"}
{"words": ["Figure", "5In", "vitro", "HMTase", "assays", ".", "Recombinant", "H3N", "-", "GST", "(", "WT", "or", "K9R", ")", "pre", "-", "ubiquitylated", "by", "the", "CLRC", "was", "purified", "and", "used", "in", "the", "HMTase", "assay", "with", "6", "×", "His", "-", "tagged", "recombinant", "Clr4", "(", "His", "-", "Clr4", ")", ".", "Proteins", "were", "analyzed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "Coomassie", "Brilliant", "Blue", "(", "CBB", ")", "staining", "(", "left", ")", "and", "autoradiography", "(", "right", ")", ".", "C", ",", "D", "In", "vitro", "HMTase", "assay", "using", "disulfide", "-", "linked", "ubiquitylated", "histone", "H3", ".", "H3K14CUb", "and", "control", "histone", "H3", "(", "H3C110A", ")", "were", "used", "as", "substrates", "in", "the", "HMTase", "assay", ",", "and", "analyzed", "The", "3H", "-", "methyl", "group", "incorporation", "was", "measured", "using", "a", "liquid", "scintillation", "counter", "(", "D", ")", ".", "Error", "bars", "indicate", "the", "standard", "deviations", "calculated", "from", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5In vitro HMTase assays. Recombinant H3N-GST (WT or K9R) pre-ubiquitylated by the CLRC was purified and used in the HMTase assay with 6×His-tagged recombinant Clr4 (His-Clr4). Proteins were analyzed by SDS-PAGE and Coomassie Brilliant Blue (CBB) staining (left) and autoradiography (right).C,D In vitro HMTase assay using disulfide-linked ubiquitylated histone H3. H3K14CUb and control histone H3 (H3C110A) were used as substrates in the HMTase assay, and analyzed The 3H-methyl group incorporation was measured using a liquid scintillation counter (D). Error bars indicate the standard deviations calculated from three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "6B", "Recombinant", "proteins", "were", "resolved", "by", "10", "%", "SDS", "-", "PAGE", "and", "visualized", "by", "CBB", "staining", ".", "C", "In", "vitro", "HMTase", "assay", "using", "disulfide", "-", "linked", "ubiquitylated", "histone", "H3", ".", "H3K14CUb", "and", "control", "histone", "H3", "(", "H3C110A", ")", "were", "used", "as", "substrates", "in", "the", "HMTase", "assay", ",", "and", "analyzedD", "In", "vitro", "pulldown", "assays", "of", "GST", "-", "Clr4", "proteins", "with", "biotinylated", "ubiquitin", ".", "Bound", "ubiquitin", "was", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "with", "HRP", "-", "conjugated", "streptavidin", "(", "left", ")", ".", "Precipitated", "GST", "proteins", "were", "analyzed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "CBB", "staining", "(", "right", ")", ".", "F", "Whole", "cell", "lysates", "prepared", "from", "control", "cells", ",", "cells", "expressing", "FLAG", "-", "tagged", "wild", "-", "type", "Clr4", "(", "F", "-", "clr4", ")", "or", "mutant", "Clr4", "(", "F", "-", "clr4", "∆", "63", "-", "127", ")", ",", "or", "clr4", "∆", "cells", "were", "subjected", "to", "immunoblotting", "using", "the", "indicated", "antibodies", ".", "G", "Heterochromatic", "silencing", "assays", "of", "wild", "-", "type", "and", "clr4", "mutant", "strains", ".", "Silencing", "at", "the", "mating", "-", "type", "Kint2", ":", ":", "ura4", "+", "was", "evaluated", ".", "H", "ChIP", "analysis", "of", "H3K9me2", "levels", "associated", "with", "the", "silencing", "marker", "gene", "inserted", "in", "the", "mating", "-", "type", "loci", "(", "Kint2", ":", ":", "ura4", "+", ")", "and", "the", "mating", "-", "type", "cenH", "and", "centromeric", "dg", "loci", ",", "relative", "to", "the", "control", "act1", "+", "locus", ".", "Error", "bars", "indicate", "standard", "errors", "from", "three", "technical", "replicates", ".", "I", "The", "levels", "of", "Kint2", ":", ":", "ura4", "+", ",", "mating", "-", "type", "cenH", ",", "and", "centromeric", "dg", "transcripts", "were", "quantified", "by", "RT", "-", "qPCR", "and", "calculated", "as", "fold", "change", "to", "the", "wild", "-", "type", "expression", ".", "Error", "bars", "indicate", "standard", "errors", "from", "three", "technical", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6B Recombinant proteins were resolved by 10% SDS-PAGE and visualized by CBB staining.C In vitro HMTase assay using disulfide-linked ubiquitylated histone H3. H3K14CUb and control histone H3 (H3C110A) were used as substrates in the HMTase assay, and analyzedD In vitro pulldown assays of GST-Clr4 proteins with biotinylated ubiquitin. Bound ubiquitin was analyzed by Western blotting with HRP-conjugated streptavidin (left). Precipitated GST proteins were analyzed by SDS-PAGE and CBB staining (right).F Whole cell lysates prepared from control cells, cells expressing FLAG-tagged wild-type Clr4 (F-clr4) or mutant Clr4 (F-clr4∆63-127), or clr4∆ cells were subjected to immunoblotting using the indicated antibodies.G Heterochromatic silencing assays of wild-type and clr4 mutant strains. Silencing at the mating-type Kint2::ura4+ was evaluated.H ChIP analysis of H3K9me2 levels associated with the silencing marker gene inserted in the mating-type loci (Kint2::ura4+) and the mating-type cenH and centromeric dg loci, relative to the control act1+ locus. Error bars indicate standard errors from three technical replicates.I The levels of Kint2::ura4+, mating-type cenH, and centromeric dg transcripts were quantified by RT-qPCR and calculated as fold change to the wild-type expression. Error bars indicate standard errors from three technical replicates."}
{"words": ["Figure", "1B", ".", "Protein", "interaction", "analysis", "by", "Nano", "LC", "-", "MS", ".", "Unique", "peptide", "counts", "and", "protein", "sequence", "coverage", ",", "as", "well", "as", "signal", "intensities", "(", "PSI", ")", "for", "Tailor", "(", "bait", ")", "and", "CG16940", "/", "dmDis3l2", "in", "control", "IP", "(", "FLAG", "-", "GFP", ")", "and", "FLAG", "-", "TailorIP", "are", "indicated", ".", "A", ".", "u", ".", ",", "arbitrary", "units", ".", "D", ".", "Co", "-", "immunoprecipitation", "of", "FLAG", "-", "dmDis3l2", "(", "bait", ")", "and", "GFP", "-", "Tailor", "full", "-", "length", "and", "truncations", "expressed", "in", "Drosophila", "S2cells", ".", "GFP", "-", "Nibbler", "(", "Nbr", ")", "served", "as", "negative", "control", ".", "Domain", "architecture", "of", "GFP", "-", "Tailor", "truncations", "are", "indicated", ".", "E", "-", "G", ".", "Recombinant", "protein", "interaction", "analysis", "using", "the", "indicated", "epitope", "tags", "and", "purification", "methods", ".", "Domain", "architecture", "of", "bait", "and", "prey", "are", "indicated", ".", "E", "-", "G", ".", "Recombinant", "protein", "interaction", "analysis", "using", "the", "indicated", "epitope", "tags", "and", "purification", "methods", ".", "Domain", "architecture", "of", "bait", "and", "prey", "are", "indicated", ".", "E", "-", "G", ".", "Recombinant", "protein", "interaction", "analysis", "using", "the", "indicated", "epitope", "tags", "and", "purification", "methods", ".", "Domain", "architecture", "of", "bait", "and", "prey", "are", "indicated", ".", "H", "and", "I", ".", "Immunostaining", "and", "imaging", "of", "Myc", "-", "Tailor", "and", "GFP", "-", "dmDis3l2", "(", "H", ")", "or", "endogenous", "dmDis3l2", "(", "I", ")", "in", "S2", "cells", ".", "Single", "color", "channel", "images", "show", "total", "inversions", ".", "Scale", "bar", "=", "5", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B. Protein interaction analysis by Nano LC-MS. Unique peptide counts and protein sequence coverage, as well as signal intensities (PSI) for Tailor (bait) and CG16940/dmDis3l2 in control IP (FLAG-GFP) and FLAG-TailorIP are indicated. A.u., arbitrary units.D. Co-immunoprecipitation of FLAG-dmDis3l2 (bait) and GFP-Tailor full-length and truncations expressed in Drosophila S2cells. GFP-Nibbler (Nbr) served as negative control. Domain architecture of GFP-Tailor truncations are indicated.E- G. Recombinant protein interaction analysis using the indicated epitope tags and purification methods. Domain architecture of bait and prey are indicated.E- G. Recombinant protein interaction analysis using the indicated epitope tags and purification methods. Domain architecture of bait and prey are indicated.E- G. Recombinant protein interaction analysis using the indicated epitope tags and purification methods. Domain architecture of bait and prey are indicated.H and I. Immunostaining and imaging of Myc-Tailor and GFP-dmDis3l2 (H) or endogenous dmDis3l2 (I) in S2 cells. Single color channel images show total inversions. Scale bar = 5 µm."}
{"words": ["Figure", "2B", ".", "In", "vitro", "exoribonuclease", "assay", "using", "5", "′", "radiolabeled", "RNA", "substrate", "and", "immunopurified", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "or", "catalytic", "mutant", "(", "CM", ")", "FLAG", "-", "dmDis3l2", "(", "mutation", "indicated", "in", "Figure", "1C", ")", ",", "incubated", "for", "the", "indicated", "time", "and", "separated", "on", "a", "15", "%", "polyacrylamide", "gel", "followed", "by", "phosphorimaging", ".", "Quantification", "of", "degraded", "substrate", "in", "percent", "is", "indicated", ".", "C", ".", "Change", "in", "abundance", "of", "256", "different", "substrate", "RNAs", "as", "determined", "by", "high", "-", "throughput", "sequencing", "of", "substrates", "in", "experiment", "shown", "in", "(", "B", ")", ".", "D", ".", "Decay", "rates", "of", "256", "different", "substrate", "RNAs", ".", "Data", "shown", "in", "(", "C", ")", "was", "normalized", "to", "overall", "decrease", "in", "substrate", "abundance", "as", "determined", "by", "phosphorimaging", "(", "as", "shown", "in", "B", ")", "and", "fit", "to", "the", "indicated", "model", "for", "exponential", "decay", ".", "Apparent", "decay", "rate", "of", "all", "substrates", ",", "as", "determined", "by", "phosphorimaging", "is", "indicated", "in", "red", ".", "E", ".", "Selected", "examples", "for", "individual", "substrates", "shown", "in", "(", "D", ")", ".", "Values", "report", "the", "observed", "decay", "rate", "(", "kobs", ")", "in", "min", "-", "1", ".", "F", ".", "Overview", "of", "decay", "rates", "(", "kobs", ")", "of", "all", "256", "different", "substrate", "RNAs", ",", "as", "determined", "in", "(", "D", ")", ".", "Error", "represents", "SEM", "of", "curve", "fit", ".", "G", ".", "Impact", "of", "RNA", "secondary", "structures", ",", "as", "determined", "by", "RNAfold", "(", "Gruber", "et", "al", ",", "2008", ")", ",", "and", "reported", "as", "effective", "free", "energy", "(", "EFE", ",", "kcal", "/", "mol", ")", ",", "on", "decay", "rates", "(", "kobs", ")", "are", "shown", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", "of", "curve", "fit", ".", "Grey", "boxes", "represent", "tukey", "boxplot", "of", "individual", "EFE", "groups", ".", "White", "line", "indicates", "median", ".", "P", "-", "Value", "was", "determined", "by", "Mann", "-", "Whitney", "test", "comparing", "individual", "EFE", "groups", "against", "all", "substrates", ".", "Unstructured", "substrates", "used", "for", "subsequent", "analysis", "are", "indicated", "(", "EFE", "groups", "4", "to", "6", ")", ".", "H", ".", "Nucleotide", "content", "of", "single", "-", "stranded", "RNA", "substrates", ",", "ranked", "from", "slow", "(", "top", ")", "to", "fast", "(", "bottom", ")", "decay", "by", "dmDis3l2", ".", "I", ".", "Cumulative", "distribution", "of", "decay", "rates", "for", "RNA", "substrates", "with", "the", "indicated", "nucleotide", "at", "each", "one", "of", "four", "randomized", "position", "at", "the", "3", "′", "end", "of", "the", "substrate", "RNA", ".", "P", "-", "Value", "was", "determined", "by", "Mann", "-", "Whitney", "test", "comparing", "individual", "nts", "against", "all", ".", "J", ".", "Functional", "coupling", "between", "two", "base", "positions", "within", "the", "randomized", "3", "′", "end", "of", "substrate", "RNA", ".", "Red", "squares", "show", "average", "increase", "in", "decay", "rate", "compared", "to", "all", "substrates", ".", "Black", "squares", "show", "no", "or", "negative", "effect", ".", "K", ".", "Boxplot", "decay", "rates", "of", "substrates", "containing", "no", ",", "one", ",", "two", ",", "or", "three", "uridine", "(", "s", ")", "within", "the", "randomized", "3", "′", "end", "of", "the", "substrate", "RNA", ".", "Median", "decay", "rates", "SEM", "of", "fit", "are", "indicated", ".", "L", ".", "Decay", "rate", "of", "all", "substrates", ",", "or", "substrates", "containing", "no", ",", "one", ",", "two", ",", "or", "three", "uridine", "(", "s", ")", "within", "the", "randomized", "3", "′", "end", "of", "the", "substrate", "RNA", ".", "Median", "and", "quartile", "ranges", "are", "indicated", ".", "P", "-", "values", "were", "determined", "by", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "Substrate", "containing", "4", "uridines", "(", "4U", ")", "is", "indicated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B. In vitro exoribonuclease assay using 5′ radiolabeled RNA substrate and immunopurified wild-type (WT) or catalytic mutant (CM) FLAG-dmDis3l2 (mutation indicated in Figure 1C), incubated for the indicated time and separated on a 15 % polyacrylamide gel followed by phosphorimaging. Quantification of degraded substrate in percent is indicated.C. Change in abundance of 256 different substrate RNAs as determined by high-throughput sequencing of substrates in experiment shown in (B).D. Decay rates of 256 different substrate RNAs. Data shown in (C) was normalized to overall decrease in substrate abundance as determined by phosphorimaging (as shown in B) and fit to the indicated model for exponential decay. Apparent decay rate of all substrates, as determined by phosphorimaging is indicated in red.E. Selected examples for individual substrates shown in (D). Values report the observed decay rate (kobs) in min-1.F. Overview of decay rates (kobs) of all 256 different substrate RNAs, as determined in (D). Error represents SEM of curve fit.G. Impact of RNA secondary structures, as determined by RNAfold (Gruber et al, 2008), and reported as effective free energy (EFE, kcal/mol), on decay rates (kobs) are shown. Error bars represent SEM of curve fit. Grey boxes represent tukey boxplot of individual EFE groups. White line indicates median. P-Value was determined by Mann-Whitney test comparing individual EFE groups against all substrates. Unstructured substrates used for subsequent analysis are indicated (EFE groups 4 to 6).H. Nucleotide content of single-stranded RNA substrates, ranked from slow (top) to fast (bottom) decay by dmDis3l2.I. Cumulative distribution of decay rates for RNA substrates with the indicated nucleotide at each one of four randomized position at the 3′ end of the substrate RNA. P-Value was determined by Mann-Whitney test comparing individual nts against all.J. Functional coupling between two base positions within the randomized 3′ end of substrate RNA. Red squares show average increase in decay rate compared to all substrates. Black squares show no or negative effect.K. Boxplot decay rates of substrates containing no, one, two, or three uridine(s) within the randomized 3′ end of the substrate RNA. Median decay rates SEM of fit are indicated.L. Decay rate of all substrates, or substrates containing no, one, two, or three uridine(s) within the randomized 3′ end of the substrate RNA. Median and quartile ranges are indicated. P-values were determined by Mann-Whitney test. Substrate containing 4 uridines (4U) is indicated."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "RNA", "decay", "assay", "using", "synthetic", ",", "5", "′", "radiolabeled", "pre", "-", "miR", "-", "1003", ",", "immunopurified", "dmDis3l2", "and", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "or", "catalytic", "mutant", "(", "CM", ")", "Tailor", ".", "Reactions", "were", "incubated", "for", "the", "indicated", "time", "and", "separated", "by", "15", "%", "denaturing", "polyacrylamide", "gel", "electrophoresis", "and", "subjected", "to", "phosphorimaging", ".", "B", ".", "Quantification", "of", "at", "least", "three", "independent", "replicates", "of", "experiment", "shown", "in", "A", ".", "Data", "represent", "mean", "SD", ".", "Half", "-", "life", "was", "determined", "by", "fitting", "data", "to", "single", "exponential", "(", "dmDis3l2", "and", "dmDis3l2", "/", "TailorCM", ")", "or", "sigmoidal", "(", "dmDis3l2", "/", "TailorWT", ")", "reaction", "kinetics", ".", "C", ".", "RNA", "decay", "assay", "using", "synthetic", ",", "5", "′", "radiolabeled", "pre", "-", "miR", "-", "1003", "containing", "the", "indicated", "number", "or", "uridine", "residues", "at", "the", "3", "′", "end", "and", "immunopurified", "dmDis3l2", ".", "D", ".", "Quantification", "of", "three", "independent", "replicates", "of", "experiment", "shown", "in", "C", ".", "Data", "represent", "mean", "SD", ".", "Data", "were", "fit", "to", "single", "exponential", "reaction", "kinetics", ".", "E", ".", "Reaction", "kinetics", "(", "kobs", ")", "determined", "in", "D", "plotted", "against", "number", "of", "3", "′", "terminal", "uridine", "residues", ".", "Error", "of", "fit", "is", "shown", "as", "SEM", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. RNA decay assay using synthetic, 5′ radiolabeled pre-miR-1003, immunopurified dmDis3l2 and wild-type (WT) or catalytic mutant (CM) Tailor. Reactions were incubated for the indicated time and separated by 15% denaturing polyacrylamide gel electrophoresis and subjected to phosphorimaging.B. Quantification of at least three independent replicates of experiment shown in A. Data represent mean SD. Half-life was determined by fitting data to single exponential (dmDis3l2 and dmDis3l2/TailorCM) or sigmoidal (dmDis3l2/TailorWT) reaction kinetics.C. RNA decay assay using synthetic, 5′ radiolabeled pre-miR-1003 containing the indicated number or uridine residues at the 3′ end and immunopurified dmDis3l2.D. Quantification of three independent replicates of experiment shown in C. Data represent mean SD. Data were fit to single exponential reaction kinetics.E. Reaction kinetics (kobs) determined in D plotted against number of 3′ terminal uridine residues. Error of fit is shown as SEM."}
{"words": ["Figure", "4A", "and", "E", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "genetically", "modified", "Drosophila", "S2", "cells", ".", "Unmodified", "S2", "cells", "(", "wild", "-", "type", ",", "wt", ")", ",", "or", "S2", "cells", "depleted", "of", "Tailor", "(", "tailorko", ")", "by", "CRISPR", "/", "Cas9", "or", "expressing", "FLAG", "-", "tagged", "Tailor", "(", "TailorOE", ")", "were", "analyzed", ".", "Antibodies", "are", "indicated", ".", "Note", ",", "that", "panels", "were", "assembled", "from", "two", "technical", "replicates", "of", "identical", "lysates", "(", "see", "source", "data", ")", ".", "B", ",", "C", ",", "F", "and", "G", ".", "Lysate", "of", "S2", "cells", "(", "as", "characterized", "in", "A", "and", "E", ")", "were", "incubated", "with", "-", "32P", "-", "UTP", "(", "B", "and", "F", ")", "or", "-", "32P", "-", "ATP", "(", "C", "and", "G", ")", "for", "the", "indicated", "time", "followed", "by", "RNA", "extraction", ",", "denaturing", "polyacrylamide", "gel", "electrophoresis", "and", "phosphorimaging", ".", "D", "and", "H", ".", "Quantification", "of", "at", "least", "five", "(", "D", ")", "or", "seven", "(", "H", ")", "independent", "replicates", "of", "experiment", "shown", "in", "B", "/", "C", "and", "F", "/", "G", ",", "respectively", ".", "Uridylation", "signal", "intensity", "for", "substrate", "S1", "(", "indicated", "in", "B", "and", "F", ")", "was", "corrected", "for", "adenylation", "activity", "and", "normalized", "to", "wild", "-", "type", "2", "min", "time", "point", ".", "Data", "represent", "mean", "SEM", ".", "P", "-", "values", "were", "determined", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "10", "-", "2", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "10", "-", "3", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "10", "-", "4", ".", "A", "and", "E", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "genetically", "modified", "Drosophila", "S2", "cells", ".", "Unmodified", "S2", "cells", "(", "wild", "-", "type", ",", "wt", ")", ",", "or", "S2", "cells", "depleted", "of", "dmDis3l2", "(", "dmDis3l2ko", ")", "by", "CRISPR", "/", "Cas9", "or", "expressing", "FLAG", "-", "tagged", "catalytic", "mutant", "dmDis3l2", "(", "dmDis3l2CM", "OE", ")", "were", "analyzed", ".", "Antibodies", "are", "indicated", ".", "Note", ",", "that", "panels", "were", "assembled", "from", "two", "technical", "replicates", "of", "identical", "lysates", "(", "see", "source", "data", ")", ".", "B", ",", "C", ",", "F", "and", "G", ".", "Lysate", "of", "S2", "cells", "(", "as", "characterized", "in", "A", "and", "E", ")", "were", "incubated", "with", "-", "32P", "-", "UTP", "(", "B", "and", "F", ")", "or", "-", "32P", "-", "ATP", "(", "C", "and", "G", ")", "for", "the", "indicated", "time", "followed", "by", "RNA", "extraction", ",", "denaturing", "polyacrylamide", "gel", "electrophoresis", "and", "phosphorimaging", ".", "D", "and", "H", ".", "Quantification", "of", "at", "least", "five", "(", "D", ")", "or", "seven", "(", "H", ")", "independent", "replicates", "of", "experiment", "shown", "in", "B", "/", "C", "and", "F", "/", "G", ",", "respectively", ".", "Uridylation", "signal", "intensity", "for", "substrate", "S1", "(", "indicated", "in", "B", "and", "F", ")", "was", "corrected", "for", "adenylation", "activity", "and", "normalized", "to", "wild", "-", "type", "2", "min", "time", "point", ".", "Data", "represent", "mean", "SEM", ".", "P", "-", "values", "were", "determined", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "10", "-", "2", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "10", "-", "3", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "10", "-", "4", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A and E. Western blot analysis of genetically modified Drosophila S2 cells. Unmodified S2 cells (wild-type, wt), or S2 cells depleted of Tailor (tailorko) by CRISPR/Cas9 or expressing FLAG-tagged Tailor (TailorOE) were analyzed. Antibodies are indicated. Note, that panels were assembled from two technical replicates of identical lysates (see source data).B, C, F and G. Lysate of S2 cells (as characterized in A and E) were incubated with -32P-UTP (B and F) or -32P-ATP (C and G) for the indicated time followed by RNA extraction, denaturing polyacrylamide gel electrophoresis and phosphorimaging.D and H. Quantification of at least five (D) or seven (H) independent replicates of experiment shown in B/C and F/G, respectively. Uridylation signal intensity for substrate S1 (indicated in B and F) was corrected for adenylation activity and normalized to wild-type 2 min time point. Data represent mean SEM. P-values were determined using Student's t-test. * p<0.05, ** p<10-2, *** p<10-3, **** p<10-4.A and E. Western blot analysis of genetically modified Drosophila S2 cells. Unmodified S2 cells (wild-type, wt), or S2 cells depleted of dmDis3l2 (dmDis3l2ko) by CRISPR/Cas9 or expressing FLAG-tagged catalytic mutant dmDis3l2 (dmDis3l2CM OE) were analyzed. Antibodies are indicated. Note, that panels were assembled from two technical replicates of identical lysates (see source data).B, C, F and G. Lysate of S2 cells (as characterized in A and E) were incubated with -32P-UTP (B and F) or -32P-ATP (C and G) for the indicated time followed by RNA extraction, denaturing polyacrylamide gel electrophoresis and phosphorimaging.D and H. Quantification of at least five (D) or seven (H) independent replicates of experiment shown in B/C and F/G, respectively. Uridylation signal intensity for substrate S1 (indicated in B and F) was corrected for adenylation activity and normalized to wild-type 2 min time point. Data represent mean SEM. P-values were determined using Student's t-test. * p<0.05, ** p<10-2, *** p<10-3, **** p<10-4."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "Protein", "/", "RNA", "co", "-", "immunopurification", "experiments", ".", "FLAG", "-", "tagged", "versions", "of", "indicated", "proteins", "were", "expressed", "in", "S2", "cells", ",", "followed", "by", "immunopurification", "and", "RNA", "isolation", ".", "RNA", "was", "visualized", "by", "CIP", "/", "PNK", "treatment", "using", "-", "32P", "-", "ATP", "followed", "by", "denaturing", "polyacrylamide", "gel", "electrophoresis", "and", "phosphorimaging", ".", "Star", "indicates", "non", "-", "specific", "contaminant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. Protein/RNA co-immunopurification experiments. FLAG-tagged versions of indicated proteins were expressed in S2 cells, followed by immunopurification and RNA isolation. RNA was visualized by CIP/PNK treatment using -32P-ATP followed by denaturing polyacrylamide gel electrophoresis and phosphorimaging. Star indicates non-specific contaminant."}
{"words": ["Figure", "6B", ".", "Meta", "-", "analysis", "of", "3", "′", "end", "counts", "in", "dmDis3l2CM", "-", "IP", "mapping", "to", "the", "indicated", "region", "around", "the", "annotated", "3", "′", "end", "of", "68", "tRNA", "loci", "in", "the", "Drosophila", "melanogaster", "genome", ".", "Cumulative", "relative", "distribution", "of", "3", "′", "end", "signal", ",", "relative", "to", "the", "annotated", "3", "′", "end", ",", "is", "reported", "(", "bottom", ")", ".", "The", "average", "genome", "thymine", "(", "T", ")", "-", "content", "for", "the", "same", "regions", "is", "displayed", "(", "top", ")", ".", "C", ".", "Northern", "hybridization", "experiment", "using", "total", "RNA", "from", "adult", "whole", "male", "flies", "using", "probes", "against", "3", "′", "trailer", "or", "mature", "tRNAAla", "(", "TGC", ")", ".", "Wild", "-", "type", "flies", "(", "w1118", ")", ",", "or", "flies", "bearing", "a", "homozygous", "frame", "-", "shift", "mutation", "in", "the", "first", "coding", "exon", "(", "dmDis3l2", "-", "/", "-", ")", "or", "a", "homozygous", "amino", "acid", "-", "exchange", "mutation", "in", "the", "catalytic", "site", "(", "dmDis3l2CM", ")", "in", "the", "endogenous", "dmdis3l2", "locus", "in", "the", "same", "genetic", "background", "were", "used", ".", "Probes", "against", "2S", "rRNA", "served", "as", "loading", "control", ".", "D", ".", "Quantification", "of", "four", "independent", "biological", "replicates", "of", "experiment", "shown", "in", "C", ".", "P", "-", "Value", "determined", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "E", ".", "Exoribonuclease", "assay", "using", "immunopurified", "dmDis3l2", "and", "in", "vitro", "transcribed", ",", "5", "′", "radiolabeled", "mature", "tRNA", ",", "containing", "a", "CCA", "modification", "or", "3", "′", "trailer", "-", "containing", "tRNA", ".", "Reactions", "were", "incubated", "for", "the", "indicated", "time", "and", "subjected", "to", "polyacrylamide", "gel", "electrophoresis", "and", "phosphorimaging", ".", "F", ".", "Quantification", "of", "three", "independent", "replicates", "of", "experiment", "shown", "in", "E", ".", "Data", "represent", "mean", "SD", ".", "Decay", "rates", "(", "kobs", ")", "SEM", "of", "fit", "were", "determined", "upon", "fitting", "to", "single", "exponential", "decay", "kinetics", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6B. Meta-analysis of 3′ end counts in dmDis3l2CM-IP mapping to the indicated region around the annotated 3′ end of 68 tRNA loci in the Drosophila melanogaster genome. Cumulative relative distribution of 3′ end signal, relative to the annotated 3′ end, is reported (bottom). The average genome thymine (T)-content for the same regions is displayed (top).C. Northern hybridization experiment using total RNA from adult whole male flies using probes against 3′ trailer or mature tRNAAla(TGC). Wild-type flies (w1118), or flies bearing a homozygous frame-shift mutation in the first coding exon (dmDis3l2-/-) or a homozygous amino acid-exchange mutation in the catalytic site (dmDis3l2CM) in the endogenous dmdis3l2 locus in the same genetic background were used. Probes against 2S rRNA served as loading control.D. Quantification of four independent biological replicates of experiment shown in C. P-Value determined by Student's t-test.E. Exoribonuclease assay using immunopurified dmDis3l2 and in vitro transcribed, 5′ radiolabeled mature tRNA, containing a CCA modification or 3′ trailer-containing tRNA. Reactions were incubated for the indicated time and subjected to polyacrylamide gel electrophoresis and phosphorimaging.F. Quantification of three independent replicates of experiment shown in E. Data represent mean SD. Decay rates (kobs) SEM of fit were determined upon fitting to single exponential decay kinetics."}
{"words": ["Figure", "7A", ".", "Impact", "of", "RNA", "secondary", "structures", "on", "RNA", "decay", "rates", "(", "kobs", ")", "of", "256", "different", "RNA", "substrates", "subjected", "to", "E", ".", "coli", "RNase", "R", "(", "ecoRNaseR", ")", "-", "or", "Drosophila", "melanogaster", "Dis3l2", "(", "dmDis3l2", ")", "-", "directed", "RNA", "decay", "assay", "as", "described", "in", "Fig", ".", "2", ".", "RNA", "secondary", "structures", "were", "determined", "by", "RNAfold", "(", "Gruber", "et", "al", ",", "2008", ")", "and", "reported", "as", "effective", "free", "energy", "(", "EFE", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", "of", "curve", "fit", ".", "Grey", "boxes", "represent", "tukey", "boxplot", "of", "individual", "EFE", "groups", ".", "White", "line", "indicates", "median", ".", "P", "-", "Value", "determined", "by", "Mann", "-", "Whitney", "test", "comparing", "individual", "EFE", "groups", "against", "all", "substrates", ".", "Unstructured", "RNA", "used", "for", "subsequent", "analysis", "are", "indicated", "(", "EFE", "groups", "4", "to", "6", ")", ".", "B", ".", "Nucleotide", "content", "of", "randomized", "3", "′", "end", "sequence", "among", "the", "indicated", "number", "of", "substrate", "RNAs", ",", "ranked", "according", "to", "decay", "kinetics", "from", "slow", "(", "left", ")", "to", "fast", "(", "right", ")", ".", "Fold", "-", "change", "in", "abundance", "for", "individual", "nucleotides", "is", "reported", "(", "bottom", ")", ".", "Only", "unstructured", "RNA", "substrates", "(", "see", "A", ")", "were", "considered", ".", "C", ".", "Decay", "rate", "of", "the", "indicated", "number", "of", "sequences", ",", "grouped", "according", "to", "individual", "nucleotide", "content", "in", "the", "randomized", "3", "′", "end", "sequence", ".", "Data", "is", "represented", "as", "boxplot", ",", "outliers", "are", "not", "shown", ".", "P", "-", "Value", "reports", "significant", "differences", "compared", "to", "all", "substrates", "as", "determined", "by", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "Grey", "area", "represents", "the", "inner", "quartile", "range", "and", "white", "line", "the", "median", "of", "all", "substrates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A. Impact of RNA secondary structures on RNA decay rates (kobs) of 256 different RNA substrates subjected to E.coli RNase R (ecoRNaseR)- or Drosophila melanogaster Dis3l2 (dmDis3l2)-directed RNA decay assay as described in Fig. 2. RNA secondary structures were determined by RNAfold (Gruber et al, 2008) and reported as effective free energy (EFE). Error bars represent SEM of curve fit. Grey boxes represent tukey boxplot of individual EFE groups. White line indicates median. P-Value determined by Mann-Whitney test comparing individual EFE groups against all substrates. Unstructured RNA used for subsequent analysis are indicated (EFE groups 4 to 6).B. Nucleotide content of randomized 3′ end sequence among the indicated number of substrate RNAs, ranked according to decay kinetics from slow (left) to fast (right). Fold-change in abundance for individual nucleotides is reported (bottom). Only unstructured RNA substrates (see A) were considered.C. Decay rate of the indicated number of sequences, grouped according to individual nucleotide content in the randomized 3′ end sequence. Data is represented as boxplot, outliers are not shown. P-Value reports significant differences compared to all substrates as determined by Mann-Whitney test. Grey area represents the inner quartile range and white line the median of all substrates."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "C", ")", "HeLa", "GFP", "-", "LC3", "cells", "were", "transfected", "with", "indicated", "siRNAs", "and", "infected", "with", "DsRed", "-", "labeled", "Salmonella", ".", "The", "percentage", "of", "GFP", "-", "LC3", "+", "Salmonella", "at", "1", "hr", "post", "-", "infection", "is", "shown", ".", "Data", "are", "shown", "as", "means", "±", "SD", ";", "n", "=", "75", "cells", "per", "condition", "from", "three", "biological", "replicates", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "D", ")", "Representative", "epifluorescent", "microscopy", "images", "of", "HeLa", "cells", "used", "to", "generate", "data", "shown", "in", "(", "C", ")", ".", "The", "scale", "bars", "represent", "10", "μm", ".", "(", "E", ")", "Western", "blot", "of", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "the", "indicated", "siRNAs", "and", "treated", "with", "Torin", "E64D", "/", "PepA", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "G", ")", "HeLa", "GFP", "-", "LC3", "cells", "were", "transfected", "with", "control", "siRNA", ",", "CLEC12A", "siRNA1", ",", "or", "CLEC12A", "siRNA2", "as", "well", "as", "CLEC12A", "rescue", "constructs", "(", "R1", "or", "R2", ")", "and", "infected", "for", "1", "hr", "with", "DsRed", "-", "labeled", "Salmonella", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ";", "n", "=", "75", "per", "condition", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "H", ")", "HeLa", "cells", "from", "(", "G", ")", "were", "lysed", ",", "and", "HA", "-", "CLEC12A", "expression", "levels", "were", "assessed", "by", "western", "blot", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(C) HeLa GFP-LC3 cells were transfected with indicated siRNAs and infected with DsRed-labeled Salmonella. The percentage of GFP-LC3+ Salmonella at 1 hr post-infection is shown. Data are shown as means ± SD; n = 75 cells per condition from three biological replicates. Data are representative of three independent experiments.(D) Representative epifluorescent microscopy images of HeLa cells used to generate data shown in (C). The scale bars represent 10 μm.(E) Western blot of HeLa cells transfected with the indicated siRNAs and treated with Torin E64D/PepA. Data are representative of three independent experiments.(G) HeLa GFP-LC3 cells were transfected with control siRNA, CLEC12A siRNA1, or CLEC12A siRNA2 as well as CLEC12A rescue constructs (R1 or R2) and infected for 1 hr with DsRed-labeled Salmonella. Data are shown as mean ± SD; n = 75 per condition. Data are representative of three independent experiments.(H) HeLa cells from (G) were lysed, and HA-CLEC12A expression levels were assessed by western blot. Data are representative of three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Representative", "epifluorescent", "images", "showing", "impaired", "antibacterial", "autophagy", "in", "ATG16L1", "KO", "HeLa", "cells", "complemented", "with", "the", "indicated", "ATG16L1", "protein", "in", "the", "presence", "of", "control", "siRNA", "or", "CLEC12A", "siRNA", ".", "The", "scale", "bars", "represent", "10", "μm", ".", "(", "B", ")", "Percentage", "of", "LC3", "-", "Salmonella", "colocalization", "in", "WT", "HeLa", "cells", ",", "ATG16L1", "KO", "HeLa", "cells", ",", "and", "ATG16L1", "KO", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "ATG16L1", "∗", "300T", "or", "∗", "300A", "alleles", "in", "the", "presence", "of", "control", "siRNA", "or", "CLEC12A", "siRNA", ".", "Data", "are", "shown", "as", "means", "±", "SD", ";", "n", "=", "75", ".", "Data", "shown", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Representative epifluorescent images showing impaired antibacterial autophagy in ATG16L1 KO HeLa cells complemented with the indicated ATG16L1 protein in the presence of control siRNA or CLEC12A siRNA. The scale bars represent 10 μm. (B) Percentage of LC3-Salmonella colocalization in WT HeLa cells, ATG16L1 KO HeLa cells, and ATG16L1 KO HeLa cells stably expressing ATG16L1∗300T or ∗300A alleles in the presence of control siRNA or CLEC12A siRNA. Data are shown as means ± SD; n = 75. Data shown are representative of three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Confocal", "micrographs", "of", "LC3", "-", "Listeria", "colocalization", "in", "WT", "and", "Clec12a", "−", "/", "−", "BMDMs", "at", "1", "hr", "post", "-", "infection", ".", "The", "scale", "bars", "represent", "10", "μm", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "LC3", "-", "Listeria", "colocalization", "in", "WT", "and", "Clec12a", "−", "/", "−", "BMDMs", ".", "Data", "shown", "represent", "mean", "±", "SD", "of", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ";", "unpaired", "t", "test", ".", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "(", "C", "and", "D", ")", "Salmonella", "cfus", "quantified", "per", "gram", "of", "stool", "(", "C", ")", "and", "per", "organ", "(", "D", ")", "at", "4", "days", "post", "-", "infection", "are", "displayed", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ";", "∗", "∗", "p", "≤", "0", ".", "01", ".", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "9", "for", "WT", ";", "n", "=", "7", "or", "8", "for", "Clec12a", "−", "/", "−", ")", ".", "(", "E", ")", "Clinical", "score", "for", "infected", "mice", "at", "4", "days", "post", "-", "infection", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "∗", "∗", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "unpaired", "t", "test", ".", "(", "n", "=", "14", "for", "WT", ";", "n", "=", "13", "for", "Clec12a", "−", "/", "−", ")", ".", "(", "F", ")", "Survival", "curve", "for", "infected", "WT", "and", "Clec12a", "−", "/", "−", "mice", "(", "n", "=", "9", "mice", "per", "genotype", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Confocal micrographs of LC3-Listeria colocalization in WT and Clec12a−/− BMDMs at 1 hr post-infection. The scale bars represent 10 μm. (B) Quantification of LC3-Listeria colocalization in WT and Clec12a−/− BMDMs. Data shown represent mean ± SD of n = 3 independent experiments; unpaired t test. ∗∗p < 0.01.(C and D) Salmonella cfus quantified per gram of stool (C) and per organ (D) at 4 days post-infection are displayed. Data are shown as mean ± SD; ∗∗p ≤ 0.01. Data are representative of at least two independent experiments (n = 9 for WT; n = 7 or 8 for Clec12a−/−).(E) Clinical score for infected mice at 4 days post-infection. Data are shown as mean ± SD. Data are representative of at least two independent experiments. ∗∗∗∗p < 0.0001; unpaired t test. (n = 14 for WT; n = 13 for Clec12a−/−).(F) Survival curve for infected WT and Clec12a−/− mice (n = 9 mice per genotype)."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Gentamicin", "protection", "assay", "in", "HeLa", "cells", "showing", "fold", "replication", "of", "Salmonella", "in", "cells", "treated", "with", "the", "indicated", "siRNAs", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ";", "n", "=", "6", ".", "Data", "are", "representative", "of", "four", "independent", "experiments", ".", "(", "B", ")", "Quantitation", "of", "CLEC12A", "-", "bacteria", "and", "LC3", "-", "bacteria", "colocalization", "at", "indicated", "time", "points", ".", "Data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ";", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "(", "C", ")", "Representative", "confocal", "micrographs", "of", "HeLa", "cells", "showing", "association", "of", "intracellular", "bacteria", "with", "GFP", "-", "CLEC12A", "at", "20", ",", "40", ",", "60", ",", "and", "80", "min", "post", "-", "infection", ".", "The", "scale", "bars", "represent", "10", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Gentamicin protection assay in HeLa cells showing fold replication of Salmonella in cells treated with the indicated siRNAs. Data are shown as mean ± SD; n = 6. Data are representative of four independent experiments.(B) Quantitation of CLEC12A-bacteria and LC3-bacteria colocalization at indicated time points. Data are shown as mean ± SD; n = 3 independent experiments. (C) Representative confocal micrographs of HeLa cells showing association of intracellular bacteria with GFP-CLEC12A at 20, 40, 60, and 80 min post-infection. The scale bars represent 10 μm."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", "-", "C", ")", "Representative", "epifluorescent", "images", "of", "HeLa", "cells", "showing", "colocalization", "of", "(", "A", ")", "CLEC12A", "(", "green", ")", "and", "galectin", "8", "or", "galectin", "3", "(", "red", ")", "around", "intracellular", "Salmonella", "(", "blue", ")", ",", "(", "B", ")", "GFP", "-", "CLEC12A", "(", "green", ")", "and", "NDP52", "(", "red", ")", "around", "Salmonella", "(", "blue", ")", ",", "and", "(", "C", ")", "endogenous", "CLEC12A", "(", "red", ")", "and", "GFP", "-", "LC3", "(", "green", ")", "around", "Salmonella", "(", "blue", ")", ".", "(", "D", ")", "CLEC12A", "or", "GFP", "-", "CLEC12A", "(", "green", ")", "and", "GABARAPL2", "or", "ATG16L1", "(", "red", ")", "around", "intracellular", "Salmonella", "(", "blue", ")", ".", "Images", "are", "representative", "of", "three", "or", "more", "independent", "experiments", ".", "(", "E", ")", "Representative", "epifluorescent", "images", "of", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "a", "control", "siRNA", "or", "a", "siRNA", "against", "CLEC12A", "and", "infected", "with", "DsRed", "-", "labeled", "Salmonella", "for", "1", "hr", ".", "(", "F", ")", "Quantitation", "of", "ubiquitin", "-", "bacteria", "colocalization", "at", "1", "hr", "post", "-", "infection", "in", "cells", "shown", "in", "(", "E", ")", ".", "Data", "are", "shown", "as", "means", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "G", ")", "Representative", "epifluorescent", "images", "of", "HeLa", "cells", "transfected", "and", "infected", "as", "in", "(", "E", ")", ".", "(", "H", ")", "Quantitation", "of", "NDP52", "-", "bacteria", "colocalization", "at", "1", "hr", "post", "-", "infection", "in", "cells", "shown", "in", "(", "G", ")", ".", "Data", "are", "shown", "as", "means", "±", "SEM", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "I", ")", "Representative", "confocal", "micrographs", "of", "HeLa", "cells", "expressing", "GFP", "-", "CLEC12A", ".", "Cells", "were", "untreated", "or", "exposed", "to", "hypertonic", "media", "containing", "PEG", "1000", ",", "followed", "by", "hypotonic", "shock", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A-C) Representative epifluorescent images of HeLa cells showing colocalization of (A) CLEC12A (green) and galectin 8 or galectin 3 (red) around intracellular Salmonella (blue), (B) GFP-CLEC12A (green) and NDP52 (red) around Salmonella (blue), and (C) endogenous CLEC12A (red) and GFP-LC3 (green) around Salmonella (blue).(D) CLEC12A or GFP-CLEC12A (green) and GABARAPL2 or ATG16L1 (red) around intracellular Salmonella (blue). Images are representative of three or more independent experiments.(E) Representative epifluorescent images of HeLa cells transfected with a control siRNA or a siRNA against CLEC12A and infected with DsRed-labeled Salmonella for 1 hr. (F) Quantitation of ubiquitin-bacteria colocalization at 1 hr post-infection in cells shown in (E). Data are shown as means ± SEM from three independent experiments.(G) Representative epifluorescent images of HeLa cells transfected and infected as in (E). (H) Quantitation of NDP52-bacteria colocalization at 1 hr post-infection in cells shown in (G). Data are shown as means ± SEM from three independent experiments.(I) Representative confocal micrographs of HeLa cells expressing GFP-CLEC12A. Cells were untreated or exposed to hypertonic media containing PEG 1000, followed by hypotonic shock."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "E", ")", "HeLa", "GFP", "-", "LC3", "cells", "were", "transfected", "with", "indicated", "siRNAs", "for", "48", "hr", "and", "then", "infected", "with", "DsRed", "-", "labeled", "Salmonella", "for", "1", "hr", ".", "The", "fraction", "of", "GFP", "-", "positive", "intracellular", "Salmonella", "is", "shown", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SD", "and", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "F", ")", "Gentamicin", "protection", "assay", "in", "HeLa", "cells", "showing", "increased", "intracellular", "bacterial", "replication", "after", "48", "hr", "of", "knockdown", "of", "ATG16L1", ",", "KLHL9", ",", "NEDD8", ",", "or", "KLHL13", ".", "Data", "shown", "as", "mean", "±", "SD", ";", "n", "=", "4", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(E) HeLa GFP-LC3 cells were transfected with indicated siRNAs for 48 hr and then infected with DsRed-labeled Salmonella for 1 hr. The fraction of GFP-positive intracellular Salmonella is shown. Data are mean ± SD and are representative of three independent experiments.(F) Gentamicin protection assay in HeLa cells showing increased intracellular bacterial replication after 48 hr of knockdown of ATG16L1, KLHL9, NEDD8, or KLHL13. Data shown as mean ± SD; n = 4. Data are representative of three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "1B", "Forest", "plots", "display", "the", "hazard", "ratios", "of", "genes", "at", "the", "17q12", "amplicon", "according", "to", "the", "DFS", "(", "top", "right", ")", "and", "OS", "(", "bottom", "right", ")", "of", "breast", "cancer", "patients", "in", "the", "METABRIC", "dataset", ".", "Genes", "located", "at", "the", "HER2", "amplicon", "were", "nominated", "according", "to", "hazard", "-", "ratio", "levels", "(", "all", "P", "-", "values", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "The", "HER2", "co", "-", "amplification", "percentage", "of", "the", "indicated", "genes", "is", "represented", "as", "bar", "graphs", "(", "left", ")", ".", "C", "The", "frequency", "of", "CDK12", "amplification", "in", "HER2", "-", "amplified", "-", "and", "HER2", "-", "nonamplified", "breast", "cancer", ".", "The", "bar", "graphs", "indicate", "the", "frequency", "of", "HER2", "and", "CDK12", "co", "-", "amplified", "cases", "among", "the", "patients", "with", "HER2", "gene", "amplification", "(", "left", ")", ".", "Tables", "show", "the", "percentage", "of", "CDK12", "amplification", "in", "the", "indicated", "cohorts", "(", "right", ")", ".", "Amp", ",", "amplification", ";", "non", "-", "amp", ",", "non", "-", "amplification", ".", "D", "Scatter", "plot", "showing", "the", "correlation", "between", "CDK12", "expression", "and", "its", "copy", "number", "alteration", "(", "CNA", ")", "in", "METABRIC", "(", "left", ")", ".", "The", "r", "value", "was", "calculated", "as", "the", "Pearson", "'", "s", "correlation", "coefficient", ".", "Box", "plots", "showing", "the", "mRNA", "levels", "of", "CDK12", "in", "the", "indicated", "subtypes", "from", "METABRIC", "(", "right", ")", ".", "P", "-", "values", "were", "calculated", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "followed", "by", "post", "-", "hoc", "LSD", "test", ".", "E", "Survival", "analysis", "of", "breast", "cancer", "patients", "according", "to", "the", "expression", "of", "CDK12", "in", "METABRIC", "(", "top", ")", "and", "KM", "plotter", "(", "bottom", ")", "using", "the", "Kaplan", "-", "Meier", "method", "with", "the", "log", "-", "rank", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B Forest plots display the hazard ratios of genes at the 17q12 amplicon according to the DFS (top right) and OS (bottom right) of breast cancer patients in the METABRIC dataset. Genes located at the HER2 amplicon were nominated according to hazard-ratio levels (all P-values < 0.01). The HER2 co-amplification percentage of the indicated genes is represented as bar graphs (left).C The frequency of CDK12 amplification in HER2-amplified- and HER2-nonamplified breast cancer. The bar graphs indicate the frequency of HER2 and CDK12 co-amplified cases among the patients with HER2 gene amplification (left). Tables show the percentage of CDK12 amplification in the indicated cohorts (right). Amp, amplification; non-amp, non-amplification.D Scatter plot showing the correlation between CDK12 expression and its copy number alteration (CNA) in METABRIC (left). The r value was calculated as the Pearson's correlation coefficient. Box plots showing the mRNA levels of CDK12 in the indicated subtypes from METABRIC (right). P-values were calculated using one-way ANOVA, followed by post-hoc LSD test.E Survival analysis of breast cancer patients according to the expression of CDK12 in METABRIC (top) and KM plotter (bottom) using the Kaplan-Meier method with the log-rank test."}
{"words": ["Figure", "2A", "FACS", "analysis", "of", "the", "percentages", "of", "CD44", "+", "/", "CD24", "−", "/", "ESA", "+", "breast", "CSC", "-", "like", "populations", "in", "CDK12", "-", "overexpressing", "ZR", "-", "75", "-", "30", "and", "HCC", "-", "1419", "cells", "and", "CDK12", "-", "siRNA", "-", "transfected", "BT474", "and", "HCC", "-", "1954", "cells", ".", "Top", ",", "representative", "dot", "plot", "of", "CD44", "-", "APC", "versus", "CD24", "-", "PE", "expression", "for", "viable", "cells", "(", "red", ")", "and", "ESA", "-", "positive", "cells", "(", "blue", ")", "from", "the", "viable", "cells", ".", "Bottom", ",", "the", "percentage", "of", "CD44", "+", "/", "CD24", "-", "/", "ESA", "+", "cell", "population", "(", "blue", "dots", "at", "lower", "right", "quadrant", "in", "the", "plots", ")", "was", "quantified", "in", "the", "indicated", "cell", "lines", ".", "Mean", "±", "s", ".", "d", ".", "of", "three", "independent", "samples", ".", "P", "-", "values", "were", "based", "on", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "ZR", "-", "75", "-", "30", "and", "HCC", "-", "1419", "cells", ")", "and", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "a", "post", "-", "hoc", "LSD", "test", "(", "BT474", "and", "HCC", "-", "1954", "cells", ")", ".", "Amp", ",", "amplification", ";", "non", "-", "amp", ",", "non", "-", "amplification", ";", "Trz", ",", "trastuzumab", ".", "B", "ALDEFLUOR", "assay", "for", "analysing", "cell", "population", "with", "a", "high", "ALDH", "activity", "in", "the", "indicated", "cell", "lines", ".", "Cells", "either", "treated", "with", "ALDH", "inhibitor", "DEAB", "(", "with", "DEAB", ";", "negative", "control", ")", "or", "untreated", "(", "without", "DEAB", ")", "were", "incubated", "with", "ALDEFLURO", "substrate", "(", "BAAA", ")", ".", "In", "the", "FACS", "analysis", ",", "the", "percentage", "of", "ALDEFLUOR", "-", "positive", "population", "was", "determined", "based", "on", "the", "shift", "of", "fluorescent", "cells", "seen", "in", "the", "dot", "plots", "in", "the", "absence", "of", "DEAB", ".", "Mean", "±", "s", ".", "d", ".", ".", "P", "-", "values", "were", "calculated", "based", "on", "a", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "cell", "line", "information", "was", "indicated", "as", "follows", ":", "a", "/", "a", ",", "CDK12", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", ";", "n", "/", "a", ",", "CDK12", "non", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", "S", ",", "trastuzumab", "-", "sensitive", ".", "C", "The", "self", "-", "renewal", "of", "CSCs", "in", "the", "indicated", "stable", "cell", "lines", "was", "analysed", "using", "a", "tumorsphere", "-", "formation", "assay", ".", "The", "number", "of", "tumorsphere", "cells", "(", ">", "100", "μm", "in", "diameter", ")", "was", "counted", "after", "3", ",", "5", ",", "and", "7", "days", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "P", "-", "value", "was", "calculated", "based", "on", "a", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "ZR", "-", "75", "-", "30", "and", "HCC", "-", "1419", "cells", ")", "or", "ANOVA", "with", "a", "post", "-", "hoc", "LSD", "test", "(", "BT474", "and", "HCC", "-", "1954", "cells", ")", ".", "cell", "line", "information", "was", "indicated", "as", "follows", ":", "a", "/", "a", ",", "CDK12", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", ";", "n", "/", "a", ",", "CDK12", "non", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", ";", "R", ",", "trastuzumab", "-", "resistant", ";", "PR", ",", "trastuzumab", "-", "partial", "responsive", ";", "S", ",", "trastuzumab", "-", "sensitive", ".", "D", "Cell", "growth", "of", "the", "indicated", "stable", "cell", "lines", "treated", "with", "trastuzumab", "(", "Trz", ")", "or", "vehicle", "(", "veh", ")", "as", "measured", "by", "SRB", "assay", ".", "Trastuzumab", "-", "sensitive", "HER2", "+", "breast", "cancer", "cell", "lines", "(", "S", ")", "and", "trastuzumab", "-", "insensitive", "HER2", "+", "breast", "cancer", "cell", "lines", "(", "partial", "responsive", ",", "PR", ";", "resistant", ",", "R", ")", "were", "treated", "with", "1", "µg", "/", "mL", "or", "100", "µg", "/", "mL", "trastuzumab", ",", "respectively", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "P", "-", "values", "were", "calculated", "using", "RM", "ANOVA", "with", "a", "post", "-", "hoc", "LSD", "test", ".", "cell", "line", "information", "was", "indicated", "as", "follows", ":", "a", "/", "a", ",", "CDK12", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", ";", "n", "/", "a", ",", "CDK12", "non", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", ";", "R", ",", "trastuzumab", "-", "resistant", ";", "PR", ",", "trastuzumab", "-", "partial", "responsive", ";", "S", ",", "trastuzumab", "-", "sensitive", ".", "E", "Analysis", "of", "the", "effect", "of", "CDK12", "deficiency", "on", "the", "in", "vivo", "trastuzumab", "response", "of", "HER2", "+", "breast", "cancer", ".", "Mice", "were", "orthotopically", "xenografted", "with", "the", "indicated", "HER2", "+", "breast", "cancer", "cells", "and", "treated", "with", "20", "mg", "/", "kg", "trastuzumab", ".", "The", "growth", "curve", "of", "each", "group", "was", "analysed", "twice", "weekly", "for", "5", "to", "6", "weeks", "(", "n", "=", "8", "/", "group", ";", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", ".", "P", "-", "values", "were", "calculated", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "a", "post", "-", "hoc", "LSD", "test", "for", "the", "last", "day", "of", "tumor", "measurement", ".", "cell", "line", "information", "was", "indicated", "as", "follows", ":", "a", "/", "a", ",", "CDK12", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", "R", ",", "trastuzumab", "-", "resistant", "S", ",", "trastuzumab", "-", "sensitive", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A FACS analysis of the percentages of CD44+/CD24−/ESA+ breast CSC-like populations in CDK12-overexpressing ZR-75-30 and HCC-1419 cells and CDK12-siRNA-transfected BT474 and HCC-1954 cells. Top, representative dot plot of CD44-APC versus CD24-PE expression for viable cells (red) and ESA-positive cells (blue) from the viable cells. Bottom, the percentage of CD44+/CD24-/ESA+ cell population (blue dots at lower right quadrant in the plots) was quantified in the indicated cell lines. Mean ± s.d. of three independent samples. P-values were based on two-tailed Student's t-test (ZR-75-30 and HCC-1419 cells) and one-way ANOVA with a post-hoc LSD test (BT474 and HCC-1954 cells). Amp, amplification; non-amp, non-amplification; Trz, trastuzumab.B ALDEFLUOR assay for analysing cell population with a high ALDH activity in the indicated cell lines. Cells either treated with ALDH inhibitor DEAB (with DEAB; negative control) or untreated (without DEAB) were incubated with ALDEFLURO substrate (BAAA). In the FACS analysis, the percentage of ALDEFLUOR-positive population was determined based on the shift of fluorescent cells seen in the dot plots in the absence of DEAB. Mean ± s.d. . P-values were calculated based on a two-tailed Student's t-test cell line information was indicated as follows: a/a, CDK12-amplified/HER2-amplified cells; n/a, CDK12 non-amplified/HER2-amplified cells S, trastuzumab-sensitive.C The self-renewal of CSCs in the indicated stable cell lines was analysed using a tumorsphere-formation assay. The number of tumorsphere cells (> 100 μm in diameter) was counted after 3, 5, and 7 days. Data represent the mean ± s.d. (n = 3). P-value was calculated based on a two-tailed Student's t-test (ZR-75-30 and HCC-1419 cells) or ANOVA with a post-hoc LSD test (BT474 and HCC-1954 cells). cell line information was indicated as follows: a/a, CDK12-amplified/HER2-amplified cells; n/a, CDK12 non-amplified/HER2-amplified cells; R, trastuzumab-resistant; PR, trastuzumab-partial responsive; S, trastuzumab-sensitive.D Cell growth of the indicated stable cell lines treated with trastuzumab (Trz) or vehicle (veh) as measured by SRB assay. Trastuzumab-sensitive HER2+ breast cancer cell lines (S) and trastuzumab-insensitive HER2+ breast cancer cell lines (partial responsive, PR; resistant, R) were treated with 1 µg/mL or 100 µg/mL trastuzumab, respectively. Data represent the mean ± s.d. P-values were calculated using RM ANOVA with a post-hoc LSD test. cell line information was indicated as follows: a/a, CDK12-amplified/HER2-amplified cells; n/a, CDK12 non-amplified/HER2-amplified cells; R, trastuzumab-resistant; PR, trastuzumab-partial responsive; S, trastuzumab-sensitive.E Analysis of the effect of CDK12 deficiency on the in vivo trastuzumab response of HER2+ breast cancer. Mice were orthotopically xenografted with the indicated HER2+ breast cancer cells and treated with 20 mg/kg trastuzumab. The growth curve of each group was analysed twice weekly for 5 to 6 weeks (n = 8/group; mean ± s.e.m.). P-values were calculated using one-way ANOVA with a post-hoc LSD test for the last day of tumor measurement. cell line information was indicated as follows: a/a, CDK12-amplified/HER2-amplified cells R, trastuzumab-resistant S, trastuzumab-sensitive."}
{"words": ["Figure", "3A", "Heatmap", "presents", "the", "alteration", "of", "gene", "expression", "(", "≥", "1", ".", "5", "-", "fold", ")", "between", "control", "(", "CON", ")", "and", "CDK12", "-", "overexpressing", "(", "CDK12", ")", "ZR", "-", "75", "-", "30", "cells", "obtained", "from", "RNA", "-", "seq", "analysis", ".", "B", "GSEA", "displaying", "correlations", "of", "the", "gene", "-", "expression", "profiles", "between", "control", "and", "CDK12", "-", "overexpressing", "cells", "based", "on", "RNA", "-", "seq", "results", ".", "D", "The", "CDK12", "-", "target", "genes", "identified", "by", "RNA", "-", "seq", "were", "validated", "in", "CDK12", "-", "overexpressing", "ZR", "-", "75", "-", "30", "cells", "using", "qRT", "-", "PCR", "analysis", ".", "Mean", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "P", "-", "values", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "E", "ChIP", "-", "qPCR", "analysis", "displaying", "the", "fold", "-", "enrichment", "of", "the", "indicated", "proteins", "and", "histone", "H3", "acetylation", "at", "the", "TSS", "of", "CDK12", "-", "target", "genes", "in", "the", "indicated", "cell", "lines", ".", "Mean", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "P", "-", "values", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Cell", "line", "information", ":", "a", "/", "a", ",", "CDK12", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", ";", "n", "/", "a", ",", "CDK12", "non", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", "S", ",", "trastuzumab", "-", "sensitive", ".", "F", "Effect", "of", "CDK12", "kinase", "inhibition", "on", "the", "expression", "of", "WNT1", ",", "WNT3", ",", "and", "IRS1", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "different", "doses", "of", "dinaciclib", "for", "12", "h", ",", "and", "the", "expression", "of", "candidate", "targets", "of", "CDK12", "were", "analysed", "by", "immunoblot", "and", "qRT", "-", "PCR", "Mean", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "P", "-", "values", "by", "ANOVA", "with", "a", "post", "-", "hoc", "LSD", "test", ".", "Cell", "line", "information", ":", "a", "/", "a", ",", "CDK12", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", ";", "R", ",", "trastuzumab", "-", "resistant", ";", "S", ",", "trastuzumab", "-", "sensitive", ".", "G", "Cell", "viability", "was", "measured", "by", "SRB", "assay", "in", "trastuzumab", "-", "sensitive", "BT474", "cells", "and", "trastuzumab", "-", "resistant", "HCC", "-", "1954", "cells", "treated", "with", "1", "µg", "/", "mL", "or", "100", "µg", "/", "mL", "trastuzumab", "(", "Trz", ")", "and", "/", "or", "5", "nM", "or", "10", "nM", "dinaciclib", "(", "Dina", ")", ",", "respectively", ".", "Mean", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "P", "-", "values", ",", "RM", "ANOVA", "with", "a", "post", "-", "hoc", "LSD", "test", ".", "Cell", "line", "information", ":", "a", "/", "a", ",", "CDK12", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", "R", ",", "trastuzumab", "-", "resistant", ";", "S", ",", "trastuzumab", "-", "sensitive", ".", "H", "Tumor", "growth", "curves", "for", "mice", "xenografted", "with", "the", "indicated", "HER2", "+", "breast", "cancer", "cells", "treated", "with", "20", "mg", "/", "kg", "trastuzumab", "and", "/", "or", "20", "mg", "/", "kg", "dinaciclib", "(", "n", "=", "8", "/", "group", ";", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", ".", "P", "-", "values", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "a", "post", "-", "hoc", "LSD", "(", "BT474", ")", "or", "Dunnett", "T3", "(", "HCC", "-", "1954", ")", "test", "for", "the", "last", "day", "of", "tumor", "measurement", ".", "Cell", "line", "information", ":", "a", "/", "a", ",", "CDK12", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", "R", ",", "trastuzumab", "-", "resistant", ";", "S", ",", "trastuzumab", "-", "sensitive", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Heatmap presents the alteration of gene expression (≥1.5-fold) between control (CON) and CDK12-overexpressing (CDK12) ZR-75-30 cells obtained from RNA-seq analysis.B GSEA displaying correlations of the gene-expression profiles between control and CDK12-overexpressing cells based on RNA-seq results.D The CDK12-target genes identified by RNA-seq were validated in CDK12-overexpressing ZR-75-30 cells using qRT-PCR analysis. Mean ± s.d. (n = 3). P-values by two-tailed Student's t-test.E ChIP-qPCR analysis displaying the fold-enrichment of the indicated proteins and histone H3 acetylation at the TSS of CDK12-target genes in the indicated cell lines. Mean ± s.d. (n = 3). P-values by two-tailed Student's t-test. Cell line information: a/a, CDK12-amplified/HER2-amplified cells; n/a, CDK12 non-amplified/HER2-amplified cells S, trastuzumab-sensitive.F Effect of CDK12 kinase inhibition on the expression of WNT1, WNT3, and IRS1. Cells were treated with different doses of dinaciclib for 12 h, and the expression of candidate targets of CDK12 were analysed by immunoblot and qRT-PCR Mean ± s.d. (n = 3). P-values by ANOVA with a post-hoc LSD test. Cell line information: a/a, CDK12-amplified/HER2-amplified cells ; R, trastuzumab-resistant; S, trastuzumab-sensitive.G Cell viability was measured by SRB assay in trastuzumab-sensitive BT474 cells and trastuzumab-resistant HCC-1954 cells treated with 1 µg/mL or 100 µg/mL trastuzumab (Trz) and/or 5 nM or 10 nM dinaciclib (Dina), respectively. Mean ± s.d. (n = 3). P-values, RM ANOVA with a post-hoc LSD test. Cell line information: a/a, CDK12-amplified/HER2-amplified cells R, trastuzumab-resistant; S, trastuzumab-sensitive.H Tumor growth curves for mice xenografted with the indicated HER2+ breast cancer cells treated with 20 mg/kg trastuzumab and/or 20 mg/kg dinaciclib (n = 8/group; mean ± s.e.m.). P-values, one-way ANOVA with a post-hoc LSD (BT474) or Dunnett T3 (HCC-1954) test for the last day of tumor measurement. Cell line information: a/a, CDK12-amplified/HER2-amplified cells R, trastuzumab-resistant; S, trastuzumab-sensitive."}
{"words": ["Figure", "4A", "Western", "blot", "and", "qRT", "-", "PCR", "results", "showing", "phosphorylation", "levels", "of", "GSK", "-", "3β", "and", "WNT1", "and", "WNT3", "expression", ",", "respectively", ",", "in", "the", "indicated", "cell", "lines", ".", "Mean", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "P", "-", "values", "by", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "a", "/", "a", ",", "CDK12", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", ";", "n", "/", "a", ",", "CDK12", "non", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", ";", "S", ",", "trastuzumab", "-", "sensitiveSubcellular", "localization", "of", "β", "-", "catenin", "in", "the", "indicated", "stable", "cell", "lines", "were", "analysed", "by", "cellular", "fractionation", "(", "B", ")", "Subcellular", "localization", "of", "β", "-", "catenin", "in", "the", "indicated", "stable", "cell", "lines", "were", "analysed", "by", "immunofluorescence", "staining", "(", "C", ")", ".", "Nuclear", "translocation", "of", "β", "-", "catenin", "in", "control", ",", "CDK12", "-", "overexpressing", ",", "and", "CDK12", "-", "knockdown", "stable", "cell", "lines", "was", "quantified", "by", "counting", "the", "cells", "harboring", "exclusively", "nuclear", "β", "-", "catenin", "(", "N", ")", "from", "the", "immunofluorescence", "image", ".", "Mean", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "P", "-", "value", "was", "calculated", "using", "a", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "M", "+", "C", ",", "cells", "containing", "membrane", "and", "/", "or", "cytoplasmic", "β", "-", "catenin", ";", "N", ",", "cells", "dominantly", "expressing", "nuclear", "β", "-", "catenin", ".", "Green", ",", "β", "-", "catenin", "staining", ";", "Blue", ",", "DAPI", "staining", "for", "visualization", "of", "nucleus", ";", "Scale", "bar", "=", "10", "μ", ".", "a", "/", "a", ",", "CDK12", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", ";", "n", "/", "a", ",", "CDK12", "non", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", ";", "S", ",", "trastuzumab", "-", "sensitive", ".", "D", "Luciferase", "-", "reporter", "assay", "measuring", "the", "TCF", "/", "lymphoid", "enhancer", "-", "binding", "factor", "-", "promoter", "activity", "in", "the", "indicated", "cell", "lines", ".", "TOP", ",", "pTOP", "-", "flash", "(", "wild", "-", "type", "TCF", "-", "binding", "sites", ")", ",", "FOP", ",", "pFOP", "-", "flash", "(", "mutant", "TCF", "-", "binding", "sites", ")", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "P", "-", "values", "were", "calculated", "using", "a", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "E", "The", "mRNA", "levels", "of", "the", "WNT", "/", "β", "-", "catenin", "/", "TCF", "-", "target", "genes", "in", "CDK12", "-", "overexpressing", "ZR", "-", "75", "-", "30", "cells", "and", "CDK12", "-", "knockdown", "BT474", "cells", "were", "analysed", "by", "qRT", "-", "PCR", ".", "Mean", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "P", "-", "values", "were", "calculated", "using", "a", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "F", "Effect", "of", "WNT", "/", "β", "-", "catenin", "/", "TCF", "pathway", "on", "the", "CDK12", "regulation", "of", "breast", "CSCs", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "DMSO", "(", "vehicle", ")", "or", "10", "nM", "FH535", ",", "a", "β", "-", "catenin", "/", "TCF", "inhibitor", ",", "for", "24", "h", ",", "and", "changes", "in", "the", "CD44", "+", "/", "CD24", "-", "/", "ESA", "+", "cell", "population", "were", "measured", "using", "FACS", "analysis", ".", "Cells", "seen", "at", "lower", "right", "quadrant", "in", "the", "dot", "plots", "indicate", "CD44", "+", "/", "CD24", "-", "population", "(", "red", ")", "and", "CD44", "+", "/", "CD24", "-", "/", "ESA", "+", "population", "(", "blue", ")", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "ofP", "-", "value", "was", "calculated", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "a", "post", "-", "hoc", "LSD", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A Western blot and qRT-PCR results showing phosphorylation levels of GSK-3β and WNT1 and WNT3 expression, respectively, in the indicated cell lines. Mean ± s.d. (n = 3). P-values by two-tailed Student's t-test. a/a, CDK12-amplified/HER2-amplified cells; n/a, CDK12 non-amplified/HER2-amplified cells; S, trastuzumab-sensitiveSubcellular localization of β-catenin in the indicated stable cell lines were analysed by cellular fractionation (B)Subcellular localization of β-catenin in the indicated stable cell lines were analysed by immunofluorescence staining (C). Nuclear translocation of β-catenin in control, CDK12-overexpressing, and CDK12-knockdown stable cell lines was quantified by counting the cells harboring exclusively nuclear β-catenin (N) from the immunofluorescence image. Mean ± s.d. (n = 3). P-value was calculated using a two-tailed Student's t-test. M+C, cells containing membrane and/or cytoplasmic β-catenin; N, cells dominantly expressing nuclear β-catenin. Green, β-catenin staining; Blue, DAPI staining for visualization of nucleus; Scale bar = 10 μ. a/a, CDK12-amplified/HER2-amplified cells; n/a, CDK12 non-amplified/HER2-amplified cells; S, trastuzumab-sensitive.D Luciferase-reporter assay measuring the TCF/ lymphoid enhancer-binding factor-promoter activity in the indicated cell lines. TOP, pTOP-flash (wild-type TCF-binding sites), FOP, pFOP-flash (mutant TCF-binding sites). Data represent the mean ± s.d. P-values were calculated using a two-tailed Student's t-test.E The mRNA levels of the WNT/β-catenin/TCF-target genes in CDK12-overexpressing ZR-75-30 cells and CDK12-knockdown BT474 cells were analysed by qRT-PCR. Mean ± s.d. (n = 3). P-values were calculated using a two-tailed Student's t-test.F Effect of WNT/ β-catenin/TCF pathway on the CDK12 regulation of breast CSCs. Cells were treated with DMSO (vehicle) or 10 nM FH535, a β-catenin/TCF inhibitor, for 24 h, and changes in the CD44+/CD24-/ESA+ cell population were measured using FACS analysis. Cells seen at lower right quadrant in the dot plots indicate CD44+/CD24- population (red) and CD44+/CD24-/ESA+ population (blue). Data represent the mean ± s.d. ofP-value was calculated using one-way ANOVA with a post-hoc LSD test."}
{"words": ["Figure", "5A", "Human", "phospho", "-", "RTK", "array", "displaying", "the", "activation", "of", "phosphokinase", "-", "related", "proteins", "in", "CDK12", "-", "knockdown", "BT474", "cells", ".", "The", "bar", "graph", "shows", "the", "fold", "change", "of", "spot", "intensity", ".", "Cell", "line", "information", ":", "a", "/", "a", ",", "CDK12", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", "S", ",", "trastuzumab", "-", "sensitive", ".", "B", "Immunoblots", "showing", "the", "levels", "of", "the", "indicated", "proteins", "in", "different", "types", "of", "HER2", "+", "breast", "cancer", "stably", "expressing", "CDK12", "or", "with", "CDK12", "knocked", "down", ".", "Cell", "line", "information", ":", "a", "/", "a", ",", "CDK12", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", ";", "n", "/", "a", ",", "CDK12", "non", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", ";", "R", ",", "trastuzumab", "-", "resistant", ";", "PR", ",", "trastuzumab", "-", "partial", "responsive", ";", "S", ",", "trastuzumab", "-", "sensitive", ".", "Co", "-", "IP", "analysis", "showing", "the", "amounts", "of", "bindings", "between", "ErbB", "receptors", ".", "Cell", "lysates", "from", "CDK12", "-", "overexpressing", "ZR", "-", "75", "-", "30", "cells", "were", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "HER2", "antibody", "and", "immunoblotted", "using", "the", "indicated", "antibodies", ".", "IgG", ",", "negative", "control", ".", "Cell", "line", "information", ":", ";", "n", "/", "a", ",", "CDK12", "non", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", "S", ",", "trastuzumab", "-", "sensitive", ".", "D", "Western", "blot", "and", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "the", "phosphorylation", "levels", "and", "expression", "of", "IRS1", ",", "respectively", ",", "in", "the", "indicated", "cell", "lines", ".", "Mean", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "P", "-", "values", "were", "calculated", "using", "a", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Cell", "line", "information", ":", "a", "/", "a", ",", "CDK12", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", ";", "n", "/", "a", ",", "CDK12", "non", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", ";", "R", ",", "trastuzumab", "-", "resistant", "S", ",", "trastuzumab", "-", "sensitive", ".", "E", "Co", "-", "IP", "analysis", "indicating", "the", "amounts", "of", "IRS1", "protein", "interaction", "with", "ErbB", "receptors", "and", "p85", "in", "CDK12", "-", "overexpressing", "ZR", "-", "75", "-", "30", "cells", ".", "Cell", "line", "information", "n", "/", "a", ",", "CDK12", "non", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", "S", ",", "trastuzumab", "-", "sensitive", ".", "F", "IRS1", "effect", "on", "CDK12", "-", "induced", "phosphorylation", "of", "ErbB", "receptors", ".", "Lysates", "from", "cells", "treated", "with", "either", "control", "siRNA", "or", "IRS1", "siRNA", "(", "siIRS1", ")", "for", "24", "h", "were", "subjected", "to", "immunoblotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Cell", "line", "information", ":", "n", "/", "a", ",", "CDK12", "non", "-", "amplified", "/", "HER2", "-", "amplified", "cells", "S", ",", "trastuzumab", "-", "sensitive", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A Human phospho-RTK array displaying the activation of phosphokinase-related proteins in CDK12-knockdown BT474 cells. The bar graph shows the fold change of spot intensity. Cell line information: a/a, CDK12-amplified/HER2-amplified cells S, trastuzumab-sensitive.B Immunoblots showing the levels of the indicated proteins in different types of HER2+ breast cancer stably expressing CDK12 or with CDK12 knocked down. Cell line information: a/a, CDK12-amplified/HER2-amplified cells; n/a, CDK12 non-amplified/HER2-amplified cells; R, trastuzumab-resistant; PR, trastuzumab-partial responsive; S, trastuzumab-sensitive.Co-IP analysis showing the amounts of bindings between ErbB receptors. Cell lysates from CDK12-overexpressing ZR-75-30 cells were immunoprecipitated with anti-HER2 antibody and immunoblotted using the indicated antibodies. IgG, negative control. Cell line information: ; n/a, CDK12 non-amplified/HER2-amplified cells S, trastuzumab-sensitive.D Western blot and qRT-PCR analysis of the phosphorylation levels and expression of IRS1, respectively, in the indicated cell lines. Mean ± s.d. (n = 3). P-values were calculated using a two-tailed Student's t-test. Cell line information: a/a, CDK12-amplified/HER2-amplified cells; n/a, CDK12 non-amplified/HER2-amplified cells; R, trastuzumab-resistant S, trastuzumab-sensitive.E Co-IP analysis indicating the amounts of IRS1 protein interaction with ErbB receptors and p85 in CDK12-overexpressing ZR-75-30 cells. Cell line information n/a, CDK12 non-amplified/HER2-amplified cells S, trastuzumab-sensitive.F IRS1 effect on CDK12-induced phosphorylation of ErbB receptors. Lysates from cells treated with either control siRNA or IRS1 siRNA (siIRS1) for 24 h were subjected to immunoblotting with the indicated antibodies. Cell line information: n/a, CDK12 non-amplified/HER2-amplified cells S, trastuzumab-sensitive."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", "-", "F", ")", "Basal", "views", "through", "living", "SCs", ",", "with", "dashed", "white", "circles", "approximating", "the", "outline", "of", "a", "single", "SC", ",", "and", "acidic", "compartments", "marked", "by", "the", "vital", "dye", "LysoTracker", "®", "Red", "(", "magenta", ")", ".", "In", "merge", "images", ",", "a", "single", "non", "-", "acidic", "(", "C", ",", "D", ",", "F", ")", "and", "acidic", "(", "E", ")", "compartment", "containing", "intraluminal", "vesicles", "(", "ILVs", ")", "is", "boxed", "and", "magnified", "in", "the", "right", "panel", "(", "Zoom", ")", ".", "ILVs", "appear", "as", "membrane", "-", "delineated", "vesicles", ",", "using", "super", "-", "resolution", "3D", "-", "structured", "illumination", "(", "3D", "-", "SIM", ")", "microscopy", "for", "the", "brighter", "overexpressed", "GFP", "-", "tagged", "constructs", "(", "yellow", ";", "C", "and", "F", ")", ".", "However", ",", "ILVs", "appear", "only", "as", "puncta", ",", "using", "lower", "resolution", "wide", "-", "field", "microscopy", "for", "the", "fainter", "endogenously", "expressed", "YFP", "-", "tagged", "Rab", "GTPases", "(", "yellow", ";", "D", "and", "E", ")", ".", "(", "B", ")", "Wide", "-", "field", "fluorescence", "image", ",", "including", "differential", "interference", "contrast", "(", "DIC", ")", ",", "of", "SC", "expressing", "a", "GFP", "-", "tagged", "version", "of", "human", "CD63", "(", "CD63", "-", "GFP", ")", ".", "CD63", "-", "GFP", "expression", "is", "apparent", "on", "the", "limiting", "membranes", "of", "non", "-", "acidic", "compartments", "and", "their", "ILVs", ",", "and", "also", "on", "the", "limiting", "membranes", "of", "the", "enlarged", "acidic", "compartments", ".", "Most", "large", "non", "-", "acidic", "compartments", "are", "Rab11", "-", "positive", "(", "D", ")", "and", "contain", "dense", "-", "core", "granules", ",", "which", "have", "a", "'", "fried", "egg", "'", "appearance", "with", "DIC", "(", "arrowheads", ")", "(", "Corrigan", "et", "al", ".", ",", "2014", ";", "Redhai", "et", "al", ".", ",", "2016", ")", ".", "(", "C", ")", "3D", "-", "SIM", "image", "of", "CD63", "-", "GFP", "-", "expressing", "SC", ".", "Arrow", "highlights", "CD63", "-", "GFP", "-", "marked", "ILVs", "(", "Zoom", ")", ".", "Many", "more", "ILVs", "are", "apparent", "in", "non", "-", "acidic", "compartments", "in", "a", "complete", "Z", "-", "stack", "of", "a", "non", "-", "acidic", "compartment", "(", "Movie", "EV1", ")", ".", "(", "D", ")", "Wide", "-", "field", "fluorescence", "image", "of", "an", "SC", "expressing", "a", "YFP", "-", "Rab11", "gene", "trap", ".", "YFP", "-", "Rab11", "marks", "the", "limiting", "membranes", "of", "most", "non", "-", "acidic", "compartments", "and", "internal", "puncta", "(", "arrow", "in", "Zoom", ")", ",", "but", "not", "the", "surface", "of", "acidic", "compartments", "(", "Appendix", "Fig", "S1B", ")", ".", "(", "E", ")", "Wide", "-", "field", "fluorescence", "image", "of", "SC", "expressing", "a", "YFP", "-", "Rab7", "gene", "trap", ".", "YFP", "-", "Rab7", "marks", "the", "limiting", "membranes", "of", "acidic", "compartments", "and", "internal", "puncta", "(", "arrow", "in", "Zoom", ")", ".", "Enlarged", "acidic", "compartments", "are", "also", "present", "in", "adjacent", "main", "cells", ".", "(", "F", ")", "3D", "-", "SIM", "image", "of", "SC", "expressing", "a", "GFP", "-", "tagged", "version", "of", "Breathless", "(", "Btl", "-", "GFP", ")", ".", "Btl", "-", "GFP", "marks", "the", "limiting", "membranes", "of", "non", "-", "acidic", "compartments", "and", "their", "ILVs", "(", "arrow", "in", "Zoom", ")", ",", "but", "not", "the", "surface", "of", "acidic", "compartments", "(", "Appendix", "Fig", "S1C", ")", ".", "Images", "from", "six", "-", "day", "-", "old", "male", "flies", "shifted", "to", "29", "°", "C", "at", "eclosion", ".", "This", "induces", "GAL4", "/", "UAS", "-", "dependent", "SC", "transgene", "expression", "in", "(", "B", ")", ",", "(", "C", ")", "and", "(", "F", ")", ".", "The", "genotypes", "of", "flies", "carrying", "multiple", "transgenes", "are", ":", "w", ";", "P", "[", "w", "+", ",", "UAS", "-", "CD63", "-", "GFP", "]", "P", "[", "w", "+", ",", "tub", "-", "GAL80ts", "]", "/", "+", ";", "dsx", "-", "GAL4", "/", "+", "(", "B", ",", "C", ")", ";", "w", ";", "P", "[", "w", "+", ",", "tub", "-", "GAL80ts", "]", "/", "+", ";", "dsx", "-", "GAL4", "/", "P", "[", "w", "+", ",", "UAS", "-", "btl", "-", "GFP", "]", "(", "F", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B-F) Basal views through living SCs, with dashed white circles approximating the outline of a single SC, and acidic compartments marked by the vital dye LysoTracker® Red (magenta). In merge images, a single non-acidic (C, D, F) and acidic (E) compartment containing intraluminal vesicles (ILVs) is boxed and magnified in the right panel (Zoom). ILVs appear as membrane-delineated vesicles, using super-resolution 3D-structured illumination (3D-SIM) microscopy for the brighter overexpressed GFP-tagged constructs (yellow; C and F). However, ILVs appear only as puncta, using lower resolution wide-field microscopy for the fainter endogenously expressed YFP-tagged Rab GTPases (yellow; D and E). (B) Wide-field fluorescence image, including differential interference contrast (DIC), of SC expressing a GFP-tagged version of human CD63 (CD63-GFP). CD63-GFP expression is apparent on the limiting membranes of non-acidic compartments and their ILVs, and also on the limiting membranes of the enlarged acidic compartments. Most large non-acidic compartments are Rab11-positive (D) and contain dense-core granules, which have a 'fried egg' appearance with DIC (arrowheads) (Corrigan et al., 2014; Redhai et al., 2016). (C) 3D-SIM image of CD63-GFP-expressing SC. Arrow highlights CD63-GFP-marked ILVs (Zoom). Many more ILVs are apparent in non-acidic compartments in a complete Z-stack of a non-acidic compartment (Movie EV1). (D) Wide-field fluorescence image of an SC expressing a YFP-Rab11 gene trap. YFP-Rab11 marks the limiting membranes of most non-acidic compartments and internal puncta (arrow in Zoom), but not the surface of acidic compartments (Appendix Fig S1B). (E) Wide-field fluorescence image of SC expressing a YFP-Rab7 gene trap. YFP-Rab7 marks the limiting membranes of acidic compartments and internal puncta (arrow in Zoom). Enlarged acidic compartments are also present in adjacent main cells. (F) 3D-SIM image of SC expressing a GFP-tagged version of Breathless (Btl-GFP). Btl-GFP marks the limiting membranes of non-acidic compartments and their ILVs (arrow in Zoom), but not the surface of acidic compartments (Appendix Fig S1C). Images from six-day-old male flies shifted to 29°C at eclosion. This induces GAL4/UAS-dependent SC transgene expression in (B), (C) and (F). The genotypes of flies carrying multiple transgenes are: w; P[w+, UAS-CD63-GFP] P[w+, tub-GAL80ts]/+; dsx-GAL4/+ (B, C); w; P[w+, tub-GAL80ts]/+; dsx-GAL4/P[w+, UAS-btl-GFP] (F)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", "-", "D", ")", "Wide", "-", "field", "fluorescence", "images", "of", "basal", "views", "through", "living", "SCs", "expressing", "a", "GFP", "-", "tagged", "form", "of", "Btl", "-", "GFP", "(", "yellow", ")", "in", "non", "-", "acidic", "compartments", ",", "with", "SC", "outline", "approximated", "by", "dashed", "white", "circles", ".", "Acidic", "compartments", "are", "marked", "by", "LysoTracker", "Red", "®", "(", "magenta", ")", ".", "Boxed", "non", "-", "acidic", "compartments", "in", "merge", "images", "are", "magnified", "in", "A", "-", "D", ",", "Zoom", ".", "On", "the", "right", ",", "lower", "magnification", "confocal", "transverse", "images", "of", "fixed", "accessory", "gland", "(", "AG", ")", "lumens", "are", "shown", "with", "dotted", "lines", "indicating", "the", "basal", "side", "of", "the", "AG", "epithelial", "layer", ",", "which", "contains", "several", "fluorescent", "SCs", "(", "highlighted", "by", "arrows", ")", ".", "(", "A", ")", "SC", "with", "no", "RNAi", "construct", "expressed", "(", "control", ")", "and", "AG", "lumen", "from", "same", "genotype", ".", "Btl", "-", "GFP", "-", "positive", "compartments", "containing", "fluorescent", "ILVs", "(", "in", "Btl", "-", "GFP", "panel", ")", ",", "ILV", "membranes", "inside", "compartments", "(", "in", "Zoom", "panel", ")", "and", "secreted", "fluorescent", "puncta", "(", "AG", "lumen", "panel", ")", "are", "marked", "by", "arrowheads", ".", "(", "B", ")", "SC", "also", "expressing", "RNAi", "construct", "targeting", "ESCRT", "-", "0", "subunit", ",", "Stam", ",", "and", "AG", "lumen", "from", "same", "genotype", ".", "Btl", "-", "GFP", "-", "positive", "ILVs", "(", "Zoom", ")", "and", "secreted", "puncta", "(", "AG", "lumen", ")", "are", "strongly", "reduced", ".", "(", "C", ")", "SC", "also", "expressing", "RNAi", "construct", "targeting", "ESCRT", "-", "I", "subunit", ",", "Vps28", ",", "and", "AG", "lumen", "from", "same", "genotype", ".", "Btl", "-", "GFP", "-", "positive", "ILVs", "(", "Zoom", ")", "and", "secreted", "puncta", "(", "AG", "lumen", ")", "are", "strongly", "reduced", ".", "(", "D", ")", "SC", "also", "expressing", "RNAi", "construct", "targeting", "ESCRT", "-", "III", "subunit", ",", "shrb", ",", "and", "AG", "lumen", "from", "same", "genotype", ".", "Btl", "-", "GFP", "-", "positive", "ILVs", "(", "Zoom", ")", "and", "secreted", "puncta", "are", "strongly", "reduced", ".", "Genotypes", "are", ":", "w", ";", "P", "[", "w", "+", ",", "tub", "-", "GAL80ts", "]", "/", "+", ";", "dsx", "-", "GAL4", "/", "P", "[", "w", "+", ",", "UAS", "-", "btl", "-", "GFP", "]", "with", "no", "knockdown", "construct", "(", "A", ")", ",", "UAS", "-", "Stam", "-", "RNAi", "(", "HMS01429", ";", "B", ")", ",", "UAS", "-", "Vps28", "-", "RNAi", "(", "v31894", ";", "C", ")", "or", "UAS", "-", "shrb", "-", "RNAi", "(", "v106823", ";", "D", ")", ".", "(", "E", ")", "Bar", "chart", "showing", "the", "number", "of", "large", "(", "diameter", "greater", "than", "one", "micrometre", ")", "non", "-", "acidic", "Btl", "-", "GFP", "-", "positive", "compartments", "per", "SC", ".", "Data", "from", "39", "SCs", "(", "three", "per", "gland", ")", "are", "shown", ".", "(", "F", ")", "Bar", "chart", "showing", "percentage", "of", "these", "large", "Btl", "-", "GFP", "compartments", "containing", "Btl", "-", "GFP", "-", "positive", "ILVs", "in", "control", "and", "ESCRT", "knockdown", "SCs", ".", "Data", "from", "39", "SCs", "(", "three", "per", "gland", ")", "are", "shown", ".", "(", "G", ")", "Bar", "chart", "showing", "the", "total", "number", "of", "Btl", "-", "GFP", "fluorescent", "puncta", "in", "ten", "Z", "-", "planes", "from", "the", "AG", "lumen", "following", "ESCRT", "knockdown", "in", "SCs", ",", "compared", "to", "controls", "without", "knockdown", ".", "Data", "from", "at", "least", "17", "AG", "lumens", "per", "condition", "are", "shown", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A-D) Wide-field fluorescence images of basal views through living SCs expressing a GFP-tagged form of Btl-GFP (yellow) in non-acidic compartments, with SC outline approximated by dashed white circles. Acidic compartments are marked by LysoTracker Red® (magenta). Boxed non-acidic compartments in merge images are magnified in A-D, Zoom. On the right, lower magnification confocal transverse images of fixed accessory gland (AG) lumens are shown with dotted lines indicating the basal side of the AG epithelial layer, which contains several fluorescent SCs (highlighted by arrows). (A) SC with no RNAi construct expressed (control) and AG lumen from same genotype. Btl-GFP-positive compartments containing fluorescent ILVs (in Btl-GFP panel), ILV membranes inside compartments (in Zoom panel) and secreted fluorescent puncta (AG lumen panel) are marked by arrowheads. (B) SC also expressing RNAi construct targeting ESCRT-0 subunit, Stam, and AG lumen from same genotype. Btl-GFP-positive ILVs (Zoom) and secreted puncta (AG lumen) are strongly reduced. (C) SC also expressing RNAi construct targeting ESCRT-I subunit, Vps28, and AG lumen from same genotype. Btl-GFP-positive ILVs (Zoom) and secreted puncta (AG lumen) are strongly reduced. (D) SC also expressing RNAi construct targeting ESCRT-III subunit, shrb, and AG lumen from same genotype. Btl-GFP-positive ILVs (Zoom) and secreted puncta are strongly reduced. Genotypes are: w; P[w+, tub-GAL80ts]/+; dsx-GAL4/P[w+, UAS-btl-GFP] with no knockdown construct (A), UAS-Stam-RNAi (HMS01429; B), UAS-Vps28-RNAi (v31894; C) or UAS-shrb-RNAi (v106823; D).(E) Bar chart showing the number of large (diameter greater than one micrometre) non-acidic Btl-GFP-positive compartments per SC. Data from 39 SCs (three per gland) are shown.(F) Bar chart showing percentage of these large Btl-GFP compartments containing Btl-GFP-positive ILVs in control and ESCRT knockdown SCs. Data from 39 SCs (three per gland) are shown.(G) Bar chart showing the total number of Btl-GFP fluorescent puncta in ten Z-planes from the AG lumen following ESCRT knockdown in SCs, compared to controls without knockdown. Data from at least 17 AG lumens per condition are shown."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", "-", "D", ")", "Confocal", "images", "of", "fixed", "HCT116", "cells", ",", "with", "boxed", "regions", "enlarged", "to", "the", "right", ".", "DAPI", "(", "grey", ")", "marks", "nucleus", ".", "Rab11a", "antibody", "is", "isoform", "-", "specific", "except", "in", "(", "F", ")", ".", "(", "A", ")", "Rab11a", "(", "yellow", ")", "is", "located", "in", "compartments", "distinct", "from", "the", "late", "endosomal", "and", "lysosomal", "marker", ",", "LAMP2", "(", "magenta", ")", ".", "(", "B", ")", "CD63", "(", "magenta", ")", "predominantly", "co", "-", "localises", "with", "the", "late", "endosomal", "and", "lysosomal", "marker", ",", "LAMP1", "(", "yellow", ")", ".", "(", "C", ")", "Rab11a", "(", "yellow", ")", "is", "located", "in", "compartments", "distinct", "from", "CD63", "(", "magenta", ")", "under", "glutamine", "-", "replete", "conditions", ".", "(", "D", ")", "Rab11a", "(", "yellow", ")", "is", "located", "in", "compartments", "distinct", "from", "CD63", "(", "magenta", ")", "under", "glutamine", "-", "depleted", "conditions", ".", "(", "E", ")", "Super", "-", "resolution", "3D", "-", "SIM", "image", "of", "fixed", "HCT116", "cell", "expressing", "GFP", "-", "Rab11a", "(", "yellow", ")", ",", "and", "stained", "with", "CD63", "(", "magenta", ")", ".", "DAPI", "(", "grey", ")", "marks", "nucleus", ".", "Boxed", "Rab11a", "-", "positive", "compartments", ",", "which", "frequently", "cluster", ",", "are", "magnified", "in", "Merge", "Zoom", ".", "This", "panel", "is", "further", "magnified", "in", "Merge", "Zoom", "x", "2", ",", "revealing", "GFP", "-", "Rab11a", "(", "arrows", "in", "right", "panel", ")", "inside", "compartments", ".", "(", "F", ")", "Wide", "-", "field", "fluorescence", "image", "of", "fixed", "HCT116", "cells", ",", "stained", "with", "Rab11a", "(", "yellow", ")", "and", "Rab7", "(", "magenta", ")", ",", "expressing", "constitutively", "active", "GFP", "-", "tagged", "Rab5", "(", "GFP", "-", "Rab5CA", ";", "cyan", ")", ",", "which", "stalls", "endosomal", "maturation", "and", "produces", "enlarged", "Rab5", "-", "positive", "endosomes", ".", "One", "of", "these", "is", "boxed", "in", "the", "Merge", "and", "magnified", "in", "Merge", "Zoom", ",", "revealing", "internal", "puncta", "marked", "by", "Rab11a", "(", "arrows", ")", "and", "Rab7", "(", "arrowheads", ")", "and", "limiting", "membrane", "subdomains", "of", "Rab11a", "(", "yellow", "arrowhead", ")", "and", "Rab7", "(", "magenta", "arrowhead", ")", ".", "DAPI", "(", "grey", ")", "marks", "nuclei", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A-D) Confocal images of fixed HCT116 cells, with boxed regions enlarged to the right. DAPI (grey) marks nucleus. Rab11a antibody is isoform-specific except in (F). (A) Rab11a (yellow) is located in compartments distinct from the late endosomal and lysosomal marker, LAMP2 (magenta). (B) CD63 (magenta) predominantly co-localises with the late endosomal and lysosomal marker, LAMP1 (yellow). (C) Rab11a (yellow) is located in compartments distinct from CD63 (magenta) under glutamine-replete conditions. (D) Rab11a (yellow) is located in compartments distinct from CD63 (magenta) under glutamine-depleted conditions.(E) Super-resolution 3D-SIM image of fixed HCT116 cell expressing GFP-Rab11a (yellow), and stained with CD63 (magenta). DAPI (grey) marks nucleus. Boxed Rab11a-positive compartments, which frequently cluster, are magnified in Merge Zoom. This panel is further magnified in Merge Zoom x 2, revealing GFP-Rab11a (arrows in right panel) inside compartments.(F) Wide-field fluorescence image of fixed HCT116 cells, stained with Rab11a (yellow) and Rab7 (magenta), expressing constitutively active GFP-tagged Rab5 (GFP-Rab5CA; cyan), which stalls endosomal maturation and produces enlarged Rab5-positive endosomes. One of these is boxed in the Merge and magnified in Merge Zoom, revealing internal puncta marked by Rab11a (arrows) and Rab7 (arrowheads) and limiting membrane subdomains of Rab11a (yellow arrowhead) and Rab7 (magenta arrowhead). DAPI (grey) marks nuclei."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "putative", "exosome", "markers", "in", "lysates", "from", "HCT116", "cells", "cultured", "in", "glutamine", "-", "replete", "(", "2", ".", "00", "mM", ")", "and", "glutamine", "-", "depleted", "(", "0", ".", "15", "mM", ")", "medium", "for", "24", "h", ".", "Gel", "was", "loaded", "with", "equal", "amounts", "of", "protein", "(", "total", "cell", "lysate", "protein", "was", "reduced", "by", "19", "±", "4", "%", "after", "glutamine", "depletion", ")", ".", "The", "activity", "of", "mTORC1", "was", "assessed", "via", "phosphorylation", "of", "S6", "and", "4E", "-", "BP1", ",", "using", "phospho", "-", "specific", "antibodies", "and", "a", "pan", "-", "4E", "-", "BP1", "antibody", ",", "where", "the", "hyper", "-", "phosphorylated", "form", "of", "4E", "-", "BP1", "produced", "by", "mTORC1", "gives", "the", "slowest", "migrating", "γ", "band", ".", "Bar", "chart", "shows", "the", "abundance", "of", "putative", "exosome", "proteins", "relative", "to", "tubulin", "in", "these", "lysates", ".", "Western", "blot", "analyses", "of", "EV", "preparations", ".", "(", "B", ")", "EVs", "isolated", "by", "ultracentrifugation", "(", "UC", ")", "of", "medium", "from", "HCT116", "cells", "cultured", "in", "glutamine", "-", "replete", "and", "-", "depleted", "conditions", "for", "24", "h", ",", "and", "loaded", "according", "to", "cell", "lysate", "protein", "levels", "to", "compare", "secretion", "on", "a", "per", "cell", "basis", ",", "as", "shown", "in", "bar", "chart", "from", "four", "biological", "replicates", ".", "Western", "blot", "analyses", "of", "EV", "preparations", ".", "(", "C", ")", "EV", "preparation", "isolated", "by", "size", "-", "exclusion", "chromatography", "(", "SEC", ")", "from", "glutamine", "-", "depleted", "HCT116", "cells", "and", "then", "separated", "by", "high", "-", "resolution", "iodixanol", "-", "PBS", "density", "centrifugation", ".", "Note", "that", "exosomes", "(", "exos", ")", "and", "microvesicles", "(", "MVs", ")", "are", "found", "in", "only", "partially", "overlapping", "fractions", "and", "the", "pattern", "of", "Rab11a", "separation", "mirrors", "that", "of", "exosome", "markers", "(", "primarily", "1", ".", "064", "-", "1", ".", "085", "g", "/", "ml", ")", ".", "Western", "blot", "analyses", "of", "EV", "preparations", ".", "(", "D", ")", "EVs", "isolated", "by", "UC", "under", "glutamine", "-", "depleted", "conditions", "as", "in", "(", "B", ")", "and", "then", "subjected", "to", "Proteinase", "K", "(", "Prot", "K", ")", "digestion", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "Triton", "®", "X", "-", "100", "(", "Triton", "-", "X", ")", ".", "Only", "membrane", "-", "associated", "CD81", "is", "digested", "in", "the", "absence", "of", "Triton", "®", "X", "-", "100", ",", "while", "CD63", "is", "resistant", "to", "digestion", ",", "even", "in", "the", "presence", "of", "Triton", "®", "X", "-", "100", ".", "Western", "blot", "analyses", "of", "EV", "preparations", ".", "EVs", "isolated", "under", "glutamine", "-", "depleted", "conditions", "were", "immunocaptured", "with", "anti", "-", "CD63", "antibodies", "coupled", "to", "magnetic", "beads", ".", "This", "method", "only", "pulls", "down", "a", "fraction", "of", "CD63", ",", "so", "the", "protein", "from", "pull", "-", "down", "of", "eight", "times", "the", "input", "is", "loaded", "for", "comparison", ".", "Approximately", "the", "same", "low", "levels", "of", "Rab11a", "are", "captured", "by", "control", "IgG", "and", "anti", "-", "CD63", "beads", ".", "Western", "blot", "analyses", "of", "EV", "preparations", ".", "(", "F", ")", "EVs", "isolated", "under", "glutamine", "-", "depleted", "conditions", "were", "immunocaptured", "with", "anti", "-", "CD81", "antibodies", "coupled", "to", "magnetic", "beads", ".", "All", "or", "most", "CD63", "and", "CD81", "appears", "to", "be", "pulled", "down", ",", "but", "less", "than", "10", "%", "of", "Rab11a", "and", "Cav", "-", "1", "is", "captured", ".", "NTA", "analysis", "suggests", "about", "10", "%", "of", "all", "particles", "are", "pulled", "down", "with", "this", "approach", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Western blot analysis of putative exosome markers in lysates from HCT116 cells cultured in glutamine-replete (2.00 mM) and glutamine-depleted (0.15 mM) medium for 24 h. Gel was loaded with equal amounts of protein (total cell lysate protein was reduced by 19 ± 4 % after glutamine depletion). The activity of mTORC1 was assessed via phosphorylation of S6 and 4E-BP1, using phospho-specific antibodies and a pan-4E-BP1 antibody, where the hyper-phosphorylated form of 4E-BP1 produced by mTORC1 gives the slowest migrating γ band. Bar chart shows the abundance of putative exosome proteins relative to tubulin in these lysates.Western blot analyses of EV preparations. (B) EVs isolated by ultracentrifugation (UC) of medium from HCT116 cells cultured in glutamine-replete and -depleted conditions for 24 h, and loaded according to cell lysate protein levels to compare secretion on a per cell basis, as shown in bar chart from four biological replicates.Western blot analyses of EV preparations. (C) EV preparation isolated by size-exclusion chromatography (SEC) from glutamine-depleted HCT116 cells and then separated by high-resolution iodixanol-PBS density centrifugation. Note that exosomes (exos) and microvesicles (MVs) are found in only partially overlapping fractions and the pattern of Rab11a separation mirrors that of exosome markers (primarily 1.064 - 1.085 g/ml).Western blot analyses of EV preparations. (D) EVs isolated by UC under glutamine-depleted conditions as in (B) and then subjected to Proteinase K (Prot K) digestion in the presence or absence of Triton® X-100 (Triton-X). Only membrane-associated CD81 is digested in the absence of Triton® X-100, while CD63 is resistant to digestion, even in the presence of Triton® X-100.Western blot analyses of EV preparations. EVs isolated under glutamine-depleted conditions were immunocaptured with anti-CD63 antibodies coupled to magnetic beads. This method only pulls down a fraction of CD63, so the protein from pull-down of eight times the input is loaded for comparison. Approximately the same low levels of Rab11a are captured by control IgG and anti-CD63 beads.Western blot analyses of EV preparations. (F) EVs isolated under glutamine-depleted conditions were immunocaptured with anti-CD81 antibodies coupled to magnetic beads. All or most CD63 and CD81 appears to be pulled down, but less than 10% of Rab11a and Cav-1 is captured. NTA analysis suggests about 10% of all particles are pulled down with this approach."}
{"words": ["Figure", "5Western", "blot", "analyses", "of", "EV", "preparations", ".", "Gel", "loading", "is", "normalised", "to", "cell", "lysate", "protein", "levels", ".", "Bar", "charts", "present", "changes", "in", "levels", "of", "putative", "exosome", "proteins", "relative", "to", "cell", "lysate", "protein", "(", "A", ")", "EVs", "isolated", "by", "UC", "of", "medium", "from", "HeLa", "cells", "cultured", "in", "glutamine", "-", "replete", "(", "2", ".", "00", "mM", ")", "and", "-", "depleted", "(", "0", ".", "02", "mM", ")", "conditions", "for", "24", "h", "(", "see", "Appendix", "Fig", "S7A", "'", "'", "for", "analysis", "of", "SEC", "-", "isolated", "EVs", ")", ".", "Western", "blot", "analyses", "of", "EV", "preparations", ".", "Gel", "loading", "is", "normalised", "to", "cell", "lysate", "protein", "levels", ".", "Bar", "charts", "present", "changes", "in", "levels", "of", "putative", "exosome", "proteins", "relative", "to", "cell", "lysate", "protein", "(", "B", ")", "EVs", "isolated", "by", "size", "-", "exclusion", "chromatography", "(", "SEC", ";", "fractions", "two", "to", "seven", ")", "from", "LNCaP", "cells", "cultured", "in", "glutamine", "-", "replete", "(", "2", ".", "00", "mM", ")", "and", "-", "depleted", "(", "0", ".", "02", "mM", ")", "conditions", "for", "24Western", "blot", "analyses", "of", "EV", "preparations", ".", "Gel", "loading", "is", "normalised", "to", "cell", "lysate", "protein", "levels", ".", "Bar", "charts", "present", "changes", "in", "levels", "of", "putative", "exosome", "proteins", "relative", "to", "cell", "lysate", "protein", "(", "C", ")", "EVs", "isolated", "by", "SEC", "from", "LNCaP", "cells", "cultured", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "120", "nM", "Torin", "1", "for", "24", "h", ".", "Western", "blot", "analyses", "of", "EV", "preparations", ".", "Gel", "loading", "is", "normalised", "to", "cell", "lysate", "protein", "levels", ".", "Bar", "charts", "present", "changes", "in", "levels", "of", "putative", "exosome", "proteins", "relative", "to", "cell", "lysate", "protein", "(", "D", ")", "EVs", "isolated", "by", "UC", "from", "HCT116", "cells", "cultured", "for", "24", "h", "following", "three", "days", "of", "raptor", "or", "non", "-", "targeting", "(", "NT", ")", "shRNA", "knockdown", ".", "Western", "blot", "analyses", "of", "EV", "preparations", ".", "Gel", "loading", "is", "normalised", "to", "cell", "lysate", "protein", "levels", ".", "Bar", "charts", "present", "changes", "in", "levels", "of", "putative", "exosome", "proteins", "relative", "to", "cell", "lysate", "protein", "(", "E", ")", "EVs", "isolated", "by", "SEC", "from", "HCT116", "cells", "cultured", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "3", "µM", "Akt", "inhibitor", "AZD5363", "for", "24", "h", ".", "Western", "blot", "analyses", "of", "EV", "preparations", ".", "Gel", "loading", "is", "normalised", "to", "cell", "lysate", "protein", "levels", ".", "(", "F", ")", "EVs", "isolated", "by", "SEC", "from", "HCT116", "cells", "cultured", "under", "glutamine", "-", "replete", "conditions", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "10", "µM", "KRAS", "inhibitor", "BI", "-", "2852", "(", "or", "control", "compound", "Bl2853", ")", "for", "24", "h", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Western blot analyses of EV preparations. Gel loading is normalised to cell lysate protein levels. Bar charts present changes in levels of putative exosome proteins relative to cell lysate protein (A) EVs isolated by UC of medium from HeLa cells cultured in glutamine-replete (2.00 mM) and -depleted (0.02 mM) conditions for 24 h (see Appendix Fig S7A'' for analysis of SEC-isolated EVs).Western blot analyses of EV preparations. Gel loading is normalised to cell lysate protein levels. Bar charts present changes in levels of putative exosome proteins relative to cell lysate protein (B) EVs isolated by size-exclusion chromatography (SEC; fractions two to seven) from LNCaP cells cultured in glutamine-replete (2.00 mM) and -depleted (0.02 mM) conditions for 24Western blot analyses of EV preparations. Gel loading is normalised to cell lysate protein levels. Bar charts present changes in levels of putative exosome proteins relative to cell lysate protein (C) EVs isolated by SEC from LNCaP cells cultured in the presence or absence of 120 nM Torin 1 for 24 h.Western blot analyses of EV preparations. Gel loading is normalised to cell lysate protein levels. Bar charts present changes in levels of putative exosome proteins relative to cell lysate protein (D) EVs isolated by UC from HCT116 cells cultured for 24 h following three days of raptor or non-targeting (NT) shRNA knockdown.Western blot analyses of EV preparations. Gel loading is normalised to cell lysate protein levels. Bar charts present changes in levels of putative exosome proteins relative to cell lysate protein (E) EVs isolated by SEC from HCT116 cells cultured in the presence or absence of 3 µM Akt inhibitor AZD5363 for 24 h.Western blot analyses of EV preparations. Gel loading is normalised to cell lysate protein levels. (F) EVs isolated by SEC from HCT116 cells cultured under glutamine-replete conditions in the presence or absence of 10 µM KRAS inhibitor BI-2852 (or control compound Bl2853) for 24 h."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Growth", "curves", "for", "HCT116", "recipient", "cells", "in", "reduced", "(", "1", "%", ")", "serum", "conditions", "following", "30", "min", "pre", "-", "incubation", "with", "EVs", "isolated", "by", "UC", "(", "104", "per", "cell", ";", "top", ")", "or", "by", "SEC", "(", "4", "x", "103", "per", "cell", ";", "bottom", ")", "from", "glutamine", "-", "replete", "and", "-", "depleted", "HCT116", "cells", "or", "with", "vehicle", "(", "PBS", ")", ".", "Fold", "change", "in", "confluency", "is", "a", "measure", "of", "cell", "area", "occupying", "well", "relative", "to", "zero", "time", ",", "as", "measured", "by", "IncuCyte", "software", ".", "(", "B", ")", "Cumulative", "tube", "length", "for", "HUVEC", "recipient", "cells", "following", "treatment", "with", "104", "EVs", "isolated", "by", "UC", "from", "glutamine", "-", "replete", "and", "-", "depleted", "HCT116", "cells", "or", "with", "vehicle", "(", "PBS", ")", ".", "Both", "EV", "preparations", "promote", "tubulation", ",", "but", "the", "network", "is", "more", "stable", "with", "EVs", "from", "glutamine", "-", "depleted", "HCT116", "cells", ".", "(", "C", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "EVs", "isolated", "by", "UC", "from", "HCT116", "cells", "cultured", "in", "glutamine", "-", "replete", "and", "-", "depleted", "medium", "for", "24", "h", ",", "following", "transduction", "with", "a", "Rab11a", "or", "control", "non", "-", "targeting", "(", "NT", ")", "shRNA", "knockdown", "construct", "over", "previous", "two", "days", ".", "Bar", "chart", "shows", "change", "in", "putative", "exosome", "proteins", "in", "EVs", "secreted", "from", "Rab11a", "knockdown", "cells", "relative", "to", "NT", "-", "treated", "cells", "in", "glutamine", "-", "depleted", "conditions", ",", "following", "initial", "normalisation", "to", "cell", "lysate", "protein", ".", "(", "C", "'", ")", "Growth", "curves", "are", "for", "HCT116", "recipient", "cells", "pre", "-", "treated", "with", "EVs", "isolated", "as", "in", "(", "C", ")", "or", "with", "vehicle", "(", "PBS", ")", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "colour", "denotes", "significant", "increase", "relative", "to", "EVs", "from", "glutamine", "-", "replete", "cells", "(", "black", ")", "and", "Rab11a", "knockdown", "cells", "(", "red", ")", ".", "(", "D", ")", "Left", "hand", "group", "of", "four", "images", "show", "cells", "grown", "in", "glutamine", "-", "replete", "(", "2", ".", "00", "mM", ")", "and", "glutamine", "-", "depleted", "(", "0", ".", "15", "mM", ")", "conditions", "for", "24", "h", ",", "then", "incubated", "with", "an", "anti", "-", "CD63", "antibody", "(", "yellow", ")", "for", "30", "min", "at", "4oC", ",", "washed", "with", "PBS", ",", "chased", "at", "37oC", "for", "30", "min", ",", "then", "fixed", ",", "immunostained", "and", "imaged", ".", "Right", "hand", "group", "of", "four", "images", "show", "cells", "grown", "in", "glutamine", "-", "replete", "and", "glutamine", "-", "depleted", "conditions", "for", "24", "h", ",", "incubated", "with", "Tfn", "-", "Alexa", "Fluor", "®", "488", "(", "yellow", ")", "for", "30", "min", "at", "4oC", ",", "shifted", "to", "37oC", "for", "30", "min", ",", "then", "washed", ",", "immediately", "fixed", "and", "imaged", ".", "(", "E", ")", "Western", "blot", "showing", "levels", "of", "anti", "-", "CD63", "heavy", "chain", "and", "biotin", "-", "conjugated", "Tfn", "in", "HCT116", "cells", "cultured", "for", "24", "h", "in", "glutamine", "-", "replete", "or", "-", "depleted", "conditions", ",", "incubated", "for", "30", "min", "in", "medium", "containing", "these", "molecules", "at", "4oC", ",", "then", "chased", "at", "37oC", "for", "15", "min", "(", "the", "chase", "step", "was", "not", "performed", "for", "Tfn", "in", "D", ",", "to", "reduce", "loss", "due", "to", "rapid", "recycling", "of", "Tfn", ")", ".", "(", "F", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "EVs", "isolated", "by", "UC", "from", "HCT116", "cells", "in", "glutamine", "-", "replete", "medium", ",", "transduced", "with", "a", "Rab7", "or", "non", "-", "targeting", "(", "NT", ")", "control", "shRNA", "knockdown", "construct", ".", "Bar", "charts", "show", "changes", "in", "putative", "exosome", "proteins", "in", "EVs", "isolated", "by", "ultracentrifugation", ",", "following", "normalisation", "to", "cell", "lysate", "protein", ".", "(", "F", "'", ")", "Growth", "curves", "are", "for", "HCT116", "recipient", "cells", "pre", "-", "treated", "with", "EVs", "isolated", "as", "in", "(", "F", ")", "or", "with", "vehicle", "(", "PBS", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Growth curves for HCT116 recipient cells in reduced (1%) serum conditions following 30 min pre-incubation with EVs isolated by UC (104 per cell; top) or by SEC (4 x 103 per cell; bottom) from glutamine-replete and -depleted HCT116 cells or with vehicle (PBS). Fold change in confluency is a measure of cell area occupying well relative to zero time, as measured by IncuCyte software.(B) Cumulative tube length for HUVEC recipient cells following treatment with 104 EVs isolated by UC from glutamine-replete and -depleted HCT116 cells or with vehicle (PBS). Both EV preparations promote tubulation, but the network is more stable with EVs from glutamine-depleted HCT116 cells.(C) Western blot analysis of EVs isolated by UC from HCT116 cells cultured in glutamine-replete and -depleted medium for 24 h, following transduction with a Rab11a or control non-targeting (NT) shRNA knockdown construct over previous two days. Bar chart shows change in putative exosome proteins in EVs secreted from Rab11a knockdown cells relative to NT-treated cells in glutamine-depleted conditions, following initial normalisation to cell lysate protein. (C') Growth curves are for HCT116 recipient cells pre-treated with EVs isolated as in (C) or with vehicle (PBS). ****P colour denotes significant increase relative to EVs from glutamine-replete cells (black) and Rab11a knockdown cells (red).(D) Left hand group of four images show cells grown in glutamine-replete (2.00 mM) and glutamine-depleted (0.15 mM) conditions for 24 h, then incubated with an anti-CD63 antibody (yellow) for 30 min at 4oC, washed with PBS, chased at 37oC for 30 min, then fixed, immunostained and imaged. Right hand group of four images show cells grown in glutamine-replete and glutamine-depleted conditions for 24 h, incubated with Tfn-Alexa Fluor® 488 (yellow) for 30 min at 4oC, shifted to 37oC for 30 min, then washed, immediately fixed and imaged.(E) Western blot showing levels of anti-CD63 heavy chain and biotin-conjugated Tfn in HCT116 cells cultured for 24 h in glutamine-replete or -depleted conditions, incubated for 30 min in medium containing these molecules at 4oC, then chased at 37oC for 15 min (the chase step was not performed for Tfn in D, to reduce loss due to rapid recycling of Tfn).(F) Western blot analysis of EVs isolated by UC from HCT116 cells in glutamine-replete medium, transduced with a Rab7 or non-targeting (NT) control shRNA knockdown construct. Bar charts show changes in putative exosome proteins in EVs isolated by ultracentrifugation, following normalisation to cell lysate protein. (F') Growth curves are for HCT116 recipient cells pre-treated with EVs isolated as in (F) or with vehicle (PBS)."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "ERK", "phosphorylation", "(", "p", "-", "ERK", ")", "in", "recipient", "serum", "-", "deprived", "HCT116", "cells", "pre", "-", "treated", "with", "EVs", "isolated", "by", "SEC", "from", "glutamine", "-", "replete", "or", "-", "depleted", "HCT116", "cells", "or", "vehicle", "(", "PBS", ")", ".", "Bar", "chart", "shows", "ratio", "of", "p", "-", "ERK", "to", "ERK", "levels", "from", "triplicate", "independent", "experiments", ".", "(", "B", ")", "Bar", "chart", "shows", "HCT116", "recipient", "cell", "growth", "over", "120", "h", ",", "after", "pre", "-", "treatment", "with", "EV", "preparations", "isolated", "as", "in", "(", "A", ")", "or", "with", "PBS", ",", "and", "then", "incubation", "for", "the", "first", "24", "h", "of", "culture", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "the", "ERK", "inhibitor", "SCH772984", "(", "1", ".", "00", "µM", ")", ".", "(", "C", ")", "Western", "blot", "analysis", "showing", "levels", "of", "the", "EGFR", "ligand", ",", "Amphiregulin", "(", "AREG", ")", "in", "EVs", "isolated", "by", "SEC", "of", "medium", "from", "HCT116", "cells", "cultured", "in", "glutamine", "-", "replete", "(", "2", ".", "00", "mM", ")", "or", "-", "depleted", "(", "0", ".", "15", "mM", ")", "conditions", "for", "24", "h", ".", "Gel", "loading", "was", "normalised", "to", "cell", "lysate", "protein", "levels", ".", "AREG", "'", "s", "molecular", "weight", "(", "approximately", "26", "-", "28", "kDa", ")", "suggests", "it", "is", "in", "its", "membrane", "-", "associated", "form", "(", "see", "Appendix", "Fig", "S8D", ")", ".", "In", "the", "bar", "chart", ",", "the", "levels", "of", "putative", "exosome", "proteins", "were", "normalised", "to", "cell", "lysate", "protein", "levels", ".", "Significantly", "decreased", "levels", "are", "in", "blue", "and", "increased", "levels", "are", "in", "red", ".", "(", "C", "'", ")", "Growth", "curves", "in", "low", "(", "1", "%", ")", "serum", "are", "for", "HCT116", "recipient", "cells", "pre", "-", "treated", "with", "the", "EV", "preparations", "[", "isolated", "as", "in", "(", "C", ")", "]", ",", "which", "had", "themselves", "been", "pre", "-", "treated", "with", "and", "without", "anti", "-", "AREG", "neutralising", "antibody", "or", "with", "a", "control", "IgG", ".", "Solid", "red", "line", "shows", "growth", "-", "promoting", "effect", "of", "EVs", "isolated", "under", "glutamine", "depletion", ",", "which", "is", "blocked", "by", "anti", "-", "AREG", "antibody", "(", "red", "dashed", "line", ")", ".", "*", "*", "*", "P", "colour", "denotes", "significant", "increase", "relative", "to", "EVs", "from", "glutamine", "-", "replete", "cells", "(", "black", ")", "and", "anti", "-", "AREG", "-", "treated", "cells", "(", "red", ")", ".", "(", "C", "'", "'", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "ERK", "phosphorylation", "(", "p", "-", "ERK", ")", "in", "recipient", "serum", "-", "deprived", "HCT116", "cells", "pre", "-", "treated", "with", "EVs", "isolated", "by", "SEC", "from", "glutamine", "-", "replete", "(", "2", ".", "00", "mM", ")", "or", "-", "depleted", "(", "0", ".", "15", "mM", ")", "HCT116", "cells", "or", "vehicle", "(", "PBS", ")", ",", "which", "were", "pre", "-", "treated", "with", "anti", "-", "AREG", "(", "AREGab", ")", "or", "a", "control", "immunoglobulin", "(", "Ig", ")", ".", "Note", "increase", "in", "ERK", "phosphorylation", "using", "EVs", "from", "glutamine", "-", "depleted", "cells", ",", "which", "is", "blunted", "by", "the", "addition", "of", "the", "anti", "-", "AREG", "antibody", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Western blot analysis of ERK phosphorylation (p-ERK) in recipient serum-deprived HCT116 cells pre-treated with EVs isolated by SEC from glutamine-replete or -depleted HCT116 cells or vehicle (PBS). Bar chart shows ratio of p-ERK to ERK levels from triplicate independent experiments.(B) Bar chart shows HCT116 recipient cell growth over 120 h, after pre-treatment with EV preparations isolated as in (A) or with PBS, and then incubation for the first 24 h of culture in the presence or absence of the ERK inhibitor SCH772984 (1.00 µM).(C) Western blot analysis showing levels of the EGFR ligand, Amphiregulin (AREG) in EVs isolated by SEC of medium from HCT116 cells cultured in glutamine-replete (2.00 mM) or -depleted (0.15 mM) conditions for 24 h. Gel loading was normalised to cell lysate protein levels. AREG's molecular weight (approximately 26-28 kDa) suggests it is in its membrane-associated form (see Appendix Fig S8D). In the bar chart, the levels of putative exosome proteins were normalised to cell lysate protein levels. Significantly decreased levels are in blue and increased levels are in red.(C') Growth curves in low (1%) serum are for HCT116 recipient cells pre-treated with the EV preparations [isolated as in (C)], which had themselves been pre-treated with and without anti-AREG neutralising antibody or with a control IgG. Solid red line shows growth-promoting effect of EVs isolated under glutamine depletion, which is blocked by anti-AREG antibody (red dashed line). ***P colour denotes significant increase relative to EVs from glutamine-replete cells (black) and anti-AREG-treated cells (red). (C'') Western blot analysis of ERK phosphorylation (p-ERK) in recipient serum-deprived HCT116 cells pre-treated with EVs isolated by SEC from glutamine-replete (2.00 mM) or -depleted (0.15 mM) HCT116 cells or vehicle (PBS), which were pre-treated with anti-AREG (AREGab) or a control immunoglobulin (Ig). Note increase in ERK phosphorylation using EVs from glutamine-depleted cells, which is blunted by the addition of the anti-AREG antibody."}
{"words": ["Figure", "8HCT116", "flank", "tumours", "produced", "by", "subcutaneous", "injection", "were", "established", "for", "20", "days", "before", "injection", "at", "three", "-", "day", "intervals", "with", "vehicle", "(", "PBS", ")", ",", "or", "EVs", "isolated", "by", "UC", "from", "glutamine", "-", "replete", "or", "glutamine", "-", "depleted", "HCT116", "cells", ".", "Tumours", "were", "excised", "24", "h", "after", "last", "of", "four", "injections", "for", "analysis", ".", "Panels", "show", "representative", "immunostained", "histological", "sections", "of", "tumour", "tissue", "quantified", "using", "the", "Visiopharm", "Integrator", "System", ".", "(", "A", ")", "Sections", "immunostained", "for", "CD31", ",", "which", "labels", "endothelial", "cells", "and", "blood", "vessels", ",", "with", "blood", "vessel", "number", "(", "upper", ")", "and", "total", "area", "(", "lower", ")", "represented", "in", "bar", "charts", ".", "HCT116", "flank", "tumours", "produced", "by", "subcutaneous", "injection", "were", "established", "for", "20", "days", "before", "injection", "at", "three", "-", "day", "intervals", "with", "vehicle", "(", "PBS", ")", ",", "or", "EVs", "isolated", "by", "UC", "from", "glutamine", "-", "replete", "or", "glutamine", "-", "depleted", "HCT116", "cells", ".", "Tumours", "were", "excised", "24", "h", "after", "last", "of", "four", "injections", "for", "analysis", ".", "Panels", "show", "representative", "immunostained", "histological", "sections", "of", "tumour", "tissue", "quantified", "using", "the", "Visiopharm", "Integrator", "System", ".", "(", "B", ")", "Sections", "immunostained", "for", "Ki67", ",", "which", "stains", "proliferative", "cells", ".", "Proportion", "of", "tumour", "cells", "with", "Ki69", "staining", "is", "represented", "in", "bar", "chart", ".", "HCT116", "flank", "tumours", "produced", "by", "subcutaneous", "injection", "were", "established", "for", "20", "days", "before", "injection", "at", "three", "-", "day", "intervals", "with", "vehicle", "(", "PBS", ")", ",", "or", "EVs", "isolated", "by", "UC", "from", "glutamine", "-", "replete", "or", "glutamine", "-", "depleted", "HCT116", "cells", ".", "Tumours", "were", "excised", "24", "h", "after", "last", "of", "four", "injections", "for", "analysis", ".", "Panels", "show", "representative", "immunostained", "histological", "sections", "of", "tumour", "tissue", "quantified", "using", "the", "Visiopharm", "Integrator", "System", ".", "(", "C", ")", "Sections", "stained", "with", "haematoxylin", "and", "eosin", ",", "which", "highlights", "necrotic", "regions", "(", "pale", "staining", ")", ".", "Proportion", "of", "tumour", "area", "that", "is", "necrotic", "is", "represented", "in", "bar", "chart", ".", "HCT116", "flank", "tumours", "produced", "by", "subcutaneous", "injection", "were", "established", "for", "20", "days", "before", "injection", "at", "three", "-", "day", "intervals", "with", "vehicle", "(", "PBS", ")", ",", "or", "EVs", "isolated", "by", "UC", "from", "glutamine", "-", "replete", "or", "glutamine", "-", "depleted", "HCT116", "cells", ".", "Tumours", "were", "excised", "24", "h", "after", "last", "of", "four", "injections", "for", "analysis", ".", "Panels", "show", "representative", "immunostained", "histological", "sections", "of", "tumour", "tissue", "quantified", "using", "the", "Visiopharm", "Integrator", "System", ".", "(", "D", ")", "Sections", "immunostained", "for", "CA9", ",", "which", "is", "expressed", "in", "hypoxic", "regions", ".", "Proportion", "of", "tumour", "cells", "with", "CA9", "staining", "is", "represented", "in", "bar", "chart", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8HCT116 flank tumours produced by subcutaneous injection were established for 20 days before injection at three-day intervals with vehicle (PBS), or EVs isolated by UC from glutamine-replete or glutamine-depleted HCT116 cells. Tumours were excised 24 h after last of four injections for analysis. Panels show representative immunostained histological sections of tumour tissue quantified using the Visiopharm Integrator System. (A) Sections immunostained for CD31, which labels endothelial cells and blood vessels, with blood vessel number (upper) and total area (lower) represented in bar charts.HCT116 flank tumours produced by subcutaneous injection were established for 20 days before injection at three-day intervals with vehicle (PBS), or EVs isolated by UC from glutamine-replete or glutamine-depleted HCT116 cells. Tumours were excised 24 h after last of four injections for analysis. Panels show representative immunostained histological sections of tumour tissue quantified using the Visiopharm Integrator System. (B) Sections immunostained for Ki67, which stains proliferative cells. Proportion of tumour cells with Ki69 staining is represented in bar chart.HCT116 flank tumours produced by subcutaneous injection were established for 20 days before injection at three-day intervals with vehicle (PBS), or EVs isolated by UC from glutamine-replete or glutamine-depleted HCT116 cells. Tumours were excised 24 h after last of four injections for analysis. Panels show representative immunostained histological sections of tumour tissue quantified using the Visiopharm Integrator System. (C) Sections stained with haematoxylin and eosin, which highlights necrotic regions (pale staining). Proportion of tumour area that is necrotic is represented in bar chart.HCT116 flank tumours produced by subcutaneous injection were established for 20 days before injection at three-day intervals with vehicle (PBS), or EVs isolated by UC from glutamine-replete or glutamine-depleted HCT116 cells. Tumours were excised 24 h after last of four injections for analysis. Panels show representative immunostained histological sections of tumour tissue quantified using the Visiopharm Integrator System. (D) Sections immunostained for CA9, which is expressed in hypoxic regions. Proportion of tumour cells with CA9 staining is represented in bar chart."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "D", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "a", "strain", "expressing", "TurboID", "-", "HA", "-", "Emc6", ",", "Bpl1", "-", "AID", "*", "-", "9myc", "and", "OsTIR1", "which", "was", "grown", "overnight", "in", "SD", "media", "with", "or", "without", "auxin", ".", "The", "cells", "were", "then", "diluted", "into", "fresh", "SD", "media", "and", "grown", "to", "mid", "logarithmic", "phase", "(", "~", "4hours", ")", "with", "or", "without", "auxin", "(", "respectively", ")", ".", "When", "required", ",", "biotin", "was", "added", "either", "30min", "before", "harvesting", ",", "or", "for", "the", "entire", "4hours", ".", "H3", "(", "histone", "H3", ")", "is", "used", "as", "a", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(D) Western blot analysis of a strain expressing TurboID-HA-Emc6, Bpl1-AID*-9myc and OsTIR1 which was grown overnight in SD media with or without auxin. The cells were then diluted into fresh SD media and grown to mid logarithmic phase (~4hours) with or without auxin (respectively). When required, biotin was added either 30min before harvesting, or for the entire 4hours. H3 (histone H3) is used as a loading control."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "B", ")", "Volcano", "plots", "for", "each", "of", "the", "four", "distinct", "LC", "-", "MS", "/", "MS", "experiments", "highlighted", "in", "Figure", "2A", "showing", "-", "log", "(", "p", "-", "value", ")", "against", "log2", "(", "fold", "-", "change", ")", "for", "all", "proteins", "identified", "in", "the", "appropriate", "Emc6", "/", "Sbh1", "samples", ".", "Proteins", "enriched", "in", "the", "Emc6", "samples", "are", "colour", "/", "pattern", "-", "coded", "as", "follows", ":", "dotted", "outline", "for", "HA", "-", "IP", "of", "BioID2", "-", "HA", "-", "Emc6", ";", "blue", "fill", "for", "streptavidin", "-", "AP", "of", "BioID2", "-", "HA", "-", "Emc6", ";", "black", ",", "solid", "outline", "for", "streptavidin", "-", "AP", "of", "TurboID", "-", "HA", "-", "Emc6", ";", "and", "yellow", "fill", "for", "streptavidin", "-", "AP", "of", "TurboID", "-", "HA", "-", "Emc6", "/", "ABOLISH", ".", "Grey", "dots", "represent", "proteins", "that", "passed", "the", "p", "-", "value", "and", "fold", "-", "change", "criteria", ",", "but", "were", "only", "identified", "by", "one", "peptide", ".", "Only", "EMC", "complex", "components", "or", "proteins", "with", "EMC", "client", "features", "are", "named", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(B) Volcano plots for each of the four distinct LC-MS/MS experiments highlighted in Figure 2A showing -log(p-value) against log2(fold-change) for all proteins identified in the appropriate Emc6/Sbh1 samples. Proteins enriched in the Emc6 samples are colour/pattern-coded as follows: dotted outline for HA-IP of BioID2-HA-Emc6; blue fill for streptavidin-AP of BioID2-HA-Emc6; black, solid outline for streptavidin-AP of TurboID-HA-Emc6; and yellow fill for streptavidin-AP of TurboID-HA-Emc6/ABOLISH. Grey dots represent proteins that passed the p-value and fold-change criteria, but were only identified by one peptide. Only EMC complex components or proteins with EMC client features are named."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Fluorescence", "microscopy", "images", "of", "control", "or", "Δemc3", "strains", "containing", "either", "Alg1", "N", "'", "tagged", "with", "GFP", ",", "Gnp1", "C", "'", "tagged", "with", "GFP", ",", "Pdr12", "N", "'", "tagged", "with", "GFP", "or", "Pho84", "C", "'", "tagged", "with", "GFP", ".", "For", "the", "Gnp1", "-", "GFP", "strain", ",", "the", "quantified", "signal", "depletion", "was", "~", "10", "%", "(", "p", "<", "0", ".", "0001", ")", ".", "Topological", "schematics", "feature", "beneath", "each", "respective", "image", ",", "with", "predicted", "TMDs", "highlighted", "in", "blue", "(", "Weill", "et", "al", ",", "2019", ")", ".", "All", "images", "are", "from", "two", "independent", "biological", "repeats", "and", "are", "digitally", "coloured", "using", "the", "'", "fire", "'", "lookup", "table", "(", "LUT", ")", "on", "Fiji", ".", "The", "same", "contrast", "settings", "were", "used", "for", "each", "image", "pair", ".", "(", "C", ")", "Streptavidin", "blots", "of", "diploid", "strains", "expressing", "either", "AviTag", "-", "Fks1", ",", "-", "Gnp1", ",", "-", "Pdr5", ",", "-", "Pdr12", "or", "-", "Stv1", "(", "as", "negative", "control", ")", "together", "with", "BirA", "-", "Emc6", ",", "grown", "in", "the", "conditions", "described", "in", "Figure", "1E", ".", "For", "each", "strain", ",", "blots", "showing", "both", "the", "'", "lower", "'", "(", "L", ")", "and", "'", "higher", "'", "(", "H", ")", "contrast", "settings", "are", "shown", "side", "-", "by", "-", "side", ".", "The", "expected", "molecular", "weight", "in", "kDa", "for", "each", "tested", "protein", "including", "AviTag", "is", "written", "in", "parentheses", "after", "the", "protein", "name", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Fluorescence microscopy images of control or Δemc3 strains containing either Alg1 N' tagged with GFP, Gnp1 C' tagged with GFP, Pdr12 N' tagged with GFP or Pho84 C' tagged with GFP. For the Gnp1-GFP strain, the quantified signal depletion was ~10% (p < 0.0001). Topological schematics feature beneath each respective image, with predicted TMDs highlighted in blue (Weill et al, 2019). All images are from two independent biological repeats and are digitally coloured using the 'fire' lookup table (LUT) on Fiji. The same contrast settings were used for each image pair.(C) Streptavidin blots of diploid strains expressing either AviTag-Fks1, -Gnp1, -Pdr5, -Pdr12 or -Stv1 (as negative control) together with BirA-Emc6, grown in the conditions described in Figure 1E. For each strain, blots showing both the 'lower' (L) and 'higher' (H) contrast settings are shown side-by-side. The expected molecular weight in kDa for each tested protein including AviTag is written in parentheses after the protein name."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "Protein", "lysates", "from", "the", "melanocytic", "-", "like", "melanoma", "cells", "501mel", ",", "MM011", ",", "MM074", "and", "MM117", "or", "the", "mesenchymal", "-", "like", "melanoma", "cells", "MM029", ",", "MM047", "and", "MM099", "were", "immuno", "-", "blotted", "for", "proteins", "as", "indicated", ".", "Molecular", "mass", "of", "the", "proteins", "is", "indicated", "(", "kDa", ")", ".", "B", ".", "Melanoma", "cells", "were", "treated", "with", "increasing", "concentrations", "of", "THZ1", "as", "indicated", "for", "72h", ".", "Mean", "growth", "is", "shown", "relative", "to", "vehicle", "(", "DMSO", ")", "-", "treated", "cells", ".", "IC50", "for", "each", "cell", "line", "is", "indicated", ".", "Melanocytic", "-", "type", "(", "MITF", "-", "High", ",", "proliferative", ")", "melanoma", "cells", "are", "shown", "in", "red", ",", "while", "mesenchymal", "-", "like", "(", "MITF", "-", "low", ",", "invasive", ")", "melanoma", "cells", "are", "shown", "in", "blue", ".", "Data", "information", ":", "data", "are", "presented", "as", "mean", "values", "+", "Standard", "Deviation", "(", "SD", ")", "for", "three", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. Protein lysates from the melanocytic-like melanoma cells 501mel, MM011, MM074 and MM117 or the mesenchymal-like melanoma cells MM029, MM047 and MM099 were immuno-blotted for proteins as indicated. Molecular mass of the proteins is indicated (kDa).B. Melanoma cells were treated with increasing concentrations of THZ1 as indicated for 72h. Mean growth is shown relative to vehicle (DMSO)-treated cells. IC50 for each cell line is indicated. Melanocytic-type (MITF-High, proliferative) melanoma cells are shown in red, while mesenchymal-like (MITF-low, invasive) melanoma cells are shown in blue. Data information: data are presented as mean values + Standard Deviation (SD) for three replicates (n=3)."}
{"words": ["Figure", "2D", ".", "Protein", "lysates", "from", "MM074", ",", "MM074BRAFi", "-", "R", "or", "MM074CDK7i", "-", "R", "were", "immuno", "-", "blotted", "for", "indicated", "proteins", ".", "Molecular", "sizes", "of", "the", "proteins", "are", "indicated", "(", "kDa", ")", ".", "The", "numbers", "below", "the", "gel", "lanes", "represent", "relative", "protein", "level", ",", "which", "was", "determined", "from", "the", "band", "intensity", "using", "ImageJ", "software", "normalized", "to", "each", "relative", "Vinculin", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2D. Protein lysates from MM074, MM074BRAFi-R or MM074CDK7i-R were immuno-blotted for indicated proteins. Molecular sizes of the proteins are indicated (kDa). The numbers below the gel lanes represent relative protein level, which was determined from the band intensity using ImageJ software normalized to each relative Vinculin control."}
{"words": ["Figure", "3B", ".", "Protein", "lysates", "from", "the", "indicated", "cells", "were", "immuno", "-", "blotted", "for", "the", "indicated", "proteins", ".", "Molecular", "sizes", "of", "the", "proteins", "are", "indicated", "in", "kDa", ".", "The", "numbers", "below", "the", "gel", "lanes", "represent", "relative", "protein", "level", ",", "which", "was", "determined", "from", "the", "band", "intensity", "using", "ImageJ", "software", "normalized", "relative", "to", "each", "relative", "ACTIN", "control", ".", "E", "-", "H", ".", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "showing", "average", "TBP", "-", "normalized", "expression", "of", "GATA6", "(", "E", ")", ",", "AMIGO2", "(", "F", ")", ",", "SERPINE1", "(", "G", ")", "and", "ABCG2", "(", "H", ")", "in", "the", "indicated", "cells", "treated", "with", "either", "siCTL", "or", "siGATA6", "for", "72h", ".", "Data", "information", ":", "data", "are", "presented", "as", "mean", "values", "+", "SD", "for", "six", "replicates", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "The", "p", "-", "value", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "is", "indicated", ",", "*", "*", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "<", "0", ".", "005", "and", "ns", "=", "non", "-", "significantJ", ".", "MM029", "(", "left", ")", "and", "MM099", "(", "right", ")", "were", "pre", "-", "treated", "with", "either", "siCTL", "or", "siGATA6", "for", "48h", "and", "treated", "with", "increasing", "concentrations", "of", "THZ1", "for", "72h", ".", "Mean", "growth", "is", "shown", "relative", "to", "vehicle", "(", "DMSO", ")", "-", "treated", "cells", ".", "Data", "information", ":", "data", "are", "presented", "as", "mean", "values", "+", "SD", "for", "six", "replicates", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "The", "p", "-", "value", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "is", "indicated", ",", "*", "*", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "<", "0", ".", "005", "and", "ns", "=", "non", "-"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B. Protein lysates from the indicated cells were immuno-blotted for the indicated proteins. Molecular sizes of the proteins are indicated in kDa. The numbers below the gel lanes represent relative protein level, which was determined from the band intensity using ImageJ software normalized relative to each relative ACTIN control.E-H. qRT-PCR analysis showing average TBP-normalized expression of GATA6 (E), AMIGO2 (F), SERPINE1 (G) and ABCG2 (H) in the indicated cells treated with either siCTL or siGATA6 for 72h. Data information: data are presented as mean values + SD for six replicates (n=6). The p-value (Student's t-test) is indicated, **<0.01, ***<0.005 and ns=non-significantJ. MM029 (left) and MM099 (right) were pre-treated with either siCTL or siGATA6 for 48h and treated with increasing concentrations of THZ1 for 72h. Mean growth is shown relative to vehicle (DMSO)-treated cells. Data information: data are presented as mean values + SD for six replicates (n=6). The p-value (Student's t-test) is indicated, **<0.01, ***<0.005 and ns=non-significant"}
{"words": ["Figure", "4C", "-", "D", ".", "MM099", "(", "c", ")", "and", "MM029", "(", "d", ")", "were", "pre", "-", "treated", "with", "either", "siCTL", "or", "siABCG2", "as", "indicated", "and", "treated", "with", "increasing", "concentrations", "of", "THZ1", "for", "72h", ".", "Mean", "growth", "is", "shown", "relative", "to", "vehicle", "(", "DMSO", ")", "-", "treated", "cells", ".", "E", "-", "F", ".", "MM099", "(", "e", ")", "and", "MM029", "(", "f", ")", "were", "pre", "-", "treated", "with", "either", "siCTL", "or", "siABCG2", "as", "indicated", "and", "treated", "with", "increasing", "doses", "of", "Vemurafenib", "for", "72h", ".", "Mean", "growth", "is", "shown", "relative", "to", "vehicle", "(", "DMSO", ")", "-", "treated", "cells", ".", "D", "Data", "information", ":", "data", "are", "presented", "as", "mean", "values", "+", "SD", "for", "three", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "IC50", "for", "each", "cell", "line", "is", "indicated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4C-D. MM099 (c) and MM029 (d) were pre-treated with either siCTL or siABCG2 as indicated and treated with increasing concentrations of THZ1 for 72h. Mean growth is shown relative to vehicle (DMSO)-treated cells. E-F. MM099 (e) and MM029 (f) were pre-treated with either siCTL or siABCG2 as indicated and treated with increasing doses of Vemurafenib for 72h. Mean growth is shown relative to vehicle (DMSO)-treated cells. D Data information: data are presented as mean values + SD for three replicates (n=3). IC50 for each cell line is indicated."}
{"words": ["Figure", "5C", "-", "E", ".", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "showing", "average", "TBP", "-", "normalized", "fold", "expression", "of", "MITF", "(", "C", ")", ",", "SOX10", "(", "D", ")", "and", "GATA6", "(", "E", ")", "in", "501mel", "treated", "either", "with", "DMSO", "/", "THZ1", "(", "50nM", ")", "(", "upper", ")", "or", "DMSO", "/", "JQ1", "(", "10μM", ")", "(", "lower", ")", "for", "24h", ".", "Data", "information", ":", "data", "are", "presented", "as", "mean", "values", "+", "SD", "for", "six", "replicates", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "The", "p", "-", "value", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "is", "indicated", ",", "*", "<", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5C-E. qRT-PCR analysis showing average TBP-normalized fold expression of MITF (C), SOX10 (D) and GATA6 (E) in 501mel treated either with DMSO/THZ1 (50nM) (upper) or DMSO/JQ1 (10μM) (lower) for 24h. Data information: data are presented as mean values + SD for six replicates (n=6). The p-value (Student's t-test) is indicated, *<0.05."}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "showing", "average", "TBP", "-", "normalized", "fold", "expression", "of", "SOX10", ",", "MITF", "and", "GATA6", "in", "501mel", "treated", "with", "either", "siCTL", "or", "siSOX10", "for", "48h", ".", "Data", "information", ":", ",", "data", "are", "presented", "as", "mean", "values", "+", "SD", "for", "six", "replicates", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "The", "p", "-", "value", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "is", "indicated", ",", "*", "<", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A. qRT-PCR analysis showing average TBP-normalized fold expression of SOX10, MITF and GATA6 in 501mel treated with either siCTL or siSOX10 for 48h. Data information: , data are presented as mean values + SD for six replicates (n=6). The p-value (Student's t-test) is indicated, *<0.05."}
{"words": ["Figure", "7D", ".", "MM099MITF", "-", "SOX10", "-", "PAX3", "expressing", "inducible", "MITF", "-", "SOX10", "-", "PAX3", "genes", "was", "treated", "or", "not", "with", "Doxycycline", "(", "1μg", "/", "ml", ")", "for", "24h", "and", "protein", "lysates", "were", "immuno", "-", "blotted", "for", "the", "indicated", "protein", ".", "The", "numbers", "below", "the", "gel", "lanes", "represent", "relative", "protein", "level", ",", "which", "was", "determined", "from", "the", "band", "intensity", "using", "ImageJ", "software", ",", "and", "normalized", "relative", "to", "VINCULIN", ".", "E", ".", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "showing", "average", "TBP", "-", "normalized", "fold", "expression", "of", "GATA6", ",", "ABCG2", ",", "AMIGO2", "or", "SERPINE1", "in", "MM099MITF", "-", "SOX10", "-", "PAX3", "treated", "or", "not", "with", "Doxycycline", "(", "1μg", "/", "ml", ")", "for", "24h", ".", "Data", "information", ":", "data", "are", "presented", "as", "mean", "values", "+", "SD", "for", "three", "biological", "triplicates", ".", "The", "p", "-", "value", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "is", "indicated", ",", "*", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7D. MM099MITF-SOX10-PAX3 expressing inducible MITF-SOX10-PAX3 genes was treated or not with Doxycycline (1μg/ml) for 24h and protein lysates were immuno-blotted for the indicated protein. The numbers below the gel lanes represent relative protein level, which was determined from the band intensity using ImageJ software, and normalized relative to VINCULIN.E. qRT-PCR analysis showing average TBP-normalized fold expression of GATA6, ABCG2, AMIGO2 or SERPINE1 in MM099MITF-SOX10-PAX3 treated or not with Doxycycline (1μg/ml) for 24h. Data information: data are presented as mean values + SD for three biological triplicates. The p-value (Student's t-test) is indicated, *<0.05, **<0.01; ***<0.001."}
{"words": ["Figure", "8A", ".", "Tumor", "sections", "were", "immuno", "-", "labelled", "(", "IHC", ")", "with", "anti", "-", "GATA6", "(", "red", ")", "and", "anti", "-", "SOX10", "(", "green", ")", "antibodies", "and", "images", "were", "captured", "by", "confocal", "microscopy", "at", "the", "indicated", "magnification", ".", "We", "analysed", "six", "tumor", "sections", "of", "metastases", "and", "observed", "significant", "GATA6", "expression", "in", "only", "one", "of", "them", ".", "Scale", "bar", "250", "μM", "for", "40x", ",", "100μM", "for", "100x", ".", "D", "-", "E", ".", "Graphs", "showing", "the", "average", "expression", "of", "GATA6", "(", "d", ")", "and", "MITF", "(", "e", ")", "(", "RPKM", ")", "for", "each", "phenotype", "cluster", "in", "T0", "(", "drug", "naïve", ")", "(", "blue", ")", ",", "phases", "1", "-", "2", "(", "MDR", ")", "(", "green", "and", "yellow", ")", "and", "phase", "3", "(", "drug", "-", "resistance", ")", "(", "red", ")", ".", "Data", "information", ":", "data", "are", "presented", "as", "mean", "values", "+", "SEM", "(", "n", "=", "6", ",", "574", "cells", "from", "5", "PDX", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8A. Tumor sections were immuno-labelled (IHC) with anti-GATA6 (red) and anti-SOX10 (green) antibodies and images were captured by confocal microscopy at the indicated magnification. We analysed six tumor sections of metastases and observed significant GATA6 expression in only one of them. Scale bar 250 μM for 40x, 100μM for 100x.D-E. Graphs showing the average expression of GATA6 (d) and MITF (e) (RPKM) for each phenotype cluster in T0 (drug naïve) (blue), phases 1-2 (MDR) (green and yellow) and phase 3 (drug-resistance) (red). Data information: data are presented as mean values + SEM (n=6,574 cells from 5 PDX)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Confocal", "images", "of", "representative", "eye", "cryosections", "immunostained", "with", "anti", "-", "Lamp1", "antibody", "from", "2", "-", "month", "-", "old", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "and", "control", "mice", "sacrificed", "3h", "after", "light", "on", ",", "at", "10", "AM", "(", "diurnal", "condition", ")", ".", "Enlarged", "boxes", "highlight", "Lamp1", "-", "positive", "structures", "(", "white", "arrowheads", ")", "in", "the", "RPE", ".", "Autofluorescence", "from", "lipofuscin", "granules", "are", "visible", "in", "all", "cryosections", "of", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "compared", "to", "control", "littermates", ".", "Nuclei", "were", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "At", "least", "n", "=", "6", "mice", "per", "group", ".", "Scale", "bar", "10", "μm", ".", "Data", "information", ":", "(", "RPE", ")", "Retinal", "Pigment", "Epithelium", ";", "(", "OS", ")", "outer", "segment", ";", "(", "ONL", ")", "outer", "nuclear", "layer", ".", "(", "B", ")", "RPE", "were", "isolated", "at", "10", "AM", "(", "diurnal", "condition", ")", "from", "2", "-", "month", "-", "old", "WT", "and", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "mice", ".", "Representative", "Western", "blot", "analysis", "of", "the", "Lamp1", ",", "Cln5", ",", "Trpml1", ",", "Sqstm1", "/", "p62", ",", "Cathepsin", "D", "(", "CtsD", ")", "and", "LC3", "proteins", "from", "WT", "and", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "mice", ".", "Note", "a", "decrease", "of", "both", "proCtsD", "and", "its", "maturation", "CtsD", "heavy", "chain", "(", "hc", ")", ".", "The", "plots", "show", "the", "quantification", "of", "the", "indicated", "proteins", "normalized", "to", "the", "Gapdh", "loading", "control", ".", "Bar", "graphs", "represent", "mean", "values", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "6", "mice", ")", "Mann", "and", "Whitney", "test", "(", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "vs", "WT", ")", ",", "*", "p", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "01", ".", "Data", "information", ":", "(", "RPE", ")", "Retinal", "Pigment", "Epithelium", "(", "C", ")", "Cathepsin", "B", "(", "CtsB", ")", "activity", "in", "RPE", "lysates", "from", "2", "-", "month", "-", "old", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "and", "control", "mice", "sacrificed", "3h", "after", "light", "on", "at", "10", "AM", "(", "diurnal", "condition", ")", ".", "CtsB", "was", "reduced", "in", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "compared", "to", "control", "mice", ".", "Bar", "graphs", "represent", "percentage", "of", "CtsB", "activity", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", "mice", ")", "Mann", "and", "Whitney", "test", "(", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "vs", "WT", ")", ",", "*", "p", "≤", "0", ".", "05", ".", "Data", "information", ":", "(", "RPE", ")", "Retinal", "Pigment", "Epithelium", "(", "D", ")", "Representative", "images", "of", "conventional", "TEM", "analysis", "of", "RPE", "of", "both", "2", "-", "month", "-", "old", "and", "3", "-", "month", "-", "old", "WT", "and", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "mice", ".", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "mice", "show", "accumulation", "of", "phagolysosomes", "(", "red", "arrows", ")", "in", "the", "RPE", ".", "Scale", "bar", "2", "μm", ".", "Enlarged", "boxes", "highlight", "phagolysosome", "-", "like", "structures", "containing", "poorly", "processed", "POS", ".", "Scale", "bar", "1", ".", "5", "μm", ".", "Representative", "images", "of", "conventional", "TEM", "analysis", "of", "RPE", "shown", "at", "higher", "magnification", "also", "highlighted", "accumulation", "of", "lipofuscin", "-", "like", "granules", "(", "blue", "arrows", ")", "in", "3", "-", "month", "-", "old", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "compared", "to", "control", "WT", "mice", ".", "Melanosomes", "are", "indicated", "by", "white", "asterisks", ".", "Scale", "bar", "500", "nm", "(", "n", "=", "3", "mice", ")", ".", "(", "E", ")", "Graphs", "showing", "number", "of", "lipofuscin", "-", "like", "granules", "(", "n", "/", "100", "μm2", ")", "from", "the", "RPE", "of", "3", "-", "month", "-", "old", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "mice", "as", "in", "(", "D", ")", ".", "Bar", "graphs", "represent", "mean", "values", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Mann", "and", "Whitney", "test", "(", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "vs", "WT", ")", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "005", "(", "n", "=", "6", "mice", ")", ".", "Data", "information", ":", "(", "RPE", ")", "Retinal", "Pigment"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Confocal images of representative eye cryosections immunostained with anti-Lamp1 antibody from 2-month-old miR-211-/- and control mice sacrificed 3h after light on, at 10 AM (diurnal condition). Enlarged boxes highlight Lamp1-positive structures (white arrowheads) in the RPE. Autofluorescence from lipofuscin granules are visible in all cryosections of miR-211-/- compared to control littermates. Nuclei were counterstained with DAPI (blue). At least n = 6 mice per group. Scale bar 10 μm. Data information: (RPE) Retinal Pigment Epithelium; (OS) outer segment; (ONL) outer nuclear layer.(B) RPE were isolated at 10 AM (diurnal condition) from 2-month-old WT and miR-211-/- mice. Representative Western blot analysis of the Lamp1, Cln5, Trpml1, Sqstm1/p62, Cathepsin D (CtsD) and LC3 proteins from WT and miR-211-/- mice. Note a decrease of both proCtsD and its maturation CtsD heavy chain (hc). The plots show the quantification of the indicated proteins normalized to the Gapdh loading control. Bar graphs represent mean values ± s.e.m. of independent experiments (n=6 mice) Mann and Whitney test (miR-211-/- vs WT), *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01. Data information: (RPE) Retinal Pigment Epithelium(C) Cathepsin B (CtsB) activity in RPE lysates from 2-month-old miR-211-/- and control mice sacrificed 3h after light on at 10 AM (diurnal condition). CtsB was reduced in miR-211-/- compared to control mice. Bar graphs represent percentage of CtsB activity ± s.e.m. of independent experiments (n=3 mice) Mann and Whitney test (miR-211-/- vs WT), *p ≤ 0.05. Data information: (RPE) Retinal Pigment Epithelium(D) Representative images of conventional TEM analysis of RPE of both 2-month-old and 3-month-old WT and miR-211-/- mice. miR-211-/- mice show accumulation of phagolysosomes (red arrows) in the RPE. Scale bar 2 μm. Enlarged boxes highlight phagolysosome-like structures containing poorly processed POS. Scale bar 1.5 μm. Representative images of conventional TEM analysis of RPE shown at higher magnification also highlighted accumulation of lipofuscin-like granules (blue arrows) in 3-month-old miR-211-/- compared to control WT mice. Melanosomes are indicated by white asterisks. Scale bar 500 nm (n=3 mice). (E) Graphs showing number of lipofuscin-like granules (n/100 μm2) from the RPE of 3-month-old miR-211-/- mice as in (D). Bar graphs represent mean values ± s.e.m. Mann and Whitney test (miR-211-/- vs WT) ***p ≤ 0.005 (n=6 mice). Data information: (RPE) Retinal Pigment Epithelium"}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "eye", "cryosections", "immunostained", "with", "anti", "-", "Ezrin", "(", "green", ")", "and", "anti", "-", "ZO", "-", "1", "(", "red", ")", "antibodies", "from", "2", "-", "month", "-", "old", "WT", "mice", "sacrificed", "3h", "after", "light", "on", "at", "10", "AM", "(", "diurnal", "condition", "-", "LIGHT", ")", "and", "3h", "after", "light", "off", "at", "10", "PM", "(", "nocturnal", "condition", "-", "DARK", ")", ",", "nuclei", "were", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Enlarged", "boxes", "highlight", "Ezrin", "staining", "in", "both", "basal", "infoldings", "(", "BI", ")", "and", "apical", "extension", "(", "AE", ")", "of", "the", "RPE", ".", "At", "least", "n", "=", "6", "mice", "per", "group", ".", "Scale", "bar", "10", "μm", ".", "Data", "information", ":", "(", "RPE", ")", "Retinal", "Pigment", "Epithelium", ";", "(", "OS", ")", "outer", "segment", ";", "(", "ONL", ")", "outer", "nuclear", "layer", ";", "(", "BI", ")", "RPE", "basal", "infoldings", "(", "AE", ")", "RPE", "apical", "extensions", ".", "(", "B", ")", "Graph", "representing", "the", "kinetic", "expression", "pattern", "of", "Ezrin", "levels", "in", "the", "RPE", "from", "2", "-", "month", "-", "old", "WT", "mice", "during", "dark", "/", "light", "and", "light", "/", "dark", "transitions", ".", "Mice", "were", "sacrificed", "at", "determined", "time", "points", "as", "indicated", "on", "the", "X", "axis", ".", "Scheme", "at", "the", "top", "describes", "light", "/", "dark", "adaptation", "regime", ".", "Values", "normalized", "to", "Hprt", ",", "represent", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Mann", "and", "Whitney", "test", "*", "p", "≤", "0", ".", "05", "(", "n", "=", "3", "mice", "for", "each", "time", "point", ")", ".", "Values", "from", "12h", "dark", "-", "adapted", "mice", "(", "T0", ")", "were", "set", "to", "one", ".", "(", "C", ")", "Confocal", "images", "of", "representative", "eye", "cryosections", "immunostained", "with", "anti", "-", "Ezrin", "(", "green", ")", "and", "anti", "-", "ZO", "-", "1", "(", "red", ")", "antibodies", "from", "2", "-", "month", "-", "old", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "and", "WT", "control", "mice", "sacrificed", "3h", "after", "light", "on", "at", "10", "AM", "(", "diurnal", "condition", ")", ".", "Enlarged", "boxes", "highlight", "Ezrin", "staining", "in", "both", "basal", "infoldings", "(", "BI", ")", "and", "apical", "extension", "(", "AE", ")", "of", "the", "RPE", ".", "At", "least", "n", "=", "6", "mice", "per", "group", ".", "Scale", "bar", "10", "μm", ".", "Data", "information", ":", "(", "RPE", ")", "Retinal", "Pigment", "Epithelium", ";", "(", "OS", ")", "outer", "segment", ";", "(", "ONL", ")", "outer", "nuclear", "layer", ";", "(", "BI", ")", "RPE", "basal", "infoldings", "(", "AE", ")", "RPE", "apical", "extensions", ".", "(", "D", ")", "qRT", "-", "PCR", "assay", "for", "Ezrin", "from", "RPE", "2", "-", "month", "-", "old", "WT", "and", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "mice", "sacrificed", "3h", "after", "light", "on", "at", "10", "AM", ".", "The", "graph", "shows", "the", "expression", "level", "of", "Ezrin", "normalized", "to", "Hprt", ".", "Bar", "graphs", "represent", "mean", "values", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Mann", "and", "Whitney", "test", "(", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "vs", "WT", ")", ",", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "005", "(", "n", "=", "6", "mice", ")", ".", "(", "E", ")", "RPE", "were", "isolated", "at", "10", "AM", "(", "diurnal", "condition", ")", "from", "2", "-", "month", "-", "old", "WT", "and", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "mice", ".", "Representative", "image", "at", "low", "exposure", "of", "Western", "blot", "analysis", "of", "the", "Ezrin", "protein", "from", "WT", "and", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "mice", ".", "The", "graph", "shows", "the", "quantification", "of", "Ezrin", "normalized", "to", "the", "Gapdh", "loading", "control", ".", "Bar", "graphs", "represent", "mean", "values", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "5", "mice", ")", "Mann", "and", "Whitney", "test", "(", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "vs", "WT", ")", ",", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "01", ".", "(", "F", ")", "Graph", "representing", "the", "kinetic", "expression", "pattern", "of", "Ezrin", "levels", "in", "the", "RPE", "from", "2", "-", "month", "-", "old", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "mice", "during", "dark", "/", "light", "and", "light", "/", "dark", "transitions", ".", "Mice", "were", "sacrificed", "at", "determined", "time", "points", "as", "indicated", "in", "X", "axis", ".", "Scheme", "at", "the", "top", "describes", "light", "/", "dark", "adaptation", "regime", ".", "Values", "normalized", "to", "Hprt", ",", "represent", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "n", "=", "3", "mice", "for", "each", "time", "point", ")", ".", "Values", "from", "12h", "dark", "adapted", "mice", "(", "T0", ")", "were", "set", "to", "one", ".", "(", "G", ")", "Graph", "representing", "the", "kinetic", "expression", "pattern", "of", "Trpm1", "levels", "in", "the", "RPE", "from", "2", "-", "month", "-", "old", "WT", "mice", "during", "dark", "/", "light", "and", "light", "/", "dark", "transitions", ".", "Mice", "were", "sacrificed", "at", "determined", "time", "points", "as", "indicated", "in", "X", "axis", ".", "Scheme", "at", "the", "top", "describes", "light", "/", "dark", "adaptation", "regime", ".", "Values", "normalized", "to", "Hprt", ",", "represent", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", "(", "n", "=", "3", "mice", "for", "each", "time", "point", ")", ".", "Values", "from", "12h", "dark", "adapted", "mice", "(", "T0", ")", "were", "set", "to", "one", ".", "(", "H", ")", "qRT", "-", "PCR", "assay", "for", "Mtmr10", "and", "Klf13", "from", "RPE", "2", "-", "month", "-", "old", "WT", "and", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "mice", "sacrificed", "3h", "after", "on", "at", "10", "AM", ".", "The", "graph", "shows", "the", "expression", "level", "of", "these", "genes", "normalized", "to", "the", "Hprt", ".", "Bar", "graphs", "represent", "mean", "values", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "n", "=", "3", "mice", ")"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Representative confocal images of eye cryosections immunostained with anti-Ezrin (green) and anti-ZO-1 (red) antibodies from 2-month-old WT mice sacrificed 3h after light on at 10 AM (diurnal condition - LIGHT) and 3h after light off at 10 PM (nocturnal condition - DARK), nuclei were counterstained with DAPI (blue). Enlarged boxes highlight Ezrin staining in both basal infoldings (BI) and apical extension (AE) of the RPE. At least n = 6 mice per group. Scale bar 10 μm. Data information: (RPE) Retinal Pigment Epithelium; (OS) outer segment; (ONL) outer nuclear layer; (BI) RPE basal infoldings (AE) RPE apical extensions.(B) Graph representing the kinetic expression pattern of Ezrin levels in the RPE from 2-month-old WT mice during dark/light and light/dark transitions. Mice were sacrificed at determined time points as indicated on the X axis. Scheme at the top describes light/dark adaptation regime. Values normalized to Hprt, represent means ± s.e.m. Mann and Whitney test *p ≤ 0.05 (n=3 mice for each time point). Values from 12h dark-adapted mice (T0) were set to one.(C) Confocal images of representative eye cryosections immunostained with anti-Ezrin (green) and anti-ZO-1 (red) antibodies from 2-month-old miR-211-/- and WT control mice sacrificed 3h after light on at 10 AM (diurnal condition). Enlarged boxes highlight Ezrin staining in both basal infoldings (BI) and apical extension (AE) of the RPE. At least n = 6 mice per group. Scale bar 10 μm. Data information: (RPE) Retinal Pigment Epithelium; (OS) outer segment; (ONL) outer nuclear layer; (BI) RPE basal infoldings (AE) RPE apical extensions.(D) qRT-PCR assay for Ezrin from RPE 2-month-old WT and miR-211-/- mice sacrificed 3h after light on at 10 AM. The graph shows the expression level of Ezrin normalized to Hprt. Bar graphs represent mean values ± s.e.m. Mann and Whitney test (miR-211-/- vs WT), ***p ≤ 0.005 (n=6 mice).(E) RPE were isolated at 10 AM (diurnal condition) from 2-month-old WT and miR-211-/- mice. Representative image at low exposure of Western blot analysis of the Ezrin protein from WT and miR-211-/- mice. The graph shows the quantification of Ezrin normalized to the Gapdh loading control. Bar graphs represent mean values ± s.e.m. of independent experiments (n=5 mice) Mann and Whitney test (miR-211-/- vs WT), **p ≤ 0.01.(F) Graph representing the kinetic expression pattern of Ezrin levels in the RPE from 2-month-old miR-211-/- mice during dark/light and light/dark transitions. Mice were sacrificed at determined time points as indicated in X axis. Scheme at the top describes light/dark adaptation regime. Values normalized to Hprt, represent means ± s.e.m. (n=3 mice for each time point). Values from 12h dark adapted mice (T0) were set to one. (G) Graph representing the kinetic expression pattern of Trpm1 levels in the RPE from 2-month-old WT mice during dark/light and light/dark transitions. Mice were sacrificed at determined time points as indicated in X axis. Scheme at the top describes light/dark adaptation regime. Values normalized to Hprt, represent means ± s.e.m (n=3 mice for each time point). Values from 12h dark adapted mice (T0) were set to one. (H) qRT-PCR assay for Mtmr10 and Klf13 from RPE 2-month-old WT and miR-211-/- mice sacrificed 3h after on at 10 AM. The graph shows the expression level of these genes normalized to the Hprt. Bar graphs represent mean values ± s.e.m. (n=3 mice)"}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Representative", "images", "from", "ARPE", "-", "19", "cells", "treated", "with", "DMSO", "and", "NSC668394", ".", "All", "cells", "were", "fixed", "and", "stained", "with", "anti", "-", "LC3", "(", "green", ")", "and", "anti", "-", "LAMP1", "(", "red", ")", "antibodies", "and", "nuclei", "were", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", "5", "μm", ".", "(", "B", ")", "The", "plot", "shows", "the", "quantification", "of", "the", "numbers", "of", "LC3", "/", "LAMP1", "-", "positive", "vesicles", "per", "cell", "(", "n", "≥", "100", ")", ".", "Values", "represent", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "NSC668394", "vs", "DMSO", ")", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "005", ".", "(", "C", ")", "Representative", "Western", "blots", "of", "LAMP1", ",", "EZRIN", ",", "EZRIN", "-", "pT567", ",", "CLN5", ",", "TRPML1", ",", "SQSTM1", "/", "p62", ",", "CTSD", "and", "LC3", "proteins", "from", "DMSO", "or", "NSC668394", "treated", "cells", ".", "Note", "an", "increase", "of", "both", "proCTSD", "and", "its", "maturation", "CTSD", "heavy", "chain", "(", "hc", ")", ".", "The", "plot", "shows", "the", "quantification", "of", "the", "indicated", "proteins", "normalized", "to", "the", "GAPDH", "loading", "control", ".", "Bar", "graphs", "represent", "mean", "values", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "at", "least", "n", " ", "=", " ", "6", "independent", "experiments", ".", "Mann", "and", "Whitney", "test", "(", "NSC668394", "vs", "DMSO", ")", "*", "p", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "005", ".", "(", "D", ")", "Representative", "images", "of", "RFP", "-", "GFP", "-", "LC3", "assay", "in", "ARPE", "-", "19", "cells", "transiently", "transfected", "with", "RFP", "-", "GFP", "-", "LC3", "and", "treated", "with", "DMSO", "or", "NSC668394", ".", "Nuclei", "were", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "5", "μm", ".", "(", "E", ")", "Box", "plots", "showing", "quantitative", "analysis", "of", "RFP", "+", "GFP", "+", "puncta", "(", "Autophagosome", ")", "and", "RFP", "+", "GFP", "-", "puncta", "(", "Autolysosome", ")", "(", "n", "≥", "100", "cells", ")", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "Box", "limits", "represent", "25th", "percentile", "and", "75th", "percentile", ";", "horizontal", "lines", "represent", "medians", ";", "whiskers", "display", "min", ".", "to", "max", ".", "values", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "NSC668394", "vs", "DMSO", ")", "*", "p", "≤", "0", ".", "05", ".", "(", "F", ")", "Endolysosomal", "Cathepsin", "activity", "was", "revealed", "by", "incubation", "with", "cathepsin", "B", "(", "CTSB", ")", "Magic", "Red", "substrate", "for", "20", "min", "and", "images", "of", "the", "living", "cell", "collected", "on", "the", "HC", "analysis", ".", "Scale", "bar", "10", "μm", ".", "(", "G", ")", "Graph", "showing", "the", "mean", "values", "of", "intensity", "of", "cresyl", "violet", "fluorescence", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "representative", "data", "(", "n", "≥", "100", "cells", ")", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "Mann", "and", "Whitney", "test", "(", "NSC668394", "vs", "DMSO", ")", "*", "p", "≤", "0", ".", "05", ".", "(", "H", ")", "Cathepsin", "B", "(", "CTSB", ")", "activity", "in", "lysates", "from", "NSC668394", "-", "treated", "and", "DMSO", "-", "control", "ARPE", "-", "19", "cells", ".", "Graph", "showing", "the", "percentage", "of", "values", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "CTSB", "activity", "from", "4", "independent", "experiments", ".", "Mann", "and", "Whitney", "test", "(", "NSC668394", "vs", "DMSO", ")", "*", "p", "≤", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Representative images from ARPE-19 cells treated with DMSO and NSC668394. All cells were fixed and stained with anti-LC3 (green) and anti-LAMP1 (red) antibodies and nuclei were counterstained with DAPI (blue). Scale bar 5 μm. (B) The plot shows the quantification of the numbers of LC3/LAMP1-positive vesicles per cell (n ≥ 100). Values represent means ± s.e.m from 3 independent experiments. Student's t-test (NSC668394 vs DMSO) ***p ≤ 0.005. (C) Representative Western blots of LAMP1, EZRIN, EZRIN-pT567, CLN5, TRPML1, SQSTM1/p62, CTSD and LC3 proteins from DMSO or NSC668394 treated cells. Note an increase of both proCTSD and its maturation CTSD heavy chain (hc). The plot shows the quantification of the indicated proteins normalized to the GAPDH loading control. Bar graphs represent mean values ± s.e.m. of at least n = 6 independent experiments. Mann and Whitney test (NSC668394 vs DMSO) *p ≤ 0.05, ***p ≤ 0.005.(D) Representative images of RFP-GFP-LC3 assay in ARPE-19 cells transiently transfected with RFP-GFP-LC3 and treated with DMSO or NSC668394. Nuclei were counterstained with DAPI (blue). Scale bars: 5 μm. (E) Box plots showing quantitative analysis of RFP+GFP+ puncta (Autophagosome) and RFP+GFP- puncta (Autolysosome ) (n ≥ 100 cells) from 3 independent experiments. Box limits represent 25th percentile and 75th percentile; horizontal lines represent medians; whiskers display min. to max. values. Student's t-test (NSC668394 vs DMSO) *p ≤ 0.05.(F) Endolysosomal Cathepsin activity was revealed by incubation with cathepsin B (CTSB) Magic Red substrate for 20 min and images of the living cell collected on the HC analysis. Scale bar 10 μm. (G) Graph showing the mean values of intensity of cresyl violet fluorescence ± s.e.m. of representative data (n ≥ 100 cells) from 3 independent experiments. Mann and Whitney test (NSC668394 vs DMSO) *p ≤ 0.05.(H) Cathepsin B (CTSB) activity in lysates from NSC668394-treated and DMSO-control ARPE-19 cells. Graph showing the percentage of values ± s.e.m. of CTSB activity from 4 independent experiments. Mann and Whitney test (NSC668394 vs DMSO) *p ≤ 0.05."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Representative", "images", "from", "HC", "assay", "of", "HeLaTFEB", "-", "GFP", "cells", "transfected", "with", "control", "(", "siCTRL", ")", "or", "siPPP3CB", ",", "and", "subjected", "to", "the", "indicated", "conditions", ".", "Analysis", "of", "TFEB", "nuclear", "translocation", "in", "HeLaTFEB", "-", "GFP", "cells", "transfected", "with", "siCTRL", "or", "siPPP3CB", "and", "treated", "with", "DMSO", "or", "NSC668394", ",", "silenced", "for", "EZRIN", "(", "siEZR", ")", "or", "serum", "-", "starved", "(", "stv", ")", ".", "Both", "pharmacological", "inhibition", "and", "silencing", "of", "Ezrin", "induced", "TFEB", "nuclear", "localization", "in", "stable", "HeLaTFEB", "-", "GFP", "cells", ".", "Starvation", "(", "stv", ")", "was", "used", "as", "control", ".", "Nuclear", "translocation", "of", "TFEB", "in", "stable", "HeLaTFEB", "-", "GFP", "cells", "subjected", "to", "the", "indicated", "conditions", "is", "rescue", "after", "silencing", "of", "PPP3CB", ".", "Scale", "bar", "5", "μm", ".", "(", "B", ")", "The", "graph", "shows", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "the", "percentage", "of", "nuclear", "TFEB", "translocation", "in", "Ezrin", "-", "inhibited", "cells", "compared", "to", "control", ";", "n", "=", "3", "independent", "experiments", "were", "performed", ".", "Mann", "and", "Whitney", "test", "(", "NSC668394", "and", "stv", "vs", "DMSO", ";", "siEZR", "vs", "siCTRL", ")", "*", "p", "≤", "0", ".", "05", ".", "(", "C", ")", "The", "graph", "shows", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "the", "percentage", "of", "nuclear", "TFEB", "translocation", "in", "Ezrin", "-", "inhibited", "cells", "and", "subjected", "to", "the", "silencing", "of", "PPP3CB", ".", "At", "least", "3", "independent", "experiments", "were", "performed", ".", "Mann", "and", "Whitney", "test", "(", "siPPP3CB", "vs", "siCTRL", ")", "*", "p", "≤", "0", ".", "05", ".", "(", "D", ")", "qRT", "-", "PCR", "assay", "for", "PPP3CB", "from", "HeLaTFEB", "-", "GFP", "cells", "transfected", "with", "siPPP3CB", "and", "siCTRL", ".", "The", "graph", "shows", "the", "reduction", "in", "PPP3CB", "expression", "level", "normalized", "to", "the", "Hprt", ".", "Bar", "graphs", "represent", "mean", "values", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Mann", "and", "Whitney", "test", "(", "siPPP3CB", "vs", "siCTRL", ")", ",", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "005", "(", "n", "=", "6", "independent", "experiments", ")", ".", "(", "E", ")", "Both", "pharmacological", "inhibition", "and", "silencing", "of", "EZRIN", "induce", "downshift", "of", "endogenous", "TFEB", "electrophoretic", "mobility", "in", "Western", "blot", "analysis", ".", "Torin", "treatment", "was", "used", "as", "control", ".", "(", "F", ")", "Representative", "traces", "of", "ML1", "-", "GCaMP3", "normalized", "fluorescence", "recorded", "in", "transiently", "transfected", "ARPE", "-", "19", "cells", ".", "During", "time", "-", "lapse", "recording", ",", "cells", "were", "stimulated", "with", "ML", "-", "SA1", "(", "20", "µM", ")", "after", "addition", "(", "arrowhead", ")", "of", "DMSO", "or", "NSC668394", ".", "Where", "indicated", ",", "the", "specific", "ML1", "inhibitor", "ML", "-", "SI3", "(", "10", "µM", ")", "was", "added", ".", "Bar", "graph", "reports", "the", "mean", "values", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "the", "time", "required", "by", "fluorescence", "to", "decay", "to", "half", "of", "the", "ML", "-", "SA1", "-", "induced", "peak", ".", "n", "=", "50", "cells", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", "by", "Mann", "and", "Whitney", "test", ".", "(", "G", ")", "Nuclear", "translocation", "of", "TFEB", "in", "stable", "HeLaTFEB", "-", "GFP", "cells", "subjected", "to", "the", "indicated", "conditions", "is", "reduced", "after", "Ca2", "+", "chelator", "BAPTA", "treatment", ".", "Scale", "bar", "5", "μm", ".", "H", ")", "The", "graph", "shows", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "the", "percentage", "of", "nuclear", "TFEB", "translocation", "in", "Ezrin", "-", "inhibited", "cells", "compared", "with", "DMSO", "under", "Ca2", "+", "chelator", "BAPTA", "treatment", ".", "At", "least", "3", "independent", "experiments", "were", "performed", ".", "Mann", "and", "Whitney", "test", "(", "stv", ",", "stv", "+", "BAPTA", ",", "BAPTA", ",", "NSC668394", ",", "NSC668394", "+", "BAPTA", "vs", "DMSO", ")", "*", "p", "≤", "0", ".", "05", ".", "(", "I", ")", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "for", "TFEB", "target", "genes", "(", "TRPML1", ",", "BECLIN", ",", "MAPLC3B", "and", "LAMP1", ")", "was", "performed", "on", "ARPE", "-", "19", "cells", "treated", "with", "DMSO", "or", "NSC668394", ".", "Bar", "graphs", "represent", "mean", "values", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "at", "least", "3", "independent", "experiments", ".", "Mann", "and", "Whitney", "*", "p", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "005", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Representative images from HC assay of HeLaTFEB-GFP cells transfected with control (siCTRL) or siPPP3CB, and subjected to the indicated conditions. Analysis of TFEB nuclear translocation in HeLaTFEB-GFP cells transfected with siCTRL or siPPP3CB and treated with DMSO or NSC668394, silenced for EZRIN (siEZR) or serum-starved (stv). Both pharmacological inhibition and silencing of Ezrin induced TFEB nuclear localization in stable HeLaTFEB-GFP cells. Starvation (stv) was used as control. Nuclear translocation of TFEB in stable HeLaTFEB-GFP cells subjected to the indicated conditions is rescue after silencing of PPP3CB. Scale bar 5 μm.(B) The graph shows the mean ± s.e.m. of the percentage of nuclear TFEB translocation in Ezrin-inhibited cells compared to control; n=3 independent experiments were performed. Mann and Whitney test (NSC668394 and stv vs DMSO; siEZR vs siCTRL) *p ≤ 0.05.(C) The graph shows the mean ± s.e.m. of the percentage of nuclear TFEB translocation in Ezrin-inhibited cells and subjected to the silencing of PPP3CB. At least 3 independent experiments were performed. Mann and Whitney test (siPPP3CB vs siCTRL) *p ≤ 0.05.(D) qRT-PCR assay for PPP3CB from HeLaTFEB-GFP cells transfected with siPPP3CB and siCTRL. The graph shows the reduction in PPP3CB expression level normalized to the Hprt. Bar graphs represent mean values ± s.e.m. Mann and Whitney test (siPPP3CB vs siCTRL), ***p ≤ 0.005 (n=6 independent experiments).(E) Both pharmacological inhibition and silencing of EZRIN induce downshift of endogenous TFEB electrophoretic mobility in Western blot analysis. Torin treatment was used as control.(F) Representative traces of ML1-GCaMP3 normalized fluorescence recorded in transiently transfected ARPE-19 cells. During time-lapse recording, cells were stimulated with ML-SA1 (20 µM) after addition (arrowhead) of DMSO or NSC668394. Where indicated, the specific ML1 inhibitor ML-SI3 (10 µM) was added. Bar graph reports the mean values ± s.e.m. of the time required by fluorescence to decay to half of the ML-SA1-induced peak. n = 50 cells from 3 independent experiments. ***p<0.005 by Mann and Whitney test.(G) Nuclear translocation of TFEB in stable HeLaTFEB-GFP cells subjected to the indicated conditions is reduced after Ca2+ chelator BAPTA treatment. Scale bar 5 μm.H) The graph shows the mean ± s.e.m. of the percentage of nuclear TFEB translocation in Ezrin-inhibited cells compared with DMSO under Ca2+ chelator BAPTA treatment. At least 3 independent experiments were performed. Mann and Whitney test (stv, stv+BAPTA, BAPTA, NSC668394, NSC668394+BAPTA vs DMSO) *p ≤ 0.05.(I) qRT-PCR analysis for TFEB target genes (TRPML1, BECLIN, MAPLC3B and LAMP1) was performed on ARPE-19 cells treated with DMSO or NSC668394. Bar graphs represent mean values ± s.e.m. of at least 3 independent experiments. Mann and Whitney *p ≤ 0.05, **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.005."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Confocal", "images", "of", "representative", "eye", "cryosections", "immunostained", "with", "anti", "-", "Ezrin", "(", "green", ")", "/", "anti", "-", "ZO", "-", "1", "(", "red", ")", ",", "anti", "-", "Ezrin", "-", "pT567", "(", "green", ")", "/", "anti", "-", "ZO", "-", "1", "(", "red", ")", ",", "anti", "-", "Lamp1", "(", "green", ")", "and", "anti", "-", "Sqstm1", "/", "p62", "(", "green", ")", "antibodies", "from", "6", "-", "month", "-", "old", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "sacrificed", "five", "months", "after", "DMSO", "or", "NSC668394", "treatment", ".", "Nuclei", "are", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "At", "least", "n", "=", "6", "mice", "per", "group", ".", "Scale", "bar", "100", "μm", ".", "Data", "information", ":", "(", "RPE", ")", "Retinal", "Pigment", "Epithelium", ";", "(", "OS", ")", "outer", "segment", ";", "(", "ONL", ")", "outer", "nuclear", "layer", ".", "(", "B", ")", "RPE", "was", "isolated", "5", "months", "after", "DMSO", "or", "NSC668394", "treatment", "from", "6", "-", "month", "-", "old", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "mice", ".", "Representative", "Western", "blots", "proteins", "from", "these", "tissues", "were", "performed", "to", "determine", "the", "expression", "levels", "of", "Lamp1", ",", "Ezrin", ",", "Ezrin", "-", "pT567", ",", "Sqstm1", "/", "p62", "and", "LC3", ".", "The", "plots", "show", "the", "quantification", "of", "the", "indicated", "proteins", "normalized", "to", "the", "β", "-", "Actin", "loading", "control", ".", "Bar", "graphs", "represent", "mean", "values", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "6", "mice", ")", ".", "Mann", "and", "Whitney", "test", "(", "DMSO", "vs", "WT", ";", "NSC668394", "vs", "DMSO", ")", ",", "*", "p", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "005", ".", "(", "C", ")", "Cathepsin", "B", "(", "CtsB", ")", "activity", "in", "RPE", "lysates", "from", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "and", "WT", "mice", "sacrificed", "3h", "after", "light", "on", "at", "10", "AM", "(", "diurnal", "condition", ")", ".", "RPE", "was", "isolated", "1", "week", "after", "DMSO", "or", "NSC668394", "treatment", "from", "2", "-", "month", "-", "old", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "mice", ".", "CtsB", "was", "rescued", "in", "NSC668394", "-", "treated", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "compared", "to", "DMSO", "-", "control", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "mice", ".", "Bar", "graphs", "represent", "percentage", "of", "CtsB", "activity", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", "mice", ")", "Mann", "and", "Whitney", "test", "(", "DMSO", "-", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "vs", "WT", ";", "NSC668394", "-", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "vs", "DMSO", "-", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", ")", ",", "*", "p", "≤", "0", ".", "05", ".", "(", "D", ")", "GUSB", "activity", "from", "retina", "from", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "and", "control", "mice", "sacrificed", "3h", "after", "light", "on", "at", "10", "AM", "(", "diurnal", "condition", ")", ".", "Retina", "was", "isolated", "1", "week", "after", "DMSO", "or", "NSC668394", "treatment", "from", "2", "-", "month", "-", "old", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "mice", ".", "GUSB", "was", "rescued", "in", "NSC668394", "-", "treated", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "compared", "to", "DMSO", "-", "control", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "mice", ".", "Bar", "graphs", "represent", "percentage", "of", "GUSB", "activity", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", "mice", ")", ".", "Mann", "and", "Whitney", "test", "(", "DMSO", "-", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "vs", "WT", ";", "NSC668394", "-", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "vs", "DMSO", "-", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Confocal images of representative eye cryosections immunostained with anti-Ezrin (green) /anti-ZO-1 (red), anti-Ezrin-pT567 (green) /anti-ZO-1 (red), anti-Lamp1 (green) and anti-Sqstm1/p62 (green) antibodies from 6-month-old miR-211-/- sacrificed five months after DMSO or NSC668394 treatment. Nuclei are counterstained with DAPI (blue). At least n = 6 mice per group. Scale bar 100 μm. Data information: (RPE) Retinal Pigment Epithelium; (OS) outer segment; (ONL) outer nuclear layer.(B) RPE was isolated 5 months after DMSO or NSC668394 treatment from 6-month-old miR-211-/- mice. Representative Western blots proteins from these tissues were performed to determine the expression levels of Lamp1, Ezrin, Ezrin-pT567, Sqstm1/p62 and LC3. The plots show the quantification of the indicated proteins normalized to the β-Actin loading control. Bar graphs represent mean values ± s.e.m. of independent experiments (n=6 mice). Mann and Whitney test (DMSO vs WT; NSC668394 vs DMSO), *p ≤ 0.05, ***p≤0.005.(C) Cathepsin B (CtsB) activity in RPE lysates from miR-211-/- and WT mice sacrificed 3h after light on at 10 AM (diurnal condition). RPE was isolated 1 week after DMSO or NSC668394 treatment from 2-month-old miR-211-/- mice. CtsB was rescued in NSC668394-treated miR-211-/- compared to DMSO-control miR-211-/- mice. Bar graphs represent percentage of CtsB activity ± s.e.m. of independent experiments (n=3 mice) Mann and Whitney test (DMSO-miR-211-/- vs WT; NSC668394-miR-211-/- vs DMSO-miR-211-/-), *p ≤ 0.05. (D) GUSB activity from retina from miR-211-/- and control mice sacrificed 3h after light on at 10 AM (diurnal condition). Retina was isolated 1 week after DMSO or NSC668394 treatment from 2-month-old miR-211-/- mice. GUSB was rescued in NSC668394-treated miR-211-/- compared to DMSO-control miR-211-/- mice. Bar graphs represent percentage of GUSB activity ± s.e.m. of independent experiments (n=3 mice). Mann and Whitney test (DMSO-miR-211-/- vs WT; NSC668394-miR-211-/- vs DMSO-miR-211-/-)."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Representative", "images", "of", "conventional", "TEM", "analysis", "of", "RPE", "of", "WT", ",", "DMSO", "-", "treated", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "mice", "and", "NSC668394", "-", "treated", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "three", "-", "month", "-", "old", "mice", ".", "NSC668394", "-", "treated", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "mice", "show", "rescue", "of", "accumulation", "of", "double", "-", "membrane", "phagolysosome", "-", "like", "structures", "containing", "poorly", "processed", "POS", "(", "red", "arrows", ")", "compared", "to", "DMSO", "-", "treated", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "mice", ".", "Scale", "bar", "1", "mm", ".", "Data", "information", ":", "(", "OS", ")", "outer", "segment", "(", "RPE", ")", "Retinal", "Pigment", "Epithelium", ".", "(", "B", ")", "Confocal", "images", "of", "representative", "eye", "cryosections", "immunostained", "with", "anti", "-", "Rhodopsin", "(", "green", ")", "antibody", "from", "WT", "and", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "mice", "at", "three", "months", "of", "age", "after", "DMSO", "or", "NSC668394", "treatment", ",", "which", "are", "sacrificed", "3h", "after", "light", "on", "at", "10", "AM", "(", "diurnal", "condition", ")", ".", "Nuclei", "are", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "At", "least", "n", "=", "6", "mice", "per", "group", ".", "Scale", "bar", "100", "μm", ".", "The", "enlarged", "box", "highlights", "rhodopsin", "accumulation", "in", "the", "RPE", "(", "green", "spots", ")", ".", "Scale", "bar", "5", "μm", ".", "Autofluorescence", "from", "lipofuscin", "granules", "from", "WT", "and", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "mice", "at", "three", "months", "of", "age", "after", "DMSO", "or", "NSC668394", "treatment", ".", "Representative", "images", "of", "retina", "cryosections", "immunostained", "with", "anti", "-", "Cone", "Arrestin", "(", "green", ")", "antibody", "from", "WT", "and", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "mice", "at", "three", "months", "of", "age", "after", "DMSO", "or", "NSC668394", "treatment", ".", "Nuclei", "are", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "N", "=", "at", "least", "6", "mice", "per", "group", ".", "Scale", "bar", "100", "μm", ".", "Data", "information", ":", "(", "OS", ")", "outer", "segment", ";", "(", "ONL", ")", "outer", "nuclear", "layer", ";", "(", "RPE", ")", "Retinal", "Pigment", "Epithelium", ".", "(", "C", ")", "Graphs", "showing", "number", "of", "lipofuscin", "granules", "from", "the", "RPE", "of", "mice", "as", "in", "(", "B", ")", ".", "Bar", "graphs", "represent", "mean", "values", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Mann", "and", "Whitney", "test", "(", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "DMSO", "vs", "WT", "and", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "NSC668394", "vs", "DMSO", "treated", "mice", ")", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "005", ".", "*", "p", "≤", "0", ".", "05", "(", "n", "=", "6", "mice", ")", ".", "(", "D", ")", "Graphs", "show", "cone", "percentage", "(", "cones", "/", "area", ")", "from", "the", "retina", "of", "mice", "treated", "as", "in", "(", "B", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Mann", "and", "Whitney", "test", "(", "DMSO", "vs", "WT", "and", "NSC668394", "vs", "DMSO", "treated", "mice", ")", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "005", "(", "n", "=", "6", "mice", ")", ".", "(", "E", ")", "Representative", "flicker", "traces", "at", "three", "months", "of", "age", "show", "the", "rescue", "of", "flicker", "responses", "of", "NSC668394", "-", "treated", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "mice", "(", "green", "lines", ")", "compared", "to", "DMSO", "-", "treated", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "control", "mice", "(", "red", "lines", ")", ".", "WT", "mice", "were", "used", "as", "a", "control", "(", "black", "lines", ")", ".", "Flicker", "recordings", "were", "performed", "with", "light", "intensities", "ranging", "from", "10", "−", "4", "to", "15", "cd", "s", "/", "m2", "in", "steps", "of", "0", ".", "6", "logarithmic", "units", "at", "6", " ", "Hz", "frequency", ".", "(", "F", ")", "Flicker", "responses", ",", "plotted", "as", "a", "function", "of", "stimulus", "intensity", ",", "from", "WT", "(", "black", "lines", ")", ",", "DMSO", "-", "treated", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "(", "red", "lines", ")", "and", "NSC668394", "-", "treated", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "(", "green", "lines", ")", "mice", ",", "at", "three", "months", "of", "age", ".", "The", "amplitude", "of", "the", "recordings", "from", "NSC668394", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "treated", "mice", "is", "significantly", "rescued", "compared", "to", "DMSO", "-", "treated", "miR", "-", "211", "-", "/", "-", "mice", ".", "WT", "mice", "were", "used", "as", "a", "control", ".", "Error", "bars", "represent", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "ANOVA", "test", "(", "DMSO", "vs", "WT", "and", "NSC668394", "vs", "DMSO", "treated", "mice", ")", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "≤", "0", ".", "005", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Representative images of conventional TEM analysis of RPE of WT, DMSO-treated miR-211-/- mice and NSC668394-treated miR-211-/- three-month-old mice. NSC668394-treated miR-211-/- mice show rescue of accumulation of double-membrane phagolysosome-like structures containing poorly processed POS (red arrows) compared to DMSO-treated miR-211-/- mice. Scale bar 1 mm. Data information: (OS) outer segment (RPE) Retinal Pigment Epithelium.(B) Confocal images of representative eye cryosections immunostained with anti-Rhodopsin (green) antibody from WT and miR-211-/- mice at three months of age after DMSO or NSC668394 treatment, which are sacrificed 3h after light on at 10 AM (diurnal condition). Nuclei are counterstained with DAPI (blue). At least n = 6 mice per group. Scale bar 100 μm. The enlarged box highlights rhodopsin accumulation in the RPE (green spots). Scale bar 5 μm. Autofluorescence from lipofuscin granules from WT and miR-211-/- mice at three months of age after DMSO or NSC668394 treatment. Representative images of retina cryosections immunostained with anti-Cone Arrestin (green) antibody from WT and miR-211-/- mice at three months of age after DMSO or NSC668394 treatment. Nuclei are counterstained with DAPI (blue). N = at least 6 mice per group. Scale bar 100 μm. Data information: (OS) outer segment; (ONL) outer nuclear layer; (RPE) Retinal Pigment Epithelium.(C) Graphs showing number of lipofuscin granules from the RPE of mice as in (B). Bar graphs represent mean values ± s.e.m. Mann and Whitney test (miR-211-/- DMSO vs WT and miR-211-/- NSC668394 vs DMSO treated mice) ***p ≤ 0.005. *p ≤ 0.05 (n=6 mice).(D) Graphs show cone percentage (cones/area) from the retina of mice treated as in (B). Error bars represent s.e.m. Mann and Whitney test (DMSO vs WT and NSC668394 vs DMSO treated mice) ***p ≤ 0.005 (n=6 mice).(E) Representative flicker traces at three months of age show the rescue of flicker responses of NSC668394-treated miR-211-/- mice (green lines) compared to DMSO-treated miR-211-/- control mice (red lines). WT mice were used as a control (black lines). Flicker recordings were performed with light intensities ranging from 10−4 to 15 cd s/m2 in steps of 0.6 logarithmic units at 6 Hz frequency. (F) Flicker responses, plotted as a function of stimulus intensity, from WT (black lines), DMSO-treated miR-211-/- (red lines) and NSC668394-treated miR-211-/- (green lines) mice, at three months of age. The amplitude of the recordings from NSC668394 miR-211-/- treated mice is significantly rescued compared to DMSO-treated miR-211-/- mice. WT mice were used as a control. Error bars represent s.e.m. ANOVA test (DMSO vs WT and NSC668394 vs DMSO treated mice) **p ≤ 0.01, ***p ≤ 0.005. "}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "Met", "-", "Phe", "formation", "monitored", "upon", "rapidly", "mixing", "initiation", "complexes", "(", "80S", "IC", ")", "with", "ternary", "complexes", "eEF1A", "-", "GTP", "-", "[", "14C", "]", "Phe", "-", "tRNAPhe", "in", "the", "absence", "(", "orange", ",", "0", ".", "13", "±", "0", ".", "02", "s", "-", "1", ")", "or", "presence", "(", "cyan", ",", "0", ".", "15", "±", "0", ".", "02", "s", "-", "1", ")", "of", "eEF3", "(", "2", "µM", ")", "in", "a", "quench", "-", "flow", "apparatus", ",", "and", "the", "extent", "of", "peptide", "formation", "was", "analyzed", "by", "HPLC", "and", "radioactivity", "counting", ".", "Data", "are", "normalized", "to", "Met", "-", "Phe", "formation", "in", "the", "absence", "of", "eEF3", "with", "the", "maximum", "value", "in", "the", "dataset", "set", "to", "1", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "of", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "(", "C", ")", "Met", "-", "Phe", "-", "Val", "formation", "monitored", "upon", "rapidly", "mixing", "80S", "complexes", "carrying", "MetPhe", "-", "tRNAPhe", "(", "80S", "2C", ")", "with", "ternary", "complexes", "eEF1A", "-", "GTP", "-", "[", "14C", "]", "Val", "-", "tRNAVal", "in", "the", "presence", "of", "eEF2", "and", "eEF3", "(", "green", ",", "0", ".", "15", "±", "0", ".", "01", "s", "-", "1", ")", ",", "eEF2", "(", "red", ")", "or", "eEF3", "(", "blue", ")", ".", "Data", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "of", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "(", "D", ")", "Met", "-", "Phe", "-", "Val", "formation", "monitored", "with", "80S", "2C", "incubated", "with", "eEF2", "and", "eEF3", "(", "green", ",", "0", ".", "4", "±", "0", ".", "14", "s", "-", "1", ")", ",", "eEF2", "(", "red", ",", "1", ".", "0", "±", "0", ".", "5", "s", "-", "1", ")", "or", "eEF3", "(", "blue", ")", ",", "or", "in", "the", "absence", "of", "eEF2", "and", "eEF3", "(", "brown", ")", "for", "15", "min", "before", "adding", "with", "ternary", "complexes", "eEF1A", "-", "GTP", "-", "[", "14C", "]", "Val", "-", "tRNAVal", "and", "monitoring", "the", "kinetics", "of", "Val", "incorporation", ".", "Data", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "of", "n", "=", "3", ".", "Data", "information", ":", "Datasets", "in", "(", "C", ")", "and", "(", "D", ")", "are", "normalized", "to", "Met", "-", "Phe", "-", "Val", "formation", "in", "presence", "of", "eEF2", "and", "eEF3", "with", "the", "maximum", "value", "set", "to", "1", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B) Met-Phe formation monitored upon rapidly mixing initiation complexes (80S IC) with ternary complexes eEF1A-GTP-[14C]Phe-tRNAPhe in the absence (orange, 0.13±0.02 s-1) or presence (cyan, 0.15±0.02 s-1) of eEF3 (2 µM) in a quench-flow apparatus, and the extent of peptide formation was analyzed by HPLC and radioactivity counting. Data are normalized to Met-Phe formation in the absence of eEF3 with the maximum value in the dataset set to 1. Data are presented as mean ± SEM of n = 3 biological replicates. (C) Met-Phe-Val formation monitored upon rapidly mixing 80S complexes carrying MetPhe-tRNAPhe (80S 2C) with ternary complexes eEF1A-GTP-[14C]Val-tRNAVal in the presence of eEF2 and eEF3 (green, 0.15±0.01 s-1), eEF2 (red) or eEF3 (blue). Data presented as mean ± SEM of n = 3 biological replicates. (D) Met-Phe-Val formation monitored with 80S 2C incubated with eEF2 and eEF3 (green, 0.4±0.14 s-1), eEF2 (red, 1.0±0.5 s-1) or eEF3 (blue), or in the absence of eEF2 and eEF3 (brown) for 15 min before adding with ternary complexes eEF1A-GTP-[14C]Val-tRNAVal and monitoring the kinetics of Val incorporation. Data presented as mean ± SEM of n = 3. Data information: Datasets in (C) and (D) are normalized to Met-Phe-Val formation in presence of eEF2 and eEF3 with the maximum value set to 1. "}
{"words": ["Figure", "2", "(", "B", ")", "mRNA", "-", "tRNA", "translocation", "monitored", "in", "a", "time", "-", "resolved", "Pmn", "assay", "upon", "mixing", "80S", "2C", "with", "Pmn", "in", "the", "absence", "(", "brown", "triangles", ")", "or", "presence", "of", "eEF2", "and", "eEF3", "(", "green", ",", "0", ".", "13", "±", "0", ".", "01", "min", "-", "1", ")", ",", "eEF2", "(", "red", ",", "0", ".", "030", "±", "0", ".", "005", "min", "-", "1", ")", "or", "eEF3", "(", "blue", ",", "0", ".", "10", "±", "0", ".", "01", "min", "-", "1", ")", ".", "Data", "are", "normalized", "to", "Met", "-", "Phe", "-", "Pmn", "formation", "in", "presence", "of", "eEF2", "with", "the", "maximum", "value", "set", "to", "1", ".", "Data", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "of", "n", "=", "3", ".", "(", "C", ")", "Dissociation", "of", "deacylated", "tRNA", "from", "the", "E", "site", "by", "the", "fluorescence", "change", "of", "tRNAfMet", "(", "Flu", ")", "upon", "rapidly", "mixing", "of", "80S", "2C", "with", "buffer", "(", "grey", ")", ",", "or", "with", "ternary", "complexes", "eEF1A", "-", "GTP", "-", "[", "14C", "]", "Val", "-", "tRNAVal", "in", "the", "presence", "of", "eEF2", "and", "eEF3", "(", "green", ")", ",", "eEF2", "(", "red", ")", ",", "eEF3", "(", "blue", ")", ",", "or", "eEF2", "and", "eEF3", "without", "the", "ternary", "complex", "(", "magenta", ")", "in", "a", "stopped", "-", "flow", "apparatus", ".", "Each", "trace", "is", "an", "average", "of", "5", "-", "7", "individual", "time", "courses", "and", "normalized", "at", "1", "for", "the", "fluorescence", "at", "the", "start", "of", "the", "reaction", ".", "(", "D", ")", "tRNAfMet", "(", "Flu", ")", "co", "-", "eluting", "with", "80S", "2C", "incubated", "without", "factors", "(", "orange", ")", ",", "with", "eEF2", "(", "red", ")", ",", "with", "eEF2", "and", "eEF3", "(", "magenta", ")", ",", "or", "with", "eEF2", ",", "eEF3", "and", "TC", "-", "Val", "(", "green", ")", "for", "15", "min", "before", "loading", "on", "a", "BioSuite", "450", "size", "-", "exclusion", "column", "to", "separate", "ribosome", "-", "bound", "and", "-", "unbound", "tRNA", ".", "Data", "are", "normalized", "to", "tRNAfMet", "(", "Flu", ")", "bound", "to", "80S", "2C", "in", "the", "absence", "of", "eEF2", "/", "eEF3", "with", "the", "maximum", "value", "set", "to", "100", "%", ".", "Data", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "of", "n", "=", "3", ".", "(", "E", ")", "Dissociation", "of", "tRNAfMet", "(", "Flu", ")", "from", "80S", "2C", "deacylated", "tRNA", "incubated", "with", "eEF2", "and", "eEF3", "(", "green", ")", "or", "eEF2", "(", "red", ")", "for", "15", "min", "before", "adding", "with", "ternary", "complexes", ".", "Each", "trace", "is", "an", "average", "of", "5", "-", "7", "individual", "time", "courses", "and", "normalized", "at", "1", "for", "the", "fluorescence", "at", "the", "start", "of", "the", "reaction", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(B) mRNA-tRNA translocation monitored in a time-resolved Pmn assay upon mixing 80S 2C with Pmn in the absence (brown triangles) or presence of eEF2 and eEF3 (green, 0.13±0.01 min-1), eEF2 (red, 0.030±0.005 min-1) or eEF3 (blue, 0.10±0.01 min-1). Data are normalized to Met-Phe-Pmn formation in presence of eEF2 with the maximum value set to 1. Data presented as mean ± SEM of n = 3.(C) Dissociation of deacylated tRNA from the E site by the fluorescence change of tRNAfMet(Flu) upon rapidly mixing of 80S 2C with buffer (grey), or with ternary complexes eEF1A-GTP-[14C]Val-tRNAVal in the presence of eEF2 and eEF3 (green), eEF2 (red), eEF3 (blue), or eEF2 and eEF3 without the ternary complex (magenta) in a stopped-flow apparatus. Each trace is an average of 5-7 individual time courses and normalized at 1 for the fluorescence at the start of the reaction.(D) tRNAfMet(Flu) co-eluting with 80S 2C incubated without factors (orange), with eEF2 (red), with eEF2 and eEF3 (magenta), or with eEF2, eEF3 and TC-Val (green) for 15 min before loading on a BioSuite 450 size-exclusion column to separate ribosome-bound and -unbound tRNA. Data are normalized to tRNAfMet(Flu) bound to 80S 2C in the absence of eEF2/eEF3 with the maximum value set to 100%. Data presented as mean ± SEM of n = 3.(E) Dissociation of tRNAfMet(Flu) from 80S 2C deacylated tRNA incubated with eEF2 and eEF3 (green) or eEF2 (red) for 15 min before adding with ternary complexes. Each trace is an average of 5-7 individual time courses and normalized at 1 for the fluorescence at the start of the reaction."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "F", ")", "Codon", "-", "specific", "ribosome", "occupancies", "for", "21", "nt", "RPFs", "from", "WT", "and", "eEF3d", "cells", "(", "two", "biological", "replicates", ")", ".", "CGA", "and", "AGG", "codons", "are", "shown", "in", "red", "and", "purple", ",", "respectively", ".", "Variance", "for", "each", "dataset", "is", "indicated", ".", "(", "G", ")", "Scatter", "plot", "of", "codon", "-", "specific", "occupancies", "for", "28", "nt", "RPFs", "comparing", "eEF3d", "to", "WT", "cells", "from", "libraries", "prepared", "with", "CHX", "+", "ANS", ".", "Trend", "line", "(", "blue", ")", "and", "its", "slope", "are", "shown", ".", "Codons", "that", "encode", "proline", "and", "glycine", "are", "colored", "in", "purple", "and", "green", ",", "respectively", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(F) Codon-specific ribosome occupancies for 21 nt RPFs from WT and eEF3d cells (two biological replicates). CGA and AGG codons are shown in red and purple, respectively. Variance for each dataset is indicated.(G) Scatter plot of codon-specific occupancies for 28 nt RPFs comparing eEF3d to WT cells from libraries prepared with CHX+ANS. Trend line (blue) and its slope are shown. Codons that encode proline and glycine are colored in purple and green, respectively."}
{"words": ["Figure", "1Telomeric", "lncRNA", "levels", "in", "the", "indicated", "deletion", "strains", "as", "analyzed", "by", "dot", "blot", "(", "top", ")", "or", "Northern", "blot", "hybridization", "(", "bottom", ")", "using", "a", "double", "‐", "stranded", "telomeric", "probe", ".", "Telomeric", "dot", "blot", "signals", "are", "expressed", "as", "fold", "increase", "relative", "to", "wtA", "after", "normalization", "through", "U6", "snRNA", ".", "Bars", "and", "error", "bars", "are", "averages", "and", "s", ".", "d", ".", "from", "4", "independent", "experiments", ".", "U6", "and", "18S", "rRNA", "are", "shown", "as", "loading", "controls", "for", "Northern", "blotting", ".", "The", "asterisk", "indicates", "unspliced", "U6", ".", "Molecular", "weights", "are", "on", "the", "left", "in", "kilobases", ".", "ARRET", "and", "αARRETNorthern", "blot", "analysis", "of", "the", "indicated", "strains", "using", "strand", "‐", "specific", "probes", ".", "Telomere", "length", "analysis", "of", "ApaI", "‐", "digested", "DNA", "from", "the", "indicated", "strains", ".", "Quantification", "of", "subtelomeric", "DNA", "from", "ChIP", "experiments", "using", "strains", "carrying", "the", "indicated", "Myc", "‐", "tagged", "proteins", "(", "2A9", "and", "8B7", ":", "SPBC2A9", ".", "02", "‐", "Myc", "and", "SPBP8B7", ".", "08c", "‐", "Myc", ",", "respectively", ")", ".", "Immunoprecipitated", "DNA", "is", "expressed", "as", "fraction", "of", "input", "DNA", ".", "An", "untagged", "strain", "(", "−", ")", "served", "as", "a", "negative", "control", ".", "Bars", "and", "error", "bars", "are", "averages", "and", "s", ".", "d", ".", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "significance", "was", "assayed", "using", "the", "unpaired", ",", "two", "‐", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ".", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "001", "relative", "to", "untagged", "strain", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Telomeric lncRNA levels in the indicated deletion strains as analyzed by dot blot (top) or Northern blot hybridization (bottom) using a double‐stranded telomeric probe. Telomeric dot blot signals are expressed as fold increase relative to wtA after normalization through U6 snRNA. Bars and error bars are averages and s.d. from 4 independent experiments. U6 and 18S rRNA are shown as loading controls for Northern blotting. The asterisk indicates unspliced U6. Molecular weights are on the left in kilobases.ARRET and αARRETNorthern blot analysis of the indicated strains using strand‐specific probes.Telomere length analysis of ApaI‐digested DNA from the indicated strains.Quantification of subtelomeric DNA from ChIP experiments using strains carrying the indicated Myc‐tagged proteins (2A9 and 8B7: SPBC2A9.02‐Myc and SPBP8B7.08c‐Myc, respectively). Immunoprecipitated DNA is expressed as fraction of input DNA. An untagged strain (−) served as a negative control. Bars and error bars are averages and s.d. from three independent experiments. Statistical significance was assayed using the unpaired, two‐tailed Student's t‐test. ***P 0.001 relative to untagged strain."}
{"words": ["Figure", "2Chromosome", "maps", "of", "differentially", "expressed", "genes", "in", "cay1Δ", "cells", "shown", "as", "fold", "enrichment", "over", "wt", ".", "Red", "dots", "are", "overexpressed", "genes", "and", "Tf2", "retrotransposons", ",", "blue", "dots", "are", "overexpressed", "LTR", "sequences", ".", "Northern", "blot", "analysis", "of", "tlh1", "/", "2", "+", ",", "Tf2", "retrotransposons", ",", "and", "18S", "rRNA", "(", "loading", "control", ")", "in", "wt", ",", "cay1Δ", ",", "and", "trichostatin", "A", "(", "TSA", ")", "‐", "treated", "wt", "cells", ".", "Black", "arrowhead", "indicates", "tlh1", "/", "2", "+", "mRNA", ";", "red", "arrowhead", "unprocessed", "Tf2", "transcripts", ";", "and", "blue", "arrowhead", "processed", "Tf2", "transcripts", ".", "ChIP", "analysis", "of", "Cay1", "‐", "Myc", "binding", "to", "the", "indicated", "genomic", "loci", ".", "subtel", ":", "subtelomeres", ";", "Tf2", ":", "Tf2", "retrotransposon", "genes", ";", "LTR", ":", "Tf2", "LTR", "sequences", ";", "Tlh", ":", "tlh1", "/", "2", "+", "genes", ";", "cen", ":", "centromeres", ".", "Immunoprecipitated", "DNA", "is", "normalized", "to", "input", "DNA", "and", "expressed", "as", "fold", "increase", "over", "untagged", "strains", "(", "unt", ")", ".", "ChIP", "analysis", "of", "H3K9ac", ",", "H3K9me3", ",", "and", "total", "H3", "at", "the", "indicated", "genomic", "loci", ".", "Immunoprecipitated", "DNA", "is", "normalized", "to", "input", "DNA", "and", "expressed", "as", "fold", "increase", "over", "wt", "after", "subtraction", "of", "values", "obtained", "for", "negative", "control", "immunoprecipitations", "performed", "with", "beads", "only", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Chromosome maps of differentially expressed genes in cay1Δ cells shown as fold enrichment over wt. Red dots are overexpressed genes and Tf2 retrotransposons, blue dots are overexpressed LTR sequences.Northern blot analysis of tlh1/2+, Tf2 retrotransposons, and 18S rRNA (loading control) in wt, cay1Δ, and trichostatin A (TSA)‐treated wt cells. Black arrowhead indicates tlh1/2+ mRNA; red arrowhead unprocessed Tf2 transcripts; and blue arrowhead processed Tf2 transcripts.ChIP analysis of Cay1‐Myc binding to the indicated genomic loci. subtel: subtelomeres; Tf2: Tf2 retrotransposon genes; LTR: Tf2 LTR sequences; Tlh: tlh1/2+ genes; cen: centromeres. Immunoprecipitated DNA is normalized to input DNA and expressed as fold increase over untagged strains (unt).ChIP analysis of H3K9ac, H3K9me3, and total H3 at the indicated genomic loci. Immunoprecipitated DNA is normalized to input DNA and expressed as fold increase over wt after subtraction of values obtained for negative control immunoprecipitations performed with beads only."}
{"words": ["Figure", "3Western", "blot", "analysis", "of", "endogenous", "Rap1", "and", "Taz1", "in", "the", "indicated", "strains", ".", "Act1", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Asterisks", "indicate", "cross", "‐", "reacting", "bands", ".", "RT", "-", "PCR", "analysis", "of", "splicing", "efficiencies", "of", "the", "indicated", "pre", "‐", "mRNAs", "in", "wt", "and", "cay1", "∆", "cells", ".", "The", "prp1", "‐", "1", "strain", "carries", "a", "thermosensitive", "allele", "of", "the", "splicing", "factor", "Prp1", "and", "was", "used", "as", "a", "positive", "control", "for", "splicing", "impairment", ".", "prp1", "‐", "1", "cells", "were", "grown", "at", "36", "°", "C", "for", "4", "h", "before", "harvesting", ".", "Amplification", "products", "corresponding", "to", "unspliced", "and", "spliced", "mRNAs", "are", "indicated", "by", "asterisks", "and", "gene", "names", ",", "respectively", ".", "rap1T", "indicates", "amplification", "products", "obtained", "with", "oligonucleotides", "spanning", "rap1", "+", "exon", "3", "and", "thereby", "amplifying", "both", "spliced", "and", "unspliced", "mRNA", ".", "Intronless", "act1", "+", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Numbers", "at", "the", "bottom", "of", "each", "panel", "are", "ratios", "between", "spliced", "and", "unspliced", "forms", "(", "s", "/", "u", ")", "and", "spliced", "and", "act1", "+", "(", "s", "/", "act1", ")", ".", "Values", "are", "expressed", "as", "fold", "increase", "over", "wt", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "Rap1", "-", "YFP", "protein", "levels", "in", "the", "indicated", "strains", "upon", "nmt1", "promoter", "shutoff", "by", "thiamine", "addition", ".", "Membranes", "were", "probed", "with", "antibodies", "against", "GFP", "and", "Act1", "(", "loading", "control", ")", ".", "Quantification", "of", "Rap1", "-", "YFP", "protein", "levels", "in", "experiments", "as", "in", "(", "C", ")", ".", "Rap1", "-", "YFP", "levels", "are", "expressed", "as", "fold", "increase", "over", "time", "0", "after", "normalization", "through", "Act1", ".", "Data", "points", "and", "error", "bars", "are", "averages", "and", "s", ".", "d", ".", "from", "at", "least", "four", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "significance", "was", "assayed", "using", "the", "unpaired", ",", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "P", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "0", ".", "01", "for", "cay1", "+", "versus", "cay1", "∆", "samples", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Western blot analysis of endogenous Rap1 and Taz1 in the indicated strains. Act1 was used as a loading control. Asterisks indicate cross‐reacting bands.RT-PCR analysis of splicing efficiencies of the indicated pre‐mRNAs in wt and cay1∆ cells. The prp1‐1 strain carries a thermosensitive allele of the splicing factor Prp1 and was used as a positive control for splicing impairment. prp1‐1 cells were grown at 36°C for 4 h before harvesting. Amplification products corresponding to unspliced and spliced mRNAs are indicated by asterisks and gene names, respectively. rap1T indicates amplification products obtained with oligonucleotides spanning rap1+ exon 3 and thereby amplifying both spliced and unspliced mRNA. Intronless act1+ was used as a loading control. Numbers at the bottom of each panel are ratios between spliced and unspliced forms (s/u) and spliced and act1+ (s/act1). Values are expressed as fold increase over wt.Western blot analysis of Rap1-YFP protein levels in the indicated strains upon nmt1 promoter shutoff by thiamine addition. Membranes were probed with antibodies against GFP and Act1 (loading control).Quantification of Rap1-YFP protein levels in experiments as in (C). Rap1-YFP levels are expressed as fold increase over time 0 after normalization through Act1. Data points and error bars are averages and s.d. from at least four independent experiments. Statistical significance was assayed using the unpaired, two-tailed Student's t-test. *P 0.05, **P 0.01 for cay1+ versus cay1∆ samples."}
{"words": ["Figure", "4Telomere", "length", "analysis", "of", "ApaI", "‐", "digested", "DNA", "from", "cay1", "∆", "trt1", "∆", "cells", "harvested", "at", "increasing", "generation", "doublings", "(", "gen", ")", ".", "Telomere", "length", "analysis", "of", "ApaI", "‐", "digested", "DNA", "from", "the", "indicated", "strains", ".", "dh", ":", "centromeric", "dh", "repeats", "shown", "as", "loading", "control", ".", "PFGE", "analysis", "of", "telomeric", "fusions", "in", "strains", "grown", "to", "logarithmic", "phase", "(", "log", ")", "or", "G1", "‐", "arrested", "by", "nitrogen", "starvation", "(", "G1", ")", ".", "Genomic", "DNA", "was", "digested", "with", "NotI", "and", "hybridized", "to", "C", ",", "I", ",", "L", ",", "and", "M", "probes", "detecting", "terminal", "fragments", "of", "chromosomes", "I", "and", "II", ".", "Bands", "corresponding", "to", "chromosome", "end", "fusions", "are", "indicated", "(", "fused", ")", ".", "Northern", "blot", "analysis", "of", "ARIA", ",", "ARRET", ",", "Tf2", "retrotransposons", ",", "and", "18S", "rRNA", "(", "loading", "control", ")", "in", "the", "indicated", "strains", ".", "qRT", "-", "PCR", "quantification", "of", "TERRA", "levels", "expressed", "as", "fold", "increase", "over", "wt", "after", "normalization", "through", "act1", "+", "mRNA", ".", "Bars", "and", "error", "bars", "are", "averages", "and", "s", ".", "d", ".", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "significance", "was", "assayed", "using", "the", "unpaired", ",", "two", "‐", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ".", "*", "*", "P", "0", ".", "01", "relative", "to", "wt", ".", "ChIP", "analysis", "of", "H3K9ac", "and", "total", "H3", "for", "the", "indicated", "strains", ".", "Immunoprecipitated", "DNA", "is", "normalized", "to", "input", "DNA", "and", "expressed", "as", "fold", "increase", "over", "wt", "after", "subtraction", "of", "values", "obtained", "for", "negative", "control", "immunoprecipitations", "performed", "with", "beads", "only", ".", "Bars", "and", "error", "bars", "are", "averages", "and", "s", ".", "d", ".", "from", "at", "least", "four", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "significance", "was", "assayed", "using", "the", "unpaired", ",", "two", "‐", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ".", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "001", "relative", "to", "wt", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Telomere length analysis of ApaI‐digested DNA from cay1∆trt1∆ cells harvested at increasing generation doublings (gen).Telomere length analysis of ApaI‐digested DNA from the indicated strains. dh: centromeric dh repeats shown as loading control.PFGE analysis of telomeric fusions in strains grown to logarithmic phase (log) or G1‐arrested by nitrogen starvation (G1). Genomic DNA was digested with NotI and hybridized to C, I, L, and M probes detecting terminal fragments of chromosomes I and II. Bands corresponding to chromosome end fusions are indicated (fused).Northern blot analysis of ARIA, ARRET, Tf2 retrotransposons, and 18S rRNA (loading control) in the indicated strains.qRT-PCR quantification of TERRA levels expressed as fold increase over wt after normalization through act1+ mRNA. Bars and error bars are averages and s.d. from 3 independent experiments. Statistical significance was assayed using the unpaired, two‐tailed Student's t‐test. **P 0.01 relative to wt.ChIP analysis of H3K9ac and total H3 for the indicated strains. Immunoprecipitated DNA is normalized to input DNA and expressed as fold increase over wt after subtraction of values obtained for negative control immunoprecipitations performed with beads only. Bars and error bars are averages and s.d. from at least four independent experiments. Statistical significance was assayed using the unpaired, two‐tailed Student's t‐test. ***P 0.001 relative to wt."}
{"words": ["Figure", "5Serial", "dilutions", "of", "the", "indicated", "strains", "were", "spotted", "on", "complete", "medium", "and", "grown", "at", "30", "°", "C", "or", "20", "°", "C", ".", "Otrt1", "∆", "and", "Otrt1", "∆", "cay1", "∆", "are", "strains", "with", "circularized", "chromosomes", "lacking", "telomeric", "sequence", "(", "Supplementary", "Fig", "S7", ")", ".", "Representative", "images", "of", "wt", "and", "cay1", "∆", "cells", "grown", "for", "24", "h", "at", "30", "°", "C", "or", "20", "°", "C", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "μm", ".", "Quantification", "of", "cell", "length", "for", "strains", "grown", "in", "complete", "medium", "for", "24", "h", "at", "30", "°", "C", "or", "20", "°", "C", ".", "Each", "dot", "represents", "a", "single", "cell", "and", "median", "cell", "length", "(", "m", ")", "is", "indicated", "for", "each", "sample", ".", "Data", "are", "from", "three", "independent", "experiments", "and", "at", "least", "100", "cells", "were", "scored", "per", "sample", "in", "each", "experiment", ".", "Top", ":", "Examples", "of", "DAPI", "‐", "stained", "wt", "and", "cay1", "∆", "cells", "grown", "in", "complete", "medium", "for", "24", "h", "at", "30", "°", "C", "or", "20", "°", "C", ".", "The", "white", "arrowhead", "indicates", "a", "chromosome", "bridge", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "Bottom", ":", "Quantification", "of", "chromosome", "bridges", ".", "Bars", "and", "error", "bars", "are", "averages", "and", "s", ".", "d", ".", "from", "three", "independent", "experiments", "and", "at", "least", "200", "cells", "were", "scored", "per", "sample", "in", "each", "experiment", ".", "Statistical", "significance", "was", "assayed", "using", "the", "unpaired", ",", "two", "‐", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ".", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "001", "relative", "to", "30", "°", "C", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Serial dilutions of the indicated strains were spotted on complete medium and grown at 30°C or 20°C. Otrt1∆ and Otrt1∆cay1∆ are strains with circularized chromosomes lacking telomeric sequence (Supplementary Fig S7).Representative images of wt and cay1∆ cells grown for 24 h at 30°C or 20°C. Scale bar, 20 μm.Quantification of cell length for strains grown in complete medium for 24 h at 30°C or 20°C. Each dot represents a single cell and median cell length (m) is indicated for each sample. Data are from three independent experiments and at least 100 cells were scored per sample in each experiment.Top: Examples of DAPI‐stained wt and cay1∆ cells grown in complete medium for 24 h at 30°C or 20°C. The white arrowhead indicates a chromosome bridge. Scale bar, 10 μm. Bottom: Quantification of chromosome bridges. Bars and error bars are averages and s.d. from three independent experiments and at least 200 cells were scored per sample in each experiment. Statistical significance was assayed using the unpaired, two‐tailed Student's t‐test. ***P 0.001 relative to 30°C."}
{"words": ["Figure", "6RT", "-", "PCR", "analysis", "of", "pre", "‐", "mRNA", "splicing", "efficiencies", "of", "rap1", "+", "and", "poz1", "+", "pre", "‐", "mRNAs", "in", "cay1", "+", "and", "cay1Δ", "cells", "expressing", "Cay1", "‐", "YFP", "or", "Rap1", "‐", "YFP", ".", "Amplification", "products", "corresponding", "to", "unspliced", "and", "spliced", "mRNAs", "are", "indicated", "by", "asterisks", "and", "gene", "names", ",", "respectively", ".", "rap1T", "indicates", "amplification", "products", "obtained", "with", "oligonucleotides", "spanning", "rap1", "exon", "3", "and", "thereby", "amplifying", "both", "spliced", "and", "unspliced", "mRNA", ".", "Intronless", "act1", "+", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Numbers", "at", "the", "bottom", "of", "each", "panel", "are", "ratios", "between", "spliced", "and", "unspliced", "forms", "(", "s", "/", "u", ")", "and", "spliced", "and", "act1", "+", "(", "s", "/", "act1", ")", ".", "Values", "are", "expressed", "as", "fold", "increase", "over", "wt", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "total", "proteins", "from", "early", "generation", "cay1", "+", "and", "cay1Δ", "cells", "expressing", "Cay1", "‐", "YFP", ",", "Rap1", "‐", "YFP", ",", "and", "Taz1", "‐", "YFP", "using", "antibodies", "against", "Rap1", ",", "Taz1", ",", "and", "Act1", "(", "loading", "control", ")", ".", "Numbers", "at", "the", "bottom", "are", "ratios", "between", "Rap1", "proteins", "(", "endogenous", "plus", "ectopic", ")", "and", "Act1", "(", "Rap1", "/", "Act1", ")", ".", "Values", "are", "expressed", "as", "fold", "increase", "over", "wt", ".", "Left", ":", "Representative", "YFPfluorescence", "microscopy", "and", "DIC", "images", "of", "cay1", "∆", "strains", "expressing", "Cay1", "‐", "YFP", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "Right", ":", "Representative", "YFP", "and", "RFP", "fluorescence", "images", "of", "Cay1", "‐", "YFP", "‐", "and", "Pot1", "‐", "RFP", "‐", "expressing", "cells", ".", "Arrows", "point", "to", "YFP", "and", "RFP", "foci", "within", "the", "same", "nucleus", "demonstrating", "lack", "of", "co", "‐", "localization", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μm", ".", "Representative", "YFPfluorescence", "microscopy", "and", "DIC", "images", "of", "cay1", "+", "and", "cay1", "∆", "strains", "expressing", "Rap1", "‐", "YFP", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6RT-PCR analysis of pre‐mRNA splicing efficiencies of rap1+ and poz1+ pre‐mRNAs in cay1+ and cay1Δ cells expressing Cay1‐YFP or Rap1‐YFP. Amplification products corresponding to unspliced and spliced mRNAs are indicated by asterisks and gene names, respectively. rap1T indicates amplification products obtained with oligonucleotides spanning rap1 exon 3 and thereby amplifying both spliced and unspliced mRNA. Intronless act1+ was used as a loading control. Numbers at the bottom of each panel are ratios between spliced and unspliced forms (s/u) and spliced and act1+ (s/act1). Values are expressed as fold increase over wt.Western blot analysis of total proteins from early generation cay1+ and cay1Δ cells expressing Cay1‐YFP, Rap1‐YFP, and Taz1‐YFP using antibodies against Rap1, Taz1, and Act1 (loading control). Numbers at the bottom are ratios between Rap1 proteins (endogenous plus ectopic) and Act1 (Rap1/Act1). Values are expressed as fold increase over wt.Left: Representative YFPfluorescence microscopy and DIC images of cay1∆ strains expressing Cay1‐YFP. Scale bar, 10 μm. Right: Representative YFP and RFP fluorescence images of Cay1‐YFP‐ and Pot1‐RFP‐expressing cells. Arrows point to YFP and RFP foci within the same nucleus demonstrating lack of co‐localization. Scale bar, 5 μm.Representative YFPfluorescence microscopy and DIC images of cay1+ and cay1∆ strains expressing Rap1‐YFP. Scale bar, 5 μm."}
{"words": ["Figure", "7Telomere", "length", "analysis", "of", "ApaI", "‐", "digested", "DNA", "from", "cells", "harvested", "at", "early", "(", "left", ")", "and", "late", "generations", "(", "right", ")", "after", "expression", "of", "YFP", "‐", "tagged", "proteins", ".", "Northern", "blot", "analysis", "of", "ARIA", ",", "ARRET", ",", "and", "18S", "rRNA", "(", "loading", "control", ")", "at", "early", "generations", "after", "expression", "of", "YFP", "‐", "tagged", "proteins", ".", "Numbers", "at", "the", "bottom", "are", "ratios", "between", "ARRET", "and", "18S", "rRNA", "signals", ",", "expressed", "as", "fold", "increase", "over", "wt", ".", "ChIP", "analysis", "of", "subtelomeric", "H3K9ac", ",", "H3K9me3", ",", "and", "total", "H3", "in", "the", "indicated", "strains", "at", "early", "generations", ".", "Immunoprecipitated", "DNA", "is", "normalized", "to", "input", "DNA", "and", "expressed", "as", "fold", "increase", "over", "wt", "after", "subtraction", "of", "values", "obtained", "for", "negative", "control", "immunoprecipitations", "performed", "with", "beads", "only", ".", "Bars", "and", "error", "bars", "are", "averages", "and", "s", ".", "d", ".", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "significance", "was", "assayed", "using", "the", "unpaired", ",", "two", "‐", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", ".", "*", "P", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "001", "relative", "to", "wt", ".", "Serial", "dilutions", "of", "early", "generation", "cay1", "+", "and", "cay1", "∆", "cells", "expressing", "Cay1", "‐", "YFP", "and", "Rap1", "‐", "YFP", "were", "spotted", "on", "complete", "medium", "and", "grown", "at", "30", "°", "C", "and", "20", "°", "C", ".", "Quantification", "of", "cell", "length", "in", "strains", "grown", "for", "24", "h", "in", "complete", "medium", "at", "30", "°", "C", "or", "20", "°", "C", ".", "Each", "dot", "represents", "a", "single", "cell", "and", "median", "cell", "length", "(", "m", ")", "is", "indicated", "for", "each", "sample", ".", "Data", "are", "from", "3", "independent", "experiments", "and", "at", "least", "100", "cells", "were", "scored", "per", "sample", "in", "each", "experiment", ".", "Quantification", "of", "chromosome", "bridges", "of", "strains", "grown", "for", "24", "h", "in", "complete", "medium", "at", "30", "°", "C", "or", "20", "°", "C", ".", "Bars", "and", "error", "bars", "are", "averages", "and", "s", ".", "d", ".", "from", "three", "independent", "experiments", "and", "at", "least", "200", "cells", "were", "scored", "per", "sample", "in", "each", "experiment", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Telomere length analysis of ApaI‐digested DNA from cells harvested at early (left) and late generations (right) after expression of YFP‐tagged proteins.Northern blot analysis of ARIA, ARRET, and 18S rRNA (loading control) at early generations after expression of YFP‐tagged proteins. Numbers at the bottom are ratios between ARRET and 18S rRNA signals, expressed as fold increase over wt.ChIP analysis of subtelomeric H3K9ac, H3K9me3, and total H3 in the indicated strains at early generations. Immunoprecipitated DNA is normalized to input DNA and expressed as fold increase over wt after subtraction of values obtained for negative control immunoprecipitations performed with beads only. Bars and error bars are averages and s.d. from 3 independent experiments. Statistical significance was assayed using the unpaired, two‐tailed Student's t‐test. *P 0.05, **P 0.01, ***P 0.001 relative to wt.Serial dilutions of early generation cay1+ and cay1∆ cells expressing Cay1‐YFP and Rap1‐YFP were spotted on complete medium and grown at 30°C and 20°C.Quantification of cell length in strains grown for 24 h in complete medium at 30°C or 20°C. Each dot represents a single cell and median cell length (m) is indicated for each sample. Data are from 3 independent experiments and at least 100 cells were scored per sample in each experiment.Quantification of chromosome bridges of strains grown for 24 h in complete medium at 30°C or 20°C. Bars and error bars are averages and s.d. from three independent experiments and at least 200 cells were scored per sample in each experiment."}
{"words": ["Figure", "8Northern", "blot", "analysis", "of", "Tf2", "retrotransposons", ",", "U6", "snRNA", ",", "and", "act1", "+", "mRNA", "(", "loading", "control", ")", "in", "wt", ",", "cay1Δ", ",", "and", "prp1", "‐", "1", "cells", ".", "prp1", "‐", "1", "cells", "were", "grown", "at", "36", "°", "C", "for", "4", "h", "before", "harvesting", ".", "Black", "arrowhead", "indicates", "unprocessed", "Tf2", "transcripts", ".", "The", "asterisk", "indicates", "unspliced", "U6", ".", "Numbers", "at", "the", "bottom", "are", "the", "ratios", "between", "Tf2", "and", "act1", "+", "signals", "(", "Tf2", "/", "Act1", ")", "and", "expressed", "as", "fold", "increase", "over", "wt", ".", "Northern", "blot", "analysis", "as", "in", "(", "A", ")", "in", "mpn1", "+", "and", "mpn1", "∆", "strains", "carrying", "a", "stably", "integrated", "extra", "copy", "of", "the", "snu6", "+", "gene", "or", "empty", "vector", "control", "plasmids", "(", "ev", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8Northern blot analysis of Tf2 retrotransposons, U6 snRNA, and act1+ mRNA (loading control) in wt, cay1Δ, and prp1‐1 cells. prp1‐1 cells were grown at 36°C for 4 h before harvesting. Black arrowhead indicates unprocessed Tf2 transcripts. The asterisk indicates unspliced U6. Numbers at the bottom are the ratios between Tf2 and act1+ signals (Tf2/Act1) and expressed as fold increase over wt.Northern blot analysis as in (A) in mpn1+ and mpn1∆ strains carrying a stably integrated extra copy of the snu6+ gene or empty vector control plasmids (ev)."}
{"words": ["Figure", "1A", "Dose", "-", "response", "viability", "curves", "in", "presence", "of", "increasing", "concentrations", "of", "IMT1", "for", "one", "-", "week", ",", "viable", "cells", "were", "counted", "and", "normalized", "to", "DMSO", "-", "treated", "controls", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SD", "of", "n", "=", "3", "independent", "experiments", "with", "four", "technical", "replicates", ".", "IC50", "values", "were", "calculated", "with", "non", "-", "linear", "least", "square", "fit", ",", "RKO", ":", "521", ".", "8", "nM", ",", "MiaPaCa", "-", "2", ":", "291", ".", "4", "nM", "and", "HeLa", ":", "29", ".", "9", "nM", ".", "B", "Mitochondrial", "transcript", "levels", "measured", "by", "qRT", "-", "PCR", "in", "RKO", "cells", "after", "96", "hours", "of", "1", "μM", "IMT1", "treatment", ".", "Data", "are", "relative", "to", "DMSO", "-", "treated", "controls", "and", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SD", "of", "n", "=", "4", "independent", "experiments", ".", "Ordinary", "one", "-", "way", "ANOVA", "was", "used", "for", "comparisons", "to", "DMSO", "-", "treated", "controls", "(", "RNR1", ",", "RNR2", ",", "MT", "-", "COX2", ",", "MT", "-", "ATP6", ",", "MT", "-", "ND1", ":", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ",", "0001", ")", ".", "D", "Volcano", "plot", "showing", "proteomic", "changes", "of", "RKO", "cells", "treated", "with", "1", "μM", "IMT1", "for", "96", "hours", ".", "Data", "are", "plotted", "as", "average", "log2", "-", "fold", "change", "versus", "log10", "of", "adjusted", "p", "-", "value", "of", "DMSO", "-", "treated", "controls", ";", "mitochondrial", "protein", "are", "highlighted", "in", "red", ".", "F", "CRISPR", "guides", "enriched", "(", "positive", "hits", ")", "in", "IMT1", "-", "treated", "RKO", "cells", "plotted", "as", "log2", "fold", "change", "(", "LFC", ")", "versus", "log10", "of", "adjusted", "p", "-", "value", ".", "mTORC1", "and", "VHL", "pathway", "-", "related", "genes", "are", "reported", "in", "green", "and", "blue", ",", "respectively", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A Dose-response viability curves in presence of increasing concentrations of IMT1 for one-week, viable cells were counted and normalized to DMSO-treated controls. Data are expressed as mean ± SD of n=3 independent experiments with four technical replicates. IC50 values were calculated with non-linear least square fit, RKO: 521.8 nM, MiaPaCa-2: 291.4 nM and HeLa: 29.9 nM.B Mitochondrial transcript levels measured by qRT-PCR in RKO cells after 96 hours of 1 μM IMT1 treatment. Data are relative to DMSO-treated controls and are expressed as mean ± SD of n=4 independent experiments. Ordinary one-way ANOVA was used for comparisons to DMSO-treated controls (RNR1, RNR2, MT-COX2, MT-ATP6, MT-ND1: ***p<0,0001).D Volcano plot showing proteomic changes of RKO cells treated with 1 μM IMT1 for 96 hours. Data are plotted as average log2-fold change versus log10 of adjusted p-value of DMSO-treated controls; mitochondrial protein are highlighted in red.F CRISPR guides enriched (positive hits) in IMT1-treated RKO cells plotted as log2 fold change (LFC) versus log10 of adjusted p-value. mTORC1 and VHL pathway-related genes are reported in green and blue, respectively."}
{"words": ["Figure", "2B", "-", "D", "Viable", "cells", "count", "in", "presence", "of", "DMSO", ",", "IMT1", "alone", "or", "in", "combination", "with", "rapamycin", "in", "RKO", "(", "B", ")", ",", "MiaPaCa", "-", "2", "(", "C", ")", "and", "HeLa", "(", "D", ")", "cells", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "values", "±", "SD", "of", "n", "=", "6", "independent", "experiments", "each", "including", "four", "technical", "intra", "-", "plate", "replicates", ".", "Statistical", "significance", "was", "calculated", "with", "one", "-", "way", "ANOVA", "test", ".", "Paired", "IMT1", "vs", ".", "IMT1", "+", "RAPA", "comparisons", ":", "RKO", ":", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ",", "0001", ",", "MiaPaCa", "-", "2", ":", "*", "*", "p", "=", "0", ",", "0014", ",", "HeLa", ":", "*", "p", "=", "0", ",", "0238", ".", "F", "-", "H", "Viability", "assessment", "of", "RKO", "(", "F", ")", ",", "MiaPaCa", "-", "2", "(", "G", ")", "and", "HeLa", "(", "H", ")", "cells", "treated", "with", "DMSO", ",", "IMT1", "alone", "and", "in", "combination", "with", "FG4592", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "values", "±", "SD", "of", "n", "=", "6", ",", "5", ",", "6", "independent", "experiments", "for", "RKO", ",", "HeLa", "and", "MiaPaCa", "-", "2", ",", "respectively", ".", "Statistical", "significance", "was", "calculated", "with", "one", "-", "way", "ANOVA", ".", "Paired", "IMT1", "vs", "IMT1", "+", "FG4592", "comparisons", ":", "RKO", ":", "*", "*", "p", "<", "0", ",", "0028", ",", "MiaPaCa", "-", "2", ":", "*", "*", "p", "=", "0", ",", "0011", ",", "HeLa", ":", "*", "p", "=", "0", ",", "0029", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B-D Viable cells count in presence of DMSO, IMT1 alone or in combination with rapamycin in RKO (B), MiaPaCa-2 (C) and HeLa (D) cells. Data are expressed as mean values ± SD of n=6 independent experiments each including four technical intra-plate replicates. Statistical significance was calculated with one-way ANOVA test. Paired IMT1 vs. IMT1 + RAPA comparisons: RKO: ***p<0,0001, MiaPaCa-2: **p= 0,0014, HeLa: *p= 0,0238.F-H Viability assessment of RKO (F), MiaPaCa-2 (G) and HeLa (H) cells treated with DMSO, IMT1 alone and in combination with FG4592. Data are expressed as mean values ± SD of n=6, 5, 6 independent experiments for RKO, HeLa and MiaPaCa-2, respectively. Statistical significance was calculated with one-way ANOVA. Paired IMT1 vs IMT1 + FG4592 comparisons: RKO: **p<0,0028, MiaPaCa-2: **p= 0,0011, HeLa: *p= 0,0029."}
{"words": ["Figure", "3C", "Western", "blot", "analyses", "of", "OXPHOS", "protein", "steady", "state", "levels", "of", "RKO", "cells", "after", "treatment", "with", "DMSO", ",", "IMT1", ",", "rapamycin", ",", "rapamycin", "with", "IMT1", ",", "FG4592", "and", "FG4592", "with", "IMT1", ".", "ACTINB", "is", "shown", "as", "loading", "control", ".", "F", ",", "G", "Cellular", "OCR", "measured", "with", "Seahorse", "extracellular", "flux", "analyzer", "after", "sequential", "addition", "of", "different", "modulators", "of", "mitochondrial", "function", ".", "RKO", "cells", "were", "treated", "with", "DMSO", ",", "rapamycin", "(", "F", ")", "or", "FG4592", "(", "G", ")", "in", "presence", "or", "absence", "of", "IMT1", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "the", "mean", "±", "SEM", "of", "n", "=", "3", "independent", "experiments", "with", "six", "technical", "replicates", ".", "Statistical", "significance", "was", "calculated", "with", "one", "-", "way", "ANOVA", "test", ".", "DMSO", "-", "treated", "controls", "vs", ":", "IMT1", ":", "p", "=", "0", ",", "0008", ";", "RAPA", ":", "p", "=", "0", ",", "1578", ";", "RAPA", "+", "IMT1", ":", "p", "=", "0", ",", "0034", ";", "FG4592", ":", "p", "=", "0", ",", "872", ";", "FG4592", "+", "IMT1", ":", "p", "=", "0", ",", "0029", ".", "Paired", "t", "-", "test", "of", "IMT1", "vs", "RAPA", "+", "IMT1", ":", "p", "=", "0", ",", "034", ";", "IMT1", "vs", "FG4592", "+", "IMT1", ":", "non", "-", "significant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3C Western blot analyses of OXPHOS protein steady state levels of RKO cells after treatment with DMSO, IMT1, rapamycin, rapamycin with IMT1, FG4592 and FG4592 with IMT1. ACTINB is shown as loading control.F, G Cellular OCR measured with Seahorse extracellular flux analyzer after sequential addition of different modulators of mitochondrial function. RKO cells were treated with DMSO, rapamycin (F) or FG4592 (G) in presence or absence of IMT1. Data are expressed as the mean ± SEM of n=3 independent experiments with six technical replicates. Statistical significance was calculated with one-way ANOVA test. DMSO-treated controls vs: IMT1: p=0,0008; RAPA: p=0,1578; RAPA + IMT1: p= 0,0034; FG4592: p=0,872; FG4592 + IMT1: p=0,0029. Paired t-test of IMT1 vs RAPA + IMT1: p= 0,034; IMT1 vs FG4592 + IMT1: non-significant."}
{"words": ["Figure", "4A", "Differences", "in", "sensitivity", "to", "increasing", "IMT1", "doses", "between", "RKO", "cells", "and", "resistant", "RKO", "cells", ".", "The", "graph", "shows", "mean", "values", "±", "SEM", "of", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "B", "Western", "blot", "analyses", "of", "OXPHOS", "protein", "steady", "state", "levels", "at", "increasing", "concentrations", "of", "IMT1", "of", "RKO", "(", "left", ")", "and", "IMT1", "-", "resistant", "RKO", "cells", "(", "right", ")", ".", "The", "samples", "were", "collected", "and", "analyzed", "after", "eight", "weeks", "of", "chronic", "IMT1", "treatment", "of", "the", "resistant", "line", ";", "GAPDH", "is", "shown", "as", "loading", "control", ".", "G", "Relative", "mtDNA", "copy", "number", "measured", "in", "RKO", "and", "IMT1", "-", "resistant", "cells", "treated", "with", "IMT1", "for", "96", "hours", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "average", "from", "n", "=", "3", "experiments", "±", "SEM", ".", "Statistical", "significance", "was", "calculated", "with", "one", "-", "way", "ANOVA", "test", ".", "RKO", "+", "IMT1", "vs", "Resistant", "+", "IMT1", ":", "MT", "-", "ND1", "*", "*", "p", "=", "0", ",", "0035", ",", "MT", "-", "ATP6", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ",", "0002", ",", "MT", "-", "CYTB", "*", "*", "p", "=", "0", ",", "0028", ".", "H", "Cellular", "OCR", "measured", "by", "Seahorse", "extracellular", "flux", "analysis", "after", "sequential", "addition", "of", "different", "modulators", "of", "mitochondrial", "function", "in", "RKO", "and", "IMT1", "-", "resistant", "RKO", "cells", "treated", "with", "DMSO", "or", "IMT1", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "the", "mean", "±", "SEM", "of", "n", "=", "3", "independent", "experiments", "with", "six", "technical", "replicates", ".", "Statistical", "significance", "was", "calculated", "with", "one", "-", "way", "ANOVA", "test", ".", "RKO", "DMSO", "vs", "RKO", "+", "IMT1", ":", "p", "=", "0", ",", "0008", ";", "RKO", "DMSO", "vs", "resistant", "DMSO", ":", "p", "=", "0", ",", "0343", ";", "RKO", "DMSO", "vs", "resistant", "+", "IMT1", ":", "p", "=", "0", ",", "0092", ".", "Paired", "t", "-", "test", "of", "RKO", "+", "IMT1", "vs", "resistant", "+", "IMT1", ":", "p", "=", "0", ",", "135", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A Differences in sensitivity to increasing IMT1 doses between RKO cells and resistant RKO cells. The graph shows mean values ± SEM of n=3 independent experiments.B Western blot analyses of OXPHOS protein steady state levels at increasing concentrations of IMT1 of RKO (left) and IMT1-resistant RKO cells (right). The samples were collected and analyzed after eight weeks of chronic IMT1 treatment of the resistant line; GAPDH is shown as loading control.G Relative mtDNA copy number measured in RKO and IMT1-resistant cells treated with IMT1 for 96 hours. Data are expressed as average from n=3 experiments ± SEM. Statistical significance was calculated with one-way ANOVA test. RKO + IMT1 vs Resistant + IMT1: MT-ND1 **p=0,0035, MT-ATP6 ***p=0,0002, MT-CYTB **p=0,0028.H Cellular OCR measured by Seahorse extracellular flux analysis after sequential addition of different modulators of mitochondrial function in RKO and IMT1-resistant RKO cells treated with DMSO or IMT1. Data are expressed as the mean ± SEM of n=3 independent experiments with six technical replicates. Statistical significance was calculated with one-way ANOVA test. RKO DMSO vs RKO + IMT1: p=0,0008; RKO DMSO vs resistant DMSO: p=0,0343; RKO DMSO vs resistant + IMT1: p= 0,0092. Paired t-test of RKO + IMT1 vs resistant + IMT1: p= 0,135."}
{"words": ["Figure", "5A", "ECAR", "measured", "by", "Seahorse", "extracellular", "flux", "analysis", "in", "DMSO", "and", "IMT1", "-", "treated", "RKO", "and", "IMT1", "-", "resistant", "cells", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "the", "mean", "±", "SEM", "of", "n", "=", "3", "independent", "experiments", "with", "six", "technical", "replicates", ".", "Statistical", "significance", "was", "calculated", "with", "one", "-", "way", "ANOVA", "test", "for", "multiple", "comparisons", ".", "RKO", "DMSO", "vs", "RKO", "+", "IMT1", ":", "*", "*", "p", "=", "0", ",", "0019", ";", "RKO", "+", "IMT1", "vs", "resistant", "+", "IMT", ":", "*", "p", "=", "0", ",", "0214", ";", "RKO", "DMSO", "vs", "resistant", "DMSO", ":", "non", "-", "significant", ".", "D", ",", "E", "IMT1", "extracellular", "(", "D", ")", "and", "extracellular", "(", "E", ")", "concentrations", "measured", "in", "the", "medium", "at", "0", ",", "2", "and", "24", "hours", "of", "IMT1", "treatment", "in", "RKO", "and", "IMT1", "-", "resistant", "RKO", "cells", ".", "Mean", "values", "±", "SEM", "of", "n", "=", "3", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A ECAR measured by Seahorse extracellular flux analysis in DMSO and IMT1-treated RKO and IMT1-resistant cells. Data are expressed as the mean ± SEM of n=3 independent experiments with six technical replicates. Statistical significance was calculated with one-way ANOVA test for multiple comparisons. RKO DMSO vs RKO + IMT1: **p=0,0019; RKO + IMT1 vs resistant + IMT: *p=0,0214; RKO DMSO vs resistant DMSO: non-significant.D, E IMT1 extracellular (D) and extracellular (E) concentrations measured in the medium at 0, 2 and 24 hours of IMT1 treatment in RKO and IMT1-resistant RKO cells. Mean values ± SEM of n=3 experiments."}
{"words": ["Figure", "6B", "Comparison", "between", "proteomic", "analyses", "of", "parental", "RKO", "and", "resistant", "cells", "treated", "with", "1", "μM", "IMT1", "for", "96", "hours", "(", "r", ":", "sample", "correlation", "coefficient", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "average", "log2", "-", "fold", "change", "of", "controls", "(", "DMSO", "-", "treated", "RKO", "cells", ")", ".", "Mitochondrial", "proteins", "are", "reported", "in", "red", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6B Comparison between proteomic analyses of parental RKO and resistant cells treated with 1 μM IMT1 for 96 hours (r: sample correlation coefficient). Data are expressed as average log2-fold change of controls (DMSO-treated RKO cells). Mitochondrial proteins are reported in red."}
{"words": ["Figure", "7A", "Depleted", "CRISPR", "guides", "(", "negative", "hits", ")", "in", "IMT1", "-", "treated", "RKO", "cells", "plotted", "as", "log2", "fold", "change", "(", "LFC", ")", "versus", "log10", "of", "adjusted", "p", "-", "value", ".", "C", "Representative", "images", "and", "related", "plot", "of", "IMT1", "-", "resistant", "RKO", "spheroid", "areas", "in", "presence", "of", "the", "aforementioned", "compounds", "for", "two", "weeks", "(", "IMT1", ":", "1", "μM", ",", "CAP", ":", "1", "μg", "/", "ml", ")", ";", "Scale", "bar", ":", "1mm", ".", "Data", "show", "the", "mean", "values", "±", "SD", "of", "n", "=", "4", "experiments", ".", "Statistical", "significance", "was", "calculated", "with", "paired", "t", "-", "test", ":", "IMT1", "vs", "IMT1", "+", "CAP", ":", "*", "p", "=", "0", ",", "0242", ".", "G", "Viable", "cells", "counts", "of", "IMT1", "-", "resistant", "RKO", "cells", "treated", "for", "one", "-", "week", "with", "either", "DMSO", "or", "IMT1", "in", "presence", "of", "controls", "(", "control", "#", "1", ",", "#", "2", ")", "or", "TFAM", "(", "TFAM", "#", "1", ",", "TFAM", "#", "2", ")", "siRNAs", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "values", "±", "SD", "of", "n", "=", "5", "independent", "experiments", "each", "including", "six", "technical", "intra", "-", "plate", "replicates", ".", "Statistical", "significance", "was", "calculated", "with", "one", "-", "way", "ANOVA", "test", ".", "Controls", "+", "IMT1", "vs", "TFAM", "#", "1", "+", "IMT1", ":", "p", "=", "0", ",", "2148", ";", "Controls", "+", "IMT1", "vs", "TFAM", "#", "2", "+", "IMT1", ":", "*", "p", "=", "0", ",", "0415", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A Depleted CRISPR guides (negative hits) in IMT1-treated RKO cells plotted as log2 fold change (LFC) versus log10 of adjusted p-value.C Representative images and related plot of IMT1-resistant RKO spheroid areas in presence of the aforementioned compounds for two weeks (IMT1: 1 μM, CAP: 1 μg/ml); Scale bar: 1mm. Data show the mean values ± SD of n=4 experiments. Statistical significance was calculated with paired t-test: IMT1 vs IMT1+ CAP: *p=0,0242.G Viable cells counts of IMT1-resistant RKO cells treated for one-week with either DMSO or IMT1 in presence of controls (control #1, #2) or TFAM (TFAM #1, TFAM #2) siRNAs. Data are expressed as mean values ± SD of n=5 independent experiments each including six technical intra-plate replicates. Statistical significance was calculated with one-way ANOVA test. Controls + IMT1 vs TFAM #1 + IMT1: p= 0,2148; Controls + IMT1 vs TFAM #2 + IMT1: *p=0,0415."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "Detection", "of", "soluble", ",", "cleaved", "NrCAM", "(", "sNrCAM", ")", "and", "full", "-", "length", ",", "mature", "NrCAM", "(", "mNrCAM", ")", "and", "soluble", "APPα", "(", "sAPPα", ")", "in", "neuronal", "supernatants", "and", "lysates", "(", "prepared", "from", "E16", "neurons", ")", ",", "treated", "with", "GI254023x", "(", "5", "µM", ")", ",", "or", "solvent", "for", "48h", ".", "Densitometric", "quantifications", "of", "the", "Western", "Blots", "are", "shown", "(", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "two", "-", "sided", "students", "t", "-", "test", "n", "=", "6", "-", "8", ")", ".", "(", "C", ")", "Detection", "of", "sAPPα", ",", "sNrCAM", "and", "mNrCAM", "in", "ADAM10", "cKO", "neuronal", "supernatants", "and", "lysates", "at", "7", "days", "in", "vitro", "(", "DIV7", ")", ".", "The", "neurons", "prepared", "from", "floxed", "ADAM10", "(", "ADAM10", "fl", "/", "fl", ")", "mice", "were", "infected", "with", "a", "lentivirus", "encoding", "improved", "Cre", "recombinase", "(", "iCre", ")", "or", "a", "control", "GFP", "lentivirus", "at", "DIV2", ".", "Conditioned", "media", "were", "collected", "for", "48", "h", ".", "Densitometric", "quantifications", "of", "the", "Western", "Blots", "are", "shown", "(", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "two", "-", "sided", "students", "t", "-", "test", "n", "=", "6", "-", "8", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B) Detection of soluble, cleaved NrCAM (sNrCAM) and full-length, mature NrCAM (mNrCAM) and soluble APPα (sAPPα) in neuronal supernatants and lysates (prepared from E16 neurons), treated with GI254023x (5 µM), or solvent for 48h. Densitometric quantifications of the Western Blots are shown (** p < 0.01; *** p < 0.001; **** p < 0.0001, two-sided students t-test n = 6-8).(C) Detection of sAPPα, sNrCAM and mNrCAM in ADAM10 cKO neuronal supernatants and lysates at 7 days in vitro (DIV7). The neurons prepared from floxed ADAM10 (ADAM10 fl/fl) mice were infected with a lentivirus encoding improved Cre recombinase (iCre) or a control GFP lentivirus at DIV2. Conditioned media were collected for 48 h. Densitometric quantifications of the Western Blots are shown (** p < 0.01; *** p < 0.001; **** p < 0.0001, two-sided students t-test n = 6-8)."}
{"words": ["Figure", "2HEK", "293", "cells", "were", "transfected", "with", "a", "C", "-", "terminally", "VSV", "-", "tagged", "NrCAM", "construct", "or", "empty", "vector", ".", "Cells", "were", "then", "treated", "with", "DAPT", "(", "1", "µM", ")", ",", "GI254023x", "(", "5", "µM", ")", ",", "either", "substances", "or", "solvent", "for", "24", "h", ".", "The", "C", "-", "terminal", "NrCAM", "-", "fragment", "was", "detected", "with", "an", "antibody", "against", "the", "VSV", "-", "tag", ".", "Representative", "Western", "Blots", "are", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2HEK 293 cells were transfected with a C-terminally VSV-tagged NrCAM construct or empty vector. Cells were then treated with DAPT (1 µM), GI254023x (5 µM), either substances or solvent for 24 h. The C-terminal NrCAM-fragment was detected with an antibody against the VSV-tag. Representative Western Blots are shown."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "ADAM10", "fl", "/", "fl", "neurons", "were", "treated", "with", "an", "iCre", "(", "to", "induce", "an", "ADAM10", "KO", ")", ",", "or", "a", "control", "lentivirus", "at", "DIV2", ".", "At", "DIV7", ",", "cell", "surface", "proteins", "were", "labeled", "with", "biotin", "and", "enriched", "by", "streptavidin", "pull", "-", "down", ".", "The", "biotinylated", "proteins", "were", "detected", "by", "immunoblotting", ".", "Total", "lysates", "were", "analyzed", "to", "compare", "mNrCAM", "'", "s", "surface", "/", "lysate", "levels", ".", "Densitometric", "quantifications", "of", "the", "Western", "Blots", "are", "shown", ".", "Two", "-", "sided", "students", "t", "-", "test", "(", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "n", "=", "7", ")", ".", "Given", "are", "mean", "+", "/", "-", "the", "standard", "error", "of", "them", "mean", ".", "The", "mean", "levels", "of", "solvent", "treated", "cells", "were", "set", "to", "1", ".", "(", "B", ")", "Primary", "murine", "neurons", "were", "treated", "with", "GI254023x", "(", "5", "µM", ")", "or", "solvent", ",", "for", "48h", ".", "The", "cell", "surface", "proteins", "were", "enriched", "like", "in", "A", ".", "Densitometric", "quantifications", "of", "the", "Western", "Blots", "are", "shown", ".", "Two", "-", "sided", "students", "t", "-", "test", "(", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "n", "=", "11", ")", ".", "Given", "are", "mean", "+", "/", "-", "the", "standard", "error", "of", "them", "mean", ".", "The", "mean", "levels", "of", "solvent", "treated", "cells", "were", "set", "to", "1", ".", "Representative", "Western", "Blots", "are", "shown", ".", "(", "C", ")", "Workflow", "of", "the", "neurite", "outgrowth", "assay", ".", "(", "D", ")", "Representative", "pictures", "of", "single", "neurites", "at", "time", "-", "point", "0h", "(", "DIV3", ")", "and", "24h", "(", "DIV4", ")", ".", "Neurons", "were", "infected", "4h", "after", "plating", "with", "lentiviruses", "encoding", "GFP", "(", "to", "visualize", "the", "neurons", ")", "together", "with", "shRNA", "expression", "cassettes", "(", "sh1", "and", "sh2", ")", "targeting", "either", "NrCAM", "or", "carrying", "a", "scrambled", "(", "scr", ")", "control", "construct", ".", "Images", "of", "neurites", "were", "taken", "at", "three", "days", "in", "vitro", "(", "DIV3", ")", "and", "24h", "later", "at", "DIV4", ".", "In", "order", "to", "study", "the", "effect", "of", "ADAM10", "on", "neurite", "outgrowth", ",", "neurons", "were", "treated", "with", "the", "ADAM10", "inhibitor", "GI254023x", ",", "or", "vehicle", "(", "control", ")", ",", "at", "DIV3", ",", "after", "taking", "the", "first", "pictures", "with", "an", "epifluorescent", "microscope", ".", "The", "differences", "in", "neurite", "length", "were", "calculated", "as", "absolute", "values", "(", "neurite", "length", "at", "24h", "minus", "neurite", "length", "of", "0h", ")", "for", "individual", "neurites", "passing", "through", "the", "middle", "channels", "of", "the", "chambers", ".", "Only", "neurites", "that", "had", "already", "entered", "the", "main", "channel", "at", "0h", "and", "had", "not", "yet", "left", "those", "channels", "at", "0h", "were", "considered", ".", "The", "red", "arrows", "indicate", "the", "start", "and", "the", "end", "of", "the", "respective", "length", "measurements", ".", "The", "scale", "bar", "indicates", "40", "µm", ".", "(", "E", ")", "One", "-", "way", "ANOVA", "with", "post", "hoc", "Dunnett", "'", "s", "test", ".", "Given", "are", "mean", "+", "/", "-", "the", "standard", "error", "of", "them", "mean", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "n", "-", "numbers", "for", "each", "condition", "are", "shown", "in", "the", "graph", "in", "3E", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) ADAM10 fl/fl neurons were treated with an iCre (to induce an ADAM10 KO), or a control lentivirus at DIV2. At DIV7, cell surface proteins were labeled with biotin and enriched by streptavidin pull-down. The biotinylated proteins were detected by immunoblotting. Total lysates were analyzed to compare mNrCAM's surface/lysate levels. Densitometric quantifications of the Western Blots are shown. Two-sided students t-test (**** p < 0.0001, n = 7). Given are mean +/- the standard error of them mean. The mean levels of solvent treated cells were set to 1.(B) Primary murine neurons were treated with GI254023x (5 µM) or solvent, for 48h. The cell surface proteins were enriched like in A. Densitometric quantifications of the Western Blots are shown. Two-sided students t-test (**** p < 0.0001, n = 11). Given are mean +/- the standard error of them mean. The mean levels of solvent treated cells were set to 1. Representative Western Blots are shown.(C) Workflow of the neurite outgrowth assay. (D) Representative pictures of single neurites at time-point 0h (DIV3) and 24h (DIV4). Neurons were infected 4h after plating with lentiviruses encoding GFP (to visualize the neurons) together with shRNA expression cassettes (sh1 and sh2) targeting either NrCAM or carrying a scrambled (scr) control construct. Images of neurites were taken at three days in vitro (DIV3) and 24h later at DIV4. In order to study the effect of ADAM10 on neurite outgrowth, neurons were treated with the ADAM10 inhibitor GI254023x, or vehicle (control), at DIV3, after taking the first pictures with an epifluorescent microscope. The differences in neurite length were calculated as absolute values (neurite length at 24h minus neurite length of 0h) for individual neurites passing through the middle channels of the chambers. Only neurites that had already entered the main channel at 0h and had not yet left those channels at 0h were considered. The red arrows indicate the start and the end of the respective length measurements. The scale bar indicates 40 µm. (E) One-way ANOVA with post hoc Dunnett's test. Given are mean +/- the standard error of them mean (* p < 0.05; ** p < 0.01; *** p < 0.001; **** p < 0.0001, n-numbers for each condition are shown in the graph in 3E)."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Wt", "neurons", "were", "kept", "in", "culture", "until", "DIV5", ",", "then", "the", "cells", "were", "treated", "with", "acitretin", "(", "4", "µM", ")", "or", "vehicle", "control", "for", "48h", ",", "as", "described", "earlier", "(", "Tippmann", "et", "al", ",", "2009", ")", ".", "(", "B", ")", "Densitometric", "quantifications", "of", "the", "Western", "Blots", "are", "shown", ".", "Given", "are", "mean", "+", "/", "-", "the", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "two", "-", "sided", "students", "t", "-", "test", "n", "=", "9", "-", "20", ")", ".", "The", "mean", "levels", "of", "solvent", "treated", "cells", "were", "set", "to", "1", ".", "(", "C", ")", "Detection", "of", "sNrCAM", "and", "human", "serum", "albumin", "(", "hSA", ")", "in", "AD", "patients", "CSF", "that", "had", "been", "treated", "with", "acitretin", "(", "30", "mg", "/", "d", ")", "or", "placebo", "for", "30", "days", "(", "n", "=", "9", ")", "(", "Endres", "et", "al", ",", "2014", ")", ".", "(", "D", ")", "Densitometric", "quantification", "of", "the", "Western", "Blots", "in", "(", "C", ")", ".", "sNrCAM", "/", "hSA", "ratios", "were", "calculated", ",", "and", "then", "the", "treatment", "to", "baseline", "ratios", "(", "t", "/", "b", ")", "for", "every", "patient", "were", "calculated", ".", "Two", "-", "sided", "student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "n", "=", "9", ")", ".", "Given", "are", "mean", "+", "/", "-", "the", "standard", "error", "of", "them", "mean", ".", "Representative", "Western", "Blots", "are", "shown", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Wt neurons were kept in culture until DIV5, then the cells were treated with acitretin (4 µM) or vehicle control for 48h, as described earlier (Tippmann et al, 2009). (B) Densitometric quantifications of the Western Blots are shown. Given are mean +/- the standard error of the mean (*** p < 0.001; **** p < 0. 0001, two-sided students t-test n = 9-20). The mean levels of solvent treated cells were set to 1.(C) Detection of sNrCAM and human serum albumin (hSA) in AD patients CSF that had been treated with acitretin (30 mg/d) or placebo for 30 days (n = 9) (Endres et al, 2014). (D) Densitometric quantification of the Western Blots in (C). sNrCAM/hSA ratios were calculated, and then the treatment to baseline ratios (t/b) for every patient were calculated. Two-sided student's t-test (n = 9). Given are mean +/- the standard error of them mean. Representative Western Blots are shown."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "To", "ensure", "proper", "synapse", "formation", ",", "primary", "neurons", "were", "kept", "in", "culture", "for", "ten", "days", "prior", "to", "the", "treatment", "(", "Wan", "et", "al", ",", "2012", ")", ".", "Then", ",", "cells", "were", "treated", "with", "NMDA", "(", "50", "µM", ")", ",", "NMDA", "(", "50", "µM", ")", "and", "GI254023x", "(", "5", "µM", ")", ",", "GI254023x", "(", "5", "µM", ")", "alone", "or", "vehicle", "for", "30", "minutes", ".", "Total", "cellular", "mADAM10", "levels", "remained", "unchanged", "by", "the", "treatment", ",", "which", "is", "in", "line", "with", "NMDA", "altering", "mainly", "the", "intracellular", "localization", "of", "ADAM10", "by", "driving", "the", "protein", "to", "the", "synaptic", "membranes", "(", "Marcello", "et", "al", ",", "2007", ")", ".", "Densitometric", "quantifications", "of", "the", "Western", "Blots", "are", "shown", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "with", "post", "hoc", "Dunnett", "'", "s", "test", "(", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "n", "=", "7", ")", ".", "Given", "are", "mean", "+", "/", "-", "the", "standard", "error", "of", "them", "mean", ".", "The", "mean", "levels", "of", "solvent", "treated", "cells", "were", "set", "to", "1", ".", "The", "membrane", "was", "reprobed", "with", "the", "different", "indicated", "antibodies", ".", "(", "B", ")", "Wt", "neurons", "were", "kept", "in", "culture", "until", "DIV10", ",", "then", "the", "cells", "were", "treated", "with", "NMDA", "(", "50", "µM", ")", ",", "or", "vehicle", "for", "30", "minutes", ".", "Cell", "surface", "proteins", "were", "labeled", "with", "biotin", "and", "enriched", "by", "streptavidin", "pull", "-", "down", ".", "The", "biotinylated", "proteins", "were", "detected", "by", "immunoblotting", ".", "Total", "lysates", "were", "analyzed", "to", "compare", "mNrCAMs", "surface", "/", "lysate", "levels", ".", "Densitometric", "quantifications", "of", "the", "Western", "Blots", "are", "shown", ".", "Two", "-", "sided", "students", "t", "-", "test", "(", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "n", "=", "6", ")", ".", "Given", "are", "mean", "+", "/", "-", "the", "standard", "error", "of", "them", "mean", ".", "The", "mean", "levels", "of", "solvent", "treated", "cells", "were", "set", "to", "1", ".", "Representative", "Western", "Blots", "are", "shown", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) To ensure proper synapse formation, primary neurons were kept in culture for ten days prior to the treatment (Wan et al, 2012). Then, cells were treated with NMDA (50 µM), NMDA (50 µM) and GI254023x (5 µM), GI254023x (5 µM) alone or vehicle for 30 minutes. Total cellular mADAM10 levels remained unchanged by the treatment, which is in line with NMDA altering mainly the intracellular localization of ADAM10 by driving the protein to the synaptic membranes (Marcello et al, 2007). Densitometric quantifications of the Western Blots are shown. One-way ANOVA with post hoc Dunnett's test (*** p < 0.001, n = 7). Given are mean +/- the standard error of them mean. The mean levels of solvent treated cells were set to 1. The membrane was reprobed with the different indicated antibodies.(B) Wt neurons were kept in culture until DIV10, then the cells were treated with NMDA (50 µM), or vehicle for 30 minutes. Cell surface proteins were labeled with biotin and enriched by streptavidin pull-down. The biotinylated proteins were detected by immunoblotting. Total lysates were analyzed to compare mNrCAMs surface/lysate levels. Densitometric quantifications of the Western Blots are shown. Two-sided students t-test (** p < 0.01, n = 6). Given are mean +/- the standard error of them mean. The mean levels of solvent treated cells were set to 1. Representative Western Blots are shown."}
{"words": ["Figure", "6Volcano", "plot", "of", "the", "proteomic", "analysis", "of", "CSF", "from", "AD", "patients", "treated", "with", "acitretin", "or", "placebo", "for", "30", "days", ".", "Every", "circle", "represents", "one", "protein", ".", "The", "log10", "transformed", "t", "-", "test", "p", "-", "values", "(", "again", "treatment", "/", "baseline", "for", "every", "patient", ")", "are", "plotted", "against", "the", "log2", "transformed", "label", "-", "free", "quantification", "intensity", "ratios", "of", "acitretin", "and", "placebo", "CSF", ".", "ADAM10", "substrates", "are", "indicated", "in", "bold", "writing", ".", "In", "total", ",", "more", "than", "50", "ADAM10", "substrates", "were", "identified", ",", "but", "only", "the", "significantly", "altered", "substrates", "as", "well", "as", "NrCAM", "and", "APP", "are", "indicated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Volcano plot of the proteomic analysis of CSF from AD patients treated with acitretin or placebo for 30 days. Every circle represents one protein. The log10 transformed t-test p-values (again treatment/baseline for every patient) are plotted against the log2 transformed label-free quantification intensity ratios of acitretin and placebo CSF. ADAM10 substrates are indicated in bold writing. In total, more than 50 ADAM10 substrates were identified, but only the significantly altered substrates as well as NrCAM and APP are indicated."}
{"words": ["Figure", "7HEK293", "cells", "were", "transiently", "transfected", "with", "hNrCAM", ",", "FLAG", "-", "tagged", "hTSPAN15", ",", "either", "plasmids", "or", "the", "empty", "vector", ".", "Detection", "of", "sAPPα", "and", "sNrCAM", "in", "the", "conditioned", "media", "and", "ADAM10", "in", "the", "cell", "lysate", ".", "Densitometric", "quantification", "of", "the", "Western", "Blots", "are", "shown", "(", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ",", "(", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ",", "(", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ")", ",", "two", "-", "sided", "students", "t", "-", "test", ",", "or", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "post", "hoc", "Dunnett", "'", "s", "test", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "Given", "are", "mean", "+", "/", "-", "the", "standard", "error", "of", "them", "mean", ".", "The", "mean", "levels", "of", "solvent", "treated", "cells", "were", "set", "to", "1", ".", "Representative", "Western", "Blots", "are", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7HEK293 cells were transiently transfected with hNrCAM, FLAG-tagged hTSPAN15, either plasmids or the empty vector. Detection of sAPPα and sNrCAM in the conditioned media and ADAM10 in the cell lysate. Densitometric quantification of the Western Blots are shown (** p < 0.01), (*** p < 0.001), (**** p < 0.0001), two-sided students t-test, or one-way ANOVA with post hoc Dunnett's test (n = 6). Given are mean +/- the standard error of them mean. The mean levels of solvent treated cells were set to 1. Representative Western Blots are shown."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Time", "series", "of", "TIRF", "microscopyimages", "showing", "GFP", "-", "dynein", "(", "green", "in", "merge", ")", "localising", "to", "the", "plus", "ends", "of", "dynamic", "Alexa568", "-", "microtubules", "(", "Alexa568", "-", "MT", ",", "magenta", "in", "merge", ")", ".", "Protein", "concentrations", "were", "10", "nM", "GFP", "-", "dynein", ",", "20", "nM", "human", "dynactin", ",", "20", "nM", "EB1", "and", "17", ".", "5", "µM", "Alexa568", "-", "tubulin", "(", "5", "%", "labelling", "ratio", ")", ".", "(", "B", ")", "individual", "and", "dual", "colour", "kymographs", "showing", "GFP", "-", "dynein", "(", "green", "in", "merge", ")", "localising", "to", "the", "plus", "ends", "of", "dynamic", "Alexa568", "-", "microtubules", "(", "Alexa568", "-", "MT", ",", "magenta", "in", "merge", ")", ".", "Protein", "concentrations", "were", "10", "nM", "GFP", "-", "dynein", ",", "20", "nM", "human", "dynactin", ",", "20", "nM", "EB1", "and", "17", ".", "5", "µM", "Alexa568", "-", "tubulin", "(", "5", "%", "labelling", "ratio", ")", ".", "(", "C", ")", "Merged", "triple", "colour", "and", "single", "fluorescence", "channel", "kymographs", "showing", "microtubule", "end", "tracking", "of", "GFP", "-", "dynein", "(", "green", "in", "merge", ")", "and", "Alexa647", "-", "EB3", "(", "red", "in", "merge", ")", "on", "dynamic", "Alexa568", "-", "microtubules", "(", "blue", "in", "merge", ")", ".", "Concentrations", "were", "10", "nM", "GFP", "-", "dynein", ",", "10", "nM", "human", "dynactin", ",", "10", "nM", "Alexa647", "-", "EB3", ",", "and", "17", ".", "5", "µM", "tubulin", ".", "(", "D", ",", "E", ")", "Dual", "and", "single", "colour", "kymographs", "of", "GFP", "-", "dynein", "(", "green", ")", "on", "dynamic", "Alexa568", "-", "microtubules", "(", "magenta", ")", "in", "the", "absence", "of", "either", "dynactin", "(", "D", ")", ".", "Concentrations", "of", "the", "proteins", "present", "as", "in", "A", ".", "(", "D", ",", "E", ")", "Dual", "and", "single", "colour", "kymographs", "of", "GFP", "-", "dynein", "(", "green", ")", "on", "dynamic", "Alexa568", "-", "microtubules", "(", "magenta", ")", "in", "the", "absence", "of", "EB", "proteins", "(", "E", ")", ".", "Concentrations", "of", "the", "proteins", "present", "as", "in", "A", ".", "(", "F", ")", "Averaged", "fluorescence", "intensity", "profiles", "of", "GFP", "-", "dynein", "at", "growing", "microtubule", "plus", "ends", "in", "the", "presence", "of", "both", "human", "dynactin", "and", "EB1", "(", "blue", "squares", ",", "as", "in", "A", ")", ",", "in", "the", "absence", "of", "dynactin", "(", "red", "circles", ",", "as", "in", "D", ")", ",", "or", "in", "the", "absence", "of", "an", "EB", "protein", "(", "black", "triangles", ",", "as", "in", "E", ")", ".", "Mean", "values", "from", "at", "least", "two", "separate", "experiments", "per", "condition", "(", "with", "a", "total", "of", "at", "least", "30", "kymographs", ")", "are", "shown", ";", "error", "bars", "are", "s", ".", "e", ".", "(", "G", ")", "Kymographs", "of", "GFP", "-", "dyneinmicrotubule", "end", "tracking", "in", "the", "absence", "of", "ATP", "(", "in", "contrast", "to", "all", "other", "experiments", "that", "contain", "ATP", ")", ".", "Other", "conditions", "as", "in", "A", ".", "For", "merged", "kymographs", ",", "microtubule", "plus", "and", "minus", "ends", "are", "labelled", "by", "(", "+", ")", "and", "(", "−", ")", ".", "Experiments", "were", "performed", "at", "30", "°", "C", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Time series of TIRF microscopyimages showing GFP-dynein (green in merge) localising to the plus ends of dynamic Alexa568-microtubules (Alexa568-MT, magenta in merge). Protein concentrations were 10 nM GFP-dynein, 20 nM human dynactin, 20 nM EB1 and 17.5 µM Alexa568-tubulin (5% labelling ratio).(B) individual and dual colour kymographs showing GFP-dynein (green in merge) localising to the plus ends of dynamic Alexa568-microtubules (Alexa568-MT, magenta in merge). Protein concentrations were 10 nM GFP-dynein, 20 nM human dynactin, 20 nM EB1 and 17.5 µM Alexa568-tubulin (5% labelling ratio).(C) Merged triple colour and single fluorescence channel kymographs showing microtubule end tracking of GFP-dynein (green in merge) and Alexa647-EB3 (red in merge) on dynamic Alexa568-microtubules (blue in merge). Concentrations were 10 nM GFP-dynein, 10 nM human dynactin, 10 nM Alexa647-EB3, and 17.5 µM tubulin.(D, E) Dual and single colour kymographs of GFP-dynein (green) on dynamic Alexa568-microtubules (magenta) in the absence of either dynactin (D) . Concentrations of the proteins present as in A.(D, E) Dual and single colour kymographs of GFP-dynein (green) on dynamic Alexa568-microtubules (magenta) in the absence of EB proteins (E). Concentrations of the proteins present as in A.(F) Averaged fluorescence intensity profiles of GFP-dynein at growing microtubule plus ends in the presence of both human dynactin and EB1 (blue squares, as in A), in the absence of dynactin (red circles, as in D), or in the absence of an EB protein (black triangles, as in E). Mean values from at least two separate experiments per condition (with a total of at least 30 kymographs) are shown; error bars are s. e.(G) Kymographs of GFP-dyneinmicrotubule end tracking in the absence of ATP (in contrast to all other experiments that contain ATP). Other conditions as in A. For merged kymographs, microtubule plus and minus ends are labelled by (+) and (−). Experiments were performed at 30°C."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Merged", "triple", "colour", "and", "single", "fluorescence", "channel", "TIRF", "microscopy", "kymographs", "of", "GFP", "-", "dynein", "showing", "end", "tracking", ",", "processive", "motility", "and", "diffusive", "and", "static", "binding", "in", "the", "presence", "of", "all", "DDB", "components", "and", "EB1", ".", "Protein", "concentrations", "are", "10", "nM", "GFP", "-", "dynein", "(", "green", "in", "merge", ")", ",", "20", "nM", "human", "dynactin", ",", "20", "nM", "EB1", ",", "200", "nM", "Alexa647", "-", "BicD2", "-", "N", "(", "magenta", "in", "merge", ")", ",", "and", "17", ".", "5", "µM", "Alexa568", "-", "tubulin", "(", "blue", "in", "merge", ")", ".", "Alexa647", "-", "BicD2", "-", "N", "often", "co", "-", "localises", "with", "processively", "moving", "and", "occasionally", "with", "statically", "bound", "GFP", "-", "dynein", ",", "but", "not", "with", "plus", "end", "-", "tracking", "GFP", "-", "dynein", ".", "(", "B", ")", "Averaged", "fluorescence", "intensity", "profiles", "of", "GFP", "-", "dynein", "(", "green", "squares", ")", "and", "Alexa647", "-", "BicD2", "-", "N", "(", "magenta", "circles", ")", "at", "growing", "microtubule", "plus", "ends", ".", "Mean", "values", "from", "three", "separate", "experiments", "per", "condition", "(", "with", "a", "total", "of", "at", "least", "75", "kymographs", ")", "are", "shown", ";", "error", "bars", "are", "s", ".", "e", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "Dual", "and", "single", "colour", "kymographs", "of", "an", "Atto565", "-", "microtubule", "(", "magenta", ")", "in", "the", "presence", "of", "GFP", "-", "dynein", "(", "green", ")", ",", "human", "dynactin", "and", "EB1", ",", "and", "either", "(", "C", ")", "in", "the", "absence", "or", "(", "D", ")", "presence", "of", "5", "µM", "BicD2", "-", "N", ";", "other", "conditions", "as", "in", "A", ".", "The", "increased", "BicD2", "-", "N", "concentration", "in", "D", "compared", "to", "A", "strongly", "reduces", "microtubule", "plus", "end", "tracking", "of", "GFP", "-", "dynein", ".", "(", "E", ")", "Averaged", "fluorescence", "intensity", "profiles", "of", "GFP", "-", "dynein", "at", "growing", "microtubule", "plus", "ends", "for", "the", "condition", "without", "BicD2", "-", "N", "(", "red", "circles", ",", "as", "in", "C", ")", "or", "with", "5", "µM", "BicD2", "-", "N", "(", "black", "squares", ",", "as", "in", "D", ")", ".", "Mean", "values", "from", "three", "separate", "experiments", "per", "condition", "(", "with", "a", "total", "of", "at", "least", "106", "kymographs", ")", "are", "shown", ";", "error", "bars", "are", "s", ".", "e", ".", "Microtubule", "plus", "and", "minus", "ends", "in", "merged", "kymographs", "are", "labelled", "by", "(", "+", ")", "and", "(", "−", ")", ".", "Experiments", "were", "performed", "at", "30", "°", "C", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Merged triple colour and single fluorescence channel TIRF microscopy kymographs of GFP-dynein showing end tracking, processive motility and diffusive and static binding in the presence of all DDB components and EB1. Protein concentrations are 10 nM GFP-dynein (green in merge), 20 nM human dynactin, 20 nM EB1, 200 nM Alexa647-BicD2-N (magenta in merge), and 17.5 µM Alexa568-tubulin (blue in merge). Alexa647-BicD2-N often co-localises with processively moving and occasionally with statically bound GFP-dynein, but not with plus end-tracking GFP-dynein.(B) Averaged fluorescence intensity profiles of GFP-dynein (green squares) and Alexa647-BicD2-N (magenta circles) at growing microtubule plus ends. Mean values from three separate experiments per condition (with a total of at least 75 kymographs) are shown; error bars are s. e.(C, D) Dual and single colour kymographs of an Atto565-microtubule (magenta) in the presence of GFP-dynein (green), human dynactin and EB1, and either (C) in the absence or (D) presence of 5 µM BicD2-N; other conditions as in A. The increased BicD2-N concentration in D compared to A strongly reduces microtubule plus end tracking of GFP-dynein.(E) Averaged fluorescence intensity profiles of GFP-dynein at growing microtubule plus ends for the condition without BicD2-N (red circles, as in C) or with 5 µM BicD2-N (black squares, as in D). Mean values from three separate experiments per condition (with a total of at least 106 kymographs) are shown; error bars are s. e. Microtubule plus and minus ends in merged kymographs are labelled by (+) and (−). Experiments were performed at 30°C."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Example", "dual", "colour", "kymograph", "and", "a", "schematic", "showing", "how", "the", "distance", "of", "initiation", "of", "processive", "runs", "was", "measured", ".", "The", "protein", "concentrations", "were", "10", "nM", "GFP", "-", "dynein", ",", "20", "nM", "pig", "dynactin", ",", "5", "µM", "BicD2", "-", "N", ",", "20", "nM", "EB1", "and", "17", ".", "5", "µM", "Atto647", "-", "tubulin", ".", "(", "B", ")", "Histograms", "of", "the", "spatial", "initiation", "probabilities", "of", "processive", "runs", "within", "the", "first", "7", ".", "2", "µm", "from", "growing", "microtubule", "plus", "ends", "in", "the", "absence", "(", "black", "bars", ")", ",", "or", "presence", "of", "10", "nM", "EB1", "(", "red", "bars", ")", ".", "199", "and", "221", "initiation", "positions", "were", "determined", "for", "the", "two", "conditions", "(", "from", "three", "experiments", "each", ")", ".", "(", "C", ")", "Averaged", "fluorescence", "intensity", "profiles", "of", "GFP", "-", "dynein", "at", "growing", "microtubule", "plus", "ends", "for", "the", "conditions", "as", "in", "B", ".", "Mean", "values", "from", "three", "separate", "experiments", "per", "condition", "(", "with", "a", "total", "of", "at", "least", "69", "kymographs", ")", "are", "shown", ";", "error", "bars", "are", "s", ".", "e", ".", "Experiments", "were", "performed", "at", "30", "°", "C", ".", "(", "D", ")", "Histogram", "of", "spatial", "initiation", "probabilities", "of", "DDB", "on", "static", "GMPCPP", "-", "microtubules", ".", "294", "initiation", "positions", "were", "detemined", "(", "from", "three", "experiments", ")", ".", "Concentrations", "of", "DDB", "components", "as", "in", "B", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Example dual colour kymograph and a schematic showing how the distance of initiation of processive runs was measured. The protein concentrations were 10 nM GFP-dynein, 20 nM pig dynactin, 5 µM BicD2-N, 20 nM EB1 and 17.5 µM Atto647-tubulin.(B) Histograms of the spatial initiation probabilities of processive runs within the first 7.2 µm from growing microtubule plus ends in the absence (black bars), or presence of 10 nM EB1 (red bars). 199 and 221 initiation positions were determined for the two conditions (from three experiments each).(C) Averaged fluorescence intensity profiles of GFP-dynein at growing microtubule plus ends for the conditions as in B. Mean values from three separate experiments per condition (with a total of at least 69 kymographs) are shown; error bars are s. e. Experiments were performed at 30°C.(D) Histogram of spatial initiation probabilities of DDB on static GMPCPP-microtubules. 294 initiation positions were detemined (from three experiments). Concentrations of DDB components as in B."}
{"words": ["Figure", "4A", ",", "B", ")", "Dual", "and", "single", "colour", "kymographs", "showing", "under", "certain", "conditions", "p150", "or", "dynactin", "-", "dependent", "microtubule", "plus", "end", "tracking", "of", "dynein", "in", "the", "absence", "of", "EB", "proteins", ":", "(", "A", ")", "10", "nM", "GFP", "-", "dynein", "(", "green", ")", "tracking", "the", "growing", "end", "of", "a", "Atto565", "-", "microtubule", "(", "magenta", ")", "in", "the", "presence", "of", "pig", "dynactin", "at", "an", "elevated", "concentration", "of", "80", "nM", ".", "Experiments", "in", "(", "A", ")", "and", "(", "B", ")", "were", "performed", "in", "standard", "assay", "buffer", "(", "BRB20", "supplemented", "with", "50", "mM", "KCl", ",", "for", "details", "see", "Methods", ")", ".", "(", "A", ",", "B", ")", "Dual", "and", "single", "colour", "kymographs", "showing", "under", "certain", "conditions", "p150", "or", "dynactin", "-", "dependent", "microtubule", "plus", "end", "tracking", "of", "dynein", "in", "the", "absence", "of", "EB", "proteins", ":", "(", "B", ")", "10", "nM", "GFP", "-", "dynein", "(", "green", ")", "tracking", "the", "plus", "end", "of", "an", "Atto565", "-", "microtubule", "(", "blue", ")", "in", "the", "presence", "of", "10", "nM", "Alexa647", "-", "p150", "(", "a", "fragment", "containing", "the", "first", "517", "amino", "acids", "of", "p150", ";", "called", "p150", "-", "N", "in", "the", "text", ")", "(", "red", ")", ".", "Experiments", "in", "(", "A", ")", "and", "(", "B", ")", "were", "performed", "in", "standard", "assay", "buffer", "(", "BRB20", "supplemented", "with", "50", "mM", "KCl", ",", "for", "details", "see", "Methods", ")", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "Dual", "and", "single", "colour", "kymographs", "showing", "that", "microtubule", "binding", "behaviour", "of", "p150", "depends", "strongly", "on", "ionic", "strength", ":", "(", "C", ")", "In", "standard", "assay", "buffer", ",", "10", "nM", "Alexa647", "-", "p150", "(", "green", ")", "accumulates", "at", "the", "plus", "end", "and", "on", "the", "GMPCPP", "-", "stabilised", "segment", "of", "a", "growing", "Atto565", "-", "microtubule", "(", "magenta", ")", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "Dual", "and", "single", "colour", "kymographs", "showing", "that", "microtubule", "binding", "behaviour", "of", "p150", "depends", "strongly", "on", "ionic", "strength", ":", "(", "D", ")", "At", "higher", "ionic", "strength", "(", "BRB80", "supplemented", "with", "60", "mM", "KCl", ",", "see", "Methods", ")", ",", "Alexa647", "-", "p150", "(", "green", ")", "binds", "only", "weakly", "to", "the", "microtubule", "without", "a", "detectable", "plus", "end", "preference", ".", "Protein", "concentrations", "as", "in", "C", ".", "The", "Atto565", "-", "tubulin", "concentration", "was", "always", "17", ".", "5", "µM", "tubulin", ".", "The", "temperature", "was", "30", "°", "C", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A, B) Dual and single colour kymographs showing under certain conditions p150 or dynactin-dependent microtubule plus end tracking of dynein in the absence of EB proteins: (A) 10 nM GFP-dynein (green) tracking the growing end of a Atto565-microtubule (magenta) in the presence of pig dynactin at an elevated concentration of 80 nM. Experiments in (A) and (B) were performed in standard assay buffer (BRB20 supplemented with 50 mM KCl, for details see Methods).(A, B) Dual and single colour kymographs showing under certain conditions p150 or dynactin-dependent microtubule plus end tracking of dynein in the absence of EB proteins: (B) 10 nM GFP-dynein (green) tracking the plus end of an Atto565-microtubule (blue) in the presence of 10 nM Alexa647-p150 (a fragment containing the first 517 amino acids of p150; called p150-N in the text) (red). Experiments in (A) and (B) were performed in standard assay buffer (BRB20 supplemented with 50 mM KCl, for details see Methods).(C, D) Dual and single colour kymographs showing that microtubule binding behaviour of p150 depends strongly on ionic strength: (C) In standard assay buffer, 10 nM Alexa647-p150 (green) accumulates at the plus end and on the GMPCPP-stabilised segment of a growing Atto565-microtubule (magenta).(C, D) Dual and single colour kymographs showing that microtubule binding behaviour of p150 depends strongly on ionic strength: (D) At higher ionic strength (BRB80 supplemented with 60 mM KCl, see Methods), Alexa647-p150 (green) binds only weakly to the microtubule without a detectable plus end preference. Protein concentrations as in C. The Atto565-tubulin concentration was always 17.5 µM tubulin. The temperature was 30°C."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", "-", "C", ")", "Kymographs", "showing", "GFP", "-", "dynein", "(", "green", ")", "on", "dynamic", "Atto647N", "-", "microtubules", "(", "magenta", ")", "in", "the", "presence", "of", "all", "the", "regulators", "at", "different", "Lis1", "concentrations", ".", "Protein", "concentrations", "were", "10", "nM", "GFP", "-", "dynein", ",", "20", "nM", "pig", "dynactin", ",", "20", "nM", "EB1", ",", "5", "µM", "BicD2", "-", "N", ",", "and", "(", "A", ")", "either", "no", "Lis1", ",", "(", "B", ")", "1", "μM", "mCherry", "-", "Lis1", ",", "or", "(", "C", ")", "5", "μM", "mCherry", "-", "Lis1", ".", "Together", "with", "BicD2", ",", "Lis1", "increases", "the", "number", "of", "processive", "dynein", "runs", "and", "high", "concentrations", "of", "Lis1", "restore", "plus", "-", "end", "localisation", "of", "dynein", "in", "the", "presence", "of", "BicD2", "-", "N", ".", "Microtubule", "orientation", "as", "indicated", ".", "(", "D", ")", "Averaged", "intensity", "profiles", "of", "GFP", "-", "dynein", "at", "growing", "microtubule", "plus", "ends", "in", "the", "presence", "of", "EB1", ",", "dynactin", "and", "5", "µM", "BicD2", "-", "N", "(", "black", "squares", ",", "as", "in", "A", ")", ",", "in", "the", "presence", "of", "1", "µM", "mCherry", "-", "Lis1", "(", "blue", "circles", ",", "as", "in", "B", ")", "and", "5", "µM", "mCherry", "-", "Lis1", "(", "red", "triangles", ",", "as", "in", "C", ")", ".", "Mean", "values", "from", "three", "separate", "experiments", "per", "condition", "(", "with", "a", "total", "of", "at", "least", "49", "kymographs", ")", "are", "shown", ";", "error", "bars", "are", "s", ".", "e", ".", "(", "E", ")", "The", "average", "number", "of", "processive", "DDB", "runs", "per", "µm", "microtubule", "length", "for", "the", "three", "different", "Lis1", "conditions", "(", "as", "in", "A", ",", "B", "and", ",", "C", ")", ".", "Error", "bars", "are", "s", ".", "d", ".", "*", "p", "=", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "003", ",", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "001", "(", "unpaired", "t", "-", "test", ")", ".", "218", ",", "969", ",", "and", "646", "processive", "DDB", "events", "were", "analysed", "for", "the", "three", "conditions", ",", "respectively", "(", "from", "two", "experiments", "each", ")", ".", "(", "F", ")", "Bar", "graphs", "showing", "the", "mean", "velocity", "and", "the", "mean", "run", "length", "of", "processive", "DDB", "events", "for", "the", "three", "Lis1", "conditions", "(", "as", "in", "A", ",", "B", "and", "C", ")", ".", "Error", "bars", "are", "the", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Mean", "velocities", "were", "0", ".", "37", "±", "0", ".", "02", "µm", "/", "s", "(", "A", ")", ",", "0", ".", "38", "±", "0", ".", "03", "µm", "/", "s", "(", "B", ")", ",", "and", "0", ".", "35", "±", "0", ".", "03", "µm", "/", "s", "(", "C", ")", ".", "Mean", "run", "lengths", "were", "3", ".", "1", "±", "0", ".", "4", "µm", "(", "A", ")", ",", "3", ".", "2", "±", "0", ".", "5", "µm", "(", "B", ")", ",", "and", "2", ".", "9", "±", "0", ".", "3", "µm", "(", "C", ")", ".", "For", "each", "condition", "over", "300", "complexes", "were", "analysed", "from", "three", "different", "data", "sets", ".", "(", "G", ")", "Histogram", "of", "spatial", "initiation", "probabilities", "of", "DDB", "runs", "in", "the", "presence", "of", "EB1", "and", "Lis1", ".", "381", "initiation", "positions", "were", "determined", "(", "from", "two", "experiments", ")", ".", "Experiments", "were", "performed", "at", "30", "°", "C", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A-C) Kymographs showing GFP-dynein (green) on dynamic Atto647N-microtubules (magenta) in the presence of all the regulators at different Lis1 concentrations. Protein concentrations were 10 nM GFP-dynein, 20 nM pig dynactin, 20 nM EB1, 5 µM BicD2-N, and (A) either no Lis1, (B) 1 μM mCherry-Lis1, or (C) 5 μM mCherry-Lis1. Together with BicD2, Lis1 increases the number of processive dynein runs and high concentrations of Lis1 restore plus-end localisation of dynein in the presence of BicD2-N. Microtubule orientation as indicated.(D) Averaged intensity profiles of GFP-dynein at growing microtubule plus ends in the presence of EB1, dynactin and 5 µM BicD2-N (black squares, as in A), in the presence of 1 µM mCherry-Lis1 (blue circles, as in B) and 5 µM mCherry-Lis1 (red triangles, as in C). Mean values from three separate experiments per condition (with a total of at least 49 kymographs) are shown; error bars are s. e.(E) The average number of processive DDB runs per µm microtubule length for the three different Lis1 conditions (as in A, B and, C). Error bars are s. d. *p = 0.001, **p = 0.003, ***p = 0.001 (unpaired t-test). 218, 969, and 646 processive DDB events were analysed for the three conditions, respectively (from two experiments each).(F) Bar graphs showing the mean velocity and the mean run length of processive DDB events for the three Lis1 conditions (as in A, B and C). Error bars are the s.e.m. Mean velocities were 0.37 ± 0.02 µm/s (A), 0.38 ± 0.03 µm/s (B), and 0.35 ± 0.03 µm/s (C). Mean run lengths were 3.1 ± 0.4 µm (A), 3.2 ± 0.5 µm (B), and 2.9 ± 0.3 µm (C). For each condition over 300 complexes were analysed from three different data sets.(G) Histogram of spatial initiation probabilities of DDB runs in the presence of EB1 and Lis1. 381 initiation positions were determined (from two experiments). Experiments were performed at 30°C."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "C", ")", "ChIP", "-", "qPCRs", "at", "ARAP1", ",", "RFX5", "-", "GBAT2", ",", "WDR74", "and", "HAUS5", "promoters", "for", "IgG", "and", "DVL3", "in", "MDA", "-", "MB", "-", "468", "(", "NTC", ",", "shA", "DVL3", ",", "and", "shB", "DVL3", ")", ".", "(", "D", ")", "ChIP", "-", "qPCRs", "at", "RFX5", "-", "GBAT2", ",", "COX14", ",", "HLA", "-", "E", "and", "PSMB8", "promoters", "for", "IgG", "and", "DVL3", "in", "MCF7", "(", "NTC", ",", "shA", "DVL3", ",", "and", "shB", "DVL3", ")", ".", "(", "E", ")", "RT", "-", "qPCR", "-", "based", "analysis", "of", "expression", "changes", "of", "RFX5", ",", "GBAT2", ",", "WDR74", ",", "HCG15", ",", "POU2F3", ",", "SNORD3B", ",", "APOC1P1", ",", "HLA", "-", "A", ",", "TAP1", ",", "PSMD8", ",", "PDG1", "and", "JUNB", "genes", "in", "MDA", "-", "MB", "-", "468", "(", "NTC", ",", "shA", "DVL3", ",", "and", "shB", "DVL3", ")", "cells", ".", "(", "F", ")", "RT", "-", "qPCR", "-", "based", "analysis", "of", "expression", "changes", "of", "RFX5", ",", "GBAT2", ",", "PCAT6", ",", "ZNF672", ",", "SSC5D", ",", "APOC1P1", ",", "HLA", "-", "A", ",", "HLA", "-", "F", "and", "TAP1", "genes", "in", "MCF7", "(", "NTC", ",", "shA", "DVL3", ",", "and", "shB", "DVL3", ")", "cells", ".", "D"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(C) ChIP-qPCRs at ARAP1, RFX5-GBAT2, WDR74 and HAUS5 promoters for IgG and DVL3 in MDA-MB-468 (NTC, shA DVL3, and shB DVL3).(D) ChIP-qPCRs at RFX5-GBAT2, COX14, HLA-E and PSMB8 promoters for IgG and DVL3 in MCF7 (NTC, shA DVL3, and shB DVL3).(E) RT-qPCR-based analysis of expression changes of RFX5, GBAT2, WDR74, HCG15, POU2F3, SNORD3B, APOC1P1, HLA-A, TAP1, PSMD8, PDG1 and JUNB genes in MDA-MB-468 (NTC, shA DVL3, and shB DVL3) cells. (F) RT-qPCR-based analysis of expression changes of RFX5, GBAT2, PCAT6, ZNF672, SSC5D, APOC1P1, HLA-A, HLA-F and TAP1 genes in MCF7 (NTC, shA DVL3, and shB DVL3) cells. D "}
{"words": ["Figure", "4", "(", "C", ")", "ChIP", "-", "qPCRs", "at", "ARAP1", ",", "RFX5", "-", "GBAT2", ",", "KDM5B", ",", "APOC1P1", ",", "and", "PSMB8", "promoters", "for", "IgG", "and", "H3K4me3", "in", "MDA", "-", "MB", "-", "468", "(", "NTC", ",", "shA", "DVL3", ",", "and", "shB", "DVL3", ")", ".", "(", "D", ")", "ChIP", "-", "qPCRs", "at", "RFX5", "-", "GBAT2", ",", "PCAT6", ",", "APOC1P1", "and", "HAUS5", "promoters", "for", "IgG", "and", "H3K4me3", "in", "MCF7", "(", "NTC", ",", "shA", "DVL3", ",", "and", "shB", "DVL3", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(C) ChIP-qPCRs at ARAP1, RFX5-GBAT2, KDM5B, APOC1P1, and PSMB8 promoters for IgG and H3K4me3 in MDA-MB-468 (NTC, shA DVL3, and shB DVL3).(D) ChIP-qPCRs at RFX5-GBAT2, PCAT6, APOC1P1 and HAUS5 promoters for IgG and H3K4me3 in MCF7 (NTC, shA DVL3, and shB DVL3)."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "C", ")", "ChIP", "-", "qPCRs", "at", "ARAP1", ",", "RFX5", "-", "GBAT2", ",", "and", "PSMB8", "promoters", "for", "IgG", "and", "KMT2D", "in", "MDA", "-", "MB", "-", "468", "(", "NTC", ",", "shA", "DVL3", ",", "and", "shB", "DVL3", ")", ".", "(", "D", ")", "An", "assembly", "of", "IgG", "(", "first", "row", ")", ",", "DVL3", "(", "second", "row", ")", ",", "H3K27ac", "(", "third", "row", ")", ",", "and", "H4K8ac", "peak", "(", "fourth", "row", ")", "ChIP", "-", "Seq", "data", "in", "MDA", "-", "MB", "-", "468", "for", "the", "PRDM10", ",", "TRIM26", ",", "BTN2A1", ",", "PNRC2", ",", "and", "MR1", "genes", ",", "visualized", "by", "IGV", ".", "The", "green", "rectangular", "bars", "are", "the", "locations", "of", "the", "statistically", "-", "qualified", "peak", "of", "H3K27ac", "or", "H4K8ac", "in", "MDA", "-", "MB", "-", "468", ".", "(", "E", ")", "An", "assembly", "of", "IgG", "(", "first", "row", ")", ",", "DVL3", "(", "second", "row", ")", ",", "H3K27ac", "(", "third", "row", ")", ",", "and", "H4K8ac", "peak", "(", "fourth", "row", ")", "ChIP", "-", "Seq", "data", "in", "MCF7", "for", "the", "WDR74", ",", "YWHAQ", ",", "CDNF", "/", "HSPA14", ",", "BTN2A1", ",", "and", "MR1", "genes", ",", "visualized", "by", "IGV", ".", "The", "turquoise", "and", "purple", "rectangular", "bars", "are", "the", "locations", "of", "the", "statistically", "-", "qualified", "peak", "of", "H3K27ac", "or", "H4K8ac", "in", "MCF7", ",", "respectively", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(C) ChIP-qPCRs at ARAP1, RFX5-GBAT2, and PSMB8 promoters for IgG and KMT2D in MDA-MB-468 (NTC, shA DVL3, and shB DVL3).(D) An assembly of IgG (first row), DVL3 (second row), H3K27ac (third row), and H4K8ac peak (fourth row) ChIP-Seq data in MDA-MB-468 for the PRDM10, TRIM26, BTN2A1, PNRC2, and MR1 genes, visualized by IGV. The green rectangular bars are the locations of the statistically-qualified peak of H3K27ac or H4K8ac in MDA-MB-468.(E) An assembly of IgG (first row), DVL3 (second row), H3K27ac (third row), and H4K8ac peak (fourth row) ChIP-Seq data in MCF7 for the WDR74, YWHAQ, CDNF/HSPA14, BTN2A1, and MR1 genes, visualized by IGV. The turquoise and purple rectangular bars are the locations of the statistically-qualified peak of H3K27ac or H4K8ac in MCF7, respectively."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "D", ")", "RT", "-", "qPCR", "-", "based", "analysis", "of", "expression", "changes", "of", "DVL3", "in", "MDA", "-", "MB", "-", "468", "(", "NTC", ",", "shA", "DVL3", ",", "and", "shB", "DVL3", ")", "cells", ".", "(", "E", ")", "RT", "-", "qPCR", "-", "based", "analysis", "of", "expression", "changes", "of", "KMT2D", "in", "MDA", "-", "MB", "-", "468", "(", "NTC", ",", "shA", "DVL3", ",", "and", "shB", "DVL3", ")", "cells", ".", "(", "F", ")", "RT", "-", "qPCR", "-", "based", "analysis", "of", "expression", "changes", "of", "DVL3", "in", "MCF7", "(", "NTC", ",", "shA", "DVL3", ",", "and", "shB", "DVL3", ")", "cells", ".", "(", "G", ")", "RT", "-", "qPCR", "-", "based", "analysis", "of", "expression", "changes", "of", "KMT2D", "in", "MCF7", "(", "NTC", ",", "shA", "DVL3", ",", "and", "shB", "DVL3", ")", "cells", ".", "(", "H", "(", "H", ")", "Immunofluorescence", "of", "KMT2D", "localization", "in", "MDA", "-", "MB", "-", "468", "cells", ".", "The", "cells", "were", "probed", "with", "KMT2D", "antibody", "(", "red", ")", ".", "The", "nucleus", "was", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", "and", "the", "actin", "filaments", "(", "green", ")", "were", "stained", "with", "Phalloidin", ".", "Merge", "of", "KMT2D", "(", "red", ")", "and", "nuclear", "staining", "(", "blue", ")", "is", "shown", "as", "KMT2D", "/", "DAPI", ",", "merge", "of", "KMT2D", "(", "red", ")", "and", "actin", "(", "green", ")", "is", "shown", "as", "KMT2D", "/", "ACTIN", ",", "and", ",", "merge", "of", "KMT2D", "(", "red", ")", ",", "nuclear", "staining", "(", "blue", ")", "and", "actin", "(", "green", ")", "is", "shown", "as", "MERGE", "for", "NTC", ",", "shA", "DVL3", "and", "shB", "DVL3", "cells", ".", "Scale", "bar", ":"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(D) RT-qPCR-based analysis of expression changes of DVL3 in MDA-MB-468 (NTC, shA DVL3, and shB DVL3) cells. (E) RT-qPCR-based analysis of expression changes of KMT2D in MDA-MB-468 (NTC, shA DVL3, and shB DVL3) cells. (F) RT-qPCR-based analysis of expression changes of DVL3 in MCF7 (NTC, shA DVL3, and shB DVL3) cells. (G) RT-qPCR-based analysis of expression changes of KMT2D in MCF7 (NTC, shA DVL3, and shB DVL3) cells. (H (H) Immunofluorescence of KMT2D localization in MDA-MB-468 cells. The cells were probed with KMT2D antibody (red). The nucleus was stained with DAPI (blue) and the actin filaments (green) were stained with Phalloidin. Merge of KMT2D (red) and nuclear staining (blue) is shown as KMT2D/DAPI, merge of KMT2D (red) and actin (green) is shown as KMT2D/ACTIN, and, merge of KMT2D (red), nuclear staining (blue) and actin (green) is shown as MERGE for NTC, shA DVL3 and shB DVL3 cells. Scale bar: 10µm"}
{"words": ["Figure", "7", "(", "C", ")", "IVIS", "images", "showing", "representative", "tumors", "generated", "by", "injecting", "luciferase", "-", "expressing", "MDA", "-", "MB", "-", "468", "cells", "(", "NTC", ",", "shA", "DVL3", "or", "shB", "DVL3", ")", "in", "the", "mammary", "fat", "pad", "of", "SCID", "mice", ".", "Color", "scale", "(", "luminescent", "signal", "intensity", ")", ":", "blue", ",", "least", "intense", "signal", ";", "red", ",", "most", "intense", "signal", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "luminescence", "changes", "in", "tumors", "generated", "by", "injecting", "luciferase", "-", "expressing", "MDA", "-", "MB", "-", "468", "cells", "(", "NTC", ",", "shA", "DVL3", "or", "shB", "DVL3", ")", "in", "the", "mammary", "fat", "pad", "of", "SCID", "mice", ",", "Average", "luminescence", "was", "used", "to", "measure", "volume", "of", "tumor", ";", "n", "≥", "9", ".", "(", "(", "G", ")", "IVIS", "images", "showing", "representative", "tumors", "generated", "by", "injecting", "luciferase", "-", "expressing", "MCF7", "cells", "(", "NTC", ",", "shA", "DVL3", ")", "in", "the", "mammary", "fat", "pad", "of", "SCID", "mice", ".", "Color", "scale", "(", "luminescent", "signal", "intensity", ")", ":", "blue", ",", "least", "intense", "signal", ";", "red", ",", "most", "intense", "signal", ".", "(", "H", ")", "Quantification", "of", "luminescence", "changes", "in", "tumors", "generated", "by", "injecting", "luciferase", "-", "expressing", "MCF7", "cells", "(", "NTC", ",", "shA", "DVL3", ")", "in", "the", "mammary", "fat", "pad", "of", "SCID", "mice", ".", "Average", "luminescence", "was", "used", "to", "measure", "volume", "of", "tumor", ".", "n", "=", "7", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(C) IVIS images showing representative tumors generated by injecting luciferase-expressing MDA-MB-468 cells (NTC, shA DVL3 or shB DVL3) in the mammary fat pad of SCID mice. Color scale (luminescent signal intensity): blue, least intense signal; red, most intense signal. (D) Quantification of luminescence changes in tumors generated by injecting luciferase-expressing MDA-MB-468 cells (NTC, shA DVL3 or shB DVL3) in the mammary fat pad of SCID mice, Average luminescence was used to measure volume of tumor; n ≥ 9. ( (G) IVIS images showing representative tumors generated by injecting luciferase-expressing MCF7 cells (NTC, shA DVL3) in the mammary fat pad of SCID mice. Color scale (luminescent signal intensity): blue, least intense signal; red, most intense signal. (H) Quantification of luminescence changes in tumors generated by injecting luciferase-expressing MCF7 cells (NTC, shA DVL3) in the mammary fat pad of SCID mice. Average luminescence was used to measure volume of tumor. n=7."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "A", ")", "Immunofluorescence", "of", "HA", "-", "tagged", "DVL3", "localization", "in", "MDA", "-", "MB", "-", "468", "cells", ".", "The", "cells", "were", "probed", "with", "an", "HA", "antibody", "(", "red", ")", ".", "The", "nucleus", "was", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", "and", "the", "actin", "filaments", "(", "green", ")", "were", "stained", "with", "Phalloidin", ".", "Merge", "of", "actin", "(", "green", ")", "and", "nuclear", "staining", "(", "blue", ")", "is", "shown", "as", "ACTIN", "/", "DAPI", ",", "merge", "of", "DVL3", "(", "red", ")", "and", "nuclear", "staining", "(", "blue", ")", "is", "shown", "as", "HA", "/", "DAPI", ",", "merge", "of", "DVL3", "(", "red", ")", "and", "actin", "(", "green", ")", "is", "shown", "as", "HA", "/", "ACTIN", ",", "and", ",", "merge", "of", "DVL3", "(", "red", ")", ",", "nuclear", "staining", "(", "blue", ")", "and", "actin", "(", "green", ")", "is", "shown", "as", "MERGE", "for", "empty", "vector", "(", "EV", ")", ",", "HA", "-", "DVL3", "-", "WT", "and", "HA", "-", "DVL3", "-", "NESm", "transient", "transfected", "cells", ".", "Scale", "bar", ":", "10µm", ".", "(", "B", ")", "RT", "-", "qPCR", "-", "based", "analysis", "of", "expression", "changes", "of", "DVL3", "in", "stable", "MDA", "-", "MB", "-", "468", "(", "EV", ",", "HA", "-", "DVL3", "-", "NESm", ")", "cells", ".", "(", "C", ")", "RT", "-", "qPCR", "-", "based", "analysis", "of", "expression", "changes", "of", "KMT2D", "in", "stable", "MDA", "-", "MB", "-", "468", "(", "EV", ",", "HA", "-", "DVL3", "-", "NESm", ")", "cells", ".", "(", "D", ")", "RT", "-", "qPCR", "-", "based", "analysis", "of", "expression", "changes", "of", "ARAP1", ",", "RFX5", ",", "GBAT2", ",", "WDR74", ",", "SNORD3D", ",", "HAUS5", ",", "TAP1", ",", "HLA", "-", "A", ",", "PDG1", ",", "and", ",", "MR1", "in", "stable", "MDA", "-", "MB", "-", "468", "(", "EV", ",", "HA", "-", "DVL3", "-", "NESm", ")", "cells", ".", "(", "E"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(A) Immunofluorescence of HA-tagged DVL3 localization in MDA-MB-468 cells. The cells were probed with an HA antibody (red). The nucleus was stained with DAPI (blue) and the actin filaments (green) were stained with Phalloidin. Merge of actin (green) and nuclear staining (blue) is shown as ACTIN/DAPI, merge of DVL3 (red) and nuclear staining (blue) is shown as HA/DAPI, merge of DVL3 (red) and actin (green) is shown as HA/ACTIN, and, merge of DVL3 (red), nuclear staining (blue) and actin (green) is shown as MERGE for empty vector (EV), HA-DVL3-WT and HA-DVL3-NESm transient transfected cells. Scale bar: 10µm.(B) RT-qPCR-based analysis of expression changes of DVL3 in stable MDA-MB-468 (EV, HA-DVL3-NESm) cells. (C) RT-qPCR-based analysis of expression changes of KMT2D in stable MDA-MB-468 (EV, HA-DVL3-NESm) cells. (D) RT-qPCR-based analysis of expression changes of ARAP1 , RFX5, GBAT2, WDR74, SNORD3D, HAUS5, TAP1, HLA-A, PDG1, and, MR1 in stable MDA-MB-468 (EV, HA-DVL3-NESm) cells. (E "}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Representative", "clones", "screened", "for", "CD24", "expression", "under", "regulation", "of", "tetracycline", ".", "The", "cells", "were", "exposed", "to", "1", "µg", "/", "ml", "tetracycline", "for", "48", "h", ".", "20", "µg", "from", "each", "sample", "were", "subjected", "to", "Western", "blot", "analysis", "for", "CD24", "and", "analyzed", "with", "anti", "-", "CD24", "SWA11", "mAb", ".", "The", "membrane", "was", "reprobed", "with", "anti", "-", "tubulin", "antibody", "to", "assess", "the", "uniformity", "of", "sample", "loading", ".", "(", "D", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "EXO", "-", "CD24", "exosomes", ".", "Tetracycline", "(", "Tet", ")", "was", "used", "to", "induce", "CD24", "expression", "in", "the", "cell", "line", "from", "which", "exosomes", "are", "derived", ".", "HSP70", "was", "used", "as", "an", "exosomal", "marker", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Representative clones screened for CD24 expression under regulation of tetracycline. The cells were exposed to 1 µg/ml tetracycline for 48 h. 20 µg from each sample were subjected to Western blot analysis for CD24 and analyzed with anti-CD24 SWA11 mAb. The membrane was reprobed with anti-tubulin antibody to assess the uniformity of sample loading.(D) Western blot analysis of EXO-CD24 exosomes. Tetracycline (Tet) was used to induce CD24 expression in the cell line from which exosomes are derived. HSP70 was used as an exosomal marker."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "C", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "EXO", "-", "mCD24", "exosomes", ".", "HSP70", "was", "used", "as", "an", "exosomal", "marker", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(C) Western blot analysis of EXO-mCD24 exosomes. HSP70 was used as an exosomal marker."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "B", ")", "respiratory", "rate", "and", "(", "C", ")", "Blood", "oxygen", "(", "SpO2", ")", "and", "before", "treatment", "(", "Day", "1", ",", "measured", "before", "administration", "of", "first", "dose", ")", "and", "after", "treatment", "(", "Day", "7", ")", ".", "Descriptive", "statistics", "(", "minimum", ",", "maximum", ",", "median", ",", "first", "quartile", ",", "third", "quartile", ")", "were", "calculated", "for", "Blood", "oxygen", "(", "SpO2", ")", "and", "respiratory", "rate", ".", "these", "are", "presented", "graphically", "via", "box", "plots", "before", "and", "after", "treatment", ".", "(", "D", ")", "Representative", "X", "-", "ray", "image", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(B) respiratory rate and (C) Blood oxygen (SpO2) and before treatment (Day 1, measured before administration of first dose) and after treatment (Day 7). Descriptive statistics (minimum, maximum, median, first quartile, third quartile) were calculated for Blood oxygen (SpO2) and respiratory rate. these are presented graphically via box plots before and after treatment.(D) Representative X-ray image."}
{"words": ["Figure", "8Systemic", "CRP", "levels", ".", "Values", "are", "normalized", "against", "baseline", "value", "(", "Day", "0", ")", ".", "Descriptive", "statistics", "(", "minimum", ",", "maximum", ",", "median", ",", "first", "quartile", ",", "third", "quartile", ")", "were", "calculated", "for", "CRP", "levels", ".", "these", "are", "presented", "graphically", "via", "box", "plots", "before", "and", "after", "treatment", "(", "n", "=", "35", "patients", ")", "(", "B", ")", "Systemic", "cytokine", "levels", ".", "Cytokine", "levels", "were", "measured", "during", "(", "Day", "3", "/", "4", ")", "or", "after", "(", "Day", "7", "/", "8", ")", "treatment", "with", "EXO", "-", "CD24", "using", "Quantibody", "Multiplex", "ELISA", "Array", ".", "Values", "are", "normalized", "against", "baseline", "value", "(", "Day", "0", ")", ".", "Samples", "from", "11", "patients", "were", "analysed", ".", "Results", "from", "8", "patients", "are", "shown", "(", "results", "for", "3", "patients", "are", "not", "shown", "because", "one", "or", "more", "baseline", "results", "were", "below", "detection", "level", ")", ".", "Box", "plot", "of", "Systemic", "cytokine", "levels", "by", "days", "after", "treatment", "(", "minimum", ",", "maximum", ",", "median", ",", "first", "quartile", ",", "third", "quartile", ")", ".", "(", "C", ")", "During", "the", "course", "of", "EXO", "-", "CD24", "treatment", "and", "follow", "-", "up", ",", "cytokine", "levels", "were", "measured", "for", "the", "rest", "of", "the", "patients", "(", "n", "=", "24", "patients", ")", ".", "(", "D", ")", "Monitoring", "systemic", "IL", "-", "6", "cytokine", "level", "following", "EXO", "-", "CD24", "treatment", ".", "Samples", "from", "17", "patients", ",", "representing", "the", "4", "experimental", "groups", ",", "were", "analysed", "using", "the", "BD", "™", "Cytometric", "Bead", "Array", "(", "CBA", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8Systemic CRP levels. Values are normalized against baseline value (Day 0). Descriptive statistics (minimum, maximum, median, first quartile, third quartile) were calculated for CRP levels. these are presented graphically via box plots before and after treatment (n=35 patients)(B) Systemic cytokine levels. Cytokine levels were measured during (Day 3/4) or after (Day 7/8) treatment with EXO-CD24 using Quantibody Multiplex ELISA Array. Values are normalized against baseline value (Day 0). Samples from 11 patients were analysed. Results from 8 patients are shown (results for 3 patients are not shown because one or more baseline results were below detection level). Box plot of Systemic cytokine levels by days after treatment (minimum, maximum, median, first quartile, third quartile).(C) During the course of EXO-CD24 treatment and follow-up, cytokine levels were measured for the rest of the patients (n=24 patients).(D) Monitoring systemic IL-6 cytokine level following EXO-CD24 treatment. Samples from 17 patients, representing the 4 experimental groups, were analysed using the BD™ Cytometric Bead Array (CBA)."}
{"words": ["Fig", "1A", ".", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "protein", "accumulates", "in", "atg1Δ", ",", "atg8Δ", ",", "and", "atg11Δ", "mutant", "cells", ".", "Lysates", "were", "prepared", "from", "wild", "type", "(", "WT", ")", ",", "ypt1", "-", "1", "(", "for", "comparison", ")", ",", "atg1Δ", ",", "atg8Δ", ",", "and", "atg11Δ", "mutant", "cells", "transformed", "with", "a", "2μ", "plasmid", "expressing", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "from", "the", "TPI", "promoter", ".", "The", "level", "of", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "was", "determined", "using", "immunoblot", "analysis", "with", "anti", "-", "GFP", "antibodies", ".", "The", "bands", "were", "quantified", "and", "increase", "in", "the", "protein", "level", "in", "mutant", "versus", "the", "WT", "cells", "is", "shown", "under", "the", "blot", "and", "adjusted", "to", "the", "G6PDH", "loading", "control", ".", "B", ".", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "protein", "accumulates", "in", "aberrant", "ER", "structures", "in", "atg1Δ", ",", "atg8Δ", ",", "and", "atg11Δ", "mutant", "cells", ".", "The", "ER", "-", "marker", "Sec61", "was", "tagged", "with", "mCherry", "in", "strains", "from", "panel", "A", ",", "and", "the", "cells", "were", "examined", "by", "live", "-", "cell", "microscopy", ".", "Shown", "from", "left", "to", "right", ":", "DIC", ",", "GFP", ",", "mCherry", ",", "merge", ",", "%", "cells", "with", "intracellular", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "(", "number", "of", "cells", "with", "internal", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "/", "number", "of", "cells", "visualized", ")", ",", "and", "%", "cells", "in", "which", "intra", "-", "cellular", "Snc1", "-", "PEM", "co", "-", "localizes", "with", "Sec61", ".", "C", ".", "UPR", "is", "induced", "in", "atg1Δ", ",", "atg8Δ", ",", "and", "atg11Δ", "mutant", "cells", ".", "Cells", "from", "panel", "A", "were", "transformed", "with", "a", "second", "plasmid", "that", "expresses", "β", "-", "gal", "from", "a", "UPR", "promoter", ".", "UPR", "was", "determined", "and", "expressed", "as", "%", "of", "the", "WT", "response", ".", "D", "-", "E", ".", "Unlike", "deletion", "of", "Atg11", ",", "deletion", "of", "other", "known", "selective", "Atgs", "required", "for", "the", "CVT", "pathway", "(", "Atg19", ")", ",", "mitophagy", "(", "Atg32", ")", "and", "pexophagy", "(", "Atg36", ")", ",", "does", "not", "result", "in", "increase", "of", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "protein", "level", "(", "DD", "-", "E", ".", "Unlike", "deletion", "of", "Atg11", ",", "deletion", "of", "other", "known", "selective", "Atgs", "required", "for", "the", "CVT", "pathway", "(", "Atg19", ")", ",", "mitophagy", "(", "Atg32", ")", "and", "pexophagy", "(", "Atg36", ")", ",", "does", "not", "result", "in", "increase", "of", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "protein", "level", "(", "D", ")", ",", "intra", "-", "cellular", "accumulation", "of", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", ",", "(", "E", ")", ",", "D", "-", "E", ".", "Unlike", "deletion", "of", "Atg11", ",", "deletion", "of", "other", "known", "selective", "Atgs", "required", "for", "the", "CVT", "pathway", "(", "Atg19", ")", ",", "mitophagy", "(", "Atg32", ")", "and", "pexophagy", "(", "Atg36", ")", ",", "does", "not", "result", "in", "increase", "of", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "protein", "level", "(", "D", ")", ",", "intra", "-", "cellular", "accumulation", "of", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", ",", "(", "E", ")", ",", "and", "induction", "of", "the", "UPR", "response", "(", "F", ")", ".", "Wild", "type", "(", "WT", ")", ",", "atg19Δ", ",", "atg11Δ", ",", "atg32Δ", ",", "and", "atg36Δ", "mutant", "cells", "overexpressing", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "were", "analyzed", "as", "described", "for", "panels", "A", "-", "C", ",", "respectively", ".", "E", ".", "Shown", "from", "left", "to", "right", ":", "DIC", ",", "GFP", ",", "and", "%", "cells", "with", "intracellular", "Snc1", "-", "PEM", "structures", ".", "+", "/", "-", "and", "error", "bars", "represent", "STDEV", ".", "Results", "in", "this", "figure", "represent", "at", "least", "two", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig 1A. GFP-Snc1-PEM protein accumulates in atg1Δ, atg8Δ, and atg11Δ mutant cells. Lysates were prepared from wild type (WT), ypt1-1 (for comparison), atg1Δ, atg8Δ, and atg11Δ mutant cells transformed with a 2μ plasmid expressing GFP-Snc1-PEM from the TPI promoter. The level of GFP-Snc1-PEM was determined using immunoblot analysis with anti-GFP antibodies. The bands were quantified and increase in the protein level in mutant versus the WT cells is shown under the blot and adjusted to the G6PDH loading control.B. GFP-Snc1-PEM protein accumulates in aberrant ER structures in atg1Δ, atg8Δ, and atg11Δ mutant cells. The ER-marker Sec61 was tagged with mCherry in strains from panel A, and the cells were examined by live-cell microscopy. Shown from left to right: DIC, GFP, mCherry, merge, % cells with intracellular GFP-Snc1-PEM (number of cells with internal GFP-Snc1-PEM / number of cells visualized), and % cells in which intra-cellular Snc1-PEM co-localizes with Sec61.C. UPR is induced in atg1Δ, atg8Δ, and atg11Δ mutant cells. Cells from panel A were transformed with a second plasmid that expresses β-gal from a UPR promoter. UPR was determined and expressed as % of the WT response.D-E. Unlike deletion of Atg11, deletion of other known selective Atgs required for the CVT pathway (Atg19), mitophagy (Atg32) and pexophagy (Atg36), does not result in increase of GFP-Snc1-PEM protein level (DD-E. Unlike deletion of Atg11, deletion of other known selective Atgs required for the CVT pathway (Atg19), mitophagy (Atg32) and pexophagy (Atg36), does not result in increase of GFP-Snc1-PEM protein level (D), intra-cellular accumulation of GFP-Snc1-PEM, (E),D-E. Unlike deletion of Atg11, deletion of other known selective Atgs required for the CVT pathway (Atg19), mitophagy (Atg32) and pexophagy (Atg36), does not result in increase of GFP-Snc1-PEM protein level (D), intra-cellular accumulation of GFP-Snc1-PEM, (E), and induction of the UPR response (F). Wild type (WT), atg19Δ, atg11Δ, atg32Δ, and atg36Δ mutant cells overexpressing GFP-Snc1-PEM were analyzed as described for panels A-C, respectively. E. Shown from left to right: DIC, GFP, and % cells with intracellular Snc1-PEM structures. +/- and error bars represent STDEV. Results in this figure represent at least two independent experiments."}
{"words": ["Fig", "2A", "-", "C", ".", "While", "the", "level", "of", "overexpressed", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "is", "increased", "in", "atg9", "∆", "and", "atg2", "∆", ",", "but", "not", "atg18", "∆", ",", "mutant", "cells", ",", "it", "does", "not", "accumulate", "in", "aberrant", "structures", "and", "does", "not", "induce", "UPR", ".", "Wild", "type", "(", "WT", ")", ",", "atg9", "∆", ",", "atg18", "∆", ",", "and", "atg2", "∆", "mutant", "cells", "overexpressing", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "were", "analyzed", "as", "described", "for", "Fig", "1A", "-", "1C", ",", "respectively", ".", "The", "tested", "phenotypes", ":", "the", "level", "of", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "protein", "(", "A", ")", ",", "A", "-", "C", ".", "While", "the", "level", "of", "overexpressed", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "is", "increased", "in", "atg9", "∆", "and", "atg2", "∆", ",", "but", "not", "atg18", "∆", ",", "mutant", "cells", ",", "it", "does", "not", "accumulate", "in", "aberrant", "structures", "and", "does", "not", "induce", "UPR", ".", "Wild", "type", "(", "WT", ")", ",", "atg9", "∆", ",", "atg18", "∆", ",", "and", "atg2", "∆", "mutant", "cells", "overexpressing", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "were", "analyzed", "as", "described", "for", "Fig", "1A", "-", "1C", ",", "respectively", ".", "The", "tested", "phenotypes", ":", "the", "level", "of", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "protein", "(", "A", ")", ",", "accumulation", "of", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "in", "aberrant", "structures", "(", "B", ")", "A", "-", "C", ".", "While", "the", "level", "of", "overexpressed", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "is", "increased", "in", "atg9", "∆", "and", "atg2", "∆", ",", "but", "not", "atg18", "∆", ",", "mutant", "cells", ",", "it", "does", "not", "accumulate", "in", "aberrant", "structures", "and", "does", "not", "induce", "UPR", ".", "Wild", "type", "(", "WT", ")", ",", "atg9", "∆", ",", "atg18", "∆", ",", "and", "atg2", "∆", "mutant", "cells", "overexpressing", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "were", "analyzed", "as", "described", "for", "Fig", "1A", "-", "1C", ",", "respectively", ".", "The", "tested", "phenotypes", ":", "the", "level", "of", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "protein", "(", "A", ")", ",", "accumulation", "of", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "in", "aberrant", "structures", "(", "B", ")", ",", "and", "induction", "of", "the", "UPR", "response", "(", "C", ",", "atg1", "∆", "is", "shown", "as", "a", "positive", "control", ")", ".", "D", "-", "G", ".", "Atg9", "is", "epistatic", "to", "Atg11", "in", "macro", "-", "ER", "-", "phagy", ".", "ATG9", "was", "deleted", "in", "wild", "type", "and", "atg11", "∆", "mutant", "cells", "and", "the", "effects", "of", "overexpression", "of", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "were", "determined", "in", "the", "single", "and", "double", "mutants", "as", "described", "in", "Fig", "1", "legend", ".", "D", ".", "Deletion", "of", "ATG9", "in", "wild", "type", "(", "WT", ")", "or", "atg11", "∆", "mutant", "cells", "results", "in", "an", "increase", "of", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "protein", "level", "similar", "to", "the", "increase", "in", "atg11", "∆", "mutant", "cells", ".", "E", ".", "Deletion", "of", "ATG9", "in", "wild", "type", "or", "atg11", "∆", "mutant", "cells", "results", "in", "an", "increase", "of", "intracellular", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "fluorescence", ".", "However", ",", "only", "~", "20", "%", "of", "the", "atg9", "∆", "single", "-", ",", "and", "atg9", "∆", "atg11", "∆", "double", "-", "mutant", "cells", "accumulate", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "in", "aberrant", "structures", ",", "as", "compared", "with", "~", "75", "%", "of", "atg11", "∆", "mutant", "cells", ".", "Shown", "from", "top", "to", "bottom", ":", "DIC", ",", "GFP", ",", "%", "cells", "with", "aberrant", "intracellular", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "structures", ",", "ratio", "of", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "fluorescence", "inside", "/", "PM", "(", "30", "cells", "were", "analyzed", "for", "each", "strain", ")", ".", "F", ".", "UPR", "is", "induced", "in", "atg11", "∆", ",", "but", "not", "in", "atg9", "∆", "single", "-", "and", "atg9", "∆", "atg11", "∆", "double", "-", "mutant", "cells", "overexpressing", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", ".", "G", ".", "UPR", "can", "be", "induced", "in", "atg9", "∆", "single", "-", ",", "and", "atg9", "atg11", "∆", "double", "-", "mutant", "cells", "overexpressing", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "by", "tunicamycin", ".", "+", "/", "-", "and", "error", "bars", "represent", "STDEV", ".", "Results", "in", "this", "figure", "represent", "at", "least", "two", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig 2A-C. While the level of overexpressed GFP-Snc1-PEM is increased in atg9∆ and atg2∆, but not atg18∆, mutant cells, it does not accumulate in aberrant structures and does not induce UPR. Wild type (WT), atg9∆, atg18∆, and atg2∆ mutant cells overexpressing GFP-Snc1-PEM were analyzed as described for Fig 1A-1C, respectively. The tested phenotypes: the level of GFP-Snc1-PEM protein (A),A-C. While the level of overexpressed GFP-Snc1-PEM is increased in atg9∆ and atg2∆, but not atg18∆, mutant cells, it does not accumulate in aberrant structures and does not induce UPR. Wild type (WT), atg9∆, atg18∆, and atg2∆ mutant cells overexpressing GFP-Snc1-PEM were analyzed as described for Fig 1A-1C, respectively. The tested phenotypes: the level of GFP-Snc1-PEM protein (A), accumulation of GFP-Snc1-PEM in aberrant structures (B)A-C. While the level of overexpressed GFP-Snc1-PEM is increased in atg9∆ and atg2∆, but not atg18∆, mutant cells, it does not accumulate in aberrant structures and does not induce UPR. Wild type (WT), atg9∆, atg18∆, and atg2∆ mutant cells overexpressing GFP-Snc1-PEM were analyzed as described for Fig 1A-1C, respectively. The tested phenotypes: the level of GFP-Snc1-PEM protein (A), accumulation of GFP-Snc1-PEM in aberrant structures (B), and induction of the UPR response (C,atg1∆ is shown as a positive control).D-G. Atg9 is epistatic to Atg11 in macro-ER-phagy. ATG9 was deleted in wild type and atg11∆ mutant cells and the effects of overexpression of GFP-Snc1-PEM were determined in the single and double mutants as described in Fig 1 legend. D. Deletion of ATG9 in wild type (WT) or atg11∆ mutant cells results in an increase of GFP-Snc1-PEM protein level similar to the increase in atg11∆ mutant cells.E. Deletion of ATG9 in wild type or atg11∆ mutant cells results in an increase of intracellular GFP-Snc1-PEM fluorescence. However, only ~20% of the atg9∆ single-, and atg9∆ atg11∆ double-mutant cells accumulate GFP-Snc1-PEM in aberrant structures, as compared with ~75% of atg11∆ mutant cells. Shown from top to bottom: DIC, GFP, % cells with aberrant intracellular GFP-Snc1-PEM structures, ratio of GFP-Snc1-PEM fluorescence inside/PM (30 cells were analyzed for each strain).F. UPR is induced in atg11∆, but not in atg9∆ single- and atg9∆ atg11∆ double-mutant cells overexpressing GFP-Snc1-PEM.G. UPR can be induced in atg9∆ single-, and atg9 atg11∆ double-mutant cells overexpressing GFP-Snc1-PEM by tunicamycin. +/- and error bars represent STDEV. Results in this figure represent at least two independent experiments."}
{"words": ["Fig", "3A", "-", "C", ".", "ATG9", "was", "deleted", "in", "ypt1", "-", "1", ",", "WT", "and", "sec12ts", "mutant", "cells", "and", "the", "effect", "of", "overexpression", "of", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "was", "determined", "in", "single", "and", "double", "mutant", "cells", ".", "Experiments", "were", "performed", "as", "described", "for", "Fig", "1A", "-", "1C", ",", "respectively", ".", "A", ".", "Snc1", "-", "PEM", "is", "increased", "~", "3", "fold", "in", "atg9", "∆", "and", "sec12ts", "as", "compared", "to", "~", "20", "fold", "in", "ypt1", "-", "1", "mutant", "cells", ".", "Importantly", ",", "atg9", "∆", "is", "epstatic", "to", "the", "ypt1", "-", "1", ",", "but", "not", "to", "the", "sec12ts", ",", "mutation", ".", "Left", ",", "immuno", "-", "blot", "analysis", ",", "increase", "of", "the", "protein", "level", "in", "mutant", "versus", "the", "WT", "cells", "is", "shown", "under", "the", "blot", ";", "right", ",", "a", "bar", "graph", "summarizing", "the", "quantified", "data", ".", "Whereas", "deletion", "of", "ATG9", "in", "ypt1", "-", "1", "mutant", "cells", "results", "in", "three", "fold", "lower", "accumulation", "of", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "in", "aberrant", "structures", "(", "85", "%", "to", "27", "%", ")", ",", "its", "deletion", "in", "sec12ts", "mutant", "cells", "results", "in", "two", "fold", "increased", "accumulation", "(", "~", "40", "%", "to", "~", "80", "%", ")", ".", "Shown", "from", "top", "to", "bottom", ":", "DIC", ",", "GFP", ",", "and", "%", "cells", "with", "intracellular", "Snc1", "-", "PEM", "structures", ".", "C", ".", "Deletion", "of", "ATG9", "in", "ypt1", "-", "1", "mutant", "cells", "overexpressing", "Snc1", "-", "PEM", "results", "in", "~", "3", ".", "5", "lower", "UPR", "(", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "0005", ")", ",", "but", "a", "slightly", "increased", "UPR", "in", "sec12ts", "mutant", "cells", "(", "p", "-", "value", "=", "0", ".", "05", ")", ".", "D", ".", "Atg9", "is", "present", "on", "aberrant", "ER", "structures", "that", "accumulate", "in", "ypt1", "-", "1", "mutant", "cells", ".", "WT", "and", "ypt1", "-", "1", "mutant", "cells", "expressing", "Atg9", "-", "mCherry", "from", "the", "chromosome", "and", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "from", "a", "2μ", "plasmid", "were", "analyzed", "by", "live", "-", "cell", "microscopy", ".", "Whereas", "in", "WT", "cells", "(", "top", ")", ",", "the", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "localizes", "to", "the", "cell", "membrane", "and", "Atg9", "-", "mCherry", "to", "intracellular", "puncta", ",", "the", "two", "proteins", "co", "-", "localize", "in", "100", "%", "of", "the", "ypt1", "-", "1", "mutant", "cells", "(", "bottom", ")", "that", "accumulate", "intracellular", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "structures", "(", "~", "80", "%", ")", ".", "Shown", "from", "left", "to", "right", ":", "DIC", ",", "GFP", ",", "mCherry", ",", "merge", ",", "%", "cells", "with", "intracellular", "Snc1", "-", "PEM", ",", "and", "%", "cells", "with", "co", "-", "localization", "(", "number", "of", "cells", "with", "observed", "phenotype", "/", "total", "number", "of", "cells", "analyzed", ")", ".", "E", ".", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "is", "delivered", "to", "the", "vacuole", "for", "degradation", "in", "sec12ts", "mutant", "cells", ".", "Accumulation", "of", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "in", "vacuoles", "of", "sec12ts", "mutant", "cells", ",", "with", "and", "without", "deletion", "of", "the", "vacuolar", "protease", "Pep4", ",", "was", "determined", "using", "the", "FM4", "-", "64", "dye", ",", "which", "labels", "the", "vacuolar", "membrane", ".", "Deletion", "of", "PEP4", "in", "sec12ts", "mutant", "cells", "results", "in", "an", "increase", "percent", "of", "cells", "in", "which", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "accumulates", "inside", "the", "vacuole", "(", "from", "8", "%", "to", "100", "%", ")", ".", "Shown", "from", "left", "to", "right", ":", "DIC", ",", "GFP", ",", "FM4", "-", "64", "(", "vacuolar", "membrane", ")", ",", "merge", ",", "%", "cells", "with", "aberrant", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "structures", ",", "%", "cells", "with", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "outside", "vacuole", ",", "and", "%", "cells", "with", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "inside", "the", "vacuole", ".", "+", "/", "-", "and", "error", "bars", "represent", "STDEV", ".", "Results", "in", "this", "figure", "represent", "at", "least", "two", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig 3A-C.ATG9 was deleted in ypt1-1, WT and sec12ts mutant cells and the effect of overexpression of GFP-Snc1-PEM was determined in single and double mutant cells. Experiments were performed as described for Fig 1A-1C, respectively. A. Snc1-PEM is increased ~3 fold in atg9∆ and sec12ts as compared to ~20 fold in ypt1-1 mutant cells. Importantly, atg9∆ is epstatic to the ypt1-1, but not to the sec12ts, mutation. Left, immuno-blot analysis, increase of the protein level in mutant versus the WT cells is shown under the blot; right, a bar graph summarizing the quantified data. Whereas deletion of ATG9 in ypt1-1 mutant cells results in three fold lower accumulation of GFP-Snc1-PEM in aberrant structures (85% to 27%), its deletion in sec12ts mutant cells results in two fold increased accumulation (~40% to ~80%). Shown from top to bottom: DIC, GFP, and % cells with intracellular Snc1-PEM structures.C. Deletion of ATG9 in ypt1-1 mutant cells overexpressing Snc1-PEM results in ~3.5 lower UPR (p-value<0.0005), but a slightly increased UPR in sec12ts mutant cells (p-value = 0.05).D. Atg9 is present on aberrant ER structures that accumulate in ypt1-1 mutant cells. WT and ypt1-1 mutant cells expressing Atg9-mCherry from the chromosome and GFP-Snc1-PEM from a 2μ plasmid were analyzed by live-cell microscopy. Whereas in WT cells (top), the GFP-Snc1-PEM localizes to the cell membrane and Atg9-mCherry to intracellular puncta, the two proteins co-localize in 100% of the ypt1-1 mutant cells (bottom) that accumulate intracellular GFP-Snc1-PEM structures (~80%). Shown from left to right: DIC, GFP, mCherry, merge, % cells with intracellular Snc1-PEM, and % cells with co-localization (number of cells with observed phenotype / total number of cells analyzed).E. GFP-Snc1-PEM is delivered to the vacuole for degradation in sec12ts mutant cells. Accumulation of GFP-Snc1-PEM in vacuoles of sec12ts mutant cells, with and without deletion of the vacuolar protease Pep4, was determined using the FM4-64 dye, which labels the vacuolar membrane. Deletion of PEP4 in sec12ts mutant cells results in an increase percent of cells in which GFP-Snc1-PEM accumulates inside the vacuole (from 8% to 100%). Shown from left to right: DIC, GFP, FM4-64 (vacuolar membrane), merge, % cells with aberrant GFP-Snc1-PEM structures, % cells with GFP-Snc1-PEM outside vacuole, and % cells with GFP-Snc1-PEM inside the vacuole. +/- and error bars represent STDEV. Results in this figure represent at least two independent experiments."}
{"words": ["Fig", "4A", ".", "The", "ypt1", "-", "1", "mutation", "is", "epistatic", "to", "vps21", "∆", "in", "ER", "-", "phagy", ".", "yDsRed", "-", "Snc1", "-", "PEM", "was", "overexpressed", "in", "WT", ",", "vps21", "∆", ",", "ypt1", "-", "1", "and", "ypt1", "-", "1vps21", "∆", "double", "mutant", "cells", "that", "also", "expressed", "the", "autophagosomal", "marker", "yEGFP", "-", "Atg8", ".", "Cells", "were", "analyzed", "by", "live", "-", "cell", "microscopy", ".", "Shown", "from", "left", "to", "right", ":", "DIC", ",", "DsRed", ",", "GFP", ",", "merge", ",", "%", "cells", "Atg8", "dots", ",", "number", "of", "Atg8", "dots", "per", "cell", ",", "and", "%", "cells", "in", "which", "the", "Atg8", "dots", "co", "-", "localize", "with", "Snc1", "-", "PEM", ".", "About", "50", "%", "of", "WT", "and", "85", "%", "of", "vps21", "∆", "mutant", "cells", "contain", "~", "1", "dot", "of", "Atg8", "representing", "the", "AP", ".", "Importantly", ",", "in", "~", "70", "%", "of", "the", "vps21", "∆", "mutant", "cells", "Snc1", "-", "PEM", "co", "-", "localizes", "with", "the", "APs", ",", "as", "compared", "to", "~", "4", "%", "in", "WT", "cells", ".", "In", "contrast", ",", "~", "90", "%", "ypt1", "-", "1", "and", "ypt1", "-", "1vps21", "∆", "mutant", "cells", "contain", "three", "APs", "per", "cell", ",", "and", "Snc1", "-", "PEM", "does", "not", "co", "-", "localize", "with", "them", ".", "Arrows", "point", "to", "co", "-", "localization", ";", "arrowheads", "point", "to", "either", "Atg8", "dots", "or", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "that", "do", "not", "co", "-", "localize", ".", "The", "following", "effects", "of", "overexpression", "of", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "in", "WT", "and", "ypt1", "-", "1", "mutant", "cells", ",", "without", "and", "with", "ire1Δ", "or", "hac1Δ", ",", "were", "analyzed", "as", "described", "for", "Fig", "1A", "-", "1C", ",", "respectively", ":", "protein", "level", "(", "B", ")", ",", "accumulation", "of", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "in", "aberrant", "structures", "(", "C", ")", ",", "and", "UPR", "induction", "(", "D", ")", ".", "B", ".", "Deletion", "of", "either", "Ire1", "or", "Hac1", "does", "not", "affect", "the", "level", "of", "Snc1", "-", "PEM", "accumulation", "in", "WT", "or", "ypt1", "-", "1", "mutant", "cells", ".", "C", ".", "Deletion", "of", "either", "Ire1", "or", "Hac1", "does", "not", "affect", "the", "percent", "of", "WT", "and", "ypt1", "-", "1", "mutant", "cells", "that", "accumulate", "aberrant", "intra", "-", "cellular", "Snc1", "-", "PEM", ".", "Shown", "from", "top", "to", "bottom", ":", "DIC", ",", "GFP", ",", "and", "%", "cells", "with", "intracellular", "Snc1", "-", "PEM", "structures", ".", "D", ".", "Deletion", "of", "either", "Ire1", "or", "Hac1", "obliterate", "UPR", "in", "both", "WT", "and", "ypt1", "-", "1", "mutant", "cells", ".", "+", "/", "-", "and", "error", "bars", "represent", "STDEV", ".", "Results", "in", "this", "figure", "represent", "at", "least", "two", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig 4A. The ypt1-1 mutation is epistatic to vps21∆ in ER-phagy. yDsRed-Snc1-PEM was overexpressed in WT, vps21∆, ypt1-1 and ypt1-1vps21∆ double mutant cells that also expressed the autophagosomal marker yEGFP-Atg8. Cells were analyzed by live-cell microscopy. Shown from left to right: DIC, DsRed, GFP, merge, % cells Atg8 dots, number of Atg8 dots per cell, and % cells in which the Atg8 dots co-localize with Snc1-PEM. About 50% of WT and 85% of vps21∆ mutant cells contain ~1 dot of Atg8 representing the AP. Importantly, in ~70% of the vps21∆ mutant cells Snc1-PEM co-localizes with the APs, as compared to ~4% in WT cells. In contrast, ~90% ypt1-1 and ypt1-1vps21∆ mutant cells contain three APs per cell, and Snc1-PEM does not co-localize with them. Arrows point to co-localization; arrowheads point to either Atg8 dots or GFP-Snc1-PEM that do not co-localize.The following effects of overexpression of GFP-Snc1-PEM in WT and ypt1-1 mutant cells, without and with ire1Δ or hac1Δ, were analyzed as described for Fig 1A-1C, respectively: protein level (B), accumulation of GFP-Snc1-PEM in aberrant structures (C), and UPR induction (D). B. Deletion of either Ire1 or Hac1 does not affect the level of Snc1-PEM accumulation in WT or ypt1-1 mutant cells.C. Deletion of either Ire1 or Hac1 does not affect the percent of WT and ypt1-1 mutant cells that accumulate aberrant intra-cellular Snc1-PEM. Shown from top to bottom: DIC, GFP, and % cells with intracellular Snc1-PEM structures.D. Deletion of either Ire1 or Hac1 obliterate UPR in both WT and ypt1-1 mutant cells. +/- and error bars represent STDEV. Results in this figure represent at least two independent experiments."}
{"words": ["Fig", "5A", "-", "C", ".", "Overexpressed", "Snq2", "-", "GFP", "accumulates", "in", "the", "ER", "and", "induces", "UPR", "in", "ypt1", "-", "1", "mutant", "cells", ".", "Snq2", "-", "yEGFP", "was", "overexpressed", "in", "WT", "and", "ypt1", "-", "1", "mutant", "cells", "and", "the", "following", "effects", "were", "analyzed", "as", "described", "for", "Fig", "1A", "-", "1C", ",", "respectively", ":", "increase", "in", "the", "level", "of", "Snq2", "-", "yEGFP", "protein", "(", "A", ")", "A", "-", "C", ".", "Overexpressed", "Snq2", "-", "GFP", "accumulates", "in", "the", "ER", "and", "induces", "UPR", "in", "ypt1", "-", "1", "mutant", "cells", ".", "Snq2", "-", "yEGFP", "was", "overexpressed", "in", "WT", "and", "ypt1", "-", "1", "mutant", "cells", "and", "the", "following", "effects", "were", "analyzed", "as", "described", "for", "Fig", "1A", "-", "1C", ",", "respectively", ":", "increase", "in", "the", "level", "of", "Snq2", "-", "yEGFP", "protein", "(", "A", ")", ",", "accumulation", "of", "Snq2", "-", "yEGFP", "in", "aberrant", "ER", "structures", "(", "B", ")", ",", "A", "-", "C", ".", "Overexpressed", "Snq2", "-", "GFP", "accumulates", "in", "the", "ER", "and", "induces", "UPR", "in", "ypt1", "-", "1", "mutant", "cells", ".", "Snq2", "-", "yEGFP", "was", "overexpressed", "in", "WT", "and", "ypt1", "-", "1", "mutant", "cells", "and", "the", "following", "effects", "were", "analyzed", "as", "described", "for", "Fig", "1A", "-", "1C", ",", "respectively", ":", "increase", "in", "the", "level", "of", "Snq2", "-", "yEGFP", "protein", "(", "A", ")", ",", "accumulation", "of", "Snq2", "-", "yEGFP", "in", "aberrant", "ER", "structures", "(", "B", ")", ",", "and", "induction", "of", "the", "UPR", "response", "(", "C", ",", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "is", "shown", "for", "comparison", ")", ".", "D", "-", "F", ".", "Synergistic", "effect", "of", "co", "-", "overexpression", "of", "Snq2", "-", "GFP", "with", "DsRed", "-", "Snc1", "-", "PEM", "in", "atg11", "∆", "mutant", "cells", ".", "WT", "(", "left", ")", "and", "atg11", "∆", "mutant", "cells", "(", "right", ")", "were", "transformed", "with", "plasmids", "for", "overexpression", "of", "Snq2", ",", "Snc1", "-", "PEM", "or", "both", "Snq2", "and", "Snc1", "-", "PEM", ".", "D", ".", "Immunoblot", "analysis", "and", "quantification", ".", "Shown", "from", "top", "to", "bottom", ":", "Snq2", "-", "yEGFP", "(", "using", "anti", "-", "GFP", "antibodies", ")", ",", "Ds", "-", "Red", "-", "Snc1", "-", "PEM", "(", "using", "anti", "-", "Snc1", "antibodies", ")", ",", "G6PDH", "(", "loading", "control", ")", ",", "and", "a", "bar", "graph", "showing", "fold", "increase", "of", "Snq2", "-", "yEGFP", "(", "green", ")", "and", "Ds", "-", "Red", "-", "Snc1", "-", "PEM", "(", "red", ")", "in", "atg11", "∆", "mutant", "cells", "over", "WT", ".", "E", ".", "Accumulation", "of", "macro", "-", "ER", "-", "phagy", "cargos", "in", "aberrant", "intracellular", "structures", "using", "live", "-", "cells", "microscopy", ".", "Shown", "from", "left", "to", "right", ":", "DIC", ",", "GFP", ",", "DsRed", "and", "Merge", ".", "Shown", "from", "top", "to", "bottom", ":", "Snq2", ",", "Snc1", "-", "PEM", ",", "Snq2", "+", "Snc1", "-", "PEM", ",", "and", "%", "cells", "with", "co", "-", "localization", "(", "relevant", "only", "for", "co", "-", "overexpression", ")", "(", "%", "cells", "with", "ER", "-", "phagy", "cargo", "accumulation", "in", "aberrant", "intracellular", "structures", "is", "shown", "in", "S5A", "Fig", ")", ".", "F", ".", "Fluorescence", "level", "of", "intracellular", "structures", "(", "ratio", "over", "PM", ")", "in", "atg11", "∆", "mutant", "cells", ".", "The", "bar", "graph", "shows", "Snq2", "-", "yEGFP", "(", "green", ")", "and", "Ds", "-", "Red", "-", "Snc1", "-", "PEM", "(", "red", ")", "fluorescence", "(", "20", "cells", "were", "analyzed", "for", "each", "strain", ")", ".", "When", "co", "-", "overexpressed", "in", "atg11", "∆", "mutant", "cells", ",", "the", "fluorescence", "level", "of", "either", "protein", "accumulating", "in", "aberrant", "structures", "is", "~", "5", "fold", "higher", "than", "when", "overexpressed", "individually", ".", "+", "/", "-", "and", "error", "bars", "represent", "STDEV", ".", "Results", "in", "this", "figure", "represent", "at", "least", "two", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig 5A-C. Overexpressed Snq2-GFP accumulates in the ER and induces UPR in ypt1-1 mutant cells. Snq2-yEGFP was overexpressed in WT and ypt1-1 mutant cells and the following effects were analyzed as described for Fig 1A-1C, respectively: increase in the level of Snq2-yEGFP protein (A)A-C. Overexpressed Snq2-GFP accumulates in the ER and induces UPR in ypt1-1 mutant cells. Snq2-yEGFP was overexpressed in WT and ypt1-1 mutant cells and the following effects were analyzed as described for Fig 1A-1C, respectively: increase in the level of Snq2-yEGFP protein (A), accumulation of Snq2-yEGFP in aberrant ER structures (B),A-C. Overexpressed Snq2-GFP accumulates in the ER and induces UPR in ypt1-1 mutant cells. Snq2-yEGFP was overexpressed in WT and ypt1-1 mutant cells and the following effects were analyzed as described for Fig 1A-1C, respectively: increase in the level of Snq2-yEGFP protein (A), accumulation of Snq2-yEGFP in aberrant ER structures (B), and induction of the UPR response (C, GFP-Snc1-PEM is shown for comparison).D-F. Synergistic effect of co-overexpression of Snq2-GFP with DsRed-Snc1-PEM in atg11∆ mutant cells. WT (left) and atg11∆ mutant cells (right) were transformed with plasmids for overexpression of Snq2, Snc1-PEM or both Snq2 and Snc1-PEM. D. Immunoblot analysis and quantification. Shown from top to bottom: Snq2-yEGFP (using anti-GFP antibodies), Ds-Red-Snc1-PEM (using anti-Snc1 antibodies), G6PDH (loading control), and a bar graph showing fold increase of Snq2-yEGFP (green) and Ds-Red-Snc1-PEM (red) in atg11∆ mutant cells over WT.E. Accumulation of macro-ER-phagy cargos in aberrant intracellular structures using live-cells microscopy. Shown from left to right: DIC, GFP, DsRed and Merge. Shown from top to bottom: Snq2, Snc1-PEM, Snq2+Snc1-PEM, and % cells with co-localization (relevant only for co-overexpression) (% cells with ER-phagy cargo accumulation in aberrant intracellular structures is shown in S5A Fig). F. Fluorescence level of intracellular structures (ratio over PM) in atg11∆ mutant cells. The bar graph shows Snq2-yEGFP (green) and Ds-Red-Snc1-PEM (red) fluorescence (20 cells were analyzed for each strain). When co-overexpressed in atg11∆ mutant cells, the fluorescence level of either protein accumulating in aberrant structures is ~5 fold higher than when overexpressed individually. +/- and error bars represent STDEV. Results in this figure represent at least two independent experiments."}
{"words": ["Fig", "6A", ".", "A", "diagram", "showing", "two", "groups", "of", "ER", "-", "resident", "proteins", ":", "those", "that", "become", "macro", "-", "ER", "-", "phagy", "cargos", "(", "in", "green", ")", ",", "and", "those", "that", "do", "not", "(", "in", "blue", "or", "grey", ")", ".", "Like", "overexpressed", "Snc1", "-", "PEM", "or", "Snq2", ",", "the", "ER", "-", "resident", "membrane", "proteins", "Sec61", "(", "translocon", "subunit", ")", "and", "Hmg1", "(", "sterol", "biogenesis", ")", "are", "transported", "to", "the", "vacuole", "via", "macro", "-", "ER", "-", "phagy", ".", "In", "contrast", ",", "the", "ER", "-", "to", "-", "Golgi", "exit", "regulators", "Sec12", "and", "Sec13", "and", "the", "ER", "lumen", "chaperone", "Kar2", "are", "not", "co", "-", "transported", "to", "the", "lysosome", "through", "macro", "-", "ER", "-", "phagy", ".", "Four", "or", "six", "different", "strains", "were", "used", "for", "this", "analysis", ":", "WT", "(", "YPT1", ")", ",", "pep4", "∆", ",", "and", "pep4", "prb1", "∆", ",", "ypt1", "-", "1", ",", "ypt1", "-", "1pep4", "∆", ",", "and", "ypt1", "-", "1pep4", "∆", "prb1", "∆", ".", "In", "each", "strain", ",", "one", "ER", "-", "resident", "protein", "was", "tagged", "at", "its", "C", "-", "terminus", "(", "except", "for", "Kar2", ")", ".", "(", "The", "pep4", "∆", "strains", "were", "not", "used", "in", "all", "experiments", "because", "they", "do", "not", "show", "the", "full", "defect", ")", ".", "The", "level", "of", "ER", "-", "resident", "proteins", "was", "determined", "by", "immunoblot", "analysis", "in", "cells", "that", "either", "do", "not", "(", "B", "-", "D", ")", "or", "do", "overexpress", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "(", "F", "-", "H", ")", ".", "B", "-", "C", ".", "Sec61", "-", "3xHA", "(", "B", ")", "and", "Sec13", "-", "3x", "HA", "(", "C", ")", "expressing", "cells", "(", "2", "independent", "un", "-", "transformed", "colonies", ")", "were", "tested", "by", "immunoblot", "analysis", "(", "using", "anti", "-", "HA", "antibodies", ")", ".", "Shown", "from", "top", "to", "bottom", ":", "strain", "genotype", ",", "HA", "-", "tagged", "protein", ",", "G6PDH", "(", "loading", "control", ")", ",", "quantification", "of", "HA", "-", "tagged", "protein", "expressed", "as", "average", "fold", "of", "WT", "(", "p", "-", "value", "=", "0", ".", "025", "for", "Sec61", ")", ".", "D", ".", "Summary", "of", "immunoblot", "analyses", "of", "ER", "-", "resident", "proteins", "level", "in", "cells", "that", "do", "not", "overexpress", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", ":", "WT", "(", "PEP4PRB1", ")", "vs", "pep4", "∆", "prb1", "∆", "(", "left", ")", ",", "ypt1", "-", "1PEP4PRB1", "vs", "ypt1", "-", "1pep4", "∆", "prb1", "∆", "(", "right", ")", ".", "Immunoblots", "and", "quantification", "are", "shown", "in", "Fig", "6B", "-", "6C", "and", "S6A", "-", "S6C", "Fig", ".", "In", "YPT1", "cells", ",", "the", "levels", "of", "Sec61", "and", "Hmg1", "(", "green", ")", "are", "slightly", "increased", "(", "14", "and", "38", "%", ",", "respectively", ")", "in", "strains", "defective", "in", "vacuolar", "proteolysis", ";", "the", "levels", "of", "Sec12", ",", "Sec13", "and", "Kar2", "are", "not", "increased", "(", "blue", "and", "grey", ")", ".", "The", "levels", "of", "Sec61", "and", "Hmg1", "(", "green", ")", "are", "increased", "by", "2", "-", "2", ".", "5", "fold", "in", "ypt1", "-", "1", "mutant", "cells", "when", "compared", "to", "WT", "cells", ",", "regardless", "if", "they", "are", "defective", "in", "vacuolar", "proteolysis", "or", "not", ".", "In", "contrast", ",", "the", "levels", "of", "Sec12", ",", "Sec13", "and", "Kar2", "are", "only", "slightly", "increased", "(", "blue", "and", "grey", ")", ".", "E", ".", "The", "level", "of", "the", "ER", "-", "resident", "protein", "Sec61", "is", "similar", "whether", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "is", "overexpressed", "or", "not", ".", "Wild", "-", "type", "cells", "were", "transformed", "with", "a", "2μ", "plasmid", ",", "either", "empty", "or", "for", "overexpression", "of", "GFP", "-", "Snc1", "-", "GEM", "(", "2", "independent", "transformants", ")", ".", "Shown", "from", "top", "to", "bottom", ":", "plasmid", ",", "Sec61", ",", "G6PDH", "(", "loading", "control", ")", ",", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", ",", "and", "quantification", "of", "Sec61", "expressed", "as", "average", "fold", "of", "WT", "with", "empty", "plasmid", ".", "F", "-", "G", ".", "Sec61", "-", "3xHA", "(", "F", ")", "and", "Sec13", "-", "3xHA", "(", "G", ")", "expressing", "cells", "were", "transformed", "with", "a", "2μ", "plasmid", "for", "overexpression", "of", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", ".", "Cell", "lysates", "were", "tested", "by", "immunoblot", "analysis", "(", "using", "ant", "-", "HA", "and", "anti", "-", "GFP", "antibodies", ")", ".", "Shown", "from", "top", "to", "bottom", ":", "strain", "genotype", ",", "the", "specific", "ER", "-", "resident", "protein", "tested", ",", "quantification", "of", "the", "ER", "-", "resident", "protein", "bands", "expressed", "as", "average", "fold", "of", "WT", ",", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", ",", "quantification", "of", "the", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "bands", "expressed", "as", "average", "fold", "of", "WT", ",", "and", "G6PDH", "(", "loading", "control", ")", ".", "H", ".", "Summary", "of", "immunoblot", "analysis", "of", "ER", "-", "resident", "proteins", "level", "in", "cells", "overexpressing", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", ":", "WT", "(", "PEP4PRB1", ")", "vs", "pep4", "∆", "prb1", "∆", "(", "left", ")", ",", "ypt1", "-", "1PEP4PRB1", "vs", "ypt1", "-", "1pep4", "∆", "prb1", "∆", "(", "right", ")", ".", "Immunoblots", "and", "quantification", "are", "shown", "in", "Fig", "6F", "and", "6G", "and", "S6F", "-", "S6H", "Fig", ".", "In", "YPT1", "cells", ",", "like", "Snc1", "-", "PEM", "(", "black", ")", ",", "the", "levels", "of", "Hmg1", "and", "Sec61", "(", "green", ")", "are", "increased", ">", "10", "fold", "in", "strains", "defective", "in", "vacuolar", "proteolysis", ".", "In", "contrast", ",", "the", "levels", "of", "Sec12", ",", "Sec13", "and", "Kar2", "are", "not", "changed", "(", "blue", "and", "grey", ")", ".", "Like", "Snc1", "-", "PEM", "(", "black", ")", ",", "the", "protein", "levels", "of", "Hmg1", "and", "Sec61", "(", "green", ")", "are", "increased", "~", "15", "fold", "in", "ypt1", "-", "1", "mutant", "cells", "when", "compared", "to", "WT", "cells", ",", "regardless", "if", "they", "are", "defective", "in", "vacuolar", "proteolysis", "or", "not", ".", "In", "contrast", ",", "the", "levels", "of", "Sec12", ",", "Sec13", "and", "Kar2", "are", "only", "slightly", "increased", "(", "blue", "and", "grey", ")", ".", "+", "/", "-", "and", "error", "bars", "represent", "STDEV", ".", "Results", "in", "this", "figure", "represent", "at", "least", "two", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig 6A. A diagram showing two groups of ER-resident proteins: those that become macro-ER-phagy cargos (in green), and those that do not (in blue or grey). Like overexpressed Snc1-PEM or Snq2, the ER-resident membrane proteins Sec61 (translocon subunit) and Hmg1 (sterol biogenesis) are transported to the vacuole via macro-ER-phagy. In contrast, the ER-to-Golgi exit regulators Sec12 and Sec13 and the ER lumen chaperone Kar2 are not co-transported to the lysosome through macro-ER-phagy. Four or six different strains were used for this analysis: WT (YPT1), pep4∆, and pep4 prb1∆, ypt1-1, ypt1-1pep4∆, and ypt1-1pep4∆ prb1∆. In each strain, one ER-resident protein was tagged at its C-terminus (except for Kar2). (The pep4∆ strains were not used in all experiments because they do not show the full defect). The level of ER-resident proteins was determined by immunoblot analysis in cells that either do not (B-D) or do overexpress GFP-Snc1-PEM (F-H). B-C. Sec61-3xHA (B) and Sec13-3x HA (C) expressing cells (2 independent un-transformed colonies) were tested by immunoblot analysis (using anti-HA antibodies). Shown from top to bottom: strain genotype, HA-tagged protein, G6PDH (loading control), quantification of HA-tagged protein expressed as average fold of WT (p-value = 0.025 for Sec61).D. Summary of immunoblot analyses of ER-resident proteins level in cells that do not overexpress GFP-Snc1-PEM: WT (PEP4PRB1) vs pep4∆ prb1∆ (left), ypt1-1PEP4PRB1 vs ypt1-1pep4∆ prb1∆ (right). Immunoblots and quantification are shown in Fig 6B-6C and S6A-S6C Fig. In YPT1 cells, the levels of Sec61 and Hmg1 (green) are slightly increased (14 and 38%, respectively) in strains defective in vacuolar proteolysis; the levels of Sec12, Sec13 and Kar2 are not increased (blue and grey). The levels of Sec61 and Hmg1 (green) are increased by 2-2.5 fold in ypt1-1 mutant cells when compared to WT cells, regardless if they are defective in vacuolar proteolysis or not. In contrast, the levels of Sec12, Sec13 and Kar2 are only slightly increased (blue and grey).E. The level of the ER-resident protein Sec61 is similar whether GFP-Snc1-PEM is overexpressed or not. Wild-type cells were transformed with a 2μ plasmid, either empty or for overexpression of GFP-Snc1-GEM (2 independent transformants). Shown from top to bottom: plasmid, Sec61, G6PDH (loading control), GFP-Snc1-PEM, and quantification of Sec61 expressed as average fold of WT with empty plasmid.F-G. Sec61-3xHA (F) and Sec13-3xHA (G) expressing cells were transformed with a 2μ plasmid for overexpression of GFP-Snc1-PEM. Cell lysates were tested by immunoblot analysis (using ant-HA and anti-GFP antibodies). Shown from top to bottom: strain genotype, the specific ER-resident protein tested, quantification of the ER-resident protein bands expressed as average fold of WT, GFP-Snc1-PEM, quantification of the GFP-Snc1-PEM bands expressed as average fold of WT, and G6PDH (loading control).H. Summary of immunoblot analysis of ER-resident proteins level in cells overexpressing GFP-Snc1-PEM: WT (PEP4PRB1) vs pep4∆ prb1∆ (left), ypt1-1PEP4PRB1 vs ypt1-1pep4∆ prb1∆ (right). Immunoblots and quantification are shown in Fig 6F and 6G and S6F-S6H Fig. In YPT1 cells, like Snc1-PEM (black), the levels of Hmg1 and Sec61 (green) are increased >10 fold in strains defective in vacuolar proteolysis. In contrast, the levels of Sec12, Sec13 and Kar2 are not changed (blue and grey). Like Snc1-PEM (black), the protein levels of Hmg1 and Sec61 (green) are increased ~15 fold in ypt1-1 mutant cells when compared to WT cells, regardless if they are defective in vacuolar proteolysis or not. In contrast, the levels of Sec12, Sec13 and Kar2 are only slightly increased (blue and grey). +/- and error bars represent STDEV. Results in this figure represent at least two independent experiments."}
{"words": ["Fig", "7A", ".", "In", "cells", "defective", "in", "vacuolar", "proteolysis", "(", "pep4", "∆", "prb1", "∆", ")", ",", "Hmg1", "co", "-", "localizes", "with", "70", "%", "of", "intra", "-", "cellular", "Snc1", "-", "PEM", ",", "but", "Sec13", "does", "not", "(", "at", "least", "36", "cells", "were", "analyzed", "for", "each", "strain", ")", ".", "No", "co", "-", "localization", "was", "observed", "for", "resident", "ER", "proteins", "and", "overexpressed", "Snc1", "-", "PEM", "in", "WT", "cells", "(", "PEP4PRB1", ")", ".", "Hmg1", "(", "left", ")", "and", "Sec13", "(", "right", ")", "were", "tagged", "with", "mCherry", "at", "their", "C", "-", "terminus", "in", "PEP4PRB1", "(", "WT", ")", "and", "pepb4", "∆", "prb1", "∆", "mutant", "cells", ".", "Cells", "were", "transformed", "with", "a", "2μ", "plasmid", "for", "overexpression", "of", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "and", "analyzed", "by", "live", "-", "cell", "microscopy", ".", "Shown", "from", "top", "to", "bottom", ":", "DIC", ",", "GFP", ",", "mCherry", ",", "merge", "(", "yellow", ")", ",", "%", "cells", "with", "intra", "-", "cellular", "Snc1", "-", "PEM", ",", "and", "%", "co", "-", "localization", "of", "the", "ER", "protein", "with", "intra", "-", "cellular", "Snc1", "-", "PEM", ".", "B", ".", "The", "ER", "-", "resident", "protein", "Hmg1", "is", "delivered", "to", "the", "vacuole", "with", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", ".", "The", "vacuole", "of", "PEP4PRB1", "(", "WT", ")", "and", "pepb4", "∆", "prb1", "∆", "mutant", "cells", "expressing", "Hmg1", "-", "mCherry", "and", "overexpressing", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "(", "see", "Panel", "A", ",", "left", ")", "was", "stained", "with", "CMAC", "-", "Arg", "(", "blue", ")", ",", "and", "the", "cells", "were", "analyzed", "by", "live", "-", "cell", "microscopy", ".", "In", "WT", "cells", "(", "top", ")", ",", "there", "is", "no", "intracellular", "Snc1", "-", "PEM", "and", "the", "red", "-", "labeled", "ER", "is", "distinguished", "from", "the", "blue", "vacuole", ".", "In", "contrast", ",", "in", "~", "75", "%", "pep4", "∆", "prb1", "∆", "mutant", "cells", "(", "bottom", ")", ",", "which", "are", "defective", "in", "vacuolar", "proteolysis", ",", "Hmg1", "(", "red", ")", "co", "-", "localizes", "with", "Snc1", "-", "PEM", "(", "green", ")", "in", "the", "vacuole", "(", "blue", ")", ".", "Shown", "from", "left", "to", "right", ":", "DIC", ",", "GFP", ",", "mCherry", ",", "blue", ",", "merge", "(", "white", "shows", "merge", "of", "the", "three", "colors", ")", ",", "%", "cells", "with", "intracellular", "Snc1", "-", "PEM", ",", "%", "cells", "in", "which", "Hmg1", "with", "Snc1", "-", "PEM", "co", "-", "localize", ",", "and", "%", "co", "-", "localization", "of", "the", "two", "proteins", "with", "the", "vacuolar", "dye", "(", "38", "cells", "were", "analyzed", "for", "each", "strain", ")", ".", "C", ".", ">", "80", "%", "of", "ypt1", "-", "1", "mutant", "cells", ",", "regardless", "if", "they", "are", "PEP4PRB1", "or", "pep4", "∆", "prb1", "∆", ",", "accumulate", "aberrant", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "structures", ".", "Hmg1", "co", "-", "localizes", "with", ">", "70", "%", "of", "these", "structures", ",", "whereas", "Sec13", "co", "-", "localizes", "with", "only", "~", "15", "%", "of", "these", "structures", "(", "36", "-", "43", "cells", "were", "analyzed", "for", "each", "strain", ")", ".", "The", "experiment", "was", "done", "as", "described", "for", "Panel", "A", ".", "D", ".", "Summary", "of", "microscopy", "analysis", "of", "ER", "-", "resident", "proteins", "co", "-", "localization", "with", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", "in", "cells", "overexpressing", "GFP", "-", "Snc1", "-", "PEM", ":", "WT", "(", "PEP4PRB1", ")", "vs", "pep4Δ", "prb1Δ", "(", "left", ")", ",", "and", "ypt1", "-", "1PEP4PRB1", "vs", "ypt1", "-", "1pep4Δ", "prb1Δ", "(", "right", ")", ".", "Microscopy", "and", "quantification", "are", "shown", "in", "Fig", "7A", "and", "7C", "and", "S7", "Fig", ".", "In", "YPT1", "cells", ",", "whereas", ">", "60", "%", "of", "Hmg1", "and", "Sec61", "(", "green", ")", "co", "-", "localize", "with", "Snc1", "-", "PEM", "in", "strains", "defective", "in", "vacuolar", "proteolysis", ",", "Sec12", ",", "Sec13", "and", "Kar2", "are", "not", "changed", "significantly", "(", "blue", "and", "grey", ")", ".", "Hmg1", "and", "Sec61", "(", "green", ")", "co", "-", "localize", "with", "Snc1", "-", "PEM", "in", ">", "70", "%", "of", "ypt1", "-", "1", "and", ">", "80", "%", "of", "ypt1", "-", "1pep4Δ", "prb1Δ", "mutant", "cells", ",", "whereas", "Sec13", "and", "Kar2", "(", "blue", "and", "grey", ")", "do", "so", "in", "<", "15", "%", "of", "the", "cells", ".", "The", "level", "of", "Sec12", "co", "-", "localization", "with", "Snc1", "-", "PEM", "is", "intermediate", ",", "~", "38", "%", "in", "ypt1", "-", "1", "and", "ypt1", "-", "1pep4Δ", "prb1Δ", ".", "Error", "bars", "represent", "STDEV", ".", "Results", "in", "panels", "A", "and", "B", "represent", "at", "least", "two", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig 7A. In cells defective in vacuolar proteolysis (pep4∆ prb1∆), Hmg1 co-localizes with 70% of intra-cellular Snc1-PEM, but Sec13 does not (at least 36 cells were analyzed for each strain). No co-localization was observed for resident ER proteins and overexpressed Snc1-PEM in WT cells (PEP4PRB1). Hmg1 (left) and Sec13 (right) were tagged with mCherry at their C-terminus in PEP4PRB1 (WT) and pepb4∆ prb1∆ mutant cells. Cells were transformed with a 2μ plasmid for overexpression of GFP-Snc1-PEM and analyzed by live-cell microscopy. Shown from top to bottom: DIC, GFP, mCherry, merge (yellow), % cells with intra-cellular Snc1-PEM, and % co-localization of the ER protein with intra-cellular Snc1-PEM.B. The ER-resident protein Hmg1 is delivered to the vacuole with GFP-Snc1-PEM. The vacuole of PEP4PRB1 (WT) and pepb4∆ prb1∆ mutant cells expressing Hmg1-mCherry and overexpressing GFP-Snc1-PEM (see Panel A, left) was stained with CMAC-Arg (blue), and the cells were analyzed by live-cell microscopy. In WT cells (top), there is no intracellular Snc1-PEM and the red-labeled ER is distinguished from the blue vacuole. In contrast, in ~75% pep4∆ prb1∆ mutant cells (bottom), which are defective in vacuolar proteolysis, Hmg1 (red) co-localizes with Snc1-PEM (green) in the vacuole (blue). Shown from left to right: DIC, GFP, mCherry, blue, merge (white shows merge of the three colors), % cells with intracellular Snc1-PEM, % cells in which Hmg1 with Snc1-PEM co-localize, and % co-localization of the two proteins with the vacuolar dye (38 cells were analyzed for each strain).C. >80% of ypt1-1 mutant cells, regardless if they are PEP4PRB1 or pep4∆ prb1∆, accumulate aberrant GFP-Snc1-PEM structures. Hmg1 co-localizes with >70% of these structures, whereas Sec13 co-localizes with only ~15% of these structures (36-43 cells were analyzed for each strain). The experiment was done as described for Panel A.D. Summary of microscopy analysis of ER-resident proteins co-localization with GFP-Snc1-PEM in cells overexpressing GFP-Snc1-PEM: WT (PEP4PRB1) vs pep4Δ prb1Δ (left), and ypt1-1PEP4PRB1 vs ypt1-1pep4Δ prb1Δ (right). Microscopy and quantification are shown in Fig 7A and 7C and S7 Fig. In YPT1 cells, whereas >60% of Hmg1 and Sec61 (green) co-localize with Snc1-PEM in strains defective in vacuolar proteolysis, Sec12, Sec13 and Kar2 are not changed significantly (blue and grey). Hmg1 and Sec61 (green) co-localize with Snc1-PEM in >70% of ypt1-1 and >80% of ypt1-1pep4Δ prb1Δ mutant cells, whereas Sec13 and Kar2 (blue and grey) do so in <15% of the cells. The level of Sec12 co-localization with Snc1-PEM is intermediate, ~38% in ypt1-1 and ypt1-1pep4Δ prb1Δ. Error bars represent STDEV. Results in panels A and B represent at least two independent experiments."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Top", ":", "DDX42", "KO", "and", "CTRL", "KO", "U87", "-", "MG", "/", "CD4", "/", "CXCR4", "/", "Cas9", "/", "Firefly", "cells", "were", "generated", "using", "3", "sgRNAs", "and", "4", "non", "-", "targeting", "sgRNAs", ",", "respectively", "(", "for", "CTRL", ",", "the", "average", "of", "data", "obtained", "with", "4", "cell", "populations", "is", "shown", ")", ".", "Cells", "were", "treated", "or", "not", "with", "IFN", "24", "h", "prior", "to", "infection", "with", "HIV", "-", "1", "Renilla", "(", "NL4", "-", "3", "/", "Nef", "-", "IRES", "-", "Renilla", ")", ".", "Relative", "luminescence", "results", "for", "IFN", "-", "treated", "and", "-", "untreated", "conditions", "are", "shown", ".", "Two", "-", "way", "ANOVA", "on", "log", "-", "transformed", "data", "with", "Sidak", "'", "s", "test", ".", "Bottom", ":", "Immunoblot", "analysis", "of", "DDX42", "levels", "is", "shown", "for", "1", "CTRL", "and", "DDX42", "-", "depleted", "populations", ";", "Actin", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "C", ".", "DDX42", "silencing", "efficiency", "measured", "by", "RT", "-", "qPCR", "(", "top", ")", "and", "immunoblot", "(", "bottom", ")", "in", "parallel", "samples", "from", "B", ".", "G", ".", "Primary", "CD4", "+", "T", "cells", "were", "electroporated", "with", "Cas9", "-", "sgRNA", "RNPs", "using", "2", "non", "-", "targeting", "sgRNAs", "(", "sgCTRL1", "and", "2", ")", "and", "5", "sgRNAs", "targeting", "DDX42", ".", "Top", ":", "Cells", "were", "then", "infected", "with", "HIV", "-", "1", "Renilla", "(", "NL4", "-", "3", "/", "Nef", "-", "IRES", "-", "Renilla", ")", "and", "relative", "infection", "efficiencies", "obtained", "with", "cells", "from", "3", "donors", "are", "shown", ".", "Two", "-", "way", "ANOVA", "on", "log", "-", "transformed", "data", "with", "Dunnett", "'", "s", "test", ".", "Bottom", ":", "DDX42", "protein", "levels", "were", "determined", "by", "immunoblot", ",", "Actin", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "A", "representative", "immunoblot", "is", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Top: DDX42 KO and CTRL KO U87-MG/CD4/CXCR4/Cas9/Firefly cells were generated using 3 sgRNAs and 4 non-targeting sgRNAs, respectively (for CTRL, the average of data obtained with 4 cell populations is shown). Cells were treated or not with IFN 24 h prior to infection with HIV-1 Renilla (NL4-3/Nef-IRES-Renilla). Relative luminescence results for IFN-treated and -untreated conditions are shown. Two-way ANOVA on log-transformed data with Sidak's test. Bottom: Immunoblot analysis of DDX42 levels is shown for 1 CTRL and DDX42-depleted populations; Actin served as a loading control.C. DDX42 silencing efficiency measured by RT-qPCR (top) and immunoblot (bottom) in parallel samples from B.G. Primary CD4+ T cells were electroporated with Cas9-sgRNA RNPs using 2 non-targeting sgRNAs (sgCTRL1 and 2) and 5 sgRNAs targeting DDX42. Top: Cells were then infected with HIV-1 Renilla (NL4-3/Nef-IRES-Renilla) and relative infection efficiencies obtained with cells from 3 donors are shown. Two-way ANOVA on log-transformed data with Dunnett's test. Bottom: DDX42 protein levels were determined by immunoblot, Actin served as a loading control. A representative immunoblot is shown."}
{"words": ["Figure", "3C", ".", "Heat", "-", "annealed", "ODN", "/", "RNA", "1", "-", "294", "complex", "was", "incubated", "with", "HIV", "-", "1", "RT", "and", "increasing", "concentrations", "of", "recombinant", "DDX42", ".", "Reverse", "transcription", "was", "initiated", "by", "addition", "of", "the", "four", "dNTPs", ".", "Extension", "was", "for", "1", ",", "5", ",", "20", "or", "60", "min", "and", "samples", "were", "analysed", "by", "PAGE", "8", "%", "(", "P", "/", "T", ":", "primer", "/", "template", ";", "SSDNA", ":", "Strong", "-", "Stop", "DNA", ")", ".", "A", "representative", "autoradiograph", "is", "shown", ".", "D", ".", "Quantification", "of", "3", "biological", "replicates", "performed", "as", "in", "C", ".", "Two", "-", "way", "ANOVA", "on", "log", "-", "transformed", "data", "with", "Dunnett", "'", "s", "test", ".", "E", ".", "PLAs", "were", "performed", "in", "MDMs", "infected", "with", "HIV", "-", "1", "or", "not", "(", "N", ".", "I", ".", "CTRL", ")", ",", "using", "anti", "-", "Capsid", "and", "anti", "-", "DDX42", "antibodies", "(", "nuclei", "stained", "with", "Hoechst", ")", ".", "Images", "were", "acquired", "using", "a", "LSM880", "Airyscan", "microscope", ".", "Left", ":", "representative", "images", ",", "scale", "-", "bar", ":", "10", "μm", ".", "Right", ":", "Average", "punctae", "quantified", "per", "cell", "in", "3", "biological", "replicates", "done", "on", "MDMs", "from", "different", "donors", "with", "mean", "±", "SD", "(", "n", ">", "65", "cells", "per", "condition", ")", ".", "K", ".", "HEK293T", "were", "co", "-", "transfected", "with", "pRPS", "-", "GFP", "and", "a", "Flag", "-", "Firefly", "-", "(", "negative", "control", ")", "or", "Flag", "-", "DDX42", "-", "coding", "plasmid", ",", "followed", "by", "Flag", "immunoprecipitation", "and", "immunoblot", "analysis", ".", "A", "representative", "immunoblot", "is", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3C. Heat-annealed ODN/RNA 1-294 complex was incubated with HIV-1 RT and increasing concentrations of recombinant DDX42. Reverse transcription was initiated by addition of the four dNTPs. Extension was for 1, 5, 20 or 60 min and samples were analysed by PAGE 8% (P/T: primer/template; SSDNA: Strong-Stop DNA). A representative autoradiograph is shown.D. Quantification of 3 biological replicates performed as in C. Two-way ANOVA on log-transformed data with Dunnett's test.E. PLAs were performed in MDMs infected with HIV-1 or not (N.I. CTRL), using anti-Capsid and anti-DDX42 antibodies (nuclei stained with Hoechst). Images were acquired using a LSM880 Airyscan microscope. Left: representative images, scale-bar: 10 μm. Right: Average punctae quantified per cell in 3 biological replicates done on MDMs from different donors with mean ± SD (n>65 cells per condition).K. HEK293T were co-transfected with pRPS-GFP and a Flag-Firefly- (negative control) or Flag-DDX42-coding plasmid, followed by Flag immunoprecipitation and immunoblot analysis. A representative immunoblot is shown."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Left", ",", "A549", "-", "ACE2", "cells", "were", "infected", "or", "not", "with", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "for", "24", "h", "prior", "to", "PLA", "using", "mouse", "anti", "-", "dsRNA", "(", "J2", ")", "and", "rabbit", "anti", "-", "DDX42", "antibodies", ",", "followed", "by", "additional", "immunofluorescence", "(", "IF", ")", "staining", "with", "anti", "-", "mouse", "Alexa", "Fluor", "546", "antibody", "(", "PLA", "in", "green", ",", "IF", "in", "magenta", ")", ".", "Representative", "Z", "-", "stack", "projection", "images", "are", "shown", ";", "scale", "bar", ":", "15", "μm", ".", "Right", ",", "Average", "punctae", "were", "quantified", "in", "3", "biological", "replicates", "with", "mean", "±", "SD", "(", "n", ">", "75", "cells", "per", "condition", ")", ".", "Left", ",", "A549", "-", "ACE2", "cells", "were", "infected", "or", "not", "with", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "for", "24", "h", "prior", "to", "PLA", "rabbit", "anti", "-", "DDX42", "antibodies", ",", "followed", "by", "additional", "immunofluorescence", "(", "IF", ")", "staining", "with", "anti", "-", "mouse", "Alexa", "Fluor", "546", "antibody", "(", "PLA", "in", "green", ",", "IF", "in", "magenta", ")", ".", "Representative", "Z", "-", "stack", "projection", "images", "are", "shown", ";", "scale", "bar", ":", "15", "μm", ".", "Right", ",", "Average", "punctae", "were", "quantified", "in", "3", "biological", "replicates", "with", "mean", "±", "SD", "(", "n", ">", "75", "cells", "per", "condition", ")", ".", "using", "an", "anti", "-", "N", "antibodyF", ".", "The", "following", "biotinylated", "RNAs", "were", "used", "to", "pull", "-", "down", "recombinant", "DDX42", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", ",", "CHIKV", "G4", ",", "TRF2", "G4", "and", "a", "mutated", "TRF2", "G4", "sequence", "(", "Mut", ".", "TRF2", "G4", ")", ",", "and", "DDX42", "was", "revealed", "by", "an", "immunoblot", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Left, A549-ACE2 cells were infected or not with SARS-CoV-2 for 24 h prior to PLA using mouse anti-dsRNA (J2) and rabbit anti-DDX42 antibodies, followed by additional immunofluorescence (IF) staining with anti-mouse Alexa Fluor 546 antibody (PLA in green, IF in magenta). Representative Z-stack projection images are shown; scale bar: 15 μm. Right, Average punctae were quantified in 3 biological replicates with mean ± SD (n>75 cells per condition).Left, A549-ACE2 cells were infected or not with SARS-CoV-2 for 24 h prior to PLA rabbit anti-DDX42 antibodies, followed by additional immunofluorescence (IF) staining with anti-mouse Alexa Fluor 546 antibody (PLA in green, IF in magenta). Representative Z-stack projection images are shown; scale bar: 15 μm. Right, Average punctae were quantified in 3 biological replicates with mean ± SD (n>75 cells per condition). using an anti-N antibodyF. The following biotinylated RNAs were used to pull-down recombinant DDX42 poly(I:C), CHIKV G4, TRF2 G4 and a mutated TRF2 G4 sequence (Mut. TRF2 G4), and DDX42 was revealed by an immunoblot."}
{"words": ["Figure", "1U2OS", "cells", "were", "transfected", "with", "siRNA", ",", "and", "subjected", "to", "immunofluorescence", "staining", "with", "DAPI", ",", "anti", "-", "human", "centromere", "autoantibody", "(", "ACA", ")", ",", "and", "antibodies", "for", "Bub1", "and", "TOP2A", ".", "Example", "images", "are", "shown", "(", "A", ")", ".", "The", "immunofluorescence", "intensity", "ratios", "of", "centromeric", "TOP2A", "/", "ACA", "(", "B", ")", ",", "centromeric", "TOP2A", "/", "arm", "TOP2A", "(", "C", ")", ",", "and", "arm", "TOP2A", "/", "DNA", "(", "D", ")", ",", "were", "determined", "on", "around", "600", "(", "B", "and", "C", ")", "or", "400", "(", "D", ")", "chromosomes", "in", "20", "cells", ".", "ns", ",", "no", "statistical", "significance", ".", "Data", "information", ":", "Means", "and", "error", "bars", "representing", "S", ".", "D", ".", "are", "shown", "unpaired", "t", "test", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "U2OS", "cells", "were", "transfected", "with", "siRNA", ",", "and", "subjected", "to", "immunofluorescence", "staining", "with", "DAPI", ",", "and", "antibodies", "for", "Bub1", "and", "TOP2A", ".", "Lysates", "of", "nocodazole", "-", "arrested", "mitotic", "cells", "were", "immunoblotted", "with", "the", "indicated", "antibodies", "(", "E", ")", ".", "ns", ",", "no", "statistical", "significance", ".", "U2OS", "cells", "were", "transfected", "with", "siRNA", ",", "and", "subjected", "to", "immunofluorescence", "staining", ".", "Example", "images", "are", "shown", "(", "F", ")", ".", "U2OS", "cells", "were", "transfected", "with", "siRNA", ",", "and", "subjected", "to", "immunofluorescence", "staining", ".", "The", "immunofluorescence", "intensity", "ratio", "of", "centromeric", "TOP2A", "/", "arm", "TOP2A", "was", "determined", "on", "around", "500", "chromosomes", "in", "15", "cells", "(", "G", ")", ".", "Data", "information", ":", "Means", "and", "error", "bars", "representing", "S", ".", "D", ".", "are", "shown", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "U2OS", "cells", "treated", "with", "STLC", "and", "MG132", "for", "0", ".", "5", "hr", "were", "subjected", "to", "further", "treatment", "with", "Reversine", ",", "AZ3146", "or", "dimethyl", "sulfoxide", "(", "DMSO", ",", "vehicle", "control", ")", "for", "1", "hr", "in", "the", "continued", "presence", "of", "STLC", "and", "MG132", ".", "Example", "images", "of", "the", "immunofluorescence", "staining", "are", "shown", "(", "H", ")", ".", "U2OS", "cells", "treated", "with", "STLC", "and", "MG132", "for", "0", ".", "5", "hr", "were", "subjected", "to", "further", "treatment", "with", "Reversine", ",", "AZ3146", "or", "dimethyl", "sulfoxide", "(", "DMSO", ",", "vehicle", "control", ")", "for", "1", "hr", "in", "the", "continued", "presence", "of", "STLC", "and", "MG132", ".", "The", "immunofluorescence", "intensity", "ratios", "of", "centromeric", "Bub1", "/", "ACA", "(", "I", ")", "were", "determined", "on", "around", "300", "chromosomes", "in", "15", "cells", ".", "Data", "information", ":", "Means", "and", "error", "bars", "representing", "S", ".", "D", ".", "are", "shown", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "U2OS", "cells", "treated", "with", "STLC", "and", "MG132", "for", "0", ".", "5", "hr", "were", "subjected", "to", "further", "treatment", "with", "Reversine", ",", "AZ3146", "or", "dimethyl", "sulfoxide", "(", "DMSO", ",", "vehicle", "control", ")", "for", "1", "hr", "in", "the", "continued", "presence", "of", "STLC", "and", "MG132", ".", "The", "immunofluorescence", "intensity", "ratios", "of", "centromeric", "TOP2A", "/", "ACA", "(", "J", ")", ",", "and", "centromeric", "TOP2A", "/", "arm", "TOP2A", "(", "K", ")", "were", "determined", "on", "around", "300", "chromosomes", "in", "15", "cells", ".", "Data", "information", ":", "Means", "and", "error", "bars", "representing", "S", ".", "D", ".", "are", "shown", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "L", "U2OS", "cells", "stably", "expressing", "CB", "-", "GFP", "or", "CB", "-", "Bub1", "-", "K", "-", "GFP", "were", "treated", "as", "in", "(", "H", ")", ".", "Example", "images", "of", "the", "immunofluorescence", "staining", "are", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1U2OS cells were transfected with siRNA, and subjected to immunofluorescence staining with DAPI, anti-human centromere autoantibody (ACA), and antibodies for Bub1 and TOP2A. Example images are shown (A). The immunofluorescence intensity ratios of centromeric TOP2A/ACA (B), centromeric TOP2A/arm TOP2A (C), and arm TOP2A/DNA (D), were determined on around 600 (B and C) or 400 (D) chromosomes in 20 cells. ns, no statistical significance. Data information: Means and error bars representing S.D. are shown unpaired t test). Scale bars, 10 μm.U2OS cells were transfected with siRNA, and subjected to immunofluorescence staining with DAPI, and antibodies for Bub1 and TOP2A. Lysates of nocodazole-arrested mitotic cells were immunoblotted with the indicated antibodies (E). ns, no statistical significance.U2OS cells were transfected with siRNA, and subjected to immunofluorescence staining. Example images are shown (F).U2OS cells were transfected with siRNA, and subjected to immunofluorescence staining. The immunofluorescence intensity ratio of centromeric TOP2A/arm TOP2A was determined on around 500 chromosomes in 15 cells (G). Data information: Means and error bars representing S.D. are shown Scale bars, 10 μm.U2OS cells treated with STLC and MG132 for 0.5 hr were subjected to further treatment with Reversine, AZ3146 or dimethyl sulfoxide (DMSO, vehicle control) for 1 hr in the continued presence of STLC and MG132. Example images of the immunofluorescence staining are shown (H).U2OS cells treated with STLC and MG132 for 0.5 hr were subjected to further treatment with Reversine, AZ3146 or dimethyl sulfoxide (DMSO, vehicle control) for 1 hr in the continued presence of STLC and MG132. The immunofluorescence intensity ratios of centromeric Bub1/ACA (I) were determined on around 300 chromosomes in 15 cells. Data information: Means and error bars representing S.D. are shown Scale bars, 10 μm.U2OS cells treated with STLC and MG132 for 0.5 hr were subjected to further treatment with Reversine, AZ3146 or dimethyl sulfoxide (DMSO, vehicle control) for 1 hr in the continued presence of STLC and MG132. The immunofluorescence intensity ratios of centromeric TOP2A/ACA (J), and centromeric TOP2A/arm TOP2A (K) were determined on around 300 chromosomes in 15 cells. Data information: Means and error bars representing S.D. are shown Scale bars, 10 μm.L U2OS cells stably expressing CB-GFP or CB-Bub1-K-GFP were treated as in (H). Example images of the immunofluorescence staining are shown."}
{"words": ["Figure", "2U2OS", "cells", "stably", "expressing", "CB", "-", "GFP", ",", "CB", "-", "Bub1", "-", "K", "-", "GFP", "or", "CB", "-", "Bub1", "-", "K", "-", "D946N", "-", "GFP", "were", "transfected", "with", "siRNA", ",", "and", "subjected", "to", "immunofluorescence", "staining", "with", "DAPI", "and", "the", "antibodies", "for", "H2ApT120", "and", "TOP2A", "(", "A", ")", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "U2OS", "cells", "stably", "expressing", "CB", "-", "GFP", ",", "CB", "-", "Bub1", "-", "K", "-", "GFP", "or", "CB", "-", "Bub1", "-", "K", "-", "D946N", "-", "GFP", "were", "transfected", "with", "siRNA", "Lysates", "of", "nocodazole", "-", "arrested", "mitotic", "cells", "were", "immunoblotted", "(", "B", ")", ".", "*", "represents", "non", "-", "specific", "bands", ".", "U2OS", "cells", "were", "treated", "with", "DMSO", "or", "BAY", "1816032", "at", "the", "indicated", "concentrations", "for", "1", "hr", ",", "and", "subjected", "to", "immunofluorescence", "staining", ".", "Example", "images", "are", "shown", "(", "C", ")", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "U2OS", "cells", "were", "treated", "with", "DMSO", "or", "BAY", "1816032", "at", "the", "indicated", "concentrations", "for", "1", "hr", ",", "and", "subjected", "to", "immunofluorescence", "staining", ".", "The", "immunofluorescence", "intensity", "ratios", "of", "centromeric", "H2ApT120", "/", "ACA", "(", "D", ")", ",", "centromeric", "TOP2A", "/", "ACA", "(", "E", ")", ",", "and", "centromeric", "TOP2A", "/", "arm", "TOP2A", "(", "F", ")", "were", "determined", "on", "around", "450", "chromosomes", "in", "15", "cells", ".", "Means", "and", "error", "bars", "representing", "S", ".", "D", ".", "are", "shown", "(", "D", "-", "F", ";", "unpaired", "t", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2U2OS cells stably expressing CB-GFP, CB-Bub1-K-GFP or CB-Bub1-K-D946N-GFP were transfected with siRNA, and subjected to immunofluorescence staining with DAPI and the antibodies for H2ApT120 and TOP2A (A). Data information: Scale bars, 10 μm.U2OS cells stably expressing CB-GFP, CB-Bub1-K-GFP or CB-Bub1-K-D946N-GFP were transfected with siRNA Lysates of nocodazole-arrested mitotic cells were immunoblotted (B). * represents non-specific bands.U2OS cells were treated with DMSO or BAY 1816032 at the indicated concentrations for 1 hr, and subjected to immunofluorescence staining. Example images are shown (C). Data information: Scale bars, 10 μm.U2OS cells were treated with DMSO or BAY 1816032 at the indicated concentrations for 1 hr, and subjected to immunofluorescence staining. The immunofluorescence intensity ratios of centromeric H2ApT120/ACA (D), centromeric TOP2A/ACA (E), and centromeric TOP2A/arm TOP2A (F) were determined on around 450 chromosomes in 15 cells. Means and error bars representing S.D. are shown (D-F; unpaired t test)."}
{"words": ["Figure", "3A", "U2OS", "cells", "were", "subjected", "to", "immunofluorescence", "staining", ".", "Example", "images", "of", "mitotic", "cells", "at", "various", "stages", "are", "shown", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "B", "U2OS", "cells", "stably", "expressing", "CB", "-", "GFP", ",", "CB", "-", "Bub1", "-", "K", "-", "GFP", "or", "CB", "-", "Bub1", "-", "K", "-", "D946N", "-", "GFP", "were", "subjected", "to", "immunofluorescence", "staining", ".", "Example", "images", "of", "anaphase", "cells", "are", "shown", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "C", "U2OS", "cells", "stably", "expressing", "CB", "-", "GFP", ",", "CB", "-", "Bub1", "-", "K", "-", "GFP", "or", "CB", "-", "Bub1", "-", "K", "-", "D946N", "-", "GFP", "were", "subjected", "to", "immunofluorescence", "staining", "with", "DAPI", ",", "and", "antibodies", "for", "TOP2A", "and", "H2ApT120", "or", "H3pS10", ".", "Example", "images", "of", "interphase", "cells", "are", "shown", ".", "The", "cells", "in", "the", "top", "line", ",", "which", "is", "H3pS10", "-", "positive", ",", "are", "in", "early", "prophase", "/", "late", "G2", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "D", "U2OS", "-", "LacO", "cells", "transiently", "expressing", "EGFP", "-", "LacI", ",", "EGFP", "-", "LacI", "-", "Bub1", "-", "K", "(", "WT", "or", "D946N", ")", "were", "subjected", "to", "immunofluorescence", "staining", ".", "Arrows", "point", "to", "the", "transgene", "loci", ".", "Data", "information", ":", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "E", ",", "F", "MBP", "-", "TOP2A", "(", "429", "-", "1531", ")", "-", "10xHis", "was", "subjected", "to", "pulldown", "by", "GST", ",", "GST", "-", "H2A", ",", "or", "GST", "-", "H2ApS120", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "antibodies", "for", "MBP", ",", "GST", "or", "H2ApT120", "(", "E", ")", ".", "The", "relative", "pulldown", "efficiency", "was", "determined", "(", "F", ")", ".", "Means", "and", "error", "bars", "representing", "S", ".", "D", ".", "from", "three", "independent", "experiments", "are", "shown", "(", "unpaired", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A U2OS cells were subjected to immunofluorescence staining. Example images of mitotic cells at various stages are shown. Data information: Scale bars, 10 μm.B U2OS cells stably expressing CB-GFP, CB-Bub1-K-GFP or CB-Bub1-K-D946N-GFP were subjected to immunofluorescence staining. Example images of anaphase cells are shown. Data information: Scale bars, 10 μm.C U2OS cells stably expressing CB-GFP, CB-Bub1-K-GFP or CB-Bub1-K-D946N-GFP were subjected to immunofluorescence staining with DAPI, and antibodies for TOP2A and H2ApT120 or H3pS10. Example images of interphase cells are shown. The cells in the top line, which is H3pS10-positive, are in early prophase/late G2. Data information: Scale bars, 10 μm.D U2OS-LacO cells transiently expressing EGFP-LacI, EGFP-LacI-Bub1-K (WT or D946N) were subjected to immunofluorescence staining. Arrows point to the transgene loci. Data information: Scale bars, 10 μm.E, F MBP-TOP2A (429-1531)-10xHis was subjected to pulldown by GST, GST-H2A, or GST-H2ApS120, followed by immunoblotting with antibodies for MBP, GST or H2ApT120 (E). The relative pulldown efficiency was determined (F). Means and error bars representing S.D. from three independent experiments are shown (unpaired t-test)."}
{"words": ["Figure", "4A", ",", "B", "HeLa", "cells", "and", "the", "Sgo1", "-", "K492A", "mutant", "cells", "were", "immunostained", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Example", "images", "are", "shown", "(", "A", ")", ".", "The", "immunofluorescence", "intensity", "ratio", "of", "centromeric", "INCENP", "/", "ACA", "was", "determined", "on", "around", "250", "chromosomes", "in", "10", "cells", "(", "B", ")", ".", "Data", "information", ":", "Means", "and", "error", "bars", "representing", "S", ".", "D", ".", "are", "shown", ";", "unpaired", "t", "-", "test", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "C", ",", "D", "HeLa", "and", "the", "Sgo1", "-", "K492A", "cells", "were", "exposed", "to", "nocodazole", "for", "4", "hr", ".", "Mitotic", "cells", "were", "cytospun", "onto", "coverslips", "and", "fixed", "for", "immunostaining", ".", "Example", "images", "are", "shown", "(", "C", ")", ".", "The", "immunofluorescence", "intensity", "ratio", "of", "centromeric", "TOP2A", "/", "arm", "TOP2A", "was", "determined", "on", "around", "150", "chromosomes", "in", "10", "cells", "(", "D", ")", ".", "Data", "information", ":", "Means", "and", "error", "bars", "representing", "S", ".", "D", ".", "are", "shown", "unpaired", "t", "-", "test", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "E", ",", "F", "HeLa", "and", "the", "Sgo1", "-", "K492A", "cells", "were", "transfected", "with", "siRNA", ",", "and", "immunostained", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Example", "images", "are", "shown", "(", "E", ")", ".", "The", "immunofluorescence", "intensity", "ratio", "of", "centromeric", "Aurora", "B", "/", "ACA", "was", "determined", "on", "around", "250", "chromosomes", "in", "10", "cells", "(", "F", ")", ".", "Data", "information", ":", "Means", "and", "error", "bars", "representing", "S", ".", "D", ".", "are", "shown", "unpaired", "t", "-", "test", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "G", ",", "H", "HeLa", "and", "the", "Sgo1", "-", "K492A", "cells", "were", "transfected", "with", "siRNA", ",", "and", "treated", "with", "nocodazole", "for", "5", "hr", ".", "Mitotic", "cells", "were", "cytospun", "onto", "coverslips", "and", "fixed", "for", "immunostaining", ".", "Example", "images", "are", "shown", "(", "G", ")", ".", "The", "immunofluorescence", "intensity", "ratio", "of", "centromeric", "TOP2A", "/", "arm", "TOP2A", "was", "determined", "on", "around", "280", "chromosomes", "in", "10", "cells", "(", "H", ")", ".", "Data", "information", ":", "Means", "and", "error", "bars", "representing", "S", ".", "D", ".", "are", "shown", "unpaired", "t", "-", "test", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A, B HeLa cells and the Sgo1-K492A mutant cells were immunostained with the indicated antibodies. Example images are shown (A). The immunofluorescence intensity ratio of centromeric INCENP/ACA was determined on around 250 chromosomes in 10 cells (B). Data information: Means and error bars representing S.D. are shown ; unpaired t-test). Scale bars, 10 μm.C, D HeLa and the Sgo1-K492A cells were exposed to nocodazole for 4 hr. Mitotic cells were cytospun onto coverslips and fixed for immunostaining. Example images are shown (C). The immunofluorescence intensity ratio of centromeric TOP2A/arm TOP2A was determined on around 150 chromosomes in 10 cells (D). Data information: Means and error bars representing S.D. are shown unpaired t-test). Scale bars, 10 μm.E, F HeLa and the Sgo1-K492A cells were transfected with siRNA, and immunostained with the indicated antibodies. Example images are shown (E). The immunofluorescence intensity ratio of centromeric Aurora B/ACA was determined on around 250 chromosomes in 10 cells (F). Data information: Means and error bars representing S.D. are shown unpaired t-test). Scale bars, 10 μm.G, H HeLa and the Sgo1-K492A cells were transfected with siRNA, and treated with nocodazole for 5 hr. Mitotic cells were cytospun onto coverslips and fixed for immunostaining. Example images are shown (G). The immunofluorescence intensity ratio of centromeric TOP2A/arm TOP2A was determined on around 280 chromosomes in 10 cells (H). Data information: Means and error bars representing S.D. are shown unpaired t-test). Scale bars, 10 μm."}
{"words": ["Figure", "5B", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "siRNA", "and", "the", "plasmids", "encoding", "the", "indicated", "proteins", ",", "and", "then", "exposed", "to", "nocodazole", "for", "5", "hr", ".", "Mitotic", "cells", "were", "cytospun", "onto", "coverslips", "and", "subjected", "to", "immunofluorescence", "staining", "with", "DAPI", ",", "ACA", "and", "anti", "-", "GFP", "antibodies", ".", "Example", "images", "are", "shown", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "and", "treated", "Example", "images", "are", "shown", "(", "C", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "and", "treated", "The", "immunofluorescence", "intensity", "ratios", "of", "centromeric", "EGFP", "-", "TOP2A", "/", "ACA", "(", "D", ")", ",", "centromeric", "EGFP", "-", "TOP2A", "/", "arm", "EGFP", "-", "TOP2A", "(", "E", ")", ",", "and", "arm", "EGFP", "-", "TOP2A", "/", "DNA", "(", "F", ")", ",", "were", "determined", "on", "around", "160", "chromosomes", "in", "8", "cells", ".", "Data", "information", ":", "Means", "and", "error", "bars", "representing", "S", ".", "D", ".", "are", "shown", "unpaired", "t", "-", "test", ")", ".", "HeLa", "cells", "transiently", "expressing", "EGFP", "-", "TOP2A", "(", "970", "-", "1531", ")", "or", "EGFP", "-", "TOP2A", "(", "970", "-", "1531", ")", "-", "Δ", "(", "1015", "-", "1032", ")", "were", "treated", "and", "immunostained", "Example", "images", "are", "shown", "(", "G", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "HeLa", "cells", "transiently", "expressing", "EGFP", "-", "TOP2A", "(", "970", "-", "1531", ")", "or", "EGFP", "-", "TOP2A", "(", "970", "-", "1531", ")", "-", "Δ", "(", "1015", "-", "1032", ")", "were", "treated", "and", "immunostained", "The", "immunofluorescence", "intensity", "ratio", "of", "centromeric", "EGFP", "-", "TOP2A", "/", "arm", "EGFP", "-", "TOP2A", "was", "determined", "on", "around", "250", "chromosomes", "in", "10", "cells", "(", "H", ")", ".", "Data", "information", ":", "Means", "and", "error", "bars", "representing", "S", ".", "D", ".", "are", "shown", "unpaired", "t", "-", "test", ")", ".", "U2OS", "-", "LacO", "cells", "transiently", "expressing", "Myc", "-", "LacI", "-", "Bub1", "and", "EGFP", "-", "TOP2A", "(", "970", "-", "1531", ")", "were", "subjected", "to", "immunofluorescence", "staining", "with", "DAPI", "and", "antibodies", "for", "the", "Myc", "-", "tag", "and", "GFP", ".", "Example", "images", "are", "shown", "(", "I", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "U2OS", "-", "LacO", "cells", "transiently", "expressing", "Myc", "-", "LacI", "-", "Bub1", "and", "EGFP", "-", "TOP2A", "(", "970", "-", "1531", ")", "were", "subjected", "to", "immunofluorescence", "staining", "with", "DAPI", "and", "antibodies", "for", "the", "Myc", "-", "tag", "and", "GFP", ".", "The", "relative", "enrichment", "of", "EGFP", "-", "TOP2A", "at", "the", "LacO", "repeats", "was", "quantified", "in", "130", "cells", "(", "J", ")", ".", "Data", "information", ":", "Means", "and", "error", "bars", "representing", "S", ".", "D", ".", "are", "shown", "unpaired", "t", "-", "test", ")", ".", "U2OS", "-", "LacO", "cells", "transiently", "expressing", "Myc", "-", "LacI", "-", "Bub1", "and", "EGFP", "-", "TOP2A", "(", "970", "-", "1531", ")", "were", "subjected", "to", "immunofluorescence", "staining", "with", "DAPI", "and", "antibodies", "for", "the", "Myc", "-", "tag", "and", "GFP", ".", "Cell", "lysates", "were", "immunoblotted", "(", "K", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5B HeLa cells were transfected with siRNA and the plasmids encoding the indicated proteins, and then exposed to nocodazole for 5 hr. Mitotic cells were cytospun onto coverslips and subjected to immunofluorescence staining with DAPI, ACA and anti-GFP antibodies. Example images are shown. Scale bars, 10 μm.HeLa cells were transfected and treated Example images are shown (C). Scale bars, 10 μm.HeLa cells were transfected and treated The immunofluorescence intensity ratios of centromeric EGFP-TOP2A/ACA (D), centromeric EGFP-TOP2A/arm EGFP-TOP2A (E), and arm EGFP-TOP2A/DNA (F), were determined on around 160 chromosomes in 8 cells. Data information: Means and error bars representing S.D. are shown unpaired t-test).HeLa cells transiently expressing EGFP-TOP2A (970-1531) or EGFP-TOP2A (970-1531)-Δ(1015-1032) were treated and immunostained Example images are shown (G). Scale bars, 10 μm.HeLa cells transiently expressing EGFP-TOP2A (970-1531) or EGFP-TOP2A (970-1531)-Δ(1015-1032) were treated and immunostained The immunofluorescence intensity ratio of centromeric EGFP-TOP2A/arm EGFP-TOP2A was determined on around 250 chromosomes in 10 cells (H). Data information: Means and error bars representing S.D. are shown unpaired t-test).U2OS-LacO cells transiently expressing Myc-LacI-Bub1 and EGFP-TOP2A (970-1531) were subjected to immunofluorescence staining with DAPI and antibodies for the Myc-tag and GFP. Example images are shown (I). Scale bars, 10 μm.U2OS-LacO cells transiently expressing Myc-LacI-Bub1 and EGFP-TOP2A (970-1531) were subjected to immunofluorescence staining with DAPI and antibodies for the Myc-tag and GFP. The relative enrichment of EGFP-TOP2A at the LacO repeats was quantified in 130 cells (J). Data information: Means and error bars representing S.D. are shown unpaired t-test).U2OS-LacO cells transiently expressing Myc-LacI-Bub1 and EGFP-TOP2A (970-1531) were subjected to immunofluorescence staining with DAPI and antibodies for the Myc-tag and GFP. Cell lysates were immunoblotted (K)."}
{"words": ["Figure", "6A", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "siRNA", "and", "plasmids", "encoding", "the", "indicated", "proteins", ",", "and", "then", "exposed", "to", "nocodazole", "for", "3", "hr", ".", "Mitotic", "cells", "were", "cytospun", "onto", "coverslips", "and", "subjected", "to", "immunofluorescence", "staining", "with", "DAPI", ",", "ACA", "and", "anti", "-", "GFP", "antibodies", ".", "Example", "images", "are", "shown", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "U2OS", "-", "LacO", "cells", "transiently", "expressing", "Myc", "-", "LacI", "-", "Bub1", "and", "the", "indicated", "EGFP", "-", "TOP2A", "proteins", "were", "subjected", "to", "immunofluorescence", "staining", "with", "DAPI", "and", "antibodies", "for", "the", "Myc", "-", "tag", "and", "H2ApT120", ".", "Example", "images", "are", "shown", "(", "B", ")", ".", "The", "relative", "enrichment", "of", "EGFP", "signal", "at", "the", "LacO", "repeats", "was", "quantified", "in", "30", "cells", "(", "C", ")", ".", "Arrows", "point", "to", "the", "transgene", "loci", ".", "Data", "information", ":", "Means", "and", "error", "bars", "representing", "S", ".", "D", ".", "are", "shown", ";", "unpaired", "t", "test", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "U2OS", "-", "LacO", "cells", "transiently", "expressing", "Myc", "-", "LacI", "-", "Bub1", "and", "the", "indicated", "EGFP", "-", "TOP2A", "proteins", "Cell", "lysates", "were", "immunoblotted", "(", "D", ")", ".", "E", ",", "F", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "siRNA", "and", "plasmids", "encoding", "the", "indicated", "proteins", "were", "treated", "and", "immunostained", "Example", "images", "are", "shown", "(", "E", ")", ".", "The", "immunofluorescence", "intensity", "ratio", "of", "centromeric", "EGFP", "-", "TOP2A", "/", "arm", "EGFP", "-", "TOP2A", "was", "determined", "on", "around", "300", "chromosomes", "in", "15", "cells", "(", "F", ")", ".", "Means", "and", "error", "bars", "representing", "S", ".", "D", ".", "are", "shown", "unpaired", "t", "test", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "G", ",", "H", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "siRNA", "and", "plasmids", "encoding", "the", "indicated", "proteins", "were", "treated", "and", "immunostained", "Example", "images", "are", "shown", "(", "G", ")", ".", "The", "immunofluorescence", "intensity", "ratio", "of", "centromeric", "TOP2A", "-", "Myc", "-", "6xHis", "/", "arm", "TOP2A", "-", "Myc", "-", "6xHis", "was", "determined", "on", "around", "200", "chromosomes", "in", "10", "cells", "(", "H", ")", ".", "Data", "information", ":", "Means", "and", "error", "bars", "representing", "S", ".", "D", ".", "are", "shown", "unpaired", "t", "test", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "U2OS", "cells", "stably", "expressing", "the", "indicated", "CENP", "-", "B", "fusion", "proteins", "were", "transfected", "with", "the", "plasmid", "encoding", "TOP2A", "-", "Myc", "-", "6xHis", "or", "TOP2A", "-", "ΔChT", "-", "Myc", "-", "6xHis", ",", "and", "then", "subjected", "to", "immunofluorescence", "staining", "with", "DAPI", "and", "antibodies", "for", "the", "Myc", "-", "tag", "and", "H2ApT120", ".", "Example", "images", "are", "shown", "(", "I", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "U2OS", "cells", "stably", "expressing", "the", "indicated", "CENP", "-", "B", "fusion", "proteins", "were", "transfected", "with", "the", "plasmid", "encoding", "TOP2A", "-", "Myc", "-", "6xHis", "or", "TOP2A", "-", "ΔChT", "-", "Myc", "-", "6xHis", ",", "and", "then", "subjected", "to", "immunofluorescence", "staining", "with", "DAPI", "and", "antibodies", "for", "the", "Myc", "-", "tag", "and", "H2ApT120", ".", "The", "relative", "enrichment", "of", "anti", "-", "Myc", "staining", "signal", "at", "the", "centromere", "region", "versus", "that", "in", "the", "nearby", "nuclear", "region", "was", "quantified", "on", "around", "200", "chromosomes", "in", "10", "cells", "(", "J", ")", ".", "Data", "information", ":", "Means", "and", "error", "bars", "representing", "S", ".", "D", ".", "are", "shown", "unpaired", "t", "test", ")", ".", "U2OS", "cells", "stably", "expressing", "the", "indicated", "CENP", "-", "B", "fusion", "proteins", "were", "transfected", "with", "the", "plasmid", "encoding", "TOP2A", "-", "Myc", "-", "6xHis", "or", "TOP2A", "-", "ΔChT", "-", "Myc", "-", "6xHis", ",", "and", "then", "subjected", "to", "immunofluorescence", "staining", "with", "DAPI", "and", "antibodies", "for", "the", "Myc", "-", "tag", "and", "H2ApT120", ".", "Cell", "lysates", "were", "immunoblotted", "(", "K", ")", ".", "L", "MBP", "-", "TOP2A", "(", "429", "-", "1531", ")", "-", "10xHis", "and", "MBP", "-", "TOP2A", "(", "429", "-", "1531", ")", "-", "ΔChT", "-", "10xHis", "were", "subjected", "to", "pulldown", "by", "GST", ",", "GST", "-", "H2A", ",", "or", "GST", "-", "H2ApS120", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "antibodies", "for", "MBP", "or", "GST", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A HeLa cells were transfected with siRNA and plasmids encoding the indicated proteins, and then exposed to nocodazole for 3 hr. Mitotic cells were cytospun onto coverslips and subjected to immunofluorescence staining with DAPI, ACA and anti-GFP antibodies. Example images are shown. Scale bars, 10 μm.U2OS-LacO cells transiently expressing Myc-LacI-Bub1 and the indicated EGFP-TOP2A proteins were subjected to immunofluorescence staining with DAPI and antibodies for the Myc-tag and H2ApT120. Example images are shown (B). The relative enrichment of EGFP signal at the LacO repeats was quantified in 30 cells (C). Arrows point to the transgene loci. Data information: Means and error bars representing S.D. are shown ; unpaired t test). Scale bars, 10 μm.U2OS-LacO cells transiently expressing Myc-LacI-Bub1 and the indicated EGFP-TOP2A proteins Cell lysates were immunoblotted (D).E, F HeLa cells transfected with siRNA and plasmids encoding the indicated proteins were treated and immunostained Example images are shown (E). The immunofluorescence intensity ratio of centromeric EGFP-TOP2A/arm EGFP-TOP2A was determined on around 300 chromosomes in 15 cells (F). Means and error bars representing S.D. are shown unpaired t test). Scale bars, 10 μm.G, H HeLa cells transfected with siRNA and plasmids encoding the indicated proteins were treated and immunostained Example images are shown (G). The immunofluorescence intensity ratio of centromeric TOP2A-Myc-6xHis/arm TOP2A-Myc-6xHis was determined on around 200 chromosomes in 10 cells (H). Data information: Means and error bars representing S.D. are shown unpaired t test). Scale bars, 10 μm.U2OS cells stably expressing the indicated CENP-B fusion proteins were transfected with the plasmid encoding TOP2A-Myc-6xHis or TOP2A-ΔChT-Myc-6xHis, and then subjected to immunofluorescence staining with DAPI and antibodies for the Myc-tag and H2ApT120. Example images are shown (I). Scale bars, 10 μm.U2OS cells stably expressing the indicated CENP-B fusion proteins were transfected with the plasmid encoding TOP2A-Myc-6xHis or TOP2A-ΔChT-Myc-6xHis, and then subjected to immunofluorescence staining with DAPI and antibodies for the Myc-tag and H2ApT120. The relative enrichment of anti-Myc staining signal at the centromere region versus that in the nearby nuclear region was quantified on around 200 chromosomes in 10 cells (J). Data information: Means and error bars representing S.D. are shown unpaired t test).U2OS cells stably expressing the indicated CENP-B fusion proteins were transfected with the plasmid encoding TOP2A-Myc-6xHis or TOP2A-ΔChT-Myc-6xHis, and then subjected to immunofluorescence staining with DAPI and antibodies for the Myc-tag and H2ApT120. Cell lysates were immunoblotted (K).L MBP-TOP2A (429-1531)-10xHis and MBP-TOP2A (429-1531)-ΔChT-10xHis were subjected to pulldown by GST, GST-H2A, or GST-H2ApS120, followed by immunoblotting with antibodies for MBP or GST."}
{"words": ["Figure", "7HeLa", "cells", "with", "or", "without", "transient", "expression", "of", "H2B", "-", "GFP", "or", "EGFP", "-", "TOP2A", "were", "exposed", "to", "nocodazole", "for", "3", "hr", ".", "Mitotic", "cells", "were", "cytospun", "onto", "coverslips", "and", "subjected", "to", "immunofluorescence", "staining", "with", "DAPI", "and", "antibodies", "for", "GFP", ",", "Sgo1", "and", "ACA", ".", "Example", "images", "are", "shown", "(", "A", ")", ".", "The", "immunofluorescence", "intensity", "ratio", "of", "centromeric", "Sgo1", "/", "ACA", "was", "determined", "on", "400", "chromosomes", "in", "20", "cells", "(", "B", ")", ".", "The", "means", "and", "S", ".", "D", ".", "s", "from", "three", "independent", "experiments", "with", "the", "Sgo1", "/", "ACA", "ratio", "determined", "on", "around", "total", "1200", "chromosomes", "in", "60", "cells", "are", "shown", "(", "C", ")", ".", "Data", "information", ":", "Means", "and", "error", "bars", "representing", "S", ".", "D", ".", "are", "shown", "unpaired", "t", "test", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "HeLa", "cells", "with", "or", "without", "transient", "expression", "of", "H2B", "-", "GFP", "or", "EGFP", "-", "TOP2A", "were", "exposed", "to", "nocodazole", "for", "3", "hr", ".", "Mitotic", "cells", "were", "cytospun", "onto", "coverslips", "and", "Lysates", "of", "asynchronous", "cells", "were", "immunoblotted", "(", "D", ")", ".", "*", "represents", "non", "-", "specific", "bands", ".", "U2OS", "-", "LacO", "cells", "transiently", "expressing", "Myc", "-", "LacI", "-", "Bub1", ",", "with", "or", "without", "EGFP", "-", "TOP2A", "(", "970", "-", "1531", ")", ",", "were", "subjected", "to", "immunofluorescence", "staining", "with", "DAPI", "and", "antibodies", "for", "H2ApT120", "and", "Sgo1", ".", "Example", "images", "are", "shown", "(", "E", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "U2OS", "-", "LacO", "cells", "transiently", "expressing", "Myc", "-", "LacI", "-", "Bub1", ",", "with", "or", "without", "EGFP", "-", "TOP2A", "(", "970", "-", "1531", ")", ",", "were", "subjected", "to", "immunofluorescence", "staining", "with", "DAPI", "and", "antibodies", "for", "H2ApT120", "and", "Sgo1", ".", "The", "relative", "enrichment", "of", "EGFP", "-", "TOP2A", "(", "F", ")", "and", "Sgo1", "(", "G", ")", "at", "the", "LacO", "repeats", "was", "quantified", "in", "120", "cells", ".", "Data", "information", ":", "Means", "and", "error", "bars", "representing", "S", ".", "D", ".", "are", "shown", "unpaired", "t", "test", ")", ".", "U2OS", "-", "LacO", "cells", "transiently", "expressing", "Myc", "-", "LacI", "-", "Bub1", ",", "with", "or", "without", "EGFP", "-", "TOP2A", "(", "970", "-", "1531", ")", "Cell", "lysates", "were", "immunoblotted", "(", "H", ")", ".", "U2OS", "-", "LacO", "cells", "transiently", "expressing", "EGFP", "-", "LacI", "-", "Bub1", "-", "K", "together", "with", "VSV", "-", "Sgo1", "or", "a", "control", "vector", "were", "subjected", "to", "immunofluorescence", "staining", "with", "DAPI", "and", "antibodies", "for", "TOP2A", "and", "VSV", "-", "tag", ".", "Example", "images", "are", "shown", "(", "I", ")", ".", "The", "relative", "enrichment", "of", "TOP2A", "(", "J", ")", "and", "VSV", "-", "Sgo1", "(", "K", ")", "at", "the", "LacO", "repeats", "was", "quantified", "in", "50", "cells", ".", "Data", "information", ":", "Means", "and", "error", "bars", "representing", "S", ".", "D", ".", "are", "shown", "unpaired", "t", "test", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "U2OS", "-", "LacO", "cells", "transiently", "expressing", "EGFP", "-", "LacI", "-", "Bub1", "-", "K", "together", "with", "VSV", "-", "Sgo1", "or", "a", "control", "vector", "Cell", "lysates", "were", "immunoblotted", "(", "L", ")", ".", "*", "represents", "non", "-", "specific", "bands", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7HeLa cells with or without transient expression of H2B-GFP or EGFP-TOP2A were exposed to nocodazole for 3 hr. Mitotic cells were cytospun onto coverslips and subjected to immunofluorescence staining with DAPI and antibodies for GFP, Sgo1 and ACA. Example images are shown (A). The immunofluorescence intensity ratio of centromeric Sgo1/ACA was determined on 400 chromosomes in 20 cells (B). The means and S.D.s from three independent experiments with the Sgo1/ACA ratio determined on around total 1200 chromosomes in 60 cells are shown (C). Data information: Means and error bars representing S.D. are shown unpaired t test). Scale bars, 10 μm.HeLa cells with or without transient expression of H2B-GFP or EGFP-TOP2A were exposed to nocodazole for 3 hr. Mitotic cells were cytospun onto coverslips and Lysates of asynchronous cells were immunoblotted (D). * represents non-specific bands.U2OS-LacO cells transiently expressing Myc-LacI-Bub1, with or without EGFP-TOP2A (970-1531), were subjected to immunofluorescence staining with DAPI and antibodies for H2ApT120 and Sgo1. Example images are shown (E). Scale bars, 10 μm.U2OS-LacO cells transiently expressing Myc-LacI-Bub1, with or without EGFP-TOP2A (970-1531), were subjected to immunofluorescence staining with DAPI and antibodies for H2ApT120 and Sgo1. The relative enrichment of EGFP-TOP2A (F) and Sgo1 (G) at the LacO repeats was quantified in 120 cells. Data information: Means and error bars representing S.D. are shown unpaired t test).U2OS-LacO cells transiently expressing Myc-LacI-Bub1, with or without EGFP-TOP2A (970-1531) Cell lysates were immunoblotted (H).U2OS-LacO cells transiently expressing EGFP-LacI-Bub1-K together with VSV-Sgo1 or a control vector were subjected to immunofluorescence staining with DAPI and antibodies for TOP2A and VSV-tag. Example images are shown (I). The relative enrichment of TOP2A (J) and VSV-Sgo1 (K) at the LacO repeats was quantified in 50 cells. Data information: Means and error bars representing S.D. are shown unpaired t test). Scale bars, 10 μm.U2OS-LacO cells transiently expressing EGFP-LacI-Bub1-K together with VSV-Sgo1 or a control vector Cell lysates were immunoblotted (L). * represents non-specific bands."}
{"words": ["Figure", "8HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "siRNA", "and", "subjected", "to", "immunofluorescence", "staining", "with", "DAPI", ",", "ACA", "and", "the", "anti", "-", "PICH", "antibody", ".", "Example", "images", "of", "anaphase", "cells", "are", "shown", "(", "A", ")", ".", "The", "percentage", "of", "PICH", "-", "positive", "cells", "was", "determined", "in", "at", "least", "339", "anaphase", "cells", "in", "each", "condition", ".", "Means", "and", "S", ".", "D", ".", "s", "from", "three", "independent", "experiments", "are", "shown", "(", "B", ")", ".", "Data", "information", ":", "Means", "and", "error", "bars", "representing", "S", ".", "D", ".", "are", "shown", ";", "unpaired", "t", "test", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "siRNA", "and", "Lysates", "of", "asynchronously", "growing", "cells", "were", "immunoblotted", "(", "C", ")", ".", "HeLa", "cells", "were", "released", "from", "single", "thymidine", "block", ",", "and", "after", "7", "hr", ",", "BAY", "1816032", "or", "DMSO", "was", "added", "for", "5", "hr", ".", "Cells", "were", "then", "fixed", "and", "subjected", "to", "immunofluorescence", "staining", "Example", "images", "of", "anaphase", "cells", "are", "shown", "(", "D", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "E", "HeLa", "cells", "were", "released", "from", "single", "thymidine", "block", ",", "and", "after", "7", "hr", ",", "BAY", "1816032", "or", "DMSO", "was", "added", "for", "5", "hr", ".", "Cells", "were", "then", "fixed", "and", "subjected", "to", "immunofluorescence", "staining", "The", "percentage", "of", "anaphases", "with", "PICH", "was", "determined", "(", "E", ")", ".", "HeLa", "cells", "were", "arrested", "in", "a", "prometaphase", "-", "like", "state", "with", "nocodazole", "treatment", "for", "5hr", ",", "and", "then", "BAY", "1816032", "or", "DMSO", "was", "added", "for", "1", "hr", "in", "the", "continued", "presence", "of", "nocodazole", ".", "Then", ",", "nocodazole", "was", "removed", "by", "washing", "into", "fresh", "medium", "containing", "BAY", "1816032", "or", "DMSO", ".", "After", "1", "hr", ",", "cells", "were", "fixed", "and", "subjected", "to", "immunofluorescence", "staining", ".", "Example", "images", "are", "shown", "(", "F", ")", ".", "The", "percentage", "of", "anaphases", "with", "PICH", "was", "determined", "(", "G", ")", ".", "Arrows", "point", "to", "the", "UFBs", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "HeLa", "and", "the", "Sgo1", "-", "K492A", "cells", "transfected", "with", "the", "indicated", "siRNA", "were", "synchronized", "and", "treated", "with", "BAY", "1816032", "or", "DMSO", "and", "then", "immunostained", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Example", "images", "of", "anaphase", "cells", "are", "shown", "(", "H", ")", ".", "The", "percentage", "of", "anaphases", "with", "PICH", "was", "determined", "in", "at", "least", "256", "cells", "in", "each", "condition", ".", "Means", "and", "S", ".", "D", ".", "s", "from", "three", "independent", "experiments", "are", "shown", "(", "I", ")", ".", "Example", "images", "of", "prometaphase", "cells", "immunostained", "with", "the", "indicated", "antibodies", "are", "shown", "(", "J", ")", ".", "Data", "information", ":", "Means", "and", "error", "bars", "representing", "S", ".", "D", ".", "are", "shown", "unpaired", "t", "test", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "HeLa", "and", "the", "Sgo1", "-", "K492A", "cells", "transfected", "with", "the", "indicated", "siRNA", "were", "synchronized", "and", "treated", "with", "BAY", "1816032", "or", "DMSO", "Lysates", "of", "nocodazole", "-", "arrested", "mitotic", "cells", "were", "immunoblotted", "(", "K", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8HeLa cells were transfected with siRNA and subjected to immunofluorescence staining with DAPI, ACA and the anti-PICH antibody. Example images of anaphase cells are shown (A). The percentage of PICH-positive cells was determined in at least 339 anaphase cells in each condition. Means and S.D.s from three independent experiments are shown (B). Data information: Means and error bars representing S.D. are shown ; unpaired t test). Scale bars, 10 μm.HeLa cells were transfected with siRNA and Lysates of asynchronously growing cells were immunoblotted (C).HeLa cells were released from single thymidine block, and after 7 hr, BAY 1816032 or DMSO was added for 5 hr. Cells were then fixed and subjected to immunofluorescence staining Example images of anaphase cells are shown (D). Scale bars, 10 μm.E HeLa cells were released from single thymidine block, and after 7 hr, BAY 1816032 or DMSO was added for 5 hr. Cells were then fixed and subjected to immunofluorescence staining The percentage of anaphases with PICH was determined (E).HeLa cells were arrested in a prometaphase-like state with nocodazole treatment for 5hr, and then BAY 1816032 or DMSO was added for 1 hr in the continued presence of nocodazole. Then, nocodazole was removed by washing into fresh medium containing BAY 1816032 or DMSO. After 1 hr, cells were fixed and subjected to immunofluorescence staining. Example images are shown (F). The percentage of anaphases with PICH was determined (G). Arrows point to the UFBs. Scale bars, 10 μm.HeLa and the Sgo1-K492A cells transfected with the indicated siRNA were synchronized and treated with BAY 1816032 or DMSO and then immunostained with the indicated antibodies. Example images of anaphase cells are shown (H). The percentage of anaphases with PICH was determined in at least 256 cells in each condition. Means and S.D.s from three independent experiments are shown (I). Example images of prometaphase cells immunostained with the indicated antibodies are shown (J). Data information: Means and error bars representing S.D. are shown unpaired t test). Scale bars, 10 μm.HeLa and the Sgo1-K492A cells transfected with the indicated siRNA were synchronized and treated with BAY 1816032 or DMSO Lysates of nocodazole-arrested mitotic cells were immunoblotted (K)."}
{"words": ["Figure", "9A", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "plasmids", "encoding", "CB", "-", "GFP", "or", "CB", "-", "TOP2A", "-", "GFP", ".", "Lysates", "of", "asynchronously", "growing", "cells", "were", "immunoblotted", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "siRNA", "and", "plasmids", "encoding", "the", "indicated", "proteins", "were", "released", "from", "single", "thymidine", "block", ".", "At", "12", "hr", "post", "-", "release", ",", "cells", "were", "fixed", "and", "subjected", "to", "immunofluorescence", "staining", "with", "DAPI", "and", "the", "antibodies", "for", "PICH", ",", "GFP", "and", "CENP", "-", "C", ".", "Example", "images", "of", "anaphase", "cells", "are", "shown", "(", "B", ")", ".", "The", "percentage", "of", "anaphases", "with", "PICH", "was", "determined", "in", "at", "least", "152", "cells", "in", "each", "condition", ".", "Means", "and", "S", ".", "D", ".", "s", "from", "three", "independent", "experiments", "are", "shown", "(", "C", ")", ".", "Arrows", "point", "to", "the", "UFBs", ".", "Data", "information", ":", "Means", "and", "error", "bars", "representing", "S", ".", "D", ".", "are", "shown", "unpaired", "t", "test", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "siRNA", "and", "plasmids", "encoding", "the", "indicated", "proteins", "were", "released", "from", "single", "thymidine", "block", ".", "At", "12", "hr", "post", "-", "release", ",", "cells", "Lysates", "of", "nocodazole", "-", "arrested", "mitotic", "cells", "were", "immunoblotted", "(", "D", ")", ".", "*", "represents", "non", "-", "specific", "bands", ".", "E", ",", "F", "HeLa", "cells", "transiently", "expressing", "CB", "-", "GFP", "or", "CB", "-", "TOP2A", "-", "GFP", "were", "released", "from", "single", "thymidine", "block", ",", "and", "after", "7", "hr", ",", "BAY", "1816032", "or", "DMSO", "was", "added", "for", "5", "hr", ".", "Cells", "were", "then", "fixed", "and", "subjected", "to", "immunofluorescence", "staining", "as", "in", "(", "B", ")", ".", "Example", "images", "of", "anaphase", "cells", "are", "shown", "(", "E", ")", ".", "The", "percentage", "of", "anaphases", "with", "PICH", "was", "determined", "in", "at", "least", "142", "cells", "in", "each", "condition", ".", "Means", "and", "S", ".", "D", ".", "s", "from", "three", "independent", "experiments", "are", "shown", "(", "F", ")", ".", "Arrows", "point", "to", "the", "UFBs", ".", "Data", "information", ":", "Means", "and", "error", "bars", "representing", "S", ".", "D", ".", "are", "shown", ";", "unpaired", "t", "test", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "siRNA", "and", "plasmids", "encoding", "EGFP", "-", "TOP2A", "(", "WT", "or", "ΔChT", ")", "were", "synchronized", "and", "then", "subjected", "to", "immunofluorescence", "staining", "with", "DAPI", ",", "ACA", "and", "the", "antibodies", "for", "PICH", "and", "GFP", ".", "Example", "images", "of", "anaphase", "cells", "are", "shown", "(", "G", ")", ".", "Arrows", "point", "to", "the", "UFBs", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "siRNA", "and", "plasmids", "encoding", "EGFP", "-", "TOP2A", "(", "WT", "or", "ΔChT", ")", "were", "synchronized", "and", "then", "subjected", "to", "immunofluorescence", "staining", "with", "DAPI", ",", "ACA", "and", "the", "antibodies", "for", "PICH", "and", "GFP", ".", "The", "percentage", "of", "anaphases", "with", "PICH", "was", "determined", "in", "at", "least", "174", "cells", "in", "each", "condition", ".", "Means", "and", "S", ".", "D", ".", "s", "from", "three", "independent", "experiments", "are", "shown", "(", "H", ")", ".", "Data", "information", ":", "Means", "and", "error", "bars", "representing", "S", ".", "D", ".", "are", "shown", "unpaired", "t", "test", ")", ".", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "siRNA", "and", "plasmids", "encoding", "EGFP", "-", "TOP2A", "(", "WT", "or", "ΔChT", ")", "were", "synchronized", "and", "then", "Lysates", "of", "asynchronous", "cells", "were", "immunoblotted", "(", "I", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 9A HeLa cells were transfected with plasmids encoding CB-GFP or CB-TOP2A-GFP. Lysates of asynchronously growing cells were immunoblotted with the indicated antibodies.HeLa cells transfected with siRNA and plasmids encoding the indicated proteins were released from single thymidine block. At 12 hr post-release, cells were fixed and subjected to immunofluorescence staining with DAPI and the antibodies for PICH, GFP and CENP-C. Example images of anaphase cells are shown (B). The percentage of anaphases with PICH was determined in at least 152 cells in each condition. Means and S.D.s from three independent experiments are shown (C). Arrows point to the UFBs. Data information: Means and error bars representing S.D. are shown unpaired t test). Scale bars, 10 μm.HeLa cells transfected with siRNA and plasmids encoding the indicated proteins were released from single thymidine block. At 12 hr post-release, cells Lysates of nocodazole-arrested mitotic cells were immunoblotted (D). * represents non-specific bands.E, F HeLa cells transiently expressing CB-GFP or CB-TOP2A-GFP were released from single thymidine block, and after 7 hr, BAY 1816032 or DMSO was added for 5 hr. Cells were then fixed and subjected to immunofluorescence staining as in (B). Example images of anaphase cells are shown (E). The percentage of anaphases with PICH was determined in at least 142 cells in each condition. Means and S.D.s from three independent experiments are shown (F). Arrows point to the UFBs. Data information: Means and error bars representing S.D. are shown ; unpaired t test). Scale bars, 10 μm.HeLa cells transfected with siRNA and plasmids encoding EGFP-TOP2A (WT or ΔChT) were synchronized and then subjected to immunofluorescence staining with DAPI, ACA and the antibodies for PICH and GFP. Example images of anaphase cells are shown (G). Arrows point to the UFBs. Scale bars, 10 μm.HeLa cells transfected with siRNA and plasmids encoding EGFP-TOP2A (WT or ΔChT) were synchronized and then subjected to immunofluorescence staining with DAPI, ACA and the antibodies for PICH and GFP. The percentage of anaphases with PICH was determined in at least 174 cells in each condition. Means and S.D.s from three independent experiments are shown (H). Data information: Means and error bars representing S.D. are shown unpaired t test).HeLa cells transfected with siRNA and plasmids encoding EGFP-TOP2A (WT or ΔChT) were synchronized and then Lysates of asynchronous cells were immunoblotted (I)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "H1299", "cells", "were", "transfected", "with", "Myc", "-", "β", "-", "catenin", ",", "CK1α", "and", "MDMX", "mutants", ".", "Phosphorylation", "of", "β", "-", "catenin", "S45", "was", "determined", "by", "western", "blot", ".", "Co", "-", "expression", "of", "MDMX", "blocked", "the", "increase", "of", "pS45", "level", ".", "MDMXSG", "(", "W200S", "/", "W201G", ")", "and", "MDMX", "-", "1", "-", "300", "were", "defective", "for", "CK1α", "binding", ".", "(", "B", ")", "GST", "-", "β", "-", "catenin", "-", "1", "-", "200", "was", "incubated", "with", "purified", "FLAG", "-", "CK1α", ",", "FLAG", "-", "MDMX", "and", "ATP", "at", "indicated", "ratios", ".", "Phosphorylation", "of", "β", "-", "catenin", "S45", "was", "determined", "by", "western", "blot", ".", "MDMXS289A", "contains", "mutation", "of", "CK1α", "phosphorylation", "site", ".", "(", "C", ")", "Kinetic", "characterization", "of", "CK1α", "inhibition", "by", "MDMX", ".", "Reaction", "velocity", "as", "a", "function", "of", "β", "-", "catenin", "peptide", "substrate", "and", "increasing", "MDMX", "concentrations", "at", "100", "µM", "ATP", "and", "2", "nM", "CK1α", ".", "Data", "were", "fitted", "to", "the", "Michaelis", "-", "Menten", "equation", ".", "The", "resulting", "parameter", "values", "are", "shown", "in", "the", "table", ".", "(", "D", ")", "Reaction", "velocity", "as", "a", "function", "of", "ATP", "and", "increasing", "MDMX", "concentrations", "at", "800", "µM", "peptide", "substrate", "and", "2", "nM", "CK1α", ".", "Data", "were", "fitted", "to", "the", "Michaelis", "-", "Menten", "equation", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) H1299 cells were transfected with Myc-β-catenin, CK1α and MDMX mutants. Phosphorylation of β-catenin S45 was determined by western blot. Co-expression of MDMX blocked the increase of pS45 level. MDMXSG (W200S/W201G) and MDMX-1-300 were defective for CK1α binding.(B) GST-β-catenin-1-200 was incubated with purified FLAG-CK1α, FLAG-MDMX and ATP at indicated ratios. Phosphorylation of β-catenin S45 was determined by western blot. MDMXS289A contains mutation of CK1α phosphorylation site.(C) Kinetic characterization of CK1α inhibition by MDMX. Reaction velocity as a function of β-catenin peptide substrate and increasing MDMX concentrations at 100 µM ATP and 2 nM CK1α. Data were fitted to the Michaelis-Menten equation. The resulting parameter values are shown in the table.(D) Reaction velocity as a function of ATP and increasing MDMX concentrations at 800 µM peptide substrate and 2 nM CK1α. Data were fitted to the Michaelis-Menten equation."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ",", "B", ")", "H1299", "cells", "and", "human", "foreskin", "fibroblasts", "HFF", "were", "stably", "infected", "with", "lentivirus", "expressing", "MDMX", "and", "analyzed", "by", "western", "blot", ".", "(", "C", ")", "H1299", "cells", "were", "transiently", "transfected", "with", "CK1α", "plasmid", "and", "analyzed", "for", "β", "-", "catenin", "phosphorylation", "by", "western", "blot", ".", "(", "D", ")", "Cytoplasmic", "and", "nuclear", "fractions", "of", "H1299", "cells", "stably", "expressing", "MDMX", "were", "analyzed", "for", "indicated", "markers", ".", "(", "E", ")", "Extract", "of", "H1299", "expressing", "MDMX", "at", "indicated", "amounts", "were", "analyzed", "for", "β", "-", "catenin", "S45", "kinase", "activity", "in", "a", "titration", "assay", ".", "(", "F", ")", "Extracts", "of", "H1299", "cells", "separately", "transfected", "with", "MDMX", "or", "CK1α", "were", "mixed", "in", "the", "presence", "of", "CK1α", "inhibitors", ".", "In", "vitro", "formation", "of", "MDMX", "-", "CK1α", "complex", "was", "detected", "by", "MDMX", "IP", "followed", "by", "CK1α", "western", "blot", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A, B) H1299 cells and human foreskin fibroblasts HFF were stably infected with lentivirus expressing MDMX and analyzed by western blot.(C) H1299 cells were transiently transfected with CK1α plasmid and analyzed for β-catenin phosphorylation by western blot.(D) Cytoplasmic and nuclear fractions of H1299 cells stably expressing MDMX were analyzed for indicated markers.(E) Extract of H1299 expressing MDMX at indicated amounts were analyzed for β-catenin S45 kinase activity in a titration assay.(F) Extracts of H1299 cells separately transfected with MDMX or CK1α were mixed in the presence of CK1α inhibitors. In vitro formation of MDMX-CK1α complex was detected by MDMX IP followed by CK1α western blot."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ",", "B", ",", "C", ",", "D", ")", "Cells", "were", "treated", "with", "MDMX", "siRNA", "for", "48", "hrs", "and", "analyzed", "for", "β", "-", "catenin", "pS45", "level", "by", "western", "blot", ".", "(", "E", ")", "H1299", "and", "293T", "cells", "were", "treated", "with", "indicated", "siRNA", "for", "48", "hrs", ".", "The", "activity", "of", "β", "-", "catenin", "S45", "kinase", "in", "cell", "extracts", "was", "determined", "using", "an", "ELISA", "assay", ".", "The", "results", "are", "average", "of", "3", "experiments", "(", "mean", "+", "/", "-", "SD", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "(", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A, B, C, D) Cells were treated with MDMX siRNA for 48 hrs and analyzed for β-catenin pS45 level by western blot.(E) H1299 and 293T cells were treated with indicated siRNA for 48 hrs. The activity of β-catenin S45 kinase in cell extracts was determined using an ELISA assay. The results are average of 3 experiments (mean +/- SD). *p<0.05 (Student's t test)."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "B", "GST", "-", "β", "-", "catenin", "-", "1", "-", "200", "was", "incubated", "with", "ATP", ",", "CK1α", "and", "GST", "-", "MDMX", "mutants", "at", "indicated", "ratios", ".", "The", "level", "of", "pS45", "was", "determined", "by", "western", "blot", ".", "C", ",", "D", ")", "GST", "-", "β", "-", "catenin", "-", "1", "-", "200", "was", "incubated", "with", "ATP", ",", "CK1α", "and", "GST", "-", "MDMX", "mutants", "at", "indicated", "ratios", ".", "The", "level", "of", "pS45", "was", "determined", "by", "western", "blot", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(B GST-β-catenin-1-200 was incubated with ATP, CK1α and GST-MDMX mutants at indicated ratios. The level of pS45 was determined by western blot.C, D) GST-β-catenin-1-200 was incubated with ATP, CK1α and GST-MDMX mutants at indicated ratios. The level of pS45 was determined by western blot."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "B", ")", "Purified", "FLAG", "-", "CK1α", "was", "incubated", "with", "ATP", ",", "GST", "-", "MDMX", ",", "GST", "-", "β", "-", "catenin", "-", "1", "-", "200", ",", "pDI", "peptide", "(", "LTFEHYWAQLTS", ",", "5", "µM", ")", ",", "and", "pDI3A", "peptide", "(", "LTAEHYAAQATS", ",", "5", "µM", ")", ".", "β", "-", "catenin", "pS45", "level", "was", "determined", "by", "western", "blot", ".", "(", "C", ")", "H1299", "cells", "were", "cotransfected", "with", "MDMX", ",", "CK1α", "and", "p53", "mutants", ".", "MDMX", "-", "CK1α", "binding", "was", "determined", "by", "IP", "-", "western", "blot", ".", "(", "D", ")", "Endogenous", "p53", "in", "A549", "(", "wt", ")", "and", "Panc1", "(", "R273H", ")", "cells", "were", "depleted", "by", "CRISPR", "/", "Cas9", "knockout", ".", "β", "-", "catenin", "pS45", "level", "was", "determined", "by", "western", "blot", ".", "(", "E", ")", "The", "β", "-", "catenin", "S45", "kinase", "activity", "in", "A549", "and", "Panc1", "cells", "was"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(B) Purified FLAG-CK1α was incubated with ATP, GST-MDMX, GST-β-catenin-1-200, pDI peptide (LTFEHYWAQLTS, 5 µM), and pDI3A peptide (LTAEHYAAQATS, 5 µM). β-catenin pS45 level was determined by western blot.(C) H1299 cells were cotransfected with MDMX, CK1α and p53 mutants. MDMX-CK1α binding was determined by IP-western blot.(D) Endogenous p53 in A549 (wt) and Panc1 (R273H) cells were depleted by CRISPR/Cas9 knockout. β-catenin pS45 level was determined by western blot.(E) The β-catenin S45 kinase activity in A549 and Panc1 cells was determined"}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "H1299", "cells", "were", "transfected", "with", "MDMX", "and", "CK1α", "mutants", ".", "MDMX", "-", "CK1α", "binding", "was", "determined", "by", "IP", "-", "western", "blot", ".", "(", "B", ")", "GST", "-", "β", "-", "catenin", "-", "1", "-", "200", "was", "incubated", "with", "ATP", ",", "CK1α", "and", "GST", "-", "MDMX", ".", "The", "level", "of", "pS45", "was", "determined", "by", "western", "blot", ".", "(", "C", ")", "GST", "-", "β", "-", "catenin", "-", "1", "-", "200", "was", "incubated", "with", "identical", "amounts", "of", "purified", "FLAG", "-", "CK1α", "mutants", "and", "ATP", ".", "The", "level", "of", "pS45", "was", "determined", "by", "western", "blot", ".", "(", "D", ")", ".", "ELISA", "plates", "coated", "with", "GST", "-", "β", "-", "catenin", "-", "1", "-", "200", "was", "incubated", "with", "purified", "FLAG", "-", "CK1α", "mutants", ",", "ATP", ",", "and", "MDMX", ".", "The", "level", "of", "pS45", "was", "determined", "by", "ELISA", "assay", ".", "The", "results", "are", "average", "of", "3", "experiments", "(", "mean", "+", "/", "-", "SD", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) H1299 cells were transfected with MDMX and CK1α mutants. MDMX-CK1α binding was determined by IP-western blot.(B) GST-β-catenin-1-200 was incubated with ATP, CK1α and GST-MDMX. The level of pS45 was determined by western blot.(C) GST-β-catenin-1-200 was incubated with identical amounts of purified FLAG-CK1α mutants and ATP. The level of pS45 was determined by western blot.(D). ELISA plates coated with GST-β-catenin-1-200 was incubated with purified FLAG-CK1α mutants, ATP, and MDMX. The level of pS45 was determined by ELISA assay. The results are average of 3 experiments (mean +/- SD)."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "MEF", "cell", "lines", "derived", "from", "3", "p53", "-", "/", "-", ";", "MDMXSG", "/", "SG", "and", "3", "p53", "-", "/", "-", ";", "MDMXwt", "/", "wt", "embryos", "were", "analyzed", "for", "β", "-", "catenin", "pS45", "level", "by", "western", "blot", ".", "(", "B", ")", "CK1α", "activity", "in", "MEF", "cell", "extracts", "was", "determined", "using", "ELISA", "kinase", "activity", "assay", ".", "The", "results", "are", "average", "of", "3", "experiments", "(", "mean", "+", "/", "-", "SD", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "(", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "(", "C", ")", "Volcano", "plot", "of", "differential", "gene", "expression", "between", "p53", "-", "/", "-", ";", "MDMXSG", "/", "SG", "and", "p53", "-", "/", "-", ";", "MDMXwt", "/", "wt", "MEF", "lines", ".", "(", "D", ")", "Multiple", "Wnt", "signaling", "genes", "were", "down", "regulated", "in", "p53", "-", "/", "-", ";", "MDMXSG", "/", "SG", "MEF", "cell", "lines", ".", "(", "E", ")", "RT", "-", "PCR", "confirmation", "of", "Wnt", "pathway", "genes", "down", "-", "regulated", "in", "p53", "-", "/", "-", ";", "MDMXSG", "/", "SG", "MEF", "(", "average", "of", "3", "cell", "lines", ",", "mean", "+", "/", "-", "SD", ")", "and", "thymus", "from", "1", "month", "old", "mice", "(", "average", "of", "3", "mice", ",", "mean", "+", "/", "-", "SD", ")", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "(", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "(", "F", ")", "p53", "-", "/", "-", ";", "MDMXSG", "/", "SG", "and", "p53", "-", "/", "-", ";", "MDMXwt", "/", "wt", "cells", "were", "treated", "with", "conditioned", "medium", "containing", "Wnt3a", ".", "Axin2", "mRNA", "level", "was", "determined", "by", "RT", "-", "PCR", "(", "average", "of", "3", "experiments", ",", "mean", "+", "/", "-", "SD", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "(", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) MEF cell lines derived from 3 p53-/-;MDMXSG/SG and 3 p53-/-;MDMXwt/wt embryos were analyzed for β-catenin pS45 level by western blot.(B) CK1α activity in MEF cell extracts was determined using ELISA kinase activity assay. The results are average of 3 experiments (mean +/- SD). *p<0.01 (Student's t test).(C) Volcano plot of differential gene expression between p53-/-;MDMXSG/SG and p53-/-;MDMXwt/wt MEF lines.(D) Multiple Wnt signaling genes were down regulated in p53-/-;MDMXSG/SG MEF cell lines.(E) RT-PCR confirmation of Wnt pathway genes down-regulated in p53-/-;MDMXSG/SG MEF (average of 3 cell lines, mean +/- SD) and thymus from 1 month old mice (average of 3 mice, mean +/- SD). **p<0.01, *p<0.05 (Student's t test).(F) p53-/-;MDMXSG/SG and p53-/-;MDMXwt/wt cells were treated with conditioned medium containing Wnt3a. Axin2 mRNA level was determined by RT-PCR (average of 3 experiments, mean +/- SD). *p<0.05 (Student's t test)."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "A", ")", "Identical", "starting", "number", "of", "cells", "from", "the", "MEF", "lines", "were", "serially", "passaged", "following", "identical", "schedules", ".", "The", "differences", "in", "cell", "number", "were", "determined", "after", "3", "and", "5", "passages", ".", "The", "results", "are", "average", "of", "3", "experiments", "(", "mean", "+", "/", "-", "SD", ")", ".", "(", "B", ")", "Identical", "number", "of", "cells", "from", "the", "MEF", "lines", "were", "plated", "at", "low", "density", "and", "cultured", "for", "14", "days", ".", "Colony", "formation", "efficiency", "was", "determined", "by", "crystal", "violate", "staining", ".", "(", "C", ")", "Survival", "curves", "of", "p53", "-", "/", "-", ";", "MDMXSG", "/", "SG", "and", "p53", "-", "/", "-", ";", "MDMXwt", "/", "wt", "mice", ".", "Thymic", "lymphomas", "were", "the", "major", "cause", "of", "mortality", "in", "both", "genotypes", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(A) Identical starting number of cells from the MEF lines were serially passaged following identical schedules. The differences in cell number were determined after 3 and 5 passages. The results are average of 3 experiments (mean +/- SD).(B) Identical number of cells from the MEF lines were plated at low density and cultured for 14 days. Colony formation efficiency was determined by crystal violate staining.(C) Survival curves of p53-/-;MDMXSG/SG and p53-/-;MDMXwt/wt mice. Thymic lymphomas were the major cause of mortality in both genotypes."}
{"words": ["Figure", "1", "Time", "-", "lapse", "microscopy", "of", "sporozoites", ",", "10", "min", "after", "intradermal", "inoculation", "into", "mice", "with", "CD31", "-", "labeled", "vascular", "endothelia", ".", "Maximum", "intensity", "projection", "over", "240", "sec", "shows", "trajectories", "of", "moving", "sporozoites", "(", "green", ")", "and", "blood", "vessels", "(", "magenta", ")", ".", "The", "light", "green", "structures", "in", "the", "first", "two", "panels", "are", "autofluorescent", "hair", "follicles", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1 Time-lapse microscopy of sporozoites, 10 min after intradermal inoculation into mice with CD31-labeled vascular endothelia. Maximum intensity projection over 240 sec shows trajectories of moving sporozoites (green) and blood vessels (magenta). The light green structures in the first two panels are autofluorescent hair follicles. Scale bar, 50 μm. "}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "P", ".", "berghei", "sporozoite", "trajectories", "obtained", "with", "manual", "(", "left", ")", "and", "automated", "(", "right", ")", "tracking", "methods", ".", "(", "B", ")", "Image", "processing", "and", "automated", "tracking", "method", ".", "Shown", "are", "images", "illustrating", "each", "step", "of", "automated", "tracking", ":", "The", "raw", "data", "image", "shows", "the", "first", "frame", "of", "time", "-", "lapse", "microscopy", "of", "P", ".", "berghei", "sporozoites", "(", "red", ")", "after", "intradermal", "inoculation", ",", "followed", "by", "the", "same", "image", "after", "background", "subtraction", "and", "thresholding", "using", "Fiji", "software", ".", "Spot", "detection", "was", "run", "using", "ICY", "software", "and", "the", "final", "image", "shows", "the", "overlay", "with", "tracks", "generated", "using", "the", "spot", "tracking", "plugin", "of", "ICY", "software", ".", "Scale", "bars", ",", "50", "μm", ".", "(", "C", ")", "Apparent", "speed", "of", "sporozoites", "5", "to", "120", "min", "after", "intradermal", "inoculation", ",", "obtained", "with", "manual", "and", "automated", "tracking", "methods", ".", "Data", "is", "displayed", "in", "box", "and", "whisker", "plots", "with", "whiskers", "showing", "10", "to", "90", "percentiles", "and", "values", "below", "and", "above", "the", "whiskers", "shown", "individually", ".", "Horizontal", "line", "indicates", "the", "median", "speed", ".", "No", "statistically", "significant", "differences", "between", "the", "corresponding", "timepoints", "of", "manual", "and", "automated", "tracking", "methods", "were", "found", "(", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", ")", ".", "(", "D", ")", "Displacement", "of", "sporozoites", "5", "to", "120", "min", "after", "intradermal", "inoculation", ",", "obtained", "with", "manual", "and", "automated", "tracking", "methods", ".", "To", "normalize", "between", "tracks", "of", "different", "duration", ",", "displacement", "is", "displayed", "as", "final", "displacement", "per", "30", "seconds", "interval", ".", "Data", "is", "displayed", "in", "box", "and", "whisker", "plots", "with", "whiskers", "showing", "10", "to", "90", "percentiles", "and", "values", "below", "and", "above", "the", "whiskers", "shown", "individually", ".", "Horizontal", "line", "indicates", "the", "median", ".", "The", "only", "statistically", "significant", "difference", "in", "sporozoite", "displacement", "between", "the", "manual", "and", "automated", "tracking", "methods", "was", "at", "120", "minutes", "(", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ")", ".", "For", "panels", "C", "&", "D", ",", "a", "varying", "number", "of", "videos", "were", "processed", "for", "each", "time", "point", ":", "C", ":", "5", "min", "(", "3", "videos", "/", "37", "manual", "tracks", "/", "203", "automated", "tracks", ")", ",", "10", "min", "(", "6", "videos", "/", "112", "manual", "tracks", "/", "292", "automated", "tracks", ")", ",", "20", "min", "(", "4", "videos", "/", "95", "manual", "tracks", "/", "184", "automated", "tracks", ")", ",", "30", "min", "(", "6", "videos", "/", "63", "manual", "tracks", "/", "235", "automated", "tracks", ")", ",", "60", "min", "(", "7", "videos", "/", "77", "manual", "tracks", "/", "162", "automated", "tracks", ")", ",", "and", "120", "min", "(", "6", "videos", "/", "44", "manual", "tracks", "/", "151", "automated", "tracks", ")", ".", "D", ":", "5", "min", "(", "3", "videos", "/", "61", "manual", "tracks", "/", "203", "automated", "tracks", ")", ",", "10", "min", "(", "6", "videos", "/", "74", "manual", "tracks", "/", "292", "automated", "tracks", ")", ",", "20", "min", "(", "4", "videos", "/", "47", "manual", "tracks", "/", "184", "automated", "tracks", ")", ",", "30", "min", "(", "6", "videos", "/", "53", "manual", "tracks", "/", "235", "automated", "tracks", ")", ",", "60", "min", "(", "7", "videos", "/", "65", "manual", "tracks", "/", "162", "automated", "tracks", ")", ",", "and", "120", "min", "(", "6", "videos", "/", "48", "manual", "tracks", "/", "151", "automated", "tracks", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) P. berghei sporozoite trajectories obtained with manual (left) and automated (right) tracking methods. (B) Image processing and automated tracking method. Shown are images illustrating each step of automated tracking: The raw data image shows the first frame of time-lapse microscopy of P. berghei sporozoites (red) after intradermal inoculation, followed by the same image after background subtraction and thresholding using Fiji software. Spot detection was run using ICY software and the final image shows the overlay with tracks generated using the spot tracking plugin of ICY software. Scale bars, 50 μm. (C) Apparent speed of sporozoites 5 to 120 min after intradermal inoculation, obtained with manual and automated tracking methods. Data is displayed in box and whisker plots with whiskers showing 10 to 90 percentiles and values below and above the whiskers shown individually. Horizontal line indicates the median speed. No statistically significant differences between the corresponding timepoints of manual and automated tracking methods were found (Kruskal-Wallis test). (D) Displacement of sporozoites 5 to 120 min after intradermal inoculation, obtained with manual and automated tracking methods. To normalize between tracks of different duration, displacement is displayed as final displacement per 30 seconds interval. Data is displayed in box and whisker plots with whiskers showing 10 to 90 percentiles and values below and above the whiskers shown individually. Horizontal line indicates the median. The only statistically significant difference in sporozoite displacement between the manual and automated tracking methods was at 120 minutes (Kruskal-Wallis test, ****p<0.0001). For panels C&D, a varying number of videos were processed for each time point: C: 5 min (3 videos/37 manual tracks/203 automated tracks), 10 min (6 videos/112 manual tracks/292 automated tracks), 20 min (4 videos/95 manual tracks/184 automated tracks), 30 min (6 videos/63 manual tracks/235 automated tracks), 60 min (7 videos/77 manual tracks/162 automated tracks), and 120 min (6 videos/44 manual tracks/151 automated tracks). D: 5 min (3 videos/61 manual tracks/203 automated tracks), 10 min (6 videos/74 manual tracks/292 automated tracks), 20 min (4 videos/47 manual tracks/184 automated tracks), 30 min (6 videos/53 manual tracks/235 automated tracks), 60 min (7 videos/65 manual tracks/162 automated tracks), and 120 min (6 videos/48 manual tracks/151 automated tracks)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", "-", "C", ")", "Tracks", "generated", "through", "automated", "tracking", "were", "plotted", "to", "a", "common", "origin", "to", "visualize", "parasite", "dispersal", "P", ".", "berghei", "(", "A", ")", ",", "P", ".", "yoelii", "(", "B", ")", "and", "P", ".", "falciparum", "(", "C", ")", "at", "5", ",", "10", ",", "30", "and", "60", "min", "after", "intradermal", "inoculation", ".", "For", "each", "timepoint", ",", "the", "tracks", "are", "representative", "of", "the", "average", "displacement", "of", "the", "entire", "sporozoite", "population", ".", "Track", "numbers", "used", "for", "each", "timepoint", "were", ":", "5", "min", ",", "40", "tracks", ";", "10", "min", ",", "32", "tracks", ";", "30", "min", ",", "25", "tracks", ";", "60", "min", ",", "21", "tracks", ".", "(", "D", "-", "F", ")", "Displacement", "of", "P", ".", "berghei", "(", "D", ")", ",", "P", ".", "yoelii", "(", "E", ")", "and", "P", ".", "falciparum", "(", "F", ")", "sporozoites", "5", "-", "120", "min", "after", "inoculation", "in", "box", "and", "whisker", "plots", "with", "whiskers", "displaying", "the", "10", "-", "90", "percentiles", "and", "values", "below", "and", "above", "the", "whiskers", "shown", "individually", ".", "Horizontal", "lines", "show", "median", "displacement", "at", "each", "time", "point", ".", "Percentage", "values", "in", "boxes", "indicate", "the", "fraction", "of", "tracks", "displacing", "over", "75", "micrometers", "at", "each", "time", "point", ".", "Within", "a", "given", "species", ",", "the", "difference", "in", "sporozoite", "displacement", "between", "5", "min", "and", "120", "min", "is", "statistically", "significant", "(", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", ":", "P", ".", "berghei", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "P", ".", "yoelii", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "P", ".", "falciparum", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "Comparisons", "between", "species", "showed", "no", "statistically", "significant", "difference", "in", "displacements", "for", "any", "given", "time", "point", ",", "with", "the", "exception", "of", "the", "10", "min", "time", "point", "in", "which", "there", "was", "a", "significant", "difference", "between", "P", ".", "berghei", "and", "P", ".", "falciparum", "(", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "For", "panels", "(", "D", "-", "F", ")", ",", "a", "varying", "number", "of", "videos", "were", "processed", "for", "each", "time", "point", "after", "inoculation", ":", "(", "D", ")", "Same", "dataset", "as", "used", "for", "Figure", "2D", ":", "5", "min", "(", "3", "videos", "/", "203", "tracks", ")", ",", "10", "min", "(", "6", "videos", "/", "292", "tracks", ")", ",", "20", "min", "(", "4", "videos", "/", "184", "tracks", ")", ",", "30", "min", "(", "6", "videos", "/", "235", "tracks", ")", ",", "60", "min", "(", "7", "videos", "/", "162", "tracks", ")", "and", "120", "min", "(", "6", "videos", "/", "151", "tracks", ")", ".", "(", "E", ")", "5", "min", "(", "7", "videos", "/", "714", "tracks", ")", ",", "10", "min", "(", "16", "videos", "/", "1514", "tracks", ")", ",", "20", "min", "(", "4", "videos", "/", "415", "tracks", ")", ",", "30", "min", "(", "4", "videos", "/", "319", "tracks", ")", ",", "60", "min", "(", "4", "videos", "/", "255", "tracks", ")", ",", "and", "120", "min", "(", "4", "videos", "/", "180", "tracks", ")", ".", "(", "F", ")", "5", "min", "(", "6", "videos", "/", "389", "tracks", ")", ",", "10", "min", "(", "6", "videos", "/", "464", "tracks", ")", ",", "20", "min", "(", "3", "videos", "/", "184", "tracks", ")", ",", "30", "min", "(", "2", "videos", "/", "195", "tracks", ")", ",", "60", "min", "(", "2", "videos", "/", "239", "tracks", ")", ",", "and", "120", "min", "(", "2", "videos", "/", "103", "tracks", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3  (A-C) Tracks generated through automated tracking were plotted to a common origin to visualize parasite dispersal P. berghei (A), P. yoelii (B) and P. falciparum (C) at 5, 10, 30 and 60 min after intradermal inoculation. For each timepoint, the tracks are representative of the average displacement of the entire sporozoite population. Track numbers used for each timepoint were: 5 min, 40 tracks; 10 min, 32 tracks; 30 min, 25 tracks; 60 min, 21 tracks. (D-F) Displacement of P. berghei (D), P. yoelii (E) and P. falciparum (F) sporozoites 5-120 min after inoculation in box and whisker plots with whiskers displaying the 10-90 percentiles and values below and above the whiskers shown individually. Horizontal lines show median displacement at each time point. Percentage values in boxes indicate the fraction of tracks displacing over 75 micrometers at each time point. Within a given species, the difference in sporozoite displacement between 5 min and 120 min is statistically significant (Kruskal-Wallis test: P. berghei p<0.0001, P. yoelii p<0.0001, P. falciparum p<0.01). Comparisons between species showed no statistically significant difference in displacements for any given time point, with the exception of the 10 min time point in which there was a significant difference between P. berghei and P. falciparum (Kruskal-Wallis test, *p<0.05). For panels (D-F), a varying number of videos were processed for each time point after inoculation: (D) Same dataset as used for Figure 2D: 5 min (3 videos/203 tracks), 10 min (6 videos/292 tracks), 20 min (4 videos/184 tracks), 30 min (6 videos/235 tracks), 60 min (7 videos/162 tracks) and 120 min (6 videos/151 tracks). (E) 5 min (7 videos/714 tracks), 10 min (16 videos/1514 tracks), 20 min (4 videos/415 tracks), 30 min (4 videos/319 tracks), 60 min (4 videos/255 tracks), and 120 min (4 videos/180 tracks). (F) 5 min (6 videos/389 tracks), 10 min (6 videos/464 tracks), 20 min (3 videos/184 tracks), 30 min (2 videos/195 tracks), 60 min (2 videos/239 tracks), and 120 min (2 videos/103 tracks). "}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Speed", "of", "P", ".", "berghei", ",", "P", ".", "yoelii", "and", "P", ".", "falciparum", "sporozoites", "5", "-", "120", "min", "after", "inoculation", "in", "box", "and", "whisker", "plots", "with", "whiskers", "displaying", "the", "10", "-", "90", "percentiles", "and", "values", "below", "and", "above", "the", "whiskers", "shown", "individually", ".", "Horizontal", "lines", "show", "the", "median", "speed", "at", "each", "time", "point", ".", "Comparisons", "among", "the", "species", "showed", "statistically", "significant", "difference", "in", "sporozoite", "speeds", "at", "the", "20", "min", "time", "point", "(", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "for", "both", "comparisons", ")", "and", "the", "120", "min", "time", "point", "(", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "006", "for", "both", "comparisons", ")", ".", "(", "B", ")", "Linear", "regression", "of", "apparent", "speed", "shows", "a", "more", "rapid", "decrease", "for", "P", ".", "berghei", "(", "slope", "=", "-", "0", ".", "005", ")", "than", "for", "P", ".", "yoelii", "and", "P", ".", "falciparum", "(", "slopes", "=", "-", "0", ".", "002", ")", ".", "Symbols", "indicate", "mean", "values", "+", "/", "-", "standard", "deviation", ".", "A", "varying", "number", "of", "videos", "were", "processed", "for", "each", "time", "point", "after", "inoculation", ",", "using", "the", "same", "data", "set", "used", "for", "Figure", "3", ":", "P", ".", "berghei", ";", "5", "min", "(", "3", "videos", "/", "203", "tracks", ")", ",", "10", "min", "(", "6", "videos", "/", "292", "tracks", ")", ",", "20", "min", "(", "4", "videos", "/", "184", "tracks", ")", ",", "30", "min", "(", "6", "videos", "/", "235", "tracks", ")", ",", "60", "min", "(", "7", "videos", "/", "162", "tracks", ")", ",", "and", "120", "min", "(", "6", "videos", "/", "151", "tracks", ")", ".", "P", ".", "yoelii", ";", "5", "min", "(", "7", "videos", "/", "714", "tracks", ")", ",", "10", "min", "(", "16", "videos", "/", "1514", "tracks", ")", ",", "20", "min", "(", "4", "videos", "/", "415", "tracks", ")", ",", "30", "min", "(", "4", "videos", "/", "319", "tracks", ")", ",", "60", "min", "(", "4", "videos", "/", "255", "tracks", ")", ",", "and", "120", "min", "(", "4", "videos", "/", "180", "tracks", ")", ".", "P", ".", "falciparum", ";", "5", "min", "(", "6", "videos", "/", "389", "tracks", ")", ",", "10", "min", "(", "6", "videos", "/", "464", "tracks", ")", ",", "20", "min", "(", "3", "videos", "/", "184", "tracks", ")", ",", "30", "min", "(", "2", "videos", "/", "195", "tracks", ")", ",", "60", "min", "(", "2", "videos", "/", "239", "tracks", ")", ",", "and", "120", "min", "(", "2", "videos", "/", "103", "tracks", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4 (A) Speed of P. berghei, P. yoelii and P. falciparum sporozoites 5-120 min after inoculation in box and whisker plots with whiskers displaying the 10-90 percentiles and values below and above the whiskers shown individually. Horizontal lines show the median speed at each time point. Comparisons among the species showed statistically significant difference in sporozoite speeds at the 20 min time point (Kruskal-Wallis test, ****p<0.0001 for both comparisons) and the 120 min time point (Kruskal-Wallis test, **p<0.006 for both comparisons). (B) Linear regression of apparent speed shows a more rapid decrease for P. berghei (slope = -0.005) than for P. yoelii and P. falciparum (slopes = -0.002). Symbols indicate mean values +/- standard deviation. A varying number of videos were processed for each time point after inoculation, using the same data set used for Figure 3: P. berghei; 5 min (3 videos/203 tracks), 10 min (6 videos/292 tracks), 20 min (4 videos/184 tracks), 30 min (6 videos/235 tracks), 60 min (7 videos/162 tracks), and 120 min (6 videos/151 tracks). P. yoelii; 5 min (7 videos/714 tracks), 10 min (16 videos/1514 tracks), 20 min (4 videos/415 tracks), 30 min (4 videos/319 tracks), 60 min (4 videos/255 tracks), and 120 min (4 videos/180 tracks). P. falciparum; 5 min (6 videos/389 tracks), 10 min (6 videos/464 tracks), 20 min (3 videos/184 tracks), 30 min (2 videos/195 tracks), 60 min (2 videos/239 tracks), and 120 min (2 videos/103 tracks). "}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "The", "number", "of", "motile", "and", "non", "-", "motile", "sporozoites", "moving", "in", "the", "dermis", "of", "mice", "was", "manually", "counted", "in", "time", "courses", "spanning", "120", "minutes", "and", "is", "displayed", "as", "a", "percentage", "of", "total", "sporozoites", "observed", "5", "min", "after", "inoculation", ",", "for", "P", ".", "berghei", "(", "left", "panel", ")", ",", "P", ".", "yoelii", "(", "center", "panel", ")", ",", "and", "P", ".", "falciparum", "(", "right", "panel", ")", ".", "(", "B", ")", "Fold", "-", "change", "in", "the", "number", "of", "motile", "sporozoites", "at", "60", "and", "120", "min", "post", "-", "inoculation", "compared", "to", "the", "number", "of", "motile", "sporozoites", "at", "5", "min", ".", "The", "data", "shown", "only", "includes", "complete", "imaging", "sessions", "over", "120", "min", "after", "intradermal", "injection", "of", "sporozoites", ".", "(", "P", ".", "berghei", ":", "n", "=", "2", ",", "P", ".", "yoelii", "n", "=", "4", ",", "P", ".", "falciparum", "n", "=", "2", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5  (A) The number of motile and non-motile sporozoites moving in the dermis of mice was manually counted in time courses spanning 120 minutes and is displayed as a percentage of total sporozoites observed 5 min after inoculation, for P. berghei (left panel), P. yoelii (center panel), and P. falciparum (right panel). (B) Fold-change in the number of motile sporozoites at 60 and 120 min post-inoculation compared to the number of motile sporozoites at 5 min. The data shown only includes complete imaging sessions over 120 min after intradermal injection of sporozoites. (P. berghei: n=2, P. yoelii n=4, P. falciparum n=2). "}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Maximum", "intensity", "projection", "shows", "trajectories", "of", "moving", "P", ".", "berghei", ",", "P", ".", "yoelii", "and", "P", ".", "falciparum", "sporozoites", "(", "green", ")", ",", "engaging", "with", "CD31", "-", "labeled", "vascular", "endothelia", "(", "magenta", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "25", "μm", ".", "See", "movies", "EV4", "-", "EV6", ".", "(", "B", ")", "Lymphatic", "and", "blood", "vessel", "invasion", "of", "P", ".", "berghei", ",", "P", ".", "yoelii", "and", "P", ".", "falciparum", "sporozoites", "moving", "in", "mouse", "dermis", ".", "Combined", "invasion", "events", "observed", "in", "4", "min", "videos", "recorded", "at", "5", ",", "10", "and", "20", "min", "after", "intradermal", "injection", "of", "sporozoites", "(", "left", "panel", ")", "and", "60", "and", "120", "min", "after", "intradermal", "injection", "(", "right", "panel", ")", ".", "n", "=", "number", "of", "videos", "scored", "for", "each", "Plasmodium", "species", ".", "To", "view", "a", "blood", "vessel", "entry", "event", "by", "P", ".", "yoelii", "or", "P", ".", "falciparum", ",", "see", "movies", "EV7", "and", "EV8", ".", "There", "were", "no", "statistically", "significant", "differences", "in", "lymphatic", "or", "blood", "vessel", "entry", "among", "the", "three", "Plasmodium", "species", "at", "5", "to", "20", "min", "after", "sporozoite", "inoculation", "whereas", "there", "was", "a", "statistically", "significant", "increase", "in", "lymphatic", "entry", "by", "P", ".", "falciparum", "sporozoites", "compared", "to", "P", ".", "berghei", "and", "P", ".", "yoelii", "sporozoites", "at", "60", "to", "120", "min", "after", "inoculation", "(", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6 (A) Maximum intensity projection shows trajectories of moving P. berghei, P. yoelii and P. falciparum sporozoites (green), engaging with CD31-labeled vascular endothelia (magenta). Scale bars, 25 μm. See movies EV4 - EV6. (B) Lymphatic and blood vessel invasion of P. berghei, P. yoelii and P. falciparum sporozoites moving in mouse dermis. Combined invasion events observed in 4 min videos recorded at 5, 10 and 20 min after intradermal injection of sporozoites (left panel) and 60 and 120 min after intradermal injection (right panel). n = number of videos scored for each Plasmodium species. To view a blood vessel entry event by P. yoelii or P. falciparum, see movies EV7 and EV8. There were no statistically significant differences in lymphatic or blood vessel entry among the three Plasmodium species at 5 to 20 min after sporozoite inoculation whereas there was a statistically significant increase in lymphatic entry by P. falciparum sporozoites compared to P. berghei and P. yoelii sporozoites at 60 to 120 min after inoculation (Kruskal-Wallis test, p<0.05). "}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Maximum", "intensity", "projection", "of", "video", "acquired", "10", "min", "after", "inoculation", "of", "P", ".", "falciparum", "sporozoites", "visualizes", "trajectories", "of", "parasites", ",", "engaging", "with", "CD31", "-", "labeled", "vascular", "endothelia", "(", "magenta", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "See", "movie", "EV9", ".", "(", "B", ")", "Displacement", "of", "sporozoites", "5", "to", "60", "min", "after", "inoculation", ".", "Data", "is", "displayed", "in", "box", "and", "whisker", "plots", "with", "whiskers", "showing", "the", "10", "to", "90", "percentiles", "and", "values", "below", "and", "above", "the", "whiskers", "shown", "individually", ".", "Horizontal", "lines", "show", "the", "median", "at", "each", "time", "point", ".", "Percentage", "values", "indicate", "the", "fraction", "of", "tracks", "displacing", "over", "75", "microns", ".", "(", "C", ")", "Apparent", "speed", "of", "sporozoites", "5", "to", "60", "min", "after", "inoculation", ".", "Data", "is", "displayed", "in", "box", "and", "whisker", "plots", "with", "whiskers", "showing", "10", "to", "90", "percentiles", "and", "values", "below", "and", "above", "the", "whiskers", "shown", "individually", ".", "Horizontal", "lines", "show", "the", "median", "speed", "at", "each", "time", "point", ".", "For", "panels", "B", "-", "C", ",", "data", "shown", "originates", "from", "the", "analysis", "of", "3", "-", "4", "videos", "per", "time", "point", "and", "a", "varying", "number", "of", "tracks", "were", "processed", "for", "each", "time", "point", "after", "inoculation", ":", "5", "min", "(", "157", "tracks", ")", ",", "10", "min", "(", "568", "tracks", ")", ",", "20", "min", "(", "286", "tracks", ")", ",", "30", "min", "(", "171", "tracks", ")", ",", "60", "min", "(", "101", "tracks", ")", ".", "No", "motile", "sporozoites", "were", "observed", "120", "min", "after", "inoculation", ".", "(", "D", ")", "Proportion", "of", "motile", "and", "non", "-", "motile", "sporozoites", "was", "manually", "counted", "and", "is", "displayed", "as", "percentage", "of", "sporozoites", "observed", "5", "min", "after", "inoculation", ".", "The", "data", "shown", "was", "obtained", "from", "one", "complete", "imaging", "session", "over", "120", "min", "after", "intradermal", "injection", "of", "sporozoites", ".", "(", "E", ")", "Sporozoite", "track", "straightness", ",", "the", "ratio", "of", "displacement", "to", "track", "length", "of", "P", ".", "falciparum", "sporozoites", "moving", "in", "mouse", "dermis", ",", "human", "skin", "ex", "vivo", ",", "and", "human", "skin", "graft", ",", "at", "5", "-", "10", "min", "post", "intradermal", "injection", ".", "Data", "is", "displayed", "in", "box", "and", "whisker", "plots", "with", "horizontal", "line", "showing", "the", "median", "and", "the", "whiskers", "extending", "to", "the", "minimum", "and", "maximum", "values", ".", "Comparisons", "showed", "statistically", "significant", "differences", "in", "track", "straightness", "between", "the", "human", "skin", "graft", "and", "both", "mouse", "skin", "(", "*", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0001", ")", "and", "human", "skin", "ex", "vivo", "(", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ")", "using", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "A", "varying", "number", "of", "tracks", "were", "processed", "for", "each", "environment", ":", "mouse", "skin", ":", "17", "videos", ",", "822", "tracks", ";", "human", "skin", "ex", "vivo", ":", "12", "videos", ",", "761", "tracks", ";", "human", "skin", "graft", ":", "9", "videos", ",", "718", "tracks", ".", "(", "F", ")", "P", ".", "falciparum", "sporozoites", "engage", "with", "and", "enter", "blood", "vessels", "in", "human", "skin", "graft", ".", "Maximum", "intensity", "projection", "shows", "trajectories", "of", "moving", "P", ".", "falciparum", "sporozoites", "(", "green", ")", ",", "engaging", "with", "human", "CD31", "-", "labeled", "vascular", "endothelia", "(", "magenta", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "25", "μm", ".", "See", "movie", "EV10", ".", "Graph", "shows", "lymphatic", "and", "blood", "vessel", "entry", "events", "of", "P", ".", "falciparum", "sporozoites", "in", "human", "skin", "graft", ".", "Combined", "invasion", "events", "observed", "at", "5", "-", "20", "min", "after", "intradermal", "injection", "in", "n", "number", "of", "videos", ".", "To", "view", "a", "blood", "vessel", "invasion", "event", "P", ".", "falciparum", "in", "human", "skin", "graft", ","], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7 (A) Maximum intensity projection of video acquired 10 min after inoculation of P. falciparum sporozoites visualizes trajectories of parasites, engaging with CD31-labeled vascular endothelia (magenta). Scale bar, 50 μm. See movie EV9. (B) Displacement of sporozoites 5 to 60 min after inoculation. Data is displayed in box and whisker plots with whiskers showing the 10 to 90 percentiles and values below and above the whiskers shown individually. Horizontal lines show the median at each time point. Percentage values indicate the fraction of tracks displacing over 75 microns. (C) Apparent speed of sporozoites 5 to 60 min after inoculation. Data is displayed in box and whisker plots with whiskers showing 10 to 90 percentiles and values below and above the whiskers shown individually. Horizontal lines show the median speed at each time point. For panels B-C, data shown originates from the analysis of 3-4 videos per time point and a varying number of tracks were processed for each time point after inoculation: 5 min (157 tracks), 10 min (568 tracks), 20 min (286 tracks), 30 min (171 tracks), 60 min (101 tracks). No motile sporozoites were observed 120 min after inoculation. (D) Proportion of motile and non-motile sporozoites was manually counted and is displayed as percentage of sporozoites observed 5 min after inoculation. The data shown was obtained from one complete imaging session over 120 min after intradermal injection of sporozoites.  (E) Sporozoite track straightness, the ratio of displacement to track length of P. falciparum sporozoites moving in mouse dermis, human skin ex vivo, and human skin graft, at 5-10 min post intradermal injection. Data is displayed in box and whisker plots with horizontal line showing the median and the whiskers extending to the minimum and maximum values. Comparisons showed statistically significant differences in track straightness between the human skin graft and both mouse skin (****p=0.0001) and human skin ex vivo (****p<0.0001) using Tukey's multiple comparisons test. A varying number of tracks were processed for each environment: mouse skin: 17 videos, 822 tracks; human skin ex vivo: 12 videos, 761 tracks; human skin graft: 9 videos, 718 tracks.  (F) P. falciparum sporozoites engage with and enter blood vessels in human skin graft. Maximum intensity projection shows trajectories of moving P. falciparum sporozoites (green), engaging with human CD31-labeled vascular endothelia (magenta). Scale bar, 25 μm. See movie EV10. Graph shows lymphatic and blood vessel entry events of P. falciparum sporozoites in human skin graft. Combined invasion events observed at 5-20 min after intradermal injection in n number of videos. To view a blood vessel invasion event P. falciparum in human skin graft, "}
{"words": ["Figure", "8", "(", "A", ")", "Activity", "of", "mAb", "2A10", "on", "sporozoite", "speed", "and", "displacement", ":", "Data", "are", "displayed", "in", "box", "and", "whisker", "plots", "with", "whiskers", "displaying", "the", "10", "to", "90", "percentiles", "and", "values", "below", "and", "above", "the", "whiskers", "shown", "individually", ".", "Horizontal", "lines", "show", "the", "median", ".", "For", "the", "displacement", "data", ",", "percentage", "values", "indicate", "the", "fraction", "of", "tracks", "displacing", "over", "75", "microns", ".", "Statistical", "analysis", ":", "Mann", "-", "Whitney", ",", "p", "=", "0", ".", "0001", "(", "speed", "data", ")", "and", "p", "=", "0", ".", "0098", "(", "displacement", "data", ")", ".", "Data", "shown", "originates", "from", "the", "analysis", "of", "5", "videos", "obtained", "at", "5", "separate", "imaging", "sessions", ",", "which", "generated", "a", "total", "number", "of", "217", "(", "naïve", ")", "and", "136", "(", "2A10", ")", "sporozoite", "tracks", ".", "(", "B", ")", "Activity", "of", "mAb", "2A10", "on", "the", "proportion", "of", "motile", "sporozoites", "(", "left", "panel", ")", "and", "blood", "vessel", "entry", "(", "right", "panel", ")", ".", "Four", "-", "minute", "videos", "of", "mice", "inoculated", "with", "mAb", "2A10", "and", "naïve", "controls", "were", "manually", "counted", "at", "10", "min", "post", "P", ".", "falciparum", "sporozoite", "inoculation", ".", "5", "videos", "for", "each", "condition", ",", "from", "5", "independent", "imaging", "sessions", "were", "scored", "for", "motility", ".", "4", "videos", "per", "condition", "from", "4", "independent", "imaging", "sessions", "were", "analyzed", "for", "blood", "vessel", "entry", ".", "Statistical", "analysis", ":", "Percent", "motile", ",", "Mann", "-", "Whitney", ",", "p", "=", "0", ".", "0317", ";", "Blood", "vessel", "entry", ",", "Fisher", "'", "s", "exact", "test", ",", "p", "=", "0", ".", "0163", "(", "C", ")", "Activity", "of", "human", "mAbs", "10", "and", "CIS43", ",", "specific", "for", "P", ".", "falciparum", "CSP", ",", "and", "VRC01", ",", "an", "isotype", "control", "human", "mAb", "specific", "for", "HIV", "-", "1", ",", "on", "the", "proportion", "of", "motile", "sporozoites", "(", "left", "panel", ")", "and", "blood", "vessel", "entry", "(", "right", "panel", ")", ".", "Four", "-", "minute", "videos", "of", "mice", "inoculated", "with", "the", "indicated", "mAbs", "were", "taken", "10", "min", "after", "sporozoite", "inoculation", "and", "manually", "counted", ".", "Data", "are", "pooled", "from", "7", "biological", "replicates", ",", "naïve", "and", "VRC01", "(", "n", "=", "2", ")", ",", "naïve", "and", "mAb", "10", "(", "n", "=", "2", ")", ",", "VRC01", "and", "CIS43", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "No", "comparisons", "were", "statistically", "significant", "(", "Mann", "-", "Whitney", "for", "percent", "motile", "and", "Fisher", "'", "s", "exact", "test", "for", "blood", "vessel", "entry", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8 (A) Activity of mAb 2A10 on sporozoite speed and displacement: Data are displayed in box and whisker plots with whiskers displaying the 10 to 90 percentiles and values below and above the whiskers shown individually. Horizontal lines show the median. For the displacement data, percentage values indicate the fraction of tracks displacing over 75 microns. Statistical analysis: Mann-Whitney, p=0.0001 (speed data) and p=0.0098 (displacement data). Data shown originates from the analysis of 5 videos obtained at 5 separate imaging sessions, which generated a total number of 217 (naïve) and 136 (2A10) sporozoite tracks.  (B) Activity of mAb 2A10 on the proportion of motile sporozoites (left panel) and blood vessel entry (right panel). Four-minute videos of mice inoculated with mAb 2A10 and naïve controls were manually counted at 10 min post P. falciparum sporozoite inoculation. 5 videos for each condition, from 5 independent imaging sessions were scored for motility. 4 videos per condition from 4 independent imaging sessions were analyzed for blood vessel entry. Statistical analysis: Percent motile, Mann-Whitney, p=0.0317; Blood vessel entry, Fisher's exact test, p=0.0163   (C) Activity of human mAbs 10 and CIS43, specific for P. falciparum CSP, and VRC01, an isotype control human mAb specific for HIV-1, on the proportion of motile sporozoites (left panel) and blood vessel entry (right panel). Four-minute videos of mice inoculated with the indicated mAbs were taken 10 min after sporozoite inoculation and manually counted. Data are pooled from 7 biological replicates, naïve and VRC01 (n=2), naïve and mAb 10 (n=2), VRC01 and CIS43 (n=3). No comparisons were statistically significant (Mann-Whitney for percent motile and Fisher's exact test for blood vessel entry). "}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Analysis", "of", "the", "single", "-", "cell", "transcriptomics", "dataset", "for", "the", "mouse", "visual", "cortex", "(", "Tasic", "et", "al", ",", "2016", ")", "revealed", "that", "the", "expression", "of", "the", "metabolism", "-", "associated", "gene", "Cox6a2", "is", "highly", "restricted", "to", "PV", "+", "interneurons", ".", "Cox6a2", "is", "expressed", "in", "all", "subtypes", "of", "PV", "+", "interneurons", "(", "marked", "in", "blue", "color", ")", "but", "rarely", "detected", "in", "other", "neuronal", "subtypes", "from", "the", "mouse", "visual", "cortex", ".", "Cox6a1", ",", "which", "encodes", "the", "other", "protein", "isoform", "of", "COX6A", ",", "is", "expressed", "in", "all", "subtypes", ".", "(", "B", "RT", "-", "PCR", "showing", "expression", "of", "Cox6a2", "in", "the", "brain", "and", "heart", ".", "C", ")", "Western", "-", "blot", "showing", "expression", "of", "Cox6a2", "in", "the", "brain", "and", "heart", ".", "(", "D", ")", "Western", "-", "blot", "analysis", "showed", "that", "COX6A2", "is", "first", "detected", "in", "the", "brain", "at", "postnatal", "day", "0", "(", "P0", ")", ".", "Then", ",", "COX6A2", "protein", "levels", "gradually", "increase", "until", "P60", ".", "COX6A2", "immunoreactivity", "is", "detected", "in", "PV", "+", "interneurons", "in", "different", "brain", "areas", "of", "adult", "mice", ",", "including", "the", "cortex", "(", "general", "overview", "in", "E", ",", "and", "single", "PV", "+", "interneuron", "magnification", "in", "F", ")", "White", "arrowheads", "indicate", "PV", "/", "Cox6a2", "double", "positive", "cells", ".", "COX6A2", "immunoreactivity", "is", "detected", "in", "PV", "+", "interneurons", "in", "hippocampus", "(", "G", ")", "and", "striatum", "(", "H", ")", ".", "White", "arrowheads", "indicate", "PV", "/", "Cox6a2", "double", "positive", "cells", ".", "(", "I", ",", "J", ")", "Quantifications", "showing", "almost", "100", "%", "of", "co", "-", "localization", "of", "COX6A2", "+", "cells", "and", "PV", "+", "cells", "in", "the", "somatosensory", "(", "SS", ")", "and", "motor", "(", "MT", ")", "cortices", ",", "and", "the", "hippocampus", "(", "HI", ")", "of", "adult", "mice", "(", "n", "animals", "=", "4", ",", "2", "months", "old", ",", "n", "sections", "=", "24", "SS", ",", "16", "MT", ",", "8", "HI", ")", ".", "(", "K", ")", "COX6A2", "immunoreactivity", "in", "the", "cortex", "at", "P9", "(", "n", "animals", "=", "2", ",", "n", "sections", "=", "12", "SS", ",", "8", "MT", ",", "4", "HI", ")", ".", "White", "arrowheads", "indicate", "Cox6a2", "positive", "cells", ".", "(", "L", "-", "N", ")", "As", "soon", "as", "parvalbumin", "immunoreactivity", "becomes", "visible", "at", "P13", ",", "almost", "100", "%", "of", "PV", "+", "cells", "are", "co", "-", "labelled", "with", "COX6A2", "immunoreactivity", "in", "the", "SS", "and", "MT", "cortices", ",", "and", "the", "HI", "of", "P13", "mice", "(", "n", "=", "2", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Analysis of the single-cell transcriptomics dataset for the mouse visual cortex (Tasic et al, 2016) revealed that the expression of the metabolism-associated gene Cox6a2 is highly restricted to PV+ interneurons. Cox6a2 is expressed in all subtypes of PV+ interneurons (marked in blue color) but rarely detected in other neuronal subtypes from the mouse visual cortex. Cox6a1, which encodes the other protein isoform of COX6A, is expressed in all subtypes.(B RT-PCR showing expression of Cox6a2 in the brain and heart.C) Western-blot showing expression of Cox6a2 in the brain and heart.(D) Western-blot analysis showed that COX6A2 is first detected in the brain at postnatal day 0 (P0). Then, COX6A2 protein levels gradually increase until P60.COX6A2 immunoreactivity is detected in PV+ interneurons in different brain areas of adult mice, including the cortex (general overview in E, and single PV+ interneuron magnification in F) White arrowheads indicate PV/Cox6a2 double positive cells.COX6A2 immunoreactivity is detected in PV+ interneurons in hippocampus (G) and striatum (H). White arrowheads indicate PV/Cox6a2 double positive cells.(I,J) Quantifications showing almost 100% of co-localization of COX6A2+ cells and PV+ cells in the somatosensory (SS) and motor (MT) cortices, and the hippocampus (HI) of adult mice (n animals=4, 2 months old, n sections=24 SS, 16 MT, 8 HI).(K) COX6A2 immunoreactivity in the cortex at P9 (n animals=2, n sections=12 SS, 8 MT, 4 HI). White arrowheads indicate Cox6a2 positive cells.(L-N) As soon as parvalbumin immunoreactivity becomes visible at P13, almost 100% of PV+ cells are co-labelled with COX6A2 immunoreactivity in the SS and MT cortices, and the HI of P13 mice (n=2)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ",", "B", ")", "COX6A2", "immunoreactivity", "is", "virtually", "restricted", "to", "PV", "+", "interneurons", "in", "the", "somatosensory", "(", "SS", ")", "and", "motor", "(", "MT", ")", "cortices", ",", "and", "the", "hippocampus", "(", "HI", ")", "of", "adult", "rat", "(", "n", "animals", "=", "1", ",", "2", ".", "5", "months", "old", ",", "n", "sections", "=", "12", "SS", ",", "8", "MT", ",", "4", "HI", ")", ".", "White", "arrowheads", "indicate", "PV", "/", "Cox6a2", "double", "positive", "cells", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "In", "the", "SS", "of", "adult", "rhesus", "monkey", ",", "COX6A2", "immunoreactivity", "is", "present", "exclusively", "in", "PV", "+", "cells", "(", "n", "animals", "=", "1", ",", "1", "-", "year", "-", "old", ",", "n", "sections", "=", "6", ")", ".", "White", "arrowheads", "indicate", "PV", "/", "Cox6a2", "double", "positive", "cells", ".", "(", "E", ",", "F", ")", "In", "adult", "humans", ",", "all", "cortical", "PV", "+", "interneurons", "from", "Brodmann", "areas", "9", "and", "10", "(", "BA9", "and", "BA10", ")", "are", "co", "-", "labelled", "with", "COX6A2", "immunoreactivity", ".", "However", ",", "PV", "+", "interneurons", "only", "represent", "60", "%", "of", "the", "cells", "in", "which", "COX6A2", "is", "detected", "(", "n", "human", "subjects", "=", "2", ",", "59", "-", "and", "69", "-", "year", "-", "old", ",", "n", "sections", "=", "6", "BA9", ",", "6", "BA10", ")", ".", "White", "arrowheads", "indicate", "PV", "/", "Cox6a2", "double", "positive", "cells", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A,B) COX6A2 immunoreactivity is virtually restricted to PV+ interneurons in the somatosensory (SS) and motor (MT) cortices, and the hippocampus (HI) of adult rat (n animals=1, 2.5 months old, n sections=12 SS, 8 MT, 4 HI). White arrowheads indicate PV/Cox6a2 double positive cells.(C,D) In the SS of adult rhesus monkey, COX6A2 immunoreactivity is present exclusively in PV+ cells (n animals=1, 1-year-old, n sections=6). White arrowheads indicate PV/Cox6a2 double positive cells.(E,F) In adult humans, all cortical PV+ interneurons from Brodmann areas 9 and 10 (BA9 and BA10) are co-labelled with COX6A2 immunoreactivity. However, PV+ interneurons only represent 60% of the cells in which COX6A2 is detected (n human subjects=2, 59- and 69-year-old, n sections=6 BA9, 6 BA10). White arrowheads indicate PV/Cox6a2 double positive cells."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Images", "showing", "absence", "of", "COX6A2", "immunoreactivity", "in", "the", "cortex", "of", "Cox6a2", "-", "/", "-", "mice", ".", "(", "B", ",", "C", ")", "Parvalbumin", "immunoreactivity", "in", "PV", "+", "interneurons", "was", "significantly", "decreased", "in", "the", "somatosensory", "cortex", "of", "Cox6a2", "-", "/", "-", "mice", "compared", "to", "wild", "-", "types", "(", "n", "=", "4", "WT", ",", "4", "Cox6a2", "-", "/", "-", ";", "2", "-", "month", "-", "old", ")", ".", "C", ":", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "(", "D", ")", "In", "Cox6a2", "-", "/", "-", "mice", ",", "cortical", "PV", "+", "interneurons", "showed", "a", "fewer", "number", "of", "synapses", "innervating", "principal", "neurons", "(", "n", "=", "3", "WT", ",", "3", "Cox6a2", "-", "/", "-", ";", "2", "-", "month", "-", "old", ")", ".", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "(", "E", ")", "To", "analyze", "changes", "in", "oxidative", "stress", "in", "PV", "+", "interneurons", ",", "the", "somatosensory", "and", "motor", "cortices", "of", "WT", "and", "Cox6a2", "-", "/", "-", "mice", "were", "stained", "with", "an", "antibody", "against", "8", "-", "OHdG", ",", "a", "marker", "of", "oxidative", "DNA", "damage", ".", "(", "F", ")", "8", "-", "OHdG", "immunoreactivity", "was", "significantly", "higher", "in", "PV", "+", "null", "in", "both", "cortices", "in", "Cox6a2", "-", "/", "-", "mice", "(", "n", "=", "4", "WT", ",", "4", "Cox6a2", "-", "/", "-", ";", "2", "-", "month", "-", "old", ")", ".", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "Mann", "-", "Whitney", "tests", ".", "(", "G", ")", "The", "density", "of", "PNNs", "around", "PV", "+", "interneurons", "residing", "in", "the", "somatosensory", "and", "motor", "cortices", "was", "analyzed", "by", "measuring", "the", "immunoreactivity", "of", "WFA", "that", "stains", "PNNs", ".", "(", "H", ")", "WFA", "immunoreactivity", "around", "PV", "+", "cells", "was", "lower", "in", "both", "cortices", "in", "Cox6a2", "-", "/", "-", "mice", "(", "n", "=", "4", "WT", ",", "4", "Cox6a2", "-", "/", "-", ";", "2", "-", "month", "-", "old", ")", ".", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "Mann", "-", "Whitney", "tests", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Images showing absence of COX6A2 immunoreactivity in the cortex of Cox6a2-/- mice.(B,C) Parvalbumin immunoreactivity in PV+ interneurons was significantly decreased in the somatosensory cortex of Cox6a2-/- mice compared to wild-types (n=4 WT, 4 Cox6a2-/-; 2-month-old). C: two-tailed unpaired Student's t-test.(D) In Cox6a2-/- mice, cortical PV+ interneurons showed a fewer number of synapses innervating principal neurons (n=3 WT, 3 Cox6a2-/-; 2-month-old). Two-tailed unpaired Student's t-test.(E) To analyze changes in oxidative stress in PV+ interneurons, the somatosensory and motor cortices of WT and Cox6a2-/- mice were stained with an antibody against 8-OHdG, a marker of oxidative DNA damage. (F) 8-OHdG immunoreactivity was significantly higher in PV+ null in both cortices in Cox6a2-/- mice (n=4 WT, 4 Cox6a2-/-; 2-month-old). Two-tailed unpaired Mann-Whitney tests. (G) The density of PNNs around PV+ interneurons residing in the somatosensory and motor cortices was analyzed by measuring the immunoreactivity of WFA that stains PNNs. (H) WFA immunoreactivity around PV+ cells was lower in both cortices in Cox6a2-/- mice (n=4 WT, 4 Cox6a2-/-; 2-month-old). Two-tailed unpaired Mann-Whitney tests. "}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "PV", "+", "interneurons", "were", "sorted", "from", "cortices", "of", "PV", "-", "EGFP", "WT", "and", "Cox6a2", "-", "/", "-", "mice", "at", "P15", "and", "processed", "for", "bulk", "RNA", "sequencing", "(", "n", "=", "4", "WT", ",", "6", "Cox6a2", "-", "/", "-", ";", "P15", ")", ".", "Heatmap", "shows", "expression", "for", "top", "down", "-", "(", "red", ")", "and", "upregulated", "(", "blue", ")", "genes", "in", "Cox6a2", "-", "/", "-", "PV", "+", "interneurons", "relative", "to", "their", "WT", "counterparts", ".", "(", "B", ")", "Cox6a2", "expression", "was", "effectively", "abolished", "in", "Cox6a2", "-", "/", "-", "PV", "+", "interneurons", ".", "In", "addition", ",", "Cox6a2", "knockout", "led", "to", "a", "decreased", "expression", "of", "Gad1", "and", "Gad2", "genes", "(", "n", "=", "4", "WT", ",", "6", "Cox6a2", "-", "/", "-", ")", ".", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "Mann", "-", "Whitney", "tests", ".", "(", "C", ")", "Changes", "in", "expression", "of", "oxidative", "stress", "-", "related", "genes", "(", "green", ")", ",", "genes", "coding", "for", "AMPA", "receptors", "(", "orange", ")", ",", "sodium", "channels", "(", "red", ")", ",", "potassium", "channels", "(", "magenta", ")", ",", "and", "internal", "calcium", "signaling", "proteins", "(", "blue", ")", ".", "Color", "scale", "bars", "show", "normalized", "read", "counts", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) PV+ interneurons were sorted from cortices of PV-EGFP WT and Cox6a2-/- mice at P15 and processed for bulk RNA sequencing (n= 4 WT, 6 Cox6a2-/-; P15). Heatmap shows expression for top down- (red) and upregulated (blue) genes in Cox6a2-/- PV+ interneurons relative to their WT counterparts.(B) Cox6a2 expression was effectively abolished in Cox6a2-/- PV+ interneurons. In addition, Cox6a2 knockout led to a decreased expression of Gad1 and Gad2 genes (n= 4 WT, 6 Cox6a2-/-). Two-tailed unpaired Mann-Whitney tests.(C) Changes in expression of oxidative stress-related genes (green), genes coding for AMPA receptors (orange), sodium channels (red), potassium channels (magenta), and internal calcium signaling proteins (blue). Color scale bars show normalized read counts."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "D", ")", "Representative", "images", "of", "PV", "+", "interneurons", "from", "PV", "-", "CRE", "and", "PV", "-", "CRE", ";", "Cox6a2fl", "/", "fl", "mice", "showing", "PercevalHR", "fluorescence", "after", "excitation", "at", "930", "nm", "and", "840", "nm", ".", "White", "arrowheads", "indicate", "PercevalHR", "expressing", "cells", ".", "Scale", "bar", ":", "20", "μm", ".", "(", "E", ")", "PV", "+", "interneurons", "from", "PV", "-", "CRE", ";", "Cox6a2fl", "/", "fl", "mice", "exhibited", "significantly", "lower", "ATP", "-", "to", "-", "ADP", "ratios", "than", "PV", "+", "interneurons", "from", "PV", "-", "CRE", "mice", "throughout", "the", "entire", "duration", "of", "the", "recordings", "(", "23", "cells", "from", "4", "PV", "-", "CRE", "mice", ";", "15", "cells", "from", "6", "PV", "-", "CRE", ";", "Cox6a2", "-", "/", "-", "mice", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(D) Representative images of PV+ interneurons from PV-CRE and PV-CRE;Cox6a2fl/fl mice showing PercevalHR fluorescence after excitation at 930 nm and 840 nm. White arrowheads indicate PercevalHR expressing cells. Scale bar: 20 μm.(E) PV+ interneurons from PV-CRE;Cox6a2fl/fl mice exhibited significantly lower ATP-to-ADP ratios than PV+ interneurons from PV-CRE mice throughout the entire duration of the recordings (23 cells from 4 PV-CRE mice; 15 cells from 6 PV-CRE;Cox6a2-/- mice)."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ",", "B", ")", "The", "resting", "membrane", "potential", "and", "amplitude", "of", "action", "potentials", "in", "WT", "and", "Cox6a2", "-", "/", "-", "PV", "+", "interneurons", ",", "respectively", ".", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "The", "threshold", "for", "action", "potentials", "increased", "over", "maturation", "in", "WT", "but", "not", "in", "Cox6a2", "-", "/", "-", "PV", "+", "interneurons", ".", "As", "a", "result", ",", "the", "threshold", "for", "action", "potentials", "was", "significantly", "lower", "in", "P34", "-", "45", "Cox6a2", "-", "/", "-", "PV", "+", "interneurons", "when", "compared", "to", "their", "WT", "counterparts", ".", "D", ":", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", ".", "(", "E", ",", "F", ")", "Trains", "of", "action", "potentials", "were", "evoked", "by", "2", "sec", "depolarizing", "current", "pulses", ".", "The", "amplitude", "difference", "(", "difference", "between", "the", "mean", "amplitude", "of", "1st", "-", "10th", "action", "potentials", "and", "190th", "-", "200th", "action", "potentials", ")", "was", "significantly", "higher", "in", "P34", "-", "45", "Cox6a2", "-", "/", "-", "compared", "to", "WT", "PV", "+", "interneurons", ".", "In", "addition", ",", "the", "amplitude", "difference", "decreased", "with", "maturation", "in", "WT", "but", "not", "in", "Cox6a2", "-", "/", "-", "PV", "+", "interneurons", ".", "F", ":", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Mann", "-", "Whitney", "tests", ".", "(", "G", ")", "While", "in", "WT", "PV", "+", "interneurons", "the", "maximal", "firing", "frequency", "increased", "during", "maturation", ",", "such", "increase", "was", "abolished", "by", "Cox6a2", "knockout", ".", "Thus", ",", "maximal", "firing", "frequency", "reached", "during", "2", "sec", "depolarizing", "current", "pulses", "was", "lower", "in", "P34", "-", "45", "Cox6a2", "-", "/", "-", "compared", "to", "WT", "PV", "+", "interneurons", ".", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", ".", "(", "H", ")", "Recorded", "PV", "+", "interneurons", "were", "filled", "with", "biocytin", "and", "their", "dendritic", "morphology", "was", "reconstructed", "using", "Imaris", "software", ".", "Scale", "bars", ":", "30", "μm", ".", "(", "I", ",", "J", ")", "Cox6a2", "-", "/", "-", "PV", "+", "interneurons", "showed", "a", "negative", "correlation", "between", "age", "and", "dendritic", "length", "and", "between", "age", "and", "full", "branch", "depth", "(", "maximal", "number", "of", "branches", "between", "the", "soma", "and", "a", "terminal", "dendritic", "point", ")", ",", "which", "contrasted", "with", "the", "expected", "positive", "correlation", "between", "these", "parameters", "in", "WT", "PV", "+", "interneurons", ".", "Linear", "regression", "of", "Pearson", "correlation", ".", "(", "K", ",", "L", ")", "WT", "and", "Cox6a2", "-", "/", "-", "PV", "+", "interneurons", "showed", "similar", "values", "for", "dendritic", "length", "and", "full", "branch", "depth", "at", "P22", "-", "P33", ".", "However", ",", "at", "P34", "-", "P45", ",", "Cox6a2", "-", "/", "-", "PV", "+", "interneurons", "showed", "lower", "dendritic", "length", "and", "full", "branch", "depth", "than", "WT", "PV", "+", "interneurons", ".", "Two", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "tests", ".", "(", "M", ",", "N", ")", "While", "younger", "WT", "and", "Cox6a2", "-", "/", "-", "PV", "+", "interneurons", "have", "similar", "dendritic", "tree", "complexities", "(", "M", ")", ",", "at", "the", "later", "stage", "of", "maturation", "Cox6a2", "-", "/", "-", "PV", "+", "interneurons", "show", "a", "reduction", "in", "dendritic", "tree", "complexity", "in", "comparison", "to", "WT", "PV", "+", "interneurons", "(", "N", ")", ".", "Multiple", "t", "-", "tests", ",", "two", "-", "stage", "step", "-", "up", "method", "of", "Benjamini", ",", "Krieger", "and", "Yekutieli", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A,B) The resting membrane potential and amplitude of action potentials in WT and Cox6a2-/- PV+ interneurons, respectively. Two-tailed unpaired Student's t-tests.(C,D) The threshold for action potentials increased over maturation in WT but not in Cox6a2-/- PV+ interneurons. As a result, the threshold for action potentials was significantly lower in P34-45 Cox6a2-/- PV+ interneurons when compared to their WT counterparts. D: two-tailed unpaired Student's t-tests.(E,F) Trains of action potentials were evoked by 2 sec depolarizing current pulses. The amplitude difference (difference between the mean amplitude of 1st-10th action potentials and 190th-200th action potentials) was significantly higher in P34-45 Cox6a2-/- compared to WT PV+ interneurons. In addition, the amplitude difference decreased with maturation in WT but not in Cox6a2-/- PV+ interneurons. F: two-tailed unpaired Mann-Whitney tests.(G) While in WT PV+ interneurons the maximal firing frequency increased during maturation, such increase was abolished by Cox6a2 knockout. Thus, maximal firing frequency reached during 2 sec depolarizing current pulses was lower in P34-45 Cox6a2-/- compared to WT PV+ interneurons. Two-tailed unpaired Student's t-tests.(H) Recorded PV+ interneurons were filled with biocytin and their dendritic morphology was reconstructed using Imaris software. Scale bars: 30 μm.(I,J) Cox6a2-/- PV+ interneurons showed a negative correlation between age and dendritic length and between age and full branch depth (maximal number of branches between the soma and a terminal dendritic point), which contrasted with the expected positive correlation between these parameters in WT PV+ interneurons. Linear regression of Pearson correlation.(K,L) WT and Cox6a2-/- PV+ interneurons showed similar values for dendritic length and full branch depth at P22-P33. However, at P34-P45, Cox6a2-/- PV+ interneurons showed lower dendritic length and full branch depth than WT PV+ interneurons. Two-way ANOVA followed by Tukey's multiple comparisons tests.(M,N) While younger WT and Cox6a2-/- PV+ interneurons have similar dendritic tree complexities (M), at the later stage of maturation Cox6a2-/- PV+ interneurons show a reduction in dendritic tree complexity in comparison to WT PV+ interneurons (N). Multiple t-tests, two-stage step-up method of Benjamini, Krieger and Yekutieli."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "B", ")", "In", "the", "OFT", ",", "Cox6a2", "-", "/", "-", "mice", "travelled", "a", "longer", "distance", "and", "moved", "faster", "than", "WT", "mice", ".", "Cox6a2", "-", "/", "-", "mice", "also", "moved", "more", "often", "from", "the", "outer", "zone", "to", "the", "inner", "zone", "of", "the", "arena", ".", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", ".", "(", "D", ")", "In", "the", "SIT", ",", "Cox6a2", "-", "/", "-", "mice", "also", "travelled", "a", "longer", "distance", "with", "higher", "mean", "velocity", "than", "WT", "mice", ".", "Additionally", ",", "both", "Cox6a2", "-", "/", "-", "and", "WT", "mice", "spent", "more", "time", "exploring", "the", "container", "with", "the", "stranger", "mouse", "than", "the", "empty", "container", ".", "Total", "distance", "moved", ",", "mean", "velocity", ",", "and", "f", "[", "number", "of", "crossings", "]", "outer", "to", "inner", "zone", ":", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Social", "interaction", ":", "two", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "(", "F", ")", "The", "startle", "responses", "were", "significantly", "lower", "in", "Cox6a2", "-", "/", "-", "mice", "when", "the", "loud", "stimulus", "(", "120", "dB", ")", "was", "presented", "alone", "the", "first", "5", "times", ".", "Two", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparisons", "tests", ".", "(", "G", ")", "The", "PPI", "of", "the", "acoustic", "startle", "response", "was", "similar", "at", "all", "pre", "-", "pulses", "for", "Cox6a2", "-", "/", "-", "and", "WT", "mice", ".", "Two", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparisons", "tests", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(B) In the OFT, Cox6a2-/- mice travelled a longer distance and moved faster than WT mice. Cox6a2-/- mice also moved more often from the outer zone to the inner zone of the arena. Two-tailed unpaired Student's t-tests.(D) In the SIT, Cox6a2-/- mice also travelled a longer distance with higher mean velocity than WT mice. Additionally, both Cox6a2-/- and WT mice spent more time exploring the container with the stranger mouse than the empty container. Total distance moved, mean velocity, and f [number of crossings] outer to inner zone: two-tailed unpaired Student's t-test. Social interaction: two-way ANOVA followed by Tukey's multiple comparisons test.(F) The startle responses were significantly lower in Cox6a2-/- mice when the loud stimulus (120 dB) was presented alone the first 5 times. Two-way ANOVA followed by Tukey's multiple comparisons tests.(G) The PPI of the acoustic startle response was similar at all pre-pulses for Cox6a2-/- and WT mice. Two-way ANOVA followed by Sidak's multiple comparisons tests."}
{"words": ["figf1RNA", "was", "extracted", "from", "young", "fertile", "adults", "fed", "ad", "libitum", "or", "fasted", "for", "6", " ", "h", ".", "ddCts", "(", "delta", "delta", "cycle", "thresholds", ")", "were", "calculated", "normalizing", "to", "ama", "-", "1", "and", "the", "efficiency", "of", "the", "primer", "sets", "as", "previously", "described", ".", "Means", "+", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "are", "depicted", ".", "lipl", "-", "1", "to", "lipl", "-", "5", ",", "n", " ", "=", " ", "6", "independent", "experiments", ".", "lipl", "-", "6", "to", "lipl", "-", "8", ",", "n", " ", "=", " ", "3independent", "experiments", ".", "Significant", "t", "-", "test", "derived", "P", "-", "values", "are", "indicated", ".", "WT", ",", "wild", "type", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf1RNA was extracted from young fertile adults fed ad libitum or fasted for 6 h. ddCts (delta delta cycle thresholds) were calculated normalizing to ama-1 and the efficiency of the primer sets as previously described. Means+s.e.m. are depicted. lipl-1 to lipl-5, n = 6 independent experiments. lipl-6 to lipl-8, n = 3independent experiments. Significant t-test derived P-values are indicated. WT, wild type."}
{"words": ["figf2", "(", "a", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "LIPL", "-", "1", ":", ":", "GFP", "and", "LIPL", "-", "3", ":", ":", "TagRFP", "localization", "relative", "to", "the", "lysosomal", "marker", "PGP", "-", "2", "show", "that", "LIPL", "-", "1", "and", "LIPL", "-", "3", "are", "localized", "to", "the", "lysosomal", "-", "related", "organelle", ".", "(", "b", ")", "Acid", "lipase", "activity", ",", "measured", "in", "1", "-", "day", "adult", "whole", "lysates", ",", "shows", "that", "lipl", "-", "1lipl", "-", "3", "double", "mutant", "animals", "have", "reduced", "acidic", "lipolytic", "capacity", ".", "Mean", "±", "s", ".", "d", ".", "are", "presented", "relative", "to", "wild", "type", "(", "WT", ")", ";", "significant", "differences", "are", "indicated", ";", "n", "=", "4", "independent", "experiments", ".", "(", "c", ")", "Oil", "Red", "O", "(", "ORO", ")", "staining", "and", "fatty", "acid", "methyl", "ester", "(", "FAME", ")", "analyses", "of", "wild", "-", "type", "and", "lipl", "-", "1", "(", "tm1954", ")", "lipl", "-", "3", "(", "tm4498", ")", "double", "mutant", "L3", "larvae", "show", "that", "lysosomal", "lipases", "regulate", "cytosolic", "fat", "stores", "(", "see", "Fig", ".", "2d", "for", "adult", "measurements", ")", ".", "Means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "are", "presented", "relative", "to", "wild", "type", ";", "significant", "differences", "are", "indicated", ";", "n", " ", "=", " ", "3", "independent", "experiments", ".", "(", "d", ")", "ORO", "quantification", "of", "wild", "-", "type", "and", "lipl", "-", "1", "(", "tm1954", ")", "lipl", "-", "3", "(", "tm4498", ")", "double", "mutant", "young", "adults", "fasted", "for", "4", " ", "h", "shows", "that", "LIPL", "-", "1", "and", "LIPL", "-", "3", "contribute", "to", "fat", "mobilization", "following", "fasting", ".", "(", "Mean", "percentage", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "relative", "to", "fed", "wild", "type", ")", ".", "Wild", "-", "type", "fasted", "worms", "show", "20", "%", "less", "ORO", "signal", "than", "animals", "fed", "ad", "libitum", "(", "P", "≤", "0", ".", "001", ")", ",", "whereas", "lipl", "-", "1", "(", "tm1954", ")", "lipl", "-", "3", "(", "tm4498", ")", "double", "mutant", "worms", "show", "7", "%", "reduction", "in", "ORO", "signal", "(", "a", "difference", "that", "is", "not", "significant", "to", "well", "-", "fed", "fat", "levels", "at", "P", "≤", "0", ".", "01", "but", "it", "is", "significant", "at", "P", "≤", "0", ".", "05", ")", ".", "n", " ", "=", " ", "3", "independent", "experiments", ".", "(", "e", ")", "Representative", "transmission", "electron", "microscopy", "images", "of", "well", "-", "fed", "and", "6", " ", "h", "-", "fasted", "wild", "-", "type", "and", "lipl", "-", "1lipl", "-", "3", "mutant", "animals", "(", "11", ",", "500", "×", ")", "show", "that", "the", "lipl", "mutants", "have", "more", "lipid", "-", "droplet", "stores", "in", "ad", "libitum", "fed", "and", "fasted", "conditions", ".", "Quantification", "of", "vesicle", "number", "and", "size", "is", "depicted", "as", "mean", "+", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "n", " ", "=", " ", "4", "independent", "experiments", ".", "(", "f", ")", "Representative", "images", "of", "well", "-", "fed", "transgenic", "animals", "expressing", "LIPL", "-", "3", ":", ":", "TagRFP", "and", "ATGL", ":", ":", "GFP", "shows", "that", "LIPL", "-", "3", "does", "not", "localize", "to", "lipid", "droplets", ".", "(", "g", ")", "ORO", "staining", "and", "quantification", "of", "wild", "-", "type", "and", "lipl", "-", "1", "(", "tm1954", ")", "lipl", "-", "3", "(", "tm4498", ")", "double", "mutant", "young", "adults", "treated", "post", "-", "developmentally", "(", "from", "L4", ")", "with", "RNAi", "against", "the", "essential", "autophagy", "genes", "lgg", "-", "1", "and", "lgg", "-", "2", "or", "vector", "control", "show", "that", "lipl", "-", "1", "lipl", "-", "3", "and", "the", "autophagy", "genes", "lgg", "-", "1", "lgg", "-", "2", "are", "in", "the", "same", "fat", "regulatory", "pathway", ".", "(", "Mean", "percentage", "+", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "relative", "to", "wild", "type", "on", "vector", "control", "is", "depicted", ".", ")", "n", "=", "4", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf2(a) Representative confocal images of LIPL-1::GFP and LIPL-3::TagRFP localization relative to the lysosomal marker PGP-2 show that LIPL-1 and LIPL-3 are localized to the lysosomal-related organelle.(b) Acid lipase activity, measured in 1-day adult whole lysates, shows that lipl-1lipl-3 double mutant animals have reduced acidic lipolytic capacity. Mean±s.d. are presented relative to wild type (WT); significant differences are indicated; n = 4 independent experiments.(c) Oil Red O (ORO) staining and fatty acid methyl ester (FAME) analyses of wild-type and lipl-1(tm1954) lipl-3(tm4498) double mutant L3 larvae show that lysosomal lipases regulate cytosolic fat stores (see Fig. 2d for adult measurements). Means±s.e.m. are presented relative to wild type; significant differences are indicated; n = 3 independent experiments. (d) ORO quantification of wild-type and lipl-1(tm1954) lipl-3(tm4498) double mutant young adults fasted for 4 h shows that LIPL-1 and LIPL-3 contribute to fat mobilization following fasting. (Mean percentage ± s.e.m. relative to fed wild type). Wild-type fasted worms show 20% less ORO signal than animals fed ad libitum (P≤0.001), whereas lipl-1(tm1954) lipl-3(tm4498) double mutant worms show 7% reduction in ORO signal (a difference that is not significant to well-fed fat levels at P≤0.01 but it is significant at P≤0.05). n = 3 independent experiments.(e) Representative transmission electron microscopy images of well-fed and 6 h-fasted wild-type and lipl-1lipl-3 mutant animals (11,500×) show that the lipl mutants have more lipid-droplet stores in ad libitum fed and fasted conditions. Quantification of vesicle number and size is depicted as mean+s.e.m., n = 4 independent experiments.(f) Representative images of well-fed transgenic animals expressing LIPL-3::TagRFP and ATGL::GFP shows that LIPL-3 does not localize to lipid droplets.(g) ORO staining and quantification of wild-type and lipl-1(tm1954) lipl-3(tm4498) double mutant young adults treated post-developmentally (from L4) with RNAi against the essential autophagy genes lgg-1 and lgg-2 or vector control show that lipl-1 lipl-3 and the autophagy genes lgg-1 lgg-2 are in the same fat regulatory pathway. (Mean percentage+s.e.m. relative to wild type on vector control is depicted.) n = 4 independent experiments."}
{"words": ["figf3", "(", "a", ")", "Expression", "of", "lipl", "genes", "in", "well", "-", "fed", "mxl", "-", "3", "(", "ok1947", ")", "and", "mxl", "-", "3", "(", "tm2580", ")", "young", "adults", "normalized", "to", "same", "age", "well", "-", "fed", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "worms", "shows", "that", "mxl", "-", "3", "loss", "of", "function", "is", "sufficient", "to", "induce", "lipl", "-", "1", "to", "3", "and", "lipl", "-", "5", ".", "Mean", "ddCts", "+", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "are", "depicted", ".", "n", " ", "=", " ", "6", "independent", "experiments", "for", "lipl", "-", "1", "to", "lipl", "-", "5", ",", "and", "n", " ", "=", " ", "4", "independent", "experiments", "for", "lipl", "-", "6", "to", "lipl", "-", "8", ".", "(", "b", ")", "L4", "larvae", "were", "fasted", "and", "RNA", "was", "extracted", "at", "the", "indicated", "times", ".", "Mean", "ddCts", "+", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "show", "that", "the", "response", "mxl", "-", "3", "orchestrates", "is", "transient", ".", "Time", "0", ",", "n", " ", "=", " ", "6", "independent", "experiments", ";", "time", "3", "-", "12", " ", "h", ",", "n", " ", "=", " ", "4", "independent", "experiments", ";", "time", "18", "-", "24", " ", "h", ",", "n", " ", "=", " ", "2", "independent", "experiments", ".", "(", "c", ")", "Immunostainings", "of", "well", "-", "fed", "or", "6", "or", "12", "h", "fasted", "MXL", "-", "3", ":", ":", "GFP", "young", "adults", "are", "presented", ".", "Quantification", "of", "GFP", "-", "positive", "nuclei", "relative", "to", "total", "intestinal", "nuclei", "(", "4", ",", "6", "-", "diamidino", "-", "2", "-", "phenylindole", ",", "DAPI", ")", "of", "two", "independent", "experiments", "shows", "that", "MXL", "-", "3", "transiently", "delocalizes", "from", "the", "intestinal", "nuclei", "during", "fasting", ".", "(", "d", ")", "ChIP", "-", "quantitative", "PCR", "(", "ChIP", "-", "qPCR", ")", "analysis", "of", "well", "-", "fed", "and", "6", " ", "h", "fasted", "mixed", "-", "stage", "worms", "expressing", "MXL", "-", "3", ":", ":", "GFP", "presented", "as", "Ct", "in", "αGFP", "immunoprecipitated", "DNA", "normalized", "to", "input", "DNA", "and", "relative", "to", "a", "mock", "promoter", "region", "(", "CACTAT", "site", "−", "88", "of", "ama", "-", "1", "gene", ")", "shows", "that", "MXL", "-", "3", "vacates", "the", "lipl", "promoters", "during", "early", "fasting", ".", "Three", "sets", "of", "primers", "surrounding", "CACGTG", "target", "sites", "found", "up", "to", "500", " ", "bp", "of", "the", "ATG", "of", "the", "lipl", "-", "1", "and", "lipl", "-", "3", "genes", "were", "used", ".", "A", "representative", "experiment", "is", "presented", ";", "see", "raw", "data", "of", "two", "independent", "experiments", "in", "Supplementary", "Table", "S9", ".", "(", "e", ")", "Wild", "-", "type", "or", "lipl", "-", "1", "(", "tm1954", ")", "lipl", "-", "3", "(", "tm4498", ")", "double", "mutant", "animals", "grown", "on", "control", "RNAi", "plates", "were", "transferred", "as", "L4", "larvae", "to", "control", "or", "mxl", "-", "3", "RNAi", "plates", ",", "incubated", "for", "12", " ", "h", "at", "20", " ", "°", "C", ",", "and", "processed", "for", "total", "FAMEs", ";", "as", "a", "reference", ",", "an", "aliquot", "of", "wild", "-", "type", "young", "adults", "on", "control", "RNAi", "bacteria", "was", "fasted", "for", "6", " ", "h", ".", "FAME", "quantification", "(", "mean", "percentage", "of", "fed", "wild", "type", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", "shows", "that", "acute", "mxl", "-", "3", "inactivation", ",", "as", "fasting", ",", "reduces", "fat", "stores", "in", "a", "lipl", "-", "dependent", "manner", ".", "n", " ", "=", " ", "3", "independent", "experiments", ".", "NSD", ",", "P", "-", "value", ">", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf3(a) Expression of lipl genes in well-fed mxl-3(ok1947) and mxl-3(tm2580) young adults normalized to same age well-fed wild-type (WT) worms shows that mxl-3 loss of function is sufficient to induce lipl-1 to 3 and lipl-5. Mean ddCts+s.e.m. are depicted. n = 6 independent experiments for lipl-1 to lipl-5, and n = 4 independent experiments for lipl-6 to lipl-8.(b) L4 larvae were fasted and RNA was extracted at the indicated times. Mean ddCts+s.e.m. show that the response mxl-3 orchestrates is transient. Time 0, n = 6 independent experiments; time 3-12 h, n = 4 independent experiments; time 18-24 h, n = 2 independent experiments.(c) Immunostainings of well-fed or 6 or 12 h fasted MXL-3::GFP young adults are presented. Quantification of GFP-positive nuclei relative to total intestinal nuclei (4,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI) of two independent experiments shows that MXL-3 transiently delocalizes from the intestinal nuclei during fasting.(d) ChIP-quantitative PCR (ChIP-qPCR) analysis of well-fed and 6 h fasted mixed-stage worms expressing MXL-3::GFP presented as Ct in αGFP immunoprecipitated DNA normalized to input DNA and relative to a mock promoter region (CACTAT site −88 of ama-1 gene) shows that MXL-3 vacates the lipl promoters during early fasting. Three sets of primers surrounding CACGTG target sites found up to 500 bp of the ATG of the lipl-1 and lipl-3 genes were used. A representative experiment is presented; see raw data of two independent experiments in Supplementary Table S9.(e) Wild-type or lipl-1(tm1954) lipl-3(tm4498) double mutant animals grown on control RNAi plates were transferred as L4 larvae to control or mxl-3 RNAi plates, incubated for 12 h at 20 °C, and processed for total FAMEs; as a reference, an aliquot of wild-type young adults on control RNAi bacteria was fasted for 6 h. FAME quantification (mean percentage of fed wild type ±s.e.m.) shows that acute mxl-3 inactivation, as fasting, reduces fat stores in a lipl-dependent manner. n = 3 independent experiments. NSD, P-value>0.05."}
{"words": ["figf4", "(", "a", ")", "Transcriptional", "levels", "of", "hlh", "-", "30", "and", "the", "mxl", "-", "3", "-", "dependent", "lipl", "genes", "measured", "in", "5", "h", "fasted", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "or", "hlh", "-", "30", "(", "tm1978", ")", "young", "-", "adult", "worms", "depicted", "as", "mean", "ddCt", "+", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "relative", "to", "wild", "-", "type", "ad", "libitum", "-", "fed", "worms", "show", "that", "hlh", "-", "30", "is", "induced", "following", "fasting", "and", "HLH", "-", "30", "induces", "lysosomal", "lipolysis", ".", "N", "=", "4", "independent", "experiments", "for", "lipl", "data", ",", "n", "=", "2", "independent", "experiments", "for", "hlh", "-", "30", "mRNA", ".", "HLH", "-", "30", "deficiency", "fully", "abrogates", "lipl", "-", "2", ",", "3", "and", "5", "(", "P0", ".", "0001", ")", ",", "and", "impairs", "lipl", "-", "1", "(", "P0", ".", "01", ")", "transcriptional", "activation", "following", "fasting", ".", "(", "b", ")", "Animals", "treated", "from", "late", "L3", "stage", "with", "RNAi", "against", "TOR", "or", "vector", "control", "were", "harvested", "as", "young", "adults", ".", "Mean", "+", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "three", "independent", "experiments", "shows", "that", "inhibition", "of", "TOR", "is", "sufficient", "to", "induce", "hlh", "-", "30", "transcription", ".", "(", "c", ")", "L3", "animals", "carrying", "the", "rescuing", "construct", "hlh", "-", "30P", ":", ":", "HLH", "-", "30", ":", ":", "mGFP", ":", ":", "hlh", "-", "30", "3", "′", "UTR", "(", "mGFP", ",", "monomeric", "GFP", ",", "and", "UTR", ",", "untranslated", "region", ")", ",", "well", "fed", "or", "fasted", "for", "8", "h", "show", "that", "HLH", "-", "30", "is", "enriched", "in", "intestinal", "nuclei", "of", "fasted", "worms", "(", "exposure", "time", ":", "well", "fed", ",", "500", "ms", ";", "fasted", ",", "100", "ms", ")", ".", "(", "d", ")", "ORO", "staining", "of", "wild", "-", "type", "or", "hlh", "-", "30", "(", "tm1978", ")", "young", "adults", "fasted", "for", "8", " ", "h", "reveals", "that", "hlh", "-", "30", "is", "required", "for", "optimal", "lipid", "mobilization", "on", "fasting", ".", "Mean", "percentages", "+", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "are", "shown", "below", "relative", "to", "well", "-", "fed", "worms", "treated", "in", "parallel", ",", "n", " ", "=", " ", "3", "independent", "experiments", ".", "(", "e", ")", "mxl", "-", "3", "and", "hlh", "-", "30", "transcriptional", "levels", "in", "wild", "-", "type", ",", "hlh", "-", "30", "(", "tm1978", ")", "and", "mxl", "-", "3", "(", "ok1947", ")", "mutants", "in", "the", "basal", "and", "fasted", "states", "show", "that", "mxl", "-", "3", "transcription", "is", "hlh", "-", "30", "independent", ",", "and", "hlh", "-", "30", "transcription", "is", "mxl", "-", "3", "independent", ".", "Expression", "is", "presented", "relative", "to", "wild", "-", "type", "fed", "animals", "as", "mean", "ddCt", "+", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "No", "significant", "differences", "relative", "to", "wild", "type", "in", "the", "same", "feeding", "state", "were", "observed", ",", "n", " ", "=", " ", "3", "independent", "experiments", ".", "(", "f", ")", "Representative", "ChIP", "-", "qPCR", "analysis", "of", "well", "-", "fed", "and", "6", " ", "h", "fasted", "mixed", "stage", "worms", "expressing", "HLH", "-", "30", ":", ":", "GFP", "presented", "as", "in", "Fig", ".", "3d", "shows", "that", "HLH", "-", "30", "occupies", "the", "lipl", "promoters", "during", "early", "fasting", ".", "See", "raw", "data", "of", "two", "independent", "experiments", "in", "Supplementary", "Table", "S9", ".", "(", "g", ")", "Transcriptional", "levels", "of", "the", "mxl", "-", "3", "-", "dependent", "lipl", "genes", "in", "wild", "-", "type", ",", "mxl", "-", "3", "(", "ok1947", ")", ",", "hlh", "-", "30", "(", "tm1978", ")", "or", "mxl", "-", "3", "(", "ok1947", ")", ";", "hlh", "-", "30", "(", "tm1978", ")", "double", "mutant", "young", "-", "adult", "worms", "show", "that", "hlh", "-", "30", "suppresses", "the", "constitutive", "-", "induction", "-", "of", "-", "the", "-", "lipl", "-", "genes", "phenotype", "of", "mxl", "-", "3", "mutant", "animals", "(", "mean", "ddCt", "+", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "relative", "to", "wild", "-", "type", "ad", "libitum", "-", "fed", "worms", ")", ".", "n", " ", "=", " ", "3", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf4(a) Transcriptional levels of hlh-30 and the mxl-3-dependent lipl genes measured in 5 h fasted wild-type (WT) or hlh-30(tm1978) young-adult worms depicted as mean ddCt+s.e.m. relative to wild-type ad libitum-fed worms show that hlh-30 is induced following fasting and HLH-30 induces lysosomal lipolysis. N = 4 independent experiments for lipl data, n = 2 independent experiments for hlh-30 mRNA. HLH-30 deficiency fully abrogates lipl-2, 3 and 5 (P0.0001), and impairs lipl-1 (P0.01) transcriptional activation following fasting.(b) Animals treated from late L3 stage with RNAi against TOR or vector control were harvested as young adults. Mean+s.e.m. of three independent experiments shows that inhibition of TOR is sufficient to induce hlh-30 transcription.(c) L3 animals carrying the rescuing construct hlh-30P::HLH-30::mGFP::hlh-30 3′UTR (mGFP, monomeric GFP, and UTR, untranslated region), well fed or fasted for 8 h show that HLH-30 is enriched in intestinal nuclei of fasted worms (exposure time: well fed, 500 ms; fasted, 100 ms).(d) ORO staining of wild-type or hlh-30(tm1978) young adults fasted for 8 h reveals that hlh-30 is required for optimal lipid mobilization on fasting. Mean percentages+s.e.m. are shown below relative to well-fed worms treated in parallel, n = 3 independent experiments.(e) mxl-3 and hlh-30 transcriptional levels in wild-type, hlh-30(tm1978) and mxl-3(ok1947) mutants in the basal and fasted states show that mxl-3 transcription is hlh-30 independent, and hlh-30 transcription is mxl-3 independent. Expression is presented relative to wild-type fed animals as mean ddCt+s.e.m. No significant differences relative to wild type in the same feeding state were observed, n = 3 independent experiments.(f) Representative ChIP-qPCR analysis of well-fed and 6 h fasted mixed stage worms expressing HLH-30::GFP presented as in Fig. 3d shows that HLH-30 occupies the lipl promoters during early fasting. See raw data of two independent experiments in Supplementary Table S9.(g) Transcriptional levels of the mxl-3-dependent lipl genes in wild-type, mxl-3(ok1947), hlh-30(tm1978) or mxl-3(ok1947);hlh-30(tm1978) double mutant young-adult worms show that hlh-30 suppresses the constitutive-induction-of-the-lipl-genes phenotype of mxl-3 mutant animals (mean ddCt+s.e.m. relative to wild-type ad libitum-fed worms). n = 3 independent experiments."}
{"words": ["figf5", "(", "a", ")", "LRO", "(", "lysosome", "-", "related", "organelle", ")", "live", "Nile", "red", "-", "stained", "images", "of", "hlh", "-", "30", "(", "tm1978", ")", "and", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "L3", "larvae", "starved", "for", "60", "h", "show", "that", "hlh", "-", "30", "is", "required", "for", "the", "expansion", "of", "the", "lysosomal", "compartment", "following", "fasting", ".", "Quantification", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "relative", "to", "fasted", "wild", "-", "type", "worms", "is", "also", "presented", ";", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "(", "b", ")", "Transcriptional", "levels", "of", "the", "autophagy", "genes", "lgg", "-", "1", ",", "lgg", "-", "2", "and", "atg", "-", "16", ".", "2", "in", "fasted", "wild", "-", "type", "and", "hlh", "-", "30", "(", "tm1978", ")", "young", "-", "adult", "worms", "show", "that", "transcriptional", "activation", "of", "autophagy", "following", "fasting", "is", "hlh", "-", "30", "dependent", "(", "mean", "ddCt", "+", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "relative", "to", "wild", "-", "type", "ad", "libitum", "-", "fed", "worms", ")", ".", "n", " ", "=", " ", "3", "independent", "experiments", "(", "c", ")", "The", "mean", "percentage", "(", "+", "s", ".", "d", ".", ")", "of", "L1", "larvae", "alive", "after", "48", "h", "fasting", "in", "minimum", "media", "shows", "that", "hlh", "-", "30", "(", "tm1978", ")", "mutant", "animals", "are", "sensitive", "to", "starvation", ".", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "For", "L4", "survival", "see", "Supplementary", "Fig", ".", "S6g", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf5(a) LRO (lysosome-related organelle) live Nile red-stained images of hlh-30(tm1978) and wild-type (WT) L3 larvae starved for 60 h show that hlh-30 is required for the expansion of the lysosomal compartment following fasting. Quantification as mean±s.e.m. relative to fasted wild-type worms is also presented; n = 3 independent experiments.(b) Transcriptional levels of the autophagy genes lgg-1, lgg-2 and atg-16.2 in fasted wild-type and hlh-30(tm1978) young-adult worms show that transcriptional activation of autophagy following fasting is hlh-30 dependent (mean ddCt+s.e.m. relative to wild-type ad libitum-fed worms). n = 3 independent experiments(c) The mean percentage (+ s.d.) of L1 larvae alive after 48 h fasting in minimum media shows that hlh-30 (tm1978) mutant animals are sensitive to starvation. n = 3 independent experiments. For L4 survival see Supplementary Fig. S6g."}
{"words": ["figf6", "(", "a", ")", "Expression", "analyses", "of", "the", "liver", "of", "C57BL", "/", "6J", "9", "-", "week", "females", "fasted", "overnight", "(", "ON", ")", "for", "10", "h", "relative", "to", "siblings", "feeding", "ad", "libitum", "show", "that", "LipA", "(", "mouse", "lysosomal", "acid", "lipase", ")", ",", "Map1lc3a", "(", "mammalian", "lgg", "-", "1", "/", "lgg", "-", "2", ")", "and", "Tfeb", "(", "mammalian", "hlh", "-", "30", ")", "but", "not", "Max", "(", "mammalian", "mxl", "-", "3", ")", "are", "transcriptionally", "linked", "to", "nutrients", "in", "the", "mouse", "liver", "(", "median", "+", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "fold", "change", ";", "ddCt", ")", ".", "Levels", "of", "expression", "were", "normalized", "to", "ActB", "and", "Cog2", "as", "internal", "controls", ";", "all", "but", "Max", "differences", "are", "significant", "(", "P0", ".", "05", ")", ",", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "Cyp4a14", "is", "a", "positive", "control", ".", "(", "b", ")", "Expression", "analyses", "of", "control", "or", "hTFEB", "siRNA", "treated", "HepG2", "cells", "incubated", "in", "EBSS", "minimal", "medium", "for", "2", ",", "4", "or", "8", "h", ",", "compared", "with", "the", "expression", "of", "control", "or", "hTFEB", "siRNA", "treated", "hepatocytes", "in", "complete", "media", ",", "show", "that", "LAL", "(", "human", "lysosomal", "acid", "lipase", ")", ",", "MAP1LC3A", "and", "TFEB", "but", "not", "MAX", "are", "transcriptionally", "linked", "to", "nutrients", "in", "human", "hepatocytes", ",", "and", "that", "LAL", "and", "MAP1LC3A", "induction", "under", "nutrient", "deprivation", "are", "TFEB", "dependent", "(", "median", "dCt", "+", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", ".", "Levels", "of", "expression", "were", "normalized", "to", "ACTB", "as", "internal", "control", ";", "all", "butMAX", "differences", "are", "significant", "(", "P0", ".", "05", ")", ",", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "IGFBP", "is", "a", "positive", "control", ".", "EBSS", ",", "Earles", "'", "s", "balanced", "salt", "solution", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf6(a) Expression analyses of the liver of C57BL/6J 9-week females fasted overnight (ON) for 10 h relative to siblings feeding ad libitum show that LipA (mouse lysosomal acid lipase), Map1lc3a (mammalian lgg-1/lgg-2) and Tfeb (mammalian hlh-30) but not Max (mammalian mxl-3) are transcriptionally linked to nutrients in the mouse liver (median+s.e.m. fold change; ddCt). Levels of expression were normalized to ActB and Cog2 as internal controls; all but Max differences are significant (P0.05), n = 3 independent experiments. Cyp4a14 is a positive control.(b) Expression analyses of control or hTFEB siRNA treated HepG2 cells incubated in EBSS minimal medium for 2, 4 or 8 h, compared with the expression of control or hTFEB siRNA treated hepatocytes in complete media, show that LAL (human lysosomal acid lipase), MAP1LC3A and TFEB but not MAX are transcriptionally linked to nutrients in human hepatocytes, and that LAL and MAP1LC3A induction under nutrient deprivation are TFEB dependent (median dCt+s.e.m.). Levels of expression were normalized to ACTB as internal control; all butMAX differences are significant (P0.05), n = 3 independent experiments. IGFBP is a positive control. EBSS, Earles's balanced salt solution."}
{"words": ["figf7", "(", "a", ")", "Wild", "-", "type", "(", "WT", ")", ",", "mxl", "-", "3", "(", "ok1947", ")", ",", "hlh", "-", "30", "(", "tm1978", ")", "or", "mxl", "-", "3", "(", "ok1947", ")", ";", "hlh", "-", "30", "(", "tm1978", ")", "double", "mutant", "were", "used", "in", "longevity", "epistasis", "analyses", ",", "revealing", "that", "hlh", "-", "30", "suppresses", "the", "mxl", "-", "3", "extended", "lifespan", "phenotype", ".", "Animals", "were", "incubated", "at", "20", "°", "C", "and", "transferred", "every", "other", "day", "until", "cessation", "of", "reproduction", ".", "The", "cumulative", "survival", "curve", "is", "depicted", ".", "Kaplan", "-", "Meier", "statistics", ",", "calculated", "using", "SSPS", "17", ",", "are", "also", "shown", ".", "(", "b", ")", "Live", "Nile", "red", "quantification", "of", "wild", "-", "type", "and", "lipl", "-", "1lipl", "-", "3", "double", "mutant", "worms", "shows", "that", "lipl", "-", "1", "and", "lipl", "-", "3", "contribute", "to", "the", "clearance", "of", "lipids", "from", "the", "endocytic", "pathway", ".", "Mean", "+", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "signal", "intensity", "is", "shown", "as", "percentage", "relative", "to", "wild", "type", ";", "significant", "differences", "are", "indicated", ";", "n", "=", "4", "independent", "experiments", ".", "(", "c", ",", "d", ")", "Animals", "overexpressing", "LIPL", "-", "1", "or", "LIPL", "-", "3", "were", "incubated", "at", "25", " ", "°", "C", "and", "transferred", "every", "other", "day", "until", "cessation", "of", "reproduction", ".", "Data", "presented", "as", "in", "Fig", ".", "7a", "show", "that", "activated", "lysosomal", "lipolysis", "extends", "C", ".", "elegans", "lifespan", ".", "a", "Survival", "presented", "as", "mean", "lifespan", "(", "LS", ")", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "b", "Number", "of", "uncensored", "animals", "(", "animals", "that", "crawled", "off", "the", "plate", ",", "bagged", ",", "exploded", "or", "became", "contaminated", "were", "censored", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf7(a) Wild-type (WT), mxl-3(ok1947), hlh-30(tm1978) or mxl-3(ok1947);hlh-30(tm1978) double mutant were used in longevity epistasis analyses, revealing that hlh-30 suppresses the mxl-3 extended lifespan phenotype. Animals were incubated at 20°C and transferred every other day until cessation of reproduction. The cumulative survival curve is depicted. Kaplan-Meier statistics, calculated using SSPS 17, are also shown.(b) Live Nile red quantification of wild-type and lipl-1lipl-3 double mutant worms shows that lipl-1 and lipl-3 contribute to the clearance of lipids from the endocytic pathway. Mean+s.e.m. signal intensity is shown as percentage relative to wild type; significant differences are indicated; n = 4 independent experiments.(c,d) Animals overexpressing LIPL-1 or LIPL-3 were incubated at 25 °C and transferred every other day until cessation of reproduction. Data presented as in Fig. 7a show that activated lysosomal lipolysis extends C. elegans lifespan. a Survival presented as mean lifespan (LS) ± s.e.m. b Number of uncensored animals (animals that crawled off the plate, bagged, exploded or became contaminated were censored)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "EM", "analysis", "of", "cortical", "synapses", "derived", "from", "WT", "and", "MPS", "-", "IIIA", "mice", "at", "different", "ages", ".", "The", "size", "of", "synaptic", "vesicles", "was", "quantified", "from", "400", "-", "500", "vesicles", "(", "taken", "from", "5", "mice", "for", "each", "genotype", "at", "each", "time", "point", ")", "and", "expressed", "as", "the", "average", "of", "vesicle", "diameter", "(", "nm", ")", ".", "The", "number", "of", "synaptic", "vesicles", "per", "synapse", "was", "quantified", "from", "20", "different", "images", "(", "taken", "from", "5", "mice", "for", "each", "genotype", "at", "each", "time", "point", ")", ",", "normalized", "by", "the", "length", "of", "synaptic", "cleft", "and", "expressed", "as", "%", "of", "WT", ".", "The", "synaptic", "density", "was", "measured", "from", "20", "different", "images", "(", "taken", "from", "5", "mice", "for", "each", "genotype", "at", "each", "time", "point", ")", "as", "the", "number", "of", "synapses", "/", "area", "(", "#", "/", "500μm2", ")", "and", "expressed", "as", "%", "of", "WT", ".", "Arrows", "indicate", "the", "synaptic", "cleft", ",", "while", "asterisks", "indicate", "abnormal", "vacuoles", "(", "B", ",", "C", ")", "The", "size", "of", "the", "lysosomal", "compartment", "was", "evaluated", "by", "WB", "(", "B", ")", "analysis", "in", "the", "brain", "of", "MPS", "-", "IIIA", "mice", "at", "indicated", "ages", ".", "Quantitation", "of", "WB", "by", "densitometry", "analysis", "(", "ImageJ", ")", "was", "shown", "(", "B", ")", ".", "(", "B", ",", "C", ")", "The", "size", "of", "the", "lysosomal", "compartment", "was", "evaluated", "by", "IF", "(", "C", ")", "analysis", "in", "the", "brain", "of", "MPS", "-", "IIIA", "mice", "at", "indicated", "ages", ".", "(", "D", ")", "Extracellular", "recordings", "(", "fEPSPs", ")", "in", "hippocampal", "brain", "slices", "from", "6", "months", "-", "old", "WT", "and", "MPS", "-", "IIIA", "mice", ".", "The", "left", "panel", "shows", "representative", "fEPSP", "traces", ".", "Summary", "graphs", "show", "the", "fEPSPs", "slope", "as", "a", "function", "of", "either", "the", "applied", "stimulus", "intensity", "or", "the", "prevolley", "amplitude", ".", "Data", "are", "the", "average", "of", "the", "values", "from", "9", "slices", "(", "from", "9", "mice", ")", "in", "the", "WT", "group", "and", "6", "slices", "(", "from", "5", "mice", ")", "in", "the", "MPS", "-", "IIIA", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "repeated", "measure", "ANOVA", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) EM analysis of cortical synapses derived from WT and MPS-IIIA mice at different ages. The size of synaptic vesicles was quantified from 400-500 vesicles (taken from 5 mice for each genotype at each time point) and expressed as the average of vesicle diameter (nm). The number of synaptic vesicles per synapse was quantified from 20 different images (taken from 5 mice for each genotype at each time point), normalized by the length of synaptic cleft and expressed as % of WT. The synaptic density was measured from 20 different images (taken from 5 mice for each genotype at each time point) as the number of synapses/area(#/500μm2) and expressed as % of WT.Arrows indicate the synaptic cleft, while asterisks indicate abnormal vacuoles(B, C) The size of the lysosomal compartment was evaluated by WB (B) analysis in the brain of MPS-IIIA mice at indicated ages. Quantitation of WB by densitometry analysis (ImageJ) was shown (B).(B, C) The size of the lysosomal compartment was evaluated by IF (C) analysis in the brain of MPS-IIIA mice at indicated ages.(D) Extracellular recordings (fEPSPs) in hippocampal brain slices from 6 months-old WT and MPS-IIIA mice. The left panel shows representative fEPSP traces. Summary graphs show the fEPSPs slope as a function of either the applied stimulus intensity or the prevolley amplitude. Data are the average of the values from 9 slices (from 9 mice) in the WT group and 6 slices (from 5 mice) in the MPS-IIIA. *p<0.05, repeated measure ANOVA."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Synaptic", "terminal", "endocytosis", "was", "analyzed", "in", "WT", "and", "MPS", "-", "IIIA", "DIV14", "hippocampal", "neurons", "by", "quantification", "of", "incorporated", "FM1", "-", "43", "dye", "fluorescence", "in", "~", "300", "individual", "boutons", "(", "taken", "from", "4", "-", "5", "coverslips", "for", "each", "group", ")", ".", "Fluorescence", "intensities", "were", "expressed", "as", "arbitrary", "units", "(", "A", ".", "F", ".", "U", ".", ")", "and", "displayed", "both", "as", "a", "distribution", "and", "as", "mean", "values", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "B", ")", "WT", "and", "MPS", "-", "IIIA", "hippocampal", "neurons", "(", "DIV14", ")", "were", "transfected", "with", "v", "-", "Glut1", "-", "pHluorin", "-", "mCherry", "plasmid", "and", "synaptic", "recycling", "was", "evaluated", "by", "the", "fluorescence", "change", "of", "the", "probe", "from", "80", "-", "100", "individual", "boutons", "(", "taken", "from", "4", "-", "5", "coverslips", "for", "each", "group", ")", ".", "Fluorescence", "intensity", "was", "quantified", "at", "each", "bouton", "during", "KCl", "perfusion", ",", "normalized", "to", "the", "fluorescence", "value", "obtained", "upon", "rapid", "alkalization", "(", "NH4Cl", "perfusion", ")", "and", "expressed", "as", "∆", "fluorescence", "(", "normalized", "to", "baseline", ";", "ΔFKCl", "/", "ΔF", "NH4Cl", ")", ".", "Values", "were", "displayed", "both", "as", "fluorescence", "traces", "(", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "at", "each", "time", "frame", ")", "and", "maximum", "fluorescence", "after", "KCl", "perfusion", "(", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", ".", "Representative", "panels", "on", "the", "right", "show", "the", "fluorescence", "intensity", "change", "in", "control", "neurons", "(", "WT", ")", ".", "Pseudo", "-", "colour", "was", "applied", "to", "better", "reveal", "fluorescence", "changes", ".", "Note", "that", "NH4Cl", "alkalinizes", "all", "vesicles", "revealing", "the", "total", "(", "recycling", "+", "resting", ")", "pool", "in", "neuronal", "cells", "analyzed", ".", "(", "C", ")", "WT", "hippocampal", "neurons", "at", "DIV10", "were", "treated", "with", "a", "lysosome", "inhibitor", "'", "s", "cocktail", "for", "3", "days", ".", "The", "size", "of", "lysosomal", "compartment", "was", "evaluated", "in", "both", "treated", "and", "control", "untreated", "WT", "neurons", "by", "EM", "examination", ".", "Quantitation", "analysis", "was", "performed", "on", "30", "different", "images", ".", "(", "D", ",", "E", ")", "Endocytosis", "(", "D", ")", "in", "presynaptic", "boutons", "from", "treated", "and", "control", "untreated", "WT", "hippocampal", "neurons", "were", "monitored", "as", "in", "(", "A", ",", "B", ")", ".", "(", "D", ",", "E", ")", "exocytosis", "(", "E", ")", "in", "presynaptic", "boutons", "from", "treated", "and", "control", "untreated", "WT", "hippocampal", "neurons", "were", "monitored", "as", "in", "(", "A", ",", "B", ")", ".", "(", "F", ")", "EM", "analysis", "of", "synaptic", "terminals", "was", "performed", "in", "treated", "and", "control", "untreated", "WT", "neurons", ".", "The", "number", "of", "synaptic", "vesicles", "per", "synapse", "was", "quantified", "from", "~", "20", "different", "images", "(", "taken", "from", "3", "ultrathin", "sections", "for", "each", "group", ")", ",", "normalized", "by", "the", "length", "of", "synaptic", "cleft", "and", "expressed", "as", "%", "of", "WT", ".", "Arrows", "indicate", "the", "synaptic", "cleft", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Synaptic terminal endocytosis was analyzed in WT and MPS-IIIA DIV14 hippocampal neurons by quantification of incorporated FM1-43 dye fluorescence in ~300 individual boutons (taken from 4-5 coverslips for each group). Fluorescence intensities were expressed as arbitrary units (A.F.U.) and displayed both as a distribution and as mean values ± s.e.m.(B) WT and MPS-IIIA hippocampal neurons (DIV14) were transfected with v-Glut1-pHluorin-mCherry plasmid and synaptic recycling was evaluated by the fluorescence change of the probe from 80-100 individual boutons (taken from 4-5 coverslips for each group). Fluorescence intensity was quantified at each bouton during KCl perfusion, normalized to the fluorescence value obtained upon rapid alkalization (NH4Cl perfusion) and expressed as ∆fluorescence (normalized to baseline; ΔFKCl/ΔF NH4Cl). Values were displayed both as fluorescence traces (means ± s.e.m. at each time frame) and maximum fluorescence after KCl perfusion (means ± s.e.m.). Representative panels on the right show the fluorescence intensity change in control neurons (WT). Pseudo-colour was applied to better reveal fluorescence changes.Note that NH4Cl alkalinizes all vesicles revealing the total (recycling + resting) pool in neuronal cells analyzed.(C) WT hippocampal neurons at DIV10 were treated with a lysosome inhibitor's cocktail for 3 days. The size of lysosomal compartment was evaluated in both treated and control untreated WT neurons by EM examination. Quantitation analysis was performed on 30 different images.(D, E) Endocytosis (D) in presynaptic boutons from treated and control untreated WT hippocampal neurons were monitored as in (A, B).(D, E) exocytosis (E) in presynaptic boutons from treated and control untreated WT hippocampal neurons were monitored as in (A, B).(F) EM analysis of synaptic terminals was performed in treated and control untreated WT neurons. The number of synaptic vesicles per synapse was quantified from ~20 different images (taken from 3 ultrathin sections for each group), normalized by the length of synaptic cleft and expressed as % of WT. Arrows indicate the synaptic cleft."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "VAMP2", ",", "SNAP", "-", "25", "and", "Syntaxin", "-", "1", "SNAREs", "were", "immunoblotted", "in", "WT", "and", "MPS", "-", "IIIA", "synaptosomal", "brain", "samples", "at", "indicated", "ages", ".", "Synapsin", "-", "1", "was", "also", "blotted", "as", "a", "control", ".", "Quantitation", "of", "WB", "was", "shown", ".", "(", "B", ")", "Confocal", "microscopy", "images", "of", "WT", "and", "MPS", "-", "IIIA", "hippocampal", "neurons", "(", "DIV14", ")", "double", "labeled", "with", "anti", "-", "synapsin", "-", "1", "(", "presynaptic", "marker", ";", "red", ")", "and", "either", "anti", "-", "VAMP2", "or", "anti", "-", "SNAP25", "antibodies", "(", "green", ")", ".", "The", "merges", "(", "yellow", ")", "of", "confocal", "images", "are", "shown", ".", "SNAP25", "-", "synapsin", "-", "1", "and", "VAMP2", "-", "synapsin", "-", "1", "co", "-", "localizations", "were", "quantified", "using", "the", "Manders", "'", "Colocalization", "Coefficients", "(", "MCC", ")", "(", "ImageJ", ")", "and", "displayed", "as", "%", "(", "MCC", "x", "100", ")", "of", "Synapsin", "-", "1", "co", "-", "localizing", "with", "either", "SNAP25", "or", "VAMP2", "(", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "from", "15", "different", "images", "taken", "from", "4", "-", "5", "coverslips", "for", "each", "group", ")", ".", "(", "C", ")", "VAMP2", "and", "SNAP", "-", "25", "protein", "levels", "were", "quantified", "by", "immunoblot", "analysis", "in", "WT", "and", "MPS", "-", "IIIA", "hippocampal", "neurons", "(", "DIV14", ")", "at", "different", "times", "after", "cycloheximide", "treatment", "and", "expressed", "as", "%", "of", "remaining", "protein", "at", "T0", "(", "100", "%", ")", ".", "The", "proteasome", "was", "inhibited", "as", "indicated", ".", "(", "D", ")", "SDS", "-", "resistant", "complex", "levels", "were", "evaluated", "in", "WT", "and", "MPS", "-", "IIIA", "total", "brain", "samples", "at", "indicated", "ages", "by", "immunoblotting", "of", "non", "-", "boiled", "samples", "with", "VAMP2", "or", "Syntaxin", "-", "1", "antibodies", ".", "Quantitation", "of", "WB", "was", "shown", ".", "(", "E", ")", "Total", "brain", "lysates", "were", "immunoprecipitated", "with", "antibodies", "to", "Syntaxin", "-", "1", "and", "co", "-", "immunoprecipitated", "VAMP2", "and", "SNAP25", "proteins", "were", "revealed", "by", "WB", "analysis", ".", "The", "levels", "of", "immunoprecipitated", "proteins", "were", "quantified", ".", "(", "F", ")", "α", "-", "Synuclein", "and", "CSPα", "were", "immunoblotted", "in", "WT", "and", "MPS", "-", "IIIA", "total", "brain", "lysates", "at", "indicated", "ages", "Total", "protein", "levels", "were", "quantified", ".", "(", "G", ")", "α", "-", "Synuclein", "and", "CSPα", "were", "immunoblotted", "in", "WT", "and", "MPS", "-", "IIIA", "synaptosomal", "fractions", "at", "indicated", "ages", ".", "Hsc70", ",", "an", "heat", "shock", "cognate", "protein", ",", "which", "forms", "together", "with", "CSPα", "and", "SGT", "(", "small", "glutamine", "-", "rich", "tetratricopeptide", "repeat", "domain", "protein", ")", "the", "\"", "chaperon", "machine", "\"", "was", "also", "blotted", ".", "Protein", "levels", "were", "quantified", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) VAMP2, SNAP-25 and Syntaxin-1 SNAREs were immunoblotted in WT and MPS-IIIA synaptosomal brain samples at indicated ages. Synapsin-1 was also blotted as a control. Quantitation of WB was shown.(B) Confocal microscopy images of WT and MPS-IIIA hippocampal neurons (DIV14) double labeled with anti-synapsin-1 (presynaptic marker; red) and either anti-VAMP2 or anti-SNAP25 antibodies (green). The merges (yellow) of confocal images are shown. SNAP25-synapsin-1 and VAMP2-synapsin-1 co-localizations were quantified using the Manders' Colocalization Coefficients (MCC) (ImageJ) and displayed as % (MCC x 100) of Synapsin-1 co-localizing with either SNAP25 or VAMP2 (means ± s.e.m. from 15 different images taken from 4-5 coverslips for each group).(C) VAMP2 and SNAP-25 protein levels were quantified by immunoblot analysis in WT and MPS-IIIA hippocampal neurons (DIV14) at different times after cycloheximide treatment and expressed as % of remaining protein at T0 (100 %). The proteasome was inhibited as indicated.(D) SDS-resistant complex levels were evaluated in WT and MPS-IIIA total brain samples at indicated ages by immunoblotting of non-boiled samples with VAMP2 or Syntaxin-1 antibodies. Quantitation of WB was shown.(E) Total brain lysates were immunoprecipitated with antibodies to Syntaxin-1 and co-immunoprecipitated VAMP2 and SNAP25 proteins were revealed by WB analysis. The levels of immunoprecipitated proteins were quantified.(F) α-Synuclein and CSPα were immunoblotted in WT and MPS-IIIA total brain lysates at indicated ages Total protein levels were quantified.(G) α-Synuclein and CSPα were immunoblotted in WT and MPS-IIIA synaptosomal fractions at indicated ages. Hsc70, an heat shock cognate protein, which forms together with CSPα and SGT (small glutamine-rich tetratricopeptide repeat domain protein) the \"chaperon machine\" was also blotted. Protein levels were quantified."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "WB", "analysis", "of", "LC3", "and", "p62", "(", "an", "autophagy", "substrate", ")", "was", "performed", "on", "WT", "and", "MPS", "-", "IIIA", "brain", "samples", "at", "indicated", "ages", ".", "WB", "quantitation", "was", "shown", ".", "(", "B", ")", "α", "-", "Synuclein", "was", "immunoblotted", "in", "WT", "and", "MPS", "-", "IIIA", "both", "total", "and", "synaptosomal", "brain", "fractions", "at", "indicated", "ages", "after", "sequential", "extraction", "with", "detergents", "with", "increased", "strength", ".", "Soluble", "(", "Sol", ".", ")", ",", "lowly", "insoluble", "(", "L", ".", "Insol", ".", ")", "and", "highly", "insoluble", "(", "H", ".", "Insol", ".", ")", "forms", "correspond", "to", "the", "protein", "solubilized", "respectively", "in", "Triton", "-", "X100", ",", "SDS", "10", "%", "and", "8M", "UREA", ".", "(", "C", ")", "Co", "-", "immunofluorescence", "analysis", "of", "α", "-", "synuclein", "with", "SMI", "-", "32", "in", "WT", "and", "MPS", "-", "IIIA", "hippocampal", "neurons", "(", "DIV14", ")", ".", "α", "-", "Synuclein", "synaptic", "puncta", "present", "in", "a", "neurite", "tract", "of", "10µm", "is", "showed", "in", "a", "representative", "enlarged", "image", ".", "Quantification", "of", "α", "-", "synuclein", "synaptic", "puncta", "was", "calculated", "from", "30", "different", "enlarged", "images", "c", ".", "(", "D", ")", "Confocal", "analysis", "of", "α", "-", "synuclein", "(", "green", ")", "and", "LAMP1", "(", "red", ")", "in", "WT", "and", "MPS", "-", "IIIA", "hippocampal", "neurons", "(", "DIV14", ")", ".", "Enlarged", "merge", "images", "are", "also", "shown", ".", "Co", "-", "localization", "was", "quantified", "using", "the", "MCC", "coefficient", "(", "ImageJ", ")", "and", "displayed", "as", "%", "(", "MCC", "x", "100", ")", "of", "α", "-", "synuclein", "co", "-", "localizing", "with", "LAMP1", "(", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "from", "15", "different", "images", "taken", "from", "4", "-", "5", "coverslips", "for", "each", "group", ")", ".", "(", "E", ")", "CSPα", "was", "immunoblotted", "in", "WT", "and", "MPS", "-", "IIIA", "total", "brain", "lysates", "at", "indicated", "ages", "after", "sequential", "extraction", "with", "detergents", "with", "increased", "strength", "as", "in", "(", "B", ")", ".", "(", "F", ")", "Co", "-", "immunofluorescence", "analysis", "of", "CSPα", "and", "SMI", "-", "32", "in", "DIV14", "hippocampal", "neurons", ".", "CSPα", "-", "synaptic", "puncta", "were", "quantified", "as", "in", "(", "C", ")", ".", "(", "G", ")", "CSPα", "protein", "levels", "were", "evaluated", "by", "immunoblot", "analysis", "in", "WT", "and", "MPS", "-", "IIIA", "hippocampal", "neurons", "(", "DIV14", ")", "at", "different", "times", "after", "cycloheximide", "treatment", "and", "expressed", "as", "%", "of", "remaining", "protein", "at", "T0", "(", "100", "%", ")", ".", "The", "proteasome", "was", "inhibited", "as", "indicated", ".", "(", "H", ")", "Palmitoylation", "-", "dependent", "shift", "in", "the", "molecular", "weight", "of", "CSPα", "was", "evaluated", "in", "WT", "and", "MPS", "-", "IIIA", "brain", "samples", "at", "indicated", "ages", "by", "immunoblotting", "CSPα", "in", "boiled", "samples", "prepared", "without", "exposure", "to", "sulphydryl", "agents", "(", "beta", "-", "mercaptoethanol", "or", "dithiothreitol", ")", ".", "(", "I", ")", "The", "protein", "levels", "of", "RPN10", "(", "the", "regulatory", "subunit", "of", "26S", "proteasome", ")", "and", "ubiquitinated", "proteins", "formed", "by", "Lys", "-", "48", "(", "K48", ")", "residue", "linkage", "(", "involved", "in", "protein", "degradation", "via", "the", "proteasome", ")", "were", "evaluated", "in", "WT", "and", "MPS", "-", "IIIA", "brain", "samples", "at", "indicated", "ages", "by", "WB", "analysis", ".", "WB", "quantitation", "was", "shown", ".", "(", "L", ")", "Proteasome", "activity", "was", "evaluated", "by", "measuring", "the", "chymotrypsin", "-", "like", "activity", "in", "WT", "and", "MPS", "-", "IIIA", "mouse", "brain", "samples", "at", "different", "ages", ".", "Proteasome", "activity", "was", "expressed", "as", "%", "of", "WT"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) WB analysis of LC3 and p62 (an autophagy substrate) was performed on WT and MPS-IIIA brain samples at indicated ages. WB quantitation was shown.(B) α-Synuclein was immunoblotted in WT and MPS-IIIA both total and synaptosomal brain fractions at indicated ages after sequential extraction with detergents with increased strength. Soluble (Sol.), lowly insoluble (L. Insol.) and highly insoluble (H. Insol.) forms correspond to the protein solubilized respectively in Triton-X100, SDS 10% and 8M UREA.(C) Co-immunofluorescence analysis of α-synuclein with SMI-32 in WT and MPS-IIIA hippocampal neurons (DIV14). α-Synuclein synaptic puncta present in a neurite tract of 10µm is showed in a representative enlarged image. Quantification of α-synuclein synaptic puncta was calculated from 30 different enlarged images c.(D) Confocal analysis of α-synuclein (green) and LAMP1 (red) in WT and MPS-IIIA hippocampal neurons (DIV14). Enlarged merge images are also shown. Co-localization was quantified using the MCC coefficient (ImageJ) and displayed as % (MCC x 100) of α-synuclein co-localizing with LAMP1 (means ± s.e.m. from 15 different images taken from 4-5 coverslips for each group).(E) CSPα was immunoblotted in WT and MPS-IIIA total brain lysates at indicated ages after sequential extraction with detergents with increased strength as in (B).(F) Co-immunofluorescence analysis of CSPα and SMI-32 in DIV14 hippocampal neurons. CSPα- synaptic puncta were quantified as in (C).(G) CSPα protein levels were evaluated by immunoblot analysis in WT and MPS-IIIA hippocampal neurons (DIV14) at different times after cycloheximide treatment and expressed as % of remaining protein at T0 (100 %). The proteasome was inhibited as indicated.(H) Palmitoylation-dependent shift in the molecular weight of CSPα was evaluated in WT and MPS-IIIA brain samples at indicated ages by immunoblotting CSPα in boiled samples prepared without exposure to sulphydryl agents (beta-mercaptoethanol or dithiothreitol).(I) The protein levels of RPN10 (the regulatory subunit of 26S proteasome) and ubiquitinated proteins formed by Lys-48 (K48) residue linkage (involved in protein degradation via the proteasome) were evaluated in WT and MPS-IIIA brain samples at indicated ages by WB analysis. WB quantitation was shown.(L) Proteasome activity was evaluated by measuring the chymotrypsin-like activity in WT and MPS-IIIA mouse brain samples at different ages. Proteasome activity was expressed as % of WT activity"}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Autophagy", "was", "monitored", "in", "WT", "hippocampal", "neurons", "treated", "with", "the", "lysosome", "inhibitor", "'", "s", "cocktail", "for", "3", "days", "by", "immunoblot", "analysis", "with", "anti", "-", "LC3", "antibodies", ".", "As", "control", "DIV10", "WT", "neurons", "were", "left", "untreated", "and", "monitored", "by", "LC3", "blot", "over", "the", "three", "days", "period", ".", "The", "LC3", "-", "II", "levels", "quantitation", "was", "shown", ".", "(", "B", ")", "Proteasome", "activity", "was", "measured", "in", "treated", "and", "control", "untreated", "WT", "neurons", "using", "pZsProSensor", "-", "1", "vector", "(", "green", ")", ".", "Cells", "were", "co", "-", "stained", "with", "anti", "SMI", "-", "32", "(", "blu", ")", ".", "Proteasome", "activity", "was", "quantified", "by", "measuring", "the", "green", "fluorescence", "(", "inversely", "correlated", "with", "proteasome", "activity", ")", "in", "10", "different", "cells", "(", "taken", "from", "4", "-", "5", "coverslips", "for", "each", "group", ")", "and", "expressed", "as", "fold", "to", "WT", ".", "(", "C", ")", "Activation", "of", "calpain", "2", "and", "caspase", "-", "3", "proteolytic", "systems", "was", "evaluated", "by", "WB", "measurement", "of", "the", "protein", "levels", "of", "calpain", "2", "and", "caspase", "-", "3", "(", "both", "full", "-", "length", "and", "activated", "cleaved", "forms", "of", "~", "17", "KDa", ")", "in", "treated", "and", "control", "untreated", "WT", "neurons", ".", "Arrow", "indicated", "the", "full", "-", "length", "caspase", "-", "3", "protein", ".", "(", "D", ")", "After", "3", "days", "-", "treatment", "cell", "lysates", "from", "treated", "and", "control", "untreated", "WT", "neurons", "were", "immunoblotted", "with", "α", "-", "synuclein", "and", "CSPα", "and", "protein", "levels", "were", "quantified", ".", "(", "E", ")", "Treated", "and", "control", "untreated", "WT", "neurons", "were", "subjected", "to", "α", "-", "synuclein", "(", "green", ")", "and", "LAMP1", "(", "red", ")", "confocal", "analysis", ".", "Enlarged", "merge", "images", "are", "also", "shown", ".", "Co", "-", "localization", "was", "quantified", "using", "the", "MCC", "coefficient", "(", "ImageJ", ")", "and", "displayed", "as", "%", "(", "MCC", "x", "100", ")", "of", "α", "-", "synuclein", "co", "-", "localizing", "with", "LAMP1", "(", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "from", "15", "different", "images", "taken", "from", "4", "-", "5", "coverslips", "for", "each", "group", ")", ".", "Cells", "were", "also", "co", "-", "stained", "with", "anti", "SMI", "-", "32", ".", "(", "F", ")", "Treated", "and", "control", "untreated", "WT", "neurons", "were", "subjected", "to", "CSPα", "/", "SMI", "-", "32", "co", "-", "immunofluorescence", ".", "CSPα", "synaptic", "puncta", "present", "in", "a", "neurite", "tract", "of", "10µm", "is", "showed", "in", "a", "representative", "enlarged", "image", ".", "Quantification", "of", "CSPα", "synaptic", "puncta", "was", "calculated", "from", "30", "different", "enlarged", "images", "taken", "from", "4", "-", "5", "coverslips", "for", "each", "group", ".", "(", "G", ")", "SDS", "-", "resistant", "complex", "levels", "in", "treated", "and", "control", "untreated", "WT", "neurons", "were", "evaluated", "by", "immunoblotting", "analysis", "of", "non", "-", "boiled", "samples", "with", "VAMP2", "or", "SNAP", "-", "25", "antibodies", ".", "The", "amounts", "of", "SNARE", "complexes", "were", "quantified", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Autophagy was monitored in WT hippocampal neurons treated with the lysosome inhibitor's cocktail for 3 days by immunoblot analysis with anti-LC3 antibodies. As control DIV10 WT neurons were left untreated and monitored by LC3 blot over the three days period. The LC3-II levels quantitation was shown.(B) Proteasome activity was measured in treated and control untreated WT neurons using pZsProSensor-1 vector (green). Cells were co-stained with anti SMI-32 (blu). Proteasome activity was quantified by measuring the green fluorescence (inversely correlated with proteasome activity) in 10 different cells (taken from 4-5 coverslips for each group) and expressed as fold to WT.(C) Activation of calpain 2 and caspase-3 proteolytic systems was evaluated by WB measurement of the protein levels of calpain 2 and caspase-3 (both full-length and activated cleaved forms of ~17 KDa) in treated and control untreated WT neurons. Arrow indicated the full-length caspase-3 protein.(D) After 3 days-treatment cell lysates from treated and control untreated WT neurons were immunoblotted with α-synuclein and CSPα and protein levels were quantified.(E) Treated and control untreated WT neurons were subjected to α-synuclein (green) and LAMP1 (red) confocal analysis. Enlarged merge images are also shown. Co-localization was quantified using the MCC coefficient (ImageJ) and displayed as % (MCC x 100) of α-synuclein co-localizing with LAMP1 (means ± s.e.m. from 15 different images taken from 4-5 coverslips for each group). Cells were also co-stained with anti SMI-32.(F) Treated and control untreated WT neurons were subjected to CSPα/SMI-32 co-immunofluorescence. CSPα synaptic puncta present in a neurite tract of 10µm is showed in a representative enlarged image. Quantification of CSPα synaptic puncta was calculated from 30 different enlarged images taken from 4-5 coverslips for each group.(G) SDS-resistant complex levels in treated and control untreated WT neurons were evaluated by immunoblotting analysis of non-boiled samples with VAMP2 or SNAP-25 antibodies. The amounts of SNARE complexes were quantified."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "α", "-", "Synuclein", ",", "CSPα", ",", "VAMP2", "and", "SNAP", "-", "25", "were", "immunoblotted", "in", "total", "brain", "homogenates", "and", "/", "or", "synaptosomal", "fractions", "of", "1", ".", "5", "month", "-", "old", "WT", "(", "CSPα", "+", "/", "+", "/", "α", "-", "syn", "+", "/", "+", ")", ",", "CSPα", "-", "/", "-", ",", "CSPα", "+", "/", "-", ",", "α", "-", "syn", "-", "/", "-", ",", "α", "-", "syn", "+", "/", "-", "and", "CSPα", "+", "/", "-", "/", "α", "-", "syn", "+", "/", "-", ".", "Synapsin", "-", "1", "was", "also", "blotted", "as", "a", "control", ".", "Quantitation", "of", "WB", "in", "synaptosomal", "samples", "was", "shown", ".", "(", "B", ")", "SDS", "-", "resistant", "complex", "levels", "were", "evaluated", "in", "brain", "homogenates", "derived", "from", "mice", "with", "indicated", "genotypes", "by", "immunoblotting", "of", "non", "-", "boiled", "samples", "with", "VAMP2", "or", "Syntaxin", "-", "1", "antibodies", ".", "Quantitation", "of", "WB", "was", "shown", ".", "(", "C", ")", "EM", "analysis", "of", "cortical", "synapses", "derived", "from", "mice", "with", "indicated", "genotypes", ".", "The", "number", "of", "synaptic", "vesicles", "per", "synapse", "was", "quantified", "from", "40", "different", "images", "(", "taken", "from", "5", "different", "mice", "for", "each", "genotype", ")", ",", "normalized", "by", "the", "length", "of", "synaptic", "cleft", "and", "expressed", "as", "%", "of", "WT", ".", "The", "size", "of", "synaptic", "vesicles", "was", "quantified", "from", "400", "-", "500", "vesicles", "(", "taken", "from", "5", "different", "mice", "for", "each", "genotype", ")", "and", "expressed", "as", "the", "average", "of", "vesicle", "diameter", "(", "nm", ")", "Arrows", "indicate", "the", "synaptic", "cleft", ".", "(", "D", ")", "Extracellular", "recordings", "(", "fEPSPs", ")", "in", "hippocampal", "brain", "slices", "from", "1", ".", "5", "months", "-", "old", "WT", "(", "CSPα", "+", "/", "+", "/", "α", "-", "syn", "+", "/", "+", ")", "and", "CSPα", "+", "/", "-", "/", "α", "-", "syn", "+", "/", "-", "mice", ".", "The", "left", "panel", "shows", "representative", "fEPSP", "traces", ".", "Summary", "graphs", "show", "the", "fEPSPs", "slope", "as", "a", "function", "of", "either", "the", "applied", "stimulus", "intensity", "or", "the", "prevolley", "amplitude", ".", "Data", "are", "the", "average", "of", "the", "values", "from", "5", "slices", "(", "from", "4", "mice", ")", "in", "the", "WT", "group", "and", "5", "slices", "(", "from", "4", "mice", ")", "in", "the", "CSPα", "+", "/", "-", "/", "α", "-", "syn", "+", "/", "-", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "repeated", "measure", "ANOVA", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) α-Synuclein, CSPα, VAMP2 and SNAP-25 were immunoblotted in total brain homogenates and/or synaptosomal fractions of 1.5 month-old WT (CSPα+/+/α-syn+/+), CSPα-/-, CSPα+/-, α-syn-/-, α-syn+/- and CSPα+/-/α-syn+/-. Synapsin-1 was also blotted as a control. Quantitation of WB in synaptosomal samples was shown.(B) SDS-resistant complex levels were evaluated in brain homogenates derived from mice with indicated genotypes by immunoblotting of non-boiled samples with VAMP2 or Syntaxin-1 antibodies. Quantitation of WB was shown.(C) EM analysis of cortical synapses derived from mice with indicated genotypes. The number of synaptic vesicles per synapse was quantified from 40 different images (taken from 5 different mice for each genotype), normalized by the length of synaptic cleft and expressed as % of WT. The size of synaptic vesicles was quantified from 400-500 vesicles (taken from 5 different mice for each genotype) and expressed as the average of vesicle diameter (nm) Arrows indicate the synaptic cleft.(D) Extracellular recordings (fEPSPs) in hippocampal brain slices from 1.5 months-old WT (CSPα+/+/α-syn+/+) and CSPα+/-/α-syn+/- mice. The left panel shows representative fEPSP traces. Summary graphs show the fEPSPs slope as a function of either the applied stimulus intensity or the prevolley amplitude. Data are the average of the values from 5 slices (from 4 mice) in the WT group and 5 slices (from 4 mice) in the CSPα+/-/α-syn+/-. *p<0.05, repeated measure ANOVA."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Anti", "-", "myc", "immunostaining", "in", "different", "brain", "regions", "derived", "from", "10", "-", "months", "-", "old", "MPS", "-", "IIIA", "mice", "intraventricularly", "injected", "with", "AAV2", "/", "9", "vectors", "encoding", "CSPα", "under", "Synapsin", "-", "1", "promoter", "(", "MPS", "-", "IIIA", "-", "myc", "-", "CSPα", "experimental", "group", ")", ".", "As", "a", "control", "immunostaining", "was", "performed", "in", "brain", "sections", "from", "10", "-", "months", "-", "old", "MPS", "-", "IIIA", "mice", "injected", "with", "empty", "AAV2", "/", "9", "vectors", "(", "MPS", "-", "IIIA", "-", "empty", "experimental", "groups", ")", ".", "To", "evaluate", "co", "-", "localization", "between", "exogenous", "CSPα", "and", "presynaptic", "compartment", "brain", "sections", "were", "also", "co", "-", "stained", "with", "anti", "-", "myc", "and", "anti", "-", "synapsin1", "antibodies", "(", "confocal", "images", "are", "also", "shown", ")", ".", "(", "B", ")", "Anti", "-", "myc", "WB", "in", "synaptosomal", "fractions", "derived", "from", "MPS", "-", "IIIA", "-", "myc", "-", "CSPα", "mice", ".", "As", "a", "control", "WB", "was", "performed", "in", "samples", "from", "10", "-", "months", "-", "old", "WT", "and", "MPS", "-", "IIIA", "mice", "injected", "with", "empty", "AAV2", "/", "9", "vectors", "(", "WT", "-", "empty", "and", "MPS", "-", "IIIA", "-", "empty", "experimental", "groups", ")", ".", "Synaptosomal", "fractions", "were", "also", "blotted", "with", "anti", "-", "CSPα", ".", "(", "C", ")", "VAMP2", ",", "SNAP", "-", "25", "and", "Syntaxin", "-", "1", "were", "immunoblotted", "in", "synaptosomal", "samples", "derived", "from", "the", "three", "experimental", "groups", "of", "mice", ".", "Protein", "levels", "were", "quantified", ".", "(", "D", ")", "The", "amount", "of", "SNARE", "-", "complexes", "was", "detected", "in", "synaptosomal", "brain", "samples", "derived", "from", "the", "three", "experimental", "groups", "of", "mice", "by", "immunoblotting", "analysis", "of", "non", "-", "boiled", "samples", "with", "VAMP2", ",", "SNAP", "-", "25", "or", "Syntaxin", "-", "1", "antibodies", ".", "The", "amounts", "of", "SNARE", "complexes", "were", "quantified", ".", "(", "E", ")", "Total", "brain", "lysates", "derived", "from", "the", "three", "experimental", "groups", "of", "mice", "were", "immunoprecipitated", "with", "Syntaxin", "-", "1", "antibodies", "and", "co", "-", "immunoprecipitated", "VAMP2", "and", "SNAP", "-", "25", "proteins", "were", "revealed", "by", "WB", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Anti-myc immunostaining in different brain regions derived from 10-months-old MPS-IIIA mice intraventricularly injected with AAV2/9 vectors encoding CSPα under Synapsin-1 promoter (MPS-IIIA-myc-CSPα experimental group). As a control immunostaining was performed in brain sections from 10-months-old MPS-IIIA mice injected with empty AAV2/9 vectors (MPS-IIIA-empty experimental groups). To evaluate co-localization between exogenous CSPα and presynaptic compartment brain sections were also co-stained with anti-myc and anti-synapsin1 antibodies (confocal images are also shown).(B) Anti-myc WB in synaptosomal fractions derived from MPS-IIIA-myc-CSPα mice. As a control WB was performed in samples from 10-months-old WT and MPS-IIIA mice injected with empty AAV2/9 vectors (WT-empty and MPS-IIIA-empty experimental groups). Synaptosomal fractions were also blotted with anti-CSPα.(C) VAMP2, SNAP-25 and Syntaxin-1 were immunoblotted in synaptosomal samples derived from the three experimental groups of mice. Protein levels were quantified.(D) The amount of SNARE-complexes was detected in synaptosomal brain samples derived from the three experimental groups of mice by immunoblotting analysis of non-boiled samples with VAMP2, SNAP-25 or Syntaxin-1 antibodies. The amounts of SNARE complexes were quantified.(E) Total brain lysates derived from the three experimental groups of mice were immunoprecipitated with Syntaxin-1 antibodies and co-immunoprecipitated VAMP2 and SNAP-25 proteins were revealed by WB."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "A", ")", "EM", "analysis", "of", "cortical", "and", "hippocampal", "synapsis", "derived", "from", "the", "three", "experimental", "groups", "of", "mice", ".", "Synaptic", "vesicles", "number", "per", "synapse", "was", "quantified", "from", "~", "40", "different", "images", "(", "taken", "from", "5", "mice", "for", "each", "group", ")", ",", "normalized", "by", "the", "length", "of", "synaptic", "cleft", "and", "expressed", "as", "%", "of", "WT", ".", "The", "synaptic", "density", "was", "measured", "from", "20", "different", "images", "(", "taken", "from", "5", "mice", "for", "each", "group", ")", "as", "the", "number", "of", "synapses", "/", "area", "(", "#", "/", "500μm2", ")", "and", "expressed", "as", "%", "of", "WT", ".", "Arrows", "indicate", "the", "synaptic", "cleft", "while", "asterisks", "indicate", "abnormal", "vacuoles", ".", "Values", "are", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ":", "Either", "MPS", "-", "IIIA", "-", "empty", "or", "MPS", "-", "IIIA", "-", "myc", "-", "CSPα", "vs", "WT", "-", "empty", ".", "Scale", "bar", ":", "0", ".", "2", "µm", "(", "B", ")", "Extracellular", "recordings", "(", "fEPSPs", ")", "in", "hippocampal", "brain", "slices", "from", "WT", "-", "empty", "(", "n", "=", "8", ")", ",", "MPS", "-", "IIIA", "-", "empty", "(", "n", "=", "5", ")", "and", "MPS", "-", "IIIA", "-", "myc", "-", "CSPα", "mice", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "The", "upper", "panel", "shows", "representative", "fEPSP", "traces", ".", "Summary", "graph", "shows", "the", "fEPSPs", "slope", "as", "a", "function", "of", "the", "applied", "stimulus", "intensity", ".", "Data", "are", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "WT", "-", "empty", "vs", "MPS", "-", "IIIA", "-", "empty", ")", ",", "#", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "MPS", "-", "IIIA", "-", "myc", "-", "CSPα", "vs", ".", "MPS", "-", "IIIA", "-", "empty", ")", ",", "Kruskal", "-", "Wallis", "ANOVA", "followed", "by", "Dunn", "'", "s", "test", ".", "(", "C", ")", "Mean", "distance", "travelled", ",", "maximal", "speed", ",", "immobility", "time", "and", "line", "crossing", "during", "10", "min", "testing", "in", "the", "open", "field", ",", "divided", "into", "5", "minute", "intervals", "in", "WT", "-", "empty", ",", "MPS", "-", "IIIA", "-", "empty", "and", "MPS", "-", "IIIA", "-", "myc", "-", "CSPα", "female", "mice", "(", "n", "=", "9", ",", "n", "=", "9", ",", "n", "=", "7", "respectively", ")", ".", "Distance", ",", "percentage", "open", "entries", "and", "open", "time", "in", "the", "elevated", "plus", "maze", "and", "latency", "to", "fall", "off", "the", "wire", "(", "*", "body", "weight", ")", "in", "the", "wire", "hanging", "test", "in", "WT", "-", "empty", ",", "MPS", "-", "IIIA", "-", "empty", "and", "MPS", "-", "IIIA", "-", "myc", "-", "CSPα", "male", "mice", "(", "n", "=", "10", ",", "n", "=", "8", ",", "n", "=", "9", "respectively", ")", ".", "Values", "are", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "MPS", "-", "IIIA", "-", "empty", "vs", ".", "WT", "-", "empty", ")", ",", "#", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "MPS", "-", "IIIA", "-", "myc", "-", "CSPα", "vs", ".", "MPS", "-", "IIIA", "-", "empty", ")", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", "for", "repeated", "measures", "for", "open", "field", "measures", "and", "t", "-", "test", "for", "the", "plus", "maze", "and", "the", "wire", "hanging", "followed", "by", "Duncan", "post", "-", "hoc", "test", ".", "Animals", "'", "average", "age", "was", "28", "±", "2", "weeks", ".", "(", "D", ")", "Neuronal", "cell", "death", "was", "evaluated", "in", "the", "cerebellum", "(", "Calbindin", "immunostaining", ")", "and", "in", "different", "layers", "of", "cortex", "(", "NeuN", "immunostaining", "of", "frontal", "cortex", ")", "of", "10", "months", "-", "old", "mice", "belonging", "to", "each", "experimental", "group", "of", "mice", ".", "Number", "of", "cells", "was", "quantified", "from", "20", "different", "images", "(", "taken", "from", "5", "mice", "for", "each", "group", ")", "and", "expressed", "as", "%", "of", "WT", ".", "Values", "are", "means", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "µm", ".", "(", "E", ")", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "analysis", "in", "WT", "-", "empty", "(", "n", "=", "13", ")", ",", "MPS", "-", "IIIA", "-", "empty", "(", "n", "=", "13", ")", "and", "MPS", "-", "IIIA", "-", "myc", "-", "CSPα", "(", "n", "=", "13", ")", "male", "mice", ".", "The", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "curve", "was", "analyzed", "with", "the", "Chi", "-", "square", "test", ".", "A", "P", "value", "<", "0", ".", "05", "was", "considered", "to", "be", "statistically", "significant", ".", "P", "=", "0", ".", "00003", "(", "MPS", "-", "IIIA", "-", "empty", "vs", "WT", "-", "empty", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "000776", "(", "MPS", "-", "IIIA", "-", "myc", "-", "CSPα", "vs", "MPS", "-", "IIIA", "-", "empty", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(A) EM analysis of cortical and hippocampal synapsis derived from the three experimental groups of mice. Synaptic vesicles number per synapse was quantified from ~40 different images (taken from 5 mice for each group), normalized by the length of synaptic cleft and expressed as % of WT. The synaptic density was measured from 20 different images (taken from 5 mice for each group) as the number of synapses/area(#/500μm2) and expressed as % of WT. Arrows indicate the synaptic cleft while asterisks indicate abnormal vacuoles. Values are means ± s.e.m. *P<0.05, Student's t-test: Either MPS-IIIA-empty or MPS-IIIA-myc-CSPα vs WT-empty. Scale bar: 0.2 µm(B) Extracellular recordings (fEPSPs) in hippocampal brain slices from WT-empty (n=8), MPS-IIIA-empty (n=5) and MPS-IIIA-myc-CSPα mice (n=5). The upper panel shows representative fEPSP traces. Summary graph shows the fEPSPs slope as a function of the applied stimulus intensity. Data are means ± s.e.m.; *P < 0.05 (WT-empty vs MPS-IIIA-empty), #P < 0.05 (MPS-IIIA-myc-CSPα vs. MPS-IIIA-empty), Kruskal-Wallis ANOVA followed by Dunn's test.(C) Mean distance travelled, maximal speed, immobility time and line crossing during 10 min testing in the open field, divided into 5 minute intervals in WT-empty, MPS-IIIA-empty and MPS-IIIA-myc-CSPα female mice (n=9, n=9, n=7 respectively). Distance, percentage open entries and open time in the elevated plus maze and latency to fall off the wire (*body weight) in the wire hanging test in WT-empty, MPS-IIIA-empty and MPS-IIIA-myc-CSPα male mice (n=10, n=8, n=9 respectively). Values are means ± s.e.m; *P < 0.05 (MPS-IIIA-empty vs. WT-empty), #P < 0.05 (MPS-IIIA-myc-CSPα vs. MPS-IIIA-empty), two-way ANOVA for repeated measures for open field measures and t-test for the plus maze and the wire hanging followed by Duncan post-hoc test. Animals' average age was 28±2 weeks.(D) Neuronal cell death was evaluated in the cerebellum (Calbindin immunostaining) and in different layers of cortex (NeuN immunostaining of frontal cortex) of 10 months-old mice belonging to each experimental group of mice. Number of cells was quantified from 20 different images (taken from 5 mice for each group) and expressed as % of WT. Values are means ± s.e.m. *P<0.05, **P<0.001 Student's t-test. Scale bar: 50 µm.(E) Kaplan-Meier survival analysis in WT-empty (n=13), MPS-IIIA-empty (n=13) and MPS-IIIA-myc-CSPα (n=13) male mice. The Kaplan-Meier survival curve was analyzed with the Chi-square test. A P value <0.05 was considered to be statistically significant. P= 0.00003 (MPS-IIIA-empty vs WT-empty), P= 0.000776 (MPS-IIIA-myc-CSPα vs MPS-IIIA-empty)."}
{"words": ["Figure", "1A", "Number", "of", "differentially", "up", "-", "and", "down", "-", "regulated", "genes", "(", "DEG", ")", "in", "RNAi", "-", "ASCO1", "seedlings", "as", "compared", "to", "wild", "type", "(", "WT", ")", "according", "to", "the", "RNA", "-", "seq", "data", "(", "FDR", "<", "0", ".", "01", ",", "|", "log2FC", "|", ">", "=", "0", ".", "75", ")", ".", "B", "Fraction", "of", "DEG", "found", "in", "each", "transcript", "class", "as", "defined", "in", "the", "Araport11", "gene", "annotation", ".", "AS", "stands", "for", "antisense", ".", "D", "Representative", "picture", "of", "14", "-", "day", "-", "old", "plants", "grown", "9", "days", "in", "liquid", "1", "/", "2MS", "supplemented", "with", "1", "µM", "flg22", ".", "The", "scale", "bar", "representing", "0", ".", "6cm", "is", "included", "in", "the", "picture", ".", "E", "Lateral", "root", "density", "of", "WT", "and", "two", "independent", "RNAi", "-", "ASCO", "lines", "9", "days", "after", "transfer", "in", "1", "/", "2MS", "supplemented", "with", "0", ".", "1", "µM", "or", "1", "µM", "flg22", ".", "F", "Representative", "picture", "of", "root", "apical", "meristems", "after", "cell", "wall", "staining", ",", "in", "response", "to", "flg22", ".", "TZ", ":", "Transition", "Zone", ";", "QC", ":", "Quiescent", "Center", ".", "G", "Root", "apical", "meristem", "size", "of", "WT", "and", "RNAi", "-", "ASCO1", "(", "eg", "distance", "from", "QC", "to", "TZ", "in", "µm", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A Number of differentially up- and down-regulated genes (DEG) in RNAi-ASCO1 seedlings as compared to wild type (WT) according to the RNA-seq data (FDR < 0.01, |log2FC| >= 0.75). B Fraction of DEG found in each transcript class as defined in the Araport11 gene annotation. AS stands for antisense. D Representative picture of 14-day-old plants grown 9 days in liquid 1/2MS supplemented with 1 µM flg22. The scale bar representing 0.6cm is included in the picture. E Lateral root density of WT and two independent RNAi-ASCO lines 9 days after transfer in 1/2MS supplemented with 0.1 µM or 1 µM flg22.  F Representative picture of root apical meristems after cell wall staining, in response to flg22. TZ: Transition Zone; QC: Quiescent Center. G Root apical meristem size of WT and RNAi-ASCO1 (eg distance from QC to TZ in µm). "}
{"words": ["Figure", "2B", "Number", "of", "genes", "containing", "at", "least", "one", "differential", "RNA", "processing", "event", "(", "as", "defined", "by", "RNAprof", "p", ".", "adj", "<", "0", ".", "001", ")", "in", "CDS", ",", "introns", ",", "5", "'", "UTR", "and", "3", "'", "UTR", "between", "RNAi", "-", "ASCO1", "and", "WT", ".", "Up", "and", "Down", "fractions", "correspond", "to", "increase", "or", "decrease", ",", "respectively", ",", "of", "RNA", "-", "seq", "coverage", "in", "RNAi", "-", "ASCO1", "for", "each", "specified", "gene", "feature", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B Number of genes containing at least one differential RNA processing event (as defined by RNAprof p.adj < 0.001) in CDS, introns, 5'UTR and 3'UTR between RNAi-ASCO1 and WT. Up and Down fractions correspond to increase or decrease, respectively, of RNA-seq coverage in RNAi-ASCO1 for each specified gene feature."}
{"words": ["Figure", "3", "B", "Scatter", "plot", "showing", "the", "respective", "gene", "expression", "fold", "change", "in", "RNAi", "-", "ASCO", "and", "35S", ":", "ASCO", "lines", "as", "compared", "to", "WT", ".", "Genes", "showing", "significant", "changes", "in", "RNAi", "-", "ASCO", "and", "35S", ":", "ASCO", "are", "highlighted", "as", "yellow", "and", "blue", "dots", ",", "respectively", ".", "C", "Scatter", "plots", "showing", "the", "respective", "Percent", "Spliced", "In", "difference", "(", "dPSI", ")", "in", "RNAi", "-", "ASCO", "and", "35S", ":", "ASCO", "lines", "as", "compared", "to", "WT", ".", "Genes", "showing", "significant", "changes", "in", "RNAi", "-", "ASCO", ",", "35S", ":", "ASCO", "or", "in", "both", "lines", "are", "highlighted", "as", "red", ",", "green", "or", "blue", "dot", ",", "respectively", ".", "Gray", "dots", "represent", "all", "AS", "events", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3 B Scatter plot showing the respective gene expression fold change in RNAi-ASCO and 35S:ASCO lines as compared to WT. Genes showing significant changes in RNAi-ASCO and 35S:ASCO are highlighted as yellow and blue dots, respectively.  C Scatter plots showing the respective Percent Spliced In difference (dPSI) in RNAi-ASCO and 35S:ASCO lines as compared to WT. Genes showing significant changes in RNAi-ASCO, 35S:ASCO or in both lines are highlighted as red, green or blue dot, respectively. Gray dots represent all AS events. "}
{"words": ["Figure", "4", "Analyses", "of", "RT", "-", "PCR", "products", "of", "SR34", "transcripts", "on", "8", "%", "acrylamide", "gel", ".", "Quantification", "of", "the", "ratio", "of", "SR34", "isoforms", "detected", "in", "the", "gel", "in", "(", "B", ")", "RNAs", "were", "extracted", "from", "WT", "and", "RNAi", "-", "ASCO1", "14", "-", "day", "-", "old", "plants", ".", "The", "asterisk", "(", "*", ")", "indicates", "a", "significant", "difference", "as", "determined", "by", "Student", "'", "s", "T", "test", "(", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "Error", "bars", "show", "mean", "+", "/", "-", "standard", "deviation", ".", "Analyses", "of", "RT", "-", "PCR", "products", "of", "NUDT7", "transcripts", "on", "8", "%", "acrylamide", "gel", ".", "Quantification", "of", "the", "ratio", "of", "NUDT7", "isoforms", "detected", "in", "the", "gel", "in", "(", "E", ")", "respectively", ".", "RNAs", "were", "extracted", "from", "WT", "and", "RNAi", "-", "ASCO1", "14", "-", "day", "-", "old", "plants", ".", "The", "asterisk", "(", "*", ")", "indicates", "a", "significant", "difference", "as", "determined", "by", "Student", "'", "s", "T", "test", "(", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "Error", "bars", "show", "mean", "+", "/", "-", "standard", "deviation", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4 Analyses of RT-PCR products of SR34 transcripts on 8% acrylamide gel. Quantification of the ratio of SR34 isoforms detected in the gel in (B) RNAs were extracted from WT and RNAi-ASCO1 14-day-old plants. The asterisk (*) indicates a significant difference as determined by Student's T test (p < 0.05, n = 3 biological replicates). Error bars show mean +/- standard deviation.  Analyses of RT-PCR products of NUDT7 transcripts on 8% acrylamide gel. Quantification of the ratio of NUDT7 isoforms detected in the gel in (E) respectively. RNAs were extracted from WT and RNAi-ASCO1 14-day-old plants. The asterisk (*) indicates a significant difference as determined by Student's T test (p < 0.05, n = 3 biological replicates). Error bars show mean +/- standard deviation. "}
{"words": ["Figure", "5", "A", "Analysis", "of", "ASCO", "enrichment", "by", "ChIRP", "using", "two", "sets", "of", "independent", "biotinylated", "probes", "ODD", "and", "EVEN", "compared", "to", "negative", "control", "with", "probes", "designed", "against", "the", "LacZ", "RNA", ".", "The", "fold", "enrichment", "was", "calculated", "between", "ODD", "or", "EVEN", "samples", "against", "LacZ", ".", "These", "samples", "were", "used", "for", "protein", "precipitation", "and", "Mass", "Spectrometry", "analyses", "(", "ChIRP", "-", "MS", ")", ",", "from", "which", "PRP8a", "was", "identified", "as", "a", "potential", "ASCO", "partner", ".", "B", "Validation", "of", "PRP8a", "-", "ASCO", "interaction", "by", "PRP8a", "-", "RIP", ".", "U5", "RNA", "was", "used", "as", "a", "positive", "control", ".", "Data", "information", ":", "In", ",", "the", "results", "are", "expressed", "as", "a", "percentage", "of", "the", "Input", "for", "PRP8a", "RIP", "followed", "by", "RT", "-", "qPCR", "C", "Immunoblot", "analysis", "was", "performed", "during", "PRP8a", "immunoprecipitation", "(", "IP", ")", ".", "The", "same", "volume", "of", "input", ",", "unbound", "fraction", "was", "loaded", "as", "well", "as", "20", "%", "of", "the", "eluted", "IP", "fraction", ".", "α", "-", "PRP8a", "and", "α", "-", "IgG", ":", "IP", "performed", "with", "anti", "-", "PRP8a", "or", "control", "rabbit", "IgG", "antibody", ",", "respectively", ".", ":", "In", "D", ",", "the", "results", "are", "expressed", "as", "a", "percentage", "of", "the", "Input", "for", "PRP8a", "RIP", "followed", "by", "RT", "-", "qPCR", ",", "and", "IgG", "RIP", "was", "used", "as", "a", "negative", "control", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5 A Analysis of ASCO enrichment by ChIRP using two sets of independent biotinylated probes ODD and EVEN compared to negative control with probes designed against the LacZ RNA. The fold enrichment was calculated between ODD or EVEN samples against LacZ. These samples were used for protein precipitation and Mass Spectrometry analyses (ChIRP-MS), from which PRP8a was identified as a potential ASCO partner.  B Validation of PRP8a-ASCO interaction by PRP8a-RIP. U5 RNA was used as a positive control. Data information: In , the results are expressed as a percentage of the Input for PRP8a RIP followed by RT-qPCR  C Immunoblot analysis was performed during PRP8a immunoprecipitation (IP). The same volume of input, unbound fraction was loaded as well as 20 % of the eluted IP fraction. α-PRP8a and α-IgG : IP performed with anti-PRP8a or control rabbit IgG antibody, respectively.  : In D, the results are expressed as a percentage of the Input for PRP8a RIP followed by RT-qPCR, and IgG RIP was used as a negative control. "}
{"words": ["Figure", "6", "A", "ASCO", "transcript", "levels", "in", "WT", "and", "prp8", "-", "7", "mutants", ".", "prp8", "-", "7", "leaky", "mutant", "displays", "similar", "AS", "events", "as", "observed", "in", "RNAi", "-", "ASCO", ".", "Quantification", "of", "SR34", "isoforms", "splicing", "index", "by", "RT", "-", "qPCR", ".", "C", "prp8", "-", "7", "leaky", "mutant", "displays", "similar", "AS", "events", "as", "observed", "in", "RNAi", "-", "ASCO", ".", "Quantification", "of", "ESP", "isoforms", "splicing", "index", "by", "RT", "-", "qPCR", ".", "D", "ASCO", "transcript", "levels", "in", "smd1b", "mutant", ".", "In", "A", "and", "D", "RNAs", "were", "extracted", "from", "WT", ",", "prp8", "-", "7", "and", "smd1b", "14", "-", "day", "-", "old", "plants", ".", "E", "SmD1b", "can", "bind", "ASCO", "in", "vivo", ".", "U6", "RNA", "was", "used", "as", "a", "positive", "control", "and", "a", "housekeeping", "gene", "(", "HKG2", ",", "AT4G26410", ")", "RNA", "as", "a", "negative", "control", ".", "F", "SmD1b", "recognizes", "in", "vivo", "the", "RNAs", "of", "4", "genes", "regulated", "by", "ASCO", ".", "In", "E", "and", "F", "the", "results", "were", "expressed", "as", "%", "INPUT", "in", "SmD1b", "-", "GFP", "RIP", "and", "IgG", "RIP", "used", "as", "a", "negative", "control", ".", "smd1b", "mutant", "displays", "similar", "AS", "events", "as", "observed", "in", "RNAi", "-", "ASCO", ".", "Quantification", "of", "SR34", "isoforms", "splicing", "index", "by", "RT", "-", "qPCR", ".", "H", "smd1b", "mutant", "displays", "similar", "AS", "events", "as", "observed", "in", "RNAi", "-", "ASCO", ".", "Quantification", "of", "ESP", "isoforms", "splicing", "index", "by", "RT", "-", "qPCR", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6 A ASCO transcript levels in WT and prp8-7 mutants. prp8-7 leaky mutant displays similar AS events as observed in RNAi-ASCO. Quantification of SR34 isoforms splicing index by RT-qPCR. C prp8-7 leaky mutant displays similar AS events as observed in RNAi-ASCO. Quantification of ESP isoforms splicing index by RT-qPCR.  D ASCO transcript levels in smd1b mutant. In A and D RNAs were extracted from WT, prp8-7 and smd1b 14-day-old plants.  E SmD1b can bind ASCO in vivo. U6 RNA was used as a positive control and a housekeeping gene (HKG2, AT4G26410) RNA as a negative control.  F SmD1b recognizes in vivo the RNAs of 4 genes regulated by ASCO. In E and F the results were expressed as % INPUT in SmD1b-GFP RIP and IgG RIP used as a negative control. smd1b mutant displays similar AS events as observed in RNAi-ASCO. Quantification of SR34 isoforms splicing index by RT-qPCR. H smd1b mutant displays similar AS events as observed in RNAi-ASCO. Quantification of ESP isoforms splicing index by RT-qPCR. "}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "Phenotypes", "of", "affected", "individuals", ".", "Camptodactyly", ",", "absent", "flexion", "crease", ",", "and", "limited", "forearm", "supination", "were", "observed", ".", "(", "C", "-", "E", ")", "T1", "weighted", "MRI", "scan", "on", "upper", "limbs", "of", "subject", "IV", ":", "7", ".", "(", "C", ")", "The", "pronator", "quadratus", "absence", "of", "affected", "side", "was", "indicated", "by", "a", "red", "arrow", ".", "(", "D", ")", "No", "difference", "was", "found", "in", "palmar", "muscles", ".", "(", "E", ")", "Loss", "of", "lumbrcalis", "and", "interosseus", "muscles", "of", "fifth", "finger", "of", "affected", "side", "was", "indicated", "by", "a", "red", "arrow", ".", "(", "F", "-", "H", ")", "T1", "weighted", "MRI", "scan", "on", "upper", "limbs", "of", "subject", "IV", ":", "8", ".", "(", "F", ")", "Increased", "epimysial", "fat", "was", "indicated", "by", "red", "arrow", ".", "(", "G", ")", "Completely", "loss", "of", "thenar", "eminences", "of", "both", "hands", "were", "indicated", "by", "red", "arrows", ".", "(", "H", ")", "Loss", "of", "radial", "lumbrcalis", "and", "interosseus", "muscles", "of", "both", "hands", "were", "indicated", "by", "red", "arrows", ".", "(", "I", ")", "The", "MET", "variants", "by", "Sanger", "sequencing", "was", "indicated", "by", "red", "arrow", ".", "(", "J", ")", "293T", "cells", "were", "transfected", "with", "FLAG", "-", "tagged", "MET", "/", "METMut", "/", "Vector", "plasmids", ",", "and", "48", "h", "post", "transfection", ",", "cells", "were", "treated", "with", "10", "ng", "/", "mL", "recombinant", "human", "HGF", "for", "1", "h", ".", "Then", "MET", "/", "METMut", "protein", "purification", "and", "tyrosine", "kinase", "assay", "were", "conducted", ".", "Western", "Blot", "pictures", "representative", "of", "n", "=", "3", "experiments", ".", "METMut", "means", "p", ".", "Y1234C", "mutant", "MET", ".", "EGFR", "means", "epidermal", "growth", "factor", "receptor", "and", "serves", "as", "a", "positive", "control", ".", "NC", "means", "negative", "control", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B) Phenotypes of affected individuals. Camptodactyly, absent flexion crease, and limited forearm supination were observed.(C-E) T1 weighted MRI scan on upper limbs of subject IV:7. (C) The pronator quadratus absence of affected side was indicated by a red arrow. (D) No difference was found in palmar muscles. (E) Loss of lumbrcalis and interosseus muscles of fifth finger of affected side was indicated by a red arrow. (F-H) T1 weighted MRI scan on upper limbs of subject IV:8. (F) Increased epimysial fat was indicated by red arrow. (G) Completely loss of thenar eminences of both hands were indicated by red arrows. (H) Loss of radial lumbrcalis and interosseus muscles of both hands were indicated by red arrows.(I) The MET variants by Sanger sequencing was indicated by red arrow.(J) 293T cells were transfected with FLAG-tagged MET/METMut/Vector plasmids, and 48 h post transfection, cells were treated with 10 ng/mL recombinant human HGF for 1 h. Then MET/METMut protein purification and tyrosine kinase assay were conducted. Western Blot pictures representative of n = 3 experiments. METMut means p.Y1234C mutant MET. EGFR means epidermal growth factor receptor and serves as a positive control. NC means negative control."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Gross", "appearance", "of", "wild", "-", "type", "and", "heterozygous", "newborns", ".", "(", "B", ")", "Graph", "showing", "weight", "of", "P0", "mice", ".", "Sample", "size", ":", "WT", "(", "n", "=", "4", ")", "and", "Hetero", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "follow", "by", "Dunnett", "'", "s", "post", "hoc", "test", ".", "Sections", "of", "spine", "from", "wild", "types", "and", "heterozygotes", "at", "P0", ",", "were", "conducted", "with", "HE", "staining", "and", "immunofluorescence", "staining", "using", "anti", "-", "myosin", "heavy", "chain", "antibody", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", ".", "Sections", "of", "forelimbs", ",", "hindlimbs", ",", "hand", ",", "and", "foot", "from", "wild", "types", "and", "heterozygotes", "at", "P0", ",", "were", "conducted", "with", "HE", "staining", "and", "immunofluorescence", "staining", "using", "anti", "-", "myosin", "heavy", "chain", "antibody", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", ".", "(", "H", ")", "The", "mean", "number", "of", "myofibers", "in", "the", "muscles", "of", "the", "spine", ",", "forelimb", ",", "hindlimb", ",", "hand", "and", "foot", "was", "qualified", ".", "NS", "means", "no", "statistic", "significance", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "by", "two", "-", "tailed", "independent", "student", "'", "s", "t", "test", ".", "In", "(", "C", "-", "H", ")", ",", "n", "=", "3", ".", "(", "I", ")", "Transmission", "electron", "microscope", "analysis", "of", "gastrocnemius", "from", "wild", "-", "type", "and", "heterozygous", "newborns", ".", "Black", "arrows", "denote", "mitochodria", ".", "Scale", "bars", ",", "2", "μm", ".", "WT", "means", "wild", "types", ",", "Hetero", "means", "heterozygotes", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Gross appearance of wild-type and heterozygous newborns. (B) Graph showing weight of P0 mice. Sample size: WT (n = 4) and Hetero (n = 5). *P < 0.05, by one-way ANOVA and follow by Dunnett's post hoc test.Sections of spine from wild types and heterozygotes at P0, were conducted with HE staining and immunofluorescence staining using anti-myosin heavy chain antibody. Scale bars, 100 μm.Sections of forelimbs, hindlimbs, hand, and foot from wild types and heterozygotes at P0, were conducted with HE staining and immunofluorescence staining using anti-myosin heavy chain antibody. Scale bars, 100 μm.(H) The mean number of myofibers in the muscles of the spine, forelimb, hindlimb, hand and foot was qualified. NS means no statistic significance. *P < 0.05, **P < 0.01, by two-tailed independent student's t test. In (C-H), n = 3.(I) Transmission electron microscope analysis of gastrocnemius from wild-type and heterozygous newborns. Black arrows denote mitochodria. Scale bars, 2 μm. WT means wild types, Hetero means heterozygotes."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "In", "situ", "hybridization", "of", "E10", ".", "5", "embryos", "using", "Pax3", "probe", ".", "Pax3", "expression", "(", "brown", "signal", ")", "was", "observed", "in", "limb", "bud", "and", "demomyotome", "(", "DM", ")", ",", "respectively", ".", "Cells", "labeled", "with", "Pax3", "were", "indicated", "by", "red", "arrow", ".", "Scale", "bars", ",", "200", "μm", ".", "(", "B", ")", "Gross", "appearance", "of", "E14", ".", "5", "embryos", "of", "indicated", "genotype", ".", "Scale", "bars", ",", "2", ".", "5", "mm", ".", "(", "C", ")", "HE", "staining", "of", "forelimb", ",", "hindlimb", ",", "and", "paraspinal", "muscle", "of", "E14", ".", "5", "embryos", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", ".", "(", "D", ")", "Gross", "appearance", "of", "E16", ".", "5", "embryos", "of", "indicated", "genotype", ".", "Scale", "bars", ",", "2", ".", "5", "mm", ".", "(", "E", ")", "HE", "staining", "of", "forelimb", ",", "hindlimb", ",", "and", "paraspinal", "muscle", "of", "E16", ".", "5", "embryos", ".", "n", "=", "3", ",", "scale", "bars", ",", "200", "μm", ".", "(", "F", ")", "Anti", "-", "Ki67", "antibody", "was", "used", "to", "label", "proliferative", "myoblasts", "(", "red", "fluorescence", ")", "with", "DAPI", "labeled", "nucleuses", "(", "blue", "fluorescence", ")", "in", "paraspinal", "muscle", ".", "Scale", "bar", ",", "25", "μm", ".", "(", "G", ")", "Bar", "graph", "showing", "statistical", "analysis", "of", "positive", "rate", "of", "Ki67", "-", "labeled", "nuclei", ",", "n", "=", "3", "with", "more", "than", "150", "cells", "analyzed", "per", "n", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "by", "chi", "-", "square", "test", "(", "χ2", "test", ")", ".", "WT", "means", "wild", "types", ",", "Hetero", "means", "heterozygotes", ",", "and", "Homo", "means", "homozygotes", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) In situ hybridization of E10.5 embryos using Pax3 probe. Pax3 expression (brown signal) was observed in limb bud and demomyotome (DM), respectively. Cells labeled with Pax3 were indicated by red arrow. Scale bars, 200 μm.(B) Gross appearance of E14.5 embryos of indicated genotype. Scale bars, 2.5 mm.(C) HE staining of forelimb, hindlimb, and paraspinal muscle of E14.5 embryos. Scale bars, 100 μm.(D) Gross appearance of E16.5 embryos of indicated genotype. Scale bars, 2.5 mm.(E) HE staining of forelimb, hindlimb, and paraspinal muscle of E16.5 embryos. n = 3, scale bars, 200 μm.(F) Anti-Ki67 antibody was used to label proliferative myoblasts (red fluorescence) with DAPI labeled nucleuses (blue fluorescence) in paraspinal muscle. Scale bar, 25 μm. (G) Bar graph showing statistical analysis of positive rate of Ki67-labeled nuclei, n = 3 with more than 150 cells analyzed per n, **P < 0.01, by chi-square test (χ2 test). WT means wild types, Hetero means heterozygotes, and Homo means homozygotes."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "C", "Upper", "part", ",", "schematic", "illustration", "of", "the", "experimental", "procedure", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "S6", "Ribosomal", "Protein", "and", "phospho", "-", "S6", "Ribosomal", "Protein", "(", "Ser235", "/", "236", ")", "from", "whole", "-", "liver", "protein", "extracts", "of", "female", "and", "male", "at", "P8", "(", "C", ")", "treated", "mice", ".", "Mice", "were", "sampled", "after", "4", "days", "of", "Et", "-", "OH", "or", "rapamycin", "treatment", ".", "D", ")", "Upper", "part", ",", "schematic", "illustration", "of", "the", "experimental", "procedure", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "S6", "Ribosomal", "Protein", "and", "phospho", "-", "S6", "Ribosomal", "Protein", "(", "Ser235", "/", "236", ")", "from", "whole", "-", "liver", "protein", "extracts", "of", "female", "and", "male", "at", "P34", "(", "D", ")", "treated", "mice", ".", "Mice", "were", "sampled", "after", "4", "days", "of", "Et", "-", "OH", "or", "rapamycin", "treatment", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(C Upper part, schematic illustration of the experimental procedure. Western blot analysis of S6 Ribosomal Protein and phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236) from whole-liver protein extracts of female and male at P8 (C) treated mice. Mice were sampled after 4 days of Et-OH or rapamycin treatment.D) Upper part, schematic illustration of the experimental procedure. Western blot analysis of S6 Ribosomal Protein and phospho-S6 Ribosomal Protein (Ser235/236) from whole-liver protein extracts of female and male at P34 (D) treated mice. Mice were sampled after 4 days of Et-OH or rapamycin treatment."}
{"words": ["Figure", "2Keratinocytes", "were", "isolated", "from", "the", "skin", "of", "a", "4", "-", "year", "-", "old", "patient", "with", "severe", "-", "generalised", "RDEB", "linked", "to", "homozygous", "insertion", "-", "deletion", "in", "COL7A1", "(", "Hilal", "et", "al", ",", "1993", ")", ".", "Cultured", "RDEB", "cells", "(", "blue", "line", ")", "were", "serially", "passaged", "for", "more", "than", "4", "months", ",", "displaying", "a", "growth", "potential", "similar", "to", "non", "-", "diseased", "control", "cells", "(", "YF29", ")", "isolated", "from", "the", "foreskin", "of", "a", "newborn", "(", "black", "line", ")", ".", "To", "calculate", "the", "percentage", "of", "growing", "colonies", ",", "100", "to", "1", ",", "000", "cells", "were", "plated", "into", "indicator", "dishes", "at", "each", "passage", ".", "Cells", "were", "grown", "for", "12", "days", ",", "fixed", "and", "stained", "with", "rhodamine", "B", ".", "Colonies", "were", "scored", "as", "growing", "or", "aborted", "(", "Barrandon", "Green", ",", "1987", ")", ".", "Clonal", "analysis", "demonstrated", "the", "presence", "of", "stem", "cells", "(", "holoclones", ")", "in", "a", "passage", "VII", "RDEB", "culture", "(", "95", "%", "of", "growing", "colonies", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Keratinocytes were isolated from the skin of a 4-year-old patient with severe-generalised RDEB linked to homozygous insertion-deletion in COL7A1 (Hilal et al, 1993). Cultured RDEB cells (blue line) were serially passaged for more than 4 months, displaying a growth potential similar to non-diseased control cells (YF29) isolated from the foreskin of a newborn (black line). To calculate the percentage of growing colonies, 100 to 1,000 cells were plated into indicator dishes at each passage. Cells were grown for 12 days, fixed and stained with rhodamine B. Colonies were scored as growing or aborted (Barrandon Green, 1987).Clonal analysis demonstrated the presence of stem cells (holoclones) in a passage VII RDEB culture (95% of growing colonies)."}
{"words": ["Figure", "3Single", "cells", "were", "isolated", "from", "a", "mass", "culture", "(", "passage", "V", ")", "of", "RDEB", "keratinocytes", "infected", "with", "SIN", "retroviruses", "bearing", "a", "COL7A1", "cDNA", ".", "Clonal", "types", "were", "determined", "(", "Barrandon", "Green", ",", "1987", ")", "and", "listed", "in", "Supplementary", "Table", "S1", ".", "Growing", "clones", "were", "expanded", "for", "further", "characterisation", ".", "COLVII", "detection", "in", "clones", "by", "immunostaining", ".", "COLVII", "expression", "(", "green", ")", "was", "detectable", "in", "some", "clones", "(", "6", ",", "17", ",", "22", ",", "58", "and", "61", ")", "and", "not", "in", "others", "(", "3", ",", "24", "and", "54", ")", ";", "nuclei", "were", "stained", "with", "Hoechst", "33342", "(", "blue", ")", ".", "Dotted", "lines", "delimit", "the", "periphery", "of", "keratinocyte", "colonies", "from", "the", "surrounding", "irradiated", "3T3", "-", "J2", "feeder", "cells", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "Single", "cells", "were", "isolated", "from", "a", "mass", "culture", "(", "passage", "V", ")", "of", "RDEB", "keratinocytes", "infected", "with", "SIN", "retroviruses", "bearing", "a", "COL7A1", "cDNA", ".", "Clonal", "types", "were", "determined", "(", "Barrandon", "Green", ",", "1987", ")", "and", "listed", "in", "Supplementary", "Table", "S1", ".", "Growing", "clones", "were", "expanded", "for", "further", "characterisation", ".", "Quantitative", "RT", "-", "PCR", "analysis", "of", "COL7A1", "expression", "in", "transduced", "clones", "compared", "to", "untransduced", "RDEB", "keratinocytes", ".", "All", "clones", "shown", "in", "(", "A", ")", "were", "transduced", "but", "expressed", "different", "levels", "of", "COL7A1", "transcripts", ".", "Clones", "6", ",", "17", ",", "22", ",", "54", ",", "58", "and", "61", "expressed", "higher", "levels", "of", "COL7A1", "than", "control", "RDEB", "cells", "and", "keratinocytes", "obtained", "from", "healthy", "donors", "(", "YF29", "and", "OR", "-", "CA", ",", "control", "1", "and", "2", ",", "respectively", ")", ".", "The", "level", "of", "COL7A1", "expression", "in", "the", "RDEB", "untransduced", "cells", "was", "referenced", "as", "1", ".", "Single", "cells", "were", "isolated", "from", "a", "mass", "culture", "(", "passage", "V", ")", "of", "RDEB", "keratinocytes", "infected", "with", "SIN", "retroviruses", "bearing", "a", "COL7A1", "cDNA", ".", "Clonal", "types", "were", "determined", "(", "Barrandon", "Green", ",", "1987", ")", "and", "listed", "in", "Supplementary", "Table", "S1", ".", "Growing", "clones", "were", "expanded", "for", "further", "characterisation", ".", "Determination", "of", "proviral", "rearrangements", "in", "transduced", "clones", ".", "A", "Southern", "blot", "was", "performed", "using", "genomic", "DNA", "of", "RDEB", "cells", ",", "clones", "and", "the", "infected", "mass", "culture", "from", "which", "the", "clones", "were", "isolated", ".", "Genomic", "DNA", "was", "digested", "with", "EcoRV", "and", "SpeI", "that", "cut", "at", "the", "3", "′", "and", "5", "′", "end", "of", "the", "provirus", "(", "Supplementary", "Fig", "S2", ")", "and", "hybridised", "with", "a", "907", "-", "bp", "COL7A1", "probe", "radiolabelled", "with", "32P", "isotope", ".", "The", "upper", "band", "corresponded", "to", "the", "endogenous", "signal", ".", "The", "retroviral", "producer", "line", "Flp293A", "-", "E1aColVII1", "was", "used", "as", "a", "control", "for", "the", "digested", "9", ".", "6", "-", "kb", "provirus", "(", "proviral", "signal", ")", ".", "Smaller", "bands", "corresponded", "to", "rearranged", "proviruses", "marked", "with", "an", "asterisk", ".", "Single", "cells", "were", "isolated", "from", "a", "mass", "culture", "(", "passage", "V", ")", "of", "RDEB", "keratinocytes", "infected", "with", "SIN", "retroviruses", "bearing", "a", "COL7A1", "cDNA", ".", "Clonal", "types", "were", "determined", "(", "Barrandon", "Green", ",", "1987", ")", "and", "listed", "in", "Supplementary", "Table", "S1", ".", "Growing", "clones", "were", "expanded", "for", "further", "characterisation", ".", "Identification", "of", "stem", "cells", "producing", "COLVII", ".", "Western", "blotting", "revealed", "that", "only", "clone", "6", "secreted", "COLVII", "in", "the", "culture", "supernatant", ",", "while", "clone", "54", "and", "surprisingly", "clone", "22", "did", "not", "(", "see", "A", ")", ".", "RDEB", "cells", "were", "used", "as", "a", "negative", "control", "and", "healthy", "donor", "cells", "as", "a", "positive", "control", ".", "The", "secreted", "matrix", "metalloproteinase", "2", "(", "MMP2", ")", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Single cells were isolated from a mass culture (passage V) of RDEB keratinocytes infected with SIN retroviruses bearing a COL7A1 cDNA. Clonal types were determined (Barrandon Green,1987) and listed in Supplementary Table S1. Growing clones were expanded for further characterisation.COLVII detection in clones by immunostaining. COLVII expression (green) was detectable in some clones (6, 17, 22, 58 and 61) and not in others (3, 24 and 54); nuclei were stained with Hoechst 33342 (blue). Dotted lines delimit the periphery of keratinocyte colonies from the surrounding irradiated 3T3-J2 feeder cells. Scale bar: 50 μm.Single cells were isolated from a mass culture (passage V) of RDEB keratinocytes infected with SIN retroviruses bearing a COL7A1 cDNA. Clonal types were determined (Barrandon Green,1987) and listed in Supplementary Table S1. Growing clones were expanded for further characterisation. Quantitative RT-PCR analysis of COL7A1 expression in transduced clones compared to untransduced RDEB keratinocytes. All clones shown in (A) were transduced but expressed different levels of COL7A1 transcripts. Clones 6, 17, 22, 54, 58 and 61 expressed higher levels of COL7A1 than control RDEB cells and keratinocytes obtained from healthy donors (YF29 and OR-CA, control 1 and 2, respectively). The level of COL7A1 expression in the RDEB untransduced cells was referenced as 1.Single cells were isolated from a mass culture (passage V) of RDEB keratinocytes infected with SIN retroviruses bearing a COL7A1 cDNA. Clonal types were determined (Barrandon Green,1987) and listed in Supplementary Table S1. Growing clones were expanded for further characterisation. Determination of proviral rearrangements in transduced clones. A Southern blot was performed using genomic DNA of RDEB cells, clones and the infected mass culture from which the clones were isolated. Genomic DNA was digested with EcoRV and SpeI that cut at the 3′ and 5′ end of the provirus (Supplementary Fig S2) and hybridised with a 907-bp COL7A1 probe radiolabelled with 32P isotope. The upper band corresponded to the endogenous signal. The retroviral producer line Flp293A-E1aColVII1 was used as a control for the digested 9.6-kb provirus (proviral signal). Smaller bands corresponded to rearranged proviruses marked with an asterisk.Single cells were isolated from a mass culture (passage V) of RDEB keratinocytes infected with SIN retroviruses bearing a COL7A1 cDNA. Clonal types were determined (Barrandon Green,1987) and listed in Supplementary Table S1. Growing clones were expanded for further characterisation. Identification of stem cells producing COLVII. Western blotting revealed that only clone 6 secreted COLVII in the culture supernatant, while clone 54 and surprisingly clone 22 did not (see A). RDEB cells were used as a negative control and healthy donor cells as a positive control. The secreted matrix metalloproteinase 2 (MMP2) was used as a loading control."}
{"words": ["Figure", "4Serial", "cultivation", "of", "transduced", "and", "untransduced", "holoclones", "demonstrated", "that", "the", "growth", "potential", "of", "the", "stem", "cells", "was", "not", "affected", "by", "the", "production", "of", "COLVII", ".", "Non", "-", "COLVII", "-", "producing", "holoclone", "54", "(", "black", "lines", ")", "and", "COLVII", "-", "producing", "holoclone", "6", "(", "red", "lines", ")", "were", "serially", "transferred", "once", "a", "week", "until", "exhaustion", "(", "Rochat", "et", "al", ",", "1994", ")", ".", "Theoretical", "number", "of", "epidermal", "cells", "available", "for", "characterisation", "and", "CEA", "production", "from", "corrected", "(", "clone", "6", ")", "and", "uncorrected", "stem", "cells", "(", "clone", "54", ")", "calculated", "from", "the", "day", "of", "cloning", ".", "The", "colony", "-", "forming", "efficiency", "and", "the", "percentage", "of", "growing", "colonies", "for", "each", "passage", "were", "used", "to", "calculate", "the", "population", "doubling", ",", "the", "generation", "number", "and", "the", "total", "progeny", "of", "isolated", "stem", "cells", ".", "Both", "corrected", "and", "uncorrected", "epidermal", "stem", "cells", "show", "high", "growth", "potential", "in", "vitro", ".", "Immunodeficient", "SCID", "mice", "were", "transplanted", "with", "untransduced", "cultured", "RDEB", "keratinocytes", "(", "left", ")", "or", "the", "COLVII", "-", "secreting", "holoclone", "(", "clone", "6", ")", "(", "right", ")", ".", "Punch", "biopsies", "were", "obtained", "at", "various", "times", "post", "-", "transplantation", "(", "PT", ")", ",", "stained", "with", "haematoxylin", "/", "eosine", "(", "H", "/", "E", ")", ",", "for", "human", "leucocyte", "antigen", "-", "1", "(", "HLA", "-", "1", ")", "(", "green", ")", "and", "human", "COLVII", "(", "red", ")", ".", "RDEB", "keratinocytes", "generated", "a", "HLA", "-", "1", "-", "positive", "epidermis", "that", "adhered", "poorly", "to", "the", "dermo", "-", "epidermal", "junction", "(", "DEJ", ")", "(", "arrow", "indicates", "a", "blister", ")", "and", "absence", "of", "COLVII", "(", "dotted", "line", "delimits", "the", "dermis", ")", ",", "whereas", "the", "corrected", "keratinocytes", "produced", "an", "epidermis", "that", "adhered", "to", "the", "dermis", "and", "deposited", "COLVII", "(", "red", ")", "at", "the", "DEJ", ".", "Note", "the", "presence", "of", "KI67", "-", "positive", "keratinocytes", "(", "red", ")", "in", "the", "basal", "and", "suprabasal", "layers", "in", "the", "corrected", "epidermis", "at", "385", "days", "post", "-", "transplantation", ",", "indicating", "that", "transplanted", "cells", "had", "self", "-", "renewed", "for", "more", "than", "a", "year", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "Transmission", "electron", "microscopy", "(", "TEM", ")", "demonstrated", "the", "presence", "of", "anchoring", "fibrils", "(", "arrows", ")", "at", "the", "DEJ", "of", "the", "corrected", "epidermis", "(", "middle", "right", "panel", ")", "and", "in", "a", "normal", "human", "skin", "biopsy", "(", "left", "panel", ")", ".", "Note", "the", "absence", "of", "anchoring", "fibrils", "in", "the", "RDEB", "epidermis", "(", "middle", "left", "panel", ")", ".", "Detection", "of", "human", "COLVII", "by", "immunogold", "staining", "in", "the", "DEJ", "of", "corrected", "epidermis", "(", "right", "panel", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "250", "nm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Serial cultivation of transduced and untransduced holoclones demonstrated that the growth potential of the stem cells was not affected by the production of COLVII. Non-COLVII-producing holoclone 54 (black lines) and COLVII-producing holoclone 6 (red lines) were serially transferred once a week until exhaustion (Rochat et al, 1994).Theoretical number of epidermal cells available for characterisation and CEA production from corrected (clone 6) and uncorrected stem cells (clone 54) calculated from the day of cloning. The colony-forming efficiency and the percentage of growing colonies for each passage were used to calculate the population doubling, the generation number and the total progeny of isolated stem cells. Both corrected and uncorrected epidermal stem cells show high growth potential in vitro.Immunodeficient SCID mice were transplanted with untransduced cultured RDEB keratinocytes (left) or the COLVII-secreting holoclone (clone 6) (right). Punch biopsies were obtained at various times post-transplantation (PT), stained with haematoxylin/eosine (H/E), for human leucocyte antigen-1 (HLA-1) (green) and human COLVII (red). RDEB keratinocytes generated a HLA-1-positive epidermis that adhered poorly to the dermo-epidermal junction (DEJ) (arrow indicates a blister) and absence of COLVII (dotted line delimits the dermis), whereas the corrected keratinocytes produced an epidermis that adhered to the dermis and deposited COLVII (red) at the DEJ. Note the presence of KI67-positive keratinocytes (red) in the basal and suprabasal layers in the corrected epidermis at 385 days post-transplantation, indicating that transplanted cells had self-renewed for more than a year. Scale bar: 50 μm.Transmission electron microscopy (TEM) demonstrated the presence of anchoring fibrils (arrows) at the DEJ of the corrected epidermis (middle right panel) and in a normal human skin biopsy (left panel). Note the absence of anchoring fibrils in the RDEB epidermis (middle left panel). Detection of human COLVII by immunogold staining in the DEJ of corrected epidermis (right panel). Scale bar: 250 nm."}
{"words": ["Figure", "5Visualisation", "of", "COL7A1", "sequence", "by", "FISH", "analysis", "in", "corrected", "stem", "cells", "at", "passage", "XII", "(", "clone", "6", ")", ".", "Five", "specific", "signals", "(", "red", ")", "were", "detected", "on", "five", "different", "chromosomes", ".", "As", "expected", ",", "a", "COL7A1", "probe", "(", "red", ")", "hybridised", "to", "the", "two", "endogenous", "COL7A1", "alleles", "located", "on", "the", "chromosomes", "3", "as", "identified", "by", "a", "specific", "centromeric", "probe", "(", "Cen", "3", ")", "and", "to", "three", "other", "chromosomes", "identified", "as", "chromosomes", "2", ",", "11", "and", "22", "by", "means", "of", "specific", "centromeric", "probes", "(", "Cen", "2", ",", "Cen", "11", "and", "Cen", "22", ",", "respectively", ")", ".", "The", "latter", "corresponded", "to", "proviruses", ".", "Determination", "of", "proviral", "integration", "sites", "in", "corrected", "stem", "cell", ".", "Genomic", "DNA", "from", "clone", "6", "was", "submitted", "to", "whole", "-", "genome", "sequencing", "together", "with", "PCR", "and", "subsequent", "Sanger", "sequencing", "to", "identify", "the", "integration", "sites", "to", "the", "base", "-", "pair", "level", ".", "Mate", "pairs", "that", "span", "from", "the", "viral", "sequence", "to", "a", "human", "chromosome", "were", "extracted", "and", "used", "to", "estimate", "integration", "regions", ".", "The", "reads", "were", "mapped", "to", "the", "hg19", "reference", "sequence", ".", "Three", "integration", "sites", "were", "uncovered", ":", "one", "in", "chromosome", "2", ",", "one", "in", "chromosome", "11", "and", "one", "in", "chromosome", "22", ",", "and", "targeted", "genes", "were", "identified", ".", "Analysis", "of", "the", "level", "of", "expression", "of", "targeted", "genes", "in", "corrected", "stem", "cells", "by", "quantitative", "RT", "-", "PCR", ".", "DARS", "was", "not", "significantly", "changed", "in", "clone", "6", "compared", "to", "the", "cells", "before", "transduction", ".", "Primers", "used", "annealed", "downstream", "of", "the", "proviral", "integration", "site", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "standard", "deviation", "of", "three", "replicates", ".", "Identification", "of", "sequence", "abnormalities", "in", "the", "two", "alleles", "of", "the", "DARS", "-", "targeted", "gene", "in", "clone", "6", "by", "NGS", ".", "Reads", "were", "mapped", "to", "the", "hg19", "reference", "sequence", ".", "Small", "insertion", "-", "deletions", "and", "SNP", "calling", "were", "performed", "and", "compared", "to", "GWAS", "databases", ".", "The", "mapping", "highlighted", "two", "indels", "and", "one", "SNP", "in", "the", "DARS", "genomic", "sequence", ".", "The", "indels", "were", "not", "associated", "with", "disease", "and", "the", "SNP", "was", "synonymous", "(", "CCU", "-", "CCG", "both", "codons", "correspond", "to", "proline", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Visualisation of COL7A1 sequence by FISH analysis in corrected stem cells at passage XII (clone 6). Five specific signals (red) were detected on five different chromosomes. As expected, a COL7A1 probe (red) hybridised to the two endogenous COL7A1 alleles located on the chromosomes 3 as identified by a specific centromeric probe (Cen 3) and to three other chromosomes identified as chromosomes 2, 11 and 22 by means of specific centromeric probes (Cen 2, Cen 11 and Cen 22, respectively). The latter corresponded to proviruses.Determination of proviral integration sites in corrected stem cell. Genomic DNA from clone 6 was submitted to whole-genome sequencing together with PCR and subsequent Sanger sequencing to identify the integration sites to the base-pair level. Mate pairs that span from the viral sequence to a human chromosome were extracted and used to estimate integration regions. The reads were mapped to the hg19 reference sequence. Three integration sites were uncovered: one in chromosome 2, one in chromosome 11 and one in chromosome 22, and targeted genes were identified.Analysis of the level of expression of targeted genes in corrected stem cells by quantitative RT-PCR. DARS was not significantly changed in clone 6 compared to the cells before transduction. Primers used annealed downstream of the proviral integration site. Error bars represent the standard deviation of three replicates.Identification of sequence abnormalities in the two alleles of the DARS-targeted gene in clone 6 by NGS. Reads were mapped to the hg19 reference sequence. Small insertion-deletions and SNP calling were performed and compared to GWAS databases. The mapping highlighted two indels and one SNP in the DARS genomic sequence. The indels were not associated with disease and the SNP was synonymous (CCU-CCG both codons correspond to proline)."}
{"words": ["Figure", "6Upper", "panel", ":", "expression", "of", "proteins", "associated", "with", "the", "acquisition", "of", "immortalisation", "process", "involved", "in", "senescence", ",", "in", "evasion", "of", "growth", "suppression", "and", "in", "apoptosis", "(", "Hanahan", "Weinberg", ",", "2011", ")", ".", "The", "level", "of", "P53", ",", "P21", ",", "RAS", "and", "P16", "was", "similar", "in", "clone", "6", ",", "untransduced", "cells", "and", "mass", "culture", "from", "four", "independent", "infections", ",", "significantly", "different", "from", "the", "squamous", "cell", "carcinoma", "cell", "line", "SCC", "-", "13", ".", "Lower", "panel", ":", "the", "phosphorylation", "state", "of", "the", "PRB", "restriction", "point", "was", "maintained", "in", "clone", "6", "and", "untransduced", "recessive", "dystrophic", "epidermolysis", "bullosa", "(", "RDEB", ")", "cells", ",", "whereas", "PRB", "was", "heavily", "phosphorylated", "in", "transformed", "cells", "(", "SCC", "-", "13", ")", ".", "Appropriate", "loading", "controls", "were", "used", "for", "each", "cellular", "extract", "(", "GAPDH", "for", "cytoplasmic", "extracts", ",", "histone", "H3", "for", "nuclear", "extracts", "and", "tubulin", "for", "whole", "-", "cell", "extracts", ".", "H3", "for", "histone", "H3", ",", "ppRB", "for", "hyperphosphorylated", "pRB", "and", "pRB", "for", "hypophosphorylated", "PRB", ")", ".", "Transduced", "clone", "6", "had", "a", "diploid", "karyotype", "at", "passage", "XVI", "(", "see", "also", "Fig5A", ")", ".", "Transduced", "clones", "were", "not", "tumorigenic", ".", "The", "tumorigenic", "potential", "of", "the", "clones", "was", "tested", "by", "tumour", "formation", "in", "nude", "mice", ".", "Transduced", "RDEB", "holoclones", "(", "blue", ")", "[", "clone", "6", "(", "square", ",", "n", "=", "4", ")", "passage", "X", ",", "clone", "22", "(", "circle", ",", "n", "=", "2", ")", "passage", "XI", ",", "clone", "54", "(", "cross", ",", "n", "=", "4", ")", "passage", "X", "]", "were", "not", "tumorigenic", "when", "injected", "subcutaneously", "in", "athymic", "mice", "as", "were", "untransduced", "RDEB", "keratinocytes", "(", "passage", "VII", ")", ".", "SCC", "-", "13", ",", "a", "squamous", "cell", "carcinoma", "cell", "line", "(", "black", ")", "(", "lozenge", ",", "n", "=", "2", ")", ",", "was", "used", "as", "a", "positive", "control", ".", "To", "test", "whether", "the", "transduced", "RDEB", "keratinocytes", "had", "disseminated", "after", "the", "generation", "of", "an", "epidermis", "onto", "SCID", "mice", "(", "see", "Fig4C", ")", ",", "the", "internal", "organs", "of", "the", "recipient", "mice", "(", "3", "mice", "for", "clone", "6", "and", "2", "mice", "for", "clone", "22", ")", "were", "harvested", "385", "days", "post", "-", "transplantation", "and", "analysed", "for", "COL7A1", "proviral", "sequences", ".", "No", "COL7A1", "sequence", "was", "detected", ".", "A", "mouse", "transplanted", "with", "a", "holoclone", "obtained", "from", "a", "healthy", "donor", "(", "YF29", ")", "was", "used", "as", "an", "internal", "control", ".", "PCR", "-", "positive", "controls", "were", "genomic", "DNA", "from", "transduced", "cells", "(", "holoclone", "6", ")", "and", "cDNAs", "isolated", "from", "healthy", "keratinocytes", ".", "B", "-", "actin", "was", "run", "as", "a", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Upper panel: expression of proteins associated with the acquisition of immortalisation process involved in senescence, in evasion of growth suppression and in apoptosis (Hanahan Weinberg, 2011). The level of P53, P21, RAS and P16 was similar in clone 6, untransduced cells and mass culture from four independent infections, significantly different from the squamous cell carcinoma cell line SCC-13. Lower panel: the phosphorylation state of the PRB restriction point was maintained in clone 6 and untransduced recessive dystrophic epidermolysis bullosa (RDEB) cells, whereas PRB was heavily phosphorylated in transformed cells (SCC-13). Appropriate loading controls were used for each cellular extract (GAPDH for cytoplasmic extracts, histone H3 for nuclear extracts and tubulin for whole-cell extracts. H3 for histone H3, ppRB for hyperphosphorylated pRB and pRB for hypophosphorylated PRB).Transduced clone 6 had a diploid karyotype at passage XVI (see also Fig5A).Transduced clones were not tumorigenic. The tumorigenic potential of the clones was tested by tumour formation in nude mice. Transduced RDEB holoclones (blue) [clone 6 (square, n = 4) passage X, clone 22 (circle, n = 2) passage XI, clone 54 (cross, n = 4) passage X] were not tumorigenic when injected subcutaneously in athymic mice as were untransduced RDEB keratinocytes (passage VII). SCC-13, a squamous cell carcinoma cell line (black) (lozenge, n = 2), was used as a positive control.To test whether the transduced RDEB keratinocytes had disseminated after the generation of an epidermis onto SCID mice (see Fig4C), the internal organs of the recipient mice (3 mice for clone 6 and 2 mice for clone 22) were harvested 385 days post-transplantation and analysed for COL7A1 proviral sequences. No COL7A1 sequence was detected. A mouse transplanted with a holoclone obtained from a healthy donor (YF29) was used as an internal control. PCR-positive controls were genomic DNA from transduced cells (holoclone 6) and cDNAs isolated from healthy keratinocytes. B-actin was run as a loading control."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "Volcano", "plot", "showing", "the", "fold", "change", "(", "y", "-", "axis", ")", "versus", "adjusted", "(", "adj", ".", ")", "p", "-", "value", "(", "x", "-", "axis", ")", "of", "the", "beta", "cell", "transcriptomes", "between", "chow", "and", "HFD", "-", "fed", "mice", "(", "16", "weeks", ")", ".", "Genes", "highlighted", "in", "red", "or", "green", "are", "based", "on", "the", "thresholds", "of", "Log2", "fold", "change", ">", "1", "and", "adj", ".", "P", "value", "<", "0", ".", "01", "(", "two", "-", "tailed", "paired", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Genes", "with", ">", "10", "fold", "upregulated", "expression", "are", "labeled", "with", "their", "name", ".", "Pbk", "gene", "expression", "is", "indicated", "by", "the", "arrow", ".", "RNAseq", "data", "was", "available", "from", "https", ":", "/", "/", "doi", ".", "org", "/", "10", ".", "1371", "/", "journal", ".", "pone", ".", "0213299", ".", "t004", ".", "L", ".", "Pbk", "KD", "in", "INS", "-", "1", "cells", "suppresses", "cell", "growth", ".", "Western", "blot", "data", "showed", "the", "decreased", "Pbk", "expression", "level", "in", "INS", "-", "1", "cells", "with", "Pbk", "-", "targeted", "shRNA", "transduction", ".", "Cell", "growth", "curve", "was", "from", "three", "independent", "experimets", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "(", "Vector", ":", "shRNA", "-", "#", "1", ")", ",", "*", "P", "=", "0", ".", "0181", "(", "Vector", ":", "shRNA", "-", "#", "5", ")", ",", "(", "Two", "way", "ANOVA", ")", ".", "M", ".", "The", "role", "of", "ectopic", "expression", "of", "Pbk", "-", "WT", "and", "Pbk", "-", "Mut", "on", "INS", "-", "1", "cell", "growth", ".", "Western", "blot", "data", "showed", "the", "overexpression", "of", "V5", "-", "flaged", "wild", "type", "and", "mutant", "Pbk", "in", "INS", "-", "1", "cells", ".", "Cell", "growth", "curve", "was", "from", "three", "independent", "experimets", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0069", "(", "Two", "way", "ANOVA", ")", ".", "ns", ",", "not", "statistically", "significant", "difference", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A.Volcano plot showing the fold change (y-axis) versus adjusted (adj.) p-value (x-axis) of the beta cell transcriptomes between chow and HFD-fed mice (16 weeks). Genes highlighted in red or green are based on the thresholds of Log2 fold change > 1 and adj. P value < 0.01 (two-tailed paired student's t-test). Genes with >10 fold upregulated expression are labeled with their name. Pbk gene expression is indicated by the arrow. RNAseq data was available from https://doi.org/10.1371/journal.pone.0213299.t004.L. Pbk KD in INS-1 cells suppresses cell growth. Western blot data showed the decreased Pbk expression level in INS-1 cells with Pbk-targeted shRNA transduction. Cell growth curve was from three independent experimets (n=3). ***P < 0.0001 (Vector:shRNA-#1), *P = 0.0181 (Vector:shRNA-#5) , (Two way ANOVA). M. The role of ectopic expression of Pbk-WT and Pbk-Mut on INS-1 cell growth. Western blot data showed the overexpression of V5-flaged wild type and mutant Pbk in INS-1 cells. Cell growth curve was from three independent experimets (n=3). **P = 0.0069 (Two way ANOVA). ns, not statistically significant difference. "}
{"words": ["Figure", "2F", ".", "Islet", "number", "in", "each", "pancreas", "section", "on", "11", "-", "week", "-", "old", "male", "PbkKI", "/", "KI", "and", "PbkWT", "/", "WT", "mice", "(", "n", "=", "4", "for", "each", "group", ")", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0443", "(", "two", "-", "tailed", "unpaired", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "G", ".", "Beta", "cell", "mass", "comparison", "between", "11", "-", "week", "-", "old", "male", "PbkKI", "/", "KI", "and", "PbkWT", "/", "WT", "mice", "(", "n", "=", "4", "for", "each", "group", ")", ".", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0015", "(", "two", "-", "tailed", "unpaired", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "K", ",", "L", ".", "Representative", "images", "of", "double", "immuno", "-", "staining", "for", "insulin", "(", "green", ")", "and", "BrdU", "(", "red", ")", "of", "pancreas", "from", "PbkWT", "/", "WT", "(", "K", ")", "or", "PbkKI", "/", "KI", "(", "L", ")", "mice", "with", "5", "weeks", "HFD", "feeding", ".", "Islet", "area", "was", "circled", "with", "white", "dashed", "line", ".", "Nuclei", "were", "labeled", "by", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2F. Islet number in each pancreas section on 11-week-old male PbkKI/KI and PbkWT/WT mice (n=4 for each group). *P = 0.0443 (two-tailed unpaired student's t-test). G. Beta cell mass comparison between 11-week-old male PbkKI/KI and PbkWT/WT mice (n=4 for each group). **P = 0.0015 (two-tailed unpaired student's t-test). K, L. Representative images of double immuno-staining for insulin (green) and BrdU (red) of pancreas from PbkWT/WT (K) or PbkKI/KI (L) mice with 5 weeks HFD feeding. Islet area was circled with white dashed line. Nuclei were labeled by DAPI (blue). Scale bar: 50 μm."}
{"words": ["Figure", "3E", ",", "F", ".", "JunD", "KD", "in", "INS", "-", "1", "cells", "using", "shRNA", "upregulated", "Pbk", "protein", "levels", "(", "E", ")", "and", "mRNA", "levels", "(", "F", ")", ".", "qPCR", "data", "was", "from", "three", "independent", "experimets", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0001", "(", "shRNA", "-", "#", "1", ")", ",", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0007", "(", "shRNA", "-", "#", "2", ")", "(", "two", "-", "tailed", "unpaired", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "G", ",", "H", ".", "JunD", "KD", "in", "PIME", "cells", "using", "shRNA", "increased", "Pbk", "protein", "levels", "(", "G", ")", "and", "mRNA", "levels", "(", "H", ")", ".", "qPCR", "data", "was", "from", "three", "independent", "experimets", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0236", "(", "shRNA", "-", "#", "1", ")", ",", "*", "P", "=", "0", ".", "0175", "(", "shRNA", "-", "#", "2", ")", "(", "two", "-", "tailed", "unpaired", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "N", ".", "JunD", "overexpression", "in", "PIME", "cells", "suppressed", "Pbk", "protein", "levels", "(", "M", ",", "Lane", "2", "vs", "Lane", "1", ")", ",", "but", "did", "not", "affect", "Pbk", "expression", "in", "menin", "-", "null", "PIME", "cells", "(", "M", ",", "Lane", "4", "vs", "Lane", "3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3E, F. JunD KD in INS-1 cells using shRNA upregulated Pbk protein levels (E) and mRNA levels (F). qPCR data was from three independent experimets (n=3).***P = 0.0001 (shRNA-#1), ***P = 0.0007 (shRNA-#2) (two-tailed unpaired student's t-test). G, H. JunD KD in PIME cells using shRNA increased Pbk protein levels (G) and mRNA levels (H). qPCR data was from three independent experimets (n=3).*P = 0.0236 (shRNA-#1), *P = 0.0175 (shRNA-#2) (two-tailed unpaired student's t-test). N. JunD overexpression in PIME cells suppressed Pbk protein levels (M, Lane 2 vs Lane 1), but did not affect Pbk expression in menin-null PIME cells (M, Lane 4 vs Lane 3)."}
{"words": ["Figure", "4J", ",", "K", ".", "The", "effect", "of", "T5224", "on", "the", "binding", "of", "JunD", ",", "menin", ",", "HDAC3", ",", "and", "acetylated", "histone3", "at", "the", "Pbk", "locus", "in", "PIME", "cells", "(", "J", ")", "or", "INS", "-", "1", "cells", "(", "K", ")", ".", "Three", "independent", "experimets", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0490", "(", "J", ",", "JunD", ")", ",", "*", "P", "=", "0", ".", "0479", "(", "J", ",", "Menin", ")", ",", "*", "P", "=", "0", ".", "0154", "(", "J", ",", "HDAC3", ")", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0029", "(", "J", ",", "Ac", "-", "H3", ")", ",", "*", "P", "=", "0", ".", "0104", "(", "K", ",", "JunD", ")", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0024", "(", "K", ",", "Menin", ")", ",", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0002", "(", "K", ",", "HDAC3", ")", ",", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0001", "(", "K", ",", "Ac", "-", "H3", ")", ",", "(", "two", "-", "tailed", "unpaired", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "ns", ",", "not", "statistically", "significant", "difference", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4J, K. The effect of T5224 on the binding of JunD, menin, HDAC3, and acetylated histone3 at the Pbk locus in PIME cells (J) or INS-1 cells (K). Three independent experimets (n=3). *P = 0.0490 (J, JunD), *P = 0.0479 (J, Menin), *P = 0.0154 (J, HDAC3), **P = 0.0029 (J, Ac-H3), *P = 0.0104 (K, JunD), **P = 0.0024 (K, Menin), ***P = 0.0002 (K, HDAC3), ***P = 0.0001 (K, Ac-H3), (two-tailed unpaired student's t-test). ns, not statistically significant difference."}
{"words": ["Figure", "5F", ".", "Mouse", "primary", "islets", "treated", "with", "MI", "-", "503", "for", "3", "days", "were", "subjected", "ChIP", "assay", "to", "detect", "the", "binding", "of", "menin", ",", "HDAC3", ",", "JunD", ",", "as", "well", "as", "histone", "acetylation", "level", "at", "the", "Pbk", "locus", ".", "Three", "independent", "experimets", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0218", "(", "Menin", ")", ",", "*", "P", "=", "0", ".", "0145", "(", "HDAC3", ")", ",", "*", "P", "=", "0", ".", "0184", "(", "Ac", "-", "H3", ")", "(", "two", "-", "tailed", "unpaired", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "ns", ",", "not", "statistically", "significant", "difference", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5F. Mouse primary islets treated with MI-503 for 3 days were subjected ChIP assay to detect the binding of menin, HDAC3, JunD, as well as histone acetylation level at the Pbk locus. Three independent experimets (n=3). *P = 0.0218 (Menin), *P = 0.0145 (HDAC3), *P = 0.0184 (Ac-H3) (two-tailed unpaired student's t-test). ns, not statistically significant difference."}
{"words": ["Figure", "6G", ".", "MI", "-", "503", "increases", "proliferation", "of", "menin", "-", "expressing", "PIME", "cells", "but", "not", "menin", "-", "null", "PIME", "cells", ".", "Three", "independent", "experimets", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "(", "Two", "-", "way", "ANOVA", ")", ".", "K", "-", "M", ".", "5", "days", "of", "MI", "-", "503", "treatment", "impacts", "the", "expression", "of", "Pbk", "at", "protein", "level", "(", "K", ")", "and", "mRNA", "level", "(", "L", ")", ",", "as", "well", "as", "ki67", "mRNA", "levels", "(", "M", ")", "in", "human", "primary", "islets", "(", "donor", "number", "is", "four", ")", ".", "qPCR", "data", "was", "from", "three", "independent", "experimets", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0036", "(", "L", ",", "10", "nM", ")", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0024", "(", "L", ",", "50", "nM", ")", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0073", "(", "L", ",", "100", "nM", ")", ",", "*", "P", "=", "0", ".", "0237", "(", "M", ",", "50", "nM", ")", "(", "two", "-", "tailed", "unpaired", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "ns", ",", "not", "statistically", "significant", "difference", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6G. MI-503 increases proliferation of menin-expressing PIME cells but not menin-null PIME cells. Three independent experimets (n=3). ***P < 0.0001 (Two-way ANOVA).K-M. 5 days of MI-503 treatment impacts the expression of Pbk at protein level (K) and mRNA level (L), as well as ki67 mRNA levels (M) in human primary islets (donor number is four). qPCR data was from three independent experimets (n=3). **P = 0.0036 (L, 10 nM), **P = 0.0024 (L, 50 nM), **P = 0.0073 (L, 100 nM), *P = 0.0237 (M, 50 nM) (two-tailed unpaired student's t-test). ns, not statistically significant difference. "}
{"words": ["Figure", "7E", "-", "L", ".", "Representative", "images", "of", "insulin", "(", "green", ")", "and", "Ki67", "(", "red", ")", "double", "staining", "on", "mouse", "islets", "with", "8", "wks", "MI", "treatment", "(", "E", "-", "H", ")", ",", "and", "insulin", "(", "green", ")", "or", "Pbk", "(", "red", ")", "double", "staining", "on", "mouse", "islets", "(", "I", "-", "L", ")", ".", "Nuclei", "were", "labeled", "by", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Islet", "area", "was", "circled", "by", "white", "dashed", "line", ".", "Ki67", "and", "Pbk", "staining", "are", "denoted", "by", "white", "arrows", ".", "Scale", "bars", ":", "50", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7E-L. Representative images of insulin (green) and Ki67 (red) double staining on mouse islets with 8 wks MI treatment (E-H), and insulin (green) or Pbk (red) double staining on mouse islets (I-L). Nuclei were labeled by DAPI (blue). Islet area was circled by white dashed line. Ki67 and Pbk staining are denoted by white arrows. Scale bars: 50 μm."}
{"words": ["Figure", "8D", ",", "E", ".", "Double", "staining", "for", "insulin", "(", "green", ")", "and", "BrdU", "(", "red", ")", "of", "mice", "islets", "after", "12", "weeks", "of", "vehicle", "(", "D", ")", "or", "MI", "(", "E", ")", "administration", ".", "Islet", "area", "was", "circled", "by", "white", "dashed", "line", ".", "Nuclei", "were", "labeled", "by", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "BrdU", "staining", "is", "indicated", "by", "arrows", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "F", ",", "G", ".", "Quantification", "of", "BrdU", "positive", "beta", "cells", "(", "F", ")", "and", "beta", "cell", "mass", "(", "G", ")", "of", "MI", "-", "463", "treated", "HFD", "-", "fed", "mice", "or", "control", "mice", ".", "Five", "mice", "for", "each", "group", ",", "and", "at", "least", "10", "islet", "images", "per", "mouse", "were", "analyzed", ".", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0059", ",", "*", "P", "=", "0", ".", "0103", "(", "two", "-", "tailed", "unpaired", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "H", ",", "I", ".", "Double", "staining", "for", "insulin", "(", "green", ")", "and", "Pbk", "(", "red", ")", "of", "mice", "islets", "after", "12", "weeks", "of", "vehicle", "(", "H", ")", "or", "MI", "(", "I", ")", "administration", ".", "Islet", "area", "was", "circled", "by", "white", "dashed", "line", ".", "Nuclei", "were", "labeled", "by", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Pbk", "staining", "is", "indicated", "by", "arrows", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "J", ".", "Quantification", "of", "Pbk", "staining", "-", "positive", "β", "-", "cells", ".", "Five", "mice", "for", "each", "group", ",", "and", "at", "least", "10", "islet", "images", "per", "mouse", "were", "analyzed", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0120", "(", "two", "-", "tailed", "unpaired", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "K", ".", "Quantification", "of", "the", "percentage", "with", "pbk", "and", "BrdU", "co", "-", "staining", "cells", "among", "total", "Pbk", "positive", "cells", "in", "HFD", "-", "fed", "mouse", "islets", ".", "The", "mean", "values", "of", "five", "mice", "from", "5", "sections", "for", "each", "mouse", "were", "presented", ".", "O", ",", "P", ".", "GTT", "data", "for", "MI", "-", "463", "or", "vehicle", "treated", "PbkKI", "/", "KI", "or", "PbkWT", "/", "WT", "mice", "(", "n", "=", "3", "for", "each", "group", ")", "on", "8", "weeks", "HFD", "(", "O", ")", "(", "*", "P", "=", "0", ".", "0133", "(", "Two", "way", "ANOVA", ")", ",", "ns", ",", "not", "statistically", "significant", "difference", ".", ")", "and", "AUC", "of", "GTT", "data", "(", "P", ")", "(", "*", "P", "=", "0", ".", "0442", "(", "two", "-", "tailed", "unpaired", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ",", "ns", ",", "not", "statistically", "significant", "difference", ".", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8D, E. Double staining for insulin (green) and BrdU (red) of mice islets after 12 weeks of vehicle (D) or MI (E) administration. Islet area was circled by white dashed line. Nuclei were labeled by DAPI (blue). BrdU staining is indicated by arrows. Scale bar:50 μm. F, G. Quantification of BrdU positive beta cells (F) and beta cell mass (G) of MI-463 treated HFD-fed mice or control mice. Five mice for each group, and at least 10 islet images per mouse were analyzed. **P = 0.0059, *P = 0.0103 (two-tailed unpaired student's t-test). H, I. Double staining for insulin (green) and Pbk (red) of mice islets after 12 weeks of vehicle (H) or MI (I) administration. Islet area was circled by white dashed line. Nuclei were labeled by DAPI (blue). Pbk staining is indicated by arrows. Scale bar: 50 μm. J. Quantification of Pbk staining-positive β-cells. Five mice for each group, and at least 10 islet images per mouse were analyzed. *P = 0.0120 (two-tailed unpaired student's t-test). K. Quantification of the percentage with pbk and BrdU co-staining cells among total Pbk positive cells in HFD-fed mouse islets. The mean values of five mice from 5 sections for each mouse were presented.O, P. GTT data for MI-463 or vehicle treated PbkKI/KI or PbkWT/WT mice (n=3 for each group) on 8 weeks HFD (O) (*P = 0.0133 (Two way ANOVA), ns, not statistically significant difference.) and AUC of GTT data (P) (*P = 0.0442 (two-tailed unpaired student's t-test), ns, not statistically significant difference.)."}
{"words": ["Figure", "1C", "Confocal", "images", "of", "rNSC", "-", "derived", "astrocytes", "expressing", "GFP", "(", "green", ")", "and", "astrocyte", "-", "specific", "markers", "(", "ACSBG1", ",", "GFAP", ",", "S100β", ";", "magenta", ")", "at", "different", "timepoints", "(", "P7", ",", "P10", ",", "P14", ")", ";", "lower", "pictures", "depict", "single", "-", "channel", "images", "the", "astrocyte", "markers", "(", "grey", ")", "used", "above", ".", "Data", "information", ":", ";", "scale", "bars", "(", "C", "=", "10", "µm", ",", "D", "Representative", "pictures", "of", "recombined", "astrocytes", "(", "GFP", "+", "/", "ACSBG1", "+", ";", "arrowheads", ")", "during", "DG", "development", "(", "P3", ",", "P7", ",", "P10", ",", "P14", ")", ".", "E", ",", "Quantification", "of", "total", "numbers", "of", "recombined", "astrocytes", "(", "GFP", "+", "/", "ACSBG1", "+", ")", "per", "area", "at", "postnatal", "timepoints", "in", "the", "total", "DG", "(", "E", ")", "Data", "information", ":", "All", "data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "number", "of", "experimental", "animals", "throughout", "figure", ":", "n", "=", "5", "(", "P3", ")", "and", "n", "=", "6", "(", "P7", ",", "P10", ",", "P14", ")", ",", "(", "E", "indicated", "by", "red", "dots", "dotted", "lines", "mark", "GZ", "borders", ";", "scale", "bars", "(", "D", "=", "50", "µm", ".", ",", "F", "Quantification", "of", "total", "numbers", "of", "recombined", "astrocytes", "(", "GFP", "+", "/", "ACSBG1", "+", ")", "per", "area", "at", "postnatal", "timepoints", "in", "the", "distinct", "DG", "compartments", "(", "F", ")", ",", "i", ".", "e", ".", "hilus", ",", "GZ", ",", "and", "ML", "indicated", "by", "different", "colours", ".", "G", "Representative", "images", "of", "proliferating", "astrocytes", "(", "ACSBG1", "+", ",", "cyan", ";", "arrowheads", ")", "in", "combination", "with", "cell", "cycle", "markers", "KI67", "or", "MCM2", "(", "magenta", ";", "P3", ",", "P7", ":", "KI67", ";", "P10", ",", "P14", ":", "MCM2", ")", ".", "Data", "information", ":", ";", "dotted", "lines", "mark", "GZ", "borders", ";", "scale", "bars", "G", ")", "=", "50", "µm", ".", "H", "Confocal", "image", "of", "proliferating", "astrocytes", "at", "P10", "(", "ACSBG1", "+", ",", "cyan", ";", "MCM2", "+", ",", "magenta", ")", "that", "did", "not", "express", "NESTIN", "(", "white", ")", ".", "I", ",", "J", "Quantification", "of", "total", "proliferating", "astrocytes", "(", "ACSBG1", "+", "/", "KI67", "+", "for", "P3", "/", "P7", ";", "ACSBG1", "+", "/", "MCM2", "+", "for", "P10", "/", "P14", ")", "per", "area", "at", "distinct", "timepoints", "per", "total", "DG", "(", "I", ")", "or", "hilus", ",", "GZ", "and", "ML", "(", "J", ")", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "number", "of", "experimental", "animals", "throughout", "figure", ":", "n", "=", "5", "(", "P3", ")", "and", "n", "=", "6", "(", "P7", ",", "P10", ",", "P14", ")", ",", "I", ")", "indicated", "by", "red", "dots", ";", "scale", "bars", ",", "H", "=", "10", "µm", ",", "K", "Confocal", "images", "of", "proliferating", "rNSC", "-", "derived", "astrocytes", "(", "GFP", "+", "/", "ACSBG1", "+", "/", "MCM2", "+", ";", "arrowheads", ")", "at", "P10", ".", "Data", "information", ":", "scale", "bars", "K", ")", "=", "10"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1C Confocal images of rNSC-derived astrocytes expressing GFP (green) and astrocyte-specific markers (ACSBG1, GFAP, S100β; magenta) at different timepoints (P7, P10, P14); lower pictures depict single-channel images the astrocyte markers (grey) used above. Data information: ; scale bars (C = 10 µm,D Representative pictures of recombined astrocytes (GFP+/ACSBG1+; arrowheads) during DG development (P3, P7, P10, P14). E, Quantification of total numbers of recombined astrocytes (GFP+/ACSBG1+) per area at postnatal timepoints in the total DG (E) Data information: All data are represented as mean ± SEM; number of experimental animals throughout figure: n = 5 (P3) and n = 6 (P7, P10, P14), (E indicated by red dots dotted lines mark GZ borders; scale bars (D = 50 µm., F Quantification of total numbers of recombined astrocytes (GFP+/ACSBG1+) per area at postnatal timepoints in the distinct DG compartments (F), i.e. hilus, GZ, and ML indicated by different colours.G Representative images of proliferating astrocytes (ACSBG1+, cyan; arrowheads) in combination with cell cycle markers KI67 or MCM2 (magenta; P3, P7: KI67; P10, P14: MCM2). Data information: ; dotted lines mark GZ borders; scale bars G) = 50 µm.H Confocal image of proliferating astrocytes at P10 (ACSBG1+, cyan; MCM2+, magenta) that did not express NESTIN (white). I, J Quantification of total proliferating astrocytes (ACSBG1+/KI67+ for P3/P7; ACSBG1+/MCM2+ for P10/P14) per area at distinct timepoints per total DG (I) or hilus, GZ and ML (J). Data information: All data are represented as mean ± SEM; number of experimental animals throughout figure: n = 5 (P3) and n = 6 (P7, P10, P14), I) indicated by red dots; scale bars ,H = 10 µm,K Confocal images of proliferating rNSC-derived astrocytes (GFP+/ACSBG1+/MCM2+; arrowheads) at P10. Data information: scale bars K) = 10 µm"}
{"words": ["Figure", "2B", "Representative", "pictures", "of", "P28", "animals", "that", "received", "BrdU", "at", "P3", ",", "P7", ",", "P14", "or", "P21", ".", "For", "cell", "type", "identification", "of", "generated", "progeny", ",", "immunostainings", "against", "NESTIN", "(", "white", ")", ",", "GFAP", "(", "green", ")", ",", "and", "BrdU", "(", "magenta", ")", "were", "performed", ".", "rNSCs", "were", "identified", "as", "NESTIN", "+", "/", "GFAP", "+", "/", "BrdU", "+", "with", "a", "radial", "process", "(", "as", "indicated", "with", "arrows", ")", ",", "neurons", "as", "NESTIN", "-", "/", "GFAP", "-", "/", "BrdU", "+", "cells", ",", "and", "astrocytes", "as", "NESTIN", "-", "/", "GFAP", "+", "/", "BrdU", "+", "cells", "in", "the", "hilus", ",", "GZ", ",", "and", "ML", "(", "arrowheads", ")", ".", "Data", "information", ":", "dotted", "lines", "label", "GZ", "borders", ";", "scale", "bars", "=", "50", "µm", ".", "C", "Quantification", "of", "total", "numbers", "of", "generated", "cell", "types", "(", "rNSCs", ",", "neurons", ",", "astrocytes", ")", "per", "area", "at", "distinct", "timepoints", "as", "indicated", "by", "different", "colours", ".", "Data", "information", ":", "Values", "represent", "mean", "±", "SEM", ";", "number", "of", "experimental", "animals", ":", "(", "C", "n", "=", "5", "(", "P3", ",", "P21", ")", ",", "n", "=", "4", "(", "P7", ",", "P14", ")", ";", "D", "Quantification", "of", "total", "numbers", "of", "newly", "generated", "astrocytes", "in", "the", "hilus", ",", "GZ", ",", "and", "ML", "at", "P3", ",", "P7", ",", "P14", ",", "P21", ".", "Data", "information", ":", "Values", "represent", "mean", "±", "SEM", ";", "number", "of", "experimental", "animals", ",", "D", ")", "n", "=", "5", "(", "P3", ",", "P21", ")", ",", "n", "=", "4", "(", "P7", ",", "P14", ")", "G", "Representative", "pictures", "of", "immunostainings", "against", "cell", "type", "-", "specific", "proteins", "(", "all", "depicted", "in", "white", ")", ".", "Recombined", "cells", "were", "identified", "by", "GFP", ",", "rNSCs", "by", "their", "radial", "process", "labelled", "with", "NESTIN", "(", "P3", ",", "P7", ")", "or", "GFAP", "(", "P10", ",", "P14", ")", ",", "astrocytes", "by", "ACSBG1", ",", "immature", "neurons", "expressed", "DCX", ",", "and", "proliferating", "cells", "the", "cell", "cycle", "markers", "KI67", "(", "P3", ",", "P7", ")", "or", "MCM2", "(", "P10", ",", "P14", ")", ".", "H", "Quantification", "of", "the", "percentages", "of", "GFP", "+", "recombined", "cell", "types", "out", "of", "all", "recombined", "cells", "at", "distinct", "timepoints", ".", "Intermediate", "precursor", "cells", "(", "IPCs", ")", "identified", "by", "TBR2", "expression", "were", "added", "to", "DCX", "+", "neuroblasts", ".", "I", "Quantification", "of", "the", "proportions", "of", "proliferating", "cell", "types", "(", "rNSCs", ",", "IPCs", "/", "neuroblasts", ",", "astrocytes", ")", "out", "of", "all", "proliferating", "cells", "at", "P3", ",", "P7", ",", "P10", ",", "P14", ".", "Data", "information", ":", "Values", "represent", "mean", "±", "SEM", ";", "number", "of", "experimental", "animals", ":", "(", "H", ",", "I", ")", "n", "=", "5", "(", "P3", ")", ",", "=", "6", "(", "P7", ",", "P10", ",", "P14", ")", ";", "dotted", "lines", "label", "GZ", "borders", ";", "scale", "bars", "=", "50", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B Representative pictures of P28 animals that received BrdU at P3, P7, P14 or P21. For cell type identification of generated progeny, immunostainings against NESTIN (white), GFAP (green), and BrdU (magenta) were performed. rNSCs were identified as NESTIN+/GFAP+/BrdU+ with a radial process (as indicated with arrows), neurons as NESTIN-/GFAP-/BrdU+ cells, and astrocytes as NESTIN-/GFAP+/BrdU+ cells in the hilus, GZ, and ML (arrowheads). Data information: dotted lines label GZ borders; scale bars = 50 µm.C Quantification of total numbers of generated cell types (rNSCs, neurons, astrocytes) per area at distinct timepoints as indicated by different colours. Data information: Values represent mean ± SEM; number of experimental animals: (C n = 5 (P3, P21), n = 4 (P7, P14);D Quantification of total numbers of newly generated astrocytes in the hilus, GZ, and ML at P3, P7, P14, P21. Data information: Values represent mean ± SEM; number of experimental animals ,D) n = 5 (P3, P21), n = 4 (P7, P14)G Representative pictures of immunostainings against cell type-specific proteins (all depicted in white). Recombined cells were identified by GFP, rNSCs by their radial process labelled with NESTIN (P3, P7) or GFAP (P10, P14), astrocytes by ACSBG1, immature neurons expressed DCX, and proliferating cells the cell cycle markers KI67 (P3, P7) or MCM2 (P10, P14). H Quantification of the percentages of GFP+ recombined cell types out of all recombined cells at distinct timepoints. Intermediate precursor cells (IPCs) identified by TBR2 expression were added to DCX+ neuroblasts. I Quantification of the proportions of proliferating cell types (rNSCs, IPCs/neuroblasts, astrocytes) out of all proliferating cells at P3, P7, P10, P14. Data information: Values represent mean ± SEM; number of experimental animals: (H,I) n = 5 (P3), = 6 (P7, P10, P14); dotted lines label GZ borders; scale bars = 50 µm."}
{"words": ["Figure", "3B", "Confocal", "image", "of", "an", "adult", "DG", "populated", "by", "distinct", "cells", "identified", "by", "cell", "type", "-", "specific", "protein", "expression", "and", "morphology", ".", "All", "cells", "newly", "-", "generated", "within", "the", "12", "days", "incorporated", "BrdU", "(", "magenta", ")", ";", "rNSCs", "were", "identified", "by", "expression", "of", "SOX2", "(", "cyan", ")", ",", "localization", "of", "their", "cell", "bodies", "to", "the", "SGZ", ",", "and", "a", "GFAP", "+", "radial", "process", "(", "green", ")", ";", "IPCs", "were", "located", "within", "the", "SGZ", "and", "express", "SOX2", "only", "(", "cyan", ")", ";", "neuroblasts", "in", "the", "SGZ", "and", "GZ", "were", "labelled", "by", "DCX", "(", "white", ";", "arrows", ")", ";", "astrocytes", "in", "the", "hilus", ",", "GZ", ",", "and", "ML", "(", "arrowheads", ")", "expressed", "SOX2", "(", "cyan", ")", ".", "C", "Quantification", "of", "the", "percentages", "of", "generated", "cell", "types", "out", "of", "all", "generated", "cells", "(", "rNSCs", ",", "IPCs", "+", "neuroblasts", ",", "astrocytes", ")", "in", "the", "DG", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "number", "of", "experimental", "animals", "(", "indicated", "by", "red", "dots", ")", ":", "(", "C", "n", "=", "5", ";", "dotted", "lines", "border", "SGZ", "and", "GZ", ";", "scale", "bars", "=", "50", "µm", "(", "BD", "Representative", "picture", "of", "astrocytes", "located", "to", "distinct", "DG", "layers", "(", "hilus", "GZ", ",", "ML", ")", ".", "Co", "-", "expression", "of", "BrdU", "/", "SOX2", "/", "GFAP", "revealed", "that", "all", "DG", "compartments", "harboured", "astrocytes", "which", "were", "newly", "generated", "during", "adulthood", "(", "arrowheads", ")", ".", "E", "Quantification", "of", "the", "proportions", "of", "generated", "astrocytes", "per", "DG", "layer", "out", "of", "all", "generated", "DG", "astrocytes", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "number", "of", "experimental", "animals", "(", "indicated", "by", "red", "dots", ")", ":", "E", ")", "n", "=", "5", ",", "dotted", "lines", "border", "GZ", ";", "scale", "bars", "=", "50", "µm", "D", ",", "F", "Representative", "image", "of", "proliferating", "astrocytes", "(", "SOX2", "+", "/", "MCM2", "+", ";", "cyan", "and", "magenta", ",", "respectively", ";", "arrowheads", ")", "of", "all", "DG", "layers", ".", "G", "Quantification", "of", "the", "percentages", "of", "proliferating", "astrocytes", "in", "distinct", "DG", "layers", "over", "all", "proliferating", "DG", "astrocytes", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "number", "of", "experimental", "animals", "(", "indicated", "by", "red", "dots", ")", ":", "(", "G", ")", "n", "=", "4", ",", "dotted", "lines", "border", "GZ", ";", "scale", "bars", "=", "50", "µm", "F", ",", "H", "Confocal", "images", "showing", "GFP", "+", "/", "GFAP", "+", "/", "SOX2", "+", "astrocytes", "of", "distinct", "DG", "layers", "co", "-", "expressing", "the", "proliferation", "marker", "MCM2", "Data", "information", ":", "scale", "bars", "=", "10", "µm", "(", "HK", "Representative", "image", "of", "recombined", "cells", "(", "GFP", "+", ",", "green", ")", "of", "different", "cellular", "identity", ":", "rNSCs", "[", "SOX2", "+", "(", "cyan", ")", "with", "a", "NESTIN", "+", "radial", "process", "(", "white", ")", "]", ",", "IPCs", "(", "SOX2", "+", "nuclei", "in", "the", "SGZ", ";", "cyan", ")", ",", "DCX", "+", "neuroblasts", "in", "the", "SGZ", "and", "GZ", "(", "magenta", ")", ",", "and", "astrocytes", "(", "SOX2", "+", "cells", "in", "the", "hilus", ",", "GZ", ",", "and", "ML", ";", "cyan", ")", ".", "L", "Quantification", "of", "the", "proportions", "of", "recombined", "cell", "types", "over", "all", "recombined", "DG", "cells", "(", "rNSCs", ",", "IPCs", "+", "neuroblasts", ",", "astrocytes", ")", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "number", "of", "experimental", "animals", "(", "indicated", "by", "red", "dots", ")", ":", "(", "L", "n", "=", "3", ";", "SGZ", "and", "GZ", ";", "scale", "bars", "=", "50", "µm", "K", ",", "M", "Quantification", "of", "the", "percentages", "of", "rNSC", "-", "derived", "astrocytes", "in", "distinct", "DG", "layers", "over", "all", "recombined", "DG", "astrocytes", ".", "N", "Confocal", "images", "of", "proliferating", "rNSC", "-", "derived", "astrocytes", "(", "GFP", "+", "/", "SOX2", "+", "/", "MCM2", "+", ";", "arrowheads", ")", "in", "hilus", "and", "GZ", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "number", "of", "experimental", "animals", "(", "indicated", "by", "red", "dots", ")", ":", "M", ")", "n", "=", "3", "scale", "bars", "=", "10", "µm", "N", ")", "Q", "Representative", "examples", "of", "field", "views", "captured", "within", "the", "hippocampal", "fissure", "(", "indicated", "by", "the", "abundant", "large", "vessels", ")", ",", "the", "GZ", "with", "its", "densely", "packed", "granule", "neurons", "and", "the", "hilus", "containing", "much", "larger", "neuronal", "somata", ";", "expression", "of", "GCaMP7", "virus", "(", "green", ")", ",", "labelling", "of", "astrocytes", "by", "hGFAP", "-", "RFP", "(", "red", ")", ".", "Data", "information", ":", "scale", "bars", "=", "50", "µm", "Q", ",", "R", "Examples", "of", "locally", "dividing", "astrocytes", "(", "arrows", ")", "derived", "from", "two", "experimental", "animals", ".", "Arrowheads", "depict", "landmarks", "that", "served", "for", "identification", ".", "Data", "information", ":", "scale", "bars", "=", "50", "µm", "R", ")", ".", "dpi", "=", "days", "post", "injection", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B Confocal image of an adult DG populated by distinct cells identified by cell type-specific protein expression and morphology. All cells newly-generated within the 12 days incorporated BrdU (magenta); rNSCs were identified by expression of SOX2 (cyan), localization of their cell bodies to the SGZ, and a GFAP+ radial process (green); IPCs were located within the SGZ and express SOX2 only (cyan); neuroblasts in the SGZ and GZ were labelled by DCX (white; arrows); astrocytes in the hilus, GZ, and ML (arrowheads) expressed SOX2 (cyan). C Quantification of the percentages of generated cell types out of all generated cells (rNSCs, IPCs + neuroblasts, astrocytes) in the DG. Data information: All data are represented as mean ± SEM; number of experimental animals (indicated by red dots): (C n = 5 ; dotted lines border SGZ and GZ; scale bars = 50 µm (BD Representative picture of astrocytes located to distinct DG layers (hilus GZ, ML). Co-expression of BrdU/SOX2/GFAP revealed that all DG compartments harboured astrocytes which were newly generated during adulthood (arrowheads). E Quantification of the proportions of generated astrocytes per DG layer out of all generated DG astrocytes. Data information: All data are represented as mean ± SEM; number of experimental animals (indicated by red dots): E) n = 5, dotted lines border GZ; scale bars = 50 µm D,F Representative image of proliferating astrocytes (SOX2+/MCM2+; cyan and magenta, respectively; arrowheads) of all DG layers. G Quantification of the percentages of proliferating astrocytes in distinct DG layers over all proliferating DG astrocytes. Data information: All data are represented as mean ± SEM; number of experimental animals (indicated by red dots): (G) n = 4, dotted lines border GZ; scale bars = 50 µm F,H Confocal images showing GFP+/GFAP+/SOX2+ astrocytes of distinct DG layers co-expressing the proliferation marker MCM2 Data information: scale bars = 10 µm (HK Representative image of recombined cells (GFP+, green) of different cellular identity: rNSCs [SOX2+ (cyan) with a NESTIN+ radial process (white)], IPCs (SOX2+ nuclei in the SGZ; cyan), DCX+ neuroblasts in the SGZ and GZ (magenta), and astrocytes (SOX2+ cells in the hilus, GZ, and ML; cyan). L Quantification of the proportions of recombined cell types over all recombined DG cells (rNSCs, IPCs + neuroblasts, astrocytes). Data information: All data are represented as mean ± SEM; number of experimental animals (indicated by red dots): (L n = 3; SGZ and GZ; scale bars = 50 µm K,M Quantification of the percentages of rNSC-derived astrocytes in distinct DG layers over all recombined DG astrocytes. N Confocal images of proliferating rNSC-derived astrocytes (GFP+/SOX2+/MCM2+; arrowheads) in hilus and GZ. Data information: All data are represented as mean ± SEM; number of experimental animals (indicated by red dots): M) n = 3 scale bars = 10 µm N)Q Representative examples of field views captured within the hippocampal fissure (indicated by the abundant large vessels), the GZ with its densely packed granule neurons and the hilus containing much larger neuronal somata; expression of GCaMP7 virus (green), labelling of astrocytes by hGFAP-RFP (red). Data information: scale bars = 50 µm Q,R Examples of locally dividing astrocytes (arrows) derived from two experimental animals. Arrowheads depict landmarks that served for identification. Data information: scale bars = 50 µm R). dpi = days post injection."}
{"words": ["Figure", "4B", "Representative", "images", "of", "BrdU", "-", "incorporating", "newly", "-", "generated", "cells", "in", "control", "and", "running", "hGFAPeGFP", "animals", ".", "BrdU", "+", "cells", "(", "magenta", ")", "were", "assigned", "to", "distinct", "cell", "types", ":", "rNSCs", "[", "identified", "by", "their", "SOX2", "+", "(", "cyan", ")", "cell", "bodies", "residing", "in", "the", "SGZ", "with", "a", "GFAP", "+", "radial", "process", "(", "green", ")", "]", ";", "IPCs", "/", "neuroblasts", "[", "SOX2", "+", "(", "cyan", ")", "nuclei", "located", "to", "the", "SGZ", ",", "DCX", "+", "cells", "(", "white", ")", "in", "the", "SGZ", "and", "GZ", ",", "respectively", "]", ",", "and", "astrocytes", "[", "SOX2", "+", "cells", "(", "cyan", ")", "in", "the", "hilus", ",", "GZ", ",", "and", "ML", "]", ".", "Arrows", "mark", "newly", "generated", "neuronally", "committed", "cells", "(", "BrdU", "+", "/", "DCX", "+", ")", ",", "while", "arrowheads", "indicate", "BrdU", "+", "astrocytes", "(", "SOX2", "+", ")", ".", "Data", "information", ":", "dotted", "lines", "border", "SGZ", "and", "GZ", ";", "scale", "bars", "=", "50", "µm", ".", "C", "Quantification", "of", "total", "numbers", "of", "generated", "cell", "types", "(", "BrdU", "+", ")", "per", "area", "in", "the", "DGs", "of", "control", "and", "runner", "animals", ".", "rNSCs", ":", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "IPCs", "/", "neuroblasts", ":", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0007", ";", "astrocytes", ":", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0032", ";", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "D", "Quantification", "of", "the", "percentages", "of", "generated", "cell", "types", "out", "of", "all", "generated", "cells", "(", "rNSCs", ",", "IPCs", "+", "neuroblasts", ",", "astrocytes", ")", "in", "the", "DGs", "of", "controls", "and", "runners", ";", "not", "significant", ",", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "number", "of", "experimental", "animals", "(", "indicated", "by", "red", "dots", ")", ":", "(", "C", ",", "D", ")", "n", "=", "5", "for", "controls", ",", "n", "=", "6", "for", "runnersE", "Representative", "images", "of", "proliferating", "(", "MCM2", "+", ";", "magenta", ")", "cells", "of", "adult", "control", "and", "running", "hGFAPeGFP", "animals", ";", "rNSCs", ",", "IPCs", "(", "arrows", ")", "and", "astrocytes", "(", "arrowheads", ")", "were", "identified", "by", "criteria", "described", "in", "(", "B", ")", ".", "F", "Quantification", "of", "total", "numbers", "of", "proliferating", "cell", "types", "(", "MCM2", "+", ")", "per", "area", "in", "the", "DG", "of", "controls", "and", "runners", ".", "rNSCs", ":", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0052", ";", "IPCs", ":", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0008", ";", "astrocytes", ":", "*", "p", "=", "0", ".", "0210", ";", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "number", "of", "experimental", "animals", "(", "indicated", "by", "red", "dots", ")", ":", ";", "(", "F", ")", "n", "=", "4", "for", "controls", ",", "n", "=", "5", "for", "runners", "dotted", "lines", "border", "SGZ", "and", "GZ", ";", "scale", "bars", "=", "50", "µm", ".", "H", "Representative", "images", "of", "recombined", "(", "GFP", "+", ";", "green", ")", "cells", "of", "distinct", "cellular", "identities", ":", "rNSCs", "[", "SOX2", "+", "(", "cyan", ")", "with", "a", "NESTIN", "+", "radial", "process", "(", "white", ")", "]", ",", "IPCs", "(", "SOX2", "+", "nuclei", "in", "the", "SGZ", ";", "cyan", ")", ",", "DCX", "+", "neuroblasts", "in", "the", "SGZ", "and", "GZ", "(", "magenta", ")", ",", "and", "astrocytes", "(", "SOX2", "+", "cells", "in", "the", "hilus", ",", "GZ", ",", "and", "ML", ";", "cyan", ")", ".", "Data", "information", ":", "dotted", "lines", "border", "SGZ", "and", "GZ", ";", "scale", "bars", "=", "50", "µm", ".", "I", "Quantification", "of", "the", "total", "numbers", "of", "recombined", "cell", "types", "(", "GFP", "+", ")", "per", "area", "in", "the", "DG", "of", "controls", "and", "runners", ";", "rNSC", ":", "p", "=", "0", ".", "074", ";", "IPCs", "/", "neuroblasts", ":", "*", "p", "=", "0", ".", "0460", ";", "astrocytes", ":", "p", "=", "0", ".", "2314", ";", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "number", "of", "experimental", "animals", "(", "indicated", "by", "red", "dots", ")", ":", "(", "I", ")", "n", "="], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B Representative images of BrdU-incorporating newly-generated cells in control and running hGFAPeGFP animals. BrdU+ cells (magenta) were assigned to distinct cell types: rNSCs [identified by their SOX2+ (cyan) cell bodies residing in the SGZ with a GFAP+ radial process (green)]; IPCs/neuroblasts [SOX2+ (cyan) nuclei located to the SGZ, DCX+ cells (white) in the SGZ and GZ, respectively], and astrocytes [SOX2+ cells (cyan) in the hilus, GZ, and ML]. Arrows mark newly generated neuronally committed cells (BrdU+/DCX+), while arrowheads indicate BrdU+ astrocytes (SOX2+). Data information: dotted lines border SGZ and GZ; scale bars = 50 µm.C Quantification of total numbers of generated cell types (BrdU+) per area in the DGs of control and runner animals. rNSCs: **** p < 0.0001; IPCs/neuroblasts: *** p = 0.0007; astrocytes: ** p = 0.0032; unpaired t-test. D Quantification of the percentages of generated cell types out of all generated cells (rNSCs, IPCs + neuroblasts, astrocytes) in the DGs of controls and runners; not significant, unpaired t-test. Data information: All data are represented as mean ± SEM; number of experimental animals (indicated by red dots): (C,D) n = 5 for controls, n = 6 for runnersE Representative images of proliferating (MCM2+; magenta) cells of adult control and running hGFAPeGFP animals; rNSCs, IPCs (arrows) and astrocytes (arrowheads) were identified by criteria described in (B). F Quantification of total numbers of proliferating cell types (MCM2+) per area in the DG of controls and runners. rNSCs: ** p = 0.0052; IPCs: *** p = 0.0008; astrocytes: * p = 0.0210; unpaired t-test. Data information: All data are represented as mean ± SEM; number of experimental animals (indicated by red dots): ; (F) n = 4 for controls, n = 5 for runners dotted lines border SGZ and GZ; scale bars = 50 µm.H Representative images of recombined (GFP+; green) cells of distinct cellular identities: rNSCs [SOX2+ (cyan) with a NESTIN+ radial process (white)], IPCs (SOX2+ nuclei in the SGZ; cyan), DCX+ neuroblasts in the SGZ and GZ (magenta), and astrocytes (SOX2+ cells in the hilus, GZ, and ML; cyan). Data information: dotted lines border SGZ and GZ; scale bars = 50 µm.I Quantification of the total numbers of recombined cell types (GFP+) per area in the DG of controls and runners; rNSC: p = 0.074; IPCs/neuroblasts: * p = 0.0460; astrocytes: p = 0.2314; unpaired t-test. Data information: All data are represented as mean ± SEM; number of experimental animals (indicated by red dots): (I) n = 3"}
{"words": ["Figure", "5B", "Representative", "confocal", "images", "of", "BrdU", "-", "incorporating", "cells", "(", "magenta", ")", "assigned", "to", "distinct", "cell", "types", "of", "8", "week", "-", ",", "14", "month", "-", ",", "and", "21", "month", "-", "old", "hGFAPeGFP", "mice", ":", "rNSCs", "[", "identified", "by", "their", "SOX2", "+", "(", "green", ")", "cell", "bodies", "residing", "in", "the", "SGZ", "with", "a", "GFAP", "+", "radial", "process", "(", "cyan", ")", "]", ";", "IPCs", "/", "neuroblasts", "[", "SOX2", "+", "(", "green", ")", "nuclei", "located", "to", "the", "SGZ", ",", "DCX", "+", "cells", "(", "white", ")", "in", "the", "SGZ", "and", "GZ", ",", "respectively", "]", ",", "and", "astrocytes", "[", "SOX2", "+", "cells", "(", "green", ")", "in", "the", "hilus", ",", "GZ", ",", "and", "ML", "]", ".", "Data", "information", ":", ";", "dotted", "lines", "border", "SGZ", "and", "GZ", ";", "scale", "bars", "=", "50", "µm", ".", "C", "Quantification", "of", "total", "numbers", "of", "generated", "cell", "types", "(", "BrdU", "+", ";", "rNSCs", ",", "IPCs", "+", "neuroblasts", ",", "astrocytes", ")", "per", "area", "in", "the", "DGs", "of", "8", "week", "-", ",", "14", "month", "-", ",", "and", "21", "month", "-", "old", "hGFAPeGFP", "animals", ".", "rNSCs", ":", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "00076", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0014", ";", "IPCs", "/", "neuroblasts", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "astrocytes", ":", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0008", ";", "*", "p", "=", "0", ".", "0403", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", ".", "D", "Quantification", "of", "the", "percentages", "of", "generated", "cell", "types", "out", "of", "all", "generated", "cells", "(", "rNSCs", ",", "IPCs", "+", "neuroblasts", ",", "astrocytes", ")", "in", "the", "DG", "of", "8", "week", "-", ",", "14", "month", "-", ",", "and", "21", "month", "-", "old", "animals", ".", "rNSCs", ":", "not", "significant", ";", "IPCs", "/", "neuroblasts", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "*", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0001", ";", "astrocytes", ":", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0019", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "number", "of", "experimental", "animals", "(", "indicated", "by", "red", "dots", ")", ":", "(", "C", ",", "D", ")", "n", "=", "5", "in", "8", "week", "-", "old", "mice", ",", "n", "=", "6", "in", "14", "month", "-", "old", "mice", ",", "n", "=", "5", "in", "21", "month", "-", "old", "miceE", "Representative", "images", "of", "proliferating", "cells", "(", "MCM2", "+", ";", "magenta", ")", ":", "rNSCs", "[", "SOX2", "+", "cell", "nuclei", "(", "cyan", ")", "residing", "in", "the", "SGZ", "with", "a", "NESTIN", "+", "radial", "process", "(", "white", ")", "]", ";", "IPCs", "[", "SOX2", "+", "nuclei", "(", "cyan", ")", "located", "to", "the", "SGZ", "]", ",", "and", "astrocytes", "[", "SOX2", "+", "cells", "(", "cyan", ")", "in", "the", "hilus", ",", "GZ", ",", "and", "ML", ";", "arrowheads", "]", ".", "F", "Quantification", "of", "total", "numbers", "of", "proliferating", "(", "MCM2", "+", ")", "cell", "types", "per", "area", "in", "the", "DGs", "of", "8", "week", "-", ",", "14", "month", "-", ",", "and", "21", "month", "-", "old", "animals", ".", "rNSCs", ":", "not", "significant", ";", "IPCs", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "astrocytes", ":", "*", "p", "=", "0", ".", "0216", ";", "*", "p", "=", "0", ".", "0266", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "number", "of", "experimental", "animals", "(", "indicated", "by", "red", "dots", ")", ":", "(", "F", ")", "n", "=", "4", "in", "8", "week", "-", "old", "mice", ",", "n", "=", "6", "in", "14", "month", "-", "and", "21", "month", "-", "old", "mice", "dotted", "lines", "border", "SGZ", "and", "GZ", ";", "scale", "bars", "=", "50", "µm", ".", "G", "Confocal", "images", "of", "8", "week", "-", "and", "14", "month", "-", "old", "NestinCreERT2", ";", "GFP", "animals", ",", "which", "received", "tamoxifen", "for", "five", "days", "(", "10", "times", ",", "every", "12", "h", ")", "and", "were", "killed", "12", "days", "after", "the", "last", "tamoxifen", "shot", ".", "The", "majority", "of", "recombined", "cells", "were", "rNSCs", "[", "SOX2", "+", "cell", "nuclei", "(", "cyan", ")", "residing", "in", "the", "SGZ", "with", "a", "NESTIN", "+", "radial", "process", "(", "white", ")", "]", "and", "IPCs", "/", "neuroblasts", "[", "SOX2", "+", "(", "cyan", ")", "nuclei", "located", "to", "the", "SGZ", ",", "DCX", "+", "cells", "(", "magenta", ")", "in", "the", "SGZ", "and", "GZ", ",", "respectively", "]", ",", "and", "only", "very", "few", "astrocytes", "[", "SOX2", "+", "cells", "(", "cyan", ")", "in", "the", "hilus", ",", "GZ", ",", "and", "ML", "]", "were", "generated", "by", "initially", "recombined", "rNSCs", ".", "H", "Quantification", "of", "total", "numbers", "of", "recombined", "(", "GFP", "+", ")", "rNSCs", ",", "IPCs", "/", "neuroblasts", ",", "astrocytes", "per", "area", "in", "the", "DGs", "of", "8", "week", "-", "and", "14", "month", "-", "old", "animals", ".", "rNSCs", ":", "*", "p", "=", "0", ".", "0460", ";", "IPCs", "/", "neuroblasts", ":", "*", "*", "*", "*", "<", "0", ".", "0001", ";", "astrocytes", ":", "not", "significant", ";", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "number", "of", "experimental", "animals", "(", "indicated", "by", "red", "dots", ")", ":", ";", "(", "H", ")", "n", "=", "3", "in", "8", "week", "-", "old", "mice", ",", "n", "=", "5", "in", "14", "month", "-", "old", "mice", ";", "dotted", "lines", "border", "SGZ", "and", "GZ", ";", "scale", "bars", "=", "50", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5B Representative confocal images of BrdU-incorporating cells (magenta) assigned to distinct cell types of 8 week-, 14 month-, and 21 month-old hGFAPeGFP mice: rNSCs [identified by their SOX2+ (green) cell bodies residing in the SGZ with a GFAP+ radial process (cyan)]; IPCs/neuroblasts [SOX2+ (green) nuclei located to the SGZ, DCX+ cells (white) in the SGZ and GZ, respectively], and astrocytes [SOX2+ cells (green) in the hilus, GZ, and ML]. Data information: ; dotted lines border SGZ and GZ; scale bars = 50 µm.C Quantification of total numbers of generated cell types (BrdU+; rNSCs, IPCs + neuroblasts, astrocytes) per area in the DGs of 8 week-, 14 month-, and 21 month-old hGFAPeGFP animals. rNSCs: *** p = 0.00076, ** p = 0.0014; IPCs/neuroblasts **** p < 0.0001; astrocytes: *** p = 0.0008; * p = 0.0403; one-way ANOVA with Tukey's post hoc test. D Quantification of the percentages of generated cell types out of all generated cells (rNSCs, IPCs + neuroblasts, astrocytes) in the DG of 8 week-, 14 month-, and 21 month-old animals. rNSCs: not significant; IPCs/neuroblasts **** p < 0.0001, *** p = 0.0001; astrocytes: ** p < 0.0019, **** p < 0.0001; one-way ANOVA with Tukey's post hoc test. Data information: All data are represented as mean ± SEM; number of experimental animals (indicated by red dots): (C,D) n = 5 in 8 week-old mice, n = 6 in 14 month-old mice, n = 5 in 21 month-old miceE Representative images of proliferating cells (MCM2+; magenta): rNSCs [SOX2+ cell nuclei (cyan) residing in the SGZ with a NESTIN+ radial process (white)]; IPCs [SOX2+ nuclei (cyan) located to the SGZ], and astrocytes [SOX2+ cells (cyan) in the hilus, GZ, and ML; arrowheads]. F Quantification of total numbers of proliferating (MCM2+) cell types per area in the DGs of 8 week-, 14 month-, and 21 month-old animals. rNSCs: not significant; IPCs **** p < 0.0001; astrocytes: * p = 0.0216; * p = 0.0266; one-way ANOVA with Tukey's post hoc test. Data information: All data are represented as mean ± SEM; number of experimental animals (indicated by red dots): (F) n = 4 in 8 week-old mice, n = 6 in 14 month- and 21 month-old mice dotted lines border SGZ and GZ; scale bars = 50 µm.G Confocal images of 8 week- and 14 month-old NestinCreERT2; GFP animals, which received tamoxifen for five days (10 times, every 12 h) and were killed 12 days after the last tamoxifen shot. The majority of recombined cells were rNSCs [SOX2+ cell nuclei (cyan) residing in the SGZ with a NESTIN+ radial process (white)] and IPCs/neuroblasts [SOX2+ (cyan) nuclei located to the SGZ, DCX+ cells (magenta) in the SGZ and GZ, respectively], and only very few astrocytes [SOX2+ cells (cyan) in the hilus, GZ, and ML] were generated by initially recombined rNSCs. H Quantification of total numbers of recombined (GFP+) rNSCs, IPCs/neuroblasts, astrocytes per area in the DGs of 8 week- and 14 month-old animals. rNSCs: * p = 0.0460; IPCs/neuroblasts: **** < 0.0001; astrocytes: not significant; unpaired t-test. Data information: All data are represented as mean ± SEM; number of experimental animals (indicated by red dots): ; (H) n = 3 in 8 week-old mice, n = 5 in 14 month-old mice ; dotted lines border SGZ and GZ; scale bars = 50 µm."}
{"words": ["Figure", "1A", ",", "Western", "blot", "analysis", "of", "293T", "cells", "treated", "with", "20", "μM", "erastin", "for", "the", "indicated", "times", ".", "B", ",", "H1299", "cells", "transfected", "with", "a", "control", "siRNA", "(", "siCont", ".", ")", "or", "an", "RNF20", "-", "specific", "siRNA", "(", "siRNF20", ")", "and", "a", "wild", "-", "type", "H2B", "(", "H2BWT", ")", "or", "a", "K120R", "-", "mutated", "H2B", "(", "H2BK120R", ")", "were", "treated", "with", "12", "μM", "erastin", "(", "+", ")", "or", "untreated", "(", "-", ")", "for", "24", "h", ".", "Representative", "phase", "-", "contrast", "images", "were", "recorded", "(", "magnification", ",", "×", "20", ")", ",", "and", "the", "surviving", "cells", "were", "counted", ".", "Data", "information", ":", "Bars", "and", "error", "bars", "are", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ",", "n", "=", "3", "independent", "repeats", ".", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "performed", ".", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "C", ",", "Lipid", "ROS", "levels", "were", "assessed", "by", "flow", "cytometry", "after", "C11", "-", "BODIPY", "staining", "in", "cells", "treated", "Data", "information", ":", "Bars", "and", "error", "bars", "are", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ",", "n", "=", "3", "independent", "repeats", ".", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "performed", ".", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "D", ",", "H1299", "cells", "treated", "were", "subjected", "to", "transmission", "electron", "microscopy", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "E", ",", "Control", "H1299", "cells", "(", "transfected", "with", "siCont", ".", "or", "H2BWT", ")", "and", "H2Bub1", "-", "depleted", "H1299", "cells", "(", "transfected", "with", "siRNF20", "or", "H2BK120R", ")", "were", "treated", "with", "erastin", "either", "with", "or", "without", "a", "ferroptosis", "-", "specific", "inhibitor", ",", "ferrostatin", "-", "1", "(", "2", "μM", ")", ",", "for", "24", "h", ".", "Representative", "phase", "-", "contrast", "images", "were", "recorded", "(", "magnification", ",", "×", "20", ")", ",", "and", "the", "surviving", "cells", "were", "counted", ".", "Data", "information", ":", "Bars", "and", "error", "bars", "are", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ",", "n", "=", "3", "independent", "repeats", ".", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "performed", ".", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A, Western blot analysis of 293T cells treated with 20 μM erastin for the indicated times.B, H1299 cells transfected with a control siRNA (siCont.) or an RNF20-specific siRNA (siRNF20) and a wild-type H2B (H2BWT) or a K120R-mutated H2B (H2BK120R) were treated with 12 μM erastin (+) or untreated (-) for 24 h. Representative phase-contrast images were recorded (magnification, ×20), and the surviving cells were counted. Data information: Bars and error bars are mean±s.d., n=3 independent repeats. Two-tailed unpaired Student's t-test was performed. *: p<0.05, **: p<0.01.C, Lipid ROS levels were assessed by flow cytometry after C11-BODIPY staining in cells treated Data information: Bars and error bars are mean±s.d., n=3 independent repeats. Two-tailed unpaired Student's t-test was performed. *: p<0.05, **: p<0.01.D, H1299 cells treated were subjected to transmission electron microscopy. Representative images are shown.E, Control H1299 cells (transfected with siCont. or H2BWT) and H2Bub1-depleted H1299 cells (transfected with siRNF20 or H2BK120R) were treated with erastin either with or without a ferroptosis-specific inhibitor, ferrostatin-1 (2 μM), for 24 h. Representative phase-contrast images were recorded (magnification, ×20), and the surviving cells were counted. Data information: Bars and error bars are mean±s.d., n=3 independent repeats. Two-tailed unpaired Student's t-test was performed. *: p<0.05, **: p<0.01."}
{"words": ["Figure", "2A", ",", "qRT", "-", "PCR", "(", "left", ")", "and", "Western", "blot", "(", "right", ")", "analyses", "of", "H1299", "cells", "transfected", "with", "a", "control", "siRNA", "(", "siCont", ".", ")", "or", "an", "RNF20", "-", "specific", "siRNA", "(", "siRNF20", ")", "and", "a", "wild", "-", "type", "H2B", "(", "H2BWT", ")", "or", "a", "K120R", "-", "mutated", "H2B", "(", "H2BK120R", ")", "for", "24", "h", ".", "Data", "information", ":", "Bars", "and", "error", "bars", "are", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ",", "n", "=", "3", "independent", "repeats", ".", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "performed", ".", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "B", ",", "Chromatin", "immunoprecipitation", "(", "ChIP", ")", "assay", "was", "carried", "out", "with", "anti", "-", "H2Bub1", "antibodies", "in", "H1299", "cells", "(", "left", ")", "or", "293T", "cells", "either", "untreated", "or", "treated", "with", "20", "μM", "erastin", "for", "24", "h", "(", "right", ")", ".", "The", "intergenic", "region", "was", "used", "as", "a", "negative", "control", "for", "the", "occupancy", "of", "H2Bub1", ".", "Data", "information", ":", "Bars", "and", "error", "bars", "are", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ",", "n", "=", "3", "independent", "repeats", ".", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "performed", ".", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "C", ",", "Intracellular", "GSH", "levels", "were", "examined", "in", "H1299", "cells", "treated", "as", "indicated", ",", "and", "bar", "graphs", "are", "shown", ".", "Data", "information", ":", "Bars", "and", "error", "bars", "are", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ",", "n", "=", "3", "independent", "repeats", ".", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "performed", ".", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "D", ",", "H1299", "cells", "transfected", "as", "indicated", "were", "treated", "with", "12", "μM", "erastin", "(", "+", ")", "or", "untreated", "(", "-", ")", "for", "24", "h", ".", "Representative", "phase", "-", "contrast", "images", "were", "recorded", "(", "magnification", ",", "×", "20", ")", ".", "E", ",", "Surviving", "cells", "from", "the", "assay", "shown", "in", "(", "D", ")", "were", "counted", ".", "Data", "information", ":", "Bars", "and", "error", "bars", "are", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ",", "n", "=", "3", "independent", "repeats", ".", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "performed", ".", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "G", ",", "Affected", "metal", "ion", "-", "binding", "genes", "were", "selected", "and", "subjected", "to", "cluster", "analysis", ".", "H", ",", "Labile", "iron", "levels", "were", "assessed", "by", "flow", "cytometry", "with", "a", "standard", "method", "in", "H1299", "cells", ".", "I", ",", "Labile", "iron", "levels", "examined", "were", "quantified", ".", "Data", "information", ":", "Bars", "and", "error", "bars", "are", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ",", "n", "=", "3", "independent", "repeats", ".", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "performed", ".", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A, qRT-PCR (left) and Western blot (right) analyses of H1299 cells transfected with a control siRNA (siCont.) or an RNF20-specific siRNA (siRNF20) and a wild-type H2B (H2BWT) or a K120R-mutated H2B (H2BK120R) for 24 h. Data information: Bars and error bars are mean±s.d., n=3 independent repeats. Two-tailed unpaired Student's t-test was performed. *: p<0.05, **: p<0.01.B, Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay was carried out with anti-H2Bub1 antibodies in H1299 cells (left) or 293T cells either untreated or treated with 20 μM erastin for 24 h (right). The intergenic region was used as a negative control for the occupancy of H2Bub1. Data information: Bars and error bars are mean±s.d., n=3 independent repeats. Two-tailed unpaired Student's t-test was performed. *: p<0.05, **: p<0.01.C, Intracellular GSH levels were examined in H1299 cells treated as indicated, and bar graphs are shown. Data information: Bars and error bars are mean±s.d., n=3 independent repeats. Two-tailed unpaired Student's t-test was performed. *: p<0.05, **: p<0.01.D, H1299 cells transfected as indicated were treated with 12 μM erastin (+) or untreated (-) for 24 h. Representative phase-contrast images were recorded (magnification, ×20). E, Surviving cells from the assay shown in (D) were counted. Data information: Bars and error bars are mean±s.d., n=3 independent repeats. Two-tailed unpaired Student's t-test was performed. *: p<0.05, **: p<0.01.G, Affected metal ion-binding genes were selected and subjected to cluster analysis.H, Labile iron levels were assessed by flow cytometry with a standard method in H1299 cells.I, Labile iron levels examined were quantified. Data information: Bars and error bars are mean±s.d., n=3 independent repeats. Two-tailed unpaired Student's t-test was performed. *: p<0.05, **: p<0.01."}
{"words": ["Figure", "3Western", "blot", "analysis", "was", "performed", "with", "H1299", "or", "Hep3B", "cells", "transfected", "with", "a", "Flag", "-", "tagged", "p53", "or", "an", "empty", "plasmid", "(", "Cont", ".", ")", "for", "48", "h", ".", "Western", "blot", "analysis", "was", "performed", "with", "H1299", "cells", "transfected", "with", "a", "Flag", "-", "tagged", "p53", "or", "an", "empty", "plasmid", "(", "Cont", ".", ")", "for", "48", "h", ".", "C", ",", "Immunofluorescence", "(", "IF", ")", "assay", "for", "H1299", "cells", "transfected", "with", "a", "Flag", "-", "tagged", "p53", "(", "Flag", "-", "p53", ")", "or", "an", "empty", "plasmid", "(", "Cont", ".", ")", "for", "48", "h", ".", "Representative", "images", "are", "shown", "(", "magnification", ",", "×", "40", ")", ".", "Arrowhead", "indicates", "a", "Flag", "-", "p53", "overexpressing", "cell", ".", "D", ",", "Western", "blot", "analysis", "was", "performed", "with", "H1299", "transfected", "with", "a", "Flag", "-", "tagged", "p53", "or", "an", "empty", "vector", "(", "Cont", ".", ")", "for", "48", "h", ".", "E", ",", "293T", "cells", "transfected", "with", "a", "control", "siRNA", "(", "siCont", ".", ")", "and", "three", "p53", "-", "specific", "siRNAs", "(", "sip53", ")", "were", "subjected", "to", "Western", "blot", "analysis", ".", "F", ",", "SMMC", "cells", "were", "treated", "with", "100", "μM", "etoposide", "(", "+", ")", "or", "untreated", "(", "-", ")", "for", "24", "h", ",", "and", "Western", "blot", "analysis", "was", "performed", ".", ",", "Western", "blot", "analysis", "of", "A549", "cells", "and", "H1299", "cells", ".", "H", ",", "H1299", "cells", "transfected", "with", "a", "Flag", "-", "tagged", "p53", "or", "an", "empty", "plasmid", "(", "Cont", ".", ")", "were", "analyzed", "by", "micrococcal", "nuclease", "(", "MNase", ")", "digestion", "assay", ".", "I", ",", "Western", "blot", "analysis", "of", "H1299", "cells", "transfected", "with", "a", "wild", "-", "type", "p53", "(", "p53", "-", "WT", ")", "or", "two", "\"", "gain", "-", "of", "-", "function", "\"", "mutants", "(", "p53", "-", "R273H", "and", "p53", "-", "R175H", ")", "for", "48", "h", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Western blot analysis was performed with H1299 or Hep3B cells transfected with a Flag-tagged p53 or an empty plasmid (Cont.) for 48 h.Western blot analysis was performed with H1299 cells transfected with a Flag-tagged p53 or an empty plasmid (Cont.) for 48 h.C, Immunofluorescence (IF) assay for H1299 cells transfected with a Flag-tagged p53 (Flag-p53) or an empty plasmid (Cont.) for 48 h. Representative images are shown (magnification, ×40). Arrowhead indicates a Flag-p53 overexpressing cell.D, Western blot analysis was performed with H1299 transfected with a Flag-tagged p53 or an empty vector (Cont.) for 48 h.E, 293T cells transfected with a control siRNA (siCont.) and three p53-specific siRNAs (sip53) were subjected to Western blot analysis.F, SMMC cells were treated with 100 μM etoposide (+) or untreated (-) for 24 h, and Western blot analysis was performed., Western blot analysis of A549 cells and H1299 cells.H, H1299 cells transfected with a Flag-tagged p53 or an empty plasmid (Cont.) were analyzed by micrococcal nuclease (MNase) digestion assay.I, Western blot analysis of H1299 cells transfected with a wild-type p53 (p53-WT) or two \"gain-of-function\" mutants (p53-R273H and p53-R175H) for 48 h."}
{"words": ["Figure", "4A", ",", "Coimmunoprecipitation", "(", "Co", "-", "IP", ")", "analysis", "was", "performed", "in", "A549", "cells", "with", "antibodies", "against", "p53", "or", "USP7", ".", "B", ",", "H1299", "cells", "were", "transfected", "with", "an", "empty", "vector", "(", "Cont", ".", ")", ",", "a", "Flag", "-", "tagged", "p53", ",", "a", "USP7", "-", "specific", "shRNA", ",", "or", "the", "last", "two", "plasmids", "together", "for", "48", "h", ".", "Western", "blot", "analysis", "was", "then", "performed", ".", "C", ",", "Nuclear", "and", "cytosolic", "extracts", "were", "differentially", "prepared", "from", "H1299", "cells", "transfected", "with", "a", "Flag", "-", "tagged", "p53", "or", "an", "empty", "plasmid", "(", "Cont", ".", ")", ".", "Western", "blot", "analysis", "was", "then", "performed", ".", "D", ",", "H1299", "cells", "transfected", "with", "a", "Myc", "-", "tagged", "USP7", "or", "a", "Myc", "-", "tagged", "USP7", "together", "with", "a", "Flag", "-", "tagged", "p53", "were", "subjected", "to", "IF", "analysis", "(", "upper", ")", ".", "A549", "cells", "transfected", "with", "a", "p53", "-", "specific", "siRNA", "or", "a", "control", "siRNA", "(", "siCont", ".", ")", "were", "examined", "by", "IF", "analysis", ",", "and", "the", "RNAi", "efficiency", "is", "shown", "(", "lower", ")", ".", "Representative", "images", "are", "shown", "(", "magnification", ",", "×", "40", ")", ".", "F", ",", "IF", "analysis", "of", "A549", "cells", "transfected", "with", "a", "Myc", "-", "tagged", "wild", "-", "type", "USP7", "(", "Myc", "-", "USP7", "-", "WT", ")", "or", "three", "Myc", "-", "tagged", "truncated", "mutants", ".", "Representative", "images", "are", "shown", "(", "magnification", ",", "×", "40", ")", ".", "G", ",", "H1299", "cells", "were", "transfected", "with", "a", "Flag", "-", "tagged", "p53", "or", "an", "empty", "vector", "together", "with", "a", "USP7", "-", "specific", "siRNA", "or", "a", "control", "siRNA", "as", "indicated", "for", "48", "h", ".", "Cells", "were", "then", "harvested", "and", "subjected", "to", "a", "MNase", "digestion", "assay", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A, Coimmunoprecipitation (Co-IP) analysis was performed in A549 cells with antibodies against p53 or USP7.B, H1299 cells were transfected with an empty vector (Cont.), a Flag-tagged p53, a USP7-specific shRNA, or the last two plasmids together for 48 h. Western blot analysis was then performed.C, Nuclear and cytosolic extracts were differentially prepared from H1299 cells transfected with a Flag-tagged p53 or an empty plasmid (Cont.). Western blot analysis was then performed.D, H1299 cells transfected with a Myc-tagged USP7 or a Myc-tagged USP7 together with a Flag-tagged p53 were subjected to IF analysis (upper). A549 cells transfected with a p53-specific siRNA or a control siRNA (siCont.) were examined by IF analysis, and the RNAi efficiency is shown (lower). Representative images are shown (magnification, ×40).F, IF analysis of A549 cells transfected with a Myc-tagged wild-type USP7 (Myc-USP7-WT) or three Myc-tagged truncated mutants. Representative images are shown (magnification, ×40).G, H1299 cells were transfected with a Flag-tagged p53 or an empty vector together with a USP7-specific siRNA or a control siRNA as indicated for 48 h. Cells were then harvested and subjected to a MNase digestion assay."}
{"words": ["Figure", "5A", ",", "Co", "-", "IP", "analysis", "was", "performed", "in", "293T", "cells", "with", "antibodies", "against", "p53", "or", "H2Bub1", ".", "Peptide", "pull", "-", "down", "assay", "was", "performed", "with", "synthesized", "peptidesD", ",", "Co", "-", "IP", "analysis", "for", "H1299", "cells", "transfected", "with", "a", "Flag", "-", "tagged", "p53", "or", "an", "empty", "plasmid", "(", "Cont", ".", ")", "treated", "with", "a", "USP7", "-", "specific", "inhibitor", "P5091", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A, Co-IP analysis was performed in 293T cells with antibodies against p53 or H2Bub1.Peptide pull-down assay was performed with synthesized peptidesD, Co-IP analysis for H1299 cells transfected with a Flag-tagged p53 or an empty plasmid (Cont.) treated with a USP7-specific inhibitor P5091."}
{"words": ["Figure", "6A", ",", "Western", "blot", "analysis", "of", "293T", "cells", "treated", "with", "20", "μM", "erastin", "for", "the", "indicated", "times", ".", "B", ",", "H1299", "cells", "were", "transfected", "with", "Flag", "-", "tagged", "p53", "for", "24", "h", "and", "then", "treated", "with", "12", "μM", "erastin", "or", "untreated", "for", "another", "24", "h", ".", "Co", "-", "IP", "analysis", "was", "performed", "with", "antibodies", "against", "Flag", ".", "C", ",", "H1299", "cells", "transfected", "with", "Flag", "-", "tagged", "p53", "were", "treated", "with", "erastin", "or", "untreated", "for", "24", "h", ".", "Nuclear", "and", "cytosolic", "extracts", "were", "differentially", "prepared", "and", "subjected", "to", "Western", "blot", "analysis", ".", "D", ",", "293T", "cells", "transfected", "with", "a", "p53", "-", "specific", "siRNA", ",", "a", "USP7", "-", "specific", "siRNA", ",", "or", "a", "control", "siRNA", "(", "siCont", ".", ")", "were", "treated", "with", "20", "μM", "erastin", "or", "untreated", "for", "24", "h", "as", "indicated", ".", "Western", "blot", "analysis", "was", "then", "performed", ".", ",", "qRT", "-", "PCR", "(", "above", ")", "and", "Western", "blot", "(", "below", ")", "analyses", "for", "H1299", "cells", "transfected", "with", "a", "Flag", "-", "tagged", "p53", "or", "an", "empty", "plasmid", "together", "with", "a", "USP7", "-", "specific", "siRNA", "or", "a", "control", "siRNA", "(", "siCont", ".", ")", "as", "indicated", ".", "Data", "information", ":", "Bars", "and", "error", "bars", "are", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ",", "n", "=", "3", "independent", "repeats", ".", "F", ",", "ChIP", "analysis", "of", "H1299", "cells", "transfected", "with", "a", "Flag", "-", "tagged", "p53", "or", "an", "empty", "plasmid", "together", "with", "a", "USP7", "-", "specific", "siRNA", "or", "a", "control", "siRNA", "(", "siCont", ".", ")", "as", "indicated", ".", "Data", "information", ":", "Bars", "and", "error", "bars", "are", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ",", "n", "=", "3", "independent", "repeats", ".", "G", ",", "H1299", "cells", "transfected", "with", "Flag", "-", "tagged", "p53", "were", "treated", "with", "12", "μM", "erastin", "or", "untreated", "for", "24", "h", ".", "ChIP", "analysis", "with", "antibodies", "against", "Flag", "or", "USP7", "was", "performed", ".", "Data", "information", ":", "Bars", "and", "error", "bars", "are", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ",", "n", "=", "3", "independent", "repeats", ".", "H", ",", "293T", "cells", "transfected", "with", "a", "p53", "-", "specific", "siRNA", ",", "a", "USP7", "-", "specific", "siRNA", "or", "a", "control", "were", "treated", "with", "20", "μM", "erastin", "or", "untreated", "for", "24", "h", ".", "ChIP", "analysis", "was", "performed", "with", "anti", "-", "H2Bub1", "antibodies", ".", "Data", "information", ":", "Bars", "and", "error", "bars", "are", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ",", "n", "=", "3", "independent", "repeats", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A, Western blot analysis of 293T cells treated with 20 μM erastin for the indicated times.B, H1299 cells were transfected with Flag-tagged p53 for 24 h and then treated with 12 μM erastin or untreated for another 24 h. Co-IP analysis was performed with antibodies against Flag.C, H1299 cells transfected with Flag-tagged p53 were treated with erastin or untreated for 24 h. Nuclear and cytosolic extracts were differentially prepared and subjected to Western blot analysis.D, 293T cells transfected with a p53-specific siRNA, a USP7-specific siRNA, or a control siRNA (siCont.) were treated with 20 μM erastin or untreated for 24 h as indicated. Western blot analysis was then performed., qRT-PCR (above) and Western blot (below) analyses for H1299 cells transfected with a Flag-tagged p53 or an empty plasmid together with a USP7-specific siRNA or a control siRNA (siCont.) as indicated. Data information: Bars and error bars are mean±s.d., n=3 independent repeats.F, ChIP analysis of H1299 cells transfected with a Flag-tagged p53 or an empty plasmid together with a USP7-specific siRNA or a control siRNA (siCont.) as indicated. Data information: Bars and error bars are mean±s.d., n=3 independent repeats.G, H1299 cells transfected with Flag-tagged p53 were treated with 12 μM erastin or untreated for 24 h. ChIP analysis with antibodies against Flag or USP7 was performed. Data information: Bars and error bars are mean±s.d., n=3 independent repeats.H, 293T cells transfected with a p53-specific siRNA, a USP7-specific siRNA or a control were treated with 20 μM erastin or untreated for 24 h. ChIP analysis was performed with anti-H2Bub1 antibodies. Data information: Bars and error bars are mean±s.d., n=3 independent repeats."}
{"words": ["Figure", "7A", ",", "H1299", "cells", "transfected", "with", "a", "Flag", "-", "tagged", "p53", "or", "an", "empty", "plasmid", "together", "with", "a", "USP7", "-", "specific", "siRNA", "or", "a", "control", "siRNA", "(", "siCont", ".", ")", "as", "were", "treated", "with", "12", "μM", "erastin", "(", "+", ")", "or", "untreated", "(", "-", ")", "for", "24", "h", "as", "indicated", ".", "Representative", "phase", "-", "contrast", "images", "were", "recorded", "(", "magnification", ",", "×", "20", ")", ",", "and", "the", "surviving", "cells", "were", "counted", ".", "Data", "information", ":", "Bars", "and", "error", "bars", "are", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ",", "n", "=", "3", "independent", "repeats", ".", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "performed", ".", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "B", ",", "H1299", "cells", "treated", "were", "subjected", "to", "transmission", "electron", "microscopy", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "Arrow", "head", "indicates", "condensed", "and", "marginated", "chromatin", ".", "C", ",", "Lipid", "ROS", "levels", "were", "examined", "in", "cells", "treated", "Data", "information", ":", "Bars", "and", "error", "bars", "are", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ",", "n", "=", "3", "independent", "repeats", ".", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "performed", ".", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A, H1299 cells transfected with a Flag-tagged p53 or an empty plasmid together with a USP7-specific siRNA or a control siRNA (siCont.) as were treated with 12 μM erastin (+) or untreated (-) for 24 h as indicated. Representative phase-contrast images were recorded (magnification, ×20), and the surviving cells were counted. Data information: Bars and error bars are mean±s.d., n=3 independent repeats. Two-tailed unpaired Student's t-test was performed. *: p<0.05.B, H1299 cells treated were subjected to transmission electron microscopy. Representative images are shown. Arrow head indicates condensed and marginated chromatin.C, Lipid ROS levels were examined in cells treated Data information: Bars and error bars are mean±s.d., n=3 independent repeats. Two-tailed unpaired Student's t-test was performed. *: p<0.05."}
{"words": ["Figure", "1Examples", "of", "CT", "scan", "images", "of", "several", "metastases", "(", "M032R1", ",", "M032R2", ",", "and", "M032R5", ")", ".", "Volumetric", "measurements", "based", "on", "the", "PET", "and", "CT", "scans", "could", "be", "generated", "from", "M032", ",", "M032R1", ",", "and", "M032R5", ".", "Graph", "illustrates", "that", "the", "metastases", "R1", "and", "R5", "initially", "expanded", "before", "the", "start", "of", "the", "treatment", ",", "but", "regressed", "upon", "vemurafenib", "treatment", ".", "M032R5", "showed", "progressive", "disease", "after", "4", "months", ",", "whereas", "M032R1", "still", "displayed", "stable", "disease", ".", "M032", "was", "excised", "and", "no", "recurrence", "was", "observed", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Examples of CT scan images of several metastases (M032R1, M032R2, and M032R5).Volumetric measurements based on the PET and CT scans could be generated from M032, M032R1, and M032R5. Graph illustrates that the metastases R1 and R5 initially expanded before the start of the treatment, but regressed upon vemurafenib treatment. M032R5 showed progressive disease after 4 months, whereas M032R1 still displayed stable disease. M032 was excised and no recurrence was observed."}
{"words": ["Figure", "2Hematoxylin", "-", "eosin", "(", "H", "&", "amp", ";", "amp", ";", "E", ")", "and", "p", "-", "ERK", "stainings", "on", "FFPE", "material", "of", "all", "metastases", "showed", "that", "all", "vemurafenib", "-", "resistant", "tumors", "had", "reactivation", "of", "the", "MAPK", "pathway", ".", "Scale", "bar", "represents", "100", "μmqPCR", "was", "performed", "on", "gDNA", "retrieved", "from", "each", "of", "the", "metastases", ",", "using", "primers", "for", "BRAF", "and", "CRAF", "and", "normalized", "on", "LINE", "levels", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "of", "three", "replicates", ",", "error", "bars", "indicate", "standard", "deviation", ".", "The", "results", "confirmed", "that", "BRAF", "was", "amplified", "in", "M032R1", ",", "M032R2", ",", "and", "M032R5", ".", "Staining", "for", "BRAFV600E", "with", "a", "mutant", "epitope", "-", "specific", "antibody", "confirmed", "the", "upregulation", "of", "BRAFV600E", "in", "R1", ",", "R2", ",", "and", "R5", ".", "Scale", "bar", "represents", "100", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Hematoxylin-eosin (H&amp;amp;E) and p-ERK stainings on FFPE material of all metastases showed that all vemurafenib-resistant tumors had reactivation of the MAPK pathway. Scale bar represents 100 μmqPCR was performed on gDNA retrieved from each of the metastases, using primers for BRAF and CRAF and normalized on LINE levels. Bars represent the mean of three replicates, error bars indicate standard deviation. The results confirmed that BRAF was amplified in M032R1, M032R2, and M032R5.Staining for BRAFV600E with a mutant epitope-specific antibody confirmed the upregulation of BRAFV600E in R1, R2, and R5. Scale bar represents 100 μm."}
{"words": ["Figure", "3Immunoblotting", "for", "MAPK", "pathway", "components", "confirmed", "reactivation", "of", "p", "-", "ERK", "and", "p", "-", "MEK", "in", "all", "resistant", "metastases", ".", "Immunoblotting", "for", "M032", "patient", "'", "s", "samples", "using", "an", "antibody", "directed", "against", "either", "the", "mutant", "BRAFV600E", "epitope", "or", "an", "N", "-", "terminal", "region", "of", "BRAF", "revealed", "the", "expression", "of", "a", "shorter", "variant", "of", "BRAFV600E", "in", "M032R3", ",", "of", "approximately", "80", "kDa", ".", "This", "80", "-", "kDa", "band", "could", "not", "be", "detected", "with", "the", "N", "-", "terminus", "-", "recognizing", "antibody", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Immunoblotting for MAPK pathway components confirmed reactivation of p-ERK and p-MEK in all resistant metastases.Immunoblotting for M032 patient's samples using an antibody directed against either the mutant BRAFV600E epitope or an N-terminal region of BRAF revealed the expression of a shorter variant of BRAFV600E in M032R3, of approximately 80 kDa. This 80-kDa band could not be detected with the N-terminus-recognizing antibody."}
{"words": ["Figure", "4Validation", "of", "T55delinsRT", "was", "done", "by", "PCR", "using", "insertion", "-", "specific", "primers", ".", "As", "a", "control", ",", "primers", "amplifying", "exon", "2", "of", "MEK1WT", "were", "used", ".", "Transfection", "of", "pQXCIP", "-", "GFP", ",", "MEK1", "-", "WT", ",", "or", "MEK1", "-", "T55delinsRT", "into", "HEK293T", "cells", "showed", "that", "this", "mutation", "induces", "p", "-", "ERK", "and", "p", "-", "RSK", ".", "Validation", "of", "expression", "of", "pQXCIP", "-", "GFP", ",", "MEK1WT", ",", "or", "MEK1T55delinsRT", "in", "A375", "melanoma", "cells", "by", "immunoblotting", ".", "Dose", "-", "response", "curves", "for", "A375", "melanoma", "cells", "expressing", "GFP", ",", "MEK1WT", ",", "or", "MEK1T55delinsRT", "with", "indicated", "doses", "of", "BRAF", "inhibitor", "vemurafenib", ",", "ERK", "inhibitor", "SCH772984", ",", "or", "MEK", "inhibitor", "trametinib", ".", "Error", "bars", "indicate", "standard", "deviation", ".", "Colony", "formation", "assays", "with", "A375", "melanoma", "cells", ",", "infected", "with", "GFP", ",", "MEK1WT", ",", "or", "MEK1T55delinsRT", "-", "encoding", "lentivirus", ",", "and", "treated", "with", "indicated", "doses", "and", "inhibitors", ".", "Treatment", "of", "A375", "MEK1T55delinsRT", "melanoma", "cells", "with", "DMSO", "(", "−", ")", ",", "250", "nM", "dabrafenib", "(", "D", ")", ",", "10", "nM", "trametinib", "(", "T", ")", ",", "or", "a", "combination", "(", "D", "+", "T", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Validation of T55delinsRT was done by PCR using insertion-specific primers. As a control, primers amplifying exon 2 of MEK1WT were used.Transfection of pQXCIP-GFP, MEK1-WT, or MEK1-T55delinsRT into HEK293T cells showed that this mutation induces p-ERK and p-RSK.Validation of expression of pQXCIP-GFP, MEK1WT, or MEK1T55delinsRT in A375 melanoma cells by immunoblotting.Dose-response curves for A375 melanoma cells expressing GFP, MEK1WT, or MEK1T55delinsRT with indicated doses of BRAF inhibitor vemurafenib, ERK inhibitor SCH772984, or MEK inhibitor trametinib. Error bars indicate standard deviation.Colony formation assays with A375 melanoma cells, infected with GFP, MEK1WT, or MEK1T55delinsRT-encoding lentivirus, and treated with indicated doses and inhibitors.Treatment of A375 MEK1T55delinsRT melanoma cells with DMSO (−), 250 nM dabrafenib (D), 10 nM trametinib (T), or a combination (D+T)."}
{"words": ["Figure", "5A375", "melanoma", "cells", "expressing", "GFP", ",", "MEK1WT", ",", "or", "MEK1T55delinsRT", "were", "injected", "into", "immune", "-", "deficient", "mice", "(", "n", "=", "8", "per", "group", ")", ",", "and", "after", "the", "tumor", "size", "of", "˜", "100", "mm3", "was", "reached", ",", "mice", "were", "treated", "with", "30", "mg", "/", "kg", "dabrafenib", "or", "vehicle", ".", "Graphs", "represent", "fold", "change", "in", "tumor", "volume", "normalized", "on", "the", "tumor", "volume", "on", "the", "day", "of", "the", "start", "of", "the", "treatment", ".", "Error", "bars", "indicate", "standard", "error", "of", "the", "mean", ".", "Average", "tumor", "weight", "of", "all", "groups", "at", "the", "end", "of", "the", "experiment", "described", "in", "(", "A", ")", ".", "Error", "bars", "indicate", "standard", "deviation", ".", "Unpaired", "t", "-", "test", "was", "used", "to", "calculate", "statistical", "significance", ".", "P", "-", "values", "are", "indicated", "in", "the", "graph", ".", "Immunoblotting", "for", "MAPK", "pathway", "components", "performed", "on", "tumors", "of", "all", "groups", ".", "Immunohistochemistry", "for", "Sirius", "Red", "(", "staining", "for", "collagen", ")", "and", "H", "&", "amp", ";", "amp", ";", "E", "on", "tumors", "from", "all", "groups", ",", "to", "identify", "grade", "of", "demarcation", "and", "local", "invasion", ".", "Scale", "bar", "represents", "500", "(", "upper", "row", ")", "and", "100", "(", "lower", "row", ")", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A375 melanoma cells expressing GFP, MEK1WT, or MEK1T55delinsRT were injected into immune-deficient mice (n = 8 per group), and after the tumor size of ˜100 mm3 was reached, mice were treated with 30 mg/kg dabrafenib or vehicle. Graphs represent fold change in tumor volume normalized on the tumor volume on the day of the start of the treatment. Error bars indicate standard error of the mean.Average tumor weight of all groups at the end of the experiment described in (A). Error bars indicate standard deviation. Unpaired t-test was used to calculate statistical significance. P-values are indicated in the graph.Immunoblotting for MAPK pathway components performed on tumors of all groups.Immunohistochemistry for Sirius Red (staining for collagen) and H&amp;amp;E on tumors from all groups, to identify grade of demarcation and local invasion. Scale bar represents 500 (upper row) and 100 (lower row) μm."}
{"words": ["Figure", "6gDNA", "was", "isolated", "from", "another", "fragment", "of", "the", "tumor", "resection", ",", "and", "the", "PCR", "with", "the", "insertion", "-", "specific", "primers", "was", "repeated", ".", "Primers", "amplifying", "exon", "2", "of", "MEK1WT", "were", "used", "as", "an", "input", "control", ".", "Source", "data", "are", "available", "online", "for", "this", "figure", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6gDNA was isolated from another fragment of the tumor resection, and the PCR with the insertion-specific primers was repeated. Primers amplifying exon 2 of MEK1WT were used as an input control.Source data are available online for this figure."}
{"words": ["Figure", "7Staining", "for", "hematoxylin", "-", "eosin", "(", "H", "&", "amp", ";", "amp", ";", "E", ")", "and", "p", "-", "ERK", "on", "the", "PDX", "samples", "M032", ".", "X1", ",", "M032R1", ".", "X1", ",", "M032R2", ".", "X1", ",", "M032R4", ".", "X1", ",", "and", "M032R5", ".", "X1", ".", "Stainings", "showed", "that", "p", "-", "ERK", "is", "higher", "in", "the", "PDX", "derived", "from", "the", "resistant", "metastases", ".", "Scale", "bar", "represents", "100", "μm", ".", "Immunoblotting", "for", "components", "of", "the", "MAPK", "pathway", "confirmed", "reactivation", "of", "p", "-", "ERK", "in", "the", "PDX", "derived", "from", "the", "vemurafenib", "-", "resistant", "metastases", ",", "although", "the", "p", "-", "ERK", "signal", "is", "heterogeneous", "in", "the", "pre", "-", "treatment", "PDX", ".", "Validation", "of", "the", "BRAF", "amplification", "was", "performed", "by", "qPCR", "on", "gDNA", "derived", "from", "the", "PDX", ",", "using", "primers", "for", "BRAF", "and", "CRAF", "and", "normalized", "on", "LINE", "expression", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "of", "three", "replicates", ",", "error", "bars", "indicate", "standard", "deviation", ".", "The", "results", "confirmed", "that", "BRAF", "was", "amplified", "in", "PDX", "derived", "from", "M032R2", "and", "M032R5", ",", "but", "not", "from", "M032R1", ".", "Presence", "of", "the", "MEK1T55delinsRT", "was", "analyzed", "by", "PCR", "using", "insertion", "-", "specific", "primers", ".", "As", "a", "control", ",", "primers", "amplifying", "exon", "2", "of", "MEK1WT", "were", "used", ".", "The", "insertion", "was", "found", "in", "M032R1", ".", "X1", "and", "M032R4", ".", "X1", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Staining for hematoxylin-eosin (H&amp;amp;E) and p-ERK on the PDX samples M032.X1, M032R1.X1, M032R2.X1, M032R4.X1, and M032R5.X1. Stainings showed that p-ERK is higher in the PDX derived from the resistant metastases. Scale bar represents 100 μm.Immunoblotting for components of the MAPK pathway confirmed reactivation of p-ERK in the PDX derived from the vemurafenib-resistant metastases, although the p-ERK signal is heterogeneous in the pre-treatment PDX.Validation of the BRAF amplification was performed by qPCR on gDNA derived from the PDX, using primers for BRAF and CRAF and normalized on LINE expression. Bars represent the mean of three replicates, error bars indicate standard deviation. The results confirmed that BRAF was amplified in PDX derived from M032R2 and M032R5, but not from M032R1.Presence of the MEK1T55delinsRT was analyzed by PCR using insertion-specific primers. As a control, primers amplifying exon 2 of MEK1WT were used. The insertion was found in M032R1.X1 and M032R4.X1."}
{"words": ["Figure", "1A", "-", "C", "Calcium", "flux", "measured", "by", "FACScan", "for", "splenic", "B", "cells", "isolated", "from", "B1", "-", "8", "transgenic", "mice", "after", "stimulation", "with", "(", "A", ")", "NIP15", "-", "BSA", "(", "30", "pM", ")", "or", "1NIP", "-", "pep", "(", "see", "Figure", "EV1", ",", "80", "nM", ")", ";", "(", "B", ")", "Ac146", "antibody", "(", "12", ".", "5", "nM", ")", "or", "Ac146Fab", "(", "25", "nM", ")", ";", "(", "C", ")", "Ac38", "antibody", "(", "12", ".", "5", "nM", ")", "or", "Ac38Fab", "(", "25", "nM", ")", ".", "The", "addition", "of", "the", "stimuli", "to", "the", "cells", "is", "indicated", "by", "arrows", ".", "D", "Representative", "microscopy", "images", "showing", "Fab", "-", "PLA", "results", "measuring", "the", "BCR", "proximity", "for", "the", "IgM", "-", "BCR", "(", "upper", ")", "and", "the", "IgD", "-", "BCR", "(", "lower", ")", "on", "untreated", "or", "treated", "B1", "-", "8", "splenic", "B", "cells", ".", "PLA", "signals", "are", "shown", "as", "red", "dots", "and", "the", "nuclei", "are", "visualized", "by", "DAPI", "staining", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "μm", ".", "E", "The", "Fab", "-", "PLA", "results", "are", "quantified", "by", "Blobfinder", "software", "and", "presented", "as", "box", "plots", ".", "The", "median", "values", "are", "highlighted", "as", "thick", "lines", "and", "the", "whiskers", "represent", "the", "minimum", "and", "maximum", "value", ".", "PLA", "signals", "(", "dots", "/", "cells", ")", "were", "counted", "from", "at", "least", "100", "cells", "for", "each", "sample", ".", "Data", "from", "treated", "samples", "were", "compared", "to", "data", "from", "resting", "cells", ",", "p", "-", "values", "were", "calculated", "by", "Kruskal", "-", "Wallis", "one", "-", "way", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A-C Calcium flux measured by FACScan for splenic B cells isolated from B1-8 transgenic mice after stimulation with (A) NIP15-BSA (30 pM) or 1NIP-pep (see Figure EV1, 80 nM); (B) Ac146 antibody (12.5 nM) or Ac146Fab (25 nM); (C) Ac38 antibody (12.5 nM) or Ac38Fab (25 nM). The addition of the stimuli to the cells is indicated by arrows.D Representative microscopy images showing Fab-PLA results measuring the BCR proximity for the IgM-BCR (upper) and the IgD-BCR (lower) on untreated or treated B1-8 splenic B cells. PLA signals are shown as red dots and the nuclei are visualized by DAPI staining. Scale bar: 5 μm.E The Fab-PLA results are quantified by Blobfinder software and presented as box plots. The median values are highlighted as thick lines and the whiskers represent the minimum and maximum value. PLA signals (dots/cells) were counted from at least 100 cells for each sample. Data from treated samples were compared to data from resting cells, p-values were calculated by Kruskal-Wallis one-way analysis of variance (ANOVA)."}
{"words": ["Figure", "2A", "-", "C", "Calcium", "flux", "measured", "by", "FACScan", "for", "splenic", "B", "cells", "isolated", "from", "Lyn", "-", "deficient", "B1", "-", "8", "transgenic", "mice", "after", "stimulation", "with", "(", "A", ")", "NIP15", "-", "BSA", "(", "30", "pM", ")", "or", "1NIP", "-", "pep", "(", "80", "nM", ")", ";", "(", "B", ")", "Ac146", "antibody", "(", "12", ".", "5", "nM", ")", "or", "Ac146Fab", "(", "25", "nM", ")", ";", "(", "C", ")", "Ac38", "antibody", "(", "12", ".", "5", "nM", ")", "or", "Ac38Fab", "(", "25", "nM", ")", ".", "Arrows", "indicate", "the", "addition", "of", "the", "stimuli", "to", "the", "cells", ".", "D", "Representative", "microscopy", "images", "showing", "Fab", "-", "PLA", "results", "monitoring", "the", "BCR", "proximity", "for", "the", "IgM", "-", "BCR", "(", "upper", ")", "and", "the", "IgD", "-", "BCR", "(", "lower", ")", "on", "untreated", "or", "treated", "B1", "-", "8", "splenic", "B", "cells", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "μm", ".", "E", "Quantified", "Fab", "-", "PLA", "results", "are", "presented", "as", "box", "plots", ",", "where", "the", "median", "values", "are", "highlighted", "as", "thick", "lines", "and", "the", "whiskers", "represent", "the", "minimum", "and", "maximum", "value", ".", "PLA", "signals", "(", "dots", "/", "cells", ")", "were", "counted", "from", "at", "least", "100", "cells", "for", "each", "sample", ".", "p", "-", "values", "were", "calculated", "by", "Kruskal", "-", "Wallis", "one", "-", "way", "ANOVA", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A-C Calcium flux measured by FACScan for splenic B cells isolated from Lyn-deficient B1-8 transgenic mice after stimulation with (A) NIP15-BSA (30 pM) or 1NIP-pep (80 nM); (B) Ac146 antibody (12.5 nM) or Ac146Fab (25 nM); (C) Ac38 antibody (12.5 nM) or Ac38Fab (25 nM). Arrows indicate the addition of the stimuli to the cells.D Representative microscopy images showing Fab-PLA results monitoring the BCR proximity for the IgM-BCR (upper) and the IgD-BCR (lower) on untreated or treated B1-8 splenic B cells. Scale bar: 5 μm.E Quantified Fab-PLA results are presented as box plots, where the median values are highlighted as thick lines and the whiskers represent the minimum and maximum value. PLA signals (dots/cells) were counted from at least 100 cells for each sample. p-values were calculated by Kruskal-Wallis one-way ANOVA."}
{"words": ["Figure", "3A", "-", "D", "Proximity", "between", "IgM", "-", "BCR", "on", "the", "surface", "of", "3046SM", "(", "A", ",", "C", ")", "or", "3046M", "(", "B", ",", "D", ")", "cells", "before", "and", "after", "a", "1", "-", "min", "stimulation", "with", "the", "indicated", "reagents", ",", "assayed", "by", "Fab", "-", "PLA", ".", "Results", "are", "presented", "as", "representative", "microscopy", "images", "(", "A", ",", "B", ")", "and", "box", "plots", "after", "quantification", "(", "C", ",", "D", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "μm", ".", "In", "the", "box", "plots", ",", "the", "median", "values", "are", "highlighted", "as", "thick", "lines", "and", "the", "whiskers", "represent", "the", "minimum", "and", "maximum", "value", ".", "PLA", "signals", "(", "dots", "/", "cells", ")", "were", "counted", "from", "at", "least", "100", "cells", "for", "each", "sample", "and", "p", "-", "values", "were", "calculated", "by", "Kruskal", "-", "Wallis", "one", "-", "way", "ANOVA", ".", "E", "-", "H", "Calcium", "flux", "measured", "by", "FACScan", "for", "3046SM", "(", "E", ",", "F", ")", "and", "3046M", "(", "G", ",", "H", ")", "cells", "after", "stimulation", "with", "NIP15", "-", "BSA", "(", "30", "pM", ")", ",", "1NIP", "-", "pep", "(", "80", "nM", ")", ",", "Ac146Fab", "(", "25", "nM", ")", "or", "Ac38Fab", "(", "25", "nM", ")", ".", "Arrows", "indicate", "the", "addition", "of", "the", "stimuli", "to", "the", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A-D Proximity between IgM-BCR on the surface of 3046SM (A, C) or 3046M (B, D) cells before and after a 1-min stimulation with the indicated reagents, assayed by Fab-PLA. Results are presented as representative microscopy images (A, B) and box plots after quantification (C, D). Scale bar: 5 μm. In the box plots, the median values are highlighted as thick lines and the whiskers represent the minimum and maximum value. PLA signals (dots/cells) were counted from at least 100 cells for each sample and p-values were calculated by Kruskal-Wallis one-way ANOVA.E-H Calcium flux measured by FACScan for 3046SM (E, F) and 3046M (G, H) cells after stimulation with NIP15-BSA (30 pM), 1NIP-pep (80 nM), Ac146Fab (25 nM) or Ac38Fab (25 nM). Arrows indicate the addition of the stimuli to the cells."}
{"words": ["Figure", "4A", "-", "D", "Proximity", "between", "IgD", "-", "BCRs", "on", "the", "surface", "of", "3046SD", "(", "A", ",", "C", ")", "or", "3046D", "(", "B", ",", "D", ")", "cells", "before", "and", "after", "a", "1", "-", "min", "stimulation", ",", "assayed", "by", "Fab", "-", "PLA", ".", "Results", "are", "presented", "as", "representative", "microscopy", "images", "(", "A", ",", "B", ")", "and", "box", "plots", "after", "quantification", "(", "C", ",", "D", ")", ".", "PLA", "signals", "are", "shown", "as", "red", "dots", "and", "nuclei", "were", "visualized", "by", "DAPI", "staining", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "μm", ".", "In", "the", "box", "plots", ",", "the", "median", "values", "were", "highlighted", "as", "thick", "lines", "and", "the", "whiskers", "represent", "the", "minimum", "and", "maximum", "value", ".", "PLA", "signals", "(", "dots", "/", "cells", ")", "were", "counted", "from", "at", "least", "100", "cells", "for", "each", "sample", "and", "p", "-", "values", "were", "calculated", "by", "Kruskal", "-", "Wallis", "one", "-", "way", "ANOVA", ".", "E", "-", "H", "Calcium", "flux", "measured", "by", "FACScan", "for", "3046SD", "(", "E", ",", "F", ")", "and", "3046D", "(", "G", ",", "H", ")", "cells", "after", "stimulation", "with", "NIP15", "-", "BSA", "(", "30", "pM", ")", ",", "1NIP", "-", "pep", "(", "80", "nM", ")", ",", "Ac146Fab", "(", "25", "nM", ")", "or", "Ac38Fab", "(", "25", "nM", ")", ".", "Arrows", "indicate", "the", "addition", "of", "the", "stimuli", "to", "the", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A-D Proximity between IgD-BCRs on the surface of 3046SD (A, C) or 3046D (B, D) cells before and after a 1-min stimulation, assayed by Fab-PLA. Results are presented as representative microscopy images (A, B) and box plots after quantification (C, D). PLA signals are shown as red dots and nuclei were visualized by DAPI staining. Scale bar: 5 μm. In the box plots, the median values were highlighted as thick lines and the whiskers represent the minimum and maximum value. PLA signals (dots/cells) were counted from at least 100 cells for each sample and p-values were calculated by Kruskal-Wallis one-way ANOVA.E-H Calcium flux measured by FACScan for 3046SD (E, F) and 3046D (G, H) cells after stimulation with NIP15-BSA (30 pM), 1NIP-pep (80 nM), Ac146Fab (25 nM) or Ac38Fab (25 nM). Arrows indicate the addition of the stimuli to the cells."}
{"words": ["Figure", "5Calcium", "flux", "measured", "by", "FACScan", "for", "3046M", "(", "A", ",", "D", ")", ",", "3046SD", "(", "B", ",", "E", ")", "and", "3046D", "(", "C", ",", "F", ")", "cells", "stimulated", "with", "anti", "-", "HC", "(", "2", "μl", "/", "ml", ")", "(", "A", ",", "B", ",", "C", ")", ",", "or", "anti", "-", "λ", "(", "2", "μl", "/", "ml", ")", "(", "D", ",", "E", ",", "F", ")", "antibodies", "with", "or", "without", "1", "min", "prestimulation", "with", "1NIP", "-", "pep", "(", "80", "nM", ")", ".", "The", "addition", "of", "antibodies", "is", "indicated", "by", "black", "arrows", ".", "The", "1NIP", "-", "pep", "was", "added", "immediately", "before", "recording", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Calcium flux measured by FACScan for 3046M (A, D), 3046SD (B, E) and 3046D (C, F) cells stimulated with anti-HC (2 μl/ml) (A, B, C), or anti-λ (2 μl/ml) (D, E, F) antibodies with or without 1 min prestimulation with 1NIP-pep (80 nM). The addition of antibodies is indicated by black arrows. The 1NIP-pep was added immediately before recording. Data are representative of three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "6A", "-", "E", "B1", "-", "8", "B", "cells", ",", "3046SM", "cells", ",", "3046M", "cells", ",", "3046SD", "cells", ",", "or", "3046D", "cells", "were", "stimulated", "with", "1NIP", "-", "pep", "(", "80", "nM", ")", ",", "or", "anti", "-", "CD19", "antibody", "(", "62", "nM", ")", ",", "or", "costimulated", "with", "1NIP", "-", "pep", "and", "anti", "-", "CD19", "antibody", ".", "The", "calcium", "fluxes", "were", "measured", "by", "FACScan", ".", "F", "-", "J", "B1", "-", "8", "B", "cells", ",", "3046SM", "cells", ",", "3046M", "cells", ",", "3046SD", "cells", ",", "or", "3046D", "cells", "were", "stimulated", "with", "1NIP", "-", "pep", "(", "80", "nM", ")", ",", "or", "anti", "-", "CD20", "antibody", "(", "62", "nM", ")", ",", "or", "costimulated", "with", "1NIP", "-", "pep", "and", "anti", "-", "CD20", "antibody", ".", "The", "calcium", "fluxes", "were", "measured", "by", "FACScan", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A-E B1-8 B cells, 3046SM cells, 3046M cells, 3046SD cells, or 3046D cells were stimulated with 1NIP-pep (80 nM), or anti-CD19 antibody (62 nM), or costimulated with 1NIP-pep and anti-CD19 antibody. The calcium fluxes were measured by FACScan.F-J B1-8 B cells, 3046SM cells, 3046M cells, 3046SD cells, or 3046D cells were stimulated with 1NIP-pep (80 nM), or anti-CD20 antibody (62 nM), or costimulated with 1NIP-pep and anti-CD20 antibody. The calcium fluxes were measured by FACScan."}
{"words": ["Figure", "1API", "delivery", "is", "blocked", "at", "low", "temperatures", ".", "SEY6210", "cells", "were", "pulse", "labeled", "for", "5", "min", "and", "chased", "for", "the", "times", "indicated", ".", "Identical", "experiments", "were", "performed", "at", "10", "°", ",", "14", "°", ",", "and", "30", "°", "C", ".", "API", "was", "recovered", "by", "immunoprecipitation", "followed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "detected", "by", "a", "STORM", "phosphorimager", "(", "Molecular", "Dynamics", ",", "Sunnyvale", ",", "CA", ")", ".", "The", "positions", "of", "prAPI", "and", "mAPI", "are", "indicated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1API delivery is blocked at low temperatures. SEY6210 cells were pulse labeled for 5 min and chased for the times indicated. Identical experiments were performed at 10°, 14°, and 30°C. API was recovered by immunoprecipitation followed by SDS-PAGE and detected by a STORM phosphorimager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). The positions of prAPI and mAPI are indicated."}
{"words": ["Figure", "2Precursor", "API", "is", "trapped", "in", "a", "prevacuolar", "compartment", "in", "vps18", "cells", ".", "(", "A", ")", "Yeast", "strain", "JSR18Δ1", "with", "plasmid", "pJSR9", "(", "vps18", "ts", ")", "was", "grown", "at", "the", "permissive", "temperature", "of", "26", "°", "C", ".", "Before", "labeling", ",", "the", "cells", "were", "incubated", "at", "either", "26", "°", "or", "38", "°", "C", "for", "10", "min", ".", "Pulse", "labeling", "was", "for", "5", "min", ",", "followed", "by", "the", "indicated", "chase", "times", ".", "(", "B", ")", "vps18", "spheroplasts", "were", "shifted", "to", "38", "°", "C", "for", "5", "min", ",", "pulse", "labeled", "for", "5", "min", ",", "and", "then", "chased", "for", "either", "0", "or", "60", "min", ".", "At", "each", "time", "point", "the", "spheroplasts", "were", "collected", "by", "centrifugation", "and", "resuspended", "in", "PS0", "buffer", ".", "The", "Total", "(", "T", ")", "fraction", "either", "received", "no", "treatment", ",", "was", "treated", "with", "50", "μg", "/", "ml", "proteinase", "K", ",", "or", "received", "proteinase", "K", "in", "the", "presence", "of", "0", ".", "2", "%", "Triton", "X", "-", "100", ".", "The", "supernatant", "(", "S0", ")", "and", "pellet", "(", "P0", ")", "fractions", "were", "collected", "after", "centrifugation", "at", "10", ",", "000", "g", "for", "5", "min", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Precursor API is trapped in a prevacuolar compartment in vps18 cells. (A) Yeast strain JSR18Δ1 with plasmid pJSR9 (vps18 ts) was grown at the permissive temperature of 26°C. Before labeling, the cells were incubated at either 26° or 38°C for 10 min. Pulse labeling was for 5 min, followed by the indicated chase times.(B) vps18 spheroplasts were shifted to 38°C for 5 min, pulse labeled for 5 min, and then chased for either 0 or 60 min. At each time point the spheroplasts were collected by centrifugation and resuspended in PS0 buffer. The Total (T) fraction either received no treatment, was treated with 50 μg/ml proteinase K, or received proteinase K in the presence of 0.2% Triton X-100. The supernatant (S0) and pellet (P0) fractions were collected after centrifugation at 10,000 g for 5 min."}
{"words": ["Figure", "3A", "mutant", "in", "the", "API", "propeptide", "causes", "accumulation", "of", "prAPI", "on", "a", "nonvacuolar", "compartment", ".", "(", "A", ")", "Spheroplasts", "from", "an", "ape1Δ", "strain", "containing", "a", "plasmid", "bearing", "P22L", "API", "were", "subjected", "to", "differential", "lysis", "in", "PS200", "buffer", ".", "The", "Total", "(", "T", ")", "fraction", "(", "after", "differential", "lysis", ")", "either", "received", "no", "treatment", ",", "was", "treated", "with", "50", "μg", "/", "ml", "proteinase", "K", ",", "or", "received", "proteinase", "K", "in", "the", "presence", "of", "0", ".", "2", "%", "Triton", "X", "-", "100", ".", "(", "B", ")", "The", "supernatant", "(", "S200", ")", "and", "pellet", "(", "P200", ")", "fractions", "were", "collected", "after", "centrifugation", "at", "5", ",", "000", "g", "for", "5", "min", ".", "The", "P200", "fraction", "was", "resuspended", "in", "10", "%", "Ficoll", ",", "and", "vacuoles", "were", "isolated", "by", "flotation", "through", "4", "%", "Ficoll", ".", "V", ",", "vacuole", ";", "I", ",", "4", "/", "10", "%", "Ficoll", "interface", ";", "P", ",", "gradient", "pellet", ".", "Proteins", "were", "detected", "by", "Western", "blotting", ".", "The", "positions", "of", "prAPI", ",", "mAPI", ",", "and", "mPrA", "are", "indicated", ".", "(", "C", ")", "ape1Δ", "cells", "containing", "P22L", "API", "on", "a", "plasmid", "were", "pulse", "labeled", "for", "5", "min", ",", "harvested", "by", "centrifugation", ",", "and", "subjected", "to", "a", "nonradioactive", "chase", "in", "either", "nitrogen", "-", "containing", "(", "SMD", ")", "or", "nitrogen", "starvation", "(", "SD", "-", "N", ")", "medium", ".", "Samples", "were", "collected", "at", "the", "times", "indicated", "and", "immunoprecipitated", "with", "API", "antiserum", ".", "The", "resulting", "SDS", "-", "PAGE", "gels", "were", "quantified", "using", "a", "Molecular", "Dynamics", "STORM", "phosphorimager", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A mutant in the API propeptide causes accumulation of prAPI on a nonvacuolar compartment. (A) Spheroplasts from an ape1Δ strain containing a plasmid bearing P22L API were subjected to differential lysis in PS200 buffer. The Total (T) fraction (after differential lysis) either received no treatment, was treated with 50 μg/ ml proteinase K, or received proteinase K in the presence of 0.2% Triton X-100.(B) The supernatant (S200) and pellet (P200) fractions were collected after centrifugation at 5,000 g for 5 min. The P200 fraction was resuspended in 10% Ficoll, and vacuoles were isolated by flotation through 4% Ficoll. V, vacuole; I, 4/10% Ficoll interface; P, gradient pellet. Proteins were detected by Western blotting. The positions of prAPI, mAPI, and mPrA are indicated.(C) ape1Δ cells containing P22L API on a plasmid were pulse labeled for 5 min, harvested by centrifugation, and subjected to a nonradioactive chase in either nitrogen-containing (SMD) or nitrogen starvation (SD-N) medium. Samples were collected at the times indicated and immunoprecipitated with API antiserum. The resulting SDS-PAGE gels were quantified using a Molecular Dynamics STORM phosphorimager."}
{"words": ["Figure", "4Precursor", "API", "is", "trapped", "within", "a", "vesicle", "in", "cvt17", "mutants", ".", "(", "A", ")", "Precursor", "API", "is", "in", "a", "protease", "-", "protected", "compartment", "in", "cvt17", "mutants", ".", "THY32", "(", "cvt17", ")", "spheroplasts", "were", "subjected", "to", "differential", "lysis", "and", "protease", "treatment", "in", "PS200", "buffer", "as", "in", "Fig", "3B", ")", "Precursor", "API", "is", "not", "free", "in", "the", "vacuolar", "lumen", "in", "cvt17", "mutants", ".", "Differential", "fractionation", "was", "continued", "by", "resuspending", "the", "P200", "fraction", "in", "PS0", "buffer", "and", "separating", "the", "supernatant", "(", "S0", ")", "and", "pellet", "(", "P0", ")", "fractions", "by", "centrifugation", "at", "10", ",", "000", "g", ".", "The", "S0", "and", "P0", "fractions", "were", "treated", "with", "proteinase", "K", "in", "the", "presence", "and", "absence", "of", "Triton", "X", "-", "100", "as", "indicated", ".", "All", "fractions", "were", "precipitated", "with", "10", "%", "TCA", "and", "resolved", "by", "SDS", "PAGE", ";", "proteins", "of", "interest", "were", "detected", "by", "Western", "blotting", ".", "The", "positions", "of", "prAPI", ",", "mAPI", ",", "and", "mPrA", "are", "indicated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Precursor API is trapped within a vesicle in cvt17 mutants. (A) Precursor API is in a protease-protected compartment in cvt17 mutants. THY32 (cvt17) spheroplasts were subjected to differential lysis and protease treatment in PS200 buffer as in Fig 3B) Precursor API is not free in the vacuolar lumen in cvt17 mutants. Differential fractionation was continued by resuspending the P200 fraction in PS0 buffer and separating the supernatant (S0) and pellet (P0) fractions by centrifugation at 10,000 g. The S0 and P0 fractions were treated with proteinase K in the presence and absence of Triton X-100 as indicated. All fractions were precipitated with 10% TCA and resolved by SDS PAGE; proteins of interest were detected by Western blotting. The positions of prAPI, mAPI, and mPrA are indicated."}
{"words": ["Figure", "5Precursor", "API", "is", "contained", "within", "subvacuolar", "vesicles", "in", "cvt17", "mutants", ".", "(", "A", ")", "Isolated", "vacuoles", "(", "V", ")", "from", "cvt17", "cells", "were", "lysed", "in", "PS0", "buffer", ",", "loaded", "on", "top", "of", "an", "Optiprep", "step", "gradient", ",", "and", "centrifuged", "at", "170", ",", "000", "g", "for", "60", "min", "as", "described", "in", "Materials", "and", "Methods", ".", "Fractions", "VV", ",", "0", "/", "1", ".", "06", "interface", ";", "LD", ",", "1", ".", "06", "region", ";", "SV", ",", "1", ".", "06", "/", "1", ".", "12", "interface", ";", "HD", ",", "1", ".", "12", "region", ".", "(", "B", ")", "An", "aliquot", "of", "fractions", "VV", "and", "SV", "was", "treated", "with", "proteinase", "K", "either", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "Triton", "X", "-", "100", "as", "indicated", ".", "Because", "of", "the", "presence", "of", "protease", "inhibitors", "in", "the", "vesicle", "isolation", "procedure", ",", "an", "intermediate", "-", "sized", "API", "degradation", "product", "results", "from", "proteinase", "K", "treatment", ".", "The", "V", "fraction", "represents", "one", "-", "tenth", "of", "the", "load", "of", "the", "Optiprep", "gradient", ".", "Proteins", "were", "detected", "by", "Western", "blotting", ".", "The", "positions", "of", "prAPI", "and", "mALP", "are", "indicated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Precursor API is contained within subvacuolar vesicles in cvt17 mutants. (A) Isolated vacuoles (V) from cvt17 cells were lysed in PS0 buffer, loaded on top of an Optiprep step gradient, and centrifuged at 170,000 g for 60 min as described in Materials and Methods. Fractions VV, 0/1.06 interface; LD, 1.06 region; SV, 1.06/1.12 interface; HD, 1.12 region.(B) An aliquot of fractions VV and SV was treated with proteinase K either in the presence or absence of Triton X-100 as indicated. Because of the presence of protease inhibitors in the vesicle isolation procedure, an intermediate-sized API degradation product results from proteinase K treatment. The V fraction represents one-tenth of the load of the Optiprep gradient. Proteins were detected by Western blotting. The positions of prAPI and mALP are indicated."}
{"words": ["Figure", "6Immuno", "-", "EM", "of", "cvt17", "cells", ".", "Yeast", "strains", "SEY6210", "(", "parental", "wild", "type", ")", "and", "THY32", "(", "cvt17", ")", "were", "grown", "in", "YPD", "and", "prepared", "for", "microscopy", "as", "described", "in", "Materials", "and", "Methods", ".", "(", "A", ")", "Wild", "-", "type", "cells", "probed", "with", "antibody", "against", "mature", "API", ".", "(", "B", ")", "A", "cvt17", "section", "showing", "a", "cytosolic", "vesicle", "containing", "prAPI", "probed", "with", "antibody", "against", "the", "API", "proregion", ".", "(", "C", ")", "A", "cvt17", "section", "showing", "subvacuolar", "vesicles", "containing", "API", "probed", "with", "antibody", "against", "mature", "API", ".", "N", ",", "nucleus", ";", "V", ",", "vacuole", ";", "(", "arrows", ")", "API", "containing", "vesicles", ".", "Bars", ",", "0", ".", "5", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Immuno-EM of cvt17 cells. Yeast strains SEY6210 (parental wild type) and THY32 (cvt17) were grown in YPD and prepared for microscopy as described in Materials and Methods. (A) Wild-type cells probed with antibody against mature API. (B) A cvt17 section showing a cytosolic vesicle containing prAPI probed with antibody against the API proregion. (C) A cvt17 section showing subvacuolar vesicles containing API probed with antibody against mature API. N, nucleus; V, vacuole; (arrows) API containing vesicles. Bars, 0.5 μm."}
{"words": ["Figure", "7Characterization", "of", "API", "-", "containing", "vesicles", ".", "(", "A", ")", "Fractionations", "were", "performed", "as", "in", "Fig", ".", "5", ".", "The", "total", "(", "T", ")", ",", "vacuole", "(", "V", ")", ",", "vacuolar", "vesicle", "(", "VV", ")", ",", "and", "subvacuolar", "vesicle", "(", "SV", ")", "fractions", "are", "shown", ".", "Proteins", "were", "detected", "by", "immunoblotting", "as", "indicated", "in", "the", "figure", ".", "(", "B", ")", "SYPRO", "orange", "staining", "detected", "by", "fluorescent", "scanning", "mode", "on", "a", "Molecular", "Dynamics", "STORM", "phosphorimager", ".", "The", "relative", "mobility", "of", "the", "molecular", "mass", "standards", "are", "indicated", "on", "the", "left", ".", "Polypeptides", "enriched", "in", "the", "subvacuolar", "vesicles", "are", "indicated", "on", "the", "right", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Characterization of API-containing vesicles. (A) Fractionations were performed as in Fig. 5. The total (T), vacuole (V), vacuolar vesicle (VV), and subvacuolar vesicle (SV) fractions are shown. Proteins were detected by immunoblotting as indicated in the figure.(B) SYPRO orange staining detected by fluorescent scanning mode on a Molecular Dynamics STORM phosphorimager. The relative mobility of the molecular mass standards are indicated on the left. Polypeptides enriched in the subvacuolar vesicles are indicated on the right."}
{"words": ["Figure", "1C", "Maximal", "cytochrome", "c", "release", "for", "all", "DX", "/", "REL", "pairs", "with", "≥", "3", "biological", "replicates", ")", ";", "box", "-", "whisker", "plots", "summarize", "data", "(", "box", "25", "%", "-", "75", "%", ";", "belt", "=", "median", ";", "dot", "=", "mean", ";", "whiskers", "=", "minimum", "and", "maximum", "values", ")", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "an", "unpaired", "two", "-", "sided", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "with", "significance", "p", "<", "0", ".", "05", "(", "trend", "p", "<", "0", ".", "10", ")", ".", "Cyto", "c", ",", "cytochrome", "cD", "Bak", "oligomerization", "in", "response", "to", "escalating", "tBid", "concentration", "for", "DX", "/", "REL", "pairs", ".", "Relative", "mitochondrial", "protein", "loading", "per", "lane", "is", "assessed", "by", "densitometry", ",", "showing", "ration", "of", "loading", "control", "in", "REL", "lane", "with", "patient", "-", "matched", "DX", "lane", "at", "same", "tBid", "exposure", "(", "no", "REL", "lane", "is", "underloaded", "compared", "to", "DX", "lane", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1C Maximal cytochrome c release for all DX/REL pairs with ≥3 biological replicates); box-whisker plots summarize data (box 25%-75%; belt=median; dot=mean; whiskers=minimum and maximum values). Statistical analyses were performed using an unpaired two-sided Student's t-test, with significance p<0.05 (trend p<0.10). Cyto c, cytochrome cD Bak oligomerization in response to escalating tBid concentration for DX/REL pairs. Relative mitochondrial protein loading per lane is assessed by densitometry, showing ration of loading control in REL lane with patient-matched DX lane at same tBid exposure (no REL lane is underloaded compared to DX lane)."}
{"words": ["Figure", "2A", "In", "vitro", "viability", "curves", "after", "72hr", "exposure", "to", "mafosfamide", "or", "doxorubicin", ".", "Results", "are", "shown", "for", "three", "DX", "/", "REL", "neuroblastoma", "cell", "line", "pairs", ",", "two", "with", "attenuated", "cytochrome", "c", "release", "(", "CHLA15", "/", "CHLA20", "and", "SKNBE1", "/", "SKNBE2C", ")", "and", "one", "without", "(", "CHLA122", "/", "CHLA136", ")", ".", "Data", "information", ":", "data", "points", "are", "mean", "and", "SD", "from", "triplicate", "wells", ",", "experiments", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "biological", "replicates", "dotted", "-", "line", "represents", "50", "%", "viability", ".", "C", ",", "In", "vitro", "viability", "for", "CHLA15", "(", "DX", ")", "and", "CHLA20", "(", "REL", ")", "following", "ionizing", "radiation", "at", "7", "days", "Data", "information", ":", "data", "points", "are", "mean", "and", "SD", "from", "triplicate", "wells", ",", "experiments", "are", "representative", "of", "at", "least", "three", "biological", "replicates", ",", "dotted", "-", "line", "represents", "50", "%", "viability", ".", "F", "Cytochrome", "c", "release", "from", "mitochondria", "after", "exposure", "to", "tBid", "or", "BimBH3", "peptide", "for", "parental", "NB1643", "and", "SY5Y", "cells", ",", "in", "comparison", "to", "cells", "cultured", "in", "escalating", "concentrations", "of", "crizotinib", "until", "resistant", "(", "NB1643", "-", "ALKR", "and", "SY5Y", "-", "ALKR", ")", ".", "Data", "information", ":", "data", "points", "are", "mean", "of", "duplicate", "wells", "(", "SD", "<", "0", ".", "05", "at", "all", "points", ")", "in", "a", "representative", "experiment", "from", "at", "least", "two", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A In vitro viability curves after 72hr exposure to mafosfamide or doxorubicin. Results are shown for three DX/REL neuroblastoma cell line pairs, two with attenuated cytochrome c release (CHLA15/CHLA20 and SKNBE1/SKNBE2C) and one without (CHLA122/CHLA136). Data information: data points are mean and SD from triplicate wells, experiments are representative of at least three biological replicates dotted-line represents 50% viability.C, In vitro viability for CHLA15 (DX) and CHLA20 (REL) following ionizing radiation at 7 days Data information: data points are mean and SD from triplicate wells, experiments are representative of at least three biological replicates, dotted-line represents 50% viability.F Cytochrome c release from mitochondria after exposure to tBid or BimBH3 peptide for parental NB1643 and SY5Y cells, in comparison to cells cultured in escalating concentrations of crizotinib until resistant (NB1643-ALKR and SY5Y-ALKR). Data information: data points are mean of duplicate wells (SD<0.05 at all points) in a representative experiment from at least two biological replicates."}
{"words": ["Figure", "3A", ",", "B", ",", "C", "Transmission", "electron", "microscopy", "image", "analysis", "was", "used", "to", "quantify", "mitochondrial", "size", ",", "circularity", "and", "roundness", "in", "DX", "/", "REL", "neuroblastoma", "pairs", "(", "mean", "+", "/", "-", "SD", "shown", ")", ".", "Data", "information", ":", ",", "n", "=", "137", "-", "241", "mitochondria", "per", "cell", "line", "statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "a", "two", "-", "tailed", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ",", "with", "significance", "p", "<", "0", ".", "05", "(", "trend", "p", "<", "0", ".", "10", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A, B, C Transmission electron microscopy image analysis was used to quantify mitochondrial size, circularity and roundness in DX/REL neuroblastoma pairs (mean +/- SD shown). Data information: , n=137-241 mitochondria per cell line statistical analyses were performed using a two-tailed Mann-Whitney U test, with significance p<0.05 (trend p<0.10)."}
{"words": ["Figure", "4H", "In", "vitro", "viability", "of", "CHLA15", "-", "ctrl", ",", "CHLA15", "-", "shMFN2", ",", "CHLA15", "-", "shPACS2", ",", "and", "CHLA20", "cells", "following", "72hr", "exposure", "to", "ABT", "-", "737", ";", "dotted", "-", "line", "represents", "50", "%", "viability", ".", "Data", "information", ":", "data", "points", "are", "mean", "and", "SD", "from", "triplicate", "wells", ",", "experiments", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "biological", "replicates", ".", "I", "Mitochondrial", "cytochrome", "c", "release", "in", "response", "to", "tBid", "and", "BimBH3", "peptide", "in", "CHLA15", "-", "Ctrl", ",", "CHLA15", "-", "shMFN2", "and", "CHLA15", "-", "shPACS2", "cells", ".", "Data", "information", ":", ",", "data", "points", "are", "mean", "of", "duplicate", "wells", "(", "SD", "<", "0", ".", "05", "at", "all", "points", ")", "in", "a", "representative", "experiment", "from", "at", "least", "two", "biological"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4H In vitro viability of CHLA15-ctrl, CHLA15-shMFN2, CHLA15-shPACS2, and CHLA20 cells following 72hr exposure to ABT-737; dotted-line represents 50% viability. Data information: data points are mean and SD from triplicate wells, experiments are representative of at least two biological replicates.I Mitochondrial cytochrome c release in response to tBid and BimBH3 peptide in CHLA15-Ctrl, CHLA15-shMFN2 and CHLA15-shPACS2 cells. Data information: , data points are mean of duplicate wells (SD<0.05 at all points) in a representative experiment from at least two biological replicates"}
{"words": ["Figure", "5A", ",", "B", "Cytosolic", "(", "black", "-", "tracing", ")", "and", "mitochondrial", "(", "colored", "-", "tracing", ")", "Ca2", "+", "concentration", "measured", "using", "fluorescent", "reporters", "in", "the", "CHLA15", "(", "n", "=", "29", "cells", ")", "/", "CHLA20", "(", "n", "=", "65", "cells", ")", "and", "SKNBE1", "(", "n", "=", "37", "cells", ")", "/", "SKNBE2C", "(", "n", "=", "52", "cells", ")", "pairs", ".", "ER", "Ca2", "+", "release", "was", "induced", "by", "100μM", "carbachol", ",", "an", "IP3R", "-", "agonist", ";", "time", "added", "indicated", "by", "arrow", ";", "tracings", "are", "mean", "+", "/", "-", "SD", "error", "bars", ".", "Coupling", "time", "(", "time", "between", "achieving", "50", "%", "of", "maximal", "cytosolic", "and", "mitochondrial", "concentrations", ")", "is", "an", "index", "of", "ER", "-", "mitochondrial", "proximity", "and", "transfer", "efficiency", ";", "plotted", "below", ".", "Data", "information", ":", "data", "is", "derived", "from", "at", "least", "3", "separate", "cell", "transfections", "(", "biological", "replicates", ")", ".", "statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "an", "unpaired", "two", "-", "sided", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "with", "significance", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "F", "Cytochrome", "c", "release", "in", "response", "to", "tBid", "and", "BimBH3", "assessed", ".", "Data", "information", ":", "data", "points", "are", "mean", "of", "duplicate", "wells", "(", "SD", "<", "0", ".", "05", "at", "all", "points", ")", "in", "a", "representative", "experiment", "from", "at", "least", "two", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A, B Cytosolic (black-tracing) and mitochondrial (colored-tracing) Ca2+ concentration measured using fluorescent reporters in the CHLA15 (n=29 cells)/CHLA20 (n=65 cells) and SKNBE1 (n=37 cells)/SKNBE2C (n=52 cells) pairs. ER Ca2+ release was induced by 100μM carbachol, an IP3R-agonist; time added indicated by arrow; tracings are mean +/- SD error bars. Coupling time (time between achieving 50% of maximal cytosolic and mitochondrial concentrations) is an index of ER-mitochondrial proximity and transfer efficiency; plotted below. Data information: data is derived from at least 3 separate cell transfections (biological replicates). statistical analyses were performed using an unpaired two-sided Student's t-test, with significance p<0.05.F Cytochrome c release in response to tBid and BimBH3 assessed. Data information: data points are mean of duplicate wells (SD<0.05 at all points) in a representative experiment from at least two biological replicates."}
{"words": ["Figure", "6A", ",", "B", ",", "C", "Concentration", "of", "ceramide", "species", "as", "measured", "by", "LC", "/", "MS", "from", "DX", "and", "REL", "pair", "whole", "cell", "pellets", ".", "Data", "information", ":", "show", "mean", "of", "3", "-", "4", "biological", "replicates", "plotted", ";", "3", "technical", "replicates", "eachD", ",", "E", "Cumulative", "ceramides", "and", "sphingomyelins", "(", "of", "C32", "-", "C36", "chain", "length", ")", "for", "DX", "/", "REL", "pairs", ".", "Data", "information", ":", "show", "mean", "of", "3", "-", "4", "biological", "replicates", "plotted", ";", "3", "technical", "replicates", "each", "error", "bars", "are", "+", "/", "-", "SD", ".", "H", "Summary", "data", "for", "CHLA15", "/", "CHLA20", "and", "SKNBE1", "/", "SKNBE2C", "showing", "relative", "cytochrome", "c", "release", "when", "pre", "-", "incubated", "with", "GW4869", "to", "inhibit", "ceramide", "generation", ",", "compared", "with", "untreated", "cells", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "points", "from", "two", "(", "CHLA15", ")", "or", "three", "(", "SKNBE1", ")", "biological", "replicates", "are", "depicted", "in", "H", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "an", "unpaired", "two", "-", "sided", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "with", "significance", "p", "<", "0", ".", "05", "(", "trend", ",", "p", "<", "0", ".", "10", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A, B, C Concentration of ceramide species as measured by LC/MS from DX and REL pair whole cell pellets. Data information: show mean of 3-4 biological replicates plotted; 3 technical replicates eachD, E Cumulative ceramides and sphingomyelins (of C32-C36 chain length) for DX/REL pairs. Data information: show mean of 3-4 biological replicates plotted; 3 technical replicates each error bars are +/- SD.H Summary data for CHLA15/CHLA20 and SKNBE1/SKNBE2C showing relative cytochrome c release when pre-incubated with GW4869 to inhibit ceramide generation, compared with untreated cells. Data information: All data points from two (CHLA15) or three (SKNBE1) biological replicates are depicted in H. Statistical analyses were performed using an unpaired two-sided Student's t-test, with significance p<0.05 (trend, p<0.10)."}
{"words": ["Figure", "1A", "-", "D", "Mesenteric", "blood", "(", "PECAM1", ",", "red", ")", "and", "lymphatic", "vessels", "(", "LYVE1", ",", "green", ";", "PROX1", ",", "gray", ")", ".", "Asterisks", "indicate", "lymphatic", "valves", ",", "arrow", "indicates", "a", "lymphatic", "vessel", "stub", ",", "and", "arrowhead", "indicates", "an", "isolated", "lymphatic", "vessel", "fragmentE", "-", "H", "Blood", "vessels", "(", "PECAM1", ",", "green", ")", "and", "lymphatic", "vessels", "(", "VEGFR", "-", "3", ",", "red", ")", "in", "the", "small", "intestinal", "wall", ".", "I", ",", "J", "Detection", "of", "chylous", "ascites", "(", "arrows", ")", "in", "the", "VCiΔR26", "mice", "at", "P6", ".", "K", ",", "L", "LYVE1", "staining", "of", "intestinal", "lymphatic", "vessels", "at", "P6", ".", "M", "-", "T", "LYVE1", "staining", "of", "lymphatic", "vessels", "in", "the", "intestinal", "wall", "in", "adult", "mice", ".", "Genotypes", "and", "deletion", "lengths", "are", "indicated", "in", "(", "U", ")", ".", "U", "Quantification", "of", "LYVE1", "areas", "in", "(", "M", "-", "T", ")", ".", "Length", "of", "the", "i", "∆", "Vegfc", "gene", "deletion", "is", "indicated", "in", "months", "(", "mo", ")", ",", "and", "Vegfd", "indicates", "the", "VEGF", "-", "D", "genotype", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "Significant", "differences", "were", "determined", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Bonferroni", "post", "hoc", "analysis", "compared", "to", "WT", "intestine", "represented", "in", "(", "M", ")", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "003", ",", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0008", ",", "♯", "P", "=", "0", ".", "0002", ",", "§", "P", "=", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A-D Mesenteric blood (PECAM1, red) and lymphatic vessels (LYVE1, green; PROX1, gray). Asterisks indicate lymphatic valves, arrow indicates a lymphatic vessel stub, and arrowhead indicates an isolated lymphatic vessel fragmentE-H Blood vessels (PECAM1, green) and lymphatic vessels (VEGFR-3, red) in the small intestinal wall.I, J Detection of chylous ascites (arrows) in the VCiΔR26 mice at P6.K, L LYVE1 staining of intestinal lymphatic vessels at P6.M-T LYVE1 staining of lymphatic vessels in the intestinal wall in adult mice. Genotypes and deletion lengths are indicated in (U).U Quantification of LYVE1 areas in (M-T). Length of the i∆Vegfc gene deletion is indicated in months (mo), and Vegfd indicates the VEGF-D genotype. Data are represented as mean ± SEM. Significant differences were determined using one-way ANOVA and Bonferroni post hoc analysis compared to WT intestine represented in (M). *P = 0.003, **P = 0.001, ***P = 0.0008, ♯P = 0.0002, §P = 0.0001."}
{"words": ["Figure", "2Overview", "of", "the", "small", "intestine", "cross", "section", "stained", "with", "nuclear", "red", "and", "highlighting", "the", "location", "of", "higher", "magnification", "images", "in", "(", "B", "-", "F", ")", ";", "(", "I", ")", "for", "the", "entire", "villus", "and", "(", "II", ")", "for", "the", "villus", "base", ".", "β", "-", "Gal", "staining", "pattern", "of", "the", "villus", "in", "wild", "-", "type", "(", "Ctrl", ")", ",", "Vegfc", "/", "LacZ", "(", "VC", ")", ",", "Vegfr3", "/", "LacZ", "(", "VR", "-", "3", ")", ",", "and", "Vegfr2", "/", "LacZ", "(", "VR", "-", "2", ")", "mice", ".", "Higher", "magnification", "images", "representing", "β", "-", "Gal", "staining", "of", "the", "villus", "base", "in", "Vegfc", "/", "LacZmice", ".", "Data", "information", ":", "Arrows", "indicate", "the", "VEGF", "-", "C", "expression", "in", "arterialSMC", ",", "arrowheads", "indicate", "the", "VEGF", "-", "C", "expression", "in", "SMCfibers", "in", "the", "villus", ",", "and", "asterisks", "highlight", "the", "VEGF", "-", "C", "expression", "in", "circular", "smooth", "muscle", "cell", "layer", "of", "the", "intestinal", "wall", ".", "Scale", "bars", ":", "50", "μm", ",", "except", "(", "C", ")", "inset", "25", "μm", ".", "Vegfc", "/", "LacZβ", "-", "Gal", "staining", "reaction", "with", "smooth", "muscle", "actin", "(", "SMA", ")", "peroxidase", "staining", ".", "Data", "information", ":", "Arrows", "indicate", "the", "VEGF", "-", "C", "expression", "in", "arterialSMC", ",", "arrowheads", "indicate", "the", "VEGF", "-", "C", "expression", "in", "SMCfibers", "in", "the", "villus", ",", "and", "asterisks", "highlight", "the", "VEGF", "-", "C", "expression", "in", "circular", "smooth", "muscle", "cell", "layer", "of", "the", "intestinal", "wall", ".", "Scale", "bars", ":", "50", "μm", ",", "except", "(", "C", ")", "inset", "25", "μm", ".", "Vegfc", "/", "LacZβ", "-", "Gal", "staining", "and", "LYVE1", "peroxidase", "staining", ".", "Data", "information", ":", "Arrows", "indicate", "the", "VEGF", "-", "C", "expression", "in", "arterialSMC", ",", "arrowheads", "indicate", "the", "VEGF", "-", "C", "expression", "in", "SMCfibers", "in", "the", "villus", ",", "and", "asterisks", "highlight", "the", "VEGF", "-", "C", "expression", "in", "circular", "smooth", "muscle", "cell", "layer", "of", "the", "intestinal", "wall", ".", "Scale", "bars", ":", "50", "μm", ",", "except", "(", "C", ")", "inset", "25", "μm", ".", "Surface", "image", "of", "Vegfc", "/", "LacZβ", "-", "Gal", "-", "stained", "intestine", "(", "left", ")", "and", "cross", "section", "counterstaining", "with", "PECAM1", "(", "right", ")", ".", "Data", "information", ":", "Arrows", "indicate", "the", "VEGF", "-", "C", "expression", "in", "arterialSMC", ",", "arrowheads", "indicate", "the", "VEGF", "-", "C", "expression", "in", "SMCfibers", "in", "the", "villus", ",", "and", "asterisks", "highlight", "the", "VEGF", "-", "C", "expression", "in", "circular", "smooth", "muscle", "cell", "layer", "of", "the", "intestinal", "wall", ".", "Scale", "bars", ":", "50", "μm", ",", "except", "(", "C", ")", "inset", "25", "μm", ".", "Immunofluorescence", "staining", "of", "lacteal", "lymphatic", "vessel", "(", "LYVE1", ")", ",", "blood", "capillaries", "(", "PECAM1", ")", ",", "and", "smooth", "muscle", "cells", "(", "SMA", ")", ".", "Data", "information", ":", "Arrows", "indicate", "the", "VEGF", "-", "C", "expression", "in", "arterialSMC", ",", "arrowheads", "indicate", "the", "VEGF", "-", "C", "expression", "in", "SMCfibers", "in", "the", "villus", ",", "and", "asterisks", "highlight", "the", "VEGF", "-", "C", "expression", "in", "circular", "smooth", "muscle", "cell", "layer", "of", "the", "intestinal", "wall", ".", "Scale", "bars", ":", "50", "μm", ",", "except", "(", "C", ")", "inset", "25", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Overview of the small intestine cross section stained with nuclear red and highlighting the location of higher magnification images in (B-F); (I) for the entire villus and (II) for the villus base. β-Gal staining pattern of the villus in wild-type (Ctrl), Vegfc/LacZ (VC), Vegfr3/LacZ (VR-3), and Vegfr2/LacZ (VR-2) mice.Higher magnification images representing β-Gal staining of the villus base in Vegfc/LacZmice.Data information: Arrows indicate the VEGF-C expression in arterialSMC, arrowheads indicate the VEGF-C expression in SMCfibers in the villus, and asterisks highlight the VEGF-C expression in circular smooth muscle cell layer of the intestinal wall. Scale bars: 50 μm, except (C) inset 25 μm.Vegfc/LacZβ-Gal staining reaction with smooth muscle actin (SMA) peroxidase staining.Data information: Arrows indicate the VEGF-C expression in arterialSMC, arrowheads indicate the VEGF-C expression in SMCfibers in the villus, and asterisks highlight the VEGF-C expression in circular smooth muscle cell layer of the intestinal wall. Scale bars: 50 μm, except (C) inset 25 μm.Vegfc/LacZβ-Gal staining and LYVE1 peroxidase staining.Data information: Arrows indicate the VEGF-C expression in arterialSMC, arrowheads indicate the VEGF-C expression in SMCfibers in the villus, and asterisks highlight the VEGF-C expression in circular smooth muscle cell layer of the intestinal wall. Scale bars: 50 μm, except (C) inset 25 μm.Surface image of Vegfc/LacZβ-Gal-stained intestine (left) and cross section counterstaining with PECAM1 (right).Data information: Arrows indicate the VEGF-C expression in arterialSMC, arrowheads indicate the VEGF-C expression in SMCfibers in the villus, and asterisks highlight the VEGF-C expression in circular smooth muscle cell layer of the intestinal wall. Scale bars: 50 μm, except (C) inset 25 μm.Immunofluorescence staining of lacteal lymphatic vessel (LYVE1), blood capillaries (PECAM1), and smooth muscle cells (SMA).Data information: Arrows indicate the VEGF-C expression in arterialSMC, arrowheads indicate the VEGF-C expression in SMCfibers in the villus, and asterisks highlight the VEGF-C expression in circular smooth muscle cell layer of the intestinal wall. Scale bars: 50 μm, except (C) inset 25 μm."}
{"words": ["Figure", "3Two", "-", "month", "-", "old", "mice", "received", "tamoxifen", "and", "were", "fed", "on", "high", "-", "fat", "diet", "(", "HFD", ")", "for", "seven", "weeks", "before", "analysis", ".", "Body", "weight", "change", "during", "seven", "weeks", "of", "HFD", ",", "expressed", "as", "average", "fold", "change", "in", "comparison", "with", "the", "starting", "weight", ".", "n", "=", "16", ",", "WT", ";", "n", "=", "6", ",", "Vegfd", "−", "/", "−", ";", "n", "=", "16", ",", "VCiΔR26", ";", "n", "=", "5", ",", "Vegfd", "−", "/", "−", ";", "VCiΔR26", ".", "Body", "weight", "comparisons", "at", "seven", "weeks", "of", "HFD", ".", "Significant", "differences", "were", "determined", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Bonferroni", "post", "hoc", "analysis", "compared", "to", "WT", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "004", ";", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "003", ".", "n", "=", "16", ",", "WT", ";", "n", "=", "6", ",", "Vegfd", "−", "/", "−", ";", "n", "=", "16", ",", "VCiΔR26", ";", "n", "=", "5", ",", "Vegfd", "−", "/", "−", ";", "VCiΔR26", ".", "Two", "-", "month", "-", "old", "mice", "received", "tamoxifen", "and", "were", "fed", "on", "high", "-", "fat", "diet", "(", "HFD", ")", "for", "seven", "weeks", "before", "analysis", ".", "Glucose", "tolerance", "test", "(", "GTT", ")", "after", "six", "weeks", "of", "HFD", ".", "Significant", "differences", "were", "determined", "using", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "014", ";", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "041", ".", "n", "=", "5", ",", "WT", ";", "n", "=", "6", ",", "VCiΔR26", ".", "Two", "-", "month", "-", "old", "mice", "received", "tamoxifen", "and", "were", "fed", "on", "high", "-", "fat", "diet", "(", "HFD", ")", "for", "seven", "weeks", "before", "analysis", ".", "Total", "fatweight", ",", "fat", "percentage", "from", "body", "composition", "measurements", "after", "six", "weeks", "of", "HFD", ",", "and", "weights", "of", "visceral", "fat", "(", "VF", ")", "and", "subcutaneous", "fat", "(", "SF", ")", "at", "the", "time", "of", "necropsy", ".", "Significant", "differences", "were", "determined", "using", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "006", ";", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "001", ";", "#", "P", "=", "0", ".", "008", ";", "§", "P", "=", "0", ".", "006", ".", "n", "=", "4", "in", "each", "group", ".", "Two", "-", "month", "-", "old", "mice", "received", "tamoxifen", "and", "were", "fed", "on", "high", "-", "fat", "diet", "(", "HFD", ")", "for", "seven", "weeks", "before", "analysis", ".", "Food", "consumption", "during", "the", "fifth", "week", "of", "HFD", ".", "n", "=", "9", ",", "WT", ";", "n", "=", "10", ",", "VCiΔR26", ".", "Two", "-", "month", "-", "old", "mice", "received", "tamoxifen", "and", "were", "fed", "on", "high", "-", "fat", "diet", "(", "HFD", ")", "for", "seven", "weeks", "before", "analysis", ".", "Whole", "-", "mount", "immunofluorescence", "staining", "of", "blood", "(", "PECAM1", ",", "red", ")", "and", "lymphatic", "vessels", "(", "LYVE1", ",", "green", ")", "in", "intestinal", "villi", "and", "intestinal", "wall", ".", "Quantification", "of", "the", "lacteal", "and", "villus", "length", "(", "solid", "and", "striped", "color", "bars", ",", "respectively", ")", "and", "the", "intestinal", "wallLYVE1", "+", "area", "percentage", "from", "images", "represented", "in", "(", "F", ")", ".", "Significant", "differences", "were", "determined", "using", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0002", ";", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "00007", ".", "n", "=", "5", ",", "WT", ";", "n", "=", "6", ",", "VCiΔR26", ".", "Two", "-", "month", "-", "old", "mice", "received", "tamoxifen", "and", "were", "fed", "on", "high", "-", "fat", "diet", "(", "HFD", ")", "for", "seven", "weeks", "before", "analysis", ".", "Free", "fatty", "acid", "(", "FFA", ")", "and", "cholesterol", "measurements", "from", "the", "feces", "after", "six", "weeks", "of", "HFD", ".", "Significant", "differences", "were", "determined", "using", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "007", ".", "n", "=", "5", ",", "WT", ";", "n", "=", "6", ",", "VCiΔR26", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Two-month-old mice received tamoxifen and were fed on high-fat diet (HFD) for seven weeks before analysis.Body weight change during seven weeks of HFD, expressed as average fold change in comparison with the starting weight. n = 16, WT; n = 6, Vegfd−/−; n = 16, VCiΔR26; n = 5, Vegfd−/−; VCiΔR26.Body weight comparisons at seven weeks of HFD. Significant differences were determined using one-way ANOVA and Bonferroni post hoc analysis compared to WT. *P = 0.004; **P = 0.003. n = 16, WT; n = 6, Vegfd−/−; n = 16, VCiΔR26; n = 5, Vegfd−/−; VCiΔR26.Two-month-old mice received tamoxifen and were fed on high-fat diet (HFD) for seven weeks before analysis. Glucose tolerance test (GTT) after six weeks of HFD. Significant differences were determined using unpaired two-tailed t-test. *P = 0.014; **P = 0.041. n = 5, WT; n = 6, VCiΔR26.Two-month-old mice received tamoxifen and were fed on high-fat diet (HFD) for seven weeks before analysis. Total fatweight, fat percentage from body composition measurements after six weeks of HFD, and weights of visceral fat (VF) and subcutaneous fat (SF) at the time of necropsy. Significant differences were determined using unpaired two-tailed t-test. *P = 0.006; **P = 0.001; #P = 0.008; §P = 0.006. n = 4 in each group.Two-month-old mice received tamoxifen and were fed on high-fat diet (HFD) for seven weeks before analysis. Food consumption during the fifth week of HFD. n = 9, WT; n = 10, VCiΔR26.Two-month-old mice received tamoxifen and were fed on high-fat diet (HFD) for seven weeks before analysis.Whole-mount immunofluorescence staining of blood (PECAM1, red) and lymphatic vessels (LYVE1, green) in intestinal villi and intestinal wall.Quantification of the lacteal and villus length (solid and striped color bars, respectively) and the intestinal wallLYVE1+ area percentage from images represented in (F). Significant differences were determined using unpaired two-tailed t-test. *P = 0.0002; **P = 0.00007. n = 5, WT; n = 6, VCiΔR26.Two-month-old mice received tamoxifen and were fed on high-fat diet (HFD) for seven weeks before analysis. Free fatty acid (FFA) and cholesterol measurements from the feces after six weeks of HFD. Significant differences were determined using unpaired two-tailed t-test. *P = 0.001; **P = 0.007. n = 5, WT; n = 6, VCiΔR26."}
{"words": ["Figure", "1D", ",", "RT", "-", "qPCR", "time", "courses", ".", "Promoters", "of", "the", "indicated", "oscillating", "genes", "were", "used", "to", "drive", "expression", "of", "a", "destabilized", ",", "nuclear", "GFP", "protein", "from", "a", "single", "copy", "integrated", "transgene", ";", "gfp", "mRNA", "and", "the", "endogenous", "transcript", "driven", "by", "the", "same", "promoter", "were", "quantified", "from", "the", "same", "RNA", "samples", ".", "Relative", "expression", "was", "calculated", "as", "-", "dCT", "=", "-", "(", "target", "CT", "values", "-", "actin", "CT", "values", ")", "and", "then", "mean", "normalized", "for", "each", "trace", "individually", ".", "Peak", "phases", "(", "ϕPeak", ")", "and", "amplitudes", "(", "A", ")", "for", "the", "endogenous", "transcripts", "are", "from", "(", "Meeuse", "et", "al", ".", ",", "2020", ")", ".", "qPCR", "was", "performed", "in", "technical", "replicate", ",", "shown", "are", "averages", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1D, RT-qPCR time courses. Promoters of the indicated oscillating genes were used to drive expression of a destabilized, nuclear GFP protein from a single copy integrated transgene; gfp mRNA and the endogenous transcript driven by the same promoter were quantified from the same RNA samples. Relative expression was calculated as -dCT = - (target CT values - actin CT values) and then mean normalized for each trace individually. Peak phases (ϕPeak) and amplitudes (A) for the endogenous transcripts are from (Meeuse et al., 2020). qPCR was performed in technical replicate, shown are averages."}
{"words": ["Figure", "2B", ",", "C", "Heatmap", "showing", "trend", "-", "corrected", "luminescence", "as", "in", "(", "A", ")", ",", "for", "indicated", "RNAi", "conditions", "causing", "altered", "numbers", "(", "B", ")", "or", "durations", "(", "C", ")", "of", "molts", ",", "respectively", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B, C Heatmap showing trend-corrected luminescence as in (A), for indicated RNAi conditions causing altered numbers (B) or durations (C) of molts, respectively."}
{"words": ["Figure", "3C", ",", "Image", "sequence", "of", "an", "L1", "synchronized", "grh", "-", "1", ":", ":", "aid", "animal", "(", "HW2418", ")", "grown", "at", "20", "°", "C", "on", "a", "250", "μM", "auxin", "-", "containing", "plates", ".", "A", "lethargic", "animal", "was", "transferred", "to", "an", "agar", "-", "pad", "containing", "microscopy", "slide", "and", "images", "were", "collected", "every", "1", "sec", ",", "using", "DIC", ",", "100x", "magnification", ".", "Selected", "images", "of", "Movie", "EV1", "are", "shown", ".", "Time", "stamp", "(", "min", ":", "sec", ")", "is", "indicated", ".", "Arrows", "indicate", "phenotypic", "features", ":", "loosening", "of", "the", "cuticle", "(", "0", ":", "00", ")", ";", "back", "-", "and", "-", "forth", "movements", "(", "0", ":", "05", ")", ";", "inflation", "of", "the", "cuticle", "(", "2", ":", "46", ")", ";", "vesicles", "underneath", "loosened", "cuticle", "(", "6", ":", "11", ")", ";", "rupturing", "of", "the", "cuticle", "(", "6", ":", "20", ",", "6", ":", "40", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3C, Image sequence of an L1 synchronized grh-1::aid animal (HW2418) grown at 20°C on a 250 μM auxin-containing plates. A lethargic animal was transferred to an agar-pad containing microscopy slide and images were collected every 1 sec, using DIC, 100x magnification. Selected images of Movie EV1 are shown. Time stamp (min:sec) is indicated. Arrows indicate phenotypic features: loosening of the cuticle (0:00); back-and-forth movements (0:05); inflation of the cuticle (2:46); vesicles underneath loosened cuticle (6:11); rupturing of the cuticle (6:20, 6:40)."}
{"words": ["Figure", "4A", ",", "Quantification", "of", "the", "percentage", "of", "grh", "-", "1", ":", ":", "aid", "animals", "constitutively", "expressing", "luciferase", "(", "HW2434", ")", "that", "enter", "each", "of", "four", "molts", "molt", "upon", "hatching", "into", "increasing", "concentrations", "of", "auxin", "as", "indicated", ".", "B", ",", "Boxplot", "showing", "the", "duration", "of", "M1", ",", "M2", "and", "M3", "of", "animals", "treated", "with", "indicated", "concentrations", "of", "auxin", ".", "Animals", "that", "failed", "to", "develop", "beyond", "M3", "in", "(", "A", ")", "were", "excluded", ".", "The", "horizontal", "line", "represents", "the", "median", ",", "hinges", "extend", "to", "first", "and", "third", "quartiles", ",", "and", "the", "whiskers", "extend", "up", "to", "the", "most", "extreme", "value", "within", "1", ".", "5", "*", "IQR", "(", "interquartile", "range", ")", "of", "the", "median", ".", "Significant", "differences", "relative", "to", "0", "nM", "auxin", "are", "indicated", ".", "P", "-", "values", "were", "determined", "by", "a", "non", "-", "parametric", "Wilcoxon", "rank", "sum", "test", "that", "does", "not", "assume", "normal", "distribution", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A, Quantification of the percentage of grh-1::aid animals constitutively expressing luciferase (HW2434) that enter each of four molts molt upon hatching into increasing concentrations of auxin as indicated.B, Boxplot showing the duration of M1, M2 and M3 of animals treated with indicated concentrations of auxin. Animals that failed to develop beyond M3 in (A) were excluded. The horizontal line represents the median, hinges extend to first and third quartiles, and the whiskers extend up to the most extreme value within 1.5*IQR (interquartile range) of the median. Significant differences relative to 0 nM auxin are indicated. P-values were determined by a non-parametric Wilcoxon rank sum test that does not assume normal distribution."}
{"words": ["Figure", "5A", "-", "D", ",", "Heatmaps", "showing", "trend", "-", "corrected", "luminescence", "(", "Lum", ",", "arbitrary", "units", ")", "of", "grh", "-", "1", ":", ":", "aid", "animals", "constitutively", "expressing", "luciferase", "(", "HW2434", ")", ".", "T", "=", "0h", "corresponds", "to", "time", "of", "plating", "embryos", ",", "which", "subsequently", "hatch", "at", "different", "times", ".", "Arrow", "indicates", "time", "point", "when", "250", "μM", "auxin", "was", "added", ",", "i", ".", "e", ".", "prior", "to", "the", "first", "molt", "(", "A", ";", "M1", ")", ",", "M2", "(", "B", ")", ",", "M3", "(", "C", ")", "or", "M4", "(", "D", ")", "larval", "stage", ".", "Note", "that", "for", "technical", "convenience", "in", "(", "A", ")", ",", "auxin", "was", "provided", "at", "time", "of", "plating", ".", "Animals", "are", "sorted", "by", "entry", "into", "M1", "(", "A", ")", ",", "M2", "(", "B", ")", ",", "M3", "(", "C", ")", ",", "M4", "(", "D", ")", ",", "respectively", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A-D, Heatmaps showing trend-corrected luminescence (Lum, arbitrary units) of grh-1::aid animals constitutively expressing luciferase (HW2434). T = 0h corresponds to time of plating embryos, which subsequently hatch at different times. Arrow indicates time point when 250 μM auxin was added, i.e. prior to the first molt (A; M1), M2 (B), M3 (C) or M4 (D) larval stage. Note that for technical convenience in (A), auxin was provided at time of plating. Animals are sorted by entry into M1 (A), M2 (B), M3 (C), M4 (D), respectively."}
{"words": ["Figure", "6Time", "-", "lapse", "imaging", "of", "grh", "-", "1", ":", ":", "gfp", ":", ":", "3xflag", "animals", "producing", "endogenously", "GFP", "-", "tagged", "GRH", "-", "1", "protein", ".", "Average", "+", "/", "-", "95", "%", "confidence", "interval", "(", "cyan", "shading", ")", "are", "shown", ";", "gray", "boxes", "indicate", "average", "time", "of", "molts", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Time-lapse imaging of grh-1::gfp::3xflag animals producing endogenously GFP-tagged GRH-1 protein. Average +/- 95% confidence interval (cyan shading) are shown; gray boxes indicate average time of molts."}
{"words": ["Figure", "7D", ",", "Western", "blot", "revealing", "rapid", "GRH", "-", "1", "depletion", "in", "the", "grh", "-", "1", ":", ":", "aid", "strain", "(", "HW2434", ")", "upon", "addition", "of", "250", "µM", "auxin", ".", "A", "synchronized", "culture", "of", "animals", "was", "grown", "in", "liquid", "at", "20", "°", "C", ".", "After", "21", "h", "(", "denoted", "t", "=", "0", "h", "in", "the", "figure", ")", ",", "the", "culture", "was", "split", "in", "two", "and", "either", "auxin", "or", "vehicle", "were", "added", "as", "indicated", ".", "Cultures", "were", "sampled", "hourly", "and", "protein", "lysates", "probed", "by", "Western", "blotting", "using", "anti", "-", "FLAG", "and", "anti", "-", "actin", "antibodies", "as", "indicated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7D, Western blot revealing rapid GRH-1 depletion in the grh-1::aid strain (HW2434) upon addition of 250 µM auxin. A synchronized culture of animals was grown in liquid at 20°C. After 21 h (denoted t=0 h in the figure), the culture was split in two and either auxin or vehicle were added as indicated. Cultures were sampled hourly and protein lysates probed by Western blotting using anti-FLAG and anti-actin antibodies as indicated."}
{"words": ["Figure", "8A", ",", "Scatter", "plot", "of", "GRH", "-", "1", ":", ":", "GFP", ":", ":", "3xFLAG", "ChIP", "-", "seq", "peak", "enrichments", "across", "two", "biological", "replicates", ",", "using", "an", "anti", "-", "GFP", "antibody", "to", "immunoprecipitate", "the", "endogenously", "tagged", "protein", "from", "L2", "stage", "larval", "lysates", ".", "Peaks", "assigned", "to", "genes", "encoding", "rhythmically", "expressed", "transcription", "factors", "are", "plotted", "in", "red", ",", "all", "others", "in", "blue", ".", "Peaks", "assigned", "to", "candidate", "core", "clock", "genes", "identified", "in", "this", "study", "are", "labeled", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8A, Scatter plot of GRH-1::GFP::3xFLAG ChIP-seq peak enrichments across two biological replicates, using an anti-GFP antibody to immunoprecipitate the endogenously tagged protein from L2 stage larval lysates. Peaks assigned to genes encoding rhythmically expressed transcription factors are plotted in red, all others in blue. Peaks assigned to candidate core clock genes identified in this study are labeled."}
{"words": ["f1Dose", "-", "dependent", "increase", "of", "C", ".", "albicans", "(", "SC5314", ")", "aggregation", "after", "4", "-", "h", "exposure", "(", "a", ")", "and", "filamentation", "after", "24", "-", "h", "exposure", "(", "b", ")", "to", "different", "concentrations", "of", "IL", "-", "17A", "in", "RPMI", "-", "1640", "liquid", "medium", ".", "Cells", "aliquots", "were", "imaged", "by", "microscopy", "and", "magnified", "in", "the", "insets", ".", "Also", "note", "the", "increased", "turbidity", "of", "cell", "suspension", "at", "24", "h", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "μm", ".", "(", "c", ")", "Percentages", "of", "germination", "of", "C", ".", "albicans", "untreated", "(", "vehicle", "-", "treated", ",", "open", "circle", ")", "or", "treated", "with", "IL", "-", "17A", "at", "1", "(", "black", "triangle", ")", "or", "10", "ng", "ml", "−", "1", "(", "black", "square", ")", "for", "4", "or", "24", "h", ".", "Data", "are", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "P", "0", ".", "05", ",", "IL", "-", "17A", "-", "treated", "versus", "vehicle", "-", "treated", "cells", ",", "at", "4", "h", ";", "P", "0", ".", "01", "(", "1", "ng", ")", "and", "P", "0", ".", "001", "(", "10", "ng", ")", "at", "24", "h", "(", "one", "-", "way", "analysis", "of", "variance", "Bonferroni", "post", "-", "test", ")", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "d", ",", "e", ")", "IL", "-", "17A", "promotes", "biofilm", "formation", ".", "SEM", "images", "of", "C", ".", "albicans", "SC5314", "untreated", "(", "d", ")", "or", "exposed", "to", "10", "ng", "ml", "−", "1", "IL", "-", "17A", "(", "e", ")", "for", "4", "h", "and", "subsequently", "cultured", "onto", "plastic", "discs", "for", "24", "h", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "(", "f", ")", "IL", "-", "17A", "increases", "resistance", "to", "nitrogen", "starvation", ".", "Cells", "were", "first", "grown", "in", "YPD", "medium", "overnight", "and", "then", "switched", "to", "nitrogen", "-", "free", "SLAD", "medium", "in", "the", "presence", "of", "10", "ng", "ml", "−", "1", "IL", "-", "17A", ".", "Viability", ",", "expressed", "as", "a", "percentage", "of", "colony", "-", "forming", "units", "at", "zero", "time", ",", "was", "measured", "over", "a", "15", "-", "day", "period", ".", "Cells", "were", "exposed", "to", "0", ".", "1", "(", "black", "circle", ")", ",", "1", "(", "black", "triangle", ")", "or", "10", "ng", "ml", "−", "1", "(", "black", "square", ")", "IL", "-", "17A", "or", "drug", "vehicle", "(", "open", "circle", ")", "at", "the", "beginning", "of", "the", "cultures", "or", ",", "in", "the", "case", "of", "1", "ng", "ml", "−", "1", "(", "open", "triangle", ")", ",", "also", "added", "every", "two", "other", "days", ".", "Data", "are", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "P", "-", "values", "ranged", "from", "0", ".", "05", "to", "0", ".", "001", "for", "all", "samples", "treated", "with", "10", "ng", "IL", "-", "17A", ";", "P0", ".", "05", ",", "on", "days", "3", "and", "5", "for", "samples", "treated", "1", "ng", "IL", "-", "17A", "every", "two", "other", "days", "(", "one", "-", "way", "analysis", "of", "variance", "Bonferroni", "post", "-", "test", ")", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "g", ",", "l", ")", "C", ".", "albicans", "cells", "are", "metabolically", "active", ".", "Untreated", "(", "g", "-", "i", ")", "or", "IL", "-", "17A", "-", "treated", "(", "10", "ng", "ml", "−", "1", "in", "RPMI", "-", "1640", "liquid", "media", "for", "24", "h", ")", "(", "j", "-", "l", ")", "cells", "were", "red", "after", "staining", "with", "FUN", "-", "1", "(", "g", ",", "j", ")", ",", "green", "with", "Con", "A", "(", "h", ",", "k", ")", "and", "yellow", "in", "the", "merged", "images", "(", "i", ",", "l", ")", ".", "Metabolically", "active", "cells", "are", "shown", "in", "red", ",", "and", "cell", "wall", "polysaccharides", "are", "shown", "in", "green", ".", "Scale", "bars", ",", "5", "μm", ".", "Images", "from", "one", "representative", "experiment", "out", "of", "two", "are", "shown", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f1Dose-dependent increase of C. albicans (SC5314) aggregation after 4-h exposure (a) and filamentation after 24-h exposure (b) to different concentrations of IL-17A in RPMI-1640 liquid medium. Cells aliquots were imaged by microscopy and magnified in the insets. Also note the increased turbidity of cell suspension at 24 h. Scale bars, 100 μm.(c) Percentages of germination of C. albicans untreated (vehicle-treated, open circle) or treated with IL-17A at 1 (black triangle) or 10 ng ml−1 (black square) for 4 or 24 h. Data are mean±s.d. P 0.05, IL-17A-treated versus vehicle-treated cells, at 4 h; P 0.01 (1 ng) and P 0.001 (10 ng) at 24 h (one-way analysis of variance Bonferroni post-test) (n=3).(d,e) IL-17A promotes biofilm formation. SEM images of C. albicans SC5314 untreated (d) or exposed to 10 ng ml−1 IL-17A (e) for 4 h and subsequently cultured onto plastic discs for 24 h. Scale bars, 10 μm.(f) IL-17A increases resistance to nitrogen starvation. Cells were first grown in YPD medium overnight and then switched to nitrogen-free SLAD medium in the presence of 10 ng ml−1 IL-17A. Viability, expressed as a percentage of colony-forming units at zero time, was measured over a 15-day period. Cells were exposed to 0.1 (black circle), 1 (black triangle) or 10 ng ml−1 (black square) IL-17A or drug vehicle (open circle) at the beginning of the cultures or, in the case of 1 ng ml−1 (open triangle), also added every two other days. Data are mean±s.d. P-values ranged from 0.05 to 0.001 for all samples treated with 10 ng IL-17A; P0.05, on days 3 and 5 for samples treated 1 ng IL-17A every two other days (one-way analysis of variance Bonferroni post-test) (n=3).(g,l) C. albicans cells are metabolically active. Untreated (g-i) or IL-17A-treated (10 ng ml−1 in RPMI-1640 liquid media for 24 h) (j-l) cells were red after staining with FUN-1 (g,j), green with Con A (h,k) and yellow in the merged images (i,l). Metabolically active cells are shown in red, and cell wall polysaccharides are shown in green. Scale bars, 5 μm. Images from one representative experiment out of two are shown."}
{"words": ["f2", "(", "g", ",", "h", ")", "TOR", "inhibition", "in", "cells", "treated", "with", "10", "ng", "ml", "−", "1", "IL", "-", "17A", ",", "15", "nM", "rapamycin", "or", "vehicle", "(", "none", ")", "by", "western", "blotting", "after", "4", "-", "h", "(", "g", ")", "or", "24", "-", "h", "(", "h", ")", "exposure", ".", "i", "-", "n", ")", "Immunofluorescence", "of", "ATG8", "in", "untreated", "(", "i", "-", "k", ")", "or", "IL", "-", "17A", "-", "treated", "(", "10", "ng", "ml", "−", "1", "for", "4", "h", ")", "(", "l", "-", "n", ")", "cells", ".", "Cells", "were", "red", "after", "TRITC", "-", "ATG8", "staining", "(", "i", ",", "l", ")", ",", "green", "after", "ConA", "staining", "(", "j", ",", "m", ")", ",", "merged", "images", "(", "k", ",", "n", ")", ".", "Mean", "values", "(", "%", "ATG8", "+", "cells", "(", "merge", ")", ";", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ")", ":", "ATG8", "/", "none", ",", "8", ".", "2", "±", "1", ".", "6", ";", "ATG8", "/", "IL", "-", "17A", ",", "58", ".", "0", "±", "11", ".", "3", "(", "P", "=", "0", ".", "002", ")", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "(", "o", "-", "r", ")", "Monodansilcadaverine", "(", "MDC", ")", "labelling", "performed", "on", "cells", "unexposed", "(", "o", ")", "or", "exposed", "to", "1", "(", "p", ")", "or", "10", "ng", "ml", "−", "1", "(", "q", ")", "IL", "-", "17A", "for", "4", "h", ".", "Cells", "were", "magnified", "in", "the", "inset", "(", "r", ")", ".", "Representative", "results", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "The", "mean", "values", "(", "%", "hyphal", "cells", "with", "MDC", "-", "stained", "organelles", "(", "merge", ")", ";", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ")", "were", "as", "follows", ":", "none", ",", "9", ".", "5", "±", "3", ".", "2", ";", "1", "ng", "ml", "−", "1", "IL", "-", "17A", ",", "14", ".", "0", "±", "4", ".", "7", ";", "10", "ng", "ml", "−", "1", "IL", "-", "17A", ",", "56", ".", "2", "±", "18", ".", "71", "(", "P", "=", "0", ".", "004", ",", "IL", "-", "17A", "10", "ng", "ml", "−", "1", "versus", "none", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "(", "s", ",", "t", ")", "Quantitative", "real", "-", "time", "PCR", "of", "orfs", ".", "19", ".", "4325", ",", "19", ".", "130", ",", "RIC1", "on", "cDNA", "from", "Candida", "SC5314", "(", "s", ")", "or", "the", "TOR1", "-", "1", "/", "TOR1", "mutant", "(", "t", ")", "strains", "exposed", "to", "vehicle", "(", "open", "column", ")", ",", "10", "ng", "ml", "−", "1", "IL", "-", "17A", "(", "black", "column", ")", "or", "15", "nM", "rapamycin", "(", "grey", "column", ")", "for", "4", "h", ".", "The", "actual", "P", "-", "values", "are", "indicated", "(", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ")", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "u", ",", "v", ")", "Intracellular", "(", "u", ")", "or", "extracellular", "(", "v", ")", "cAMP", "levels", ",", "vehicle", "(", "open", "circle", ")", ",", "10", "ng", "ml", "−", "1", "IL", "-", "17A", "(", "black", "square", ")", "or", "rapamycin", "(", "grey", "square", ")", ".", "P0", ".", "05", ",", "IL", "-", "17A", "-", "treated", "versus", "untreated", "at", "1", "h", "and", "P0", ".", "01", ",", "IL", "-", "17A", "-", "treated", "versus", "untreated", "at", "24", "h", "(", "u", ")", ",", "and", "P0", ".", "05", ",", "rapamycin", "-", "treated", "versus", "untreated", "at", "6", "h", "(", "v", ")", "(", "one", "-", "way", "analysis", "of", "variance", "Bonferroni", "post", "-", "test", ")", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "w", ")", "orf", ".", "19", ".", "5258", "expression", "after", "24", "-", "h", "Candida", "SC5314", "exposure", "as", "in", "(", "n", ",", "o", ")", ".", "Data", "are", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "The", "actual", "P", "-", "values", "are", "indicated", "(", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f2(g,h) TOR inhibition in cells treated with 10 ng ml−1 IL-17A, 15 nM rapamycin or vehicle (none) by western blotting after 4-h (g) or 24-h (h) exposure.i-n) Immunofluorescence of ATG8 in untreated (i-k) or IL-17A-treated (10 ng ml−1 for 4 h) (l-n) cells. Cells were red after TRITC-ATG8 staining (i,l), green after ConA staining (j,m), merged images (k,n). Mean values (% ATG8+ cells (merge); mean±s.d.): ATG8/none, 8.2±1.6; ATG8/IL-17A, 58.0±11.3 (P=0.002) (n=3). Scale bars, 10 μm.(o-r) Monodansilcadaverine (MDC) labelling performed on cells unexposed (o) or exposed to 1 (p) or 10 ng ml−1 (q) IL-17A for 4 h. Cells were magnified in the inset (r). Representative results from three independent experiments. The mean values (% hyphal cells with MDC-stained organelles (merge); mean±s.d.) were as follows: none, 9.5±3.2; 1 ng ml−1 IL-17A, 14.0±4.7; 10 ng ml−1 IL-17A, 56.2±18.71 (P=0.004, IL-17A 10 ng ml−1 versus none). Scale bars, 10 μm.(s,t) Quantitative real-time PCR of orfs. 19.4325, 19.130, RIC1 on cDNA from Candida SC5314 (s) or the TOR1-1/TOR1 mutant (t) strains exposed to vehicle (open column), 10 ng ml−1 IL-17A (black column) or 15 nM rapamycin (grey column) for 4 h. The actual P-values are indicated (two-tailed t-test) (n=3).(u,v) Intracellular (u) or extracellular (v) cAMP levels, vehicle (open circle), 10 ng ml−1 IL-17A (black square) or rapamycin (grey square). P0.05, IL-17A-treated versus untreated at 1 h and P0.01, IL-17A-treated versus untreated at 24 h (u), and P0.05, rapamycin-treated versus untreated at 6 h (v) (one-way analysis of variance Bonferroni post-test) (n=3).(w) orf. 19.5258 expression after 24-h Candida SC5314 exposure as in (n,o). Data are mean±s.d. (n=3). The actual P-values are indicated (two-tailed t-test)."}
{"words": ["f3", "(", "a", "-", "g", ")", "GFP", "C", ".", "albicans", "cells", "were", "untreated", "(", "a", "-", "c", ")", "or", "treated", "(", "d", "-", "g", ")", "for", "4", "h", "with", "10", "ng", "ml", "−", "1", "IL", "-", "17A", "followed", "by", "anti", "-", "IL17A", "-", "PE", "and", "examined", "by", "fluorescence", "microscopy", "(", "scale", "bars", ",", "5", "μm", ")", ".", "Cells", "were", "green", "in", "(", "a", ",", "d", ")", ",", "red", "upon", "staining", "with", "anti", "-", "IL17A", "-", "PE", "(", "b", ",", "e", ")", "and", "double", "stained", "in", "the", "merged", "images", "(", "c", ",", "f", ")", ".", "Note", "the", "binding", "of", "IL", "-", "17A", "to", "hyphal", "tips", "(", "arrows", "and", "magnified", "in", "g", ")", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Images", "are", "from", "one", "representative", "experiment", "out", "of", "three", ".", "(", "h", ",", "i", ")", "Binding", "of", "murine", "(", "h", ")", "or", "human", "(", "i", ")", "IL", "-", "17A", "to", "clinical", "isolates", "of", "C", ".", "albicans", "from", "human", "urine", "(", "yellow", "triangle", ")", ",", "blood", "(", "green", "triangle", ")", ",", "vagina", "(", "red", "triangle", ")", "and", "gut", "(", "blue", "triangle", ")", ".", "IL", "-", "17A", "was", "added", "to", "paraformaldehyde", "-", "fixed", "fungal", "cells", "followed", "by", "biotinylated", "secondary", "anti", "-", "IL", "-", "17A", "antibody", "and", "streptavidin", "-", "horse", "radish", "peroxidase", ".", "The", "optical", "density", "at", "450", "nm", "was", "corrected", "by", "subtracting", "the", "optical", "density", "at", "570", "nm", "(", "normalized", "OD", ")", "in", "the", "enzyme", "-", "linked", "immunosorbent", "assay", ".", "P", "-", "values", "of", "samples", "exposed", "to", "0", ".", "1", "and", "1", "ng", "IL", "-", "17A", "ranged", "from", "0", ".", "05", "to", "0", ".", "001", "(", "one", "-", "way", "analysis", "of", "variance", "Bonferroni", "post", "-", "test", ")", ".", "All", "samples", "exposed", "to", "10", "ng", "IL", "-", "17A", "displayed", "significant", "(", "P0", ".", "001", ",", "one", "-", "way", "analysis", "of", "variance", "Bonferroni", "post", "-", "test", ")", "OD", "values", "relative", "to", "unexposed", "samples", "(", "0", ")", ".", "(", "j", "-", "o", ")", "Direct", "visualization", "of", "IL", "-", "17A", "on", "Candida", "freshly", "harvested", "from", "human", "vagina", ".", "Same", "experiment", "as", "in", "(", "a", "-", "g", ")", "on", "cells", "previously", "stained", "with", "Con", "A", "(", "j", ",", "m", ",", "green", ")", "and", "incubated", "with", "PE", "-", "anti", "-", "human", "IL", "-", "17A", "(", "k", ",", "n", ",", "red", ")", "and", "double", "stained", "in", "the", "merged", "images", "(", "l", ",", "o", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "Shown", "is", "one", "representative", "experiment", "out", "of", "three", ".", "(", "p", "-", "r", ")", "Cytospins", "of", "vaginal", "fluids", "from", "IL", "-", "17F", "-", "deficient", "(", "p", ")", ",", "IL", "-", "17A", "-", "deficient", "(", "q", ")", "and", "C57BL", "/", "6", "(", "r", ")", "mice", "intravaginally", "infected", "two", "days", "before", "with", "C", ".", "albicans", "SC5314", "blastospores", ".", "Note", "the", "presence", "of", "hyphae", "in", "the", "vagina", "of", "IL", "-", "17F", "-", "deficient", "mice", "after", "May", "-", "Grünwald", "-", "Giemsa", "staining", "(", "scale", "bars", ",", "20", "μm", ")", ".", "Shown", "is", "one", "representative", "experiment", "out", "of", "three", ".", "(", "s", ")", "Binding", "of", "IL", "-", "17A", "to", "clinical", "isolates", "of", "C", ".", "krusei", "(", "red", "square", ")", ",", "C", ".", "glabrata", "(", "green", "square", ")", "and", "S", ".", "cerevisiae", "(", "yellow", "square", ")", "done", "as", "in", "(", "h", ",", "i", ")", ".", "IL", "-", "17A", "was", "added", "to", "paraformaldehyde", "-", "fixed", "fungal", "cells", "followed", "by", "biotinylated", "secondary", "anti", "-", "IL", "-", "17A", "antibody", "and", "streptavidin", "-", "horse", "radish", "peroxidase", ".", "The", "optical", "density", "at", "450", "nm", "was", "corrected", "by", "subtracting", "the", "optical", "density", "at", "570", "nm", "(", "normalized", "OD", ")", "in", "the", "enzyme", "-", "linked", "immunosorbent", "assay", ".", "P", "-", "values", "of", "samples", "exposed", "to", "0", ".", "1", "and", "1", "ng", "IL", "-", "17A", "ranged", "from", "0", ".", "05", "to", "0", ".", "001", "(", "one", "-", "way", "analysis", "of", "variance", "Bonferroni", "post", "-", "test", ")", ".", "All", "samples", "exposed", "to", "10", "ng", "IL", "-", "17A", "displayed", "significant", "(", "P0", ".", "001", ",", "one", "-", "way", "analysis", "of", "variance", "Bonferroni", "post", "-", "test", ")", "OD", "values", "relative", "to", "unexposed", "samples", "(", "0", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f3(a-g) GFP C. albicans cells were untreated (a-c) or treated (d-g) for 4 h with 10 ng ml−1 IL-17A followed by anti-IL17A-PE and examined by fluorescence microscopy (scale bars, 5 μm). Cells were green in (a,d), red upon staining with anti-IL17A-PE (b,e) and double stained in the merged images (c,f). Note the binding of IL-17A to hyphal tips (arrows and magnified in g) (n=3). Images are from one representative experiment out of three.(h,i) Binding of murine (h) or human (i) IL-17A to clinical isolates of C. albicans from human urine (yellow triangle), blood (green triangle), vagina (red triangle) and gut (blue triangle). IL-17A was added to paraformaldehyde-fixed fungal cells followed by biotinylated secondary anti-IL-17A antibody and streptavidin-horse radish peroxidase. The optical density at 450 nm was corrected by subtracting the optical density at 570 nm (normalized OD) in the enzyme-linked immunosorbent assay. P-values of samples exposed to 0.1 and 1 ng IL-17A ranged from 0.05 to 0.001 (one-way analysis of variance Bonferroni post-test). All samples exposed to 10 ng IL-17A displayed significant (P0.001, one-way analysis of variance Bonferroni post-test) OD values relative to unexposed samples (0).(j-o) Direct visualization of IL-17A on Candida freshly harvested from human vagina. Same experiment as in (a-g) on cells previously stained with Con A (j,m, green) and incubated with PE-anti-human IL-17A (k,n, red) and double stained in the merged images (l,o). Scale bars, 10 μm. Shown is one representative experiment out of three.(p-r) Cytospins of vaginal fluids from IL-17F-deficient (p), IL-17A-deficient (q) and C57BL/6 (r) mice intravaginally infected two days before with C.albicans SC5314 blastospores. Note the presence of hyphae in the vagina of IL-17F-deficient mice after May-Grünwald-Giemsa staining (scale bars, 20 μm). Shown is one representative experiment out of three.(s) Binding of IL-17A to clinical isolates of C. krusei (red square), C. glabrata (green square) and S. cerevisiae (yellow square) done as in (h,i). IL-17A was added to paraformaldehyde-fixed fungal cells followed by biotinylated secondary anti-IL-17A antibody and streptavidin-horse radish peroxidase. The optical density at 450 nm was corrected by subtracting the optical density at 570 nm (normalized OD) in the enzyme-linked immunosorbent assay. P-values of samples exposed to 0.1 and 1 ng IL-17A ranged from 0.05 to 0.001 (one-way analysis of variance Bonferroni post-test). All samples exposed to 10 ng IL-17A displayed significant (P0.001, one-way analysis of variance Bonferroni post-test) OD values relative to unexposed samples (0)."}
{"words": ["f4", "(", "a", ")", "Dose", "-", "dependent", "binding", "of", "IL", "-", "17A", "to", "fungal", "Crh11p", "(", "red", "circle", ")", "and", "Gas1p", "(", "light", "blue", "circle", ")", "proteins", ",", "but", "not", "to", "the", "fungal", "polysaccharides", "β", "-", "1", ",", "3", "-", "D", "-", "glucan", "(", "open", "circle", ")", ",", "mannan", "(", "blue", "circle", ")", "and", "zymosan", "(", "grey", "circle", ")", ".", "The", "lack", "of", "binding", "of", "IL", "-", "17E", "to", "Crh11p", "(", "orange", "circle", ")", "serves", "as", "a", "negative", "control", ".", "The", "optical", "density", "at", "450", "nm", "was", "corrected", "by", "subtracting", "the", "optical", "density", "at", "570", "nm", "(", "normalized", "OD", ")", "in", "the", "enzyme", "-", "linked", "immunosorbent", "assay", ".", "Data", "are", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ",", "n", "=", "3", ".", "P0", ".", "001", ",", "Crh11p", "and", "Gas1p", "without", "versus", "with", "IL", "-", "17A", "(", "one", "-", "way", "analysis", "of", "variance", "Bonferroni", "post", "-", "test", ")", ".", "(", "b", ")", "Co", "-", "immunoprecipitation", "assay", "of", "fungal", "Crh11p", "and", "murine", "IL", "-", "17A", "proteins", ".", "Immunoprecipitates", "were", "probed", "with", "antibodies", "to", "the", "corresponding", "antigens", "and", "secondary", "HRP", "-", "conjugated", "antibody", ".", "C", ",", "irrelevant", "antibody", ".", "(", "c", ")", "Failure", "of", "IL", "-", "17A", "to", "bind", "to", "wild", "-", "type", "(", "red", "square", ")", "or", "mutant", "C", ".", "albicans", "strains", "in", "which", "the", "three", "genes", "of", "the", "CRH", "family", "(", "UTR2", ",", "open", "light", "blue", ",", "CRH1", ",", "open", "black", "and", "CRH12", ",", "open", "blue", "square", ")", "had", "been", "deleted", ",", "and", "restoration", "of", "binding", "by", "CRH1", "(", "black", "square", ")", "and", "CRH12", "(", "blue", "square", ")", ",", "but", "not", "UTR2", "(", "light", "blue", "square", ")", ",", "reconstitution", ".", "Data", "are", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "P0", ".", "001", "for", "red", "square", ",", "open", "light", "blue", ",", "black", "square", "and", "blue", "square", "(", "one", "-", "way", "analysis", "of", "variance", "Bonferroni", "post", "-", "test", ")", ".", "(", "d", ",", "e", ")", "Cellular", "localization", "of", "bound", "IL", "-", "17A", ".", "Electron", "micrographs", "of", "ultrafine", "sections", "of", "C", ".", "albicans", "MKY", "378", "wild", "-", "type", "(", "d", ")", "or", "the", "crh11Δ", "mutant", "(", "e", ")", "incubated", "with", "biotinylated", "IL", "-", "17A", "and", "streptavidin", "gold", "-", "conjugated", "particles", ".", "Arrows", "indicate", "immunogold", "particles", ".", "Scale", "bars", ",", "200", "nm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f4(a) Dose-dependent binding of IL-17A to fungal Crh11p (red circle) and Gas1p (light blue circle) proteins, but not to the fungal polysaccharides β-1,3-D-glucan (open circle), mannan (blue circle) and zymosan (grey circle). The lack of binding of IL-17E to Crh11p (orange circle) serves as a negative control. The optical density at 450 nm was corrected by subtracting the optical density at 570 nm (normalized OD) in the enzyme-linked immunosorbent assay. Data are mean±s.d., n=3. P0.001, Crh11p and Gas1p without versus with IL-17A (one-way analysis of variance Bonferroni post-test).(b) Co-immunoprecipitation assay of fungal Crh11p and murine IL-17A proteins. Immunoprecipitates were probed with antibodies to the corresponding antigens and secondary HRP-conjugated antibody. C, irrelevant antibody.(c) Failure of IL-17A to bind to wild-type (red square) or mutant C. albicans strains in which the three genes of the CRH family (UTR2, open light blue, CRH1, open black and CRH12, open blue square) had been deleted, and restoration of binding by CRH1 (black square) and CRH12 (blue square), but not UTR2 (light blue square), reconstitution. Data are mean±s.d. (n=3). P0.001 for red square, open light blue, black square and blue square (one-way analysis of variance Bonferroni post-test).(d,e) Cellular localization of bound IL-17A. Electron micrographs of ultrafine sections of C. albicans MKY 378 wild-type (d) or the crh11Δ mutant (e) incubated with biotinylated IL-17A and streptavidin gold-conjugated particles. Arrows indicate immunogold particles. Scale bars, 200 nm."}
{"words": ["f5Fungi", "were", "harvested", "from", "the", "stomachs", "of", "C57BL", "/", "6", "(", "a", "-", "c", ")", ",", "IL", "-", "17F", "-", "deficient", "(", "d", "-", "f", ")", "or", "IL", "-", "17A", "-", "deficient", "(", "g", "-", "i", ")", "mice", "infected", "with", "GFP", "-", "Candida", "for", "2", "days", ",", "and", "stained", "using", "PE", "-", "labeled", "antibody", "to", "IL", "-", "17A", ".", "Cells", "were", "green", "in", "(", "a", ",", "d", "and", "g", ")", ",", "red", "upon", "staining", "with", "anti", "-", "IL17A", "-", "PE", "(", "b", ",", "e", "and", "h", ")", "and", "double", "stained", "in", "the", "merged", "images", "(", "c", ",", "f", "and", "i", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "Images", "are", "from", "one", "representative", "experiment", "out", "of", "two", ".", "(", "j", "-", "l", ")", "SEM", "images", "showing", "fungal", "germination", "in", "the", "stomachs", "of", "C57BL", "/", "6", "mice", "(", "j", ")", ",", "filamentation", "in", "IL", "-", "17F", "-", "deficient", "mice", "(", "k", ")", "and", "neither", "one", "in", "IL", "-", "17A", "-", "deficient", "(", "l", ")", "mice", "intragastrically", "infected", "2", "days", "before", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "(", "a", "-", "l", ")", "Images", "are", "from", "one", "representative", "experiment", "out", "of", "two", ".", "(", "m", "-", "o", ")", "C57BL", "/", "6", "mice", "were", "infected", "intragastrically", "with", "C", ".", "albicans", "MKY", "378", "strain", "(", "m", ")", "or", "the", "crh11Δ", "(", "n", ")", "and", "crh12Δ", "(", "o", ")", "mutants", ",", "and", "were", "monitored", "for", "fungal", "growth", "(", "log10", "colony", "-", "forming", "units", "(", "CFU", ")", "at", "2", "(", "open", "circle", ")", "or", "8", "(", "black", "circle", ")", "days", "post", "infection", ")", ".", "Data", "are", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "The", "actual", "P", "-", "values", "are", "indicated", "(", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ")", "for", "2", "and", "8", "days", "(", "m", ")", "and", "for", "2", "days", "(", "o", ")", ".", "Fungal", "cells", "were", "untreated", "(", "none", ")", "or", "exposed", "to", "10", "ng", "ml", "−", "1", "IL", "-", "17A", "for", "4", "h", "before", "injection", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f5Fungi were harvested from the stomachs of C57BL/6 (a-c), IL-17F-deficient (d-f) or IL-17A-deficient (g-i) mice infected with GFP-Candida for 2 days, and stained using PE-labeled antibody to IL-17A. Cells were green in (a,d and g), red upon staining with anti-IL17A-PE (b,e and h) and double stained in the merged images (c,f and i). Scale bars, 10 μm. Images are from one representative experiment out of two. (j-l) SEM images showing fungal germination in the stomachs of C57BL/6 mice (j), filamentation in IL-17F-deficient mice (k) and neither one in IL-17A-deficient (l) mice intragastrically infected 2 days before. Scale bars, 10 μm. (a-l) Images are from one representative experiment out of two.(m-o) C57BL/6 mice were infected intragastrically with C. albicans MKY 378 strain (m) or the crh11Δ (n) and crh12Δ (o) mutants, and were monitored for fungal growth (log10 colony-forming units (CFU) at 2 (open circle) or 8 (black circle) days post infection). Data are mean±s.d. (n=3). The actual P-values are indicated (two-tailed t-test) for 2 and 8 days (m) and for 2 days (o). Fungal cells were untreated (none) or exposed to 10 ng ml−1 IL-17A for 4 h before injection."}
{"words": ["f6Candida", "SC5314", "(", "a", ")", ",", "TOR1", "-", "1", "/", "TOR1", "(", "b", ")", "and", "atg9Δ", "/", "atg9Δ", "(", "c", ")", "mutant", "strains", "were", "untreated", "(", "open", "column", ")", "or", "pre", "-", "incubated", "with", "IL", "-", "17A", "(", "filled", "column", ")", "for", "4", "h", "before", "exposure", "to", "neutrophils", "for", "additional", "2", "h", "before", "the", "assessment", "of", "adhesion", ",", "phagocytosis", "and", "killing", ".", "Error", "bars", ",", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "The", "actual", "P", "-", "values", "are", "indicated", "(", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ")", ".", "i", "-", "n", ")", "Immunofluorescence", "of", "ATG8", "in", "untreated", "(", "i", "-", "k", ")", "or", "IL", "-", "17A", "-", "treated", "(", "10", "ng", "ml", "−", "1", "for", "4", "h", ")", "(", "l", "-", "n", ")", "cells", ".", "Cells", "were", "red", "after", "TRITC", "-", "ATG8", "staining", "(", "i", ",", "l", ")", ",", "green", "after", "ConA", "staining", "(", "j", ",", "m", ")", ",", "merged", "images", "(", "k", ",", "n", ")", ".", "Mean", "values", "(", "%", "ATG8", "+", "cells", "(", "merge", ")", ";", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", ")", ":", "ATG8", "/", "none", ",", "8", ".", "2", "±", "1", ".", "6", ";", "ATG8", "/", "IL", "-", "17A", ",", "58", ".", "0", "±", "11", ".", "3", "(", "P", "=", "0", ".", "002", ")", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "(", "g", ")", "Fungi", "purified", "from", "the", "stomachs", "of", "mice", "infected", "as", "in", "(", "d", "-", "f", ")", "were", "subjected", "to", "RT", "-", "PCR", "for", "autophagy", "genes", "expression", ".", "C", "+", ",", "fungal", "cells", "grown", "on", "SPIDER", "solid", "medium", ".", "C", "-", ",", "no", "cells", ".", "(", "h", "-", "j", ")", "Log10", "colony", "-", "forming", "units", "(", "CFU", ")", "at", "2", "days", "post", "infection", "with", "C", ".", "albicans", "SC5314", "(", "wild", "-", "type", ")", "or", "different", "mutant", "strains", "in", "C57BL", "/", "6", "(", "h", ")", ",", "IL", "-", "17F", "-", "deficient", "(", "i", ")", "or", "IL", "-", "17A", "-", "deficient", "(", "j", ")", "mice", ".", "Data", "are", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "The", "actual", "P", "-", "values", "are", "indicated", "(", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f6Candida SC5314 (a), TOR1-1/TOR1(b) and atg9Δ/atg9Δ (c) mutant strains were untreated (open column) or pre-incubated with IL-17A (filled column) for 4 h before exposure to neutrophils for additional 2 h before the assessment of adhesion, phagocytosis and killing. Error bars, mean±s.d. (n=3). The actual P-values are indicated (two-tailed t-test).i-n) Immunofluorescence of ATG8 in untreated (i-k) or IL-17A-treated (10 ng ml−1 for 4 h) (l-n) cells. Cells were red after TRITC-ATG8 staining (i,l), green after ConA staining (j,m), merged images (k,n). Mean values (% ATG8+ cells (merge); mean±s.d.): ATG8/none, 8.2±1.6; ATG8/IL-17A, 58.0±11.3 (P=0.002) (n=3). Scale bars, 10 μm.(g) Fungi purified from the stomachs of mice infected as in (d-f) were subjected to RT-PCR for autophagy genes expression. C+, fungal cells grown on SPIDER solid medium. C-, no cells.(h-j) Log10 colony-forming units (CFU) at 2 days post infection with C. albicans SC5314 (wild-type) or different mutant strains in C57BL/6 (h), IL-17F-deficient (i) or IL-17A-deficient (j) mice. Data are mean±s.d. (n=3). The actual P-values are indicated (two-tailed t-test)."}
{"words": ["f7", "(", "a", "-", "f", ")", "GFPAspergillus", "conidia", ",", "incubated", "overnight", "at", "room", "temperature", ",", "were", "untreated", "(", "a", "-", "c", ")", "or", "exposed", "(", "d", "-", "f", ")", "to", "10", "ng", "ml", "−", "1", "IL", "-", "17A", "for", "4", "h", "followed", "by", "anti", "-", "IL", "-", "17A", "-", "PE", ".", "Cells", "were", "green", "in", "(", "a", ",", "b", ")", ",", "red", "upon", "staining", "with", "anti", "-", "IL17A", "-", "PE", "(", "b", ",", "e", ")", "and", "double", "stained", "in", "the", "merged", "images", "(", "c", ",", "f", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "(", "g", ",", "h", ")", "IL", "-", "17A", "promotes", "biofilm", "formation", "in", "A", ".", "fumigatus", "AF293", "strain", ".", "SEM", "images", "refer", "to", "cells", "untreated", "(", "g", ")", "or", "pretreated", "(", "h", ")", "with", "10", "ng", "ml", "−", "1", "IL", "-", "17A", "for", "4", "h", "and", "subsequently", "cultured", "onto", "plastic", "discs", "for", "24", "h", ".", "Scale", "bars", ",", "20", "μm", ".", "(", "i", "-", "k", ")", "IL", "-", "17A", "induces", "autophagy", "in", "Aspergillus", ".", "Representative", "electron", "micrographs", "of", "vacuoles", "(", "v", ")", "in", "A", ".", "fumigatus", "AF293", "unexposed", "(", "k", ")", "or", "exposed", "to", "10", "ng", "ml", "−", "1", "IL", "-", "17A", "(", "j", ")", "or", "15", "nM", "rapamycin", "(", "i", ")", "for", "4", "h", "before", "TEM", ".", "Scale", "bars", ",", "500", "nm", ".", "(", "l", ")", "IL", "-", "17A", "binds", "the", "Aspergillus", "Crf1p", "protein", ".", "Dose", "-", "dependent", "binding", "of", "IL", "-", "17A", "to", "Crf1p", "(", "red", "circle", ")", ",", "Gel1p", "(", "light", "blue", "circle", ")", "or", "the", "Aspergillus", "-", "derived", "polysaccharides", "β", "-", "1", ",", "3", "-", "D", "-", "glucan", "(", "blue", "circle", ")", ",", "α", "-", "1", ",", "3", "-", "D", "-", "glucan", "(", "open", "circle", ")", "and", "galactomannan", "(", "grey", "circle", ")", ".", "The", "optical", "density", "at", "450", "nm", "was", "corrected", "by", "subtracting", "the", "optical", "density", "at", "570", "nm", "(", "normalized", "OD", ")", "in", "the", "enzyme", "-", "linked", "immunosorbent", "assay", "(", "ELISA", ")", "on", "microtitre", "-", "coated", "plates", ".", "Data", "are", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "P", "-", "values", "ranged", "from", "0", ".", "01", "to", "0", ".", "001", "for", "IL", "-", "17A", "-", "treated", "versus", "untreated", "(", "0", ")", "Crf1p", "(", "one", "-", "way", "analysis", "of", "variance", ",", "Bonferroni", "post", "-", "test", ")", ".", "(", "m", ")", "ELISA", "assay", "showing", "failure", "of", "IL", "-", "17A", "to", "bind", "the", "Aspergillus", "mutant", "crf1Δ", "(", "blue", "square", ")", "as", "opposed", "to", "the", "wild", "-", "type", "strain", "AF293", "(", "red", "square", ")", ".", "Data", "are", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "P", "-", "values", "ranged", "from", "0", ".", "05", "to", "0", ".", "01", ",", "wild", "-", "type", "versus", "mutant", "strain", "exposed", "to", "1", "or", "10", "ng", "ml", "−", "1", "IL", "-", "17A", "(", "one", "-", "way", "analysis", "of", "variance", ",", "Bonferroni", "post", "-", "test", ")", ".", "(", "n", "-", "q", ")", "IL", "-", "17A", "promotes", "filamentation", "in", "the", "mutant", "crf1Δ", "(", "o", ")", "but", "not", "the", "wild", "-", "type", "AF293", "(", "q", ")", "strain", "after", "24", "-", "h", "exposure", "in", "liquid", "culture", ".", "Scale", "bars", ",", "500", "μm", ".", "(", "r", ",", "s", ")", "C57BL", "/", "6", "mice", "were", "infected", "intranasally", "with", "the", "Aspergillus", "crf1Δ", "mutant", "(", "r", ")", "or", "the", "AF293", "(", "s", ")", "strain", "and", "monitored", "for", "fungal", "growth", "(", "log10", "colony", "-", "forming", "units", "(", "CFU", ")", "±", "s", ".", "d", ".", ")", "in", "the", "lungs", "2", "days", "later", ".", "Fungal", "cells", "were", "exposed", "or", "not", "(", "none", ")", "to", "10", "ng", "ml", "−", "1", "IL", "-", "17A", "for", "4", "h", ",", "extensively", "washed", "and", "injected", ".", "Data", "are", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "The", "actual", "P", "-", "values", "are", "indicated", "(", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f7(a-f) GFPAspergillus conidia, incubated overnight at room temperature, were untreated (a-c) or exposed (d-f) to 10 ng ml−1 IL-17A for 4 h followed by anti-IL-17A-PE. Cells were green in (a,b), red upon staining with anti-IL17A-PE (b,e) and double stained in the merged images (c,f). Scale bars, 10 μm.(g,h) IL-17A promotes biofilm formation in A. fumigatus AF293 strain. SEM images refer to cells untreated (g) or pretreated (h) with 10 ng ml−1 IL-17A for 4 h and subsequently cultured onto plastic discs for 24 h. Scale bars, 20 μm.(i-k) IL-17A induces autophagy in Aspergillus. Representative electron micrographs of vacuoles (v) in A. fumigatus AF293 unexposed (k) or exposed to 10 ng ml−1 IL-17A (j) or 15 nM rapamycin (i) for 4 h before TEM. Scale bars, 500 nm.(l) IL-17A binds the Aspergillus Crf1p protein. Dose-dependent binding of IL-17A to Crf1p (red circle), Gel1p (light blue circle) or the Aspergillus-derived polysaccharides β-1,3-D-glucan (blue circle), α-1,3-D-glucan (open circle) and galactomannan (grey circle). The optical density at 450 nm was corrected by subtracting the optical density at 570 nm (normalized OD) in the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) on microtitre-coated plates. Data are mean±s.d. (n=5). P-values ranged from 0.01 to 0.001 for IL-17A-treated versus untreated (0) Crf1p (one-way analysis of variance, Bonferroni post-test).(m) ELISA assay showing failure of IL-17A to bind the Aspergillus mutant crf1Δ (blue square) as opposed to the wild-type strain AF293 (red square). Data are mean±s.d. (n =5). P-values ranged from 0.05 to 0.01, wild-type versus mutant strain exposed to 1 or 10 ng ml−1 IL-17A (one-way analysis of variance, Bonferroni post-test).(n-q) IL-17A promotes filamentation in the mutant crf1Δ (o) but not the wild-type AF293 (q) strain after 24-h exposure in liquid culture. Scale bars, 500 μm.(r,s) C57BL/6 mice were infected intranasally with the Aspergillus crf1Δ mutant (r) or the AF293 (s) strain and monitored for fungal growth (log10 colony-forming units (CFU)±s.d.) in the lungs 2 days later. Fungal cells were exposed or not (none) to 10 ng ml−1 IL-17A for 4 h, extensively washed and injected. Data are mean±s.d. (n=4). The actual P-values are indicated (two-tailed t-test)."}
{"words": ["Figure", "1A", "Phase", "contrast", "images", "of", "Mabs", "cultured", "into", "PF", "hydrogels", "(", "5", "days", ")", ":", "cells", "formed", "a", "thick", "three", "-", "dimensional", "myotube", "network", "with", "numerous", "thick", "myofibres", "(", "arrows", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "B", "Confocalimmunofluorescence", "analysis", "with", "an", "antibody", "against", "myosin", "heavy", "chain", "(", "MyHC", ")", "(", "red", ")", "and", "SYTOX", "green", "which", "labels", "nuclei", "(", "green", ")", ",", "showing", "multi", "-", "nucleated", ",", "mature", "musclefibres", "(", "arrows", ")", "developed", "from", "Mabs", "in", "PF", "(", "5", "days", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "C", ",", "D", "Western", "blot", "and", "densitometry", "analysis", "of", "different", "protein", "extracts", "of", "Mabs", "differentiated", "inside", "PF", "constructs", "(", "PF", ")", "showing", "expression", "levels", "comparable", "to", "adult", "TA", "(", "Ctrl", ")", ".", "Group", "of", "n", "=", "6", "of", "Mabs", "differentiated", "inside", "PF", "and", "host", "TA", "has", "been", "tested", ",", "densitometric", "analysis", "from", "n", "=", "3", "different", "Western", "blots", "gauging", "the", "level", "of", "expression", "of", "muscle", "markers", "is", "presented", "as", "means", "±", "standard", "error", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A Phase contrast images of Mabs cultured into PF hydrogels (5 days): cells formed a thick three-dimensional myotube network with numerous thick myofibres (arrows). Scale bar: 50 μm.B Confocalimmunofluorescence analysis with an antibody against myosin heavy chain (MyHC) (red) and SYTOX green which labels nuclei (green), showing multi-nucleated, mature musclefibres (arrows) developed from Mabs in PF (5 days). Scale bar: 50 μm.C, D Western blot and densitometry analysis of different protein extracts of Mabs differentiated inside PF constructs (PF) showing expression levels comparable to adult TA (Ctrl). Group of n = 6 of Mabs differentiated inside PF and host TA has been tested, densitometric analysis from n = 3 different Western blots gauging the level of expression of muscle markers is presented as means ± standard error."}
{"words": ["Figure", "2A", "Gross", "morphology", "of", "the", "PF", "implant", "containing", "Mabs", "-", "nLacZ", "/", "PlGF", "immediately", "after", "implantation", "on", "the", "surface", "of", "underlying", "TA", "(", "arrow", ")", ".", "B", ",", "C", "Artificial", "muscles", "(", "arrows", ")", "developed", "within", "8", "weeks", "over", "the", "host", "TA", "surface", "(", "arrowheads", ")", ",", "encapsulated", "by", "the", "host", "perimysium", "(", "B", ")", "and", "released", "after", "tendon", "resection", "of", "the", "TA", "(", "C", ")", ".", "D", "The", "isolated", "artificial", "muscle", "from", "the", "TA", "surface", "(", "arrow", ")", "is", "comparable", "in", "size", "to", "the", "underlying", "host", "TA", "(", "arrowhead", ")", ".", "E", "Stereomicroscopy", "images", "revealing", "blood", "vessel", "formation", "in", "the", "artificial", "muscle", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "μm", ".", "F", "X", "-", "Gal", "and", "H", "&", "amp", ";", "amp", ";", "E", "staining", "on", "artificial", "muscle", "section", "revealing", "vessel", "connection", "with", "host", "vasculature", "by", "Indian", "ink", ",", "injected", "into", "the", "femoral", "artery", "immediately", "before", "sacrifice", ".", "Scale", "bar", ":", "20", "μm", ".", "G", "Western", "blot", "analysis", "of", "protein", "extracts", "from", "artificial", "muscles", "(", "PF", ")", "and", "host", "TA", "(", "Ctrl", ")", "reveals", "remarkable", "expression", "of", "muscle", "-", "and", "vessel", "-", "specific", "proteins", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "I", "-", "L", "X", "-", "Gal", "and", "H", "&", "amp", ";", "amp", ";", "E", "staining", "of", "artificial", "muscle", "sections", "at", "4", "(", "I", ",", "K", ")", "and", "8", "weeks", "(", "J", ",", "L", ")", "after", "implantation", ",", "showing", "donor", "origin", "of", "muscle", "cells", "(", "nLacZ", "+", "nuclei", ")", "and", "correlation", "between", "implant", "duration", "and", "myofibre", "maturation", "(", "I", ",", "J", "images", "are", "the", "results", "of", "the", "collage", "of", "several", "photos", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "(", "I", ",", "J", ")", "200", "μm", ",", "(", "K", ",", "L", ")", "100", "μm", ".", "M", "-", "P", "Immunofluorescence", "analysis", "on", "adjacent", "sections", "revealing", "laminin", "organization", "(", "green", ")", "and", "myosin", "heavy", "chain", "(", "MyHC", ")", "expression", "(", "red", ")", "at", "4", "weeks", "(", "M", ")", "and", "8", "weeks", "(", "N", ")", "after", "grafting", "(", "M", ",", "N", "displayed", "items", "are", "obtained", "from", "a", "multi", "-", "photo", "collage", ")", ";", "DAPI", "staining", "(", "blue", ")", "shows", "centrally", "located", "nuclei", "in", "developing", "fibres", "(", "O", ")", "and", "peripheral", "nuclei", "in", "mature", "myofibres", "(", "P", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "(", "M", ",", "N", ")", "200", "μm", ",", "(", "O", ",", "P", ")", "50", "μm", ".", "Q", "Confocal", "isosurface", "image", "of", "neurofilament", "(", "green", ")", "and", "bungarotoxin", "(", "red", ")", "immunofluorescence", "in", "the", "artificial", "muscle", "section", "shows", "a", "mature", "neuromuscular", "plaque", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "R", "Immunofluorescence", "against", "smooth", "muscle", "actin", "(", "blue", ")", ",", "laminin", "(", "green", ")", "and", "VE", "-", "Cad", "(", "red", ")", "superimposed", "on", "phase", "contrast", "image", "shows", "blood", "vessels", "(", "arrows", ")", "adjacent", "to", "the", "myofibres", "in", "the", "artificial", "muscle", "section", ".", "Scale", "bar", ":", "20", "μm", ".", "S", "X", "-", "Gal", "staining", "on", "mature", "artificial", "muscle", "(", "arrowhead", ")", "and", "the", "underneath", "host", "TA", "(", "arrow", ")", "revealing", "no", "tendon", "development", "at", "the", "extremity", "of", "the", "artificial", "tissue", ";", "implanted", "LacZ", "-", "positive", "Mabs", "are", "present", "within", "the", "host", "TA", ".", "Scale", "bar", ":", "200", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Gross morphology of the PF implant containing Mabs-nLacZ/PlGF immediately after implantation on the surface of underlying TA (arrow).B, C Artificial muscles (arrows) developed within 8 weeks over the host TA surface (arrowheads), encapsulated by the host perimysium (B) and released after tendon resection of the TA (C).D The isolated artificial muscle from the TA surface (arrow) is comparable in size to the underlying host TA (arrowhead).E Stereomicroscopy images revealing blood vessel formation in the artificial muscle. Scale bar: 100 μm.F X-Gal and H&amp;amp;E staining on artificial muscle section revealing vessel connection with host vasculature by Indian ink, injected into the femoral artery immediately before sacrifice. Scale bar: 20 μm.G Western blot analysis of protein extracts from artificial muscles (PF) and host TA (Ctrl) reveals remarkable expression of muscle- and vessel-specific proteins (n = 5).I-L X-Gal and H&amp;amp;E staining of artificial muscle sections at 4 (I, K) and 8 weeks (J, L) after implantation, showing donor origin of muscle cells (nLacZ+ nuclei) and correlation between implant duration and myofibre maturation (I, J images are the results of the collage of several photos). Scale bar: (I, J) 200 μm, (K, L) 100 μm.M-P Immunofluorescence analysis on adjacent sections revealing laminin organization (green) and myosin heavy chain (MyHC) expression (red) at 4 weeks (M) and 8 weeks (N) after grafting (M, N displayed items are obtained from a multi-photo collage); DAPI staining (blue) shows centrally located nuclei in developing fibres (O) and peripheral nuclei in mature myofibres (P). Scale bar: (M, N) 200 μm, (O, P) 50 μm.Q Confocal isosurface image of neurofilament (green) and bungarotoxin (red) immunofluorescence in the artificial muscle section shows a mature neuromuscular plaque. Scale bar: 10 μm.R Immunofluorescence against smooth muscle actin (blue), laminin (green) and VE-Cad (red) superimposed on phase contrast image shows blood vessels (arrows) adjacent to the myofibres in the artificial muscle section. Scale bar: 20 μm.S X-Gal staining on mature artificial muscle (arrowhead) and the underneath host TA (arrow) revealing no tendon development at the extremity of the artificial tissue; implanted LacZ-positive Mabs are present within the host TA. Scale bar: 200 μm."}
{"words": ["Figure", "3A", "Electron", "microscopy", "with", "Bluo", "-", "Gal", "staining", "reveals", "a", "LacZ", "-", "positive", "donor", "nucleus", "(", "arrow", ")", "peripheral", "to", "transversely", "sectioned", "sarcomeres", "of", "the", "artificial", "muscle", ".", "Scale", "bar", ":", "1", "μm", ".", "B", "Longitudinal", "EM", "section", "of", "an", "artificial", "muscle", "showing", "mature", "sarcomere", "myofibril", "organization", ".", "Scale", "bar", ":", "0", ".", "5", "μm", ".", "C", "A", "single", "fibre", "from", "an", "artificial", "muscle", "showing", "a", "striation", "pattern", "typical", "of", "a", "mature", "myofibre", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "D", "X", "-", "Gal", "staining", "of", "freshly", "dissected", "artificial", "muscle", "bundle", "at", "8", "weeks", "showing", "abundant", "LacZ", "-", "positive", "donor", "nuclei", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "μm", ".", "E", "Immunofluorescence", "analysis", "of", "LacZ", "-", "positive", "nuclei", "(", "green", ")", "and", "dystrophin", "(", "red", ")", "in", "an", "individual", "muscle", "fibre", "after", "functional", "analysis", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "F", "The", "same", "fibre", "shown", "in", "(", "E", ")", "is", "counterstained", "with", "DAPI", "to", "show", "that", "the", "interstitial", "nuclei", "(", "blue", ")", "are", "of", "donor", "origin", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "G", "-", "I", "Specific", "force", "(", "Po", "/", "CSA", ")", "(", "G", ")", ",", "maximum", "shortening", "velocity", "(", "Vo", ")", "(", "H", ")", ",", "and", "cross", "-", "sectional", "area", "(", "CSA", ")", "(", "I", ")", "of", "single", "fibres", "(", "n", "=", "153", ")", "from", "artificial", "muscles", "and", "control", "(", "CTRL", ")", "muscles", "(", "n", "=", "103", ")", ".", "J", "Silver", "-", "stained", "SDS", "-", "PAGE", "(", "8", "%", ")", "gel", "revealing", "myosin", "heavy", "chain", "(", "MyHC", ")", "-", "2B", "isoform", "expression", "in", "two", "single", "fibres", "of", "artificial", "muscles", "(", "lanes", "1", ",", "2", ")", "and", "a", "bulk", "muscle", "control", "sample", "from", "soleus", "muscle", "containing", "all", "four", "adult", "MyHC", "isoforms", "indicated", "in", "(", "K", ")", "(", "lane", "3", ")", ".", "K", "Comassie", "blue", "-", "stained", "SDS", "-", "PAGE", "(", "8", "%", ")", "of", "bulk", "samples", "of", "two", "artificial", "muscles", "(", "lanes", "1", ",", "2", ")", "and", "of", "a", "bulk", "control", "muscle", "sample", "(", "lane", "3", ")", ",", "as", "in", "(", "J", ")", ",", "showing", "different", "MyHC", "isoform", "expression", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Electron microscopy with Bluo-Gal staining reveals a LacZ-positive donor nucleus (arrow) peripheral to transversely sectioned sarcomeres of the artificial muscle. Scale bar: 1 μm.B Longitudinal EM section of an artificial muscle showing mature sarcomere myofibril organization. Scale bar: 0.5 μm.C A single fibre from an artificial muscle showing a striation pattern typical of a mature myofibre. Scale bar: 10 μm.D X-Gal staining of freshly dissected artificial muscle bundle at 8 weeks showing abundant LacZ-positive donor nuclei. Scale bar: 100 μm.E Immunofluorescence analysis of LacZ-positive nuclei (green) and dystrophin (red) in an individual muscle fibre after functional analysis. Scale bar: 10 μm.F The same fibre shown in (E) is counterstained with DAPI to show that the interstitial nuclei (blue) are of donor origin. Scale bar: 10 μm.G-I Specific force (Po/CSA) (G), maximum shortening velocity (Vo) (H), and cross-sectional area (CSA) (I) of single fibres (n = 153) from artificial muscles and control (CTRL) muscles (n = 103).J Silver-stained SDS-PAGE (8%) gel revealing myosin heavy chain (MyHC)-2B isoform expression in two single fibres of artificial muscles (lanes 1, 2) and a bulk muscle control sample from soleus muscle containing all four adult MyHC isoforms indicated in (K) (lane 3).K Comassie blue-stained SDS-PAGE (8%) of bulk samples of two artificial muscles (lanes 1, 2) and of a bulk control muscle sample (lane 3), as in (J), showing different MyHC isoform expression."}
{"words": ["Figure", "4A", ",", "B", "Gross", "morphology", "of", "the", "TA", "injury", "at", "6", "months", "after", "massive", "muscle", "ablation", ",", "revealing", "the", "new", "artificial", "TA", "regeneration", "(", "arrow", ")", "when", "grafted", "with", "PF", "-", "embedded", "Mabs", "-", "PlGF", "(", "B", ")", "and", "absence", "of", "TA", "muscle", "(", "arrow", ")", "when", "treated", "with", "empty", "PF", "as", "a", "control", "(", "A", ")", ".", "C", "PF", "-", "embedded", "Mabs", "-", "PlGF", "-", "derived", "artificial", "TA", "(", "right", ")", "showing", "comparable", "size", "to", "the", "wild", "-", "type", "normal", "TA", "(", "left", ")", ".", "D", "-", "O", "Immunofluorescence", "against", "myosin", "heavy", "chain", "(", "MyHC", ")", "(", "red", ")", "and", "laminin", "(", "green", ")", "on", "mice", "TA", "cross", "sections", "at", "early", "(", "10", "days", ")", "(", "D", "-", "I", ")", "and", "later", "stage", "(", "6", "months", ")", "(", "J", "-", "O", ")", "after", "massive", "removal", "of", "the", "muscle", "(", "D", ",", "G", ",", "J", ",", "M", "are", "the", "results", "of", "a", "collage", "of", "several", "photos", ")", ".", "TA", "regeneration", "at", "early", "stages", "showed", "very", "few", "residual", "myofibres", "after", "implantation", "of", "acellular", "PF", "in", "place", "of", "the", "ablated", "TA", "(", "white", "box", "in", "D", ")", ",", "an", "enlarged", "view", "(", "E", ")", ",", "and", "DAPI", "-", "counterstained", "view", "(", "F", ")", "reveals", "the", "infiltration", "of", "undifferentiated", "mono", "-", "nucleated", "cells", ".", "Conversely", ",", "a", "PF", "-", "embedded", "Mabs", "-", "PlGF", "graft", "(", "G", ")", "demonstrated", "early", "-", "stage", "regeneration", "with", "several", "MyHC", "-", "positive", "(", "red", ")", "regenerating", "myofibres", "surrounded", "by", "laminin", "(", "green", ")", "(", "H", ")", ",", "most", "of", "these", "(", "arrows", ")", "being", "centre", "-", "nucleated", "(", "DAPI", "labelled", "in", "I", ")", ".", "At", "the", "later", "stages", ",", "acellular", "PF", "implanted", "mice", "(", "J", ")", "showed", "a", "very", "small", "portion", "of", "muscle", "tissue", "likely", "derived", "from", "residual", "myofibres", "from", "TA", "removal", ",", "higher", "magnification", "(", "K", ")", "revealed", "very", "few", "mature", "myofibres", "with", "peripheral", "nuclei", "(", "DAPI", "labelled", "in", "L", ")", ".", "Contrary", ",", "the", "PF", "-", "embedded", "Mabs", "-", "PlGF", "treatment", "(", "M", ")", "showed", "a", "complete", "replacement", "of", "the", "ablated", "TA", "with", "the", "recovered", "native", "structure", "of", "MyHC", "-", "positive", "myofibres", "surrounded", "by", "laminin", "(", "N", ")", ",", "some", "of", "these", "(", "arrows", ")", "still", "being", "centre", "nucleate", "(", "DAPI", "labelled", "in", "O", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "(", "D", ",", "G", ",", "J", ",", "M", ")", "500", "μm", ",", "(", "E", ",", "F", ",", "H", ",", "I", ",", "K", ",", "L", ",", "N", ",", "O", ")", "100", "μm", ".", "P", "-", "R", "Functional", "analysis", "demonstrated", "the", "effective", "ability", "of", "the", "PF", "and", "Mabs", "-", "PlGF", "combination", "to", "generate", "a", "complete", "and", "functional", "artificial", "TA", "replacing", "the", "ablated", "TA", "injury", ".", "(", "P", ")", "The", "fore", "-", "hind", "limb", "grip", "test", "diagram", "reveals", "functional", "grab", "force", "recovery", "for", "mice", "treated", "with", "PF", "-", "embedded", "Mabs", "-", "PlGF", "(", "TA", "ABL", "-", "PF", "+", "MABS", ")", "after", "only", "4", "weeks", "post", "-", "TA", "injury", ",", "being", "comparable", "with", "not", "-", "ablated", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "mice", "and", "significantly", "higher", "than", "control", "ablated", "mice", "(", "TA", "ABL", "-", "CONT", ")", "or", "mice", "implanted", "with", "void", "PF", "(", "TA", "ABL", "-", "PF", "CONT", ")", "(", "n", "=", "10", "mice", "per", "group", ")", ".", "(", "Q", ",", "R", ")", "The", "treadmill", "analysis", "of", "the", "treated", "mice", "relative", "to", "wild", "-", "type", "not", "-", "ablated", "(", "wt", ")", "shows", "both", "exhaustion", "time", "and", "distance", "indicative", "of", "a", "full", "recovery", "of", "motor", "functionality", "already", "at", "3", "weeks", "after", "TA", "ablation", "with", "an", "increase", "in", "time", "and", "distance", "run", "for", "mice", "treated", "with", "PF", "-", "embedded", "Mabs", "-", "PlGF", ",", "while", "control", "mice", "(", "TA", "ABL", "-", "CONT", "or", "TA", "ABL", "-", "PF", "CONT", ")", "showed", "a", "much", "lower", "resistance", "(", "n", "=", "10", "mice", "per", "group", ")", ".", "The", "values", "shown", "in", "the", "diagrams", "are", "expressed", "as", "means", "±", "standard", "error", "and", "statistical", "significance", "was", "tested", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "P", "<", "0", ".", "05", "was", "considered", "significant", ")", ".", "S", "-", "Z", "Morphological", "analysis", "demonstrated", "the", "effective", "ability", "of", "the", "PF", "and", "Mabs", "-", "PlGF", "combination", "to", "generate", "a", "complete", "and", "functional", "artificial", "TA", "replacing", "the", "ablated", "TA", "injury", ".", "H", "&", "amp", ";", "amp", ";", "E", "staining", "of", "TA", "injury", "in", "mice", "by", "cross", "section", "at", "an", "early", "(", "10", "days", ")", "(", "S", "-", "V", ")", "and", "late", "(", "6", "months", ")", "(", "W", "-", "Z", ")", "time", "point", "after", "ablation", "(", "in", "S", ",", "U", ",", "W", ",", "Y", "displayed", "items", "are", "obtained", "from", "a", "multi", "-", "photo", "collage", ")", ".", "At", "the", "early", "time", "point", ",", "the", "acellular", "PF", "-", "treated", "mice", "revealed", "few", "mature", "muscle", "fibres", "that", "survive", "the", "massive", "ablation", "(", "box", "in", "S", ")", "signs", "of", "continued", "muscle", "degeneration", "(", "arrows", "in", "T", ")", ",", "whereas", "PF", "-", "embedded", "Mabs", "implanted", "mice", "showed", "remarkable", "muscle", "regeneration", "indicated", "by", "centre", "-", "nucleated", "myofibres", "(", "arrows", "in", "V", ")", ".", "At", "later", "stages", ",", "the", "control", "mice", "grafted", "with", "acellular", "PF", "showed", "an", "almost", "devoid", "TA", "(", "W", ")", "with", "very", "few", "muscle", "fibres", "(", "X", ")", ",", "in", "contrast", "to", "PF", "-", "embedded", "Mabs", ",", "which", "exhibited", "a", "complete", "muscle", "replacement", "generating", "an", "artificial", "TA", "(", "Y", ")", ",", "enlarged", "view", "(", "Z", ")", "proved", "the", "complete", "and", "mature", "organization", "of", "the", "newly", "formed", "muscle", "showing", "capillary", "and", "blood", "vessel", "around", "myofibres", "(", "arrows", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "(", "S", ",", "U", ",", "W", ",", "Y", ")", "500", "μm", ",", "(", "T", ",", "V", ",", "X", ",", "Z", ")", "50", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A, B Gross morphology of the TA injury at 6 months after massive muscle ablation, revealing the new artificial TA regeneration (arrow) when grafted with PF-embedded Mabs-PlGF (B) and absence of TA muscle (arrow) when treated with empty PF as a control (A).C PF-embedded Mabs-PlGF-derived artificial TA (right) showing comparable size to the wild-type normal TA (left).D-O Immunofluorescence against myosin heavy chain (MyHC) (red) and laminin (green) on mice TA cross sections at early (10 days) (D-I) and later stage (6 months) (J-O) after massive removal of the muscle (D, G, J, M are the results of a collage of several photos). TA regeneration at early stages showed very few residual myofibres after implantation of acellular PF in place of the ablated TA (white box in D), an enlarged view (E), and DAPI-counterstained view (F) reveals the infiltration of undifferentiated mono-nucleated cells. Conversely, a PF-embedded Mabs-PlGF graft (G) demonstrated early-stage regeneration with several MyHC-positive (red) regenerating myofibres surrounded by laminin (green) (H), most of these (arrows) being centre-nucleated (DAPI labelled in I). At the later stages, acellular PF implanted mice (J) showed a very small portion of muscle tissue likely derived from residual myofibres from TA removal, higher magnification (K) revealed very few mature myofibres with peripheral nuclei (DAPI labelled in L). Contrary, the PF-embedded Mabs-PlGF treatment (M) showed a complete replacement of the ablated TA with the recovered native structure of MyHC-positive myofibres surrounded by laminin (N), some of these (arrows) still being centre nucleate (DAPI labelled in O). Scale bar: (D, G, J, M) 500 μm, (E, F, H, I, K, L, N, O) 100 μm.P-R Functional analysis demonstrated the effective ability of the PF and Mabs-PlGF combination to generate a complete and functional artificial TA replacing the ablated TA injury. (P) The fore-hind limb grip test diagram reveals functional grab force recovery for mice treated with PF-embedded Mabs-PlGF (TA ABL-PF+MABS) after only 4 weeks post-TA injury, being comparable with not-ablated wild-type (WT) mice and significantly higher than control ablated mice (TA ABL-CONT) or mice implanted with void PF (TA ABL-PF CONT) (n = 10 mice per group). (Q, R) The treadmill analysis of the treated mice relative to wild-type not-ablated (wt) shows both exhaustion time and distance indicative of a full recovery of motor functionality already at 3 weeks after TA ablation with an increase in time and distance run for mice treated with PF-embedded Mabs-PlGF, while control mice (TA ABL-CONT or TA ABL-PF CONT) showed a much lower resistance (n = 10 mice per group). The values shown in the diagrams are expressed as means ± standard error and statistical significance was tested using Student's t-test (P < 0.05 was considered significant).S-Z Morphological analysis demonstrated the effective ability of the PF and Mabs-PlGF combination to generate a complete and functional artificial TA replacing the ablated TA injury. H&amp;amp;E staining of TA injury in mice by cross section at an early (10 days) (S-V) and late (6 months) (W-Z) time point after ablation (in S, U, W, Y displayed items are obtained from a multi-photo collage). At the early time point, the acellular PF-treated mice revealed few mature muscle fibres that survive the massive ablation (box in S) signs of continued muscle degeneration (arrows in T), whereas PF-embedded Mabs implanted mice showed remarkable muscle regeneration indicated by centre-nucleated myofibres (arrows in V). At later stages, the control mice grafted with acellular PF showed an almost devoid TA (W) with very few muscle fibres (X), in contrast to PF-embedded Mabs, which exhibited a complete muscle replacement generating an artificial TA (Y), enlarged view (Z) proved the complete and mature organization of the newly formed muscle showing capillary and blood vessel around myofibres (arrows). Scale bar: (S, U, W, Y) 500 μm, (T, V, X, Z) 50 μm."}
{"words": ["Figure", "1B", "WT", "and", "SirT7", "-", "/", "-", "mice", "at", "10", "days", "(", "top", ")", "and", "2", "months", "(", "bottom", ")", "of", "age", ".", "C", "Weight", "distribution", "of", "WT", "and", "SirT7", "-", "/", "-", "mice", "(", "n", "=", "3", "-", "10", "female", "mice", "per", "time", "point", "and", "genotype", ";", "P", "value", "=", "0", ".", "003", "by", "unpaired", "t", "-", "Test", ")", ".", "Kaplan", "Meier", "survival", "curves", "(", "n", "=", "170", "WT", "and", "n", "=", "58", "SirT7", "-", "/", "-", "mice", ";", "Log", "-", "rank", "Test", "P", "value", "<", "0", ".", "0001", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B WT and SirT7-/- mice at 10 days (top) and 2 months (bottom) of age.C Weight distribution of WT and SirT7-/- mice (n=3-10 female mice per time point and genotype; P value = 0.003 by unpaired t-Test).Kaplan Meier survival curves (n=170 WT and n=58 SirT7-/- mice; Log-rank Test P value <0.0001)."}
{"words": ["Figure", "2A", "Representative", "3D", "reconstructed", "CT", "scans", "showing", "increased", "kyphosis", "in", "16", "month", "old", "SirT7", "-", "/", "-", "mice", "compared", "with", "WT", ".", "B", "Representative", "gonadal", "fat", "pads", "from", "WT", "and", "SirT7", "-", "/", "-", "16", "month", "old", "mice", ".", "C", "Quantitation", "of", "body", "weight", "(", "left", ")", "and", "gonadal", "fat", "pad", "mass", "normalized", "to", "total", "body", "weight", "(", "right", ")", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "4", "samples", "per", "genotype", ")", ".", "D", "IGF", "-", "1", "protein", "levels", "in", "serum", "measured", "by", "ELISA", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "3", "-", "8", "mice", "per", "genotype", "and", "age", "group", ")", ".", "E", ",", "F", "Dot", "plots", "of", "Lin", "-", "Sca1", "+", "cKit", "+", "(", "LSK", ")", "cells", "(", "middle", "and", "right", ")", "from", "WT", "and", "SirT7", "-", "/", "-", "bone", "marrow", "cells", ".", "Cells", "were", "gated", "for", "negative", "staining", "of", "lineage", "markers", "B220", ",", "CD3", ",", "CD11b", ",", "CD19", ",", "Gr", "-", "1", ",", "and", "Ter", "-", "119", "(", "Left", ")", ",", "and", "analyzed", "for", "Sca1", "and", "cKit", "expression", "(", "middle", "and", "right", ")", ".", "(", "F", ")", "Quantitation", "of", "(", "E", ")", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "4", "mice", "per", "genotype", ")", ".", "G", "Bone", "marrow", ",", "thymus", ",", "and", "spleen", "cell", "number", "in", "young", "WT", "and", "SirT7", "-", "/", "-", "mice", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "3", "-", "5", "mice", "per", "genotype", ")", ".", "H", "mRNA", "expression", "of", "p16", "gene", "normalized", "to", "GAPDH", "measured", "by", "RT", "-", "PCR", "from", "young", "and", "old", "WT", "and", "SirT7", "-", "/", "-", "fibroblasts", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "3", "samples", "per", "genotype", ")", ".", "I", ",", "J", "Senescence", "-", "associated", "β", "-", "galactosidasestaining", "(", "I", ",", "blue", ")", "in", "HT1080", "cells", "transfected", "with", "Scramble", "Control", "or", "SirT7", "Knockdown", "and", "grown", "for", "7", "days", "in", "selection", "media", ".", "(", "J", ")", "Quantitation", "of", "the", "number", "of", "senescent", "cells", "shown", "in", "(", "I", ")", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "3", "independent", "cell", "lines", "per", "genotype", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "by", "ANOVA", "Single", "Factor", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Representative 3D reconstructed CT scans showing increased kyphosis in 16 month old SirT7-/- mice compared with WT.B Representative gonadal fat pads from WT and SirT7-/- 16 month old mice.C Quantitation of body weight (left) and gonadal fat pad mass normalized to total body weight (right) (mean ± SEM; 4 samples per genotype).D IGF-1 protein levels in serum measured by ELISA (mean ± SEM; 3-8 mice per genotype and age group).E, F Dot plots of Lin-Sca1+cKit+ (LSK) cells (middle and right) from WT and SirT7-/- bone marrow cells. Cells were gated for negative staining of lineage markers B220, CD3, CD11b, CD19, Gr-1, and Ter-119 (Left), and analyzed for Sca1 and cKit expression (middle and right). (F) Quantitation of (E) (mean ± SEM; 4 mice per genotype).G Bone marrow, thymus, and spleen cell number in young WT and SirT7-/- mice (mean ± SEM; 3-5 mice per genotype).H mRNA expression of p16 gene normalized to GAPDH measured by RT-PCR from young and old WT and SirT7-/- fibroblasts (mean ± SEM; 3 samples per genotype).I, J Senescence-associated β-galactosidasestaining (I, blue) in HT1080 cells transfected with Scramble Control or SirT7 Knockdown and grown for 7 days in selection media. (J) Quantitation of the number of senescent cells shown in (I) (mean ± SEM; 3 independent cell lines per genotype).*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001 by ANOVA Single Factor."}
{"words": ["Figure", "3A", ",", "B", "Dot", "plots", "of", "FACS", "cell", "cycle", "analyses", "of", "WT", "and", "SirT7", "-", "/", "-", "MEFs", "in", "passage", "3", "(", "P3", ")", "and", "6", "(", "P6", ")", "using", "EdU", "incorporation", "and", "7AAD", "(", "A", ")", ".", "Percentages", "of", "cells", "in", "Sub", "G1", "(", "apoptotic", "cells", ",", "left", "square", ")", "and", "cells", "with", "DNA", "content", "above", "4N", "(", "polyploid", ",", "right", "square", ")", ".", "(", "B", ")", "Quantitation", "of", "experiment", "shown", "in", "(", "A", ")", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "3", "samples", "per", "genotype", ")", ".", "C", "Survival", "curve", "for", "WT", "and", "SirT7", "-", "/", "-", "thymocytes", "after", "X", "-", "Ray", "irradiation", "(", "IR", ")", "at", "the", "indicated", "doses", ".", "Cell", "death", "was", "quantified", "by", "FACS", "using", "AnexinV", "and", "7AAD", "staining", "18", "hours", "post", "insult", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "3", "samples", "per", "genotype", "from", "one", "of", "two", "independent", "experiments", ")", ".", "D", "Clonogenic", "assays", "in", "HT1080", "cells", "transfected", "with", "Scramble", "Control", "or", "SirT7", "Knockdown", "and", "irradiated", "at", "the", "indicated", "X", "-", "Ray", "doses", ",", "then", "plated", "at", "low", "density", ".", "After", "9", "days", ",", "colonies", "were", "stained", "with", "crystal", "violet", "and", "counted", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "3", "independent", "cell", "lines", "per", "genotype", ")", ".", "F", "Quantitation", "of", "experiment", "shown", "in", "(", "E", ")", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "9", "WT", "and", "3", "SirT7", "-", "/", "-", "samples", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "ANOVA", "Single", "Factor", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A, B Dot plots of FACS cell cycle analyses of WT and SirT7-/- MEFs in passage 3 (P3) and 6 (P6) using EdU incorporation and 7AAD (A). Percentages of cells in Sub G1 (apoptotic cells, left square) and cells with DNA content above 4N (polyploid, right square). (B) Quantitation of experiment shown in (A) (mean ± SEM; 3 samples per genotype).C Survival curve for WT and SirT7-/- thymocytes after X-Ray irradiation (IR) at the indicated doses. Cell death was quantified by FACS using AnexinV and 7AAD staining 18 hours post insult (mean ± SEM; 3 samples per genotype from one of two independent experiments).D Clonogenic assays in HT1080 cells transfected with Scramble Control or SirT7 Knockdown and irradiated at the indicated X-Ray doses, then plated at low density. After 9 days, colonies were stained with crystal violet and counted (mean ± SEM; 3 independent cell lines per genotype).F Quantitation of experiment shown in (E) (mean ± SEM; 9 WT and 3 SirT7-/- samples).*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 by ANOVA Single Factor."}
{"words": ["Figure", "4A", "Quantitation", "of", "neutral", "comet", "assays", ",", "using", "passage", "3", "WT", "and", "SirT7", "-", "/", "-", "primary", "MEFs", ",", "showing", "(", "left", ")", "the", "amount", "(", "%", ")", "of", "DNA", "in", "the", "tail", "and", "(", "right", ")", "the", "tail", "moment", "(", "see", "Fig", "S3A", "for", "representative", "images", ")", ".", "B", "Western", "blot", "showing", "ATM", "and", "KAP1", "phosphorylation", "and", "total", "protein", "levels", "in", "WT", "and", "SirT7", "-", "/", "-", "primary", "fibroblasts", "after", "IR", "(", "8Gy", ")", ".", "ATM", "inhibitor", "(", "ATMi", ")", "KU", "-", "55933", "was", "added", "30", "min", "prior", "to", "irradiation", "where", "indicated", ".", "One", "representative", "blot", "from", "4", "independent", "experiments", "is", "shown", ".", "C", "-", "F", "IF", "analysis", "of", "WT", "and", "SirT7", "-", "/", "-", "primary", "fibroblasts", "showing", "γH2AX", "dynamics", "after", "DNA", "damage", "induction", ".", "Cells", "were", "untreated", "(", "NoIR", ")", "or", "treated", "with", "1Gy", "of", "X", "-", "rays", "(", "IR", ")", "and", "fixed", "at", "the", "indicated", "times", "post", "insult", ".", "Cells", "were", "pulsed", "with", "EdU", "(", "green", ")", "30", "min", "prior", "to", "fixation", ",", "then", "stained", "for", "γH2AX", "(", "red", ")", "and", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", "(", "n", ">", "30", "cells", "per", "group", "/", "mice", ";", "3", "mice", "per", "genotype", ")", ".", "(", "C", ")", "Representative", "images", "of", "untreated", "S", "-", "phase", "(", "NoIR", ",", "EdU", "positive", ")", "WT", "and", "SirT7", "-", "/", "-", "nuclei", "(", "scale", "bar", "5µm", ")", ".", "(", "D", ")", "Quantitation", "of", "the", "number", "of", "γH2AX", "foci", "per", "nucleus", "at", "the", "indicated", "time", "points", "post", "IR", "(", "1Gy", ")", ",", "and", "indicated", "cell", "cycle", "phases", ".", "(", "E", ")", "Quantitation", "of", "experiment", "described", "in", "(", "C", ")", "showing", "mean", "number", "of", "γH2AX", "foci", "per", "nucleus", "in", "euchromatic", "and", "heterochromatic", "regions", "at", "the", "indicated", "time", "points", "before", "and", "after", "IR", "in", "G2", "(", "mean", "±", "SEM", "from", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "Total", "γH2AX", "foci", "and", "γH2AX", "foci", "overlapping", "with", "or", "at", "the", "periphery", "of", "heterochromatic", "regions", "were", "enumerated", ".", "Nuclei", "and", "pericentric", "heterochromatin", "(", "chromocenters", ")", "were", "segmented", "by", "DAPI", "staining", ".", "Euchromatic", "numbers", "were", "estimated", "by", "subtracting", "the", "heterochromatic", "number", "of", "foci", "from", "the", "total", "foci", "number", ".", "(", "F", ")", "Representative", "images", "of", "WT", "and", "SirT7", "-", "/", "-", "primary", "fibroblasts", "in", "G2", "phase", "showing", "γH2AX", "(", "red", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", "at", "the", "indicated", "period", "of", "time", "after", "IR", ".", "(", "Right", ")", "3D", "rendering", "of", "the", "IF", "segmentation", "depicting", "nuclei", "(", "pale", "blue", ")", ",", "chromocenters", "(", "darker", "blue", ")", ",", "and", "γH2AX", "(", "yellow", "denotes", "foci", "associated", "with", "pericentric", "heterochromatin", ",", "otherwise", "foci", "are", "red", ")", ".", "Scale", "bar", "2", "µm", ".", "G", "FACS", "quantitation", "of", "WT", "and", "SirT7", "-", "/", "-", "MEF", "cells", "in", "S", "-", "phase", "after", "insult", "with", "10", "mM", "hydroxyurea", "(", "HU", ")", "for", "24", "hours", ".", "Cells", "were", "fixed", "and", "stained", "with", "7AAD", "and", "cell", "cycle", "was", "monitored", "by", "FACS", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "5", "samples", "per", "genotype", ")", ".", "H", ",", "I", "DNA", "fiber", "labeling", "analysis", "was", "used", "to", "assess", "DNA", "replication", "fork", "progression", "in", "passage", "3", "and", "passage", "6", "primary", "WT", "and", "SirT7", "-", "/", "-", "MEFs", ".", "(", "H", ")", "Representative", "images", "from", "cells", "labeled", "for", "20", "min", "with", "IdU", "(", "green", ")", "followed", "by", "20", "min", "of", "CldU", "(", "red", ")", ".", "(", "I", ")", "Quantitation", "of", "fork", "velocity", "(", "fiber", "length", "/", "labeling", "time", ";", "mean", "±", "SEM", ";", "3", "samples", "per", "genotype", "per", "condition", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "ANOVA", "Single", "Factor", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A Quantitation of neutral comet assays, using passage 3 WT and SirT7-/- primary MEFs, showing (left) the amount (%) of DNA in the tail and (right) the tail moment (see Fig S3A for representative images).B Western blot showing ATM and KAP1 phosphorylation and total protein levels in WT and SirT7-/- primary fibroblasts after IR (8Gy). ATM inhibitor (ATMi) KU-55933 was added 30 min prior to irradiation where indicated. One representative blot from 4 independent experiments is shown.C-F IF analysis of WT and SirT7-/- primary fibroblasts showing γH2AX dynamics after DNA damage induction. Cells were untreated (NoIR) or treated with 1Gy of X-rays (IR) and fixed at the indicated times post insult. Cells were pulsed with EdU (green) 30 min prior to fixation, then stained for γH2AX (red) and counterstained with DAPI (blue) (n>30 cells per group/mice; 3 mice per genotype). (C) Representative images of untreated S-phase (NoIR, EdU positive) WT and SirT7-/- nuclei (scale bar 5µm). (D) Quantitation of the number of γH2AX foci per nucleus at the indicated time points post IR (1Gy), and indicated cell cycle phases. (E) Quantitation of experiment described in (C) showing mean number of γH2AX foci per nucleus in euchromatic and heterochromatic regions at the indicated time points before and after IR in G2 (mean ± SEM from 3 independent experiments). Total γH2AX foci and γH2AX foci overlapping with or at the periphery of heterochromatic regions were enumerated. Nuclei and pericentric heterochromatin (chromocenters) were segmented by DAPI staining. Euchromatic numbers were estimated by subtracting the heterochromatic number of foci from the total foci number.(F) Representative images of WT and SirT7-/- primary fibroblasts in G2 phase showing γH2AX (red) and DAPI (blue) at the indicated period of time after IR. (Right) 3D rendering of the IF segmentation depicting nuclei (pale blue), chromocenters (darker blue), and γH2AX (yellow denotes foci associated with pericentric heterochromatin, otherwise foci are red). Scale bar 2 µm.G FACS quantitation of WT and SirT7-/- MEF cells in S-phase after insult with 10 mM hydroxyurea (HU) for 24 hours. Cells were fixed and stained with 7AAD and cell cycle was monitored by FACS (mean ± SEM; 5 samples per genotype).H, I DNA fiber labeling analysis was used to assess DNA replication fork progression in passage 3 and passage 6 primary WT and SirT7-/- MEFs. (H) Representative images from cells labeled for 20 min with IdU (green) followed by 20 min of CldU (red). (I) Quantitation of fork velocity (fiber length/labeling time; mean ± SEM; 3 samples per genotype per condition).*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 by ANOVA Single Factor."}
{"words": ["Figure", "5A", "-", "E", "IF", "analysis", "of", "WT", "and", "SirT7", "-", "/", "-", "primary", "fibroblasts", "after", "IR", "(", "1Gy", ")", "and", "1", "hour", "chase", ".", "Cells", "were", "pulsed", "with", "EdU", "30", "min", "prior", "to", "fixation", ",", "stained", "with", "antibodies", "against", "γH2AX", "and", "53BP1", "and", "then", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "scale", "bar", "5µm", ")", ".", "(", "A", ")", "Representative", "images", "from", "each", "cell", "cycle", "stage", "showing", "merge", "(", "top", "-", "left", ")", "including", "EdU", "(", "green", ")", ",", "53BP1", "(", "top", "-", "right", ",", "magenta", ")", ",", "γH2AX", "(", "bottom", "-", "left", ",", "red", ")", ",", "and", "3D", "rendering", "of", "reconstructed", "Z", "-", "stacks", "with", "53BP1", "foci", "modeled", "as", "spheres", "(", "bottom", "-", "right", ";", "pale", "-", "blue", ":", "nucleus", ";", "magenta", "spheres", ":", "53BP1", "foci", ")", ".", "(", "B", ")", "Quantitation", "of", "the", "number", "of", "53BP1", "foci", "per", "nucleus", ",", "and", "(", "C", ")", "mean", "volume", "of", "53BP1", "foci", "(", "n", ">", "30", "cells", "per", "group", "/", "mice", ";", "3", "mice", "per", "genotype", ")", ".", "(", "D", "-", "E", ")", "Same", "as", "in", "(", "B", "-", "C", ")", ",", "upon", "overexpression", "of", "SIRT7", "WT", "or", "catalytically", "inactive", "point", "mutant", "SIRT7", "-", "H188Y", "in", "WT", "and", "SirT7", "-", "/", "-", "primary", "fibroblasts", ".", "F", "Detection", "of", "endogenous", "chromatin", "-", "bound", "and", "nucleoplasmic", "53BP1", "protein", "from", "WT", "and", "SirT7", "-", "/", "-", "MEFs", "before", "and", "after", "IR", "(", "8Gy", ")", "by", "western", "blot", ".", "Histone", "H3", "was", "used", "as", "loading", "control", ",", "and", "tubulin", "as", "control", "for", "fractionation", ".", "G", "Same", "as", "(", "F", ")", ",", "using", "293T", "-", "REX", "cells", "treated", "with", "doxycycline", "or", "vehicle", "to", "induce", "SIRT7", "-", "HA", "expression", ".", "H", "ChIP", "-", "on", "break", "assay", ".", "(", "Top", ")", "Schematic", "of", "I", "-", "SceI", "substrate", "construct", "introduced", "into", "HT1080", "cells", ",", "which", "contains", "a", "single", "I", "-", "SceI", "site", "located", "within", "a", "puromycin", "resistance", "cassette", ".", "Shown", "along", "the", "top", "are", "the", "coordinates", "for", "amplicons", "probed", "by", "Q", "-", "PCR", ".", "(", "Bottom", ")", "53BP1", "enrichment", "at", "the", "indicated", "loci", "in", "Scramble", "control", "or", "SirT7", "knockdown", "cells", ".", "Q", "-", "PCR", "measurements", "were", "normalized", "to", "input", "DNA", "and", "non", "-", "I", "-", "SceI", "treated", "samples", "(", "No", "Cut", ")", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "one", "of", "two", "independent", "experiments", "shown", ")", ".", "(", "Bottom", "Right", ")", "western", "blot", "demonstrating", "efficient", "knockdown", "of", "SirT7", ",", "with", "Histone", "H3", "as", "a", "loading", "control", ".", "I", ",", "J", "NHEJ", "repair", "assay", "using", "GFP", "expression", "-", "based", "reporter", "system", "in", "SirT7", "-", "depleted", "HT1080", "cells", "(", "SirT7", "Knockdown", ")", "versus", "control", "(", "Scramble", "Control", ")", ".", "(", "I", ")", "Representative", "FACS", "dot", "plots", ".", "(", "J", ")", "Quantitation", "of", "(", "I", ")", ";", "mean", "±", "SEM", "of", "3", "independent", "clones", "per", "condition", ".", "Values", "are", "normalized", "to", "control", "(", "Scramble", "Control", "+", "I", "-", "SceI", ")", "mean", ".", "K", ",", "L", "Class", "-", "switch", "recombination", "in", "splenic", "B", "cells", "from", "WT", "and", "SirT7", "-", "/", "-", "mice", "stimulated", "with", "lipopolysaccharides", "(", "LPS", ")", "and", "interleukin", "4", "(", "IL4", ")", ".", "(", "K", ")", "The", "switching", "from", "IgM", "to", "IgG1", "(", "left", ")", "and", "to", "IgG3", "(", "right", ")", "was", "measured", "by", "FACS", ".", "(", "L", ")", "Quantitation", "of", "(", "K", ")", "showing", "mean", "±", "SEM", "of", "3", "-", "4", "samples", "per", "genotype", ".", "One", "representative", "experiment", "from", "two", "is", "shown", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "ANOVA", "Single", "Factor", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A-E IF analysis of WT and SirT7-/- primary fibroblasts after IR (1Gy) and 1 hour chase. Cells were pulsed with EdU 30 min prior to fixation, stained with antibodies against γH2AX and 53BP1 and then counterstained with DAPI (scale bar 5µm). (A) Representative images from each cell cycle stage showing merge (top-left) including EdU (green), 53BP1 (top-right, magenta), γH2AX (bottom-left, red), and 3D rendering of reconstructed Z-stacks with 53BP1 foci modeled as spheres (bottom-right; pale-blue: nucleus; magenta spheres: 53BP1 foci). (B) Quantitation of the number of 53BP1 foci per nucleus, and (C) mean volume of 53BP1 foci (n>30 cells per group/mice; 3 mice per genotype). (D-E) Same as in (B-C), upon overexpression of SIRT7 WT or catalytically inactive point mutant SIRT7-H188Y in WT and SirT7-/- primary fibroblasts.F Detection of endogenous chromatin-bound and nucleoplasmic 53BP1 protein from WT and SirT7-/- MEFs before and after IR (8Gy) by western blot. Histone H3 was used as loading control, and tubulin as control for fractionation.G Same as (F), using 293T-REX cells treated with doxycycline or vehicle to induce SIRT7-HA expression.H ChIP-on break assay. (Top) Schematic of I-SceI substrate construct introduced into HT1080 cells, which contains a single I-SceI site located within a puromycin resistance cassette. Shown along the top are the coordinates for amplicons probed by Q-PCR. (Bottom) 53BP1 enrichment at the indicated loci in Scramble control or SirT7 knockdown cells. Q-PCR measurements were normalized to input DNA and non-I-SceI treated samples (No Cut) (mean ± SEM; one of two independent experiments shown). (Bottom Right) western blot demonstrating efficient knockdown of SirT7, with Histone H3 as a loading control.I, J NHEJ repair assay using GFP expression-based reporter system in SirT7-depleted HT1080 cells (SirT7 Knockdown) versus control (Scramble Control). (I) Representative FACS dot plots. (J) Quantitation of (I); mean ± SEM of 3 independent clones per condition. Values are normalized to control (Scramble Control + I-SceI) mean.K, L Class-switch recombination in splenic B cells from WT and SirT7-/- mice stimulated with lipopolysaccharides (LPS) and interleukin 4 (IL4). (K) The switching from IgM to IgG1 (left) and to IgG3 (right) was measured by FACS. (L) Quantitation of (K) showing mean ± SEM of 3-4 samples per genotype. One representative experiment from two is shown.*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 by ANOVA Single Factor."}
{"words": ["Figure", "6A", ",", "B", "H3K18Ac", "IF", "in", "WT", "and", "SirT7", "-", "/", "-", "fibroblasts", ".", "Cells", "were", "pulsed", "with", "EdU", "(", "green", ")", ",", "stained", "with", "antibody", "against", "H3K18Ac", "(", "magenta", ")", "and", "then", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "(", "A", ")", "Representative", "IF", "images", "of", "late", "S", "-", "phase", "nuclei", "(", "EdU", "positive", ";", "scale", "bar", "5µm", ")", ".", "(", "B", ")", "Quantitation", "of", "(", "A", ")", "throughout", "the", "cell", "cycle", ".", "C", "Same", "as", "in", "(", "B", ")", ",", "in", "S", "-", "phase", "cells", "at", "the", "indicated", "times", "after", "IR", "(", "1Gy", ")", "(", "mean", "±", "SEM", "of", ">", "30", "cells", "per", "cell", "cycle", ",", "time", "point", ",", "and", "genotype", ")", ".", "D", "Laser", "-", "induced", "DNA", "damage", "in", "HT1080", "cells", "expressing", "HA", "-", "tagged", "SirT7", "stained", "with", "antibodies", "against", "γH2AX", "(", "red", ")", "and", "HA", "(", "green", ")", ",", "then", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", "30", "min", "post", "damage", "(", "scale", "bar", "3", "µm", ")", ".", "E", "ChIP", "assays", "of", "SIRT7", "enrichment", "at", "the", "indicated", "loci", "as", "described", "in", "Figure", "5H", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "one", "of", "two", "independent", "experiments", "is", "shown", ")", ".", "F", "Recruitment", "kinetics", "of", "GFP", "-", "tagged", "SirT7", "after", "laser", "-", "induced", "microirradiation", ".", "(", "Top", ")", "Representative", "cell", "at", "the", "indicated", "times", "after", "induction", "of", "DNA", "damage", "(", "white", "circle", ";", "scale", "bar", "2µm", ")", ".", "Images", "were", "adjusted", "to", "account", "for", "photobleaching", "by", "normalizing", "to", "nucleoplasmic", "background", "signal", ".", "(", "Middle", ")", "Quantitation", "of", "recruitment", "kinetics", "at", "the", "site", "of", "induced", "damage", "in", "the", "presence", "of", "5M", "KU", "-", "55933", "ATM", "inhibitor", "(", "ATMi", ")", ",", "10M", "Olaparib", "PARP", "inhibitor", "(", "PARPi", ")", ",", "or", "DMSO", ".", "KU", "-", "55933", "and", "Olaparib", "were", "added", "30", "min", "and", "1", "hour", "respectively", "prior", "to", "DNA", "damage", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "sample", "size", ":", "SIRT7", "-", "GFP", ",", "n", "=", "34", ";", "SIRT7", "-", "GFP", "+", "ATMi", ",", "n", "=", "36", ";", "SIRT7", "-", "GFP", "+", "PARPi", "=", "18", ")", ".", "(", "Bottom", ")", "Same", "as", "(", "middle", ")", "except", "quantitation", "of", "SIRT7", "-", "GFP", "relative", "intensity", "within", "the", "nucleolus", ".", "Data", "was", "acquired", "at", "five", "second", "intervals", "over", "a", "span", "of", "five", "min", ".", "G", "ChIP", "assays", "of", "H3K18Ac", "enrichment", "at", "the", "indicated", "loci", "as", "described", "in", "Figure", "5H", ".", "H3K18Ac", "enrichment", "adjacent", "to", "the", "induced", "DSB", "in", "control", "and", "SIRT7", "depleted", "cells", "(", "bottom", "left", ")", ",", "or", "in", "cells", "overexpressing", "SIRT7", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "PARP", "inhibitors", "(", "PARPi", ")", "(", "bottom", "right", ")", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "one", "of", "two", "independent", "experiments", "is", "shown", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "by", "ANOVA", "Single", "Factor", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A, B H3K18Ac IF in WT and SirT7-/- fibroblasts. Cells were pulsed with EdU (green), stained with antibody against H3K18Ac (magenta) and then counterstained with DAPI (blue). (A) Representative IF images of late S-phase nuclei (EdU positive; scale bar 5µm). (B) Quantitation of (A) throughout the cell cycle.C Same as in (B), in S-phase cells at the indicated times after IR (1Gy) (mean ± SEM of >30 cells per cell cycle, time point, and genotype).D Laser-induced DNA damage in HT1080 cells expressing HA-tagged SirT7 stained with antibodies against γH2AX (red) and HA (green), then counterstained with DAPI (blue) 30 min post damage (scale bar 3 µm).E ChIP assays of SIRT7 enrichment at the indicated loci as described in Figure 5H (mean ± SEM; one of two independent experiments is shown).F Recruitment kinetics of GFP-tagged SirT7 after laser-induced microirradiation. (Top) Representative cell at the indicated times after induction of DNA damage (white circle; scale bar 2µm). Images were adjusted to account for photobleaching by normalizing to nucleoplasmic background signal. (Middle) Quantitation of recruitment kinetics at the site of induced damage in the presence of 5M KU-55933 ATM inhibitor (ATMi), 10M Olaparib PARP inhibitor (PARPi), or DMSO. KU-55933 and Olaparib were added 30 min and 1 hour respectively prior to DNA damage (mean ± SEM; sample size: SIRT7-GFP, n=34; SIRT7-GFP + ATMi, n=36; SIRT7-GFP + PARPi=18). (Bottom) Same as (middle) except quantitation of SIRT7-GFP relative intensity within the nucleolus. Data was acquired at five second intervals over a span of five min.G ChIP assays of H3K18Ac enrichment at the indicated loci as described in Figure 5H. H3K18Ac enrichment adjacent to the induced DSB in control and SIRT7 depleted cells (bottom left), or in cells overexpressing SIRT7 in the presence or absence of PARP inhibitors (PARPi) (bottom right) (mean ± SEM; one of two independent experiments is shown).*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ****P < 0.0001 by ANOVA Single Factor."}
{"words": ["Figure", "7A", "-", "H", "NHEJ", "activity", "in", "HT1080", "or", "NIH3T3", "cells", "stably", "overexpressing", "H3", "-", "WT", ",", "H3", "-", "K18Q", "or", "H3", "-", "K18R", "(", "naive", ",", "acetylated", "or", "deacetylated", "H3K18", "residues", ",", "respectively", ")", ".", "A", "Random", "integration", "assay", "in", "HT1080", "cells", "using", "a", "linearized", "pSMCV", "vector", "containing", "a", "puromycin", "resistance", "cassette", "(", "mean", "number", "of", "puromycin", "resistant", "colonies", "normalized", "by", "plating", "efficiency", "±", "SEM", ";", "One", "representative", "transfection", "from", "3", "is", "shown", ")", ".", "B", "NHEJ", "repair", "assay", "using", "GFP", "expression", "-", "based", "reporter", "system", "described", "in", "Fig", "5I", "(", "mean", "±", "SEM", "of", "3", "independent", "experiments", ".", "See", "Fig", "EV5B", "for", "representative", "FACS", "dot", "plots", ")", ".", "C", "-", "D", "IF", "staining", "of", "NIH3T3", "cells", "after", "IR", "(", "1Gy", ")", "and", "1", "hour", "chase", ".", "Cells", "were", "pulsed", "with", "EdU", "30", "min", "prior", "to", "fixation", ",", "stained", "with", "antibodies", "against", "γH2AX", "and", "53BP1", ",", "and", "counterstained", "with", "DAPI", ".", "Representative", "images", "can", "be", "found", "in", "Fig", "EV5C", ".", "(", "C", ")", "Quantitation", "of", "the", "number", "of", "53BP1", "foci", "per", "nucleus", ",", "and", "(", "D", ")", "mean", "volume", "of", "53BP1", "foci", "(", "mean", "±", "SEM", "of", ">", "30", "cells", "per", "condition", "and", "cell", "cycle", "stage", ")", ".", "E", "Western", "blot", "analysis", "of", "53BP1", "in", "chromatin", "and", "non", "-", "chromatin", "fractions", "from", "NIH3T3", "cells", "expressing", "H3", "-", "WT", ",", "H3", "-", "K18Q", "or", "H3", "-", "K18R", "vectors", "and", "exposed", "to", "IR", "(", "10Gy", ")", ".", "One", "representative", "blot", "is", "shown", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "Shown", "is", "53BP1", ",", "GAPDH", "for", "fractionation", "control", ",", "and", "H3", "for", "loading", "control", ".", "F", "-", "H", "Same", "as", "in", "(", "C", "-", "D", ")", "except", "using", "antibodies", "against", "γH2AX", "(", "red", ")", "and", "RIF1", "(", "magenta", ")", ".", "(", "F", ")", "Representative", "images", "from", "cells", "in", "S", "-", "phase", "(", "EdU", "positive", ";", "scale", "bar", "5µm", ")", ".", "(", "G", ")", "Quantitation", "of", "the", "number", "of", "RIF1", "foci", "per", "nucleus", ",", "and", "(", "H", ")", "mean", "volume", "of", "RIF1", "foci", "(", "mean", "±", "SEM", "of", ">", "30", "cells", "per", "condition", "and", "cell", "cycle", "stage", ")", ".", "I", "53BP1", "enrichment", "at", "the", "indicated", "loci", "as", "described", "in", "Figure", "5H", "in", "Scramble", "control", "or", "SirT7", "knockdown", "cells", "expressing", "the", "indicated", "H3", "constructs", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "one", "of", "two", "independent", "experiments", ")", ".", "J", "Western", "blot", "analysis", "of", "chromatin", "fractions", "from", "primary", "WT", "and", "SirT7", "-", "/", "-", "MEFs", "expressing", "the", "indicated", "H3", "constructs", "and", "exposed", "to", "IR", "(", "10Gy", ")", ".", "Shown", "are", "levels", "of", "53BP1", ",", "SIRT7", ",", "H3", "-", "Myc", ",", "GAPDH", "for", "fractionation", "control", ",", "and", "H3", "for", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A-H NHEJ activity in HT1080 or NIH3T3 cells stably overexpressing H3-WT, H3-K18Q or H3-K18R (naive, acetylated or deacetylated H3K18 residues, respectively).A Random integration assay in HT1080 cells using a linearized pSMCV vector containing a puromycin resistance cassette (mean number of puromycin resistant colonies normalized by plating efficiency ± SEM; One representative transfection from 3 is shown).B NHEJ repair assay using GFP expression-based reporter system described in Fig 5I (mean ± SEM of 3 independent experiments. See Fig EV5B for representative FACS dot plots).C-D IF staining of NIH3T3 cells after IR (1Gy) and 1 hour chase. Cells were pulsed with EdU 30 min prior to fixation, stained with antibodies against γH2AX and 53BP1, and counterstained with DAPI. Representative images can be found in Fig EV5C. (C) Quantitation of the number of 53BP1 foci per nucleus, and (D) mean volume of 53BP1 foci (mean ± SEM of >30 cells per condition and cell cycle stage).E Western blot analysis of 53BP1 in chromatin and non-chromatin fractions from NIH3T3 cells expressing H3-WT, H3-K18Q or H3-K18R vectors and exposed to IR (10Gy). One representative blot is shown from 3 independent experiments. Shown is 53BP1, GAPDH for fractionation control, and H3 for loading control.F-H Same as in (C-D) except using antibodies against γH2AX (red) and RIF1 (magenta). (F) Representative images from cells in S-phase (EdU positive; scale bar 5µm). (G) Quantitation of the number of RIF1 foci per nucleus, and (H) mean volume of RIF1 foci (mean ± SEM of >30 cells per condition and cell cycle stage).I 53BP1 enrichment at the indicated loci as described in Figure 5H in Scramble control or SirT7 knockdown cells expressing the indicated H3 constructs (mean ± SEM; one of two independent experiments).J Western blot analysis of chromatin fractions from primary WT and SirT7-/- MEFs expressing the indicated H3 constructs and exposed to IR (10Gy). Shown are levels of 53BP1, SIRT7, H3-Myc, GAPDH for fractionation control, and H3 for loading control."}
{"words": ["Figure", "1Restriction", "enzyme", "diagnostic", "test", "for", "the", "presence", "of", "the", "R749H", "mutation", ".", "qRT", "-", "PCR", "with", "primers", "specific", "to", "both", "wild", "-", "type", "and", "mutant", "RNAPII", "(", "left", "panel", ")", "or", "to", "the", "mutant", "form", "of", "RNAPII", "(", "right", "panel", ")", ",", "confirming", "that", "only", "the", "slow", "version", "of", "RNAPII", "is", "expressed", "in", "homozygous", "slow", "/", "slow", "ESCs", ".", "The", "sequences", "of", "the", "respective", "forward", "primers", "are", "shown", ".", "The", "\"", "WT", "/", "slow", "allele", "\"", "primer", "is", "complementary", "to", "the", "sequence", "in", "exon", "14", "upstream", "of", "the", "mutation", ".", "The", "\"", "slow", "allele", "only", "\"", "primer", "has", "its", "3", "'", "end", "matching", "the", "mutated", "codon", "749", "and", "does", "not", "anneal", "to", "the", "WT", "DNA", "sequence", ".", "The", "mean", "±", "SEM", "is", "plotted", ",", "n", "=", "2", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Restriction enzyme diagnostic test for the presence of the R749H mutation.qRT-PCR with primers specific to both wild-type and mutant RNAPII (left panel) or to the mutant form of RNAPII (right panel), confirming that only the slow version of RNAPII is expressed in homozygous slow/slow ESCs. The sequences of the respective forward primers are shown. The \"WT/slow allele\" primer is complementary to the sequence in exon 14 upstream of the mutation. The \"slow allele only\" primer has its 3' end matching the mutated codon 749 and does not anneal to the WT DNA sequence. The mean ± SEM is plotted, n=2."}
{"words": ["Figure", "3Meta", "-", "gene", "profile", "of", "normalized", "4sU", "-", "DRB", "-", "seq", "reads", "in", "WT", "/", "WT", "and", "slow", "/", "slow", "ESCs", ".", "Density", "and", "violin", "plot", "of", "elongation", "rate", "(", "bases", "/", "min", ")", "calculated", "for", "genes", "common", "in", "all", "genotypes", "in", "WT", "/", "WT", ",", "WT", "/", "slow", "and", "slow", "/", "slow", "ESCs", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Meta-gene profile of normalized 4sU-DRB-seq reads in WT/WT and slow/slow ESCs.Density and violin plot of elongation rate (bases/min) calculated for genes common in all genotypes in WT/WT, WT/slow and slow/slow ESCs. Box"}
{"words": ["Figure", "4Brightfield", "images", "and", "analysis", "of", "NPC", "markers", "by", "immunofluorescence", "staining", "(", "Sox1", "and", "Nestin", ")", "or", "RT", "-", "qPCR", "(", "Nestin", "and", "Pax6", ")", "(", "n", "=", "3", ",", "mean", "±", "SEM", ")", ".", "Brightfield", "images", "of", "aggregates", ".", "Brightfield", "images", "and", "immunofluorescence", "staining", "for", "Nestin", "and", "neuronal", "marker", "Tuj1", "in", "NSC", "cultures", "grown", "in", "EGF", "/", "FGF", "proliferating", "conditions", ".", "White", "arrows", "indicate", "NSCs", "and", "green", "arrows", "differentiated", "cells", ".", "Two", "small", "panels", "on", "the", "right", "are", "examples", "of", "Tuj1", "+", "neuronal", "cells", "in", "slow", "/", "slow", "NSCs", "cultures", ".", "Immunofluorescence", "staining", "for", "neuronal", "marker", "Tuj1", "in", "neuronal", "cultures", "grown", "on", "poly", "-", "ornithine", "/", "laminin", "at", "21", "days", "of", "differentiation", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Brightfield images and analysis of NPC markers by immunofluorescence staining (Sox1 and Nestin) or RT-qPCR (Nestin and Pax6) (n=3, mean ±SEM).Brightfield images of aggregates.Brightfield images and immunofluorescence staining for Nestin and neuronal marker Tuj1 in NSC cultures grown in EGF/FGF proliferating conditions. White arrows indicate NSCs and green arrows differentiated cells. Two small panels on the right are examples of Tuj1+ neuronal cells in slow/slow NSCs cultures.Immunofluorescence staining for neuronal marker Tuj1 in neuronal cultures grown on poly-ornithine/laminin at 21 days of differentiation."}
{"words": ["Figure", "5RT", "-", "PCR", "analysis", "validation", "of", "selected", "alternatively", "spliced", "exons", ".", "RT", "-", "PCR", "was", "performed", "on", "total", "RNA", "from", "WT", "or", "slow", "/", "slow", "ESCs", ",", "NPCs", "or", "neurons", ".", "PCR", "products", "were", "visualized", "and", "quantified", "by", "Bioanalyzer", "(", "Agilent", ")", ".", "Images", "are", "representative", "of", "experiments", "performed", "in", "triplicate", ".", "Themean", "±", "SEMis", "plotted", "with", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "*", "*", "<", "0", ".", "0001", "as", "determined", "by", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5RT-PCR analysis validation of selected alternatively spliced exons. RT-PCR was performed on total RNA from WT or slow/slow ESCs, NPCs or neurons. PCR products were visualized and quantified by Bioanalyzer (Agilent). Images are representative of experiments performed in triplicate. Themean ± SEMis plotted with *p-value<0.05, **p<0.005, ***<0.0001 as determined by t-test."}
{"words": ["Figure", "6Box", "plot", "showing", "the", "length", "of", "upregulated", "(", "UP", ")", ",", "downregulated", "(", "DOWN", ")", ",", "not", "affected", "genes", "(", "ALL", ")", ",", "and", "pre", "-", "mRNAs", "affected", "by", "alternative", "splicing", "(", "AE", ",", "for", "Alternative", "exons", ")", "for", "ESCs", "(", "left", "panel", ")", ";", "length", "of", "upregulated", "(", "UP", ")", ",", "downregulated", "(", "DOWN", ")", ",", "not", "affected", "genes", "(", "ALL", ")", ",", "pre", "-", "mRNAs", "affected", "by", "alternative", "splicing", "(", "AE", ",", "for", "Alternative", "exons", ")", ",", "and", "not", "affected", "genes", "that", "are", "only", "expressed", "in", "neurons", "(", "but", "not", "in", "ESCs", ")", "(", "ALL", "_", "notESC", ")", ",", "for", "Neurons", "(", "right", "panel", ")", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "p", "-", "value", ">", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "as", "determined", "by", "Mann", "-", "Whitney", "t", "-", "test", ".", "Boxes", "delimit", "the", "first", "and", "third", "quartiles", ".", "The", "horizontal", "lines", "represent", "the", "data", "medians", ".", "Whiskers", "are", "drawn", "down", "to", "the", "1st", "and", "99th", "percentile", ".", "Percentage", "of", "genes", "that", "are", "downregulated", "in", "ESCs", "and", "neurons", ";", "plotted", "as", "a", "sliding", "window", "of", "100", " ", "genes", "by", "length", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Box plot showing the length of upregulated (UP), downregulated (DOWN), not affected genes (ALL), and pre-mRNAs affected by alternative splicing (AE, for Alternative exons) for ESCs (left panel); length of upregulated (UP), downregulated (DOWN), not affected genes (ALL), pre-mRNAs affected by alternative splicing (AE, for Alternative exons), and not affected genes that are only expressed in neurons (but not in ESCs) (ALL_notESC), for Neurons (right panel). n.s., p-value>0.05, **p<0.005; ****p<0.0001 as determined by Mann-Whitney t-test. Boxes delimit the first and third quartiles. The horizontal lines represent the data medians. Whiskers are drawn down to the 1st and 99th percentile. Percentage of genes that are downregulated in ESCs and neurons; plotted as a sliding window of 100 genes by length."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Number", "of", "cell", "corpses", "at", "the", "L1", "stage", "of", "development", "per", "100", "animals", "carrying", "the", "neurotoxic", "mec", "‐", "4", "(", "d", ")", "or", "deg", "‐", "3", "(", "d", ")", "alleles", "in", "SNT", "‐", "1", "‐", "deficient", "mutants", ".", "For", "mec", "‐", "4", "(", "d", ")", "mutant", "animals", ",", "bars", "denote", "touch", "receptor", "neuron", "corpses", ".", "For", "deg", "‐", "3", "(", "d", ")", "mutants", ",", "bars", "denote", "inner", "labial", "neuron", "1", "(", "L1", ")", "sensory", "neuron", "and", "PVC", "interneuron", "corpses", ".", "(", "B", ")", "Expression", "of", "a", "full", "‐", "length", "MEC", "‐", "4", ":", ":", "GFP", "reporter", "fusion", "under", "the", "control", "of", "the", "mec", "‐", "4", "promoter", "in", "touch", "receptor", "neurons", "of", "wild", "‐", "type", ",", "snt", "‐", "1", "and", "unc", "‐", "57", "mutant", "animals", ".", "Representative", "photos", "of", "touch", "receptor", "neuron", "cell", "bodies", "are", "shown", ".", "Bar", "denotes", "6", "μm", ".", "The", "quantification", "(", "%", ")", "of", "GFP", "signal", "intensity", "from", "the", "animals", "examined", "is", "graphed", "below", "(", "n", "=", "100", "neurons", "per", "assay", ";", "P0", ".", "05", "compared", "with", "wild", "type", ";", "t", "‐", "test", ")", ".", "(", "C", ")", "Percentage", "of", "SNT", "‐", "1", "‐", "deficient", "animals", "that", "survive", "near", "‐", "lethal", "treatment", "with", "sodium", "azide", ".", "This", "chemical", "inhibits", "the", "activity", "of", "the", "respiratory", "electron", "transport", "complex", "IV", "(", "cytochrome", "C", "oxidase", ")", "and", "simulates", "hypoxia", ".", "(", "D", ")", "Number", "of", "touch", "receptor", "neuron", "corpses", ",", "at", "the", "L1", "stage", "of", "development", ",", "per", "100", "animals", "carrying", "the", "neurotoxic", "mec", "-", "4", "(", "d", ")", "or", "deg", "‐", "3", "(", "d", ")", "alleles", "in", "UNC", "‐", "57", "‐", "deficient", "animals", ".", "(", "E", ")", "Percentage", "of", "UNC", "‐", "57", "‐", "deficient", "animals", "that", "survive", "after", "the", "hypoxia", "‐", "inducing", "treatment", "with", "sodium", "azide", ".", "(", "F", ")", "Number", "of", "touch", "receptor", "neuron", "corpses", ",", "at", "the", "L1", "stage", "of", "development", ",", "per", "100", "animals", "carrying", "the", "neurotoxic", "mec", "‐", "4", "(", "d", ")", "or", "deg", "‐", "3", "(", "d", ")", "alleles", "together", "with", "lesions", "in", "genes", "encoding", "key", "proteins", "that", "participate", "in", "all", "four", "steps", "of", "clathrin", "‐", "mediated", "endocytosis", ".", "UNC", "‐", "11", "and", "DPY", "‐", "23", "are", "adaptor", "proteins", "required", "for", "the", "formation", "of", "clathrin", "‐", "coated", "pits", ",", "DYN", "‐", "1", "is", "a", "GTPase", "necessary", "for", "fission", "of", "clathrin", "‐", "coated", "vesicles", "and", "UNC", "‐", "26", "participates", "in", "the", "uncoating", "of", "vesicles", ".", "Error", "bars", "denote", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "values", "(", "n", ">", "250", "for", "all", "populations", "examined", ";", "P0", ".", "001", ",", "compared", "with", "wild", "‐", "type", "animals", ",", "unpaired", "t", "‐", "test", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Number of cell corpses at the L1 stage of development per 100 animals carrying the neurotoxic mec‐4(d) or deg‐3(d) alleles in SNT‐1‐deficient mutants. For mec‐4(d) mutant animals, bars denote touch receptor neuron corpses. For deg‐3(d)mutants, bars denote inner labial neuron 1 (L1) sensory neuron and PVC interneuron corpses.(B) Expression of a full‐length MEC‐4::GFP reporter fusion under the control of the mec‐4 promoter in touch receptor neurons of wild‐type, snt‐1 and unc‐57 mutant animals. Representative photos of touch receptor neuron cell bodies are shown. Bar denotes 6 μm. The quantification (%) of GFP signal intensity from the animals examined is graphed below (n=100 neurons per assay; P0.05 compared with wild type; t‐test).(C) Percentage of SNT‐1‐deficient animals that survive near‐lethal treatment with sodium azide. This chemical inhibits the activity of the respiratory electron transport complex IV (cytochrome C oxidase) and simulates hypoxia.(D) Number of touch receptor neuron corpses, at the L1 stage of development, per 100 animals carrying the neurotoxic mec-4(d) or deg‐3(d) alleles in UNC‐57‐deficient animals.(E) Percentage of UNC‐57‐deficient animals that survive after the hypoxia‐inducing treatment with sodium azide.(F) Number of touch receptor neuron corpses, at the L1 stage of development, per 100 animals carrying the neurotoxic mec‐4(d) or deg‐3(d) alleles together with lesions in genes encoding key proteins that participate in all four steps of clathrin‐mediated endocytosis. UNC‐11 and DPY‐23 are adaptor proteins required for the formation of clathrin‐coated pits, DYN‐1 is a GTPase necessary for fission of clathrin‐coated vesicles and UNC‐26 participates in the uncoating of vesicles. Error bars denote s.e.m. values (n>250 for all populations examined; P0.001, compared with wild‐type animals, unpaired t‐test)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Confocal", "images", "of", "touch", "receptor", "neurons", "expressing", "a", "pmec", "‐", "17APS", "‐", "2GFP", "reporter", "transgene", ".", "During", "early", "necrosis", ",", "the", "number", "of", "APS", "‐", "2", ":", ":", "GFP", "puncta", ",", "corresponding", "to", "clathrin", "‐", "coated", "pits", "and", "vesicles", ",", "in", "touch", "receptor", "neurons", "ofmec", "‐", "4", "(", "d", ")", "animals", "does", "not", "change", "significantly", ",", "whereas", "at", "later", "stages", "it", "decreases", ".", "A", "similar", "decrease", "is", "also", "observed", "in", "unc", "‐", "57", "(", "e1190", ")", "mutants", ",", "defective", "for", "clathrin", "‐", "mediated", "endocytosis", ".", "(", "B", ")", "Confocal", "images", "of", "touch", "receptor", "neurons", "expressing", "a", "pmec", "‐", "7GFP", ":", ":", "RAB", "‐", "5", "reporter", "transgene", ".", "The", "number", "of", "fluorescent", "puncta", "that", "correspond", "to", "early", "endosomes", "in", "touch", "receptor", "neurons", "of", "mec", "‐", "4", "(", "d", ")", "animals", "significantly", "increases", "during", "early", "necrosis", ",", "whereas", "it", "declines", "later", ".", "(", "C", ")", "Confocal", "images", "of", "touch", "receptor", "neurons", "expressing", "a", "pmec", "‐", "7GFP", ":", ":", "RAB", "‐", "11", "reporter", "transgene", ".", "The", "number", "of", "GFP", ":", ":", "RAB", "‐", "11", "puncta", "that", "correspond", "to", "recycling", "endosomes", "in", "touch", "receptor", "neurons", "of", "mec", "‐", "4", "(", "d", ")", "animals", "increases", "early", "during", "cell", "death", ",", "while", "it", "declines", "as", "degeneration", "proceeds", ".", "Both", "early", "and", "recycling", "endosomes", "tend", "to", "accumulate", "around", "a", "swollen", "structure", "that", "is", "probably", "the", "nucleus", ".", "Bars", "denote", "4", "μm", ".", "Error", "bars", "denote", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "values", "(", "n", ">", "250", "for", "all", "populations", "examined", ";", "P0", ".", "001", ",", "compared", "with", "control", "animals", ",", "unpaired", "t", "‐", "test", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Confocal images of touch receptor neurons expressing a pmec‐17APS‐2GFP reporter transgene. During early necrosis, the number of APS‐2::GFP puncta, corresponding to clathrin‐coated pits and vesicles, in touch receptor neurons ofmec‐4(d) animals does not change significantly, whereas at later stages it decreases. A similar decrease is also observed in unc‐57(e1190) mutants, defective for clathrin‐mediated endocytosis.(B) Confocal images of touch receptor neurons expressing a pmec‐7GFP::RAB‐5 reporter transgene. The number of fluorescent puncta that correspond to early endosomes in touch receptor neurons of mec‐4(d) animals significantly increases during early necrosis, whereas it declines later.(C) Confocal images of touch receptor neurons expressing a pmec‐7GFP::RAB‐11 reporter transgene. The number of GFP::RAB‐11 puncta that correspond to recycling endosomes in touch receptor neurons of mec‐4(d) animals increases early during cell death, while it declines as degeneration proceeds. Both early and recycling endosomes tend to accumulate around a swollen structure that is probably the nucleus. Bars denote 4 μm. Error bars denote s.e.m. values (n>250 for all populations examined; P0.001, compared with control animals, unpaired t‐test)."}
{"words": ["Figure", "3Endocytosis", "functions", "together", "with", "lysosomal", "proteolysis", "to", "facilitate", "necrotic", "cell", "death", ".", "(", "A", ")", "Depletion", "of", "synaptotagmin", "(", "SNT", "‐", "1", ")", "or", "endophilin", "(", "UNC", "‐", "57", ")", "does", "not", "further", "suppress", "MEC", "‐", "4", "(", "d", ")", "‐", "induced", "necrosis", "in", "cad", "‐", "1", "mutants", "with", "reduced", "cathepsin", "activity", "or", "with", "V", "‐", "ATPase", "dysfunction", "(", "B", ",", "C", ")", ".", "Similarly", ",", "no", "synthetic", "reduction", "of", "necrotic", "cell", "death", "is", "observed", "in", "calpain", "‐", "deficient", "animals", "that", "also", "carry", "lesions", "in", "the", "synaptotagmin", "(", "D", ")", "or", "endophilin", "(", "E", ")", "genes", ".", "Error", "bars", "denote", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "values", "(", "n", ">", "250", "for", "all", "populations", "examined", ";", "P", ">", "0", ".", "5", ",", "compared", "with", "single", "mutant", "control", "animals", ",", "unpaired", "t", "‐", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Endocytosis functions together with lysosomal proteolysis to facilitate necrotic cell death. (A) Depletion of synaptotagmin (SNT‐1) or endophilin (UNC‐57) does not further suppress MEC‐4(d)‐induced necrosis in cad‐1 mutants with reduced cathepsin activity or with V‐ATPase dysfunction (B, C).Similarly, no synthetic reduction of necrotic cell death is observed in calpain‐deficient animals that also carry lesions in the synaptotagmin (D) or endophilin (E) genes. Error bars denote s.e.m. values (n>250 for all populations examined; P>0.5, compared with single mutant control animals, unpaired t‐test)."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Synaptotagmin", "(", "SNT", "‐", "1", ")", "deficiency", "further", "suppresses", "MEC", "‐", "4", "(", "d", ")", "‐", "induced", "necrosis", "in", "animals", "with", "impaired", "autophagy", ".", "(", "B", ")", "Endophilin", "dysfunction", "enhances", "suppression", "of", "necrosis", "in", "mec", "‐", "4", "(", "d", ")", ";", "lgg", "‐", "1", "(", "RNAi", ")", "animals", ",", "where", "autophagy", "is", "impaired", ".", "Error", "bars", "denote", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "values", "(", "n", ">", "250", "for", "all", "populations", "examined", ";", "P0", ".", "01", ",", "compared", "with", "single", "mutant", "control", "animals", ",", "unpaired", "t", "‐", "test", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Synaptotagmin (SNT‐1) deficiency further suppresses MEC‐4(d)‐induced necrosis in animals with impaired autophagy.(B) Endophilin dysfunction enhances suppression of necrosis in mec‐4(d);lgg‐1(RNAi) animals, where autophagy is impaired. Error bars denote s.e.m. values (n>250 for all populations examined; P0.01, compared with single mutant control animals, unpaired t‐test)."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Depletion", "of", "the", "kinesin", "1", "heavy", "chain", "UNC", "‐", "116", "suppresses", "necrosis", "induced", "by", "both", "mec", "‐", "4", "(", "d", ")", "and", "deg", "‐", "3", "(", "d", ")", "toxic", "alleles", ".", "(", "B", ")", "Expression", "of", "a", "full", "‐", "length", "MEC", "‐", "4", ":", ":", "GFP", "reporter", "fusion", "under", "the", "control", "of", "the", "mec", "‐", "4", "promoter", "in", "touch", "receptor", "neurons", "of", "wild", "‐", "type", ",", "unc", "‐", "116", "and", "unc", "‐", "104", "mutant", "animals", ".", "Representative", "photos", "of", "touch", "receptor", "neuron", "cell", "bodies", "are", "shown", ".", "Bar", "denotes", "6", "μm", ".", "The", "quantification", "(", "%", ")", "of", "GFP", "signal", "intensity", "from", "the", "animals", "examined", "is", "graphed", "below", "(", "n", "=", "100", "neurons", "per", "assay", ";", "P0", ".", "05", "compared", "with", "wild", "type", ";", "t", "‐", "test", ")", ".", "(", "C", ")", "Percentage", "of", "unc", "‐", "116", "animals", "that", "survive", "after", "treatment", "with", "sodium", "azide", ".", "(", "D", ")", "Depletion", "of", "the", "monomeric", "kinesin", "UNC", "‐", "104", "protects", "neurons", "against", "MEC", "‐", "4", "(", "d", ")", "‐", "induced", "degeneration", ".", "(", "E", ")", "unc", "‐", "104", "mutant", "animals", "are", "more", "resistant", "to", "hypoxic", "death", "induced", "by", "sodium", "azide", ".", "(", "F", ")", "Combined", "inactivation", "of", "endocytosis", "and", "kinesin", "‐", "mediated", "intracellular", "trafficking", "does", "not", "enhance", "protection", "of", "touch", "receptor", "neurons", "against", "MEC", "‐", "4", "(", "d", ")", "‐", "induced", "degeneration", ".", "Error", "bars", "denote", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "values", "(", "n", ">", "250", "for", "all", "populations", "examined", ";", "P0", ".", "001", ",", "compared", "with", "control", "animals", ",", "unpaired", "t", "‐", "test", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Depletion of the kinesin 1 heavy chain UNC‐116 suppresses necrosis induced by both mec‐4(d) and deg‐3(d) toxic alleles.(B) Expression of a full‐length MEC‐4::GFP reporter fusion under the control of the mec‐4 promoter in touch receptor neurons of wild‐type, unc‐116 and unc‐104 mutant animals. Representative photos of touch receptor neuron cell bodies are shown. Bar denotes 6 μm. The quantification (%) of GFP signal intensity from the animals examined is graphed below (n=100 neurons per assay; P0.05 compared with wild type; t‐test).(C) Percentage of unc‐116 animals that survive after treatment with sodium azide.(D) Depletion of the monomeric kinesin UNC‐104 protects neurons against MEC‐4(d)‐induced degeneration.(E) unc‐104 mutant animals are more resistant to hypoxic death induced by sodium azide.(F) Combined inactivation of endocytosis and kinesin‐mediated intracellular trafficking does not enhance protection of touch receptor neurons against MEC‐4(d)‐induced degeneration. Error bars denote s.e.m. values (n>250 for all populations examined; P0.001, compared with control animals, unpaired t‐test)."}
{"words": ["Figure", "6Genetic", "interaction", "between", "kinesin", "‐", "mediated", "intracellular", "trafficking", "and", "cellular", "proteolytic", "pathways", "mediating", "necrotic", "cell", "death", ".", "Dysfunction", "of", "either", "kinesin", "1", "heavy", "chain", "(", "UNC", "‐", "116", ")", "or", "the", "monomeric", "kinesin", "UNC", "‐", "104", "does", "not", "significantly", "enhance", "suppression", "of", "neurodegeneration", "in", "aspartyl", "protease", "‐", "deficient", "mutant", "animals", "(", "A", ",", "B", ")", ",", "in", "animals", "with", "compromised", "lysosomal", "acidification", "(", "C", ",", "D", ")", ",", "or", "in", "calpain", "protease", "‐", "deficient", "mutants", "animals", "(", "E", ",", "F", ")", ".", "Error", "bars", "denote", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "values", "(", "n", ">", "250", "for", "all", "populations", "examined", ";", "P", ">", "0", ".", "5", ",", "compared", "with", "single", "mutant", "control", "animals", ",", "unpaired", "t", "‐", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Genetic interaction between kinesin‐mediated intracellular trafficking and cellular proteolytic pathways mediating necrotic cell death. Dysfunction of either kinesin 1 heavy chain (UNC‐116) or the monomeric kinesin UNC‐104 does not significantly enhance suppression of neurodegeneration in aspartyl protease‐deficient mutant animals (A, B), in animals with compromised lysosomal acidification (C, D), or in calpain protease‐deficient mutants animals (E, F). Error bars denote s.e.m. values (n>250 for all populations examined; P>0.5, compared with single mutant control animals, unpaired t‐test)."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Kinesin", "1", "heavy", "chain", "(", "UNC", "‐", "116", ")", "deficiency", ".", "(", "B", ")", "Monomeric", "kinesin", "UNC", "‐", "104", "deficiency", ".", "In", "both", "cases", ",", "no", "significant", "synthetic", "protection", "of", "neurons", "is", "observed", "in", "LGG", "‐", "1", "/", "LC3", "‐", "depleted", "animals", "with", "impaired", "autophagy", ".", "Error", "bars", "denote", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "values", "(", "n", ">", "250", "for", "all", "populations", "examined", ";", "P", ">", "0", ".", "5", ",", "compared", "with", "single", "mutant", "control", "animals", ",", "unpaired", "t", "‐", "test", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Kinesin 1 heavy chain (UNC‐116) deficiency.(B) Monomeric kinesin UNC‐104 deficiency. In both cases, no significant synthetic protection of neurons is observed in LGG‐1/LC3‐depleted animals with impaired autophagy. Error bars denote s.e.m. values (n>250 for all populations examined; P>0.5, compared with single mutant control animals, unpaired t‐test)."}
{"words": ["Figure", "1A", "Normalized", "firefly", "luciferase", "luminescence", "(", "compared", "to", "renilla", "luciferase", ")", "as", "a", "function", "of", "external", "IAA", "concentration", ".", "Arabidopsis", "protoplast", "cells", "were", "transiently", "transformed", "with", "either", "AtPIN1", "or", "GFP", "(", "in", "the", "case", "of", "the", "control", ")", "both", "under", "the", "control", "of", "a", "constitutive", "CaMV", "35S", "promoter", ".", "Where", "indicated", ",", "10", "µM", "NPA", "was", "added", ".", "B", "Normalized", "firefly", "luciferase", "luminescence", "(", "compared", "to", "renilla", "luciferase", ")", "as", "a", "function", "of", "external", "NPA", "concentration", "in", "the", "presence", "of", "100nM", "IAA", "in", "control", "GFP", "-", "(", "blue", "or", "red", ")", "or", "PIN1", "-", "(", "green", "or", "purple", ")", "transformed", "protoplasts", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A Normalized firefly luciferase luminescence (compared to renilla luciferase) as a function of external IAA concentration. Arabidopsis protoplast cells were transiently transformed with either AtPIN1 or GFP (in the case of the control) both under the control of a constitutive CaMV 35S promoter. Where indicated, 10 µM NPA was added. B Normalized firefly luciferase luminescence (compared to renilla luciferase) as a function of external NPA concentration in the presence of 100nM IAA in control GFP- (blue or red) or PIN1- (green or purple) transformed protoplasts. "}
{"words": ["Figure", "2A", ",", "B", "Native", "PAGE", "separation", "reveals", "distinct", "detergent", "-", "sensitive", "PIN1", "-", "complexes", ".", "Plasma", "membrane", "preparations", "from", "dark", "grown", "Arabidopsis", "cell", "suspension", "cultures", "were", "solubilized", "with", "(", "a", ")", "Complexiolyte", "27", "(", "a", "mixture", "of", "ionic", "and", "non", "-", "ionic", "detergents", ")", ",", "and", "(", "b", ")", "Complexiolyte", "47", "(", "lower", "stringency", ",", "non", "-", "ionic", "detergent", ")", ",", "(", "both", "Logopharm", ")", ";", "first", "dimension", "BN", "-", "PAGE", ",", "second", "dimension", "SDS", "-", "PAGE", ",", "blots", "stained", "with", "anti", "-", "PIN1", "antibody", "revealing", "distinct", "PIN1", "complex", "populations", "at", "the", "indicated", "positions", ".", "Values", "are", "given", "in", "KDa", ".", "c", ")", "Molecular", "abundance", "(", "abundancenormspec", "values", "calculated", "as", "summarized", "peptide", "PVs", "divided", "by", "the", "number", "of", "MS", "-", "accessible", "protein", "specific", "amino", "acids", ")", "of", "PIN", "subunits", "and", "ABCB19", "in", "anti", "-", "GFP", "affinity", "purification", "of", "CL47", "-", "solubilized", "PIN1", "-", "GFP", "-", "expressing", "roots", "with", "a", "GFP", "-", "specific", "DARPin", ".", "Note", "the", "significant", "heteromerization", "of", "several", "endogenous", "PINs", "with", "PIN1", "-", "GFP", "and", "the", "absence", "of", "other", "abundant", "interaction", "partners", "(", "ABC19B", "shown", "as", "an", "example", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A, B Native PAGE separation reveals distinct detergent-sensitive PIN1-complexes. Plasma membrane preparations from dark grown Arabidopsis cell suspension cultures were solubilized with (a) Complexiolyte 27 (a mixture of ionic and non-ionic detergents), and (b) Complexiolyte 47 (lower stringency, non-ionic detergent), (both Logopharm); first dimension BN-PAGE, second dimension SDS-PAGE, blots stained with anti-PIN1 antibody revealing distinct PIN1 complex populations at the indicated positions. Values are given in KDa.c) Molecular abundance (abundancenormspec values calculated as summarized peptide PVs divided by the number of MS-accessible protein specific amino acids) of PIN subunits and ABCB19 in anti-GFP affinity purification of CL47-solubilized PIN1-GFP-expressing roots with a GFP-specific DARPin. Note the significant heteromerization of several endogenous PINs with PIN1-GFP and the absence of other abundant interaction partners (ABC19B shown as an example)."}
{"words": ["Figure", "3a", ")", "BN", "-", "PAGE", "was", "performed", "with", "PIN1", "-", "containing", "microsomes", "prepared", "from", "either", "PIN1", "-", "expressing", "HEK293T", "cells", "or", "a", "dark", "-", "grown", "Arabidopsis", "cell", "suspension", "culture", ".", "Prior", "to", "solubilization", "with", "1", "%", "dodecyl", "maltoside", ",", "microsomes", "were", "incubated", "with", "either", "10", "µM", "NPA", "or", "10", "µM", "quercetin", ".", "b", ")", "PIN1", "dimer", "stability", "induced", "by", "NPA", "after", "expression", "in", "HEK", "cells", ".", "Relative", "distribution", "between", "monomer", "and", "dimer", "after", "NPA", "treatment", "is", "given", "relative", "to", "distribution", "of", "untreated", "samples", "after", "solubilization", "with", "50", "%", "(", "v", "/", "v", ")", "CL27", ".", "Each", "measurement", "given", "(", "three", "for", "each", "concentration", ")", "represents", "the", "mean", "of", "three", "gel", "lanes", "for", "wild", "type", "(", "circles", ")", "or", "triple", "S2523", ",", "S253E", ",", "S261E", "phosphomimetic", "sequences", "(", "crosses", ")", "(", "example", "images", "are", "given", "in", "the", "figure", "inset", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3a) BN-PAGE was performed with PIN1-containing microsomes prepared from either PIN1-expressing HEK293T cells or a dark-grown Arabidopsis cell suspension culture. Prior to solubilization with 1% dodecyl maltoside, microsomes were incubated with either 10 µM NPA or 10 µM quercetin.b) PIN1 dimer stability induced by NPA after expression in HEK cells. Relative distribution between monomer and dimer after NPA treatment is given relative to distribution of untreated samples after solubilization with 50% (v/v) CL27. Each measurement given (three for each concentration) represents the mean of three gel lanes for wild type (circles) or triple S2523, S253E, S261E phosphomimetic sequences (crosses) (example images are given in the figure inset)."}
{"words": ["Figure", "4a", ")", "Summed", "2D", "projections", "of", "PLA", "interactions", "(", "left", ")", "and", "co", "-", "localisation", "(", "right", ")", "(", "n", "=", "3", ")", "between", "PIN1", "and", "PIN4", "laterally", "bisected", "2D", "-", "projected", "heat", "map", ".", "Treatments", "as", "indicated", ".", "b", ")", "Quantification", "of", "positive", "PLA", "interactions", ".", "n", ".", "t", "(", "no", "treatment", ")", "and", "10µM", "NPA", ",", "n", "=", "4", ";", "10µM", "IAA", "and", "10µM", "IAA", "+", "10µM", "NPA", ";", "n", "=", "3", ".", "Error", "bars", "indicate", "standard", "deviation", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4a) Summed 2D projections of PLA interactions (left) and co-localisation (right) (n=3) between PIN1 and PIN4 laterally bisected 2D-projected heat map. Treatments as indicated. b) Quantification of positive PLA interactions. n.t (no treatment) and 10µM NPA, n=4; 10µM IAA and 10µM IAA+ 10µM NPA; n=3. Error bars indicate standard deviation. "}
{"words": ["Figure", "5a", ")", "Microsomes", "from", "HEK293", "cells", "expressing", "PIN1", "-", "RFP", "were", "separated", "under", "native", "conditions", "in", "the", "presence", "of", "NPA", "or", "an", "anti", "-", "PIN1", "Fab", "fragment", ".", "1", ")", "PIN1", "-", "RFP", ",", "2", ")", "PIN1", "-", "RFP", "+", "Fab", ",", "3", ")", "PIN1", "-", "RFP", "+", "10", "µM", "NPA", ",", "4", ")", "PIN1", "-", "RFP", "+", "Fab", "+", "10", "µM", "NPA", ",", "5", ")", "PIN1", "-", "RFP", "+", "10", "µM", "Quercetin", "(", "Q", ")", ",", "6", ")", "PIN1", "-", "RFP", "+", "Fab", "+", "10", "µM", "Quercetin", "(", "Q", ")", ".", "Protein", "complexes", "were", "solubilized", "and", "separated", "under", "native", "conditions", "as", "described", "before", ".", "Western", "blots", "were", "performed", "with", "an", "anti", "-", "RFP", "monoclonal", "antibody", ".", "b", ")", "Fourteen", "-", "day", "-", "old", "Arabidopsis", "seedlings", "(", "wild", "type", ",", "brown", ";", "pPIN1", ":", ":", "Mab9B2", ";", "blue", ")", "grown", "on", "AM", "containing", "0", ".", "2", "µM", "NPA", ".", "Scale", "bar", "=", "1", "cm", ".", "c", ")", "NPA", "-", "affected", "lateral", "root", "density", "of", "nine", "-", "day", "-", "old", "Arabidopsis", "seedlings", "expressing", "Mab9B2", "scFv", "fragments", "(", "wild", "type", "sample", "sizes", "were", "between", "16", "and", "21", "plants", ";", "Mab9B2", "sample", "sizes", "were", "between", "12", "and", "31", "plants", ")", ".", "Bars", "indicate", "standard", "error", ".", "d", ")", "NPA", "-", "affected", "apical", "hook", "angle", "in", "dark", "-", "grown", "three", "-", "day", "-", "old", "Arabidopsis", "seedlings", "expressing", "Mab9B2", "scFv", "fragments", ".", "(", "wild", "type", "sample", "sizes", "were", "between", "38", "and", "50", "plants", ";", "Mab9B2", "sample", "sizes", "were", "between", "33", "and", "45", "plants", ")", ".", "e", ")", "Gravitropic", "curvature", "in", "four", "-", "day", "old", "Arabidopsis", "seedlings", "expressing", "Mab9B2", "scFv", "fragments", ".", "(", "wild", "type", "sample", "sizes", "were", "between", "15", "and", "21", "plants", ";", "Mab9B2", "sample", "sizes", "were", "between", "14", "and", "20", "plants", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5a) Microsomes from HEK293 cells expressing PIN1-RFP were separated under native conditions in the presence of NPA or an anti-PIN1 Fab fragment. 1) PIN1-RFP, 2) PIN1-RFP+Fab, 3) PIN1-RFP+10 µM NPA, 4) PIN1-RFP+Fab+10 µM NPA, 5) PIN1-RFP + 10 µM Quercetin (Q), 6) PIN1-RFP+Fab+10 µM Quercetin (Q). Protein complexes were solubilized and separated under native conditions as described before. Western blots were performed with an anti-RFP monoclonal antibody.b) Fourteen-day-old Arabidopsis seedlings (wild type, brown; pPIN1::Mab9B2; blue) grown on AM containing 0.2 µM NPA. Scale bar = 1 cm.c) NPA-affected lateral root density of nine-day-old Arabidopsis seedlings expressing Mab9B2 scFv fragments (wild type sample sizes were between 16 and 21 plants; Mab9B2 sample sizes were between 12 and 31 plants). Bars indicate standard error.d) NPA-affected apical hook angle in dark-grown three-day-old Arabidopsis seedlings expressing Mab9B2 scFv fragments. (wild type sample sizes were between 38 and 50 plants; Mab9B2 sample sizes were between 33 and 45 plants). e) Gravitropic curvature in four-day old Arabidopsis seedlings expressing Mab9B2 scFv fragments. (wild type sample sizes were between 15 and 21 plants; Mab9B2 sample sizes were between 14 and 20 plants)."}
{"words": ["Figure", "1A", ")", "Auto", "-", "Ub", "of", "recombinant", "CHN", "-", "1", "and", "CHN", "-", "1", "-", "UFD", "-", "2", "was", "carried", "out", "using", "the", "E2", "UBE2D1", ".", "Time", "-", "dependent", "(", "0", ",", "10", ",", "20", ",", "40", ",", "80", ",", "120", "min", ")", "CHN", "-", "1", "auto", "-", "Ub", "was", "performed", "as", "indicated", "using", "wild", "-", "type", "ubiquitin", ".", "Protein", "samples", "were", "resolved", "via", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "CHN", "-", "1", "antibodies", ".", "Below", ",", "a", "graph", "representing", "the", "nmol", "of", "ubiquitylated", "CHN", "-", "1", "vs", ".", "time", "for", "CHN", "-", "1", "alone", "(", "black", ")", "or", "CHN", "-", "1", "+", "UFD", "-", "2", "(", "cyan", ")", ".", "Plotted", "data", "are", "the", "mean", "of", "three", "technical", "replicates", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "standard", "error", "of", "measurement", "(", "SEM", ")", ";", "statistical", "and", "significance", "was", "determined", "using", "Pearson", "correlation", "coefficients", "which", "define", "the", "statistical", "relation", "between", "two", "continuous", "variables", "[", "CHN", "-", "1", "vs", "Time", ",", "CHN", "-", "1", "+", "UFD", "-", "2", "vs", "Time", ",", "and", "CHN", "-", "1", "vs", "CHN", "-", "1", "+", "UFD", "-", "2", "with", "increasing", "time", "]", ".", "B", ")", "CHN", "-", "1", "auto", "-", "Ub", "was", "performed", "in", "the", "presence", "of", "UFD", "-", "2", "with", "the", "increasing", "molar", "concentration", "as", "indicated", ".", "Protein", "samples", "were", "resolved", "via", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "CHN", "-", "1", "antibodies", ".", "Right", ",", "signal", "quantification", "of", "the", "unmodified", "CHN", "-", "1", "(", "yellow", ")", ",", "ubiquitylated", "fraction", "<", "70", "kDa", "(", "cyan", ")", "and", ">", "70", "kDa", "(", "magenta", ")", ",", "plotted", "as", "a", "percentage", "of", "different", "CHN", "-", "1", "species", "present", "in", "the", "indicated", "condition", ".", "Plotted", "data", "are", "the", "mean", "from", "the", "three", "technical", "replicates", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "SEM", ";", "statistical", "significance", "was", "determined", "using", "a", "two", "-", "way", "ANOVA", "test", ".", "(", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ")", "C", ")", "Auto", "-", "Ub", "was", "performed", "as", "indicated", "using", "recombinant", "CHN", "-", "1", "and", "UFD", "-", "2P951A", ",", "UBE2D1", "E2", ",", "UbWT", ",", "UbNoK", ",", "or", "Ub", "with", "substitutions", "of", "lysines", "29", ",", "48", ",", "and", "63", "to", "arginines", "(", "Ub3KTR", ")", ".", "Protein", "samples", "were", "resolved", "via", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "CHN", "-", "1", "antibodies", ".", "E", ")", "CHN", "-", "1", "auto", "-", "Ub", "was", "performed", "in", "the", "presence", "of", "recombinant", "C", ".", "elegans", "UFD", "-", "2", "and", "S", ".", "cerevisiae", "Ufd", "-", "2p", "and", "UBE2D1", ".", "Protein", "samples", "were", "resolved", "via", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "CHN", "-", "1", "antibodies", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A) Auto-Ub of recombinant CHN-1 and CHN-1-UFD-2 was carried out using the E2 UBE2D1. Time-dependent (0, 10, 20, 40, 80, 120 min) CHN-1 auto-Ub was performed as indicated using wild-type ubiquitin. Protein samples were resolved via SDS-PAGE and immunoblotted with anti-CHN-1 antibodies. Below, a graph representing the nmol of ubiquitylated CHN-1 vs. time for CHN-1 alone (black) or CHN-1+UFD-2 (cyan). Plotted data are the mean of three technical replicates. Error bars represent the standard error of measurement (SEM); statistical and significance was determined using Pearson correlation coefficients which define the statistical relation between two continuous variables [CHN-1 vs Time, CHN-1+UFD-2 vs Time, and CHN-1 vs CHN-1+UFD-2 with increasing time].B) CHN-1 auto-Ub was performed in the presence of UFD-2 with the increasing molar concentration as indicated. Protein samples were resolved via SDS-PAGE and immunoblotted with anti-CHN-1 antibodies. Right, signal quantification of the unmodified CHN-1 (yellow), ubiquitylated fraction <70 kDa (cyan) and >70 kDa (magenta), plotted as a percentage of different CHN-1 species present in the indicated condition. Plotted data are the mean from the three technical replicates. Error bars represent the SEM; statistical significance was determined using a two-way ANOVA test. (**P < 0.01)C) Auto-Ub was performed as indicated using recombinant CHN-1 and UFD-2P951A, UBE2D1 E2, UbWT, UbNoK, or Ub with substitutions of lysines 29, 48, and 63 to arginines (Ub3KTR). Protein samples were resolved via SDS-PAGE and immunoblotted with anti-CHN-1 antibodies.E) CHN-1 auto-Ub was performed in the presence of recombinant C. elegans UFD-2 and S. cerevisiae Ufd-2p and UBE2D1. Protein samples were resolved via SDS-PAGE and immunoblotted with anti-CHN-1 antibodies."}
{"words": ["Figure", "2B", ")", "CHN", "-", "1", "auto", "-", "Ub", "was", "performed", "as", "indicated", "using", "increasing", "molar", "concentrations", "(", "0", ".", "5", ",", "1", ",", "2", ",", "3", ",", "4", "µM", ")", "of", "UBE2D1", "without", "and", "with", "a", "complexing", "equimolar", "concentration", "(", "1", ":", "1", ")", "of", "recombinant", "CHN", "-", "1", "and", "UFD", "-", "2P951A", "(", "1", ".", "5", "µM", "CHN", "-", "1", "with", "1", ".", "5", "µM", "of", "recombinant", "UFD", "-", "2P951A", ")", ".", "Protein", "samples", "were", "resolved", "via", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "CHN", "-", "1", "antibodies", ".", "Right", ",", "a", "graph", "representing", "the", "nmol", "of", "ubiquitylated", "CHN", "-", "1", "vs", ".", "UBE2D1", "(", "µM", ")", "for", "CHN", "-", "1", "alone", "(", "black", ")", "or", "CHN", "-", "1", "+", "UFD", "-", "2P951A", "(", "cyan", ")", ".", "Plotted", "data", "are", "the", "mean", "from", "the", "three", "technical", "replicates", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "SEM", ";", "statistical", "significance", "was", "determined", "using", "Pearson", "correlation", "coefficients", "which", "define", "the", "statistical", "relation", "between", "two", "continuous", "variables", "[", "nmol", "of", "ubiquitylated", "CHN", "-", "1", "vs", "UBE2D1", "(", "µM", ")", "in", "the", "presence", "of", "CHN", "-", "1", "or", "CHN", "-", "1", "+", "UFD", "-", "2P951A", "and", "CHN", "-", "1", "vs", "CHN", "-", "1", "+", "UFD", "-", "2P951A", "with", "increasing", "UBE2D1", "(", "µM", ")", "]", ".", "C", ")", "Discharging", "assay", "of", "Ub", "-", "charged", "UBE2D1", "was", "carried", "out", "in", "the", "presence", "of", "CHN", "-", "1", "or", "CHN", "-", "1", "-", "UFD", "-", "2P951A", ".", "The", "experimental", "sample", "was", "run", "together", "with", "the", "control", "with", "and", "without", "a", "reducing", "agent", "(", "50", "mM", "DTT", ")", ".", "The", "reaction", "was", "stopped", "after", "30", "min", "by", "boiling", "the", "samples", "in", "1x", "SDS", "sample", "buffer", ".", "Proteins", "were", "resolved", "via", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "UBE2D1", "antibodies", ".", "Below", ",", "quantification", "of", "uncharged", "UBE2D1", "plotted", "as", "the", "uncharged", "UBE2D1", "fraction", "vs", ".", "UBE2D1", "-", "Ub", "(", "µM", ")", ".", "The", "graph", "representing", "the", "UBE2D1", "fraction", "vs", ".", "UBE2D1", "-", "Ub", "(", "µM", ")", "for", "CHN", "-", "1", "alone", "(", "black", ")", "or", "CHN", "-", "1", "+", "UFD", "-", "2P951A", "(", "cyan", ")", "and", "Plotted", "data", "are", "the", "mean", "of", "three", "technical", "replicates", ".", "Significance", "was", "determined", "using", "Pearson", "correlation", "coefficients", "which", "define", "the", "statistical", "relation", "between", "two", "continuous", "variables", "[", "UBE2D1", "vs", "UBE2D1", "-", "Ub", "(", "µM", ")", "in", "the", "presene", "of", "CHN", "-", "1", "or", "CHN", "-", "1", "+", "UFD", "-", "2P951A", "and", "CHN", "-", "1", "vs", "CHN", "-", "1", "+", "UFD", "-", "2P951A", "with", "increasing", "UBE2D1", "-", "Ub", "(", "µM", ")", "]", ".", "D", ")", "CHN", "-", "1", "auto", "-", "Ub", "was", "performed", "as", "indicated", "in", "the", "presence", "of", "Ube2W", "-", "Ub", "or", "Ube2W", "-", "UbFLAG", "without", "and", "with", "equimolar", "concentration", "of", "recombinant", "CHN", "-", "1", "and", "UFD", "-", "2P951A", ".", "Protein", "samples", "were", "resolved", "via", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "CHN", "-", "1", "antibodies", ".", "For", "each", "sample", ",", "the", "quantified", "relative", "signal", "after", "probing", "the", "blot", "using", "anti", "-", "CHN", "-", "1", "antibodies", "is", "shown", "as", "a", "ratio", "above", "the", "respective", "signal", ".", "Below", ",", "a", "schematic", "of", "the", "CHN", "-", "1", "-", "UbFLAG", "(", "cyan", ")", ",", "CHN", "-", "1", "-", "Ub", "(", "magenta", ")", ",", "and", "unmodified", "CHN", "-", "1", "signal", "(", "black", ")", "presented", "as", "the", "ratio", "and", "the", "signal", "fold", "change", "between", "CHN", "-", "1", "and", "CHN", "-", "1", "-", "UFD", "-", "2P951A", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B) CHN-1 auto-Ub was performed as indicated using increasing molar concentrations (0.5, 1, 2, 3, 4 µM) of UBE2D1 without and with a complexing equimolar concentration (1:1) of recombinant CHN-1 and UFD-2P951A (1.5 µM CHN-1 with 1.5 µM of recombinant UFD-2P951A). Protein samples were resolved via SDS-PAGE and immunoblotted with anti-CHN-1 antibodies. Right, a graph representing the nmol of ubiquitylated CHN-1 vs. UBE2D1 (µM) for CHN-1 alone (black) or CHN-1+UFD-2P951A (cyan). Plotted data are the mean from the three technical replicates. Error bars represent the SEM; statistical significance was determined using Pearson correlation coefficients which define the statistical relation between two continuous variables [nmol of ubiquitylated CHN-1 vs UBE2D1(µM) in the presence of CHN-1 or CHN-1+UFD-2P951A and CHN-1 vs CHN-1+UFD-2P951A with increasing UBE2D1(µM)].C) Discharging assay of Ub-charged UBE2D1 was carried out in the presence of CHN-1 or CHN-1-UFD-2P951A. The experimental sample was run together with the control with and without a reducing agent (50 mM DTT). The reaction was stopped after 30 min by boiling the samples in 1x SDS sample buffer. Proteins were resolved via SDS-PAGE and immunoblotted with anti-UBE2D1 antibodies. Below, quantification of uncharged UBE2D1 plotted as the uncharged UBE2D1 fraction vs. UBE2D1-Ub (µM). The graph representing the UBE2D1 fraction vs. UBE2D1-Ub (µM) for CHN-1 alone (black) or CHN-1+UFD-2P951A (cyan) and Plotted data are the mean of three technical replicates. Significance was determined using Pearson correlation coefficients which define the statistical relation between two continuous variables [UBE2D1 vs UBE2D1-Ub(µM) in the presene of CHN-1 or CHN-1+UFD-2P951A and CHN-1 vs CHN-1+UFD-2P951A with increasing UBE2D1-Ub(µM)].D) CHN-1 auto-Ub was performed as indicated in the presence of Ube2W-Ub or Ube2W-UbFLAG without and with equimolar concentration of recombinant CHN-1 and UFD-2P951A. Protein samples were resolved via SDS-PAGE and immunoblotted with anti-CHN-1 antibodies. For each sample, the quantified relative signal after probing the blot using anti-CHN-1 antibodies is shown as a ratio above the respective signal. Below, a schematic of the CHN-1-UbFLAG (cyan), CHN-1-Ub (magenta), and unmodified CHN-1 signal (black) presented as the ratio and the signal fold change between CHN-1 and CHN-1-UFD-2P951A."}
{"words": ["Figure", "3A", ")", "Auto", "-", "Ub", "of", "recombinant", "CHN", "-", "1", "using", "UBE2D1", "was", "performed", "alone", "or", "complexed", "with", "UFD", "-", "2", "in", "the", "presence", "of", "recombinant", "DAF", "-", "21", ",", "DAF", "-", "21ΔEEVD", ",", "HSP", "-", "1", ",", "or", "HSP", "-", "1ΔEEVD", ".", "Protein", "samples", "were", "resolved", "via", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "CHN", "-", "1", "antibodies", ".", "B", ")", "Top", ",", "schematics", "of", "the", "HSP", "-", "1", "peptide", "sequence", "(", "cyan", ")", "aligned", "with", "the", "C", "-", "terminal", "sequence", "of", "full", "-", "length", "HSP", "-", "1", "(", "amino", "acids", "600", "-", "640", ")", "used", "in", "the", "ubiquitylation", "reaction", ".", "Auto", "-", "Ub", "of", "recombinant", "CHN", "-", "1", "was", "performed", "as", "indicated", "HSP", "-", "1", "‑", "derived", "peptide", ".", "Protein", "samples", "were", "resolved", "via", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "CHN", "-", "1", "antibodies", ".", "Right", ",", "quantification", "of", "the", "CHN", "-", "1", "modifications", "(", "unmodified", ",", "multi", "-", "monoubiquitylated", ",", "poly", "-", "ubiquitylated", ")", "when", "CHN", "-", "1", "alone", "(", "black", ")", "or", "CHN", "-", "1", "+", "HSP", "-", "1", "peptide", "(", "cyan", ")", ".", "Plotted", "data", "are", "the", "mean", "of", "three", "technical", "replicates", ".", "C", ")", "Top", ",", "schematics", "of", "the", "UFD", "-", "2", "peptide", "sequences", "aligned", "with", "the", "C", "-", "terminal", "sequence", "of", "full", "-", "length", "UFD", "-", "2", "(", "UFD", "-", "2", "amino", "acids", "864", "-", "914", ")", "for", "PEPTIDE", "1", "(", "yellow", ")", "and", "PEPTIDE", "2", "(", "cyan", ")", "and", "(", "UFD", "-", "2", "amino", "acids", "648", "-", "678", ")", "for", "PEPTIDE", "3", "(", "magenta", ")", "used", "in", "the", "ubiquitylation", "reaction", ".", "Below", ",", "auto", "-", "Ub", "of", "recombinant", "CHN", "-", "1", "was", "performed", "as", "indicated", "in", "the", "presence", "of", "UFD", "-", "2", "‑", "derived", "peptides", ".", "Protein", "samples", "were", "resolved", "via", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "CHN", "-", "1", "antibodies", ".", "Right", ",", "quantification", "of", "the", "CHN", "-", "1", "modifications", "(", "unmodified", ",", "multi", "-", "monoubiquitylated", ",", "poly", "-", "ubiquitylated", ")", "when", "CHN", "-", "1", "alone", "(", "black", ")", ",", "CHN", "-", "1", "+", "PEPTIDE", "1", "(", "yellow", ")", ",", "CHN", "-", "1", "+", "PEPTIDE", "2", "(", "cyan", ")", ",", "or", "CHN", "-", "1", "+", "PEPTIDE", "3", "(", "magenta", ")", ".", "Plotted", "data", "are", "the", "mean", "of", "three", "technical", "replicates", ".", "D", ")", "Auto", "-", "Ub", "of", "recombinant", "CHN", "-", "1", "was", "performed", "as", "indicated", "in", "the", "presence", "of", "recombinant", "HSP", "-", "1", "or", "HSP", "-", "1EEYD", ".", "Protein", "samples", "were", "resolved", "via", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "CHN", "-", "1", "antibodies", ".", "E", ")", "Auto", "-", "Ub", "of", "recombinant", "CHN", "-", "1", "was", "performed", "as", "indicated", "alone", "or", "with", "UFD", "-", "2", "or", "UFD", "-", "2EEVD", ".", "Protein", "samples", "were", "resolved", "via", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "CHN", "-", "1", "antibodies", ".", "F", ")", "CHN", "-", "1R230A", "auto", "-", "Ub", "was", "performed", "as", "indicated", "in", "the", "presence", "of", "recombinant", "UFD", "-", "2", "and", "HSP", "-", "1", ".", "Protein", "samples", "were", "resolved", "via", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "CHN", "-", "1", "antibodies", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A) Auto-Ub of recombinant CHN-1 using UBE2D1 was performed alone or complexed with UFD-2 in the presence of recombinant DAF-21, DAF-21ΔEEVD, HSP-1, or HSP-1ΔEEVD. Protein samples were resolved via SDS-PAGE and immunoblotted with anti-CHN-1 antibodies.B) Top, schematics of the HSP-1 peptide sequence (cyan) aligned with the C-terminal sequence of full-length HSP-1 (amino acids 600-640) used in the ubiquitylation reaction. Auto-Ub of recombinant CHN-1 was performed as indicated HSP-1‑derived peptide. Protein samples were resolved via SDS-PAGE and immunoblotted with anti-CHN-1 antibodies. Right, quantification of the CHN-1 modifications (unmodified, multi-monoubiquitylated, poly-ubiquitylated) when CHN-1 alone (black) or CHN-1+HSP-1 peptide (cyan). Plotted data are the mean of three technical replicates.C) Top, schematics of the UFD-2 peptide sequences aligned with the C-terminal sequence of full-length UFD-2 (UFD-2 amino acids 864-914) for PEPTIDE 1 (yellow) and PEPTIDE 2 (cyan) and (UFD-2 amino acids 648-678) for PEPTIDE 3 (magenta) used in the ubiquitylation reaction. Below, auto-Ub of recombinant CHN-1 was performed as indicated in the presence of UFD-2‑derived peptides. Protein samples were resolved via SDS-PAGE and immunoblotted with anti-CHN-1 antibodies. Right, quantification of the CHN-1 modifications (unmodified, multi-monoubiquitylated, poly-ubiquitylated) when CHN-1 alone (black), CHN-1+PEPTIDE 1 (yellow), CHN-1+PEPTIDE 2 (cyan), or CHN-1+PEPTIDE 3 (magenta). Plotted data are the mean of three technical replicates.D) Auto-Ub of recombinant CHN-1 was performed as indicated in the presence of recombinant HSP-1 or HSP-1EEYD. Protein samples were resolved via SDS-PAGE and immunoblotted with anti-CHN-1 antibodies.E) Auto-Ub of recombinant CHN-1 was performed as indicated alone or with UFD-2 or UFD-2EEVD. Protein samples were resolved via SDS-PAGE and immunoblotted with anti-CHN-1 antibodies.F) CHN-1R230A auto-Ub was performed as indicated in the presence of recombinant UFD-2 and HSP-1. Protein samples were resolved via SDS-PAGE and immunoblotted with anti-CHN-1 antibodies."}
{"words": ["Figure", "4A", ")", "To", "detect", "CHN", "-", "1", "and", "UFD", "-", "2", ",", "indicated", "lysates", "of", "young", "adult", "worms", "were", "subjected", "to", "immunoblotting", "with", "anti", "-", "CHN", "-", "1", "and", "anti", "-", "UFD", "-", "2", "antibodies", ".", "Tubulin", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "Right", ",", "quantification", "of", "the", "CHN", "-", "1", "signals", "normalized", "to", "tubulin", "levels", "and", "plotted", "as", "N2", "(", "wild", "-", "type", ";", "black", ")", ",", "ufd", "-", "2", "(", "tm1380", ")", "(", "cyan", ")", ",", "and", "UFD", "-", "2P951A", "(", "magenta", ")", ".", "Plotted", "data", "are", "the", "mean", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "B", ")", "CHN", "-", "1", "protein", "levels", "were", "determined", "in", "the", "indicated", "lysates", "of", "young", "adult", "worms", "treated", "with", "a", "proteasome", "inhibitor", "(", "MG", "-", "132", ",", "10µM", ")", "and", "DUB", "inhibitor", "(", "NEM", ",", "100mM", ")", ".", "Tubulin", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "Right", ",", "quantification", "of", "the", "CHN", "-", "1", "signals", "normalized", "to", "tubulin", "levels", "plotted", "as", "control", "(", "black", ")", ",", "or", "MG", "-", "132", "treated", "(", "magenta", ")", "in", "N2", "(", "wild", "-", "type", ")", "and", "ufd", "-", "2", "(", "tm1380", ")", ".", "Plotted", "data", "are", "the", "mean", "of", "three", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A) To detect CHN-1 and UFD-2, indicated lysates of young adult worms were subjected to immunoblotting with anti-CHN-1 and anti-UFD-2 antibodies. Tubulin served as a loading control. Right, quantification of the CHN-1 signals normalized to tubulin levels and plotted as N2 (wild-type; black), ufd-2(tm1380) (cyan), and UFD-2P951A (magenta). Plotted data are the mean of three biological replicates.B) CHN-1 protein levels were determined in the indicated lysates of young adult worms treated with a proteasome inhibitor (MG-132, 10µM) and DUB inhibitor (NEM, 100mM). Tubulin served as a loading control. Right, quantification of the CHN-1 signals normalized to tubulin levels plotted as control (black), or MG-132 treated (magenta) in N2 (wild-type) and ufd-2(tm1380). Plotted data are the mean of three biological replicates."}
{"words": ["Figure", "5B", ")", "Ubiquitylation", "of", "recombinant", "AHCY", "-", "1", "was", "performed", "as", "indicated", ".", "Protein", "samples", "were", "resolved", "via", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "AHCY", "-", "1", "antibodies", ".", "Right", ",", "quantification", "of", "the", "AHCY", "-", "1", "modifications", "(", "unmodified", ",", "oligo", "-", "monoubiquitylated", ",", "poly", "-", "ubiquitylated", ")", "when", "CHN", "-", "1", "alone", "(", "black", ")", ",", "CHN", "-", "1", "-", "UFD", "-", "2", "(", "magenta", ")", ",", "or", "CHN", "-", "1", "-", "UFD", "-", "2EEVD", "(", "cyan", ")", ".", "Plotted", "data", "are", "the", "mean", "of", "three", "technical", "replicates", ".", "C", ")", "Protein", "level", "of", "endogenous", "AHCY", "-", "1", "in", "N2", "(", "wild", "-", "type", ")", ",", "chn", "-", "1", "(", "by155", ")", ",", "CHN", "-", "1", "OE", ",", "and", "ufd", "-", "2", "(", "tm1380", ")", "young", "adult", "worms", "treated", "with", "the", "proteasome", "inhibitor", "(", "MG", "-", "132", ",", "10", "µM", ")", "and", "DUB", "inhibitor", "(", "NEM", ",", "100", "mM", ")", ".", "Protein", "samples", "were", "resolved", "via", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "AHCY", "-", "1", "antibodies", ".", "Tubulin", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "Right", ",", "quantification", "of", "the", "modified", "AHCY", "-", "1", "signals", "plotted", "as", "Ub", "-", "modified", "AHCY", "-", "1", "species", "normalized", "to", "unmodified", "endogenous", "AHCY", "-", "1", "signal", "and", "plotted", "for", "N2", "(", "wild", "-", "type", ";", "black", ")", ",", "chn", "-", "1", "(", "by155", ")", "(", "magenta", ")", ",", "CHN", "-", "1", "OE", "(", "yellow", ")", ",", "and", "ufd", "-", "2", "(", "tm1380", ")", "(", "cyan", ")", ".", "Plotted", "data", "are", "the", "mean", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "D", ")", "Representative", "images", "of", "GFP", ":", ":", "AHCY", "-", "1", "fluorescence", "in", "chn", "-", "1", "(", "by155", ")", ",", "ufd", "-", "2", "(", "tm1380", ")", ",", "and", "CHN", "-", "1", "OE", "background", ".", "Scale", "bar", "=", "200µm", ".", "Below", ",", "quantification", "of", "the", "AHCY", "-", "1", "GFP", "signal", "plotted", "as", "fluorescence", "intensity", "for", "GFP", ":", ":", "AHCY", "-", "1", "expressing", "worms", "(", "control", ";", "black", ")", ",", "chn", "-", "1", "(", "by155", ")", "(", "magenta", ")", ",", "ufd", "-", "2", "(", "tm1380", ")", "(", "cyan", ")", "or", "CHN", "-", "1", "OE", "(", "yellow", ")", ".", "Plotted", "data", "are", "the", "mean", "of", "three", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5B) Ubiquitylation of recombinant AHCY-1 was performed as indicated. Protein samples were resolved via SDS-PAGE and immunoblotted with anti-AHCY-1 antibodies. Right, quantification of the AHCY-1 modifications (unmodified, oligo-monoubiquitylated, poly-ubiquitylated) when CHN-1 alone (black), CHN-1-UFD-2 (magenta), or CHN-1-UFD-2EEVD (cyan). Plotted data are the mean of three technical replicates.C) Protein level of endogenous AHCY-1 in N2 (wild-type), chn-1(by155), CHN-1 OE, and ufd-2(tm1380) young adult worms treated with the proteasome inhibitor (MG-132, 10 µM) and DUB inhibitor (NEM, 100 mM). Protein samples were resolved via SDS-PAGE and immunoblotted with anti-AHCY-1 antibodies. Tubulin served as a loading control. Right, quantification of the modified AHCY-1 signals plotted as Ub-modified AHCY-1 species normalized to unmodified endogenous AHCY-1 signal and plotted for N2 (wild-type; black), chn-1(by155) (magenta), CHN-1 OE (yellow), and ufd-2(tm1380) (cyan). Plotted data are the mean of three biological replicates.D) Representative images of GFP::AHCY-1 fluorescence in chn-1(by155), ufd-2(tm1380), and CHN-1 OE background. Scale bar = 200µm. Below, quantification of the AHCY-1 GFP signal plotted as fluorescence intensity for GFP::AHCY-1 expressing worms (control; black), chn-1(by155) (magenta), ufd-2(tm1380) (cyan) or CHN-1 OE (yellow). Plotted data are the mean of three biological replicates."}
{"words": ["figf1a", ",", "Protein", "extracts", "from", "drpr", "null", "(", "w", ";", "drpr", "∆", "5", "/", "drpr", "∆", "5", ")", "pupae", "at", "puparium", "formation", "(", "0", "h", ")", "and", "wild", "-", "type", "(", "Canton", "-", "S", ")", "salivary", "glands6", "h", ",", "12", "h", "and", "14", "h", "after", "puparium", "formation", ",", "analysed", "by", "western", "blotting", "with", "anti", "-", "Drpr", "antibody", ".", "b", ",", "Samples", "from", "control", "animals", "(", "+", "/", "w", ";", "+", "/", "drpr", "∆", "5", ")", ",", "n", "=", "12", ",", "and", "drpr", "null", "mutants", "(", "w", ";", "drpr", "∆", "5", "/", "drpr", "∆", "5", ")", ",", "n", "=", "47", ",", "analysed", "by", "histology", "for", "the", "presence", "of", "salivary", "gland", "material", "(", "red", "circles", ")", "24", " ", "h", "after", "puparium", "formation", ".", "c", ",", "Quantification", "of", "data", "from", "b", "and", "d", ".", "d", ",", "Samples", "from", "control", "animals", "(", "+", "/", "w", ";", "+", "/", "UAS", "-", "drprIR", ")", ",", "n", "=", "11", ",", "and", "those", "with", "salivary", "gland", "-", "specific", "knockdown", "of", "drpr", "(", "fkh", "-", "Gal4", "/", "w", ";", "UAS", "-", "drprIR", "/", "+", ")", ",", "n", "=", "19", ",", "analysed", "by", "histology", "for", "the", "presence", "of", "salivary", "gland", "material", "(", "red", "circles", ")", "24", " ", "h", "after", "puparium", "formation", ".", "e", ",", "Control", "animals", "(", "+", "/", "w", ";", "+", "/", "UAS", "-", "drpr", "-", "IIR", ")", ",", "n", "=", "9", ",", "and", "those", "with", "salivary", "gland", "-", "specific", "knockdown", "of", "drpr", "-", "I", "(", "fkh", "-", "Gal4", "/", "w", ";", "UAS", "-", "drpr", "-", "IIR", "/", "+", ")", ",", "n", "=", "20", ",", "analysed", "by", "histology", "for", "the", "presence", "of", "salivary", "gland", "material", "(", "red", "circles", ")", "24", " ", "h", "after", "puparium", "formation", ".", "f", ",", "Quantification", "of", "data", "from", "e", ".", "g", ",", "Samples", "from", "drpr", "null", "animals", "(", "+", "/", "w", ";", "+", "/", "UAS", "-", "Drpr", "-", "I", ";", "drpr", "∆", "5", "/", "drpr", "∆", "5", ")", ",", "n", "=", "9", ",", "and", "those", "with", "salivary", "gland", "-", "specific", "expression", "of", "Drpr", "-", "I", "(", "fkh", "-", "Gal4", "/", "w", ";", "UAS", "-", "Drpr", "-", "I", "/", "+", ";", "drpr", "∆", "5", "/", "drpr", "∆", "5", ")", ",", "n", "=", "20", ",", "analysed", "by", "histology", "for", "the", "presence", "of", "salivary", "gland", "material", "(", "red", "circles", ")", "24", " ", "h", "after", "puparium", "formation", ".", "h", ",", "Quantification", "of", "data", "from", "g", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf1a, Protein extracts from drpr null (w; drpr∆5/drpr∆5) pupae at puparium formation (0 h) and wild-type (Canton-S) salivary glands6 h, 12 h and 14 h after puparium formation, analysed by western blotting with anti-Drpr antibody.b, Samples from control animals (+/w; +/drpr∆5), n = 12, and drpr null mutants (w; drpr∆5/drpr∆5), n = 47, analysed by histology for the presence of salivary gland material (red circles) 24 h after puparium formation. c, Quantification of data from b and d. d, Samples from control animals (+/w; +/UAS-drprIR), n = 11, and those with salivary gland-specific knockdown of drpr (fkh-Gal4/w; UAS-drprIR/+), n = 19, analysed by histology for the presence of salivary gland material (red circles) 24 h after puparium formation.e, Control animals (+/w; +/UAS-drpr-IIR), n = 9, and those with salivary gland-specific knockdown of drpr-I (fkh-Gal4/w; UAS-drpr-IIR/+), n = 20, analysed by histology for the presence of salivary gland material (red circles) 24 h after puparium formation. f, Quantification of data from e.g, Samples from drpr null animals (+/w; +/UAS-Drpr-I; drpr∆5/drpr∆5), n = 9, and those with salivary gland-specific expression of Drpr-I (fkh-Gal4/w; UAS-Drpr-I/+; drpr∆5/drpr∆5), n = 20, analysed by histology for the presence of salivary gland material (red circles) 24 h after puparium formation. h, Quantification of data from g."}
{"words": ["figf2a", ",", "Samples", "from", "animals", "with", "salivary", "gland", "-", "specific", "expression", "of", "p35", "(", "fkh", "-", "Gal4", "/", "+", ";", "UAS", "-", "p35", "/", "+", ")", ",", "n", "=", "18", "(", "left", ")", ",", "drpr", "null", "animals", "(", "+", "/", "w", ";", "+", "/", "UAS", "-", "p35", ";", "drpr", "∆", "5", "/", "drpr", "∆", "5", ")", ",", "n", "=", "10", "(", "middle", ")", ",", "and", "drpr", "null", "animals", "with", "salivary", "gland", "-", "specific", "expression", "of", "p35", "(", "fkh", "-", "Gal4", "/", "w", ";", "UAS", "-", "p35", "/", "+", ";", "drpr", "∆", "5", "/", "drpr", "∆", "5", ")", ",", "n", "=", "16", "(", "right", ")", ",", "analysed", "by", "histology", "for", "the", "presence", "of", "salivary", "gland", "material", "24", " ", "h", "after", "puparium", "formation", ".", "Red", "circles", ",", "cell", "fragments", ";", "yellow", "circle", ",", "gland", "fragments", ".", "a", ",", "Samples", "from", "animals", "with", "salivary", "gland", "-", "specific", "expression", "of", "p35", "(", "fkh", "-", "Gal4", "/", "+", ";", "UAS", "-", "p35", "/", "+", ")", ",", "n", "=", "18", "(", "left", ")", ",", "drpr", "null", "animals", "(", "+", "/", "w", ";", "+", "/", "UAS", "-", "p35", ";", "drpr", "∆", "5", "/", "drpr", "∆", "5", ")", ",", "n", "=", "10", "(", "middle", ")", ",", "and", "drpr", "null", "animals", "with", "salivary", "gland", "-", "specific", "expression", "of", "p35", "(", "fkh", "-", "Gal4", "/", "w", ";", "UAS", "-", "p35", "/", "+", ";", "drpr", "∆", "5", "/", "drpr", "∆", "5", ")", ",", "n", "=", "16", "(", "right", ")", ",", "analysed", "by", "histology", "for", "the", "presence", "of", "salivary", "gland", "material", "24", " ", "h", "after", "puparium", "formation", ".", "Red", "circles", ",", "cell", "fragments", ";", "yellow", "circle", ",", "gland", "fragments", ".", "b", ",", "Quantification", "of", "data", "from", "a", ".", "c", ",", "Salivary", "glands", "dissected", "from", "animals", "expressing", "drprIR", "specifically", "in", "GFP", "-", "marked", "clone", "cells", "(", "heat", "shock", "(", "hs", ")", "flp", "/", "w", ";", "UAS", "-", "drprIR", "/", "+", ";", "act", ",", "cd2", ",", "FRT", ">", "Gal4", ",", "UAS", "-", "GFP", "/", "+", ")", "6", " ", "h", "and", "14", " ", "h", "after", "puparium", "formation", ".", "Stained", "with", "GFP", "antibody", "(", "green", ")", ",", "to", "label", "cells", "expressing", "drpr", "IR", ",", "and", "Lamin", "antibody", "(", "red", ")", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf2a, Samples from animals with salivary gland-specific expression of p35 (fkh-Gal4/+; UAS-p35/+), n = 18 (left), drpr null animals (+/w; +/UAS-p35; drpr∆5/drpr∆5), n = 10 (middle), and drpr null animals with salivary gland-specific expression of p35 (fkh-Gal4/w; UAS-p35/+; drpr∆5/drpr∆5), n = 16 (right), analysed by histology for the presence of salivary gland material 24 h after puparium formation. Red circles, cell fragments; yellow circle, gland fragments.a, Samples from animals with salivary gland-specific expression of p35 (fkh-Gal4/+; UAS-p35/+), n = 18 (left), drpr null animals (+/w; +/UAS-p35; drpr∆5/drpr∆5), n = 10 (middle), and drpr null animals with salivary gland-specific expression of p35 (fkh-Gal4/w; UAS-p35/+; drpr∆5/drpr∆5), n = 16 (right), analysed by histology for the presence of salivary gland material 24 h after puparium formation. Red circles, cell fragments; yellow circle, gland fragments. b, Quantification of data from a.c, Salivary glands dissected from animals expressing drprIR specifically in GFP-marked clone cells (heat shock (hs)flp/w; UAS-drprIR/+; act,cd2, FRT > Gal4, UAS-GFP/+) 6 h and 14 h after puparium formation. Stained with GFP antibody (green), to label cells expressing drpr IR, and Lamin antibody (red)."}
{"words": ["figf3a", ",", "Samples", "from", "animals", "with", "salivary", "gland", "-", "specific", "knockdown", "of", "Atg12", "(", "fkh", "-", "Gal4", "/", "w", ";", "UAS", "-", "Atg12IR", "/", "+", ")", ",", "n", "=", "21", ",", "and", "those", "with", "salivary", "gland", "-", "specific", "knockdown", "of", "both", "Atg12", "and", "drpr", "-", "I", "(", "fkh", "-", "Gal4", "/", "w", ";", "UAS", "-", "Atg12IR", "/", "+", ";", "UAS", "-", "drpr", "-", "IIR", "/", "+", ")", ",", "n", "=", "19", ",", "analysed", "by", "histology", "for", "the", "presence", "of", "salivary", "gland", "material", "(", "red", "circles", ")", "24", " ", "h", "after", "puparium", "formation", ".", "b", ",", "Quantification", "of", "data", "from", "a", ".", "c", ",", "GFP", "-", "LC3", "was", "expressed", "in", "salivary", "glands", "of", "control", "animals", "(", "+", "/", "w", ";", "UAS", "-", "GFP", "-", "LC3", "/", "+", ";", "fkh", "-", "Gal4", "/", "+", ")", "and", "those", "with", "salivary", "gland", "-", "specific", "knockdown", "of", "drpr", "(", "w", ";", "UAS", "-", "drprIR", "/", "UAS", "-", "GFP", "-", "LC3", ";", "fkh", "-", "Gal4", "/", "+", ")", ".", "Salivary", "glands", "were", "dissected", "6", " ", "h", "and", "14", " ", "h", "after", "puparium", "formation", ",", "imaged", "for", "GFP", "-", "LC3", ",", "and", "LC3", "puncta", "were", "quantified", "using", "Zeiss", "Automeasure", "software", ".", "d", ",", "Quantification", "of", "data", "from", "c", ".", "Error", "bars", "represent", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "n", " ", "≥", " ", "10", ";", "p", " ", " ", "0", ".", "0000001", ".", "e", ",", "LAMP1", "-", "GFP", "was", "expressed", "in", "control", "animals", "(", "tub", "-", "LAMP", "-", "GFP", "/", "w", ";", "+", "/", "fkh", "-", "Gal4", ")", "and", "those", "with", "salivary", "gland", "-", "specific", "knockdown", "of", "drpr", "(", "tub", "-", "LAMP", "-", "GFP", "/", "w", ";", "UAS", "-", "drprIR", "/", "+", ";", "fkh", "-", "Gal4", "/", "+", ")", ".", "Salivary", "glands", "were", "dissected", "14", " ", "h", "after", "puparium", "formation", ",", "imaged", "for", "LAMP", "-", "GFP", ",", "and", "LAMP", "puncta", "were", "quantified", "using", "Zeiss", "Automeasure", "software", ".", "f", ",", "Quantification", "of", "data", "from", "e", ".", "Error", "bars", "represent", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "n", " ", "≥", " ", "10", ";", "p", " ", " ", "0", ".", "05", ".", "g", ",", "Samples", "from", "drpr", "mutant", "animals", "(", "+", "/", "w", ";", "+", "/", "UAS", "-", "Atg16A", ";", "drprDgr", ";", "5", "/", "drprDgr", ";", "5", ")", ",", "n", "=", "10", ",", "and", "those", "with", "salivary", "gland", "-", "specific", "expression", "of", "Atg16A", "(", "fkh", "-", "Gal4", "/", "w", ";", "UAS", "-", "Atg16A", "/", "+", ";", "drprDgr", ";", "5", "/", "drprDgr", ";", "5", ")", ",", "n", "=", "16", ",", "analysed", "by", "histology", "for", "the", "presence", "of", "salivary", "gland", "material", "(", "red", "circles", ")", "24", " ", "h", "after", "puparium", "formation", ".", "h", ",", "Quantification", "of", "data", "from", "g", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf3a, Samples from animals with salivary gland-specific knockdown of Atg12 (fkh-Gal4/w; UAS-Atg12IR/+), n = 21, and those with salivary gland-specific knockdown of both Atg12 and drpr-I (fkh-Gal4/w; UAS-Atg12IR/+; UAS-drpr-IIR/+), n = 19, analysed by histology for the presence of salivary gland material (red circles) 24 h after puparium formation. b, Quantification of data from a.c, GFP-LC3 was expressed in salivary glands of control animals (+/w; UAS-GFP-LC3/+; fkh-Gal4/+) and those with salivary gland-specific knockdown of drpr (w; UAS-drprIR/UAS-GFP-LC3; fkh-Gal4/+). Salivary glands were dissected 6 h and 14 h after puparium formation, imaged for GFP-LC3, and LC3 puncta were quantified using Zeiss Automeasure software. d, Quantification of data from c. Error bars represent s.e.m.; n ≥ 10; p  0.0000001.e, LAMP1-GFP was expressed in control animals (tub-LAMP-GFP/w; +/fkh-Gal4) and those with salivary gland-specific knockdown of drpr (tub-LAMP-GFP/w; UAS-drprIR/+; fkh-Gal4/+). Salivary glands were dissected 14 h after puparium formation, imaged for LAMP-GFP, and LAMP puncta were quantified using Zeiss Automeasure software. f, Quantification of data from e. Error bars represent s.e.m.; n ≥ 10; p  0.05.g, Samples from drpr mutant animals (+/w; +/UAS-Atg16A; drprDgr;5/drprDgr;5), n = 10, and those with salivary gland-specific expression of Atg16A (fkh-Gal4/w; UAS-Atg16A/+; drprDgr;5/drprDgr;5), n = 16, analysed by histology for the presence of salivary gland material (red circles) 24 h after puparium formation. h, Quantification of data from g."}
{"words": ["figf4a", ",", "Protein", "extracts", "from", "drpr", "null", "(", "w", ";", "drprDgr", ";", "5", "/", "drprDgr", ";", "5", ")", "pupae", "at", "puparium", "formation", "(", "0", " ", "h", ")", "and", "from", "the", "fat", "bodies", "of", "wild", "-", "type", "(", "Canton", "-", "S", ")", "third", "-", "instar", "larvae", "were", "analysed", "by", "western", "blotting", "with", "anti", "-", "Drpr", "antibody", ".", "Third", "-", "instar", "larvae", "were", "either", "fed", "or", "starved", "for", "4", " ", "h", ".", "b", ",", "We", "either", "fed", "Wild", "-", "type", "(", "Canton", "-", "S", ")", "third", "-", "instar", "larvae", "or", "starved", "them", "for", "4", " ", "h", ",", "and", "dissected", "fat", "bodies", ",", "stained", "them", "with", "anti", "-", "Drpr", "antibody", ",", "and", "imaged", "them", "for", "Drpr", "(", "green", ")", ".", "We", "stained", "nuclei", "with", "4", "′", ",", "6", "-", "diamidino", "-", "2", "-", "phenylindole", "(", "DAPI", ")", "(", "blue", ")", ".", "c", ",", "We", "starved", "third", "-", "instar", "larvae", "expressing", "GFP", "-", "Atg8a", "in", "all", "cells", ",", "and", "drprIR", "specifically", "in", "dsRed", "-", "marked", "clone", "cells", "(", "hsflp", "/", "w", ";", "UAS", "-", "drprIR", "/", "+", ";", "hsGFPAtg8a", ",", "act", ",", "cd2", ",", "FRT", ">", "Gal4", ",", "UAS", "-", "dsRed", "/", "+", ")", ",", "for", "4", "h", ".", "We", "dissected", "larval", "fat", "bodies", "and", "imaged", "them", "for", "GFP", "-", "Atg8a", "(", "green", ")", "and", "dsRed", "(", "red", ")", ".", "d", ",", "Salivary", "glands", "of", "animals", "expressing", "GFP", "-", "Atg8a", "in", "all", "cells", ",", "and", "drprIR", "specifically", "in", "dsRed", "-", "marked", "clone", "cells", "(", "hsflp", "/", "w", ";", "UAS", "-", "drprIR", "/", "+", ";", "hsGFPAtg8a", ",", "act", ",", "cd2", ",", "FRT", ">", "Gal4", ",", "UAS", "-", "dsRed", "/", "+", ")", ",", "dissected", "14", " ", "h", "after", "puparium", "formation", ".", "Imaged", "for", "GFP", "-", "Atg8a", "(", "green", ")", "and", "dsRed", "(", "red", ")", ".", "We", "stained", "nuclei", "with", "Hoechst", "(", "blue", ")", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf4a, Protein extracts from drpr null (w; drprDgr;5/drprDgr;5) pupae at puparium formation (0 h) and from the fat bodies of wild-type (Canton-S) third-instar larvae were analysed by western blotting with anti-Drpr antibody. Third-instar larvae were either fed or starved for 4 h.b, We either fed Wild-type (Canton-S) third-instar larvae or starved them for 4 h, and dissected fat bodies, stained them with anti-Drpr antibody, and imaged them for Drpr (green). We stained nuclei with 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (blue).c, We starved third-instar larvae expressing GFP-Atg8a in all cells, and drprIR specifically in dsRed-marked clone cells (hsflp/w; UAS-drprIR/+; hsGFPAtg8a, act,cd2, FRT > Gal4, UAS-dsRed/+), for 4 h. We dissected larval fat bodies and imaged them for GFP-Atg8a (green) and dsRed (red).d, Salivary glands of animals expressing GFP-Atg8a in all cells, and drprIR specifically in dsRed-marked clone cells (hsflp/w; UAS-drprIR/+; hsGFPAtg8a, act,cd2, FRT > Gal4, UAS-dsRed/+), dissected 14 h after puparium formation. Imaged for GFP-Atg8a (green) and dsRed (red). We stained nuclei with Hoechst (blue)."}
{"words": ["Figure", "1", ":", "(", "a", ")", "Effect", "of", "steroids", "on", "MERS", "-", "CoV", "replication", ".", "Vero", "cells", "were", "infected", "with", "MERS", "-", "CoV", "at", "MOI", "=", "0", ".", "01", "in", "the", "presence", "of", "steroids", "for", "24", "h", ".", "The", "viral", "titer", "in", "the", "cell", "supernatant", "was", "quantified", "by", "standard", "plaque", "assay", "using", "Vero", "/", "TMPRSS2", "cells", ".", "Cell", "viability", "in", "the", "presence", "of", "steroids", "was", "quantified", "by", "WST", "assay", "at", "24", "hours", "post", "-", "infection", "(", "hpi", ")", ".", "(", "b", ")", "Ciclesonide", "escape", "mutant", ".", "Vero", "cells", "treated", "with", "ciclesonide", "were", "infected", "with", "parental", "MERS", "-", "CoV", "or", "ciclesonide", "escape", "mutant", ".", "Viral", "titer", "was", "measured", "as", "described", "in", "panel", "a", ".", "(", "c", ")", "Vero", "cells", "were", "infected", "with", "the", "parental", "MERS", "-", "CoV", "/", "EMC", "strain", "(", "Re", "-", "EMC", "/", "MERS", ")", "or", "the", "recombinant", "mutant", "strain", "(", "Re", "-", "Nsp15", "-", "A25V", ")", "with", "an", "amino", "acid", "substitution", "at", "A25V", "in", "NSP15", ".", "Viral", "titer", "was", "measured", "as", "described", "in", "panel", "a", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1:(a) Effect of steroids on MERS-CoV replication. Vero cells were infected with MERS-CoV at MOI = 0.01 in the presence of steroids for 24 h. The viral titer in the cell supernatant was quantified by standard plaque assay using Vero/TMPRSS2 cells. Cell viability in the presence of steroids was quantified by WST assay at 24 hours post-infection (hpi).(b) Ciclesonide escape mutant. Vero cells treated with ciclesonide were infected with parental MERS-CoV or ciclesonide escape mutant. Viral titer was measured as described in panel a.(c) Vero cells were infected with the parental MERS-CoV/EMC strain (Re-EMC/MERS) or the recombinant mutant strain (Re-Nsp15-A25V) with an amino acid substitution at A25V in NSP15. Viral titer was measured as described in panel a."}
{"words": ["Figure", "2", ":", "(", "a", ")", "Intracellular", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "RNA", "(", "6", "hpi", ")", ".", "VeroE6", "/", "TMPRSS2", "cells", "were", "infected", "with", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "at", "MOI", "=", "1", "in", "the", "presence", "of", "10", "□", "μM", "compounds", "for", "6", "h", ".", "Cellular", "viral", "RNA", "was", "quantified", "by", "real", "-", "time", "PCR", "using", "the", "E", "gene", "primer", "/", "probe", "set", ".", "(", "b", ")", "Culture", "Medium", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "RNA", "(", "27", "hpi", ")", ".", "VeroE6", "/", "TMPRSS2", "cells", "were", "infected", "with", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "at", "MOI", "=", "0", ".", "01", "in", "the", "presence", "of", "ciclesonide", "for", "27", "h", ".", "Viral", "RNA", "in", "culture", "medium", "was", "quantified", "by", "real", "-", "time", "PCR", "using", "the", "E", "gene", "primer", "/", "probe", "set", ".", "Cell", "viability", "in", "the", "presence", "of", "ciclesonide", "was", "quantified", "at", "27", "hpi", "by", "WST", "assay", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2:(a) Intracellular SARS-CoV-2 RNA (6 hpi). VeroE6/TMPRSS2 cells were infected with SARS-CoV-2 at MOI = 1 in the presence of 10□μM compounds for 6 h. Cellular viral RNA was quantified by real-time PCR using the E gene primer/probe set.(b) Culture Medium SARS-CoV-2 RNA (27 hpi). VeroE6/TMPRSS2 cells were infected with SARS-CoV-2 at MOI = 0.01 in the presence of ciclesonide for 27 h. Viral RNA in culture medium was quantified by real-time PCR using the E gene primer/probe set. Cell viability in the presence of ciclesonide was quantified at 27 hpi by WST assay."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "CRMP2", "expression", "in", "adult", "cortex", "(", "layers", "VI", "-", "IV", ")", ",", "corpus", "callosum", "(", "CC", ")", "and", "hippocampal", "area", "CA1", ".", "CRMP2", "(", "green", ")", "is", "expressed", "throughout", "the", "cortex", "and", "hippocampus", ",", "CRMP2A", "(", "red", ")", "is", "particularly", "strongly", "expressed", "in", "a", "subset", "of", "callosal", "axons", ".", "Nuclei", "are", "counterstained", "with", "Hoechst", "33342", ".", "Scale", "bars", ":", "50", "μm", ".", "(", "C", ")", "Whole", "-", "mount", "immunohistochemistry", "with", "anti", "-", "neurofilaments", "antibody", "for", "visualization", "of", "peripheral", "nerves", ".", "In", "crmp2", "-", "/", "-", "embryos", ",", "the", "growth", "of", "ophthalmic", "branch", "of", "the", "trigeminal", "nerve", "is", "increased", "and", "axons", "are", "defasciculated", "(", "first", "and", "second", "row", ",", "arrowheads", ")", ".", "Similarly", ",", "we", "detected", "increased", "growth", "and", "branching", "of", "lateral", "branches", "of", "spinal", "nerves", "in", "crmp2", "-", "/", "-", "embryos", "(", "third", "row", ",", "arrowheads", ")", ".", "Trigeminal", "nerve", "(", "V", ")", "and", "its", "branches", "(", "Op", "-", "ophthalmic", ",", "Mx", "-", "maxillar", ",", "Md", "-", "mandibular", ")", "are", "indicated", ".", "Scale", "bars", ":", "500", "μm", ".", "(", "D", ",", "E", ")", "Quantification", "of", "areas", "innervated", "by", "ophthalmic", "branches", "of", "trigeminal", "ganglion", "and", "spinal", "nerve", ",", "normalized", "to", "WT", "littermates", "(", "each", "dot", "depicts", "one", "embryo", ")", ".", "Area", "of", "ophthalmic", "branch", "in", "crmp2", "-", "/", "-", "was", "increased", "by", "66", "%", "(", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "n", "=", "10", ",", "3", "litters", ")", ".", "For", "spinal", "nerves", ",", "total", "area", "in", "knockouts", "was", "increased", "by", "45", "%", "(", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "WT", "n", "=", "8", ",", "crmp2", "-", "/", "-", "n", "=", "7", ",", "3", "litters", ")", ".", "Mean", "±", "SD", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "t", "-", "test", ".", "(", "F", ")", "Growth", "of", "motor", "neurons", "from", "E11", ".", "5", "-", "E12", ".", "5", "WT", "and", "crmp2", "-", "/", "-", "spinal", "cord", "explants", "in", "microfluidic", "chambers", ".", "Excerpts", "from", "14", "hour", "time", "-", "lapse", "imaging", "are", "shown", ".", "Upon", "application", "of", "Sema3A", "into", "distal", "compartment", ",", "WT", "axons", "tend", "to", "stop", "or", "slow", "down", "their", "growth", "unlike", "crmp2", "-", "/", "-", "axons", ".", "Purple", "lines", "highlight", "the", "growth", "path", "of", "individual", "axons", "in", "a", "distal", "chamber", ".", "Scale", "bars", ":", "100", "μm", ".", "(", "G", ")", "Quantification", "of", "the", "fraction", "of", "growing", "(", ">", "50", "μm", ")", "axons", "in", "one", "imaging", "field", "(", "WT", ":", "control", "76", ".", "8", "±", "5", ".", "7", "%", ",", "Sema3A", "57", ".", "7", "±", "10", ".", "6", "%", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "crmp2", "-", "/", "-", ":", "control", "75", ".", "4", "±", "10", ".", "4", "%", ",", "Sema3A", "75", ".", "4", "±", "6", ".", "7", "%", ",", "p", "=", "0", ".", "99", ")", ",", "n", "=", "3", "experiments", "per", "genotype", ",", "7", "-", "8", "explants", "per", "condition", ".", "Mean", "±", "SD", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "2", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B) CRMP2 expression in adult cortex (layers VI - IV), corpus callosum (CC) and hippocampal area CA1. CRMP2 (green) is expressed throughout the cortex and hippocampus, CRMP2A (red) is particularly strongly expressed in a subset of callosal axons. Nuclei are counterstained with Hoechst 33342. Scale bars: 50 μm.(C) Whole-mount immunohistochemistry with anti-neurofilaments antibody for visualization of peripheral nerves. In crmp2-/- embryos, the growth of ophthalmic branch of the trigeminal nerve is increased and axons are defasciculated (first and second row, arrowheads). Similarly, we detected increased growth and branching of lateral branches of spinal nerves in crmp2-/- embryos (third row, arrowheads). Trigeminal nerve (V) and its branches (Op - ophthalmic, Mx - maxillar, Md - mandibular) are indicated. Scale bars: 500 μm.(D, E) Quantification of areas innervated by ophthalmic branches of trigeminal ganglion and spinal nerve, normalized to WT littermates (each dot depicts one embryo). Area of ophthalmic branch in crmp2-/- was increased by 66% (p<0.05, n=10, 3 litters). For spinal nerves, total area in knockouts was increased by 45% (p<0.05, WT n=8, crmp2-/- n=7, 3 litters). Mean ± SD, * p<0.05, t-test.(F) Growth of motor neurons from E11.5 - E12.5 WT and crmp2-/- spinal cord explants in microfluidic chambers. Excerpts from 14 hour time-lapse imaging are shown. Upon application of Sema3A into distal compartment, WT axons tend to stop or slow down their growth unlike crmp2-/- axons. Purple lines highlight the growth path of individual axons in a distal chamber. Scale bars: 100 μm.(G) Quantification of the fraction of growing (>50 μm) axons in one imaging field (WT: control 76.8±5.7%, Sema3A 57.7±10.6%, p<0.001, crmp2-/-: control 75.4±10.4%, Sema3A 75.4±6.7%, p=0.99), n=3 experiments per genotype, 7-8 explants per condition. Mean ± SD. *** p<0.001, 2-way ANOVA with Bonferroni's multiple comparisons test."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "CRMP2", "deficiency", "leads", "to", "callosal", "hypoplasia", ".", "Shortening", "of", "corpus", "callosum", "(", "arrowheads", ")", "is", "apparent", "in", "both", "sagittal", "(", "first", "row", ")", "and", "coronal", "sections", "(", "second", "row", ")", "of", "adult", "brains", ".", "Scale", "bars", ":", "1", "mm", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "callosal", "length", "in", "30", "-", "days", "old", "mice", "(", "P30", ",", "n", "=", "3", ",", "crmp2", "-", "/", "-", "is", "80", ".", "8", "±", "5", "%", "of", "WT", ",", "p", "=", "0", ".", "003", ")", "and", "adult", "mice", "(", "n", "=", "3", ",", "crmp2", "-", "/", "-", "is", "80", ".", "5", "±", "3", "%", "of", "WT", ",", "p", "=", "0", ".", "002", ")", ",", "mean", "±", "SD", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "t", "-", "test", ".", "(", "C", ")", "Labeling", "of", "adult", "corpus", "callosum", "with", "anti", "-", "neurofilaments", "antibody", "in", "sagittal", "sections", ".", "Outline", "depicts", "missing", "posterior", "part", "of", "the", "tract", "in", "crmp2", "-", "/", "-", "mice", ".", "Caudal", "part", "of", "the", "corpus", "callosum", "in", "WTs", "is", "located", "dorsally", "above", "the", "habenular", "commissure", "(", "hbc", ")", ",", "while", "in", "crmp2", "-", "/", "-", "mice", "callosum", "terminates", "rostrally", "before", "reaching", "the", "hbc", "(", "arrows", ")", ".", "PC", "indicates", "posterior", "commissure", ".", "Scale", "bars", ":", "500", "µm", ".", "(", "D", ")", "The", "growth", "of", "GFP", "-", "labeled", "callosal", "axons", "in", "the", "contralateral", "cortex", "at", "P6", "(", "embryos", "were", "electroporated", "at", "E15", ".", "5", ")", ".", "Note", "the", "disorganized", "paths", "of", "crmp2", "-", "/", "-", "axons", ".", "Scale", "bars", ":", "200", "μm", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "tortuosity", "of", "axons", "(", "WT", "n", "=", "6", "pups", ",", "crmp2", "-", "/", "-", "n", "=", "3", "pups", ")", "upon", "their", "exit", "from", "the", "callosal", "tract", "(", "WT", "1", ".", "016", "±", "0", ".", "003", "vs", ".", "crmp2", "-", "/", "-", "1", ".", "044", "±", "0", ".", "012", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ",", "mean", "±", "SD", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "t", "-", "test", ".", "(", "G", ")", "DiI", "-", "labeled", "callosal", "axons", "from", "P9", "oblique", "brain", "sections", "and", "their", "reconstruction", "in", "Neurolucida", "360", "(", "WT", "n", "=", "6", ",", "crmp2", "-", "/", "-", "n", "=", "9", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "200", "μm", ".", "(", "H", ")", "Polar", "histograms", "of", "callosal", "axons", "reconstructed", "Note", "the", "broader", "range", "of", "axon", "growth", "angles", "in", "crmp2", "-", "/", "-", "mice", ".", "(", "I", ")", "Left", ":", "schematic", "representation", "of", "polar", "histogram", "analysis", "by", "clustering", "the", "traced", "axons", "(", "WT", "n", "=", "6", "pups", ",", "crmp2", "-", "/", "-", "n", "=", "9", "pups", ")", "into", "3", "groups", "based", "on", "the", "growth", "angles", ".", "Right", ":", "proportion", "of", "axons", "growing", "in", "selected", "clusters", "(", "WT", ",", "0", "°", "-", "±", "20", "°", ":", "67", ".", "3", "±", "10", ".", "3", "%", ";", "±", "20", "°", "-", "±", "40", "°", ":", "21", ".", "2", "±", "5", ".", "3", "%", ";", "±", "40", "°", "-", "±", "60", "°", ":", "6", ".", "22", "±", "3", ".", "2", "%", ";", "crmp2", "-", "/", "-", ",", "58", ".", "5", "±", "5", "%", ",", "p", "=", "0", ".", "047", ",", "27", ".", "7", "±", "4", ".", "3", "%", ",", "p", "=", "0", ".", "022", ",", "8", ".", "64", "±", "2", ".", "25", "%", ",", "p", "=", "0", ".", "11", ")", ",", "mean", "±", "SD", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) CRMP2 deficiency leads to callosal hypoplasia. Shortening of corpus callosum (arrowheads) is apparent in both sagittal (first row) and coronal sections (second row) of adult brains. Scale bars: 1 mm.(B) Quantification of callosal length in 30-days old mice (P30, n=3, crmp2-/- is 80.8±5% of WT, p=0.003) and adult mice (n=3, crmp2-/- is 80.5±3% of WT, p=0.002), mean ± SD, * p<0.05, t-test.(C) Labeling of adult corpus callosum with anti-neurofilaments antibody in sagittal sections. Outline depicts missing posterior part of the tract in crmp2-/- mice. Caudal part of the corpus callosum in WTs is located dorsally above the habenular commissure (hbc), while in crmp2-/- mice callosum terminates rostrally before reaching the hbc (arrows). PC indicates posterior commissure. Scale bars: 500 µm.(D) The growth of GFP-labeled callosal axons in the contralateral cortex at P6 (embryos were electroporated at E15.5). Note the disorganized paths of crmp2-/- axons. Scale bars: 200 μm.(F) Quantification of tortuosity of axons (WT n=6 pups, crmp2-/- n=3 pups) upon their exit from the callosal tract (WT 1.016±0.003 vs. crmp2-/- 1.044±0.012, p<0.001), mean ± SD, ***p<0.001, t-test.(G) DiI-labeled callosal axons from P9 oblique brain sections and their reconstruction in Neurolucida 360 (WT n=6, crmp2-/- n=9). Scale bars: 200 μm.(H) Polar histograms of callosal axons reconstructed Note the broader range of axon growth angles in crmp2-/- mice.(I) Left: schematic representation of polar histogram analysis by clustering the traced axons (WT n=6 pups, crmp2-/- n=9 pups) into 3 groups based on the growth angles. Right: proportion of axons growing in selected clusters (WT, 0°-±20°: 67.3±10.3%; ±20°-±40°: 21.2±5.3%; ±40°-±60°: 6.22±3.2%; crmp2-/-, 58.5±5%, p=0.047, 27.7±4.3%, p=0.022, 8.64±2.25%, p=0.11), mean ± SD, *p<0.05, t-test."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ",", "B", ")", "(", "A", ")", "Coronal", "sections", "of", "P14", "brains", "stained", "for", "calbindin", "and", "VgluT1", ".", "Infrapyramidal", "bundle", "(", "IPB", ")", "progresses", "into", "hippocampal", "CA3", "region", "in", "both", "WT", "and", "crmp2", "-", "/", "-", "mice", ".", "Nuclei", "are", "counterstained", "with", "Hoechst", "33342", ".", "(", "B", ")", "Details", "from", "depicted", "regions", "in", "(", "A", ")", ",", "arrowheads", "show", "the", "course", "of", "IPB", ".", "Scale", "bars", ":", "100", "μm", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "(", "C", ")", "Staining", "for", "calbindin", "shows", "unpruned", "infrapyramidal", "bundle", "in", "adult", "crmp2", "-", "/", "-", "mice", ".", "No", "VGluT2", "signal", "in", "hippocampal", "CA3", "region", "is", "present", "in", "WT", "and", "crmp2", "-", "/", "-", "suggesting", "mature", "synapses", ".", "Scale", "bars", ":", "500", "μm", ".", "(", "D", ")", "Details", "from", "depicted", "regions", "in", "(", "C", ")", ",", "arrowheads", "show", "the", "course", "of", "IPB", ".", "Scale", "bars", ":", "100", "μm", ".", "(", "E", ",", "F", ")", "Staining", "for", "calbindin", "and", "VgluT1", "shows", "mature", "synapses", "in", "the", "main", "bundle", "in", "both", "genotypes", "and", "in", "the", "IPB", "in", "crmp2", "-", "/", "-", "mice", "(", "arrowheads", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "100", "μm", ".", "(", "G", ")", "Quantification", "of", "IPB", "index", "(", "length", "of", "the", "IPB", "vs", ".", "main", "bundle", ",", "WT", "0", ".", "43", "±", "0", ".", "05", ",", "crmp2", "-", "/", "-", "0", ".", "78", "±", "0", ".", "05", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ")", "counted", "from", "adult", "coronal", "sections", "(", "WT", "n", "=", "4", "mice", ",", "crmp2", "-", "/", "-", "n", "=", "5", "mice", ")", ".", "Mean", "±", "SD", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A, B) (A) Coronal sections of P14 brains stained for calbindin and VgluT1. Infrapyramidal bundle (IPB) progresses into hippocampal CA3 region in both WT and crmp2-/- mice. Nuclei are counterstained with Hoechst 33342. (B) Details from depicted regions in (A), arrowheads show the course of IPB. Scale bars: 100 μm.(C, D) (C) Staining for calbindin shows unpruned infrapyramidal bundle in adult crmp2-/- mice. No VGluT2 signal in hippocampal CA3 region is present in WT and crmp2-/- suggesting mature synapses. Scale bars: 500 μm. (D) Details from depicted regions in (C), arrowheads show the course of IPB. Scale bars: 100 μm.(E, F) Staining for calbindin and VgluT1 shows mature synapses in the main bundle in both genotypes and in the IPB in crmp2-/- mice (arrowheads). Scale bars: 100 μm.(G) Quantification of IPB index (length of the IPB vs. main bundle, WT 0.43±0.05, crmp2-/- 0.78±0.05, p<0.001) counted from adult coronal sections (WT n=4 mice, crmp2-/- n=5 mice). Mean ± SD, ***p<0.001, t-test."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Upper", "row", ":", "DiI", "tracing", "of", "the", "visual", "cortex", "axons", "at", "P9", "(", "before", "pruning", ")", ",", "sagittal", "sections", ".", "Branching", "point", "of", "the", "tract", "is", "shown", ".", "Lower", "row", ":", "visual", "cortex", "axons", "in", "adult", "mice", "after", "pruning", "period", ".", "Note", "significantly", "reduced", "number", "of", "axons", "continuing", "into", "pyramidal", "tract", "in", "WT", "(", "dashed", "arrow", ")", ".", "(", "arrows", "-", "2", "branches", "of", "corticospinal", "visual", "axons", ")", ".", "Maximum", "projections", "are", "shown", ".", "Scale", "bars", ":", "200", "μm", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "VP", "(", "visual", "pruning", ")", "index", "(", "fluorescence", "intensity", "of", "pyramidal", "axons", "after", "vs", ".", "before", "the", "branch", "point", ")", ".", "In", "WT", "animals", "after", "the", "pruning", "period", ",", "only", "a", "minor", "part", "of", "axons", "descends", "towards", "the", "pyramidal", "tract", "(", "WT", ":", "P9", "0", ".", "65", "±", "0", ".", "09", ",", "adults", "0", ".", "17", "±", "0", ".", "04", ",", "p", "=", "0", ".", "006", ")", ".", "However", ",", "in", "crmp2", "-", "/", "-", "mice", ",", "corticospinal", "axons", "are", "still", "largely", "present", ",", "and", "their", "VP", "indexes", "are", "not", "significantly", "different", "between", "adult", "and", "P9", "stages", "(", "crmp2", "-", "/", "-", ":", "P9", "0", ".", "54", "±", "0", ".", "18", ",", "adults", "0", ".", "62", "±", "0", ".", "27", ",", "p", "=", "0", ".", "24", ")", ".", "Mean", "±", "SD", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "2", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "P9", ":", "n", "=", "3", "pups", "/", "genotype", ",", "adults", ":", "n", "=", "5", "mice", "/", "genotype", ")"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Upper row: DiI tracing of the visual cortex axons at P9 (before pruning), sagittal sections. Branching point of the tract is shown. Lower row: visual cortex axons in adult mice after pruning period. Note significantly reduced number of axons continuing into pyramidal tract in WT (dashed arrow). (arrows - 2 branches of corticospinal visual axons). Maximum projections are shown. Scale bars: 200 μm.(C) Quantification of VP (visual pruning) index (fluorescence intensity of pyramidal axons after vs. before the branch point). In WT animals after the pruning period, only a minor part of axons descends towards the pyramidal tract (WT: P9 0.65±0.09, adults 0.17±0.04, p=0.006). However, in crmp2-/- mice, corticospinal axons are still largely present, and their VP indexes are not significantly different between adult and P9 stages (crmp2-/-: P9 0.54±0.18, adults 0.62±0.27, p=0.24). Mean ± SD, **p<0.01, 2-way ANOVA with Bonferroni's multiple comparisons test. P9: n=3 pups/genotype, adults: n=5 mice/genotype)"}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Time", "-", "lapse", "imaging", "of", "DIV7", "cultured", "hippocampal", "neurons", "before", "and", "after", "Semaphorin", "stimulation", ".", "Upper", "panel", ":", "Axon", "growth", "without", "Semaphorin", "stimulation", ".", "Middle", "panel", ":", "stimulation", "with", "Sema3A", "(", "0", "hours", ")", "(", "1nM", ",", "n", "=", "669", "axons", "for", "WT", ",", "761", "axons", "for", "knockout", ")", "causes", "retraction", "of", "both", "WT", "and", "crmp2", "-", "/", "-", "neurons", ".", "Lower", "panel", ":", "stimulation", "with", "Sema3F", "(", "5", "nM", ",", "n", "=", "602", "axons", "for", "WT", ",", "955", "axons", "for", "knockout", ")", "causes", "axon", "retraction", "in", "WT", ",", "but", "not", "in", "crmp2", "-", "/", "-", "neurons", ".", "Red", "triangles", "depict", "growing", "axons", ",", "yellow", "retracting", "axons", "and", "blue", "asterisks", "indicate", "steady", "non", "-", "growing", "axons", ".", "Scale", "bars", ":", "100", "μm", "(", "whole", "image", "field", ")", "and", "50", "μm", "(", "magnified", ")", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "retracting", "axons", "(", "number", "of", "retracting", "vs", ".", "steady", "axons", ",", "3", "experiments", ")", ".", "WT", ":", "control", "13", ".", "4", "±", "5", "%", ",", "Sema3A", "31", ".", "2", "±", "6", "%", "(", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ",", "Sema3F", "36", ".", "9", "±", "8", ".", "7", "%", "(", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ";", "crmp2", "-", "/", "-", ":", "control", "19", ".", "8", "±", "1", ".", "8", "%", ",", "Sema3A", "28", ".", "5", "±", "4", ".", "4", "%", "(", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ",", "Sema3F", "22", ".", "4", "±", "4", ".", "1", "%", "(", "p", ">", "0", ".", "99", ")", ",", "mean", "±", "SD", "are", "shown", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "2", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Time-lapse imaging of DIV7 cultured hippocampal neurons before and after Semaphorin stimulation. Upper panel: Axon growth without Semaphorin stimulation. Middle panel: stimulation with Sema3A (0 hours) (1nM, n=669 axons for WT, 761 axons for knockout) causes retraction of both WT and crmp2-/- neurons. Lower panel: stimulation with Sema3F (5 nM, n=602 axons for WT, 955 axons for knockout) causes axon retraction in WT, but not in crmp2-/- neurons. Red triangles depict growing axons, yellow retracting axons and blue asterisks indicate steady non-growing axons. Scale bars: 100 μm (whole image field) and 50 μm (magnified).(C) Quantification of retracting axons (number of retracting vs. steady axons, 3 experiments). WT: control 13.4±5%, Sema3A 31.2±6% (p<0.001), Sema3F 36.9±8.7% (p<0.001); crmp2-/-: control 19.8±1.8%, Sema3A 28.5±4.4% (p<0.05), Sema3F 22.4±4.1% (p>0.99), mean ± SD are shown. ***p<0.001, *p<0.05, 2-way ANOVA with Bonferroni's multiple comparisons test."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ",", "B", ")", "Dendritic", "spine", "density", "in", "DiOlistically", "labeled", "DG", "granule", "cells", "is", "similar", "in", "WT", "and", "crmp2", "-", "/", "-", "mice", "at", "P30", ".", "In", "adults", ",", "however", ",", "spine", "density", "in", "crmp2", "-", "/", "-", "granule", "cells", "is", "increased", "comparing", "to", "WT", ".", "Scale", "bars", ":", "5", "μm", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "dendritic", "spine", "density", "in", "DG", "granule", "cells", "in", "the", "inner", "molecular", "layer", "(", "50", "-", "100", "μm", "away", "from", "the", "soma", ")", ".", "WT", ",", "P30", ":", "12", ".", "5", "±", "2", ".", "2", "spines", "/", "10", "μm", ",", "adults", ":", "9", ".", "95", "±", "2", ".", "3", ";", "crmp2", "-", "/", "-", ",", "P30", ":", "12", ".", "86", "±", "2", ".", "1", "(", "p", ">", "0", ".", "99", ")", ",", "adults", ":", "12", ".", "88", "±", "2", ".", "9", "(", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ",", "mean", "±", "SD", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "2", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "correction", ".", "P30", ":", "3", "animals", "/", "genotype", ",", "WT", "=", "61", "dendrites", ",", "knockout", "=", "64", "dendrites", ";", "adults", ":", "3", "animals", "/", "genotype", ",", "WT", "=", "41", "dendrites", ",", "knockout", "=", "37", "dendrites", ".", "(", "D", ",", "E", ")", "Analysis", "of", "branching", "of", "DiOlistically", "labeled", "DG", "granule", "cell", "dendrites", "in", "adult", "WT", "and", "crmp2", "-", "/", "-", "mice", "(", "n", "=", "3", "animals", ",", "≥", "25", "dendrites", ")", ".", "Quantification", "of", "granule", "cell", "branching", "by", "Sholl", "analysis", "showed", "no", "significant", "differences", "(", "p", ">", "0", ".", "99", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "50", "μm", ",", "mean", "±", "SEM", ",", "2", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "correction", ".", "(", "F", ")", "Defects", "in", "synapse", "elimination", "in", "the", "inner", "molecular", "layer", "revealed", "by", "double", "immunostaining", "with", "PSD95", "and", "VGluT2", "antibodies", "(", "n", "=", "5", "mice", "/", "genotype", ")", ".", "GL", "indicates", "granule", "cell", "layer", ",", "IML", "/", "OML", "indicate", "inner", "/", "outer", "molecular", "layer", ",", "respectively", ".", "Density", "of", "colocalized", "PSD95", "/", "VGLuT2", "puncta", "was", "counted", ".", "IML", ":", "WT", "109", "±", "21", ",", "crmp2", "-", "/", "-", "156", "±", "15", "(", "p", "=", "0", ".", "004", ")", ".", "OML", ":", "WT", "281", "±", "38", ",", "crmp2", "-", "/", "-", "297", "±", "80", "(", "p", "=", "0", ".", "7", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "10", "μm", ",", "mean", "±", "SD", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "t", "-", "test", ".", "(", "G", ")", "Spine", "density", "in", "DiOlistically", "labeled", "prefrontal", "cortex", "(", "PFC", ")", "is", "similar", "in", "WT", "and", "crmp2", "-", "/", "-", "mice", "in", "both", "juvenile", "and", "adult", "mice", ".", "Scale", "bars", ":", "5", "μm", ".", "(", "H", ")", "Quantification", "of", "dendritic", "spine", "density", "of", "PFC", "pyramidal", "neurons", ",", "basal", "dendrites", "(", "WT", ",", "juvenile", ":", "8", ".", "63", "±", "1", ".", "44", "spines", "/", "10", "μm", ",", "adults", ":", "7", ".", "3", "±", "1", ".", "4", ";", "crmp2", "-", "/", "-", ",", "juvenile", ":", "9", ".", "05", "±", "1", ".", "73", ",", "p", "=", "0", ".", "97", ",", "adults", ":", "6", ".", "98", "±", "1", ".", "53", ",", "p", ">", "0", ".", "99", ")", ",", "mean", "±", "SD", ",", "2", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", ".", "P25", ":", "n", "=", "3", ",", "≥", "50", "dendrites", ";", "adults", ":", "n", "=", "3", ",", "≥", "50", "dendrites", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A, B) Dendritic spine density in DiOlistically labeled DG granule cells is similar in WT and crmp2-/- mice at P30. In adults, however, spine density in crmp2-/- granule cells is increased comparing to WT. Scale bars: 5 μm. (C) Quantification of dendritic spine density in DG granule cells in the inner molecular layer (50 - 100 μm away from the soma). WT, P30: 12.5±2.2 spines/10 μm, adults: 9.95±2.3; crmp2-/-, P30: 12.86±2.1 (p>0.99), adults: 12.88±2.9 (p<0.001), mean ± SD, ***p<0.001, 2-way ANOVA with Bonferroni correction. P30: 3 animals/genotype, WT=61 dendrites, knockout=64 dendrites; adults: 3 animals/genotype, WT=41 dendrites, knockout=37 dendrites. (D, E) Analysis of branching of DiOlistically labeled DG granule cell dendrites in adult WT and crmp2-/- mice (n=3 animals, ≥25 dendrites). Quantification of granule cell branching by Sholl analysis showed no significant differences (p>0.99). Scale bars: 50 μm, mean ± SEM, 2-way ANOVA with Bonferroni correction.(F) Defects in synapse elimination in the inner molecular layer revealed by double immunostaining with PSD95 and VGluT2 antibodies (n=5 mice/genotype). GL indicates granule cell layer, IML/OML indicate inner/outer molecular layer, respectively. Density of colocalized PSD95/VGLuT2 puncta was counted. IML: WT 109±21, crmp2-/- 156±15 (p=0.004). OML: WT 281±38, crmp2-/- 297±80 (p=0.7). Scale bars: 10 μm, mean ± SD, *p<0.05, t-test.(G) Spine density in DiOlistically labeled prefrontal cortex (PFC) is similar in WT and crmp2-/- mice in both juvenile and adult mice. Scale bars: 5 μm. (H) Quantification of dendritic spine density of PFC pyramidal neurons, basal dendrites (WT, juvenile: 8.63±1.44 spines/10 μm, adults: 7.3±1.4; crmp2-/-, juvenile: 9.05±1.73, p=0.97, adults: 6.98±1.53, p>0.99), mean ± SD, 2-way ANOVA with Bonferroni's multiple comparisons test. P25: n=3, ≥50 dendrites; adults: n=3, ≥50 dendrites. "}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", "-", "B", ")", "Ultrasonic", "vocalization", "was", "measured", "at", "P6", ",", "P8", "and", "P12", "(", "WT", "n", "=", "14", "pups", ",", "crmp2", "-", "/", "-", "n", "=", "13", "pups", ")", ".", "In", "crmp2", "-", "/", "-", "mice", ",", "there", "is", "a", "significant", "decrease", "in", "the", "rate", "and", "duration", "of", "calls", "at", "P8", "(", "call", "rate", ",", "WT", "352", "±", "58", "/", "5", "min", ",", "crmp2", "-", "/", "-", "164", "±", "41", "/", "5", "min", ",", "p", "=", "0", ".", "015", ";", "call", "duration", ",", "WT", "9", ".", "52", "±", "2", "ms", ",", "crmp2", "-", "/", "-", "3", ".", "36", "±", "1", "ms", ",", "p", "=", "0", ".", "011", ")", "and", "P12", "(", "call", "rate", ",", "WT", "46", "±", "16", "/", "5", "min", "crmp2", "-", "/", "-", "1", ".", "54", "±", "1", ".", "24", "/", "5", "min", ",", "p", "=", "0", ".", "002", ";", "call", "duration", ",", "WT", "0", ".", "68", "±", "0", ".", "35", "ms", ",", "crmp2", "-", "/", "-", "0", ".", "007", "±", "0", ".", "006", "ms", ",", "p", "=", "0", ".", "002", ")", ".", "Mean", "±", "SEM", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "t", "-", "test", "(", "P6", ",", "P8", ")", ",", "Mann", "-", "Whitney", "test", "(", "P12", ")", ".", "(", "C", ")", "Representative", "sonograms", "of", "the", "P8", "mice", ".", "(", "D", ")", "3", "-", "chamber", "test", "(", "WT", "n", "=", "11", "mice", ",", "crmp2", "-", "/", "-", "n", "=", "13", "mice", ")", ".", "In", "sociability", "phase", ",", "WT", "mice", "spent", "significantly", "more", "time", "with", "a", "social", "partner", "(", "stranger", "1", ")", ",", "unlike", "knockouts", ".", "(", "WT", "-", "stranger", "1", ":", "0", ".", "14", "±", "0", ".", "01", ",", "object", ":", "0", ".", "07", "±", "0", ".", "007", "(", "p", "=", "0", ".", "0001", ")", ";", "crmp2", "-", "/", "-", "-", "stranger", "1", ":", "0", ".", "07", "±", "0", ".", "01", ",", "object", ":", "0", ".", "04", "±", "0", ".", "006", "(", "p", "=", "0", ".", "07", ")", ")", ".", "In", "social", "novelty", "phase", ",", "when", "an", "object", "was", "substituted", "with", "a", "second", "social", "partner", "(", "stranger", "2", ")", ",", "both", "WTs", "and", "knockouts", "preferred", "novel", "mice", "to", "known", "mice", ".", "(", "WT", "-", "stranger", "1", ":", "0", ".", "03", "±", "0", ".", "006", ",", "stranger", "2", ":", "0", ".", "09", "±", "0", ".", "008", "(", "p", "<", "0", ".", "0001", ")", ";", "crmp2", "-", "/", "-", "-", "stranger", "1", ":", "0", ".", "02", "±", "0", ".", "004", ",", "stranger", "2", ":", "0", ".", "05", "±", "0", ".", "01", "(", "p", "=", "0", ".", "02", ")", ")", ".", "Mean", "±", "SEM", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "t", "-", "test", ".", "Elevated", "plus", "maze", "test", "(", "n", "=", "10", "mice", "/", "genotype", ")", ".", "(", "E", ")", "Total", "distance", "walked", "is", "similar", "in", "WT", "and", "crmp2", "-", "/", "-", "(", "WT", "7", ".", "9", "±", "0", ".", "45", "m", ",", "crmp2", "-", "/", "-", "8", ".", "6", "±", "0", ".", "5", "m", ",", "p", "=", "0", ".", "3", ")", ".", "(", "F", ")", "Frequency", "of", "open", "arm", "(", "OA", ")", "visits", "is", "increased", "in", "crmp2", "-", "/", "-", "mice", "suggesting", "decreased", "anxiety", ".", "CA", "denotes", "closed", "arms", ",", "MID", "denotes", "the", "transition", "zone", "between", "arms", ",", "Total", "arm", "visits", "represents", "a", "sum", "of", "visits", "in", "all", "four", "arms", ".", "(", "CA", "frequency", ":", "WT", "13", ".", "7", "±", "0", ".", "9", "/", "5", "min", ",", "crmp2", "-", "/", "-", "10", ".", "5", "±", "1", ".", "1", "/", "5", "min", ",", "p", "=", "0", ".", "04", ";", "OA", "frequency", ":", "WT", "7", ".", "7", "±", "0", ".", "8", "/", "5", "min", ",", "crmp2", "-", "/", "-", "14", ".", "6", "±", "1", ".", "7", "/", "5", "min", ",", "p", "=", "0", ".", "002", ";", "MID", "frequency", ":", "WT", "20", ".", "6", "±", "1", "/", "5", "min", ",", "crmp2", "-", "/", "-", "24", ".", "6", "±", "1", ".", "6", "/", "5", "min", ",", "p", "=", "0", ".", "06", "mean", "±", "SEM", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "t", "-", "test", ".", "Elevated", "plus", "maze", "test", "(", "n", "=", "10", "mice", "/", "genotype", ")", ".", "(", "G", ")", "duration", "of", "open", "arm", "(", "OA", ")", "visits", "is", "increased", "in", "crmp2", "-", "/", "-", "mice", "suggesting", "decreased", "anxiety", ".", "CA", "denotes", "closed", "arms", ",", "MID", "denotes", "the", "transition", "zone", "between", "arms", ",", "Total", "arm", "visits", "represents", "a", "sum", "of", "visits", "in", "all", "four", "arms", ".", "Total", "arm", "visits", ":", "WT", "21", ".", "4", "±", "1", "/", "5", "min", ",", "crmp2", "-", "/", "-", "25", ".", "1", "±", "1", ".", "5", "/", "5", "min", ",", "p", "=", "0", ".", "07", ";", "CA", "duration", ":", "WT", "177", "±", "17", "s", ".", ",", "crmp2", "-", "/", "-", "75", ".", "3", "±", "12", ".", "6", "s", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "OA", "duration", ":", "WT", "42", "±", "12", ".", "6", "s", ",", "crmp2", "-", "/", "-", "144", ".", "4", "±", "21", "s", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "MID", "duration", ":", "WT", "80", ".", "26", "±", "11", ".", "5", "s", ".", ",", "crmp2", "-", "/", "-", "80", ".", "17", "±", "12", ".", "6", "s", ".", ",", "p", "=", "0", ".", "99", ")", ",", "mean", "±", "SEM", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "t", "-", "test", ".", "(", "H", ",", "I", ")", "Y", "maze", "test", "(", "WT", "n", "=", "9", "mice", ",", "crmp2", "-", "/", "-", "n", "=", "8", "mice", ")", ".", "Decreased", "alternations", "between", "arms", "of", "the", "maze", "indicates", "impaired", "working", "memory", "(", "number", "of", "visits", ",", "WT", ":", "23", ".", "1", "±", "1", ".", "9", ",", "crmp2", "-", "/", "-", "30", ".", "4", "±", "3", ".", "8", ",", "p", "=", "0", ".", "12", ";", "alternations", ",", "WT", "68", ".", "8", "±", "2", ".", "5", "%", ",", "crmp2", "-", "/", "-", "57", ".", "3", "±", "2", ".", "5", "%", ",", "p", "=", "0", ".", "006", ")", ",", "mean", "±", "SEM", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A - B) Ultrasonic vocalization was measured at P6, P8 and P12 (WT n=14 pups, crmp2-/- n=13 pups). In crmp2-/- mice, there is a significant decrease in the rate and duration of calls at P8 (call rate, WT 352±58/5 min, crmp2-/- 164±41/5 min, p=0.015; call duration, WT 9.52±2 ms, crmp2-/- 3.36±1 ms, p=0.011) and P12 (call rate, WT 46±16/5 min crmp2-/- 1.54±1.24/5 min, p=0.002; call duration, WT 0.68±0.35 ms, crmp2-/- 0.007±0.006 ms, p=0.002). Mean ± SEM, *p<0.05, t-test (P6, P8), Mann-Whitney test (P12). (C) Representative sonograms of the P8 mice. (D) 3-chamber test (WT n=11 mice, crmp2-/- n=13 mice). In sociability phase, WT mice spent significantly more time with a social partner (stranger 1), unlike knockouts. (WT - stranger 1: 0.14±0.01, object: 0.07±0.007 (p=0.0001); crmp2-/- - stranger 1: 0.07±0.01, object: 0.04±0.006 (p=0.07)). In social novelty phase, when an object was substituted with a second social partner (stranger 2), both WTs and knockouts preferred novel mice to known mice. (WT - stranger 1: 0.03±0.006, stranger 2: 0.09±0.008 (p<0.0001); crmp2-/- - stranger 1: 0.02±0.004, stranger 2: 0.05±0.01 (p=0.02)). Mean ± SEM, *p<0.05, ***p<0.001, t-test.Elevated plus maze test (n=10 mice/genotype). (E) Total distance walked is similar in WT and crmp2-/- (WT 7.9±0.45 m, crmp2-/- 8.6±0.5 m, p=0.3). (F) Frequency of open arm (OA) visits is increased in crmp2-/- mice suggesting decreased anxiety. CA denotes closed arms, MID denotes the transition zone between arms, Total arm visits represents a sum of visits in all four arms. (CA frequency: WT 13.7±0.9/5 min, crmp2-/- 10.5±1.1/5 min, p=0.04; OA frequency: WT 7.7±0.8/5 min, crmp2-/- 14.6±1.7/5 min, p=0.002; MID frequency: WT 20.6±1/5 min, crmp2-/- 24.6±1.6/5 min, p=0.06 mean ± SEM, *p<0.05, ***p<0.001, t-test.Elevated plus maze test (n=10 mice/genotype). (G) duration of open arm (OA) visits is increased in crmp2-/- mice suggesting decreased anxiety. CA denotes closed arms, MID denotes the transition zone between arms, Total arm visits represents a sum of visits in all four arms. Total arm visits: WT 21.4±1/5 min, crmp2-/- 25.1±1.5/5 min, p=0.07; CA duration: WT 177±17 s., crmp2-/- 75.3±12.6 s, p<0.001; OA duration: WT 42±12.6 s, crmp2-/- 144.4±21 s, p<0.001; MID duration: WT 80.26±11.5 s., crmp2-/- 80.17±12.6 s., p=0.99), mean ± SEM, *p<0.05, ***p<0.001, t-test.(H, I) Y maze test (WT n=9 mice, crmp2-/- n=8 mice). Decreased alternations between arms of the maze indicates impaired working memory (number of visits, WT: 23.1±1.9, crmp2-/- 30.4±3.8, p=0.12; alternations, WT 68.8±2.5%, crmp2-/- 57.3±2.5%, p=0.006), mean ± SEM, *p<0.05, t-test."}
{"words": ["figf1", "(", "a", ")", "MN", "-", "1", "cells", "were", "transfected", "with", "mCherry", "-", "EGFP", "-", "LC3", "vector", ",", "fixed", "and", "imaged", "after", "24", "h", ".", "Numbers", "of", "yellow", "puncta", "(", "autophagosomes", ")", "and", "red", "puncta", "(", "autolysosomes", ")", "per", "cell", "were", "counted", ".", "Autophagosomes", ":", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "F", "=", "3", ".", "56", ";", "autolysosomes", ":", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "F", "=", "20", ".", "13", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "with", "post", "hoc", "Tukey", "test", ".", "*", "P", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "001", ".", "n", "=", "34", "cells", "per", "genotype", ".", "(", "b", ")", "We", "transfected", "MEFs", "stably", "expressing", "mCherry", "-", "EGFP", "-", "LC3", "with", "BFP", "-", "tagged", "AR25Q", "or", "AR125Q", ".", "Cells", "were", "imaged", "after", "24", "h", ",", "and", "yellow", "puncta", "(", "autophagosomes", ")", "and", "red", "puncta", "(", "autolysosomes", ")", "in", "AR", "-", "expressing", "(", "blue", ")", "cells", "were", "counted", ".", "Autophagosomes", ":", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "F", "=", "20", ".", "65", ";", "autolysosomes", ":", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "F", "=", "4", ".", "49", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "with", "post", "hoc", "Tukey", "test", ".", "*", "P", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "001", ".", "n", "=", "33", "cells", "per", "genotype", ".", "(", "c", ")", "MN", "-", "1", "cells", "were", "immunoblotted", "for", "LC3", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "ammonium", "chloride", "to", "evaluate", "autophagic", "flux", ".", "A", "representative", "LC3", "western", "blot", "is", "shown", ".", "All", "ratios", "were", "normalized", "to", "MN", "-", "1", "WT", "cells", "at", "baseline", ",", "which", "was", "set", "to", "1", ".", "(", "d", ")", "The", "ratio", "of", "LC3", "-", "II", ":", "actin", "for", "c", "determined", "by", "densitometry", "analysis", "using", "ImageJ", ".", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "F", "=", "0", ".", "4501", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "post", "hoc", "Tukey", "test", ".", "*", "P", "0", ".", "05", ".", "(", "e", ")", "MN", "-", "1", "cells", "were", "treated", "with", "ammonium", "chloride", "to", "block", "lysosomal", "activity", ",", "and", "then", "ammonium", "chloride", "was", "removed", "and", "cells", "were", "allowed", "to", "degrade", "accumulated", "autophagy", "cargo", "during", "a", "6", "-", "h", "recovery", "period", ".", "We", "performed", "p62", "western", "blot", "analysis", "on", "MN", "-", "1", "cells", "at", "baseline", "(", "-", ")", ",", "after", "ammonium", "chloride", "treatment", "(", "+", ")", "and", "after", "the", "recovery", "period", "(", "Rec", ")", ".", "All", "ratios", "were", "normalized", "to", "MN", "-", "1", "WT", "cells", "at", "baseline", ",", "which", "was", "set", "to", "1", ".", "(", "f", ")", "On", "the", "basis", "of", "the", "p62", "values", "obtained", "in", "e", ",", "we", "calculated", "the", "efficiency", "of", "degraded", "accumulated", "autophagic", "cargo", "by", "dividing", "p62", "at", "baseline", "by", "p62", "at", "recovery", "and", "normalized", "the", "baseline", "/", "recovery", "values", "to", "baseline", "/", "recovery", "for", "MN", "-", "1", "WT", "cells", ".", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "F", "=", "5", ".", "45", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "post", "hoc", "Tukey", "test", ".", "*", "P", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "0", ".", "01", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "μm", ".", "Individual", "P", "values", "and", "degrees", "of", "freedom", "are", "available", "in", "the", "Supplementary", "Methods", "Checklist", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf1(a) MN-1 cells were transfected with mCherry-EGFP-LC3 vector, fixed and imaged after 24 h. Numbers of yellow puncta (autophagosomes) and red puncta (autolysosomes) per cell were counted. Autophagosomes: n = 3 independent experiments, F = 3.56; autolysosomes: n = 3 independent experiments, F = 20.13. One-way ANOVA with post hoc Tukey test. *P 0.05, ***P 0.001. n = 34 cells per genotype.(b) We transfected MEFs stably expressing mCherry-EGFP-LC3 with BFP-tagged AR25Q or AR125Q. Cells were imaged after 24 h, and yellow puncta (autophagosomes) and red puncta (autolysosomes) in AR-expressing (blue) cells were counted. Autophagosomes: n = 3 independent experiments, F = 20.65; autolysosomes: n = 3 independent experiments, F = 4.49. One-way ANOVA with post hoc Tukey test. *P 0.05, **P 0.01, ***P 0.001. n = 33 cells per genotype.(c) MN-1 cells were immunoblotted for LC3 in the presence or absence of ammonium chloride to evaluate autophagic flux. A representative LC3 western blot is shown. All ratios were normalized to MN-1 WT cells at baseline, which was set to 1. (d) The ratio of LC3-II:actin for c determined by densitometry analysis using ImageJ. n = 3 independent experiments, F = 0.4501, one-way ANOVA with post hoc Tukey test. *P 0.05.(e) MN-1 cells were treated with ammonium chloride to block lysosomal activity, and then ammonium chloride was removed and cells were allowed to degrade accumulated autophagy cargo during a 6-h recovery period. We performed p62 western blot analysis on MN-1 cells at baseline (-), after ammonium chloride treatment (+) and after the recovery period (Rec). All ratios were normalized to MN-1 WT cells at baseline, which was set to 1. (f) On the basis of the p62 values obtained in e, we calculated the efficiency of degraded accumulated autophagic cargo by dividing p62 at baseline by p62 at recovery and normalized the baseline/recovery values to baseline/recovery for MN-1 WT cells. n = 3 independent experiments, F = 5.45, one-way ANOVA with post hoc Tukey test. *P 0.05, ** P 0.01. Data are presented as mean ± s.e.m. Scale bar, 20 μm. Individual P values and degrees of freedom are available in the Supplementary Methods Checklist."}
{"words": ["figf2", "(", "a", ",", "b", ")", "Electron", "micrographs", "of", "motor", "neuron", "perinuclear", "regions", "from", "age", "-", "matched", "non", "-", "transgenic", "(", "Nt", ")", ",", "YAC", "AR20", "and", "YAC", "AR100", "transgenic", "mice", "before", "disease", "onset", "(", "a", ",", "6", "months", "of", "age", ")", "and", "after", "prominent", "neuromuscular", "and", "molecular", "pathology", "is", "apparent", "(", "b", ",", "14", "months", "of", "age", ")", ".", "(", "a", ")", "At", "6", "months", "of", "age", ",", "occasional", "autophagosomes", "(", "yellow", "arrowheads", ")", "are", "noted", "in", "Nt", ",", "YAC", "AR20", "and", "YAC", "AR100", "at", "roughly", "equivalent", "frequency", ".", "Autolysosomes", "(", "red", "arrowheads", ")", "are", "much", "more", "common", "and", "are", "present", "in", "higher", "numbers", "in", "YAC", "AR20", "and", "YAC", "AR100", "motor", "neurons", ".", "(", "b", ")", "At", "14", "months", "of", "age", ",", "when", "YAC", "AR100", "mice", "display", "signs", "of", "motor", "neuronopathy", "and", "molecular", "pathology", ",", "we", "observed", "many", "YAC", "AR100", "motor", "neuron", "micrographs", "with", "frequent", "autophagosomes", "(", "yellow", "arrowheads", ")", ".", "Despite", "this", "increase", "in", "autophagosomes", ",", "autolysosomes", "were", "fewer", "in", "number", "at", "this", "age", "in", "YAC", "AR100", "motor", "neurons", ",", "such", "that", "autophagosome", "numbers", "approached", "autolysosome", "numbers", "in", "YAC", "AR100", "motor", "neurons", ".", "This", "was", "never", "the", "case", "for", "Nt", "motor", "neurons", "or", "YAC", "AR20", "motor", "neurons", ".", "Main", "panels", "are", "at", "original", "magnification", "2", ",", "200", "×", "and", "insets", "are", "at", "original", "magnification", "3", ",", "700", "×", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf2(a,b) Electron micrographs of motor neuron perinuclear regions from age-matched non-transgenic (Nt), YAC AR20 and YAC AR100 transgenic mice before disease onset (a, 6 months of age) and after prominent neuromuscular and molecular pathology is apparent (b, 14 months of age). (a) At 6 months of age, occasional autophagosomes (yellow arrowheads) are noted in Nt, YAC AR20 and YAC AR100 at roughly equivalent frequency. Autolysosomes (red arrowheads) are much more common and are present in higher numbers in YAC AR20 and YAC AR100 motor neurons. (b) At 14 months of age, when YAC AR100 mice display signs of motor neuronopathy and molecular pathology, we observed many YAC AR100 motor neuron micrographs with frequent autophagosomes (yellow arrowheads). Despite this increase in autophagosomes, autolysosomes were fewer in number at this age in YAC AR100 motor neurons, such that autophagosome numbers approached autolysosome numbers in YAC AR100 motor neurons. This was never the case for Nt motor neurons or YAC AR20 motor neurons. Main panels are at original magnification 2,200× and insets are at original magnification 3,700×."}
{"words": ["figf3", "(", "a", ")", "Mean", "number", "of", "autophagosomes", "per", "motor", "neuron", "field", "in", "electron", "micrographs", "from", "non", "-", "transgenic", "(", "Nt", ")", ",", "YAC", "AR20", "and", "YAC", "AR100", "transgenic", "mice", "at", "6", "and", "14", "months", "of", "age", ",", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "6", "months", ":", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "F", "=", "0", ".", "63", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "post", "hoc", "Tukey", "test", ".", "P", "=", "0", ".", "534", ".", "14", "months", ":", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "F", "=", "4", ".", "32", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "post", "hoc", "Tukey", "test", ".", "*", "P", "0", ".", "05", ".", "(", "b", ")", "Mean", "number", "of", "autolysosomes", "per", "motor", "neuron", "field", "in", "electron", "micrographs", "from", "Nt", ",", "YAC", "AR20", "and", "YAC", "AR100", "transgenic", "mice", "at", "6", "and", "14", "months", "of", "age", ",", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "6", "months", ":", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "F", "=", "4", ".", "18", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "post", "hoc", "Tukey", "test", ".", "*", "P", "0", ".", "05", ".", "14", "months", ":", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "F", "=", "4", ".", "56", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "post", "hoc", "Tukey", "test", ".", "*", "P", "0", ".", "05", ".", "(", "c", ")", "Mean", "autophagy", "index", ",", "dividing", "number", "of", "autolysosome", "by", "number", "of", "autophagosomes", "for", "each", "motor", "neuron", "field", ",", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "At", "6", "months", ",", "YAC", "AR100", "motor", "neurons", "displayed", "a", "markedly", "increased", "autophagy", "index", ";", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "F", "=", "129", ".", "81", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "post", "hoc", "Tukey", "test", ".", "*", "*", "P", "0", ".", "01", ".", "However", ",", "once", "YAC", "AR100", "mice", "develop", "disease", "pathology", "at", "14", "months", ",", "the", "autophagy", "index", "for", "YAC", "AR100", "motor", "neurons", "is", "significantly", "decreased", ";", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "F", "=", "82", ".", "82", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "post", "hoc", "Tukey", "test", ".", "*", "*", "P", "0", ".", "01", ".", "Individual", "P", "values", "and", "degrees", "of", "freedom", "are", "available", "in", "the", "Supplementary", "Methods", "Checklist", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf3(a) Mean number of autophagosomes per motor neuron field in electron micrographs from non-transgenic (Nt), YAC AR20 and YAC AR100 transgenic mice at 6 and 14 months of age, ± s.e.m. 6 months: n = 3 independent experiments, F = 0.63, one-way ANOVA with post hoc Tukey test. P = 0.534. 14 months: n = 3 independent experiments, F = 4.32, one-way ANOVA with post hoc Tukey test. *P 0.05. (b) Mean number of autolysosomes per motor neuron field in electron micrographs from Nt, YAC AR20 and YAC AR100 transgenic mice at 6 and 14 months of age, ± s.e.m. 6 months: n = 3 independent experiments, F = 4.18, one-way ANOVA with post hoc Tukey test. *P 0.05. 14 months: n = 3 independent experiments, F = 4.56, one-way ANOVA with post hoc Tukey test. *P 0.05. (c) Mean autophagy index, dividing number of autolysosome by number of autophagosomes for each motor neuron field, ± s.e.m. At 6 months, YAC AR100 motor neurons displayed a markedly increased autophagy index; n = 3 independent experiments, F = 129.81, one-way ANOVA with post hoc Tukey test. **P 0.01. However, once YAC AR100 mice develop disease pathology at 14 months, the autophagy index for YAC AR100 motor neurons is significantly decreased; n = 3 independent experiments, F = 82.82, one-way ANOVA with post hoc Tukey test. **P 0.01. Individual P values and degrees of freedom are available in the Supplementary Methods Checklist."}
{"words": ["figf4", "(", "a", ")", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "TFEB", "and", "AR25Q", "or", "AR125Q", ",", "as", "indicated", ".", "Immunoprecipitation", "(", "IP", ")", "was", "performed", "with", "anti", "-", "TFEB", "antibody", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "(", "IB", ")", "for", "TFEB", "and", "AR", ".", "Untransfected", "HEK293", "cells", "served", "as", "a", "negative", "control", ",", "and", "no", "AR", "was", "observed", "with", "IgG", "antibody", "only", "(", "not", "shown", ")", ".", "(", "b", ")", "We", "transfected", "MN", "-", "1", "cells", "with", "the", "4X", "-", "CLEAR", "luciferase", "reporter", "and", "treated", "cells", "with", "sucrose", "to", "induce", "TFEB", "activation", ".", "Untreated", ":", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "F", "=", "3", ".", "48", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "post", "hoc", "Tukey", "test", ".", "*", "*", "P", "0", ".", "01", ".", "Sucrose", "treatment", ":", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "*", "*", "P", "0", ".", "01", ",", "t", "-", "test", ",", "WT", "t", "(", "10", ")", "=", "8", ".", "133", ";", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "001", ",", "t", "-", "test", ",", "AR", "24Q", "t", "(", "10", ")", "=", "6", ".", "11", ";", "P", "not", "significant", "(", "n", ".", "s", ".", ")", ",", "AR", "65Q", "t", "(", "10", ")", "=", "0", ".", "644", ".", "Sucrose", "-", "treated", "MN", "-", "1", "AR24Q", "cells", "displayed", "significantly", "higher", "4X", "-", "CLEAR", "luciferase", "activity", ":", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "F", "=", "2", ".", "49", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "post", "hoc", "Tukey", "test", ".", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "001", ".", "All", "ratios", "were", "normalized", "to", "untreated", "MN", "-", "1", "WT", "cells", ",", "whose", "value", "was", "set", "to", "1", ".", "(", "c", ")", "We", "exposed", "MN", "-", "1", "cells", "to", "ammonium", "chloride", ",", "an", "inhibitor", "of", "lysosomal", "activity", ",", "to", "determine", "the", "capacity", "for", "TFEB", "induction", ".", "RT", "-", "PCR", "analysis", "revealed", "lack", "of", "TFEB", "target", "gene", "induction", "in", "MN", "-", "1", "AR65Q", "cells", "for", "four", "gene", "targets", ":", "Lamp1", "(", "lysosomal", "-", "associated", "membrane", "protein", "1", ")", ",", "F", "=", "37", ".", "51", ";", "Atp6v1h", "(", "vesicular", "ATPase", "V1", "subunit", "H", ")", ",", "F", "=", "57", ".", "26", ";", "Mcoln1", "(", "mucolipin", "1", ")", ",", "F", "=", "251", ".", "0", ";", "and", "Gla", "(", "galactosidase", "-", "α", ")", ",", "F", "=", "75", ".", "51", ";", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "*", "P", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "0", ".", "01", ",", "ANOVA", "with", "post", "hoc", "Tukey", "test", ".", "For", "Lamp1", "and", "Mcoln1", ",", "MN", "-", "1", "AR24Q", "cells", "yielded", "significantly", "higher", "expression", ".", "Differences", "in", "the", "expression", "of", "TFEB", "target", "genes", "at", "baseline", "were", "negligible", ".", "(", "d", ")", "We", "measured", "expression", "levels", "of", "TFEB", "target", "genes", "in", "E13", "motor", "neurons", "derived", "from", "non", "-", "transgenic", "(", "Nt", ")", ",", "YAC", "AR20", "and", "YAC", "AR100", "mice", "by", "RT", "-", "PCR", "analysis", ":", "Ctsf", "(", "cathepsin", "F", ")", ",", "F", "=", "4", ".", "63", ";", "Mcoln1", ",", "F", "=", "6", ".", "64", ";", "Atp6v1h", ",", "F", "=", "5", ".", "6", ";", "and", "Gla", ",", "F", "=", "5", ".", "65", ";", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "*", "P", "0", ".", "05", ",", "ANOVA", "with", "post", "hoc", "Tukey", "test", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Individual", "P", "values", "and", "degrees", "of", "freedom", "are", "available", "in", "the", "Supplementary", "Methods", "Checklist", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf4(a) HEK293 cells were transfected with TFEB and AR25Q or AR125Q, as indicated. Immunoprecipitation (IP) was performed with anti-TFEB antibody, followed by immunoblotting (IB) for TFEB and AR. Untransfected HEK293 cells served as a negative control, and no AR was observed with IgG antibody only (not shown).(b) We transfected MN-1 cells with the 4X-CLEAR luciferase reporter and treated cells with sucrose to induce TFEB activation. Untreated: n = 3 independent experiments, F = 3.48, one-way ANOVA with post hoc Tukey test. **P 0.01. Sucrose treatment: n = 3 independent experiments, **P 0.01, t-test, WT t(10) = 8.133; ***P 0.001, t-test, AR 24Q t(10) = 6.11; P not significant (n.s.), AR 65Q t(10) = 0.644. Sucrose-treated MN-1 AR24Q cells displayed significantly higher 4X-CLEAR luciferase activity: n = 3 independent experiments, F = 2.49, one-way ANOVA with post hoc Tukey test. ***P 0.001. All ratios were normalized to untreated MN-1 WT cells, whose value was set to 1.(c) We exposed MN-1 cells to ammonium chloride, an inhibitor of lysosomal activity, to determine the capacity for TFEB induction. RT-PCR analysis revealed lack of TFEB target gene induction in MN-1 AR65Q cells for four gene targets: Lamp1 (lysosomal-associated membrane protein 1), F = 37.51; Atp6v1h (vesicular ATPase V1 subunit H), F = 57.26; Mcoln1 (mucolipin 1), F = 251.0; and Gla (galactosidase-α), F = 75.51; n = 3 independent experiments, *P 0.05, **P 0.01, ANOVA with post hoc Tukey test. For Lamp1 and Mcoln1, MN-1 AR24Q cells yielded significantly higher expression. Differences in the expression of TFEB target genes at baseline were negligible.(d) We measured expression levels of TFEB target genes in E13 motor neurons derived from non-transgenic (Nt), YAC AR20 and YAC AR100 mice by RT-PCR analysis: Ctsf (cathepsin F), F = 4.63; Mcoln1, F = 6.64; Atp6v1h, F = 5.6; and Gla, F = 5.65; n = 3 independent experiments, *P 0.05, ANOVA with post hoc Tukey test. Data are presented as mean ± s.e.m. Individual P values and degrees of freedom are available in the Supplementary Methods Checklist."}
{"words": ["figf5", "(", "a", ")", "We", "transfected", "MN", "-", "1", "cells", "with", "the", "4X", "-", "CLEAR", "luciferase", "reporter", "and", "with", "BFP", "-", "tagged", "TFEB", "or", "BFP", "empty", "vector", ",", "and", "then", "measured", "luciferase", "activity", ".", "Marked", "induction", "of", "luciferase", "activity", "occurred", "with", "BFP", "-", "TFEB", ";", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "001", ",", "t", "-", "test", ",", "WT", "t", "(", "4", ")", "=", "48", ".", "79", ";", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "001", ",", "t", "-", "test", ",", "AR", "24Q", "t", "(", "4", ")", "=", "22", ".", "91", ";", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "001", ",", "t", "-", "test", ",", "AR", "65Q", "t", "(", "4", ")", "=", "14", ".", "02", ".", "Results", "for", "each", "line", "were", "normalized", "to", "the", "BFP", "-", "empty", "luciferase", "activity", ".", "(", "b", ")", "We", "transfected", "MN", "-", "1", "AR65Q", "cells", "with", "the", "4X", "-", "CLEAR", "luciferase", "reporter", "and", "with", "BFP", "-", "TFEB", "or", "BFP", "empty", "vector", "and", "subjected", "the", "MN", "-", "1", "AR65Q", "cells", "to", "conditions", "that", "promote", "TFEB", "activation", ",", "as", "shown", ".", "MN", "-", "1", "WT", "cells", "were", "also", "transfected", "with", "the", "4X", "-", "CLEAR", "luciferase", "reporter", "and", "BFP", "empty", "vector", "and", "subjected", "to", "the", "identical", "treatments", "for", "control", "purposes", ".", "Results", "are", "shown", "normalized", "to", "untreated", "MN", "-", "1", "WT", "cells", "expressing", "BFP", "-", "empty", ".", "Untreated", ",", "F", "=", "182", ".", "7", ";", "starvation", ",", "F", "=", "63", ".", "64", ";", "NH4Cl", ",", "F", "=", "291", ".", "9", ";", "Rapamycin", ",", "F", "=", "3128", ";", "ANOVA", "with", "post", "hoc", "Tukey", "test", ".", "*", "*", "P", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "001", ".", "(", "c", ")", "We", "transfected", "MN", "-", "1", "AR65Q", "cells", "with", "the", "mCherry", "-", "EGFP", "-", "LC3", "construct", "and", "with", "either", "BFP", "-", "empty", "or", "BFP", "-", "TFEB", ".", "Autophagic", "vesicles", "forming", "in", "BFP", "-", "expressing", "cells", "were", "then", "detected", "as", "red", ",", "green", "or", "yellow", "puncta", ",", "as", "shown", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "μm", ".", "(", "d", ")", "Left", ",", "quantification", "of", "autophagic", "vesicle", "type", ".", "Note", "marked", "reduction", "in", "autophagosomes", "in", "MN", "-", "1", "AR65Q", "cells", "expressing", "BFP", "-", "TFEB", ";", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "F", "=", "16", ".", "596", ",", "ANOVA", "with", "post", "hoc", "Tukey", "test", ".", "*", "*", "P", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "001", ".", "Right", ",", "calculation", "of", "the", "autophagy", "index", ";", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "F", "=", "24", ".", "43", ",", "ANOVA", "with", "post", "hoc", "Tukey", "test", ".", "*", "*", "P", "0", ".", "01", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Individual", "P", "values", "and", "degrees", "of", "freedom", "are", "available", "in", "the", "Supplementary", "Methods", "Checklist", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf5(a) We transfected MN-1 cells with the 4X-CLEAR luciferase reporter and with BFP-tagged TFEB or BFP empty vector, and then measured luciferase activity. Marked induction of luciferase activity occurred with BFP-TFEB; n = 3 independent experiments, ***P 0.001, t-test, WT t(4) = 48.79; ***P 0.001, t-test, AR 24Q t(4) = 22.91; ***P 0.001, t-test, AR 65Q t(4) = 14.02. Results for each line were normalized to the BFP-empty luciferase activity.(b) We transfected MN-1 AR65Q cells with the 4X-CLEAR luciferase reporter and with BFP-TFEB or BFP empty vector and subjected the MN-1 AR65Q cells to conditions that promote TFEB activation, as shown. MN-1 WT cells were also transfected with the 4X-CLEAR luciferase reporter and BFP empty vector and subjected to the identical treatments for control purposes. Results are shown normalized to untreated MN-1 WT cells expressing BFP-empty. Untreated, F = 182.7; starvation, F = 63.64; NH4Cl, F = 291.9; Rapamycin, F = 3128; ANOVA with post hoc Tukey test. **P 0.01, ***P 0.001.(c) We transfected MN-1 AR65Q cells with the mCherry-EGFP-LC3 construct and with either BFP-empty or BFP-TFEB. Autophagic vesicles forming in BFP-expressing cells were then detected as red, green or yellow puncta, as shown. Scale bar, 20 μm. (d) Left, quantification of autophagic vesicle type. Note marked reduction in autophagosomes in MN-1 AR65Q cells expressing BFP-TFEB; n = 3 independent experiments, F = 16.596, ANOVA with post hoc Tukey test. **P 0.01, ***P 0.001. Right, calculation of the autophagy index; n = 3 independent experiments, F = 24.43, ANOVA with post hoc Tukey test. **P 0.01. Data are presented as mean ± s.e.m. Individual P values and degrees of freedom are available in the Supplementary Methods Checklist."}
{"words": ["figf6", "(", "b", ")", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "TFEB", "and", "influenza", "hemagglutinin", "(", "HA", ")", "-", "tagged", "full", "-", "length", "AR25", "(", "FL", ")", "or", "a", "C", "-", "terminal", "AR", "mutant", "(", "m1", ",", "m2", ",", "m3", ",", "m4", ")", ".", "Immunoprecipitation", "(", "IP", ")", "was", "performed", "with", "anti", "-", "TFEB", "antibody", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "(", "IB", ")", "for", "TFEB", "and", "AR", ".", "Untransfected", "HEK293", "cells", "served", "as", "a", "negative", "control", ",", "and", "no", "AR", "was", "observed", "with", "IgG", "antibody", "only", "(", "not", "shown", ")", ".", "(", "c", ")", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "TFEB", "and", "HA", "-", "tagged", "N", "-", "terminal", "AR", "mutant", "containing", "a", "19Q", "or", "112Q", "tract", "(", "NT19Q", ",", "NT112Q", ")", ".", "Immunoprecipitation", "was", "performed", "as", "in", "b", ".", "with", "anti", "-", "TFEB", "antibody", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "(", "IB", ")", "for", "TFEB", "and", "AR", ".", "Untransfected", "HEK293", "cells", "served", "as", "a", "negative", "control", ",", "and", "no", "AR", "was", "observed", "with", "IgG", "antibody", "only", "(", "not", "shown", ")", ".", "(", "d", ")", "MN", "-", "1", "WT", ",", "MN", "-", "1", "AR24Q", "and", "MN", "-", "1", "AR65Q", "cells", "were", "cultured", "in", "standard", "medium", "(", "Ctl", ")", "or", "in", "medium", "supplemented", "with", "R1881", "and", "then", "immunostained", "with", "antibodies", "to", "AR", "and", "to", "TFEB", ".", "Cells", "were", "scored", "for", "nuclear", "or", "cytosolic", "localization", "of", "TFEB", ".", "Scale", "bars", ",", "20", "μm", ".", "(", "e", ")", "Quantification", "of", "d", ".", "Untreated", ",", "F", "=", "0", ".", "56", ";", "R1881", ",", "F", "=", "5", ".", "51", ";", "ANOVA", "with", "post", "hoc", "Tukey", "test", ".", "*", "*", "P", "0", ".", "01", ".", "(", "f", ")", "We", "transfected", "MN", "-", "1", "WT", "cells", "with", "the", "4X", "-", "CLEAR", "luciferase", "reporter", "and", "either", "BFP", "-", "empty", "or", "AR25Q", "-", "BFP", ",", "under", "standard", "culture", "conditions", "(", "control", ")", ",", "ammonium", "chloride", "treatment", "or", "rapamycin", "treatment", ".", "Control", ",", "t", "(", "3", ")", "=", "15", ".", "73", ";", "NH4Cl", ",", "t", "(", "4", ")", "=", "4", ".", "108", ";", "rapamycin", ".", "t", "(", "4", ")", "=", "4", ".", "58", ";", "t", "-", "test", ".", "*", "*", "P", "0", ".", "01", ".", "(", "g", ")", "We", "transfected", "MN", "-", "1", "AR24Q", "cells", "with", "either", "scrambled", "shRNA", "control", "vector", "or", "AR", "shRNA", "vector", "and", "measured", "4X", "-", "CLEAR", "luciferase", "reporter", "activity", "under", "baseline", "conditions", "(", "control", ")", "or", "after", "rapamycin", ".", "Control", ",", "t", "(", "4", ")", "=", "0", ".", "51", ";", "rapamycin", ",", "t", "(", "4", ")", "=", "7", ".", "15", ";", "t", "-", "test", ".", "*", "*", "P", "0", ".", "01", ".", "(", "h", ")", "RT", "-", "PCR", "analysis", "of", "MN", "-", "1", "AR24Q", "cells", "transfected", "with", "scrambled", "shRNA", "control", "or", "AR", "shRNA", "vector", ":", "Gla", ",", "t", "(", "4", ")", "=", "4", ".", "77", ";", "Atp6v1h", ",", "t", "(", "4", ")", "=", "3", ".", "75", ";", "Mcoln1", ",", "t", "(", "4", ")", "=", "13", ".", "74", ";", "Ctsd", "(", "cathepsin", "D", ")", ",", "t", "(", "4", ")", "=", "7", ".", "91", ";", "and", "Lamp1", ",", "t", "(", "4", ")", "=", "6", ".", "46", ";", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "*", "P", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "0", ".", "01", ",", "t", "-", "test", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Individual", "P", "values", "and", "degrees", "of", "freedom", "are", "available", "in", "the", "Supplementary", "Methods", "Checklist", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf6(b) HEK293 cells were transfected with TFEB and influenza hemagglutinin (HA)-tagged full-length AR25 (FL) or a C-terminal AR mutant (m1, m2, m3, m4). Immunoprecipitation (IP) was performed with anti-TFEB antibody, followed by immunoblotting (IB) for TFEB and AR. Untransfected HEK293 cells served as a negative control, and no AR was observed with IgG antibody only (not shown).(c) HEK293 cells were transfected with TFEB and HA-tagged N-terminal AR mutant containing a 19Q or 112Q tract (NT19Q, NT112Q). Immunoprecipitation was performed as in b. with anti-TFEB antibody, followed by immunoblotting (IB) for TFEB and AR. Untransfected HEK293 cells served as a negative control, and no AR was observed with IgG antibody only (not shown).(d) MN-1 WT, MN-1 AR24Q and MN-1 AR65Q cells were cultured in standard medium (Ctl) or in medium supplemented with R1881 and then immunostained with antibodies to AR and to TFEB. Cells were scored for nuclear or cytosolic localization of TFEB. Scale bars, 20 μm. (e) Quantification of d. Untreated, F = 0.56; R1881, F = 5.51; ANOVA with post hoc Tukey test. **P 0.01.(f) We transfected MN-1 WT cells with the 4X-CLEAR luciferase reporter and either BFP-empty or AR25Q-BFP, under standard culture conditions (control), ammonium chloride treatment or rapamycin treatment. Control, t(3) = 15.73; NH4Cl, t(4) = 4.108; rapamycin. t(4) = 4.58; t-test. **P 0.01.(g) We transfected MN-1 AR24Q cells with either scrambled shRNA control vector or AR shRNA vector and measured 4X-CLEAR luciferase reporter activity under baseline conditions (control) or after rapamycin. Control, t(4) = 0.51; rapamycin, t(4) = 7.15; t-test. **P 0.01.(h) RT-PCR analysis of MN-1 AR24Q cells transfected with scrambled shRNA control or AR shRNA vector: Gla, t(4) = 4.77; Atp6v1h, t(4) = 3.75; Mcoln1, t(4) = 13.74; Ctsd (cathepsin D), t(4) = 7.91; and Lamp1, t(4) = 6.46; n = 3 independent experiments, *P 0.05, **P 0.01, t-test. Data are presented as mean ± s.e.m. Individual P values and degrees of freedom are available in the Supplementary Methods Checklist."}
{"words": ["figf7", "(", "a", ")", "We", "performed", "filter", "-", "trap", "assays", "to", "determine", "the", "extent", "of", "accumulation", "of", "insoluble", "AR", "protein", "in", "NPC", "lines", "from", "three", "different", "controls", "and", "three", "different", "SBMA", "patients", ".", "Significantly", "higher", "levels", "of", "insoluble", "AR", "protein", "were", "present", "in", "the", "SBMA", "NPC", "lines", ",", "as", "based", "on", "densitometry", ";", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "P", "0", ".", "05", ",", "t", "-", "test", ",", "t", "(", "4", ")", "=", "4", ".", "026", ".", "AU", ",", "arbitrary", "units", ".", "(", "b", ")", "NPCs", "from", "three", "different", "controls", "and", "three", "different", "SBMA", "patients", "were", "cultured", "in", "the", "presence", "of", "JC", "-", "1", "dye", ".", "Results", "are", "presented", "as", "a", "Tukey", "box", "plots", "with", "box", "corresponding", "to", "first", "to", "third", "quartiles", "from", "the", "median", "and", "whiskers", "corresponding", "to", "1", ".", "5", "quartiles", "from", "the", "median", ";", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "*", "P", "0", ".", "05", ",", "t", "-", "test", ",", "t", "(", "4", ")", "=", "3", ".", "983", ".", "(", "c", ")", "We", "transfected", "NPC", "lines", "derived", "from", "SBMA", "patients", "and", "controls", "(", "three", "different", "NPC", "lines", "per", "patient", ")", "with", "the", "mCherry", "-", "EGFP", "-", "LC3", "vector", ".", "Autophagic", "vesicles", "were", "detected", "as", "colored", "puncta", ",", "as", "shown", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "(", "d", ")", "Quantification", "of", "autophagic", "vesicle", "type", "from", "c", ".", "SBMA", "NPCs", "exhibit", "a", "significant", "increase", "in", "autophagosomes", ";", "n", "=", "18", "different", "samples", ":", "3", "clones", "per", "line", ",", "3", "lines", "per", "group", ",", "*", "P", "0", ".", "05", ",", "t", "-", "test", ";", "t", "(", "18", ")", "=", "2", ".", "3799", "(", "autophagosomes", ")", ".", "(", "e", ")", "We", "isolated", "RNAs", "from", "SBMA", "and", "control", "NPC", "lines", "(", "three", "different", "NPC", "lines", "per", "human", "subject", ")", "and", "then", "measured", "the", "expression", "levels", "of", "TFEB", "target", "genes", "including", "CYCS", "(", "cytochrome", "c", ")", ",", "t", "(", "4", ")", "=", "2", ".", "844", ";", "MCOLN1", ",", "t", "(", "4", ")", "=", "3", ".", "246", ";", "GLA", ",", "t", "(", "4", ")", "=", "3", ".", "174", ";", "ACADM", "(", "acyl", "-", "CoA", "dehydrogenase", ")", ",", "t", "(", "4", ")", "=", "4", ".", "405", ";", "COX6A1", "(", "cytochrome", "oxidase", "6A1", ")", ",", "t", "(", "4", ")", "=", "5", ".", "584", ";", "and", "the", "TFEB", "gene", "itself", ",", "t", "(", "4", ")", "=", "0", ".", "593", ".", "Significant", "expression", "reductions", "were", "noted", "in", "SBMA", "NPC", "lines", "for", "all", "tested", "TFEB", "target", "genes", ".", "*", "P", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "0", ".", "01", ".", "Data", "in", "d", ",", "e", "are", "presented", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Individual", "P", "values", "and", "degrees", "of", "freedom", "are", "available", "in", "the", "Supplementary", "Methods", "Checklist", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf7(a) We performed filter-trap assays to determine the extent of accumulation of insoluble AR protein in NPC lines from three different controls and three different SBMA patients. Significantly higher levels of insoluble AR protein were present in the SBMA NPC lines, as based on densitometry; n = 3 independent experiments, P 0.05, t-test, t(4) = 4.026. AU, arbitrary units.(b) NPCs from three different controls and three different SBMA patients were cultured in the presence of JC-1 dye. Results are presented as a Tukey box plots with box corresponding to first to third quartiles from the median and whiskers corresponding to 1.5 quartiles from the median; n = 3 independent experiments, *P 0.05, t-test, t(4) = 3.983.(c) We transfected NPC lines derived from SBMA patients and controls (three different NPC lines per patient) with the mCherry-EGFP-LC3 vector. Autophagic vesicles were detected as colored puncta, as shown. Scale bar, 10 μm. (d) Quantification of autophagic vesicle type from c. SBMA NPCs exhibit a significant increase in autophagosomes; n = 18 different samples: 3 clones per line, 3 lines per group, *P 0.05, t-test; t(18) = 2.3799 (autophagosomes).(e) We isolated RNAs from SBMA and control NPC lines (three different NPC lines per human subject) and then measured the expression levels of TFEB target genes including CYCS (cytochrome c), t(4) = 2.844; MCOLN1, t(4) = 3.246; GLA, t(4) = 3.174; ACADM (acyl-CoA dehydrogenase), t(4) = 4.405; COX6A1 (cytochrome oxidase 6A1), t(4) = 5.584; and the TFEB gene itself, t(4) = 0.593. Significant expression reductions were noted in SBMA NPC lines for all tested TFEB target genes. *P 0.05, **P 0.01. Data in d,e are presented as mean ± s.e.m. Individual P values and degrees of freedom are available in the Supplementary Methods Checklist."}
{"words": ["figf8", "(", "a", ")", "Control", "and", "SBMA", "NPC", "lines", "were", "maintained", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "the", "AR", "ligand", "dihydrotestosterone", "(", "DHT", ")", "and", "then", "harvested", "for", "immunoblotting", "analysis", "after", "TFEB", "antibody", "immunoprecipitation", "(", "IP", ")", ".", "Immunoblotting", "(", "IB", ")", "for", "AR", "confirmed", "expression", "of", "AR", "in", "control", "(", "Ctrl", ")", "and", "SBMA", "NPCs", ",", "and", "immunoblotting", "for", "TFEB", "confirmed", "the", "interaction", "of", "AR", "with", "TFEB", "in", "both", "control", "and", "SBMA", "NPCs", ".", "(", "b", ")", "We", "transfected", "SBMA", "NPC", "lines", "(", "three", "different", "NPC", "lines", "per", "patient", ")", "with", "either", "the", "BFP", "-", "empty", "vector", "or", "BFP", "-", "TFEB", "expression", "construct", ",", "treated", "the", "NPCs", "with", "JC", "-", "1", "dye", "and", "counted", "the", "percentage", "of", "cells", "with", "depolarized", "mitochondria", ".", "Results", "are", "presented", "as", "Tukey", "box", "plots", "with", "boxes", "corresponding", "to", "first", "and", "third", "quartiles", "from", "the", "median", "and", "whiskers", "corresponding", "to", "1", ".", "5", "quartiles", "from", "the", "median", ";", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "*", "P", "0", ".", "05", ",", "t", "-", "test", ",", "t", "(", "6", ")", "=", "3", ".", "217", ".", "(", "c", ")", "Representative", "images", "from", "transfection", "of", "SBMANPCs", "with", "the", "mCherry", "-", "EGFP", "-", "LC3", "vector", "and", "either", "BFP", "-", "empty", "vector", "or", "BFP", "-", "TFEB", "expression", "construct", ".", "BFP", "-", "empty", "vector", "-", "expressing", "SBMANPCs", "display", "a", "preponderance", "of", "yellow", "puncta", "(", "autophagosomes", ")", ",", "while", "BFP", "-", "TFEB", "-", "expressing", "SBMANPCs", "exhibit", "a", "shift", "toward", "almost", "entirely", "red", "puncta", "(", "autolysosomes", ")", ",", "consistent", "with", "rescue", "of", "the", "autophagic", "flux", "defect", ".", "Scale", "bars", ",", "20", "μm", ".", "(", "d", ")", "We", "transfected", "SBMANPC", "lines", "(", "three", "different", "NPC", "lines", "per", "patient", ")", "with", "the", "mCherry", "-", "EGFP", "-", "LC3", "vector", "and", "either", "BFP", "-", "empty", "vector", "or", "BFP", "-", "TFEB", "expression", "construct", ",", "counted", "the", "number", "of", "autophagosomes", "and", "autolysosomes", "in", "BFP", "-", "expressing", "NPCs", "and", "determined", "the", "number", "of", "autophagic", "vesicles", "per", "cell", ".", "TFEB", "overexpression", "markedly", "reduced", "autophagosome", "formation", "in", "SBMANPCs", ".", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "001", ";", "t", "-", "test", ",", "t", "(", "30", ")", "=", "4", ".", "373", ".", "Data", "in", "d", "are", "presented", "as", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Individual", "P", "values", "are", "available", "in", "the", "Supplementary", "Methods", "Checklist", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf8(a) Control and SBMA NPC lines were maintained in the presence or absence of the AR ligand dihydrotestosterone (DHT) and then harvested for immunoblotting analysis after TFEB antibody immunoprecipitation (IP). Immunoblotting (IB) for AR confirmed expression of AR in control (Ctrl) and SBMA NPCs, and immunoblotting for TFEB confirmed the interaction of AR with TFEB in both control and SBMA NPCs.(b) We transfected SBMA NPC lines (three different NPC lines per patient) with either the BFP-empty vector or BFP-TFEB expression construct, treated the NPCs with JC-1 dye and counted the percentage of cells with depolarized mitochondria. Results are presented as Tukey box plots with boxes corresponding to first and third quartiles from the median and whiskers corresponding to 1.5 quartiles from the median; n = 3 independent experiments, *P 0.05, t-test, t(6) = 3.217.(c) Representative images from transfection of SBMANPCs with the mCherry-EGFP-LC3 vector and either BFP-empty vector or BFP-TFEB expression construct. BFP-empty vector-expressing SBMANPCs display a preponderance of yellow puncta (autophagosomes), while BFP-TFEB-expressing SBMANPCs exhibit a shift toward almost entirely red puncta (autolysosomes), consistent with rescue of the autophagic flux defect. Scale bars, 20 μm. (d) We transfected SBMANPC lines (three different NPC lines per patient) with the mCherry-EGFP-LC3 vector and either BFP-empty vector or BFP-TFEB expression construct, counted the number of autophagosomes and autolysosomes in BFP-expressing NPCs and determined the number of autophagic vesicles per cell. TFEB overexpression markedly reduced autophagosome formation in SBMANPCs. ***P 0.001; t-test, t(30) = 4.373. Data in d are presented as mean ± s.e.m. Individual P values are available in the Supplementary Methods Checklist."}
{"words": ["Figure", "1Detection", "of", "NRPB2WT", "-", "FLAG", ",", "NRPB2P979S", "-", "FLAG", "and", "NRPB2Y732F", "-", "FLAG", "protein", "by", "western", "blotting", "in", "NRPB2WT", "-", "FLAG", "Col", "-", "0", ",", "NRPB2P979S", "-", "FLAG", "Col", "-", "0", "and", "NRPB2Y732F", "-", "FLAG", "Col", "-", "0", "plants", ".", "Untagged", "NRPB2", "(", "Col", "-", "0", ")", "was", "used", "as", "a", "negative", "control", ".", "Histone", "H3", "was", "used", "as", "an", "internal", "control", "and", "total", "protein", "level", "detected", "by", "stain", "-", "free", "blot", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Quantification", "was", "done", "by", "normalizing", "to", "the", "loading", "control", "and", "anti", "-", "H3", "blot", "based", "on", "3", "independent", "replicates", ".", "Transmission", "rate", "of", "nrpb2", "-", "2", "allele", "in", "nrpb2", "-", "2", "+", "/", "-", "line", "(", "n", "=", "197", ")", "and", "nrpb2", "-", "+", "/", "-", "lines", "combined", "with", "homozygous", "NRPB2P979S", "-", "FLAG", "+", "/", "+", "(", "n", "=", "280", ")", ",", "NRPB2Y732F", "-", "FLAG", "+", "/", "+", "(", "n", "=", "240", ")", "and", "NRPB2WT", "-", "FLAG", "+", "/", "+", "(", "n", "=", "210", ")", ",", "respectively", ".", "Fisher", "´", "s", "exact", "test", "was", "used", "as", "a", "statistic", "test", ",", "three", "asterisks", "denote", "p", "<", "0", ".", "001", "between", "samples", "and", "n", ".", "s", ".", "stands", "for", "not", "significant", ".", "Image", "of", "homozygous", "mutant", "nrpb2", "-", "2", "fully", "complemented", "by", "NRPB2WT", "-", "FLAG", "(", "top", ",", "NRPB2WT", "+", "/", "+", "nrpb2", "-", "2", "-", "/", "-", ")", "and", "partially", "complemented", "by", "NRPB2Y732F", "-", "FLAG", "(", "bottom", ",", "NRPB2WT", "+", "/", "+", "nrpb2", "-", "2", "-", "/", "-", ")", ".", "Plants", "were", "grown", "for", "4", "weeks", "in", "soil", ".", "Scale", "bars", "represent", "1", "cm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Detection of NRPB2WT-FLAG, NRPB2P979S-FLAG and NRPB2Y732F-FLAG protein by western blotting in NRPB2WT-FLAG Col-0, NRPB2P979S-FLAG Col-0 and NRPB2Y732F-FLAG Col-0 plants. Untagged NRPB2 (Col-0) was used as a negative control. Histone H3 was used as an internal control and total protein level detected by stain-free blot was used as a loading control. Quantification was done by normalizing to the loading control and anti-H3 blot based on 3 independent replicates.Transmission rate of nrpb2-2 allele in nrpb2-2 +/- line (n=197) and nrpb2- +/- lines combined with homozygous NRPB2P979S-FLAG +/+ (n=280), NRPB2Y732F-FLAG +/+ (n=240) and NRPB2WT-FLAG +/+ (n=210), respectively. Fisher´s exact test was used as a statistic test, three asterisks denote p<0.001 between samples and n.s. stands for not significant.Image of homozygous mutant nrpb2-2 fully complemented by NRPB2WT-FLAG (top, NRPB2WT +/+ nrpb2-2 -/-) and partially complemented by NRPB2Y732F-FLAG (bottom, NRPB2WT +/+ nrpb2-2 -/-). Plants were grown for 4 weeks in soil. Scale bars represent 1 cm."}
{"words": ["Figure", "2Schematic", "drawing", "of", "the", "experimental", "design", "to", "investigate", "RNAPII", "transcription", "speed", "in", "vivo", ".", "In", "brief", ",", "Arabidopsis", "seedlings", "of", "NRPB2WT", "-", "FLAG", "Col", "-", "0", "and", "NRPB2Y732F", "-", "FLAG", "Col", "-", "0", "were", "grown", "on", "MS", "media", "for", "12", "days", "and", "then", "were", "transferred", "to", "MS", "liquid", "media", "for", "2", "days", ".", "Flagellin", "peptides", "(", "flagellin", "22", ")", "were", "added", "into", "media", "and", "treated", "samples", "were", "collected", "in", "a", "0", "minute", "(", "no", "treatment", ")", ",", "2", "minutes", "and", "4", "minutes", "time", "course", ".", "The", "nascent", "RNA", "was", "isolated", "and", "used", "for", "reverse", "transcription", "and", "qPCR", "analyses", "to", "reveal", "RNAPII", "accumulation", "at", "different", "region", "in", "genes", ".", "See", "Methods", "for", "technical", "details", ".", "Nascent", "RNA", "profile", "of", "AT5G41750", ".", "Nascent", "RNA", "RT", "-", "qPCR", "assay", "measuring", "RNAPII", "signal", "at", "3", "positions", "(", "dark", "red", "bars", ":", "probe", "1", ",", "2", "and", "3", ")", "on", "the", "gene", "upon", "flagellin", "22", "treatment", "in", "a", "0", "minute", ",", "2", "minutes", ",", "3", "minutes", "and", "4", "minutes", "time", "course", ".", "Nascent", "RNA", "signal", "values", "were", "normalized", "to", "reference", "gene", "ACT2", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", "from", "3", "independent", "replicates", ".", "The", "statistical", "significance", "of", "differences", "between", "NRPB2Y732F", "and", "NRPB2WT", "at", "the", "same", "time", "point", "were", "assessed", "by", "the", "two", "-", "sided", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "n", ".", "s", ".", "denotes", "not", "significant", ";", "*", "denotes", "p", "<", "0", ".", "05", "and", "*", "*", "denotes", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Scale", "bar", "(", "black", ")", "represent", "0", ".", "5", "kb", ".", "Nascent", "RNA", "profile", "of", "AT4G19520", ".", "Nascent", "RNA", "RT", "-", "qPCR", "assay", "measuring", "RNAPII", "signal", "at", "3", "positions", "(", "dark", "red", "bars", ":", "probe", "1", ",", "2", "and", "3", ")", "on", "the", "gene", "upon", "flagellin", "22", "treatment", "in", "a", "0", "minute", ",", "2", "minutes", ",", "3", "minutes", "and", "4", "minutes", "time", "course", ".", "Nascent", "RNA", "signal", "values", "were", "normalized", "to", "reference", "gene", "ACT2", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", "from", "3", "independent", "replicates", ".", "The", "statistical", "significance", "of", "differences", "between", "NRPB2Y732F", "and", "NRPB2WT", "at", "the", "same", "time", "point", "were", "assessed", "by", "a", "two", "-", "sided", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "n", ".", "s", ".", "denotes", "not", "significant", ";", "*", "denotes", "p", "<", "0", ".", "05", "and", "*", "*", "denotes", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Scale", "bar", "(", "black", ")", "represents", "0", ".", "5", "kb", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Schematic drawing of the experimental design to investigate RNAPII transcription speed in vivo. In brief, Arabidopsis seedlings of NRPB2WT-FLAG Col-0 and NRPB2Y732F-FLAG Col-0 were grown on MS media for 12 days and then were transferred to MS liquid media for 2 days. Flagellin peptides (flagellin 22) were added into media and treated samples were collected in a 0 minute (no treatment), 2 minutes and 4 minutes time course. The nascent RNA was isolated and used for reverse transcription and qPCR analyses to reveal RNAPII accumulation at different region in genes. See Methods for technical details.Nascent RNA profile of AT5G41750. Nascent RNA RT-qPCR assay measuring RNAPII signal at 3 positions (dark red bars: probe 1, 2 and 3) on the gene upon flagellin 22 treatment in a 0 minute, 2 minutes, 3 minutes and 4 minutes time course. Nascent RNA signal values were normalized to reference gene ACT2. Error bars represent SEM from 3 independent replicates. The statistical significance of differences between NRPB2Y732F and NRPB2WT at the same time point were assessed by the two-sided Student's t-test. n.s. denotes not significant; * denotes p<0.05 and ** denotes p<0.01. Scale bar (black) represent 0.5 kb.Nascent RNA profile of AT4G19520. Nascent RNA RT-qPCR assay measuring RNAPII signal at 3 positions (dark red bars: probe 1, 2 and 3) on the gene upon flagellin 22 treatment in a 0 minute, 2 minutes, 3 minutes and 4 minutes time course. Nascent RNA signal values were normalized to reference gene ACT2. Error bars represent SEM from 3 independent replicates. The statistical significance of differences between NRPB2Y732F and NRPB2WT at the same time point were assessed by a two-sided Student's t-test. n.s. denotes not significant; * denotes p<0.05 and ** denotes p<0.01. Scale bar (black) represents 0.5 kb."}
{"words": ["Figure", "3plaNET", "-", "seq", "signal", "of", "RNAPII", "in", "the", "promoter", "proximal", "region", "of", "AT1G70600", "in", "NRPB2WT", "+", "/", "+", "nrpb2", "-", "2", "-", "/", "-", "(", "NRPB2WT", ",", "blue", ")", "and", "NRPB2Y732F", "+", "/", "+", "nrpb2", "-", "2", "-", "/", "-", "(", "NRPB2Y732F", ",", "red", ")", ".", "Arrows", "indicate", "the", "RNAPII", "signal", "at", "the", "region", "of", "promoter", "-", "proximal", "stalling", ".", "Metagene", "profile", "of", "plaNET", "-", "seq", "mean", "signal", "of", "RNAPII", "in", "a", "1", "Kb", "window", "centered", "at", "the", "+", "1", "nucleosome", "in", "Arabidopsis", "genes", "(", "n", "=", "25474", ")", "in", "NRPB2WT", "+", "/", "+", "nrpb2", "-", "2", "-", "/", "-", "(", "NRPB2WT", ",", "blue", ")", "and", "NRPB2Y732F", "+", "/", "+", "nrpb2", "-", "2", "-", "/", "-", "(", "NRPB2Y732F", ",", "red", ")", ".", "The", "significance", "of", "differences", "of", "plaNET", "-", "seq", "signal", "in", "the", "region", "from", "-", "25", "bins", "to", "+", "25", "bins", "around", "+", "1", "nucleosome", "between", "NRPB2WT", "and", "NRPB2Y732F", "were", "assessed", "by", "a", "two", "-", "sided", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", ",", "p", "=", "5", ".", "20e", "-", "10", ".", "RNAPII", "stalling", "index", "calculated", "for", "all", "the", "genes", "with", "plaNET", "-", "Seq", "FPKM", "≥", "10", "in", "NRPB2WT", "+", "/", "+", "nrpb2", "-", "2", "-", "/", "-", "(", "NRPB2WT", ",", "blue", ")", "and", "NRPB2Y732F", "+", "/", "+", "nrpb2", "-", "2", "-", "/", "-", "(", "NRPB2Y732F", ",", "red", ")", "(", "n", "=", "6596", ")", ".", "Medians", "of", "the", "stalling", "index", "are", "1", ".", "891", "and", "1", ".", "222", "for", "NRPB2WT", "and", "NRPB2Y732F", ",", "respectively", ".", "*", "*", "*", "denotes", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "001", "by", "Wilcoxon", "signed", "-", "rank", "test", ".", "The", "solid", "horizontal", "lines", "and", "box", "limits", "represent", "medians", ",", "lower", "and", "upper", "quartiles", "of", "data", "values", "in", "each", "group", ".", "The", "upper", "and", "lower", "whiskers", "extend", "to", "the", "largest", "or", "smallest", "value", ",", "respectively", ",", "no", "further", "than", "1", ".", "5", "*", "IQR", "from", "the", "relevant", "quartile", ".", "Metagene", "profile", "of", "plaNET", "-", "seq", "mean", "signal", "over", "whole", "genes", "(", "length", "from", "0", ".", "5", "Kb", "to", "5", "Kb", ",", "scaled", "to", "500", "bins", ",", "n", "=", "27042", ")", "in", "NRPB2WT", "+", "/", "+", "nrpb2", "-", "2", "-", "/", "-", "(", "NRPB2WT", ",", "blue", ")", "and", "NRPB2Y732F", "+", "/", "+", "nrpb2", "-", "2", "-", "/", "-", "(", "NRPB2Y732F", ",", "red", ")", ".", "Metagene", "profile", "of", "plaNET", "-", "seq", "mean", "signal", "of", "RNAPII", "in", "exons", "(", "length", "from", "50", "bp", "to", "300", "bp", ",", "scaled", "to", "100", "bins", ",", "n", "=", "73925", ")", "in", "NRPB2WT", "+", "/", "+", "nrpb2", "-", "2", "-", "/", "-", "(", "NRPB2WT", ",", "blue", ")", "and", "NRPB2Y732F", "+", "/", "+", "nrpb2", "-", "2", "-", "/", "-", "(", "NRPB2Y732F", ",", "red", ")", ".", "Pink", "dashed", "line", "rectangle", "illustrates", "the", "amplitude", "of", "differences", "between", "the", "minimum", "and", "the", "maximum", "of", "RNAPII", "signal", "across", "the", "exons", ".", "A", "two", "-", "sided", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", "was", "used", "to", "assess", "the", "plaNET", "-", "seq", "signal", "of", "NRPB2WT", "(", "blue", ")", "and", "NRPB2Y732F", "(", "red", ")", "in", "exons", ",", "p", "<", "1e", "-", "16", ".", "Metagene", "profile", "of", "plaNET", "-", "seq", "mean", "signal", "of", "RNAPII", "in", "introns", "(", "50", "bp", "to", "300", "bp", ",", "scaled", "to", "100", "bins", ",", "n", "=", "102260", ")", "in", "NRPB2WT", "+", "/", "+", "nrpb2", "-", "2", "-", "/", "-", "(", "NRPB2WT", ",", "blue", ")", "and", "NRPB2Y732F", "+", "/", "+", "nrpb2", "-", "2", "-", "/", "-", "(", "NRPB2Y732F", ",", "red", ")", ".", "A", "two", "-", "sided", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", "was", "used", "to", "assess", "the", "plaNET", "-", "seq", "signal", "of", "NRPB2WT", "(", "blue", ")", "and", "NRPB2Y732F", "(", "red", ")", "in", "introns", ",", "p", "<", "1e", "-", "16", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3plaNET-seq signal of RNAPII in the promoter proximal region of AT1G70600 in NRPB2WT +/+ nrpb2-2 -/- (NRPB2WT, blue) and NRPB2Y732F +/+ nrpb2-2 -/- (NRPB2Y732F ,red). Arrows indicate the RNAPII signal at the region of promoter-proximal stalling.Metagene profile of plaNET-seq mean signal of RNAPII in a 1 Kb window centered at the +1 nucleosome in Arabidopsis genes (n=25474) in NRPB2WT +/+ nrpb2-2 -/- (NRPB2WT, blue) and NRPB2Y732F +/+ nrpb2-2 -/- (NRPB2Y732F ,red). The significance of differences of plaNET-seq signal in the region from -25 bins to +25 bins around +1 nucleosome between NRPB2WT and NRPB2Y732F were assessed by a two-sided Mann-Whitney U-test, p=5.20e-10.RNAPII stalling index calculated for all the genes with plaNET-Seq FPKM ≥ 10 in NRPB2WT +/+ nrpb2-2 -/- (NRPB2WT, blue) and NRPB2Y732F +/+ nrpb2-2 -/- (NRPB2Y732F ,red) (n=6596). Medians of the stalling index are 1.891 and 1.222 for NRPB2WT and NRPB2Y732F, respectively. *** denotes p-value <0.001 by Wilcoxon signed-rank test. The solid horizontal lines and box limits represent medians, lower and upper quartiles of data values in each group. The upper and lower whiskers extend to the largest or smallest value, respectively, no further than 1.5 * IQR from the relevant quartile.Metagene profile of plaNET-seq mean signal over whole genes (length from 0.5 Kb to 5 Kb, scaled to 500 bins, n=27042) in NRPB2WT +/+ nrpb2-2 -/- (NRPB2WT, blue) and NRPB2Y732F +/+ nrpb2-2 -/- (NRPB2Y732F ,red).Metagene profile of plaNET-seq mean signal of RNAPII in exons (length from 50 bp to 300 bp, scaled to 100 bins, n=73925) in NRPB2WT +/+ nrpb2-2 -/- (NRPB2WT, blue) and NRPB2Y732F +/+ nrpb2-2 -/- (NRPB2Y732F ,red). Pink dashed line rectangle illustrates the amplitude of differences between the minimum and the maximum of RNAPII signal across the exons. A two-sided Mann-Whitney U-test was used to assess the plaNET-seq signal of NRPB2WT (blue) and NRPB2Y732F (red) in exons, p<1e-16. Metagene profile of plaNET-seq mean signal of RNAPII in introns (50 bp to 300 bp, scaled to 100 bins, n=102260) in NRPB2WT +/+ nrpb2-2 -/- (NRPB2WT, blue) and NRPB2Y732F +/+ nrpb2-2 -/- (NRPB2Y732F ,red). A two-sided Mann-Whitney U-test was used to assess the plaNET-seq signal of NRPB2WT (blue) and NRPB2Y732F (red) in introns, p<1e-16."}
{"words": ["Figure", "4Bar", "charts", "showing", "the", "fractions", "of", "3", "'", "and", "5", "'", "splicing", "intermediate", "reads", "from", "plaNET", "-", "seq", "in", "NRPB2WT", "+", "/", "+", "nrpb2", "-", "2", "-", "/", "-", "(", "NRPB2WT", ",", "blue", ")", "and", "NRPB2Y732F", "+", "/", "+", "nrpb2", "-", "2", "-", "/", "-", "(", "NRPB2Y732F", ",", "red", ")", ".", "Genome", "browser", "snapshots", "illustrating", "enhanced", "intron", "splicing", "in", "NRPB2Y732F", "+", "/", "+", "nrpb2", "-", "2", "-", "/", "-", "(", "NRPB2Y732F", ",", "red", ")", "compared", "to", "NRPB2WT", "+", "/", "+", "nrpb2", "-", "2", "-", "/", "-", "(", "NRPB2WT", ",", "blue", ")", ".", "Scale", "bars", "denote", "0", ".", "5", "Kb", ".", "The", "fraction", "of", "RNA", "-", "seq", "intronic", "reads", "calculated", "for", "all", "genes", "(", "n", "=", "24912", ")", "in", "NRPB2WT", "+", "/", "+", "nrpb2", "-", "2", "-", "/", "-", "and", "NRPB2Y732F", "+", "/", "+", "nrpb2", "-", "2", "-", "/", "-", ".", "Two", "-", "sided", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ":", "*", "*", "*", "*", "denotes", "p", "-", "value", "<", "2", ".", "2e", "-", "16", ".", "The", "solid", "horizontal", "lines", "and", "box", "limits", "represent", "medians", ",", "lower", "and", "upper", "quartiles", "of", "data", "values", "in", "each", "group", ".", "The", "upper", "and", "lower", "whiskers", "extend", "to", "the", "largest", "or", "smallest", "value", ",", "respectively", ",", "no", "further", "than", "1", ".", "5", "*", "IQR", "from", "the", "relevant", "quartile", ".", "Differentially", "expressed", "(", "DE", ")", "exons", "and", "introns", "in", "NRPB2Y732F", "+", "/", "+", "nrpb2", "-", "2", "-", "/", "-", "compared", "to", "NRPB2WT", "+", "/", "+", "nrpb2", "-", "2", "-", "/", "-", "based", "on", "RNA", "-", "seq", "results", ".", "Numbers", "of", "DE", "exons", "and", "introns", "were", "shown", "in", "plot", ".", "Quantification", "(", "log", "fold", "change", "of", "FPKM", "from", "RNA", "-", "seq", ")", "of", "differentially", "expressed", "(", "DE", ")", "exons", "and", "non", "-", "DE", "exons", "in", "NRPB2Y732F", "+", "/", "+", "nrpb2", "-", "2", "-", "/", "-", "compared", "to", "NRPB2WT", "+", "/", "+", "nrpb2", "-", "2", "-", "/", "-", ".", "*", "*", "denotes", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "01", "by", "Wilcoxon", "signed", "-", "rank", "test", ".", "The", "solid", "horizontal", "lines", "and", "box", "limits", "represent", "medians", ",", "lower", "and", "upper", "quartiles", "of", "data", "values", "in", "each", "group", ".", "The", "upper", "and", "lower", "whiskers", "extend", "to", "the", "largest", "or", "smallest", "value", ",", "respectively", ",", "no", "further", "than", "1", ".", "5", "*", "IQR", "from", "the", "relevant", "quartile", ".", "Genome", "browser", "snapshots", "illustrating", "enhanced", "exon", "skipping", "in", "NRPB2Y732F", "+", "/", "+", "nrpb2", "-", "2", "-", "/", "-", "(", "NRPB2Y732F", ",", "red", ")", "compared", "to", "NRPB2WT", "+", "/", "+", "nrpb2", "-", "2", "-", "/", "-", "(", "NRPB2WT", ",", "blue", ")", ".", "Scale", "bars", "denote", "0", ".", "5", "Kb", ".", "Quantification", "(", "log", "fold", "change", "of", "FPKM", "from", "RNA", "-", "seq", ")", "of", "differentially", "expressed", "(", "DE", ")", "introns", "and", "non", "-", "DE", "exons", "in", "NRPB2Y732F", "+", "/", "+", "nrpb2", "-", "2", "-", "/", "-", "compared", "to", "NRPB2WT", "+", "/", "+", "nrpb2", "-", "2", "-", "/", "-", ".", "*", "*", "*", "*", "denotes", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "0001", "by", "Wilcoxon", "signed", "-", "rank", "test", ".", "The", "solid", "horizontal", "lines", "and", "box", "limits", "represent", "medians", ",", "lower", "and", "upper", "quartiles", "of", "data", "values", "in", "each", "group", ".", "The", "upper", "and", "lower", "whiskers", "extend", "to", "the", "largest", "or", "smallest", "value", ",", "respectively", ",", "no", "further", "than", "1", ".", "5", "*", "IQR", "from", "the", "relevant", "quartile", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Bar charts showing the fractions of 3' and 5' splicing intermediate reads from plaNET-seq in NRPB2WT +/+ nrpb2-2 -/- (NRPB2WT, blue) and NRPB2Y732F +/+ nrpb2-2 -/- (NRPB2Y732F ,red).Genome browser snapshots illustrating enhanced intron splicing in NRPB2Y732F +/+ nrpb2-2 -/- (NRPB2Y732F, red) compared to NRPB2WT +/+ nrpb2-2 -/- (NRPB2WT ,blue). Scale bars denote 0.5 Kb.The fraction of RNA-seq intronic reads calculated for all genes (n=24912) in NRPB2WT +/+ nrpb2-2 -/- and NRPB2Y732F +/+ nrpb2-2 -/-. Two-sided Mann-Whitney U test: **** denotes p-value<2.2e-16. The solid horizontal lines and box limits represent medians, lower and upper quartiles of data values in each group. The upper and lower whiskers extend to the largest or smallest value, respectively, no further than 1.5 * IQR from the relevant quartile.Differentially expressed (DE) exons and introns in NRPB2Y732F +/+ nrpb2-2 -/- compared to NRPB2WT +/+ nrpb2-2 -/- based on RNA-seq results. Numbers of DE exons and introns were shown in plot. Quantification (log fold change of FPKM from RNA-seq) of differentially expressed (DE) exons and non-DE exons in NRPB2Y732F +/+ nrpb2-2 -/- compared to NRPB2WT +/+ nrpb2-2 -/-. ** denotes p-value <0.01 by Wilcoxon signed-rank test. The solid horizontal lines and box limits represent medians, lower and upper quartiles of data values in each group. The upper and lower whiskers extend to the largest or smallest value, respectively, no further than 1.5 * IQR from the relevant quartile.Genome browser snapshots illustrating enhanced exon skipping in NRPB2Y732F +/+ nrpb2-2 -/- (NRPB2Y732F, red) compared to NRPB2WT +/+ nrpb2-2 -/- (NRPB2WT ,blue). Scale bars denote 0.5 Kb. Quantification (log fold change of FPKM from RNA-seq) of differentially expressed (DE) introns and non-DE exons in NRPB2Y732F +/+ nrpb2-2 -/- compared to NRPB2WT +/+ nrpb2-2 -/-. **** denotes p-value <0.0001 by Wilcoxon signed-rank test. The solid horizontal lines and box limits represent medians, lower and upper quartiles of data values in each group. The upper and lower whiskers extend to the largest or smallest value, respectively, no further than 1.5 * IQR from the relevant quartile."}
{"words": ["Figure", "5plaNET", "-", "seq", "signal", "of", "RNAPII", "at", "3", "'", "end", "of", "AT2G21410", "in", "NRPB2WT", "+", "/", "+", "nrpb2", "-", "2", "-", "/", "-", "(", "NRPB2WT", ",", "blue", ")", "and", "NRPB2Y732F", "+", "/", "+", "nrpb2", "-", "2", "-", "/", "-", "(", "NRPB2Y732F", ",", "red", ")", ".", "Arrows", "indicate", "the", "RNAPII", "signal", "peaks", "at", "PAS", "stalling", "region", ".", "Metagene", "profile", "of", "plaNET", "-", "seq", "mean", "signal", "of", "RNAPII", "in", "a", "1", "kb", "window", "centered", "at", "PAS", "(", "n", "=", "24448", ")", "in", "NRPB2WT", "+", "/", "+", "nrpb2", "-", "2", "-", "/", "-", "(", "NRPB2WT", ",", "blue", ")", "and", "NRPB2Y732F", "+", "/", "+", "nrpb2", "-", "2", "-", "/", "-", "(", "NRPB2Y732F", ",", "red", ")", ".", "The", "significance", "of", "differences", "of", "plaNET", "-", "seq", "signal", "in", "the", "region", "from", "PAS", "to", "+", "100", "bins", "between", "NRPB2WT", "and", "NRPB2Y732F", "were", "assessed", "by", "Two", "-", "sided", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", ",", "p", "=", "1", ".", "53e", "-", "06", ".", "Histogram", "of", "transcriptional", "read", "-", "through", "length", "(", "nt", ")", "from", "PAS", "of", "protein", "-", "coding", "gene", "(", "plaNET", "-", "seq", "FPKM", ">", "5", ",", "n", "=", "9316", ")", "in", "NRPB2WT", "+", "/", "+", "nrpb2", "-", "2", "-", "/", "-", "(", "NRPB2WT", ",", "blue", ")", "and", "NRPB2Y732F", "+", "/", "+", "nrpb2", "-", "2", "-", "/", "-", "(", "NRPB2Y732F", ",", "red", ")", ".", "Box", "plot", "shows", "the", "RNAPII", "transcriptional", "read", "-", "through", "length", "from", "PAS", "of", "protein", "-", "coding", "genes", "(", "plaNET", "-", "seq", "FPKM", ">", "5", "n", "=", "9316", ")", "called", "based", "on", "statistic", "model", "(", "see", "Methods", ")", "in", "NRPB2WT", "+", "/", "+", "nrpb2", "-", "2", "-", "/", "-", "(", "NRPB2WT", ",", "blue", ")", "and", "NRPB2Y732F", "+", "/", "+", "nrpb2", "-", "2", "-", "/", "-", "(", "NRPB2Y732F", ",", "red", ")", ".", "Median", "of", "read", "-", "through", "length", "in", "NRPB2WT", "and", "NRPB2Y732F", "mutant", "are", "534", "nt", "and", "649", "nt", ".", "Two", "-", "sided", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", ":", "*", "*", "*", "denotes", "p", "=", "9", ".", "9e", "-", "62", ".", "The", "solid", "horizontal", "lines", "and", "box", "limits", "represent", "medians", ",", "lower", "and", "upper", "quartiles", "of", "data", "values", "in", "each", "group", ".", "The", "upper", "and", "lower", "whiskers", "extend", "to", "the", "largest", "or", "smallest", "value", ",", "respectively", ",", "no", "further", "than", "1", ".", "5", "*", "IQR", "from", "the", "relevant", "quartile", ".", "Metagene", "plot", "of", "RNAPII", "signal", "by", "plaNET", "-", "seq", "anchored", "at", "both", "PAS", "of", "upstream", "genes", "and", "TSS", "of", "downstream", "genes", "for", "tandemly", "oriented", "genes", "(", "n", "=", "5753", ")", "in", "NRPB2WT", "+", "/", "+", "nrpb2", "-", "2", "-", "/", "-", "(", "NRPB2WT", ",", "blue", ")", "and", "NRPB2Y732F", "+", "/", "+", "nrpb2", "-", "2", "-", "/", "-", "(", "NRPB2Y732F", ",", "red", ")", ".", "Red", "arrow", "denotes", "the", "direction", "of", "transcriptional", "read", "-", "through", ".", "Pink", "dashed", "line", "rectangle", "indicates", "the", "region", "corresponding", "to", "the", "second", "half", "of", "PAS", "-", "TSS", "gaps", "along", "5", "'", "to", "3", "'", "direction", ".", "Metagene", "plot", "of", "RNAPII", "signal", "by", "plaNET", "-", "seq", "anchored", "at", "PASs", "of", "both", "upstream", "genes", "and", "downstream", "genes", "for", "gene", "pairs", "located", "in", "\"", "tail", "to", "tail", "\"", "orientation", "(", "n", "=", "1384", ")", "in", "NRPB2WT", "+", "/", "+", "nrpb2", "-", "2", "-", "/", "-", "(", "NRPB2WT", ",", "blue", ")", "and", "NRPB2Y732F", "+", "/", "+", "nrpb2", "-", "2", "-", "/", "-", "(", "NRPB2Y732F", ",", "red", ")", ".", "Red", "arrows", "denote", "the", "directions", "of", "transcriptional", "read", "-", "through", "from", "both", "PASs", ".", "Pink", "dashed", "line", "rectangles", "indicate", "the", "region", "corresponding", "to", "the", "second", "half", "of", "PAS", "-", "TSS", "gaps", "along", "5", "'", "to", "3", "'", "direction", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5plaNET-seq signal of RNAPII at 3' end of AT2G21410 in NRPB2WT +/+ nrpb2-2 -/- (NRPB2WT, blue) and NRPB2Y732F +/+ nrpb2-2 -/- (NRPB2Y732F ,red). Arrows indicate the RNAPII signal peaks at PAS stalling region.Metagene profile of plaNET-seq mean signal of RNAPII in a 1 kb window centered at PAS (n=24448) in NRPB2WT +/+ nrpb2-2 -/- (NRPB2WT, blue) and NRPB2Y732F +/+ nrpb2-2 -/- (NRPB2Y732F ,red). The significance of differences of plaNET-seq signal in the region from PAS to +100 bins between NRPB2WT and NRPB2Y732F were assessed by Two-sided Mann-Whitney U-test, p = 1.53e-06.Histogram of transcriptional read-through length (nt) from PAS of protein-coding gene (plaNET-seq FPKM>5, n=9316) in NRPB2WT +/+ nrpb2-2 -/- (NRPB2WT, blue) and NRPB2Y732F +/+ nrpb2-2 -/- (NRPB2Y732F ,red).Box plot shows the RNAPII transcriptional read-through length from PAS of protein-coding genes (plaNET-seq FPKM>5 n=9316) called based on statistic model (see Methods) in NRPB2WT +/+ nrpb2-2 -/- (NRPB2WT, blue) and NRPB2Y732F +/+ nrpb2-2 -/- (NRPB2Y732F ,red). Median of read-through length in NRPB2WT and NRPB2Y732F mutant are 534 nt and 649 nt. Two-sided Mann-Whitney U-test: *** denotes p = 9.9e-62. The solid horizontal lines and box limits represent medians, lower and upper quartiles of data values in each group. The upper and lower whiskers extend to the largest or smallest value, respectively, no further than 1.5 * IQR from the relevant quartile.Metagene plot of RNAPII signal by plaNET-seq anchored at both PAS of upstream genes and TSS of downstream genes for tandemly oriented genes (n=5753) in NRPB2WT +/+ nrpb2-2 -/- (NRPB2WT, blue) and NRPB2Y732F +/+ nrpb2-2 -/- (NRPB2Y732F ,red). Red arrow denotes the direction of transcriptional read-through. Pink dashed line rectangle indicates the region corresponding to the second half of PAS-TSS gaps along 5' to 3' direction. Metagene plot of RNAPII signal by plaNET-seq anchored at PASs of both upstream genes and downstream genes for gene pairs located in \"tail to tail\" orientation (n=1384) in NRPB2WT +/+ nrpb2-2 -/- (NRPB2WT, blue) and NRPB2Y732F +/+ nrpb2-2 -/- (NRPB2Y732F ,red). Red arrows denote the directions of transcriptional read-through from both PASs. Pink dashed line rectangles indicate the region corresponding to the second half of PAS-TSS gaps along 5' to 3' direction."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "Binding", "of", "ubiquitin", "chains", "to", "immobilized", "GST", "-", "fusion", "proteins", ".", "Indicated", "proteins", "were", "purified", "from", "E", ".", "coli", "and", "incubated", "with", "equal", "amounts", "of", "preformed", "fluorescently", "labeled", "ubiquitin", "chains", ",", "which", "were", "either", "K48", "-", "or", "K63", "-", "linked", ".", "The", "fraction", "of", "ubiquitin", "chains", "interacting", "with", "the", "bait", "protein", "was", "analyzed", "by", "SDS", "‑", "PAGE", "and", "fluorescence", "scan", ".", "Total", "fluorescence", "was", "quantified", "per", "lane", "and", "normalized", "to", "the", "first", "lane", "(", "rel", ".", "fluo", ".", ")", ".", "Asterisk", "(", "*", ")", "indicates", "lane", "from", "the", "same", "gel", "that", "was", "cropped", "and", "moved", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. Binding of ubiquitin chains to immobilized GST-fusion proteins. Indicated proteins were purified from E. coli and incubated with equal amounts of preformed fluorescently labeled ubiquitin chains, which were either K48- or K63-linked. The fraction of ubiquitin chains interacting with the bait protein was analyzed by SDS‑PAGE and fluorescence scan. Total fluorescence was quantified per lane and normalized to the first lane (rel. fluo.). Asterisk (*) indicates lane from the same gel that was cropped and moved."}
{"words": ["Figure", "2B", ".", "At", "indicated", "time", "points", ",", "samples", "were", "taken", "from", "the", "reaction", "mix", "and", "analyzed", "by", "SDS", "‑", "PAGE", "and", "fluorescence", "scan", ".", "Product", "fluorescence", "over", "total", "fluorescence", "per", "lane", "was", "quantified", "(", "rel", ".", "fluo", ".", ")", ".", "D", ".", "Initial", "reaction", "rates", "were", "determined", "for", "a", "panel", "of", "acceptor", "ubiquitin", "molecules", "in", "reactions", "with", "either", "full", "‑", "length", "Ubc1", "or", "Ubc1", "-", "ΔUBA", "(", "aa1", "‑", "150", ")", ".", "The", "binding", "of", "the", "UBA", "domain", "to", "individual", "ubiquitin", "molecules", "was", "disrupted", "by", "introducing", "an", "R42A", "amino", "acid", "exchange", "in", "ubiquitin", ",", "while", "acceptor", "sites", "were", "blocked", "by", "introducing", "the", "K48R", "substitution", ".", "Reactions", "were", "performed", "in", "triplicate", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B. At indicated time points, samples were taken from the reaction mix and analyzed by SDS‑PAGE and fluorescence scan. Product fluorescence over total fluorescence per lane was quantified (rel. fluo.). D. Initial reaction rates were determined for a panel of acceptor ubiquitin molecules in reactions with either full‑length Ubc1 or Ubc1-ΔUBA (aa1‑150). The binding of the UBA domain to individual ubiquitin molecules was disrupted by introducing an R42A amino acid exchange in ubiquitin, while acceptor sites were blocked by introducing the K48R substitution. Reactions were performed in triplicate."}
{"words": ["Figure", "3b", ".", "L143E", "and", "/", "or", "L147E", "amino", "acid", "substitutions", "were", "introduced", "into", "Ubc1", "to", "disrupt", "the", "hydrophobic", "UBC", "/", "UBA", "domain", "interface", ".", "Single", "turnover", "ubiquitination", "experiments", "were", "performed", "with", "these", "Ubc1", "variants", "in", "presence", "of", "K63", "‑", "Ub2", "with", "Ub", "(", "K48R", ")", "at", "the", "distal", "position", "or", "monoubiquitin", "as", "acceptor", ".", "Experiment", "and", "initial", "rate", "determinationc", ".", "Ubc1", "variants", "were", "generated", "with", "deletions", "in", "the", "linker", "region", "(", "aa152", "‑", "167", ")", ",", "which", "connects", "the", "UBA", "domain", "and", "the", "UBC", "domain", ".", "Single", "turnover", "ubiquitination", "reaction", "mixes", "were", "incubated", "for", "5", "min", "with", "K63", "-", "Ub2", "or", "for", "20", "min", "with", "monoubiquitin", "as", "acceptor", ".", "Final", "product", "formation", "was", "analyzed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "fluorescence", "scan", ".", "Product", "fluorescence", "over", "total", "fluorescence", "(", "rel", ".", "fluo", ".", ")", "was", "quantified", ".", "d", ".", "C", "-", "terminally", "blocked", "M1", "-", "linked", "diubiquitin", "with", "or", "without", "a", "K48R", "amino", "acid", "substitution", "at", "the", "distal", "or", "proximal", "position", "were", "employed", "in", "single", "turnover", "experiments", "with", "full", "-", "length", "Ubc1", "or", "Ubc1", "-", "ΔUBA", ".", "Reactions", "with", "acceptor", "K63", "-", "Ub2", "were", "carried", "out", "controls", ".", "Initial", "rate"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3b. L143E and/or L147E amino acid substitutions were introduced into Ubc1 to disrupt the hydrophobic UBC/UBA domain interface. Single turnover ubiquitination experiments were performed with these Ubc1 variants in presence of K63‑Ub2 with Ub(K48R) at the distal position or monoubiquitin as acceptor. Experiment and initial rate determinationc. Ubc1 variants were generated with deletions in the linker region (aa152‑167), which connects the UBA domain and the UBC domain. Single turnover ubiquitination reaction mixes were incubated for 5 min with K63-Ub2 or for 20 min with monoubiquitin as acceptor. Final product formation was analyzed by SDS-PAGE and fluorescence scan. Product fluorescence over total fluorescence (rel. fluo.) was quantified.d. C-terminally blocked M1-linked diubiquitin with or without a K48R amino acid substitution at the distal or proximal position were employed in single turnover experiments with full-length Ubc1 or Ubc1-ΔUBA. Reactions with acceptor K63-Ub2 were carried out controls. Initial rate determination"}
{"words": ["Figure", "4e", ".", "CSPs", "of", "I44", "were", "plotted", "over", "UBA", "domain", "concentration", ".", "f", ".", "KD", "values", "for", "binding", "of", "the", "UBA", "domain", "were", "determined", "from", "results", "in", "(", "E", ")", "assuming", "two", "independent", "but", "different", "binding", "sites", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4e. CSPs of I44 were plotted over UBA domain concentration. f. KD values for binding of the UBA domain were determined from results in (E) assuming two independent but different binding sites. "}
{"words": ["Figure", "5a", ".", "The", "activity", "of", "Ubc1", "was", "compared", "with", "the", "K48", "-", "linked", "chain", "building", "enzyme", "Ubc7", "/", "Cue1", "in", "single", "turnover", "ubiquitination", "experiments", "in", "presence", "of", "either", "monoubiquitin", ",", "K48", "‑", "Ub2", "or", "K63", "-", "Ub2", ".", "Initial", "rates", "were", "determinedb", ".", "The", "K63", "-", "linked", "chain", "building", "enzyme", "Ubc13", "with", "its", "cofactor", "Uev1a", "or", "the", "Ubc1", "homologue", "Ube2K", "(", "h", ".", "sapiens", ")", "were", "employed", "in", "single", "turnover", "ubiquitination", "experiments", "in", "presence", "of", "K63", "-", "Ub2", "with", "Ub", "(", "K48R", ")", "at", "the", "proximal", "or", "distal", "position", "or", "in", "presence", "of", "K48", "‑", "Ub2", ".", "Initial", "rate", "determination", "c", ".", "Experiment", "as", "in", "(", "B", ")", "but", "with", "the", "Ubc1", "homologue", "ubc", "-", "20", "(", "c", ".", "elegans", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5a. The activity of Ubc1 was compared with the K48-linked chain building enzyme Ubc7/Cue1 in single turnover ubiquitination experiments in presence of either monoubiquitin, K48‑Ub2 or K63-Ub2. Initial rates were determinedb. The K63-linked chain building enzyme Ubc13 with its cofactor Uev1a or the Ubc1 homologue Ube2K (h. sapiens) were employed in single turnover ubiquitination experiments in presence of K63-Ub2 with Ub(K48R) at the proximal or distal position or in presence of K48‑Ub2. Initial rate determination c. Experiment as in (B) but with the Ubc1 homologue ubc-20 (c. elegans)."}
{"words": ["Figure", "6D", ".", "Alexa488", "-", "labeled", "monoubiquitin", "and", "C", "-", "terminally", "capped", "K63", "-", "Ub4", "were", "used", "in", "a", "4", ":", "1", "molar", "ratio", "for", "in", "vitro", "ubiquitination", "reactions", "with", "full", "‑", "length", "Ubc1", "or", "Ubc1", "-", "ΔUBA", ".", "Where", "indicated", ",", "Alexa488", "-", "labeled", "monoubiquitin", "was", "methylated", "prior", "to", "the", "reaction", "(", "met", "-", "Ub", ")", "to", "block", "de", "novo", "chain", "assembly", ".", "Reactions", "were", "incubated", "overnight", ",", "quenched", "and", "half", "the", "reaction", "mix", "from", "each", "condition", "was", "treated", "with", "the", "K63", "specific", "deubiquitinating", "enzyme", "AMSH", "(", "lanes", "4", "-", "6", ")", ".", "Samples", "were", "analyzed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "fluorescence", "scan", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6D. Alexa488-labeled monoubiquitin and C-terminally capped K63-Ub4 were used in a 4:1 molar ratio for in vitro ubiquitination reactions with full‑length Ubc1 or Ubc1-ΔUBA. Where indicated, Alexa488-labeled monoubiquitin was methylated prior to the reaction (met-Ub) to block de novo chain assembly. Reactions were incubated overnight, quenched and half the reaction mix from each condition was treated with the K63 specific deubiquitinating enzyme AMSH (lanes 4-6). Samples were analyzed by SDS-PAGE and fluorescence scan."}
{"words": ["Figure", "7F", ".", "Ubc1", "-", "EA", "was", "genomically", "integrated", "into", "various", "yeast", "strains", ".", "Exponentially", "growing", "cells", "of", "the", "indicated", "genotype", "were", "spotted", "onto", "YPD", "plates", "in", "serial", "10", "‑", "fold", "dilutions", ".", "Where", "noted", "cells", "were", "incubated", "at", "elevated", "temperature", "(", "37", "°", "C", ")", "or", "in", "presence", "of", "hydroxyurea", "(", "HU", ")", "to", "induce", "DNA", "replication", "stress", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7F. Ubc1-EA was genomically integrated into various yeast strains. Exponentially growing cells of the indicated genotype were spotted onto YPD plates in serial 10‑fold dilutions. Where noted cells were incubated at elevated temperature (37 °C) or in presence of hydroxyurea (HU) to induce DNA replication stress."}
{"words": ["Figure", "1CSF", "extract", "was", "treated", "with", "DMSO", ",", "CsA", ",", "buffer", "or", "His", "-", "CnA420", "-", "508", "at", "the", "indicated", "concentrations", ".", "Meiotic", "exit", "was", "induced", "by", "calcium", "addition", "and", "samples", "were", "taken", "at", "the", "indicated", "time", "points", ".", "Samples", "were", "immunoblotted", "for", "cyclin", "B2", ".", "The", "cyclin", "B2", "membrane", "was", "stripped", "and", "reprobed", "for", "α", "-", "tubulin", ".", "CSF", "extract", "was", "treated", "with", "DMSO", "or", "CsA", ".", "Both", "reactions", "were", "divided", "and", "supplemented", "with", "the", "indicated", "amounts", "of", "calcium", "or", "H2O", ".", "After", "20min", ",", "samples", "were", "taken", "and", "immunoblotted", "for", "cyclin", "B2", "for", "which", "a", "low", "and", "high", "exposure", "is", "shown", ".", "The", "cyclin", "B2", "membrane", "was", "stripped", "and", "reprobed", "for", "α", "-", "tubulin", ".", "CSF", "extract", "was", "supplemented", "with", "Myc", "-", "XErp1", "wt", "IVT", "at", "the", "indicated", "dilutions", ".", "An", "empty", "IVT", "reaction", "not", "expressing", "Myc", "-", "XErp1", "served", "as", "control", ".", "All", "reactions", "were", "divided", "and", "treated", "with", "DMSO", "or", "CsA", ".", "Calcium", "was", "added", "to", "all", "reactions", "and", "samples", "were", "taken", "at", "the", "indicated", "time", "points", ",", "treated", "with", "λ", "-", "phosphatase", "and", "immunoblotted", "for", "XErp1", ",", "the", "Myc", "-", "tag", ",", "cyclin", "B2", "and", "α", "-", "tubulin", ".", "Asterisks", "indicate", "unspecific", "bands", ".", "CSF", "extract", "was", "supplemented", "with", "Myc", "-", "XErp1", "wt", "IVT", ".", "The", "reaction", "was", "divided", "and", "treated", "with", "DMSO", "or", "CsA", ".", "Both", "reactions", "were", "treated", "with", "calcium", ",", "samples", "were", "taken", "at", "the", "indicated", "time", "points", "and", "as", "indicated", "incubated", "with", "λ", "-", "phosphatase", ".", "Samples", "were", "immunoblotted", "for", "XErp1", "and", "cyclin", "B2", ".", "The", "cyclin", "B2", "membrane", "was", "stripped", "and", "reprobed", "for", "α", "-", "tubulin", ".", "Asterisk", "indicates", "unspecific", "bands", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1CSF extract was treated with DMSO, CsA, buffer or His-CnA420-508 at the indicated concentrations. Meiotic exit was induced by calcium addition and samples were taken at the indicated time points. Samples were immunoblotted for cyclin B2. The cyclin B2 membrane was stripped and reprobed for α-tubulin.CSF extract was treated with DMSO or CsA. Both reactions were divided and supplemented with the indicated amounts of calcium or H2O. After 20min, samples were taken and immunoblotted for cyclin B2 for which a low and high exposure is shown. The cyclin B2 membrane was stripped and reprobed for α-tubulin.CSF extract was supplemented with Myc-XErp1 wt IVT at the indicated dilutions. An empty IVT reaction not expressing Myc-XErp1 served as control. All reactions were divided and treated with DMSO or CsA. Calcium was added to all reactions and samples were taken at the indicated time points, treated with λ-phosphatase and immunoblotted for XErp1, the Myc-tag, cyclin B2 and α-tubulin. Asterisks indicate unspecific bands.CSF extract was supplemented with Myc-XErp1 wt IVT. The reaction was divided and treated with DMSO or CsA. Both reactions were treated with calcium, samples were taken at the indicated time points and as indicated incubated with λ-phosphatase. Samples were immunoblotted for XErp1 and cyclin B2. The cyclin B2 membrane was stripped and reprobed for α-tubulin. Asterisk indicates unspecific bands."}
{"words": ["Figure", "2CSF", "extract", "was", "supplemented", "with", "Myc", "-", "XErp1", "DSG", "-", "DSA", "-", "ZBR", "-", "(", "S33N", "S38N", "S284N", "S288N", "C583A", ")", "IVT", "and", "as", "indicated", "treated", "with", "DMSO", "or", "CsA", ".", "Both", "reactions", "were", "treated", "with", "calcium", "and", "samples", "were", "taken", "at", "the", "indicated", "time", "points", ".", "Samples", "were", "immunoblotted", "for", "the", "Myc", "-", "tag", ",", "cyclin", "B2", "and", "α", "-", "tubulin", ".", "A", "pseudocoloured", "representation", "of", "the", "Myc", "immunoblot", "is", "shown", "in", "Fig", "EV2A", ".", "Arrow", "marks", "the", "meiotic", "phosphorylation", "state", "of", "Myc", "-", "XErp1", ".", "Asterisk", "indicates", "unspecific", "bands", ".", "CSF", "extract", "was", "supplemented", "with", "Myc", "-", "XErp1", "DSG", "-", "DSA", "-", "ZBR", "-", "(", "S33N", "S38N", "S284N", "S288N", "C583A", ")", "IVT", "that", "was", "either", "wild", "-", "type", "or", "mutated", "to", "alanine", "at", "the", "p90RSK", "-", "target", "sites", "S335", ",", "T336", "and", "S342", "(", "Rsk3A", ")", ".", "Both", "reactions", "were", "divided", "and", "treated", "with", "DMSO", "or", "CsA", ".", "Calcium", "was", "added", "and", "samples", "were", "taken", "at", "the", "indicated", "time", "points", ".", "Samples", "were", "immunoblotted", "for", "the", "Myc", "-", "tag", "and", "cyclin", "B2", ".", "The", "cyclin", "B2", "membrane", "was", "stripped", "and", "reprobed", "for", "α", "-", "tubulin", ".", "Asterisk", "indicates", "unspecific", "bands", ".", "CSF", "extract", "was", "treated", "with", "Myc", "-", "XErp1", "CaMKII", "-", "ZBR", "-", "(", "T195A", "C583A", ")", "IVT", ".", "An", "empty", "IVT", "reaction", "not", "expressing", "XErp1", "was", "used", "as", "control", ".", "The", "extracts", "were", "treated", "with", "DMSO", "or", "CsA", "as", "indicated", ".", "Calcium", "was", "added", ",", "samples", "were", "taken", "at", "the", "indicated", "time", "points", "and", "immunoblotted", "for", "cyclin", "B2", ",", "pSer335", "XErp1", "and", "α", "-", "tubulin", ".", "The", "pSer335", "XErp1", "membrane", "was", "stripped", "and", "reprobed", "for", "the", "Myc", "-", "tag", ".", "Asterisks", "indicate", "unspecific", "bands", ".", "Myc", "-", "XErp1", "CaMKII", "-", "ZBR", "-", "(", "T195A", "C583A", ")", "IVT", "was", "in", "vitro", "phosphorylated", "by", "recombinant", "PKA", "and", "isolated", "by", "α", "-", "Myc", "immunoprecipitation", ".", "The", "immunoprecipitate", "was", "supplemented", "with", "calcium", "and", "treated", "with", "recombinant", "hs", "_", "CaN", "and", "calmodulin", "as", "indicated", ".", "Samples", "were", "taken", "at", "the", "indicated", "time", "points", "and", "immunoblotted", "for", "the", "catalytic", "calcineurin", "subunit", "CnA", "and", "pSer335", "XErp1", ".", "The", "pSer335", "XErp1", "membrane", "was", "stripped", "and", "reprobed", "for", "the", "Myc", "-", "tag", ".", "Asterisk", "indicates", "the", "IgG", "heavy", "chain", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2CSF extract was supplemented with Myc-XErp1 DSG- DSA- ZBR- (S33N S38N S284N S288N C583A) IVT and as indicated treated with DMSO or CsA. Both reactions were treated with calcium and samples were taken at the indicated time points. Samples were immunoblotted for the Myc-tag, cyclin B2 and α-tubulin. A pseudocoloured representation of the Myc immunoblot is shown in Fig EV2A. Arrow marks the meiotic phosphorylation state of Myc-XErp1. Asterisk indicates unspecific bands.CSF extract was supplemented with Myc-XErp1 DSG- DSA- ZBR- (S33N S38N S284N S288N C583A) IVT that was either wild-type or mutated to alanine at the p90RSK-target sites S335, T336 and S342 (Rsk3A). Both reactions were divided and treated with DMSO or CsA. Calcium was added and samples were taken at the indicated time points. Samples were immunoblotted for the Myc-tag and cyclin B2. The cyclin B2 membrane was stripped and reprobed for α-tubulin. Asterisk indicates unspecific bands.CSF extract was treated with Myc-XErp1 CaMKII- ZBR- (T195A C583A) IVT. An empty IVT reaction not expressing XErp1 was used as control. The extracts were treated with DMSO or CsA as indicated. Calcium was added, samples were taken at the indicated time points and immunoblotted for cyclin B2, pSer335 XErp1 and α-tubulin. The pSer335 XErp1 membrane was stripped and reprobed for the Myc-tag. Asterisks indicate unspecific bands.Myc-XErp1 CaMKII- ZBR- (T195A C583A) IVT was in vitro phosphorylated by recombinant PKA and isolated by α-Myc immunoprecipitation. The immunoprecipitate was supplemented with calcium and treated with recombinant hs_CaN and calmodulin as indicated. Samples were taken at the indicated time points and immunoblotted for the catalytic calcineurin subunit CnA and pSer335 XErp1. The pSer335 XErp1 membrane was stripped and reprobed for the Myc-tag. Asterisk indicates the IgG heavy chain."}
{"words": ["Figure", "3CSF", "extract", "was", "supplemented", "with", "mRNA", "encoding", "Flag", "-", "Cdc20", "that", "was", "either", "wild", "-", "type", "or", "mutated", "to", "serine", "at", "Thr64", ",", "Thr68", "and", "Thr79", "(", "3TS", ")", ".", "After", "expression", ",", "calcium", "was", "added", ",", "samples", "were", "taken", "at", "the", "indicated", "time", "points", "and", "resolved", "by", "either", "conventional", "or", "Phos", "-", "tagTM", "SDS", "-", "PAGE", ".", "Samples", "were", "immunoblotted", "for", "the", "Flag", "-", "tag", ",", "Cdc27", "and", "cyclin", "B2", ".", "CSF", "extract", "was", "supplemented", "with", "Myc", "-", "XErp1", "wt", "IVT", "and", "treated", "with", "DMSO", "or", "CsA", ".", "Calcium", "was", "added", ",", "samples", "were", "taken", "at", "the", "indicated", "time", "points", ",", "resolved", "by", "either", "conventional", "or", "Phos", "-", "tagTM", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblotted", "for", "Cdc20", ",", "Cdc27", "and", "cyclin", "B2", ".", "A", "control", "sample", "was", "treated", "with", "λ", "-", "phosphatase", ".", "A", "pseudocoloured", "representation", "of", "the", "Cdc20", "and", "the", "Cdc27", "immunoblots", "is", "shown", "in", "Fig", ".", "EV4A", ".", "The", "cyclin", "B2", "membrane", "was", "stripped", "and", "reprobed", "for", "α", "-", "tubulin", ".", "CSF", "extract", "was", "supplemented", "with", "Flag", "-", "Cdc20", "wt", "IVT", "coupled", "to", "α", "-", "Flag", "beads", ".", "Calcium", "was", "added", "and", "Flag", "-", "Cdc20", "was", "isolated", "by", "α", "-", "Flag", "immunoprecipitation", "at", "the", "indicated", "time", "points", ".", "Input", "and", "pellet", "(", "IP", ":", "Flag", ")", "samples", "were", "immunoblotted", "for", "the", "Flag", "-", "tag", ",", "pThr68", "Cdc20", "and", "p150", "(", "Glued", ")", ".", "The", "pThr68", "Cdc20", "membrane", "was", "stripped", "and", "reprobed", "for", "cyclin", "B2", ".", "Asterisk", "in", "the", "cyclin", "B2", "immunoblot", "indicates", "the", "IgG", "heavy", "chain", ".", "Asterisks", "in", "other", "immunoblots", "indicate", "unspecific", "bands", ".", "CSF", "extract", "was", "supplemented", "with", "Flag", "-", "Cdc20", "wt", "IVT", ".", "Flag", "-", "Cdc20", "was", "re", "-", "isolated", "by", "α", "-", "Flag", "immunoprecipitation", ",", "supplemented", "with", "calcium", "and", "treated", "with", "recombinant", "hs", "_", "CaN", "and", "calmodulin", "as", "indicated", ".", "Samples", "were", "taken", "at", "the", "indicated", "time", "points", "and", "immunoblotted", "for", "the", "Flag", "-", "tag", "and", "pThr68", "Cdc20", ".", "The", "pThr68", "Cdc20", "membrane", "was", "stripped", "and", "reprobed", "for", "the", "catalytic", "calcineurin", "subunit", "CnA", ".", "Asterisk", "indicates", "the", "IgG", "heavy", "chain", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3CSF extract was supplemented with mRNA encoding Flag-Cdc20 that was either wild-type or mutated to serine at Thr64, Thr68 and Thr79 (3TS). After expression, calcium was added, samples were taken at the indicated time points and resolved by either conventional or Phos-tagTM SDS-PAGE. Samples were immunoblotted for the Flag-tag, Cdc27 and cyclin B2.CSF extract was supplemented with Myc-XErp1 wt IVT and treated with DMSO or CsA. Calcium was added, samples were taken at the indicated time points, resolved by either conventional or Phos-tagTM SDS-PAGE and immunoblotted for Cdc20, Cdc27 and cyclin B2. A control sample was treated with λ-phosphatase. A pseudocoloured representation of the Cdc20 and the Cdc27 immunoblots is shown in Fig. EV4A. The cyclin B2 membrane was stripped and reprobed for α-tubulin.CSF extract was supplemented with Flag-Cdc20 wt IVT coupled to α-Flag beads. Calcium was added and Flag-Cdc20 was isolated by α-Flag immunoprecipitation at the indicated time points. Input and pellet (IP: Flag) samples were immunoblotted for the Flag-tag, pThr68 Cdc20 and p150(Glued). The pThr68 Cdc20 membrane was stripped and reprobed for cyclin B2. Asterisk in the cyclin B2 immunoblot indicates the IgG heavy chain. Asterisks in other immunoblots indicate unspecific bands.CSF extract was supplemented with Flag-Cdc20 wt IVT. Flag-Cdc20 was re-isolated by α-Flag immunoprecipitation, supplemented with calcium and treated with recombinant hs_CaN and calmodulin as indicated. Samples were taken at the indicated time points and immunoblotted for the Flag-tag and pThr68 Cdc20. The pThr68 Cdc20 membrane was stripped and reprobed for the catalytic calcineurin subunit CnA. Asterisk indicates the IgG heavy chain."}
{"words": ["figf1", "(", "a", ")", "Left", ",", "cells", "were", "fixed", "and", "stained", "for", "anti", "-", "pTyr", "-", "416", "-", "Src", "(", "green", ")", "and", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Solid", "arrows", "indicate", "cells", "with", "active", "Src", "in", "adhesions", ";", "dashed", "arrows", "show", "cells", "with", "active", "Src", "in", "puncta", ".", "Scale", "bars", ",", "20", "μm", ".", "Right", ",", "percentage", "of", "cells", "with", "active", "Src", "localizing", "to", "intracellular", "structures", "was", "quantified", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "and", "significance", "is", "P0", ".", "001", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "b", ")", "Cells", "were", "fixed", "and", "stained", "for", "anti", "-", "FAK", "(", "red", ")", "and", "anti", "-", "pTyr", "-", "416", "-", "Src", "(", "green", ")", ".", "Merged", "and", "higher", "-", "magnification", "images", "of", "the", "outlined", "areas", "are", "also", "shown", ".", "Solid", "and", "dashed", "arrows", "show", "Src", "localization", "to", "adhesions", "or", "to", "puncta", ",", "respectively", ".", "Scale", "bars", ",", "20", " ", "μm", ".", "(", "c", ")", "Lysates", "from", "cells", "were", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "FAK", ",", "anti", "-", "Src", ",", "anti", "-", "Yes", ",", "anti", "-", "Fyn", ",", "anti", "-", "pTyr", "-", "416", "-", "Src", "and", "anti", "-", "actin", "antibodies", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", ".", "S9", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf1(a) Left, cells were fixed and stained for anti-pTyr-416-Src (green) and with DAPI (blue). Solid arrows indicate cells with active Src in adhesions; dashed arrows show cells with active Src in puncta. Scale bars, 20 μm. Right, percentage of cells with active Src localizing to intracellular structures was quantified. Data are presented as mean±s.d. and significance is P0.001 (n=3).(b) Cells were fixed and stained for anti-FAK (red) and anti-pTyr-416-Src (green). Merged and higher-magnification images of the outlined areas are also shown. Solid and dashed arrows show Src localization to adhesions or to puncta, respectively. Scale bars, 20 μm.(c) Lysates from cells were immunoblotted with anti-FAK, anti-Src, anti-Yes, anti-Fyn, anti-pTyr-416-Src and anti-actin antibodies. Uncropped images of blots are shown in Supplementary Fig. S9."}
{"words": ["figf2", "(", "a", ")", "Cells", "were", "fixed", "and", "stained", "for", "anti", "-", "pTyr", "-", "416", "-", "Src", "(", "red", ")", "and", "co", "-", "stained", "for", "anti", "-", "LC3B", ",", "anti", "-", "Atg7", "or", "anti", "-", "Atg12", "(", "all", "green", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "20", " ", "μm", ".", "(", "b", ")", "Higher", "-", "magnification", "images", "of", "the", "areas", "outlined", "in", "a", ".", "Solid", "arrows", "indicate", "co", "-", "localization", "in", "focal", "adhesions", "and", "dashed", "arrows", "show", "puncta", "in", "the", "cytoplasm", ".", "(", "c", ")", "LC3B", "was", "immunoprecipitated", "(", "IP", ")", "from", "FAK", "+", "/", "+", "and", "FAK", "−", "/", "−", "cells", "and", "then", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "Src", ",", "anti", "-", "pTyr", "-", "416", "-", "Src", "and", "anti", "-", "LC3B", "antibodies", ".", "(", "d", ")", "Cells", "were", "transfected", "with", "40", " ", "nM", "scrambled", ",", "Atg5", "or", "Atg12", "siRNA", "for", "72", " ", "h", "and", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "Atg5", ",", "anti", "-", "Atg12", "and", "anti", "-", "actin", "antibodies", "(", "lower", "panels", ")", "or", "fixed", "and", "stained", "for", "anti", "-", "pTyr", "-", "416", "-", "Src", "(", "green", ")", ",", "anti", "-", "paxillin", "(", "red", ")", "and", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Dashed", "arrows", "point", "to", "intracellular", "phospho", "-", "Src", "-", "containing", "puncta", ";", "solid", "arrows", "point", "to", "peripheral", "phospho", "-", "Src", ".", "Scale", "bars", ",", "20", " ", "μm", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", ".", "S9", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf2(a) Cells were fixed and stained for anti-pTyr-416-Src (red) and co-stained for anti-LC3B, anti-Atg7 or anti-Atg12 (all green). Scale bars, 20 μm. (b) Higher-magnification images of the areas outlined in a. Solid arrows indicate co-localization in focal adhesions and dashed arrows show puncta in the cytoplasm.(c) LC3B was immunoprecipitated (IP) from FAK+/+ and FAK−/− cells and then immunoblotted with anti-Src, anti-pTyr-416-Src and anti-LC3B antibodies.(d) Cells were transfected with 40 nM scrambled, Atg5 or Atg12 siRNA for 72 h and immunoblotted with anti-Atg5, anti-Atg12 and anti-actin antibodies (lower panels) or fixed and stained for anti-pTyr-416-Src (green), anti-paxillin (red) and with DAPI (blue). Dashed arrows point to intracellular phospho-Src-containing puncta; solid arrows point to peripheral phospho-Src. Scale bars, 20 μm. Uncropped images of blots are shown in Supplementary Fig. S9."}
{"words": ["figf3", "(", "a", ")", "Top", ",", "cells", "were", "transiently", "transfected", "with", "an", "RFP", "-", "GFP", "tandem", "fluorescent", "-", "tagged", "LC3", "(", "RFP", "-", "GFP", "-", "LC3", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "20", "μm", ".", "Bottom", ",", "the", "number", "of", "yellow", "puncta", "and", "the", "number", "of", "RFP", "LC3", "-", "positive", "puncta", "in", "the", "merged", "images", "were", "counted", "and", "the", "total", "number", "of", "puncta", "per", "cell", "was", "calculated", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "b", ")", "Cells", "were", "treated", "with", "10", "μM", "chloroquine", "for", "24", "h", "and", "then", "immunoblotted", "using", "anti", "-", "pTyr", "-", "416", "-", "Src", ",", "anti", "-", "Src", ",", "anti", "-", "LC3B", "and", "anti", "-", "actin", "antibodies", ".", "Densitometry", "was", "carried", "out", "to", "calculate", "the", "increase", "in", "the", "amount", "of", "LC3B", "-", "II", "relative", "to", "actin", "for", "each", "cell", "type", "following", "treatment", "with", "chloroquine", "and", "is", "presented", "as", "a", "percentage", "increase", "for", "the", "immunoblot", "shown", ".", "(", "c", ")", "Cells", "were", "treated", "with", "200", " ", "nM", "epoxomicin", "for", "4", " ", "h", "and", "then", "immunoblotted", "and", "probed", "with", "anti", "-", "pTyr", "-", "416", "-", "Src", ",", "anti", "-", "Src", ",", "anti", "-", "p53", "and", "anti", "-", "actin", "antibodies", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", ".", "S9", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf3(a) Top, cells were transiently transfected with an RFP-GFP tandem fluorescent-tagged LC3 (RFP-GFP-LC3). Scale bars, 20 μm. Bottom, the number of yellow puncta and the number of RFP LC3-positive puncta in the merged images were counted and the total number of puncta per cell was calculated. Data are presented as mean±s.d. (n=3).b) Cells were treated with 10 μM chloroquine for 24 h and then immunoblotted using anti-pTyr-416-Src, anti-Src, anti-LC3B and anti-actin antibodies. Densitometry was carried out to calculate the increase in the amount of LC3B-II relative to actin for each cell type following treatment with chloroquine and is presented as a percentage increase for the immunoblot shown.(c) Cells were treated with 200 nM epoxomicin for 4 h and then immunoblotted and probed with anti-pTyr-416-Src, anti-Src, anti-p53 and anti-actin antibodies. Uncropped images of blots are shown in Supplementary Fig. S9."}
{"words": ["figf4", "(", "a", ")", "Top", ",", "FAK", "−", "/", "−", "cells", "were", "treated", "with", "200", " ", "nM", "dasatinib", "for", "24", " ", "h", "and", "then", "fixed", "and", "stained", "for", "anti", "-", "Src", "antibody", "(", "green", ")", ".", "Solid", "arrows", "indicate", "Src", "at", "the", "cell", "periphery", ";", "dashed", "arrows", "indicate", "Src", "in", "autophagosomes", ".", "Scale", "bars", ",", "20", " ", "μm", ".", "Bottom", ",", "quantification", "of", "dasatinib", "-", "treated", "cells", "with", "Src", "in", "puncta", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "and", "significance", "is", "P0", ".", "001", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Middle", ",", "lysates", "from", "cells", "treated", "with", "dasatinib", "were", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "Src", "and", "anti", "-", "pTyr", "-", "416", "-", "Src", "and", "lysates", "from", "cells", "treated", "with", "dasatinib", "and", "chloroquine", "were", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "LC3B", "and", "anti", "-", "actin", "antibodies", ".", "Densitometry", "was", "carried", "out", "to", "calculate", "the", "increase", "in", "the", "amount", "of", "LC3B", "-", "II", "relative", "to", "actin", "for", "each", "condition", "after", "treatment", "with", "chloroquine", "and", "is", "presented", "as", "a", "percentage", "increase", "for", "the", "immunoblot", "shown", ".", "(", "b", ")", "Top", ",", "FAK", "−", "/", "−", "cells", "were", "transiently", "transfected", "with", "SrcY527F", "-", "GFP", "or", "with", "Src", "-", "251", "-", "GFP", "(", "green", ")", "and", "stained", "for", "anti", "-", "LC3B", "(", "red", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "20", " ", "μm", ".", "Bottom", ",", "quantification", "of", "cells", "with", "co", "-", "localization", "between", "Src", "and", "LC3B", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "and", "significance", "is", "P0", ".", "001", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "c", ")", "Left", ",", "FAK", "−", "/", "−", "cells", "stably", "re", "-", "expressing", "wild", "-", "type", "FAK", ",", "FAKY397F", "or", "FAKY4F", "-", "Y9F", "were", "fixed", "and", "stained", "for", "anti", "-", "FAK", "(", "red", ")", "and", "anti", "-", "pTyr", "-", "416", "-", "Src", "(", "green", ")", ".", "Solid", "arrows", "indicate", "co", "-", "localization", "at", "adhesions", "and", "dashed", "arrows", "indicate", "active", "Src", "in", "autophagosomes", ".", "Scale", "bars", ",", "20", " ", "μm", ".", "Right", ",", "lysates", "from", "these", "cells", "were", "also", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "FAK", "and", "anti", "-", "actin", "antibodies", ".", "(", "d", ")", "Left", ",", "wild", "-", "type", "FAK", ",", "FAKY397F", "or", "FAKY4F", "-", "Y9F", "cells", "were", "transfected", "with", "RFP", "-", "GFP", "-", "LC3", ".", "Solid", "arrows", "indicate", "co", "-", "localization", "and", "dotted", "arrows", "indicate", "its", "absence", ".", "Scale", "bars", ",", "20", " ", "μm", ".", "(", "e", ")", "Lysates", "were", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "LC3B", "and", "actin", "antibodies", "in", "the", "absence", "and", "presence", "of", "chloroquine", ".", "Densitometry", "was", "carried", "out", "to", "calculate", "the", "increase", "in", "the", "amount", "of", "LC3B", "-", "II", "relative", "to", "actin", "for", "each", "cell", "type", "after", "treatment", "with", "chloroquine", "and", "is", "presented", "as", "a", "percentage", "increase", "for", "the", "immunoblot", "shown", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", ".", "S9", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf4(a) Top, FAK−/− cells were treated with 200 nM dasatinib for 24 h and then fixed and stained for anti-Src antibody (green). Solid arrows indicate Src at the cell periphery; dashed arrows indicate Src in autophagosomes. Scale bars, 20 μm. Bottom, quantification of dasatinib-treated cells with Src in puncta. Data are presented as mean±s.d. and significance is P0.001 (n=3). Middle, lysates from cells treated with dasatinib were immunoblotted with anti-Src and anti-pTyr-416-Src and lysates from cells treated with dasatinib and chloroquine were immunoblotted with anti-LC3B and anti-actin antibodies. Densitometry was carried out to calculate the increase in the amount of LC3B-II relative to actin for each condition after treatment with chloroquine and is presented as a percentage increase for the immunoblot shown.(b) Top, FAK−/− cells were transiently transfected with SrcY527F-GFP or with Src-251-GFP (green) and stained for anti-LC3B (red). Scale bars, 20 μm. Bottom, quantification of cells with co-localization between Src and LC3B. Data are presented as mean±s.d. and significance is P0.001 (n=3).(c) Left, FAK−/− cells stably re-expressing wild-type FAK, FAKY397F or FAKY4F-Y9F were fixed and stained for anti-FAK (red) and anti-pTyr-416-Src (green). Solid arrows indicate co-localization at adhesions and dashed arrows indicate active Src in autophagosomes. Scale bars, 20 μm. Right, lysates from these cells were also immunoblotted with anti-FAK and anti-actin antibodies.(d) Left, wild-type FAK, FAKY397F or FAKY4F-Y9F cells were transfected with RFP-GFP-LC3. Solid arrows indicate co-localization and dotted arrows indicate its absence. Scale bars, 20 μm.(e) Lysates were immunoblotted with anti-LC3B and actin antibodies in the absence and presence of chloroquine. Densitometry was carried out to calculate the increase in the amount of LC3B-II relative to actin for each cell type after treatment with chloroquine and is presented as a percentage increase for the immunoblot shown. Uncropped images of blots are shown in Supplementary Fig. S9."}
{"words": ["figf5", "(", "a", ")", "Wild", "-", "type", "FAK", "cells", "were", "suspended", "in", "1", ".", "4", "%", "methylcellulose", "solution", "in", "growth", "media", "and", "plated", "on", "agarose", "for", "3", "days", ".", "Top", "and", "bottom", "right", ",", "cells", "were", "recovered", "and", "cytospins", "prepared", "that", "were", "stained", "for", "anti", "-", "pTyr", "-", "416", "-", "Src", "(", "red", ")", ",", "LC3B", "(", "green", ")", "and", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", "or", "for", "paxillin", "(", "red", ")", ",", "LC3B", "(", "green", ")", "and", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Higher", "-", "magnification", "images", "of", "the", "outlined", "areas", "are", "also", "shown", ".", "Solid", "arrows", "indicate", "localization", "of", "pTyr", "-", "416", "-", "Src", "in", "LC3B", "-", "positive", "puncta", ".", "Scale", "bars", ",", "20", " ", "μm", ".", "Bottom", "left", ",", "immunoblotting", "was", "carried", "out", "on", "lysates", "from", "adherent", "cells", "and", "from", "cells", "recovered", "from", "methylcellulose", "using", "anti", "-", "pTyr", "-", "397", "FAK", ",", "anti", "-", "FAK", ",", "anti", "-", "pTyr", "-", "416", "and", "anti", "-", "Src", "antibodies", ".", "(", "b", ")", "FAK", "+", "/", "+", "cells", "were", "suspended", "for", "1", " ", "h", "in", "PBS", "and", "cytospins", "were", "prepared", "that", "were", "stained", "for", "anti", "-", "pTyr", "-", "416", "-", "Src", "(", "green", ")", "and", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "A", "higher", "-", "magnification", "image", "of", "the", "area", "outlined", "is", "also", "shown", ".", "Scale", "bar", ",", "20", " ", "μm", ".", "(", "c", ")", "LC3B", "was", "immunoprecipitated", "(", "IP", ")", "from", "adherent", "or", "suspended", "FAK", "+", "/", "+", "and", "then", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "Src", "and", "anti", "-", "LC3B", "antibodies", ".", "Lysates", "were", "also", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "pTyr", "-", "397", "-", "FAK", "and", "anti", "-", "actin", "antibodies", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", ".", "S9", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf5(a) Wild-type FAK cells were suspended in 1.4% methylcellulose solution in growth media and plated on agarose for 3 days. Top and bottom right, cells were recovered and cytospins prepared that were stained for anti-pTyr-416-Src (red), LC3B (green) and with DAPI (blue) or for paxillin (red), LC3B (green) and with DAPI (blue). Higher-magnification images of the outlined areas are also shown. Solid arrows indicate localization of pTyr-416-Src in LC3B-positive puncta. Scale bars, 20 μm. Bottom left, immunoblotting was carried out on lysates from adherent cells and from cells recovered from methylcellulose using anti-pTyr-397 FAK, anti-FAK, anti-pTyr-416 and anti-Src antibodies.(b) FAK+/+ cells were suspended for 1 h in PBS and cytospins were prepared that were stained for anti-pTyr-416-Src (green) and with DAPI (blue). A higher-magnification image of the area outlined is also shown. Scale bar, 20 μm.(c) LC3B was immunoprecipitated (IP) from adherent or suspended FAK+/+ and then immunoblotted with anti-Src and anti-LC3B antibodies. Lysates were also immunoblotted with anti-pTyr-397-FAK and anti-actin antibodies. Uncropped images of blots are shown in Supplementary Fig. S9."}
{"words": ["figf6", "(", "a", ")", "Top", ",", "FAK", "−", "/", "−", "cells", "were", "sparsely", "plated", "and", "then", "treated", "with", "3", "-", "MA", "(", "for", "48", " ", "h", ")", ",", "chloroquine", "or", "dasatinib", "(", "both", "for", "24", " ", "h", ")", ".", "Cells", "were", "then", "left", "at", "37", " ", "°", "C", "for", "1", "week", "to", "allow", "colony", "formation", ",", "fixed", "and", "then", "stained", "with", "crystal", "violet", ".", "Bottom", ",", "the", "number", "of", "colonies", "formed", "was", "then", "quantified", "and", "normalized", "against", "untreated", "controls", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "and", "significance", "is", "P0", ".", "001", "for", "3", "-", "MA", ",", "P0", ".", "01", "for", "chloroquine", "and", "P", ">", "0", ".", "5", "for", "dasatinib", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "b", ")", "Top", ",", "wild", "-", "type", "FAK", "and", "FAK", "−", "/", "−", "cells", "were", "transiently", "transfected", "with", "two", "individual", "Atg5", "shRNAs", "(", "1", "and", "2", ")", ",", "selected", "in", "puromycin", "and", "then", "the", "clonogenic", "assay", "was", "carried", "out", "as", "described", "above", ".", "Bottom", ",", "quantification", ";", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "and", "significance", "is", "P", ">", "0", ".", "1", "for", "Atg5", "A", "and", "B", "in", "wild", "-", "type", "FAK", "cells", "and", "P0", ".", "01", "for", "Atg5", "A", "and", "P0", ".", "05", "for", "Atg5", "B", "in", "FAK", "−", "/", "−", "cells", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "c", ")", "Cells", "were", "also", "stained", "with", "TUNEL", ".", "The", "positive", "control", "was", "DNase1", "-", "treated", "cells", "and", "the", "negative", "control", "lacked", "TUNEL", "reaction", "mix", ".", "Quantification", "is", "shown", "and", "data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "and", "significance", "is", "P0", ".", "005", "for", "3", "-", "MA", "and", "P0", ".", "001", "for", "Atg5", "siRNA", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "d", ")", "FAK", "−", "/", "−", "cells", "were", "untreated", "or", "treated", "with", "dasatinib", ",", "3", "-", "MA", ",", "chloroquine", "or", "bafilomycin", "A", "(", "BFA", ")", "for", "24", " ", "h", ",", "or", "were", "transfected", "with", "scrambled", "or", "Atg5", "siRNA", "for", "72", " ", "h", "and", "then", "immunoblotted", "with", "an", "anti", "-", "PARP", "antibody", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", ".", "S9", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf6(a) Top, FAK−/− cells were sparsely plated and then treated with 3-MA (for 48 h), chloroquine or dasatinib (both for 24 h). Cells were then left at 37 °C for 1 week to allow colony formation, fixed and then stained with crystal violet. Bottom, the number of colonies formed was then quantified and normalized against untreated controls. Data are presented as mean±s.d. and significance is P0.001 for 3-MA, P0.01 for chloroquine and P>0.5 for dasatinib (n=3).(b) Top, wild-type FAK and FAK−/− cells were transiently transfected with two individual Atg5 shRNAs (1 and 2), selected in puromycin and then the clonogenic assay was carried out as described above. Bottom, quantification; data are presented as mean±s.d. and significance is P>0.1 for Atg5 A and B in wild-type FAK cells and P0.01 for Atg5 A and P0.05 for Atg5 B in FAK−/− cells (n=3).(c) Cells were also stained with TUNEL. The positive control was DNase1-treated cells and the negative control lacked TUNEL reaction mix. Quantification is shown and data are presented as mean±s.d. and significance is P0.005 for 3-MA and P0.001 for Atg5 siRNA (n=3).(d) FAK−/− cells were untreated or treated with dasatinib, 3-MA, chloroquine or bafilomycin A (BFA) for 24 h, or were transfected with scrambled or Atg5 siRNA for 72 h and then immunoblotted with an anti-PARP antibody. Uncropped images of blots are shown in Supplementary Fig. S9."}
{"words": ["figf7", "(", "a", ")", "Cells", "untreated", ",", "or", "treated", "with", "chloroquine", "for", "24", " ", "h", ",", "were", "fixed", "and", "stained", "for", "anti", "-", "pTyr", "-", "416", "-", "Src", "(", "red", ")", "and", "anti", "-", "c", "-", "Cbl", "(", "green", ")", ".", "Solid", "arrows", "indicate", "co", "-", "localization", "at", "adhesions", "and", "dashed", "arrows", "indicate", "co", "-", "localization", "in", "autophagosomes", ".", "Scale", "bars", ",", "20", " ", "μm", ".", "(", "b", ")", "c", "-", "Cbl", "was", "immunoprecipitated", "(", "IP", ")", "from", "FAK", "+", "/", "+", "and", "FAK", "−", "/", "−", "cells", "and", "then", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "Src", ",", "anti", "-", "pTyr", "-", "416", "-", "Src", "and", "anti", "-", "c", "-", "Cbl", "antibodies", ".", "(", "c", ",", "d", ")", "Cells", "were", "transfected", "with", "scrambled", "siRNA", "or", "with", "c", "-", "Cbl", "siRNA", "for", "72", " ", "h", "and", "then", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "c", "-", "Cbl", "and", "actin", "antibodies", "(", "c", ")", "or", "stained", "for", "anti", "-", "pTyr", "-", "416", "-", "Src", "(", "red", ")", "and", "anti", "-", "c", "-", "Cbl", "(", "green", ";", "d", ",", "left", ")", ".", "Dashed", "arrows", "indicate", "co", "-", "localization", "and", "solid", "arrows", "indicate", "Src", "at", "focal", "adhesions", ".", "Scale", "bars", ",", "20", " ", "μm", ".", "Quantification", "is", "shown", "(", "d", ",", "right", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "and", "significance", "is", "P", ">", "0", ".", "5", "for", "FAK", "+", "/", "+", "cells", "and", "P0", ".", "001", "for", "FAK", "−", "/", "−", "cells", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "e", ")", "LC3B", "was", "immunoprecipitated", "from", "FAK", "−", "/", "−", "cells", "expressing", "either", "scrambled", "or", "c", "-", "Cbl", "siRNA", "and", "then", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "Src", "and", "anti", "-", "LC3B", "antibodies", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", ".", "S9", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf7(a) Cells untreated, or treated with chloroquine for 24 h, were fixed and stained for anti-pTyr-416-Src (red) and anti-c-Cbl (green). Solid arrows indicate co-localization at adhesions and dashed arrows indicate co-localization in autophagosomes. Scale bars, 20 μm.(b) c-Cbl was immunoprecipitated (IP) from FAK+/+ and FAK−/− cells and then immunoblotted with anti-Src, anti-pTyr-416-Src and anti-c-Cbl antibodies.(c,d) Cells were transfected with scrambled siRNA or with c-Cbl siRNA for 72 h and then immunoblotted with anti-c-Cbl and actin antibodies (c) or stained for anti-pTyr-416-Src (red) and anti-c-Cbl (green; d, left). Dashed arrows indicate co-localization and solid arrows indicate Src at focal adhesions. Scale bars, 20 μm. Quantification is shown (d, right). Data are presented as mean±s.d. and significance is P>0.5 for FAK+/+ cells and P0.001 for FAK−/− cells (n=3).(e) LC3B was immunoprecipitated from FAK−/− cells expressing either scrambled or c-Cbl siRNA and then immunoblotted with anti-Src and anti-LC3B antibodies. Uncropped images of blots are shown in Supplementary Fig. S9."}
{"words": ["figf8", "(", "a", ")", "c", "-", "Cbl", "siRNA", "was", "transfected", "into", "FAK", "−", "/", "−", "cells", "expressing", "siRNA", "resistant", ",", "HA", "-", "tagged", "wild", "-", "type", "c", "-", "Cbl", "or", "c", "-", "Cbl", "mutants", "with", "defective", "E3", "ligase", "activity", "(", "c", "-", "CblC381A", "or", "c", "-", "Cbl", "-", "70Z", ")", ".", "Left", ",", "cells", "were", "stained", "for", "anti", "-", "p", "-", "Tyr", "-", "416", "-", "Src", "(", "green", ")", ",", "anti", "-", "HA", "(", "red", ")", "and", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Solid", "arrows", "show", "co", "-", "localization", "in", "intracellular", "puncta", ".", "Scale", "bars", ",", "20", " ", "μm", ".", "Right", ",", "quantification", "of", "percentage", "of", "cells", "that", "contained", "active", "Src", "in", "intracellular", "puncta", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "and", "significance", "is", "P", ">", "0", ".", "5", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "c", ")", "GST", "-", "pulldown", "assay", "of", "HA", "-", "tagged", "wild", "-", "type", "c", "-", "Cbl", ",", "c", "-", "CblAA", "(", "W802A", ",", "L805A", ")", "and", "c", "-", "CblAAAA", "(", "W802A", ",", "L803A", ",", "S804A", ",", "L805A", ")", "expressed", "in", "HEK293T", "cells", "was", "carried", "out", "using", "GST", "-", "LC3", ".", "(", "d", ")", "c", "-", "Cbl", "siRNA", "was", "transfected", "into", "FAK", "−", "/", "−", "cells", "expressing", "siRNA", "-", "resistant", "HA", "-", "tagged", "wild", "-", "type", "c", "-", "Cbl", "or", "c", "-", "CblAAAA", ".", "Left", ",", "cells", "were", "stained", "for", "anti", "-", "pTyr", "-", "416", "-", "Src", "(", "green", ")", ",", "anti", "-", "HA", "(", "red", ")", "and", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Solid", "arrows", "indicate", "pTyr", "-", "416", "localization", "to", "adhesions", "and", "dashed", "arrows", "indicate", "localization", "to", "intracellular", "puncta", ".", "Scale", "bars", ",", "20", " ", "μm", ".", "Right", ",", "quantification", "of", "percentage", "of", "cells", "that", "contained", "active", "Src", "in", "intracellular", "puncta", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "and", "significance", "is", "P0", ".", "01", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Uncropped", "images", "of", "blots", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", ".", "S9", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf8(a) c-Cbl siRNA was transfected into FAK−/− cells expressing siRNA resistant, HA-tagged wild-type c-Cbl or c-Cbl mutants with defective E3 ligase activity (c-CblC381A or c-Cbl-70Z). Left, cells were stained for anti-p-Tyr-416-Src (green), anti-HA (red) and with DAPI (blue). Solid arrows show co-localization in intracellular puncta. Scale bars, 20 μm. Right, quantification of percentage of cells that contained active Src in intracellular puncta. Data are presented as mean±s.d. and significance is P>0.5 (n=3).(c) GST-pulldown assay of HA-tagged wild-type c-Cbl, c-CblAA (W802A, L805A) and c-CblAAAA (W802A, L803A, S804A, L805A) expressed in HEK293T cells was carried out using GST-LC3.(d) c-Cbl siRNA was transfected into FAK−/− cells expressing siRNA-resistant HA-tagged wild-type c-Cbl or c-CblAAAA. Left, cells were stained for anti-pTyr-416-Src (green), anti-HA (red) and with DAPI (blue). Solid arrows indicate pTyr-416 localization to adhesions and dashed arrows indicate localization to intracellular puncta. Scale bars, 20 μm. Right, quantification of percentage of cells that contained active Src in intracellular puncta. Data are presented as mean±s.d. and significance is P0.01 (n=3). Uncropped images of blots are shown in Supplementary Fig. S9."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "The", "mRNA", "levels", "of", "QKI", "relative", "to", "those", "of", "36B4", "in", "BAT", "and", "ingWAT", "from", "HFD", "mice", "(", "n", "=", "8", ")", "and", "lean", "controls", "(", "n", "=", "8", ")", ".", "WT", "fl", "/", "fl", "and", "QKI", "KO", "fl", "/", "fl", ":", "AP2", "-", "Cre", "mice", "fed", "a", "NCD", "or", "HFD", "for", "20", "weeks", ".", "The", "arrow", "indicates", "the", "time", "when", "the", "high", "fat", "diet", "（", "HFD", "）", "starts", ",", "and", "body", "weight", "was", "monitored", "weekly", ".", "(", "n", "=", "10", ",", "per", "genotype", ")", "Representative", "pictures", "of", "adipocyte", "-", "specific", "QKI", "-", "deficient", "mice", "under", "NCD", "or", "HFD", "conditions", ".", "Gross", "appearance", "of", "tissues", "from", "BAT", ",", "eWAT", "and", "ingWAT", "fat", "pads", "from", "WT", "fl", "/", "fl", "and", "QKI", "KO", "fl", "/", "fl", ":", "AP2", "-", "Cre", "mice", "after", "20", "weeks", "on", "the", "NCD", "or", "HFD", ".", "H", "&", "E", "staining", "of", "BAT", ",", "eWAT", "and", "ingWAT", "from", "WT", "fl", "/", "fl", "and", "QKI", "KO", "fl", "/", "fl", ":", "AP2", "-", "Cre", "mice", "fed", "the", "NCD", "or", "HFD", "for", "20", "weeks", ".", "(", "Scale", "bar", "represents", "50", "μm", ")", "The", "gross", "appearance", "of", "BAT", ",", "eWAT", "and", "ingWAT", "fat", "pads", "after", "administration", "of", "AAV", "-", "ShQKI", "or", "AAV", "-", "NC", "vectors", "in", "local", "adipose", "(", "ingWAT", "and", "BAT", ")", ".", "The", "increase", "in", "relative", "body", "weights", "following", "HFD", "feeding", ".", "(", "n", "=", "8", ",", "per", "group", ")", "H", "&", "E", "staining", "of", "the", "liver", ",", "BAT", "and", "ingWAT", "from", "AAV", "-", "NC", "or", "AAV", "-", "ShQKI", "mice", ".", "(", "Scale", "bar", "represents", "50", "μm", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A)The mRNA levels of QKI relative to those of 36B4 in BAT and ingWAT from HFD mice (n = 8) and lean controls (n = 8).WT fl/fl and QKI KO fl/fl:AP2-Cre mice fed a NCD or HFD for 20 weeks. The arrow indicates the time when the high fat diet（HFD）starts, and body weight was monitored weekly. (n = 10, per genotype)Representative pictures of adipocyte-specific QKI-deficient mice under NCD or HFD conditions.Gross appearance of tissues from BAT, eWAT and ingWAT fat pads from WT fl/fl and QKI KO fl/fl:AP2-Cre mice after 20 weeks on the NCD or HFD.H&E staining of BAT, eWAT and ingWAT from WT fl/fl and QKI KO fl/fl:AP2-Cre mice fed the NCD or HFD for 20 weeks. (Scale bar represents 50 μm)The gross appearance of BAT, eWAT and ingWAT fat pads after administration of AAV-ShQKI or AAV-NC vectors in local adipose (ingWAT and BAT).The increase in relative body weights following HFD feeding. (n = 8, per group)H&E staining of the liver, BAT and ingWAT from AAV-NC or AAV-ShQKI mice. (Scale bar represents 50 μm)."}
{"words": ["Figure", "2Representative", "CT", "images", "of", "WT", "fl", "/", "fl", "and", "QKI", "KO", "fl", "/", "fl", ":", "AP2", "-", "Cre", "mice", "on", "an", "NCD", "or", "HFD", ",", "showing", "the", "whole", "-", "body", "fat", "composition", ".", "Glucose", "tolerance", "tests", "(", "GTT", ")", "and", "Insulin", "tolerance", "tests", "(", "ITT", ")", "were", "performed", "on", "WT", "fl", "/", "fl", "and", "QKI", "KO", "fl", "/", "fl", ":", "AP2", "-", "Cre", "mice", "fed", "the", "NCD", "or", "HFD", "for", "20", "weeks", ".", "Blood", "glucose", "concentrations", "during", "GTT", "and", "ITT", "were", "monitored", ".", "(", "n", "=", "10", ",", "per", "genotype", ")", "Blood", "glucose", "and", "plasma", "insulin", "levels", "in", "WT", "fl", "/", "fl", "and", "QKI", "KO", "fl", "/", "fl", ":", "AP2", "-", "Cre", "mice", "fed", "the", "NCD", "or", "HFD", "for", "20", "weeks", ".", "(", "n", "=", "8", ",", "per", "genotype", ")", "Plasma", "Free", "Fatty", "Acid", "(", "FFA", ")", "and", "Glycerol", "levels", "in", "WT", "fl", "/", "fl", "and", "QKI", "KO", "fl", "/", "fl", ":", "AP2", "-", "Cre", "mice", "fed", "the", "NCD", "or", "HFD", "for", "20", "weeks", ".", "(", "n", "=", "8", ",", "per", "genotype", ")", "H", "&", "E", "and", "Oil", "Red", "O", "staining", ",", "and", "liver", "triglyceride", "(", "TG", ")", "content", "in", "WT", "fl", "/", "fl", "and", "QKI", "KO", "fl", "/", "fl", ":", "AP2", "-", "Cre", "mice", "fed", "the", "NCD", "or", "HFD", "for", "20", "weeks", ".", "(", "Scale", "bar", "represents", "50", "μm", ")"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Representative CT images of WT fl/fl and QKI KO fl/fl:AP2-Cre mice on an NCD or HFD, showing the whole-body fat composition.Glucose tolerance tests (GTT) and Insulin tolerance tests (ITT) were performed on WT fl/fl and QKI KO fl/fl:AP2-Cre mice fed the NCD or HFD for 20 weeks. Blood glucose concentrations during GTT and ITT were monitored. (n= 10, per genotype)Blood glucose and plasma insulin levels in WT fl/fl and QKI KO fl/fl:AP2-Cre mice fed the NCD or HFD for 20 weeks. (n = 8, per genotype)Plasma Free Fatty Acid (FFA) and Glycerol levels in WT fl/fl and QKI KO fl/fl:AP2-Cre mice fed the NCD or HFD for 20 weeks. (n = 8, per genotype)H&E and Oil Red O staining, and liver triglyceride (TG) content in WT fl/fl and QKI KO fl/fl:AP2-Cre mice fed the NCD or HFD for 20 weeks. (Scale bar represents 50 μm)"}
{"words": ["Figure", "3O2", "consumption", "rates", "were", "measured", "via", "indirect", "calorimetry", "using", "CLAMS", "under", "chow", "-", "fed", "conditions", "(", "n", "=", "8", ",", "per", "genotype", ")", ".", "And", "average", "light", "and", "dark", "O2", "consumption", "rates", "are", "shown", "on", "the", "right", ".", "Heat", "production", "rates", "in", "WT", "fl", "/", "fl", "and", "QKI", "KO", "fl", "/", "fl", ":", "AP2", "-", "Cre", "mice", "(", "n", "=", "8", ",", "per", "genotype", ")", ".", "And", "average", "light", "and", "dark", "heat", "production", "rates", "are", "shown", "on", "the", "right", ".", "Heatmaps", "of", "log2", "(", "fold", "change", "QKI", "KO", "fl", "/", "fl", ":", "AP2", "-", "Cre", "BAT", "vs", ".", "WT", "fl", "/", "fl", "BAT", ")", "for", "genes", "involved", "in", "thermogenesis", "and", "oxidation", ".", "(", "3", "samples", ",", "per", "group", ")", "Photograph", "of", "WT", "fl", "/", "fl", "and", "QKI", "KO", "fl", "/", "fl", ":", "AP2", "-", "Cre", "classical", "BAT", "in", "4", "%", "paraformaldehyde", "solution", ",", "representative", "transmission", "electron", "micrographs", ",", "and", "UCP1", "staining", "of", "BAT", "from", "WT", "fl", "/", "fl", "and", "QKI", "KO", "fl", "/", "fl", ":", "AP2", "-", "Cre", "mice", ".", "The", "average", "diameter", "of", "lipid", "droplets", "and", "the", "number", "of", "mitochondria", "per", "field", "from", "WT", "fl", "/", "fl", "and", "QKI", "KO", "fl", "/", "fl", ":", "AP2", "-", "Cre", "BAT", ".", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", "The", "relative", "mRNA", "levels", "of", "genes", "related", "to", "thermogenesis", "in", "BAT", "analyzed", "by", "RT", "-", "PCR", ".", "(", "n", "=", "4", "biological", "replicates", ")", "Total", "oxygen", "consumption", "rates", "(", "OCR", ")", "per", "gram", "in", "BAT", "from", "WT", "fl", "/", "fl", "and", "QKI", "KO", "fl", "/", "fl", ":", "AP2", "-", "Cre", "mice", "under", "basal", "conditions", "were", "measured", "using", "a", "Clark", "electrode", ".", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", "The", "relative", "mRNA", "levels", "of", "genes", "related", "to", "thermogenesis", "in", "ingWAT", "analyzed", "by", "RT", "-", "PCR", ".", "(", "n", "=", "4", "biological", "replicates", ")", "Total", "oxygen", "consumption", "rates", "(", "OCR", ")", "per", "gram", "in", "ingWAT", "from", "WT", "fl", "/", "fl", "and", "QKI", "KO", "fl", "/", "fl", ":", "AP2", "-", "Cre", "mice", "under", "basal", "conditions", ".", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", "Representative", "recording", "of", "Continuous", "measurement", "of", "oxygen", "consumption", "rate", "(", "OCR", ")", "in", "isolated", "mitochondria", "from", "BAT", "of", "WT", "fl", "/", "fl", "and", "QKI", "KO", "fl", "/", "fl", ":", "AP2", "-", "Cre", "mice", "on", "NCD", ";", "Oxygen", "consumption", "was", "performed", "under", "basal", "conditions", ",", "following", "the", "addition", "of", "0", ".", "25", "mg", "mitochondria", "(", "Mit", ")", ",", "5", "mM", "substrate", "glycerol", "-", "3", "-", "phosphate", "(", "G3P", ")", ",", "2", "mM", "GDP", ",", "and", "450", "mM", "ADP", ",", "2", "μg", "/", "ml", "oligomycin", ",", "and", "1", ".", "5", "μM", "FCCP", ".", "Quantification", "of", "experimental", "data", ".", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ",", "per", "group", ")", "UCP1", "-", "dependent", "oxygen", "consumption", "rates", "estimated", "as", "GDP", "-", "inhabitable", "rates", ",", "based", "on", "the", "data", "shown", "in", "(", "K", ")", ".", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3O2 consumption rates were measured via indirect calorimetry using CLAMS under chow-fed conditions (n = 8, per genotype). And average light and dark O2 consumption rates are shown on the right.Heat production rates in WT fl/fl and QKI KO fl/fl:AP2-Cre mice (n = 8, per genotype). And average light and dark heat production rates are shown on the right.Heatmaps of log2 (fold change QKI KO fl/fl:AP2-Cre BAT vs. WT fl/fl BAT) for genes involved in thermogenesis and oxidation. (3 samples, per group)Photograph of WT fl/fl and QKI KO fl/fl:AP2-Cre classical BAT in 4% paraformaldehyde solution, representative transmission electron micrographs, and UCP1 staining of BAT from WT fl/fl and QKI KO fl/fl:AP2-Cre mice.The average diameter of lipid droplets and the number of mitochondria per field from WT fl/fl and QKI KO fl/fl:AP2-Cre BAT. (n = 3 biological replicates)The relative mRNA levels of genes related to thermogenesis in BAT analyzed by RT-PCR. (n = 4 biological replicates)Total oxygen consumption rates (OCR) per gram in BAT from WT fl/fl and QKI KO fl/fl:AP2-Cre mice under basal conditions were measured using a Clark electrode. (n = 3 biological replicates)The relative mRNA levels of genes related to thermogenesis in ingWAT analyzed by RT-PCR. (n = 4 biological replicates)Total oxygen consumption rates (OCR) per gram in ingWAT from WT fl/fl and QKI KO fl/fl:AP2-Cre mice under basal conditions. (n = 3 biological replicates)Representative recording of Continuous measurement of oxygen consumption rate (OCR) in isolated mitochondria from BAT of WT fl/fl and QKI KO fl/fl:AP2-Cre mice on NCD; Oxygen consumption was performed under basal conditions, following the addition of 0. 25 mg mitochondria (Mit), 5 mM substrate glycerol-3-phosphate (G3P), 2 mM GDP, and 450 mM ADP, 2 μg/ml oligomycin, and 1.5 μM FCCP. Quantification of experimental data. (n=3 biological replicates, per group)UCP1-dependent oxygen consumption rates estimated as GDP-inhabitable rates, based on the data shown in (K). (n=3 biological replicates)"}
{"words": ["Figure", "4The", "protein", "levels", "of", "PGC1α", "and", "QKI", "in", "siRNA", "-", "mediated", "QKI", "knockdown", "differentiated", "cell", ",", "and", "the", "quantification", "graph", "was", "shown", "on", "the", "right", ".", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", "Immunostaining", "of", "PGC1α", "and", "UCP1", "in", "NC", ",", "Si", "-", "QKI", "1", ",", "and", "Si", "-", "QKI", "2", "adipocytes", ".", "(", "Scale", "bar", "represents", "20", "μm", ")", ".", "The", "relative", "mRNA", "levels", "of", "genes", "related", "to", "thermogenesis", "in", "adipocytes", "treated", "with", "NC", ",", "QKI", "siRNA", "or", "both", "QKI", "and", "PGC1α", "siRNA", ".", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", "The", "oxygen", "consumption", "rates", "in", "adipocytes", "treated", "with", "NC", ",", "QKI", "siRNA", "or", "both", "QKI", "and", "PGC1α", "siRNA", ".", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", "Representative", "pictures", "of", "oil", "red", "O", "staining", "in", "three", "adipocyte", "types", ":", "ShScramble", "+", "ovCon", "cells", ",", "QKI", "knockdown", "cells", "(", "ShQKI", "+", "ovCon", ")", "and", "QKI", "knockdown", "with", "QKI", "-", "5", "re", "-", "expression", "cells", "(", "ShQKI", "+", "ovQKI", ")", ".", "The", "protein", "levels", "of", "PGC1α", "in", "these", "adipocytes", ",", "and", "the", "quantification", "graph", "was", "shown", "on", "the", "right", ".", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", "The", "relative", "mRNA", "levels", "of", "genes", "associated", "with", "energy", "dissipation", "in", "ShScramble", "+", "ovCon", ",", "ShQKI", "+", "ovCon", "and", "ShQKI", "+", "ovQKI", "differentiated", "cells", ".", "The", "results", "represent", "3", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4The protein levels of PGC1α and QKI in siRNA-mediated QKI knockdown differentiated cell, and the quantification graph was shown on the right. (n=3 biological replicates)Immunostaining of PGC1α and UCP1 in NC, Si-QKI 1, and Si-QKI 2 adipocytes. (Scale bar represents 20 μm).The relative mRNA levels of genes related to thermogenesis in adipocytes treated with NC, QKI siRNA or both QKI and PGC1α siRNA. (n=3 biological replicates)The oxygen consumption rates in adipocytes treated with NC, QKI siRNA or both QKI and PGC1α siRNA. (n=3 biological replicates)Representative pictures of oil red O staining in three adipocyte types: ShScramble+ovCon cells, QKI knockdown cells (ShQKI+ovCon) and QKI knockdown with QKI-5 re-expression cells (ShQKI+ovQKI).The protein levels of PGC1α in these adipocytes, and the quantification graph was shown on the right. (n=3 biological replicates)The relative mRNA levels of genes associated with energy dissipation in ShScramble+ovCon, ShQKI+ovCon and ShQKI+ovQKI differentiated cells. The results represent 3 independent experiments."}
{"words": ["Figure", "5Construction", "of", "a", "series", "of", "luciferase", "reporter", "vectors", "(", "PGC1α", "full", "-", "length", "3", "'", "UTR", "T", ",", "A", ",", "B", ",", "C", "fragments", "and", "PGC1α", "3", "'", "UTR", "QRE", "motif", "sites", "mutant", "B", "M1", ",", "B", "M2", ",", "C", "M1", ",", "C", "M2", "fragments", ")", ".", "Luciferase", "activity", "assays", "to", "examine", "the", "functional", "QRE", "motif", "sites", "in", "the", "PGC1α", "3", "'", "UTR", "affected", "by", "QKI", ".", "(", "n", "=", "4", "biological", "replicates", ")", "Construction", "of", "a", "series", "of", "luciferase", "reporter", "vectors", "(", "UCP1", "full", "-", "length", "3", "'", "UTR", "T", "fragment", "and", "UCP1", "3", "'", "UTR", "QRE", "motif", "sites", "mutant", "T", "M1", ",", "T", "M2", ",", "T", "M3", "fragments", ")", ".", "Luciferase", "activity", "assays", "to", "examine", "the", "functional", "QRE", "motif", "sites", "in", "the", "UCP1", "3", "'", "UTR", "affected", "by", "QKI", ".", "(", "n", "=", "4", "biological", "replicates", ")", "Based", "on", "RIP", "-", "sequencing", "data", ",", "the", "distribution", "of", "QKI", "-", "binding", "peaks", "within", "UCP1", "and", "PGC1α", "transcript", "regions", ".", "RNA", "immunoprecipitation", "followed", "by", "real", "-", "time", "PCR", ".", "Specific", "primer", "for", "PGC1α", "3", "'", "UTR", "region", "1", ",", "region", "2", "and", "UCP1", "3", "'", "UTR", "to", "detect", "these", "QRE", "motif", "sites", "region", "bound", "to", "endogenous", "QKI", "in", "brown", "fat", "tissue", ",", "and", "data", "showing", "the", "PGC1α", "and", "UCP1", "transcripts", "abundance", "in", "QKI", "IP", "compared", "with", "IgG", "IP", ".", "(", "n", "=", "4", "biological", "replicates", ")", "293T", "cells", "were", "transfected", "with", "PGC1α", "wild", "type", "or", "QRE", "sites", "mutant", "3", "'", "UTR", "fragments", ".", "RNA", "immunoprecipitation", "(", "RIP", ")", "to", "identify", "these", "QRE", "motif", "sites", "region", "bound", "to", "endogenous", "QKI", "by", "using", "anti", "-", "QKI", "antibodies", ".", "The", "results", "showed", "that", "endogenous", "QKI", "interacted", "with", "full", "-", "length", "wild", "type", "QRE", "motif", "regions", "within", "3", "'", "UTRs", "of", "PGC1α293T", "cells", "were", "transfected", "with", "UCP1", "wild", "type", "or", "QRE", "sites", "mutant", "3", "'", "UTR", "fragments", ".", "RNA", "immunoprecipitation", "(", "RIP", ")", "to", "identify", "these", "QRE", "motif", "sites", "region", "bound", "to", "endogenous", "QKI", "by", "using", "anti", "-", "QKI", "antibodies", ".", "The", "results", "showed", "that", "endogenous", "QKI", "interacted", "with", "full", "-", "length", "wild", "type", "QRE", "motif", "regions", "within", "3", "'", "UTRs", "of", "UCP1", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Construction of a series of luciferase reporter vectors (PGC1α full-length 3'UTR T, A, B, C fragments and PGC1α 3'UTR QRE motif sites mutant B M1, B M2, C M1, C M2 fragments). Luciferase activity assays to examine the functional QRE motif sites in the PGC1α 3'UTR affected by QKI. (n=4 biological replicates)Construction of a series of luciferase reporter vectors (UCP1 full-length 3'UTR T fragment and UCP1 3'UTR QRE motif sites mutant T M1, T M2, T M3 fragments). Luciferase activity assays to examine the functional QRE motif sites in the UCP1 3'UTR affected by QKI. (n=4 biological replicates)Based on RIP-sequencing data, the distribution of QKI-binding peaks within UCP1 and PGC1α transcript regions.RNA immunoprecipitation followed by real-time PCR. Specific primer for PGC1α 3'UTR region 1, region 2 and UCP1 3'UTR to detect these QRE motif sites region bound to endogenous QKI in brown fat tissue, and data showing the PGC1α and UCP1 transcripts abundance in QKI IP compared with IgG IP. (n=4 biological replicates)293T cells were transfected with PGC1α wild type or QRE sites mutant 3'UTR fragments. RNA immunoprecipitation (RIP) to identify these QRE motif sites region bound to endogenous QKI by using anti-QKI antibodies. The results showed that endogenous QKI interacted with full-length wild type QRE motif regions within 3'UTRs of PGC1α293T cells were transfected with UCP1 wild type or QRE sites mutant 3'UTR fragments. RNA immunoprecipitation (RIP) to identify these QRE motif sites region bound to endogenous QKI by using anti-QKI antibodies. The results showed that endogenous QKI interacted with full-length wild type QRE motif regions within 3'UTRs of UCP1."}
{"words": ["Figure", "6The", "mRNA", "stability", "in", "adipocytes", "was", "measured", "by", "incubating", "cells", "with", "actinomycin", "D", "(", "5", "μg", "/", "ml", ")", ".", "Actinomycin", "D", "was", "added", "to", "stop", "transcription", ",", "and", "RNAs", "were", "harvested", "at", "the", "indicated", "times", "(", "x", "-", "axis", ")", "after", "transcription", "inhibition", ".", "Real", "-", "time", "PCR", "was", "used", "to", "determine", "remaining", "UCP1", ",", "PGC1α", "and", "Actin", "mRNA", "levels", "compared", "with", "the", "starting", "time", ".", "Increasing", "PGC1α", "mRNA", "half", "-", "life", "by", "depletion", "of", "QKI", "(", "ShScramble", "T1", "/", "2", "=", "4", ".", "73", "h", ",", "ShQKI", "T1", "/", "2", "=", "8", ".", "04", "h", ")", ".", "(", "n", "=", "4", "biological", "replicates", ")", "The", "nuclear", "and", "cytoplasmic", "fractionation", "was", "valid", "by", "immunoblotting", "using", "cytoplasmic", "and", "nuclear", "protein", "markers", "(", "GAPDH", "and", "Lamin", "B1", ")", "to", "show", "the", "purity", "of", "fractions", ".", "Real", "-", "time", "PCR", "analysis", "of", "mRNA", "transcript", "levels", "of", "the", "QKI", "targets", "UCP1", "and", "PGC1α", "in", "the", "nuclear", "and", "cytoplasmic", "fractions", "of", "differentiated", "MEF", "cells", "transfected", "with", "ShScramble", "or", "ShQKI", ".", "Values", "represent", "the", "cytoplasmic", "-", "to", "-", "nuclear", "ratio", "of", "each", "transcript", ".", "Actin", "served", "as", "a", "negative", "control", ".", "(", "n", "=", "4", "biological", "replicates", ")", "RNAs", "from", "isolated", "nuclear", "and", "cytoplasmic", "fractionation", "were", "harvested", "after", "RNA", "immunoprecipitation", "(", "RIP", ")", "of", "RNA", "-", "protein", "complexes", "using", "either", "anti", "-", "QKI", "antibody", "or", "control", "IgG", ".", "And", "RIP", "-", "RT", "-", "PCR", "showing", "the", "PGC1α", "and", "UCP1", "transcripts", "majorly", "interacted", "with", "endogenous", "QKI", "in", "the", "nucleus", ".", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", "Control", "(", "ShScramble", ")", "and", "QKI", "knockdown", "(", "ShQKI", ")", "adipocyte", "lysates", "were", "subjected", "to", "polysome", "profiling", ",", "and", "a", "representative", "polysome", "profile", "is", "shown", ".", "Total", "RNA", "was", "extracted", "from", "each", "fraction", ",", "and", "the", "distribution", "of", "UCP1", "and", "PGC1α", "mRNA", "was", "measured", "via", "real", "-", "time", "PCR", "(", "K", "and", "L", ")", ".", "The", "results", "are", "shown", "as", "the", "percentage", "of", "total", "mRNA", "(", "%", "mRNA", ")", "in", "polysome", "fractions", "and", "represent", "3", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6The mRNA stability in adipocytes was measured by incubating cells with actinomycin D (5 μg/ml). Actinomycin D was added to stop transcription, and RNAs were harvested at the indicated times (x-axis) after transcription inhibition. Real-time PCR was used to determine remaining UCP1, PGC1α and Actin mRNA levels compared with the starting time. Increasing PGC1α mRNA half-life by depletion of QKI (ShScramble T1/2 = 4.73 h, ShQKI T1/2 = 8.04 h). (n=4 biological replicates)The nuclear and cytoplasmic fractionation was valid by immunoblotting using cytoplasmic and nuclear protein markers (GAPDH and Lamin B1) to show the purity of fractions.Real-time PCR analysis of mRNA transcript levels of the QKI targets UCP1 and PGC1α in the nuclear and cytoplasmic fractions of differentiated MEF cells transfected with ShScramble or ShQKI. Values represent the cytoplasmic-to-nuclear ratio of each transcript. Actin served as a negative control. (n=4 biological replicates)RNAs from isolated nuclear and cytoplasmic fractionation were harvested after RNA immunoprecipitation (RIP) of RNA-protein complexes using either anti-QKI antibody or control IgG. And RIP-RT-PCR showing the PGC1α and UCP1 transcripts majorly interacted with endogenous QKI in the nucleus. (n=3 biological replicates)Control (ShScramble) and QKI knockdown (ShQKI) adipocyte lysates were subjected to polysome profiling, and a representative polysome profile is shown. Total RNA was extracted from each fraction, and the distribution of UCP1 and PGC1α mRNA was measured via real-time PCR (K and L). The results are shown as the percentage of total mRNA (% mRNA) in polysome fractions and represent 3 independent experiments."}
{"words": ["Figure", "7The", "rectal", "temperature", "of", "WT", "fl", "/", "fl", "and", "QKI", "KO", "fl", "/", "fl", ":", "AP2", "-", "Cre", "mice", "was", "monitored", "upon", "acute", "cold", "exposure", "(", "4", "°", "C", ")", ".", "(", "n", "=", "10", "mice", ",", "per", "group", ")", "H", "&", "E", "staining", "and", "UCP1", "immunostaining", "of", "sections", "of", "ingWAT", "from", "WT", "fl", "/", "fl", "and", "QKI", "KO", "fl", "/", "fl", ":", "AP2", "-", "Cre", "mice", "at", "RT", "(", "22", "°", "C", ")", "or", "following", "72", "h", "of", "cold", "exposure", "(", "4", "°", "C", ")", ".", "(", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ")", ".", "The", "protein", "levels", "of", "UCP1", "in", "ingWAT", "from", "WT", "fl", "/", "fl", "and", "QKI", "KO", "fl", "/", "fl", ":", "AP2", "-", "Cre", "mice", "at", "RT", "or", "following", "72", "h", "of", "cold", "exposure", "(", "4", "°", "C", ")", ",", "and", "quantified", "protein", "levels", "are", "shown", "in", "(", "D", ")", ".", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ",", "per", "group", ")", "Red", "Nile", "staining", "in", "BAT", "injected", "with", "Control", "or", "QKI", "knockdown", "AAV", "at", "RT", "(", "22", "°", "C", ")", "or", "following", "6", "h", "and", "72", "h", "of", "cold", "exposure", "(", "4", "°", "C", ")", ".", "TG", "content", "in", "BAT", "injected", "with", "Control", "or", "QKI", "knockdown", "AAV", "at", "RT", "(", "22", "°", "C", ")", "or", "following", "6", "h", "and", "72", "h", "of", "cold", "exposure", "(", "4", "°", "C", ")", ".", "The", "UCP1", "protein", "level", "in", "BAT", "at", "RT", "or", "following", "6", "h", "and", "72", "h", "of", "cold", "exposure", "(", "4", "°", "C", ")", "and", "the", "quantified", "protein", "levels", ".", "(", "n", "=", "4", "biological", "replicates", ",", "per", "group", ")", "The", "mRNA", "levels", "of", "genes", "related", "to", "energy", "consumption", "(", "PGC1α", ",", "UCP1", "and", "Dio2", ")", ".", "(", "n", "=", "4", "biological", "replicates", ",", "per", "group", ")"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7The rectal temperature of WT fl/fl and QKI KO fl/fl:AP2-Cre mice was monitored upon acute cold exposure (4 °C). (n = 10 mice, per group)H&E staining and UCP1 immunostaining of sections of ingWAT from WT fl/fl and QKI KO fl/fl:AP2-Cre mice at RT (22 °C) or following 72 h of cold exposure (4 °C). (Scale bar: 50 μm).The protein levels of UCP1 in ingWAT from WT fl/fl and QKI KO fl/fl:AP2-Cre mice at RT or following 72 h of cold exposure (4 °C), and quantified protein levels are shown in (D). (n=3 biological replicates, per group)Red Nile staining in BAT injected with Control or QKI knockdown AAV at RT (22 °C) or following 6 h and 72 h of cold exposure (4 °C).TG content in BAT injected with Control or QKI knockdown AAV at RT (22 °C) or following 6 h and 72 h of cold exposure (4 °C).The UCP1 protein level in BAT at RT or following 6 h and 72 h of cold exposure (4 °C) and the quantified protein levels. (n = 4 biological replicates, per group)The mRNA levels of genes related to energy consumption (PGC1α, UCP1 and Dio2). (n=4 biological replicates, per group)"}
{"words": ["Figure", "8The", "protein", "levels", "of", "QKI", "in", "BAT", "and", "ingWAT", "during", "cold", "stimulation", "(", "4", "°", "C", ")", "and", "the", "quantified", "protein", "levels", ".", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", "The", "relative", "luminescence", "of", "a", "QKI", "promoter", "reporter", "under", "cAMP", "(", "Forskolin", "and", "IBMX", ")", "stimulus", ".", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", "The", "effect", "of", "transcriptional", "factors", "on", "the", "QKI", "promoter", ",", "assessed", "by", "luciferase", "activity", "assays", ".", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", "The", "relative", "mRNA", "levels", "of", "genes", "(", "UCP1", ",", "PGC1α", ",", "Dio2", ")", "in", "differentiated", "MEFs", "transfected", "with", "ShScramble", "or", "ShQKI", "lentivirus", ",", "following", "cAMP", "(", "Forskolin", "and", "IBMX", ")", "stimulation", ".", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8The protein levels of QKI in BAT and ingWAT during cold stimulation (4 °C) and the quantified protein levels. (n=3 biological replicates)The relative luminescence of a QKI promoter reporter under cAMP (Forskolin and IBMX) stimulus. (n=3 biological replicates)The effect of transcriptional factors on the QKI promoter, assessed by luciferase activity assays. (n=3 biological replicates)The relative mRNA levels of genes (UCP1, PGC1α, Dio2) in differentiated MEFs transfected with ShScramble or ShQKI lentivirus, following cAMP (Forskolin and IBMX) stimulation. (n=3 biological replicates)"}
{"words": ["Figure", "1", ",", "body", "weight", "trajectories", "of", "the", "mice", ".", "L", ",", "M", ",", "N", ",", "O", "The", "blood", "glucose", "level", "of", "mice", "after", "intraperitoneal", "injection", "of", "glucose", "or", "insulin", "for", "glucose", "(", "GTT", ")", "(", "L", ")", "and", "insulin", "tolerance", "tests", "(", "ITT", ")", "(", "N", ")", ",", "and", "AUC", ",", "area", "under", "the", "curve", "(", "M", ",", "O", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1, body weight trajectories of the mice.L, M, N, O The blood glucose level of mice after intraperitoneal injection of glucose or insulin for glucose (GTT) (L) and insulin tolerance tests (ITT) (N), and AUC, area under the curve (M, O)."}
{"words": ["Figure", "2A", "ORO", "staining", "of", "SVF", "cells", "isolated", "from", "iWAT", "of", "male", "mice", ".", "Differentiation", "was", "induced", "with", "curcumin", "up", "to", "day", "8", ".", "C", "ORO", "staining", "of", "3T3", "-", "L1", "cells", ".", "Differentiation", "was", "induced", "with", "curcumin", "up", "to", "day", "8", ".", "B", "mRNA", "expression", "of", "adipogenesis", "-", "related", "factors", "of", "SVF", "cells", "isolated", "from", "iWAT", "of", "male", "mice", ".", "D", "mRNA", "expression", "of", "PPARγ", ",", "C", "/", "EBPα", "and", "FABP4", "expression", "of", "3T3", "-", "L1", "cells", "treated", "with", "curcumin", ".", "protein", "expression", "levels", "of", "m6A", "regulator", "in", "iWAT", "from", "mice", "in", "HFD", "and", "HFD", "+", "CUR", "groups", ".", "protein", "expression", "levels", "of", "m6A", "regulator", "in", "3T3", "-", "L1", "cells", "were", "analyzedK", "Oil", "Red", "O", "staining", "of", "Vector", "or", "OE", "-", "ALKBH5", "transfected", "3T3", "-", "L1", "cells", ".", "Differentiation", "was", "induced", "with", "curcumin", "up", "to", "day", "8", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A ORO staining of SVF cells isolated from iWAT of male mice. Differentiation was induced with curcumin up to day 8. C ORO staining of 3T3-L1 cells. Differentiation was induced with curcumin up to day 8.B mRNA expression of adipogenesis-related factors of SVF cells isolated from iWAT of male mice. D mRNA expression of PPARγ, C/EBPα and FABP4 expression of 3T3-L1 cells treated with curcumin.protein expression levels of m6A regulator in iWAT from mice in HFD and HFD+CUR groups. protein expression levels of m6A regulator in 3T3-L1 cells were analyzedK Oil Red O staining of Vector or OE-ALKBH5 transfected 3T3-L1 cells. Differentiation was induced with curcumin up to day 8."}
{"words": ["Figure", "3E", "Oil", "Red", "O", "staining", "of", "control", ",", "ALKBH5", "-", "depleted", "and", "ALKBH5", "+", "TRAF4", "depleted", "cells", "after", "induced", "for", "8", "days", ".", "G", "Western", "blot", "analysis", "of", "PPARγ", "and", "C", "/", "EBPα", "protein", "levels", "in", "cells", ",", "and", "quantification", "of", "protein", "levels", "normalized", "to", "β", "-", "actin", "expression", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3E Oil Red O staining of control, ALKBH5-depleted and ALKBH5+TRAF4 depleted cells after induced for 8 days.G Western blot analysis of PPARγ and C/EBPα protein levels in cells , and quantification of protein levels normalized to β-actin expression."}
{"words": ["Figure", "4Western", "blot", "analysis", "of", "YTHDF1", ",", "ALKBH5", "and", "TRAF4", "in", "control", ",", "ALKBH5", "-", "depleted", "and", "ALKBH5", "+", "YTHDF1", "depleted", "cells", "and", "quantification", "of", "protein", "levels", "normalized", "to", "β", "-", "actin", "expression", ".", "L", "Oil", "Red", "O", "staining", "of", "control", ",", "ALKBH5", "-", "depleted", "and", "ALKBH5", "+", "YTHDF1", "depleted", "cells", "on", "day", "8", "of", "differentiation", ".", "M", "qPCR", "analysis", "of", "PPARγ", ",", "C", "/", "EBPα", "and", "FABP4", "expression", "in", "cell", "β", "-", "Actin", "was", "used", "as", "an", "internal", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Western blot analysis of YTHDF1, ALKBH5 and TRAF4 in control, ALKBH5-depleted and ALKBH5 + YTHDF1 depleted cells and quantification of protein levels normalized to β-actin expression.L Oil Red O staining of control, ALKBH5-depleted and ALKBH5+YTHDF1 depleted cells on day 8 of differentiation.M qPCR analysis of PPARγ, C/EBPα and FABP4 expression in cell β-Actin was used as an internal control."}
{"words": ["Figure", "5C", ",", "D", "Western", "blot", "analysis", "of", "PPARγ", "protein", "levels", "in", "control", "and", "TRAF4", "overexpressing", "cells", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "MG132", "or", "3MA", "and", "quantification", "of", "protein", "levels", "normalized", "to", "β", "-", "actin", "expression", ".", "E", "Ubiquitination", "of", "endogenous", "PPARγ", "in", "control", "and", "TRAF4", "overexpressing", "cells", "were", "differentiated", "by", "treatment", "with", "DMI", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "MG132", "for", "6", "h", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5C, D Western blot analysis of PPARγ protein levels in control and TRAF4 overexpressing cells in the absence or presence of MG132 or 3MA and quantification of protein levels normalized to β-actin expression.E Ubiquitination of endogenous PPARγ in control and TRAF4 overexpressing cells were differentiated by treatment with DMI. Cells were treated with MG132 for 6 h."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Daily", "10", "μg", "4", "-", "AP", "enhanced", "recovery", "of", "sciatic", "nerve", "motor", "function", "as", "compared", "with", "treatment", "with", "vehicle", "at", "3", "days", "post", "injury", "(", "dpi", ")", "through", "8", "dpi", ".", "(", "*", ":", "Day3", "(", "D3", ")", ",", "p", "=", "0", ".", "0131", ";", "D5", ",", "p", "=", "0", ".", "0475", ";", "D8", ",", "p", "=", "0", ".", "0472", ";", "n", "=", "6", ";", "ANOVA", "with", "post", "-", "hoc", "comparisons", "using", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ")", "(", "B", ")", "Daily", "10", "μg", "4", "-", "AP", "administration", "also", "enhanced", "recovery", "of", "nerve", "conduction", "velocity", "(", "NCV", ")", "as", "observed", "beginning", "at", "21", "days", "post", "-", "injury", ",", "eventually", "restoring", "NCV", "to", "near", "-", "normal", "values", "while", "NCV", "in", "vehicle", "-", "treated", "mice", "remained", "less", "than", "half", "that", "of", "uninjured", "animals", "(", "*", ":", "D21", ",", "p", "=", "0", ".", "0454", ";", "D28", ",", "p", "=", "0", ".", "0487", ";", "D35", ",", "p", "=", "0", ".", "0475", ";", "n", "=", "5", ";", "ANOVA", "with", "post", "-", "hoc", "comparisons", "using", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "Analysis", "of", "withdrawal", "latency", "in", "response", "to", "thermal", "(", "C", ")", "or", "mechanical", "(", "D", ")", "stimuli", "revealed", "that", "4", "-", "AP", "treatment", "did", "not", "worsen", "these", "diagnostics", "of", "neuropathic", "pain", "syndromes", ".", "In", "the", "case", "of", "response", "to", "thermal", "hyperalgesis", ",", "4", "-", "AP", "treated", "mice", "showed", "a", "significantly", "more", "rapid", "return", "to", "baseline", "levels", ".", "(", "*", ":", "(", "C", ")", "D3", ",", "D5", ",", "D8", ":", "p", "<", "0", ".", "001", "saline", "vs", ".", "baseline", ";", "D3", "p", "=", "0", ".", "006", ";", "4", "-", "AP", "vs", ".", "baseline", ";", "(", "D", ")", "D3", ",", "p", "=", "0", ".", "014", ";", "D5", ",", "p", "=", "0", ".", "008", ";", "saline", "versus", "baseline", ";", "D3", ",", "p", "=", "0", ".", "006", "4", "-", "AP", "vs", ".", "baseline", ";", "D8", ":", "p", "=", "0", ".", "0472", ";", "n", "=", "10", ";", "ANOVA", "with", "post", "-", "hoc", "comparisons", "using", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ".", ")", "In", "this", "and", "all", "other", "figures", "data", "is", "mean", "+", "SEM", "and", "shows", "a", "representative", "experiment", "from", "2", "-", "3", "repetitions", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Daily 10 μg 4-AP enhanced recovery of sciatic nerve motor function as compared with treatment with vehicle at 3 days post injury (dpi) through 8 dpi. (*: Day3 (D3), p= 0.0131; D5, p = 0.0475; D8, p =0.0472; n=6; ANOVA with post-hoc comparisons using two-tailed unpaired t-test)(B) Daily 10 μg 4-AP administration also enhanced recovery of nerve conduction velocity (NCV) as observed beginning at 21 days post-injury, eventually restoring NCV to near-normal values while NCV in vehicle-treated mice remained less than half that of uninjured animals (*: D21, p= 0.0454; D28, p = 0.0487; D35, p =0.0475; n=5; ANOVA with post-hoc comparisons using two-tailed unpaired t-test).(C, D) Analysis of withdrawal latency in response to thermal (C) or mechanical (D) stimuli revealed that 4-AP treatment did not worsen these diagnostics of neuropathic pain syndromes. In the case of response to thermal hyperalgesis, 4-AP treated mice showed a significantly more rapid return to baseline levels. (*: (C) D3, D5, D8 : p<0.001 saline vs. baseline; D3 p= 0.006; 4-AP vs. baseline; (D) D3, p= 0.014; D5, p = 0.008; saline versus baseline; D3, p = 0.006 4-AP vs. baseline; D8: p =0.0472; n=10 ; ANOVA with post-hoc comparisons using two-tailed unpaired t-test.) In this and all other figures data is mean + SEM and shows a representative experiment from 2-3 repetitions."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Local", "4", "-", "AP", "treated", "crushed", "sciatic", "nerve", "(", "black", ":", "vehicle", "PLGA", "films", ";", "red", ":", "(", "4", "-", "AP", ")", "-", "PLGA", "films", ")", "regained", "partial", "walking", "ability", "as", "early", "as", "3", "days", "post", "-", "injury", "compared", "to", "vehicle", "treated", "group", ".", "(", "*", ":", "D5", ",", "p", "=", "0", ".", "0004", ";", "D8", ",", "p", "=", "0", ".", "0012", ";", "D11", ",", "p", "=", "0", ".", "003", ";", "D14", ",", "p", "=", "0", ".", "0089", ";", "n", "=", "6", ";", "ANOVA", ",", "with", "post", "-", "hoc", "comparisons", "using", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "B", ")", "Local", "4", "-", "AP", "treated", "crushed", "sciatic", "nerve", "(", "black", ":", "vehicle", "PLGA", "films", ";", "red", ":", "(", "4", "-", "AP", ")", "-", "PLGA", "films", ")", "showed", "faster", "improvement", "in", "NCV", "restoration", "compared", "with", "vehicle", "-", "treated", "mice", ",", "beginning", "at", "21", "days", "post", "-", "injury", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Local 4-AP treated crushed sciatic nerve (black: vehicle PLGA films; red: (4-AP)-PLGA films) regained partial walking ability as early as 3 days post-injury compared to vehicle treated group. (*: D5, p= 0.0004; D8, p = 0.0012; D11, p =0.003; D14, p=0.0089; n=6; ANOVA, with post-hoc comparisons using two-tailed unpaired t-test).(B) Local 4-AP treated crushed sciatic nerve (black: vehicle PLGA films; red: (4-AP)-PLGA films) showed faster improvement in NCV restoration compared with vehicle-treated mice, beginning at 21 days post-injury."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Electron", "microscopy", "images", "of", "healthy", ",", "crushed", ",", "and", "4", "-", "AP", "treated", "crushed", "sciatic", "nerve", "at", "21", "days", "post", "-", "injury", ".", "Scale", "bar", "at", "3000x", "=", "5m", ";", "scale", "bar", "at", "8000x", "=", "2m", ")", "(", "B", ")", "Comparison", "of", "the", "axonal", "area", "of", "randomly", "chosen", "individual", "axons", "of", "vehicle", "treated", "and", "4", "-", "AP", "treated", "mice", "(", "n", "=", "4", "for", "each", "experimental", "group", ";", "40", "axons", "analyzed", "per", "mouse", ")", ".", "4", "-", "AP", "treated", "sciatic", "nerve", "showed", "statistically", "greater", "axonal", "area", "compared", "to", "the", "vehicle", "-", "treated", "group", "(", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "ANOVA", ";", "restricted", "-", "maximum", "-", "likelihood", ")", ".", "Moreover", ",", "4", "-", "AP", "treated", "mice", "had", "a", "greater", "proportion", "of", "axons", "with", "areas", "greater", "than", "the", "mean", "value", "for", "uninjured", "mice", "(", "shown", "in", "the", "green", "line", ")", ",", "with", "inset", "figure", "displaying", "all", "axons", "with", "values", "above", "this", "mean", ".", "This", "experiment", "represents", "a", "single", "group", "of", "mice", "of", "one", "of", "three", "replicates", "on", "NCV", "recovery", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Electron microscopy images of healthy, crushed, and 4-AP treated crushed sciatic nerve at 21 days post-injury. Scale bar at 3000x = 5m; scale bar at 8000x = 2m) (B) Comparison of the axonal area of randomly chosen individual axons of vehicle treated and 4-AP treated mice (n=4 for each experimental group; 40 axons analyzed per mouse). 4-AP treated sciatic nerve showed statistically greater axonal area compared to the vehicle-treated group (p<0.05; ANOVA; restricted-maximum-likelihood). Moreover, 4-AP treated mice had a greater proportion of axons with areas greater than the mean value for uninjured mice (shown in the green line), with inset figure displaying all axons with values above this mean. This experiment represents a single group of mice of one of three replicates on NCV recovery."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ",", "B", ")", "Sustained", "local", "4", "-", "AP", "administration", "was", "associated", "with", "increased", "myelin", "area", "and", "close", "-", "to", "-", "normal", "Garea", "-", "ratio", "compared", "to", "untreated", "group", ",", "as", "determined", "by", "analysis", "of", "40", "randomly", "chosen", "myelinated", "axons", "from", "sections", "of", "4", "nerves", "for", "each", "group", ".", "(", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "ANOVA", ",", "with", "post", "-", "hoc", "comparisons", "using", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ")", ".", "4", "-", "AP", "treated", "mice", "had", "a", "greater", "proportion", "of", "axons", "for", "which", "the", "associated", "myelin", "area", "was", "greater", "than", "the", "mean", "value", "for", "uninjured", "mice", "(", "shown", "in", "the", "green", "line", ")", ",", "with", "inset", "figure", "displaying", "all", "axons", "with", "values", "above", "this", "mean", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "4", "-", "AP", "treated", "nerves", "also", "showed", "increases", "in", "the", "levels", "of", "P0", "protein", "as", "detected", "by", "western", "blot", "analysis", "(", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "ANOVA", ",", "with", "post", "-", "hoc", "comparisons", "using", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "4", "-", "AP", "treated", "nerves", "also", "showed", "increases", "in", "the", "levels", "of", "P0", "protein", "as", "detected", "by", "western", "blot", "analysis", "(", "*", "*", ":", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "ANOVA", ",", "with", "post", "-", "hoc", "comparisons", "using", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "E", ")", "Increases", "in", "P0", "protein", "over", "time", "also", "were", "observed", "by", "immunofluorescence", "analysis", "at", "different", "time", "points", ",", "with", "P0", "protein", "expression", "increasing", "to", "a", "greater", "extent", "in", "nerves", "of", "mice", "treated", "with", "4", "-", "AP", ".", "Scale", "bar", "=", "200", "m", ".", "(", "F", ",", "G", ")", "4", "-", "AP", "treatment", "increased", "the", "number", "of", "myelinated", "axons", "(", "*", "*", ":", "p", "=", "0", ".", "002", ",", "n", "=", "4", ";", "ANOVA", ",", "with", "post", "-", "hoc", "comparisons", "using", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ")", ".", "Even", "though", "the", "4", "-", "AP", "treated", "group", "also", "exhibited", "a", "greater", "number", "of", "total", "axons", ",", "this", "difference", "was", "not", "statistically", "significant", ".", "All", "myelinated", "and", "total", "axons", "were", "counted", "in", "5", "randomly", "chosen", "grids", "from", "each", "of", "4", "nerves", "for", "each", "group", ".", "This", "experiment", "represents", "a", "single", "group", "of", "mice", "of", "one", "of", "three", "replicates", "on", "NCV", "recovery", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A, B) Sustained local 4-AP administration was associated with increased myelin area and close-to-normal Garea-ratio compared to untreated group, as determined by analysis of 40 randomly chosen myelinated axons from sections of 4 nerves for each group. (**: p<0.0001; ANOVA, with post-hoc comparisons using two-tailed unpaired t-test). 4-AP treated mice had a greater proportion of axons for which the associated myelin area was greater than the mean value for uninjured mice (shown in the green line), with inset figure displaying all axons with values above this mean.(C, D) 4-AP treated nerves also showed increases in the levels of P0 protein as detected by western blot analysis (**:p<0.01; ANOVA, with post-hoc comparisons using two-tailed unpaired t-test).(C, D) 4-AP treated nerves also showed increases in the levels of P0 protein as detected by western blot analysis (**:p<0.01; ANOVA, with post-hoc comparisons using two-tailed unpaired t-test).(E) Increases in P0 protein over time also were observed by immunofluorescence analysis at different time points, with P0 protein expression increasing to a greater extent in nerves of mice treated with 4-AP. Scale bar = 200 m.(F, G) 4-AP treatment increased the number of myelinated axons (**: p=0.002, n=4; ANOVA, with post-hoc comparisons using two-tailed unpaired t-test). Even though the 4-AP treated group also exhibited a greater number of total axons, this difference was not statistically significant. All myelinated and total axons were counted in 5 randomly chosen grids from each of 4 nerves for each group. This experiment represents a single group of mice of one of three replicates on NCV recovery."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "At", "1", "day", "post", "-", "injury", ",", "a", "single", "dose", "of", "10", "μg", "4", "-", "AP", "significantly", "improved", "walking", "function", "as", "determined", "by", "SFI", "analysis", "(", "*", ":", "p", "=", "0", ".", "001", ",", "n", "=", "5", ")", ".", "(", "B", ")", "In", "contrast", ",", "even", "higher", "doses", "of", "4", "-", "AP", "administration", "(", "50", "μg", ",", "ip", ")", "had", "no", "effect", "on", "SFI", "in", "mice", "with", "transected", "nerves", "(", "n", "=", "10", ")", ".", "(", "C", ")", "In", "contrast", "with", "effects", "of", "4", "-", "AP", ",", "treatment", "with", "neostigmine", "did", "not", "cause", "improvements", "in", "SFI", ".", "(", "p", "=", "0", ".", "0024", "for", "4", "-", "AP", "vs", ".", "saline", ",", "n", "=", "8", ",", "1", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) At 1 day post-injury, a single dose of 10 μg 4-AP significantly improved walking function as determined by SFI analysis (*: p=0.001, n=5). (B) In contrast, even higher doses of 4-AP administration (50 μg, ip) had no effect on SFI in mice with transected nerves (n=10). (C) In contrast with effects of 4-AP, treatment with neostigmine did not cause improvements in SFI. (p = 0.0024 for 4-AP vs. saline, n=8, 1-way ANOVA with Tukey's multiple comparison test)."}
{"words": ["Figure", "1Ratiometric", "and", "mTFP1", "donor", "images", "of", "EKAR2G", "in", "an", "EGF", "‐", "stimulated", "PC", "‐", "12", "cell", "at", "the", "indicated", "time", "points", ",", "with", "t", "=", "0", "'", "corresponding", "to", "EGF", "application", ".", "Upper", "panel", ":", "FRET", "ratio", "image", "is", "color", "‐", "coded", "for", "ERK", "activity", ".", "Lower", "panel", ":", "raw", "mTFP1", "donor", "image", "in", "black", "/", "white", "contrast", ".", "Scale", "bar", "=", "20", "μm", ".", "Population", "average", "of", "ERK", "activation", "dynamics", "measured", "by", "Western", "blot", "using", "a", "phosphoERK", "antibody", ".", "Population", "average", "of", "ERK", "activation", "dynamics", "cell", "‐", "averaged", "EKAR2G", "emission", "ratios", "(", "ERs", ")", "from", "n", "=", "at", "least", "111", "cells", ".", "StDev", "are", "shown", ".", "Selected", "EKAR2G", "ratio", "time", "series", "illustrating", ",", "from", "top", "to", "bottom", ",", "sustained", ",", "oscillatory", ",", "or", "transient", "ERK", "activity", "dynamics", ".", "ER", "is", "color", "‐", "coded", "as", "in", "bar", ".", "Scale", "bar", "=", "20", "μm", ".", "Single", "‐", "cell", "ERK", "activity", "trajectories", ".", "Cell", "‐", "averaged", "ERs", "for", "n", "=", "10", "cells", ",", "standard", "deviation", "range", "(", "StDev", ")", ",", "population", "average", "for", "the", "indicated", "GFs", "and", "dosages", ".", "Experimental", "time", "courses", "were", "normalized", "to", "the", "mean", "of", "5", "time", "points", "immediately", "preceding", "GF", "application", ".", "Waterfall", "plots", "of", "single", "‐", "cell", "ERK", "activity", "trajectories", ".", "Cell", "‐", "averaged", "ER", "trajectories", "are", "color", "‐", "coded", "(", "n", "=", "78", "cells", ")", ",", "population", "average", "(", "bottom", ")", ".", "Vertical", "dotted", "line", "indicates", "GF", "application", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Ratiometric and mTFP1 donor images of EKAR2G in an EGF‐stimulated PC‐12 cell at the indicated time points, with t = 0' corresponding to EGF application. Upper panel: FRET ratio image is color‐coded for ERK activity. Lower panel: raw mTFP1 donor image in black/white contrast. Scale bar = 20 μm.Population average of ERK activation dynamics measured by Western blot using a phosphoERK antibody.Population average of ERK activation dynamics cell‐averaged EKAR2G emission ratios (ERs) from n= at least 111 cells. StDev are shown.Selected EKAR2G ratio time series illustrating, from top to bottom, sustained, oscillatory, or transient ERK activity dynamics. ER is color‐coded as in bar. Scale bar = 20 μm.Single‐cell ERK activity trajectories. Cell‐averaged ERs for n = 10 cells, standard deviation range (StDev), population average for the indicated GFs and dosages. Experimental time courses were normalized to the mean of 5 time points immediately preceding GF application.Waterfall plots of single‐cell ERK activity trajectories. Cell‐averaged ER trajectories are color‐coded (n = 78 cells), population average (bottom). Vertical dotted line indicates GF application."}
{"words": ["Figure", "2Trajectories", "from", "all", "sustained", "GF", "stimulation", "experiments", "(", "n", "=", "307", "cells", ",", "same", "ERK", "activation", "trajectories", "as", "in", "Fig", "1", ")", "were", "pooled", "and", "five", "representative", "trajectories", "were", "identified", "using", "k", "‐", "means", "clustering", "with", "squared", "Euclidean", "distance", ".", "Raw", "(", "color", "‐", "coded", "by", "cluster", ")", "and", "cluster", "representative", "trajectories", "(", "black", ")", ".", "Overlaid", "cluster", "representative", "trajectories", ".", "Population", "distribution", "of", "representative", "ERK", "activity", "trajectories", "in", "response", "to", "different", "GF", "dosages", ".", "Data", "representative", "of", "n", "=", "3", "experiments", ".", "Peak", "emission", "ratio", "intensity", "for", "each", "cluster", ".", "Boxplots", "with", "median", ",", "interquartile", "(", "box", ")", "and", "1", ".", "5", "IQR", "(", "whiskers", ")", "range", ",", "and", "raw", "datasets", "are", "shown", ".", "Boxplot", "notches", "extend", "1", ".", "58", "IQR", "/", "√", "Nobs", ",", "which", "gives", "approximately", "95", "%", "confidence", "interval", "for", "comparing", "medians", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Trajectories from all sustained GF stimulation experiments (n = 307 cells, same ERK activation trajectories as in Fig 1) were pooled and five representative trajectories were identified using k‐means clustering with squared Euclidean distance. Raw (color‐coded by cluster) and cluster representative trajectories (black).Overlaid cluster representative trajectories.Population distribution of representative ERK activity trajectories in response to different GF dosages. Data representative of n = 3 experiments.Peak emission ratio intensity for each cluster. Boxplots with median, interquartile (box) and 1.5 IQR (whiskers) range, and raw datasets are shown. Boxplot notches extend 1.58 IQR / √Nobs, which gives approximately 95% confidence interval for comparing medians."}
{"words": ["Figure", "3A", "-", "DSingle", "GF", "pulse", "experiments", ".", "Cell", "‐", "averaged", "ERs", ",", "population", "average", ",", "and", "StDev", "range", "for", "n", "=", "10", "cells", ".", "Pulse", "application", "indicated", "by", "black", "bars", ".", "3", "′", "(", "A", ",", "C", ")", "and", "10", "′", "(", "B", ",", "D", ")", "pulse", ".", "High", "(", "A", ",", "B", ")", "and", "low", "(", "C", ",", "D", ")", "GF", "concentrations", ".", "ERationale", "for", "measuring", "amplitude", "and", "duration", "of", "1st", "ERK", "activity", "peak", "in", "response", "to", "GF", "stimulation", ".", "Peak", "amplitude", "was", "measured", "as", "the", "ER", "change", "from", "when", "the", "GF", "stimulation", "starts", "until", "the", "highest", "ERK", "activity", "before", "adaptation", "occurs", ".", "Peak", "duration", "was", "estimated", "as", "the", "time", "between", "the", "first", "point", "before", "reaching", "the", "half", "‐", "maximum", "of", "the", "peak", "in", "the", "ascending", "phase", ",", "and", "the", "first", "point", "after", "the", "half", "‐", "maximum", "in", "the", "descending", "phase", ".", "FAmplitude", "of", "1st", "ERK", "activity", "peak", "in", "response", "to", "different", "sustained", "or", "pulsed", "GF", "stimulation", "experiments", ".", "Notched", "boxplots", "of", "1st", "ERK", "activity", "peak", "amplitude", "with", "median", ",", "interquartile", "range", "(", "box", ")", ",", "and", "data", "within", "1", ".", "5", "IQR", "range", "of", "the", "lower", "and", "upper", "quartiles", "(", "whiskers", ")", "are", "shown", "(", "n", "=", "20", "cells", "per", "experiment", ")", ".", "GDuration", "of", "1st", "ERK", "activity", "peak", "in", "response", "to", "sustained", "and", "pulsed", "GF", "stimulation", ".", "Boxplots", "of", "1st", "ERK", "activity", "peak", "duration", "with", "median", ",", "interquartile", "range", "(", "box", ")", ",", "and", "data", "within", "1", ".", "5", "IQR", "range", "of", "the", "lower", "and", "upper", "quartiles", "(", "whiskers", ")", "are", "shown", "(", "n", "=", "20", "cells", "per", "experiment", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A-DSingle GF pulse experiments. Cell‐averaged ERs, population average, and StDev range for n = 10 cells. Pulse application indicated by black bars. 3′ (A, C) and 10′ (B, D) pulse. High (A, B) and low (C, D) GF concentrations.ERationale for measuring amplitude and duration of 1st ERK activity peak in response to GF stimulation. Peak amplitude was measured as the ER change from when the GF stimulation starts until the highest ERK activity before adaptation occurs. Peak duration was estimated as the time between the first point before reaching the half‐maximum of the peak in the ascending phase, and the first point after the half‐maximum in the descending phase.FAmplitude of 1st ERK activity peak in response to different sustained or pulsed GF stimulation experiments. Notched boxplots of 1st ERK activity peak amplitude with median, interquartile range (box), and data within 1.5 IQR range of the lower and upper quartiles (whiskers) are shown (n = 20 cells per experiment).GDuration of 1st ERK activity peak in response to sustained and pulsed GF stimulation. Boxplots of 1st ERK activity peak duration with median, interquartile range (box), and data within 1.5 IQR range of the lower and upper quartiles (whiskers) are shown (n = 20 cells per experiment)."}
{"words": ["Figure", "4A", "-", "CDouble", "‐", "pulse", "GF", "experiments", ".", "(", "A", ")", "3", "′", "GF", "/", "3", "′", "pause", "/", "3", "′", "GF", ".", "(", "B", ")", "3", "′", "GF", "/", "10", "′", "pause", "/", "3", "′", "GF", ".", "(", "C", ")", "3", "′", "GF", "/", "20", "′", "pause", "/", "3", "′", "GF", ".", "Cell", "‐", "averaged", "ERs", ",", "population", "average", ",", "and", "StDev", "range", "for", "n", "=", "10", "cells", ".", "D", "-", "GMulti", "‐", "pulse", "GF", "experiments", ".", "Population", "average", "ERs", "(", "n", "=", "at", "least", "30", "cells", ")", "for", "different", "EGF", "/", "NGF", "dosages", ".", "(", "D", ")", "3", "′", "GF", "/", "3", "′", "pause", ".", "(", "E", ")", "3", "′", "GF", "/", "10", "′", "pause", ".", "(", "F", ")", "3", "′", "GF", "/", "20", "′", "pause", ".", "(", "G", ")", "3", "′", "GF", "/", "60", "′", "pause", ".", "HDecay", "kinetics", "of", "ERK", "activity", "maxima", "from", "(", "D", "-", "G", ")", ".", "Boxplots", "with", "median", ",", "interquartile", "(", "box", ")", ",", "and", "1", ".", "5", "IQR", "(", "whiskers", ")", "range", "are", "shown", "for", "at", "least", "n", "=", "30", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A-CDouble‐pulse GF experiments. (A) 3′ GF/3′ pause/3′ GF. (B) 3′ GF/10′ pause/3′ GF. (C) 3′ GF/20′ pause/3′ GF. Cell‐averaged ERs, population average, and StDev range for n = 10 cells.D-GMulti‐pulse GF experiments. Population average ERs (n= at least 30 cells) for different EGF/NGF dosages. (D) 3′ GF/3′pause. (E) 3′ GF/10′ pause. (F) 3′ GF/20′ pause. (G) 3′ GF/60′ pause.HDecay kinetics of ERK activity maxima from (D-G). Boxplots with median, interquartile (box), and 1.5 IQR (whiskers) range are shown for at least n = 30 cells."}
{"words": ["Figure", "7ARepresentative", "micrographs", "of", "tubulin", "‐", "stained", "PC", "‐", "12", "NS", "‐", "1", "subclone", "cells", "stimulated", "with", "sustained", "and", "multi", "‐", "pulse", "GF", "regimes", ".", "Scale", "bar", "=", "20", "μm", ".", "B", ",", "CQuantification", "of", "neuronal", "differentiation", "fate", ".", "(", "B", ")", "Total", "neurite", "outgrowth", "per", "cell", "normalized", "to", "the", "major", "axis", "length", "of", "cell", "soma", "for", "sustained", "and", "multi", "‐", "pulse", "GF", "regimes", ".", "(", "C", ")", "Differentiation", "ratio", "calculated", "as", "the", "fraction", "of", "cells", "with", "normalized", "total", "neurite", "outgrowth", "per", "cell", "larger", "than", "1", ".", "At", "least", "5", ",", "000", "cells", "quantified", "in", "at", "least", "2", "independent", "experiments", "for", "each", "condition", ".", "Boxplots", "with", "median", ",", "interquartile", "(", "Box", ")", ",", "and", "1", ".", "5", "IQR", "(", "Whiskers", ")", "are", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7ARepresentative micrographs of tubulin‐stained PC‐12 NS‐1 subclone cells stimulated with sustained and multi‐pulse GF regimes. Scale bar = 20 μm.B, CQuantification of neuronal differentiation fate. (B) Total neurite outgrowth per cell normalized to the major axis length of cell soma for sustained and multi‐pulse GF regimes. (C) Differentiation ratio calculated as the fraction of cells with normalized total neurite outgrowth per cell larger than 1. At least 5,000 cells quantified in at least 2 independent experiments for each condition. Boxplots with median, interquartile (Box), and 1.5 IQR (Whiskers) are shown."}
{"words": ["Figure", "1A", "Heatmap", "depiction", "of", "the", "3", ",", "731", "DNA", "hypomethylation", "loci", "in", "ago4", "‐", "6", ".", "Each", "hypomethylated", "region", "corresponds", "to", "a", "colored", "horizontal", "bar", ",", "and", "the", "bars", "are", "clustered", "numerically", "into", "a", "column", "(", "y", "‐", "axis", ")", ".", "Cytosines", "were", "examined", "as", "CG", ",", "CHG", ",", "and", "CHH", ".", "The", "color", "‐", "scaled", "methylation", "levels", "indicate", "the", "ratios", "of", "each", "type", "of", "methylated", "cytosines", "over", "total", "cytosines", "of", "the", "same", "type", "within", "the", "examined", "hypomethylated", "regions", ".", "B", "Heatmap", "depiction", "of", "the", "3", ",", "678", "DNA", "hypomethylation", "loci", "in", "ago6", "‐", "2", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A Heatmap depiction of the 3,731 DNA hypomethylation loci in ago4‐6. Each hypomethylated region corresponds to a colored horizontal bar, and the bars are clustered numerically into a column (y‐axis). Cytosines were examined as CG, CHG, and CHH. The color‐scaled methylation levels indicate the ratios of each type of methylated cytosines over total cytosines of the same type within the examined hypomethylated regions.B Heatmap depiction of the 3,678 DNA hypomethylation loci in ago6‐2."}
{"words": ["Figure", "2B", "Box", "plots", "showing", "methylation", "patterns", "of", "different", "groups", "of", "loci", "as", "categorized", "in", "(", "A", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B Box plots showing methylation patterns of different groups of loci as categorized in (A)."}
{"words": ["Figure", "3B", "DNA", "methylation", "levels", "in", "different", "mutants", ".", "The", "2", ",", "174", "loci", "where", "AGO4", "and", "AGO6", "are", "mutually", "dependent", "are", "numerically", "clustered", "(", "y", "‐", "axis", ")", ".", "Cytosines", "were", "examined", "as", "CG", ",", "CHG", ",", "and", "CHH", ".", "C", "DNA", "methylation", "levels", "at", "TAS1a", ",", "TAS1c", ",", "and", "TAS3a", "loci", ".", "Snapshots", "from", "whole", "‐", "genome", "bisulfite", "sequencing", "results", "are", "shown", ".", "D", "RT", "-", "qPCR", "measurements", "of", "transposon", "RNA", "levels", ".", "Double", ":", "ago4", "‐", "6", "ago6", "‐", "2", "double", "mutant", ".", "Actin", "2", "was", "used", "as", "an", "internal", "control", ".", "RNA", "levels", "in", "the", "mutants", "are", "relative", "to", "those", "in", "the", "wild", "‐", "type", "(", "Col", "‐", "0", ")", ".", "Means", "±", "SD", "are", "shown", ",", "n", "=", "3", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B DNA methylation levels in different mutants. The 2,174 loci where AGO4 and AGO6 are mutually dependent are numerically clustered (y‐axis). Cytosines were examined as CG, CHG, and CHH.C DNA methylation levels at TAS1a, TAS1c, and TAS3a loci. Snapshots from whole‐genome bisulfite sequencing results are shown.D RT-qPCR measurements of transposon RNA levels. Double: ago4‐6 ago6‐2 double mutant. Actin 2 was used as an internal control. RNA levels in the mutants are relative to those in the wild‐type (Col‐0). Means ± SD are shown, n = 3."}
{"words": ["Figure", "4A", "AGO4", "and", "AGO6", "were", "visualized", "by", "immunofluorescence", "microscopy", "using", "their", "specific", "antibodies", ".", "Yellow", "signals", "would", "be", "expected", "in", "the", "merged", "images", "if", "the", "two", "proteins", "co", "‐", "localize", ",", "as", "a", "result", "of", "the", "overlap", "of", "red", "and", "green", "channels", ".", "DNA", "(", "blue", ")", "was", "stained", "with", "DAPI", ".", "B", "The", "largest", "subunit", "of", "Pol", "IV", ",", "NRPD1", "(", "red", ")", ",", "was", "visualized", "by", "its", "specific", "antibody", "in", "cells", "expressing", "FLAG", "‐", "tagged", "AGO4", "or", "AGO6", "(", "green", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A AGO4 and AGO6 were visualized by immunofluorescence microscopy using their specific antibodies. Yellow signals would be expected in the merged images if the two proteins co‐localize, as a result of the overlap of red and green channels. DNA (blue) was stained with DAPI.B The largest subunit of Pol IV, NRPD1 (red), was visualized by its specific antibody in cells expressing FLAG‐tagged AGO4 or AGO6 (green)."}
{"words": ["Figure", "5A", "The", "largest", "subunit", "of", "Pol", "V", ",", "NRPE1", "(", "red", ")", ",", "was", "visualized", "by", "immunofluorescence", "microscopy", "using", "its", "specific", "antibody", "in", "cells", "expressing", "FLAG", "‐", "tagged", "AGO4", "(", "green", ")", ".", "AGO4", "‐", "NRPE1", "co", "‐", "localized", "to", "nucleolar", "dot", "(", "yellow", "dot", ",", "marked", "with", "white", "arrow", ",", "upper", "panel", ")", "but", "not", "in", "nucleoplasmic", "foci", "(", "lower", "panel", ")", ".", "B", "NRPE1", "(", "red", ")", "was", "visualized", "by", "its", "specific", "antibody", "in", "cells", "expressing", "FLAG", "‐", "tagged", "AGO6", "(", "green", ")", ".", "The", "yellow", "signals", "due", "to", "the", "overlap", "of", "red", "and", "green", "channels", "in", "merged", "images", "indicate", "protein", "co", "‐", "localization", ".", "DNA", "(", "blue", ")", "was", "stained", "with", "DAPI", ".", "AGO6", "‐", "NRPE1", "co", "‐", "localized", "to", "nucleoplasmic", "foci", "(", "yellow", "dots", ",", "marked", "with", "white", "arrow", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A The largest subunit of Pol V, NRPE1 (red), was visualized by immunofluorescence microscopy using its specific antibody in cells expressing FLAG‐tagged AGO4 (green). AGO4‐NRPE1 co‐localized to nucleolar dot (yellow dot, marked with white arrow, upper panel) but not in nucleoplasmic foci (lower panel).B NRPE1 (red) was visualized by its specific antibody in cells expressing FLAG‐tagged AGO6 (green). The yellow signals due to the overlap of red and green channels in merged images indicate protein co‐localization. DNA (blue) was stained with DAPI. AGO6‐NRPE1 co‐localized to nucleoplasmic foci (yellow dots, marked with white arrow)."}
{"words": ["Figure", "6A", "AGO6", "dysfunction", "reduces", "levels", "of", "Pol", "V", "‐", "dependent", "transcripts", ".", "RNA", "levels", "were", "measured", "by", "RT", "-", "qPCR", ".", "Means", "±", "SD", "are", "shown", ",", "n", "=", "3", ".", "B", "AGO6", "dysfunction", "decreases", "Pol", "V", "occupancy", "at", "chromatin", "of", "loci", "where", "Pol", "V", "transcript", "levels", "are", "affected", "by", "AGO6", ".", "Anti", "‐", "NRPE1", "antibody", "was", "used", "for", "ChIP", "assays", ".", "Means", "±", "SD", "are", "shown", ",", "n", "=", "3", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A AGO6 dysfunction reduces levels of Pol V‐dependent transcripts. RNA levels were measured by RT-qPCR. Means ± SD are shown, n = 3.B AGO6 dysfunction decreases Pol V occupancy at chromatin of loci where Pol V transcript levels are affected by AGO6. Anti‐NRPE1 antibody was used for ChIP assays. Means ± SD are shown, n = 3."}
{"words": ["Figure", "7A", "Heatmap", "depiction", "of", "the", "dependence", "of", "AGO4", "‐", "and", "AGO6", "‐", "bound", "siRNAs", "on", "Pol", "IV", ".", "Identities", "of", "siRNAs", "were", "retrieved", "from", "Havecker", "et", "al", "(", ")", ",", "and", "siRNAs", "were", "grouped", "into", "1", ",", "210", "AGO4", "‐", "bound", "clusters", "and", "1", ",", "486", "AGO6", "‐", "bound", "clusters", "(", "see", "Materials", "and", "Methods", "for", "details", ")", ",", "each", "of", "which", "corresponds", "to", "a", "colored", "horizontal", "bar", ";", "the", "bars", "are", "stacked", "numerically", "into", "a", "column", "(", "y", "‐", "axis", ")", ".", "Information", "on", "siRNA", "levels", "in", "Pol", "IV", "mutant", "and", "wild", "‐", "type", "plants", "was", "retrieved", "from", "Zhang", "et", "al", "(", ")", ".", "B", "Heatmap", "depiction", "of", "the", "dependence", "of", "AGO4", "‐", "and", "AGO6", "‐", "bound", "siRNAs", "on", "Pol", "V", ".", "C", "Quantification", "of", "individual", "24", "‐", "nt", "siRNAs", "by", "TaqMan", "small", "RNA", "assays", ".", "Double", ":", "ago4", "‐", "6", "ago6", "‐", "2", "double", "mutant", ".", "snoR101", "was", "used", "as", "an", "internal", "control", ".", "RNA", "levels", "in", "the", "mutants", "were", "relative", "to", "those", "of", "the", "wild", "‐", "type", "(", "Col", "‐", "0", ")", ".", "Error", "bars", "indicate", "SD", ",", "n", "≥", "3", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A Heatmap depiction of the dependence of AGO4‐ and AGO6‐bound siRNAs on Pol IV. Identities of siRNAs were retrieved from Havecker et al (), and siRNAs were grouped into 1,210 AGO4‐bound clusters and 1,486 AGO6‐bound clusters (see Materials and Methods for details), each of which corresponds to a colored horizontal bar; the bars are stacked numerically into a column (y‐axis). Information on siRNA levels in Pol IV mutant and wild‐type plants was retrieved from Zhang et al ().B Heatmap depiction of the dependence of AGO4‐ and AGO6‐bound siRNAs on Pol V.C Quantification of individual 24‐nt siRNAs by TaqMan small RNA assays. Double: ago4‐6 ago6‐2 double mutant. snoR101 was used as an internal control. RNA levels in the mutants were relative to those of the wild‐type (Col‐0). Error bars indicate SD, n ≥ 3."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ",", "C", ")", "HEK293T", "cells", "were", "co", "‐", "transfected", "with", "the", "indicated", "constructs", ".", "Cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "IP", "using", "anti", "‐", "FLAG", "antibodies", ".", "The", "resulting", "precipitates", "were", "examined", "by", "immunoblot", "analysis", "with", "anti", "‐", "FLAG", "and", "anti", "‐", "HA", "antibodies", ".", "(", "D", ")", "HEK293T", "cells", "were", "cultured", "in", "regular", "or", "starvation", "medium", "for", "2", "h", ".", "Cells", "were", "harvested", "and", "treated", "with", "DSP", ".", "(", "E", ")", "HEK293T", "cells", "were", "harvested", "and", "treated", "with", "DSP", ".", "(", "F", ")", "HEK293T", "cells", "were", "cultured", "in", "regular", "DMEM", "or", "starvation", "medium", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "200", "nM", "wortmannin", "for", "2", "h", ".", "After", "treatment", "with", "DSP", ",", "cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "IP", "analysis", ".", "(", "G", ")", "Atg14F", "/", "F", "(", "undeleted", ")", "or", "Atg14Δ", "/", "Δ", "(", "deleted", ")", "MEFs", "were", "harvested", "and", "treated", "with", "DSP", ".", "*", "(", "E", ")", "and", "*", "*", "(", "G", ")", "indicate", "the", "positions", "of", "the", "immunoglobulin", "light", "and", "heavy", "chains", ",", "respectively", ".", "aa", ",", "amino", "acid", ";", "DSP", ",", "dithiobis", "(", "succinimidyl", "propionate", ")", ";", "IP", ",", "immunoprecipitation", ";", "MEFs", ",", "mouse", "embryonic", "fibroblasts", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B,C) HEK293T cells were co‐transfected with the indicated constructs. Cell lysates were subjected to IP using anti‐FLAG antibodies. The resulting precipitates were examined by immunoblot analysis with anti‐FLAG and anti‐HA antibodies.(D) HEK293T cells were cultured in regular or starvation medium for 2 h. Cells were harvested and treated with DSP.(E) HEK293T cells were harvested and treated with DSP.(F) HEK293T cells were cultured in regular DMEM or starvation medium in the presence or absence of 200 nM wortmannin for 2 h. After treatment with DSP, cell lysates were subjected to IP analysis.(G) Atg14F/F (undeleted) or Atg14Δ/Δ (deleted) MEFs were harvested and treated with DSP. * (E) and ** (G) indicate the positions of the immunoglobulin light and heavy chains, respectively. aa, amino acid; DSP, dithiobis(succinimidyl propionate); IP, immunoprecipitation; MEFs, mouse embryonic fibroblasts."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "Atg", "proteins", "in", "the", "indicated", "MEFs", ".", "(", "B", ")", "m5", "‐", "7", "cells", "were", "cultured", "in", "regular", "medium", "containing", "10", "ng", "/", "ml", "Dox", "for", "8", "days", ",", "and", "then", "cultured", "in", "the", "absence", "of", "Dox", "for", "a", "further", "2", "days", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "m5", "‐", "7", "cells", "were", "cultured", "in", "regular", "medium", "with", "or", "without", "10", "ng", "/", "ml", "Dox", "for", "4", "days", ",", "and", "then", "cultured", "in", "the", "presence", "of", "50", "μg", "/", "ml", "CHX", "for", "the", "indicated", "time", "periods", "(", "C", ")", ".", "mRNA", "levels", "of", "the", "indicated", "genes", "were", "measured", "by", "quantitative", "PCR", "following", "the", "4", "‐", "day", "Dox", "treatment", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "(", "*", "P0", ".", "05", ")", "(", "D", ")", ".", "CHX", ",", "cycloheximide", ";", "Dox", ",", "doxycycline", ";", "MEFs", ",", "mouse", "embryonic", "fibroblasts", ";", "mRNA", ",", "messenger", "RNA", ";", "WT", ",", "wild", "‐", "type", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Immunoblot analysis of Atg proteins in the indicated MEFs.(B) m5‐7 cells were cultured in regular medium containing 10 ng/ml Dox for 8 days, and then cultured in the absence of Dox for a further 2 days.(C, D) m5‐7 cells were cultured in regular medium with or without 10 ng/ml Dox for 4 days, and then cultured in the presence of 50 μg/ml CHX for the indicated time periods (C). mRNA levels of the indicated genes were measured by quantitative PCR following the 4‐day Dox treatment. Data represent mean±s.e. (*P0.05) (D). CHX, cycloheximide; Dox, doxycycline; MEFs, mouse embryonic fibroblasts; mRNA, messenger RNA; WT, wild‐type."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", ",", "C", ")", "HEK293T", "cells", "were", "co", "‐", "transfected", "with", "the", "indicated", "constructs", ".", "Cell", "lysates", "were", "analysed", "by", "IP", ".", "IP", ",", "immunoprecipitation", ";", "ND", ",", "not", "determined", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(B, C) HEK293T cells were co‐transfected with the indicated constructs. Cell lysates were analysed by IP. IP, immunoprecipitation; ND, not determined."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "WT", "MEFs", ",", "Atg16L1", "KO", "MEFs", "or", "Atg16L1", "KO", "MEFs", "stably", "expressing", "either", "full", "‐", "length", "Atg16L1", "(", "1", "-", "588", ")", ",", "Atg16L1", "(", "1", "-", "230", ")", "or", "Atg16L1Δ", "(", "230", "-", "300", ")", "were", "cultured", "in", "regular", "DMEM", "or", "starvation", "medium", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "100", "nM", "BafA1", "for", "2", "h", ".", "*", "indicates", "nonspecific", "immunoreactive", "bands", ".", "(", "B", ",", "C", ")", "Atg16L1", "KO", "MEFs", "stably", "expressing", "GFP", "-", "ULK1", "and", "either", "full", "‐", "length", "Atg16L1", "(", "1", "-", "588", ")", ",", "Atg16L1", "(", "1", "-", "230", ")", "or", "Atg16L1Δ", "(", "230", "-", "300", ")", "were", "cultured", "in", "regular", "DMEM", "(", "C", ")", "or", "starvation", "medium", "(", "B", ",", "C", ")", "for", "1", "h", ".", "Cells", "were", "fixed", "and", "analysed", "by", "immunofluorescence", "microscopy", "using", "anti", "‐", "GFP", ",", "anti", "‐", "Atg16L1", "and", "anti", "‐", "LC3", "antibodies", ".", "Arrowheads", "indicate", "the", "perinuclear", "localization", "of", "Atg16L1", "(", "1", "-", "230", ")", ".", "The", "number", "of", "dots", "was", "quantified", "from", "more", "than", "30", "randomly", "selected", "cells", "from", "three", "independent", "samples", "as", "described", "in", "the", "Methods", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "(", "*", "P0", ".", "001", ",", "analysis", "of", "variance", "followed", "by", "Bonferroni", "/", "Dunn", "post", "hoc", "test", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ",", "and", "2", "μm", "in", "inset", ".", "(", "D", ",", "E", ")", "Cells", "stably", "expressing", "GFP", "-", "LC3", "were", "cultured", "in", "regular", "DMEM", ",", "starvation", "medium", "or", "starvation", "medium", "in", "the", "presence", "of", "0", ".", "2", "μM", "WM", "or", "100", "nM", "BafA1", "for", "6", "h", ".", "Total", "cellular", "GFP", "-", "LC3", "signals", "were", "analysed", "by", "flow", "cytometry", ".", "Representative", "FACS", "data", "were", "shown", "(", "D", ")", ".", "The", "geometric", "mean", "of", "fluorescence", "intensity", "was", "determined", ".", "Values", "are", "expressed", "as", "a", "percentage", "of", "the", "mean", "of", "control", "cells", "cultured", "in", "regular", "DMEM", ".", "Data", "represent", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "(", "*", "P0", ".", "05", ")", "(", "E", ")", ".", "BafA1", ",", "bafilomycin", "A1", ";", "GFP", ",", "green", "fluorescent", "protein", ";", "KO", ",", "knockout", ";", "MEFs", ",", "mouse", "embryonic", "fibroblasts", ";", "NS", ",", "not", "significant", ";", "WM", ",", "wortmannin", ";", "WT", ",", "wild", "‐", "type", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) WT MEFs, Atg16L1 KO MEFs or Atg16L1 KO MEFs stably expressing either full‐length Atg16L1(1-588), Atg16L1(1-230) or Atg16L1Δ(230-300) were cultured in regular DMEM or starvation medium in the presence or absence of 100 nM BafA1 for 2 h. * indicates nonspecific immunoreactive bands.(B, C) Atg16L1 KO MEFs stably expressing GFP-ULK1 and either full‐length Atg16L1(1-588), Atg16L1(1-230) or Atg16L1Δ(230-300) were cultured in regular DMEM (C) or starvation medium (B,C) for 1 h. Cells were fixed and analysed by immunofluorescence microscopy using anti‐GFP, anti‐Atg16L1 and anti‐LC3 antibodies. Arrowheads indicate the perinuclear localization of Atg16L1(1-230). The number of dots was quantified from more than 30 randomly selected cells from three independent samples as described in the Methods. Data represent mean±s.e. (*P0.001, analysis of variance followed by Bonferroni/Dunn post hoc test). Scale bar, 10 μm, and 2 μm in inset.(D, E) Cells stably expressing GFP-LC3 were cultured in regular DMEM, starvation medium or starvation medium in the presence of 0.2 μM WM or 100 nM BafA1 for 6 h. Total cellular GFP-LC3 signals were analysed by flow cytometry. Representative FACS data were shown (D). The geometric mean of fluorescence intensity was determined. Values are expressed as a percentage of the mean of control cells cultured in regular DMEM. Data represent mean±s.e. (*P0.05) (E). BafA1, bafilomycin A1; GFP, green fluorescent protein; KO, knockout; MEFs, mouse embryonic fibroblasts; NS, not significant; WM, wortmannin; WT, wild‐type."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Atg16L1", "KO", "MEFs", "stably", "expressing", "either", "full", "‐", "length", "Atg16L1", "(", "1", "-", "588", ")", ",", "Atg16L1", "(", "1", "-", "230", ")", "or", "Atg16L1Δ", "(", "230", "-", "300", ")", "were", "cultured", "in", "regular", "DMEM", "or", "starvation", "medium", "for", "1", "h", ".", "Cells", "were", "fixed", "and", "subjected", "to", "immunofluorescence", "microscopy", "using", "anti", "‐", "Atg16L1", "antibody", ".", "Note", "that", "full", "‐", "length", "Atg16L1", "and", "Atg16L1", "(", "1", "-", "230", ")", ",", "but", "not", "Atg16L1Δ", "(", "230", "-", "300", ")", ",", "showed", "punctate", "structures", "under", "starvation", "conditions", "(", "inset", ")", ".", "(", "B", ")", "FIP200", "KO", "MEFs", "stably", "expressing", "either", "CFP", "-", "Atg16L1", "(", "1", "-", "588", ")", ",", "CFP", "-", "Atg16L1", "(", "1", "-", "230", ")", "or", "CFP", "-", "Atg16L1Δ", "(", "230", "-", "300", ")", "were", "cultured", "in", "regular", "DMEM", "or", "starvation", "medium", "for", "1", "h", ".", "Cells", "were", "fixed", "and", "analysed", "by", "immunofluorescence", "microscopy", "using", "anti", "‐", "GFP", "antibody", ".", "Arrowheads", "indicate", "the", "perinuclear", "localization", "of", "Atg16L1", "(", "1", "-", "230", ")", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "FIP200", "KO", "MEFs", "stably", "expressing", "CFP", "-", "Atg16L1", "(", "1", "-", "230", ")", "were", "cultured", "in", "regular", "DMEM", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ",", "and", "2", "μm", "in", "inset", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Atg16L1 KO MEFs stably expressing either full‐length Atg16L1(1-588), Atg16L1(1-230) or Atg16L1Δ(230-300) were cultured in regular DMEM or starvation medium for 1 h. Cells were fixed and subjected to immunofluorescence microscopy using anti‐Atg16L1 antibody. Note that full‐length Atg16L1 and Atg16L1(1-230), but not Atg16L1Δ(230-300), showed punctate structures under starvation conditions (inset).(B) FIP200 KO MEFs stably expressing either CFP-Atg16L1(1-588), CFP-Atg16L1(1-230) or CFP-Atg16L1Δ(230-300) were cultured in regular DMEM or starvation medium for 1 h. Cells were fixed and analysed by immunofluorescence microscopy using anti‐GFP antibody. Arrowheads indicate the perinuclear localization of Atg16L1(1-230).(C, D) FIP200 KO MEFs stably expressing CFP-Atg16L1(1-230) were cultured in regular DMEM. Scale bar, 10 μm, and 2 μm in inset."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "a", ")", "Representative", "micro", "-", "CT", "pictures", "of", "hind", "legs", "of", "20", "-", "30", "week", "-", "old", "control", "(", "A20WT", ")", "and", "A20myel", "-", "KO", "littermates", ".", "Note", "the", "severe", "osteoporosis", "in", "A20myel", "-", "KO", "mice", ".", "(", "b", ")", "Trabecular", "parameters", ",", "calculated", "on", "micro", "-", "CT", "scans", "of", "hind", "legs", "of", "20", "-", "30", "week", "-", "old", "control", "(", "A20WT", ")", "and", "A20myel", "-", "KO", "littermates", ".", "Each", "dot", "represents", "an", "individual", "mouse", "(", "A20WT", ",", "n", "=", "10", ";", "A20myel", "-", "KO", ",", "n", "=", "8", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(a) Representative micro-CT pictures of hind legs of 20-30 week-old control (A20WT) and A20myel-KO littermates. Note the severe osteoporosis in A20myel-KO mice. (b) Trabecular parameters, calculated on micro-CT scans of hind legs of 20-30 week-old control (A20WT) and A20myel-KO littermates. Each dot represents an individual mouse (A20WT, n=10; A20myel-KO, n=8)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "a", ")", "Levels", "of", "TNF", "and", "IL", "-", "6", "in", "serum", "of", "A20WT", ",", "A20OC", "-", "KO", "and", "A20myel", "-", "KO", "mice", ".", "Each", "dot", "represents", "an", "individual", "mouse", "(", "A20WT", ",", "n", "=", "11", ";", "A20OC", "-", "KO", ",", "n", "=", "11", "and", "A20myel", "-", "KO", ",", "n", "=", "14", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "(", "c", ")", "Trabecular", "parameters", ",", "calculated", "on", "micro", "-", "CT", "scans", "of", "hind", "legs", "of", "20", "-", "30", "week", "-", "old", "control", "(", "A20WT", ")", "and", "A20OC", "-", "KO", "littermates", ".", "Each", "dot", "represents", "an", "individual", "mouse", "(", "A20WT", ",", "n", "=", "6", ";", "A20OC", "-", "KO", ",", "n", "=", "9", ")", ".", "(", "e", ")", "Representative", "pictures", "of", "TRAP", "-", "stained", "sections", "from", "tibia", "of", "20", "week", "-", "old", "A20WT", "and", "A20OC", "-", "KO", "mice", ".", "Red", "arrows", "indicate", "osteoclasts", ".", "(", "f", ")", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "TRAP", "-", "positive", "cells", "on", "sections", "from", "tibia", "of", "20", "week", "-", "old", "A20WT", "and", "A20OC", "-", "KO", "mice", ".", "Each", "dot", "represents", "an", "individual", "mouse", "(", "A20WT", ",", "n", "=", "5", ";", "A20OC", "-", "KO", ",", "n", "=", "6", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(a) Levels of TNF and IL-6 in serum of A20WT, A20OC-KO and A20myel-KO mice. Each dot represents an individual mouse (A20WT, n=11; A20OC-KO, n=11 and A20myel-KO, n=14). Data are expressed as mean ± SEM. *(c) Trabecular parameters, calculated on micro-CT scans of hind legs of 20-30 week-old control (A20WT) and A20OC-KO littermates. Each dot represents an individual mouse (A20WT, n=6; A20OC-KO, n=9).(e) Representative pictures of TRAP-stained sections from tibia of 20 week-old A20WT and A20OC-KO mice. Red arrows indicate osteoclasts.(f) Quantification of the number of TRAP-positive cells on sections from tibia of 20 week-old A20WT and A20OC-KO mice. Each dot represents an individual mouse (A20WT, n=5; A20OC-KO, n=6)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "d", ")", "Measurement", "of", "NF", "-", "κB", "luciferase", "activity", "in", "lysates", "of", "HEK293T", "cells", "transiently", "transfected", "with", "an", "NF", "-", "κB", "reporter", "plasmid", ",", "an", "expression", "plasmid", "for", "β", "-", "galactosidase", "(", "βgal", ")", ",", "an", "expression", "plasmid", "for", "RANK", ",", "and", "with", "either", "an", "empty", "vector", "or", "a", "vector", "expressing", "wild", "-", "type", "A20", ".", "Cell", "lysates", "were", "analysed", "for", "luciferase", "and", "βgal", "activity", "and", "values", "are", "plotted", "as", "Luc", "/", "βgal", "to", "normalize", "for", "possible", "differences", "in", "transfection", "efficiency", ".", "(", "e", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "whole", "cell", "lysates", "from", "BMDMs", "cultures", "isolated", "from", "A20WT", "and", "A20myel", "-", "KO", "mice", "and", "stimulated", "with", "RANKL", "(", "100ng", "/", "ml", ")", "for", "the", "indicated", "time", "periods", ".", "Actin", "is", "shown", "as", "a", "loading", "control", ".", "(", "f", ")", "Wild", "-", "type", "and", "A20", "deficient", "BMDMs", "were", "stimulated", "with", "GST", "-", "RANKL", "(", "1", "μg", "/", "ml", ")", "for", "the", "indicated", "time", "periods", ".", "The", "RANK", "signaling", "complex", "was", "immunoprecipitated", "using", "glutathione", "-", "sepharose", "beads", "and", "immunoblotted", "for", "RANK", ",", "A20", ",", "TRAF6", ",", "HOIP", "and", "Sharpin", ".", "(", "g", ")", "BMDMs", "from", "A20WT", "and", "A20myel", "-", "KO", "mice", "were", "stimulated", "with", "RANKL", "(", "100ng", "/", "ml", ")", "for", "the", "indicated", "time", "periods", "and", "immunoblotted", "to", "visualize", "p100", "processing", "to", "p52", ".", "Actin", "is", "shown", "as", "a", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(d) Measurement of NF-κB luciferase activity in lysates of HEK293T cells transiently transfected with an NF-κB reporter plasmid, an expression plasmid for β-galactosidase (βgal), an expression plasmid for RANK, and with either an empty vector or a vector expressing wild-type A20. Cell lysates were analysed for luciferase and βgal activity and values are plotted as Luc/βgal to normalize for possible differences in transfection efficiency.(e) Western blot analysis of whole cell lysates from BMDMs cultures isolated from A20WT and A20myel-KO mice and stimulated with RANKL (100ng/ml) for the indicated time periods. Actin is shown as a loading control.(f) Wild-type and A20 deficient BMDMs were stimulated with GST-RANKL (1 μg/ml) for the indicated time periods. The RANK signaling complex was immunoprecipitated using glutathione-sepharose beads and immunoblotted for RANK, A20, TRAF6, HOIP and Sharpin.(g) BMDMs from A20WT and A20myel-KO mice were stimulated with RANKL (100ng/ml) for the indicated time periods and immunoblotted to visualize p100 processing to p52. Actin is shown as a loading control."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "a", ")", "Measurement", "of", "NF", "-", "κB", "luciferase", "activity", "in", "lysates", "of", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "an", "NF", "-", "κB", "luciferase", "reporter", "plasmid", ",", "an", "expression", "plasmid", "for", "β", "-", "galactosidase", "(", "βgal", ")", ",", "an", "expression", "plasmid", "for", "RANK", ",", "and", "plasmids", "encoding", "different", "A20", "variants", ":", "A20WT", ",", "A20DUB", "(", "C103A", "mutation", ")", ",", "A20ZnF4", "(", "C624A", "/", "C627A", ")", ",", "A20ZnF7", "(", "C775A", "/", "C779A", ")", ",", "and", "A20ZnF4ZnF7", "(", "C624A", "/", "C627A", "/", "C775A", "/", "C779A", ")", ".", "Cell", "lysates", "were", "analysed", "for", "luciferase", "and", "βgal", "activity", "and", "values", "are", "plotted", "as", "Luc", "/", "βgal", "to", "normalize", "for", "possible", "differences", "in", "transfection", "efficiency", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "the", "mean", "of", "technical", "triplicates", "±", "SD", ".", "(", "c", "-", "d", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "whole", "cell", "lysates", "from", "BMDMs", "differentiated", "from", "A20WT", "and", "A20ZnF4ZnF7", "mice", ",", "stimulated", "with", "RANKL", "(", "100ng", "/", "ml", ")", "for", "the", "indicated", "time", "periods", ".", "Actin", "is", "shown", "as", "a", "loading", "control", ".", "(", "e", ")", "BMDMs", "isolated", "from", "control", "(", "A20WT", ")", ",", "A20ZnF7", ",", "A20ZnF4ZnF7", "and", "A20DUB", "mice", "were", "stimulated", "with", "GST", "-", "RANKL", "(", "1", "μg", "/", "ml", ")", "for", "the", "indicated", "time", "periods", ".", "The", "RANK", "signaling", "complex", "was", "immunoprecipitated", "using", "glutathione", "-", "sepharose", "beads", "and", "immunoblotted", "for", "A20", ".", "Actin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "(", "f", ")", "Wild", "-", "type", "BMDMs", "were", "pretreated", "for", "1h", "with", "HOIPIN", "-", "8", "(", "50µM", ")", "or", "left", "untreated", "and", "stimulated", "with", "GST", "-", "RANKL", "(", "1", "μg", "/", "ml", ")", "for", "the", "indicated", "time", "periods", ".", "The", "RANK", "signaling", "complex", "was", "immunoprecipitated", "using", "glutathione", "-", "sepharose", "beads", "and", "immunoblotted", "for", "A20", ".", "Actin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(a) Measurement of NF-κB luciferase activity in lysates of HEK293T cells transfected with an NF-κB luciferase reporter plasmid, an expression plasmid for β-galactosidase (βgal), an expression plasmid for RANK, and plasmids encoding different A20 variants: A20WT, A20DUB (C103A mutation), A20ZnF4 (C624A/C627A), A20ZnF7 (C775A/C779A), and A20ZnF4ZnF7 (C624A/C627A/C775A/C779A). Cell lysates were analysed for luciferase and βgal activity and values are plotted as Luc/βgal to normalize for possible differences in transfection efficiency. Data are expressed as the mean of technical triplicates ± SD.(c-d) Western blot analysis of whole cell lysates from BMDMs differentiated from A20WT and A20ZnF4ZnF7 mice, stimulated with RANKL (100ng/ml) for the indicated time periods. Actin is shown as a loading control.(e) BMDMs isolated from control (A20WT), A20ZnF7, A20ZnF4ZnF7 and A20DUB mice were stimulated with GST-RANKL (1 μg/ml) for the indicated time periods. The RANK signaling complex was immunoprecipitated using glutathione-sepharose beads and immunoblotted for A20. Actin was used as a loading control.(f) Wild-type BMDMs were pretreated for 1h with HOIPIN-8 (50µM) or left untreated and stimulated with GST-RANKL (1 μg/ml) for the indicated time periods. The RANK signaling complex was immunoprecipitated using glutathione-sepharose beads and immunoblotted for A20. Actin was used as a loading control."}
{"words": ["Figure", "1Immunoblots", "of", "acyl", "-", "biotin", "exchange", "purifications", "from", "Hela", "cells", "transiently", "transfected", "with", "WT", "Golga7b", "or", "a", "palmitoylation", "-", "deficient", "mutant", "form", "of", "the", "protein", "with", "cysteines", "replaced", "with", "alanine", "residues", ".", "The", "hydroxylamine", "sensitivity", "of", "the", "Golga7b", "signal", "in", "the", "+", "HA", "condition", "of", "the", "WT", "pull", "-", "down", "and", "not", "in", "either", "the", "-", "HA", "condition", "or", "the", "+", "HA", "condition", "of", "the", "mutant", "shows", "that", "Golga7b", "is", "a", "palmitoylated", "protein", ".", "Immunoblots", "of", "acyl", "-", "biotin", "exchange", "purifications", "from", "Hela", "cells", "treated", "with", "either", "DHHC5", "siRNA", "or", "control", "non", "-", "targeting", "siRNA", ".", "Immunoblots", "showing", "rescue", "of", "Golga7b", "palmitoylation", "in", "DHHC5", "depleted", "cells", "after", "transfection", "of", "WT", "DHHC5", "but", "not", "by", "the", "DHHC5", "catalytic", "mutant", ".", "A", "significant", "reduction", "in", "the", "Golga7b", "signal", "is", "observed", "in", "the", "+", "HA", "condition", "of", "the", "pull", "-", "down", "when", "DHHC5", "is", "depleted", "with", "siRNA", ".", "The", "graph", "displays", "mean", "+", "/", "-", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "N", "=", "4", ",", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "paired", "t", "-", "test", ".", "Immunoblots", "of", "WT", "and", "non", "-", "palmitoylatable", "mutant", "Golga7b", "from", "immunoprecipitations", "of", "WT", "DHHC5", "and", "a", "pair", "of", "DHHC5", "mutants", "(", "DHHS5", "=", "catalytically", "inactive", "mutant", "where", "catalytic", "cysteine", "has", "been", "mutated", "to", "serine", ",", "C", "-", "terminal", "mutant", "=", "mutant", "where", "the", "3", "C", "-", "terminal", "palmitoylation", "sites", "of", "DHHC5", "have", "been", "mutated", "to", "alanine", "residues", ".", ")", ".", "WT", "and", "DHHS5", "immunoprecipitates", "both", "WT", "and", "mutant", "Golga7b", "but", "the", "C", "-", "terminal", "mutant", "is", "unable", "to", "immunoprecipitate", "either", "form", "of", "Golga7b", "showing", "that", "the", "palmitoylation", "of", "the", "C", "-", "terminus", "of", "DHHC5", "is", "essential", "for", "the", "stability", "of", "this", "interaction", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Immunoblots of acyl-biotin exchange purifications from Hela cells transiently transfected with WT Golga7b or a palmitoylation-deficient mutant form of the protein with cysteines replaced with alanine residues. The hydroxylamine sensitivity of the Golga7b signal in the + HA condition of the WT pull-down and not in either the - HA condition or the + HA condition of the mutant shows that Golga7b is a palmitoylated protein.Immunoblots of acyl-biotin exchange purifications from Hela cells treated with either DHHC5 siRNA or control non-targeting siRNA.Immunoblots showing rescue of Golga7b palmitoylation in DHHC5 depleted cells after transfection of WT DHHC5 but not by the DHHC5 catalytic mutant.A significant reduction in the Golga7b signal is observed in the + HA condition of the pull-down when DHHC5 is depleted with siRNA. The graph displays mean +/- s.e.m. N=4, *=p<0.05, paired t-test.Immunoblots of WT and non-palmitoylatable mutant Golga7b from immunoprecipitations of WT DHHC5 and a pair of DHHC5 mutants (DHHS5 = catalytically inactive mutant where catalytic cysteine has been mutated to serine, C-terminal mutant = mutant where the 3 C-terminal palmitoylation sites of DHHC5 have been mutated to alanine residues.). WT and DHHS5 immunoprecipitates both WT and mutant Golga7b but the C-terminal mutant is unable to immunoprecipitate either form of Golga7b showing that the palmitoylation of the C-terminus of DHHC5 is essential for the stability of this interaction."}
{"words": ["Figure", "2Tagged", "constructs", "with", "palmitoylation", "site", "mutations", "in", "DHHC5", "and", "Golga7b", "were", "expressed", "in", "in", "HeLa", "cells", "depleted", "of", "endogenous", "DHHC5", ".", "Confocal", "images", "of", "HeLa", "cells", "co", "-", "expressing", "WT", "Golga7b", "(", "1st", "column", ")", "and", "DHHC5", "(", "2nd", "column", ")", ",", "with", "a", "merged", "image", "(", "3rd", "column", ")", ".", "Confocal", "images", "of", "HeLa", "cells", "co", "-", "expressing", "palmitoylation", "deficient", "mutant", "Golga7b", "(", "1st", "column", ")", "and", "DHHC5", "(", "2nd", "column", ")", ",", "with", "a", "merged", "image", "(", "3rd", "column", ")", ".", "Confocal", "images", "of", "HeLa", "cells", "co", "-", "expressing", "WT", "Golga7b", "(", "1st", "column", ")", "and", "the", "catalytic", "mutant", "DHHS5", "(", "2nd", "column", ")", ",", "with", "a", "merged", "image", "(", "3rd", "column", ")", ".", "Confocal", "images", "of", "HeLa", "cells", "co", "-", "expressing", "palmitoylation", "deficient", "mutant", "Golga7b", "(", "1st", "column", ")", "and", "DHHS5", "(", "2nd", "column", ")", ",", "with", "a", "merged", "image", "(", "3rd", "column", ")", ".", "Confocal", "images", "of", "HeLa", "cells", "co", "-", "expressing", "WT", "Golga7b", "(", "1st", "column", ")", "and", "DHHC5", "C", "-", "terminal", "palmitoylation", "deficient", "mutant", "(", "2nd", "column", ")", ",", "with", "a", "merged", "image", "(", "3rd", "column", ")", ".", "Confocal", "images", "of", "HeLa", "cells", "co", "-", "expressing", "palmitoylation", "deficient", "mutant", "Golga7b", "(", "1st", "column", ")", "and", "DHHC5", "C", "-", "terminal", "palmitoylation", "deficient", "mutant", "(", "2nd", "column", ")", ",", "with", "a", "merged", "image", "(", "3rd", "column", ")", ".", "Quantification", "of", "the", "plasma", "membrane", "signal", "of", "DHHC5", "in", "each", "of", "the", "images", "(", "A", "-", "F", ")", ",", "the", "graph", "displays", "mean", "+", "/", "-", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "n", ".", "s", ".", "=", "not", "significant", ",", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "N", "=", "35", ",", "DHHC5", "+", "WT", "Golga7b", ".", "N", "=", "41", ",", "DHHC5", "+", "mutant", "Golga7b", ".", "N", "=", "35", ",", "DHHS5", "+", "WT", "Golga7b", ".", "N", "=", "31", ",", "DHHS5", "+", "Golga7b", "mutant", ".", "N", "=", "29", ",", "C", "-", "terminal", "mutant", "+", "WT", "Golga7b", ".", "N", "=", "30", ",", "C", "-", "terminal", "mutant", "+", "mutant", "Golga7b", ".", "Co", "expression", "of", "palmitoylation", "-", "deficient", "mutant", "Golga7b", "significantly", "reduces", "DHHC5", "as", "well", "as", "DHHCS5", "signal", "at", "the", "plasma", "membrane", ".", "The", "majority", "of", "the", "DHHC5", "C", "-", "terminal", "palmitoylation", "-", "deficient", "mutant", "is", "localised", "to", "the", "plasma", "membrane", "in", "a", "Golga7b", "independent", "manner", ".", "All", "N", "numbers", "refer", "to", "the", "number", "of", "cells", "imaged", "and", "quantified", ",", "all", "experiments", "repeated", "4", "times", ".", "Data", "information", ":", "All", "images", "show", "ectopic", "protein", "expression", "only", ".", "All", "scale", "bars", "10µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Tagged constructs with palmitoylation site mutations in DHHC5 and Golga7b were expressed in in HeLa cells depleted of endogenous DHHC5. Confocal images of HeLa cells co-expressing WT Golga7b (1st column) and DHHC5 (2nd column), with a merged image (3rd column). Confocal images of HeLa cells co-expressing palmitoylation deficient mutant Golga7b (1st column) and DHHC5 (2nd column), with a merged image (3rd column). Confocal images of HeLa cells co-expressing WT Golga7b (1st column) and the catalytic mutant DHHS5 (2nd column), with a merged image (3rd column). Confocal images of HeLa cells co-expressing palmitoylation deficient mutant Golga7b (1st column) and DHHS5 (2nd column), with a merged image (3rd column). Confocal images of HeLa cells co-expressing WT Golga7b (1st column) and DHHC5 C-terminal palmitoylation deficient mutant (2nd column), with a merged image (3rd column). Confocal images of HeLa cells co-expressing palmitoylation deficient mutant Golga7b (1st column) and DHHC5 C-terminal palmitoylation deficient mutant (2nd column), with a merged image (3rd column). Quantification of the plasma membrane signal of DHHC5 in each of the images (A-F), the graph displays mean +/- s.e.m. ****=p<0.001, n.s. = not significant, unpaired t-test. N=35, DHHC5 + WT Golga7b. N=41, DHHC5 + mutant Golga7b. N=35, DHHS5 + WT Golga7b. N=31, DHHS5 + Golga7b mutant. N=29, C-terminal mutant + WT Golga7b. N=30, C-terminal mutant + mutant Golga7b. Co expression of palmitoylation-deficient mutant Golga7b significantly reduces DHHC5 as well as DHHCS5 signal at the plasma membrane. The majority of the DHHC5 C-terminal palmitoylation-deficient mutant is localised to the plasma membrane in a Golga7b independent manner. All N numbers refer to the number of cells imaged and quantified, all experiments repeated 4 times. Data information: All images show ectopic protein expression only. All scale bars 10µm."}
{"words": ["Figure", "3Confocal", "images", "of", "endogenous", "DHHC5", "in", "HeLa", "cells", "expressing", "FLAG", "-", "tagged", "WT", "Golga7b", ".", "Confocal", "images", "of", "endogenous", "DHHC5", "in", "HeLa", "cells", "expressing", "FLAG", "-", "tagged", "mutant", "Golga7b", ".", "Confocal", "images", "of", "endogenous", "Golga7b", "and", "DHHC5", "in", "HeLa", "cells", "treated", "with", "negative", "control", "non", "-", "targeting", "siRNA", ".", "Confocal", "images", "of", "endogenous", "Golga7b", "and", "DHHC5", "in", "HeLa", "cell", "treated", "with", "Golga7b", "siRNA", ".", "Quantification", "of", "plasma", "membrane", "signal", "of", "endogenous", "DHHC5", "when", "co", "-", "expressed", "with", "WT", "or", "mutant", "Golga7b", "or", "without", "any", "transfected", "Golga7b", ".", "*", "*", "*", "*", "=", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "t", "-", "test", ",", "endogenous", "+", "WT", "Golga7b", "n", "=", "37", ",", "endogenous", "+", "mutant", "Golga7b", "n", "=", "23", ",", "endogenous", "n", "=", "42", ".", "Expression", "of", "the", "palmitoylation", "deficient", "mutant", "Golga7b", "causes", "endogenous", "DHHC5", "to", "be", "internalised", "in", "the", "cell", ",", "while", "WT", "Golga7b", "stabilises", "DHHC5", "at", "the", "plasma", "membrane", ".", "Quantification", "of", "the", "plasma", "membrane", "signal", "of", "DHHC5", "in", "(", "C", "and", "D", ")", ",", "*", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "001", "t", "-", "test", ",", "control", "siRNA", "n", "=", "23", ",", "Golga7b", "siRNA", "n", "=", "23", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Confocal images of endogenous DHHC5 in HeLa cells expressing FLAG-tagged WT Golga7b. Confocal images of endogenous DHHC5 in HeLa cells expressing FLAG-tagged mutant Golga7b.Confocal images of endogenous Golga7b and DHHC5 in HeLa cells treated with negative control non-targeting siRNA. Confocal images of endogenous Golga7b and DHHC5 in HeLa cell treated with Golga7b siRNA.Quantification of plasma membrane signal of endogenous DHHC5 when co-expressed with WT or mutant Golga7b or without any transfected Golga7b. ****=P<0.001, t-test, endogenous + WT Golga7b n=37, endogenous + mutant Golga7b n=23, endogenous n=42. Expression of the palmitoylation deficient mutant Golga7b causes endogenous DHHC5 to be internalised in the cell, while WT Golga7b stabilises DHHC5 at the plasma membrane.Quantification of the plasma membrane signal of DHHC5 in (C and D), ****=p<0.001 t-test, control siRNA n=23, Golga7b siRNA n=23."}
{"words": ["Figure", "4FLAG", "-", "DHHC5", "immunoprecipitations", "were", "performed", "using", "lysates", "from", "Hela", "cells", "co", "-", "expressing", "either", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "or", "palmitoylation", "deficient", "mutant", "(", "m", ")", "Golga7b", ".", "The", "interaction", "of", "DHHC5", "with", "its", "substrate", "Flot2", "was", "measured", "by", "immunoblotting", "and", "is", "significantly", "reduced", "in", "the", "presence", "of", "palmitoylation", "deficient", "mutant", "Golga7b", ",", "quantification", "normalised", "to", "input", ",", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "ratio", "paired", "t", "-", "test", ",", "n", "=", "3", ".", "Venn", "diagram", "comparing", "the", "overlap", "of", "numbers", "of", "proteins", "immunoprecipitated", "when", "FLAG", "-", "DHHC5", "is", "expressed", "alone", "or", "co", "-", "expressed", "with", "either", "WT", "or", "mutant", "Golga7b", ".", "IF", "images", "are", "taken", "from", "figures", "EV2", "and", "EV3", "to", "illustrate", "DHHC5", "localisation", ".", "Volcano", "plot", "of", "DHHC5", "interactors", "from", "AP", "-", "MS", "analysis", "from", "HeLa", "cells", "co", "-", "expressing", "FLAG", "-", "DHHC5", "and", "WT", "Golga7b", "highlighting", "interacting", "proteins", "involved", "in", "clathrin", "-", "mediated", "endocytosis", ",", "cell", ":", "cell", "adhesion", "and", "known", "substrates", "of", "DHHC5", ".", "Validation", "of", "novel", "DHHC5", "interactors", "by", "co", "-", "IP", ":", "immunoblots", "of", "Dsg2from", "Hela", "cells", "co", "-", "expressing", "DHHC5", "and", "either", "Wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "or", "mutant", "(", "m", ")", "Golga7b", "and", "quantification", "normalised", "to", "input", ",", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "ratio", "paired", "t", "-", "test", ",", "n", "=", "3", ".", "Co", "-", "IP", "immunoblots", "of", "clathrin", "heavy", "chain", "from", "Hela", "cells", "co", "-", "expressing", "DHHC5", "and", "either", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "or", "mutant", "(", "m", ")", "Golga7b", "and", "quantification", "normalised", "to", "input", ",", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "ratio", "paired", "t", "-", "test", ",", "n", "=", "3", ".", "Co", "-", "IP", "immunoblots", "of", "ZO", "-", "1", "protein", "from", "Hela", "cells", "co", "-", "expressing", "DHHC5", "and", "either", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "or", "mutant", "(", "m", ")", "Golga7b", "and", "quantification", "normalised", "to", "input", ",", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "01", "ratio", "paired", "t", "-", "test", ",", "n", "=", "3", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4FLAG-DHHC5 immunoprecipitations were performed using lysates from Hela cells co-expressing either wild-type (WT) or palmitoylation deficient mutant (m) Golga7b. The interaction of DHHC5 with its substrate Flot2 was measured by immunoblotting and is significantly reduced in the presence of palmitoylation deficient mutant Golga7b, quantification normalised to input, *=p<0.05, ratio paired t-test, n=3.Venn diagram comparing the overlap of numbers of proteins immunoprecipitated when FLAG-DHHC5 is expressed alone or co-expressed with either WT or mutant Golga7b. IF images are taken from figures EV2 and EV3 to illustrate DHHC5 localisation.Volcano plot of DHHC5 interactors from AP-MS analysis from HeLa cells co-expressing FLAG-DHHC5 and WT Golga7b highlighting interacting proteins involved in clathrin-mediated endocytosis, cell:cell adhesion and known substrates of DHHC5.Validation of novel DHHC5 interactors by co-IP: immunoblots of Dsg2from Hela cells co-expressing DHHC5 and either Wild-type (WT) or mutant (m) Golga7b and quantification normalised to input, *=p<0.05, ratio paired t-test, n=3. Co-IP immunoblots of clathrin heavy chain from Hela cells co-expressing DHHC5 and either wild-type (WT) or mutant (m) Golga7b and quantification normalised to input, *=p<0.05, ratio paired t-test, n=3. Co-IP immunoblots of ZO-1 protein from Hela cells co-expressing DHHC5 and either wild-type (WT) or mutant (m) Golga7b and quantification normalised to input, **=p<0.01 ratio paired t-test, n=3."}
{"words": ["Figure", "530", "minute", "DMSO", "treatment", "of", "HeLa", "cells", "co", "-", "expressing", "WT", "DHHC5", "(", "FLAG", "tagged", ")", "and", "mutant", "Golga7b", "(", "HA", "tagged", ")", ".", "30", "minute", "Dynasore", "treatment", "(", "25µM", ")", "of", "HeLa", "cells", "co", "-", "expressing", "WT", "DHHC5", "(", "FLAG", "tagged", ")", "and", "mutant", "Golga7b", "(", "HA", "tagged", ")", ".", "Non", "-", "targeting", "control", "siRNA", "treatment", "(", "10nM", ")", "of", "HeLa", "cells", "expressing", "mutant", "Golga7b", "(", "HA", "tagged", ")", ".", "Images", "are", "detecting", "endogenous", "DHHC5", "and", "the", "HA", "tagged", "Golga7b", "AP2µ", "siRNA", "treatment", "(", "10nM", ")", "of", "HeLa", "cells", "that", "were", "subsequently", "transfected", "with", "mutant", "Golga7b", "(", "HA", "tagged", ")", ".", "Images", "are", "detecting", "endogenous", "DHHC5", "and", "the", "HA", "tagged", "Golga7b", ".", "Quantification", "of", "plasma", "membrane", "signal", "of", "DHHC5", "in", "(", "A", "and", "B", ")", ".", "*", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "N", "=", "37", ",", "+", "Dynasore", ".", "N", "=", "28", ",", "+", "DMSO", ".", "Quantification", "of", "plasma", "membrane", "signal", "of", "DHHC5", "in", "(", "C", "and", "D", ")", ".", "*", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "All", "scale", "bars", "10μm", ".", "Biotin", "endocytosis", "assays", "of", "HeLa", "cells", "with", "endogenous", "DHHC5", ",", "over", "-", "expression", "of", "DHHC5", "alone", ",", "co", "-", "expression", "of", "DHHC5", "and", "WT", "Golga7b", ",", "co", "-", "expression", "of", "DHHC5", "and", "mutant", "Golga7b", "or", "expression", "of", "the", "DHHC5", "C", "-", "terminal", "mutant", ".", "Biotinylated", "cell", "surface", "proteins", "endocytosed", "within", "15", "minutes", "were", "purified", "using", "streptavidin", "resin", "and", "blots", "probed", "with", "an", "antibody", "to", "DHHC5", ".", "The", "lack", "of", "signal", "in", "the", "pull", "-", "down", "of", "the", "DHHC5", "C", "-", "terminal", "mutant", "or", "when", "DHHC5", "and", "WT", "Golga7b", "are", "co", "-", "expressed", "indicates", "that", "DHHC5", "is", "stabilised", "at", "the", "plasma", "membrane", "in", "these", "conditions", ".", "The", "robust", "signal", "in", "the", "pull", "-", "down", "of", "endocytosed", "proteins", "from", "cells", "co", "-", "expressing", "DHHC5", "and", "mutant", "Golga7b", "shows", "a", "high", "rate", "of", "endocytosis", "of", "DHHC5", "in", "this", "condition", ".", "N", "=", "3", ",", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "paired", "t", "test", "\""], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 530 minute DMSO treatment of HeLa cells co-expressing WT DHHC5 (FLAG tagged) and mutant Golga7b (HA tagged). 30 minute Dynasore treatment (25µM) of HeLa cells co-expressing WT DHHC5 (FLAG tagged) and mutant Golga7b (HA tagged).Non-targeting control siRNA treatment (10nM) of HeLa cells expressing mutant Golga7b (HA tagged). Images are detecting endogenous DHHC5 and the HA tagged Golga7b AP2µ siRNA treatment (10nM) of HeLa cells that were subsequently transfected with mutant Golga7b (HA tagged). Images are detecting endogenous DHHC5 and the HA tagged Golga7b.Quantification of plasma membrane signal of DHHC5 in (A and B). ****=p<0.001, unpaired t-test. N=37, +Dynasore. N=28, +DMSO.Quantification of plasma membrane signal of DHHC5 in (C and D). ****=p<0.001, unpaired t-test. All scale bars 10μm.Biotin endocytosis assays of HeLa cells with endogenous DHHC5, over-expression of DHHC5 alone, co-expression of DHHC5 and WT Golga7b, co-expression of DHHC5 and mutant Golga7b or expression of the DHHC5 C-terminal mutant. Biotinylated cell surface proteins endocytosed within 15 minutes were purified using streptavidin resin and blots probed with an antibody to DHHC5. The lack of signal in the pull-down of the DHHC5 C-terminal mutant or when DHHC5 and WT Golga7b are co-expressed indicates that DHHC5 is stabilised at the plasma membrane in these conditions. The robust signal in the pull-down of endocytosed proteins from cells co-expressing DHHC5 and mutant Golga7b shows a high rate of endocytosis of DHHC5 in this condition. N=3, *=p<0.05, paired t test\""}
{"words": ["Figure", "6ABE", "purifications", "from", "HeLa", "cells", "treated", "with", "10nM", "non", "-", "targeting", "siRNA", "(", "nt", "siRNA", ")", "or", "DHHC5", "siRNA", "were", "immunoblotted", "for", "Dsg2", ".", "Loss", "of", "the", "band", "in", "the", "+", "HA", "pull", "-", "down", "in", "the", "DHHC5", "siRNA", "condition", "shows", "that", "Dsg2", "palmitoylation", "is", "dependent", "on", "DHHC5", ".", "Confocal", "images", "of", "DHHC5", "and", "Dsg2", "in", "nt", "siRNA", "treated", "A431", "cells", "three", "hours", "after", "calcium", "was", "reintroduced", "to", "the", "media", "in", "calcium", "switch", "experiments", ".", "Confocal", "images", "of", "DHHC5", "and", "Dsg2", "in", "DHHC5", "depleted", "A431", "cells", "three", "hours", "after", "calcium", "was", "reintroduced", "to", "the", "media", "in", "calcium", "switch", "experiments", ".", "Confocal", "images", "of", "DHHC5", ",", "Dsg2", "and", "Golga7b", "in", "Golga7b", "depleted", "A431", "cells", "three", "hours", "after", "calcium", "was", "reintroduced", "to", "the", "media", "in", "calcium", "switch", "experiments", ".", "See", "Appendix", "Figure", "S6", "for", "quantification", "of", "data", "in", "panels", "B", "-", "D", ".", "Immunoblots", "and", "quantification", "of", "Dsg2", "pulled", "-", "down", "in", "cell", "surface", "biotinylation", "assays", "in", "nt", "siRNA", ",", "DHHC5", "siRNA", "or", "Golga7b", "siRNA", "treated", "conditions", ".", "Quantification", "of", "the", "intensity", "of", "the", "DSG2", "signal", "in", "the", "pulldown", "is", "normalised", "to", "input", ".", "A", "significant", "reduction", "of", "cell", "surface", "Dsg2", "occurs", "when", "DHHC5", "or", "Golga7b", "are", "depleted", "by", "siRNA", ".", "*", "=", "Immunoblot", "of", "an", "ABE", "purification", "for", "Dsg2", "in", "cells", "with", "either", "normal", "media", "or", "low", "calcium", "(", "5µM", "calcium", ")", "conditions", ",", "with", "quantification", "of", "the", "intensity", "of", "the", "DSG2", "signal", "in", "the", "pulldown", "normalised", "to", "input", ".", "There", "is", "a", "significant", "reduction", "in", "the", "Dsg2", "signal", "in", "the", "+", "HA", "pull", "-", "down", "from", "low", "calcium", "cells", "showing", "that", "Dsg2", "is", "significantly", "less", "palmitoylated", "in", "this", "condition", ".", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "paired", "t", "-", "test", ",", "N", "=", "4", ",", "error", "bars", "represent", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "All", "scale", "bars", "10μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6ABE purifications from HeLa cells treated with 10nM non-targeting siRNA (nt siRNA) or DHHC5 siRNA were immunoblotted for Dsg2. Loss of the band in the +HA pull-down in the DHHC5 siRNA condition shows that Dsg2 palmitoylation is dependent on DHHC5.Confocal images of DHHC5 and Dsg2 in nt siRNA treated A431 cells three hours after calcium was reintroduced to the media in calcium switch experiments. Confocal images of DHHC5 and Dsg2 in DHHC5 depleted A431 cells three hours after calcium was reintroduced to the media in calcium switch experiments.Confocal images of DHHC5, Dsg2 and Golga7b in Golga7b depleted A431 cells three hours after calcium was reintroduced to the media in calcium switch experiments. See Appendix Figure S6 for quantification of data in panels B-D.Immunoblots and quantification of Dsg2 pulled-down in cell surface biotinylation assays in nt siRNA, DHHC5 siRNA or Golga7b siRNA treated conditions. Quantification of the intensity of the DSG2 signal in the pulldown is normalised to input. A significant reduction of cell surface Dsg2 occurs when DHHC5 or Golga7b are depleted by siRNA. *=Immunoblot of an ABE purification for Dsg2 in cells with either normal media or low calcium (5µM calcium) conditions, with quantification of the intensity of the DSG2 signal in the pulldown normalised to input. There is a significant reduction in the Dsg2 signal in the +HA pull-down from low calcium cells showing that Dsg2 is significantly less palmitoylated in this condition. *=p<0.05, paired t-test, N=4, error bars represent s.e.m. All scale bars 10μm."}
{"words": ["Figure", "710x", "brightfield", "images", "of", "A431", "cells", "treated", "with", "non", "-", "targeting", "siRNA", "at", "time", "0", "(", "left", ")", "and", "after", "48", "hours", "(", "right", ")", "of", "5", "ng", "/", "ml", "EGF", "treatment", ".", "10x", "brightfield", "images", "of", "A431", "cells", "treated", "with", "DHHC5", "siRNA", "at", "time", "0", "(", "left", ")", "and", "after", "48", "hours", "(", "right", ")", "of", "5ng", "/", "ml", "EGF", "treatment", ".", "Quantification", "of", "cell", "scattering", "of", "A431", "cells", ",", "showing", "a", "significant", "increase", "in", "cell", "scatter", "after", "48", "hours", "of", "DHHC5", "knockdown", "and", "therefore", "a", "decrease", "in", "cell", "adhesion", "was", "observed", ".", "10x", "brightfield", "images", "of", "A431", "cells", "treated", "with", "non", "-", "targeting", "siRNA", "at", "time", "0", "(", "left", ")", "and", "after", "48", "hours", "(", "right", ")", "of", "5ng", "/", "ml", "EGF", "treatment", ".", "10x", "brightfield", "images", "of", "A431", "cells", "treated", "with", "Golga7b", "siRNA", "at", "time", "0", "(", "left", ")", "and", "after", "48", "hours", "(", "right", ")", "of", "5ng", "/", "ml", "EGF", "treatment", ".", "Quantification", "of", "cell", "scattering", "of", "A431", "cells", ",", "showing", "a", "significant", "increase", "in", "cell", "scatter", "after", "48", "hours", "of", "Golga7b", "knockdown", "and", "therefore", "a", "decrease", "in", "cell", "adhesion", ",", "was", "observed", ".", "Plot", "showing", "the", "resistance", "of", "A431", "cells", "from", "a", "trans", "-", "epithelial", "electrical", "resistance", "assay", "treated", "with", "either", "DHHC5", "siRNA", ",", "Golga7b", "siRNA", "or", "non", "-", "targeting", "siRNA", ".", "A", "significant", "reduction", "in", "TEER", "demonstrates", "a", "decrease", "in", "cell", "adhesion", "after", "both", "DHHC5", "and", "Golga7b", "depletion", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 710x brightfield images of A431 cells treated with non-targeting siRNA at time 0 (left) and after 48 hours (right) of 5 ng/ml EGF treatment. 10x brightfield images of A431 cells treated with DHHC5 siRNA at time 0 (left) and after 48 hours (right) of 5ng/ml EGF treatment. Quantification of cell scattering of A431 cells, showing a significant increase in cell scatter after 48 hours of DHHC5 knockdown and therefore a decrease in cell adhesion was observed.10x brightfield images of A431 cells treated with non-targeting siRNA at time 0 (left) and after 48 hours (right) of 5ng/ml EGF treatment. 10x brightfield images of A431 cells treated with Golga7b siRNA at time 0 (left) and after 48 hours (right) of 5ng/ml EGF treatment. Quantification of cell scattering of A431 cells, showing a significant increase in cell scatter after 48 hours of Golga7b knockdown and therefore a decrease in cell adhesion, was observed.Plot showing the resistance of A431 cells from a trans-epithelial electrical resistance assay treated with either DHHC5 siRNA, Golga7b siRNA or non-targeting siRNA. A significant reduction in TEER demonstrates a decrease in cell adhesion after both DHHC5 and Golga7b depletion."}
{"words": ["Figure", "1B", ".", "Chromatin", "accessibility", "and", "p300", "binding", "at", "differential", "ATAC", "-", "seq", "peaks", "visualized", "using", "K", "-", "means", "clustering", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B. Chromatin accessibility and p300 binding at differential ATAC-seq peaks visualized using K-means clustering."}
{"words": ["Figure", "2B", ".", "Boxplots", "showing", "differential", "gene", "expression", "(", "AC", "versus", "DMZ", ")", "and", "associated", "ATAC", "-", "seq", "signals", "(", "Two", "biological", "replicates", ")", ".", "The", "central", "band", "within", "the", "boxplot", "represents", "the", "median", "and", "the", "whiskers", "show", "1", ".", "5", "times", "the", "range", "between", "the", "first", "and", "third", "quartile", "(", "IQR", ")", ".", "F", ".", "Genomic", "tracks", "showing", "aggregated", "accessibility", "of", "single", "-", "cell", "ATAC", "-", "seq", "clusters", "at", "the", "t", "(", "tbxt", ")", ",", "tfap2a", ",", "gsc", ",", "ctcf", ",", "lhx1", "and", "sox11", "loci", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B. Boxplots showing differential gene expression (AC versus DMZ) and associated ATAC-seq signals (Two biological replicates). The central band within the boxplot represents the median and the whiskers show 1.5 times the range between the first and third quartile (IQR).F. Genomic tracks showing aggregated accessibility of single-cell ATAC-seq clusters at the t (tbxt), tfap2a, gsc, ctcf, lhx1 and sox11 loci."}
{"words": ["Figure", "4C", ".", "Feature", "maps", ",", "showing", "the", "expression", "of", "selected", "genes", "in", "single", "cells", "(", "cf", ".", "Appendix", "Fig", ".", "S2", ")", ".", "Color", "scale", "represents", "the", "gene", "expression", "value", "(", "log1p", "-", "transformed", "counts", "per", "10", ",", "000", "unique", "reads", ")", "for", "each", "cell", "for", "a", "given", "gene", ",", "from", "low", "(", "grey", ")", "to", "high", "(", "orange", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4C. Feature maps, showing the expression of selected genes in single cells (cf. Appendix Fig. S2). Color scale represents the gene expression value (log1p-transformed counts per 10,000 unique reads) for each cell for a given gene, from low (grey) to high (orange)."}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "Heat", "map", "showing", "log2", "fold", "expression", "changes", "of", "differentially", "expressed", "genes", "in", "AC", "tissues", "overexpressing", "Foxb1", ",", "Foxb1", "-", "Eomes", ",", "Eomes", ",", "Irx3", ",", "Irx3", "-", "Otx2", ",", "Otx2", "and", "Lhx8", ".", "C", ".", "Fold", "enrichment", "of", "genes", "with", "zygotically", "defined", "(", "ZyD", ")", "H3K4me3", "at", "their", "promoter", "in", "AC", "with", "transcription", "factor", "overexpression", ".", "Asterisk", "indicates", "hypergeometric", "p", "-", "value", "<", "=", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A. Heat map showing log2 fold expression changes of differentially expressed genes in AC tissues overexpressing Foxb1, Foxb1-Eomes, Eomes, Irx3, Irx3-Otx2, Otx2 and Lhx8.C. Fold enrichment of genes with zygotically defined (ZyD) H3K4me3 at their promoter in AC with transcription factor overexpression. Asterisk indicates hypergeometric p-value <= 0.01."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ",", "B", ")", "Actively", "dividing", "cells", "labelled", "by", "BrdU", "and", "Ki67", "are", "reduced", "in", "the", "SGZ", "of", "DSCR1", "mutants", "compared", "to", "that", "of", "wild", "type", "mice", ".", "Brain", "sections", "were", "prepared", "1", "day", "after", "BrdU", "injection", ".", "The", "white", "box", "area", "is", "magnified", "in", "the", "lower", "panels", ":", "DAPI", "(", "blue", ")", ",", "Ki67", "(", "green", ")", ",", "and", "BrdU", "(", "red", ")", ".", "Arrow", "heads", "indicate", "BrdU", "and", "Ki", "-", "67", "double", "positive", "cells", "in", "the", "SGZ", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "Differentiating", "cells", "are", "identified", "by", "staining", "with", "BrdU", "and", "DCX", ".", "Brain", "sections", "were", "prepared", "10", "days", "after", "BrdU", "injection", ".", "(", "E", ",", "F", ")", "Maturation", "of", "progenitor", "cells", "are", "assessed", "by", "staining", "with", "BrdU", "and", "NeuN", ".", "Brain", "sections", "were", "prepared", "21", "days", "after", "BrdU", "injection", "Each", "hippocampal", "section", "was", "40", "μm", "in", "thickness", ",", "and", "a", "total", "of", "24", "sections", "were", "obtained", "from", "one", "hippocampus", ".", "Scale", "bars", ":", "100", "μm", "in", "the", "large", "panel", ",", "and", "10", "μm", "in", "the", "magnified", "images", ".", "Values", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", "and", "tested", "for", "statistical", "significance", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "post", "hoc", "test", ".", "N", "=", "3", "animals", "for", "each", "condition", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A, B) Actively dividing cells labelled by BrdU and Ki67 are reduced in the SGZ of DSCR1 mutants compared to that of wild type mice. Brain sections were prepared 1 day after BrdU injection. The white box area is magnified in the lower panels: DAPI (blue), Ki67 (green), and BrdU (red). Arrow heads indicate BrdU and Ki-67 double positive cells in the SGZ.(C, D) Differentiating cells are identified by staining with BrdU and DCX. Brain sections were prepared 10 days after BrdU injection.(E, F) Maturation of progenitor cells are assessed by staining with BrdU and NeuN. Brain sections were prepared 21 days after BrdU injection Each hippocampal section was 40 μm in thickness, and a total of 24 sections were obtained from one hippocampus. Scale bars:100 μm in the large panel, and 10 μm in the magnified images. Values are shown as mean ± SEM and tested for statistical significance by one-way ANOVA followed by Bonferroni post hoc test. N = 3 animals for each condition, *P< 0.05, **P< 0.01."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "miR", "-", "124", "expression", "is", "altered", "in", "DSCR1", "mutants", ".", "Values", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", "and", "tested", "for", "statistical", "significance", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "post", "hoc", "test", ".", "N", "=", "3", "animals", "for", "each", "condition", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "(", "B", ")", "Promoter", "activity", "of", "miR", "-", "124", "in", "Neuro2", "A", "cells", "with", "DSCR1", "reduction", "or", "overexpression", ".", "Firefly", "luciferase", "reporter", "under", "the", "control", "of", "miR", "-", "124", "promoter", "is", "measured", ".", "Values", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", "and", "tested", "for", "statistical", "significance", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "post", "hoc", "test", ".", "N", "=", "3", "for", "each", "condition", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "(", "C", ")", "Bisulfite", "sequencing", "analyses", "of", "the", "miR", "-", "124", "promoter", ".", "Each", "CpG", "site", "is", "indicated", ",", "and", "the", "methylation", "status", "of", "two", "different", "regions", "are", "shown", ".", "Open", "and", "filled", "circles", "represent", "unmethylated", "and", "methylated", "CpG", "sites", ",", "respectively", ".", "The", "percentage", "of", "methylated", "CpGs", "among", "total", "number", "of", "CpGs", "is", "also", "shown", ".", "(", "D", ")", "Neuro2A", "cells", "containing", "DSCR1shRNA", "show", "increased", "activity", "of", "miR", "-", "124", "promoter", "measured", ".", "The", "miR", "-", "124", "promoter", "was", "inserted", "in", "front", "of", "the", "luciferase", "reporter", ".", "Site", "-", "directed", "mutation", "of", "two", "methylation", "sites", "(", "31", "and", "58", ")", "in", "the", "promoter", "shows", "the", "luciferase", "activity", "similar", "to", "that", "of", "DSCR1", "reduction", ".", "Values", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ",", "and", "tested", "for", "statistical", "significance", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "post", "hoc", "test", ".", "N", "=", "3", "for", "each", "condition", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ".", "(", "E", ")", "Overexpression", "of", "DSCR1", "reduced", "the", "luciferase", "activity", ",", "while", "removing", "all", "methylation", "sites", "in", "the", "miR", "-", "124", "promoter", "increases", "it", ".", "Values", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ",", "and", "tested", "for", "statistical", "significance", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "post", "hoc", "test", ".", "N", "=", "3", "for", "each", "condition", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) miR-124 expression is altered in DSCR1 mutants. Values are shown as mean ± SEM and tested for statistical significance by one-way ANOVA followed by Bonferroni post hoc test. N = 3 animals for each condition, *P< 0.01.(B) Promoter activity of miR-124 in Neuro2 A cells with DSCR1 reduction or overexpression. Firefly luciferase reporter under the control of miR-124 promoter is measured. Values are shown as mean ± SEM and tested for statistical significance by one-way ANOVA followed by Bonferroni post hoc test. N = 3 for each condition, *P< 0.05, **P< 0.01.(C) Bisulfite sequencing analyses of the miR-124 promoter. Each CpG site is indicated, and the methylation status of two different regions are shown. Open and filled circles represent unmethylated and methylated CpG sites, respectively. The percentage of methylated CpGs among total number of CpGs is also shown.(D) Neuro2A cells containing DSCR1shRNA show increased activity of miR-124 promoter measured. The miR-124 promoter was inserted in front of the luciferase reporter. Site-directed mutation of two methylation sites (31 and 58) in the promoter shows the luciferase activity similar to that of DSCR1 reduction. Values are shown as mean ± SEM, and tested for statistical significance by one-way ANOVA followed by Bonferroni post hoc test. N = 3 for each condition, *P< 0.05.(E) Overexpression of DSCR1 reduced the luciferase activity, while removing all methylation sites in the miR-124 promoter increases it. Values are shown as mean ± SEM, and tested for statistical significance by one-way ANOVA followed by Bonferroni post hoc test. N = 3 for each condition, *P< 0.05."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "DSCR1", "binds", "to", "TET1", "introns", ".", "The", "binding", "affinity", "of", "DSCR1", "to", "the", "intron", "8", "of", "TET1", "decreased", "with", "increased", "dosage", "of", "U1", "snRNA", "and", "U2", "snRNA", ".", "(", "B", ")", "DSCR1", "missing", "RNA", "recognition", "motif", "(", "△", "RRM", ")", "does", "not", "bind", "to", "the", "TET1", "intron", "8", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "Schematic", "diagram", "of", "the", "luciferase", "reporter", "separated", "by", "TET1", "intron", "8", "and", "9", "or", "GAPDH", "intron", "3", "and", "4", ".", "DSCR1", "reduction", "increases", "the", "activity", "of", "this", "luciferase", "construct", ",", "while", "DSCR1", "overexpression", "decreases", "its", "activity", ".", "In", "contrast", ",", "altering", "DSCR1", "levels", "did", "not", "affect", "luciferase", "activity", "of", "the", "construct", "containing", "GAPDH", "introns", ".", "Values", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ",", "and", "tested", "for", "statistical", "significance", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "post", "hoc", "test", ".", "N", "=", "3", "for", "each", "condition", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "E", ")", "TET1", "protein", "expression", "in", "the", "dentate", "gyrus", "region", "of", "hippocampus", "of", "DSCR1", "mutants", ".", "TET1", "is", "increased", "in", "DSCR1", "knockout", ",", "while", "it", "is", "decreased", "in", "DSCR1", "transgenic", "mice", ".", "Values", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ",", "and", "tested", "for", "statistical", "significance", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "post", "hoc", "test", ".", "N", "=", "3", "animal", "for", "each", "condition", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) DSCR1 binds to TET1 introns. The binding affinity of DSCR1 to the intron 8 of TET1 decreased with increased dosage of U1 snRNA and U2 snRNA.(B) DSCR1 missing RNA recognition motif (△RRM) does not bind to the TET1 intron 8.(C, D) Schematic diagram of the luciferase reporter separated by TET1 intron 8 and 9 or GAPDH intron 3 and 4. DSCR1 reduction increases the activity of this luciferase construct, while DSCR1 overexpression decreases its activity. In contrast, altering DSCR1 levels did not affect luciferase activity of the construct containing GAPDH introns. Values are shown as mean ± SEM, and tested for statistical significance by one-way ANOVA followed by Bonferroni post hoc test. N = 3 for each condition, *P< 0.05, **P< 0.01. ***P< 0.001.(E) TET1 protein expression in the dentate gyrus region of hippocampus of DSCR1 mutants. TET1 is increased in DSCR1 knockout, while it is decreased in DSCR1 transgenic mice. Values are shown as mean ± SEM, and tested for statistical significance by one-way ANOVA followed by Bonferroni post hoc test. N = 3 animal for each condition, *P< 0.05, **P< 0.01."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "B", ")", "3", "weeks", "after", "lentivirus", "injection", ",", "neural", "progenitor", "cells", "are", "identified", "by", "double", "staining", "of", "GFP", "and", "Sox2", "in", "dentate", "gyrus", "region", ".", "The", "white", "arrow", "indicates", "Sox2", "and", "GFP", "double", "positive", "cells", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "(", "C", ")", "The", "number", "of", "GFP", "and", "Sox2", "double", "positive", "cells", "is", "restored", "to", "that", "of", "wild", "type", ".", "Scale", "bar", ":", "10μm", ".", "Values", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", "and", "tested", "for", "statistical", "significance", "by", "paired", "t", "-", "test", ".", "N", "=", "3", "animal", "for", "each", "condition", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(B) 3 weeks after lentivirus injection, neural progenitor cells are identified by double staining of GFP and Sox2 in dentate gyrus region. The white arrow indicates Sox2 and GFP double positive cells. Scale bar, 10 μm. (C) The number of GFP and Sox2 double positive cells is restored to that of wild type. Scale bar: 10μm. Values are shown as mean ± SEM and tested for statistical significance by paired t-test. N = 3 animal for each condition, *P< 0.05."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Genotype", "of", "Ts65Dn", "/", "DSCR1", "+", "/", "-", "mouse", "was", "confirmed", "by", "detecting", "markers", "for", "Ts65Dn", "and", "DSCR1", "KO", "(", "B", ")", "Expression", "of", "the", "DSCR1", "mRNA", "in", "Ts65Dn", "mouse", "was", "increased", "about", "2", ".", "5", "folds", "compared", "to", "that", "of", "wild", "type", ".", "However", ",", "Ts65Dn", "/", "DSCR1", "+", "/", "-", "mouse", "showed", "normal", "level", "of", "DSCR1", "mRNA", "transcript", ".", "Values", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", "and", "tested", "for", "statistical", "significance", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "post", "hoc", "test", ".", "N", "=", "3", "for", "each", "condition", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ".", "As", "expected", ",", "the", "levels", "of", "TET1", "are", "decreased", "in", "Ts65Dn", "mouse", ",", "however", "Ts65Dn", "/", "DSCR1", "+", "/", "-", "mouse", "restores", "the", "TET1", "mRNA", "expression", ".", "Values", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", "and", "tested", "for", "statistical", "significance", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "post", "hoc", "test", ".", "ß", "-", "actin", "was", "used", "for", "normalization", ".", "N", "=", "3", "(", "Diploid", ")", ",", "3", "(", "Ts65Dn", ")", ",", "4", "(", "Ts65Dn", "/", "DSCR1", "+", "/", "-", ")", "mice", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "As", "expected", ",", "the", "levels", "of", "miR", "-", "124", "are", "decreased", "in", "Ts65Dn", "mouse", ",", "however", "Ts65Dn", "/", "DSCR1", "+", "/", "-", "mouse", "restores", "the", "miR", "-", "124", "expression", ".", "Values", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", "and", "tested", "for", "statistical", "significance", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "post", "hoc", "test", ".", "ß", "-", "actin", "was", "used", "for", "normalization", ".", "N", "=", "3", "(", "Diploid", ")", ",", "3", "(", "Ts65Dn", ")", ",", "4", "(", "Ts65Dn", "/", "DSCR1", "+", "/", "-", ")", "mice", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "(", "E", ",", "F", ")", "The", "number", "proliferating", "progenitor", "neurons", "identified", "by", "BrdU", "and", "Ki", "-", "67", "double", "staining", "is", "restored", "in", "the", "SGZ", "of", "Ts65Dn", "/", "DSCR1", "+", "/", "-", "mouse", "compared", "to", "that", "of", "Ts65Dn", "mouse", ".", "The", "white", "box", "area", "is", "magnified", "in", "the", "lower", "panels", ":", "DAPI", "(", "blue", ")", ",", "Ki67", "(", "green", ")", ",", "and", "BrdU", "(", "red", ")", ".", "Arrow", "heads", "indicate", "BrdU", "and", "Ki", "-", "67", "double", "positive", "cells", "in", "the", "SGZ", ".", "Scale", "bars", ":", "100", "μm", "in", "the", "large", "image", "and", "10", "μm", "in", "magnified", "image", ".", "Each", "hippocampal", "section", "was", "40", "μm", "in", "thickness", ",", "and", "total", "6", "hippocampi", "were", "used", "for", "analysis", ".", "Values", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", "and", "tested", "for", "statistical", "significance", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "post", "hoc", "test", ".", "N", "=", "6", "(", "control", ")", ",", "5", "(", "Ts65Dn", ")", ",", "3", "(", "Ts65Dn", "/", "DSCR1", "+", "/", "-", ")", "animals", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ".", "(", "G", "-", "J", ")", "Ts65Dn", "has", "learning", "and", "memory", "defects", ",", "but", "Ts65Dn", "/", "DSCR1", "+", "/", "-", "mouse", "clearly", "rescues", "learning", "and", "memory", "defects", "to", "control", "levels", ".", "Values", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ",", "and", "tested", "for", "statistical", "significance", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "post", "hoc", "test", ".", "N", "=", "8", "(", "control", ")", ",", "5", "(", "Ts65Dn", ")", ",", "10", "(", "Ts65Dn", "/", "DSCR1", "+", "/", "-", ")", "animals", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "G", ",", "H", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "I", ")", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "I", ")", ".", "(", "J", ")", "Open", "-", "field", "analysis", "shows", "no", "defects", "in", "movement", "of", "tested", "animals", ".", "Values", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ",", "N", "=", "6", "(", "control", ")", ",", "5", "(", "Ts65Dn", ")", ",", "3", "(", "Ts65Dn", "/", "DSCR1", "+", "/", "-", ")", "animals", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Genotype of Ts65Dn/DSCR1+/- mouse was confirmed by detecting markers for Ts65Dn and DSCR1 KO(B) Expression of the DSCR1 mRNA in Ts65Dn mouse was increased about 2.5 folds compared to that of wild type. However, Ts65Dn/DSCR1+/- mouse showed normal level of DSCR1 mRNA transcript. Values are shown as mean ± SEM and tested for statistical significance by one-way ANOVA followed by Bonferroni post hoc test. N=3 for each condition, *P< 0.05.As expected, the levels of TET1 are decreased in Ts65Dn mouse, however Ts65Dn/DSCR1+/- mouse restores the TET1 mRNA expression. Values are shown as mean ± SEM and tested for statistical significance by one-way ANOVA followed by Bonferroni post hoc test. ß-actin was used for normalization. N = 3 (Diploid), 3 (Ts65Dn), 4 (Ts65Dn/DSCR1+/-) mice, *P< 0.05, **P< 0.01.As expected, the levels of miR-124 are decreased in Ts65Dn mouse, however Ts65Dn/DSCR1+/- mouse restores the miR-124 expression. Values are shown as mean ± SEM and tested for statistical significance by one-way ANOVA followed by Bonferroni post hoc test. ß-actin was used for normalization. N = 3 (Diploid), 3 (Ts65Dn), 4 (Ts65Dn/DSCR1+/-) mice, *P< 0.05, **P< 0.01.(E, F) The number proliferating progenitor neurons identified by BrdU and Ki-67 double staining is restored in the SGZ of Ts65Dn/DSCR1+/- mouse compared to that of Ts65Dn mouse. The white box area is magnified in the lower panels: DAPI (blue), Ki67 (green), and BrdU (red). Arrow heads indicate BrdU and Ki-67 double positive cells in the SGZ. Scale bars: 100 μm in the large image and 10 μm in magnified image. Each hippocampal section was 40 μm in thickness, and total 6 hippocampi were used for analysis. Values are shown as mean ± SEM and tested for statistical significance by one-way ANOVA followed by Bonferroni post hoc test. N = 6 (control), 5 (Ts65Dn), 3 (Ts65Dn/DSCR1+/-) animals, *P< 0.05.(G-J) Ts65Dn has learning and memory defects, but Ts65Dn/DSCR1+/- mouse clearly rescues learning and memory defects to control levels. Values are shown as mean ± SEM, and tested for statistical significance by one-way ANOVA followed by Bonferroni post hoc test. N = 8 (control), 5 (Ts65Dn), 10 (Ts65Dn/DSCR1+/-) animals, *P< 0.001 (G, H). *P< 0.05 (I), **P< 0.01 (I). (J) Open-field analysis shows no defects in movement of tested animals. Values are shown as mean ± SEM, N = 6 (control), 5 (Ts65Dn), 3 (Ts65Dn/DSCR1+/-) animals."}
{"words": ["figf1", "(", "b", ")", "Suppression", "of", "Htt103Q", "toxicity", "in", "yeast", "by", "Gpx1", ",", "Hyr1", "(", "Gpx3", ")", "and", "mGpx1", ".", "The", "viability", "of", "the", "parental", "strain", ",", "Y258", ",", "and", "of", "cells", "overexpressing", "yeast", "GPxs", "was", "determined", "using", "spotting", "assays", ".", "Equal", "numbers", "of", "cells", "were", "serially", "diluted", "fivefold", "and", "plated", "on", "medium", "containing", "glucose", "to", "assess", "cell", "numbers", "and", "containing", "galactose", "(", "GAL", ")", "to", "induce", "the", "expression", "of", "Htt103Q", "and", "the", "indicated", "ORF", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf1(b) Suppression of Htt103Q toxicity in yeast by Gpx1, Hyr1 (Gpx3) and mGpx1. The viability of the parental strain, Y258, and of cells overexpressing yeast GPxs was determined using spotting assays. Equal numbers of cells were serially diluted fivefold and plated on medium containing glucose to assess cell numbers and containing galactose (GAL) to induce the expression of Htt103Q and the indicated ORF."}
{"words": ["figf2a", ")", "Total", "GPx", "activity", "was", "measured", "in", "mGpx1", "-", "overexpressing", "(", "mGpx1", ")", "or", "control", "(", "WT", ")", "cell", "lines", "with", "(", "induced", ")", "or", "without", "(", "uninduced", ")", "Htt103Q", "expression", ".", "Overexpression", "of", "mGpx1", "increases", "total", "GPx", "activity", "in", "PC12", "cells", "(", "*", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "0001", "compared", "to", "uninduced", "controls", ";", "n", "=", "7", "per", "condition", ")", ".", "(", "b", ")", "Quantification", "of", "caspase", "-", "3", "/", "7", "activation", "in", "response", "to", "Htt103Q", "expression", "in", "cells", "overexpressing", "mGpx1", ".", "Overexpression", "of", "mGpx1", "reduces", "Htt103Q", "-", "mediated", "caspase", "-", "3", "/", "7", "activation", "(", "*", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "0001", ")", ".", "Values", "represent", "the", "ratio", "of", "mGpx1", "activity", "in", "cells", "expressing", "Htt103Q", "for", "72", "h", "compared", "to", "cells", "not", "expressing", "Htt103Q", "(", "n", "=", "12", "(", "WT", ")", ";", "n", "=", "9", "(", "monomeric", "red", "fluorescent", "protein", "(", "mRFP", ")", ")", ";", "n", "=", "8", "(", "mGpx1", ")", "per", "condition", ")", ".", "(", "c", ")", "Effect", "of", "the", "GPx", "mimetic", "ebselen", "on", "Htt103Q", "-", "mediated", "caspase", "activation", ".", "A", "single", "10", "μM", "dose", "of", "ebselen", "significantly", "reduced", "caspase", "-", "3", "/", "7", "activation", "in", "Htt103Q", "-", "expressing", "cells", "(", "*", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "0001", ")", ".", "Values", "represent", "the", "ratio", "of", "caspase", "-", "3", "/", "7", "activity", "in", "cells", "expressing", "Htt103Q", "for", "72", "h", "compared", "to", "cells", "not", "expressing", "Htt103Q", ".", "Statistical", "analysis", "was", "performed", "using", "an", "unpaired", ",", "two", "-", "tailed", "Mann", "-", "Whitney", "test", "(", "n", "=", "12", "per", "condition", ")", ".", "(", "d", ")", "mGpx1", "overexpression", "(", "*", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "0001", ")", "and", "ebselen", "treatment", "(", "*", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "0001", ")", "significantly", "reduce", "Htt103Q", "-", "mediated", "ROS", "production", "(", "n", "=", "9", "per", "condition", ")", ".", "Unless", "stated", "otherwise", ",", "all", "statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "one", "-", "way", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", "with", "post", "-", "hoc", "tests", ".", "NS", ",", "not", "significant", ".", "*", "*", "P", "0", ".", "01", ".", "All", "data", "are", "shown", "as", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf2a) Total GPx activity was measured in mGpx1-overexpressing (mGpx1) or control (WT) cell lines with (induced) or without (uninduced) Htt103Q expression. Overexpression of mGpx1 increases total GPx activity in PC12 cells (****P 0.0001 compared to uninduced controls; n = 7 per condition).(b) Quantification of caspase-3/7 activation in response to Htt103Q expression in cells overexpressing mGpx1. Overexpression of mGpx1 reduces Htt103Q-mediated caspase-3/7 activation (****P 0.0001). Values represent the ratio of mGpx1 activity in cells expressing Htt103Q for 72 h compared to cells not expressing Htt103Q (n = 12 (WT); n = 9 (monomeric red fluorescent protein (mRFP)); n = 8 (mGpx1) per condition).(c) Effect of the GPx mimetic ebselen on Htt103Q-mediated caspase activation. A single 10 μM dose of ebselen significantly reduced caspase-3/7 activation in Htt103Q-expressing cells (****P 0.0001). Values represent the ratio of caspase-3/7 activity in cells expressing Htt103Q for 72 h compared to cells not expressing Htt103Q. Statistical analysis was performed using an unpaired, two-tailed Mann-Whitney test (n = 12 per condition).(d) mGpx1 overexpression (****P 0.0001) and ebselen treatment (****P 0.0001) significantly reduce Htt103Q-mediated ROS production (n = 9 per condition). Unless stated otherwise, all statistical analyses were performed using one-way analysis of variance (ANOVA) with post-hoc tests. NS, not significant. **P 0.01. All data are shown as the mean ± s.e.m."}
{"words": ["figf3", "(", "a", ")", "Pseudopupil", "images", "from", "wild", "-", "type", "flies", ",", "Huntington", "'", "s", "disease", "flies", "and", "Huntington", "'", "s", "disease", "flies", "overexpressing", "mGpx1", "at", "day", "10", ".", "In", "wild", "-", "type", "flies", ",", "seven", "rhabdomeres", "are", "visible", "per", "ommatidium", ".", "Scale", "bar", ",", "∼", "10", "μM", "(", "b", ")", "Quantification", "of", "the", "average", "number", "of", "rhabdomeres", "per", "ommatidium", "in", "Huntington", "'", "s", "disease", "flies", "with", "and", "without", "pan", "-", "neural", "mGpx1", "overexpression", "at", "days", "1", "(", "n", "=", "14", "(", "Htt93Q", ")", ";", "n", "=", "9", "(", "Htt93Q", "+", "mGpx1", ")", ")", ",", "7", "(", "n", "=", "7", "(", "Htt93Q", ")", ";", "n", "=", "9", "(", "Htt93Q", "+", "mGpx1", ")", ")", "and", "10", "(", "n", "=", "8", "(", "Htt93Q", ")", ";", "n", "=", "9", "(", "Htt93Q", "+", "mGpx1", ")", ")", "after", "eclosion", ".", "Significant", "effects", "of", "genotype", "(", "F1", ",", "50", "=", "82", ".", "3", ",", "P", "=", "3", ".", "82", "×", "10", "−", "12", ")", "and", "age", "(", "F2", ",", "50", "=", "94", ".", "3", ",", "P", "=", "1", ".", "06", "×", "10", "−", "17", ")", "were", "observed", ",", "as", "well", "as", "a", "significant", "interaction", "between", "genotype", "and", "age", "(", "F2", ",", "50", "=", "7", ".", "76", ",", "P", "=", "0", ".", "00116", ")", ",", "indicating", "that", "mGpx1", "reduces", "the", "rate", "of", "neurodegeneration", "in", "Htt93Q", "flies", ".", "Post", "-", "hoc", "Newman", "-", "Keuls", "comparisons", "showed", "significant", "rescue", "of", "neurodegeneration", "in", "mGpx1", "-", "expressing", "flies", "at", "days", "1", "(", "*", "P", "0", ".", "05", ")", ",", "7", "(", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "001", ")", "and", "10", "(", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "001", ")", ".", "Browne", "-", "Forsythe", "analyses", "for", "equality", "of", "variance", "revealed", "a", "significant", "inequality", "of", "variance", "(", "P", "=", "0", ".", "02", ")", "due", "to", "a", "single", "group", "(", "Htt93Q", "+", "mGpx1", ",", "day", "1", ")", ".", "The", "nonparametric", "Mann", "-", "Whitney", "test", "confirmed", "a", "difference", "at", "day", "1", "between", "the", "two", "groups", "(", "P", "=", "0", ".", "03", ")", ",", "and", "between", "Htt93Q", "+", "mGpx1", "flies", "at", "days", "1", "and", "7", "(", "P", "0", ".", "0001", ")", ".", "(", "c", ")", "Total", "locomotor", "activity", "was", "assessed", "as", "the", "average", "number", "of", "beam", "crossings", "per", "30", "-", "min", "bin", "per", "fly", ".", "Htt93Qex1", "-", "expressing", "flies", "(", "n", "=", "29", ")", "have", "reduced", "locomotor", "activity", "compared", "to", "controls", "(", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "001", ";", "n", "=", "30", "(", "WT", "(", "w118", ")", ")", ";", "n", "=", "32", "(", "mGpx1", ")", ")", ",", "which", "is", "restored", "by", "mGpx1", "(", "*", "*", "P", "0", ".", "01", ";", "n", "=", "32", ")", ".", "Comparisons", "were", "performed", "by", "Kruskal", "-", "Wallis", "one", "-", "way", "ANOVA", ".", "(", "d", ")", "Neurodegeneration", "of", "Pdf", "clock", "neurons", "was", "assessed", "using", "confocal", "microscopy", "in", "adult", "flies", "at", "day", "7", ".", "Flies", "expressing", "Htt93Qex1", "driven", "by", "Pdf", "-", "GAL4", "(", "n", "=", "16", "brain", "hemispheres", ")", "showed", "loss", "of", "s", "-", "LNVs", "compared", "to", "Canton", "S", "(", "CS", ")", "control", "flies", "(", "n", "=", "13", ")", ",", "which", "was", "ameliorated", "by", "coexpression", "of", "mGpx1", "(", "*", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "0001", ";", "n", "=", "16", ")", ".", "Comparisons", "were", "performed", "by", "Kruskal", "-", "Wallis", "one", "-", "way", "ANOVA", ".", "(", "e", ")", "Quantification", "of", "the", "average", "number", "of", "rhabdomeres", "per", "ommatidium", "in", "Huntington", "'", "s", "disease", "flies", "with", "ebselen", "or", "vehicle", "(", "DMSO", ";", "n", "=", "10", ")", "treatment", "at", "day", "7", "after", "eclosion", "and", "in", "newly", "emerged", "day", "0", "adult", "flies", "(", "untreated", "control", ";", "n", "=", "10", ")", ".", "Significant", "treatment", "effects", "were", "observed", ",", "both", "with", "the", "100", "μM", "(", "*", "*", "P", "0", ".", "01", ";", "n", "=", "9", ")", "and", "300", "μM", "(", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "001", ";", "n", "=", "9", ")", "doses", "of", "ebselen", ".", "All", "data", "are", "shown", "as", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf3(a) Pseudopupil images from wild-type flies, Huntington's disease flies and Huntington's disease flies overexpressing mGpx1 at day 10. In wild-type flies, seven rhabdomeres are visible per ommatidium. Scale bar, ∼10 μM(b) Quantification of the average number of rhabdomeres per ommatidium in Huntington's disease flies with and without pan-neural mGpx1 overexpression at days 1 (n = 14 (Htt93Q); n = 9 (Htt93Q + mGpx1)), 7 (n = 7 (Htt93Q); n = 9 (Htt93Q + mGpx1)) and 10 (n = 8 (Htt93Q); n = 9 (Htt93Q + mGpx1)) after eclosion. Significant effects of genotype (F1,50 = 82.3, P = 3.82 × 10−12) and age (F2,50 = 94.3, P = 1.06 × 10−17) were observed, as well as a significant interaction between genotype and age (F2,50 = 7.76, P = 0.00116), indicating that mGpx1 reduces the rate of neurodegeneration in Htt93Q flies. Post-hoc Newman-Keuls comparisons showed significant rescue of neurodegeneration in mGpx1-expressing flies at days 1 (*P 0.05), 7 (***P 0.001) and 10 (***P 0.001). Browne-Forsythe analyses for equality of variance revealed a significant inequality of variance (P = 0.02) due to a single group (Htt93Q + mGpx1, day 1). The nonparametric Mann-Whitney test confirmed a difference at day 1 between the two groups (P = 0.03), and between Htt93Q + mGpx1 flies at days 1 and 7 (P 0.0001).(c) Total locomotor activity was assessed as the average number of beam crossings per 30-min bin per fly. Htt93Qex1-expressing flies (n = 29) have reduced locomotor activity compared to controls (***P 0.001; n = 30 (WT (w118)); n = 32 (mGpx1)), which is restored by mGpx1 (**P 0.01; n = 32). Comparisons were performed by Kruskal-Wallis one-way ANOVA.(d) Neurodegeneration of Pdf clock neurons was assessed using confocal microscopy in adult flies at day 7. Flies expressing Htt93Qex1 driven by Pdf-GAL4 (n = 16 brain hemispheres) showed loss of s-LNVs compared to Canton S (CS) control flies (n = 13), which was ameliorated by coexpression of mGpx1 (****P 0.0001; n = 16). Comparisons were performed by Kruskal-Wallis one-way ANOVA.(e) Quantification of the average number of rhabdomeres per ommatidium in Huntington's disease flies with ebselen or vehicle (DMSO; n = 10) treatment at day 7 after eclosion and in newly emerged day 0 adult flies (untreated control; n = 10). Significant treatment effects were observed, both with the 100 μM (**P 0.01; n = 9) and 300 μM (***P 0.001; n = 9) doses of ebselen. All data are shown as the mean ± s.e.m."}
{"words": ["figf4PC12", "cells", "were", "treated", "with", "either", "10", "μM", "ebselen", "or", "10", "mM", "N", "-", "acetylcysteine", "(", "NAc", ")", "for", "24", "h", ",", "with", "the", "addition", "of", "400", "nM", "bafilomycin", "A1", "for", "the", "final", "4", "h", ".", "Autophagy", "was", "induced", "in", "the", "indicated", "samples", "by", "the", "addition", "of", "200", "nM", "rapamycin", "for", "24", "h", ".", "(", "a", ")", "Autophagy", "was", "determined", "by", "measuring", "the", "amount", "of", "LC3", "-", "II", "by", "immunoblot", "analysis", ".", "(", "b", ")", "Densitometric", "analysis", "of", "the", "bands", "was", "performed", "using", "ImageJ", ",", "and", "the", "amounts", "of", "LC3", "-", "II", "are", "expressed", "relative", "to", "the", "untreated", "control", ".", "All", "statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "post", "-", "hoc", "tests", "(", "*", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "0001", ")", ".", "All", "data", "are", "shown", "as", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "n", "=", "7", "per", "condition", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf4PC12 cells were treated with either 10 μM ebselen or 10 mM N-acetylcysteine (NAc) for 24 h, with the addition of 400 nM bafilomycin A1 for the final 4 h. Autophagy was induced in the indicated samples by the addition of 200 nM rapamycin for 24 h. (a) Autophagy was determined by measuring the amount of LC3-II by immunoblot analysis. (b) Densitometric analysis of the bands was performed using ImageJ, and the amounts of LC3-II are expressed relative to the untreated control. All statistical analyses were performed using one-way ANOVA with post-hoc tests (****P 0.0001). All data are shown as the mean ± s.e.m.; n = 7 per condition."}
{"words": ["Figure", "1A", ",", "Genome", "browser", "images", "of", "ChIP", "-", "seq", "for", "SAGA", "proteins", "before", "and", "after", "induction", "of", "ER", "stress", "at", "ER", "stress", "response", "genes", "CHOP", ",", "ERP70", ",", "and", "GRP78", ".", "ATF4", "/", "Xbp1s", "binding", "sites", "are", "from", "publicly", "available", "datasets", "(", "GEO", "accessions", "GSE69304", "and", "GSE49952", ")", ".", "C", ",", "Mean", "ChIP", "-", "seq", "signal", "for", "USP22", ",", "GCN5", ",", "and", "ATXN7L3", "surrounding", "gene", "promoters", "from", "B", ".", "Nonparametric", "Mann", "-", "Whitney", "analysis", "of", "7", "bins", "(", "grey", "shade", ")", "surrounding", "maximal", "peak", "in", "Thaps", "treated", "conditions", "are", "reported", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A, Genome browser images of ChIP-seq for SAGA proteins before and after induction of ER stress at ER stress response genes CHOP, ERP70, and GRP78. ATF4/Xbp1s binding sites are from publicly available datasets (GEO accessions GSE69304 and GSE49952).C, Mean ChIP-seq signal for USP22, GCN5, and ATXN7L3 surrounding gene promoters from B. Nonparametric Mann-Whitney analysis of 7 bins (grey shade) surrounding maximal peak in Thaps treated conditions are reported."}
{"words": ["Figure", "2A", ",", "HCT116", "cells", "were", "treated", "with", "100", "nM", "Thapsigargin", "for", "24", "hrs", ".", "Cells", "were", "stained", "with", "dye", "recognizing", "cleaved", "Caspases", "3", "and", "7", "and", "imaged", "every", "4", "hours", ".", "Scale", "bar", "=", "400", "µm", ".", "B", ",", "Quantification", "of", "apoptotic", "populations", "as", "indicated", "by", "Cas3", "/", "7", "fluorescence", "from", "A", ".", "Three", "independent", "experiments", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", ",", "with", "significance", "calculated", "by", "Two", "-", "way", "ANOVA", "between", "conditions", "over", "time", "(", "f", "(", "3", ")", "=", "50", ".", "530", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ";", "significant", "pairwise", "comparisons", "by", "Tukey", "'", "s", "HSD", "post", "-", "hoc", "assessment", "are", "indicated", "by", "*", ".", "C"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A, HCT116 cells were treated with 100 nM Thapsigargin for 24 hrs. Cells were stained with dye recognizing cleaved Caspases 3 and 7 and imaged every 4 hours. Scale bar = 400 µm. B, Quantification of apoptotic populations as indicated by Cas3/7 fluorescence from A. Three independent experiments are represented as mean ± SEM, with significance calculated by Two-way ANOVA between conditions over time (f(3)=50.530, p<0.001); significant pairwise comparisons by Tukey's HSD post-hoc assessment are indicated by *. C "}
{"words": ["Figure", "3A", ",", "HCT116", "cells", "were", "treated", "with", "100", "nM", "Thapsigargin", "for", "the", "indicated", "times", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "shRNA", "targeting", "USP22", ".", "Cells", "were", "harvested", "and", "whole", "-", "cell", "lysate", "was", "subjected", "to", "immunoblotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A, HCT116 cells were treated with 100 nM Thapsigargin for the indicated times in the presence or absence of shRNA targeting USP22. Cells were harvested and whole-cell lysate was subjected to immunoblotting with the indicated antibodies."}
{"words": ["Figure", "4A", ",", "Genome", "browser", "images", "of", "ChIP", "-", "seq", "for", "Pol", "II", "and", "Ub", "-", "H2B", "before", "and", "after", "induction", "of", "ER", "stress", ",", "with", "and", "without", "USP22", "knockdown", ",", "at", "ER", "stress", "response", "genes", "CHOP", ",", "ERP70", ",", "and", "GRP78", ".", "ATF4", "/", "Xbp1s", "binding", "sites", "are", "from", "publicly", "available", "datasets", "(", "GEO", "accessions", "GSE69304", "and", "GSE49952", ")", ".", "B", ",", "Metagene", "profiles", "for", "Pol", "II", "(", "upper", "panel", ")", "and", "Ub", "-", "H2B", "(", "middle", "panel", ")", "ChIP", "-", "seq", "for", "USP22", "-", "dependent", ",", "USP22", "-", "Bound", "genes", ".", "mRNA", "analyses", "of", "select", "Bound", "gene", "transcripts", "are", "presented", "(", "lower", "panel", ")", ".", "Three", "independent", "experiments", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", ",", "with", "significance", "measured", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", "C", ",", "Metagene", "profiles", "for", "Pol", "II", "(", "upper", "panel", ")", "and", "Ub", "-", "H2B", "(", "middle", "panel", ")", "ChIP", "-", "seq", "for", "USP22", "-", "dependent", ",", "SAGA", "-", "Unbound", "genes", ".", "Nonparametric", "Mann", "-", "Whitney", "analyses", "of", "7", "bins", "(", "grey", "shade", ")", "surrounding", "TSS", "(", "TSS", ")", "and", "the", "midpoint", "of", "the", "profiles", "(", "Body", ")", "in", "Thaps", "treated", "conditions", "are", "reported", ".", "mRNA", "analysis", "of", "select", "Unbound", "gene", "transcripts", "are", "presented", "(", "lower", "panel", ")", ".", "Three", "independent", "experiments", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", ",", "with", "significance", "measured", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A, Genome browser images of ChIP-seq for Pol II and Ub-H2B before and after induction of ER stress, with and without USP22 knockdown, at ER stress response genes CHOP, ERP70, and GRP78. ATF4/Xbp1s binding sites are from publicly available datasets (GEO accessions GSE69304 and GSE49952).B, Metagene profiles for Pol II (upper panel) and Ub-H2B (middle panel) ChIP-seq for USP22-dependent, USP22-Bound genes. mRNA analyses of select Bound gene transcripts are presented (lower panel). Three independent experiments are represented as mean ± SEM, with significance measured by Student's t-test, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005 C, Metagene profiles for Pol II (upper panel) and Ub-H2B (middle panel) ChIP-seq for USP22-dependent, SAGA-Unbound genes. Nonparametric Mann-Whitney analyses of 7 bins (grey shade) surrounding TSS (TSS) and the midpoint of the profiles (Body) in Thaps treated conditions are reported. mRNA analysis of select Unbound gene transcripts are presented (lower panel). Three independent experiments are represented as mean ± SEM, with significance measured by Student's t-test, **p<0.01, ***p<0.005. "}
{"words": ["Figure", "5C", ",", "ChIP", "-", "qPCR", "for", "total", "RNA", "Pol", "II", ",", "pSer5", "Pol", "II", ",", "and", "pSer2", "Pol", "II", "at", "ERP70", ",", "GRP78", ",", "and", "a", "gene", "desert", "(", "Prom", "=", "gene", "promoter", ",", "Coding", "=", "downstream", "coding", "region", "-", "see", "Appendix", "Table", "S1", "for", "primer", "sequences", ")", ".", "Three", "independent", "experiments", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "with", "significance", "measured", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ".", "H", ",", "An", "aliquot", "of", "cells", "from", "D", "‑", "G", "were", "harvested", "for", "whole", "-", "cell", "lysate", "and", "subjected", "to", "immunoblotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5C, ChIP-qPCR for total RNA Pol II, pSer5 Pol II, and pSer2 Pol II at ERP70, GRP78, and a gene desert (Prom = gene promoter, Coding = downstream coding region - see Appendix Table S1 for primer sequences). Three independent experiments are represented as mean ± SEM. with significance measured by Student's t-test, *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.005.H, An aliquot of cells from D‑G were harvested for whole-cell lysate and subjected to immunoblotting with the indicated antibodies."}
{"words": ["Figure", "6B", ",", "HCT116", "cells", "were", "treated", "for", "2", "hrs", "with", "100", "nM", "Thapsigargin", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "shRNA", "targeting", "USP22", ".", "Cells", "were", "harvested", ",", "fractionated", ",", "and", "fractions", "were", "subjected", "to", "immunoblotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "C", ",", "In", "vitro", "deubiquitylation", "UbiTest", "of", "endogenously", "ubiquitylated", "MED24", ".", "HCT116", "cells", "were", "treated", "with", "MG132", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "shRNA", "targeting", "USP22", ".", "Lysates", "were", "generated", "using", "buffer", "containing", "protease", "cocktail", "inhibitor", ",", "pan", "-", "DUB", "inhibitor", "PR619", ",", "and", "the", "JAMM", "protease", "inhibitor", "o", "-", "phenanthroline", ".", "Ubiquitylated", "proteins", "were", "purified", "on", "ubiquitin", "binding", "resin", "and", "eluates", "were", "either", "undigested", "(", "lanes", "1", "and", "2", ")", "or", "digested", "with", "USP2", "to", "strip", "polyubiquitin", "(", "lanes", "3", "and", "4", ")", "and", "reduce", "target", "proteins", "to", "unit", "length", ".", "Digestion", "reactions", "were", "subjected", "to", "immunoblotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6B, HCT116 cells were treated for 2 hrs with 100 nM Thapsigargin in the presence or absence of shRNA targeting USP22. Cells were harvested, fractionated, and fractions were subjected to immunoblotting with the indicated antibodies.C, In vitro deubiquitylation UbiTest of endogenously ubiquitylated MED24. HCT116 cells were treated with MG132 in the presence or absence of shRNA targeting USP22. Lysates were generated using buffer containing protease cocktail inhibitor, pan-DUB inhibitor PR619, and the JAMM protease inhibitor o-phenanthroline. Ubiquitylated proteins were purified on ubiquitin binding resin and eluates were either undigested (lanes 1 and 2) or digested with USP2 to strip polyubiquitin (lanes 3 and 4) and reduce target proteins to unit length. Digestion reactions were subjected to immunoblotting with the indicated antibodies."}
{"words": ["Figure", "7A", ",", "Genome", "browser", "image", "of", "ChIP", "-", "seq", "for", "middle", "and", "tail", "Mediator", "subunits", "and", "H3K4me3", "HiChIP", "tracks", "before", "and", "after", "induction", "of", "ER", "stress", "at", "ER", "stress", "response", "gene", "BHLHE40", ".", "H3K4me1", "and", "H3K27ac", "tracks", "are", "from", "the", "ENCODE", "Consortium", "(", "GEO", "accessions", "GSM945858", "and", "GSM945853", ")", ".", "ATF4", "/", "Xbp1s", "binding", "sites", "are", "from", "publicly", "available", "datasets", "(", "GEO", "accessions", "GSE69304", "and", "GSE49952", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A, Genome browser image of ChIP-seq for middle and tail Mediator subunits and H3K4me3 HiChIP tracks before and after induction of ER stress at ER stress response gene BHLHE40. H3K4me1 and H3K27ac tracks are from the ENCODE Consortium (GEO accessions GSM945858 and GSM945853). ATF4/Xbp1s binding sites are from publicly available datasets (GEO accessions GSE69304 and GSE49952)."}
{"words": ["Figure", "1B", "-", "F", "Live", "confocal", "images", "of", "ddaC", "clones", "expressing", "mCD8", ":", ":", "GFP", "driven", "by", "ppk", "-", "Gal4", "at", "WP", "stage", "or", "16", "h", "APF", ".", "l", "(", "3", ")", "810", "and", "l", "(", "3", ")", "924", "mutant", "ddaC", "clones", "(", "C", ",", "E", ")", "displayed", "dendrite", "arborization", "defects", "at", "WP", "stage", "and", "pruning", "defects", "at", "16", "h", "APF", ".", "(", "D", ",", "F", ")", "Introduction", "of", "one", "genomic", "construct", "of", "msps", ",", "HN267", "/", "g", "-", "msps", ",", "rescued", "dendrite", "pruning", "defects", "in", "msps810", "and", "msps924", "clones", ".", "Red", "arrowheads", "point", "to", "the", "ddaC", "somas", ".", "G", "Percentages", "of", "ddaC", "clones", "showing", "severing", "defects", "at", "16", "h", "APF", ".", "H", "Quantitative", "analysis", "of", "unpruned", "dendrite", "lengths", "at", "16", "h", "APF", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B-F Live confocal images of ddaC clones expressing mCD8::GFP driven by ppk-Gal4 at WP stage or 16 h APF. l(3)810 and l(3)924 mutant ddaC clones (C, E) displayed dendrite arborization defects at WP stage and pruning defects at 16 h APF. (D, F) Introduction of one genomic construct of msps, HN267/g-msps, rescued dendrite pruning defects in msps810 and msps924 clones. Red arrowheads point to the ddaC somas.G Percentages of ddaC clones showing severing defects at 16 h APF.H Quantitative analysis of unpruned dendrite lengths at 16 h APF."}
{"words": ["Figure", "2A", "Pan", "-", "neuronal", "driver", "elav", "-", "Gal4", "was", "used", "to", "co", "-", "express", "GFP", "-", "Msps", "and", "TACC", "in", "postmitotic", "neurons", ".", "elav", "-", "Gal4", "driven", "mCD8", ":", ":", "GFP", "expression", "was", "used", "as", "a", "control", ".", "TACC", "was", "pulled", "down", "by", "GFP", "-", "Msps", "but", "not", "by", "mCD8", ":", ":", "GFP", ".", "Alpha", "-", "tubulin", "was", "used", "as", "a", "loading", "and", "probing", "control", ".", "Neither", "mCD8", ":", ":", "GFP", "nor", "GFP", "-", "Msps", "could", "pull", "down", "alpha", "-", "tubulin", ".", "B", "Endogenous", "Msps", "proteins", "were", "co", "-", "immunoprecipitated", "with", "Venus", "-", "TACC", "by", "GFP", "beads", "but", "not", "by", "control", "IgG", "beads", ".", "Alpha", "-", "tubulin", "was", "used", "as", "loading", "and", "probing", "control", ".", "C", "Endogenous", "Msps", "or", "TACC", "was", "pulled", "down", "by", "their", "respective", "antibodies", ",", "and", "the", "other", "protein", "was", "simultaneously", "detected", "in", "the", "immunoprecipitated", "contents", ".", "Alpha", "-", "tubulin", "was", "used", "as", "loading", "and", "probing", "control", ".", "D", "-", "G", "Confocal", "images", "of", "ddaC", "neurons", "expressing", "control", "RNAi", "(", "D", ")", ",", "msps", "RNAi", "(", "E", ")", ",", "tacc", "RNAi", "(", "F", ")", "and", "αTub84B", "RNAi", "(", "G", ")", "that", "were", "immunostained", "for", "TACC", "at", "wL3", "stage", ".", "ddaC", "somas", "are", "labeled", "by", "dashed", "lines", ".", "ddaC", "neurons", "are", "identified", "by", "ppk", "-", "Gal4", "driven", "mCD8", ":", ":", "GFP", "(", "green", "channel", ")", "expression", ",", "as", "shown", "at", "the", "top", "right", "corner", ".", "H", "Quantitative", "analysis", "of", "normalized", "TACC", "fluorescence", "intensity", "in", "ddaC", "somas", ".", "I", "-", "L", "Confocal", "images", "of", "ddaC", "neurons", "expressing", "control", "RNAi", "(", "I", ")", ",", "msps", "RNAi", "(", "J", ")", ",", "tacc", "RNAi", "(", "K", ")", "and", "αTub84B", "RNAi", "(", "L", ")", "that", "were", "immunostained", "for", "Msps", "at", "wL3", "stage", ".", "ddaC", "somas", "are", "labeled", "by", "dashed", "lines", ".", "ddaC", "neurons", "are", "identified", "by", "ppk", "-", "Gal4", "driven", "mCD8", ":", ":", "GFP", "(", "green", "channel", ")", "expression", ",", "as", "shown", "at", "the", "top", "right", "corner", ".", "M", "Quantitative", "analysis", "of", "normalized", "Msps", "fluorescence", "intensity", "in", "ddaC", "somas", ".", "N", ",", "O", "Protein", "expression", "of", "Msps", "and", "TACC", "in", "brain", "tissues", ".", "(", "N", ")", "Larval", "brains", "of", "msps810", "/", "mspsP", "transheterozygotes", "at", "early", "wL3", "stage", "were", "immunoblotted", "and", "probed", "with", "α", "-", "Msps", "and", "α", "-", "TACC", "antibody", ".", "Actin", "blotting", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "The", "dot", "plot", "on", "the", "right", "depicts", "the", "quantitative", "analysis", "of", "total", "TACC", "levels", "in", "control", "and", "msps", "transheterozygous", "larvae", ".", "O", "Protein", "expression", "of", "Msps", "and", "TACC", "in", "brain", "tissues", ".", "(", "O", ")", "Adult", "brains", "of", "tacc59", "/", "tacc74", "transheterozygotes", "were", "immunoblotted", "and", "probed", "with", "α", "-", "Msps", "and", "α", "-", "TACC", "antibody", ".", "Actin", "blotting", "was", "used", "as", "loading", "and", "probing", "control", ".", "The", "dot", "plot", "on", "the", "right", "displays", "the", "quantitative", "analysis", "of", "total", "Msps", "level", "in", "control", "and", "tacc", "transheterozygotes", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Pan-neuronal driver elav-Gal4 was used to co-express GFP-Msps and TACC in postmitotic neurons. elav-Gal4 driven mCD8::GFP expression was used as a control. TACC was pulled down by GFP-Msps but not by mCD8::GFP. Alpha-tubulin was used as a loading and probing control. Neither mCD8::GFP nor GFP-Msps could pull down alpha-tubulin.B Endogenous Msps proteins were co-immunoprecipitated with Venus-TACC by GFP beads but not by control IgG beads. Alpha-tubulin was used as loading and probing control.C Endogenous Msps or TACC was pulled down by their respective antibodies, and the other protein was simultaneously detected in the immunoprecipitated contents. Alpha-tubulin was used as loading and probing control.D-G Confocal images of ddaC neurons expressing control RNAi (D), msps RNAi (E), tacc RNAi (F) and αTub84B RNAi (G) that were immunostained for TACC at wL3 stage. ddaC somas are labeled by dashed lines. ddaC neurons are identified by ppk-Gal4 driven mCD8::GFP (green channel) expression, as shown at the top right corner.H Quantitative analysis of normalized TACC fluorescence intensity in ddaC somas.I-L Confocal images of ddaC neurons expressing control RNAi (I), msps RNAi (J), tacc RNAi (K) and αTub84B RNAi (L) that were immunostained for Msps at wL3 stage. ddaC somas are labeled by dashed lines. ddaC neurons are identified by ppk-Gal4 driven mCD8::GFP (green channel) expression, as shown at the top right corner.M Quantitative analysis of normalized Msps fluorescence intensity in ddaC somas.N, O Protein expression of Msps and TACC in brain tissues. (N) Larval brains of msps810/mspsP transheterozygotes at early wL3 stage were immunoblotted and probed with α-Msps and α-TACC antibody. Actin blotting was used as loading control. The dot plot on the right depicts the quantitative analysis of total TACC levels in control and msps transheterozygous larvae.O Protein expression of Msps and TACC in brain tissues. (O) Adult brains of tacc59/ tacc74 transheterozygotes were immunoblotted and probed with α-Msps and α-TACC antibody. Actin blotting was used as loading and probing control. The dot plot on the right displays the quantitative analysis of total Msps level in control and tacc transheterozygotes."}
{"words": ["Figure", "3A", "-", "C", "Live", "confocal", "images", "of", "ddaC", "neurons", "visualized", "by", "ppk", "-", "Gal4", "driven", "mCD8", ":", ":", "GFP", "expression", "at", "WP", "or", "16", "h", "APF", ".", "While", "expression", "of", "control", "RNAi", "in", "ddaC", "neurons", "(", "A", ")", "did", "not", "affect", "the", "dendrite", "morphogenesis", "nor", "the", "pruning", "processes", ",", "knockdown", "of", "tacc", "using", "RNAi", "#", "1", "(", "B", ")", "or", "tacc59", "/", "tacc74", "transheterozygous", "mutant", "(", "C", ")", "severely", "perturbed", "the", "dendrite", "arborization", "as", "well", "as", "pruning", ".", "Red", "arrowheads", "point", "to", "the", "ddaC", "somas", ".", "D", "Percentages", "of", "ddaC", "neurons", "showing", "severing", "defects", "in", "(", "A", "-", "C", ")", "at", "16", "h", "APF", ".", "E", "Quantitative", "analysis", "of", "unpruned", "dendrite", "lengths", "in", "(", "A", "-", "C", ")", "at", "16", "h", "APF", ".", "F", "-", "H", "Live", "confocal", "images", "of", "ddaC", "neurons", "visualized", "by", "ppk", "-", "Gal4", "driven", "mCD8", ":", ":", "GFP", "expression", "at", "WP", "or", "16", "h", "APF", ".", "Simultaneous", "knockdown", "of", "tacc", "and", "msps", "via", "co", "-", "expressing", "tacc", "RNAi", "and", "msps", "RNAi", "(", "H", ")", "in", "the", "ddaC", "neurons", "did", "not", "enhance", "the", "pruning", "defects", ",", "compared", "to", "those", "neurons", "co", "-", "expressing", "control", "RNAi", "and", "msps", "RNAi", "(", "F", ")", ".", "Red", "arrowheads", "point", "to", "the", "ddaC", "somas", ".", "I", "Percentages", "of", "ddaC", "neurons", "showing", "severing", "defects", "in", "(", "F", "-", "H", ")", "at", "16", "h", "APF", ".", "J", "Quantitative", "analysis", "of", "unpruned", "dendrite", "lengths", "in", "(", "F", "-", "H", ")", "at", "16", "h", "APF", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A-C Live confocal images of ddaC neurons visualized by ppk-Gal4 driven mCD8::GFP expression at WP or 16 h APF. While expression of control RNAi in ddaC neurons (A) did not affect the dendrite morphogenesis nor the pruning processes, knockdown of tacc using RNAi #1 (B) or tacc59/tacc74 transheterozygous mutant (C) severely perturbed the dendrite arborization as well as pruning. Red arrowheads point to the ddaC somas.D Percentages of ddaC neurons showing severing defects in (A-C) at 16 h APF.E Quantitative analysis of unpruned dendrite lengths in (A-C) at 16 h APF.F-H Live confocal images of ddaC neurons visualized by ppk-Gal4 driven mCD8::GFP expression at WP or 16 h APF. Simultaneous knockdown of tacc and msps via co-expressing tacc RNAi and msps RNAi (H) in the ddaC neurons did not enhance the pruning defects, compared to those neurons co-expressing control RNAi and msps RNAi (F). Red arrowheads point to the ddaC somas.I Percentages of ddaC neurons showing severing defects in (F-H) at 16 h APF.J Quantitative analysis of unpruned dendrite lengths in (F-H) at 16 h APF."}
{"words": ["Figure", "4Confocal", "images", "of", "ddaC", "neurons", "expressing", "UAS", "-", "mCD8", ":", ":", "GFP", ",", "UAS", "-", "Nod", "-", "lacZ", "or", "UAS", "-", "Kin", "-", "lacZ", "and", "immunostained", "for", "β", "-", "galactosidase", "at", "wL3", "stages", ".", "(", "A", "-", "C", ")", "Wild", "-", "type", "ddaC", "neurons", "(", "A", ")", "displayed", "normal", "distribution", "of", "Nod", "-", "lacZ", "signals", "in", "dendrites", ".", "In", "contrast", ",", "in", "msps810", "mutants", "(", "B", ")", "and", "tacc59", "/", "tacc74", "mutants", "(", "C", ")", ",", "ddaC", "neurons", "exhibited", "altered", "Nod", "-", "lacZ", "distribution", "patterns", ",", "with", "highly", "enriched", "stainings", "in", "the", "somas", "and", "decreased", "signals", "in", "the", "dendrites", ".", "Confocal", "images", "of", "ddaC", "neurons", "(", "D", "-", "F", ")", "Kin", "-", "lacZ", "signals", "were", "present", "in", "axons", "but", "not", "detectable", "in", "dendrites", "of", "the", "control", "ddaC", "neurons", "(", "D", ")", ",", "whereas", "part", "of", "the", "Kin", "-", "lacZ", "were", "mislocalized", "to", "dendrites", "in", "msps", "RNAi", "(", "E", ")", "and", "tacc", "RNAi", "(", "F", ")", "ddaC", "neurons", ".", "Asterisks", "indicate", "the", "location", "of", "ddaC", "somas", ".", "White", "arrows", "indicate", "the", "location", "of", "axons", ".", "Curly", "brackets", "mark", "the", "dendritic", "regions", "where", "fluorescence", "intensity", "of", "Nod", "-", "lacZ", "was", "measured", ".", "White", "arrowheads", "point", "to", "dendritically", "localized", "Kin", "-", "lacZ", "signals", ".", "G", "Percentages", "of", "ddaC", "neurons", "showing", "defective", "Nod", "-", "lacZ", "distribution", "in", "mutants", "or", "RNAi", "-", "expressing", "neurons", ".", "H", "Quantitative", "analysis", "of", "normalized", "Nod", "-", "lacZ", "intensity", "for", "20", "μm", "of", "major", "dendrite", "located", "40", "μm", "away", "from", "the", "soma", ".", "I", "Percentages", "of", "ddaC", "neurons", "showing", "defective", "Kin", "-", "lacZ", "distribution", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Confocal images of ddaC neurons expressing UAS-mCD8::GFP, UAS-Nod-lacZ or UAS-Kin-lacZ and immunostained for β-galactosidase at wL3 stages. (A-C) Wild-type ddaC neurons (A) displayed normal distribution of Nod-lacZ signals in dendrites. In contrast, in msps810 mutants (B) and tacc59/tacc74 mutants (C), ddaC neurons exhibited altered Nod-lacZ distribution patterns, with highly enriched stainings in the somas and decreased signals in the dendrites.Confocal images of ddaC neurons (D-F) Kin-lacZ signals were present in axons but not detectable in dendrites of the control ddaC neurons (D), whereas part of the Kin-lacZ were mislocalized to dendrites in msps RNAi (E) and tacc RNAi (F) ddaC neurons. Asterisks indicate the location of ddaC somas. White arrows indicate the location of axons. Curly brackets mark the dendritic regions where fluorescence intensity of Nod-lacZ was measured. White arrowheads point to dendritically localized Kin-lacZ signals.G Percentages of ddaC neurons showing defective Nod-lacZ distribution in mutants or RNAi-expressing neurons.H Quantitative analysis of normalized Nod-lacZ intensity for 20 μm of major dendrite located 40 μm away from the soma.I Percentages of ddaC neurons showing defective Kin-lacZ distribution."}
{"words": ["Figure", "5A", "-", "F", "Representative", "kymographs", "depicting", "EB1", "comet", "movement", "patterns", "in", "the", "proximal", "dendrites", "of", "ddaC", "neurons", "at", "96", "h", "AEL", ".", "Horizontal", "arrow", "indicates", "the", "direction", "towards", "the", "somas", ",", "and", "vertical", "arrow", "indicates", "the", "time", ".", "EB1", ":", ":", "GFP", "expression", "was", "driven", "under", "Gal44", "-", "77", ".", "In", "the", "control", "ddaC", "neurons", "(", "A", ",", "D", ")", ",", "EB1", "comets", "move", "predominantly", "in", "retrograde", "direction", ".", "EB1", "comets", "were", "largely", "diminished", "in", "msps810", "/", "mspsP", "mutant", "neurons", "(", "B", ")", ".", "Interestingly", ",", "in", "msps810", "/", "mspsP18", "mutants", "(", "C", ")", ",", "tacc", "RNAi", "(", "E", ")", "and", "tacc59", "/", "tacc74", "mutant", "(", "F", ")", ",", "increased", "anterograde", "comets", "were", "detected", "in", "ddaC", "dendrites", ".", "G", "-", "J", "Quantitative", "analysis", "of", "the", "percentages", "of", "anterograde", "EB1", ":", ":", "GFP", "comets", ",", "the", "track", "length", ",", "the", "number", "(", "per", "30", "µm", ")", "and", "the", "velocity", "of", "the", "comets", "in", "each", "neuron", "imaged", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A-F Representative kymographs depicting EB1 comet movement patterns in the proximal dendrites of ddaC neurons at 96 h AEL. Horizontal arrow indicates the direction towards the somas, and vertical arrow indicates the time. EB1::GFP expression was driven under Gal44-77. In the control ddaC neurons (A, D), EB1 comets move predominantly in retrograde direction. EB1 comets were largely diminished in msps810/mspsP mutant neurons (B). Interestingly, in msps810/mspsP18 mutants (C), tacc RNAi (E) and tacc59/tacc74 mutant (F), increased anterograde comets were detected in ddaC dendrites.G-J Quantitative analysis of the percentages of anterograde EB1::GFP comets, the track length, the number (per 30 µm) and the velocity of the comets in each neuron imaged."}
{"words": ["Figure", "6A", "-", "F", "Confocal", "images", "of", "ddaC", "neurons", "expressing", "UAS", "-", "mCD8", ":", ":", "GFP", "(", "Green", "channel", ")", ",", "UAS", "-", "Nod", "-", "lacZ", "and", "immunostained", "for", "β", "-", "galactosidase", "at", "wL3", "stages", ".", "Simultaneous", "knockdown", "of", "klp10A", "and", "msps", "(", "B", ")", "significantly", "restored", "Nod", "-", "lacZ", "localization", "in", "the", "dendrites", ",", "compared", "to", "msps", "and", "control", "RNAi", "(", "A", ")", ".", "ddaC", "neurons", "with", "colchicine", "treatment", "(", "D", ")", "or", "with", "Kat", "-", "60", "overexpression", "(", "F", ")", "exhibited", "perturbed", "Nod", "-", "lacZ", "distribution", "with", "highly", "enriched", "staining", "in", "the", "soma", "and", "decreased", "signals", "in", "the", "dendrites", ".", "Asterisks", "indicate", "the", "location", "of", "ddaC", "somas", ".", "White", "arrows", "indicate", "the", "location", "of", "axons", ".", "Curly", "brackets", "mark", "the", "dendritic", "regions", "where", "fluorescence", "intensity", "of", "Nod", "-", "lacZ", "was", "measured", ".", "G", "-", "L", "Live", "confocal", "images", "of", "ddaC", "neurons", "visualized", "by", "ppk", "-", "Gal4", "driven", "mCD8", ":", ":", "GFP", "expression", "at", "WP", "or", "16", "h", "APF", ".", "Simultaneous", "knockdown", "klp10A", "and", "msps", "(", "H", ")", "almost", "fully", "rescued", "the", "dendrite", "morphological", "defects", "and", "the", "pruning", "defects", "compared", "with", "the", "msps", ",", "control", "RNAi", "neurons", ".", "Wild", "type", "larvae", "fed", "with", "colchicine", "(", "J", ")", "showed", "pruning", "defects", "in", "comparison", "with", "those", "feed", "with", "DMSO", "(", "I", ")", ".", "ddaC", "neurons", "with", "Kat", "-", "60", "overexpression", "(", "L", ")", "exhibited", "abnormal", "dendrite", "arborization", "and", "pruning", "defects", ".", "Red", "arrowheads", "point", "to", "the", "ddaC", "somas", ".", "M", ",", "N", "Quantitative", "analysis", "of", "normalized", "Nod", "-", "lacZ", "intensity", "for", "20", "μm", "of", "major", "dendrite", "located", "55", "μm", "or", "40", "μm", "away", "from", "the", "soma", "respectively", ".", "O", "Percentages", "of", "ddaC", "neurons", "showing", "severing", "defects", "at", "16", "h", "APF", ".", "P", "Quantitative", "analysis", "of", "unpruned", "dendrite", "lengths", "at", "16", "h", "APF", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A-F Confocal images of ddaC neurons expressing UAS-mCD8::GFP (Green channel), UAS-Nod-lacZ and immunostained for β-galactosidase at wL3 stages. Simultaneous knockdown of klp10A and msps (B) significantly restored Nod-lacZ localization in the dendrites, compared to msps and control RNAi (A). ddaC neurons with colchicine treatment (D) or with Kat-60 overexpression (F) exhibited perturbed Nod-lacZ distribution with highly enriched staining in the soma and decreased signals in the dendrites. Asterisks indicate the location of ddaC somas. White arrows indicate the location of axons. Curly brackets mark the dendritic regions where fluorescence intensity of Nod-lacZ was measured.G-L Live confocal images of ddaC neurons visualized by ppk-Gal4 driven mCD8::GFP expression at WP or 16 h APF. Simultaneous knockdown klp10A and msps (H) almost fully rescued the dendrite morphological defects and the pruning defects compared with the msps, control RNAi neurons. Wild type larvae fed with colchicine (J) showed pruning defects in comparison with those feed with DMSO (I). ddaC neurons with Kat-60 overexpression (L) exhibited abnormal dendrite arborization and pruning defects. Red arrowheads point to the ddaC somas.M, N Quantitative analysis of normalized Nod-lacZ intensity for 20 μm of major dendrite located 55 μm or 40 μm away from the soma respectively.O Percentages of ddaC neurons showing severing defects at 16 h APF.P Quantitative analysis of unpruned dendrite lengths at 16 h APF."}
{"words": ["Figure", "7", "-", "F", "Representative", "kymographs", "depicting", "EB1", "comet", "movement", "patterns", "in", "the", "proximal", "dendrites", "of", "ddaC", "neurons", "at", "96", "h", "AEL", ".", "Horizontal", "arrow", "indicates", "the", "direction", "towards", "the", "somas", ",", "and", "vertical", "arrow", "indicates", "the", "time", ".", "(", "B", ")", "RNAi", "knockdown", "of", "klp10A", "in", "msps810", "/", "mspsP18", "mutants", "restored", "the", "retrograde", "movement", "pattern", "of", "EB1", "comets", ".", "MT", "depolymerization", "or", "severing", "induced", "by", "Colchicine", "treatment", "(", "D", ")", "or", "overexpression", "of", "Kat", "-", "60", "(", "F", ")", "led", "to", "mixed", "MT", "orientation", "in", "ddaC", "neurons", ".", "G", "-", "J", "Quantitative", "analysis", "of", "the", "percentages", "of", "anterograde", "EB1", "comets", ",", "the", "track", "length", ",", "number", "(", "per", "30", "µm", ")", "and", "the", "velocity", "of", "EB1", "comets", "in", "each", "neuron", "imaged", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7-F Representative kymographs depicting EB1 comet movement patterns in the proximal dendrites of ddaC neurons at 96 h AEL. Horizontal arrow indicates the direction towards the somas, and vertical arrow indicates the time. (B) RNAi knockdown of klp10A in msps810/mspsP18 mutants restored the retrograde movement pattern of EB1 comets. MT depolymerization or severing induced by Colchicine treatment (D) or overexpression of Kat-60 (F) led to mixed MT orientation in ddaC neurons.G-J Quantitative analysis of the percentages of anterograde EB1 comets, the track length, number (per 30 µm) and the velocity of EB1 comets in each neuron imaged."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "2D", "STED", "micrographs", "of", "RPE1", "cells", "co", "-", "stained", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "­", "Scale", "bar", ":", "200", "nm", ".", "(", "B", ")", "Dot", "plots", "showing", "the", "average", "pixel", "intensities", "at", "individual", "parent", "centrioles", "expressed", "as", "the", "PIDD1", "/", "ODF2", "fluorescence", "ratio", "in", "the", "indicated", "cell", "lines", "and", "genotypes", ".", "Mean", "values", "(", "red", "lines", ")", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "are", "reported", ".", "N", "≥", "50", "centrosomes", "were", "assessed", "for", "each", "condition", ",", "a", ".", "u", ".", "=", "arbitrary", "units", ".", "Unpaired", "Mann", "-", "Whitney", "test", "(", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ")", ".", "(", "C", ")", "Representative", "fluorescence", "micrographs", "from", "the", "indicated", "cell", "lines", "co", "-", "stained", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Blow", "-", "ups", "without", "Hoechst", "33342", "are", "magnified", "2", ".", "5X", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "μm", ".", "(", "D", ")", "Co", "-", "localization", "between", "ODF2", "and", "PIDD1", "(", "n", "=", "11", ")", ",", "FBF1", "and", "PIDD1", "(", "n", "=", "21", ")", ",", "and", "ANKRD26", "and", "PIDD1", "(", "n", "=", "17", ")", "assessed", "on", "images", "The", "value", "represents", "the", "fraction", "PIDD1", "objects", "touching", "either", "ODF2", ",", "FBF1", "or", "ANKRD26", "objects", ".", "(", "E", ")", "2D", "STED", "micrographs", "of", "RPE1", "cells", "co", "-", "stained", "with", "the", "indicated", "antibodies", ",", "scale", "bar", ":", "200", "nm", ".", "(", "F", ")", "Representative", "fluorescence", "micrographs", "of", "RPE1", "cells", "of", "the", "indicated", "genotypes", "co", "-", "stained", "with", "indicated", "antibodies", ".", "Blow", "-", "ups", "without", "Hoechst", "33342", "are", "magnified", "2", ".", "5X", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "μm", ".", "(", "G", ")", "Dot", "plot", "showing", "the", "average", "pixel", "intensities", "at", "individual", "parent", "centrioles", "expressed", "as", "the", "PIDD1", "/", "CEP128", "fluorescence", "ratio", "in", "RPE1", "of", "the", "indicated", "genotypes", ".", "Mean", "values", "(", "red", "lines", ")", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "are", "reported", ".", "N", "≥", "50", "centrosomes", "were", "assessed", "from", "as", "many", "individual", "cells", "for", "each", "condition", ",", "a", ".", "u", ".", "=", "arbitrary", "units", ".", "Statistical", "significance", "was", "assessed", "by", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", ",", "comparing", "each", "sample", "to", "the", "wild", "type", "(", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) 2D STED micrographs of RPE1 cells co-stained with the indicated antibodies. ­Scale bar: 200 nm.(B) Dot plots showing the average pixel intensities at individual parent centrioles expressed as the PIDD1/ODF2 fluorescence ratio in the indicated cell lines and genotypes. Mean values (red lines) ± s.e.m. are reported. N ≥ 50 centrosomes were assessed for each condition, a.u. = arbitrary units. Unpaired Mann-Whitney test (****P < 0.0001).(C) Representative fluorescence micrographs from the indicated cell lines co-stained with the indicated antibodies. Blow-ups without Hoechst 33342 are magnified 2.5X. Scale bar: 5 μm.(D) Co-localization between ODF2 and PIDD1 (n = 11), FBF1 and PIDD1 (n = 21), and ANKRD26 and PIDD1 (n = 17) assessed on images The value represents the fraction PIDD1 objects touching either ODF2, FBF1 or ANKRD26 objects.(E) 2D STED micrographs of RPE1 cells co-stained with the indicated antibodies, scale bar: 200 nm.(F) Representative fluorescence micrographs of RPE1 cells of the indicated genotypes co-stained with indicated antibodies. Blow-ups without Hoechst 33342 are magnified 2.5X. Scale bar: 5 μm.(G) Dot plot showing the average pixel intensities at individual parent centrioles expressed as the PIDD1/CEP128 fluorescence ratio in RPE1 of the indicated genotypes. Mean values (red lines) ± s.e.m. are reported. N ≥ 50 centrosomes were assessed from as many individual cells for each condition, a.u. = arbitrary units. Statistical significance was assessed by Kruskal-Wallis test, comparing each sample to the wild type (****P < 0.0001)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "B", ")", "Representative", "fluorescent", "micrographs", "of", "RPE1", "cells", "of", "the", "indicated", "genotypes", ",", "either", "transduced", "with", "the", "indicated", "lentiviral", "vectors", "or", "left", "untransduced", "(", "mock", ")", ".", "Cells", "were", "co", "-", "stained", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Blow", "-", "ups", "without", "Hoechst", "33342", "are", "magnified", "2", ".", "5X", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "μm", ".", "(", "C", ")", "Dot", "plot", "showing", "the", "average", "pixel", "intensities", "of", "the", "Myc", "signal", "at", "individual", "parent", "centrioles", "in", "RPE1", "cells", "of", "the", "indicated", "genotypes", ",", "either", "transduced", "with", "the", "indicated", "lentiviral", "vectors", "or", "left", "untransduced", "(", "mock", ")", ".", "Mean", "values", "(", "red", "lines", ")", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "are", "reported", ".", "N", ">", "50", "centrosomes", "were", "assessed", "for", "each", "condition", "in", "as", "many", "individual", "cells", ";", "a", ".", "u", ".", "=", "arbitrary", "units", ".", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "(", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "n", ".", "s", ".", "=", "non", "-", "significant", ")", ".", "(", "D", ")", "Dot", "plot", "showing", "the", "average", "pixel", "intensities", "of", "the", "PIDD1", "signal", "at", "individual", "parent", "centrioles", "in", "RPE1", "cells", "of", "the", "indicated", "genotypes", ",", "either", "transduced", "with", "the", "indicated", "lentiviral", "vectors", "or", "left", "untransduced", "(", "mock", ")", ".", "Mean", "values", "(", "red", "lines", ")", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "are", "reported", ".", "N", ">", "50", "centrosomes", "were", "assessed", "for", "each", "condition", "in", "as", "many", "individual", "cells", ";", "a", ".", "u", ".", "=", "arbitrary", "units", ".", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "(", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "n", ".", "s", ".", "=", "non", "-", "significant", ")", ".", "(", "E", ")", "Representative", "fluorescent", "micrographs", "of", "RPE1", "cells", "of", "the", "indicated", "genotypes", ",", "either", "transduced", "with", "the", "indicated", "lentiviral", "vectors", "or", "left", "untransduced", "(", "mock", ")", ".", "Cells", "were", "co", "-", "stained", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Blow", "-", "ups", "without", "Hoechst", "33342", "are", "magnified", "2", ".", "5X", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(B) Representative fluorescent micrographs of RPE1 cells of the indicated genotypes, either transduced with the indicated lentiviral vectors or left untransduced (mock). Cells were co-stained with the indicated antibodies. Blow-ups without Hoechst 33342 are magnified 2.5X. Scale bar: 5 μm.(C) Dot plot showing the average pixel intensities of the Myc signal at individual parent centrioles in RPE1 cells of the indicated genotypes, either transduced with the indicated lentiviral vectors or left untransduced (mock). Mean values (red lines) ± s.e.m. are reported. N > 50 centrosomes were assessed for each condition in as many individual cells; a.u. = arbitrary units. Kruskal-Wallis test (****P < 0.0001; n.s. = non-significant).(D) Dot plot showing the average pixel intensities of the PIDD1 signal at individual parent centrioles in RPE1 cells of the indicated genotypes, either transduced with the indicated lentiviral vectors or left untransduced (mock). Mean values (red lines) ± s.e.m. are reported. N > 50 centrosomes were assessed for each condition in as many individual cells; a.u. = arbitrary units. Kruskal-Wallis test (****P < 0.0001; n.s. = non-significant).(E) Representative fluorescent micrographs of RPE1 cells of the indicated genotypes, either transduced with the indicated lentiviral vectors or left untransduced (mock). Cells were co-stained with the indicated antibodies. Blow-ups without Hoechst 33342 are magnified 2.5X. Scale bar: 5 μm."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "RPE1", "cells", "of", "the", "indicated", "genotypes", "were", "treated", "either", "with", "DMSO", "or", "with", "DHCB", "for", "24h", ".", "A", "fraction", "of", "DHCB", "treated", "cells", "were", "released", "into", "fresh", "medium", "for", "other", "24h", "(", "release", ")", ".", "Samples", "were", "subjected", "to", "immunoblotting", ";", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "(", "B", ")", "Fluorescence", "micrographs", "of", "RPE1", "cells", "of", "the", "indicated", "genotypes", ",", "either", "treated", "for", "24h", "with", "DHCB", "or", "with", "vehicle", "alone", "(", "DMSO", ")", ".", "Blow", "-", "up", "without", "Hoechst", "33342", "is", "magnified", "2", ".", "5X", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "μm", ".", "(", "C", ")", "Immunofluorescence", "micrographs", "of", "RPE1", "as", "in", "(", "B", ")", "were", "used", "to", "visually", "assess", "the", "percentage", "of", "cells", "presenting", "one", "or", "two", "nuclei", ".", "N", "=", "3", ",", "≥", "50", "cells", "from", "each", "independent", "experiment", ".", "Mean", "values", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "are", "reported", ".", "The", "increase", "in", "the", "number", "of", "binucleated", "cells", "between", "the", "wild", "type", "sample", "and", "all", "the", "other", "genotypes", "was", "assessed", "(", "ANOVA", "test", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "(", "D", ")", "Immunofluorescence", "micrographs", "of", "RPE1", "as", "in", "(", "B", ")", "were", "used", "to", "visual", "score", "the", "number", "of", "centrosomes", "per", "cell", "by", "counting", "the", "number", "of", "γ", "-", "tubulin", "-", "positive", "centrioles", ".", "N", "=", "3", ",", "≥", "50", "cells", "from", "each", "independent", "experiment", ".", "Mean", "values", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "are", "reported", ".", "The", "increase", "in", "the", "number", "of", "cells", "with", ">", "2", "centrosomes", "between", "the", "wild", "type", "sample", "and", "all", "the", "other", "genotypes", "was", "assessed", "(", "ANOVA", "test", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "(", "E", ")", "Quantitative", "assessment", "of", "the", "fraction", "of", "RPE1", "cells", "undergoing", "cytokinesis", "failure", "upon", "DHCB", "treatment", ",", "inferred", "on", "the", "basis", "of", "the", "increase", "of", "ploidies", "≥", "4C", "(", "upper", "panel", ")", ",", "and", "of", "the", "fraction", "of", "the", "abovementioned", "cells", "undergoing", "genome", "reduplication", "upon", "release", "after", "DHCB", "treatment", "(", "lower", "panel", ")", ".", "Individual", "values", "of", "biological", "replicates", ",", "their", "mean", "and", "standard", "deviations", "are", "reported", ".", "(", "F", ")", "RPE1", "cells", "were", "either", "left", "untransduced", "(", "mock", ")", "or", "transduced", "with", "lentiviral", "vectors", "expressing", "the", "indicated", "Myc", "-", "ANKRD26", "constructs", ".", "Subsequently", ",", "cells", "were", "treated", "either", "with", "DMSO", "or", "ZM447439", "for", "24h", "and", "subjected", "to", "immunoblotting", ";", "n", "=", "3", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) RPE1 cells of the indicated genotypes were treated either with DMSO or with DHCB for 24h. A fraction of DHCB treated cells were released into fresh medium for other 24h (release). Samples were subjected to immunoblotting; n = 3 independent experiments.(B) Fluorescence micrographs of RPE1 cells of the indicated genotypes, either treated for 24h with DHCB or with vehicle alone (DMSO). Blow-up without Hoechst 33342 is magnified 2.5X. Scale bar: 5 μm. (C) Immunofluorescence micrographs of RPE1 as in (B) were used to visually assess the percentage of cells presenting one or two nuclei. N = 3, ≥ 50 cells from each independent experiment. Mean values ± s.e.m. are reported. The increase in the number of binucleated cells between the wild type sample and all the other genotypes was assessed (ANOVA test; *P < 0.05). (D) Immunofluorescence micrographs of RPE1 as in (B) were used to visual score the number of centrosomes per cell by counting the number of γ-tubulin-positive centrioles. N = 3, ≥ 50 cells from each independent experiment. Mean values ± s.e.m. are reported. The increase in the number of cells with > 2 centrosomes between the wild type sample and all the other genotypes was assessed (ANOVA test; **P < 0.01). (E) Quantitative assessment of the fraction of RPE1 cells undergoing cytokinesis failure upon DHCB treatment, inferred on the basis of the increase of ploidies ≥ 4C (upper panel), and of the fraction of the abovementioned cells undergoing genome reduplication upon release after DHCB treatment (lower panel). Individual values of biological replicates, their mean and standard deviations are reported.(F) RPE1 cells were either left untransduced (mock) or transduced with lentiviral vectors expressing the indicated Myc-ANKRD26 constructs. Subsequently, cells were treated either with DMSO or ZM447439 for 24h and subjected to immunoblotting; n = 3 independent experiments."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "B", ")", "A549", "cells", "of", "the", "indicated", "genotypes", "were", "either", "left", "untransduced", "(", "mock", ")", "or", "transduced", "with", "lentiviral", "vectors", "expressing", "the", "indicated", "PIDD1", "-", "V5", "derivatives", "and", "subjected", "to", "immunoblotting", ".", "N", "=", "2", "independent", "experiments", ".", "(", "C", ")", "Fluorescence", "micrographs", "of", "A549", "cells", "of", "the", "indicated", "genotypes", "either", "left", "untransduced", "(", "mock", ")", ",", "or", "transduced", "with", "PIDD1", "-", "V5", "lentiviral", "vectors", "and", "co", "-", "stained", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Blow", "-", "ups", "without", "Hoechst", "33342", "are", "magnified", "2", ".", "5X", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "μm", ".", "(", "D", ")", "Dot", "plot", "showing", "the", "average", "V5", "pixel", "intensities", "at", "individual", "parent", "centrioles", "in", "A549", "cells", "of", "the", "indicated", "genotypes", ",", "either", "transduced", "with", "the", "indicated", "lentiviral", "vectors", "or", "left", "untransduced", "(", "mock", ")", ".", "N", ">", "50", "centrosomes", "were", "assessed", "for", "each", "condition", "in", "as", "many", "individual", "cells", ";", "a", ".", "u", ".", "=", "arbitrary", "units", ".", "(", "E", ")", "Dot", "plot", "showing", "the", "average", "V5", "pixel", "intensities", "at", "individual", "parent", "centrioles", "in", "A549", "cells", "of", "the", "indicated", "genotypes", ",", "either", "transduced", "with", "the", "indicated", "lentiviral", "vectors", "or", "left", "untransduced", "(", "mock", ")", ".", "N", ">", "50", "centrosomes", "were", "assessed", "for", "each", "condition", "in", "as", "many", "individual", "cells", ";", "a", ".", "u", ".", "=", "arbitrary", "units", ".", "(", "F", ")", "Representative", "fluorescence", "micrographs", "of", "A549", "cells", "of", "the", "indicated", "genotypes", ".", "Cells", "were", "either", "left", "untransduced", "(", "mock", ")", "or", "transduced", "with", "PIDD1", "-", "V5", "lentiviral", "vectors", "expressing", "the", "PIDD1", "non", "-", "cleavable", "derivative", "(", "PIDD1S446A", "-", "S588A", ")", "or", "truncations", "thereof", ".", "Blow", "-", "ups", "without", "Hoechst", "33342", "are", "magnified", "2", ".", "5X", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(B) A549 cells of the indicated genotypes were either left untransduced (mock) or transduced with lentiviral vectors expressing the indicated PIDD1-V5 derivatives and subjected to immunoblotting. N = 2 independent experiments.(C) Fluorescence micrographs of A549 cells of the indicated genotypes either left untransduced (mock), or transduced with PIDD1-V5 lentiviral vectors and co- stained with the indicated antibodies. Blow-ups without Hoechst 33342 are magnified 2.5X. Scale bar: 5 μm.(D) Dot plot showing the average V5 pixel intensities at individual parent centrioles in A549 cells of the indicated genotypes, either transduced with the indicated lentiviral vectors or left untransduced (mock). N > 50 centrosomes were assessed for each condition in as many individual cells; a.u. = arbitrary units. (E) Dot plot showing the average V5 pixel intensities at individual parent centrioles in A549 cells of the indicated genotypes, either transduced with the indicated lentiviral vectors or left untransduced (mock). N > 50 centrosomes were assessed for each condition in as many individual cells; a.u. = arbitrary units.(F) Representative fluorescence micrographs of A549 cells of the indicated genotypes. Cells were either left untransduced (mock) or transduced with PIDD1-V5 lentiviral vectors expressing the PIDD1 non-cleavable derivative (PIDD1S446A-S588A) or truncations thereof. Blow-ups without Hoechst 33342 are magnified 2.5X. Scale bar: 5 μm."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "A549", "cells", "of", "the", "indicated", "genotypes", "were", "either", "left", "untransduced", "or", "transduced", "with", "a", "lentiviral", "vector", "expressing", "PIDD1", "-", "V5", "in", "its", "wild", "type", "form", ".", "Cells", "were", "treated", "either", "with", "DMSO", "or", "with", "ZM447439", "for", "24h", "and", "subjected", "to", "immunoblotting", ".", "N", "=", "2", "independent", "experiments", ".", "(", "B", ",", "C", ")", "A549", "cells", "of", "the", "indicated", "genotypes", "were", "either", "left", "untransduced", "(", "mock", ")", ",", "or", "transduced", "with", "lentiviral", "vectors", "expressing", "PIDD1", "-", "V5", "in", "its", "wild", "type", "form", "or", "carrying", "the", "indicated", "point", "mutations", ".", "Cells", "were", "treated", "either", "with", "DMSO", "or", "with", "ZM447439", "for", "24h", "and", "subjected", "to", "immunoblotting", ".", "N", "=", "2", "independent", "experiments", ".", "(", "D", ")", "Fluorescence", "micrographs", "of", "A549", "cells", "of", "the", "indicated", "genotypes", ".", "Cells", "were", "either", "left", "untransduced", "(", "mock", ")", "or", "transduced", "with", "PIDD1", "-", "V5", "lentiviral", "vectors", "carrying", "the", "indicated", "point", "mutations", ",", "and", "stained", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Blow", "-", "ups", "without", "Hoechst", "33342", "are", "magnified", "2", ".", "5X", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) A549 cells of the indicated genotypes were either left untransduced or transduced with a lentiviral vector expressing PIDD1-V5 in its wild type form. Cells were treated either with DMSO or with ZM447439 for 24h and subjected to immunoblotting. N = 2 independent experiments.(B,C) A549 cells of the indicated genotypes were either left untransduced (mock), or transduced with lentiviral vectors expressing PIDD1-V5 in its wild type form or carrying the indicated point mutations. Cells were treated either with DMSO or with ZM447439 for 24h and subjected to immunoblotting. N = 2 independent experiments.(D) Fluorescence micrographs of A549 cells of the indicated genotypes. Cells were either left untransduced (mock) or transduced with PIDD1-V5 lentiviral vectors carrying the indicated point mutations, and stained with the indicated antibodies. Blow-ups without Hoechst 33342 are magnified 2.5X. Scale bar: 5 μm."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Representative", "fluorescence", "micrographs", "across", "the", "indicated", "cell", "cycle", "phases", "from", "RPE1", "cells", "stably", "expressing", "CETN1", "-", "GFP", ".", "Centrosomal", "antigens", "were", "stained", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Blow", "-", "ups", "without", "Hoechst", "33342", "are", "magnified", "2", ".", "5X", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "μm", ".", "The", "centrioles", "subjected", "to", "fluorescence", "intensity", "measurement", "in", "(", "B", ")", "are", "labelled", "with", "numbers", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "the", "PIDD1", "average", "pixel", "intensity", "at", "individual", "centrioles", "across", "the", "indicated", "cell", "cycle", "phases", "of", "RPE1", "cells", "stained", "N", ">", "50", "centrioles", "were", "assessed", "for", "each", "phase", ",", "a", ".", "u", ".", "=", "arbitrary", "units", ".", "(", "C", ")", "Fluorescence", "micrographs", "of", "RPE1", "cells", "stably", "expressing", "CETN1", "-", "GFP", "treated", "either", "with", "DMSO", "or", "with", "DHCB", "for", "24h", ".", "Blow", "-", "ups", "33342", "are", "magnified", "2", ".", "5X", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "μm", ".", "(", "D", ")", "Dot", "plot", "showing", "PIDD1", "average", "pixel", "intensities", "at", "individual", "parent", "centrioles", "calculated", "from", "images", "as", "in", "(", "C", ")", ".", "Mean", "values", "(", "red", "lines", ")", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "are", "reported", ".", "N", ">", "50", "centrosomes", "were", "assessed", "for", "each", "condition", ",", "a", ".", "u", ".", "=", "arbitrary", "units", ".", "(", "E", ")", "Movie", "stills", "of", "a", "representative", "RPE1", "cell", "stably", "expressing", "CETN1", "-", "GFP", "treated", "with", "DHCB", "and", "subjected", "to", "time", "-", "lapse", "video", "microscopy", "in", "the", "presence", "of", "SiR", "-", "DNA", ".", "Time", "is", "expressed", "in", "minutes", ",", "relative", "to", "anaphase", "onset", ".", "The", "dashed", "line", "indicates", "the", "plasma", "membrane", "of", "the", "cell", "of", "interest", ",", "arrowheads", "indicate", "the", "centrosomes", "'", "position", ".", "(", "F", ")", "Centrosomal", "distance", "over", "time", "in", "RPE1", "cells", "stably", "expressing", "CETN1", "-", "GFP", "and", "treated", "with", "DHCB", ".", "Time", "zero", "corresponds", "to", "the", "frame", "preceding", "anaphase", "onset", ".", "Coloured", "dots", "(", "lower", "panel", ")", "summarize", "the", "clustering", "time", "for", "each", "cell", ",", "mean", "±", "standard", "deviation", "in", "black", ".", "Data", "calculated", "from", "four", "-", "dimensional", "imaging", "as", "in", "(", "E", ")", ".", "N", "=", "10", "cells", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Representative fluorescence micrographs across the indicated cell cycle phases from RPE1 cells stably expressing CETN1-GFP. Centrosomal antigens were stained with the indicated antibodies. Blow-ups without Hoechst 33342 are magnified 2.5X. Scale bar: 5 μm.The centrioles subjected to fluorescence intensity measurement in (B) are labelled with numbers. (B) Quantification of the PIDD1 average pixel intensity at individual centrioles across the indicated cell cycle phases of RPE1 cells stained N > 50 centrioles were assessed for each phase, a.u. = arbitrary units.(C) Fluorescence micrographs of RPE1 cells stably expressing CETN1-GFP treated either with DMSO or with DHCB for 24h. Blow-ups 33342 are magnified 2.5X. Scale bar: 5 μm. (D) Dot plot showing PIDD1 average pixel intensities at individual parent centrioles calculated from images as in (C). Mean values (red lines) ± s.e.m. are reported. N > 50 centrosomes were assessed for each condition, a.u. = arbitrary units. (E) Movie stills of a representative RPE1 cell stably expressing CETN1-GFP treated with DHCB and subjected to time-lapse video microscopy in the presence of SiR-DNA. Time is expressed in minutes, relative to anaphase onset. The dashed line indicates the plasma membrane of the cell of interest, arrowheads indicate the centrosomes' position.(F) Centrosomal distance over time in RPE1 cells stably expressing CETN1-GFP and treated with DHCB. Time zero corresponds to the frame preceding anaphase onset. Coloured dots (lower panel) summarize the clustering time for each cell, mean ± standard deviation in black. Data calculated from four-dimensional imaging as in (E). N = 10 cells."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Dot", "plot", "showing", "the", "distance", "between", "parent", "centrioles", "pairs", "in", "A549", "cells", "following", "the", "indicated", "treatments", "(", "ZM", "=", "ZM447439", ";", "REV", "=", "reversine", ")", ".", "Nocodazole", "concentrations", "are", "0", ".", "03", "μM", ",", "0", ".", "1", "μM", ",", "0", ".", "33", "μM", ",", "1", "μM", ",", "3", ".", "3", "μM", ".", "Median", "(", "red", ")", "and", "95", "%", "confidence", "interval", "thereof", "(", "black", ")", "are", "shown", ".", "N", ">", "50", "cells", "were", "analysed", ".", "(", "B", ")", "Immunoblot", "of", "A549", "cells", "subjected", "to", "the", "indicated", "treatments", "for", "24h", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "N", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "(", "C", ")", "DNA", "content", "analysis", "of", "A549", "cells", "subjected", "to", "the", "indicated", "treatments", "as", "in", "(", "A", ")", "either", "for", "24h", "(", "left", "panels", ")", "or", "48h", "(", "right", "panels", ")", ".", "N", "=", "2", "independent", "experiments", ".", "(", "E", ")", "Immunoblots", "of", "RPE1", "cells", "synchronized", "(", "F", ")", "Representative", "fluorescence", "micrographs", "of", "RPE1", "cells", "synchronized", "Centrosomal", "antigens", "were", "stained", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Blow", "-", "ups", "without", "Hoechst", "33342", "are", "magnified", "2X", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Dot plot showing the distance between parent centrioles pairs in A549 cells following the indicated treatments (ZM = ZM447439; REV = reversine). Nocodazole concentrations are 0.03 μM, 0.1 μM, 0.33 μM, 1 μM, 3.3 μM. Median (red) and 95% confidence interval thereof (black) are shown. N > 50 cells were analysed. (B) Immunoblot of A549 cells subjected to the indicated treatments for 24h as in (A). N = 3 independent experiments. (C) DNA content analysis of A549 cells subjected to the indicated treatments as in (A) either for 24h (left panels) or 48h (right panels). N = 2 independent experiments. (E) Immunoblots of RPE1 cells synchronized(F) Representative fluorescence micrographs of RPE1 cells synchronized Centrosomal antigens were stained with the indicated antibodies. Blow-ups without Hoechst 33342 are magnified 2X. Scale bar: 5 μm."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "A", ")", "A549", "cells", "of", "the", "indicated", "genotypes", "were", "treated", "for", "24h", "as", "indicated", "(", "CPT", "=", "camptothecin", ",", "ZM", "=", "ZM447439", ")", ".", "Samples", "were", "subjected", "to", "immunoblotting", ";", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ".", "(", "B", ")", "A549", "cells", "treated", "as", "in", "(", "A", ")", "were", "subjected", "to", "fluorescence", "microscopy", "and", "centrosome", "abundance", "was", "assessed", "by", "visually", "scoring", "γ", "-", "tubulin", "-", "positive", "centrioles", "per", "cell", ".", "N", "=", "3", ",", "≥", "50", "cells", "from", "each", "independent", "experiment", ".", "(", "C", ")", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "PIDD1", "mRNA", "expression", "in", "A549", "cells", "upon", "treatment", "with", "increasing", "doses", "of", "Nutlin", "3a", "(", "i", ".", "e", ".", "3", ".", "3", "μM", "or", "10", "μM", ")", "using", "two", "independent", "probes", ".", "The", "average", "fold", "of", "induction", "±", "standard", "deviation", "is", "shown", ".", "N", "=", "3", "biological", "replicates", "with", "two", "technical", "replicates", "each", ".", "Comparisons", "were", "performed", "between", "treatments", "of", "every", "genotype", "and", "the", "corresponding", "treatment", "of", "wild", "type", "(", "WT", ")", "cellswith", "increasing", "doses", "of", "Nutlin", "3a", "(", "i", ".", "e", ".", "3", ".", "3", "μM", "or", "10", "μM", ")", "using", "two", "independent", "probes", ".", "(", "D", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "samples", "treated", "N", "=", "3", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(A) A549 cells of the indicated genotypes were treated for 24h as indicated (CPT = camptothecin, ZM = ZM447439). Samples were subjected to immunoblotting; n = 3 independent experiments. (B) A549 cells treated as in (A) were subjected to fluorescence microscopy and centrosome abundance was assessed by visually scoring γ-tubulin-positive centrioles per cell. N = 3, ≥ 50 cells from each independent experiment.(C) RT-qPCR analysis of PIDD1 mRNA expression in A549 cells upon treatment with increasing doses of Nutlin 3a (i.e. 3.3 μM or 10 μM) using two independent probes. The average fold of induction ± standard deviation is shown. N = 3 biological replicates with two technical replicates each. Comparisons were performed between treatments of every genotype and the corresponding treatment of wild type (WT) cellswith increasing doses of Nutlin 3a (i.e. 3.3 μM or 10 μM) using two independent probes. (D) Immunoblot analysis of samples treated N = 3 independent experiments."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Recombinant", "c10orf76", "directly", "binds", "to", "PI4KB", "in", "vitro", ".", "His", "-", "pulldown", "assays", "of", "baculovirus", "/", "Sf9", "produced", "6xHis", "-", "c10orf76", "(", "3", "μM", ")", "were", "carried", "out", "with", "untagged", "PI4KB", "(", "2", ".", "5", "μM", ")", ".", "(", "B", ")", "PI4KB", "and", "c10orf76", "form", "a", "stable", "complex", ".", "The", "complex", "of", "c10orf76", "-", "PI4KB", "eluted", "from", "a", "S200", "superdex", "10", "/", "300", "GL", "increase", "gel", "filtration", "column", "(", "GE", ")", "at", "a", "volume", "consistent", "with", "a", "heterodimer", "(", "169", "kDa", ")", ",", "while", "c10orf76", "alone", "eluted", "at", "a", "volume", "consistent", "with", "a", "monomer", "(", "79", "kDa", ")", ".", "Lines", "with", "MW", "values", "indicate", "elution", "of", "MW", "standards", "(", "158", "kDa", "aldolase", ",", "75", "kDa", "conalbumin", ")", ".", "(", "C", ")", "PI4KB", "is", "potently", "inhibited", "by", "c10orf76", "in", "a", "dose", "-", "dependent", "manner", "in", "vitro", ".", "Kinase", "assays", "of", "PI4KB", "(", "20", "nM", ")", "in", "the", "presence", "of", "varying", "concentrations", "of", "c10orf76", "(", "1", ".", "6", "nM", "-", "1", "μM", ")", "were", "carried", "out", "on", "pure", "PI", "lipid", "vesicles", "(", "0", ".", "5", "mg", "/", "L", ")", "in", "the", "presence", "of", "100", "μM", "ATP", ".", "The", "data", "was", "normalized", "to", "the", "kinase", "activity", "of", "PI4KB", "alone", ".", "IC50", "values", "were", "determined", "by", "one", "binding", "site", ",", "nonlinear", "regression", "(", "curve", "fit", ")", "using", "Graphpad", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviation", "of", "independent", "technical", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "D", ")", "PI4KB", "is", "potently", "inhibited", "by", "c10orf76", "on", "pure", "PI", "vesicles", "and", "vesicles", "mimicking", "Golgi", "composition", ".", "Kinase", "assays", "of", "PI4KB", "and", "c10orf76", "were", "carried", "out", "on", "lipid", "substrate", "composed", "of", "pure", "PI", "vesicles", "(", "0", ".", "5", "mg", "/", "mL", ")", "with", "100", "μM", "ATP", ",", "and", "Golgi", "mimic", "vesicles", "(", "0", ".", "5", "mg", "/", "ml", ",", "10", "%", "PS", ",", "20", "%", "PI", ",", "25", "%", "PE", ",", "45", "%", "PC", ")", "with", "10", "μM", "ATP", ".", "PI4KB", "was", "present", "at", "20", "and", "300", "nM", "in", "the", "PI", "and", "Golgi", "substrate", "assays", "respectively", ",", "with", "c10orf76", "present", "at", "500", "nM", "in", "both", "experiments", ".", "The", "data", "is", "normalized", "to", "the", "kinase", "activity", "of", "PI4KB", "alone", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviation", "of", "independent", "technical", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "E", ")", "Changes", "in", "deuterium", "incorporation", "PI4KB", "in", "the", "presence", "of", "c10orf76", "showed", "a", "profound", "ordering", "of", "the", "kinase", "domain", "N", "-", "lobe", "linker", "and", "smaller", "changes", "in", "the", "helical", "domain", "and", "C", "-", "lobe", "of", "the", "kinase", "domain", ".", "The", "sum", "of", "the", "difference", "mapped", "as", "the", "difference", "in", "number", "of", "deuterons", "incorporated", "for", "PI4KB", "(", "400", "nM", ")", "in", "the", "presence", "and", "absence", "of", "c10orf76", "(", "400", "nM", ")", "over", "all", "time", "points", "(", "3s", "at", "1", "oC", ";", "3s", ",", "30s", ",", "and", "300s", "at", "23", "oC", ")", ".", "Each", "dot", "represents", "a", "peptide", "graphed", "on", "the", "x", "-", "axis", "according", "to", "the", "central", "residue", ".", "The", "red", "boxes", "highlight", "key", "regions", "that", "showed", "significant", "changes", "(", ">", "7", "%", "decrease", "in", "exchange", ",", ">", "0", ".", "5", "Da", "difference", ",", "and", "unpaired", "two", "-", "tailed", "student", "t", "-", "test", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviation", "of", "independent", "technical", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "G", ")", "Changes", "in", "the", "deuterium", "incorporation", "of", "c10orf76", "in", "the", "presence", "of", "PI4KB", ".", "H", "/", "D", "exchange", "reactions", "displayed", "as", "the", "sum", "of", "the", "difference", "in", "HDX", "in", "the", "number", "of", "deuterons", "for", "c10orf76", "(", "400", "nM", ")", "in", "the", "presence", "of", "PI4KB", "(", "400", "nM", ")", "at", "all", "time", "points", "(", "3s", "at", "1", "oC", ";", "3s", ",", "30s", ",", "and", "300s", "at", "23", "oC", ")", "analyzed", ".", "Red", "boxes", "highlight", "regions", "that", "showed", "significant", "changes", "(", ">", "7", "%", "decrease", "in", "exchange", ",", ">", "0", ".", "5", "Da", "difference", ",", "and", "unpaired", "two", "-", "tailed", "student", "t", "-", "test", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviation", "of", "independent", "technical", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "H", ")", "The", "PI4KB", "N", "-", "lobe", "linker", "undergoes", "a", "disorder", "-", "to", "-", "order", "transition", "upon", "binding", "c10orf76", ".", "Selected", "peptides", "(", "including", "the", "sequence", ",", "domain", "information", ",", "and", "numbering", ")", "of", "both", "PI4KB", "and", "c10orf76", "displayed", "as", "the", "%", "deuteration", "incorporation", "over", "time", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviation", "of", "independent", "technical", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", ",", "and", "are", "typically", "smaller", "than", "the", "size", "of", "the", "point", "on", "the", "graph", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Recombinant c10orf76 directly binds to PI4KB in vitro. His-pulldown assays of baculovirus/Sf9 produced 6xHis-c10orf76 (3 μM) were carried out with untagged PI4KB (2.5 μM).(B) PI4KB and c10orf76 form a stable complex. The complex of c10orf76-PI4KB eluted from a S200 superdex 10/300 GL increase gel filtration column (GE) at a volume consistent with a heterodimer (169 kDa), while c10orf76 alone eluted at a volume consistent with a monomer (79 kDa). Lines with MW values indicate elution of MW standards (158 kDa aldolase, 75 kDa conalbumin).(C) PI4KB is potently inhibited by c10orf76 in a dose-dependent manner in vitro. Kinase assays of PI4KB (20 nM) in the presence of varying concentrations of c10orf76 (1.6 nM-1 μM) were carried out on pure PI lipid vesicles (0.5 mg/L) in the presence of 100 μM ATP. The data was normalized to the kinase activity of PI4KB alone. IC50 values were determined by one binding site, nonlinear regression (curve fit) using Graphpad. Error bars represent standard deviation of independent technical replicates (n=3).(D) PI4KB is potently inhibited by c10orf76 on pure PI vesicles and vesicles mimicking Golgi composition. Kinase assays of PI4KB and c10orf76 were carried out on lipid substrate composed of pure PI vesicles (0.5 mg/mL) with 100 μM ATP, and Golgi mimic vesicles (0.5 mg/ml, 10% PS, 20% PI, 25% PE, 45% PC) with 10 μM ATP. PI4KB was present at 20 and 300 nM in the PI and Golgi substrate assays respectively, with c10orf76 present at 500 nM in both experiments. The data is normalized to the kinase activity of PI4KB alone. Error bars represent standard deviation of independent technical replicates (n=3).(E) Changes in deuterium incorporation PI4KB in the presence of c10orf76 showed a profound ordering of the kinase domain N-lobe linker and smaller changes in the helical domain and C-lobe of the kinase domain. The sum of the difference mapped as the difference in number of deuterons incorporated for PI4KB (400 nM) in the presence and absence of c10orf76 (400 nM) over all time points (3s at 1 oC; 3s, 30s, and 300s at 23 oC). Each dot represents a peptide graphed on the x-axis according to the central residue. The red boxes highlight key regions that showed significant changes (>7% decrease in exchange, >0.5 Da difference, and unpaired two-tailed student t-test p<0.05). Error bars represent standard deviation of independent technical replicates (n=3).(G) Changes in the deuterium incorporation of c10orf76 in the presence of PI4KB. H/D exchange reactions displayed as the sum of the difference in HDX in the number of deuterons for c10orf76 (400 nM) in the presence of PI4KB (400 nM) at all time points (3s at 1 oC; 3s, 30s, and 300s at 23 oC) analyzed. Red boxes highlight regions that showed significant changes (>7% decrease in exchange, >0.5 Da difference, and unpaired two-tailed student t-test p<0.05). Error bars represent standard deviation of independent technical replicates (n=3).(H) The PI4KB N-lobe linker undergoes a disorder-to-order transition upon binding c10orf76. Selected peptides (including the sequence, domain information, and numbering) of both PI4KB and c10orf76 displayed as the % deuteration incorporation over time. Error bars represent standard deviation of independent technical replicates (n=3), and are typically smaller than the size of the point on the graph."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "B", ")", "The", "N", "-", "lobe", "kinase", "linker", "of", "PI4KB", "can", "be", "efficiently", "phosphorylated", "by", "PKA", ".", "Recombinant", "PKA", "at", "different", "concentrations", "(", "0", ",", "7", ",", "34", ",", "168", ",", "or", "840", "ng", ")", "was", "incubated", "with", "recombinant", "(", "E", ".", "coli", ")", "wild", "-", "type", "PI4KB", "(", "20", "μg", ")", "for", "1", "hour", "with", "200", "μM", "ATP", "and", "the", "amount", "of", "phosphorylation", "was", "followed", "using", "mass", "spectrometry", ".", "Relative", "abundance", "of", "Ser496", "phosphorylated", "PI4KB", "was", "calculated", "using", "the", "relative", "intensity", "(", "total", "area", ")", "of", "the", "phosphorylated", "vs", "non", "-", "phosphorylated", "peptide", "(", "486", "-", "506", ")", ".", "(", "C", ")", "PI4KB", "phosphorylation", "by", "PKA", "alters", "the", "affinity", "for", "c10orf76", ".", "The", "kinase", "activity", "of", "different", "variants", "of", "PI4KB", "(", "15", "nM", ")", "was", "measured", "in", "the", "presence", "of", "varying", "amounts", "of", "c10orf76", "(", "23", "nM", "-", "1", ".", "5μM", ")", "with", "100", "%", "PI", "lipid", "substrate", "(", "0", ".", "5", "mg", "/", "L", ")", "and", "100", "μM", "ATP", ".", "The", "data", "was", "normalized", "to", "the", "kinase", "activity", "of", "PI4KB", "alone", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviation", "of", "independent", "technical", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "D", ")", "PI4KB", "has", "the", "same", "kinase", "activity", "when", "Ser496", "is", "phosphorylated", "or", "mutated", "to", "alanine", ".", "Kinase", "assay", "of", "PI4KB", "non", "-", "phosphorylated", ",", "phos", "-", "Ser496", "or", "S496A", "(", "15", "nM", ")", "on", "pure", "PI", "lipid", "vesicles", "(", "0", ".", "5", "mg", "/", "L", ")", "with", "100", "μM", "ATP", ".", "The", "data", "was", "normalized", "to", "the", "kinase", "activity", "of", "WT", "PI4KB", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviation", "of", "independent", "technical", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "E", ")", "Engineered", "RL494EA", "PI4KB", "mutant", "shows", "decreased", "binding", "to", "c10orf76", ".", "His", "-", "pulldown", "assays", "of", "6xHis", "-", "c10orf76", "(", "3", "μM", ")", "with", "wild", "-", "type", "or", "RL494EA", "PI4KB", "(", "1", "-", "2", "μM", ")", ".", "(", "F", ")", "RL494EA", "PI4KB", "activity", "is", "not", "inhibited", "by", "c10orf76", ".", "Kinase", "assays", "of", "either", "wild", "type", "or", "mutant", "RL494EA", "PI4KB", "(", "40", "nM", ")", "were", "carried", "out", "with", "varying", "concentrations", "of", "c10orf76", "(", "3", ".", "9", "nM", "-", "2μM", ")", "with", "100", "%", "PI", "lipid", "vesicles", "(", "0", ".", "5", "mg", "/", "L", ")", "and", "100", "μM", "ATP", ".", "The", "data", "was", "normalized", "to", "the", "kinase", "activity", "of", "PI4KB", "alone", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviation", "of", "independent", "technical", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "G", ")", "Wild", "-", "type", "PI4KB", "and", "RL494EA", "PI4KB", "mutant", "have", "the", "same", "lipid", "kinase", "activity", ".", "Kinase", "assays", "of", "either", "wild", "-", "type", "and", "mutant", "PI4KB", "(", "10", "nM", ")", "were", "carried", "out", "with", "100", "%", "PI", "lipid", "vesicles", "(", "0", ".", "5", "mg", "/", "L", ")", ",", "100", "μM", "ATP", ",", "and", "PI4KB", "(", "300", "nM", ")", "on", "Golgi", "-", "mimic", "vesicles", "(", "0", ".", "5", "mg", "/", "mL", ")", "with", "10", "μM", "ATP", ".", "The", "data", "was", "normalized", "to", "the", "kinase", "activity", "of", "WT", "PI4KB", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviation", "of", "independent", "technical", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "H", ")", "FLH409AAA", "-", "c10orf76", "mutant", "shows", "decreased", "affinity", "for", "PI4KB", ".", "His", "-", "pulldown", "assays", "of", "6xHis", "-", "c10orf76", "(", "1", "μM", ")", "with", "wild", "-", "type", "PI4KB", "(", "1", "μM", ")", ".", "Samples", "washed", "a", "total", "of", "4", "times", ".", "(", "I", ")", "Kinase", "assay", "shows", "FLH409AAA", "c10orf76", "inhibition", "of", "PI4KB", "is", "greatly", "reduced", ".", "Kinase", "assay", "of", "PI4KB", "(", "40", "nM", ")", "and", "a", "concentration", "curve", "of", "c10orf76", "(", "3", ".", "9", "nM", "-", "2μM", ")", "on", "pure", "PI", "lipid", "vesicles", "(", "0", ".", "5", "mg", "/", "L", ")", "with", "100", "μM", "ATP", ".", "The", "data", "was", "normalized", "to", "the", "kinase", "activity", "of", "PI4KB", "alone", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviation", "of", "independent", "technical", "replicates", "(", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(B) The N-lobe kinase linker of PI4KB can be efficiently phosphorylated by PKA. Recombinant PKA at different concentrations (0, 7, 34, 168, or 840 ng) was incubated with recombinant (E. coli) wild-type PI4KB (20 μg) for 1 hour with 200 μM ATP and the amount of phosphorylation was followed using mass spectrometry. Relative abundance of Ser496 phosphorylated PI4KB was calculated using the relative intensity (total area) of the phosphorylated vs non-phosphorylated peptide (486-506).(C) PI4KB phosphorylation by PKA alters the affinity for c10orf76. The kinase activity of different variants of PI4KB (15 nM) was measured in the presence of varying amounts of c10orf76 (23 nM-1.5μM) with 100% PI lipid substrate (0.5 mg/L) and 100 μM ATP. The data was normalized to the kinase activity of PI4KB alone Error bars represent standard deviation of independent technical replicates (n=3).(D) PI4KB has the same kinase activity when Ser496 is phosphorylated or mutated to alanine. Kinase assay of PI4KB non-phosphorylated, phos-Ser496 or S496A (15 nM) on pure PI lipid vesicles (0.5 mg/L) with 100 μM ATP. The data was normalized to the kinase activity of WT PI4KB. Error bars represent standard deviation of independent technical replicates (n=3).(E) Engineered RL494EA PI4KB mutant shows decreased binding to c10orf76. His-pulldown assays of 6xHis-c10orf76 (3 μM) with wild-type or RL494EA PI4KB (1-2 μM).(F) RL494EA PI4KB activity is not inhibited by c10orf76. Kinase assays of either wild type or mutant RL494EA PI4KB (40 nM) were carried out with varying concentrations of c10orf76 (3.9 nM-2μM) with 100% PI lipid vesicles (0.5 mg/L) and 100 μM ATP. The data was normalized to the kinase activity of PI4KB alone. Error bars represent standard deviation of independent technical replicates (n=3).(G) Wild-type PI4KB and RL494EA PI4KB mutant have the same lipid kinase activity. Kinase assays of either wild-type and mutant PI4KB (10 nM) were carried out with 100% PI lipid vesicles (0.5 mg/L), 100 μM ATP, and PI4KB (300 nM) on Golgi-mimic vesicles (0.5 mg/mL) with 10 μM ATP. The data was normalized to the kinase activity of WT PI4KB. Error bars represent standard deviation of independent technical replicates (n=3).(H) FLH409AAA-c10orf76 mutant shows decreased affinity for PI4KB. His-pulldown assays of 6xHis-c10orf76 (1 μM) with wild-type PI4KB (1 μM). Samples washed a total of 4 times.(I) Kinase assay shows FLH409AAA c10orf76 inhibition of PI4KB is greatly reduced. Kinase assay of PI4KB (40 nM) and a concentration curve of c10orf76 (3.9 nM-2μM) on pure PI lipid vesicles (0.5 mg/L) with 100 μM ATP. The data was normalized to the kinase activity of PI4KB alone. Error bars represent standard deviation of independent technical replicates (n=3)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Transfections", "of", "HEK293", "cells", "revealed", "that", "both", "wild", "-", "type", "GFP", "-", "PI4KB", "and", "RL494EA", "GFP", "-", "PI4KB", "localize", "to", "the", "Golgi", ".", "(", "B", ")", "WT", "c10orf76", "also", "localized", "to", "the", "Golgi", ",", "however", ",", "the", "PI4KB", "binding", "deficient", "mutant", "of", "c10orf76", "(", "FLH409AAA", ")", "predominantly", "localized", "to", "the", "cytosol", ".", "(", "D", ")", "Mitochondria", "recruitment", "experiment", "with", "wild", "-", "type", "PI4KB", "and", "c10orf76", ".", "Left", ":", "AKAP1", "-", "FRB", "-", "CFP", "is", "localized", "to", "the", "mitochondria", "before", "(", "top", ")", "and", "5", "minutes", "after", "rapamycin", "(", "100", "nM", ")", "treatment", "(", "bottom", ")", ".", "Middle", ":", "mRFP", "-", "FKBP12", "-", "PI4KB", "at", "high", "expression", "level", "is", "located", "in", "the", "cytosol", "before", "rapamycin", "(", "top", ")", "and", "translocates", "to", "the", "mitochondria", "after", "rapamycin", "induction", "(", "bottom", ")", ".", "Right", ":", "eGFP", "-", "c10orf76", "at", "a", "high", "expression", "level", "is", "located", "in", "the", "cytosol", "before", "rapamycin", "(", "top", ")", "and", "translocates", "to", "the", "mitochondria", "after", "rapamycin", "induction", "(", "bottom", ")", ".", "(", "F", ")", "Mitochondria", "recruitment", "experiment", "with", "mutant", "PI4KB", "and", "WT", "c10orf76", ".", "Left", ":", "AKAP1", "-", "FRB", "-", "CFP", "is", "localized", "to", "the", "mitochondria", "before", "(", "top", ")", "and", "5", "minutes", "after", "(", "bottom", ")", "rapamycin", "treatment", ".", "Middle", ":", "mRFP", "-", "FKBP12", "-", "PI4KB", "(", "RL494EA", ")", "is", "located", "in", "the", "cytosol", "before", "rapamycin", "(", "top", ")", "and", "translocates", "to", "the", "mitochondria", "after", "rapamycin", "induction", "(", "bottom", ")", ".", "Right", ":", "eGFP", "-", "c10orf76", "is", "located", "in", "the", "cytosol", "before", "(", "top", ")", "and", "after", "(", "bottom", ")", "rapamycin", "induction", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Transfections of HEK293 cells revealed that both wild-type GFP-PI4KB and RL494EA GFP-PI4KB localize to the Golgi.(B) WT c10orf76 also localized to the Golgi, however, the PI4KB binding deficient mutant of c10orf76 (FLH409AAA) predominantly localized to the cytosol.(D) Mitochondria recruitment experiment with wild-type PI4KB and c10orf76. Left: AKAP1-FRB-CFP is localized to the mitochondria before (top) and 5 minutes after rapamycin (100 nM) treatment (bottom). Middle: mRFP-FKBP12-PI4KB at high expression level is located in the cytosol before rapamycin (top) and translocates to the mitochondria after rapamycin induction (bottom). Right: eGFP-c10orf76 at a high expression level is located in the cytosol before rapamycin (top) and translocates to the mitochondria after rapamycin induction (bottom).(F) Mitochondria recruitment experiment with mutant PI4KB and WT c10orf76. Left: AKAP1-FRB-CFP is localized to the mitochondria before (top) and 5 minutes after (bottom) rapamycin treatment. Middle: mRFP-FKBP12-PI4KB(RL494EA) is located in the cytosol before rapamycin (top) and translocates to the mitochondria after rapamycin induction (bottom). Right: eGFP-c10orf76 is located in the cytosol before (top) and after (bottom) rapamycin induction."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", "HAP1", "cells", "were", "fixed", "and", "stained", "with", "antibodies", "examining", "PI4P", "and", "PI4KB", "Data", "information", ":", "Nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bars", "represent", "10", "μm", ".", "B", ")", "HAP1", "cells", "were", "fixed", "and", "stained", "with", "antibodies", "examining", "Golgi", "morphology", "markers", "(", "B", ")", ".", "(", "C", ")", "Western", "blot", "of", "GBF1", ",", "PI4KB", "and", "B", "-", "Actin", "levels", "in", "both", "wild", "-", "type", "and", "c10orf76", "KO", "HAP1", "cells", ".", "Data", "information", ":", "Nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bars", "represent", "10", "μm", ".", "(", "D", ")", "Markers", "of", "Arf1", "activation", "-", "the", "coatomer", "proteins", "COPIα", "/", "γ", "and", "βCOP", "act", "as", "a", "readout", "for", "GTP", "-", "bound", "Arf1", ",", "while", "the", "native", "coatomer", "was", "detected", "with", "the", "CM1", "antibody", ".", "Data", "information", ":", "Nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bars", "represent", "10", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A HAP1 cells were fixed and stained with antibodies examining PI4P and PI4KB Data information: Nuclei were stained with DAPI (blue). Scale bars represent 10 μm.B) HAP1 cells were fixed and stained with antibodies examining Golgi morphology markers (B). (C) Western blot of GBF1, PI4KB and B-Actin levels in both wild-type and c10orf76 KO HAP1 cells. Data information: Nuclei were stained with DAPI (blue). Scale bars represent 10 μm.(D) Markers of Arf1 activation - the coatomer proteins COPIα/γ and βCOP act as a readout for GTP-bound Arf1, while the native coatomer was detected with the CM1 antibody. Data information: Nuclei were stained with DAPI (blue). Scale bars represent 10 μm."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Viral", "infection", "assays", "determining", "viral", "titers", "by", "end", "-", "point", "titration", "at", "0", "hours", "and", "8", "hours", "in", "HAP1", "wild", "-", "type", "or", "c10orf76", "knockout", "cells", ".", "Left", ":", "Coxsackievirus", "A10", "infection", ".", "Middle", ":", "Poliovirus", "-", "1", "infection", ".", "Right", ":", "Coxsackievirus", "B3", "infection", ".", "Titre", "values", "for", "c10orf76", "knockout", "cells", "at", "8", "hours", "were", "statistically", "evaluated", "compared", "to", "c10orf76", "knockout", "titres", "at", "0", "hours", "and", "wild", "-", "type", "titres", "at", "8", "hours", "using", "a", "one", "-", "way", "ANOVA", ".", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "N", ".", "S", ".", ",", "P", ">", "0", ".", "05", ".", "(", "B", ")", "Viral", "infection", "assays", "determining", "virus", "titers", "by", "end", "point", "titration", "at", "8", "hours", "in", "HeLa", "wild", "-", "type", "and", "PI4KB", "knockout", "cells", "upon", "transfection", "of", "wild", "-", "type", "PI4KB", ",", "the", "complex", "-", "disrupting", "RL494EA", "PI4KB", "mutant", "or", "the", "kinase", "dead", "D674A", "PI4KB", "mutant", ".", "Left", ":", "Coxsackievirus", "A10", "infection", ".", "Middle", ":", "Poliovirus", "-", "1", "infection", ".", "Right", ":", "Coxsackievirus", "B3", "infection", ".", "Values", "were", "statistically", "evaluated", "compared", "to", "the", "GalT", "control", "using", "a", "one", "-", "way", "ANOVA", ".", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "N", ".", "S", ".", ",", "P", ">", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Viral infection assays determining viral titers by end-point titration at 0 hours and 8 hours in HAP1 wild-type or c10orf76 knockout cells. Left: Coxsackievirus A10 infection. Middle: Poliovirus-1 infection. Right: Coxsackievirus B3 infection. Titre values for c10orf76 knockout cells at 8 hours were statistically evaluated compared to c10orf76 knockout titres at 0 hours and wild-type titres at 8 hours using a one-way ANOVA. **, P<0.01; N.S., P>0.05.(B) Viral infection assays determining virus titers by end point titration at 8 hours in HeLa wild-type and PI4KB knockout cells upon transfection of wild-type PI4KB, the complex-disrupting RL494EA PI4KB mutant or the kinase dead D674A PI4KB mutant. Left: Coxsackievirus A10 infection. Middle: Poliovirus-1 infection. Right: Coxsackievirus B3 infection. Values were statistically evaluated compared to the GalT control using a one-way ANOVA. **, P<0.01; *, P<0.05; N.S., P>0.05."}
{"words": ["Fig", ".", "1Overall", "structure", "of", "2019", "-", "nCoV", "RBD", "bound", "with", "ACE2", ".", "ACE2", "is", "colored", "green", ".", "2019", "-", "nCoV", "RBD", "core", "is", "colored", "cyan", "and", "RBM", "is", "colored", "red", ".", "Disulfide", "bonds", "in", "the", "2019", "-", "nCoV", "RBD", "are", "shown", "as", "stick", "and", "indicated", "by", "yellow", "arrows", ".", "The", "N", "-", "terminal", "helix", "of", "ACE2", "responsible", "for", "binding", "is", "labeled", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig. 1Overall structure of 2019-nCoV RBD bound with ACE2. ACE2 is colored green. 2019-nCoV RBD core is colored cyan and RBM is colored red. Disulfide bonds in the 2019-nCoV RBD are shown as stick and indicated by yellow arrows. The N-terminal helix of ACE2 responsible for binding is labeled."}
{"words": ["Fig", ".", "2Alignment", "of", "the", "2019", "-", "nCoV", "RBD", "(", "core", "in", "cyan", "and", "RBM", "in", "red", ")", "and", "SARS", "-", "CoV", "RBD", "(", "core", "in", "orange", "and", "RBM", "in", "blue", ")", "structures", ".", "Structural", "alignment", "of", "2019", "-", "nCoV", "RBD", "/", "ACE2", "and", "SARS", "-", "CoV", "RBD", "/", "ACE2", "complexes", ".", "2019", "-", "nCoV", "RBD", "is", "colored", "cyan", "and", "red", ",", "its", "interacting", "ACE2", "is", "colored", "green", ".", "SARS", "-", "CoV", "RBD", "is", "colored", "orange", "and", "blue", ",", "its", "interacting", "ACE2", "is", "colored", "salmon", ".", "The", "PDB", "code", "for", "SARS", "-", "CoV", "RBD", "/", "ACE2", "complex", ":", "2AJF", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig. 2Alignment of the 2019-nCoV RBD (core in cyan and RBM in red) and SARS-CoV RBD (core in orange and RBM in blue) structures.Structural alignment of 2019-nCoV RBD/ACE2 and SARS-CoV RBD/ACE2 complexes. 2019-nCoV RBD is colored cyan and red, its interacting ACE2 is colored green. SARS-CoV RBD is colored orange and blue, its interacting ACE2 is colored salmon. The PDB code for SARS-CoV RBD/ACE2 complex: 2AJF."}
{"words": ["Fig", ".", "3Contacting", "residues", "shown", "as", "stick", "at", "the", "2019", "-", "nCoV", "RBD", "/", "ACE2", "and", "SARS", "-", "CoV", "RBD", "/", "ACE2", "interfaces", ".", "Positions", "in", "both", "RBDs", "involved", "in", "ACE2", "binding", "are", "indicated", "by", "red", "labels", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Fig. 3Contacting residues shown as stick at the 2019-nCoV RBD/ACE2 and SARS-CoV RBD/ACE2 interfaces. Positions in both RBDs involved in ACE2 binding are indicated by red labels."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", "-", "K", "'", ")", "The", "Drosophila", "posterior", "midguts", "containing", "Su", "(", "H", ")", "-", "Gal4", ">", "UAS", "-", "CD8", ":", "GFP", "(", "Su", "(", "H", ")", ">", "GFP", ")", "with", "sucrose", "(", "Suc", ",", "control", ")", "(", "B", "-", "C", "'", ")", ",", "P", ".", "e", "for", "36", "h", "(", "D", "-", "F", "'", ")", ",", "Ecc15", "for", "36", "h", "(", "G", "-", "I", "'", ")", "and", "DSS", "for", "36", "h", "(", "J", "-", "K", "'", ")", "were", "immunostained", "for", "GFP", "(", "green", ")", ",", "PH3", "(", "red", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "(", "C", "-", "C", "'", ",", "E", "-", "E", "'", ",", "H", "-", "H", "'", "and", "K", "-", "K", "'", ")", "Magnification", "of", "selected", "areas", "containing", "PH3", "+", "GFP", "─", "cells", "from", "B", ",", "D", ",", "G", "and", "J", ".", "The", "EB", "cell", "close", "to", "the", "PH3", "+", "cell", "(", "white", "arrow", ")", "in", "C", "-", "C", "'", "is", "out", "of", "focus", ".", "(", "F", "-", "F", "'", "and", "I", "-", "I", "'", ")", "Magnification", "of", "selected", "areas", "containing", "PH3", "+", "EBs", "(", "GFP", "+", ")", "from", "D", "and", "G", ".", "White", "arrowheads", "and", "red", "arrows", "indicate", "PH3", "in", "GFP", "─", "and", "GFP", "+", "cells", ",", "respectively", ".", "(", "L", "and", "M", ")", "Quantification", "of", "PH3", "GFP", "─", "ISCs", "(", "L", ")", "and", "PH3", "+", "GFP", "+", "EBs", "(", "M", ")", "with", "given", "treatments", ".", "n", "=", "21", "guts", "for", "each", "treatment", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B-K') The Drosophila posterior midguts containing Su(H)-Gal4>UAS-CD8:GFP (Su(H)>GFP) with sucrose (Suc, control) (B-C'), P.e for 36 h (D-F'), Ecc15 for 36 h (G-I') and DSS for 36 h (J-K') were immunostained for GFP (green), PH3 (red) and DAPI (blue). (C-C', E-E', H-H' and K-K') Magnification of selected areas containing PH3+GFP─ cells from B, D, G and J. The EB cell close to the PH3+ cell (white arrow) in C-C' is out of focus. (F-F' and I-I') Magnification of selected areas containing PH3+ EBs (GFP+) from D and G. White arrowheads and red arrows indicate PH3 in GFP─ and GFP+ cells, respectively. (L and M) Quantification of PH3 GFP─ ISCs (L) and PH3+GFP+ EBs (M) with given treatments. n = 21 guts for each treatment."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "D", "-", "F", "'", "'", ")", "When", "the", "ISCs", "were", "marked", "by", "esgGal4", ",", "su", "(", "H", ")", "-", "Gal80", ">", "UAS", "-", "GFP", ",", "PH3", "expression", "was", "found", "in", "GFP", "+", "ISCs", "with", "feeding", "of", "Suc", "(", "control", ")", "(", "D", "-", "D", "'", "'", ")", ",", "P", ".", "e", "(", "E", "-", "E", "'", "'", ")", "and", "Dss", "(", "F", "-", "F", "'", "'", ")", ".", "However", ",", "PH3", "expression", "is", "present", "in", "EBs", "with", "GFP", "─", "Pros", "─", "and", "small", "nuclei", "upon", "P", ".", "e", "infection", "(", "E", "-", "E", "'", "'", ",", "red", "arrows", ")", ".", "The", "white", "arrows", "indicate", "GFP", "+", "cells", "with", "PH3", "expression", ".", "(", "G", ")", "Quantification", "of", "PH3", "+", "GFP", "─", "Pros", "─", "EBs", "with", "given", "treatments", ".", "n", "=", "11", "guts", "for", "each", "treatment", ".", "Data", "information", ":", "Three", "independent", "experiments", "were", "performed", ",", "and", "error", "bars", "are", "±", "SEM", ".", "*", "*", "*", ",", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "(", "G", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(D-F'') When the ISCs were marked by esgGal4, su(H)-Gal80>UAS-GFP, PH3 expression was found in GFP+ ISCs with feeding of Suc (control) (D-D''), P.e (E-E'') and Dss (F-F''). However, PH3 expression is present in EBs with GFP─Pros─ and small nuclei upon P.e infection (E-E'', red arrows). The white arrows indicate GFP+ cells with PH3 expression. (G) Quantification of PH3+GFP─Pros─ EBs with given treatments. n = 11 guts for each treatment. Data information: Three independent experiments were performed, and error bars are ± SEM. ***, P < 0.001 (Student's t-test) (G)."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "D", "-", "N", "'", ")", "The", "Drosophila", "midguts", "expressing", "Su", "(", "H", ")", "ts", ">", "GFP", "with", "control", "(", "D", "-", "E", "'", ")", ",", "UAS", "-", "RasV12", "for", "6", "days", "(", "F", "-", "H", "'", ")", ",", "EGFRA887T", "for", "4", "days", "(", "I", "-", "K", "'", ")", "and", "UAS", "−", "λTop", "for", "5", "days", "(", "L", "-", "N", "'", ")", "were", "immunostained", "for", "GFP", "(", "green", ")", ",", "PH3", "(", "red", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "(", "E", "-", "E", "'", ",", "G", "-", "G", "'", ",", "J", "-", "J", "'", "and", "M", "-", "M", "'", ")", "Magnification", "of", "selected", "areas", "containing", "PH3", "+", "GFP", "─", "cells", "from", "D", ",", "F", ",", "I", "and", "L", ".", "(", "H", "-", "H", "'", ",", "K", "-", "K", "'", "and", "N", "-", "N", "'", ")", "Magnification", "of", "selected", "areas", "containing", "PH3", "+", "GFP", "+", "cells", "from", "F", ",", "I", "and", "L", ".", "White", "arrowheads", "and", "red", "arrows", "indicate", "PH3", "in", "GFP", "─", "ISCs", "and", "GFP", "+", "EBs", ",", "respectively", ".", "(", "O", ",", "P", ")", "Quantification", "of", "PH3", "+", "GFP", "─", "(", "P", ")", "and", "PH3", "+", "GFP", "+", "(", "O", ")", "in", "midguts", "with", "indicated", "genotypes", ".", "n", "=", "13", "guts", "for", "each", "genotype", ".", "(", "Q", ")", "Quantification", "of", "PH3", "+", "EBs", "(", "GFP", "+", ")", "with", "the", "given", "genotypes", "in", "response", "to", "P", ".", "e", "infection", ".", "n", "=", "11", "guts", "for", "each", "genotype", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(D-N') The Drosophila midguts expressing Su(H)ts>GFP with control (D-E'), UAS-RasV12 for 6 days (F-H'), EGFRA887T for 4 days (I-K') and UAS−λTop for 5 days (L-N') were immunostained for GFP (green), PH3 (red) and DAPI (blue). (E-E', G-G', J-J' and M-M') Magnification of selected areas containing PH3+GFP─ cells from D, F, I and L. (H-H', K-K' and N-N') Magnification of selected areas containing PH3+GFP+ cells from F, I and L. White arrowheads and red arrows indicate PH3 in GFP─ ISCs and GFP+ EBs, respectively. (O, P) Quantification of PH3+GFP─ (P) and PH3+GFP+ (O) in midguts with indicated genotypes. n = 13 guts for each genotype. (Q) Quantification of PH3+ EBs (GFP+) with the given genotypes in response to P. e infection. n = 11 guts for each genotype."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "B", "-", "C", "'", "'", "'", ")", "Flies", "expressing", "UAS", "-", "Flp", ";", "Su", "(", "H", ")", "ts", "UAS", "-", "CD8", ":", "GFP", ";", "ActP", ">", "Stop", ">", "LacZ", "were", "fed", "with", "Suc", "(", "B", "-", "B", "'", "'", "'", ")", "or", "P", ".", "e", "(", "C", "-", "C", "'", "'", "'", ")", "for", "36h", "and", "their", "midguts", "were", "dissected", "and", "immunostained", "with", "antibodies", "against", "GFP", ",", "β", "-", "gal", "and", "Dl", ".", "Blue", "arrowheads", "indicate", "Dl", "+", "ISCs", ";", "white", "arrows", "indicate", "GFP", "+", "EBs", ";", "and", "red", "arrowheads", "indicate", "EB", "progeny", "cells", "(", "LacZ", "+", "GFP", "─", ")", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "Dl", "+", "ISC", "-", "like", "cells", "from", "EBs", "(", "GFP", "─", "LacZ", "+", "Dl", "+", ")", "in", "the", "control", ",", "P", ".", "e", "infected", "midguts", ",", "n", "=", "50", ".", "(", "E", ")", "Quantification", "of", "Dl", "+", "ISC", "-", "like", "cells", "from", "EBs", "(", "GFP", "─", "LacZ", "+", "Dl", "+", ")", "in", "the", "control", "with", "Suc", "or", "P", ".", "e", ",", "or", "knockdown", "of", "EGFR", "with", "Suc", "or", "P", ".", "e", "infection", ",", "n", "=", "50", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(B-C''') Flies expressing UAS-Flp; Su(H)ts UAS-CD8:GFP; ActP>Stop>LacZ were fed with Suc (B-B''') or P.e (C-C''') for 36h and their midguts were dissected and immunostained with antibodies against GFP, β-gal and Dl. Blue arrowheads indicate Dl+ ISCs; white arrows indicate GFP+ EBs; and red arrowheads indicate EB progeny cells (LacZ+GFP─). (D) Quantification of Dl+ ISC-like cells from EBs (GFP─LacZ+Dl+) in the control, P. e infected midguts, n=50. (E) Quantification of Dl+ ISC-like cells from EBs (GFP─LacZ+Dl+) in the control with Suc or P. e, or knockdown of EGFR with Suc or P. e infection, n=50."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", "-", "C", "'", "'", "'", ")", "The", "midguts", "from", "adult", "female", "flies", "expressing", "UAS", "-", "Flp", ";", "Su", "(", "H", ")", "ts", "UAS", "-", "CD8", ":", "GFP", ";", "ActP", ">", "Stop", ">", "LacZ", "with", "(", "B", "-", "B", "'", "'", "'", ")", "or", "without", "(", "A", "-", "A", "'", "'", "'", ")", "UAS", "-", "RasV12", "or", "with", "UAS", "-", "RasV12", "and", "UAS", "-", "stg", "-", "RNAi", "(", "C", "-", "C", "'", "'", "'", ")", "were", "dissected", "and", "immunostained", "with", "antibodies", "against", "GFP", ",", "β", "-", "gal", "and", "Dl", ".", "The", "bigger", "GFP", "─", "nucleus", "with", "LacZ", "expression", "(", "only", "red", "arrowheads", ")", "indicate", "differentiating", "or", "mature", "ECs", ".", "Blue", "arrowheads", "indicate", "Dl", "+", "ISCs", ";", "white", "arrows", "indicate", "GFP", "+", "EBs", ";", "and", "red", "arrowheads", "indicate", "EB", "progeny", "cells", "(", "LacZ", "+", "GFP", "─", ")", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "Dl", "+", "ISC", "-", "like", "cells", "from", "EBs", "(", "GFP", "─", "LacZ", "+", "Dl", "+", ")", "in", "the", "indicated", "genotypes", ",", "n", "=", "50", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A-C''') The midguts from adult female flies expressing UAS-Flp; Su(H)ts UAS-CD8:GFP; ActP>Stop>LacZ with (B-B''') or without (A-A''') UAS-RasV12 or with UAS-RasV12 and UAS-stg-RNAi (C-C''') were dissected and immunostained with antibodies against GFP, β-gal and Dl. The bigger GFP─ nucleus with LacZ expression (only red arrowheads) indicate differentiating or mature ECs. Blue arrowheads indicate Dl+ ISCs; white arrows indicate GFP+ EBs; and red arrowheads indicate EB progeny cells (LacZ+GFP─). (D) Quantification of Dl+ ISC-like cells from EBs (GFP─LacZ+Dl+) in the indicated genotypes, n=50."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "C", "-", "E", "'", "'", ")", "The", "representative", "twin", "clones", "from", "midguts", "when", "EGFRA887T", "is", "overexpressed", "in", "EBs", "(", "D", "-", "D", "'", "'", ",", "red", "and", "green", "arrows", ")", "or", "adult", "flies", "were", "fed", "with", "P", ".", "e", "for", "36h", "(", "E", "-", "E", "'", "'", ",", "red", "and", "green", "arrows", ")", ",", "but", "no", "twin", "clone", "is", "found", "in", "the", "control", "(", "C", "-", "C", "'", "'", ")", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "different", "types", "of", "twin", "clones", "in", "the", "control", "midguts", ",", "or", "in", "the", "midguts", "with", "EGFRA887T", "overexpression", "or", "P", ".", "e", "infection", ".", "n", "=", "10", "guts", "for", "each", "genotype", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(C-E'') The representative twin clones from midguts when EGFRA887T is overexpressed in EBs (D-D'', red and green arrows) or adult flies were fed with P.e for 36h (E-E'', red and green arrows), but no twin clone is found in the control (C-C''). (F) Quantification of different types of twin clones in the control midguts, or in the midguts with EGFRA887T overexpression or P.e infection. n = 10 guts for each genotype."}
{"words": ["Figure", "9", "(", "A", "-", "C", "'", "'", ")", "ISCs", "from", "EBs", "upon", "RasV12", "expression", "or", "P", ".", "e", "infection", "could", "differentiate", "to", "generate", "EE", "or", "pre", "-", "EE", "cells", "(", "B", "-", "C", "'", "'", ",", "LacZ", "+", "Pros", "+", "GFP", "─", ",", "blue", "arrowheads", ")", ",", "but", "no", "EE", "or", "pre", "-", "EE", "cells", "from", "EBs", "are", "found", "in", "the", "control", "(", "A", "-", "A", "'", "'", ",", "white", "arrowheads", ")", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "EE", "cells", "from", "progenies", "of", "EBs", "with", "indicated", "genotypes", "or", "treatments", ".", "n", "=", "9", "guts", "for", "each", "genotype", "or", "treatment", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 9(A-C'') ISCs from EBs upon RasV12 expression or P. e infection could differentiate to generate EE or pre-EE cells (B-C'', LacZ+Pros+GFP─, blue arrowheads), but no EE or pre-EE cells from EBs are found in the control (A-A'', white arrowheads). (D) Quantification of EE cells from progenies of EBs with indicated genotypes or treatments. n = 9 guts for each genotype or treatment."}
{"words": ["Figure", "1Flow", "cytometric", "analysis", "of", "γδ", "T", "cells", "in", "RORγtCRE", "-", "STAT3F", "/", "F", "(", "Cre", "+", ")", "and", "littermate", "control", "mice", "(", "Cre", "−", ")", ".", "In", "graphs", ",", "each", "symbol", "represents", "a", "mouse", "and", "line", "the", "median", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "using", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "Numbers", "of", "γδT17", "cells", "in", "the", "LN", "(", "A", ")", "and", "skin", "(", "B", ")", "before", "(", "steady", "-", "state", ")", "and", "after", "(", "IMQ", ")", "IMQ", "-", "induced", "psoriasis", ".", "Steady", "-", "state", ":", "n", "=", "8", ";", "4", "experiments", ",", "IMQ", ":", "n", "=", "11", "-", "12", ";", "4", "experiments", ".", "Representative", "micrographs", "indicating", "ear", "skin", "sections", "stained", "for", "H", "&", "E", "before", "and", "after", "IMQ", "-", "induced", "psoriasis", "(", "scale", "bar", "=", "100μm", ")", ".", "Quantification", "of", "epidermal", "thickening", "from", "H", "&", "E", "stained", "sections", ".", "Steady", "-", "state", ":", "n", "=", "8", ";", "4", "experiments", ",", "IMQ", ":", "n", "=", "11", "-", "12", ";", "4", "experiments", ".", "Each", "symbol", "is", "the", "average", "thickening", "from", "5", "micrographs", "measured", "in", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Flow cytometric analysis of γδ T cells in RORγtCRE-STAT3F/F (Cre+) and littermate control mice (Cre−). In graphs, each symbol represents a mouse and line the median. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 using Mann-Whitney test. Numbers of γδT17 cells in the LN (A) and skin (B) before (steady-state) and after (IMQ) IMQ-induced psoriasis. Steady-state: n = 8; 4 experiments, IMQ: n = 11-12; 4 experiments.Representative micrographs indicating ear skin sections stained for H&E before and after IMQ-induced psoriasis (scale bar = 100μm). Quantification of epidermal thickening from H&E stained sections. Steady-state: n = 8; 4 experiments, IMQ: n = 11-12; 4 experiments. Each symbol is the average thickening from 5 micrographs measured in μm."}
{"words": ["Figure", "2Flow", "cytometric", "analysis", "of", "γδ", "T", "cells", "in", "STAT4", "−", "/", "−", "(", "−", "/", "−", ")", "and", "littermate", "control", "mice", "(", "+", "/", "−", ")", ".", "In", "graphs", ",", "each", "symbol", "represents", "a", "mouse", "and", "line", "the", "median", ".", "Numbers", "of", "γδT17", "cells", "in", "the", "LN", "and", "skin", "(", "staining", "as", "in", "Fig", "EV1", ")", "before", "(", "steady", "-", "state", ")", "and", "after", "(", "IMQ", ")", "IMQ", "-", "induced", "psoriasis", ".", "Steady", "-", "state", ":", "n", "=", "6", ";", "3", "experiments", ",", "IMQ", ":", "n", "=", "11", ";", "4", "experiments", ".", "Representative", "micrographs", "indicating", "ear", "skin", "sections", "stained", "for", "H", "&", "E", "before", "and", "after", "IMQ", "-", "induced", "psoriasis", "(", "scale", "bar", "=", "100μm", ")", ".", "Quantification", "of", "epidermal", "thickening", "from", "H", "&", "E", "stained", "sections", ".", "Steady", "-", "state", ":", "n", "=", "6", ";", "3", "experiments", ",", "IMQ", ":", "n", "=", "8", ";", "3", "experiments", ".", "Each", "symbol", "is", "the", "average", "thickening", "from", "5", "micrographs", "measured", "in", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Flow cytometric analysis of γδ T cells in STAT4−/− (−/−) and littermate control mice (+/−). In graphs, each symbol represents a mouse and line the median. Numbers of γδT17 cells in the LN and skin (staining as in Fig EV1) before (steady-state) and after (IMQ) IMQ-induced psoriasis. Steady-state: n = 6; 3 experiments, IMQ: n = 11; 4 experiments.Representative micrographs indicating ear skin sections stained for H&E before and after IMQ-induced psoriasis (scale bar = 100μm). Quantification of epidermal thickening from H&E stained sections. Steady-state: n = 6; 3 experiments, IMQ: n = 8; 3 experiments. Each symbol is the average thickening from 5 micrographs measured in μm."}
{"words": ["Figure", "3Flow", "cytometric", "analysis", "of", "lymph", "node", "γδ", "T", "cells", "in", "RORγtCRE", "-", "STAT3F", "/", "F", "(", "Cre", "+", ")", "and", "littermate", "control", "mice", "(", "Cre", "−", ")", ".", "In", "graphs", ",", "each", "symbol", "represents", "a", "mouse", "or", "experiment", "and", "line", "the", "median", ".", "Representative", "dot", "plots", "showing", "IL", "-", "17A", "(", "A", ")", "or", "IL", "-", "17F", "(", "D", ")", "and", "IFNγ", "production", "in", "γδ", "T", "cells", "before", "(", "steady", "-", "state", ")", "and", "after", "IMQ", "-", "induced", "psoriasis", ".", "Numbers", "in", "gate", "indicate", "%", "positive", "cells", ";", "numbers", "outside", "the", "gate", "indicate", "mean", "fluorescence", "intensity", "of", "IL", "-", "17A", "or", "IL", "-", "17F", ".", "(", "B", ",", "E", ")", "Frequency", "of", "IL", "-", "17A", "+", "(", "B", ")", "and", "IL", "-", "17F", "+", "(", "E", ")", "γδ", "T", "cells", "before", "(", "steady", "-", "state", ")", "and", "after", "(", "IMQ", ")", "IMQ", "-", "induced", "psoriasis", ".", "(", "C", ",", "F", ")", "Quantification", "of", "mean", "fluorescence", "intensity", "(", "MFI", ")", "of", "IL", "-", "17A", "(", "C", ")", "and", "IL", "-", "17F", "(", "F", ")", "staining", "in", "γδ", "T", "cells", "after", "IMQ", "-", "induced", "psoriasis", "(", "each", "color", "represents", "a", "different", "experiment", ")", ".", "Frequency", "of", "IL", "-", "17A", "+", "and", "IL", "-", "17F", "+", "γδ", "T", "cells", "or", "IL", "-", "17A", "(", "G", ")", "and", "IL", "-", "17F", "(", "H", ")", "MFI", "following", "culture", "with", "IL", "-", "1β", ",", "IL", "-", "23", "or", "nothing", ".", "Each", "symbol", "represents", "one", "experiment", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Flow cytometric analysis of lymph node γδ T cells in RORγtCRE-STAT3F/F (Cre+) and littermate control mice (Cre−). In graphs, each symbol represents a mouse or experiment and line the median. Representative dot plots showing IL-17A (A) or IL-17F (D) and IFNγ production in γδ T cells before (steady-state) and after IMQ-induced psoriasis. Numbers in gate indicate % positive cells; numbers outside the gate indicate mean fluorescence intensity of IL-17A or IL-17F. (B, E) Frequency of IL-17A+ (B) and IL-17F+ (E) γδ T cells before (steady-state) and after (IMQ) IMQ-induced psoriasis. (C, F) Quantification of mean fluorescence intensity (MFI) of IL-17A (C) and IL-17F (F) staining in γδ T cells after IMQ-induced psoriasis (each color represents a different experiment).Frequency of IL-17A+ and IL-17F+ γδ T cells or IL-17A (G) and IL-17F (H) MFI following culture with IL-1β, IL-23 or nothing. Each symbol represents one experiment."}
{"words": ["Figure", "4Flow", "cytometric", "analysis", "of", "lymph", "node", "γδ", "T", "cells", "in", "RORγtCRE", "-", "STAT3F", "/", "F", "(", "Cre", "+", ")", "and", "littermate", "control", "mice", "(", "Cre", "−", ")", ".", "In", "graphs", ",", "each", "symbol", "represents", "a", "mouse", "or", "experiment", "and", "line", "the", "median", ".", "Representative", "dot", "plots", "showing", "IL", "-", "22", "and", "IL", "-", "17A", "production", "in", "γδ", "T", "cells", "(", "A", ")", "and", "frequency", "of", "IL", "-", "22", "+", "γδ", "T", "cells", "(", "B", ")", "before", "(", "steady", "-", "state", ")", "and", "after", "(", "IMQ", ")", "IMQ", "-", "induced", "psoriasis", ".", "Steady", "-", "state", ":", "n", "=", "6", ";", "3", "experiments", ",", "IMQ", ":", "n", "=", "8", "-", "9", ";", "3", "experiments", ".", "Flow", "cytometric", "analysis", "of", "lymph", "node", "γδ", "T", "cells", "in", "RORγtCRE", "-", "STAT3F", "/", "F", "(", "Cre", "+", ")", "and", "littermate", "control", "mice", "(", "Cre", "−", ")", ".", "In", "graphs", ",", "each", "symbol", "represents", "a", "mouse", "or", "experiment", "and", "line", "the", "median", ".", "Representative", "dot", "plots", "showing", "IL", "-", "22", "and", "IL", "-", "17A", "production", "in", "γδ", "T", "cells", "(", "C", ")", "and", "frequency", "of", "IL", "-", "22", "+", "γδ", "T", "cells", "(", "D", ")", "following", "culture", "without", "(", "−", ")", "or", "with", "40ng", "/", "ml", "recombinant", "IL", "-", "23", "(", "n", "=", "9", "-", "10", ",", "3", "experiments", ")", ".", "Frequency", "of", "IL", "-", "22", "+", "γδ", "T", "cells", "following", "culture", "with", "IL", "-", "1β", ",", "IL", "-", "23", "or", "nothing", ".", "Each", "symbol", "represents", "one", "experiment", ".", "Open", "circles", "=", "Cre", "+", "(", "each", "color", "represents", "a", "different", "culture", "condition", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Flow cytometric analysis of lymph node γδ T cells in RORγtCRE-STAT3F/F (Cre+) and littermate control mice (Cre−). In graphs, each symbol represents a mouse or experiment and line the median. Representative dot plots showing IL-22 and IL-17A production in γδ T cells (A) and frequency of IL-22+ γδ T cells (B) before (steady-state) and after (IMQ) IMQ-induced psoriasis. Steady-state: n = 6; 3 experiments, IMQ: n = 8-9; 3 experiments.Flow cytometric analysis of lymph node γδ T cells in RORγtCRE-STAT3F/F (Cre+) and littermate control mice (Cre−). In graphs, each symbol represents a mouse or experiment and line the median. Representative dot plots showing IL-22 and IL-17A production in γδ T cells (C) and frequency of IL-22+ γδ T cells (D) following culture without (−) or with 40ng/ml recombinant IL-23 (n = 9-10, 3 experiments).Frequency of IL-22+ γδ T cells following culture with IL-1β, IL-23 or nothing. Each symbol represents one experiment. Open circles = Cre+ (each color represents a different culture condition)."}
{"words": ["Figure", "5Flow", "cytometric", "analysis", "of", "lymph", "node", "γδ", "T", "cells", "in", "STAT4", "−", "/", "−", "(", "−", "/", "−", ")", "and", "littermate", "control", "mice", "(", "+", "/", "−", ")", ".", "(", "A", ",", ")", "Frequency", "of", "IL", "-", "17A", "+", "(", "A", ")", "γδ", "T", "cells", "before", "(", "steady", "-", "state", ")", "and", "after", "(", "IMQ", ")", "IMQ", "-", "induced", "psoriasis", ".", "(", "B", ")", "Frequency", "of", "IL", "-", "17F", "+", "γδ", "T", "cells", "before", "(", "steady", "-", "state", ")", "and", "after", "(", "IMQ", ")", "IMQ", "-", "induced", "psoriasis", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "mean", "fluorescence", "intensity", "(", "MFI", ")", "of", "IL", "-", "17A", "staining", "in", "γδ", "T", "cells", "after", "IMQ", "-", "induced", "psoriasis", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "mean", "fluorescence", "intensity", "(", "MFI", ")", "of", "IL", "-", "17F", "staining", "in", "γδ", "T", "cells", "after", "IMQ", "-", "induced", "psoriasis", ".", "Flow", "cytometric", "analysis", "of", "lymph", "node", "γδ", "T", "cells", "in", "STAT4", "−", "/", "−", "(", "−", "/", "−", ")", "and", "littermate", "control", "mice", "(", "+", "/", "−", ")", ".", "Frequency", "of", "IL", "-", "22", "+", "γδ", "T", "cells", "before", "(", "steady", "-", "state", ")", "and", "after", "(", "IMQ", ")", "IMQ", "-", "induced", "psoriasis", ".", "Flow", "cytometric", "analysis", "of", "lymph", "node", "γδ", "T", "cells", "in", "STAT4", "−", "/", "−", "(", "−", "/", "−", ")", "and", "littermate", "control", "mice", "(", "+", "/", "−", ")", ".", "Frequency", "of", "IL", "-", "22", "+", "γδ", "T", "cells", "following", "culture", "without", "(", "−", ")", "or", "with", "40ng", "/", "ml", "recombinant", "IL", "-"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Flow cytometric analysis of lymph node γδ T cells in STAT4−/− (−/−) and littermate control mice (+/−). (A, ) Frequency of IL-17A+ (A) γδ T cells before (steady-state) and after (IMQ) IMQ-induced psoriasis. (B) Frequency of IL-17F+ γδ T cells before (steady-state) and after (IMQ) IMQ-induced psoriasis. (C) Quantification of mean fluorescence intensity (MFI) of IL-17A staining in γδ T cells after IMQ-induced psoriasis (D) Quantification of mean fluorescence intensity (MFI) of IL-17F staining in γδ T cells after IMQ-induced psoriasis.Flow cytometric analysis of lymph node γδ T cells in STAT4−/− (−/−) and littermate control mice (+/−). Frequency of IL-22+ γδ T cells before (steady-state) and after (IMQ) IMQ-induced psoriasis.Flow cytometric analysis of lymph node γδ T cells in STAT4−/− (−/−) and littermate control mice (+/−). Frequency of IL-22+ γδ T cells following culture without (−) or with 40ng/ml recombinant IL-23"}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Homer1c", "-", "GFP", "signal", "(", "magenta", ")", "and", "immunostaining", "for", "surface", "AMPARs", "(", "cyan", ")", "and", "SP", "(", "green", ")", "in", "neurons", "treated", "for", "48h", "with", "TTX", ",", "or", "untreated", "(", "UT", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "10", "µm", "(", "low", "magnification", ")", ",", "5", "µm", "(", "insets", ")", ".", "Dotted", "lines", "indicate", "the", "outline", "of", "dendrites", ".", "Arrowheads", "indicate", "SP", "+", "synapses", ".", "(", "B", ")", "Percentage", "of", "SP", "+", "synapses", "for", "untreated", "(", "UT", ")", "and", "TTX", "-", "treated", "neurons", "(", "dot", "plots", "represent", "different", "cells", ";", "UT", ":", "n", "=", "26", ";", "TTX", ":", "n", "=", "33", ",", "n", "indicates", "the", "number", "of", "cells", ",", "from", "2", "cultures", ")", ".", "%", "SP", "+", "spines", ":", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "019", "(", "Mann", "Whitney", "test", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "(", "C", ")", "AMPAR", "synaptic", "fluorescence", "intensity", "for", "SP", "+", "versus", "SP", "-", "synapses", "in", "UT", "and", "TTX", "-", "treated", "neurons", ".", "AMPAR", "synaptic", "fluorescence", "intensity", "was", "normalized", "to", "SP", "-", "or", "small", "synapses", ",", "respectively", ",", "from", "UT", "condition", ".", "(", "UT", ":", "SP", "-", ",", "n", "=", "1455", ",", "SP", "+", ",", "n", "=", "516", ";", "TTX", ":", "SP", "-", ",", "n", "=", "1529", ",", "SP", "+", ",", "n", "=", "724", ",", "n", "indicates", "the", "number", "of", "synapses", ",", "from", "2", "cultures", ")", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "ns", ",", "not", "significant", ",", "P", ">", "0", ".", "05", "(", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "followed", "by", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Homer1c-GFP signal (magenta) and immunostaining for surface AMPARs (cyan) and SP (green) in neurons treated for 48h with TTX, or untreated (UT). Scale bars: 10 µm (low magnification), 5 µm (insets). Dotted lines indicate the outline of dendrites. Arrowheads indicate SP+ synapses. (B) Percentage of SP+ synapses for untreated (UT) and TTX-treated neurons (dot plots represent different cells; UT: n = 26; TTX: n = 33, n indicates the number of cells, from 2 cultures). % SP+ spines: **P = 0.019 (Mann Whitney test). Data information: Data are represented as mean ± SEM.(C) AMPAR synaptic fluorescence intensity for SP+ versus SP- synapses in UT and TTX-treated neurons. AMPAR synaptic fluorescence intensity was normalized to SP- or small synapses, respectively, from UT condition. (UT: SP-, n = 1455, SP +, n = 516; TTX: SP-, n = 1529, SP+, n = 724, n indicates the number of synapses, from 2 cultures). **P < 0.01, ****P < 0.0001, ns, not significant, P > 0.05 (Kruskal-Wallis test followed by Dunn's multiple comparison test). Data information: Data are represented as mean ± SEM."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Example", "images", "of", "a", "FRAP", "experiment", ":", "SP", "-", "and", "SP", "+", "spines", "from", "the", "same", "cultured", "hippocampal", "neuron", "transfected", "with", "SEP", "-", "GluA2", "(", "gray", "and", "color", "-", "coded", ")", "+", "RFP", "-", "SP", "(", "red", ")", "10s", "before", ",", "and", "0", ",", "370", ",", "750", "s", "after", "the", "photobleaching", ".", "Scale", "bars", ":", "1", "µm", ".", "Dotted", "lines", "represent", "the", "outline", "of", "dendrites", ".", "Arrowheads", "indicate", "dendritic", "spines", "which", "were", "targeted", "for", "photobleaching", ".", "(", "B", ")", "SEP", "-", "GluA2", "fluorescence", "intensity", "at", "SP", "-", "vs", "SP", "+", "spines", ".", "Each", "pair", "of", "dot", "plots", "represents", "average", "fluorescence", "for", "SP", "-", "and", "SP", "+", "spines", "from", "a", "same", "neuron", "(", "4", "cultures", ")", ".", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0061", "(", "two", "-", "tailed", "paired", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "FRAP", "dynamics", "for", "SP", "-", "vs", "SP", "+", "spines", ".", "Recovery", "curves", "represent", "SEP", "-", "GluA2", "fluorescence", "average", "per", "cell", "(", "n", "=", "14", "cells", ",", "from", "4", "cultures", ")", ".", "The", "two", "traces", "were", "fitted", "using", "double", "exponential", "components", "equations", "and", "the", "convergence", "of", "the", "traces", "to", "a", "common", "fit", "was", "tested", "using", "the", "extra", "sum", "of", "squares", "F", "test", ".", "The", "F", "test", "indicates", "that", "the", "traces", "are", "best", "fitted", "by", "two", "divergent", "models", "(", "P", "<", "0", ".", "0001", ")", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "the", "recovery", "fraction", "750", "s", "after", "the", "photobleaching", ".", "Each", "pair", "of", "dot", "plots", "represents", "average", "recovery", "for", "SP", "-", "and", "SP", "+", "spines", "from", "a", "same", "neuron", "(", "4", "cultures", ")", ".", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "0067", "(", "Wilcoxon", "matched", "-", "pairs", "signed", "rank", "test", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Example images of a FRAP experiment: SP- and SP+ spines from the same cultured hippocampal neuron transfected with SEP-GluA2 (gray and color-coded) + RFP-SP (red) 10s before, and 0, 370, 750 s after the photobleaching. Scale bars: 1 µm. Dotted lines represent the outline of dendrites. Arrowheads indicate dendritic spines which were targeted for photobleaching. (B) SEP-GluA2 fluorescence intensity at SP- vs SP+ spines. Each pair of dot plots represents average fluorescence for SP- and SP+ spines from a same neuron (4 cultures). **P = 0.0061 (two-tailed paired Student's t test). (C) Quantification of FRAP dynamics for SP- vs SP+ spines. Recovery curves represent SEP-GluA2 fluorescence average per cell (n = 14 cells, from 4 cultures). The two traces were fitted using double exponential components equations and the convergence of the traces to a common fit was tested using the extra sum of squares F test. The F test indicates that the traces are best fitted by two divergent models (P < 0.0001). (D) Quantification of the recovery fraction 750 s after the photobleaching. Each pair of dot plots represents average recovery for SP- and SP+ spines from a same neuron (4 cultures). **P = 0.0067 (Wilcoxon matched-pairs signed rank test). Data information: Data are represented as mean ± SEM."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "SP", "in", "lysates", "from", "COS", "-", "7", "cells", "which", "were", "untransfected", ",", "transfected", "with", "RFP", "-", "SP", "+", "empty", "vector", "or", "co", "-", "transfected", "with", "SP", "-", "shRNA", "-", "GFP", "+", "RFP", "-", "SP", "(", "knock", "-", "down", ")", "or", "shRNA", "-", "resistant", "RFP", "-", "SP", "(", "rescue", ")", ".", "β", "-", "actin", "and", "GFP", "signals", "illustrate", "equal", "protein", "loading", "and", "SP", "-", "shRNA", "expression", "level", ",", "respectively", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "SP", "expression", "from", "6", "different", "experiments", ",", "normalized", "to", "the", "β", "-", "actin", "signal", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "ns", ",", "not", "significant", ",", "P", ">", "0", ".", "05", "(", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "followed", "by", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "mean", "±", "SEM", ".", "(", "C", ")", "Homer", "-", "DsRed", "(", "green", ")", "and", "immunostained", "endogenous", "SP", "(", "red", ")", "in", "dendrites", "from", "neurons", "transfected", "with", "either", "empty", "vector", ",", "scramble", "shRNA", "or", "SP", "-", "shRNA", "with", "GFP", "reporter", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "µm", ".", "(", "D", ")", "Average", "SP", "intensity", "for", "same", "conditions", "(", "EV", ":", "n", "=", "47", ";", "Scr", "-", "shRNA", ":", "n", "=", "53", ";", "SP", "-", "shRNA", ":", "n", "=", "62", ",", "n", "indicates", "the", "number", "of", "cells", ",", "from", "3", "cultures", ";", "normalized", "to", "empty", "vector", "condition", ")", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "(", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "followed", "by", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ")", ".", "(", "E", ")", "Fraction", "of", "SP", "+", "synapses", "for", "same", "conditions", ".", "(", "EV", ":", "n", "=", "47", ";", "Scr", "-", "shRNA", ":", "n", "=", "53", ";", "SP", "-", "shRNA", ":", "n", "=", "62", ",", "n", "indicates", "the", "number", "of", "cells", "from", "3", "cultures", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "followed", "by", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "mean", "±", "SEM", ".", "(", "F", ")", "Homer1c", "-", "DsRed", "(", "red", ")", "and", "immunostained", "surface", "AMPARs", "(", "green", ")", "in", "dendrites", "from", "neurons", "transfected", "with", "either", "SP", "-", "shRNA", "-", "GFP", "or", "empty", "vector", "(", "EV", ")", "with", "GFP", "reporter", "(", "blue", ")", "and", "treated", "with", "TTX", "or", "left", "untreated", "(", "UT", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "µm", ".", "(", "G", ")", "AMPAR", "synaptic", "fluorescence", "intensity", "normalized", "to", "untreated", "empty", "vector", "(", "EV", ")", "condition", "(", "EV", ":", "UT", ",", "n", "=", "42", ",", "TTX", ",", "n", "=", "33", ";", "SP", "-", "shRNA", ":", "UT", ",", "n", "=", "30", ",", "TTX", ",", "n", "=", "31", ",", "n", "indicates", "the", "number", "of", "cells", ",", "from", "3", "cultures", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "ns", ",", "not", "significant", ",", "P", ">", "0", ".", "05", "(", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "followed", "by", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "represent", "mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Immunoblot analysis of SP in lysates from COS-7 cells which were untransfected, transfected with RFP-SP + empty vector or co-transfected with SP-shRNA-GFP + RFP-SP (knock-down) or shRNA-resistant RFP-SP (rescue). β-actin and GFP signals illustrate equal protein loading and SP-shRNA expression level, respectively. (B) Quantification of SP expression from 6 different experiments, normalized to the β-actin signal. *P < 0.05, ns, not significant, P > 0.05 (Kruskal-Wallis test followed by Dunn's multiple comparison test). Data information: Data represent mean ± SEM.(C) Homer-DsRed (green) and immunostained endogenous SP (red) in dendrites from neurons transfected with either empty vector, scramble shRNA or SP-shRNA with GFP reporter (blue). Scale bar: 10 µm. (D) Average SP intensity for same conditions (EV: n = 47; Scr-shRNA: n = 53; SP-shRNA: n = 62, n indicates the number of cells, from 3 cultures; normalized to empty vector condition). **P < 0.01, ****P < 0.0001 (Kruskal-Wallis test followed by Dunn's multiple comparison test). (E) Fraction of SP+ synapses for same conditions. (EV: n = 47; Scr-shRNA: n = 53; SP-shRNA: n = 62, n indicates the number of cells from 3 cultures). *P < 0.05 (Kruskal-Wallis test followed by Dunn's multiple comparison test). Data information: Data represent mean ± SEM.(F) Homer1c-DsRed (red) and immunostained surface AMPARs (green) in dendrites from neurons transfected with either SP-shRNA-GFP or empty vector (EV) with GFP reporter (blue) and treated with TTX or left untreated (UT). Scale bar: 5 µm. (G) AMPAR synaptic fluorescence intensity normalized to untreated empty vector (EV) condition (EV: UT, n = 42, TTX, n = 33; SP-shRNA: UT, n = 30, TTX, n = 31, n indicates the number of cells, from 3 cultures). *P < 0.05, **P < 0.01, ns, not significant, P > 0.05 (Kruskal-Wallis test followed by Dunn's multiple comparison test). Data information: Data represent mean ± SEM."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Micrographs", "showing", "Homer1c", "-", "GFP", "(", "green", ")", "and", "immunostaining", "for", "surface", "AMPARs", "(", "blue", ")", "and", "endogenous", "SP", "(", "red", ")", "in", "neurons", "transfected", "with", "miR", "-", "124", "or", "control", "miR", "-", "67", "(", "miR", "-", "Ctrl", ")", ",", "and", "treated", "with", "TTX", ",", "or", "left", "untreated", "(", "UT", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "µ", "(", "B", ")", "Percentage", "of", "SP", "+", "synapses", "for", "same", "conditions", "as", "in", "(", "A", ")", "(", "miR", "-", "Ctrl", ":", "UT", ",", "n", "=", "25", ",", "TTX", ",", "n", "=", "26", ";", "miR", "-", "124", ":", "UT", ",", "n", "=", "30", ",", "TTX", ",", "n", "=", "30", ",", "n", "indicates", "the", "number", "of", "cells", ",", "from", "3", "cultures", ")", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "ns", ",", "not", "significant", ",", "P", ">", "0", ".", "05", "(", "two", "-", "way", "ANOVA", "test", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ")", ".", "(", "C", ")", "Homer1c", "-", "GFP", "intensity", "for", "same", "condition", "as", "in", "(", "A", ")", ",", "normalized", "to", "untreated", "miR", "-", "Ctrl", "(", "miR", "-", "Ctrl", ":", "UT", ",", "n", "=", "25", ",", "TTX", ",", "n", "=", "26", ";", "miR", "-", "124", ":", "UT", ",", "n", "=", "30", ",", "TTX", ",", "n", "=", "30", ",", "n", "indicates", "the", "number", "of", "cells", ",", "from", "3", "cultures", ")", ".", "ns", ",", "not", "significant", ",", "P", ">", "0", ".", "05", "(", "two", "-", "way", "ANOVA", "test", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ")", ".", "(", "D", ")", "AMPAR", "synaptic", "fluorescence", "intensity", "for", "same", "condition", "as", "in", "(", "A", ")", ",", "normalized", "to", "untreated", "miR", "-", "Ctrl", "(", "miR", "-", "Ctrl", ":", "UT", ",", "n", "=", "25", ",", "TTX", ",", "n", "=", "26", ",", "miR", "-", "124", ":", "UT", ",", "n", "=", "30", ",", "TTX", ",", "n", "=", "30", ",", "n", "indicates", "the", "number", "of", "cells", ",", "from", "3", "cultures", ")", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "ns", ",", "not", "significant", ",", "P", ">", "0", ".", "05", "(", "two", "-", "way", "ANOVA", "test", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Micrographs showing Homer1c-GFP (green) and immunostaining for surface AMPARs (blue) and endogenous SP (red) in neurons transfected with miR-124 or control miR-67 (miR-Ctrl), and treated with TTX, or left untreated (UT). Scale bar: 5 µ (B) Percentage of SP+ synapses for same conditions as in (A) (miR-Ctrl: UT, n = 25, TTX, n = 26; miR-124: UT, n = 30, TTX, n = 30, n indicates the number of cells, from 3 cultures). ****P < 0.0001, ns, not significant, P > 0.05 (two-way ANOVA test followed by Tukey's multiple comparison test). (C) Homer1c-GFP intensity for same condition as in (A), normalized to untreated miR-Ctrl (miR-Ctrl: UT, n = 25, TTX, n = 26; miR-124: UT, n = 30, TTX, n = 30, n indicates the number of cells, from 3 cultures). ns, not significant, P > 0.05 (two-way ANOVA test followed by Tukey's multiple comparison test). (D) AMPAR synaptic fluorescence intensity for same condition as in (A), normalized to untreated miR-Ctrl (miR-Ctrl: UT, n = 25, TTX, n = 26, miR-124: UT, n = 30, TTX, n = 30, n indicates the number of cells, from 3 cultures). ***P < 0.001, *P < 0.01, ns, not significant, P > 0.05 (two-way ANOVA test followed by Tukey's multiple comparison test). Data information: Data are represented as mean ± SEM."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Micrographs", "showing", "dendrites", "from", "neurons", "transfected", "with", "Homer1c", "-", "DsRed", "(", "magenta", ")", "and", "SEP", "-", "GluA2", "constructs", "containing", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "or", "mutated", "(", "MUT", ")", "3", "'", "UTR", "(", "green", ")", "and", "treated", "with", "TTX", "for", "48", "h", ",", "or", "left", "untreated", "(", "UT", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "µm", ".", "(", "B", ")", "SEP", "-", "GluA2", "synaptic", "fluorescence", "intensity", "for", "each", "condition", ",", "normalized", "to", "GluA2", "-", "3", "'", "UTR", "-", "WT", "untreated", "neurons", "(", "3", "'", "UTR", "-", "WT", ":", "UT", ",", "n", "=", "29", ",", "TTX", ",", "n", "=", "37", ";", "3", "'", "UTR", "-", "MUT", ":", "UT", ",", "n", "=", "18", ",", "TTX", ",", "n", "=", "14", ";", "n", "indicates", "the", "number", "of", "cells", ",", "from", "3", "cultures", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "ns", ",", "not", "significant", ",", "P", ">", "0", ".", "05", "(", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "followed", "by", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "(", "C", ")", "Micrographs", "showing", "dendrites", "from", "neurons", "transfected", "with", "Homer1c", "-", "BFP", "(", "magenta", ")", ",", "GFP", "-", "SP", "-", "shRNA", "(", "gray", ")", "and", "a", "rescue", "RFP", "-", "SP", "construct", "containing", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "or", "mutated", "(", "MUT", ")", "3", "'", "UTR", "(", "geen", ")", "and", "treated", "with", "TTX", ",", "or", "left", "untreated", "(", "UT", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "µm", ".", "(", "D", ")", "Percentage", "of", "SP", "+", "synapses", "for", "each", "condition", "(", "3", "'", "UTR", "-", "WT", ":", "UT", ",", "n", "=", "26", ",", "TTX", ",", "n", "=", "28", ";", "3", "'", "UTR", "-", "MUT", ":", "UT", ",", "n", "=", "26", ",", "TTX", ",", "n", "=", "24", ";", "n", "indicates", "the", "number", "of", "cells", ",", "from", "3", "cultures", ")", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "ns", ",", "not", "significant", ",", "P", ">", "0", ".", "05", "(", "two", "-", "way", "ANOVA", "test", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "(", "E", ")", "Micrographs", "showing", "Homer1c", "-", "GFP", "(", "magenta", ")", "and", "immunostaining", "for", "surface", "AMPARs", "(", "cyan", ")", "and", "endogenous", "SP", "(", "green", ")", "in", "neurons", "transfected", "with", "or", "without", "50", "nM", "SP", "TSB", "-", "LNA", "and", "treated", "with", "TTX", ",", "or", "left", "untreated", "(", "UT", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "µm", ".", "(", "F", ")", "Percentage", "of", "SP", "+", "synapses", "for", "each", "condition", "(", "Control", ":", "UT", ",", "n", "=", "36", ",", "TTX", ",", "n", "=", "52", ";", "SP", "TSB", "-", "LNA", ":", "UT", ",", "n", "=", "62", ",", "TTX", ",", "n", "=", "29", ";", "n", "indicates", "the", "number", "of", "cells", "from", "3", "cultures", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "ns", ",", "not", "significant", ",", "P", ">", "0", ".", "05", "(", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "followed", "by", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ")", ".", "(", "G", ")", "AMPAR", "synaptic", "fluorescence", "intensity", "for", "each", "condition", ",", "normalized", "to", "control", "untreated", "neurons", "(", "Control", ":", "UT", ",", "n", "=", "30", ",", "TTX", ",", "n", "=", "36", ";", "SP", "TSB", "-", "LNA", ":", "UT", ",", "n", "=", "37", ",", "TTX", ",", "n", "=", "20", ";", "n", "indicates", "the", "number", "of", "cells", "from", "2", "cultures", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "ns", ",", "not", "significant", ",", "P", ">", "0", ".", "05", "(", "Kruskal", "-", "Wallis", "test", "followed", "by", "Dunn", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Micrographs showing dendrites from neurons transfected with Homer1c-DsRed (magenta) and SEP-GluA2 constructs containing wild-type (WT) or mutated (MUT) 3'UTR (green) and treated with TTX for 48 h, or left untreated (UT). Scale bar: 10 µm. (B) SEP-GluA2 synaptic fluorescence intensity for each condition, normalized to GluA2-3'UTR-WT untreated neurons (3'UTR-WT: UT, n = 29, TTX, n = 37; 3'UTR-MUT: UT, n = 18, TTX, n = 14; n indicates the number of cells, from 3 cultures). *P < 0.05, ns, not significant, P > 0.05 (Kruskal-Wallis test followed by Dunn's multiple comparison test). Data information: Data are represented as mean ± SEM.(C) Micrographs showing dendrites from neurons transfected with Homer1c-BFP (magenta), GFP-SP-shRNA (gray) and a rescue RFP-SP construct containing wild-type (WT) or mutated (MUT) 3'UTR (geen) and treated with TTX, or left untreated (UT). Scale bar: 10 µm. (D) Percentage of SP+ synapses for each condition (3'UTR-WT: UT, n = 26, TTX, n = 28; 3'UTR-MUT: UT, n = 26, TTX, n = 24; n indicates the number of cells, from 3 cultures). **P < 0.01, ***P < 0.001, ns, not significant, P > 0.05 (two-way ANOVA test followed by Tukey's multiple comparison test). Data information: Data are represented as mean ± SEM.(E) Micrographs showing Homer1c-GFP (magenta) and immunostaining for surface AMPARs (cyan) and endogenous SP (green) in neurons transfected with or without 50 nM SP TSB-LNA and treated with TTX, or left untreated (UT). Scale bar: 10 µm. (F) Percentage of SP+ synapses for each condition (Control: UT, n = 36, TTX, n = 52; SP TSB-LNA: UT, n = 62, TTX, n = 29; n indicates the number of cells from 3 cultures). *P < 0.05, **P < 0.01, ns, not significant, P > 0.05 (Kruskal-Wallis test followed by Dunn's multiple comparison test). (G) AMPAR synaptic fluorescence intensity for each condition, normalized to control untreated neurons (Control: UT, n = 30, TTX, n = 36; SP TSB-LNA: UT, n = 37, TTX, n = 20; n indicates the number of cells from 2 cultures). *P < 0.05, ns, not significant, P > 0.05 (Kruskal-Wallis test followed by Dunn's multiple comparison test). Data information: Data are represented as mean ± SEM."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Micrographs", "showing", "puro", "-", "PLA", "staining", "of", "newly", "synthesized", "SP", "(", "green", ")", "in", "neurons", "immunostained", "for", "MAP", "-", "2", "(", "magenta", ")", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", "and", "treated", "with", "TTX", "for", "24", "h", "or", "left", "untreated", ".", "The", "images", "on", "bottom", "panels", "show", "no", "staining", "in", "the", "absence", "of", "puromycin", "treatment", "or", "when", "omitting", "SP", "primary", "antibody", ".", "Scale", "bars", ":", "30", "µm", "(", "large", "view", ")", ",", "5", "µm", "(", "insets", ")", ".", "(", "C", ")", "Density", "of", "SP", "puro", "-", "PLA", "puncta", ",", "normalized", "to", "the", "untreated", "condition", "(", "UT", ")", "(", "UT", ":", "n", "=", "62", ";", "TTX", ":", "n", "=", "57", ",", "n", "represents", "the", "number", "of", "cells", ",", "from", "3", "cultures", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "Mann", "-", "Whitney", "test", ")", ".", "(", "D", ")", "SP", "puro", "-", "PLA", "cluster", "fluorescence", "intensity", "normalized", "to", "the", "untreated", "condition", "(", "UT", ")", "(", "UT", ":", "n", "=", "62", ";", "TTX", ":", "n", "=", "57", ",", "n", "indicates", "the", "number", "of", "cells", ",", "from", "3", "cultures", ")", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "(", "Mann", "-", "Whitney", "test", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "(", "E", ")", "Micrographs", "showing", "puro", "-", "PLA", "staining", "of", "newly", "synthesized", "SP", "(", "green", ")", "in", "neurons", "transfected", "with", "Homer1c", "-", "GFP", "(", "magenta", ")", "and", "treated", "with", "TTX", "for", "24", "h", "or", "left", "untreated", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "µm", ".", "Arrowheads", "indicate", "puro", "-", "PLA", "+", "spines", ".", "(", "F", ")", "Percentage", "of", "SP", "puro", "-", "PLA", "+", "synapses", "(", "UT", ",", "n", "=", "26", ",", "TTX", ",", "n", "=", "33", ";", "n", "indicates", "the", "number", "of", "cells", ",", "from", "2", "cultures", ")", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "ns", ",", "not", "significant", "(", "Mann", "-", "Whitney", "test", ")", ".", "(", "G", ")", "Homer1c", "-", "GFP", "integrated", "fluorescence", "intensity", "at", "SP", "puro", "-", "PLA", "-", "vs", "SP", "puro", "-", "PLA", "+", "synapses", "(", "n", "=", "32", "cells", ",", "from", "2", "cultures", ")", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "ns", ",", "not", "significant", "(", "Wilcoxon", "matched", "-", "pairs", "signed", "rank", "test", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Micrographs showing puro-PLA staining of newly synthesized SP (green) in neurons immunostained for MAP-2 (magenta) and DAPI (blue) and treated with TTX for 24 h or left untreated. The images on bottom panels show no staining in the absence of puromycin treatment or when omitting SP primary antibody. Scale bars: 30 µm (large view), 5 µm (insets).(C) Density of SP puro-PLA puncta, normalized to the untreated condition (UT) (UT: n = 62; TTX: n = 57, n represents the number of cells, from 3 cultures). *P < 0.05 (Mann-Whitney test). (D) SP puro-PLA cluster fluorescence intensity normalized to the untreated condition (UT) (UT: n = 62; TTX: n = 57, n indicates the number of cells, from 3 cultures). ****P < 0.0001 (Mann-Whitney test). Data information: Data are represented as mean ± SEM.(E) Micrographs showing puro-PLA staining of newly synthesized SP (green) in neurons transfected with Homer1c-GFP (magenta) and treated with TTX for 24 h or left untreated. Scale bar: 5 µm. Arrowheads indicate puro-PLA+ spines. (F) Percentage of SP puro-PLA+ synapses (UT, n = 26, TTX, n = 33; n indicates the number of cells, from 2 cultures). **P < 0.01, ns, not significant (Mann-Whitney test). (G) Homer1c-GFP integrated fluorescence intensity at SP puro-PLA- vs SP puro-PLA+ synapses (n = 32 cells, from 2 cultures). ****P < 0.0001, ns, not significant (Wilcoxon matched-pairs signed rank test). Data information: Data are represented as mean ± SEM."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "A", ")", "Confocal", "images", "showing", "dendrites", "from", "CA3", "pyramidal", "cells", "transfected", "with", "RFP", "-", "SP", "(", "green", ")", "containing", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "or", "mutated", "(", "MUT", ")", "3", "'", "UTR", "+", "SP", "-", "shRNA", "-", "BFP", "(", "magenta", ")", ".", "Arrowheads", "indicate", "SP", "+", "spines", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "µm", ".", "(", "B", ")", "Graph", "plot", "showing", "spine", "head", "volume", "vs", "SP", "integrated", "intensity", "(", "n", "=", "5", "cells", ")", ".", "Each", "plot", "represents", "a", "single", "spine", "for", "which", "SP", "integrated", "intensity", "has", "been", "normalized", "to", "average", "SP", "intensity", "of", "SP", "+", "spines", "in", "the", "same", "neuron", ".", "Plots", "for", "SP", "-", "and", "SP", "+", "spines", "appear", "in", "grey", "and", "magenta", ",", "respectively", ".", "The", "black", "dotted", "line", "represents", "linear", "regression", "(", "R2", "=", "0", ".", "25", ",", "P", "=", "0", ".", "0004", ")", ".", "(", "C", ")", "Paired", "data", "showing", "spine", "head", "volume", "for", "SP", "-", "vs", "SP", "+", "spines", ".", "Each", "pair", "of", "plot", "represents", "average", "values", "for", "SP", "-", "vs", "SP", "+", "spines", "for", "a", "given", "neuron", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0031", "(", "two", "-", "tailed", "Student", "t", "test", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(A) Confocal images showing dendrites from CA3 pyramidal cells transfected with RFP-SP (green) containing wild-type (WT) or mutated (MUT) 3'UTR + SP-shRNA-BFP (magenta). Arrowheads indicate SP+ spines. Scale bar: 10 µm. (B) Graph plot showing spine head volume vs SP integrated intensity (n = 5 cells). Each plot represents a single spine for which SP integrated intensity has been normalized to average SP intensity of SP+ spines in the same neuron. Plots for SP- and SP+ spines appear in grey and magenta, respectively. The black dotted line represents linear regression (R2 = 0.25, P = 0.0004). (C) Paired data showing spine head volume for SP- vs SP+ spines. Each pair of plot represents average values for SP- vs SP+ spines for a given neuron. *P = 0.0031 (two-tailed Student t test). Data information: Data are represented as mean ± SEM."}
{"words": ["Figure", "9", "(", "F", ")", "Higher", "magnification", "of", "dendritic", "spines", "from", "neurons", "transfected", "with", "rescue", "RFP", "-", "SP", "(", "magenta", ")", "containing", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "or", "mutated", "(", "MUT", ")", "3", "'", "UTR", "and", "BFP", "-", "shRNA", "-", "SP", "(", "grey", ")", "and", "contacted", "by", "GFP", "-", "Syp", "+", "terminals", "(", "green", ")", ".", "Arrowheads", "indicate", "putative", "synaptic", "contacts", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "μm", ".", "(", "G", ")", "Percentage", "of", "SP", "+", "spines", "in", "neurons", "expressing", "RFP", "-", "SP", "-", "3", "'", "UTR", "-", "WT", "vs", "-", "MUT", "and", "depending", "on", "the", "apposition", "or", "not", "to", "a", "GFP", "-", "Syp", "+", "terminal", "(", "SP", "-", "3", "'", "UTR", "-", "WT", ":", "TetTx", "-", ",", "n", "=", "220", ",", "TetTx", "+", ",", "n", "=", "26", ";", "SP", "-", "3", "'", "UTR", "-", "MUT", ":", "TetTx", "-", ",", "n", "=", "616", ",", "TetTx", "+", ",", "n", "=", "25", ";", "n", "indicates", "the", "number", "of", "spines", "from", "5", "-", "7", "pairs", ")", ".", "(", "H", ")", "Spine", "head", "volume", "in", "same", "conditions", "as", "in", "(", "G", ")", "(", "SP", "-", "3", "'", "UTR", "-", "WT", ":", "TetTx", "-", ",", "n", "=", "26", ",", "TetTx", "+", ",", "n", "=", "26", "spines", "from", "5", "pairs", ",", "4", "slices", ";", "SP", "-", "3", "'", "UTR", "-", "MUT", ":", "TetTx", "-", ",", "n", "=", "25", ",", "TetTx", "+", ",", "n", "=", "25", ";", "n", "indicates", "the", "number", "of", "spines", "from", "7", "pairs", ",", "7", "slices", ")", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "ns", ",", "not", "significant", "(", "Kruskall", "-", "Wallis", "test", "followed", "by", "Dunn", "'", "s", "multiple", "test", ")", ".", "(", "I", ")", "Cumulative", "probability", "distributions", "of", "spine", "head", "volumes", "for", "TetTx", "-", "and", "TetTx", "+", "spines", "from", "neurons", "expressing", "RFP", "-", "SP", "-", "3", "'", "UTR", "-", "WT", "(", "SP", "-", "WT", ",", "light", "gray", "and", "light", "green", ")", "or", "RFP", "-", "SP", "-", "3", "'", "UTR", "-", "MUT", "(", "SP", "-", "MUT", ",", "dark", "gray", "and", "dark", "green", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 9(F) Higher magnification of dendritic spines from neurons transfected with rescue RFP-SP (magenta) containing wild-type (WT) or mutated (MUT) 3'UTR and BFP-shRNA-SP (grey) and contacted by GFP-Syp+ terminals (green). Arrowheads indicate putative synaptic contacts. Scale bar: 5 μm. (G) Percentage of SP+ spines in neurons expressing RFP-SP-3'UTR-WT vs -MUT and depending on the apposition or not to a GFP-Syp+ terminal (SP-3'UTR-WT: TetTx-, n = 220, TetTx+, n = 26; SP-3'UTR-MUT: TetTx-, n = 616, TetTx+, n = 25; n indicates the number of spines from 5-7 pairs). (H) Spine head volume in same conditions as in (G) (SP-3'UTR-WT: TetTx-, n = 26, TetTx+, n = 26 spines from 5 pairs, 4 slices; SP-3'UTR-MUT: TetTx-, n = 25, TetTx+, n = 25; n indicates the number of spines from 7 pairs, 7 slices). ***P < 0.001, *P < 0.05, ns, not significant (Kruskall-Wallis test followed by Dunn's multiple test). (I) Cumulative probability distributions of spine head volumes for TetTx- and TetTx+ spines from neurons expressing RFP-SP-3'UTR-WT (SP-WT, light gray and light green) or RFP-SP-3'UTR-MUT (SP-MUT, dark gray and dark green). Data information: Data are represented as mean ± SEM."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "c", ")", "Intravascular", "endothelial", "cell", "interactions", "and", "transmigration", "of", "neutrophils", "(", "Ly", "-", "6G", "+", "CX3CR", "-", "1", "-", ";", "red", ")", "and", "cMOs", "(", "Ly", "-", "6G", "-", "CX3CR", "-", "1low", ";", "green", ")", "to", "the", "perivascular", "tissue", "as", "assessed", "6", "h", "after", "intrascrotal", "stimulation", "with", "recombinant", "murine", "uPA", ",", "PAI", "-", "1", ",", "or", "uPA", "-", "PAI", "-", "1", "in", "postcapillary", "venules", "of", "the", "cremaster", "of", "CX3CR", "-", "1GFP", "/", "+", "mice", "by", "multi", "-", "channel", "in", "vivo", "microscopy", ".", "Representative", "still", "images", "(", "scale", "bar", ":", "50", ":", "µm", ")", "and", "quantitative", "data", "are", "shown", "(", "mean", "±", "SEM", "for", "n", "=", "4", "mice", "per", "group", ";", "#", "p", "<", "0", ".", "05", "vs", ".", "saline", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "vs", ".", "uPA", ";", "§", "p", "<", "0", ".", "05", "vs", ".", "PAI", "-", "1", ";", "One", "-", "way", "ANOVA", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(c) Intravascular endothelial cell interactions and transmigration of neutrophils (Ly-6G+ CX3CR-1-; red) and cMOs (Ly-6G- CX3CR-1low; green) to the perivascular tissue as assessed 6 h after intrascrotal stimulation with recombinant murine uPA, PAI-1, or uPA-PAI-1 in postcapillary venules of the cremaster of CX3CR-1GFP/+ mice by multi-channel in vivo microscopy. Representative still images (scale bar: 50: µm) and quantitative data are shown (mean±SEM for n=4 mice per group; #p<0.05 vs. saline; *p<0.05 vs. uPA; §p<0.05 vs. PAI-1; One-way ANOVA)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "b", ")", "Expression", "of", "PECAM", "-", "1", "/", "CD31", "(", "red", ")", "and", "ICAM", "-", "1", "/", "CD54", "or", "VCAM", "-", "1", "/", "CD106", "(", "green", ")", "in", "the", "cremaster", "muscle", "of", "WT", "mice", "as", "assessed", "ex", "vivo", "by", "confocal", "laser", "scanning", "microscopy", "6", "h", "after", "intrascrotal", "injection", "of", "recombinant", "murine", "uPA", "-", "PAI", "-", "1", "or", "saline", ",", "representative", "images", "(", "scale", "bar", ":", "50", "µm", ")", "and", "quantitative", "data", "are", "shown", "(", "mean", "±", "SEM", "for", "n", "=", "4", "mice", "per", "group", ";", "#", "p", "<", "0", ".", "05", "vs", ".", "saline", ";", "t", "test", ")", ".", "(", "g", ")", "Quantitative", "analysis", "of", "LFA", "-", "1", "/", "CD11a", "clustering", "on", "the", "surface", "of", "mouse", "neutrophils", "under", "increasing", "flow", "conditions", "in", "vitro", "in", "the", "presence", "of", "either", "E", "-", "selectin", "/", "CD62E", "+", "ICAM", "-", "1", "/", "CD54", ",", "E", "-", "selectin", "/", "CD62E", "+", "ICAM", "-", "1", "/", "CD54", "+", "KC", ",", "or", "E", "-", "selectin", "/", "CD62E", "+", "ICAM", "-", "1", "/", "CD54", "+", "KC", "+", "uPA", "-", "PAI", "-", "1", "as", "assessed", "by", "spinning", "disk", "confocal", "microscopy", ",", "representative", "images", "and", "quantitative", "data", "are", "shown", "(", "scale", "bar", ":", "10", "μm", ";", "mean", "±", "SD", ";", "n", "=", "3", "mice", ";", "n", "=", "10", "-", "13", "flow", "chambers", ",", "n", "=", "122", "-", "222", "cells", ")", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "vs", ".", "E", "-", "selectin", "/", "CD62E", "+", "ICAM", "-", "1", "/", "CD54", ";", "One", "-", "way", "ANOVA", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(b) Expression of PECAM-1/CD31 (red) and ICAM-1/CD54 or VCAM-1/CD106 (green) in the cremaster muscle of WT mice as assessed ex vivo by confocal laser scanning microscopy 6 h after intrascrotal injection of recombinant murine uPA-PAI-1 or saline, representative images (scale bar: 50 µm) and quantitative data are shown (mean±SEM for n=4 mice per group; #p<0.05 vs. saline; t test).(g) Quantitative analysis of LFA-1/CD11a clustering on the surface of mouse neutrophils under increasing flow conditions in vitro in the presence of either E-selectin/CD62E + ICAM-1/CD54, E-selectin/CD62E + ICAM-1/CD54 + KC, or E-selectin/CD62E + ICAM-1/CD54 + KC + uPA-PAI-1 as assessed by spinning disk confocal microscopy, representative images and quantitative data are shown (scale bar: 10 μm; mean±SD; n=3 mice; n=10-13 flow chambers, n =122-222 cells); *p<0.05 vs. E-selectin/CD62E + ICAM-1/CD54; One-way ANOVA)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "b", ")", "Correlation", "analyses", "of", "RNA", "expression", "levels", "of", "uPA", "(", "PLAU", "gene", ")", ",", "PAI", "-", "1", "(", "SERPINE1", "gene", ")", ",", "and", "the", "neutrophil", "marker", "gene", "FPR1", ",", "and", "overall", "survival", "of", "breast", "cancer", "patients", "(", "stages", "0", "and", "1", ")", "with", "high", "and", "low", "PLAU", "or", "SERPINE1", "gene", "expression", "levels", "(", "cut", "-", "off", "z", "≥", "2", ".", "0", ")", "in", "the", "METABRIC", "breast", "cancer", "cohort", ".", "(", "c", ")", "Surface", "expression", "of", "MMP", "-", "9", ",", "VEGF", ",", "and", "NE", "as", "assessed", "on", "circulating", "neutrophils", "isolated", "from", "the", "peripheral", "blood", "of", "WT", "mice", "(", "saline", ")", "or", "from", "the", "peritoneal", "cavity", "of", "WT", "mice", "6", "h", "after", "intraperitoneal", "stimulation", "with", "uPA", "-", "PAI", "-", "1", "(", "uPA", "-", "PAI", "-", "1", ")", "by", "multi", "-", "channel", "flow", "cytometry", ",", "quantitative", "data", "are", "shown", "(", "mean", "±", "SEM", "for", "n", "=", "4", "-", "6", "mice", "per", "group", ";", "#", "p", "<", "0", ".", "05", "vs", ".", "saline", ";", "t", "test", ")", ".", "(", "f", ")", "Formation", "of", "NETs", "(", "histone", "H3", "+", ";", "green", ")", "as", "assessed", "ex", "vivo", "by", "confocal", "microscopy", "in", "the", "cremaster", "muscle", "of", "WT", "mice", "6", "h", "after", "intra", "-", "scrotal", "injection", "of", "uPA", "-", "PAI", "-", "1", ",", "TNF", ",", "or", "saline", ",", "PECAM", "-", "1", "/", "CD31", "+", "postcapillary", "venules", "(", "blue", ")", "and", "Ly", "-", "6G", "+", "neutrophils", "(", "red", ")", "are", "depicted", ".", "Representative", "images", "are", "shown", "(", "scale", "bar", ":", "50", "µm", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(b) Correlation analyses of RNA expression levels of uPA (PLAU gene), PAI-1 (SERPINE1 gene), and the neutrophil marker gene FPR1, and overall survival of breast cancer patients (stages 0 and 1) with high and low PLAU or SERPINE1 gene expression levels (cut-off z≥ 2.0) in the METABRIC breast cancer cohort.(c) Surface expression of MMP-9, VEGF, and NE as assessed on circulating neutrophils isolated from the peripheral blood of WT mice (saline) or from the peritoneal cavity of WT mice 6 h after intraperitoneal stimulation with uPA-PAI-1 (uPA-PAI-1) by multi-channel flow cytometry, quantitative data are shown (mean±SEM for n=4-6 mice per group; #p<0.05 vs. saline; t test).(f) Formation of NETs (histone H3+; green) as assessed ex vivo by confocal microscopy in the cremaster muscle of WT mice 6 h after intra-scrotal injection of uPA-PAI-1, TNF, or saline, PECAM-1/CD31+ postcapillary venules (blue) and Ly-6G+ neutrophils (red) are depicted. Representative images are shown (scale bar: 50 µm)."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "a", ")", "Effect", "of", "compound", "WX", "-", "340", "on", "binding", "of", "recombinant", "murine", "uPA", "to", "PAI", "-", "1", "protein", "as", "assessed", "by", "ELISA", ",", "quantitative", "data", "are", "shown", "(", "mean", "±", "SEM", "for", "n", "=", "3", "experiments", "per", "group", ";", "#", "p", "<", "0", ".", "05", "vs", ".", "drug", "vehicle", ";", "One", "-", "way", "ANOVA", ")", ".", "(", "d", ")", "Relative", "development", "rates", "and", "tumor", "weight", "in", "animals", "treated", "with", "WX", "-", "340", "a", "priori", "or", "therapeutically", "after", "1", "week", "after", "tumor", "cell", "injection", "on", "a", "daily", "basis", "as", "assessed", "in", "an", "orthotopic", "model", "of", "4T1", "breast", "cancer", "in", "WT", "mice", "(", "mean", "±", "SEM", "for", "n", "=", "4", "-", "6", "mice", "per", "group", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "vs", ".", "drug", "vehicle", ";", "One", "-", "way", "ANOVA", ")", ".", "(", "f", ")", "Numbers", "of", "neutrophils", "and", "4T1", "tumor", "cells", "in", "lungs", "and", "brain", "of", "WT", "mice", "receiving", "WX", "-", "340", "or", "vehicle", "therapeutically", "after", "1", "week", "after", "tumor", "cell", "injection", "on", "a", "daily", "basis", "as", "assessed", "14", "days", "after", "intravenous", "injection", "of", "4T1", "tumor", "cells", "by", "multi", "-", "channel", "flow", "cytometry", ",", "quantitative", "data", "are", "shown", "(", "mean", "±", "SEM", "for", "n", "=", "4", "-", "6", "mice", "per", "group", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "vs", ".", "drug", "vehicle", ";", "t", "test", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(a) Effect of compound WX-340 on binding of recombinant murine uPA to PAI-1 protein as assessed by ELISA, quantitative data are shown (mean±SEM for n=3 experiments per group; #p<0.05 vs. drug vehicle; One-way ANOVA).(d) Relative development rates and tumor weight in animals treated with WX-340 a priori or therapeutically after 1 week after tumor cell injection on a daily basis as assessed in an orthotopic model of 4T1 breast cancer in WT mice (mean±SEM for n=4-6 mice per group; *p<0.05 vs. drug vehicle; One-way ANOVA).(f) Numbers of neutrophils and 4T1 tumor cells in lungs and brain of WT mice receiving WX-340 or vehicle therapeutically after 1 week after tumor cell injection on a daily basis as assessed 14 days after intravenous injection of 4T1 tumor cells by multi-channel flow cytometry, quantitative data are shown (mean±SEM for n=4-6 mice per group; *p<0.05 vs. drug vehicle; t test)."}
{"words": ["Figure", "1C", "Immunofluorescent", "analyses", "of", "USP33", "(", "red", ")", ",", "the", "hypoxia", "marker", "CA9", "(", "green", ")", ",", "and", "the", "stem", "cell", "marker", "SOX2", "(", "gray", ")", "in", "human", "primary", "GBMs", ".", "Arrows", "indicate", "the", "USP33", "+", "/", "CA9", "+", "/", "SOX2", "+", "cells", ".", "Scale", "bar", ",", "80", "µm", ".", "E", "Immunofluorescent", "analyses", "of", "USP33", "(", "red", ")", "and", "the", "hypoxic", "cell", "population", "labeled", "by", "pimonidazole", "(", "green", ")", "in", "intracranial", "xenografts", "derived", "from", "T3359", "GSCs", ".", "Mice", "bearing", "intracranial", "xenografts", "were", "injected", "intravenously", "(", "tail", "vein", ")", "with", "60", "mg", "/", "kg", "of", "pimonidazole", "and", "were", "sacrificed", "2", "hours", "post", "injection", ".", "Hypoxic", "cells", "were", "labeled", "with", "the", "FITC", "-", "conjugated", "mouse", "monoclonal", "anti", "-", "pimonidazole", "antibody", ".", "Scale", "bar", ",", "80", "µm", ".", "G", "Immunoblot", "analysis", "of", "USP33", ",", "HIF2α", "and", "HIF1α", "protein", "levels", "in", "GSCs", ",", "NSTCs", "and", "NPCs", "in", "normoxic", "and", "hypoxic", "conditions", ".", "Hypoxia", "(", "5", "%", "O2", ")", "relative", "to", "normoxia", "(", "20", "%", "O2", ")", "clearly", "induced", "USP33", "and", "HIF2α", "expression", "in", "GSCs", "but", "not", "NSTCs", "or", "NPCs", ".", "The", "mild", "hypoxia", "of", "5", "%", "O2", "showed", "negligible", "induction", "of", "HIF1α", "in", "all", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1C Immunofluorescent analyses of USP33 (red), the hypoxia marker CA9 (green), and the stem cell marker SOX2 (gray) in human primary GBMs. Arrows indicate the USP33+/CA9+/SOX2+ cells. Scale bar, 80 µm.E Immunofluorescent analyses of USP33 (red) and the hypoxic cell population labeled by pimonidazole (green) in intracranial xenografts derived from T3359 GSCs. Mice bearing intracranial xenografts were injected intravenously (tail vein) with 60 mg/kg of pimonidazole and were sacrificed 2 hours post injection. Hypoxic cells were labeled with the FITC-conjugated mouse monoclonal anti-pimonidazole antibody. Scale bar, 80 µm.G Immunoblot analysis of USP33, HIF2α and HIF1α protein levels in GSCs, NSTCs and NPCs in normoxic and hypoxic conditions. Hypoxia (5% O2) relative to normoxia (20% O2) clearly induced USP33 and HIF2α expression in GSCs but not NSTCs or NPCs. The mild hypoxia of 5% O2 showed negligible induction of HIF1α in all cells."}
{"words": ["Figure", "2A", ",", "Representative", "images", "of", "immunofluorescent", "analyses", "of", "USP33", "(", "red", ")", "and", "HIF2α", "(", "green", ")", "in", "human", "primary", "GBMs", ".", "Frozen", "sections", "of", "human", "GBMs", "were", "immunostained", "with", "antibodies", "against", "USP33", "and", "HIF2α", ",", "and", "counterstained", "with", "DAPI", "to", "show", "nuclei", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "40", "μm", ".", "(", "n", "=", "5", "sections", ";", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", ".", "F", "Immunoblot", "analysis", "of", "ectopic", "HIF2α", "protein", "levels", "in", "293T", "cells", "with", "gradually", "increased", "amount", "of", "ectopic", "USP33", ".", "0", ".", "5", "µg", "of", "HA", "-", "tagged", "HIF2α", "plasmids", "together", "with", "the", "increased", "amounts", "of", "GFP", "-", "tagged", "USP33", "plasmids", "(", "0", ",", "0", ".", "1", ",", "0", ".", "2", "or", "0", ".", "3", "μg", ")", "were", "introduced", "into", "293T", "cells", ".", "Forty", "-", "eight", "hours", "post", "transfection", ",", "levels", "of", "ectopic", "HIF2α", "-", "HA", "and", "GFP", "-", "USP33", "were", "analyzed", "by", "immunoblot", "analysis", ".", "Concomitantly", "increased", "levels", "of", "ectopic", "HIF2α", "and", "USP33", "expression", "indicated", "the", "positive", "regulation", "of", "HIF2α", "protein", "by", "USP33", ".", "G", "Immunoblot", "analysis", "of", "ectopic", "HIF2α", "protein", "levels", "in", "293T", "cells", "expressing", "ectopic", "wild", "type", "(", "WT", ")", "USP33", "or", "the", "catalytically", "dead", "(", "CD", ")", "USP33", ".", "HA", "-", "tagged", "HIF2α", "plasmids", "(", "0", ".", "5", "µg", ")", "were", "introduced", "into", "293T", "cells", "alone", "or", "together", "with", "GFP", "-", "tagged", "WT", "or", "CD", "USP33", "plasmids", "(", "0", ".", "2", "µg", ")", ".", "Levels", "of", "ectopic", "HIF2α", "-", "HA", "and", "GFP", "-", "USP33", "were", "analyzed", "48", "hours", "post", "transfection", ".", "Expression", "of", "the", "wild", "type", "USP33", "but", "not", "the", "catalytically", "dead", "USP33", "increased", "the", "ectopic", "HIF2α", "protein", "levels", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A, Representative images of immunofluorescent analyses of USP33 (red) and HIF2α (green) in human primary GBMs. Frozen sections of human GBMs were immunostained with antibodies against USP33 and HIF2α, and counterstained with DAPI to show nuclei (blue). Scale bar, 40 μm. (n = 5 sections; mean ± s.e.m.).F Immunoblot analysis of ectopic HIF2α protein levels in 293T cells with gradually increased amount of ectopic USP33. 0.5 µg of HA-tagged HIF2α plasmids together with the increased amounts of GFP-tagged USP33 plasmids (0, 0.1, 0.2 or 0.3 μg) were introduced into 293T cells. Forty-eight hours post transfection, levels of ectopic HIF2α-HA and GFP-USP33 were analyzed by immunoblot analysis. Concomitantly increased levels of ectopic HIF2α and USP33 expression indicated the positive regulation of HIF2α protein by USP33. G Immunoblot analysis of ectopic HIF2α protein levels in 293T cells expressing ectopic wild type (WT) USP33 or the catalytically dead (CD) USP33. HA-tagged HIF2α plasmids (0.5 µg) were introduced into 293T cells alone or together with GFP-tagged WT or CD USP33 plasmids (0.2 µg). Levels of ectopic HIF2α-HA and GFP-USP33 were analyzed 48 hours post transfection. Expression of the wild type USP33 but not the catalytically dead USP33 increased the ectopic HIF2α protein levels."}
{"words": ["Figure", "3A", ",", "Co", "-", "immunoprecipitation", "(", "Co", "-", "IP", ")", "to", "detect", "the", "interaction", "between", "endogenous", "HIF2α", "and", "USP33", "in", "GSCs", "in", "response", "to", "low", "oxygen", ".", "GSCs", "were", "cultured", "under", "20", "%", "or", "5", "%", "oxygen", "for", "24", "hours", "before", "harvest", "for", "the", "Co", "-", "IP", ".", "Cell", "lysate", "was", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "HIF2α", "antibodies", ".", "Co", "-", "immunoprecipitated", "products", "were", "immunoblotted", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "An", "increased", "interaction", "between", "HIF2α", "and", "USP33", "was", "detected", "in", "GSCs", "cultured", "under", "5", "%", "oxygen", "relative", "to", "20", "%", "oxygen", ".", "D", "Co", "-", "immunoprecipitation", "(", "Co", "-", "IP", ")", "to", "detect", "the", "interaction", "between", "endogenous", "HIF2α", "and", "USP33", "in", "GSCs", "in", "response", "to", "CoCl2", "treatment", ".", "GSCs", "were", "treated", "with", "CoCl2", "(", "300", "µM", ")", "for", "12", "hours", "before", "harvest", "for", "the", "Co", "-", "IP", ".", "Cell", "lysate", "was", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "USP33", "antibodies", ".", "Co", "-", "immunoprecipitated", "products", "were", "immunoblotted", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "An", "increased", "interaction", "between", "HIF2α", "and", "USP33", "was", "detected", "in", "GSCs", "treated", "with", "CoCl2", "mimicking", "hypoxia", ".", "G", "Co", "-", "immunoprecipitation", "to", "detect", "the", "interaction", "between", "HIF2α", "and", "the", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "or", "the", "catalytically", "dead", "(", "CD", ")", "USP33", ".", "Ectopic", "HA", "-", "tagged", "HIF2α", "were", "expressed", "in", "293T", "cells", "with", "GFP", "-", "tagged", "wild", "-", "type", "or", "catalytically", "dead", "USP33", ".", "Cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "HA", "antibodies", ".", "Co", "-", "immunoprecipitated", "products", "immunoblotted", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "The", "catalytically", "dead", "USP33", "relative", "to", "the", "wild", "type", "USP33", "showed", "a", "stronger", "affinity", "to", "HIF2α", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A, Co-immunoprecipitation (Co-IP) to detect the interaction between endogenous HIF2α and USP33 in GSCs in response to low oxygen. GSCs were cultured under 20% or 5% oxygen for 24 hours before harvest for the Co-IP. Cell lysate was subjected to immunoprecipitation with anti-HIF2α antibodies. Co-immunoprecipitated products were immunoblotted with the indicated antibodies. An increased interaction between HIF2α and USP33 was detected in GSCs cultured under 5% oxygen relative to 20% oxygen.D Co-immunoprecipitation (Co-IP) to detect the interaction between endogenous HIF2α and USP33 in GSCs in response to CoCl2 treatment. GSCs were treated with CoCl2 (300 µM) for 12 hours before harvest for the Co-IP. Cell lysate was subjected to immunoprecipitation with anti-USP33 antibodies. Co-immunoprecipitated products were immunoblotted with the indicated antibodies. An increased interaction between HIF2α and USP33 was detected in GSCs treated with CoCl2 mimicking hypoxia.G Co-immunoprecipitation to detect the interaction between HIF2α and the wild-type (WT) or the catalytically dead (CD) USP33. Ectopic HA-tagged HIF2α were expressed in 293T cells with GFP-tagged wild-type or catalytically dead USP33. Cell lysates were subjected to immunoprecipitation with anti-HA antibodies. Co-immunoprecipitated products immunoblotted with the indicated antibodies. The catalytically dead USP33 relative to the wild type USP33 showed a stronger affinity to HIF2α."}
{"words": ["Figure", "4A", "Immunoblot", "analysis", "of", "the", "serine", "/", "threonine", "phosphorylation", "(", "pS", "/", "T", ")", "status", "of", "HIF2α", "in", "GSCs", "in", "response", "to", "5", "%", "oxygen", ".", "GSCs", "were", "cultured", "under", "20", "%", "or", "5", "%", "oxygen", "for", "24", "hours", ",", "and", "then", "harvested", "for", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "HIF2α", "antibodies", "or", "IgG", "control", ".", "Immunoprecipitated", "endogenous", "HIF2α", "were", "immunoblotted", "with", "anti", "-", "pan", "-", "pS", "/", "T", "antibodies", ".", "An", "increased", "pS", "/", "T", "of", "HIF2α", "was", "detected", "in", "GSCs", "cultured", "under", "5", "%", "oxygen", "relative", "to", "20", "%", "oxygen", ".", "D", "Co", "-", "immunoprecipitation", "to", "detect", "the", "interaction", "between", "endogenous", "HIF2α", "and", "USP33", "in", "GSCs", "after", "inhibition", "of", "ERK1", "/", "2", "activity", ".", "GSCs", "were", "cultured", "under", "20", "%", "or", "5", "%", "oxygen", "for", "24", "hours", ",", "then", "treated", "with", "the", "MEK", "inhibitor", "U0126", "(", "10µM", ")", "for", "30", "minutes", "to", "inhibit", "ERK1", "/", "2", "activity", ",", "and", "harvested", "for", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "USP33", "antibodies", ".", "Co", "-", "immunoprecipitated", "products", "were", "immunoblotted", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "Relative", "to", "20", "%", "oxygen", "treatment", ",", "5", "%", "oxygen", "treatment", "promoted", "the", "interaction", "between", "HIF2α", "and", "USP33", "in", "GSCs", ".", "However", ",", "inhibition", "of", "ERK1", "/", "2", "activity", "by", "U0126", "treatment", "suppressed", "the", "interaction", "between", "HIF2α", "and", "USP33", ".", "G", "Co", "-", "immunoprecipitation", "to", "determine", "the", "serine", "phosphorylation", "sites", "in", "human", "HIF2α", "responsible", "for", "its", "binding", "to", "USP33", ".", "Ectopic", "GFP", "-", "tagged", "USP33", "along", "with", "HA", "-", "tagged", "wild", "type", "HIF2α", "or", "HIF2α", "mutants", "with", "indicated", "serine", "to", "alanine", "point", "mutations", "were", "expressed", "in", "293T", "cells", ".", "Cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "HA", "agaroses", "Co", "-", "immunoprecipitated", "products", "were", "immunoblotted", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "The", "S484A", "mutation", "largely", "attenuated", "the", "interaction", "of", "HIF2α", "with", "USP33", ",", "indicating", "that", "the", "serine", "484", "site", "in", "HIF2α", "was", "the", "most", "important", "phosphorylation", "site", "for", "the", "interaction", "between", "HIF2α", "and", "USP33", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A Immunoblot analysis of the serine/threonine phosphorylation (pS/T) status of HIF2α in GSCs in response to 5% oxygen. GSCs were cultured under 20% or 5% oxygen for 24 hours, and then harvested for immunoprecipitation with anti-HIF2α antibodies or IgG control. Immunoprecipitated endogenous HIF2α were immunoblotted with anti-pan-pS/T antibodies. An increased pS/T of HIF2α was detected in GSCs cultured under 5% oxygen relative to 20% oxygen.D Co-immunoprecipitation to detect the interaction between endogenous HIF2α and USP33 in GSCs after inhibition of ERK1/2 activity. GSCs were cultured under 20% or 5% oxygen for 24 hours, then treated with the MEK inhibitor U0126 (10µM) for 30 minutes to inhibit ERK1/2 activity, and harvested for immunoprecipitation with anti-USP33 antibodies. Co-immunoprecipitated products were immunoblotted with the indicated antibodies. Relative to 20% oxygen treatment, 5% oxygen treatment promoted the interaction between HIF2α and USP33 in GSCs. However, inhibition of ERK1/2 activity by U0126 treatment suppressed the interaction between HIF2α and USP33.G Co-immunoprecipitation to determine the serine phosphorylation sites in human HIF2α responsible for its binding to USP33. Ectopic GFP-tagged USP33 along with HA-tagged wild type HIF2α or HIF2α mutants with indicated serine to alanine point mutations were expressed in 293T cells. Cell lysates were subjected to immunoprecipitation with anti-HA agaroses Co-immunoprecipitated products were immunoblotted with the indicated antibodies. The S484A mutation largely attenuated the interaction of HIF2α with USP33, indicating that the serine 484 site in HIF2α was the most important phosphorylation site for the interaction between HIF2α and USP33."}
{"words": ["Figure", "5B", "Representative", "images", "of", "tumorsphere", "formation", "of", "T387", "GSCs", "expressing", "USP33", "-", "targeting", "shRNA", "(", "shUSP33", ")", "or", "non", "-", "targeting", "shRNA", "(", "shNT", ")", ".", "Twenty", "-", "four", "hours", "after", "lentiviral", "infection", ",", "T387", "GSCs", "expressing", "shUSP33", "or", "shNT", "were", "planted", "in", "96", "well", "plates", "at", "the", "density", "of", "2", ",", "000", "cells", "per", "well", "and", "cultured", "for", "48", "hours", "under", "normoxia", "(", "20", "%", "O2", ")", "or", "hypoxia", "(", "5", "%", "O2", ")", ".", "Disruption", "of", "USP33", "inhibited", "GSC", "tumorsphere", "formation", "in", "normoxia", "and", "dramatically", "suppressed", "GSC", "tumorsphere", "formation", "in", "hypoxia", ".", "Scale", "bar", ",", "200", "μm", ".", "E", "Cell", "titer", "assays", "showing", "cell", "growth", "of", "T387", "GSCs", "expressing", "shUSP33", "or", "shNT", "in", "normoxia", "or", "hypoxia", ".", "GSCs", "were", "transduced", "with", "shNT", "or", "shUSP33", "through", "lentiviral", "infection", "for", "24", "hours", ",", "and", "then", "split", "into", "96", "well", "plates", "at", "the", "concentration", "of", "2", ",", "000", "cells", "per", "well", ".", "Cell", "titer", "was", "determined", "by", "the", "Glo", "luminescent", "cell", "viability", "assay", "kit", "(", "Promega", ")", "at", "the", "indicated", "time", "points", ".", "Disruption", "of", "USP33", "inhibited", "GSC", "growth", "in", "normoxia", "and", "hypoxia", ".", "The", "experiment", "has", "been", "repeated", "three", "times", ".", "The", "presented", "curves", "were", "based", "on", "three", "technical", "replicates", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", "(", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "two", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ")", ".", "F", "Representative", "immunofluorescent", "staining", "of", "the", "apoptotic", "marker", "cleaved", "caspase", "3", "in", "T387", "GSCs", "expressing", "shUSP33", "or", "shNT", "in", "normoxia", "or", "hypoxia", ".", "GSCs", "were", "attached", "to", "hESC", "-", "Qualified", "Matrix", "(", "Corning", ")", "in", "6", "-", "well", "plates", "at", "the", "concentration", "of", "50", ",", "000", "cells", "per", "well", ".", "Forty", "-", "eight", "hours", "post", "infection", "with", "shUSP33", "or", "shNT", "lentiviruses", ",", "cells", "were", "stained", "for", "cleaved", "caspase", "3", "(", "green", ")", "and", "nuclei", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "80", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5B Representative images of tumorsphere formation of T387 GSCs expressing USP33-targeting shRNA (shUSP33) or non-targeting shRNA (shNT). Twenty-four hours after lentiviral infection, T387 GSCs expressing shUSP33 or shNT were planted in 96 well plates at the density of 2,000 cells per well and cultured for 48 hours under normoxia (20% O2) or hypoxia (5% O2). Disruption of USP33 inhibited GSC tumorsphere formation in normoxia and dramatically suppressed GSC tumorsphere formation in hypoxia. Scale bar, 200 μm.E Cell titer assays showing cell growth of T387 GSCs expressing shUSP33 or shNT in normoxia or hypoxia. GSCs were transduced with shNT or shUSP33 through lentiviral infection for 24 hours, and then split into 96 well plates at the concentration of 2,000 cells per well. Cell titer was determined by the Glo luminescent cell viability assay kit (Promega) at the indicated time points. Disruption of USP33 inhibited GSC growth in normoxia and hypoxia. The experiment has been repeated three times. The presented curves were based on three technical replicates. *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001 (mean ± s.e.m.; two tailed unpaired t-test).F Representative immunofluorescent staining of the apoptotic marker cleaved caspase 3 in T387 GSCs expressing shUSP33 or shNT in normoxia or hypoxia. GSCs were attached to hESC-Qualified Matrix (Corning) in 6-well plates at the concentration of 50,000 cells per well. Forty-eight hours post infection with shUSP33 or shNT lentiviruses, cells were stained for cleaved caspase 3 (green) and nuclei (blue). Scale bar, 80 μm."}
{"words": ["Figure", "6C", ",", "Representative", "images", "of", "autonomous", "fluorescent", "signals", "of", "4HRE", "-", "d2GFP", "in", "xenografts", "derived", "from", "or", "shUSP33", "-", "or", "shNT", "-", "expressing", "T387", "GSCs", "transduced", "with", "4HRE", "-", "d2GFP", ".", "Scale", "bar", ",", "200", "μm", ".", "E", ",", "Representative", "images", "of", "autonomous", "fluorescent", "signals", "of", "4HRE", "-", "d2GFP", "(", "green", ")", "and", "immunofluorescent", "staining", "of", "the", "stem", "cell", "marker", "SOX2", "(", "red", ")", "in", "xenografts", "derived", "from", "T387", "GSCs", "transduced", "with", "4HRE", "-", "d2GFP", ".", "More", "GFP", "signals", "were", "detected", "in", "the", "SOX2", "+", "cells", "compared", "with", "the", "SOX2", "-", "cells", ",", "suggesting", "a", "stronger", "hypoxia", "response", "in", "GSCs", "relative", "to", "NSTCs", ".", "Scale", "bar", ",", "200", "μm", ".", "G", ",", "Representative", "images", "of", "immunofluorescent", "staining", "of", "the", "apoptotic", "marker", "cleaved", "caspase", "3", "(", "red", ")", "and", "autonomous", "fluorescent", "signals", "of", "4HRE", "-", "d2GFP", "(", "green", ")", "in", "xenografts", "derived", "from", "T387", "GSCs", "transduced", "with", "4HRE", "-", "d2GFP", ".", "The", "GFP", "+", "population", "had", "much", "less", "apoptosis", "relative", "to", "the", "GFP", "-", "population", ",", "suggesting", "that", "hypoxia", "response", "inhibited", "cell", "apoptosis", ".", "Scale", "bar", ",", "200", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6C, Representative images of autonomous fluorescent signals of 4HRE-d2GFP in xenografts derived from or shUSP33- or shNT- expressing T387 GSCs transduced with 4HRE-d2GFP. Scale bar, 200 μm.E, Representative images of autonomous fluorescent signals of 4HRE-d2GFP (green) and immunofluorescent staining of the stem cell marker SOX2 (red) in xenografts derived from T387 GSCs transduced with 4HRE-d2GFP. More GFP signals were detected in the SOX2+ cells compared with the SOX2- cells, suggesting a stronger hypoxia response in GSCs relative to NSTCs. Scale bar, 200 μm.G, Representative images of immunofluorescent staining of the apoptotic marker cleaved caspase 3 (red) and autonomous fluorescent signals of 4HRE-d2GFP (green) in xenografts derived from T387 GSCs transduced with 4HRE-d2GFP. The GFP+ population had much less apoptosis relative to the GFP- population, suggesting that hypoxia response inhibited cell apoptosis. Scale bar, 200 μm."}
{"words": ["Figure", "7B", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "curves", "of", "mice", "bearing", "GBMs", "derived", "from", "T387", "GSCs", "expressing", "shUSP33", "or", "shNT", "from", "(", "A", ")", ".", "Disruption", "of", "USP33", "extended", "the", "survival", "of", "mice", "bearing", "GSC", "-", "derived", "GBM", "tumors", ".", "(", "n", "=", "5", "mice", "for", "each", "group", ";", "shUSP33", "#", "42", "vs", "shNT", ",", "p", "=", "0", ".", "0185", ";", "shUSP33", "#", "45", "vs", "shNT", ",", "p", "=", "0", ".", "0027", ";", "two", "-", "tailed", "log", "-", "rank", "test", ")", ".", "E", ",", "F", "Immunofluorescent", "analysis", "(", "E", ")", "and", "statistical", "quantifications", "(", "F", ")", "of", "the", "cell", "proliferation", "marker", "Ki67", "in", "xenografts", "derived", "from", "T387", "GSCs", "expressing", "shUSP33", "or", "shNT", ".", "Disruption", "of", "USP33", "in", "GSCs", "reduced", "cell", "proliferation", "in", "GBM", "xenografts", ".", "Scale", "bar", ",", "80", "μm", ".", "(", "n", "=", "5", "tumors", "for", "each", "group", ";", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ";", "two", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7B Kaplan-Meier survival curves of mice bearing GBMs derived from T387 GSCs expressing shUSP33 or shNT from (A). Disruption of USP33 extended the survival of mice bearing GSC-derived GBM tumors. (n= 5 mice for each group; shUSP33#42 vs shNT, p = 0.0185; shUSP33#45 vs shNT, p = 0.0027; two-tailed log-rank test).E, F Immunofluorescent analysis (E) and statistical quantifications (F) of the cell proliferation marker Ki67 in xenografts derived from T387 GSCs expressing shUSP33 or shNT. Disruption of USP33 in GSCs reduced cell proliferation in GBM xenografts. Scale bar, 80 μm. (n = 5 tumors for each group; ***, p < 0.001; mean ± s.e.m.; two tailed unpaired t-test)."}
{"words": ["Figure", "1", "A", ".", "HeLa", "cells", "released", "from", "double", "thymidine", "synchronization", "in", "early", "S", "phase", "were", "treated", "with", "5", "-", "azadC", "for", "30", "min", ",", "washed", "and", "collected", "at", "the", "indicated", "times", ".", "Soluble", "and", "chromatin", "-", "enriched", "fractions", "were", "immunoblotted", "with", "indicated", "antibodies", ".", "E", ".", "HeLa", "/", "GFP", "-", "DNMT1", "cells", "transfected", "with", "indicated", "siRNAs", "were", "processed", "as", "in", "(", "D", ")", ".", "H", ".", "Representative", "images", "of", "U2OS", "cells", "transfected", "with", "indicated", "siRNAs", "followed", "by", "mCherry", "-", "RNF4", "expression", "plasmid", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "5", "-", "azadC", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "SUMOi", ",", "fixed", "2", "h", "later", ",", "pre", "-", "extracted", "and", "co", "-", "immunostained", "with", "DNMT1", "and", "SUMO2", "/", "3", "antibodies", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μm", ".", "J", ".", "GFP", "-", "tagged", "DNMT1", "from", "extracts", "of", "HeLa", "/", "GFP", "-", "DNMT1", "cells", "treated", "or", "not", "with", "5", "-", "azadC", "was", "immobilized", "on", "GFP", "-", "Trap", "agarose", ",", "subjected", "to", "stringent", "washing", "to", "remove", "proteins", "non", "-", "covalently", "bound", "to", "GFP", "-", "DNMT1", "and", "incubated", "with", "recombinant", "HA", "-", "ubiquitin", ",", "E1", "and", "E2", "(", "UbcH5a", ")", "enzymes", "and", "RNF4", "proteins", "(", "STUbL", "reaction", ")", "at", "37", "°", "C", "for", "1", "h", ".", "Samples", "were", "then", "subjected", "to", "immunoblotting", "to", "assay", "for", "RNF4", "-", "dependent", "STUbL", "activity", "towards", "GFP", "-", "DNMT1", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1 A. HeLa cells released from double thymidine synchronization in early S phase were treated with 5-azadC for 30 min, washed and collected at the indicated times. Soluble and chromatin-enriched fractions were immunoblotted with indicated antibodies.  E. HeLa/GFP-DNMT1 cells transfected with indicated siRNAs were processed as in (D).  H. Representative images of U2OS cells transfected with indicated siRNAs followed by mCherry-RNF4 expression plasmid. Cells were treated with 5-azadC in the presence or absence of SUMOi, fixed 2 h later, pre-extracted and co-immunostained with DNMT1 and SUMO2/3 antibodies. Scale bar, 5 μm.  J. GFP-tagged DNMT1 from extracts of HeLa/GFP-DNMT1 cells treated or not with 5-azadC was immobilized on GFP-Trap agarose, subjected to stringent washing to remove proteins non-covalently bound to GFP-DNMT1 and incubated with recombinant HA-ubiquitin, E1 and E2 (UbcH5a) enzymes and RNF4 proteins (STUbL reaction) at 37 °C for 1 h. Samples were then subjected to immunoblotting to assay for RNF4-dependent STUbL activity towards GFP-DNMT1. "}
{"words": ["Figure", "2", "A", ".", "M", ".", "HpaII", "was", "crosslinked", "into", "a", "plasmid", "to", "generate", "p4xDPC", "and", "then", "incubated", "in", "nucleoplasmic", "egg", "extracts", "(", "NPE", ")", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "50", "μM", "of", "SUMOi", ".", "DPC", "pull", "-", "down", "under", "stringent", "conditions", "was", "performed", "at", "the", "indicated", "time", "points", "and", "the", "recovered", "samples", "were", "immunoblotted", "for", "crosslinked", "M", ".", "HpaII", "(", "Larsen", "et", "al", ",", "2019", ")", ".", "Note", "that", "p4xDPC", ",", "which", "contains", "four", "M", ".", "HpaII", "DPCs", ",", "is", "sometimes", "used", "to", "increase", "sensitivity", "towards", "modified", "M", ".", "HpaII", "species", ".", "Identical", "results", "were", "obtained", "with", "plasmids", "containing", "one", "or", "four", "DPCs", ".", "B", ".", "p4xDPC", "or", "p4xDPCSUMO", "(", "generated", "by", "crosslinking", "SUMO", "∆", "GG", "-", "M", ".", "HpaII", ")", "were", "incubated", "in", "NPE", "and", "DPC", "pull", "-", "down", "performed", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "Note", "that", "priming", "M", ".", "HpaII", "with", "SUMO", "stimulates", "rapid", "poly", "-", "SUMOylation", "of", "the", "DPC", "in", "NPE", ".", "Thus", ",", "this", "substrate", "was", "frequently", "used", "in", "subsequent", "experiments", "to", "stimulate", "DPC", "poly", "-", "SUMOylation", ".", "C", ".", "p4xDPCSUMO", "was", "incubated", "in", "NPE", "and", "plasmids", "analyzed", "as", "in", "(", "A", ")", ".", "Following", "plasmid", "pull", "-", "down", ",", "the", "samples", "were", "split", "and", "either", "left", "untreated", "or", "treated", "with", "the", "SUMO", "protease", "Ulp1", ".", "I", ".", "Representative", "images", "of", "U2OS", "cells", "transfected", "with", "Myc", "-", "PIAS4", "expression", "plasmid", "that", "were", "left", "untreated", "or", "exposed", "to", "5", "-", "azadC", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "SUMOi", ",", "fixed", "2", "h", "later", ",", "pre", "-", "extracted", "and", "co", "-", "immunostained", "with", "DNMT1", "and", "Myc", "antibodies", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "μm", ".", "J", ".", "HeLa", "or", "HeLa", "/", "GFP", "-", "DNMT1", "cells", "left", "untreated", "or", "exposed", "to", "5", "-", "azadC", "for", "30", "min", "were", "lysed", "and", "subjected", "to", "GFP", "IP", "under", "stringent", "conditions", ".", "After", "extensive", "washing", ",", "individual", "IPs", "were", "incubated", "with", "an", "equal", "amount", "(", "800", "μg", ")", "of", "whole", "cell", "lysate", "of", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "Myc", "-", "PIAS4", "expression", "construct", "(", "Fig", ".", "EV2J", ")", ",", "washed", "and", "immunoblotted", "with", "antibodies", "to", "Myc", ",", "SUMO2", "/", "3", "and", "GFP", ".", "*", ",", "cross", "-", "reactive", "band", ".", "K", ".", "HeLa", "/", "GFP", "-", "DNMT1", "cells", "transfected", "with", "previously", "validated", "siRNAs", "targeting", "established", "SUMO", "E3", "ligases", "(", "Fig", ".", "EV2L", "and", "Methods", "section", ")", "were", "treated", "with", "5", "-", "azadC", "for", "30", "min", ",", "collected", "and", "subjected", "to", "GFP", "immunoprecipitation", "under", "denaturing", "conditions", ",", "and", "immunoblotted", "with", "antibodies", "to", "SUMO1", ",", "SUMO2", "/", "3", ",", "ubiquitin", "and", "GFP", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2 A. M.HpaII was crosslinked into a plasmid to generate p4xDPC and then incubated in nucleoplasmic egg extracts (NPE) in the presence or absence of 50 μM of SUMOi. DPC pull-down under stringent conditions was performed at the indicated time points and the recovered samples were immunoblotted for crosslinked M.HpaII (Larsen et al, 2019). Note that p4xDPC, which contains four M.HpaII DPCs, is sometimes used to increase sensitivity towards modified M.HpaII species. Identical results were obtained with plasmids containing one or four DPCs.  B. p4xDPC or p4xDPCSUMO (generated by crosslinking SUMO∆GG-M.HpaII) were incubated in NPE and DPC pull-down performed as in (A). Note that priming M.HpaII with SUMO stimulates rapid poly-SUMOylation of the DPC in NPE. Thus, this substrate was frequently used in subsequent experiments to stimulate DPC poly-SUMOylation.  C. p4xDPCSUMO was incubated in NPE and plasmids analyzed as in (A). Following plasmid pull-down, the samples were split and either left untreated or treated with the SUMO protease Ulp1.  I. Representative images of U2OS cells transfected with Myc-PIAS4 expression plasmid that were left untreated or exposed to 5-azadC in the presence or absence of SUMOi, fixed 2 h later, pre-extracted and co-immunostained with DNMT1 and Myc antibodies. Scale bar, 5 μm.  J. HeLa or HeLa/GFP-DNMT1 cells left untreated or exposed to 5-azadC for 30 min were lysed and subjected to GFP IP under stringent conditions. After extensive washing, individual IPs were incubated with an equal amount (800 μg) of whole cell lysate of HeLa cells transfected with Myc-PIAS4 expression construct (Fig. EV2J), washed and immunoblotted with antibodies to Myc, SUMO2/3 and GFP. *, cross-reactive band.  K. HeLa/GFP-DNMT1 cells transfected with previously validated siRNAs targeting established SUMO E3 ligases (Fig. EV2L and Methods section) were treated with 5-azadC for 30 min, collected and subjected to GFP immunoprecipitation under denaturing conditions, and immunoblotted with antibodies to SUMO1, SUMO2/3, ubiquitin and GFP. "}
{"words": ["Figure", "3", "B", ".", "p2xDPCLeads", "or", "p2xDPCSUMOLeads", "were", "replicated", "in", "egg", "extracts", "in", "the", "presence", "[", "α", "-", "32P", "]", "dATP", ".", "Where", "indicated", ",", "50", "μM", "of", "SUMOi", "was", "added", "to", "the", "extracts", ".", "Reaction", "samples", "were", "analyzed", "by", "native", "agarose", "gel", "electrophoresis", ".", "RI", ",", "replication", "intermediates", ";", "OC", ",", "open", "circular", ";", "SC", ",", "supercoiled", ".", "Red", "arrowheads", "indicate", "OC", "molecules", "that", "have", "not", "yet", "undergone", "repair", ".", "C", ".", "Samples", "in", "(", "B", ")", "were", "recovered", "by", "stringent", "DPC", "pull", "-", "down", "and", "immunoblotted", "for", "crosslinked", "M", ".", "HpaII", ".", "J", ".", "As", "in", "(", "I", ")", ",", "but", "using", "RNF4", "-", "depleted", "CSF", "-", "arrested", "extracts", "reconstituted", "with", "recombinant", "RNF4", "WT", "or", "C130A", "from", "(", "H", ")", ".", "L", ".", "p4xDPCSUMO", "was", "subjected", "to", "sequential", "addition", "of", "NPE", "and", "CSF", "-", "arrested", "extract", "as", "in", "(", "I", ")", ".", "CSF", "-", "arrested", "extracts", "from", "(", "K", ")", "were", "supplemented", "with", "recombinant", "RNF4", ",", "and", "the", "DPC", "plasmid", "was", "recovered", "by", "DPC", "pull", "-", "down", "at", "the", "indicated", "time", "points", "and", "immunoblotted", "against", "M", ".", "HpaII", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3 B. p2xDPCLeads or p2xDPCSUMOLeads were replicated in egg extracts in the presence [α-32P]dATP. Where indicated, 50 μM of SUMOi was added to the extracts. Reaction samples were analyzed by native agarose gel electrophoresis. RI, replication intermediates; OC, open circular; SC, supercoiled. Red arrowheads indicate OC molecules that have not yet undergone repair. C. Samples in (B) were recovered by stringent DPC pull-down and immunoblotted for crosslinked M.HpaII.  J. As in (I), but using RNF4-depleted CSF-arrested extracts reconstituted with recombinant RNF4 WT or C130A from (H).  L. p4xDPCSUMO was subjected to sequential addition of NPE and CSF-arrested extract as in (I). CSF-arrested extracts from (K) were supplemented with recombinant RNF4, and the DPC plasmid was recovered by DPC pull-down at the indicated time points and immunoblotted against M.HpaII. "}
{"words": ["Figure", "4", "D", ".", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "indicated", "siRNAs", "and", "synchronized", "in", "early", "S", "phase", "by", "double", "thymidine", "block", "were", "pulse", "-", "labeled", "with", "5", "-", "azadC", "in", "late", "S", "phase", "as", "outlined", "in", "(", "A", ")", ".", "Cells", "were", "then", "collected", "at", "the", "indicated", "times", "after", "5", "-", "azadC", "withdrawal", "and", "analyzed", "by", "flow", "cytometry", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Proportion", "of", "cells", "with", "G2", "/", "M", "DNA", "content", "is", "indicated", ".", "E", ".", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "indicated", "siRNAs", "were", "treated", "with", "5", "-", "azadC", "and", "/", "or", "SUMOi", "in", "late", "S", "phase", "as", "outlined", "in", "(", "A", ")", ".", "Cells", "were", "then", "collected", "at", "the", "indicated", "times", "after", "5", "-", "azadC", "withdrawal", "and", "analyzed", "by", "flow", "cytometry", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Proportion", "of", "cells", "with", "G2", "/", "M", "DNA", "content", "is", "indicated", ".", "F", ".", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "indicated", "siRNAs", "were", "pulse", "-", "labeled", "or", "not", "with", "5", "-", "azadC", "for", "30", "min", "in", "late", "S", "phase", "according", "to", "the", "experimental", "setup", "in", "(", "A", ")", ".", "Following", "5", "-", "azadC", "withdrawal", "cells", "were", "incubated", "with", "nocodazole", ",", "collected", "at", "the", "indicated", "times", "and", "immunoblotted", "with", "indicated", "antibodies", ".", "H", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "siRNA", "-", "treated", "HeLa", "cells", "that", "were", "exposed", "to", "indicated", "genotoxic", "agents", "and", "collected", "1", "h", "later", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4 D. HeLa cells transfected with indicated siRNAs and synchronized in early S phase by double thymidine block were pulse-labeled with 5-azadC in late S phase as outlined in (A). Cells were then collected at the indicated times after 5-azadC withdrawal and analyzed by flow cytometry. Data are representative of three independent experiments. Proportion of cells with G2/M DNA content is indicated.  E. HeLa cells transfected with indicated siRNAs were treated with 5-azadC and/or SUMOi in late S phase as outlined in (A). Cells were then collected at the indicated times after 5-azadC withdrawal and analyzed by flow cytometry. Data are representative of three independent experiments. Proportion of cells with G2/M DNA content is indicated.  F. HeLa cells transfected with indicated siRNAs were pulse-labeled or not with 5-azadC for 30 min in late S phase according to the experimental setup in (A). Following 5-azadC withdrawal cells were incubated with nocodazole, collected at the indicated times and immunoblotted with indicated antibodies.  H. Immunoblot analysis of siRNA-treated HeLa cells that were exposed to indicated genotoxic agents and collected 1 h later. "}
{"words": ["Figure", "5", "B", ".", "Representative", "time", "-", "lapse", "sequences", "of", "mitotic", "progression", "in", "cells", "in", "(", "A", ")", ".", "NEBD", "corresponds", "to", "t", "=", "0", ".", "White", "arrowheads", "indicate", "cells", "undergoing", "division", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "E", ".", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "RNF4", "siRNA", "were", "synchronized", "in", "early", "S", "phase", "by", "double", "thymidine", "block", ".", "Six", "h", "after", "release", "from", "the", "block", ",", "cells", "were", "pulse", "-", "labeled", "with", "5", "-", "azadC", "for", "30", "min", ".", "Mitotic", "cells", "were", "isolated", "by", "shake", "-", "off", "8", "h", "later", ",", "washed", "and", "incubated", "or", "not", "with", "MPS1", "inhibitor", "(", "MPS1i", ")", "and", "collected", "at", "the", "indicated", "times", ".", "Cells", "were", "then", "processed", "for", "immunoblotting", "with", "indicated", "antibodies", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5 B. Representative time-lapse sequences of mitotic progression in cells in (A). NEBD corresponds to t=0. White arrowheads indicate cells undergoing division. Scale bar, 10 μm.  E. HeLa cells transfected with RNF4 siRNA were synchronized in early S phase by double thymidine block. Six h after release from the block, cells were pulse-labeled with 5-azadC for 30 min. Mitotic cells were isolated by shake-off 8 h later, washed and incubated or not with MPS1 inhibitor (MPS1i) and collected at the indicated times. Cells were then processed for immunoblotting with indicated antibodies. "}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", "-", "B", ")", "Spinal", "cord", "sections", "from", "5", "-", "month", "-", "old", "WT", "and", "Tmem106b", "-", "/", "-", "mice", "were", "stained", "with", "anti", "-", "neurofascin", ",", "anti", "-", "LAMP1", "and", "anti", "-", "Cath", "D", "antibodies", ".", "Accumulation", "of", "LAMP1", "and", "CathD", "positive", "vacuoles", "at", "the", "distal", "end", "of", "AIS", "was", "observed", "in", "Tmem106b", "-", "/", "-", "motor", "neurons", ".", "Representative", "images", "from", "three", "independent", "mice", "were", "shown", ".", "Scale", "bar", "=", "10", "µm", ".", "n", "=", "3", ".", "Data", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "Unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "(", "C", "-", "F", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "p62", ",", "ubiquitin", "(", "Ub", ")", ",", "TDP", "-", "43", "and", "p", "-", "TDP", "-", "43", "in", "RIPA", "-", "and", "urea", "-", "soluble", "fractions", "from", "brain", "(", "C", "and", "E", ")", "and", "spinal", "cord", "(", "D", "and", "F", ")", "of", "16", "-", "month", "-", "old", "WT", "and", "Tmem106b", "-", "/", "-", "mice", ".", "n", "=", "5", ".", "Data", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "Unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", ".", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A-B) Spinal cord sections from 5-month-old WT and Tmem106b-/- mice were stained with anti- neurofascin, anti- LAMP1 and anti-Cath D antibodies. Accumulation of LAMP1 and CathD positive vacuoles at the distal end of AIS was observed in Tmem106b-/- motor neurons. Representative images from three independent mice were shown. Scale bar = 10 µm. n=3. Data presented as mean ± SEM. Unpaired Student's t test. ****, p<0.0001.(C-F) Western blot analysis of p62, ubiquitin (Ub), TDP-43 and p-TDP-43 in RIPA- and urea-soluble fractions from brain (C and E) and spinal cord (D and F) of 16-month-old WT and Tmem106b-/- mice. n=5. Data presented as mean ± SEM. Unpaired Student's t test. *, p<0.05, ***, p<0.001, ****, p<0.0001."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Tmem106b", "-", "/", "-", "Grn", "-", "/", "-", "mice", "do", "not", "show", "any", "changes", "in", "body", "weight", ".", "Body", "weight", "of", "5", "-", "month", "-", "old", "mice", "of", "indicated", "genotypes", "were", "measured", "and", "analyzed", ".", "n", "=", "6", "-", "10", ".", "(", "B", "Tmem106b", "-", "/", "-", "Grn", "-", "/", "-", "mice", "show", "reduced", "activities", "in", "the", "open", "field", "test", ".", "4", ".", "5", "-", "month", "-", "old", "mice", "were", "used", "in", "the", "study", ".", "C", ")", "Tmem106b", "-", "/", "-", "Grn", "-", "/", "-", "mice", "show", "reduced", "activities", "in", "the", "open", "field", "test", ".", "4", ".", "5", "-", "month", "-", "old", "mice", "were", "used", "in", "the", "study", ".", "Total", "movement", "was", "quantified", ".", "n", "=", "8", "-", "10", ".", "Data", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "tests", "with", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparisons", ":", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "(", "D", "Tmem106b", "-", "/", "-", "Grn", "-", "/", "-", "mice", "show", "abnormal", "hindlimb", "clasping", "behavior", ".", "5", "-", "month", "-", "old", "mice", "were", "used", "in", "the", "study", ".", "E", ")", "Tmem106b", "-", "/", "-", "Grn", "-", "/", "-", "mice", "show", "abnormal", "hindlimb", "clasping", "behavior", ".", "5", "-", "month", "-", "old", "mice", "were", "used", "in", "the", "study", ".", "Severity", "score", "was", "quantified", ".", "n", "=", "8", "-", "10", ".", "Data", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "tests", "with", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparisons", ":", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Tmem106b-/-Grn-/- mice do not show any changes in body weight. Body weight of 5-month-old mice of indicated genotypes were measured and analyzed. n=6-10.(B Tmem106b-/-Grn-/- mice show reduced activities in the open field test. 4.5-month-old mice were used in the study.C) Tmem106b-/-Grn-/- mice show reduced activities in the open field test. 4.5-month-old mice were used in the study. Total movement was quantified. n=8-10. Data presented as mean ± SEM. One-way ANOVA tests with Bonferroni's multiple comparisons: ****, p<0.0001.(D Tmem106b-/-Grn-/- mice show abnormal hindlimb clasping behavior. 5-month-old mice were used in the study.E) Tmem106b-/-Grn-/- mice show abnormal hindlimb clasping behavior. 5-month-old mice were used in the study. Severity score was quantified. n= 8-10. Data presented as mean ± SEM. One-way ANOVA tests with Bonferroni's multiple comparisons: ***, p<0.001, ****, p<0.0001."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ",", "B", ")", "Spinal", "cord", "sections", "(", "C1", "-", "C4", ")", "from", "5", "-", "month", "-", "old", "mice", "of", "indicated", "genotypes", "were", "stained", "with", "indicated", "antibodies", "(", "A", ")", "and", "the", "numbers", "of", "NeuN", ",", "or", "CHAT", "positive", "cells", ",", "as", "well", "as", "IBA1", "and", "GFAP", "intensities", "were", "quantified", "(", "B", ")", ".", "3", "-", "5", "sections", "/", "mouse", "were", "used", "for", "quantification", ".", "n", "=", "3", ".", "Data", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "tests", "with", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparisons", ":", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "Scale", "bar", ":", "20", "µm", "for", "CHAT", "staining", ",", "200", "µm", "for", "other", "images", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A,B) Spinal cord sections (C1-C4) from 5-month-old mice of indicated genotypes were stained with indicated antibodies (A) and the numbers of NeuN, or CHAT positive cells, as well as IBA1 and GFAP intensities were quantified (B). 3-5 sections/mouse were used for quantification. n=3. Data presented as mean ± SEM. One-way ANOVA tests with Bonferroni's multiple comparisons: *, p<0.05, **, p<0.01, ***, p<0.001, ****, p<0.0001. Scale bar: 20 µm for CHAT staining, 200 µm for other images."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", "-", "D", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "NeuN", ",", "PSD95", ",", "SYN", ",", "GFAP", ",", "TMEM106B", ",", "PGRN", "and", "GAPDH", "in", "spinal", "cord", "(", "C5", "-", "C8", ")", "(", "A", ",", "B", ")", "and", "brain", "(", "C", ",", "D", ")", "lysates", "from", "5", "-", "month", "-", "old", "WT", ",", "Tmem106b", "-", "/", "-", ",", "Grn", "-", "/", "-", ",", "and", "Tmem106b", "-", "/", "-", "Grn", "-", "/", "-", "mice", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A-D) Western blot analysis of NeuN, PSD95, SYN, GFAP, TMEM106B, PGRN and GAPDH in spinal cord (C5-C8) (A, B) and brain (C, D) lysates from 5-month-old WT, Tmem106b-/-, Grn-/-, and Tmem106b-/-Grn-/- mice."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ",", "B", ")", "Retinal", "sections", "from", "5", "-", "month", "-", "old", "mice", "were", "stained", "with", "indicated", "antibodies", ".", "Thickness", "of", "each", "layer", ",", "number", "of", "Brn3a", "positive", "cells", "(", "retinal", "ganglion", "cells", ")", "per", "section", "and", "length", "of", "outer", "segment", "as", "indicated", "by", "opsin", "staining", "are", "quantified", ".", "Data", "information", ":", "ONL", ":", "outer", "nuclear", "layer", ";", "INL", ":", "Inner", "nuclear", "layer", ";", "OPL", ":", "outer", "plexiform", "layer", ";", "IPL", ":", "inner", "plexiform", "layer", ";", "GCL", ":", "ganglion", "cell", "layer", ".", "(", "C", "Increase", "in", "apoptosis", "in", "Grn", "-", "/", "-", "and", "Tmem106b", "-", "/", "-", "Grn", "-", "/", "-", "retina", "as", "indicated", "by", "TUNEL", "assay", ".", "TUNEL", "positive", "signals", "per", "section", "were", "quantified", ".", "Data", "information", ":", "ONL", ":", "outer", "nuclear", "layer", ";", "INL", ":", "Inner", "nuclear", "layer", ";", "OPL", ":", "outer", "plexiform", "layer", ";", "IPL", ":", "inner", "plexiform", "layer", ";", "GCL", ":", "ganglion", "cell", "layer", ".", "D", ")", "Increase", "in", "apoptosis", "in", "Grn", "-", "/", "-", "and", "Tmem106b", "-", "/", "-", "Grn", "-", "/", "-", "retina", "as", "indicated", "by", "TUNEL", "assay", ".", "TUNEL", "positive", "signals", "per", "section", "were", "quantified", ".", "(", "E", "Increase", "in", "Müller", "glial", "activation", "in", "Tmem106b", "-", "/", "-", "Grn", "-", "/", "-", "retina", "as", "indicated", "by", "GFAP", "staining", ".", "GFAP", "intensity", "per", "section", "was", "quantified", "and", "normalized", "to", "WT", "control", ".", "Data", "information", ":", "ONL", ":", "outer", "nuclear", "layer", ";", "INL", ":", "Inner", "nuclear", "layer", ";", "OPL", ":", "outer", "plexiform", "layer", ";", "IPL", ":", "inner", "plexiform", "layer", ";", "GCL", ":", "ganglion", "cell", "layer", ".", "F", ")", "Increase", "in", "Müller", "glial", "activation", "in", "Tmem106b", "-", "/", "-", "Grn", "-", "/", "-", "retina", "as", "indicated", "by", "GFAP", "staining", ".", "GFAP", "intensity", "per", "section", "was", "quantified", "and", "normalized", "to", "WT", "control", ".", "(", "G", ",", "H", ")", "Increase", "in", "microglia", "activation", "in", "Grn", "-", "/", "-", "and", "Tmem106b", "-", "/", "-", "Grn", "-", "/", "-", "retina", "as", "indicated", "by", "IBA1", "staining", ".", "The", "number", "of", "IBA1", "positive", "cells", "per", "section", "was", "quantified", ".", "Data", "information", ":", "ONL", ":", "outer", "nuclear", "layer", ";", "INL", ":", "Inner", "nuclear", "layer", ";", "OPL", ":", "outer", "plexiform", "layer", ";", "IPL", ":", "inner", "plexiform", "layer", ";", "GCL", ":", "ganglion", "cell", "layer", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A, B) Retinal sections from 5-month-old mice were stained with indicated antibodies. Thickness of each layer, number of Brn3a positive cells (retinal ganglion cells) per section and length of outer segment as indicated by opsin staining are quantified. Data information: ONL: outer nuclear layer; INL: Inner nuclear layer; OPL: outer plexiform layer; IPL: inner plexiform layer; GCL: ganglion cell layer.(C Increase in apoptosis in Grn-/- and Tmem106b-/-Grn-/- retina as indicated by TUNEL assay. TUNEL positive signals per section were quantified. Data information: ONL: outer nuclear layer; INL: Inner nuclear layer; OPL: outer plexiform layer; IPL: inner plexiform layer; GCL: ganglion cell layer.D) Increase in apoptosis in Grn-/- and Tmem106b-/-Grn-/- retina as indicated by TUNEL assay. TUNEL positive signals per section were quantified.(E Increase in Müller glial activation in Tmem106b-/-Grn-/- retina as indicated by GFAP staining. GFAP intensity per section was quantified and normalized to WT control. Data information: ONL: outer nuclear layer; INL: Inner nuclear layer; OPL: outer plexiform layer; IPL: inner plexiform layer; GCL: ganglion cell layer.F) Increase in Müller glial activation in Tmem106b-/-Grn-/- retina as indicated by GFAP staining. GFAP intensity per section was quantified and normalized to WT control.(G, H) Increase in microglia activation in Grn-/- and Tmem106b-/-Grn-/- retina as indicated by IBA1 staining. The number of IBA1 positive cells per section was quantified. Data information: ONL: outer nuclear layer; INL: Inner nuclear layer; OPL: outer plexiform layer; IPL: inner plexiform layer; GCL: ganglion cell layer."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", "Heatmap", "illustrating", "gene", "expression", "changes", "in", "WT", ",", "Tmem106b", "-", "/", "-", ",", "Grn", "-", "/", "-", ",", "and", "Tmem106b", "-", "/", "-", "Grn", "-", "/", "-", "cortex", "samples", "isolated", "from", "2", ".", "7", "-", "month", "-", "old", "mice", ".", "n", "=", "3", ".", "Genes", "with", "FDR", "p", "≤", "0", ".", "05", ",", "LogFC", "≥", "0", ".", "5", "or", "≤", "0", ".", "5", "between", "WT", "and", "Tmem106b", "-", "/", "-", "Grn", "-", "/", "-", "groups", "are", "plotted", "based", "on", "hierarchical", "clustering", "analysis", ".", "Data", "information", ":", "Inflammation", "genes", "are", "highlighted", "in", "magenta", "and", "lysosomal", "genes", "are", "highlighted", "in", "blue", ".", "B", ")", "Heatmap", "illustrating", "gene", "expression", "changes", "in", "WT", ",", "Tmem106b", "-", "/", "-", ",", "Grn", "-", "/", "-", ",", "and", "Tmem106b", "-", "/", "-", "Grn", "-", "/", "-", "spinal", "cord", "samples", "isolated", "from", "2", ".", "7", "-", "month", "-", "old", "mice", ".", "n", "=", "3", ".", "Genes", "with", "FDR", "p", "≤", "0", ".", "05", ",", "LogFC", "≥", "0", ".", "5", "or", "≤", "0", ".", "5", "between", "WT", "and", "Tmem106b", "-", "/", "-", "Grn", "-", "/", "-", "groups", "are", "plotted", "based", "on", "hierarchical", "clustering", "analysis", ".", "Data", "information", ":", "Inflammation", "genes", "are", "highlighted", "in", "magenta", "and", "lysosomal", "genes", "are", "highlighted", "in", "blue", ".", "(", "C", ")", "Heatmap", "illustrating", "gene", "expression", "changes", "in", "the", "inflammation", "and", "lysosome", "pathways", "in", "WT", ",", "Tmem106b", "-", "/", "-", ",", "Grn", "-", "/", "-", ",", "and", "Tmem106b", "-", "/", "-", "Grn", "-", "/", "-", "spinal", "cord", "samples", ".", "Data", "information", ":", "Inflammation", "genes", "are", "highlighted", "in", "magenta", "and", "lysosomal", "genes", "are", "highlighted", "in", "blue", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A Heatmap illustrating gene expression changes in WT, Tmem106b-/-, Grn-/-, and Tmem106b-/-Grn-/- cortex samples isolated from 2.7-month-old mice. n=3. Genes with FDR p≤0.05, LogFC≥0.5 or ≤0.5 between WT and Tmem106b-/-Grn-/- groups are plotted based on hierarchical clustering analysis. Data information: Inflammation genes are highlighted in magenta and lysosomal genes are highlighted in blue.B) Heatmap illustrating gene expression changes in WT, Tmem106b-/-, Grn-/-, and Tmem106b-/-Grn-/- spinal cord samples isolated from 2.7-month-old mice. n=3. Genes with FDR p≤0.05, LogFC≥0.5 or ≤0.5 between WT and Tmem106b-/-Grn-/- groups are plotted based on hierarchical clustering analysis. Data information: Inflammation genes are highlighted in magenta and lysosomal genes are highlighted in blue.(C) Heatmap illustrating gene expression changes in the inflammation and lysosome pathways in WT, Tmem106b-/-, Grn-/-, and Tmem106b-/-Grn-/- spinal cord samples. Data information: Inflammation genes are highlighted in magenta and lysosomal genes are highlighted in blue."}
{"words": ["Figure", "7Western", "blot", "analysis", "of", "Galectin", "-", "3", "and", "GPNMB", "in", "the", "spinal", "cord", "lysates", "from", "5", "-", "month", "-", "old", "WT", ",", "Tmem106b", "-", "/", "-", ",", "Grn", "-", "/", "-", ",", "and", "Tmem106b", "-", "/", "-", "Grn", "-", "/", "-", "mice", ".", "n", "=", "3", ".", "Data", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "tests", "with", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparisons", ":", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "Galectin", "-", "3", "and", "GPNMB", "in", "the", "brain", "lysates", "from", "5", "-", "month", "-", "old", "WT", ",", "Tmem106b", "-", "/", "-", ",", "Grn", "-", "/", "-", ",", "and", "Tmem106b", "-", "/", "-", "Grn", "-", "/", "-", "mice", ".", "n", "=", "3", ".", "Data", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "tests", "with", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparisons", ":", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "(", "E", ")", "Immunostaining", "of", "Galectin", "-", "3", ",", "CathD", "and", "CD68", "in", "spinal", "cord", "sections", "from", "5", "-", "month", "-", "old", "WT", ",", "Tmem106b", "-", "/", "-", ",", "Grn", "-", "/", "-", ",", "and", "Tmem106b", "-", "/", "-", "Grn", "-", "/", "-", "mice", ".", "Scale", "bar", "=", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Western blot analysis of Galectin-3 and GPNMB in the spinal cord lysates from 5-month-old WT, Tmem106b-/-, Grn-/-, and Tmem106b-/-Grn-/- mice. n=3. Data presented as mean ± SEM. One-way ANOVA tests with Bonferroni's multiple comparisons: ***, p<0.001, ****, p<0.0001.Western blot analysis of Galectin-3 and GPNMB in the brain lysates from 5-month-old WT, Tmem106b-/-, Grn-/-, and Tmem106b-/-Grn-/- mice. n=3. Data presented as mean ± SEM. One-way ANOVA tests with Bonferroni's multiple comparisons: ***, p<0.001, ****, p<0.0001.(E) Immunostaining of Galectin-3, CathD and CD68 in spinal cord sections from 5-month-old WT, Tmem106b-/-, Grn-/-, and Tmem106b-/-Grn-/- mice. Scale bar = 10 µm."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "A", "-", "B", ")", "Lipofuscin", "accumulation", "in", "the", "retina", ":", "the", "number", "of", "auto", "fluorescent", "puncta", "per", "section", "was", "quantified", ".", "ONL", ":", "outer", "nuclear", "layer", ";", "INL", ":", "Inner", "nuclear", "layer", ";", "OPL", ":", "outer", "plexiform", "layer", ";", "IPL", ":", "inner", "plexiform", "layer", ";", "GCL", ":", "ganglion", "cell", "layer", ".", "n", "=", "3", "-", "6", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "µm", ".", "TMEM106B", "and", "PGRN", "deletion", "results", "in", "increased", "autofluorescence", "in", "the", "spinal", "cord", "of", "5", "-", "month", "-", "old", "mice", ".", "n", "=", "3", ".", "Scale", "bar", "=", "10", "µm", ".", "TMEM106B", "and", "PGRN", "deletion", "results", "in", "increased", "autofluorescence", "in", "the", "thalamus", "of", "5", "-", "month", "-", "old", "mice", ".", "n", "=", "3", ".", "Scale", "bar", "=", "10", "µm", ".", "(", "G", ",", "H", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "lysosomal", "proteins", "in", "the", "spinal", "cord", "lysates", "from", "5", "-", "month", "-", "old", "WT", ",", "Tmem106b", "-", "/", "-", ",", "Grn", "-", "/", "-", ",", "and", "Tmem106b", "-", "/", "-", "Grn", "-", "/", "-", "mice", ".", "Asterisk", "indicates", "non", "-", "specific", "bands", ".", "n", "=", "3", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(A-B) Lipofuscin accumulation in the retina: the number of auto fluorescent puncta per section was quantified. ONL: outer nuclear layer; INL: Inner nuclear layer; OPL: outer plexiform layer; IPL: inner plexiform layer; GCL: ganglion cell layer. n=3-6. Scale bar = 50 µm.TMEM106B and PGRN deletion results in increased autofluorescence in the spinal cord of 5-month-old mice. n=3. Scale bar = 10 µm.TMEM106B and PGRN deletion results in increased autofluorescence in the thalamus of 5-month-old mice. n=3. Scale bar = 10 µm.(G, H) Western blot analysis of lysosomal proteins in the spinal cord lysates from 5-month-old WT, Tmem106b-/-, Grn-/-, and Tmem106b-/-Grn-/- mice. Asterisk indicates non-specific bands. n=3."}
{"words": ["Figure", "9", "(", "A", ")", "Spinal", "cord", "sections", "from", "5", "-", "month", "-", "old", "WT", ",", "Tmem106b", "-", "/", "-", ",", "Grn", "-", "/", "-", "and", "Tmem106b", "-", "/", "-", "Grn", "-", "/", "-", "mice", "were", "stained", "with", "anti", "-", "neurofascin", ",", "anti", "-", "LAMP1", "and", "anti", "-", "CathD", "antibodies", ".", "Representative", "images", "from", "three", "independent", "mice", "were", "shown", ".", "Scale", "bar", "=", "10", "µm", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "LAMP1", "positive", "vacuoles", "(", ">", "2", "µm", ")", "for", "experiments", "in", "(", "A", ")", ".", "4", "-", "6", "sections", "/", "spinal", "cord", "from", "3", "mice", "were", "analyzed", "for", "each", "genotype", ".", "Data", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "Unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", ":", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 9(A) Spinal cord sections from 5-month-old WT, Tmem106b-/-, Grn-/- and Tmem106b-/-Grn-/- mice were stained with anti-neurofascin, anti-LAMP1 and anti-CathD antibodies. Representative images from three independent mice were shown. Scale bar = 10 µm. (B) Quantification of LAMP1 positive vacuoles (> 2 µm) for experiments in (A). 4-6 sections/spinal cord from 3 mice were analyzed for each genotype. Data presented as mean ± SEM. Unpaired Student's t test: ****, p<0.0001. "}
{"words": ["Figure", "10", "(", "A", "Immunostaining", "of", "GFAP", "with", "LAMP1", "and", "Cath", "D", "in", "the", "spinal", "cord", "sections", "from", "5", "-", "month", "-", "old", "WT", ",", "Tmem106b", "-", "/", "-", ",", "Grn", "-", "/", "-", ",", "and", "Tmem106b", "-", "/", "-", "Grn", "-", "/", "-", "mice", ".", "Scale", "bar", "=", "5", "µm", ".", "B", ")", "Immunostaining", "of", "IBA1", "with", "LAMP1", "and", "Cath", "D", "in", "the", "spinal", "cord", "sections", "from", "5", "-", "month", "-", "old", "WT", ",", "Tmem106b", "-", "/", "-", ",", "Grn", "-", "/", "-", ",", "and", "Tmem106b", "-", "/", "-", "Grn", "-", "/", "-", "mice", ".", "Scale", "bar", "=", "5", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 10(A Immunostaining of GFAP with LAMP1 and Cath D in the spinal cord sections from 5-month-old WT, Tmem106b-/-, Grn-/-, and Tmem106b-/-Grn-/- mice. Scale bar = 5 µm.B) Immunostaining of IBA1 with LAMP1 and Cath D in the spinal cord sections from 5-month-old WT, Tmem106b-/-, Grn-/-, and Tmem106b-/-Grn-/- mice. Scale bar = 5 µm."}
{"words": ["Figure", "11", "(", "A", ")", "Accumulation", "of", "autophagosomes", "and", "lysosomes", "in", "the", "spinal", "cord", "sections", "from", "a", "5", "-", "month", "-", "old", "Tmem106b", "-", "/", "-", "Grn", "-", "/", "-", "mouse", "as", "shown", "by", "transmission", "electron", "microscope", "analysis", ".", "Scale", "bar", "=", "1µm", ".", "Arrows", ":", "autophagosome", ";", "arrow", "heads", ":", "lysosomes", ";", "(", "a", ")", ":", "axon", ".", "(", "B", ")", "Accumulation", "of", "myelin", "debris", "and", "amorphous", "inclusions", "in", "the", "microglia", "in", "the", "spinal", "cord", "sections", "from", "a", "5", "-", "month", "-", "old", "Tmem106b", "-", "/", "-", "Grn", "-", "/", "-", "mouse", "as", "shown", "by", "transmission", "electron", "microscope", "analysis", ".", "Scale", "bar", "=", "1µm", ".", "Arrows", ":", "myelin", "debris", ";", "arrow", "heads", ":", "dark", "amorphous", "inclusions", ";", "(", "m", ")", ":", "microglia", ".", "(", "C", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "LC3", "-", "I", "and", "LC3", "-", "II", "in", "the", "spinal", "cord", "lysates", "from", "5", "-", "month", "-", "old", "WT", ",", "Tmem106b", "-", "/", "-", ",", "Grn", "-", "/", "-", ",", "and", "Tmem106b", "-", "/", "-", "Grn", "-", "/", "-", "mice", ".", "n", "=", "3", ".", "Data", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "tests", "with", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparisons", ":", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "(", "D", "Immunostaining", "of", "TFE3", "and", "IBA1", "in", "the", "spinal", "cord", "sections", "from", "5", "-", "month", "-", "old", "WT", ",", "Tmem106b", "-", "/", "-", ",", "Grn", "-", "/", "-", ",", "and", "Tmem106b", "-", "/", "-", "Grn", "-", "/", "-", "mice", ".", "E", ")", "Immunostaining", "of", "TFE3", "and", "IBA1", "in", "the", "spinal", "cord", "sections", "from", "5", "-", "month", "-", "old", "WT", ",", "Tmem106b", "-", "/", "-", ",", "Grn", "-", "/", "-", ",", "and", "Tmem106b", "-", "/", "-", "Grn", "-", "/", "-", "mice", ".", "Nuclear", "signals", "of", "TFE3", "in", "IBA1", "positive", "microglia", "were", "quantified", ".", "n", "=", "3", ".", "Data", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "tests", "with", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparisons", ":", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "Scale", "bar", "=", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 11(A) Accumulation of autophagosomes and lysosomes in the spinal cord sections from a 5-month-old Tmem106b-/-Grn-/- mouse as shown by transmission electron microscope analysis. Scale bar = 1µm. Arrows: autophagosome; arrow heads: lysosomes; (a): axon.(B) Accumulation of myelin debris and amorphous inclusions in the microglia in the spinal cord sections from a 5-month-old Tmem106b-/-Grn-/- mouse as shown by transmission electron microscope analysis. Scale bar = 1µm. Arrows: myelin debris; arrow heads: dark amorphous inclusions; (m): microglia.(C) Western blot analysis of LC3-I and LC3-II in the spinal cord lysates from 5-month-old WT, Tmem106b-/-, Grn-/-, and Tmem106b-/-Grn-/- mice. n=3. Data presented as mean ± SEM. One-way ANOVA tests with Bonferroni's multiple comparisons: ****, p<0.0001.(D Immunostaining of TFE3 and IBA1 in the spinal cord sections from 5-month-old WT, Tmem106b-/-, Grn-/-, and Tmem106b-/-Grn-/- mice.E) Immunostaining of TFE3 and IBA1 in the spinal cord sections from 5-month-old WT, Tmem106b-/-, Grn-/-, and Tmem106b-/-Grn-/- mice. Nuclear signals of TFE3 in IBA1 positive microglia were quantified. n=3. Data presented as mean ± SEM. One-way ANOVA tests with Bonferroni's multiple comparisons: ***, p<0.001, ****, p<0.0001. Scale bar = 10 µm."}
{"words": ["Figure", "12", "(", "A", ",", "B", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "p62", ",", "ubiquitin", "(", "Ub", ")", ",", "TDP", "-", "43", "and", "p", "-", "TDP", "-", "43", "in", "RIPA", "-", "and", "urea", "-", "soluble", "fractions", "from", "spinal", "cord", "(", "C5", "-", "C8", ")", "and", "brain", "of", "5", "-", "month", "-", "old", "WT", ",", "Tmem106b", "-", "/", "-", ",", "Grn", "-", "/", "-", ",", "and", "Tmem106b", "-", "/", "-", "Grn", "-", "/", "-", "mice", ".", "Spinal", "cord", ":", "n", "=", "3", ";", "brain", ":", "n", "=", "4", ".", "Data", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "tests", "with", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparisons", ":", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "Immunostaining", "of", "p62", "and", "ubiquitin", "in", "the", "spinal", "cord", "sections", "from", "5", "-", "month", "-", "old", "WT", ",", "Tmem106b", "-", "/", "-", ",", "Grn", "-", "/", "-", ",", "and", "Tmem106b", "-", "/", "-", "Grn", "-", "/", "-", "mice", ".", "The", "number", "of", "p62", "or", "Ub", "positive", "puncta", "was", "quantified", ".", "n", "=", "3", ".", "Data", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "tests", "with", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparisons", ":", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "Scale", "bar", "=", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 12(A, B) Western blot analysis of p62, ubiquitin (Ub), TDP-43 and p-TDP-43 in RIPA- and urea-soluble fractions from spinal cord (C5-C8) and brain of 5-month-old WT, Tmem106b-/-, Grn-/-, and Tmem106b-/-Grn-/- mice. Spinal cord: n=3; brain: n=4. Data presented as mean ± SEM. One-way ANOVA tests with Bonferroni's multiple comparisons: *, p<0.05; **, p<0.01***, p<0.001, ****, p<0.0001.(C, D) Immunostaining of p62 and ubiquitin in the spinal cord sections from 5-month-old WT, Tmem106b-/-, Grn-/-, and Tmem106b-/-Grn-/- mice. The number of p62 or Ub positive puncta was quantified. n=3. Data presented as mean ± SEM. One-way ANOVA tests with Bonferroni's multiple comparisons: ***, p<0.001, ****, p<0.0001. Scale bar = 10 µm."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "H3122", "cells", "expressing", "endogenous", "EML4", "-", "ALK", "V1", "and", "HEK293", "transfected", "with", "YFP", "-", "EML4", "-", "ALK", "V1", "WT", "and", "KD", "were", "stained", "for", "either", "anti", "-", "ALK", "or", "anti", "-", "GFP", "(", "green", ")", ",", "anti", "-", "α", "-", "tubulin", "(", "red", ")", ",", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ";", "magnified", "views", "of", "a", "selected", "area", "are", "shown", ".", "B", ".", "Violin", "plots", "showing", "the", "number", "of", "EML4", "-", "ALK", "V1", "cytoplasmic", "foci", "per", "cell", ".", "Data", "represents", "30", "-", "50", "counts", "from", "three", "biological", "replicates", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "in", "comparison", "to", "HEK293", "YFP", "-", "EML4", "-", "ALK", "-", "V1", "KD", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "analysis", ".", "C", ".", "H2228", "cells", "expressing", "endogenous", "EML4", "-", "ALK", "V3", "and", "HEK293", "transfected", "with", "YFP", "-", "EML4", "-", "ALK", "V3", "WT", "and", "KD", "were", "stained", "for", "either", "anti", "-", "ALK", "or", "anti", "-", "GFP", "(", "green", ")", ",", "anti", "-", "α", "-", "tubulin", "(", "red", ")", ",", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ";", "magnified", "views", "of", "a", "selected", "area", "are", "shown", ".", "D", ".", "Violin", "plots", "showing", "the", "number", "of", "EML4", "-", "ALK", "V3", "cytoplasmic", "foci", "per", "cell", ".", "Data", "represents", "30", "-", "50", "counts", "from", "four", "biological", "replicates", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "in", "comparison", "to", "HEK293", "YFP", "-", "EML4", "-", "ALK", "-", "V3", "KD", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "analysis", ".", "H", ".", "Whisker", "plot", "showing", "the", "calculated", "velocity", "of", "single", "events", "in", "the", "kymograph", ".", "Data", "represent", "20", "counts", "from", "10", "kymographs", ".", "n", "=", "2", ".", "Error", "bar", "represents", "SD", "of", "two", "biological", "replicates", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "in", "comparison", "to", "YFP", "EML4", "-", "ALK", "V3", "KD", "by", "unpaired", "t", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. H3122 cells expressing endogenous EML4-ALK V1 and HEK293 transfected with YFP-EML4-ALK V1 WT and KD were stained for either anti-ALK or anti-GFP (green), anti-α-tubulin (red), and DAPI (blue). Scale bars, 10 μm; magnified views of a selected area are shown. B. Violin plots showing the number of EML4-ALK V1 cytoplasmic foci per cell. Data represents 30-50 counts from three biological replicates. ***P<0.001, ****P<0.0001 in comparison to HEK293 YFP-EML4-ALK-V1 KD by one-way ANOVA analysis. C. H2228 cells expressing endogenous EML4-ALK V3 and HEK293 transfected with YFP-EML4-ALK V3 WT and KD were stained for either anti-ALK or anti-GFP (green), anti-α-tubulin (red), and DAPI (blue). Scale bars, 10 μm; magnified views of a selected area are shown. D. Violin plots showing the number of EML4-ALK V3 cytoplasmic foci per cell. Data represents 30-50 counts from four biological replicates. ***P<0.001, ****P<0.0001 in comparison to HEK293 YFP-EML4-ALK-V3 KD by one-way ANOVA analysis. H. Whisker plot showing the calculated velocity of single events in the kymograph. Data represent 20 counts from 10 kymographs. n=2. Error bar represents SD of two biological replicates. *P< 0.05 in comparison to YFP EML4-ALK V3 KD by unpaired t test."}
{"words": ["Figure", "2A", ",", "B", ".", "H3122", "and", "H2228", "cells", "were", "stained", "for", "anti", "-", "ALK", "(", "green", ")", ",", "anti", "-", "GRB2", "(", "red", ")", ",", "anti", "-", "SOS1", "(", "red", ")", ",", "anti", "-", "pC", "-", "KITY721", "(", "red", ")", ",", "anti", "-", "PI3K", "p85β", "or", "anti", "-", "pPLCγ2Y759", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ";", "magnified", "views", "of", "a", "selected", "area", "are", "shown", ".", "C", ".", "HEK293", "cells", "transfected", "with", "YFP", "-", "EM4L", "-", "ALK", "V1", "WT", "or", "V3", "WT", "for", "48", "hrs", "and", "treated", "with", "5", "%", "or", "10", "%", "1", ",", "6", "-", "hexanediol", ".", "Representative", "still", "images", "after", "5", "min", "(", "taken", "from", "time", "-", "lapse", "movies", ")", "are", "shown", "of", "cells", "treated", "with", "10", "%", "1", ",", "6", "-", "Hexanediol", "or", "DMSO", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ";", "the", "arrowheads", "indicate", "cytoplasmic", "foci", ".", "D", ".", "Box", "plot", "showing", "the", "number", "of", "cytoplasmic", "foci", "in", "DMSO", "and", "5", "%", "or", "10", "%", "Hexanediol", "(", "5", "min", ")", ".", "Data", "represent", "5", "-", "10", "counts", "from", "3", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Error", "bar", "represents", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "in", "comparison", "to", "YFP", "-", "EML4", "-", "ALK", "V3", "WT", "DMSO", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "analysis", ".", "E", ".", "Representative", "western", "blots", "of", "HEK293", "transfected", "EML4", "-", "ALK", "V1", "WT", "and", "V3", "WT", "for", "48", "hrs", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "either", "5", "%", "or", "10", "%", "1", ",", "6", "-", "Hexanediol", "for", "5", "minutes", ".", "DMSO", "was", "used", "a", "control", ".", "Lysates", "were", "analysed", "for", "the", "phosphorylation", "and", "expression", "of", "the", "indicated", "antibodies", ".", "GAPDH", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Data", "representative", "of", "n", "=", "2", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A, B. H3122 and H2228 cells were stained for anti-ALK (green), anti-GRB2 (red), anti-SOS1 (red), anti-pC-KITY721 (red), anti-PI3K p85β or anti-pPLCγ2Y759 and DAPI (blue). Scale bars, 10 μm; magnified views of a selected area are shown.C. HEK293 cells transfected with YFP-EM4L-ALK V1 WT or V3 WT for 48 hrs and treated with 5% or 10% 1,6-hexanediol. Representative still images after 5 min (taken from time-lapse movies) are shown of cells treated with 10% 1,6-Hexanediol or DMSO. Scale bars, 10 μm; the arrowheads indicate cytoplasmic foci. D. Box plot showing the number of cytoplasmic foci in DMSO and 5% or 10% Hexanediol (5 min). Data represent 5-10 counts from 3 independent experiments (n=3). Error bar represents SD of three biological replicates. ****P< 0.0001 in comparison to YFP-EML4-ALK V3 WT DMSO by one-way ANOVA analysis. E. Representative western blots of HEK293 transfected EML4-ALK V1 WT and V3 WT for 48 hrs. Cells were treated with either 5% or 10% 1,6-Hexanediol for 5 minutes. DMSO was used a control. Lysates were analysed for the phosphorylation and expression of the indicated antibodies. GAPDH was used as a loading control. Data representative of n=2 experiments."}
{"words": ["Figure", "3A", ",", "B", ",", "C", ",", "D", ".", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "EML4", "-", "ALK", "V1", "WT", "or", "V3", "WT", "or", "Kinase", "Dead", "(", "KD", ")", "for", "48", "hours", ".", "Cells", "were", "either", "untreated", "(", "DMSO", ")", "or", "treated", "with", "ALK", "inhibitors", "for", "4", "hours", "before", "fixation", "and", "staining", "with", "anti", "-", "GFP", "(", "green", ")", ",", "anti", "-", "α", "-", "tubulin", "(", "red", ")", ",", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ";", "magnified", "views", "of", "a", "selected", "area", "are", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A, B, C, D. HEK293 cells were transfected with EML4-ALK V1 WT or V3 WT or Kinase Dead (KD) for 48 hours. Cells were either untreated (DMSO) or treated with ALK inhibitors for 4 hours before fixation and staining with anti-GFP (green), anti-α-tubulin (red), and DAPI (blue). Scale bars, 10 μm; magnified views of a selected area are shown."}
{"words": ["Figure", "4B", ".", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "EML4", "-", "ALK", "V1", "deletion", "12N", "blade", "for", "48", "hours", ".", "Cells", "were", "either", "untreated", "(", "DMSO", ")", "or", "treated", "with", "ALK", "inhibitors", "for", "4", "hours", "before", "fixation", "and", "staining", "with", "anti", "-", "GFP", "(", "green", ")", ",", "anti", "-", "α", "-", "tubulin", "(", "red", ")", ",", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ";", "magnified", "views", "of", "a", "selected", "area", "are", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B. HEK293 cells were transfected with EML4-ALK V1 deletion 12N blade for 48 hours. Cells were either untreated (DMSO) or treated with ALK inhibitors for 4 hours before fixation and staining with anti-GFP (green), anti-α-tubulin (red), and DAPI (blue). Scale bars, 10 μm; magnified views of a selected area are shown."}
{"words": ["Figure", "5D", ".", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "EML4", "-", "ALK", "V3", "∆", "JM", "1058", "-", "1100", "for", "48", "hours", ".", "Cells", "were", "either", "untreated", "(", "DMSO", ")", "or", "treated", "with", "ALK", "inhibitors", "for", "4", "hours", "before", "fixation", "and", "staining", "with", "anti", "-", "GFP", "(", "green", ")", ",", "anti", "-", "α", "-", "tubulin", "(", "red", ")", ",", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ";", "magnified", "views", "of", "a", "selected", "area", "are", "shown", ".", "E", ".", "Violin", "plot", "representing", "the", "number", "of", "cytoplasmic", "foci", "counted", "per", "cell", "from", "D", ".", "Data", "represent", "counts", "from", "at", "least", "30", "cells", ",", "n", "=", "3", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "in", "comparison", "to", "DMSO", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5D. HEK293 cells were transfected with EML4-ALK V3 ∆JM 1058-1100 for 48 hours. Cells were either untreated (DMSO) or treated with ALK inhibitors for 4 hours before fixation and staining with anti-GFP (green), anti-α-tubulin (red), and DAPI (blue). Scale bars, 10 μm; magnified views of a selected area are shown. E. Violin plot representing the number of cytoplasmic foci counted per cell from D. Data represent counts from at least 30 cells, n=3. ****P< 0.0001 in comparison to DMSO by one-way ANOVA. "}
{"words": ["Figure", "6A", "-", "F", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "A", ".", "YFP", "-", "EML4", "-", "ALK", "V3", "K1150M", ",", "C", ".", "R1275Q", "or", "E", ".", "F1174L", "constructs", "and", "treated", "with", "ALK", "inhibitors", "or", "DMSO", "for", "4", "hours", "before", "fixation", "and", "staining", "with", "anti", "-", "GFP", "(", "green", ")", ",", "anti", "-", "α", "-", "tubulin", "(", "red", ")", ",", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ";", "magnified", "views", "of", "a", "selected", "area", "are", "shown", ".", "B", ",", "D", ",", "F", ".", "Violin", "plots", "representing", "the", "number", "of", "cytoplasmic", "foci", "counted", "per", "cell", "from", "A", ",", "C", "and", "E", ".", "Data", "represent", "counts", "from", "at", "least", "30", "cells", ",", "n", "=", "3", "or", "4", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "in", "comparison", "to", "DMSO", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A-F HEK293 cells were transfected with A. YFP-EML4-ALK V3 K1150M, C. R1275Q or E. F1174L constructs and treated with ALK inhibitors or DMSO for 4 hours before fixation and staining with anti-GFP (green), anti-α-tubulin (red), and DAPI (blue). Scale bars, 10 μm; magnified views of a selected area are shown. B, D, F. Violin plots representing the number of cytoplasmic foci counted per cell from A, C and E. Data represent counts from at least 30 cells, n=3 or 4. ****P< 0.0001 in comparison to DMSO by one-way ANOVA."}
{"words": ["Figure", "7B", ".", "HEK293", "cells", "transfected", "with", "YFP", "-", "EML4", "-", "GyrB", "and", "either", "untreated", "(", "DMSO", ")", "or", "treated", "with", "Coumermycin", "A1", "to", "induce", "dimerization", "of", "GyrB", "before", "fixation", "and", "staining", "with", "anti", "-", "GFP", "(", "green", ")", ",", "anti", "-", "α", "-", "tubulin", "(", "red", ")", ",", "and", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ";", "magnified", "views", "of", "a", "selected", "area", "are", "shown", ".", "C", ".", "Violin", "plot", "showing", "the", "number", "of", "cytoplasmic", "foci", "per", "HEK293", "cell", "transfected", "with", "YFP", "-", "EML4", "-", "GyrB", ".", "Data", "represent", "counts", "from", ">", "30", "cells", ",", "n", "=", "4", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "in", "comparison", "to", "DMSO", "by", "unpaired", "t", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7B. HEK293 cells transfected with YFP-EML4-GyrB and either untreated (DMSO) or treated with Coumermycin A1 to induce dimerization of GyrB before fixation and staining with anti-GFP (green), anti-α-tubulin (red), and DAPI (blue). Scale bars, 10 μm; magnified views of a selected area are shown. C. Violin plot showing the number of cytoplasmic foci per HEK293 cell transfected with YFP-EML4-GyrB. Data represent counts from >30 cells, n= 4. ****P< 0.0001 in comparison to DMSO by unpaired t test. "}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "HEK293T", "‐", "Fpn", "cells", "were", "incubated", "with", "FAC", "(", "10", "μM", "Fe", ")", "for", "24", "h", "followed", "by", "incubation", "for", "6", "h", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "10", "μM", "Ponasterone", "A", ".", "Cells", "were", "then", "incubated", "with", "and", "without", "100", "μM", "chloroquine", "or", "10", "μM", "leupeptin", "for", "10", "h", "and", "harvested", ".", "The", "ferritin", "content", "was", "determined", "by", "ELISA", ".", "Induction", "of", "Fpn", "resulted", "in", "decreased", "ferritin", "levels", "and", "this", "was", "not", "prevented", "by", "treatment", "with", "chloroquine", "or", "leupeptin", ".", "The", "data", "are", "presented", "as", "the", "standard", "deviation", "from", "three", "different", "experiments", ".", "(", "B", ")", "Cells", "treated", "as", "in", "(", "A", ")", "were", "incubated", "in", "the", "presence", "of", "1", "μg", "/", "ml", "EGF", "for", "2", "h", ".", "Cells", "were", "fixed", "and", "processed", "for", "immunofluorescence", "using", "mouse", "anti", "‐", "EGF", "receptor", "and", "Alexa", "594", "conjugated", "goat", "anti", "‐", "mouse", "IgG", ".", "Chloroquine", "and", "leupeptin", "effectively", "inhibit", "degradation", "of", "EGF", "receptor", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) HEK293T‐Fpn cells were incubated with FAC (10 μM Fe) for 24 h followed by incubation for 6 h in the absence or presence of 10 μM Ponasterone A. Cells were then incubated with and without 100 μM chloroquine or 10 μM leupeptin for 10 h and harvested. The ferritin content was determined by ELISA. Induction of Fpn resulted in decreased ferritin levels and this was not prevented by treatment with chloroquine or leupeptin. The data are presented as the standard deviation from three different experiments.(B) Cells treated as in (A) were incubated in the presence of 1 μg/ml EGF for 2 h. Cells were fixed and processed for immunofluorescence using mouse anti‐EGF receptor and Alexa 594 conjugated goat anti‐mouse IgG. Chloroquine and leupeptin effectively inhibit degradation of EGF receptor."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "HEK293T", "‐", "Fpn", "cells", "were", "incubated", "with", "FAC", "(", "10", "μM", "Fe", ")", "for", "24", "h", "followed", "by", "incubation", "for", "6", "h", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "10", "μM", "Ponasterone", "A", ".", "Cells", "were", "then", "treated", "with", "or", "without", "10", "μM", "MG132", "or", "10", "μM", "lactacystin", "in", "the", "presence", "of", "Ponasterone", "A", "for", "10", "h", "and", "harvested", ".", "The", "ferritin", "content", "was", "determined", "by", "ELISA", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "standard", "deviation", "from", "three", "different", "experiments", "in", "duplicate", ".", "(", "B", ")", "Samples", "treated", "as", "in", "(", "A", ")", "were", "immunoprecipitated", "using", "anti", "‐", "ferritin", "antibodies", "and", "the", "immunoprecipitate", "examined", "for", "the", "presence", "of", "ferritin", "or", "ubiquitin", "by", "Western", "blot", "analysis", ".", "The", "arrows", "indicate", "the", "migration", "of", "H", "and", "L", "chains", ".", "(", "C", ")", "Cells", "were", "incubated", "with", "1", ".", "0", "×", "10", "−", "7", "M", "Tf", "(", "59Fe", ")", "2", "for", "24", "h", "followed", "by", "incubation", "for", "6", "h", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "10", "μM", "Ponasterone", "A", ".", "Cells", "were", "then", "treated", "with", "or", "without", "10", "μM", "MG132", "in", "the", "presence", "of", "Ponasterone", "A", "for", "10", "h", "and", "harvested", "and", "the", "amount", "of", "59Fe", "in", "immunoprecipitatedferritin", "was", "determined", ".", "(", "D", ")", "Cells", "were", "treated", "as", "described", "in", "(", "A", ")", "and", "cell", "extracts", "were", "applied", "to", "size", "exclusion", "chromatography", "and", "the", "ferritin", "content", ",", "in", "selected", "fractions", ",", "was", "determined", "by", "ELISA", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "standard", "deviation", "from", "three", "different", "experiments", "in", "duplicate", ".", "(", "E", ")", "Cells", "were", "treated", "as", "described", "in", "(", "C", ")", ",", "ferritin", "was", "then", "immunoprecipitated", ",", "eluted", "using", "100", "mM", "glycine", ",", "pH", "2", ".", "5", "and", "measured", "by", "ELISA", ".", "The", "amount", "of", "ferritin", "‐", "associated", "59Fe", "was", "measured", "and", "the", "specific", "activity", "of", "ferritin", "determined", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "standard", "deviation", "from", "three", "different", "experiments", "in", "duplicate", ".", "(", "F", ")", "Samples", "were", "treated", "as", "in", "(", "D", ")", ",", "and", "ferritin", "was", "immunoprecipitated", "and", "analyzed", "by", "Western", "blot", "analysis", "using", "an", "antibody", "to", "ubiquitin", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) HEK293T‐Fpn cells were incubated with FAC (10 μM Fe) for 24 h followed by incubation for 6 h in the absence or presence of 10 μM Ponasterone A. Cells were then treated with or without 10 μM MG132 or 10 μM lactacystin in the presence of Ponasterone A for 10 h and harvested. The ferritin content was determined by ELISA. Error bars represent the standard deviation from three different experiments in duplicate.(B) Samples treated as in (A) were immunoprecipitated using anti‐ferritin antibodies and the immunoprecipitate examined for the presence of ferritin or ubiquitin by Western blot analysis. The arrows indicate the migration of H and L chains.(C) Cells were incubated with 1.0 × 10−7 M Tf(59Fe)2 for 24 h followed by incubation for 6 h in the absence or presence of 10 μM Ponasterone A. Cells were then treated with or without 10 μM MG132 in the presence of Ponasterone A for 10 h and harvested and the amount of 59Fe in immunoprecipitatedferritin was determined.(D) Cells were treated as described in (A) and cell extracts were applied to size exclusion chromatography and the ferritin content, in selected fractions, was determined by ELISA. Error bars represent the standard deviation from three different experiments in duplicate.(E) Cells were treated as described in (C), ferritin was then immunoprecipitated, eluted using 100 mM glycine, pH 2.5 and measured by ELISA. The amount of ferritin‐associated 59Fe was measured and the specific activity of ferritin determined. Error bars represent the standard deviation from three different experiments in duplicate.(F) Samples were treated as in (D), and ferritin was immunoprecipitated and analyzed by Western blot analysis using an antibody to ubiquitin."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "FM3A", "(", "black", ")", "and", "ts85", "(", "grey", ")", "cells", "were", "transiently", "transfected", "with", "a", "plasmid", "containing", "CMV", "‐", "regulated", "Fpn", "‐", "GFP", "and", "incubated", "in", "the", "presence", "of", "FAC", "(", "10", "μM", "Fe", ")", "and", "0", ".", "5", "μM", "hepcidin", "for", "24", "h", ".", "Hepcidin", "was", "either", "maintained", "(", "+", ")", "or", "removed", "(", "−", ")", "to", "allow", "Fpn", "‐", "GFP", "localization", "at", "the", "plasma", "membrane", ".", "Cells", "were", "maintained", "at", "the", "permissive", "temperature", "(", "33", "°", "C", ")", "or", "moved", "to", "the", "restrictive", "temperature", "(", "39", "°", "C", ")", "and", "incubated", "for", "6", "h", ".", "Cells", "were", "harvested", "and", "ferritin", "content", "determined", "by", "ELISA", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "standard", "deviation", "from", "three", "different", "experiments", "in", "duplicate", ".", "(", "B", ")", "FM3A", "and", "ts85", "cells", "were", "treated", "as", "in", "(", "A", ")", "but", "FAC", "was", "replaced", "with", "1", ".", "0", "×", "10", "−", "7", "M", "Tf", "(", "59Fe", ")", "2", ".", "Ferritin", "was", "immunoprecipitated", "and", "the", "specific", "activity", "of", "59Fe", "‐", "ferritin", "determined", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "standard", "deviation", "from", "three", "different", "experiments", "in", "duplicate", ".", "(", "C", ")", "ts85", "cells", "were", "treated", "as", "in", "(", "B", ")", "and", "cell", "extracts", "applied", "to", "size", "exclusion", "chromatography", ".", "Ferritin", "content", "in", "selected", "fractions", "was", "measured", "by", "ELISA", ".", "Black", "bars", "represent", "assembled", "ferritin", "(", ">", "400", "kDa", ")", ",", "gray", "bars", "represent", "monomeric", "(", "50", "kDa", ")", ".", "(", "D", ")", "FM3A", "and", "ts85", "cells", "were", "treated", "as", "in", "(", "A", ")", "but", "cells", "that", "had", "been", "incubated", "at", "the", "restrictive", "temperature", "(", "39", "°", "C", ")", "were", "then", "returned", "to", "the", "permissive", "temperature", "(", "33", "°", "C", ")", "and", "incubated", "in", "the", "presence", "of", "cycloheximide", "(", "75", "μg", "/", "ml", ")", "and", "10", "μM", "FAC", "for", "1", "h", ".", "Cells", "were", "then", "harvested", "and", "ferritin", "levels", "determined", "by", "ELISA", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "standard", "deviation", "from", "three", "different", "experiments", "in", "duplicate", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) FM3A (black) and ts85 (grey) cells were transiently transfected with a plasmid containing CMV‐regulated Fpn‐GFP and incubated in the presence of FAC (10 μM Fe) and 0.5 μM hepcidin for 24 h. Hepcidin was either maintained (+) or removed (−) to allow Fpn‐GFP localization at the plasma membrane. Cells were maintained at the permissive temperature (33°C) or moved to the restrictive temperature (39°C) and incubated for 6 h. Cells were harvested and ferritin content determined by ELISA. Error bars represent the standard deviation from three different experiments in duplicate.(B) FM3A and ts85 cells were treated as in (A) but FAC was replaced with 1.0 × 10−7 M Tf(59Fe)2. Ferritin was immunoprecipitated and the specific activity of 59Fe‐ferritin determined. Error bars represent the standard deviation from three different experiments in duplicate.(C) ts85 cells were treated as in (B) and cell extracts applied to size exclusion chromatography. Ferritin content in selected fractions was measured by ELISA. Black bars represent assembled ferritin (>400 kDa), gray bars represent monomeric (50 kDa).(D) FM3A and ts85 cells were treated as in (A) but cells that had been incubated at the restrictive temperature (39°C) were then returned to the permissive temperature (33°C) and incubated in the presence of cycloheximide (75 μg/ml) and 10 μM FAC for 1 h. Cells were then harvested and ferritin levels determined by ELISA. Error bars represent the standard deviation from three different experiments in duplicate."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Cells", "were", "then", "incubated", "at", "the", "restrictive", "temperature", "(", "39", "°", "C", ")", "for", "6", "h", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "100", "μM", "DFO", ",", "with", "or", "without", "100", "μM", "chloroquine", "or", "10", "μM", "MG132", ".", "Cells", "were", "then", "harvested", "and", "ferritin", "content", "determined", "by", "ELISA", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "standard", "deviation", "from", "three", "different", "experiments", "in", "duplicate", ".", "(", "B", ")", "Cells", "treated", "as", "in", "(", "A", ")", "were", "incubated", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "5", "mM", "3", "‐", "methyladenine", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Cells were then incubated at the restrictive temperature (39°C) for 6 h in the presence or absence of 100 μM DFO, with or without 100 μM chloroquine or 10 μM MG132. Cells were then harvested and ferritin content determined by ELISA. Error bars represent the standard deviation from three different experiments in duplicate.(B) Cells treated as in (A) were incubated in the presence or absence of 5 mM 3‐methyladenine."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Δccc1", "/", "pGAL", "‐", "H", "+", "L", "cells", "were", "transformed", "with", "a", "plasmid", "containing", "a", "methionine", "regulated", "CCC1", "(", "pMET3CCC1", ")", ".", "Cells", "were", "grown", "in", "medium", "with", "galactose", "for", "20", "h", ",", "washed", "and", "incubated", "in", "galactose", "(", "•", ")", ",", "glucose", "with", "10", "×", "methionine", "(", "▵", ")", ",", "glucose", "(", "○", ")", "or", "glucose", "without", "methionine", "(", "▾", ")", "for", "10", "h", ".", "Cells", "were", "then", "harvested", "and", "ferritin", "levels", "determined", "by", "ELISA", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "standard", "deviation", "from", "three", "different", "experiments", "in", "duplicate", ".", "The", "absence", "of", "methionine", "leads", "to", "expression", "of", "the", "vacuolar", "iron", "transporter", "Ccc1p", ".", "(", "B", ")", "erg6", "‐", "2", "and", "erg6", "‐", "2", "pGAL", "‐", "H", "+", "L", "strains", "were", "grown", "in", "medium", "with", "galactose", "and", "250", "μM", "FeSO4", "for", "24", "h", ".", "Cells", "were", "then", "washed", "and", "incubated", "in", "galactose", "or", "glucose", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "50", "μM", "MG132", "for", "7", "h", ".", "(", "C", ")", "Cells", "were", "then", "harvested", ",", "ferritin", "levels", "determined", "by", "ELISA", "and", "immunoprecipitated", "using", "anti", "‐", "ferritin", "antibodies", "and", "the", "immunoprecipitate", "examined", "for", "the", "presence", "of", "ubiquitin", "by", "Western", "analysis", ".", "Cells", "with", "the", "erg6", "‐", "2", "allele", "permit", "the", "entry", "of", "MG132", "(", "Lee", "and", "Goldberg", ",", "1996", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Δccc1/pGAL‐H+L cells were transformed with a plasmid containing a methionine regulated CCC1 (pMET3CCC1). Cells were grown in medium with galactose for 20 h, washed and incubated in galactose (•), glucose with 10 × methionine (▵), glucose (○) or glucose without methionine (▾) for 10 h. Cells were then harvested and ferritin levels determined by ELISA. Error bars represent the standard deviation from three different experiments in duplicate. The absence of methionine leads to expression of the vacuolar iron transporter Ccc1p.(B) erg6‐2 and erg6‐2 pGAL‐H+L strains were grown in medium with galactose and 250 μM FeSO4 for 24 h. Cells were then washed and incubated in galactose or glucose in the absence or presence of 50 μM MG132 for 7 h.(C) Cells were then harvested, ferritin levels determined by ELISA and immunoprecipitated using anti‐ferritin antibodies and the immunoprecipitate examined for the presence of ubiquitin by Western analysis. Cells with the erg6‐2 allele permit the entry of MG132 ( Lee and Goldberg, 1996)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Mitochondrial", "extracts", "from", "143B", "cells", ",", "COX1", "∆", "and", "COX2", "∆", "mutant", "cybrids", "and", "their", "respective", "isogenic", "controls", "(", "CON", "-", "1", "and", "CON", "-", "2", ")", "were", "analyzed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "The", "graphs", "(", "right", ")", "show", "densitometric", "quantifications", "of", "the", "signals", "normalized", "to", "CII", "subunit", "SDHA", ".", "The", "mean", "of", "three", "independent", "controls", "(", "CON", ")", "was", "set", "to", "100", "and", "all", "measurements", "were", "referenced", "to", "that", "value", ".", "The", "values", "represent", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "-", "8", ")", ".", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", "was", "applied", "for", "statistical", "analyses", ".", "Variations", "between", "controls", "and", "mutants", ":", "α", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "β", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "γ", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "Specific", "variations", "between", "COX1", "∆", "and", "COX2", "∆", "mutants", ":", "∗", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "(", "B", ")", "Digitonized", "mitochondria", "(", "digitonin", "-", "to", "-", "protein", "ratio", "of", "2", ":", "1", ")", "were", "analyzed", "by", "BN", "-", "PAGE", ",", "followed", "by", "CI", "in", "gel", "activity", "(", "IGA", ")", "assays", "and", "Coomassie", "staining", ".", "The", "SC", "I", "+", "III2", "+", "IV1", "band", "(", "b1", ")", "was", "excised", "from", "the", "control", "(", "143B", ")", "lane", "and", "the", "SC", "I", "+", "III2", "bands", "(", "b2", "to", "b4", ")", "were", "excised", "from", "the", "COX1", "∆", "and", "COX2", "∆", "lanes", ".", "Their", "protein", "compositions", "were", "subsequently", "analyzed", "by", "nano", "-", "LC", "/", "ESI", "-", "MS", "(", "see", "also", "Figure", "EV2", ")", ".", "The", "relative", "position", "of", "the", "molecular", "weight", "marker", "is", "indicated", "on", "the", "left", ".", "(", "C", ")", "BN", "-", "PAGE", "was", "followed", "by", "CI", "-", "IGA", "assay", "and", "immunoblotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", "(", "in", "brackets", ")", ".", "The", "identity", "of", "the", "MRC", "complexes", "and", "SCs", "is", ":", "I", "+", "III2", "+", "IV1", ",", "SC", "containing", "CI", ",", "CIII2", ",", "and", "CIV", ";", "I", "+", "III2", ",", "SC", "containing", "CI", "and", "CIII2", ";", "I", "+", "III2plus", ",", "SC", "containing", "CI", ",", "CIII2", "and", "a", "COX1", "-", "submodule", ";", "III2", "+", "IV", ",", "SC", "containing", "CIII2", "and", "CIV", ";", "I", ",", "complex", "I", ";", "III2", ",", "CIII", "dimer", ";", "IV2", ",", "CIV", "dimer", ";", "subCOX1", ",", "COX1", "-", "containing", "subcomplexes", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Mitochondrial extracts from 143B cells, COX1∆ and COX2∆ mutant cybrids and their respective isogenic controls (CON-1 and CON-2) were analyzed by SDS-PAGE and immunoblotting with the indicated antibodies. The graphs (right) show densitometric quantifications of the signals normalized to CII subunit SDHA. The mean of three independent controls (CON) was set to 100 and all measurements were referenced to that value. The values represent mean ± SD (n=3-8). Mann-Whitney U test was applied for statistical analyses. Variations between controls and mutants: α, p<0.05; β, p<0.01; γ, p<0.001. Specific variations between COX1∆ and COX2∆ mutants: ∗p<0.05; ∗∗p<0.01.(B) Digitonized mitochondria (digitonin-to-protein ratio of 2:1) were analyzed by BN-PAGE, followed by CI in gel activity (IGA) assays and Coomassie staining. The SC I+III2+IV1 band (b1) was excised from the control (143B) lane and the SC I+III2 bands (b2 to b4) were excised from the COX1∆ and COX2∆ lanes. Their protein compositions were subsequently analyzed by nano-LC/ESI-MS (see also Figure EV2). The relative position of the molecular weight marker is indicated on the left.(C) BN-PAGE was followed by CI-IGA assay and immunoblotting with the indicated antibodies (in brackets). The identity of the MRC complexes and SCs is: I+III2+IV1, SC containing CI, CIII2, and CIV; I+III2, SC containing CI and CIII2; I+III2plus, SC containing CI, CIII2 and a COX1-submodule; III2+IV, SC containing CIII2 and CIV; I, complex I; III2, CIII dimer; IV2, CIV dimer; subCOX1, COX1-containing subcomplexes."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Control", "143B", "cells", "(", "left", "panels", ")", ",", "COX1", "∆", "cybrids", "(", "middle", "panels", ")", ",", "and", "COX2", "∆", "cybrids", "(", "right", "panels", ")", ".", "The", "right", "lane", "highlights", "structural", "subunits", "of", "CI", "(", "yellow", ")", ",", "CIII", "(", "light", "green", ")", ",", "and", "CIV", "(", "orange", "brown", ")", ",", "and", "assembly", "factors", "(", "orange", ")", ".", "Intensity", "-", "based", "absolute", "quantification", "(", "iBAQ", ")", "values", "were", "normalized", "to", "the", "sum", "of", "all", "control", "values", ".", "Top", "lanes", "indicate", "gel", "slice", "numbers", "and", "their", "relative", "native", "masses", ".", "(", "B", ")", "Intensity", "profiles", "showing", "abundance", "and", "relative", "distribution", "of", "structural", "subunits", "from", "CI", "(", "upper", "graphs", ")", ",", "CIII", "(", "middle", "graphs", ")", ",", "and", "CIV", "(", "bottom", "graphs", ")", ".", "The", "identities", "of", "MRC", "complexes", "and", "SCs", "are", "as", "in", "Figure", "1", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Control 143B cells (left panels), COX1∆ cybrids (middle panels), and COX2∆ cybrids (right panels). The right lane highlights structural subunits of CI (yellow), CIII (light green), and CIV (orange brown), and assembly factors (orange). Intensity-based absolute quantification (iBAQ) values were normalized to the sum of all control values. Top lanes indicate gel slice numbers and their relative native masses.(B) Intensity profiles showing abundance and relative distribution of structural subunits from CI (upper graphs), CIII (middle graphs), and CIV (bottom graphs). The identities of MRC complexes and SCs are as in Figure 1."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Excerpts", "of", "complexome", "profiling", "data", "showing", "the", "distribution", "of", "CIV", "subunits", "and", "assembly", "factors", "HIGD1A", ",", "HIGD2A", ",", "CMC1", "and", "COA3", "in", "control", "(", "143B", ")", ",", "COX1", "∆", "and", "COX2", "∆", "cybrids", ".", "The", "relative", "abundance", "and", "distribution", "of", "detected", "proteins", "is", "shown", "in", "the", "lower", "graphs", ".", "The", "localization", "of", "SC", "I", "+", "III2plus", "in", "COX2Δ", "cybrids", "is", "highlighted", "with", "a", "red", "line", ".", "The", "approximate", "molecular", "weights", "of", "CIV", "-", "containing", "structures", "are", "indicated", "on", "the", "top", "(", "in", "kDa", ")", ".", "(", "B", ")", "2D", "-", "BN", "/", "SDS", "-", "PAGE", "analysis", "from", "control", "(", "143B", ")", "and", "COX2Δ", "cybrids", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "I", "+", "III2", "+", "IV1", ",", "SC", "containing", "CI", ",", "CIII", ",", "and", "CIV", ";", "I", "+", "III2plus", ",", "SC", "containing", "CI", ",", "CIII", "and", "a", "COX1", "-", "submodule", ";", "III2", "+", "IV", ",", "SC", "containing", "CIII", "and", "CIV", ";", "IV2", ",", "CIV", "dimer", ";", "IV", ",", "CIV", "monomer", ".", "The", "presence", "of", "a", "COX1", "-", "CMC1", "-", "COA3", "-", "containing", "subcomplex", "is", "indicated", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Excerpts of complexome profiling data showing the distribution of CIV subunits and assembly factors HIGD1A, HIGD2A, CMC1 and COA3 in control (143B), COX1∆ and COX2∆ cybrids. The relative abundance and distribution of detected proteins is shown in the lower graphs. The localization of SC I+III2plus in COX2Δ cybrids is highlighted with a red line. The approximate molecular weights of CIV-containing structures are indicated on the top (in kDa).(B) 2D-BN/SDS-PAGE analysis from control (143B) and COX2Δ cybrids followed by immunoblotting with the indicated antibodies. I+III2+IV1, SC containing CI, CIII, and CIV; I+III2plus, SC containing CI, CIII and a COX1-submodule; III2+IV, SC containing CIII and CIV; IV2, CIV dimer; IV, CIV monomer. The presence of a COX1-CMC1-COA3-containing subcomplex is indicated."}
{"words": ["Figure", "4Mitochondrial", "extracts", "from", "control", "143B", "cells", "(", "left", ")", ",", "COX1", "∆", "cybrids", "(", "right", ")", ",", "and", "COX2", "∆", "cybrids", "(", "middle", ")", "were", "immunoprecipitated", "using", "antibodies", "against", ":", "(", "A", ")", "CIV", "subunits", "COX1", "and", "COX5B", ".", "(", "B", ")", "CI", "subunit", "NDUFB7", ".", "Samples", "were", "subsequently", "analyzed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "In", ",", "input", ".", "IP", ",", "immuno", "-", "precipitate", ".", "FT", ",", "flow", "-", "through", ".", "Ig", ",", "unrelated", "immunoglobulin", "used", "as", "a", "negative", "control", ".", "Mitochondrial", "extracts", "from", "control", "143B", "cells", "(", "left", ")", ",", "COX1", "∆", "cybrids", "(", "right", ")", ",", "and", "COX2", "∆", "cybrids", "(", "middle", ")", "were", "immunoprecipitated", "using", "antibodies", "against", ":", "(", "B", ")", "CI", "subunit", "NDUFB7", ".", "Samples", "were", "subsequently", "analyzed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "In", ",", "input", ".", "IP", ",", "immuno", "-", "precipitate", ".", "FT", ",", "flow", "-", "through", ".", "Ig", ",", "unrelated", "immunoglobulin", "used", "as", "a", "negative", "control", ".", "Mitochondrial", "extracts", "from", "control", "143B", "cells", "(", "left", ")", ",", "COX1", "∆", "cybrids", "(", "right", ")", ",", "and", "COX2", "∆", "cybrids", "(", "middle", ")", "were", "immunoprecipitated", "using", "antibodies", "against", ":", "(", "C", ")", "CIII", "subunit", "CORE2", ".", "Samples", "were", "subsequently", "analyzed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "In", ",", "input", ".", "IP", ",", "immuno", "-", "precipitate", ".", "FT", ",", "flow", "-", "through", ".", "Ig", ",", "unrelated", "immunoglobulin", "used", "as", "a", "negative", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Mitochondrial extracts from control 143B cells (left), COX1∆ cybrids (right), and COX2∆ cybrids (middle) were immunoprecipitated using antibodies against: (A) CIV subunits COX1 and COX5B. (B) CI subunit NDUFB7. Samples were subsequently analyzed by SDS-PAGE and immunoblotting with the indicated antibodies. In, input. IP, immuno-precipitate. FT, flow-through. Ig, unrelated immunoglobulin used as a negative control.Mitochondrial extracts from control 143B cells (left), COX1∆ cybrids (right), and COX2∆ cybrids (middle) were immunoprecipitated using antibodies against: (B) CI subunit NDUFB7. Samples were subsequently analyzed by SDS-PAGE and immunoblotting with the indicated antibodies. In, input. IP, immuno-precipitate. FT, flow-through. Ig, unrelated immunoglobulin used as a negative control.Mitochondrial extracts from control 143B cells (left), COX1∆ cybrids (right), and COX2∆ cybrids (middle) were immunoprecipitated using antibodies against: (C) CIII subunit CORE2. Samples were subsequently analyzed by SDS-PAGE and immunoblotting with the indicated antibodies. In, input. IP, immuno-precipitate. FT, flow-through. Ig, unrelated immunoglobulin used as a negative control."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Digitonin", "-", "solubilized", "mitochondria", "from", "doxycycline", "-", "treated", "143B", "cells", ",", "COX1", "∆", "and", "COX2", "∆", "cybrids", "were", "analyzed", "by", "BN", "-", "PAGE", "followed", "by", "CI", "-", "IGA", "assays", "(", "upper", "panels", ")", "or", "immunoblotting", "(", "medium", "and", "lower", "panels", ")", "with", "antibodies", "against", "CI", "subunits", "NDUFA9", "and", "NDUFS1", ".", "The", "identities", "of", "MRC", "complexes", "and", "SCs", "are", "as", "in", "Figure", "1", ".", "(", "B", ")", "Mean", "incorporation", "rates", "of", "NDUFA9", "and", "NDUFS1", "into", "SC", "I", "+", "III2", "+", "IV1", "from", "143B", "cells", "and", "into", "SCs", "I", "+", "III2", "from", "the", "CIV", "-", "KO", "cybrids", ".", "Signals", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "were", "quantified", "and", "normalized", "by", "CII", "subunit", "SDHA", "levels", ".", "Time", "-", "point", "values", "are", "expressed", "as", "percentages", "of", "untreated", "cells", "(", "SS", ")", "and", "indicated", "as", "mean", "±", "SD", ".", "(", "C", ")", "Samples", "were", "subsequently", "analyzed", "by", "2D", "-", "BN", "/", "SDS", "-", "PAGE", "and", "immunoblotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "The", "identities", "of", "MRC", "complexes", "and", "SCs", "are", "as", "in", "Figure", "1", ".", "(", "D", ")", "Mean", "incorporation", "rates", "of", "CIII", "subunits", "CORE2", "and", "RISP", "into", "SC", "I", "+", "III2", "+", "IV1", "from", "control", "cells", "and", "into", "SCs", "I", "+", "III2", "from", "CIV", "-", "KO", "cybrids", ".", "Signals", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "were", "quantified", "and", "normalized", "by", "CII", "subunit", "SDHA", "levels", ".", "Time", "-", "point", "values", "are", "expressed", "as", "percentages", "of", "untreated", "cells", "(", "SS", ")", "and", "indicated", "as", "mean", "±", "SD", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Digitonin-solubilized mitochondria from doxycycline-treated 143B cells, COX1∆ and COX2∆ cybrids were analyzed by BN-PAGE followed by CI-IGA assays (upper panels) or immunoblotting (medium and lower panels) with antibodies against CI subunits NDUFA9 and NDUFS1. The identities of MRC complexes and SCs are as in Figure 1.(B) Mean incorporation rates of NDUFA9 and NDUFS1 into SC I+III2+IV1 from 143B cells and into SCs I+III2 from the CIV-KO cybrids. Signals from at least three independent experiments were quantified and normalized by CII subunit SDHA levels. Time-point values are expressed as percentages of untreated cells (SS) and indicated as mean±SD.(C) Samples were subsequently analyzed by 2D-BN/SDS-PAGE and immunoblotting with the indicated antibodies. The identities of MRC complexes and SCs are as in Figure 1.(D) Mean incorporation rates of CIII subunits CORE2 and RISP into SC I+III2+IV1 from control cells and into SCs I+III2 from CIV-KO cybrids. Signals from at least three independent experiments were quantified and normalized by CII subunit SDHA levels. Time-point values are expressed as percentages of untreated cells (SS) and indicated as mean±SD."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Digitonized", "mitochondria", "from", "doxycycline", "-", "treated", "143B", "cells", "and", "COX2", "∆", "cybrids", "were", "analyzed", "by", "2D", "-", "BN", "/", "SDS", "-", "PAGE", "and", "western", "blot", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "(", "B", ")", "Mean", "incorporation", "rates", "of", "COX", "subunits", "into", "SC", "I", "+", "III2plus", "from", "COX2", "∆", "cybrids", ".", "Signals", "from", "three", "independent", "experiments", "were", "quantified", "and", "normalized", "by", "CII", ".", "Time", "-", "point", "values", "are", "expressed", "as", "percentages", "of", "the", "untreated", "cells", "(", "SS", ")", "and", "indicated", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Control", "(", "143B", ")", "values", "for", "subunits", "COX4", ",", "COX5A", "and", "COX6C", "were", "obtained", "from", "(", "Moreno", "-", "Lastres", "et", "al", ".", ",", "2012", ")", ".", "C", "-", "D", "SDS", "-", "PAGE", "(", "C", ")", "and", "BN", "-", "PAGE", "(", "D", ")", "analyses", "from", "143B", "cells", "and", "COX2", "∆", "cybrids", "transiently", "transfected", "either", "with", "a", "COX5B", "-", "Myc", "-", "DDK", "construct", "or", "with", "the", "empty", "vector", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "antibodies", "against", "COX5B", "and", "CII", "subunit", "SDHA", "(", "loading", "control", ")", ".", "The", "identities", "of", "MRC", "complexes", "and", "SCs", "are", "as", "in", "Figure", "1", ".", "The", "red", "arrow", "points", "to", "the", "accumulation", "of", "over", "expressed", "COX5B", "bound", "to", "SC", "I", "+", "III2", "in", "control", "cells", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Digitonized mitochondria from doxycycline-treated 143B cells and COX2∆ cybrids were analyzed by 2D-BN/SDS-PAGE and western blot with the indicated antibodies.(B) Mean incorporation rates of COX subunits into SC I+III2plus from COX2∆ cybrids. Signals from three independent experiments were quantified and normalized by CII. Time-point values are expressed as percentages of the untreated cells (SS) and indicated as mean ± SD. Control (143B) values for subunits COX4, COX5A and COX6C were obtained from (Moreno-Lastres et al., 2012).C-D SDS-PAGE (C) and BN-PAGE (D) analyses from 143B cells and COX2∆ cybrids transiently transfected either with a COX5B-Myc-DDK construct or with the empty vector, followed by immunoblotting with antibodies against COX5B and CII subunit SDHA (loading control). The identities of MRC complexes and SCs are as in Figure 1. The red arrow points to the accumulation of over expressed COX5B bound to SC I+III2 in control cells."}
{"words": ["Figure", "7Mitochondrial", "translation", "products", "were", "pulse", "-", "labelled", "in", "control", "143B", "cells", "(", "left", "panel", ")", ",", "COX1", "∆", "(", "middle", "panel", ")", "and", "COX2", "∆", "(", "right", "panel", ")", "cybrids", "with", "[", "35S", "]", "-", "methionine", "for", "30", "minutes", "in", "the", "presence", "of", "anisomycin", "to", "inhibit", "cytosolic", "translation", ".", "For", "chase", ",", "cells", "were", "washed", "and", "incubated", "with", "fresh", "culture", "medium", "for", "the", "indicated", "time", "points", "(", "T0", "-", "T24", "hours", ")", ".", "Radiolabeled", "mitochondrial", "proteins", "(", "indicated", "on", "the", "right", ")", "were", "separated", "by", "2D", "-", "BN", "/", "SDS", "-", "PAGE", "and", "visualized", "by", "autoradiography", ".", "A", "enlarged", "section", "of", "the", "SCs", "region", "at", "T24", "(", "delimited", "by", "a", "square", ")", "shows", "the", "co", "-", "migration", "of", "COX1", "with", "SC", "I", "+", "III2plus", "(", "black", "arrow", ")", "in", "the", "COX2", "∆", "cybrids", "relative", "to", "the", "position", "of", "canonical", "SC", "I", "+", "III2", "(", "gray", "arrow", ")", ".", "The", "identities", "of", "MRC", "complexes", "and", "SCs", "(", "bottom", ")", "are", "as", "in", "Figure", "1", ".", "Molecular", "weight", "markers", "are", "indicated", "on", "the", "left", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Mitochondrial translation products were pulse-labelled in control 143B cells (left panel), COX1∆ (middle panel) and COX2∆ (right panel) cybrids with [35S]-methionine for 30 minutes in the presence of anisomycin to inhibit cytosolic translation. For chase, cells were washed and incubated with fresh culture medium for the indicated time points (T0-T24 hours). Radiolabeled mitochondrial proteins (indicated on the right) were separated by 2D-BN/SDS-PAGE and visualized by autoradiography. A enlarged section of the SCs region at T24 (delimited by a square) shows the co-migration of COX1 with SC I+III2plus (black arrow) in the COX2∆ cybrids relative to the position of canonical SC I+III2 (gray arrow). The identities of MRC complexes and SCs (bottom) are as in Figure 1. Molecular weight markers are indicated on the left."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "A", ")", "Respiratory", "chain", "enzyme", "activities", "of", "control", "(", "blue", ")", ",", "COX1", "∆", "(", "red", ")", "and", "COX2", "∆", "(", "green", ")", "cybrids", ".", "Enzyme", "activities", "were", "measured", "in", "three", "experimental", "replicates", ".", "Data", "are", "expressed", "as", "the", "percentages", "of", "control", "cells", ",", "and", "indicated", "as", "means", "±", "SD", ".", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", "was", "applied", "for", "statistical", "analyses", ".", "Variations", "between", "controls", "and", "mutants", ":", "α", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "γ", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "Specific", "variations", "between", "COX1", "∆", "and", "COX2", "∆", "mutants", ":", "∗", "p", "<", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(A) Respiratory chain enzyme activities of control (blue), COX1∆ (red) and COX2∆ (green) cybrids. Enzyme activities were measured in three experimental replicates. Data are expressed as the percentages of control cells, and indicated as means ± SD. Mann-Whitney U test was applied for statistical analyses. Variations between controls and mutants: α, p<0.05; γ, p<0.001. Specific variations between COX1∆ and COX2∆ mutants: ∗p<0.05."}
{"words": ["Figure", "1Colorectal", "tumor", "outcomes", "in", "WT", "(", "n", "=", "7", ")", ",", "IL", "-", "33KO", "(", "n", "=", "4", ")", "and", "ST2KO", "(", "n", "=", "3", ")", "mice", "at", "the", "completion", "of", "the", "AOM", "/", "DSS", "carcinogenesis", "protocol", ".", "(", "A", ")", "Tumor", "volumes", "at", "the", "endpoint", "(", "each", "dot", "represents", "a", "tumor", ",", "mice", "with", "no", "tumor", "are", "marked", "as", "zero", ")", ",", "Skin", "tumor", "outcomes", "in", "WT", "(", "n", "=", "7", ")", ",", "IL", "-", "33KO", "(", "n", "=", "6", ")", "and", "ST2KO", "(", "n", "=", "7", ")", "mice", "at", "the", "completion", "of", "the", "DMBA", "/", "DNFB", "carcinogenesis", "protocol", ".", "(", "D", ")", "Tumor", "volumes", "at", "the", "endpoint", "(", "each", "dot", "represents", "a", "tumor", ",", "mice", "with", "no", "tumor", "are", "marked", "as", "zero", ")", ",", "H", ")", "Quantification", "of", "nuclear", "IL", "-", "33", "+", "epidermal", "and", "dermal", "cells", "in", "the", "DNFB", "-", "versus", "acetone", "-", "treated", "WT", "skin", ".", "Dots", "represent", "cell", "counts", "from", "three", "randomly", "selected", "high", "power", "field", "(", "HPF", ")", "images", "per", "sample", "(", "n", "=", "5", "per", "group", ")", ".", "J", ")", "Quantification", "of", "nuclear", "IL", "-", "33", "+", "epithelial", "and", "stromal", "cells", "of", "colon", "treated", "with", "AOM", "/", "DSS", "versus", "no", "treatment", ".", "Dots", "represent", "cell", "counts", "from", "three", "randomly", "selected", "HPF", "images", "per", "sample", "(", "n", "=", "4", "per", "group", ")", ".", "Data", "information", ":", "Graphs", "show", "mean", "+", "SD", ",", "unpaired", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Colorectal tumor outcomes in WT (n=7), IL-33KO (n=4) and ST2KO (n=3) mice at the completion of the AOM/DSS carcinogenesis protocol. (A) Tumor volumes at the endpoint (each dot represents a tumor, mice with no tumor are marked as zero), Skin tumor outcomes in WT (n=7), IL-33KO (n=6) and ST2KO (n=7) mice at the completion of the DMBA/DNFB carcinogenesis protocol. (D) Tumor volumes at the endpoint (each dot represents a tumor, mice with no tumor are marked as zero),H) Quantification of nuclear IL-33+ epidermal and dermal cells in the DNFB- versus acetone-treated WT skin. Dots represent cell counts from three randomly selected high power field (HPF) images per sample (n=5 per group). J) Quantification of nuclear IL-33+ epithelial and stromal cells of colon treated with AOM/DSS versus no treatment. Dots represent cell counts from three randomly selected HPF images per sample (n=4 per group). Data information: Graphs show mean + SD, unpaired t-test. "}
{"words": ["Figure", "2", "(", "H", ")", "ChIP", "-", "qPCR", "assay", "for", "Smad6", "in", "the", "presence", "of", "IL", "-", "33", "full", "length", "or", "cytokine", "domain", "using", "an", "anti", "-", "RUNX2", "antibody", ".", "After", "Pam212", "cells", "were", "transfected", "with", "IL", "-", "33", "full", "length", "or", "cytokine", "domain", "for", "24", "hours", ",", "cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "chromatin", "-", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "RUNX2", "antibody", "and", "eluted", "RUNX2", "-", "bound", "chromatin", "was", "used", "for", "qPCR", "with", "primers", "against", "Smad6", "promoter", "region", ".", "Anti", "-", "IgG", "ChIP", "-", "qPCR", "results", "are", "shown", "as", "negative", "controls", "(", "n", "=", "4", "per", "group", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(H) ChIP-qPCR assay for Smad6 in the presence of IL-33 full length or cytokine domain using an anti-RUNX2 antibody. After Pam212 cells were transfected with IL-33 full length or cytokine domain for 24 hours, cell lysates were subjected to chromatin-immunoprecipitation with anti-RUNX2 antibody and eluted RUNX2-bound chromatin was used for qPCR with primers against Smad6 promoter region. Anti-IgG ChIP-qPCR results are shown as negative controls (n=4 per group)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "D", ")", "Immunoblot", "of", "p", "-", "SMAD2", "/", "3", "and", "SMAD2", "/", "3", "proteins", "in", "response", "to", "TGF", "-", "β", "and", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "treatment", ".", "Pam212", "cells", "were", "treated", "with", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "or", "PBS", "followed", "by", "incubation", "with", "and", "without", "TGF", "-", "β", "(", "5nM", ")", ".", "Data", "represent", "three", "independent", "experiments", "with", "similar", "results", ".", "(", "E", ")", "Immunoblot", "of", "p", "-", "SMAD2", "/", "3", "and", "SMAD2", "/", "3", "proteins", "in", "response", "to", "TGF", "-", "β", "+", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "after", "knocking", "down", "of", "IL", "-", "33", ".", "Pam212", "cells", "were", "transfected", "with", "siIl33", "knockdown", "construct", "or", "siRNA", "control", "(", "siCon", ")", "for", "30", "hours", "followed", "by", "incubation", "with", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", "and", "TGF", "-", "β", ".", "Data", "represent", "three", "independent", "experiments", "with", "similar", "results", ".", "(", "F", ")", "Immunoblot", "of", "p", "-", "SMAD2", "/", "3", "and", "SMAD2", "/", "3", "proteins", "upon", "the", "expression", "of", "IL", "-", "33", "full", "length", "or", "cytokine", "domain", ".", "Pam212", "cells", "were", "transfected", "with", "IL", "-", "33", "full", "length", "or", "cytokine", "domain", "for", "24", "hours", "followed", "by", "incubation", "with", "and", "without", "TGF", "-", "β", ".", "Data", "represent", "three", "independent", "experiments", "with", "similar", "results", ".", "Data", "information", ":", "GAPDH", "is", "used", "as", "the", "control", "housekeeping", "protein", "in", "D", "-", "F", ")", ".", "Graphs", "show", "mean", "+", "SD", ",", "NS", ":", "not", "significant", ",", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "(", "G", ")", "Impact", "of", "IL", "-", "33", "knockdown", "on", "cell", "proliferation", "in", "response", "to", "TGF", "-", "β", ".", "Pam212", "cells", "were", "treated", "with", "siIl33", "or", "siCon", "followed", "by", "TGF", "-", "β", "treatment", "(", "n", "=", "7", "in", "each", "group", ")", ".", "(", "H", ")", "Impact", "of", "IL", "-", "33", "knockdown", "and", "SB431542", "treatment", "on", "cell", "proliferation", ".", "Pam212", "cells", "were", "treated", "with", "siIl33", "or", "siCon", "in", "combination", "with", "SB431542", "or", "DMSO", "(", "carrier", "control", ",", "n", "=", "7", "in", "each", "group", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(D) Immunoblot of p-SMAD2/3 and SMAD2/3 proteins in response to TGF-β and poly (I:C) treatment. Pam212 cells were treated with poly (I:C) or PBS followed by incubation with and without TGF-β (5nM). Data represent three independent experiments with similar results. (E) Immunoblot of p-SMAD2/3 and SMAD2/3 proteins in response to TGF-β + poly (I:C) after knocking down of IL-33. Pam212 cells were transfected with siIl33 knockdown construct or siRNA control (siCon) for 30 hours followed by incubation with poly (I:C) and TGF-β. Data represent three independent experiments with similar results. (F) Immunoblot of p-SMAD2/3 and SMAD2/3 proteins upon the expression of IL-33 full length or cytokine domain. Pam212 cells were transfected with IL-33 full length or cytokine domain for 24 hours followed by incubation with and without TGF-β. Data represent three independent experiments with similar results. Data information: GAPDH is used as the control housekeeping protein in D-F). Graphs show mean + SD, NS: not significant, unpaired t-test.(G) Impact of IL-33 knockdown on cell proliferation in response to TGF-β. Pam212 cells were treated with siIl33 or siCon followed by TGF-β treatment (n=7 in each group). (H) Impact of IL-33 knockdown and SB431542 treatment on cell proliferation. Pam212 cells were treated with siIl33 or siCon in combination with SB431542 or DMSO (carrier control, n=7 in each group). "}
{"words": ["Figure", "4", "(", "I", ")", "SMAD", "signaling", "proteins", "levels", "in", "WT", "and", "K14", "-", "IL33tg", ",", "ST2KO", "skin", "treated", "with", "acetone", "(", "control", ")", "at", "the", "completion", "of", "the", "DMBA", "/", "TPA", "carcinogenesis", "protocol", ".", "Tissue", "lysates", "prepared", "from", "the", "whole", "back", "skin", "of", "the", "animals", "were", "subjected", "to", "immunoblot", "with", "p", "-", "SMAD2", "/", "3", ",", "p", "-", "SMAD1", "/", "5", ",", "SMAD6", ",", "SMAD2", "/", "3", "and", "SMAD1", "antibodies", ".", "GAPDH", "is", "used", "as", "the", "control", "housekeeping", "protein", "(", "n", "=", "5", "in", "each", "group", ")", ".", "(", "J", ")", "Representative", "images", "of", "IL", "-", "33", "and", "p", "-", "SMAD2", "/", "3", "immunostaining", "on", "the", "adjacent", "sections", "of", "human", "squamous", "cell", "carcinoma", "(", "SCC", ")", "and", "normal", "skin", "(", "scale", "bar", ":", "100", "μm", ")", ".", "Data", "information", ":", "Graphs", "show", "mean", "+", "SD", ",", "NS", ":", "not", "significant", ",", "unpaired", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(I) SMAD signaling proteins levels in WT and K14-IL33tg,ST2KO skin treated with acetone (control) at the completion of the DMBA/TPA carcinogenesis protocol. Tissue lysates prepared from the whole back skin of the animals were subjected to immunoblot with p-SMAD2/3, p-SMAD1/5, SMAD6, SMAD2/3 and SMAD1 antibodies. GAPDH is used as the control housekeeping protein (n=5 in each group).(J) Representative images of IL-33 and p-SMAD2/3 immunostaining on the adjacent sections of human squamous cell carcinoma (SCC) and normal skin (scale bar: 100 μm). Data information: Graphs show mean + SD, NS: not significant, unpaired t-test. "}
{"words": ["Figure", "5", "(", "B", ")", "Il33", "and", "Smad6", "mRNA", "levels", "in", "caerulein", "-", "treated", "WT", "pancreas", "compared", "with", "PBS", "-", "treated", "controls", "at", "the", "completion", "of", "chronic", "pancreatitis", "protocol", "(", "n", "=", "8", "in", "caerulein", "and", "n", "=", "9", "in", "PBS", "group", "for", "Il33", ",", "n", "=", "9", "in", "caerulein", "and", "n", "=", "10", "in", "PBS", "group", "for", "Smad6", ",", "unpaired", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "D", ")", "Pancreatic", "tumor", "-", "free", "survival", "of", "WT", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "IL", "-", "33KO", "(", "n", "=", "5", ")", "and", "ST2KO", "(", "n", "=", "6", ")", "mice", "at", "the", "completion", "of", "the", "DMBA", "/", "caerulein", "carcinogenesis", "protocol", "(", "log", "-", "rank", "test", ")", ".", "(", "G", ",", "H", ")", "Quantification", "of", "nuclear", "(", "G", ")", "IL", "-", "33", "+", "and", "(", "H", ")", "p", "-", "SMAD2", "/", "3", "+", "epithelial", "cells", "per", "HPF", "in", "the", "matched", "human", "pancreatic", "tissues", ".", "Each", "dot", "represents", "the", "average", "cell", "counts", "across", "three", "randomly", "selected", "HPF", "images", "per", "sample", "(", "n", "=", "18", "patients", ",", "paired", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(B) Il33 and Smad6 mRNA levels in caerulein-treated WT pancreas compared with PBS-treated controls at the completion of chronic pancreatitis protocol (n=8 in caerulein and n=9 in PBS group for Il33, n=9 in caerulein and n=10 in PBS group for Smad6, unpaired t-test).(D) Pancreatic tumor-free survival of WT (n=4), IL-33KO (n=5) and ST2KO (n=6) mice at the completion of the DMBA/caerulein carcinogenesis protocol (log-rank test).(G, H) Quantification of nuclear (G) IL-33+ and (H) p-SMAD2/3+ epithelial cells per HPF in the matched human pancreatic tissues. Each dot represents the average cell counts across three randomly selected HPF images per sample (n=18 patients, paired t-test)."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "Representative", "FACS", "plot", "(", "left", ")", "showing", "a", "mixed", "-", "lineage", "clone", "with", "a", "T", "-", "lymphoid", "(", "CD25", "+", "/", "CD11b", "-", "Gr1", "-", ")", ",", "myeloid", "(", "CD11b", "+", "Gr1", "+", "/", "CD25", "-", ")", ",", "and", "biphenotypic", "(", "CD11b", "+", "Gr1", "+", "/", "CD25", "+", ")", "fraction", "derived", "from", "a", "single", "Myc", "/", "Bcl2", "-", "transformed", "DN2cell", "grown", "on", "1", ":", "1", "OP9", ":", "OP9", "-", "Dll1", "co", "-", "culture", "with", "lineage", "-", "promiscuous", "cytokines", "IL", "-", "2", ",", "IL", "-", "3", ",", "IL", "-", "6", ",", "IL", "-", "7", ",", "SCF", ",", "GM", "-", "CSF", ",", "Flt3", ".", "Morphology", "of", "the", "indicated", "flow", "-", "sorted", "cell", "fractions", "was", "analyzed", "by", "Giemsa", "staining", "(", "right", ")", ".", "B", ".", "Phenotype", "frequencies", "of", "clones", "from", "Myc", "/", "Bcl2", "-", "transformed", "single", "cells", "(", "grown", "and", "phenotyped", "as", "mentioned", "in", "A", ")", ".", "Analyzed", "were", "31", "clones", "from", "LSKs", ",", "107", "from", "GMPs", "and", "28", "from", "DN2", "cells", ".", "C", ".", "Cumulative", "survival", "of", "31", "±", "2", "and", "27", "±", "6", "days", "of", "mice", "that", "received", "5104", "to", "5105", "T", "-", "lymphoid", "cells", "or", "myeloid", "cells", ",", "respectively", ",", "that", "were", "flow", "-", "sorted", "from", "mixed", "Myc", "/", "Bcl2", "+", "DN2", "-", "derived", "clones", ".", "The", "summarized", "data", "are", "from", "3", "mice", "injected", "with", "the", "T", "-", "lymphoid", "and", "4", "mice", "injected", "with", "the", "myeloid", "fraction", "of", "two", "different", "clones", ".", "D", ".", "Representative", "FACS", "plots", "demonstrating", "predominant", "outgrowth", "of", "myeloid", "clones", "from", "single", "Myc", "/", "Bcl2", "-", "transformed", "LSK", "or", "GMPcells", "on", "OP9", ":", "OP9", "-", "Dll1", "co", "-", "cultures", ".", "E", ".", "(", "top", "panels", ")", "Serial", "replating", "of", "Myc", "-", "Bcl2", "+", "DN2", "cells", "in", "methylcellulose", "generated", "myeloid", "clones", "with", "stable", "genomic", "reassembly", "of", "the", "Dβ1", "TCR", "locus", "in", "vitro", "(", "gel", ":", "left", "two", "lanes", ")", ".", "Upon", "transplantation", ",", "the", "same", "clones", "induced", "myeloid", "leukemia", "that", "retained", "the", "initial", "rearrangement", "in", "vivo", "(", "gel", ":", "right", "two", "lanes", ")", "as", "assessed", "by", "nested", "PCR", ".", "GL", "=", "germline", ".", "(", "bottom", "panels", ")", "Methylcellulose", "-", "based", "replating", "of", "Myc", "-", "Bcl2", "+", "GMPs", "generated", "myeloid", "clones", "that", "exclusively", "displayed", "the", "TCRß", "locus", "in", "germline", "configuration", ".", "F", ".", "Cumulative", "survival", "of", "mice", "that", "received", "106cells", "of", "TCRβ", "-", "rearranged", "myeloid", "DN2", "-", "derived", "clones", "leading", "to", "death", "within", "33", "±", "4", "days", "after", "transplantation", ".", "Two", "DN2", "clones", "were", "transplanted", "into", "5", "recipient", "mice", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. Representative FACS plot (left) showing a mixed-lineage clone with a T-lymphoid (CD25+/CD11b-Gr1-), myeloid (CD11b+Gr1+/CD25-), and biphenotypic (CD11b+Gr1+/CD25+) fraction derived from a single Myc/Bcl2-transformed DN2cell grown on 1:1 OP9:OP9-Dll1 co-culture with lineage-promiscuous cytokines IL-2, IL-3, IL-6, IL-7, SCF,GM-CSF, Flt3. Morphology of the indicated flow-sorted cell fractions was analyzed by Giemsa staining (right).B. Phenotype frequencies of clones from Myc/Bcl2-transformed single cells (grown and phenotyped as mentioned in A). Analyzed were 31 clones from LSKs, 107 from GMPs and 28 from DN2 cells.C. Cumulative survival of 31±2 and 27±6 days of mice that received 5104 to 5105 T-lymphoid cells or myeloid cells, respectively, that were flow-sorted from mixed Myc/Bcl2+ DN2-derived clones. The summarized data are from 3 mice injected with the T-lymphoid and 4 mice injected with the myeloid fraction of two different clones.D. Representative FACS plots demonstrating predominant outgrowth of myeloid clones from single Myc/Bcl2-transformed LSK or GMPcells on OP9:OP9-Dll1 co-cultures.E. (top panels) Serial replating of Myc-Bcl2+DN2 cells in methylcellulose generated myeloid clones with stable genomic reassembly of the Dβ1 TCR locus in vitro (gel: left two lanes). Upon transplantation, the same clones induced myeloid leukemia that retained the initial rearrangement in vivo (gel: right two lanes) as assessed by nested PCR. GL = germline. (bottom panels) Methylcellulose-based replating of Myc-Bcl2+GMPs generated myeloid clones that exclusively displayed the TCRß locus in germline configuration.F. Cumulative survival of mice that received 106cells of TCRβ-rearranged myeloid DN2-derived clones leading to death within 33±4 days after transplantation. Two DN2 clones were transplanted into 5 recipient mice."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Representative", "FACS", "plots", "of", "spleens", "from", "leukemic", "recipient", "mice", "that", "had", "received", "LSK", ",", "GMP", "or", "DN2", "cell", "grafts", "immediately", "after", "retroviral", "Myc", "/", "Bcl2", "transduction", ".", "Numbers", "indicate", "frequencies", "(", "%", ")", "of", "CD45", ".", "2", "donor", "cells", "within", "the", "indicated", "gates", "summarizing", "the", "mean", "±", "SEM", "of", "at", "least", "8", "recipients", "per", "group", "from", "a", "total", "of", "10", "independent", "experiments", ".", "B", ".", "Cumulative", "survival", "of", "mice", "that", "received", "2104", "to", "2105", "freshly", "Myc", "/", "Bcl2", "-", "transduced", "LSK", ",", "GMP", "or", "DN2", "cells", ";", "Graph", "shows", "n", "=", "11", "Myc", "-", "Bcl2", "+", "LSK", "-", ",", "n", "=", "14", "DN2", "-", ",", "and", "n", "=", "8", "GMP", "-", "transplanted", "animals", ".", "C", ".", "Histological", "spleen", "sections", "of", "Myc", "-", "Bcl2", "+", "LSK", "-", ",", "GMP", "-", "or", "DN2", "-", "transplanted", "mice", "displaying", "myeloperoxidasestaining", ".", "Leukemic", "cell", "engraftment", "in", "spleens", "ranged", "from", "75", ".", "1", "%", "-", "95", ".", "5", "%", ".", "D", ".", "Multiplex", "quantitative", "RT", "-", "PCR", "demonstrating", "strong", "expression", "of", "PU", ".", "1", "in", "the", "myeloid", "(", "M3L", ":", "CD11b", "+", "Gr1", "+", "/", "CD3", "-", "CD4", "-", "CD8", "-", ")", "and", "biphenotypic", "T", "/", "myeloid", "(", "BL", ":", "CD11b", "+", "Gr1", "+", "/", "CD3", "+", "CD4", "+", "CD8", "+", ")", "fractions", "but", "not", "in", "the", "T", "-", "lymphoid", "(", "TL", ":", "CD11b", "-", "Gr1", "-", "/", "CD3", "+", "CD4", "+", "CD8", "+", ")", "fraction", "that", "were", "flow", "-", "sorted", "from", "diseased", "Myc", "-", "Bcl2", "+", "DN2", "-", "transplanted", "mice", ".", "Myeloid", "progeny", "of", "Myc", "/", "Bcl2", "+", "GMP", "-", "transplanted", "or", "T", "-", "lymphoid", "progeny", "of", "Myc", "/", "Bcl2", "+", "DN3", "-", "transplanted", "animals", "as", "well", "as", "healthy", "thymocytes", "(", "Thy", ")", "and", "BM", "cells", "from", "WT", "mice", "served", "as", "controls", ".", "Results", "are", "shown", "as", "fold", "over", "actin", "transcripts", ".", "E", ".", "D", "-", "J", "rearrangement", "PCR", "of", "flow", "-", "sorted", "T", "-", "lymphoid", "(", "TL", ")", ",", "biphenotypic", "(", "BL", ")", "and", "myeloid", "(", "ML", ")", "fractions", "of", "donor", "splenocytes", "of", "a", "diseased", "Myc", "/", "Bcl2", "+", "DN2", "-", "transplanted", "mouse", ".", "All", "three", "fractions", "revealed", "a", "stable", "genomic", "reassembly", "of", "the", "Dβ1", "TCR", "locus", "(", "Dβ1Jβ1", ".", "5", ")", "demonstrating", "clonality", "in", "DN2", "leukemia", ".", "thy", "=", "thymus", ".", "F", ".", "FACS", "plot", "of", "diseased", "intrathymic", "grafts", "(", "CD45", ".", "2", "-", "gated", ")", ",", "demonstrating", "that", "Myc", "/", "Bcl2", "+", "DN2", "cells", "could", "produce", "multi", "-", "lineage", "leukemia", "within", "a", "T", "-", "cell", "supporting", "environment", ";", "Myc", "/", "Bcl2", "+", "GMPs", "remained", "myeloid", "restricted", "under", "these", "conditions", ".", "Numbers", "indicate", "cell", "frequencies", "within", "the", "gates", "(", "mean", "±", "SEM", ")", "representing", "six", "independent", "experiments", ".", "G", ".", "Intrathymic", "transplantation", "of", "mock", "-", "infected", "non", "-", "leukemic", "DN2", "cells", "produced", "predominantly", "T", "-", "lymphoid", "but", "also", "myeloid", "progeny", "23", "days", "after", "injection", ".", "This", "differentiation", "outcome", "resembles", "that", "of", "freshly", "isolated", "DN2", "cells", "(", "Bell", "and", "Bhandoola", ",", "2008", ";", "Richie", "Ehrlich", "et", "al", ".", ",", "2011", ")", ",", "and", "indicates", "that", "the", "short", "-", "term", "culture", "necessary", "for", "retroviral", "transduction", "did", "not", "interfere", "with", "the", "physiological", "lineage", "potential", "of", "DN2", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Representative FACS plots of spleens from leukemic recipient mice that had received LSK, GMP or DN2 cell grafts immediately after retroviral Myc/Bcl2 transduction. Numbers indicate frequencies (%) of CD45.2 donor cells within the indicated gates summarizing the mean±SEM of at least 8 recipients per group from a total of 10 independent experiments.B. Cumulative survival of mice that received 2104 to 2105 freshly Myc/Bcl2-transduced LSK, GMP or DN2 cells; Graph shows n=11 Myc-Bcl2+LSK-, n=14 DN2-, and n=8 GMP-transplanted animals.C. Histological spleen sections of Myc-Bcl2+LSK-, GMP- or DN2-transplanted mice displaying myeloperoxidasestaining. Leukemic cell engraftment in spleens ranged from 75.1%-95.5%.D. Multiplex quantitative RT-PCR demonstrating strong expression of PU.1 in the myeloid (M3L: CD11b+Gr1+/CD3-CD4-CD8-) and biphenotypic T/myeloid (BL: CD11b+Gr1+/CD3+CD4+CD8+) fractions but not in the T-lymphoid (TL: CD11b-Gr1-/CD3+CD4+CD8+) fraction that were flow-sorted from diseased Myc-Bcl2+DN2-transplanted mice. Myeloid progeny of Myc/Bcl2+GMP-transplanted or T-lymphoid progeny of Myc/Bcl2+DN3-transplanted animals as well as healthy thymocytes (Thy) and BM cells from WT mice served as controls. Results are shown as fold over actin transcripts.E. D-J rearrangement PCR of flow-sorted T-lymphoid (TL), biphenotypic (BL) and myeloid (ML) fractions of donor splenocytes of a diseased Myc/Bcl2+DN2-transplanted mouse. All three fractions revealed a stable genomic reassembly of the Dβ1 TCR locus (Dβ1Jβ1.5) demonstrating clonality in DN2 leukemia. thy = thymus.F. FACS plot of diseased intrathymic grafts (CD45.2-gated), demonstrating that Myc/Bcl2+DN2 cells could produce multi-lineage leukemia within a T-cell supporting environment; Myc/Bcl2+GMPs remained myeloid restricted under these conditions. Numbers indicate cell frequencies within the gates (mean±SEM) representing six independent experiments.G. Intrathymic transplantation of mock-infected non-leukemic DN2 cells produced predominantly T-lymphoid but also myeloid progeny 23 days after injection. This differentiation outcome resembles that of freshly isolated DN2 cells (Bell and Bhandoola, 2008; Richie Ehrlich et al., 2011), and indicates that the short-term culture necessary for retroviral transduction did not interfere with the physiological lineage potential of DN2 cells."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "GSEA", "demonstrates", "that", "Myc", "/", "Bcl2", "+", "DN2", "-", "derived", "myeloid", "blasts", "were", "significantly", "(", "FDR", ">", "0", ".", "05", ")", "enriched", "for", "expression", "of", "a", "pan", "-", "dendritic", "cell", "gene", "set", ".", "Gene", "sets", "were", "published", "in", "(", "Schonheit", "et", "al", ".", ",", "2013", ")", ".", "B", ".", "Heat", "map", "of", "the", "top", "100", "differentially", "expressed", "genes", "(", "adjusted", "p", "-", "value", "of", "≤", "0", ".", "05", ")", "in", "each", "myeloid", "fraction", "(", "ML", ":", "CD11b", "+", "Gr1", "+", "/", "CD3", "-", "CD4", "-", "CD8", "-", ")", "from", "GMP", "-", ",", "LSK", "-", "and", "DN2", "-", "derived", "leukemias", ".", "D", ".", "GSEA", "demonstrates", "significant", "enrichment", "of", "a", "normal", "DN2", "-", "specific", "gene", "set", "(", "see", "methods", "section", ")", "in", "the", "Myc", "/", "Bcl2", "+", "DN2", "-", "derived", "myeloid", "blasts", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. GSEA demonstrates that Myc/Bcl2+DN2-derived myeloid blasts were significantly (FDR >0.05) enriched for expression of a pan-dendritic cell gene set. Gene sets were published in (Schonheit et al., 2013).B. Heat map of the top 100 differentially expressed genes (adjusted p-value of ≤ 0.05) in each myeloid fraction (ML: CD11b+Gr1+/CD3-CD4-CD8-) from GMP-, LSK- and DN2-derived leukemias.D. GSEA demonstrates significant enrichment of a normal DN2-specific gene set (see methods section) in the Myc/Bcl2+DN2-derived myeloid blasts."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "Western", "blot", "illustrating", "abundant", "Bcl11b", "and", "Gata3protein", "expression", "in", "Myc", "/", "Bcl2", "+", "DN2", "-", "but", "not", "LSK", "-", "or", "GMP", "-", "derived", "blasts", ".", "Thymus", "(", "Thy", ")", "and", "bone", "marrow", "(", "BM", ")", "extracts", "from", "healthy", "WT", "mice", "served", "as", "controls", ".", "Detection", "of", "α", "-", "tubulin", "or", "valosin", "-", "containing", "protein", "(", "VCP", ")", "ensured", "comparable", "loading", ".", "B", ",", "C", ".", "Proliferation", "assays", "illustrating", "growth", "of", "Myc", "/", "Bcl2", "+", "DN2", "-", "(", "B", ")", "or", "GMP", "-", "derived", "(", "C", ")", "blasts", "after", "lentiviral", "transduction", "with", "the", "indicated", "shRNAs", ".", "The", "shRNA", "-", "transduced", "cells", "were", "flow", "-", "sorted", "based", "on", "co", "-", "expression", "of", "the", "RFP", "-", "reporter", "and", "seeded", "on", "OP9", "/", "OP9Dll1", "1", ":", "1", "layers", ".", "Growing", "cells", "were", "RFP", "-", "sorted", "for", "3", "rounds", "within", "21", "days", "of", "culture", "and", "percent", "growth", "was", "calculated", "over", "the", "initially", "seeded", "cell", "number", "in", "relation", "to", "the", "Luc", "control", ".", "Shown", "are", "results", "of", "4", "independent", "experiments", "with", "cells", "from", "4", "different", "DN2", "-", "and", "3", "different", "GMP", "-", "leukemic", "animals", ".", "Luc", "=", "control", "shRNA", "targeting", "luciferase", "(", "Suzuki", "et", "al", ".", ",", "2003", ")", ".", "At", "least", "2", "different", "shRNAs", "were", "used", "against", "Bcl11b", "or", "Gata3", "as", "indicated", ".", "*", "=", "p", "≤", "0", ".", "05", ",", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "D", ".", "Representative", "FACS", "plots", "showing", "CD45", ".", "2", "-", "donor", "splenocytes", "of", "a", "secondary", "(", "CD45", ".", "1", ")", "recipient", "23", "weeks", "after", "transplantation", "with", "4103RFP", "+", "Myc", "-", "Bcl2", "+", "DN2", "-", "leukemia", "blasts", "carrying", "the", "indicated", "shRNAs", ".", "Luc", ":", "luciferase", "control", "shRNA", ".", "The", "data", "are", "representative", "of", "2", "Gata3", ",", "4", "Bcl11b", ",", "and", "2", "luciferase", "shRNA", "-", "transplanted", "animals", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. Western blot illustrating abundant Bcl11b and Gata3protein expression in Myc/Bcl2+DN2- but not LSK- or GMP-derived blasts. Thymus (Thy) and bone marrow (BM) extracts from healthy WT mice served as controls. Detection of α-tubulin or valosin-containing protein (VCP) ensured comparable loading.B,C. Proliferation assays illustrating growth of Myc/Bcl2+ DN2- (B) or GMP-derived (C) blasts after lentiviral transduction with the indicated shRNAs. The shRNA-transduced cells were flow-sorted based on co-expression of the RFP-reporter and seeded on OP9/OP9Dll1 1:1 layers. Growing cells were RFP-sorted for 3 rounds within 21 days of culture and percent growth was calculated over the initially seeded cell number in relation to the Luc control. Shown are results of 4 independent experiments with cells from 4 different DN2- and 3 different GMP-leukemic animals. Luc= control shRNA targeting luciferase (Suzuki et al., 2003). At least 2 different shRNAs were used against Bcl11b or Gata3 as indicated. * = p≤0.05, Student's t-test.D. Representative FACS plots showing CD45.2-donor splenocytes of a secondary (CD45.1) recipient 23 weeks after transplantation with 4103RFP+Myc-Bcl2+DN2-leukemia blasts carrying the indicated shRNAs. Luc: luciferase control shRNA. The data are representative of 2 Gata3, 4 Bcl11b, and 2 luciferase shRNA-transplanted animals."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "Representative", "FACS", "plots", "of", "splenocytes", "from", "diseased", "secondary", "recipients", "that", "were", "transplanted", "with", "104", "to", "105", "flow", "-", "sorted", "myeloid", "leukemia", "blasts", "(", "ML", ":", "CD11b", "+", "Gr1", "+", "/", "CD3", "-", "CD4", "-", "CD8", "-", ")", "from", "sick", "primary", "Myc", "/", "Bcl2", "+", "LSK", "-", ",", "GMP", "-", "or", "DN2", "-", "transplanted", "mice", ".", "Cell", "percentages", "in", "indicated", "gates", "are", "shown", ".", "B", ".", "Table", "summarizing", "the", "phenotype", "frequencies", "within", "the", "spleens", "of", "secondary", "recipients", "that", "were", "retransplanted", "with", "Myc", "/", "Bcl2", "+", "LSK", "-", ",", "GMP", "-", "or", "DN2", "-", "derived", "myeloid", "blasts", "as", "described", "in", "A", ".", "T", "-", "lymphoid", "leukemia", ":", "(", "TL", ":", "CD11b", "-", "Gr1", "-", "/", "CD3", "+", "CD4", "+", "CD8", "+", ")", ",", "biphenotypic", "leukemia", ":", "BL", "(", "CD11b", "+", "Gr1", "+", "/", "CD3", "+", "CD4", "+", "CD8", "+", ")", ",", "myeloid", "leukemia", ":", "ML", "(", "CD11b", "+", "Gr1", "+", "/", "CD3", "-", "CD4", "-", "CD8", "-", ")", ".", "Numbers", "before", "the", "dash", "represent", "mice", "holding", "the", "indicated", "leukemia", "fraction", ";", "numbers", "after", "the", "dash", "indicate", "the", "total", "mouse", "count", "analyzed", ".", "C", ".", "Single", "myeloid", "blasts", "from", "4", "different", "Myc", "/", "bcl2", "+", "DN2", "-", "derived", "leukemias", "were", "flow", "-", "sorted", "from", "transplanted", "mice", "and", "grown", "on", "irradiated", "OP9", ":", "OP9DL1", "stroma", ".", "The", "clones", "were", "analyzed", "at", "two", "different", "time", "points", ".", "FACS", "plots", "of", "two", "representative", "clones", ",", "one", "with", "strong", "(", "top", ")", "and", "one", "with", "weak", "(", "bottom", ")", "lineage", "switching", "potential", "are", "shown", ".", "D", ".", "Table", "summarizing", "the", "lineage", "switching", "outcome", "of", "20", "independent", "clones", "that", "were", "grown", "from", "single", "DN2", "-", "derived", "myeloid", "blasts", "of", "4", "different", "leukemias", ".", "Percentages", "at", "the", "right", "indicate", "the", "relative", "amounts", "of", "cells", "with", "T", "-", "lymphoid", "(", "TL", ")", ",", "biphenotypic", "(", "BL", ")", "or", "myeloid", "(", "ML", ")", "phenotype", "as", "analyzed", "by", "FACS", "at", "the", "end", "of", "the", "experiment", ".", "E", ".", "FACS", "plot", "of", "DN2", "-", "derived", "primary", "leukemic", "cells", "transduced", "with", "a", "retrovirus", "carrying", "GFP", "alone", "or", "GFP", "together", "with", "PU", ".", "1", "as", "a", "bicistronic", "RNA", ".", "The", "transduced", "cells", "were", "grown", "on", "OP9", "/", "OP9Dll1", "1", ":", "1", "layer", "for", "8", "-", "13", "days", "and", "analyzed", "using", "a", "GFP", "-", "gate", ".", "The", "data", "are", "representative", "of", "3", "different", "experiments", "with", "similar", "outcome", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. Representative FACS plots of splenocytes from diseased secondary recipients that were transplanted with 104 to 105 flow-sorted myeloid leukemia blasts (ML: CD11b+Gr1+/CD3-CD4-CD8-) from sick primary Myc/Bcl2+LSK-, GMP- or DN2-transplanted mice. Cell percentages in indicated gates are shown.B. Table summarizing the phenotype frequencies within the spleens of secondary recipients that were retransplanted with Myc/Bcl2+LSK-, GMP- or DN2-derived myeloid blasts as described in A. T-lymphoid leukemia: (TL: CD11b-Gr1-/CD3+CD4+CD8+), biphenotypic leukemia: BL (CD11b+Gr1+/CD3+CD4+CD8+), myeloid leukemia: ML (CD11b+Gr1+/CD3-CD4-CD8-). Numbers before the dash represent mice holding the indicated leukemia fraction; numbers after the dash indicate the total mouse count analyzed.C. Single myeloid blasts from 4 different Myc/bcl2+ DN2-derived leukemias were flow-sorted from transplanted mice and grown on irradiated OP9:OP9DL1 stroma. The clones were analyzed at two different time points. FACS plots of two representative clones, one with strong (top) and one with weak (bottom) lineage switching potential are shown.D. Table summarizing the lineage switching outcome of 20 independent clones that were grown from single DN2-derived myeloid blasts of 4 different leukemias. Percentages at the right indicate the relative amounts of cells with T-lymphoid (TL), biphenotypic (BL) or myeloid (ML) phenotype as analyzed by FACS at the end of the experiment.E. FACS plot of DN2-derived primary leukemic cells transduced with a retrovirus carrying GFP alone or GFP together with PU.1 as a bicistronic RNA. The transduced cells were grown on OP9/OP9Dll1 1:1 layer for 8-13 days and analyzed using a GFP-gate. The data are representative of 3 different experiments with similar outcome."}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "Heat", "map", "depicting", "all", "human", "AML", "samples", "from", "the", "Haferlach", "study", "(", "Haferlach", "et", "al", ".", ",", "2010", ")", "whose", "transcriptomes", "resembled", "DN2", "-", "leukemia", "by", "a", "Spearman", "'", "s", "rank", "correlation", "coefficient", "≥", "0", ".", "5", ".", "The", "top", "100", "up", "-", "and", "downregulated", "gene", "signature", "of", "Myc", "/", "Bcl2", "+", "DN2", "-", "derived", "myeloid", "blasts", "was", "applied", "(", "see", "also", "Figure", "3B", ")", ".", "C", ",", "E", ".", "GSEA", "confirming", "enrichment", "of", "the", "Myc", "/", "Bcl2", "+", "DN2", "-", "derived", "myeloid", "blast", "top", "100", "UP", "(", "C", ")", "and", "pan", "-", "DC", "(", "Schonheit", "et", "al", ".", ",", "2013", ")", "(", "E", ")", "gene", "signatures", "in", "the", "human", "FAB", "M2", "DN2", "-", "like", "AML", "samples", "as", "compared", "to", "all", "residual", "M2", "AMLs", "from", "the", "Verhaak", "study", "(", "Verhaak", "et", "al", ".", ",", "2009", ")", ".", "D", ".", "Relative", "transcript", "levels", "of", "the", "T", "cell", "receptor", "alpha", "locus", "(", "TRAC", ")", "in", "human", "DN2", "-", "like", "M2", "AML", "compared", "to", "residual", "M2", "AML", "patient", "samples", "from", "the", "Verhaak", "study", "(", "Wilcoxon", "rank", "-", "sum", "test", ",", "*", "*", "=", "p", "≤", "0", ".", "01", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A. Heat map depicting all human AML samples from the Haferlach study (Haferlach et al., 2010) whose transcriptomes resembled DN2-leukemia by a Spearman's rank correlation coefficient ≥ 0.5. The top 100 up- and downregulated gene signature of Myc/Bcl2+DN2-derived myeloid blasts was applied (see also Figure 3B).C,E. GSEA confirming enrichment of the Myc/Bcl2+DN2-derived myeloid blast top 100 UP (C) and pan-DC (Schonheit et al., 2013) (E) gene signatures in the human FAB M2 DN2-like AML samples as compared to all residual M2 AMLs from the Verhaak study (Verhaak et al., 2009). D. Relative transcript levels of the T cell receptor alpha locus (TRAC) in human DN2-like M2 AML compared to residual M2 AML patient samples from the Verhaak study (Wilcoxon rank-sum test, **=p≤0.01)."}
{"words": ["Figure", "7A", ".", "Survival", "assay", "of", "Myc", "/", "Bcl2", "+", "GMP", "-", "and", "DN2", "-", "derived", "leukemia", "cells", "that", "were", "isolated", "from", "diseased", "mice", "and", "treated", "for", "24", "h", "with", "0", ".", "15", "μM", "daunorubicine", "or", "1", "μM", "doxorubicine", "in", "liquid", "culture", ".", "Cell", "death", "was", "measured", "by", "FACS", "of", "7", "-", "AAD", "+", "cells", "and", "was", "normalized", "to", "the", "solvent", "controls", ".", "The", "graphs", "show", "the", "mean", "+", "SEM", "of", "three", "different", "DN2", "-", "and", "five", "GMP", "-", "leukemias", ".", "*", "*", "=", "p", "≤", "0", ".", "01", ".", "C", ".", "Scatterplot", "depicting", "the", "averaged", "quantitative", "changes", "(", "log10", ")", "of", "each", "shRNA", "within", "the", "library", "in", "the", "T1", "spleen", "and", "BM", "samples", "in", "reference", "to", "T0", ".", "The", "changes", "in", "both", "organs", "were", "concordant", "(", "R2", "=", "0", ".", "72", ")", ".", "T1", "samples", "from", "11", "mice", "were", "compared", "to", "3", "T0", "reference", "samples", ".", "Blue", "dots", "represent", "shRNAs", "with", "a", "significant", "depletion", "by", "≥", "10", "-", "fold", ".", "D", ".", "Top", "5", "genes", "with", "≥", "10", "-", "fold", "shRNA", "depletion", "in", "BM", ",", "spleen", "and", "thymus", "in", "comparison", "to", "the", "reference", ".", "E", ".", "Percent", "cell", "growth", "of", "5", "different", "DN2", "-", "derived", "leukemic", "cell", "lines", "transduced", "with", "2", "different", "shRNA", "constructs", "targeting", "Jak2", ".", "The", "cells", "were", "sorted", "for", "the", "GFP", "or", "YFP", "reporter", "and", "normalized", "to", "the", "control", "shRNA", "targeting", "the", "lacZ", "gene", "(", "lacZ", ")", ".", "Four", "of", "five", "DN2", "-", "derived", "leukemias", "show", "reduced", "growth", "with", "both", "shRNAs", "after", "the", "second", "round", "of", "sorting", "within", "8", "days", "in", "culture", ".", "The", "lacZ", "control", "was", "set", "to", "100", "%", ".", "F", ".", "Proliferation", "curves", "of", "3", "Myc", "/", "Bcl2", "+", "DN2", "-", "and", "3", "GMP", "-", "derived", "leukemia", "lines", "during", "treatment", "with", "0", ".", "5", "μM", "ruxolitinib", ".", "1", ".", "5105", "cells", "were", "seeded", "in", "culture", "and", "counted", "at", "the", "indicated", "time", "points", ".", "Results", "are", "shown", "as", "fold", "growth", "of", "the", "starting", "cell", "number", "which", "was", "set", "to", "1", ".", "*", "=", "p", "≤", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "=", "p", "≤", "0", ".", "01", ",", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "G", ".", "Western", "blot", "indicating", "active", "Jak", "/", "Stat", "signaling", "in", "DN2", "-", "derived", "leukemia", "with", "Stat3", "as", "well", "as", "pStat3", "protein", "expression", ",", "that", "diminishes", "after", "treatment", "with", "the", "Jak", "-", "inhibitor", "ruxolitinib", ".", "H", ".", "GSEA", "indicating", "significant", "enrichment", "of", "genes", "of", "the", "JAK", "/", "STAT", "signaling", "pathway", "of", "the", "KEGG", "pathway", "database", "in", "the", "DN2", "-", "like", "M2", "AML", "samples", "as", "compared", "to", "the", "residual", "M2", "AML", "samples", "using", "the", "Verhaak", "AML", "data", "set", "(", "Verhaak", "et", "al", ".", ",", "2009", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A. Survival assay of Myc/Bcl2+GMP- and DN2-derived leukemia cells that were isolated from diseased mice and treated for 24 h with 0.15 μM daunorubicine or 1 μM doxorubicine in liquid culture. Cell death was measured by FACS of 7-AAD+cells and was normalized to the solvent controls. The graphs show the mean+SEM of three different DN2- and five GMP-leukemias. **=p≤0.01.C. Scatterplot depicting the averaged quantitative changes (log10) of each shRNA within the library in the T1 spleen and BM samples in reference to T0. The changes in both organs were concordant (R2=0.72). T1 samples from 11 mice were compared to 3 T0 reference samples. Blue dots represent shRNAs with a significant depletion by ≥10-fold.D. Top 5 genes with ≥10-fold shRNA depletion in BM, spleen and thymus in comparison to the reference.E. Percent cell growth of 5 different DN2-derived leukemic cell lines transduced with 2 different shRNA constructs targeting Jak2. The cells were sorted for the GFP or YFP reporter and normalized to the control shRNA targeting the lacZ gene (lacZ). Four of five DN2-derived leukemias show reduced growth with both shRNAs after the second round of sorting within 8 days in culture. The lacZ control was set to 100%.F. Proliferation curves of 3 Myc/Bcl2+ DN2- and 3 GMP-derived leukemia lines during treatment with 0.5 μM ruxolitinib. 1.5105 cells were seeded in culture and counted at the indicated time points. Results are shown as fold growth of the starting cell number which was set to 1. *=p≤0.05, **=p≤0.01, Student's t-test.G. Western blot indicating active Jak/Stat signaling in DN2-derived leukemia with Stat3 as well as pStat3 protein expression, that diminishes after treatment with the Jak-inhibitor ruxolitinib.H. GSEA indicating significant enrichment of genes of the JAK/STAT signaling pathway of the KEGG pathway database in the DN2-like M2 AML samples as compared to the residual M2 AML samples using the Verhaak AML data set (Verhaak et al., 2009)."}
{"words": ["Figure", "1A", ",", "Live", "images", "of", "neurons", "co", "-", "transfected", "with", "SyGCaMP5", "and", "MtDsRed", "before", "and", "during", "10", "Hz", "field", "stimulation", ".", "The", "full", "arrow", "indicates", "a", "mitochondrially", "occupied", "terminal", ",", "and", "the", "empty", "arrow", "a", "terminal", "without", "a", "mitochondrion", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "m", ".", "B", ",", "Average", "ΔF", "/", "F0", "SyGCaMP5", "traces", "from", "n", "=", "11", "neurons", "(", "98", "terminals", ")", "plotting", "the", "average", "of", "terminals", "without", "a", "mitochondrion", "(", "black", "trace", ")", "and", "with", "a", "mitochondrion", "(", "red", "trace", ")", ".", "Stimulation", "occurred", "for", "10s", "(", "t", "=", "20", "-", "30", ")", "at", "10", "Hz", ".", "C", ",", "Average", "Ca2", "+", "response", "following", "stimulation", "in", "terminals", "with", "or", "without", "a", "mitochondrion", "(", "average", "of", "ΔF", "measurement", "taken", "for", "a", "t", "=", "20", "-", "30s", "of", "B", ")", ",", "ΔF", "/", "F0", "=", "1", ".", "9", "0", ".", "3", "with", "and", "3", ".", "5", "0", ".", "4", "without", "mitochondria", ",", "paired", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "D", "E", ",", "However", ",", "there", "is", "no", "significant", "difference", "in", "the", "presynaptic", "Ca2", "+", "response", "in", "terminals", "with", "and", "without", "a", "mitochondrion", "in", "response", "to", "single", "action", "potentials", ".", "D", ",", "Example", "trace", "of", "hippocampal", "neurons", "transfected", "with", "MtDsRed", "and", "SyGCaMP5", ".", "1", "ms", "stimulation", "pulses", "were", "applied", "every", "5", "s", ".", "The", "red", "trace", "represents", "an", "average", "of", "the", "terminals", "occupied", "with", "a", "mitochondrion", "in", "this", "neuron", ",", "whereas", "the", "black", "trace", "represents", "the", "averaged", "response", "of", "terminals", "without", "a", "mitochondrion", ".", "E", ",", "Maximal", "fluorescence", "intensity", "in", "terminals", "without", "a", "mitochondrion", "(", "left", ")", "or", "with", "a", "mitochondrion", "(", "right", ")", "within", "the", "same", "axon", "(", "dots", "connected", "by", "a", "line", ")", "(", "n", "=", "8", "neurons", ",", "44", "terminals", ",", "paired", "t", "-", "test", ",", "p", "=", "0", ".", "55", ")", ".", "F", ",", "Average", "ΔF", "/", "F0", "SyGCaMP5", "traces", "for", "80", "stimuli", "(", "n", "=", "7", "neurons", ",", "21", "terminals", ",", "t", "=", "20", "-", "28s", ",", "ΔF", "/", "F0", "=", "1", ".", "3", "0", ".", "2", "with", "and", "2", ".", "2", "0", ".", "5", "without", "mitochondria", ",", "paired", "t", "-", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ",", "40", "stimuli", "(", "n", "=", "5", "neurons", ",", "25", "terminals", ",", "t", "=", "20", "-", "24s", ",", "ΔF", "/", "F0", "=", "0", ".", "9", "0", ".", "3", "with", "and", "2", ".", "0", "0", ".", "4", "without", "mitochondria", ",", "paired", "t", "-", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ",", "20", "stimuli", "(", "n", "=", "10", "neurons", ",", "55", "terminals", ",", "t", "=", "20", "-", "22s", ",", "ΔF", "/", "F0", "=", "0", ".", "8", "0", ".", "4", "with", "and", "1", ".", "8", "0", ".", "4", "without", "mitochondria", ",", "paired", "t", "-", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", "and", "10", "stimuli", "(", "n", "=", "4", "neurons", ",", "21", "terminals", ",", "t", "=", "20", "-", "21s", ",", "ΔF", "/", "F0", "=", "0", ".", "4", "0", ".", "3", "with", "and", "0", ".", "4", "0", ".", "1", "without", "mitochondria", ",", "paired", "t", "-", "test", ",", "p", "=", "0", ".", "90", ")", ",", "all", "delivered", "at", "10", "Hz", ".", "Experiments", "performed", "in", "E18", "or", "P0", "rat", "hippocampal", "neuronal", "cultures", "at", "DIV", "10", "-", "12", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A, Live images of neurons co-transfected with SyGCaMP5 and MtDsRed before and during 10 Hz field stimulation. The full arrow indicates a mitochondrially occupied terminal, and the empty arrow a terminal without a mitochondrion. Scale bar, 10 m.B, Average ΔF/F0 SyGCaMP5 traces from n=11 neurons (98 terminals) plotting the average of terminals without a mitochondrion (black trace) and with a mitochondrion (red trace). Stimulation occurred for 10s (t=20-30) at 10 Hz.C, Average Ca2+ response following stimulation in terminals with or without a mitochondrion (average of ΔF measurement taken for a t=20-30s of B), ΔF/F0 = 1.9 0.3 with and 3.5 0.4 without mitochondria, paired t-test, ***p<0.0001.D E, However, there is no significant difference in the presynaptic Ca2+ response in terminals with and without a mitochondrion in response to single action potentials. D, Example trace of hippocampal neurons transfected with MtDsRed and SyGCaMP5. 1 ms stimulation pulses were applied every 5 s. The red trace represents an average of the terminals occupied with a mitochondrion in this neuron, whereas the black trace represents the averaged response of terminals without a mitochondrion. E, Maximal fluorescence intensity in terminals without a mitochondrion (left) or with a mitochondrion (right) within the same axon (dots connected by a line) (n=8 neurons, 44 terminals, paired t-test, p=0.55).F, Average ΔF/F0 SyGCaMP5 traces for 80 stimuli (n=7 neurons, 21 terminals, t= 20-28s, ΔF/F0 = 1.3 0.2 with and 2.2 0.5 without mitochondria, paired t-test, *p<0.05), 40 stimuli (n=5 neurons, 25 terminals, t= 20-24s, ΔF/F0 = 0.9 0.3 with and 2.0 0.4 without mitochondria, paired t-test, *p<0.05), 20 stimuli (n=10 neurons, 55 terminals, t= 20-22s, ΔF/F0 = 0.8 0.4 with and 1.8 0.4 without mitochondria, paired t-test, *p<0.05) and 10 stimuli (n=4 neurons, 21 terminals, t= 20-21s, ΔF/F0 = 0.4 0.3 with and 0.4 0.1 without mitochondria, paired t-test, p=0.90), all delivered at 10 Hz. Experiments performed in E18 or P0 rat hippocampal neuronal cultures at DIV 10-12. Error bars represent SEM."}
{"words": ["Figure", "2A", ",", "Average", "trace", "of", "hippocampal", "neurons", "transfected", "with", "MtDsRed", "and", "SyGCaMP5", "imaged", "after", "incubation", "in", "ACSF", "for", "30", "min", ".", "Neurons", "were", "stimulated", "using", "field", "stimulation", "for", "10s", "at", "10", "Hz", ".", "Red", "trace", "=", "average", "of", "the", "terminals", "occupied", "with", "a", "mitochondrion", ",", "black", "trace", "=", "averaged", "response", "of", "terminals", "without", "a", "mitochondrion", ".", "B", ",", "as", "in", "A", ",", "but", "after", "30", "min", "treatment", "with", "10", "µM", "Ru360", ".", "C", ",", "Summary", "bar", "graph", "of", "the", "control", "neurons", "(", "corresponds", "to", "the", "traces", "shown", "in", "panel", "A", ")", ".", "Average", "Ca2", "+", "response", "(", "t", "=", "20", "-", "30s", ")", "following", "stimulation", "for", "terminals", "occupied", "by", "a", "mitochondrion", "(", "ΔF", "/", "F0", "=", "3", ".", "5", "0", ".", "4", ")", "and", "unoccupied", "terminals", "(", "ΔF", "/", "F0", "=", "4", ".", "9", "0", ".", "5", ",", "n", "=", "15", "neurons", ",", "96", "terminals", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "paired", "t", "-", "test", ")", ".", "D", ",", "Summary", "bar", "graph", "of", "the", "Ru360", "-", "treated", "neurons", "(", "corresponds", "to", "the", "traces", "shown", "in", "panel", "B", ")", ".", "Average", "Ca2", "+", "response", "(", "t", "=", "20", "-", "30s", ")", "following", "stimulation", "for", "terminals", "occupied", "by", "a", "mitochondrion", "(", "ΔF", "/", "F0", "=", "4", ".", "1", "0", ".", "5", ")", "and", "unoccupied", "terminals", "(", "ΔF", "/", "F0", "=", "3", ".", "8", "0", ".", "9", ",", "n", "=", "13", "neurons", ",", "79", "terminals", ",", "p", "=", "0", ".", "53", ",", "paired", "t", "-", "test", ")", ".", "Experiments", "performed", "in", "P0", "rat", "hippocampal", "neuronal", "cultures", "at", "DIV", "10", "-", "12", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A, Average trace of hippocampal neurons transfected with MtDsRed and SyGCaMP5 imaged after incubation in ACSF for 30 min. Neurons were stimulated using field stimulation for 10s at 10 Hz. Red trace = average of the terminals occupied with a mitochondrion, black trace = averaged response of terminals without a mitochondrion. B, as in A, but after 30 min treatment with 10 µM Ru360.C, Summary bar graph of the control neurons (corresponds to the traces shown in panel A). Average Ca2+ response (t=20-30s) following stimulation for terminals occupied by a mitochondrion (ΔF/F0 = 3.5 0.4) and unoccupied terminals (ΔF/F0 = 4.9 0.5, n=15 neurons, 96 terminals, ***p<0.001, paired t-test). D, Summary bar graph of the Ru360-treated neurons (corresponds to the traces shown in panel B). Average Ca2+ response (t=20-30s) following stimulation for terminals occupied by a mitochondrion (ΔF/F0 = 4.1 0.5) and unoccupied terminals (ΔF/F0 = 3.8 0.9, n=13 neurons, 79 terminals, p=0.53, paired t-test). Experiments performed in P0 rat hippocampal neuronal cultures at DIV 10-12. Error bars represent SEM."}
{"words": ["Figure", "3A", ",", "Example", "images", "of", "hippocampal", "neurons", "co", "-", "transfected", "with", "Mito", "-", "mKate2", "and", "VGlut1pHluorin", "before", "and", "during", "field", "stimulation", ".", "The", "white", "arrow", "indicates", "a", "terminal", "occupied", "with", "a", "mitochondrion", ",", "while", "the", "empty", "arrow", "indicates", "a", "terminal", "without", "a", "mitochondrion", ".", "B", ",", "Average", "traces", "of", "presynaptic", "terminals", "of", "hippocampal", "neurons", "transfected", "with", "VGlut1pHluorin", "and", "Mito", "-", "mKate2", "and", "stimulated", "using", "field", "stimulation", "at", "10", "Hz", "for", "20s", "(", "40", "-", "60s", ")", ".", "Terminals", "with", "a", "mitochondrion", "are", "represented", "by", "the", "red", "trace", "and", "terminals", "without", "are", "represented", "by", "the", "black", "trace", ".", "C", ",", "Summary", "graph", "corresponds", "to", "the", "traces", "shown", "in", "panel", "B", ")", ".", "Mean", "stimulation", "fluorescence", "(", "time", "points", "60", "-", "70s", ")", "comparing", "terminals", "of", "the", "same", "axon", "which", "contain", "mitochondria", "(", "right", ",", "ΔF", "/", "F0", "=", "2", ".", "3", "0", ".", "9", ")", "compared", "to", "terminals", "without", "mitochondria", "(", "left", ",", "ΔF", "/", "F0", "=", "3", ".", "2", "0", ".", "7", ")", "(", "n", "=", "9", "neurons", ",", "66", "terminals", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "paired", "t", "-", "test", ")", ".", "Experiments", "performed", "in", "P0", "rat", "hippocampal", "neuronal", "cultures", "at", "DIV", "10", "-", "12", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A, Example images of hippocampal neurons co-transfected with Mito-mKate2 and VGlut1pHluorin before and during field stimulation. The white arrow indicates a terminal occupied with a mitochondrion, while the empty arrow indicates a terminal without a mitochondrion. B, Average traces of presynaptic terminals of hippocampal neurons transfected with VGlut1pHluorin and Mito-mKate2 and stimulated using field stimulation at 10 Hz for 20s (40-60s). Terminals with a mitochondrion are represented by the red trace and terminals without are represented by the black trace. C, Summary graph corresponds to the traces shown in panel B). Mean stimulation fluorescence (time points 60-70s) comparing terminals of the same axon which contain mitochondria (right, ΔF/F0 = 2.3 0.9) compared to terminals without mitochondria (left, ΔF/F0 = 3.2 0.7) (n=9 neurons, 66 terminals, *p<0.05, paired t-test). Experiments performed in P0 rat hippocampal neuronal cultures at DIV 10-12. Error bars represent SEM."}
{"words": ["Figure", "4A", ",", "C", "E", ",", "Confocal", "images", "of", "neuronal", "processes", "of", "fixed", "neurons", "transfected", "with", "MtDsRed", "and", "SYN", "-", "GFP", "and", "C", ",", "myc", "-", "Miro1", "(", "Miro", "OE", ")", "or", "E", ",", "myc", "-", "Miro1ΔEF", "(", "Miro", "ΔEF", ")", ".", "Neurons", "are", "either", "non", "-", "treated", "(", "NT", ")", ",", "TTX", "treated", "(", "1", "M", ",", "48h", ")", ",", "PTX", "treated", "(", "100", "M", ",", "48h", ")", ",", "or", "DMSO", "treated", "(", "1", ":", "2000", ",", "as", "PTX", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "m", ".", "B", ",", "D", "F", ",", "Fraction", "of", "SYN", "-", "GFP", "clusters", "co", "-", "localising", "with", "mitochondria", "in", "cultures", "in", "B", ",", "control", "conditions", ",", "DMSO", "28", ".", "7", "%", "3", ".", "9", ",", "TTX", "16", ".", "6", "%", "3", ".", "1", ",", "PTX", "50", ".", "0", "%", "7", ".", "2", ",", "ANOVA", "*", "*", "p0", ".", "001", ",", "n", "=", "8", "-", "9", "neurons", ",", "D", ",", "with", "the", "expression", "of", "myc", "-", "Miro1", ",", "DMSO", "33", ".", "9", "%", "4", ".", "7", ",", "TTX", "35", ".", "9", "%", "5", ".", "4", ",", "PTX", "46", ".", "7", "%", "4", ".", "0", ",", "ANOVA", ",", "*", "p0", ".", "05", ",", "n", "=", "8", "-", "9", ",", "F", ",", "with", "the", "expression", "of", "myc", "-", "Miro1ΔEF", ",", "ANOVA", "p0", ".", "05", ",", "n", "=", "9", "-", "12", ".", "Experiments", "performed", "in", "E16", "mouse", "hippocampal", "neuronal", "cultures", "at", "DIV", "10", "-", "12", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A, C E, Confocal images of neuronal processes of fixed neurons transfected with MtDsRed and SYN-GFP and C, myc-Miro1 (Miro OE) or E, myc-Miro1ΔEF (Miro ΔEF). Neurons are either non-treated (NT), TTX treated (1 M, 48h), PTX treated (100 M, 48h), or DMSO treated (1:2000, as PTX). Scale bar, 10 m. B, D F, Fraction of SYN-GFP clusters co-localising with mitochondria in cultures in B, control conditions, DMSO 28.7% 3.9, TTX 16.6% 3.1, PTX 50.0% 7.2, ANOVA **p0.001, n=8-9 neurons, D, with the expression of myc-Miro1, DMSO 33.9% 4.7, TTX 35.9% 5.4, PTX 46.7% 4.0, ANOVA, *p0.05, n=8-9, F, with the expression of myc-Miro1ΔEF, ANOVA p0.05, n=9-12. Experiments performed in E16 mouse hippocampal neuronal cultures at DIV 10-12. Error bars represent SEM."}
{"words": ["Figure", "5A", ",", "Live", "images", "of", "neurons", "co", "-", "transfected", "with", "SyGCaMP5", "and", "MtDsRed", "or", "myc", "-", "ΔEF", "-", "Miro1", "-", "IRES", "-", "MtDsRed", "(", "ΔEF", "Miro", ")", "before", "and", "during", "10", "Hz", "field", "stimulation", "with", "and", "without", "TTX", "treatments", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "m", ".", "B", ",", "Average", "ΔF", "/", "F0", "SyGCaMP5", "traces", "from", "terminals", "treated", "with", "TTX", "(", "red", "trace", ",", "ΔF", "/", "F0", "=", "2", ".", "5", "0", ".", "5", ")", ",", "n", "=", "10", "neurons", "(", "62", "terminals", ")", "and", "non", "-", "treated", "terminals", "(", "black", "trace", ",", "ΔF", "/", "F0", "=", "1", ".", "3", "0", ".", "6", ")", ",", "n", "=", "11", "neurons", "(", "69", "terminals", ")", "co", "-", "transfected", "with", "MtDsRed", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "t", "-", "test", ".", "C", ",", "Average", "ΔF", "/", "F0", "SyGCaMP5", "traces", "from", "terminals", "treated", "with", "TTX", "(", "red", "trace", ",", "ΔF", "/", "F0", "=", "1", ".", "8", "0", ".", "3", ")", "in", "n", "=", "7", "neurons", "(", "33", "terminals", ")", "and", "non", "-", "treated", "terminals", "(", "black", "trace", ",", "ΔF", "/", "F0", "=", "2", ".", "3", "0", ".", "6", ")", "in", "n", "=", "7", "neurons", "(", "32", "terminals", ")", "co", "-", "transfected", "with", "myc", "-", "ΔEF", "-", "Miro1", "-", "IRES", "-", "MtDsRed", ";", "p", "=", "0", ".", "5", ",", "t", "-", "test", ".", "Experiments", "performed", "in", "E16", "mouse", "hippocampal", "neuronal", "cultures", "at", "DIV", "10", "-", "12", ".", "Error", "bars", "represent", "SEM", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A, Live images of neurons co-transfected with SyGCaMP5 and MtDsRed or myc-ΔEF-Miro1-IRES-MtDsRed (ΔEF Miro) before and during 10 Hz field stimulation with and without TTX treatments. Scale bar, 10 m. B, Average ΔF/F0 SyGCaMP5 traces from terminals treated with TTX (red trace, ΔF/F0 = 2.5 0.5), n=10 neurons (62 terminals) and non-treated terminals (black trace, ΔF/F0 = 1.3 0.6), n=11 neurons (69 terminals) co-transfected with MtDsRed, *p<0.05, t-test. C, Average ΔF/F0 SyGCaMP5 traces from terminals treated with TTX (red trace, ΔF/F0 = 1.8 0.3) in n=7 neurons (33 terminals) and non-treated terminals (black trace, ΔF/F0 = 2.3 0.6) in n=7 neurons (32 terminals) co-transfected with myc-ΔEF-Miro1-IRES-MtDsRed; p=0.5, t-test. Experiments performed in E16 mouse hippocampal neuronal cultures at DIV 10-12. Error bars represent SEM."}
{"words": ["Figure", "2Luciferase", "sequestration", "as", "an", "assay", "for", "in", "vitro", "uptake", ".", "(", "A", ")", "Luciferase", "cofractionating", "with", "vacuoles", "is", "proteinase", "K", "protected", ".", "In", "vitro", "uptake", "reactions", "of", "three", "times", "the", "standard", "volume", "were", "performed", "(", "60", "min", ",", "27", "°", "C", ")", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "the", "ATP", "-", "regenerating", "system", ".", "The", "vacuoles", "were", "reisolated", ",", "washed", ",", "resuspended", "in", "150", "mM", "KCl", "in", "PS", "buffer", "to", "a", "concentration", "of", "0", ".", "23", "mg", "/", "ml", ",", "and", "split", "into", "aliquots", ".", "After", "addition", "of", "1", "%", "Triton", "X", "-", "100", "or", "buffer", ",", "the", "mixture", "was", "digested", "with", "the", "indicated", "concentrations", "of", "proteinase", "K", "(", "15", "min", ",", "0", "°", "C", ")", ".", "Proteinase", "treatment", "was", "stopped", "by", "adding", "one", "volume", "of", "0", ".", "5", "mM", "PMSF", "in", "150", "mM", "KCl", "in", "PS", "buffer", ".", "Then", ",", "luciferase", "activity", "was", "assayed", ".", "(", "B", ")", "Luciferase", "can", "be", "released", "from", "the", "vacuolar", "lumen", "by", "freeze", "-", "thaw", "treatment", ".", "An", "uptake", "reaction", "was", "performed", "(", "60", "min", ",", "27", "°", "C", ")", ".", "The", "vacuoles", "were", "reisolated", "and", "washed", "as", "described", "in", "the", "Materials", "and", "Methods", "section", ".", "The", "final", "pellet", "was", "resuspended", "in", "90", "μl", "PS", "buffer", "with", "150", "mM", "KCl", "and", "split", "into", "two", "aliquots", ".", "One", "was", "frozen", "at", "−", "80", "°", "C", "and", "thawed", "again", "slowly", ",", "whereas", "the", "other", "remained", "on", "ice", ".", "The", "samples", "were", "centrifuged", "(", "15", "min", ",", "145", ",", "000", "g", ",", "4", "°", "C", ")", ".", "The", "supernatants", "(", "Sup", ")", "were", "recovered", "and", "the", "pellets", "were", "resuspended", "in", "an", "equal", "volume", "of", "PS", "with", "150", "mM", "KCl", ".", "Luciferase", "activity", "in", "both", "fractions", "was", "determined", ".", "The", "reaction", "tubes", "for", "this", "experiment", "had", "been", "coated", "with", "BSA", "(", "0", ".", "5", "mg", "/", "ml", ",", "15", "min", "at", "room", "temperature", ")", "to", "reduce", "unspecific", "binding", "of", "luciferase", "to", "the", "surface", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Luciferase sequestration as an assay for in vitro uptake. (A) Luciferase cofractionating with vacuoles is proteinase K protected. In vitro uptake reactions of three times the standard volume were performed (60 min, 27°C) in the presence or absence of the ATP-regenerating system. The vacuoles were reisolated, washed, resuspended in 150 mM KCl in PS buffer to a concentration of 0.23 mg/ml, and split into aliquots. After addition of 1% Triton X-100 or buffer, the mixture was digested with the indicated concentrations of proteinase K (15 min, 0°C). Proteinase treatment was stopped by adding one volume of 0.5 mM PMSF in 150 mM KCl in PS buffer. Then, luciferase activity was assayed.(B) Luciferase can be released from the vacuolar lumen by freeze-thaw treatment. An uptake reaction was performed (60 min, 27°C). The vacuoles were reisolated and washed as described in the Materials and Methods section. The final pellet was resuspended in 90 μl PS buffer with 150 mM KCl and split into two aliquots. One was frozen at −80°C and thawed again slowly, whereas the other remained on ice. The samples were centrifuged (15 min, 145,000 g, 4°C). The supernatants (Sup)were recovered and the pellets were resuspended in an equal volume of PS with 150 mM KCl. Luciferase activity in both fractions was determined. The reaction tubes for this experiment had been coated with BSA (0.5 mg/ml, 15 min at room temperature) to reduce unspecific binding of luciferase to the surface."}
{"words": ["Figure", "3time", "course", "and", "temperature", "dependence", "of", "uptake", ".", "(", "A", ")", "Standard", "uptake", "reactions", "were", "performed", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "the", "ATP", "-", "regenerating", "system", ".", "After", "the", "indicated", "times", "at", "27", "°", "C", ",", "the", "vacuoles", "were", "reisolated", ",", "washed", ",", "treated", "with", "protease", ",", "and", "luciferaseuptake", "activity", "was", "assayed", ".", "(", "B", ")", "A", "standard", "uptake", "reaction", "was", "performed", ".", "After", "70", "min", "of", "incubation", ",", "the", "vacuoles", "were", "reisolated", ",", "washed", ",", "and", "treated", "with", "protease", ".", "The", "vacuoles", "were", "reisolated", "again", ",", "resuspended", "in", "reaction", "buffer", "without", "luciferase", ",", "and", "incubated", "for", "the", "indicated", "times", "at", "27", "°", "C", ".", "Aliquots", "were", "withdrawn", "to", "assay", "the", "total", "luciferase", "remaining", ".", "As", "a", "control", ",", "luciferase", "was", "incubated", "in", "reaction", "buffer", "for", "the", "same", "periods", "of", "time", "and", "assayed", "for", "activity", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3time course and temperature dependence of uptake. (A) Standard uptake reactions were performed in the presence or absence of the ATP-regenerating system. After the indicated times at 27°C, the vacuoles were reisolated, washed, treated with protease, and luciferaseuptake activity was assayed.(B) A standard uptake reaction was performed. After 70 min of incubation, the vacuoles were reisolated, washed, and treated with protease. The vacuoles were reisolated again, resuspended in reaction buffer without luciferase, and incubated for the indicated times at 27°C. Aliquots were withdrawn to assay the total luciferase remaining. As a control, luciferase was incubated in reaction buffer for the same periods of time and assayed for activity."}
{"words": ["Figure", "4Requirements", "for", "in", "vitro", "uptake", ".", "Standard", "uptake", "reactions", "were", "performed", "(", "60", "min", ")", "(", "A", ")", "at", "different", "temperatures", ",", "or", "in", "the", "presence", "of", "different", "concentrations", "of", "(", "B", ")", "cytosol", ",", "(", "C", ")", "ATP", ",", "or", "(", "D", ")", "MgCl2", ".", "Luciferase", "uptake", "was", "determined", "as", "described", "in", "the", "legend", "to", "Fig", ".", "3", "A", ".", "In", "B", ",", "titration", "curves", "for", "four", "independent", "cytosol", "preparations", "are", "shown", ".", "The", "maximal", "uptake", "signal", "of", "each", "titration", "curve", "was", "set", "at", "100", "%", ".", "In", "D", ",", "the", "sample", "drawn", "as", "0", "mM", "MgCl2", "contained", "10", "mM", "EDTA", "to", "chelate", "free", "magnesium", "in", "the", "reaction", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Requirements for in vitro uptake. Standard uptake reactions were performed (60 min) (A) at different temperatures, or in the presence of different concentrations of (B) cytosol, (C) ATP, or (D) MgCl2. Luciferase uptake was determined as described in the legend to Fig. 3 A. In B, titration curves for four independent cytosol preparations are shown. The maximal uptake signal of each titration curve was set at 100%. In D, the sample drawn as 0 mM MgCl2 contained 10 mM EDTA to chelate free magnesium in the reaction."}
{"words": ["Figure", "6In", "vitro", "uptake", "is", "independent", "of", "components", "involved", "in", "homotypic", "vacuolar", "fusion", ".", "(", "A", ")", "Standard", "uptake", "reactions", "were", "performed", "(", "60", "min", ",", "27", "°", "C", ")", "in", "the", "presence", "of", "the", "indicated", "reagents", "using", "a", "mixture", "of", "vacuoles", "from", "strains", "DBY5734", "-", "16", "(", "Δpep4", ")", "and", "DBY5734", "-", "19", "(", "Δpho8", ")", ".", "Therefore", ",", "homotypic", "vacuolar", "fusion", "and", "luciferase", "uptake", "could", "be", "assayed", "simultaneously", "from", "the", "same", "sample", ".", "Four", "independent", "experiments", "were", "averaged", ".", "Error", "bars", "indicate", "SD", ".", "For", "averaging", ",", "uptake", "and", "fusion", "activities", "of", "the", "control", "sample", "without", "inhibitor", "were", "set", "at", "100", "%", ".", "Inhibitors", "were", "used", "at", "the", "following", "concentrations", ":", "anti", "-", "Sec17p", ",", "1", "μM", ";", "anti", "-", "Sec18p", ",", "1", "μM", ";", "Gdi1p", ",", "2", ".", "5", "μM", ";", "anti", "-", "Vam3p", ",", "1", "μM", ";", "anti", "-", "Vam7p", ",", "1", "μM", ";", "and", "anti", "-", "Nyv1p", ",", "1", "μM", ".", "(", "B", ")", "Vacuoles", "and", "cytosols", "were", "prepared", "from", "sec18", "-", "1", "and", "from", "corresponding", "wild", "-", "type", "(", "Wt", ")", "cells", "grown", "and", "spheroplasted", "at", "23", "°", "C", ".", "The", "isolated", "vacuoles", "and", "the", "cytosols", "were", "exposed", "to", "heat", "treatment", "(", "10", "min", ",", "37", "°", "C", ")", ".", "Standard", "uptake", "reactions", "were", "performed", "with", "vacuoles", "and", "cytosols", "in", "the", "indicated", "combinations", ".", "Control", "reactions", "were", "performed", "in", "the", "absence", "of", "ATP", ".", "Five", "independent", "experiments", "were", "averaged", ";", "the", "sample", "with", "vacuoles", "and", "cytosol", "from", "wild", "-", "type", "cells", "was", "used", "as", "the", "100", "%", "reference", ".", "Error", "bars", "indicate", "SD", ".", "Mut", ",", "mutant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6In vitro uptake is independent of components involved in homotypic vacuolar fusion. (A) Standard uptake reactions were performed (60 min, 27°C) in the presence of the indicated reagents using a mixture of vacuoles from strains DBY5734-16 (Δpep4) and DBY5734-19 (Δpho8). Therefore, homotypic vacuolar fusion and luciferase uptake could be assayed simultaneously from the same sample. Four independent experiments were averaged. Error bars indicate SD. For averaging, uptake and fusion activities of the control sample without inhibitor were set at 100%. Inhibitors were used at the following concentrations: anti-Sec17p, 1 μM; anti-Sec18p, 1 μM; Gdi1p, 2.5 μM; anti-Vam3p, 1 μM; anti-Vam7p, 1 μM; and anti-Nyv1p, 1 μM.(B) Vacuoles and cytosols were prepared from sec18-1 and from corresponding wild-type (Wt) cells grown and spheroplasted at 23°C. The isolated vacuoles and the cytosols were exposed to heat treatment (10 min, 37°C). Standard uptake reactions were performed with vacuoles and cytosols in the indicated combinations. Control reactions were performed in the absence of ATP. Five independent experiments were averaged; the sample with vacuoles and cytosol from wild-type cells was used as the 100% reference. Error bars indicate SD. Mut, mutant."}
{"words": ["Figure", "7In", "vitro", "uptake", "depends", "on", "GTP", "hydrolysis", "and", "on", "the", "V", "-", "ATPase", ".", "(", "A", ")", "Standard", "uptake", "reactions", "were", "performed", "in", "the", "presence", "of", "different", "concentrations", "of", "GTPγS", ".", "Luciferase", "uptake", "was", "assayed", "as", "in", "the", "legend", "to", "Fig", ".", "3", "A", ".", "Four", "independent", "experiments", "were", "averaged", ",", "using", "the", "sample", "without", "inhibitor", "as", "the", "100", "%", "reference", ".", "Error", "bars", "indicate", "SD", ".", "GTPγS", "did", "not", "influence", "luciferase", "activity", "by", "itself", "(", "not", "shown", ")", ".", "(", "B", ")", "Standard", "uptake", "reactions", "were", "performed", "in", "the", "presence", "of", "FCCP", "(", "CMA", ",", "20", "μM", ")", "or", "concanamycin", "A", "(", "20", "μM", ")", ",", "or", "in", "the", "absence", "of", "ATP", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7In vitro uptake depends on GTP hydrolysis and on the V-ATPase. (A) Standard uptake reactions were performed in the presence of different concentrations of GTPγS. Luciferase uptake was assayed as in the legend to Fig. 3 A. Four independent experiments were averaged, using the sample without inhibitor as the 100% reference. Error bars indicate SD. GTPγS did not influence luciferase activity by itself (not shown).(B) Standard uptake reactions were performed in the presence of FCCP (CMA, 20 μM) or concanamycin A (20 μM), or in the absence of ATP."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "H", ")", "The", "bur1", "-", "ΔC", "mutant", "exhibits", "a", "synthetic", "growth", "defect", "with", "the", "vac17Δ", "mutant", ".", "Plasmids", "were", "transformed", "into", "a", "bur1Δ", "or", "bur1Δ", "vac17Δ", "mutant", "containing", "YCp50", "[", "URA3", "]", "BUR1", ".", "Plasmids", "tested", "were", "pRS415", "[", "LEU2", "]", "(", "mock", ")", ",", "pRS415", "BUR1", ",", "or", "pRS415", "bur1", "-", "ΔC", ".", "Transformed", "colonies", "were", "cultured", "in", "liquid", "medium", "and", "serial", "dilutions", "spotted", "onto", "SC", "+", "5", "-", "FOA", "or", "SC", "-", "Leu", "-", "Ura", "plates", ".", "Plates", "were", "incubated", "at", "24", "̊", "C", "for", "3", "days", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(H) The bur1-ΔC mutant exhibits a synthetic growth defect with the vac17Δ mutant. Plasmids were transformed into a bur1Δ or bur1Δ vac17Δ mutant containing YCp50 [URA3] BUR1. Plasmids tested were pRS415 [LEU2] (mock), pRS415 BUR1, or pRS415 bur1-ΔC. Transformed colonies were cultured in liquid medium and serial dilutions spotted onto SC+5-FOA or SC-Leu-Ura plates. Plates were incubated at 24 ̊C for 3 days."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ",", "B", ")", "The", "bur1", "-", "ΔC", "vac17Δ", "double", "mutant", "exhibits", "a", "delay", "in", "progression", "through", "G1", "phase", "of", "the", "cell", "cycle", ".", "Yeast", "were", "grown", "in", "YPD", "medium", "and", "collected", "in", "log", "phase", "growth", ".", "DNA", "content", "was", "measured", "using", "propidium", "iodide", "(", "PI", ")", "staining", "and", "assessed", "by", "flow", "cytometry", ".", "p", "-", "value", "determined", "with", "a", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Tukey", "post", "hoc", "test", ".", "*", "*", "(", "p", "-", "value", "<", "1", "x", "10", "-", "2", ")", ".", "Error", "bars", ";", "SD", "calculated", "from", "at", "least", "four", "independent", "experiments", "with", "at", "least", "100", "cells", "counted", "in", "each", "strain", "/", "experiment", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "A", "bur1", "-", "267", "mutant", "also", "exhibits", "a", "delay", "in", "progression", "through", "G1", "phase", "of", "the", "cell", "cycle", ".", "DNA", "content", "was", "measured", "using", "PI", "staining", "and", "assessed", "by", "flow", "cytometry", ".", "p", "-", "value", "determined", "with", "a", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Tukey", "post", "hoc", "test", ".", "*", "*", "*", "*", "(", "p", "-", "value", "<", "1", "x", "10", "-", "4", ")", ".", "Error", "bars", ";", "SD", "calculated", "from", "at", "least", "four", "independent", "experiments", "with", "at", "least", "100", "cells", "counted", "in", "each", "strain", "/", "experiment", ".", "(", "E", ",", "F", ")", "The", "bur1", "-", "ΔC", "vac17Δ", "double", "mutant", "shows", "accumulation", "of", "Whi5", "in", "the", "nucleus", ".", "WT", ",", "vac17Δ", ",", "bur1", "-", "ΔC", ",", "and", "bur1", "-", "ΔC", "vac17Δ", "cells", ",", "which", "express", "Whi5", "-", "3xGFP", "and", "Nup188", "-", "mCherry", "from", "endogenous", "loci", ",", "were", "incubated", "at", "24", "̊", "C", ".", "Cells", "were", "scored", "for", "the", "presence", "of", "Whi5", "-", "3xGFP", "in", "within", "the", "nucleus", "(", "Nup188", "-", "mCherry", ")", ".", "Error", "bars", ";", "SD", "calculated", "from", "at", "least", "four", "independent", "experiments", "with", "at", "least", "100", "cells", "counted", "in", "each", "strain", "/", "experiment", ".", "p", "-", "value", "determined", "with", "a", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Tukey", "post", "hoc", "test", ".", "*", "*", "(", "p", "-", "value", "<", "1", "x", "10", "-", "2", ")", ".", "Error", "bars", ";", "SD", "calculated", "from", "at", "least", "four", "independent", "experiments", "with", "at", "least", "100", "cells", "counted", "in", "each", "strain", "/", "experiment", ".", "Scale", "bar", ",", "2", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A, B) The bur1-ΔC vac17Δ double mutant exhibits a delay in progression through G1 phase of the cell cycle. Yeast were grown in YPD medium and collected in log phase growth. DNA content was measured using propidium iodide (PI) staining and assessed by flow cytometry. p-value determined with a one-way ANOVA and Tukey post hoc test. ** (p-value < 1 x 10-2). Error bars; SD calculated from at least four independent experiments with at least 100 cells counted in each strain/experiment. (C, D) A bur1-267 mutant also exhibits a delay in progression through G1 phase of the cell cycle. DNA content was measured using PI staining and assessed by flow cytometry. p-value determined with a one-way ANOVA and Tukey post hoc test. **** (p-value < 1 x 10-4). Error bars; SD calculated from at least four independent experiments with at least 100 cells counted in each strain/experiment.(E, F) The bur1-ΔC vac17Δ double mutant shows accumulation of Whi5 in the nucleus. WT, vac17Δ, bur1-ΔC, and bur1-ΔC vac17Δ cells, which express Whi5-3xGFP and Nup188-mCherry from endogenous loci, were incubated at 24 ̊C. Cells were scored for the presence of Whi5-3xGFP in within the nucleus (Nup188-mCherry). Error bars; SD calculated from at least four independent experiments with at least 100 cells counted in each strain/experiment. p-value determined with a one-way ANOVA and Tukey post hoc test. ** (p-value < 1 x 10-2). Error bars; SD calculated from at least four independent experiments with at least 100 cells counted in each strain/experiment. Scale bar, 2 μm."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", ")", "The", "bur1", "-", "∆", "C", "vac17", "∆", "double", "mutant", "cells", "have", "the", "ability", "to", "generate", "a", "vacuole", "de", "novo", ",", "which", "suggests", "that", "the", "cell", "-", "cycle", "delay", "is", "due", "to", "a", "defect", "in", "Bur1", "-", "dependent", "signaling", ".", "WT", ",", "vac17Δ", ",", "bur1", "-", "∆", "C", ",", "and", "bur1", "-", "∆", "C", "vac17", "∆", "cells", "which", "express", "Vph1", "-", "GFP", "from", "its", "endogenous", "locus", ",", "were", "pulse", "labeled", "with", "the", "vacuole", "specific", "dye", "FM4", "-", "64", ".", "WT", "and", "bur1", "-", "∆", "C", "cells", "have", "both", "FM4", "-", "64", "and", "Vph1", "-", "GFP", "signals", "in", "both", "mother", "and", "daughter", "cells", ".", "vac17Δ", "and", "bur1", "-", "∆", "C", "vac17", "∆", "cells", "have", "both", "Vph1", "-", "GFP", "and", "FM4", "-", "64", "on", "the", "vacuole", "in", "mother", "cells", ",", "however", "the", "daughter", "cells", "solely", "have", "a", "Vph1", "-", "GFP", "labeled", "vacuole", ",", "indicating", "that", "the", "vacuole", "was", "generated", "de", "novo", ",", "rather", "than", "inherited", "from", "the", "mother", "vacuole", ".", "Arrowheads", ";", "new", "vacuoles", "in", "daughter", "cells", ".", "Scale", "bar", ",", "2", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(B) The bur1-∆C vac17∆ double mutant cells have the ability to generate a vacuole de novo, which suggests that the cell-cycle delay is due to a defect in Bur1-dependent signaling. WT, vac17Δ, bur1-∆C, and bur1-∆C vac17∆ cells which express Vph1-GFP from its endogenous locus, were pulse labeled with the vacuole specific dye FM4-64. WT and bur1-∆C cells have both FM4-64 and Vph1-GFP signals in both mother and daughter cells. vac17Δ and bur1-∆C vac17∆ cells have both Vph1-GFP and FM4-64 on the vacuole in mother cells, however the daughter cells solely have a Vph1-GFP labeled vacuole, indicating that the vacuole was generated de novo, rather than inherited from the mother vacuole. Arrowheads; new vacuoles in daughter cells. Scale bar, 2 μm."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "In", "vivo", "phosphorylation", "of", "Sch9", "is", "reduced", "in", "bur1", "-", "∆", "C", "vac17", "∆", "cells", ".", "WT", ",", "bur1", "-", "∆", "C", ",", "vac17", "∆", ",", "or", "bur1", "-", "∆", "C", "vac17", "∆", "cells", "expressing", "SCH9", "-", "HA", "from", "the", "URA3", "locus", "were", "grown", "in", "YPD", ".", "Cell", "lysates", "were", "analyzed", "by", "immunoblot", "with", "antibodies", "directed", "against", "HA", "(", "top", ")", "and", "Pgk1", "(", "loading", "control", ")", ".", "(", "B", ")", "In", "vivo", "phosphorylation", "of", "Sch9", "is", "reduced", "in", "bur1", "-", "267", "cells", ".", "WT", ",", "vac17", "∆", ",", "bur1", "-", "267", ",", "or", "bur1", "-", "267", "vac17", "∆", "cells", "expressing", "SCH9", "-", "HA", "from", "the", "URA3", "locus", "were", "grown", "in", "YPD", ".", "Cell", "lysates", "were", "analyzed", "by", "immunoblot", "with", "antibodies", "directed", "against", "HA", "(", "top", ")", "and", "Pgk1", "(", "loading", "control", ")", ".", "(", "C", ")", "bur1", "-", "∆", "C", "shows", "high", "rapamycin", "sensitivity", ".", "WT", ",", "tor1", "∆", ",", "bur1", "-", "∆", "C", ",", "tor1", "∆", "bur1", "-", "∆", "C", "or", "vac17", "∆", "cells", "were", "cultured", "in", "liquid", "YPD", "medium", "and", "serial", "dilutions", "were", "spotted", "onto", "YPD", "plates", "with", "0", ",", "2", ",", "4", "or", "8", "ng", "/", "ml", "of", "rapamycin", "added", ".", "Plates", "were", "incubated", "at", "24", "̊", "C", "for", "2", "days", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) In vivo phosphorylation of Sch9 is reduced in bur1-∆C vac17∆ cells. WT, bur1-∆C, vac17∆, or bur1-∆C vac17∆ cells expressing SCH9-HA from the URA3 locus were grown in YPD. Cell lysates were analyzed by immunoblot with antibodies directed against HA (top) and Pgk1 (loading control). (B) In vivo phosphorylation of Sch9 is reduced in bur1-267 cells. WT, vac17∆, bur1-267, or bur1-267 vac17∆ cells expressing SCH9-HA from the URA3 locus were grown in YPD. Cell lysates were analyzed by immunoblot with antibodies directed against HA (top) and Pgk1 (loading control).(C) bur1-∆C shows high rapamycin sensitivity. WT, tor1∆, bur1-∆C, tor1∆ bur1-∆C or vac17∆ cells were cultured in liquid YPD medium and serial dilutions were spotted onto YPD plates with 0, 2, 4 or 8 ng/ml of rapamycin added. Plates were incubated at 24 ̊C for 2 days."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "B", ")", "In", "vitro", ",", "Bur1", "directly", "phosphorylates", "the", "kinase", "domain", "of", "Sch9", "as", "well", "as", "Bur1", "itself", ".", "pRS425", "BUR1", "-", "HA", "and", "pVT102", "-", "Ura", "BUR2", ",", "the", "essential", "cyclin", "for", "BUR1", ",", "were", "co", "-", "expressed", "in", "a", "bur1Δ", "mutant", ",", "immunoprecipitated", "using", "anti", "-", "HA", "antibody", "and", "protein", "A", "beads", ",", "and", "then", "incubated", "with", "[", "γ", "-", "32P", "]", "ATP", "and", "GST", ",", "GST", "-", "N", "-", "Sch9", "(", "1", "-", "390", ")", "or", "GST", "-", "C", "-", "Sch9", "(", "391", "-", "824", ")", ".", "Proteins", "were", "eluted", "with", "SDS", "sample", "buffer", ",", "separated", "by", "SDS", "-", "PAGE", ",", "and", "transferred", "to", "nitrocellulose", "membranes", ".", "Membranes", "exposed", "to", "x", "-", "ray", "film", "(", "top", ")", "or", "stained", "with", "Ponceau", "S", "(", "bottom", ")", ".", "Red", "arrowhead", ";", "phosphorylated", "GST", "-", "C", "-", "Sch9", ".", "Gray", "arrowhead", ";", "auto", "-", "phosphorylated", "Bur1", ".", "(", "D", ")", "Sch9", "-", "2D3E", ",", "but", "not", "Sch9", "-", "3A", "-", "2D3E", ",", "partially", "suppressed", "the", "rapamycin", "sensitivity", "of", "tor1", "∆", "cells", ".", "tor1", "∆", "which", "expresses", "pRS426", "(", "mock", ")", ",", "pRS425", "TOR1", ",", "pVT102", "-", "Ura", "(", "mock", ")", ",", "pVT102", "-", "Ura", "Sch9", ",", "pVT102", "-", "Ura", "Sch9", "-", "2D3E", ",", "or", "pVT102", "-", "Ura", "Sch9", "-", "3A", "-", "2D3E", ",", "were", "cultured", "in", "liquid", "SC", "-", "Ura", "medium", "and", "serial", "dilutions", "spotted", "onto", "SC", "-", "Ura", "plates", "with", "0", "or", "8", "ng", "/", "ml", "of", "rapamycin", "added", ".", "Plates", "were", "incubated", "at", "24", "̊", "C", "for", "2", "-", "3", "days", ".", "(", "E", ")", "The", "Sch9", "-", "2D3E", "mutant", "did", "not", "suppress", "the", "rapamycin", "sensitivity", "of", "bur1", "-", "∆", "C", "cells", ".", "bur1", "-", "∆", "C", "which", "expresses", "pRS426", "(", "mock", ")", ",", "pRS426", "BUR1", ",", "pVT102", "-", "Ura", "(", "mock", ")", ",", "pVT102", "-", "Ura", "SCH9", ",", "pVT102", "-", "Ura", "sch9", "-", "2D3E", ",", "pVT102", "-", "Ura", "sch9", "-", "3A", "-", "2D3E", ",", "pVT102", "-", "Ura", "sch9", "-", "3D", "/", "E", ",", "or", "pVT102", "-", "Ura", "sch9", "-", "3D", "/", "E", "-", "2D3E", "were", "cultured", "in", "liquid", "SC", "-", "Ura", "medium", "and", "serial", "dilutions", "spotted", "onto", "SC", "-", "Ura", "plates", "with", "0", "or", "8", "ng", "/", "ml", "of", "rapamycin", "added", ".", "Plates", "were", "incubated", "at", "24", "̊", "C", "for", "3", "days", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(B) In vitro, Bur1 directly phosphorylates the kinase domain of Sch9 as well as Bur1 itself. pRS425 BUR1-HA and pVT102-Ura BUR2, the essential cyclin for BUR1, were co-expressed in a bur1Δ mutant, immunoprecipitated using anti-HA antibody and protein A beads, and then incubated with [γ-32P]ATP and GST, GST-N-Sch9 (1-390) or GST-C-Sch9 (391-824). Proteins were eluted with SDS sample buffer, separated by SDS-PAGE, and transferred to nitrocellulose membranes. Membranes exposed to x-ray film (top) or stained with Ponceau S (bottom). Red arrowhead; phosphorylated GST-C-Sch9. Gray arrowhead; auto-phosphorylated Bur1.(D) Sch9-2D3E, but not Sch9-3A-2D3E, partially suppressed the rapamycin sensitivity of tor1∆ cells. tor1∆ which expresses pRS426 (mock), pRS425 TOR1, pVT102-Ura (mock), pVT102-Ura Sch9, pVT102-Ura Sch9-2D3E, or pVT102-Ura Sch9-3A-2D3E, were cultured in liquid SC-Ura medium and serial dilutions spotted onto SC-Ura plates with 0 or 8 ng/ml of rapamycin added. Plates were incubated at 24 ̊C for 2-3 days.(E) The Sch9-2D3E mutant did not suppress the rapamycin sensitivity of bur1-∆C cells. bur1-∆C which expresses pRS426 (mock), pRS426 BUR1, pVT102-Ura (mock), pVT102-Ura SCH9, pVT102-Ura sch9-2D3E, pVT102-Ura sch9-3A-2D3E, pVT102-Ura sch9-3D/E, or pVT102-Ura sch9-3D/E-2D3E were cultured in liquid SC-Ura medium and serial dilutions spotted onto SC-Ura plates with 0 or 8 ng/ml of rapamycin added. Plates were incubated at 24 ̊C for 3 days."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Bur1", "fused", "SV40", "-", "NLS", "does", "not", "rescue", "the", "rapamycin", "sensitivity", "of", "bur1", "-", "∆", "C", "compared", "to", "Bur1", "without", "the", "NLS", ".", "bur1", "-", "∆", "C", "which", "expresses", "pRS416", "(", "mock", ")", ",", "pRS416", "BUR1", ",", "pRS416", "BUR1", "-", "mNG", ",", "pRS416", "BUR1", "-", "mNG", "-", "NLS", ",", "pRS416", "bur1", "-", "∆", "C", ",", "pRS416", "bur1", "-", "∆", "C", "-", "mNG", "-", "NLS", "or", "pRS416", "bur1", "-", "∆", "N", ",", "were", "cultured", "in", "liquid", "SC", "-", "Ura", "medium", "and", "serial", "dilutions", "spotted", "onto", "SC", "-", "Ura", "plates", "with", "0", ",", "4", ",", "8", ",", "or", "16", "ng", "/", "ml", "of", "rapamycin", "added", ".", "Plates", "were", "incubated", "at", "24", "̊", "C", "for", "2", "days", ".", "(", "B", ")", "Adding", "nuclear", "-", "export", "signal", "(", "NES", ")", "of", "PKI", "to", "Bur1", "and", "/", "or", "deletion", "of", "the", "importin", "α", "-", "dependent", "NLS", "from", "Bur1", "resulted", "in", "higher", "sensitivity", "to", "rapamycin", "compared", "to", "Bur1", "without", "this", "NES", ".", "bur1", "-", "∆", "C", "which", "expresses", "pRS426", "(", "mock", ")", ",", "pRS426", "BUR1", ",", "pRS426", "bur1", "-", "∆", "N", ",", "pRS426", "BUR1", "-", "mNG", ",", "pRS426", "BUR1", "-", "mNG", "-", "NES", ",", "or", "pRS426", "bur1", "-", "∆", "N", "-", "mNG", "-", "NES", ",", "were", "cultured", "in", "liquid", "SC", "-", "Ura", "medium", "and", "serial", "dilutions", "spotted", "onto", "SC", "-", "Ura", "plates", "with", "0", ",", "4", ",", "8", ",", "or", "16", "ng", "/", "ml", "of", "rapamycin", "added", ".", "Plates", "were", "incubated", "at", "24", "̊", "C", "for", "2", "days", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Bur1 fused SV40-NLS does not rescue the rapamycin sensitivity of bur1-∆C compared to Bur1 without the NLS. bur1-∆C which expresses pRS416 (mock), pRS416 BUR1, pRS416 BUR1-mNG, pRS416 BUR1-mNG-NLS, pRS416 bur1-∆C, pRS416 bur1-∆C-mNG-NLS or pRS416 bur1-∆N, were cultured in liquid SC-Ura medium and serial dilutions spotted onto SC-Ura plates with 0, 4, 8, or 16 ng/ml of rapamycin added. Plates were incubated at 24 ̊C for 2 days.(B) Adding nuclear-export signal (NES) of PKI to Bur1 and/or deletion of the importin α-dependent NLS from Bur1 resulted in higher sensitivity to rapamycin compared to Bur1 without this NES. bur1-∆C which expresses pRS426 (mock), pRS426 BUR1, pRS426 bur1-∆N, pRS426 BUR1-mNG, pRS426 BUR1-mNG-NES, or pRS426 bur1-∆N-mNG-NES, were cultured in liquid SC-Ura medium and serial dilutions spotted onto SC-Ura plates with 0, 4, 8, or 16 ng/ml of rapamycin added. Plates were incubated at 24 ̊C for 2 days."}
{"words": ["Figure", "1C", ",", "Immunoblot", "analysis", "of", "protein", "lysates", "from", "MEF", "cells", "treated", "with", "EBSS", ",", "250", "nM", "Torin", "-", "1", "or", "100", "μM", "NaAsO2", "for", "1h", "and", "run", "under", "non", "-", "reducing", "conditions", ".", "For", "refeed", "condition", ",", "starved", "cells", "were", "incubated", "in", "complete", "medium", "for", "the", "indicated", "times", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1C, Immunoblot analysis of protein lysates from MEF cells treated with EBSS, 250 nM Torin-1 or 100 μM NaAsO2 for 1h and run under non-reducing conditions. For refeed condition, starved cells were incubated in complete medium for the indicated times."}
{"words": ["Figure", "2C", ",", "Immunoblot", "analysis", "of", "protein", "lysates", "from", "ARPE", "-", "19", "cells", "expressing", "TFEB", "-", "FLAG", "-", "WT", "or", "mutants", "treated", "with", "250", "μM", "NaAsO2", "or", "EBSS", "for", "1h", "and", "run", "under", "non", "-", "reducing", "condition", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2C, Immunoblot analysis of protein lysates from ARPE-19 cells expressing TFEB-FLAG-WT or mutants treated with 250 μM NaAsO2 or EBSS for 1h and run under non-reducing condition."}
{"words": ["Figure", "3D", ",", "Immunoblot", "analysis", "of", "protein", "lysates", "from", "ARPE", "-", "19", "cells", "overexpressing", "TFEB", "-", "FLAG", "or", "TFE3", "-", "MYC", ",", "treated", "with", "250", "nM", "Torin", "-", "1", "for", "1", "h", "and", "run", "under", "non", "-", "reducing", "condition", ".", "E", ",", "Quantification", "of", "immunoblot", "data", "shown", "in", "(", "D", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "using", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", "(", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "05", "from", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3D, Immunoblot analysis of protein lysates from ARPE-19 cells overexpressing TFEB-FLAG or TFE3-MYC, treated with 250 nM Torin-1 for 1 h and run under non-reducing condition. E, Quantification of immunoblot data shown in (D). Data are presented as mean ± SD using two-tailed t-test (*)p<0.05 from three independent experiments. "}
{"words": ["Figure", "4D", ",", "Relative", "quantitative", "RT", "-", "PCR", "analysis", "of", "the", "mRNA", "expression", "of", "autophagy", "-", "(", "UVRAG", ")", ",", "mitochondria", "-", "(", "PGC", "-", "1α", ")", "and", "lysosome", "(", "MCOLN1", ",", "ATPV1C1", "and", "HEXA", ")", "-", "related", "genes", "in", "ARPE", "-", "19", "cells", "overexpressing", "TFEB", "-", "FLAG", "-", "WT", "or", "TFEB", "-", "FLAG", "-", "C212A", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "using", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "(", "ns", ")", "not", "significant", "as", "compared", "to", "the", "same", "gene", "in", "TFEB", "-", "WT", "overexpressing", "cells", ",", "from", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4D, Relative quantitative RT-PCR analysis of the mRNA expression of autophagy- (UVRAG), mitochondria- (PGC-1α) and lysosome (MCOLN1, ATPV1C1 and HEXA)-related genes in ARPE-19 cells overexpressing TFEB-FLAG-WT or TFEB-FLAG-C212A. Data are presented as mean ± SD using two-way ANOVA, (ns) not significant as compared to the same gene in TFEB-WT overexpressing cells, from three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "5G", ",", "Relative", "quantitative", "RT", "-", "PCR", "analysis", "of", "the", "mRNA", "expression", "of", "lysosome", "-", "related", "genes", "(", "MCOLN1", "and", "ATPV61C1", ")", "in", "ARPE", "-", "19", "and", "HeLa", "cells", "treated", "with", "100", "μM", "and", "50", "μM", "NaAsO2", "respectively", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "(", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "(", "*", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "(", "*", "*", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "001", "from", "two", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5G, Relative quantitative RT-PCR analysis of the mRNA expression of lysosome-related genes (MCOLN1 and ATPV61C1) in ARPE-19 and HeLa cells treated with 100 μM and 50 μM NaAsO2 respectively for the indicated times. Data are presented as mean ± SD using one-way ANOVA (*)p<0.05, (**)p< 0.01, (***)p<0.001 from two independent experiments."}
{"words": ["Figure", "6D", ",", "Relative", "quantitative", "RT", "-", "PCR", "analysis", "of", "the", "mRNA", "expression", "of", "autophagy", "-", "(", "UVRAG", ")", ",", "lysosome", "-", "(", "ATP6V1C1", ")", ",", "oxidative", "stress", "response", "-", "(", "TXNRD1", "and", "HMOX1", ")", ",", "cell", "cycle", "control", "-", "(", "CDKN1a", ")", "and", "cytokine", "production", "(", "IL6", ")", "-", "related", "genes", "in", "TFEB", "/", "TFE3", "-", "double", "knockout", "MEFs", "cells", "stably", "expressing", "TFEB", "-", "FLAG", "-", "WT", "or", "TFEB", "-", "FLAG", "-", "C212A", "and", "treated", "with", "5", "μM", "arsenic", "trioxide", "(", "ATO", ")", "or", "12", ".", "5", "μM", "NaAsO2", "for", "12", "h", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "using", "two", "-", "way", "ANOVA", "(", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "(", "*", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "(", "*", "*", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "and", "(", "*", "*", "*", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "0001", "from", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6D, Relative quantitative RT-PCR analysis of the mRNA expression of autophagy- (UVRAG), lysosome- (ATP6V1C1), oxidative stress response- (TXNRD1 and HMOX1), cell cycle control- (CDKN1a) and cytokine production (IL6) -related genes in TFEB/TFE3-double knockout MEFs cells stably expressing TFEB-FLAG-WT or TFEB-FLAG-C212A and treated with 5 μM arsenic trioxide (ATO) or 12.5 μM NaAsO2 for 12 h. Data are presented as mean ± SD using two-way ANOVA (*)p<0.05, (**)p<0.01, (***)p<0.001, and (****)p<0.0001 from three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "7C", ",", "Representative", "examples", "of", "HLH", "-", "30", ":", ":", "3xFLAG", ":", ":", "eGFP", "subcellular", "localization", ":", "Cytoplasmic", ",", "diffuse", "GFP", "distribution", "along", "the", "whole", "body", "of", "the", "worm", ";", "Weak", "nuclear", ",", "some", "cells", "in", "the", "posterior", "part", "of", "the", "worm", "display", "nuclear", "GFP", "labeling", "but", "no", "nuclear", "labeling", "is", "found", "in", "the", "head", "cells", ";", "Strong", "nuclear", ",", "distinct", "nuclear", "GFP", "labeling", "in", "cells", "along", "the", "worm", "body", ",", "including", "neurons", "in", "the", "head", "area", ".", "Arrowheads", "denote", "nuclear", "localization", "of", "HLH", "-", "30", ":", ":", "3xFLAG", ":", ":", "eGFP", ".", "Scale", "bar", "200", "µm", "and", "50", "µm", ".", "D", ",", "Quantification", "of", "the", "subcellular", "distribution", "of", "HLH", "-", "30", ":", ":", "3xFLAG", ":", ":", "eGFP", "and", "HLH", "-", "30", "(", "C284A", ")", ":", ":", "3xFLAG", ":", ":", "eGFP", "upon", "treatment", "with", "different", "stimuli", ".", "Data", "are", "from", "three", "independent", "experiments", "with", "at", "least", "50", "animals", "per", "experiment", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7C, Representative examples of HLH-30::3xFLAG::eGFP subcellular localization: Cytoplasmic, diffuse GFP distribution along the whole body of the worm; Weak nuclear, some cells in the posterior part of the worm display nuclear GFP labeling but no nuclear labeling is found in the head cells; Strong nuclear, distinct nuclear GFP labeling in cells along the worm body, including neurons in the head area. Arrowheads denote nuclear localization of HLH-30::3xFLAG::eGFP. Scale bar 200 µm and 50 µm. D, Quantification of the subcellular distribution of HLH-30::3xFLAG::eGFP and HLH-30(C284A)::3xFLAG::eGFP upon treatment with different stimuli. Data are from three independent experiments with at least 50 animals per experiment. "}
{"words": ["Figure", "8A", ",", "Lifespan", "assay", "of", "hlh", "-", "30", "mutants", "at", "25", "°", "C", ".", "Graph", "represents", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "plots", "of", "two", "independent", "experiments", "initiated", "with", "100", "animals", "per", "strain", ".", "(", "*", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "01", "and", "(", "*", "*", "*", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "Log", "-", "rank", "(", "Mantel", "-", "Cox", ")", "test", "compared", "to", "wild", "type", "control", ".", "B", ",", "Survival", "of", "hlh", "-", "30", "mutants", "on", "7", ".", "5", "mM", "NaAsO2", ".", "Data", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", "initiated", "with", "120", "animals", "per", "strain", ".", "(", "*", "*", "*", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "compared", "to", "wild", "type", "control", ".", "C", ",", "Survival", "of", "hlh", "-", "30", "mutants", "to", "infection", "by", "Staphylococcus", "aureus", ".", "Data", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", "initiated", "with", "100", "animals", "per", "strain", ".", "(", "*", "*", "*", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "compared", "to", "wild", "type", "control", ".", "E", ",", "Synthetic", "developmental", "delay", "phenotype", "of", "eat", "-", "2", "(", "ad1116", ")", "worms", "carrying", "mutations", "in", "the", "hlh", "-", "30", "gene", ".", "Data", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", "with", "at", "least", "20", "animals", "per", "assay", ".", "(", "*", "*", "*", "*", ")", "p", "<", "0", ".", "0001", "by", "One", "-", "way", "ANOVA", "with", "multiple", "comparison", "test", ".", "F", ",", "Representative", "images", "of", "worms", "quantified", "in", "(", "E", ")", ".", "Scale", "bars", "200", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8A, Lifespan assay of hlh-30 mutants at 25°C. Graph represents Kaplan-Meier survival plots of two independent experiments initiated with 100 animals per strain. (**)p<0.01 and (****)p<0.0001 by Log-rank (Mantel-Cox) test compared to wild type control. B, Survival of hlh-30 mutants on 7.5 mM NaAsO2. Data are the mean ± SD of three independent experiments initiated with 120 animals per strain. (****)p<0.0001 by two-way ANOVA compared to wild type control. C, Survival of hlh-30 mutants to infection by Staphylococcus aureus. Data are the mean ± SD of three independent experiments initiated with 100 animals per strain. (****)p<0.0001 by two-way ANOVA compared to wild type control. E, Synthetic developmental delay phenotype of eat-2(ad1116) worms carrying mutations in the hlh-30 gene. Data are the mean ± SD of three independent experiments with at least 20 animals per assay. (****)p<0.0001 by One-way ANOVA with multiple comparison test. F, Representative images of worms quantified in (E). Scale bars 200 µm. "}
{"words": ["Figure", "2ISCts", "midguts", "expressing", "YFP", "alone", "(", "control", ")", ",", "or", "expressing", "two", "non", "-", "overlapping", "EcR", "-", "RNAi", ",", "and", "quantification", "of", "the", "number", "of", "YFP", "-", "positive", "cells", "(", "yellow", ")", ".", "The", "graph", "also", "plots", "the", "number", "of", "GFP", "-", "positive", "cells", "in", "esgts", "midgut", "expressing", "GFP", "alone", "(", "ctrl", ")", ",", "or", "expressing", "EcR", "-", "RNAi", "#", "1", ",", "EcR", "-", "RNAi", "#", "2", ",", "and", "mcherry", "-", "RNAi", "as", "an", "additional", "negative", "control", "(", "see", "EV2B", ")", ".", "esgts", "midguts", "expressing", "GFP", "alone", "(", "control", ")", ",", "or", "expressing", "EcR", "-", "DN", ",", "and", "EcR", "-", "DN", "+", "pri", ".", "Samples", "were", "stained", "for", "GFP", "(", "green", ")", ".", "The", "graph", "shows", "quantification", "of", "the", "number", "of", "GFP", "-", "positive", "cells", "in", "the", "different", "genotypes", ".", "Posterior", "midguts", "containing", "control", "and", "Ubr3", "null", "MARCM", "clones", "(", "GFP", ",", "green", ")", ".", "esgts", "midguts", "expressing", "GFP", "alone", "(", "control", ")", ",", "or", "expressing", "Ubr3", "-", "RNAi", ",", "and", "Ubr3", "-", "RNAi", "+", "OvoB", ".", "Samples", "were", "stained", "for", "GFP", "(", "green", ")", ".", "H", "'", "quantification", "of", "GFP", "-", "positive", "cells", "from", "H", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2ISCts midguts expressing YFP alone (control), or expressing two non-overlapping EcR-RNAi, and quantification of the number of YFP-positive cells (yellow). The graph also plots the number of GFP-positive cells in esgts midgut expressing GFP alone (ctrl), or expressing EcR-RNAi#1, EcR-RNAi#2, and mcherry-RNAi as an additional negative control (see EV2B).esgts midguts expressing GFP alone (control), or expressing EcR-DN, and EcR-DN + pri. Samples were stained for GFP (green). The graph shows quantification of the number of GFP-positive cells in the different genotypes.Posterior midguts containing control and Ubr3 null MARCM clones (GFP, green).esgts midguts expressing GFP alone (control), or expressing Ubr3-RNAi, and Ubr3-RNAi + OvoB. Samples were stained for GFP (green). H' quantification of GFP-positive cells from H."}
{"words": ["Figure", "3esgts", "midguts", "expressing", "GFP", "alone", "(", "control", ")", "or", "expressing", "SvbACT", ".", "Samples", "were", "stained", "for", "GFP", "(", "green", ")", ",", "and", "ß", "-", "catenin", "(", "purple", ")", ",", "DE", "-", "Cadherin", "(", "white", ")", "or", "Scribble", "(", "yellow", ")", ".", "Top", "and", "bottom", "pictures", "show", "separate", "channels", "for", "a", "same", "region", ".", "esgts", "midguts", "expressing", "GFP", "alone", "(", "control", ")", ",", "or", "expressing", "miR8", ",", "OvoB", ",", "and", "mir8", "+", "OvoB", ".", "Samples", "were", "stained", "for", "GFP", "(", "green", ")", "and", "ß", "-", "catenin", "(", "purple", ")", ".", "The", "graph", "shows", "quantification", "of", "GFP", "-", "positive", "cells", "for", "each", "genotype", ".", "The", "Y", "axis", "is", "drawn", "using", "a", "log", "(", "10", ")", "scale", ".", "esgts", "midguts", "expressing", "GFP", "alone", "(", "control", ")", ",", "or", "expressing", "Notch", "Intra", "Cellular", "Domain", "(", "NICD", ")", ",", "and", "NICD", "+", "OvoB", ".", "In", "closeups", "(", "right", ")", ",", "DAPI", "is", "shown", "in", "purple", "for", "improved", "contrast", ";", "the", "arrow", "highlights", "a", "cell", "with", "intermediate", "phenotype", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3esgts midguts expressing GFP alone (control) or expressing SvbACT. Samples were stained for GFP (green), and ß-catenin (purple), DE-Cadherin (white) or Scribble (yellow). Top and bottom pictures show separate channels for a same region.esgts midguts expressing GFP alone (control), or expressing miR8, OvoB, and mir8 + OvoB. Samples were stained for GFP (green) and ß-catenin (purple). The graph shows quantification of GFP-positive cells for each genotype. The Y axis is drawn using a log(10) scale.esgts midguts expressing GFP alone (control), or expressing Notch Intra Cellular Domain (NICD), and NICD + OvoB. In closeups (right), DAPI is shown in purple for improved contrast; the arrow highlights a cell with intermediate phenotype."}
{"words": ["Figure", "4esgtsF", "/", "O", "midguts", "expressing", "GFP", "alone", "(", "control", ")", ",", "or", "expressing", "RasV12", ",", "and", "RasV12", "+", "svb", "-", "RNAi", "(", "top", "panels", ")", ".", "Bottom", "panels", "show", "esgts", "midguts", "expressing", "GFP", "alone", "(", "control", ")", ",", "or", "expressing", "EGFR", "-", "DN", ",", "and", "EGFR", "-", "DN", "+", "OvoB", ".", "Samples", "were", "stained", "for", "GFP", "(", "green", ")", ".", "The", "graph", "shows", "quantification", "of", "the", "number", "of", "GFP", "-", "positive", "cells", "in", "esgts", "midguts", "expressing", "GFP", "alone", "(", "ctrl", ")", ",", "or", "expressing", "EGFR", "-", "DN", ",", "EGFR", "-", "DN", "+", "OvoB", ",", "and", "EGFR", "-", "DN", "+", "svb", "-", "RNAi", ".", "The", "Y", "axis", "is", "plotted", "as", "log", "(", "10", ")", ".", "esgts", "midguts", "expressing", "GFP", "alone", "(", "control", ")", ",", "or", "expressing", "ArmS10", ",", "ArmS10", "+", "svb", "-", "RNAi", ",", "ArmS10", "+", "OvoB", ",", "TCF", "-", "DN", ",", "and", "TCF", "-", "DN", "+", "OvoB", ".", "Samples", "were", "stained", "for", "GFP", "(", "green", ")", ".", "The", "graph", "shows", "quantification", "of", "the", "number", "of", "GFP", "-", "positive", "cells", "in", "esgts", "midguts", "expressing", "GFP", "alone", "(", "ctrl", ")", ",", "or", "expressing", "TCF", "-", "DN", ",", "TCF", "-", "DN", "+", "OvoB", ",", "and", "TCF", "-", "DN", "+", "svb", "-", "RNAi", ".", "The", "Y", "axis", "is", "plotted", "as", "log", "(", "10", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4esgtsF/O midguts expressing GFP alone (control), or expressing RasV12, and RasV12 + svb-RNAi (top panels). Bottom panels show esgts midguts expressing GFP alone (control), or expressing EGFR-DN, and EGFR-DN + OvoB. Samples were stained for GFP (green). The graph shows quantification of the number of GFP-positive cells in esgts midguts expressing GFP alone (ctrl), or expressing EGFR-DN, EGFR-DN + OvoB, and EGFR-DN + svb-RNAi. The Y axis is plotted as log(10).esgts midguts expressing GFP alone (control), or expressing ArmS10, ArmS10 + svb-RNAi, ArmS10 + OvoB ,TCF-DN, and TCF-DN + OvoB. Samples were stained for GFP (green). The graph shows quantification of the number of GFP-positive cells in esgts midguts expressing GFP alone (ctrl), or expressing TCF-DN, TCF-DN + OvoB, and TCF-DN + svb-RNAi. The Y axis is plotted as log(10)."}
{"words": ["Figure", "5esgts", "midguts", "expressing", "GFP", "alone", "(", "control", ")", ",", "or", "expressing", "SvbREP", ".", "Samples", "were", "stained", "for", "GFP", "(", "green", ")", "and", "Prospero", "(", "red", ")", ".", "Closeups", "correspond", "to", "boxed", "regions", ",", "with", "DAPI", "shown", "in", "purple", "and", "GFP", "-", "positive", "cells", "outlined", "in", "yellow", ".", "esgts", "-", "F", "/", "O", "midguts", "expressing", "GFP", "alone", "(", "control", ")", ",", "or", "expressing", "SvbREP", ".", "Samples", "were", "stained", "for", "GFP", "(", "green", ")", "and", "cleaved", "DCP1", "(", "red", ")", ".", "E", "'", "shows", "quantification", "of", "the", "number", "of", "GFP", "-", "positive", "cells", "in", "esgts", "guts", "expressing", "GFP", "alone", "(", "ctrl", ")", ",", "or", "DIAP", ",", "SvbREP", ",", "and", "SvbREP", "+", "DIAP", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5esgts midguts expressing GFP alone (control), or expressing SvbREP. Samples were stained for GFP (green) and Prospero (red). Closeups correspond to boxed regions, with DAPI shown in purple and GFP-positive cells outlined in yellow.esgts-F/O midguts expressing GFP alone (control), or expressing SvbREP. Samples were stained for GFP (green) and cleaved DCP1 (red). E' shows quantification of the number of GFP-positive cells in esgts guts expressing GFP alone (ctrl), or DIAP, SvbREP, and SvbREP + DIAP."}
{"words": ["Figure", "6esgts", "midguts", "expressing", "GFP", "alone", "(", "control", ")", ",", "or", "expressing", "Notch", "-", "RNAi", ",", "Notch", "-", "RNAi", "+", "svb", "-", "RNAi", ",", "and", "Notch", "-", "RNAi", "+", "SvbREP", ".", "Samples", "were", "stained", "for", "GFP", "(", "green", ")", "and", "Prospero", "(", "red", ")", ".", "The", "graph", "shows", "quantification", "of", "the", "number", "of", "GFP", "-", "positive", "cells", ".", "esgts", "midguts", "expressing", "GFP", "alone", "(", "control", ")", ",", "or", "expressing", "STAT", "-", "RNAi", ",", "STAT", "-", "RNAi", "+", "svb", "-", "RNAi", "and", "STAT", "-", "RNAi", "+", "SvbREP", ".", "Samples", "were", "stained", "for", "GFP", "(", "green", ")", "and", "Prospero", "(", "red", ")", ".", "The", "graph", "shows", "quantification", "of", "the", "number", "of", "GFP", "-", "positive", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6esgts midguts expressing GFP alone (control), or expressing Notch-RNAi, Notch-RNAi + svb-RNAi, and Notch-RNAi + SvbREP. Samples were stained for GFP (green) and Prospero (red). The graph shows quantification of the number of GFP-positive cells.esgts midguts expressing GFP alone (control), or expressing STAT-RNAi, STAT-RNAi + svb-RNAi and STAT-RNAi + SvbREP. Samples were stained for GFP (green) and Prospero (red). The graph shows quantification of the number of GFP-positive cells."}
{"words": ["Figure", "7Cross", "sections", "of", "control", "MyoIAts", "midguts", "(", "expressing", "GFP", "and", "mCherry", "-", "RNAi", ")", ",", "or", "expressing", "svb", "-", "RNAi", ",", "SvbACT", ",", "and", "Pri", ".", "Samples", "were", "stained", "for", "F", "-", "actin", "(", "white", ")", ",", "GFP", "(", "green", ")", "and", "Tsp2a", "(", "yellow", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Cross sections of control MyoIAts midguts (expressing GFP and mCherry-RNAi), or expressing svb-RNAi, SvbACT, and Pri. Samples were stained for F-actin (white), GFP (green) and Tsp2a (yellow)."}
{"words": ["Figure", "8MyoIAts", "midguts", "expressing", "GFP", "alone", "(", "control", ")", ",", "or", "expressing", "SvbACT", ".", "Samples", "were", "stained", "for", "GFP", "(", "green", ")", ",", "Scribble", "(", "yellow", ")", ",", "ß", "-", "catenin", "(", "purple", ")", "and", "DAPI", "(", "Blue", ")", ".", "A", "'", "pictures", "display", "cross", "sections", "of", "the", "regions", "shown", "in", "A", ".", "MyoIAts", "midguts", "expressing", "GFP", "alone", "(", "control", ")", ",", "or", "expressing", "SvbACT", ".", "Samples", "were", "stained", "for", "GFP", "(", "green", ")", "and", "PH3", "(", "red", ")", ".", "The", "graph", "plots", "number", "of", "mitotic", "PH3", "-", "positive", "cells", "per", "midgut", "of", "MyoIAts", "guts", "expressing", "GFP", "alone", "(", "ctrl", ")", ",", "or", "expressing", "SvbACT", ",", "and", "SvbREP", "+", "pri", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8MyoIAts midguts expressing GFP alone (control), or expressing SvbACT. Samples were stained for GFP (green), Scribble (yellow), ß-catenin (purple) and DAPI (Blue). A' pictures display cross sections of the regions shown in A.MyoIAts midguts expressing GFP alone (control), or expressing SvbACT. Samples were stained for GFP (green) and PH3 (red). The graph plots number of mitotic PH3-positive cells per midgut of MyoIAts guts expressing GFP alone (ctrl), or expressing SvbACT , and SvbREP + pri."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "qPCR", "analysis", "shows", "loss", "of", "Setd1b", "in", "forebrain", "regions", "while", "levels", "in", "the", "cerebellum", "are", "not", "affected", "(", "CA", ":", "Control", ",", "n", "=", "6", ";", "cKO", ",", "n", "=", "6", ".", "DG", ":", "Control", ",", "n", "=", "6", ";", "cKO", ",", "n", "=", "6", ".", "Cortex", ":", "Control", ",", "n", "=", "7", ";", "cKO", ",", "n", "=", "7", ".", "Cerebellum", ":", "Control", ",", "n", "=", "4", ";", "cKO", ",", "n", "=", "4", ")", ".", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", "(", "Student", "t", "-", "test", ")", ".", "B", ".", "Immunoblot", "analysis", "shows", "loss", "of", "Setd1b", "protein", "in", "the", "hippocampus", "of", "Setd1b", "cKO", "mice", "(", "Control", ",", "n", "=", "4", ";", "cKO", ",", "n", "=", "4", ")", ".", "*", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "01", "(", "Student", "t", "-", "test", ")", ".", "C", ".", "Immunohistochemical", "staining", "(", "upper", "level", ")", "for", "marker", "proteins", "of", "neuronal", "integrity", "and", "quantification", "(", "lower", "panel", ")", "show", "no", "difference", "in", "control", "and", "Setd1b", "cKO", "mice", "(", "NeuN", ":", "Control", ",", "n", "=", "6", ";", "cKO", ",", "n", "=", "6", ";", "Student", "t", "-", "test", "p", "-", "value", "=", "0", ".", "57", ".", "MAP2", ":", "Control", ",", "n", "=", "4", ";", "cKO", ",", "n", "=", "4", ";", "Student", "t", "-", "test", "p", "-", "value", "=", "0", ".", "72", ".", "Iba1", ":", "Control", ",", "n", "=", "5", ";", "cKO", ",", "n", "=", "5", ";", "Student", "t", "-", "test", "p", "-", "value", "=", "0", ".", "8", ".", "Gfap", ":", "Control", ",", "n", "=", "5", ";", "cKO", ",", "n", "=", "5", ";", "Student", "t", "-", "test", "p", "-", "value", "=", "0", ".", "09", ".", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "µm", ".", "D", ".", "Average", "speed", "(", "left", "panel", ")", "and", "percent", "time", "spent", "in", "the", "center", "(", "right", "panel", ")", "during", "exposure", "to", "the", "open", "field", "test", "was", "similar", "in", "control", "and", "Setd1b", "cKO", "mice", "(", "Average", "speed", ":", "Control", ",", "n", "=", "15", ";", "cKO", ",", "n", "=", "15", ";", "Student", "t", "-", "test", "p", "-", "value", "=", "0", ".", "075", ".", "Time", "spent", "in", "center", ":", "Control", ",", "n", "=", "15", ";", "cKO", ",", "n", "=", "15", ";", "Student", "t", "-", "test", "p", "-", "value", "=", "0", ".", "96", ")", ".", "E", ".", "Short", "term", "memory", "was", "not", "different", "between", "control", "and", "Setd1b", "cKO", "mice", "as", "indicated", "by", "similar", "percent", "of", "alternations", "in", "the", "Y", "-", "maze", "test", "(", "Control", ",", "n", "=", "15", ";", "cKO", ",", "n", "=", "15", ";", "Student", "t", "-", "test", "p", "-", "value", "=", "0", ".", "3", ")", ".", "F", ".", "Depressive", "-", "like", "behavior", "was", "measured", "in", "the", "Porsolt", "forced", "swim", "test", ".", "There", "was", "no", "significant", "difference", "in", "the", "%", "time", "spent", "immobile", "between", "groups", "(", "Control", ",", "n", "=", "8", ";", "cKO", ",", "n", "=", "8", ";", "Student", "t", "-", "test", "p", "-", "value", "=", "0", ".", "5", ")", ".", "G", ".", "Escape", "latency", "during", "water", "maze", "training", "indicated", "severe", "learning", "impairment", "in", "Setd1b", "cKO", "mice", "(", "Control", ":", "n", "=", "15", ",", "cKO", ":", "n", "=", "15", ".", "Repeated", "measures", "ANOVA", ",", "genotype", "effect", ":", "F", "(", "1", ",", "28", ")", "=", "82", ".", "34", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "0001", ")", ".", "H", ".", "Plots", "showing", "the", "specific", "search", "strategies", "during", "water", "maze", "training", ".", "Note", "the", "failure", "of", "Setd1b", "cKO", "mice", "to", "adopt", "hippocampus", "-", "dependent", "search", "strategies", ".", "I", ".", "The", "cognitive", "score", "calculated", "on", "the", "basis", "of", "the", "hippocampal", "search", "strategies", "reflects", "severe", "memory", "impairment", "in", "Setd1b", "cKO", "mice", "(", "Student", "t", "-", "test", ":", "*", "*", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "001", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. qPCR analysis shows loss of Setd1b in forebrain regions while levels in the cerebellum are not affected (CA: Control, n = 6; cKO, n = 6. DG: Control, n = 6; cKO, n = 6. Cortex: Control, n = 7; cKO, n = 7. Cerebellum: Control, n = 4; cKO, n = 4). * p-value < 0.05 (Student t-test).B. Immunoblot analysis shows loss of Setd1b protein in the hippocampus of Setd1b cKO mice (Control, n = 4; cKO, n = 4). ** p-value < 0.01 (Student t-test).C. Immunohistochemical staining (upper level) for marker proteins of neuronal integrity and quantification (lower panel) show no difference in control and Setd1b cKO mice (NeuN: Control, n = 6; cKO, n = 6; Student t-test p-value = 0.57. MAP2: Control, n = 4; cKO, n = 4; Student t-test p-value = 0.72. Iba1: Control, n = 5; cKO, n = 5; Student t-test p-value = 0.8. Gfap: Control, n = 5; cKO, n = 5; Student t-test p-value = 0.09.). Scale bar: 100 µm.D. Average speed (left panel) and percent time spent in the center (right panel) during exposure to the open field test was similar in control and Setd1b cKO mice (Average speed: Control, n = 15; cKO, n = 15; Student t-test p-value = 0.075. Time spent in center: Control, n = 15; cKO, n = 15; Student t-test p-value = 0.96).E. Short term memory was not different between control and Setd1b cKO mice as indicated by similar percent of alternations in the Y-maze test (Control, n = 15; cKO, n = 15; Student t-test p-value = 0.3).F. Depressive-like behavior was measured in the Porsolt forced swim test. There was no significant difference in the % time spent immobile between groups (Control, n = 8; cKO, n = 8; Student t-test p-value = 0.5).G. Escape latency during water maze training indicated severe learning impairment in Setd1b cKO mice (Control: n = 15, cKO: n = 15. Repeated measures ANOVA, genotype effect: F (1,28) = 82.34, **** p-value < 0.0001).H. Plots showing the specific search strategies during water maze training. Note the failure of Setd1b cKO mice to adopt hippocampus-dependent search strategies. I. The cognitive score calculated on the basis of the hippocampal search strategies reflects severe memory impairment in Setd1b cKO mice (Student t-test: *** p-value < 0.001)."}
{"words": ["Figure", "6F", ".", "Left", "panel", "shows", "representative", "images", "of", "RNAscope", "performed", "for", "Kmt2a", ",", "Kmt2b", "and", "Setd1b", ".", "Right", "panel", "shows", "a", "bar", "chart", "quantifying", "the", "dots", "/", "cell", "(", "n", "=", "1500", "cells", "from", "2", "mice", ")", "indicative", "of", "the", "corresponding", "expression", "level", ".", "Kmt2a", "expression", "was", "significantly", "higher", "when", "compared", "to", "Kmt2b", "or", "Setd1b", "(", "*", "*", "*", "p", "-", "value", "<", "0", ",", "0001", ",", "Student", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6F. Left panel shows representative images of RNAscope performed for Kmt2a, Kmt2b and Setd1b. Right panel shows a bar chart quantifying the dots/cell (n = 1500 cells from 2 mice) indicative of the corresponding expression level. Kmt2a expression was significantly higher when compared to Kmt2b or Setd1b (*** p-value < 0,0001, Student t-test)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "The", "transcript", "level", "of", "solo", "LTR", "in", "the", "wild", "type", "and", "the", "epcr1", "mutant", ".", "Error", "bars", "are", "standard", "deviations", "of", "three", "technical", "replicates", ".", "The", "experiment", "was", "independently", "performed", "three", "times", "and", "similar", "results", "were", "obtained", ".", "(", "B", ")", "The", "developmental", "phenotype", "of", "the", "epcr1", "and", "epcr2", "single", "mutants", "and", "the", "epcr1", "/", "2", "double", "mutant", "relative", "to", "the", "wild", "type", ".", "Two", "-", "week", "-", "old", "seedlings", "grown", "on", "vertical", "MS", "medium", "plates", "are", "shown", ".", "(", "C", ")", "The", "transcript", "levels", "of", "solo", "LTR", ",", "SDC", ",", "AtSN1", ",", "AtGP1", "and", "AtCOPIA28", "in", "the", "wild", "type", ",", "epcr1", "and", "epcr2", "single", "mutants", ",", "epcr1", "/", "2", "double", "mutant", ",", "and", "two", "individual", "EPCR1", "transgenic", "lines", "in", "the", "epcr1", "/", "2", "double", "mutant", "background", ".", "Error", "bars", "are", "standard", "deviations", "of", "three", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) The transcript level of solo LTR in the wild type and the epcr1 mutant. Error bars are standard deviations of three technical replicates. The experiment was independently performed three times and similar results were obtained.(B) The developmental phenotype of the epcr1 and epcr2 single mutants and the epcr1/2 double mutant relative to the wild type. Two-week-old seedlings grown on vertical MS medium plates are shown.(C) The transcript levels of solo LTR, SDC, AtSN1, AtGP1 and AtCOPIA28 in the wild type, epcr1 and epcr2 single mutants, epcr1/2 double mutant, and two individual EPCR1 transgenic lines in the epcr1/2 double mutant background. Error bars are standard deviations of three biological replicates."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "The", "interaction", "between", "EPCR1", "and", "ARID2", "or", "ARID3", ".", "Arabidopsis", "plants", "carrying", "EPCR1", "-", "Flag", "and", "ARID2", "-", "Myc", "or", "ARID3", "-", "Myc", "transgenes", "were", "used", "for", "co", "-", "IP", ".", "(", "B", ")", "The", "interaction", "between", "TRB1", "and", "ARID2", ".", "Arabidopsis", "plants", "carrying", "TRB1", "-", "Flag", "and", "/", "or", "ARID2", "-", "Myc", "transgenes", "were", "used", "for", "co", "-", "IP", ".", "(", "C", ")", "The", "interaction", "between", "TRB1", "and", "EPCR1", ".", "Arabidopsis", "plants", "carrying", "TRB1", "-", "Flag", "and", "/", "or", "EPCR1", "-", "Myc", "transgenes", "were", "used", "for", "co", "-", "IP", ".", "(", "E", ")", "The", "interaction", "between", "TRB1", "and", "PWWP2", "or", "ARID2", "was", "detected", "by", "an", "GST", "pull", "-", "down", "assay", ".", "(", "F", ")", "The", "interaction", "between", "EPCR1", ",", "PWWP2", ",", "ARID2", ",", "and", "TRB1", "was", "detected", "by", "an", "HIS", "pull", "-", "down", "assay", ".", "The", "full", "-", "length", "PWWP2", ",", "ARID2", ",", "and", "TRB1", ",", "and", "the", "EPCR1", "-", "N", "terminal", "(", "1", "-", "500", "aa", ")", "were", "used", "for", "the", "interaction", "assay", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) The interaction between EPCR1 and ARID2 or ARID3. Arabidopsis plants carrying EPCR1-Flag and ARID2-Myc or ARID3-Myc transgenes were used for co-IP.(B) The interaction between TRB1 and ARID2. Arabidopsis plants carrying TRB1-Flag and/or ARID2-Myc transgenes were used for co-IP.(C) The interaction between TRB1 and EPCR1. Arabidopsis plants carrying TRB1-Flag and/or EPCR1-Myc transgenes were used for co-IP.(E) The interaction between TRB1 and PWWP2 or ARID2 was detected by an GST pull-down assay.(F) The interaction between EPCR1, PWWP2, ARID2, and TRB1 was detected by an HIS pull-down assay. The full-length PWWP2, ARID2, and TRB1, and the EPCR1-N terminal (1-500 aa) were used for the interaction assay."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "The", "developmental", "phenotype", "of", "the", "arid2", "/", "3", "/", "4", "mutant", "as", "compared", "to", "the", "wild", "type", ".", "Two", "-", "week", "-", "old", "seedlings", "grown", "on", "MS", "medium", "are", "shown", ".", "(", "B", ")", "The", "developmental", "phenotype", "of", "the", "pwwp1", "/", "2", "/", "3", "+", "/", "-", "mutant", "as", "compared", "to", "the", "wild", "type", ".", "One", "-", "month", "-", "old", "plants", "grown", "in", "soil", "are", "shown", ".", "The", "effect", "of", "the", "arid2", ",", "arid3", ",", "and", "arid4", "mutations", "on", "the", "silencing", "of", "solo", "LTR", ",", "SDC", ",", "and", "FWA", "as", "determined", "by", "qPCR", ".", "Showing", "are", "results", "of", "three", "biological", "replicates", "with", "standard", "deviations", ".", "The", "effect", "of", "the", "pwwp1", ",", "pwwp2", ",", "and", "pwwp3", "mutations", "on", "the", "silencing", "of", "solo", "LTR", ",", "SDC", ",", "and", "FWA", "as", "determined", "by", "qPCR", ".", "Showing", "are", "results", "of", "three", "biological", "replicates", "with", "standard", "deviations", ".", "(", "E", ")", "The", "effect", "of", "the", "trb1", "mutation", "and", "the", "TRB2", "knockdown", "(", "TRB2", "-", "KD", ")", "on", "the", "silencing", "of", "solo", "LTR", ",", "as", "determined", "by", "qPCR", "(", "right", "panel", ")", ".", "The", "transcript", "level", "of", "TRB2", "was", "evaluated", "to", "confirm", "the", "TRB2", "knockdown", "(", "left", "panel", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviations", "of", "three", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) The developmental phenotype of the arid2/3/4 mutant as compared to the wild type. Two-week-old seedlings grown on MS medium are shown.(B) The developmental phenotype of the pwwp1/2/3+/- mutant as compared to the wild type. One-month-old plants grown in soil are shown.The effect of the arid2, arid3, and arid4 mutations on the silencing of solo LTR, SDC, and FWA as determined by qPCR. Showing are results of three biological replicates with standard deviations.The effect of the pwwp1, pwwp2, and pwwp3 mutations on the silencing of solo LTR, SDC, and FWA as determined by qPCR. Showing are results of three biological replicates with standard deviations.(E) The effect of the trb1 mutation and the TRB2 knockdown (TRB2-KD) on the silencing of solo LTR, as determined by qPCR (right panel). The transcript level of TRB2 was evaluated to confirm the TRB2 knockdown (left panel). Error bars represent standard deviations of three biological replicates."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "B", ")", "Heat", "maps", "showing", "differentially", "transcribed", "genes", "and", "TEs", "in", "the", "arid2", "/", "3", "/", "4", "and", "epcr1", "/", "2", "mutants", "relative", "to", "the", "wild", "type", ".", "(", "D", ")", "Genome", "browser", "snapshots", "showing", "the", "transcript", "patterns", "of", "ROS1", "and", "IBM1", "in", "arid2", "/", "3", "/", "4", "and", "epcr1", "/", "2", "relative", "to", "the", "wild", "type", ".", "(", "E", ")", "Effects", "of", "arid2", "/", "3", "/", "4", "epcr1", "/", "2", "on", "the", "transcript", "levels", "of", "ROS1", "and", "IBM1", "-", "L", "as", "determined", "by", "qPCR", ".", "The", "expression", "of", "ROS1", "and", "the", "longer", "version", "of", "IBM1", "(", "IBM1", "-", "L", ")", "was", "evaluated", "by", "qPCR", ".", "ACT7", "was", "amplified", "as", "an", "internal", "control", ".", "Bars", "represent", "SD", "from", "two", "independent", "experiments", ",", "each", "with", "three", "technical", "replications", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(B) Heat maps showing differentially transcribed genes and TEs in the arid2/3/4 and epcr1/2 mutants relative to the wild type.(D) Genome browser snapshots showing the transcript patterns of ROS1 and IBM1 in arid2/3/4 and epcr1/2 relative to the wild type.(E) Effects of arid2/3/4 epcr1/2 on the transcript levels of ROS1 and IBM1-L as determined by qPCR. The expression of ROS1 and the longer version of IBM1 (IBM1-L) was evaluated by qPCR. ACT7 was amplified as an internal control. Bars represent SD from two independent experiments, each with three technical replications."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "The", "interaction", "of", "EPCR1", "with", "HAM1", "and", "HAM2", ".", "EPCR1", "-", "Flag", "transgenic", "plants", "were", "crossed", "to", "HAM1", "-", "Myc", "and", "HAM2", "-", "Myc", "transgenic", "plants", ".", "The", "progeny", "were", "used", "to", "evaluate", "the", "interaction", "between", "EPCR1", "with", "HAM1", "and", "HAM2", "by", "co", "-", "IP", ".", "(", "B", ")", "The", "interaction", "of", "ARID2", ",", "ARID3", ",", "and", "ARID4", "with", "HAM1", "and", "HAM2", ".", "ARID2", "-", "Myc", ",", "ARID3", "-", "Myc", ",", "and", "ARID4", "-", "Myc", "transgenic", "plants", "were", "crossed", "to", "HAM1", "-", "Flag", "and", "HAM2", "-", "Flag", "transgenic", "plants", "and", "their", "progeny", "were", "used", "for", "co", "-", "IP", ".", "(", "C", ")", "The", "interaction", "of", "TRB1", "with", "HAM1", "and", "HAM2", ".", "TRB1", "-", "Flag", "transgenic", "plants", "were", "crossed", "to", "HAM1", "-", "Myc", "and", "HAM2", "-", "Myc", "transgenic", "plants", "and", "their", "progeny", "were", "used", "for", "co", "-", "IP", ".", "(", "D", ")", "The", "interaction", "of", "HDA9", "with", "ARID2", ",", "ARID3", ",", "and", "ARID4", ".", "ARID2", "-", "Myc", ",", "ARID3", "-", "Myc", ",", "and", "ARID4", "-", "Myc", "transgenic", "plants", "were", "crossed", "to", "HDA9", "-", "Flag", "transgenic", "plants", "and", "their", "progeny", "were", "used", "for", "co", "-", "IP", ".", "(", "E", ")", "The", "interaction", "of", "HDA6", "with", "EPCR1", "and", "ARID2", ".", "EPCR1", "-", "Flag", "and", "ARID2", "-", "Flag", "transgenic", "plants", "were", "crossed", "to", "HDA6", "-", "Myc", "transgenic", "plants", "and", "their", "progeny", "were", "used", "for", "co", "-", "IP", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) The interaction of EPCR1 with HAM1 and HAM2. EPCR1-Flag transgenic plants were crossed to HAM1-Myc and HAM2-Myc transgenic plants. The progeny were used to evaluate the interaction between EPCR1 with HAM1 and HAM2 by co-IP.(B) The interaction of ARID2, ARID3, and ARID4 with HAM1 and HAM2. ARID2-Myc, ARID3-Myc, and ARID4-Myc transgenic plants were crossed to HAM1-Flag and HAM2-Flag transgenic plants and their progeny were used for co-IP.(C) The interaction of TRB1 with HAM1 and HAM2. TRB1-Flag transgenic plants were crossed to HAM1-Myc and HAM2-Myc transgenic plants and their progeny were used for co-IP.(D) The interaction of HDA9 with ARID2, ARID3, and ARID4. ARID2-Myc, ARID3-Myc, and ARID4-Myc transgenic plants were crossed to HDA9-Flag transgenic plants and their progeny were used for co-IP.(E) The interaction of HDA6 with EPCR1 and ARID2. EPCR1-Flag and ARID2-Flag transgenic plants were crossed to HDA6-Myc transgenic plants and their progeny were used for co-IP."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Overlap", "among", "H4K5", "hyperacetylated", "regions", "in", "the", "arid2", "/", "3", "/", "4", "and", "epcr1", "/", "2", "mutants", "relative", "to", "the", "wild", "type", ".", "The", "overlap", "is", "significant", "(", "P", "=", "4", ".", "410", "-", "78", ")", "as", "determined", "by", "hypergeometric", "test", ".", "(", "B", ")", "Metaplot", "of", "histone", "H4K5", "acetylation", "levels", "of", "TEs", "in", "wild", "type", ",", "arid2", "/", "3", "/", "4", ",", "and", "epcr1", "/", "2", "plants", ".", "Histone", "H4K5", "acetylation", "levels", "are", "represented", "by", "normalized", "reads", "that", "obtained", "in", "the", "H4K5Ac", "ChIP", "-", "seq", "analysis", ".", "TSS", "represents", "transcription", "start", "site", "and", "TTS", "represents", "transcription", "termination", "site", ".", "(", "C", ")", "Boxplot", "of", "histone", "H4K5", "acetylation", "levels", "of", "TEs", "in", "wild", "type", ",", "arid2", "/", "3", "/", "4", ",", "and", "epcr1", "/", "2", "plants", ".", "Asterisks", "indicate", "that", "H4K5Ac", "levels", "is", "significantly", "higher", "in", "the", "arid2", "/", "3", "/", "4", "(", "P", "=", "2", ".", "4210", "-", "13", ")", "and", "epcr1", "/", "2", "(", "P", "=", "1", ".", "5210", "-", "8", ")", "mutants", "than", "in", "the", "wild", "type", "as", "determined", "by", "Welch", "'", "s", "Two", "-", "Sample", "t", "-", "test", ".", "Horizontal", "lines", "represent", "the", "median", ",", "and", "the", "bottom", "and", "top", "of", "the", "box", "represent", "the", "25th", "and", "75th", "percentile", ".", "The", "whiskers", "represent", "data", "range", "within", "1", ".", "5", "×", "of", "the", "interquantile", "range", ".", "(", "D", ")", "The", "nuclei", "with", "condensed", ",", "intermediate", ",", "or", "decondensed", "heterochromatin", "status", ",", "as", "marked", "by", "DAPI", "staining", "and", "H3K27me", "signals", ".", "(", "E", ")", "Percentages", "of", "nuclei", "with", "condensed", ",", "intermediate", ",", "or", "decondensed", "heterochromatin", "signals", "in", "the", "wild", "type", "and", "the", "arid2", "/", "3", "/", "4", "mutant", ".", "n", "=", "113", ".", "(", "F", ")", "Abundance", "of", "Pol", "IV", "-", "dependent", "siRNAs", "in", "the", "epcr1", "/", "2", ",", "arid2", "/", "3", "/", "4", ",", "nrpd1", ",", "nrpe1", ",", "and", "hda6", "mutants", "relative", "to", "the", "wild", "type", "[", "(", "Mut", "-", "WT", ")", "/", "(", "Mut", "+", "WT", ")", "]", "from", "chromosome", "3", "of", "Arabidopsis", ".", "(", "H", ")", "Boxplot", "showing", "levels", "of", "Pol", "IV", "-", "dependent", "siRNAs", "that", "are", "up", "-", "regulated", "in", "the", "hda6", "mutant", ".", "Asterisks", "indicate", "that", "siRNA", "levels", "in", "the", "mutants", "are", "significantly", "(", "P", "→", "0", ")", "up", "-", "regulated", "compared", "to", "the", "wild", "type", "as", "determined", "by", "paired", "student", "t", "-", "test", ".", "Horizontal", "lines", "represent", "the", "median", ",", "and", "the", "bottom", "and", "top", "of", "the", "box", "represent", "the", "25th", "and", "75th", "percentile", ".", "The", "whiskers", "represent", "data", "range", "within", "1", ".", "5", "×", "of", "the", "interquantile", "range", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Overlap among H4K5 hyperacetylated regions in the arid2/3/4 and epcr1/2 mutants relative to the wild type. The overlap is significant (P=4.410-78) as determined by hypergeometric test. (B) Metaplot of histone H4K5 acetylation levels of TEs in wild type, arid2/3/4, and epcr1/2 plants. Histone H4K5 acetylation levels are represented by normalized reads that obtained in the H4K5Ac ChIP-seq analysis. TSS represents transcription start site and TTS represents transcription termination site. (C) Boxplot of histone H4K5 acetylation levels of TEs in wild type, arid2/3/4, and epcr1/2 plants. Asterisks indicate that H4K5Ac levels is significantly higher in the arid2/3/4 (P=2.4210-13) and epcr1/2 (P=1.5210-8) mutants than in the wild type as determined by Welch's Two-Sample t-test. Horizontal lines represent the median, and the bottom and top of the box represent the 25th and 75th percentile. The whiskers represent data range within 1.5× of the interquantile range.(D) The nuclei with condensed, intermediate, or decondensed heterochromatin status, as marked by DAPI staining and H3K27me signals. (E) Percentages of nuclei with condensed, intermediate, or decondensed heterochromatin signals in the wild type and the arid2/3/4 mutant. n=113.(F) Abundance of Pol IV-dependent siRNAs in the epcr1/2, arid2/3/4, nrpd1, nrpe1, and hda6 mutants relative to the wild type [(Mut-WT)/(Mut+WT)] from chromosome 3 of Arabidopsis.(H) Boxplot showing levels of Pol IV-dependent siRNAs that are up-regulated in the hda6 mutant. Asterisks indicate that siRNA levels in the mutants are significantly (P→0) up-regulated compared to the wild type as determined by paired student t-test. Horizontal lines represent the median, and the bottom and top of the box represent the 25th and 75th percentile. The whiskers represent data range within 1.5× of the interquantile range."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Metaplot", "of", "CG", ",", "CHG", ",", "and", "CHH", "methylation", "of", "genes", "and", "TEs", "in", "the", "genomes", "of", "wild", "type", ",", "epcr1", "/", "2", ",", "and", "arid2", "/", "3", "/", "4", "plants", ".", "H", "indicates", "C", ",", "A", ",", "or", "T", ".", "(", "B", ")", "Metaplot", "of", "CG", ",", "CHG", ",", "and", "CHH", "methylation", "on", "chromosome", "3", "of", "Arabidopsis", "in", "wild", "type", ",", "epcr1", "/", "2", ",", "and", "arid2", "/", "3", "/", "4", "plants", ".", "(", "D", ")", "Boxplot", "of", "DNA", "methylation", "in", "the", "wild", "type", ",", "nrpe1", ",", "epcr1", "/", "2", ",", "and", "arid2", "/", "3", "/", "4", "mutants", ".", "The", "hypo", "-", "DMRs", "identified", "in", "the", "nrpe1", "mutant", "was", "defined", "as", "RdDM", "target", "loci", ".", "Asterisks", "indicate", "that", "DNA", "methylation", "is", "significantly", "(", "P", "<", "0", ".", "001", ")", "decreased", "in", "the", "mutants", "as", "determined", "by", "paired", "student", "t", "-", "test", ".", "Horizontal", "lines", "represent", "the", "median", ",", "and", "the", "bottom", "and", "top", "of", "the", "box", "represent", "the", "25th", "and", "75th", "percentile", ".", "The", "whiskers", "represent", "data", "range", "within", "1", ".", "5", "×", "of", "the", "interquantile", "range", ".", "(", "E", ")", "Heat", "maps", "of", "CG", ",", "CHG", ",", "and", "CHH", "methylation", "at", "RdDM", "target", "loci", ".", "The", "hypo", "-", "DMRs", "identified", "in", "the", "nrpe1", "mutant", "were", "defined", "as", "RdDM", "target", "loci", "and", "analyzed", "in", "the", "wild", "type", ",", "nrpe1", ",", "eprc1", "/", "2", ",", "and", "arid2", "/", "3", "/", "4", "mutants", ".", "Black", "and", "light", "yellow", "indicate", "low", "methylation", "and", "high", "methylation", ",", "respectively", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Metaplot of CG, CHG, and CHH methylation of genes and TEs in the genomes of wild type, epcr1/2, and arid2/3/4 plants. H indicates C, A, or T.(B) Metaplot of CG, CHG, and CHH methylation on chromosome 3 of Arabidopsis in wild type, epcr1/2, and arid2/3/4 plants.(D) Boxplot of DNA methylation in the wild type, nrpe1, epcr1/2, and arid2/3/4 mutants. The hypo-DMRs identified in the nrpe1 mutant was defined as RdDM target loci. Asterisks indicate that DNA methylation is significantly (P<0.001) decreased in the mutants as determined by paired student t-test. Horizontal lines represent the median, and the bottom and top of the box represent the 25th and 75th percentile. The whiskers represent data range within 1.5× of the interquantile range.(E) Heat maps of CG, CHG, and CHH methylation at RdDM target loci. The hypo-DMRs identified in the nrpe1 mutant were defined as RdDM target loci and analyzed in the wild type, nrpe1, eprc1/2, and arid2/3/4 mutants. Black and light yellow indicate low methylation and high methylation, respectively."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "A", ")", "Scatter", "plots", "showing", "the", "effect", "of", "the", "epcr1", "/", "2", "and", "arid2", "/", "3", "/", "4", "mutations", "on", "CG", ",", "CHG", ",", "and", "CHH", "methylation", "at", "the", "co", "-", "upregulated", "TEs", "and", "genes", "in", "the", "epcr1", "/", "2", "and", "arid2", "/", "3", "/", "4", "mutants", ".", "TE", "methylation", "and", "gene", "DNA", "methylation", "refer", ",", "respectively", ",", "to", "methylation", "of", "the", "TE", "body", "and", "methylation", "of", "the", "1", "-", "kb", "-", "gene", "-", "promoter", "region", ".", "(", "B", ")", "Box", "plots", "of", "CG", ",", "CHG", ",", "and", "CHH", "methylation", "in", "the", "wild", "type", ",", "arid2", "/", "3", "/", "4", ",", "and", "epcr1", "/", "2", "mutants", "at", "the", "co", "-", "upregulated", "TEs", "and", "genes", "in", "the", "arid2", "/", "3", "/", "4", "and", "epcr1", "/", "2", "mutants", ".", "Asterisks", "indicate", "statistical", "significance", "as", "determined", "by", "paired", "student", "t", "test", ".", "CHG", "methylation", "of", "co", "-", "upregulated", "TEs", "is", "significantly", "increased", "in", "arid2", "/", "3", "/", "4", "(", "P", "=", "1", ".", "2610", "-", "4", ")", "and", "epcr1", "/", "2", "(", "P", "=", "6", ".", "310", "-", "9", ")", ";", "CHH", "methylation", "of", "co", "-", "upregulated", "genes", "is", "significantly", "decreased", "in", "arid2", "/", "3", "/", "4", "(", "P", "=", "3", ".", "510", "-", "6", ")", "and", "epcr1", "/", "2", "(", "P", "=", "6", ".", "410", "-", "7", ")", ".", "Horizontal", "lines", "represent", "the", "median", ",", "the", "bottom", "and", "top", "of", "the", "box", "represent", "the", "25th", "and", "75th", "percentile", ".", "The", "whiskers", "represent", "data", "range", "within", "1", ".", "5", "×", "of", "the", "interquantile", "range", ".", "(", "C", ")", "Overexpression", "of", "DRD1", "fails", "to", "restore", "the", "silencing", "of", "EPCR1", "/", "2", "target", "loci", "in", "the", "epcr1", "/", "2", "mutant", "background", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(A) Scatter plots showing the effect of the epcr1/2 and arid2/3/4 mutations on CG, CHG, and CHH methylation at the co-upregulated TEs and genes in the epcr1/2 and arid2/3/4 mutants. TE methylation and gene DNA methylation refer, respectively, to methylation of the TE body and methylation of the 1-kb-gene-promoter region.(B) Box plots of CG, CHG, and CHH methylation in the wild type, arid2/3/4, and epcr1/2 mutants at the co-upregulated TEs and genes in the arid2/3/4 and epcr1/2 mutants. Asterisks indicate statistical significance as determined by paired student t test. CHG methylation of co-upregulated TEs is significantly increased in arid2/3/4 (P=1.2610-4) and epcr1/2 (P=6.310-9); CHH methylation of co-upregulated genes is significantly decreased in arid2/3/4 (P=3.510-6) and epcr1/2 (P=6.410-7). Horizontal lines represent the median, the bottom and top of the box represent the 25th and 75th percentile. The whiskers represent data range within 1.5× of the interquantile range.(C) Overexpression of DRD1 fails to restore the silencing of EPCR1/2 target loci in the epcr1/2 mutant background."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "C", ")", "STIM1", "and", "STIM2", "mRNA", "expression", "in", "PBMC", "of", "P1", ",", "P2", ",", "mother", "and", "a", "healthy", "donor", "(", "HD", ")", "that", "were", "left", "unstimulated", "or", "stimulated", "with", "anti", "-", "CD3", "/", "CD28", "for", "24", "hours", ".", "mRNA", "levels", "of", "STIM1", "/", "2", "normalized", "to", "18S", ".", "Graph", "shows", "the", "mean", "±", "SEM", "of", "duplicates", "from", "one", "experiment", ".", "(", "D", ")", "STIM1", "protein", "expression", "in", "CD4", "+", "and", "CD8", "+", "T", "cells", "from", "P1", ",", "P2", ",", "the", "mother", "and", "a", "HD", "analyzed", "by", "flow", "cytometry", ".", "Shaded", "histograms", ":", "polyclonal", "rabbit", "IgG", "control", "antibody", ";", "open", "histograms", ":", "polyclonal", "anti", "-", "STIM1", "antibody", ".", "Bar", "graphs", "show", "the", "delta", "MFI", "calculated", "as", "MFISTIM1", "-", "MFIIgG", "control", "that", "was", "normalized", "to", "HD", "T", "cells", ".", "Bar", "graphs", "are", "mean", "±", "SEM", "of", "2", "independent", "repeat", "experiments", ".", "(", "E", ")", "STIM1", "protein", "expression", "in", "expanded", "human", "T", "cells", "analyzed", "by", "immunoblotting", ".", "One", "representative", "Western", "blot", "of", "3", "is", "shown", ".", "Bar", "graphs", "are", "the", "mean", "±", "SEM", "of", "STIM1", "expression", "normalized", "to", "actin", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "(", "F", ")", "Ca2", "+", "influx", "in", "Fura", "-", "2", "loaded", "PBMC", "of", "P1", ",", "P2", ",", "the", "mother", "and", "a", "HD", ".", "T", "cells", "were", "stimulated", "with", "1", "μM", "thapsigargin", "(", "TG", ")", "in", "the", "absence", "of", "extracellular", "Ca2", "+", "followed", "by", "addition", "of", "1", "mM", "extracellular", "Ca2", "+", ".", "Bar", "graphs", "show", "the", "integrated", "Ca2", "+", "influx", "response", "(", "AUC", ",", "area", "under", "the", "curve", ")", "from", "400", "-", "800", "sec", "and", "the", "peak", "Ca2", "+", "influx", "normalized", "to", "baseline", "Ca2", "+", "levels", "(", "F340", "/", "380", ")", "at", "400", "sec", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "from", "2", "experiments", ".", "Statistical", "analysis", "by", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(C) STIM1 and STIM2 mRNA expression in PBMC of P1, P2, mother and a healthy donor (HD) that were left unstimulated or stimulated with anti-CD3/CD28 for 24 hours. mRNA levels of STIM1/2 normalized to 18S. Graph shows the mean ± SEM of duplicates from one experiment.(D) STIM1 protein expression in CD4+ and CD8+ T cells from P1, P2, the mother and a HD analyzed by flow cytometry. Shaded histograms: polyclonal rabbit IgG control antibody; open histograms: polyclonal anti-STIM1 antibody. Bar graphs show the delta MFI calculated as MFISTIM1 - MFIIgG control that was normalized to HD T cells. Bar graphs are mean ± SEM of 2 independent repeat experiments.(E) STIM1 protein expression in expanded human T cells analyzed by immunoblotting. One representative Western blot of 3 is shown. Bar graphs are the mean ± SEM of STIM1 expression normalized to actin from 3 independent experiments.(F) Ca2+ influx in Fura-2 loaded PBMC of P1, P2, the mother and a HD. T cells were stimulated with 1 μM thapsigargin (TG) in the absence of extracellular Ca2+ followed by addition of 1 mM extracellular Ca2+. Bar graphs show the integrated Ca2+ influx response (AUC, area under the curve) from 400-800 sec and the peak Ca2+ influx normalized to baseline Ca2+ levels (F340/380) at 400 sec. Data represent the mean ± SEM from 2 experiments. Statistical analysis by unpaired Student's t-test. **p<0.01, ***p<0.001."}
{"words": ["Figure", "2GFP", "-", "ORAI1", "expressing", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "mCherry", "-", "STIM1", "(", "WT", "or", "L374P", ")", "and", "left", "unstimulated", "or", "stimulated", "with", "1", "μM", "TG", "in", "Ca2", "+", "-", "free", "Ringer", "'", "s", "solution", ".", "(", "D", ",", "E", ")", "Representative", "TIRF", "microscopy", "images", "from", "one", "of", "two", "repeat", "experiments", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "GFP", "-", "ORAI1", "expressing", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "mCherry", "-", "STIM1", "(", "WT", "or", "L374P", ")", "and", "left", "unstimulated", "or", "stimulated", "with", "1", "μM", "TG", "in", "Ca2", "+", "-", "free", "Ringer", "'", "s", "solution", ".", "(", "F", ")", "Percentages", "of", "WT", "or", "mutant", "mCherry", "-", "STIM1", "present", "at", "the", "plasma", "membrane", "(", "i", ".", "e", ".", "visible", "in", "the", "TIRFM", "evanescent", "field", ")", "before", "TG", "stimulation", ".", "Data", "are", "the", "mean", "±", "SEM", "calculated", "from", "550", "(", "WT", ")", "and", "830", "(", "L374P", ")", "cells", "from", "two", "independent", "experiments", ".", "(", "G", ")", "Change", "of", "mCherry", "-", "STIM1", "(", "WT", "or", "L374P", "mutant", ")", "fluorescence", "[", "F", "(", "t", ")", "/", "F", "(", "0", ")", "]", "in", "the", "TIRFM", "evanescence", "field", ".", "Fluorescence", "normalized", "to", "values", "at", "the", "time", "of", "TG", "addition", "in", "Ca2", "+", "-", "free", "Ringer", "'", "s", "buffer", "at", "0", "sec", ".", "Traces", "show", "mean", "±", "SEM", "of", "40", "-", "50", "cells", "from", "two", "independent", "experiments", ".", "(", "H", ")", "Colocalization", "of", "mCherry", "-", "STIM1", "(", "WT", "or", "L374P", "mutant", ")", "and", "GFP", "-", "ORAI1", "from", "the", "time", "of", "TG", "addition", "at", "0", "sec", ".", "Colocalization", "measured", "using", "the", "Pearson", "'", "s", "coefficient", "for", "GFP", "and", "mCherry", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2GFP-ORAI1 expressing HEK293 cells were transfected with mCherry-STIM1 (WT or L374P) and left unstimulated or stimulated with 1 μM TG in Ca2+-free Ringer's solution. (D,E) Representative TIRF microscopy images from one of two repeat experiments. Scale bars, 10 μm.GFP-ORAI1 expressing HEK293 cells were transfected with mCherry-STIM1 (WT or L374P) and left unstimulated or stimulated with 1 μM TG in Ca2+-free Ringer's solution. (F) Percentages of WT or mutant mCherry-STIM1 present at the plasma membrane (i.e. visible in the TIRFM evanescent field) before TG stimulation. Data are the mean ± SEM calculated from 550 (WT) and 830 (L374P) cells from two independent experiments. (G) Change of mCherry-STIM1 (WT or L374P mutant) fluorescence [F(t)/F(0)] in the TIRFM evanescence field. Fluorescence normalized to values at the time of TG addition in Ca2+-free Ringer's buffer at 0 sec. Traces show mean ± SEM of 40-50 cells from two independent experiments. (H) Colocalization of mCherry-STIM1 (WT or L374P mutant) and GFP-ORAI1 from the time of TG addition at 0 sec. Colocalization measured using the Pearson's coefficient for GFP and mCherry."}
{"words": ["Figure", "3Cell", "size", "(", "A", ")", "of", "CD4", "+", "T", "cells", "from", "P1", "(", "red", ")", ",", "P2", "(", "blue", ")", ",", "the", "mother", "(", "grey", ")", "and", "HD", "(", "black", ")", "stimulated", "with", "anti", "-", "CD3", "(", "5", "μg", "/", "ml", ")", "and", "anti", "-", "CD28", "(", "10", "μg", "/", "ml", ")", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "1", "μM", "FK506", "for", "24", "hours", ".", "(", "A", ")", "Representative", "histograms", "of", "FSC", "(", "left", "panel", ")", "and", "percentages", "of", "T", "cell", "blasts", "(", "defined", "as", "cells", "to", "the", "right", "of", "the", "dotted", "vertical", "line", ")", "analyzed", "by", "flow", "cytometry", "(", "right", "panel", ")", ".", "proliferation", "(", "B", ")", "of", "CD4", "+", "T", "cells", "from", "P1", "(", "red", ")", ",", "P2", "(", "blue", ")", ",", "the", "mother", "(", "grey", ")", "and", "HD", "(", "black", ")", "stimulated", "with", "anti", "-", "CD3", "(", "5", "μg", "/", "ml", ")", "and", "anti", "-", "CD28", "(", "10", "μg", "/", "ml", ")", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "1", "μM", "FK506", "for", "24", "hours", ".", "(", "B", ")", "Representative", "histograms", "of", "CFSE", "dilution", "(", "left", "panel", ")", "and", "percentages", "of", "proliferating", "cells", "(", "defined", "as", "cells", "to", "the", "left", "of", "the", "dotted", "vertical", "line", ")", "(", "right", "panel", ")", ".", "Bar", "graphs", "in", "A", "and", "B", "are", "the", "mean", "±", "SEM", "from", "two", "independent", "experiments", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "Cytokine", "production", "by", "PBMC", "from", "P1", ",", "P2", ",", "the", "mother", "and", "an", "unrelated", "HD", "after", "stimulation", "with", "PMA", "(", "40", "ng", "/", "ml", ")", "and", "ionomycin", "(", "500", "ng", "/", "ml", ")", "for", "4", "hours", ".", "Cytokines", "were", "analyzed", "by", "flow", "cytometry", "following", "surface", "staining", "with", "antibodies", "against", "CD3", ",", "CD4", "and", "CD45RO", ",", "permeabilization", "and", "intracellular", "cytokine", "staining", "for", "GM", "-", "CSF", ",", "IL", "-", "22", "and", "IL", "-", "17A", ".", "Representative", "flow", "cytometry", "plots", "(", "C", ")", "and", "quantification", "of", "Th17", "(", "GM", "-", "CSF", ",", "IL", "-", "22", ",", "IL", "-", "17A", ")", ",", "Th1", "(", "TNF", "-", "α", ",", "IFN", "-", "γ", ")", "and", "Th2", "(", "IL", "-", "4", ")", "cytokines", "(", "D", ")", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "from", "two", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Cell size (A) of CD4+ T cells from P1 (red), P2 (blue), the mother (grey) and HD (black) stimulated with anti-CD3 (5 μg/ml) and anti-CD28 (10 μg/ml) in the presence or absence of 1 μM FK506 for 24 hours. (A) Representative histograms of FSC (left panel) and percentages of T cell blasts (defined as cells to the right of the dotted vertical line) analyzed by flow cytometry (right panel).proliferation (B) of CD4+ T cells from P1 (red), P2 (blue), the mother (grey) and HD (black) stimulated with anti-CD3 (5 μg/ml) and anti-CD28 (10 μg/ml) in the presence or absence of 1 μM FK506 for 24 hours. (B) Representative histograms of CFSE dilution (left panel) and percentages of proliferating cells (defined as cells to the left of the dotted vertical line) (right panel). Bar graphs in A and B are the mean ± SEM from two independent experiments.(C,D) Cytokine production by PBMC from P1, P2, the mother and an unrelated HD after stimulation with PMA (40 ng/ml) and ionomycin (500 ng/ml) for 4 hours. Cytokines were analyzed by flow cytometry following surface staining with antibodies against CD3, CD4 and CD45RO, permeabilization and intracellular cytokine staining for GM-CSF, IL-22 and IL-17A. Representative flow cytometry plots (C) and quantification of Th17 (GM-CSF, IL-22, IL-17A), Th1 (TNF-α, IFN-γ) and Th2 (IL-4) cytokines (D). Data represent the mean ± SEM from two independent experiments."}
{"words": ["Figure", "4A", ")", "Severe", "onychomycosis", "in", "P2", "(", "STIM1", "p", ".", "L374P", ")", ".", "B", ")", "PBMC", "of", "a", "healthy", "donor", "(", "HD1", ")", "cultured", "for", "6", "days", "in", "the", "presence", "of", "6", ".", "5", "mg", "/", "ml", "C", ".", "albicans", "protein", ".", "At", "day", "6", ",", "PBMC", "were", "restimulated", "with", "PMA", "and", "ionomycin", "in", "the", "presence", "of", "10", "μM", "GSK", "-", "7975A", "or", "DMSO", "for", "6", "h", "and", "CD4", "+", "and", "CD8", "+", "T", "cells", "were", "analyzed", "for", "cytokine", "production", "by", "flow", "cytometry", ".", "Bar", "graphs", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "from", "two", "independent", "experiments", ".", "Human", "T", "cells", "from", "two", "healthy", "donors", ",", "P1", "and", "his", "mother", "were", "expanded", "and", "cultured", "in", "the", "presence", "of", "C", ".", "albicans", "and", "IL", "-", "2", "for", "2", "-", "4", "weeks", ".", "(", "C", ")", "T", "cells", "were", "restimulated", "with", "PMA", "and", "ionomycin", "for", "6", "h", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "10", "μM", "GSK", "-", "7975A", "and", "analyzed", "for", "cytokine", "production", "by", "flow", "cytometry", ".", "Bar", "graphs", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "from", "two", "independent", "experiments", ".", "Human", "T", "cells", "from", "two", "healthy", "donors", ",", "P1", "and", "his", "mother", "were", "expanded", "and", "cultured", "in", "the", "presence", "of", "C", ".", "albicans", "and", "IL", "-", "2", "for", "2", "-", "4", "weeks", ".", "(", "D", ")", "Fura", "-", "2", "loaded", "T", "cells", "were", "stimulated", "with", "thapsigargin", "(", "TG", ")", "in", "Ca2", "+", "-", "free", "buffer", "followed", "by", "readdition", "of", "2", "mM", "Ca2", "+", "to", "induce", "SOCE", ".", "Bar", "graphs", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "from", "two", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A) Severe onychomycosis in P2 (STIM1 p.L374P).B) PBMC of a healthy donor (HD1) cultured for 6 days in the presence of 6.5 mg/ml C. albicans protein. At day 6, PBMC were restimulated with PMA and ionomycin in the presence of 10 μM GSK-7975A or DMSO for 6 h and CD4+ and CD8+ T cells were analyzed for cytokine production by flow cytometry. Bar graphs represent the mean ± SEM from two independent experiments.Human T cells from two healthy donors, P1 and his mother were expanded and cultured in the presence of C. albicans and IL-2 for 2-4 weeks. (C) T cells were restimulated with PMA and ionomycin for 6 h in the presence or absence of 10 μM GSK-7975A and analyzed for cytokine production by flow cytometry. Bar graphs represent the mean ± SEM from two independent experiments.Human T cells from two healthy donors, P1 and his mother were expanded and cultured in the presence of C. albicans and IL-2 for 2-4 weeks. (D) Fura-2 loaded T cells were stimulated with thapsigargin (TG) in Ca2+-free buffer followed by readdition of 2 mM Ca2+ to induce SOCE. Bar graphs represent the mean ± SEM from two independent experiments."}
{"words": ["Figure", "5Sublingual", "infection", "of", "WT", ",", "Stim1fl", "/", "flVav", "-", "iCre", "and", "Stim1fl", "/", "flStim2fl", "/", "flVav", "-", "iCre", "mice", "with", "2x107", "CFU", "of", "C", ".", "albicans", ".", "(", "A", ")", "Body", "weight", "(", "BW", ")", "measured", "for", "7", "days", "and", "normalized", "to", "BW", "at", "day", "0", "of", "infection", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SEM", "measured", "from", "4", "repeat", "experiments", "and", "13", "WT", ",", "7", "Stim1fl", "/", "flVav", "-", "iCre", ",", "8", "Stim1fl", "/", "flStim2fl", "/", "flVav", "-", "iCre", "mice", ".", "Sublingual", "infection", "of", "WT", ",", "Stim1fl", "/", "flVav", "-", "iCre", "and", "Stim1fl", "/", "flStim2fl", "/", "flVav", "-", "iCre", "mice", "with", "2x107", "CFU", "of", "C", ".", "albicans", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "CFU", "of", "C", ".", "albicans", "per", "gram", "tongue", "tissue", "of", "the", "indicated", "mice", "at", "day", "7", "p", ".", "i", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SEM", "from", "4", "repeat", "experiments", "and", "12", "WT", ",", "7", "Stim1fl", "/", "flVav", "-", "iCre", ",", "8", "Stim1fl", "/", "flStim2fl", "/", "flVav", "-", "iCre", "mice", ".", "Sublingual", "infection", "of", "WT", ",", "Stim1fl", "/", "flVav", "-", "iCre", "and", "Stim1fl", "/", "flStim2fl", "/", "flVav", "-", "iCre", "mice", "with", "2x107", "CFU", "of", "C", ".", "albicans", ".", "(", "C", ")", "Macroscopic", "images", "of", "the", "C", ".", "albicans", "-", "infected", "tongues", "of", "mice", "at", "day", "7", "p", ".", "i", ".", "Arrows", "and", "dashes", "lines", "indicate", "C", ".", "albicans", "infiltrated", "areas", ".", "Sublingual", "infection", "of", "WT", ",", "Stim1fl", "/", "flVav", "-", "iCre", "and", "Stim1fl", "/", "flStim2fl", "/", "flVav", "-", "iCre", "mice", "with", "2x107", "CFU", "of", "C", ".", "albicans", ".", "(", "D", ")", "Histological", "images", "of", "H", "&", "E", "(", "left", ")", "and", "PAS", "(", "right", ")", "stained", "tongue", "tissue", "at", "day", "7", "p", ".", "i", ".", "Clusters", "of", "polymorphonuclear", "(", "PMN", ")", "cells", "(", "neutrophils", ",", "white", "arrows", ")", "and", "Candida", "(", "black", "arrows", ")", "are", "indicated", ".", "Sublingual", "infection", "of", "WT", ",", "Stim1fl", "/", "flVav", "-", "iCre", "and", "Stim1fl", "/", "flStim2fl", "/", "flVav", "-", "iCre", "mice", "with", "2x107", "CFU", "of", "C", ".", "albicans", ".", "(", "E", ")", "Frequencies", "of", "Cd11b", "+", "Gr1", "+", "neutrophils", "in", "the", "tongues", "from", "the", "indicated", "mice", "at", "day", "7", "p", ".", "i", ".", "Bar", "graphs", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "from", "3", "experiments", "and", "9", "WT", ",", "7", "Stim1fl", "/", "flVav", "-", "iCre", ",", "8", "Stim1fl", "/", "flStim2fl", "/", "flVav", "-", "iCre", "mice", ".", "(", "F", ",", "G", ")", "Cytokine", "production", "by", "CD4", "+", "T", "cells", "isolated", "from", "submandibular", "lymph", "nodes", "of", "WT", ",", "Stim1fl", "/", "flVav", "-", "iCre", ",", "Stim1fl", "/", "flStim2fl", "/", "flVav", "-", "iCre", "and", "Stim1fl", "/", "flCd4Cre", "mice", "7", "days", "after", "sublingual", "infection", "with", "2x107", "CFU", "C", ".", "albicans", ".", "Representative", "contour", "plots", "of", "cytokine", "production", "(", "F", ")", "and", "percentages", "of", "CD4", "+", "T", "cells", "producing", "TNF", "-", "α", ",", "IFN", "-", "γ", ",", "IL", "-", "17A", ",", "IL", "-", "17F", "and", "GM", "-", "CSF", "(", "G", ")", ".", "Data", "are", "the", "mean", "±", "SEM", "from", "two", "independent", "experiments", "and", "9", "WT", ",", "7", "Stim1fl", "/", "flVav", "-", "iCre", ",", "8", "Stim1fl", "/", "flStim2fl", "/", "flVav", "-", "iCre", "mice", ".", "Candicidal", "function", "of", "neutrophils", "depend", "on", "SOCE", ".", "(", "H", ")", "Coculture", "of", "Cd11b", "+", "Gr", "-", "1", "+", "neutrophils", "from", "WT", ",", "Stim1fl", "/", "flMx1Cre", "and", "Stim1fl", "/", "flStim2fl", "/", "flMx1Cre", "mice", "with", "C", ".", "albicans", "in", "vitro", "for", "0", ",", "30", ",", "60", "and", "90", "min", "(", "MOI", "0", ".", "5", ")", ".", "Percentages", "of", "live", "C", ".", "albicans", "isolated", "from", "neutrophils", "that", "were", "lysed", "at", "the", "indicated", "time", "points", ".", "Data", "are", "the", "mean", "±", "SEM", "from", "6", "mice", "per", "genotype", "and", "3", "independent", "repeat", "experiments", ".", "ROS", "production", "of", "neutrophils", "depend", "on", "SOCE", ".", "(", "I", ")", "ROS", "production", "by", "Cd11b", "+", "Gr", "-", "1", "+", "neutrophils", "from", "WT", ",", "Stim1fl", "/", "flMx1Cre", "and", "Stim1fl", "/", "flStim2fl", "/", "flMx1Cre", "mice", "was", "measured", "after", "loading", "of", "cells", "with", "dihydrorhodamine", "123", "and", "stimulation", "with", "10", "nM", "PMA", "for", "30", "minutes", ".", "Representative", "histogram", "plots", "and", "bar", "graphs", "indicating", "the", "percentages", "of", "ROS", "+", "neutrophils", "normalized", "to", "WT", "neutrophils", "stimulated", "with", "PMA", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Sublingual infection of WT, Stim1fl/flVav-iCre and Stim1fl/flStim2fl/flVav-iCre mice with 2x107 CFU of C. albicans. (A) Body weight (BW) measured for 7 days and normalized to BW at day 0 of infection. Data are mean ± SEM measured from 4 repeat experiments and 13 WT, 7 Stim1fl/flVav-iCre, 8 Stim1fl/flStim2fl/flVav-iCre mice.Sublingual infection of WT, Stim1fl/flVav-iCre and Stim1fl/flStim2fl/flVav-iCre mice with 2x107 CFU of C. albicans. (B) Quantification of CFU of C. albicans per gram tongue tissue of the indicated mice at day 7 p.i. Data are mean ± SEM from 4 repeat experiments and 12 WT, 7 Stim1fl/flVav-iCre, 8 Stim1fl/flStim2fl/flVav-iCre mice.Sublingual infection of WT, Stim1fl/flVav-iCre and Stim1fl/flStim2fl/flVav-iCre mice with 2x107 CFU of C. albicans. (C) Macroscopic images of the C. albicans-infected tongues of mice at day 7 p.i. Arrows and dashes lines indicate C. albicans infiltrated areas.Sublingual infection of WT, Stim1fl/flVav-iCre and Stim1fl/flStim2fl/flVav-iCre mice with 2x107 CFU of C. albicans. (D) Histological images of H&E (left) and PAS (right) stained tongue tissue at day 7 p.i. Clusters of polymorphonuclear (PMN) cells (neutrophils, white arrows) and Candida (black arrows) are indicated.Sublingual infection of WT, Stim1fl/flVav-iCre and Stim1fl/flStim2fl/flVav-iCre mice with 2x107 CFU of C. albicans. (E) Frequencies of Cd11b+Gr1+ neutrophils in the tongues from the indicated mice at day 7 p.i. Bar graphs represent the mean ± SEM from 3 experiments and 9 WT, 7 Stim1fl/flVav-iCre, 8 Stim1fl/flStim2fl/flVav-iCre mice.(F,G) Cytokine production by CD4+ T cells isolated from submandibular lymph nodes of WT, Stim1fl/flVav-iCre, Stim1fl/flStim2fl/flVav-iCre and Stim1fl/flCd4Cre mice 7 days after sublingual infection with 2x107 CFU C. albicans. Representative contour plots of cytokine production (F) and percentages of CD4+ T cells producing TNF-α, IFN-γ, IL-17A, IL-17F and GM-CSF (G). Data are the mean ± SEM from two independent experiments and 9 WT, 7 Stim1fl/flVav-iCre, 8 Stim1fl/flStim2fl/flVav-iCre mice.Candicidal function of neutrophils depend on SOCE. (H) Coculture of Cd11b+Gr-1+ neutrophils from WT, Stim1fl/flMx1Cre and Stim1fl/flStim2fl/flMx1Cre mice with C.albicans in vitro for 0, 30, 60 and 90 min (MOI 0.5). Percentages of live C.albicans isolated from neutrophils that were lysed at the indicated time points. Data are the mean ± SEM from 6 mice per genotype and 3 independent repeat experiments.ROS production of neutrophils depend on SOCE. (I) ROS production by Cd11b+Gr-1+ neutrophils from WT, Stim1fl/flMx1Cre and Stim1fl/flStim2fl/flMx1Cre mice was measured after loading of cells with dihydrorhodamine 123 and stimulation with 10 nM PMA for 30 minutes. Representative histogram plots and bar graphs indicating the percentages of ROS+ neutrophils normalized to WT neutrophils stimulated with PMA."}
{"words": ["Figure", "6Sublingual", "C", ".", "albicans", "infection", "of", "WT", "and", "Stim1fl", "/", "flCd4Cre", "mice", "as", "described", "in", "Figure", "5", ".", "(", "A", ")", "Body", "weight", "(", "BW", ")", "change", "measured", "for", "7", "days", "p", ".", "i", ".", "relative", "to", "BW", "at", "the", "day", "of", "infection", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SEM", "measured", "from", "4", "repeat", "experiments", "and", "13", "WT", "and", "7", "Stim1fl", "/", "flCd4Cre", "mice", ".", "Sublingual", "C", ".", "albicans", "infection", "of", "WT", "and", "Stim1fl", "/", "flCd4Cre", "mice", "as", "described", "in", "Figure", "5", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "CFU", "of", "C", ".", "albicans", "isolated", "from", "the", "tongues", "of", "mice", "at", "day", "7", "post", "-", "infection", "(", "p", ".", "i", ".", ")", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SEM", "from", "4", "repeat", "experiments", "and", "7", "-", "13", "mice", "per", "genotype", ".", "Sublingual", "C", ".", "albicans", "infection", "of", "WT", "and", "Stim1fl", "/", "flCd4Cre", "mice", "as", "described", "in", "Figure", "5", ".", "(", "C", ")", "Macroscopic", "images", "of", "the", "C", ".", "albicans", "-", "infected", "tongues", "of", "mice", "at", "day", "7", "p", ".", "i", ".", "Sublingual", "C", ".", "albicans", "infection", "of", "WT", "and", "Stim1fl", "/", "flCd4Cre", "mice", "as", "described", "in", "Figure", "5", ".", "(", "D", ")", "Histological", "images", "of", "H", "&", "E", "(", "left", ")", "and", "PAS", "-", "stained", "(", "right", ")", "tongue", "tissue", "at", "day", "7", "p", ".", "i", ".", "Scale", "bars", "100", "μm", ".", "Arrows", "point", "to", "clusters", "of", "polymorphonuclear", "(", "PMN", ")", "cell", "(", "neutrophil", ")", "infiltrates", ".", "Systemic", "C", ".", "albicans", "infection", ".", "WT", "and", "Stim1fl", "/", "fl", "Cd4Cre", "mice", "were", "injected", "i", ".", "v", ".", "with", "2x105", "CFU", "C", ".", "albicans", "or", "PBS", "as", "control", ".", "(", "E", ")", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "plot", "showing", "survival", "of", "mice", ".", "Data", "from", "5", "Stim1fl", "/", "fl", "Cd4Cre", "mice", "and", "12", "WT", "mice", "is", "shown", ".", "Systemic", "C", ".", "albicans", "infection", ".", "WT", "and", "Stim1fl", "/", "fl", "Cd4Cre", "mice", "were", "injected", "i", ".", "v", ".", "with", "2x105", "CFU", "C", ".", "albicans", "or", "PBS", "as", "control", ".", "(", "F", ")", "Body", "weight", "(", "BW", ")", "of", "mice", "normalized", "to", "BW", "at", "the", "day", "of", "infection", ".", "Data", "are", "the", "mean", "±", "SEM", "from", "4", "independent", "experiments", "and", "8", "WT", "and", "7", "Stim1fl", "/", "flCd4Cre", "mice", ".", "Systemic", "C", ".", "albicans", "infection", ".", "WT", "and", "Stim1fl", "/", "fl", "Cd4Cre", "mice", "were", "injected", "i", ".", "v", ".", "with", "2x105", "CFU", "C", ".", "albicans", "or", "PBS", "as", "control", ".", "(", "G", ")", "Representative", "macroscopic", "images", "of", "kidneys", "at", "day", "6", "p", ".", "i", ".", "Systemic", "C", ".", "albicans", "infection", ".", "WT", "and", "Stim1fl", "/", "fl", "Cd4Cre", "mice", "were", "injected", "i", ".", "v", ".", "with", "2x105", "CFU", "C", ".", "albicans", "or", "PBS", "as", "control", ".", "(", "H", ")", "CFUs", "of", "C", ".", "albicans", "per", "gram", "tissue", "isolated", "from", "the", "liver", ",", "the", "right", "kidney", "and", "the", "lung", "of", "mice", "at", "day", "6", "p", ".", "i", ".", "Each", "dot", "represents", "one", "mouse", ".", "Systemic", "C", ".", "albicans", "infection", ".", "WT", "and", "Stim1fl", "/", "fl", "Cd4Cre", "mice", "were", "injected", "i", ".", "v", ".", "with", "2x105", "CFU", "C", ".", "albicans", "or", "PBS", "as", "control", ".", "(", "I", ")", "Representative", "histological", "images", "of", "H", "&", "E", "and", "PAS", "stained", "kidneys", "of", "mice", "at", "day", "6", "p", ".", "i", ".", "Magnification", "6", ".", "4x", "(", "left", ")", "and", "40x", "(", "right", ")", ".", "White", "arrows", "define", "areas", "infiltrated", "with", "leukocytes", "(", "H", "&", "E", ")", "and", "C", ".", "albicans", "(", "PAS", ")", ".", "Systemic", "C", ".", "albicans", "infection", ".", "WT", "and", "Stim1fl", "/", "fl", "Cd4Cre", "mice", "were", "injected", "i", ".", "v", ".", "with", "2x105", "CFU", "C", ".", "albicans", "or", "PBS", "as", "control", ".", "(", "J", ")", "Frequencies", "of", "CD4", "+", "T", "cells", "isolated", "from", "the", "spleens", "of", "mice", "at", "day", "6", "p", ".", "i", ".", "producing", "the", "indicated", "cytokines", "after", "restimulation", "with", "20", "nM", "PMA", "and", "1", "μM", "ionomycin", "for", "6", "hours", "and", "analyzed", "by", "flow", "cytometry", ".", "Systemic", "C", ".", "albicans", "infection", ".", "WT", "and", "Stim1fl", "/", "fl", "Cd4Cre", "mice", "were", "injected", "i", ".", "v", ".", "with", "2x105", "CFU", "C", ".", "albicans", "or", "PBS", "as", "control", ".", "(", "K", ")", "Frequencies", "CD45", "+", "Cd11b", "+", "Gr", "-", "1", "+", "neutrophils", "in", "the", "blood", "of", "mice", "at", "day", "6", "post", "-", "infection", "analyzed", "by", "flow", "cytometry", ".", "Data", "in", "J", "are", "the", "mean", "±", "SEM", "from", "2", "independent", "experiments", "and", "6", "WT", "and", "4", "Stim1fl", "/", "flCd4Cre", "mice", ";", "data", "in", "K", "are", "the", "mean", "±", "SEM", "from", "one", "experiment", "and", "2", "WT", "and", "3", "Stim1fl", "/", "flCd4Cre", "mice", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Sublingual C. albicans infection of WT and Stim1fl/flCd4Cre mice as described in Figure 5. (A) Body weight (BW) change measured for 7 days p.i. relative to BW at the day of infection. Data are mean ± SEM measured from 4 repeat experiments and 13 WT and 7 Stim1fl/flCd4Cre mice.Sublingual C. albicans infection of WT and Stim1fl/flCd4Cre mice as described in Figure 5. (B) Quantification of CFU of C. albicans isolated from the tongues of mice at day 7 post-infection (p.i.). Data are mean ± SEM from 4 repeat experiments and 7-13 mice per genotype.Sublingual C. albicans infection of WT and Stim1fl/flCd4Cre mice as described in Figure 5. (C) Macroscopic images of the C. albicans-infected tongues of mice at day 7 p.i.Sublingual C. albicans infection of WT and Stim1fl/flCd4Cre mice as described in Figure 5. (D) Histological images of H&E (left) and PAS-stained (right) tongue tissue at day 7 p.i. Scale bars 100 μm. Arrows point to clusters of polymorphonuclear (PMN) cell (neutrophil) infiltrates.Systemic C. albicans infection. WT and Stim1fl/fl Cd4Cre mice were injected i.v. with 2x105 CFU C.albicans or PBS as control. (E) Kaplan-Meier survival plot showing survival of mice. Data from 5 Stim1fl/fl Cd4Cre mice and 12 WT mice is shown.Systemic C. albicans infection. WT and Stim1fl/fl Cd4Cre mice were injected i.v. with 2x105 CFU C.albicans or PBS as control. (F) Body weight (BW) of mice normalized to BW at the day of infection. Data are the mean ± SEM from 4 independent experiments and 8 WT and 7 Stim1fl/flCd4Cre mice.Systemic C. albicans infection. WT and Stim1fl/fl Cd4Cre mice were injected i.v. with 2x105 CFU C.albicans or PBS as control. (G) Representative macroscopic images of kidneys at day 6 p.i.Systemic C. albicans infection. WT and Stim1fl/fl Cd4Cre mice were injected i.v. with 2x105 CFU C.albicans or PBS as control. (H) CFUs of C. albicans per gram tissue isolated from the liver, the right kidney and the lung of mice at day 6 p.i. Each dot represents one mouse.Systemic C. albicans infection. WT and Stim1fl/fl Cd4Cre mice were injected i.v. with 2x105 CFU C.albicans or PBS as control. (I) Representative histological images of H&E and PAS stained kidneys of mice at day 6 p.i. Magnification 6.4x (left) and 40x (right). White arrows define areas infiltrated with leukocytes (H&E) and C. albicans (PAS).Systemic C. albicans infection. WT and Stim1fl/fl Cd4Cre mice were injected i.v. with 2x105 CFU C.albicans or PBS as control. (J) Frequencies of CD4+ T cells isolated from the spleens of mice at day 6 p.i. producing the indicated cytokines after restimulation with 20 nM PMA and 1 μM ionomycin for 6 hours and analyzed by flow cytometry.Systemic C. albicans infection. WT and Stim1fl/fl Cd4Cre mice were injected i.v. with 2x105 CFU C.albicans or PBS as control. (K) Frequencies CD45+Cd11b+Gr-1+ neutrophils in the blood of mice at day 6 post-infection analyzed by flow cytometry. Data in J are the mean ± SEM from 2 independent experiments and 6 WT and 4 Stim1fl/flCd4Cre mice; data in K are the mean ± SEM from one experiment and 2 WT and 3 Stim1fl/flCd4Cre mice."}
{"words": ["Figure", "7RNA", "-", "seq", "analysis", "of", "CD4", "+", "T", "cells", "isolated", "from", "3", "WT", "and", "3", "Stim1fl", "/", "flCd4Cre", "mice", "that", "were", "differentiated", "into", "pathogenic", "Th17", "cells", "(", "pTh17", ":", "IL", "-", "1β", ",", "IL", "-", "6", ",", "IL", "-", "23", ")", "and", "non", "-", "pathogenic", "Th17", "cells", "(", "npTh17", ":", "IL", "-", "6", ",", "TGFβ1", ")", ".", "(", "B", ")", "Volcano", "plots", "of", "DEGs", "in", "npTh17", "cells", "(", "gray", "dots", ")", ".", "Highlighted", "in", "red", "(", "upregulated", "in", "Stim1fl", "/", "flCd4Cre", ")", "and", "blue", "(", "downregulated", "in", "Stim1fl", "/", "flCd4Cre", ")", "are", "DEGs", "that", "belong", "to", "a", "gene", "expression", "signature", "of", "npTh17", "cells", "and", "pTh17", "cells", "defined", "previously", "(", "Gaublomme", "et", "al", ".", ",", "2015", ",", "Lee", "et", "al", ".", ",", "2012", ")", ".", "(", "C", ")", "Normalized", "expression", "of", "Th17", "cell", "-", "associated", "cytokines", "and", "receptors", "in", "npTh17", "cells", "derived", "from", "WT", "and", "Stim1fl", "/", "flCd4Cre", "mice", ".", "Bar", "graphs", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "from", "3", "mice", "per", "group", ".", "Statistical", "analysis", "by", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "with", "the", "following", "significance", "levels", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "F", ")", "Heat", "map", "of", "DEGs", "(", "p", "(", "adj", ".", ")", "<", "0", ".", "1", ")", "within", "the", "KEGG", "pathways", "\"", "Foxo", "signaling", "\"", "and", "\"", "HIF", "-", "1", "signaling", "\"", "that", "are", "specifically", "deregulated", "in", "npTh17", "cells", ".", "Numerical", "values", "are", "relative", "gene", "expression", ".", "(", "G", ")", "Gene", "set", "enrichment", "analysis", "(", "GSEA", ")", "of", "DEGs", "in", "WT", "and", "STIM1", "-", "deficient", "npTh17", "cells", ".", "Normalized", "enrichment", "score", "(", "NES", ")", "and", "p", "-", "values", "are", "as", "indicated", "for", "the", "following", "genesets", ":", "Myc", "targets", ":", "\"", "Menssen", "_", "myc", "_", "targets", "\"", ";", "Glycolysis", ":", "\"", "Humancyc", "_", "mm", "_", "glycolysis", "_", "i", "\"", ";", "Mitochondrial", "function", ":", "\"", "Wong", "_", "mitochondria", "_", "gene", "_", "module", "\"", ";", "TCA", "cycle", ":", "\"", "Kegg", "_", "mm", "_", "citrate", "_", "cycle", "\"", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7RNA-seq analysis of CD4+ T cells isolated from 3 WT and 3 Stim1fl/flCd4Cre mice that were differentiated into pathogenic Th17 cells (pTh17: IL-1β, IL-6, IL-23) and non-pathogenic Th17 cells (npTh17: IL-6, TGFβ1). (B) Volcano plots of DEGs in npTh17 cells (gray dots). Highlighted in red (upregulated in Stim1fl/flCd4Cre) and blue (downregulated in Stim1fl/flCd4Cre) are DEGs that belong to a gene expression signature of npTh17 cells and pTh17 cells defined previously (Gaublomme et al., 2015, Lee et al., 2012).(C) Normalized expression of Th17 cell-associated cytokines and receptors in npTh17 cells derived from WT and Stim1fl/flCd4Cre mice. Bar graphs represent the mean ± SEM from 3 mice per group. Statistical analysis by unpaired Student's t-test with the following significance levels: *p<0.05, ***p<0.001.(F) Heat map of DEGs (p (adj.) < 0.1) within the KEGG pathways \"Foxo signaling\" and \"HIF-1 signaling\" that are specifically deregulated in npTh17 cells. Numerical values are relative gene expression.(G) Gene set enrichment analysis (GSEA) of DEGs in WT and STIM1-deficient npTh17 cells. Normalized enrichment score (NES) and p-values are as indicated for the following genesets: Myc targets: \"Menssen_myc_targets\"; Glycolysis: \"Humancyc_mm_glycolysis_i\"; Mitochondrial function: \"Wong_mitochondria_gene_module\"; TCA cycle: \"Kegg_mm_citrate_cycle\"."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "A", ")", "Heat", "map", "of", "metabolism", "-", "associated", "DEGs", "(", "p", "(", "adj", ".", ")", "<", "0", ".", "10", ")", "in", "npTh17", "cells", "of", "WT", "and", "Stim1fl", "/", "flCd4Cre", "mice", "determined", "by", "RNA", "-", "Seq", "as", "described", "in", "Figure", "7", ".", "Heatmap", "shows", "relative", "minimum", "and", "maximum", "values", "per", "gene", "(", "row", "min", "/", "max", ")", ".", "Numerical", "values", "are", "relative", "gene", "expression", ".", "TCA", ",", "tricarboxylic", "acid", ".", "Glucose", "and", "mitochondrial", "metabolism", "in", "npTh17", "cells", "from", "WT", "(", "grey", "or", "black", ")", "and", "Stim1fl", "/", "flCd4Cre", "(", "blue", ")", "mice", "differentiated", "for", "3", "days", "in", "vitro", ".", "(", "B", ")", "Glucose", "uptake", "by", "npTh17", "cells", "were", "loaded", "with", "2", "-", "NBDG", "(", "+", ")", "or", "not", "(", "-", ")", "and", "analyzed", "by", "flow", "cytometry", "90", "min", "later", ".", "Bar", "graphs", "show", "the", "delta", "MFI", "of", "2", "-", "NBDG", "fluorescence", "normalized", "to", "unlabeled", "cells", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "(", "C", ")", "Extracellular", "acidification", "rate", "(", "ECAR", ")", "of", "npTh17", "cells", "before", "and", "after", "addition", "of", "25", "mM", "glucose", ",", "5", "μM", "oligomycin", "and", "100", "mM", "2", "-", "deoxy", "-", "D", "-", "glucose", "(", "2", "-", "DG", ")", ".", "Seahorse", "graphs", "and", "bar", "graphs", "depicting", "glycolysis", ",", "glycolytic", "capacity", "and", "reserve", "the", "mean", "±", "SEM", "from", "of", "2", "-", "3", "mice", "per", "genotype", "from", "one", "representative", "out", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Glucose", "and", "mitochondrial", "metabolism", "in", "npTh17", "cells", "from", "WT", "(", "grey", "or", "black", ")", "and", "Stim1fl", "/", "flCd4Cre", "(", "blue", ")", "mice", "differentiated", "for", "3", "days", "in", "vitro", ".", "(", "D", ")", "Oxygen", "consumption", "rate", "(", "OCR", ")", "of", "npTh17", "cells", "before", "and", "after", "addition", "of", "1", "μM", "oligomycin", ",", "1", ".", "5", "μM", "FCCP", "and", "100", "nM", "rotenone", "/", "1", "μM", "antimycin", ".", "Seahorse", "graphs", "and", "bar", "graphs", "depicting", "basal", "and", "maximal", "respiration", ",", "coupling", "efficiency", "and", "ATP", "production", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "from", "of", "2", "-", "3", "mice", "per", "genotype", "from", "one", "representative", "out", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "Glucose", "and", "mitochondrial", "metabolism", "in", "human", "CD4", "+", "T", "cells", "isolated", "from", "PBMC", "of", "a", "HD", "and", "P1", "and", "stimulated", "with", "5", "μg", "/", "ml", "anti", "-", "CD3", "and", "10", "μg", "/", "ml", "anti", "-", "CD28", "for", "24", "hours", "before", "analysis", ".", "Some", "HD", "T", "cells", "were", "stimulated", "in", "the", "presence", "of", "1μM", "FK506", ".", "(", "E", ",", "F", ")", "ECAR", "before", "and", "after", "addition", "of", "25", "mM", "glucose", ",", "5", "μM", "oligomycin", "and", "100", "mM", "2", "-", "DG", ".", "Glucose", "and", "mitochondrial", "metabolism", "in", "human", "CD4", "+", "T", "cells", "isolated", "from", "PBMC", "of", "a", "HD", "and", "P1", "and", "stimulated", "with", "5", "μg", "/", "ml", "anti", "-", "CD3", "and", "10", "μg", "/", "ml", "anti", "-", "CD28", "for", "24", "hours", "before", "analysis", ".", "Some", "HD", "T", "cells", "were", "stimulated", "in", "the", "presence", "of", "1μM", "FK506", ".", "(", "G", ",", "H", ")", "OCR", "before", "and", "after", "addition", "of", "1", "μM", "oligomycin", ",", "1", ".", "5", "μM", "FCCP", "and", "100", "nM", "rotenone", "/", "1", "μM", "antimycin", ".", "Seahorse", "graphs", "(", "G", ")", "and", "bar", "graphs", "(", "H", ")", "depicting", "basal", "and", "maximal", "respiration", ",", "SRC", "and", "ATP", "production", "(", "right", ")", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "of", "2", "technical", "replicates", "from", "isolated", "T", "cells", "from", "one", "experiment", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(A) Heat map of metabolism-associated DEGs (p (adj.) < 0.10) in npTh17 cells of WT and Stim1fl/flCd4Cre mice determined by RNA-Seq as described in Figure 7. Heatmap shows relative minimum and maximum values per gene (row min/max). Numerical values are relative gene expression. TCA, tricarboxylic acid.Glucose and mitochondrial metabolism in npTh17 cells from WT (grey or black) and Stim1fl/flCd4Cre (blue)mice differentiated for 3 days in vitro. (B) Glucose uptake by npTh17 cells were loaded with 2-NBDG (+) or not (-) and analyzed by flow cytometry 90 min later. Bar graphs show the delta MFI of 2-NBDG fluorescence normalized to unlabeled cells. Data represent the mean ± SEM from 3 independent experiments.(C) Extracellular acidification rate (ECAR) of npTh17 cells before and after addition of 25 mM glucose, 5 μM oligomycin and 100 mM 2-deoxy-D-glucose (2-DG). Seahorse graphs and bar graphs depicting glycolysis, glycolytic capacity and reserve the mean ± SEM from of 2-3 mice per genotype from one representative out of three independent experiments.Glucose and mitochondrial metabolism in npTh17 cells from WT (grey or black) and Stim1fl/flCd4Cre (blue)mice differentiated for 3 days in vitro. (D) Oxygen consumption rate (OCR) of npTh17 cells before and after addition of 1 μM oligomycin, 1.5 μM FCCP and 100 nM rotenone / 1 μM antimycin. Seahorse graphs and bar graphs depicting basal and maximal respiration, coupling efficiency and ATP production represent the mean ± SEM from of 2-3 mice per genotype from one representative out of three independent experiments.Glucose and mitochondrial metabolism in human CD4+ T cells isolated from PBMC of a HD and P1 and stimulated with 5 μg/ml anti-CD3 and 10 μg/ml anti-CD28 for 24 hours before analysis. Some HD T cells were stimulated in the presence of 1μM FK506. (E,F) ECAR before and after addition of 25 mM glucose, 5 μM oligomycin and 100 mM 2-DG.Glucose and mitochondrial metabolism in human CD4+ T cells isolated from PBMC of a HD and P1 and stimulated with 5 μg/ml anti-CD3 and 10 μg/ml anti-CD28 for 24 hours before analysis. Some HD T cells were stimulated in the presence of 1μM FK506. (G,H) OCR before and after addition of 1 μM oligomycin, 1.5 μM FCCP and 100 nM rotenone / 1 μM antimycin. Seahorse graphs (G) and bar graphs (H) depicting basal and maximal respiration, SRC and ATP production (right) represent the mean ± SEM of 2 technical replicates from isolated T cells from one experiment."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "Immunoblotting", "of", "c", "-", "MYC", "and", "ATF4", "in", "melanoma", "cells", "treated", "with", "NT", "-", "siRNA", "(", "-", ")", "or", "siASNS", "(", "#", "1", "or", "#", "2", ")", "for", "72", "hr", ".", "Reverse", "transcription", "with", "quantitative", "PCR", "(", "RT", "-", "qPCR", ")", "of", "the", "indicated", "transcripts", "in", "melanoma", "cells", "36", "hr", "after", "treatment", "with", "siASNS", "(", "#", "1", "or", "#", "2", ")", "(", "B", ")", "C", ".", "Reverse", "transcription", "with", "quantitative", "PCR", "(", "RT", "-", "qPCR", ")", "of", "the", "indicated", "transcripts", "in", "melanoma", "cells", "36", "hr", "after", "treatment", "with", "siASNS", ",", "siATF4", ",", "or", "both", "(", "C", ")", ".", "D", ".", "Immunoblotting", "of", "ATF4", "and", "ASNS", "in", "melanoma", "cells", "72", "hr", "after", "treatment", "with", "siASNS", ",", "siATF4", ",", "or", "both", ".", "E", ".", "Proliferation", "of", "melanoma", "cells", "over", "indicated", "times", "after", "treatment", "with", "siASNS", ",", "siATF4", ",", "or", "both", ".", "F", ".", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "indicated", "transcripts", "in", "melanoma", "cells", "36", "hr", "after", "treatment", "with", "siASNS", "(", "#", "1", "or", "#", "2", ")", ".", "Immunoblotting", "of", "c", "-", "MYC", "in", "melanoma", "cells", "treated", "for", "72", "hr", "with", "siASNS", ",", "L", "-", "Asn", ",", "or", "both", "(", "G", ")", "H", ".", "Immunoblotting", "of", "c", "-", "MYC", "in", "A375", "cells", "treated", "as", "indicated", "for", "72", "hr", "(", "H", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. Immunoblotting of c-MYC and ATF4 in melanoma cells treated with NT-siRNA (-) or siASNS (#1 or #2) for 72 hr.Reverse transcription with quantitative PCR (RT-qPCR) of the indicated transcripts in melanoma cells 36 hr after treatment with siASNS (#1 or #2) (B)C. Reverse transcription with quantitative PCR (RT-qPCR) of the indicated transcripts in melanoma cells 36 hr after treatment with siASNS, siATF4, or both (C).D. Immunoblotting of ATF4 and ASNS in melanoma cells 72 hr after treatment with siASNS, siATF4, or both.E. Proliferation of melanoma cells over indicated times after treatment with siASNS, siATF4, or both.F. RT-qPCR analysis of indicated transcripts in melanoma cells 36 hr after treatment with siASNS (#1 or #2).Immunoblotting of c-MYC in melanoma cells treated for 72 hr with siASNS, L-Asn, or both (G)H. Immunoblotting of c-MYC in A375 cells treated as indicated for 72 hr (H)."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Immunoblotting", "of", "c", "-", "MYC", "in", "A375", "cells", "treated", "with", "NT", "-", "siRNA", "or", "siASNS", "for", "24", "hr", "followed", "by", "cycloheximide", "treatment", "for", "indicated", "timepoints", "(", "left", ")", ".", "Plot", "showing", "relative", "protein", "levels", "of", "c", "-", "MYC", "(", "y", "-", "axis", ")", "as", "a", "function", "of", "time", "lapsed", "(", "x", "-", "axis", ")", "in", "the", "left", "panel", "(", "right", ")", ".", "Immunoblotting", "of", "indicated", "proteins", "in", "melanoma", "cells", "72", "hr", "after", "treatment", "with", "NT", "-", "siRNA", "(", "-", ")", "or", "siASNS", "(", "#", "1", "or", "#", "2", ")", "(", "B", "and", "C", ")", "Immunoblotting", "of", "indicated", "proteins", "in", "melanoma", "cells", "72", "hr", "after", "treatment", "with", "siASNS", ",", "PLX", "-", "4032", ",", "or", "both", "(", "D", ")", ".", "E", ".", "Immunoblotting", "of", "indicated", "proteins", "in", "A375", "cells", "cultured", "in", "L", "-", "Asn", "and", "treated", "with", "L", "-", "A", "'", "ase", ",", "PLX", "-", "4032", ",", "or", "both", "for", "72", "hr", ".", "F", ".", "A375", "cells", "were", "treated", "with", "siASNS", ",", "SCH772984", ",", "or", "both", "for", "72", "hr", "followed", "by", "immunoblotting", "of", "phosphorylated", "and", "total", "GSK3", "-", "β", ".", "G", ".", "A375", "cells", "were", "treated", "with", "siASNS", ",", "HA", "-", "GSK3", "-", "β", "(", "S9A", ")", ",", "or", "both", "for", "72", "hr", "followed", "by", "immunoblotting", "of", "indicated", "proteins", ".", "H", ".", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "indicated", "transcripts", "in", "melanoma", "cells", "36", "hr", "after", "treatment", "with", "siASNS", ",", "HA", "-", "GSK3", "-", "β", "(", "S9A", ")", ",", "or", "both", ".", "I", ".", "A375", "cells", "were", "treated", "as", "indicated", "for", "72", "hr", "followed", "by", "immunoblotting", "of", "c", "-", "MYC", ".", "J", ".", "Immunoblotting", "of", "c", "-", "MYC", "and", "HA", "proteins", "in", "A375", "cells", "treated", "as", "indicated", "for", "72", "hr", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Immunoblotting of c-MYC in A375 cells treated with NT-siRNA or siASNS for 24 hr followed by cycloheximide treatment for indicated timepoints (left). Plot showing relative protein levels of c-MYC (y-axis) as a function of time lapsed (x-axis) in the left panel (right).Immunoblotting of indicated proteins in melanoma cells 72 hr after treatment with NT-siRNA (-) or siASNS (#1 or #2) (B and C)Immunoblotting of indicated proteins in melanoma cells 72 hr after treatment with siASNS, PLX-4032, or both (D).E. Immunoblotting of indicated proteins in A375 cells cultured in L-Asn and treated with L-A'ase, PLX-4032, or both for 72 hr.F. A375 cells were treated with siASNS, SCH772984, or both for 72 hr followed by immunoblotting of phosphorylated and total GSK3-β.G. A375 cells were treated with siASNS, HA-GSK3-β (S9A), or both for 72 hr followed by immunoblotting of indicated proteins.H. RT-qPCR analysis of indicated transcripts in melanoma cells 36 hr after treatment with siASNS, HA-GSK3-β (S9A), or both.I. A375 cells were treated as indicated for 72 hr followed by immunoblotting of c-MYC.J. Immunoblotting of c-MYC and HA proteins in A375 cells treated as indicated for 72 hr."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "Immunoblotting", "of", "indicated", "proteins", "in", "melanoma", "cells", "treated", "with", "siASNS", ",", "sicMYC", "(", "#", "1", "or", "#", "2", ")", ",", "or", "a", "combination", "of", "siASNS", "and", "sicMYC", "(", "#", "1", "or", "#", "2", ")", "for", "72", "hr", ".", "B", ".", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "indicated", "transcripts", "in", "melanoma", "cells", "36", "hr", "after", "treatment", "with", "siASNS", ",", "sicMYC", ",", "or", "both", ".", "C", ".", "Immunoblotting", "of", "indicated", "proteins", "in", "melanoma", "cells", "72", "hr", "after", "treatment", "with", "siASNS", ",", "sicMYC", ",", "PLX", "-", "4032", ",", "or", "a", "combination", "of", "siASNS", "and", "sicMYC", ",", "or", "siASNS", "and", "PLX", "-", "4032", ".", "D", ".", "Immunoblotting", "of", "indicated", "proteins", "in", "A375", "cells", "72", "hr", "after", "treatment", "with", "siASNS", ",", "HA", "-", "GSK3", "-", "β", "(", "S9A", ")", ",", "or", "both", ".", "E", ".", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "indicated", "transcripts", "in", "melanoma", "cells", "after", "36", "hr", "treatment", "with", "siASNS", ",", "HA", "-", "GSK3", "-", "β", "(", "S9A", ")", ",", "or", "both", ".", "F", ".", "A375", "cells", "were", "treated", "as", "indicated", "for", "72", "hr", "followed", "by", "immunoblotting", "of", "indicated", "proteins", ".", "Proliferation", "of", "melanoma", "cells", "over", "indicated", "times", "after", "treatment", "with", "siASNS", ",", "sicMYC", ",", "or", "both", "(", "G", ")", ",", "Proliferation", "of", "melanoma", "cells", "over", "indicated", "times", "after", "treatment", "with", "siASNS", ",", "HA", "-", "GSK3", "-", "β", "(", "S9A", ")", ",", "or", "both", "(", "H", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. Immunoblotting of indicated proteins in melanoma cells treated with siASNS, sicMYC (#1 or #2), or a combination of siASNS and sicMYC (#1 or #2) for 72 hr.B. RT-qPCR analysis of indicated transcripts in melanoma cells 36 hr after treatment with siASNS, sicMYC, or both.C. Immunoblotting of indicated proteins in melanoma cells 72 hr after treatment with siASNS, sicMYC, PLX-4032, or a combination of siASNS and sicMYC, or siASNS and PLX-4032.D. Immunoblotting of indicated proteins in A375 cells 72 hr after treatment with siASNS, HA-GSK3-β (S9A), or both.E. RT-qPCR analysis of indicated transcripts in melanoma cells after 36 hr treatment with siASNS, HA-GSK3-β (S9A), or both.F. A375 cells were treated as indicated for 72 hr followed by immunoblotting of indicated proteins.Proliferation of melanoma cells over indicated times after treatment with siASNS, sicMYC, or both (G),Proliferation of melanoma cells over indicated times after treatment with siASNS, HA-GSK3-β (S9A), or both (H)."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "Immunoblotting", "of", "indicated", "proteins", "in", "A375", "cells", "72", "hr", "after", "treatment", "with", "siASNS", ",", "siSLC1A5", ",", "siSLC7A5", ",", "or", "a", "combination", "of", "siASNS", "and", "siSLC1A5", ",", "or", "siASNS", "and", "siSLC7A5", ".", "B", ".", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "indicated", "transcripts", "in", "melanoma", "cells", "after", "36", "hr", "treatment", "with", "siASNS", ",", "siSLC7A5", ",", "or", "both", ".", "C", ".", "Proliferation", "of", "melanoma", "cells", "over", "indicated", "times", "after", "treatment", "with", "siASNS", ",", "siSLC7A5", ",", "or", "both", ".", "D", ".", "GC", "-", "MS", "-", "based", "estimation", "of", "intracellular", "amino", "acid", "levels", "in", "A375", "cells", "treated", "with", "siASNS", ",", "siATF4", ",", "or", "both", "(", "top", "left", ")", ";", "siASNS", ",", "sicMYC", ",", "or", "both", "(", "top", "right", ")", ";", "siASNS", ",", "siSLC1A5", ",", "or", "both", "(", "bottom", "left", ")", ";", "or", "siASNS", ",", "siSLC7A5", ",", "or", "both", "(", "bottom", "right", ")", ".", "The", "fold", "change", "is", "relative", "to", "NT", "-", "siRNA", "-", "treated", "A375", "cells", ".", "Immunoblotting", "of", "indicated", "proteins", "in", "A375", "cells", "72", "hr", "after", "indicated", "treatment", "(", "E", ")", ",", "Immunoblotting", "of", "indicated", "proteins", "in", "A375", "cells", "72", "hr", "after", ",", "treatment", "with", "siASNS", ",", "sicMYC", ",", "or", "bothImmunoblotting", "of", "indicated", "proteins", "in", "A375", "cells", "72", "hr", "after", "indicated", "treatment", "with", ",", "siASNS", ",", "siSLC7A5", ",", "or", "both", "(", "G", ")", "Immunoblotting", "of", "indicated", "proteins", "in", "A375", "cells", "72", "hr", "after", "indicated", "treatment", "with", "siASNS", ",", "BCH", ",", "or", "both", "(", "H", ")", "Immunoblotting", "of", "indicated", "proteins", "in", "A375", "cells", "72", "hr", "after", "indicated", "treatment", "with", "siASNS", ",", "HA", "-", "GSK3", "-", "β", "(", "S9A", ")", ",", "or", "both", "(", "I", ")", "Immunoblotting", "of", "indicated", "proteins", "in", "A375", "cells", "72", "hr", "after", "indicated", "treatment", "with", ",", "siASNS", "or", "indicated", "combinations", "(", "J", ")", "Immunoblotting", "of", "indicated", "proteins", "in", "A375", "cells", "72", "hr", "after", "indicated", "treatment", "with", "siASNS", ",", "siSLC3A2", ",", "or", "both", "(", "K", ")", ".", "L", ".", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "indicated", "transcripts", "in", "melanoma", "cells", "after", "36", "hr", "treatment", "with", "siASNS", ",", "siSLC3A2", ",", "or", "both", ".", "M", ".", "Proliferation", "of", "melanoma", "cells", "over", "indicated", "times", "after", "treatment", "with", "siASNS", ",", "siSLC3A2", ",", "or", "both", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. Immunoblotting of indicated proteins in A375 cells 72 hr after treatment with siASNS, siSLC1A5, siSLC7A5, or a combination of siASNS and siSLC1A5, or siASNS and siSLC7A5.B. RT-qPCR analysis of indicated transcripts in melanoma cells after 36 hr treatment with siASNS, siSLC7A5, or both.C. Proliferation of melanoma cells over indicated times after treatment with siASNS, siSLC7A5, or both.D. GC-MS-based estimation of intracellular amino acid levels in A375 cells treated with siASNS, siATF4, or both (top left); siASNS, sicMYC, or both (top right); siASNS, siSLC1A5, or both (bottom left); or siASNS, siSLC7A5, or both (bottom right). The fold change is relative to NT-siRNA-treated A375 cells.Immunoblotting of indicated proteins in A375 cells 72 hr after indicated treatment (E),Immunoblotting of indicated proteins in A375 cells 72 hr after , treatment with siASNS, sicMYC, or bothImmunoblotting of indicated proteins in A375 cells 72 hr after indicated treatment with , siASNS, siSLC7A5, or both (G)Immunoblotting of indicated proteins in A375 cells 72 hr after indicated treatment with siASNS, BCH, or both (H)Immunoblotting of indicated proteins in A375 cells 72 hr after indicated treatment with siASNS, HA-GSK3-β (S9A), or both (I)Immunoblotting of indicated proteins in A375 cells 72 hr after indicated treatment with , siASNS or indicated combinations (J)Immunoblotting of indicated proteins in A375 cells 72 hr after indicated treatment with siASNS, siSLC3A2, or both (K).L. RT-qPCR analysis of indicated transcripts in melanoma cells after 36 hr treatment with siASNS, siSLC3A2, or both.M. Proliferation of melanoma cells over indicated times after treatment with siASNS, siSLC3A2, or both."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "CRISPR", "-", "guided", "AID", "∆", "C", "protein", "could", "support", "CSR", "in", "Aicda", "-", "/", "-", "CH12F3", "cells", ".", "Left", ",", "CRISPR", "-", "guided", "AID", "is", "schematically", "illustrated", "with", "each", "component", "listed", ".", "Right", ",", "CRISPR", "-", "guided", "AID", "initiated", "CSR", "levels", "to", "IgA", ".", "Blue", "arrows", "represent", "multiple", "CRISPR", "recognition", "sites", ".", "The", "number", "in", "the", "parentheses", "indicates", "CRISPR", "recognition", "sites", "in", "each", "S", "region", ".", "Three", "biological", "replicates", "are", "plotted", "by", "dots", "and", "mean", "with", "standard", "deviation", "(", "SD", ")", ".", "Data", "information", ":", "For", "panels", "A", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Dunnett", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "was", "used", "for", "significance", "assessment", ".", "For", "all", "panels", ",", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "ns", ",", "p", ">", "0", ".", "05", ".", "(", "B", ")", "CRISPR", "-", "guided", "AID", "generated", "breaks", "at", "the", "S", "region", "in", "Aicda", "-", "/", "-", "CH12F3", "cells", "were", "quantitatively", "detected", "by", "PEM", "-", "seq", ".", "Top", ",", "schematic", "illustration", "shows", "the", "bait", "SaCas9", "site", "at", "Iγ3", "region", "and", "CRISPR", "-", "guided", "AID", "variants", "targeting", "sites", "at", "S", "regions", ".", "Bottom", ",", "percentages", "of", "translocation", "junctions", "between", "Iγ3", "and", "Sμ", "or", "Sα", "regions", "are", "plotted", "as", "mean", "with", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", "in", "the", "bar", "plot", ".", "Data", "information", ":", "For", "panels", "B", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Dunnett", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "was", "used", "for", "significance", "assessment", ".", "For", "all", "panels", ",", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "ns", ",", "p", ">", "0", ".", "05", ".", "(", "C", ")", "AID", "-", "AIDE58Q", "dimer", "proteins", "were", "expressed", "in", "AID", "-", "deficient", "CSR", "-", "activated", "B", "cells", ",", "AID", "dimer", "is", "schematically", "illustrated", "on", "top", "and", "CSR", "levels", "to", "IgG1", "are", "shown", ".", "Three", "biological", "replicates", "are", "plotted", "by", "dots", "and", "mean", "with", "SD", "is", "shown", ".", "Data", "information", ":", "For", "panels", "C", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Dunnett", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "was", "used", "for", "significance", "assessment", ".", "For", "all", "panels", ",", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "ns", ",", "p", ">", "0", ".", "05", ".", "(", "D", ")", "CSR", "levels", "to", "IgA", "in", "Aicda", "-", "/", "-", "CH12F3", "-", "miniS", "cells", "with", "indicated", "AID", "variants", "or", "CRISPR", "-", "guided", "AID", "variants", ".", "Levels", "of", "CSR", "to", "IgA", "are", "plotted", "and", "mean", "with", "SD", "of", "three", "to", "six", "biological", "replicates", ".", "Data", "information", ":", "Unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "performed", "for", "panel", "D", ".", "For", "all", "panels", ",", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "ns", ",", "p", ">", "0", ".", "05", ".", "(", "E", ")", "Mutation", "profiles", "of", "miniS", "region", "in", "Ung", "-", "/", "-", "Msh2", "-", "/", "-", "Aicda", "-", "/", "-", "miniS", "cell", "lines", "complemented", "with", "indicated", "AID", ".", "Mutation", "frequency", "at", "each", "nucleotide", "along", "the", "756", "-", "bp", "miniS", "region", "is", "plotted", "as", "a", "bar", "graph", "with", "green", "error", "bars", ",", "representing", "mean", "with", "standard", "error", "of", "the", "mean", "(", "SEM", ")", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "Positions", "of", "AID", "-", "preferred", "AGCT", "and", "other", "RGYW", "motifs", "are", "marked", "with", "orange", "and", "yellow", "respectively", "under", "each", "plot", ".", "(", "F", ")", "Mutation", "profiles", "of", "miniS", "region", "in", "Ung", "-", "/", "-", "Msh2", "-", "/", "-", "Aicda", "-", "/", "-", "miniS", "cell", "lines", "expressing", "CRISPR", "-", "guided", "AID", "variants", ".", "Mutation", "frequency", "at", "each", "nucleotide", "is", "plotted", "as", "mean", "with", "SEM", "of", "three", "biological", "replicates", "in", "the", "bar", "graph", "with", "green", "error", "bar", ".", "Plots", "are", "labeled", "as", "in", "(", "B", ")", ".", "The", "sgRNA", "targeting", "position", "is", "indicated", "with", "blue", "lines", "at", "the", "bottom", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) CRISPR-guided AID∆C protein could support CSR in Aicda-/- CH12F3 cells. Left, CRISPR-guided AID is schematically illustrated with each component listed. Right, CRISPR-guided AID initiated CSR levels to IgA. Blue arrows represent multiple CRISPR recognition sites. The number in the parentheses indicates CRISPR recognition sites in each S region. Three biological replicates are plotted by dots and mean with standard deviation (SD). Data information: For panels A one-way ANOVA followed by Dunnett's multiple comparisons test was used for significance assessment. For all panels, ****, p<0.0001; ***, p<0.001; **, p<0.01; *, p<0.05; ns, p>0.05.(B) CRISPR-guided AID generated breaks at the S region in Aicda-/- CH12F3 cells were quantitatively detected by PEM-seq. Top, schematic illustration shows the bait SaCas9 site at Iγ3 region and CRISPR-guided AID variants targeting sites at S regions. Bottom, percentages of translocation junctions between Iγ3 and Sμ or Sα regions are plotted as mean with SD of three biological replicates in the bar plot. Data information: For panels B, one-way ANOVA followed by Dunnett's multiple comparisons test was used for significance assessment. For all panels, ****, p<0.0001; ***, p<0.001; **, p<0.01; *, p<0.05; ns, p>0.05.(C) AID-AIDE58Q dimer proteins were expressed in AID-deficient CSR-activated B cells, AID dimer is schematically illustrated on top and CSR levels to IgG1 are shown. Three biological replicates are plotted by dots and mean with SD is shown. Data information: For panels C, one-way ANOVA followed by Dunnett's multiple comparisons test was used for significance assessment. For all panels, ****, p<0.0001; ***, p<0.001; **, p<0.01; *, p<0.05; ns, p>0.05.(D) CSR levels to IgA in Aicda-/- CH12F3-miniS cells with indicated AID variants or CRISPR-guided AID variants. Levels of CSR to IgA are plotted and mean with SD of three to six biological replicates. Data information: Unpaired two-tailed Student's t-test was performed for panel D. For all panels, ****, p<0.0001; ***, p<0.001; **, p<0.01; *, p<0.05; ns, p>0.05.(E) Mutation profiles of miniS region in Ung-/-Msh2-/-Aicda-/- miniS cell lines complemented with indicated AID. Mutation frequency at each nucleotide along the 756-bp miniS region is plotted as a bar graph with green error bars, representing mean with standard error of the mean (SEM) of three biological replicates. Positions of AID-preferred AGCT and other RGYW motifs are marked with orange and yellow respectively under each plot.(F) Mutation profiles of miniS region in Ung-/-Msh2-/-Aicda-/- miniS cell lines expressing CRISPR-guided AID variants. Mutation frequency at each nucleotide is plotted as mean with SEM of three biological replicates in the bar graph with green error bar. Plots are labeled as in (B). The sgRNA targeting position is indicated with blue lines at the bottom."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Representative", "images", "showing", "the", "localization", "of", "AID", "(", "green", ")", ",", "AIDR190X", "(", "green", ")", ",", "and", "endogenous", "IgH", "loci", "(", "red", ")", "in", "nucleofected", "Aicda", "-", "/", "-", "CH12F3", "cells", ".", "The", "IgH", "loci", "are", "visualized", "using", "Sμ", "-", "gRNA", "and", "indicated", "by", "white", "arrows", ".", "An", "illustration", "of", "CRISPR", "-", "Sirius", "IgH", "locus", "visualization", "is", "shown", "on", "top", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "µm", ".", "(", "B", ")", "OptoDroplet", "formation", "in", "CH12F3", "cells", ".", "Schematic", "illustration", "of", "light", "-", "induced", "optoDroplet", "system", "is", "depicted", "on", "top", ".", "AID", "variants", "were", "tagged", "to", "the", "N", "terminus", "of", "the", "optoDroplet", "construct", "and", "blue", "light", "was", "employed", "to", "promote", "the", "formation", "of", "puncta", "three", "times", "followed", "by", "imaging", "each", "time", ".", "Representative", "images", "after", "the", "third", "blue", "light", "activation", "in", "Aicda", "-", "/", "-", "CH12F3", "cells", "with", "the", "indicated", "AID", "variants", "are", "shown", "at", "the", "bottom", ".", "White", "dashed", "line", "and", "green", "line", "depict", "the", "shapes", "of", "nucleus", "and", "nucleolus", "based", "on", "Hoechst", "staining", "or", "GFP", "-", "FBL", ",", "respectively", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "µm", ".", "(", "C", ")", "Representative", "images", "showing", "optoDroplet", "formation", "of", "indicated", "AID", "variants", "in", "HEK293T", "cells", ".", "CRM1", "inhibitor", "(", "CRM1i", ")", "was", "used", "for", "selective", "trapping", "of", "AID", "in", "nuclei", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "µm", ".", "(", "D", ")", "The", "fluorescence", "intensity", "of", "indicated", "AID", "variants", "in", "each", "HEK293T", "cell", "nucleus", "was", "measured", "and", "normalized", "relative", "to", "the", "fluorescence", "intensity", "of", "the", "whole", "cell", ".", "Data", "are", "shown", "as", "box", "plots", ".", "Values", "between", "lower", "quartile", "and", "upper", "quartile", "are", "represented", "by", "box", "ranges", ",", "a", "horizontal", "line", "within", "the", "box", "represents", "the", "median", ",", "and", "whisker", "extends", "from", "the", "minimum", "value", "to", "the", "maximum", "value", ".", "\"", "+", "\"", "indicates", "the", "mean", "level", ".", "Each", "dot", "indicates", "one", "cell", ",", "and", "more", "than", "20", "cells", "represent", "two", "biological", "replicate", "samples", "were", "counted", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Dunnett", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "was", "performed", ".", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ";", "ns", ",", "p", ">", "0", ".", "05", ".", "(", "E", ")", "Intensity", "recovery", "lines", "for", "optoAID", "∆", "C", "droplets", "in", "FRAP", "experiment", "in", "HEK293T", "cells", ".", "Bleaching", "occurs", "at", "t", "=", "0", "s", ".", "The", "background", "-", "subtracted", "fluorescence", "intensities", "are", "normalized", "by", "pre", "-", "bleach", "values", ".", "The", "mean", "with", "SD", "of", "10", "pairs", "of", "optoAIDR190X", "and", "10", "pairs", "of", "optoAIDcry", "is", "shown", ",", "respectively", ".", "(", "F", ")", "Formation", "of", "puncta", "in", "primary", "B", "cells", "complemented", "with", "AID", "-", "FUS", "-", "GFP", "or", "AID", "-", "FUSm", "-", "GFP", ".", "FUSm", "contains", "13", "mutations", "on", "either", "Y", "or", "R", "residue", ".", "Left", ":", "Representative", "images", "showing", "cellular", "localization", "of", "AID", "-", "FUS", "-", "GFP", "and", "AID", "-", "FUSm", "-", "GFP", "with", "and", "without", "CRM1", "inhibitor", "(", "CRM1i", ")", "treatment", "in", "Aicda", "-", "/", "-", "primary", "B", "cells", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "µm", ".", "Right", ":", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "cells", "with", "condensed", "puncta", "(", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "Unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "performed", ".", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "(", "G", ")", "CSR", "levels", "to", "IgG1", "in", "activated", "Aicda", "-", "/", "-", "primary", "B", "cells", "complemented", "with", "the", "indicated", "protein", ".", "Left", ",", "representative", "flow", "cytometry", "plots", "measuring", "CSR", "to", "IgG1", ".", "Co", "-", "expressed", "GFP", "was", "used", "to", "indicate", "the", "infected", "fractions", ".", "Right", ",", "the", "mean", "with", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", "is", "shown", "in", "the", "bar", "plot", ".", "Unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "performed", ".", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Representative images showing the localization of AID (green), AIDR190X (green), and endogenous IgH loci (red) in nucleofected Aicda-/- CH12F3 cells. The IgH loci are visualized using Sμ-gRNA and indicated by white arrows. An illustration of CRISPR-Sirius IgH locus visualization is shown on top. Scale bar, 5 µm.(B) OptoDroplet formation in CH12F3 cells. Schematic illustration of light-induced optoDroplet system is depicted on top. AID variants were tagged to the N terminus of the optoDroplet construct and blue light was employed to promote the formation of puncta three times followed by imaging each time. Representative images after the third blue light activation in Aicda-/- CH12F3 cells with the indicated AID variants are shown at the bottom. White dashed line and green line depict the shapes of nucleus and nucleolus based on Hoechst staining or GFP-FBL, respectively. Scale bar, 5 µm.(C) Representative images showing optoDroplet formation of indicated AID variants in HEK293T cells. CRM1 inhibitor (CRM1i) was used for selective trapping of AID in nuclei. Scale bar, 5 µm.(D) The fluorescence intensity of indicated AID variants in each HEK293T cell nucleus was measured and normalized relative to the fluorescence intensity of the whole cell. Data are shown as box plots. Values between lower quartile and upper quartile are represented by box ranges, a horizontal line within the box represents the median, and whisker extends from the minimum value to the maximum value. \"+\" indicates the mean level. Each dot indicates one cell, and more than 20 cells represent two biological replicate samples were counted. One-way ANOVA followed by Dunnett's multiple comparisons test was performed. ****, p<0.0001; *, p<0.05; ns, p>0.05.(E) Intensity recovery lines for optoAID∆C droplets in FRAP experiment in HEK293T cells. Bleaching occurs at t = 0 s. The background-subtracted fluorescence intensities are normalized by pre-bleach values. The mean with SD of 10 pairs of optoAIDR190X and 10 pairs of optoAIDcry is shown, respectively.(F) Formation of puncta in primary B cells complemented with AID-FUS-GFP or AID-FUSm-GFP. FUSm contains 13 mutations on either Y or R residue. Left: Representative images showing cellular localization of AID-FUS-GFP and AID-FUSm-GFP with and without CRM1 inhibitor (CRM1i) treatment in Aicda-/- primary B cells. Scale bar, 5 µm. Right: Quantification of the number of cells with condensed puncta (3 biological replicates). Unpaired two-tailed Student's t-test was performed. ****, p<0.0001.(G) CSR levels to IgG1 in activated Aicda-/- primary B cells complemented with the indicated protein. Left, representative flow cytometry plots measuring CSR to IgG1. Co-expressed GFP was used to indicate the infected fractions. Right, the mean with SD of three biological replicates is shown in the bar plot. Unpaired two-tailed Student's t-test was performed. ****, p<0.0001."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Representative", "immunofluorescence", "images", "of", "endogenous", "AID", "in", "the", "presence", "of", "ectopically", "-", "expressed", "EV", ",", "AID", ",", "AIDR190X", ",", "or", "AIDcry", "in", "cytokine", "-", "stimulated", "CH12F3", "cells", ".", "EV", ",", "empty", "vector", "control", ".", "An", "antibody", "against", "AID", "C", "terminus", "(", "185", "-", "198", "aa", ")", "detected", "both", "endogenous", "and", "ectopically", "-", "expressed", "full", "-", "length", "AID", ".", "The", "nucleolus", "is", "indicated", "by", "co", "-", "nucleofected", "mCherry", "-", "FBL", ".", "The", "white", "dashed", "line", "depicts", "the", "shape", "of", "the", "nucleus", "based", "on", "Hoechst", "staining", ".", "Arrows", "indicate", "the", "location", "of", "puncta", "formed", "by", "endogenous", "AID", ".", "The", "images", "were", "taken", "by", "the", "N", "-", "SIM", "microscope", "and", "processed", "via", "N", "-", "SIM", "software", ".", "A", "middle", "slice", "of", "the", "images", "was", "shown", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "µm", ".", "(", "B", ")", "Co", "-", "condensation", "of", "AID", "and", "AIDR190X", "in", "the", "nucleus", "of", "CH12F3", "cells", "in", "the", "early", "G1", "phase", ".", "Top", ":", "experimental", "layout", ".", "GFP", "-", "tagged", "wild", "-", "type", "AID", "(", "green", ")", "and", "mCherry", "-", "tagged", "AID", "variants", "(", "red", ")", "were", "co", "-", "nucleofected", "in", "Aicda", "-", "/", "-", "CH12F3", "cells", ".", "The", "resulting", "cells", "were", "arrested", "with", "nocodazole", "for", "12", "hours", "after", "transfection", ".", "Six", "hours", "later", ",", "nocodazole", "was", "removed", "from", "the", "system", "for", "1", ".", "5", "hours", "before", "imaging", ".", "Bottom", "left", ":", "representative", "images", "showing", "subcellular", "localization", "of", "indicated", "AID", "variants", ".", "The", "white", "dashed", "line", "depicts", "the", "shape", "of", "the", "nucleus", "based", "on", "Hoechst", "staining", ".", "The", "white", "arrow", "indicates", "the", "location", "of", "the", "co", "-", "condensed", "puncta", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "µm", ".", "Bottom", "right", ":", "plot", "profiles", "of", "the", "images", ".", "Cyto", ":", "cytoplasm", ",", "Nuc", ":", "nucleus", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "the", "relative", "fluorescence", "intensity", "of", "AID", "-", "GFP", "in", "the", "diluted", "phase", "of", "cells", "shown", "in", "(", "B", ")", ".", "The", "fluorescence", "intensity", "of", "AID", "-", "GFP", "in", "the", "diluted", "nuclear", "phase", "was", "normalized", "by", "the", "total", "intensity", "from", "the", "whole", "cell", ".", "Data", "are", "shown", "as", "box", "plots", ".", "Values", "between", "lower", "quartile", "and", "upper", "quartile", "are", "represented", "by", "box", "ranges", ",", "a", "horizontal", "line", "within", "the", "box", "represents", "the", "median", ",", "and", "whisker", "extends", "from", "the", "minimum", "value", "to", "the", "maximum", "value", ".", "\"", "+", "\"", "indicates", "the", "mean", "level", ".", "Each", "dot", "indicates", "one", "cell", "(", "n", "=", "25", ")", ",", "and", "representative", "result", "from", "three", "biological", "replicates", "were", "shown", ".", "Unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "performed", ".", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "(", "D", ")", "Dynamics", "of", "trapping", "of", "wild", "-", "type", "AID", "in", "optoAIDR190X", "condensates", ".", "Top", ",", "representative", "fluorescence", "images", "at", "different", "time", "points", ".", "Dashed", "circles", "indicate", "the", "co", "-", "condensed", "puncta", "formation", "of", "AID", "-", "GFP", ".", "Scale", "bar", ",", "5", "µm", ".", "Bottom", ",", "a", "summary", "of", "12", "observed", "cells", "is", "shown", "as", "mean", "±", "SD", "in", "a", "bar", "graph", ".", "Percentages", "of", "optoAIDR190X", "puncta", "with", "trapped", "wild", "-", "type", "AID", "are", "plotted", "for", "the", "second", "and", "third", "blue", "-", "light", "activations", ",", "and", "the", "colored", "dot", "indicates", "one", "cell", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Representative immunofluorescence images of endogenous AID in the presence of ectopically-expressed EV, AID, AIDR190X, or AIDcry in cytokine-stimulated CH12F3 cells. EV, empty vector control. An antibody against AID C terminus (185-198 aa) detected both endogenous and ectopically-expressed full-length AID. The nucleolus is indicated by co-nucleofected mCherry-FBL. The white dashed line depicts the shape of the nucleus based on Hoechst staining. Arrows indicate the location of puncta formed by endogenous AID. The images were taken by the N-SIM microscope and processed via N-SIM software. A middle slice of the images was shown. Scale bar, 5 µm.(B) Co-condensation of AID and AIDR190X in the nucleus of CH12F3 cells in the early G1 phase. Top: experimental layout. GFP-tagged wild-type AID (green) and mCherry-tagged AID variants (red) were co-nucleofected in Aicda-/- CH12F3 cells. The resulting cells were arrested with nocodazole for 12 hours after transfection. Six hours later, nocodazole was removed from the system for 1.5 hours before imaging. Bottom left: representative images showing subcellular localization of indicated AID variants. The white dashed line depicts the shape of the nucleus based on Hoechst staining. The white arrow indicates the location of the co-condensed puncta. Scale bar, 5 µm. Bottom right: plot profiles of the images. Cyto: cytoplasm, Nuc: nucleus.(C) Quantification of the relative fluorescence intensity of AID-GFP in the diluted phase of cells shown in (B). The fluorescence intensity of AID-GFP in the diluted nuclear phase was normalized by the total intensity from the whole cell. Data are shown as box plots. Values between lower quartile and upper quartile are represented by box ranges, a horizontal line within the box represents the median, and whisker extends from the minimum value to the maximum value. \"+\" indicates the mean level. Each dot indicates one cell (n = 25), and representative result from three biological replicates were shown. Unpaired two-tailed Student's t-test was performed. ****, p<0.0001.(D) Dynamics of trapping of wild-type AID in optoAIDR190X condensates. Top, representative fluorescence images at different time points. Dashed circles indicate the co-condensed puncta formation of AID-GFP. Scale bar, 5 µm. Bottom, a summary of 12 observed cells is shown as mean ±SD in a bar graph. Percentages of optoAIDR190X puncta with trapped wild-type AID are plotted for the second and third blue-light activations, and the colored dot indicates one cell."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "B", ")", "The", "optoDroplet", "formation", "of", "indicated", "AID", "mutants", "along", "with", "light", "stimulation", ".", "Top", ",", "the", "procedure", "of", "optoDroplet", "assay", "is", "illustrated", "with", "indicated", "light", "stimulation", "(", "blue", "arrow", ")", "and", "image", "acquisition", "(", "black", "arrow", ")", "time", "points", ".", "Bottom", ",", "line", "plots", "show", "quantification", "of", "cells", "with", "optoDroplet", "formation", "as", "mean", "±", "SD", "at", "each", "acquisition", "time", "point", ".", "The", "total", "acquired", "cell", "numbers", "of", "each", "genotype", "are", "indicated", "in", "parentheses", ".", "Significance", "assessment", "between", "AIDR190X", "and", "AIDR190X", "-", "4R", "was", "shown", "at", "each", "time", "point", ".", "Unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "performed", ".", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "(", "C", ")", "CSR", "levels", "of", "ectopically", "-", "expressed", "AID", "variants", "in", "AID", "-", "proficient", "CH12F3", "cells", ".", "Left", ",", "representative", "flow", "cytometry", "plots", "of", "CSR", "to", "IgA", ".", "Co", "-", "expressed", "GFP", "indicates", "the", "infected", "cell", "fractions", ".", "Right", ",", "the", "CSR", "mean", "with", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", "is", "shown", "in", "the", "bar", "plot", ".", "(", "D", ")", "CSR", "levels", "of", "ectopically", "-", "expressed", "AID", "variants", "in", "CSR", "-", "activated", "B", "cells", ".", "Left", ",", "representative", "flow", "cytometry", "plots", "of", "CSR", "to", "IgG1", ".", "Right", ",", "the", "bar", "plot", "shows", "the", "CSR", "mean", "with", "SD", "of", "four", "biological", "replicates", ".", "Data", "information", ":", "One", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Dunnett", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "was", "performed", "for", "(", "C", ")", "and", "(", "D", ")", ".", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(B) The optoDroplet formation of indicated AID mutants along with light stimulation. Top, the procedure of optoDroplet assay is illustrated with indicated light stimulation (blue arrow) and image acquisition (black arrow) time points. Bottom, line plots show quantification of cells with optoDroplet formation as mean ± SD at each acquisition time point. The total acquired cell numbers of each genotype are indicated in parentheses. Significance assessment between AIDR190X and AIDR190X-4R was shown at each time point. Unpaired two-tailed Student's t-test was performed. ****, p<0.0001.(C) CSR levels of ectopically-expressed AID variants in AID-proficient CH12F3 cells. Left, representative flow cytometry plots of CSR to IgA. Co-expressed GFP indicates the infected cell fractions. Right, the CSR mean with SD of three biological replicates is shown in the bar plot. (D) CSR levels of ectopically-expressed AID variants in CSR-activated B cells. Left, representative flow cytometry plots of CSR to IgG1. Right, the bar plot shows the CSR mean with SD of four biological replicates. Data information: One-way ANOVA followed by Dunnett's multiple comparisons test was performed for (C) and (D). ***, p<0.001; **, p<0.01; *, p<0.05."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Left", ",", "representative", "images", "of", "MBP", "-", "GFP", "-", "AID", "in", "the", "presence", "of", "10", "%", "PEG8000", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", "and", "2", "µm", ",", "respectively", ".", "Right", ",", "the", "schematic", "protein", "sequences", ".", "(", "B", ")", "Left", ",", "representative", "images", "of", "MBP", "-", "GFP", "-", "AIDcry", "+", "CTT", "or", "MBP", "-", "GFP", "-", "AIDcry", "in", "the", "presence", "10", "%", "PEG8000", "at", "the", "indicated", "protein", "concentrations", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "Right", ",", "sizes", "of", "MBP", "-", "GFP", "-", "AIDcry", "+", "CTT", "or", "MBP", "-", "GFP", "-", "AIDcry", "protein", "condensates", "are", "plotted", "as", "box", "plots", "with", "three", "technical", "replicates", ".", "The", "box", "represents", "values", "between", "the", "lower", "quartile", "and", "the", "upper", "quartile", ",", "a", "horizontal", "line", "within", "the", "box", "represents", "the", "median", ",", "and", "whisker", "extends", "from", "the", "minimum", "value", "to", "the", "maximum", "value", ".", "All", "points", "are", "listed", "and", "mean", "is", "indicated", "by", "\"", "+", "\"", ".", "Unpaired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "performed", ".", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Left, representative images of MBP-GFP-AID in the presence of 10% PEG8000. Scale bar, 10 µm and 2 µm, respectively. Right, the schematic protein sequences.(B) Left, representative images of MBP-GFP-AIDcry+CTT or MBP-GFP-AIDcry in the presence 10% PEG8000 at the indicated protein concentrations. Scale bar, 10 µm. Right, sizes of MBP-GFP-AIDcry+CTT or MBP-GFP-AIDcry protein condensates are plotted as box plots with three technical replicates. The box represents values between the lower quartile and the upper quartile, a horizontal line within the box represents the median, and whisker extends from the minimum value to the maximum value. All points are listed and mean is indicated by \"+\". Unpaired two-tailed Student's t-test was performed. ****, p<0.0001."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "AID", "deamination", "assay", "was", "performed", "in", "vitro", ".", "Left", ",", "a", "schematic", "diagram", "of", "deamination", "activity", "assay", ".", "Right", ",", "the", "deamination", "reaction", "with", "indicated", "protein", "combinations", "was", "processed", "and", "visualized", ".", "\"", "+", "\"", ":", "0", ".", "25", "μM", "of", "indicated", "protein", ";", "\"", "+", "+", "\"", ":", "0", ".", "5", "μM", "of", "indicated", "protein", ";", "\"", "-", "\"", ":", "not", "added", ".", "(", "B", ")", "CSR", "to", "IgA", "induced", "by", "AID", "variants", "in", "CH12F3", "cells", ".", "Left", ",", "representative", "flow", "cytometry", "plots", ".", "Right", ",", "the", "CSR", "mean", "with", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", "is", "shown", "in", "the", "bar", "plot", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Dunnett", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "was", "performed", ".", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "(", "C", ")", "Representative", "images", "of", "the", "co", "-", "condensation", "of", "MBP", "-", "mCherry", "-", "AIDcry", "and", "MBP", "-", "GFP", "-", "AID", ".", "The", "protein", "concentrations", "and", "molecular", "ratios", "are", "indicated", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) AID deamination assay was performed in vitro. Left, a schematic diagram of deamination activity assay. Right, the deamination reaction with indicated protein combinations was processed and visualized. \"+\": 0.25 μM of indicated protein; \"++\": 0.5 μM of indicated protein; \"-\": not added.(B) CSR to IgA induced by AID variants in CH12F3 cells. Left, representative flow cytometry plots. Right, the CSR mean with SD of three biological replicates is shown in the bar plot. One-way ANOVA followed by Dunnett's multiple comparisons test was performed. ***, p<0.001; **, p<0.01.(C) Representative images of the co-condensation of MBP-mCherry-AIDcry and MBP-GFP-AID. The protein concentrations and molecular ratios are indicated. Scale bar, 10 µm."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "C", ")", "Immunocytochemistry", "showing", "post", "-", "synaptic", "marker", "PSD", "-", "95", "(", "red", ")", ",", "pre", "-", "synaptic", "marker", "Synapsin", "-", "I", "(", "green", ")", ",", "dendritic", "marker", "Map2", "(", "blue", ")", "and", "co", "-", "localization", "of", "PSD", "-", "95", "and", "Synapsin", "-", "I", "from", "dissociated", "Nedd4", "-", "2", "WT", "or", "Nedd4", "-", "2", "cKO", "hippocampal", "neurons", "at", "DIV", "16", ".", "Representative", "secondary", "dendrites", "(", "left", ")", "and", "quantification", "of", "colocalized", "synaptic", "puncta", "number", "and", "area", "(", "right", ")", "(", "n", "=", "36", "for", "Nedd4", "-", "2", "WT", "and", "Nedd4", "-", "2", "cKO", "neurons", ")", "are", "shown", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "µm", ".", "(", "F", ")", "A", "train", "of", "high", "frequency", "stimulation", "(", "HFS", ";", "100", "Hz", "for", "1s", ")", "induced", "early", "-", "phase", "LTP", "(", "E", "-", "LTP", ")", "at", "Schaffer", "collateral", "synapses", "in", "Nedd4", "-", "2", "WT", "(", "n", "=", "7", "slices", "from", "6", "mice", ")", "and", "Nedd4", "-", "2", "cKO", "(", "n", "=", "6", "slices", "from", "5", "mice", ")", "mice", ".", "Representative", "fEPSP", "traces", "were", "recorded", "before", "and", "60", "min", "after", "LTP", "induction", "(", "Scale", "bars", ":", "0", ".", "5", "mV", ",", "5", "ms", ")", ".", "Summary", "bar", "graphs", "showing", "the", "fEPSP", "slopes", "measured", "50", "-", "60", "min", "after", "a", "HFS", "at", "Schaffer", "collateral", "synapses", "was", "on", "the", "right", ".", "(", "G", ")", "Late", "-", "phase", "LTP", "(", "L", "-", "LTP", ")", "induced", "by", "four", "trains", "of", "HFS", "in", "Nedd4", "-", "2", "WT", "slices", "(", "n", "=", "7", "slices", "from", "7", "mice", ")", "and", "Nedd4", "-", "2", "cKO", "slices", "(", "n", "=", "9", "slices", "from", "8", "mice", ")", ".", "Representative", "fEPSP", "traces", "were", "recorded", "before", "and", "180", "min", "after", "LTP", "induction", "(", "Scale", "bars", ":", "0", ".", "5", "mV", ",", "5", "ms", ")", ".", "Summary", "bar", "graphs", "showing", "the", "fEPSP", "slopes", "measured", "160", "-", "180", "min", "after", "L", "-", "LTP", "induction", "at", "Schaffer", "collateral", "synapses", "was", "on", "the", "right", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(C) Immunocytochemistry showing post-synaptic marker PSD-95 (red), pre-synaptic marker Synapsin-I (green), dendritic marker Map2 (blue) and co-localization of PSD-95 and Synapsin-I from dissociated Nedd4-2 WT or Nedd4-2 cKO hippocampal neurons at DIV 16. Representative secondary dendrites (left) and quantification of colocalized synaptic puncta number and area (right) (n = 36 for Nedd4-2 WT and Nedd4-2 cKO neurons) are shown. Scale bar: 5 µm.(F) A train of high frequency stimulation (HFS; 100 Hz for 1s) induced early-phase LTP (E-LTP) at Schaffer collateral synapses in Nedd4-2 WT (n = 7 slices from 6 mice) and Nedd4-2 cKO (n = 6 slices from 5 mice) mice. Representative fEPSP traces were recorded before and 60 min after LTP induction (Scale bars: 0.5 mV, 5 ms). Summary bar graphs showing the fEPSP slopes measured 50-60 min after a HFS at Schaffer collateral synapses was on the right. (G) Late-phase LTP (L-LTP) induced by four trains of HFS in Nedd4-2 WT slices (n = 7 slices from 7 mice) and Nedd4-2 cKO slices (n = 9 slices from 8 mice). Representative fEPSP traces were recorded before and 180 min after LTP induction (Scale bars: 0.5 mV, 5 ms). Summary bar graphs showing the fEPSP slopes measured 160-180 min after L-LTP induction at Schaffer collateral synapses was on the right. "}
{"words": ["Figure", "2", "(", "B", ")", "Barnes", "maze", "test", "from", "Nedd4", "-", "2", "WT", "(", "n", "=", "8", ")", "or", "Nedd4", "-", "2", "cKO", "(", "n", "=", "8", ")", "mice", "(", "6", "-", "8", "weeks", "old", ")", ".", "Schematic", "representation", "of", "Barnes", "maze", "(", "top", "left", ")", ".", "Mice", "were", "trained", "for", "4", "days", "with", "three", "training", "trials", "on", "each", "day", "to", "locate", "the", "escape", "box", "(", "black", "circle", ")", ".", "Learning", "curve", "during", "4", "training", "days", "was", "shown", "by", "the", "escape", "latency", "and", "the", "number", "of", "errors", "before", "escaping", "(", "top", "right", ")", ".", "Schematic", "representation", "of", "Barnes", "maze", "on", "probe", "trials", "(", "bottom", "left", ")", ".", "Quadrant", "occupancy", "on", "probe", "trial", "at", "day5", "and", "at", "day12", "(", "bottom", "right", ")", "were", "assessed", "by", "the", "time", "spent", "in", "the", "target", "area", "(", "green", "quadrant", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(B) Barnes maze test from Nedd4-2 WT (n = 8) or Nedd4-2 cKO (n = 8) mice (6-8 weeks old). Schematic representation of Barnes maze (top left). Mice were trained for 4 days with three training trials on each day to locate the escape box (black circle). Learning curve during 4 training days was shown by the escape latency and the number of errors before escaping (top right). Schematic representation of Barnes maze on probe trials (bottom left). Quadrant occupancy on probe trial at day5 and at day12 (bottom right) were assessed by the time spent in the target area (green quadrant)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", ")", "Western", "blots", "of", "F", "-", "actin", "to", "G", "-", "actin", "ratio", "with", "or", "without", "cLTP", "induction", "from", "Nedd4", "-", "2", "WT", "or", "Nedd4", "-", "2", "cKO", "cultured", "neurons", ".", "Schematic", "representation", "of", "the", "experimental", "design", "for", "cLTP", "inductions", "(", "top", "left", ")", ".", "Representative", "western", "blots", "(", "bottom", "left", ")", "and", "quantification", "of", "F", "-", "actin", "to", "G", "-", "actin", "from", "Nedd4", "-", "2", "WT", "or", "Nedd4", "-", "2", "cKO", "(", "right", ")", "cultures", "after", "cLTP", "induction", "and", "recovery", "in", "normal", "aCSF", "for", "10", "or", "30", "min", "before", "lysis", "(", "n", "=", "11", "and", "8", "for", "Nedd4", "-", "2", "WT", "and", "Nedd4", "-", "2", "cKO", "cultures", ",", "respectively", ")", ".", "For", "quantification", ",", "data", "from", "cLTP", "induction", "were", "normalized", "to", "data", "from", "control", "(", "CTL", ")", "condition", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(B) Western blots of F-actin to G-actin ratio with or without cLTP induction from Nedd4-2 WT or Nedd4-2 cKO cultured neurons. Schematic representation of the experimental design for cLTP inductions (top left). Representative western blots (bottom left) and quantification of F-actin to G-actin from Nedd4-2 WT or Nedd4-2 cKO (right) cultures after cLTP induction and recovery in normal aCSF for 10 or 30 min before lysis (n = 11 and 8 for Nedd4-2 WT and Nedd4-2 cKO cultures, respectively). For quantification, data from cLTP induction were normalized to data from control (CTL) condition."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Western", "blots", "of", "Nedd4", "-", "2", ",", "total", "cofilin", ",", "phospho", "(", "p", ")", "-", "cofilin", "and", "GAPDH", "from", "Nedd4", "-", "2", "WT", "or", "Nedd4", "-", "2", "cKO", "forebrains", "at", "postnatal", "day", "14", ".", "Representative", "western", "blots", "and", "quantification", "of", "total", "cofilin", "relative", "to", "GAPDH", "and", "p", "-", "cofilin", "relative", "to", "total", "cofilin", "(", "n", "=", "6", "for", "Nedd4", "-", "2", "WT", "and", "Nedd4", "-", "2", "cKO", "brains", ")", "were", "shown", ".", "(", "B", ")", "Immunocytochemistry", "of", "cofilin", ",", "p", "-", "cofilin", "and", "dendritic", "marker", "MAP2", "from", "Nedd4", "-", "2", "WT", "or", "Nedd4", "-", "2", "cKO", "cultured", "hippocampal", "neurons", "at", "DIV", "16", ".", "Representative", "dendrites", "of", "Nedd4", "-", "2", "WT", "and", "Nedd4", "-", "2", "cKO", "neurons", "and", "quantification", "of", "total", "cofilin", "relative", "to", "MAP2", "and", "p", "-", "cofilin", "relative", "to", "total", "cofilin", "are", "shown", "(", "n", "=", "25", "and", "26", "for", "Nedd4", "-", "2", "WT", "and", "Nedd4", "-", "2", "cKO", "neurons", ",", "respectively", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "µm", ".", "(", "C", ")", "Immunocytochemistry", "showing", "cofilin", ",", "p", "-", "cofilin", ",", "and", "dendritic", "marker", "MAP2", "from", "Nedd4", "-", "2", "WT", "or", "Nedd4", "-", "2", "cKO", "cultured", "hippocampal", "neurons", "induced", "with", "or", "without", "cLTP", "at", "DIV", "16", ".", "Representative", "dendrites", "and", "quantification", "from", "Nedd4", "-", "2", "WT", "or", "Nedd4", "-", "2", "cKO", "cultures", "are", "shown", "(", "n", "=", "36", "-", "39", "neurons", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "µm", ".", "For", "quantification", ",", "data", "from", "cLTP", "induction", "were", "normalized", "to", "data", "from", "control", "(", "CTL", ")", "condition", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Western blots of Nedd4-2, total cofilin, phospho (p)-cofilin and GAPDH from Nedd4-2 WT or Nedd4-2 cKO forebrains at postnatal day 14. Representative western blots and quantification of total cofilin relative to GAPDH and p-cofilin relative to total cofilin (n = 6 for Nedd4-2 WT and Nedd4-2 cKO brains) were shown.(B) Immunocytochemistry of cofilin, p-cofilin and dendritic marker MAP2 from Nedd4-2 WT or Nedd4-2 cKO cultured hippocampal neurons at DIV 16. Representative dendrites of Nedd4-2 WT and Nedd4-2 cKO neurons and quantification of total cofilin relative to MAP2 and p-cofilin relative to total cofilin are shown (n = 25 and 26 for Nedd4-2 WT and Nedd4-2 cKO neurons, respectively). Scale bar: 5 µm.(C) Immunocytochemistry showing cofilin, p-cofilin, and dendritic marker MAP2 from Nedd4-2 WT or Nedd4-2 cKO cultured hippocampal neurons induced with or without cLTP at DIV 16. Representative dendrites and quantification from Nedd4-2 WT or Nedd4-2 cKO cultures are shown (n = 36-39 neurons). Scale bar: 5 µm. For quantification, data from cLTP induction were normalized to data from control (CTL) condition."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Immunocytochemistry", "showing", "post", "-", "synaptic", "marker", "PSD", "-", "95", "(", "red", ")", ",", "pre", "-", "synaptic", "marker", "Synapsin", "-", "I", "(", "green", ")", ",", "dendritic", "marker", "Map2", "(", "blue", ")", "and", "co", "-", "localization", "of", "PSD", "-", "95", "and", "Synapsin", "-", "I", "from", "Nedd4", "-", "2", "WT", "or", "Nedd4", "-", "2", "cKO", "cultured", "hippocampal", "neurons", "at", "DIV", "16", "treated", "with", "TAT", ",", "TAT", "-", "S3", ",", "or", "TAT", "-", "pS3", "peptide", "for", "12", "hrs", "(", "10", "μM", ")", ".", "Representative", "secondary", "dendrites", "of", "Nedd4", "-", "2", "WT", "(", "top", "left", ")", "and", "Nedd4", "-", "2", "cKO", "(", "bottom", "left", ")", "neurons", "are", "shown", ".", "Quantification", "of", "colocalized", "synaptic", "puncta", "number", "and", "synaptic", "puncta", "area", "for", "Nedd4", "-", "2", "WT", "(", "top", "right", ")", "and", "Nedd4", "-", "2", "cKO", "(", "bottom", "right", ")", "neurons", "is", "on", "the", "right", "(", "n", "=", "32", "-", "36", "neurons", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "µm", ".", "(", "B", ")", "Patch", "-", "clamp", "recordings", "from", "Nedd4", "-", "2", "WT", "or", "Nedd4", "-", "2", "cKO", "hippocampal", "neurons", "treated", "with", "TAT", ",", "TAT", "-", "S3", ",", "or", "TAT", "-", "pS3", "peptide", "for", "12", "hrs", "(", "10", "μM", ")", "at", "DIV", "14", "-", "17", ".", "Representative", "mEPSC", "traces", "from", "Nedd4", "-", "2", "WT", "(", "top", "left", ")", "and", "Nedd4", "-", "2", "cKO", "(", "bottom", "left", ")", "are", "shown", ".", "Quantification", "of", "mEPSC", "amplitude", "and", "frequency", "from", "Nedd4", "-", "2", "WT", "(", "top", "right", ")", "and", "Nedd4", "-", "2", "cKO", "(", "bottom", "right", ")", "neurons", "are", "shown", "(", "n", "=", "22", "-", "24", "neurons", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Immunocytochemistry showing post-synaptic marker PSD-95 (red), pre-synaptic marker Synapsin-I (green), dendritic marker Map2 (blue) and co-localization of PSD-95 and Synapsin-I from Nedd4-2 WT or Nedd4-2 cKO cultured hippocampal neurons at DIV 16 treated with TAT, TAT-S3, or TAT-pS3 peptide for 12 hrs (10 μM). Representative secondary dendrites of Nedd4-2 WT (top left) and Nedd4-2 cKO (bottom left) neurons are shown. Quantification of colocalized synaptic puncta number and synaptic puncta area for Nedd4-2 WT (top right) and Nedd4-2 cKO (bottom right) neurons is on the right (n = 32-36 neurons). Scale bar: 5 µm.(B) Patch-clamp recordings from Nedd4-2 WT or Nedd4-2 cKO hippocampal neurons treated with TAT, TAT-S3, or TAT-pS3 peptide for 12 hrs (10 μM) at DIV 14-17. Representative mEPSC traces from Nedd4-2 WT (top left) and Nedd4-2 cKO (bottom left) are shown. Quantification of mEPSC amplitude and frequency from Nedd4-2 WT (top right) and Nedd4-2 cKO (bottom right) neurons are shown (n = 22-24 neurons)."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "C", ")", "Barnes", "maze", "test", "after", "intraperitoneally", "injecting", "TAT", "(", "n", "=", "8", ")", "or", "TAT", "-", "pS3", "(", "n", "=", "8", ")", "peptide", "in", "Nedd4", "-", "2", "WT", "mice", "(", "top", ")", ",", "or", "TAT", "(", "n", "=", "9", ")", "or", "TAT", "-", "pS3", "(", "n", "=", "8", ")", "peptides", "in", "Nedd4", "-", "2", "cKO", "mice", "(", "bottom", ")", ".", "Learning", "curve", "during", "4", "training", "days", "of", "Barnes", "maze", "task", "showing", "the", "escape", "latency", ",", "number", "of", "errors", "before", "escaping", ",", "and", "the", "quadrant", "occupancy", "on", "probe", "trial", "at", "day", "5", "and", "at", "day", "12", "were", "assessed", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(C) Barnes maze test after intraperitoneally injecting TAT (n = 8) or TAT-pS3 (n = 8) peptide in Nedd4-2 WT mice (top), or TAT (n = 9) or TAT-pS3 (n = 8) peptides in Nedd4-2 cKO mice (bottom). Learning curve during 4 training days of Barnes maze task showing the escape latency, number of errors before escaping, and the quadrant occupancy on probe trial at day 5 and at day 12 were assessed."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "membrane", "fractions", "of", "HEK293", "Flp", "-", "In", "cells", "stably", "overexpressing", "both", "mouse", "TREM2", "and", "mouse", "DAP12", "upon", "treatment", "with", "4D9", "antibody", "reveals", "increased", "levels", "of", "membrane", "-", "bound", "TREM2", "similar", "to", "what", "can", "be", "achieved", "by", "ADAM", "protease", "inhibition", "using", "the", "GM6001", "inhibitor", ".", "An", "isotype", "antibody", "was", "used", "as", "a", "negative", "control", ".", "Calnexin", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "Levels", "of", "membrane", "-", "bound", "TREM2", "were", "quantified", "by", "MSD", "ELISA", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", ",", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", ";", "p", "(", "DMSO", "vs", "GM", ")", "=", "0", ".", "0011", ";", "p", "(", "DMSO", "vs", "isotype", ")", "=", "0", ".", "992", ";", "p", "(", "isotype", "vs", "4D9", ")", "=", "0", ".", "0005", ";", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ".", "(", "C", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "conditioned", "media", "from", "HEK293", "Flp", "-", "In", "cells", "stably", "overexpressing", "both", "mouse", "TREM2", "and", "mouse", "DAP12", "upon", "treatment", "with", "4D9", "antibody", "reveals", "decreased", "levels", "of", "sTREM2", "similar", "to", "what", "can", "be", "achieved", "by", "ADAM", "protease", "inhibition", "using", "the", "GM6001", "inhibitor", ".", "An", "isotype", "antibody", "was", "used", "as", "a", "negative", "control", ".", "sAPPα", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "Note", "that", "heavy", "and", "light", "chains", "of", "the", "antibodies", "used", "for", "treatment", "are", "also", "detected", "and", "annotated", ".", "Levels", "of", "sTREM2", "were", "quantified", "by", "MSD", "ELISA", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", ",", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", ";", "p", "(", "DMSO", "vs", "GM", ")", "<", "0", ".", "0001", ";", "p", "(", "DMSO", "vs", "isotype", ")", "=", "0", ".", "6372", ";", "p", "(", "isotype", "vs", "4D9", ")", "<", "0", ".", "0001", ";", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ".", "(", "D", ")", "4D9", "antibody", "selectively", "detects", "TREM2", "on", "the", "cell", "surface", "of", "HEK293", "Flp", "-", "In", "cells", "stably", "overexpressing", "mouse", "TREM2", "and", "mouse", "DAP12", ".", "An", "anti", "-", "HA", "antibody", "was", "used", "as", "a", "positive", "control", "while", "empty", "vector", "transfected", "HEK293", "Flp", "-", "In", "cells", "were", "used", "as", "a", "negative", "control", ".", "Scale", "bar", "=", "10µm", ".", "(", "F", ")", "Sequence", "comparison", "of", "mouse", "TREM2", "and", "human", "TREM2", "shows", "substantial", "sequence", "conservation", "around", "the", "4D9", "epitope", "(", "upper", "panel", ")", ".", "Immunoblot", "analysis", "demonstrates", "that", "antibody", "4D9", "is", "highly", "specific", "for", "mouse", "TREM2", "and", "does", "not", "detect", "human", "TREM2", "or", "mouse", "TREM1", "(", "lower", "panel", ")", ".", "(", "G", ")", "4D9", "binding", "to", "mouse", "TREM2", "ECD", "is", "competed", "off", "by", "a", "stalk", "region", "peptide", ".", "A", "competition", "ELISA", "demonstrates", "that", "a", "dose", "titration", "of", "stalk", "peptide", "reduces", "binding", "of", "4D9", "to", "TREM2", "ECD", "with", "an", "EC50", "of", "1", ".", "3uM", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "H", ")", "Surface", "plasmon", "resonance", "binding", "kinetics", "of", "increasing", "concentrations", "of", "4D9", "antibody", "to", "mouse", "TREM2", "ectodomain", "evaluated", "by", "BIAcore", ",", "Kon", "=", "5", ".", "9", "x", "105", "M", "-", "1s", "-", "1", ",", "Koff", "=", "4", ".", "0", "x", "10", "-", "5", "s", "-", "1", ",", "KD", "=", "68", "pM", ".", "4D9", "binding", "to", "human", "TREM2", "or", "mouse", "TREM1", "was", "undetectable", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B) Immunoblot analysis of membrane fractions of HEK293 Flp-In cells stably overexpressing both mouse TREM2 and mouse DAP12 upon treatment with 4D9 antibody reveals increased levels of membrane-bound TREM2 similar to what can be achieved by ADAM protease inhibition using the GM6001 inhibitor. An isotype antibody was used as a negative control. Calnexin served as a loading control. Levels of membrane-bound TREM2 were quantified by MSD ELISA. Data represent the mean ± SEM (n=3). One-way ANOVA, Tukey's post hoc test; p (DMSO vs GM) = 0.0011; p (DMSO vs isotype) = 0.992; p (isotype vs 4D9) = 0.0005; n.s., not significant.(C) Immunoblot analysis of conditioned media from HEK293 Flp-In cells stably overexpressing both mouse TREM2 and mouse DAP12 upon treatment with 4D9 antibody reveals decreased levels of sTREM2 similar to what can be achieved by ADAM protease inhibition using the GM6001 inhibitor. An isotype antibody was used as a negative control. sAPPα served as a loading control. Note that heavy and light chains of the antibodies used for treatment are also detected and annotated. Levels of sTREM2 were quantified by MSD ELISA. Data represent the mean ± SEM (n=3). One-way ANOVA, Tukey's post hoc test; p (DMSO vs GM) < 0.0001; p (DMSO vs isotype) = 0.6372; p (isotype vs 4D9) < 0.0001; n.s., not significant.(D) 4D9 antibody selectively detects TREM2 on the cell surface of HEK293 Flp-In cells stably overexpressing mouse TREM2 and mouse DAP12. An anti-HA antibody was used as a positive control while empty vector transfected HEK293 Flp-In cells were used as a negative control. Scale bar= 10µm.(F) Sequence comparison of mouse TREM2 and human TREM2 shows substantial sequence conservation around the 4D9 epitope (upper panel). Immunoblot analysis demonstrates that antibody 4D9 is highly specific for mouse TREM2 and does not detect human TREM2 or mouse TREM1 (lower panel).(G) 4D9 binding to mouse TREM2 ECD is competed off by a stalk region peptide. A competition ELISA demonstrates that a dose titration of stalk peptide reduces binding of 4D9 to TREM2 ECD with an EC50 of 1.3uM. Data represent the mean ± SEM (n=3).(H) Surface plasmon resonance binding kinetics of increasing concentrations of 4D9 antibody to mouse TREM2 ectodomain evaluated by BIAcore, Kon = 5.9 x 105 M-1s-1, Koff = 4.0 x 10-5 s-1, KD = 68 pM. 4D9 binding to human TREM2 or mouse TREM1 was undetectable."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Flow", "cytometry", "dose", "response", "curve", "for", "cell", "binding", "of", "4D9", "mAb", "(", "EC50", "=", "0", ".", "29nM", ")", ",", "4D9", "Fab", "(", "EC50", "=", "0", ".", "17nM", ")", ",", "and", "isotype", "to", "HEK", "cells", "stably", "overexpressing", "mouse", "TREM2", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "2", ")", ".", "(", "B", ")", "In", "vitro", "ADAM17", "sheddase", "activity", "is", "blocked", "by", "4D9", "-", "effectorless", "mAb", "and", "4D9", "Fab", "fragment", "but", "not", "an", "isotype", "control", ".", "Fluorescence", "polarization", "of", "FAM", "conjugated", "TREM2", "stalk", "peptide", "was", "detected", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "ADAM17", "and", "4D9", "mAb", ",", "4D9", "Fab", "and", "isotype", "control", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", ",", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", ";", "p", "(", "4D9", "Fab", "vs", "4D9", "mAb", ")", "=", "0", ".", "8855", ";", "p", "(", "4D9", "Fab", "vs", "uncleaved", ")", "<", "0", ".", "0001", ";", "p", "(", "4D9", "mAb", "vs", "uncleaved", ")", "<", "0", ".", "0001", ";", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ".", "(", "C", ")", "ELISA", "-", "mediated", "quantification", "of", "sTREM2", "in", "conditioned", "media", "from", "(", "D", ")", "AlphaLISA", "-", "mediated", "quantification", "of", "pSYK", "levels", "in", "HEK293", "Flp", "-", "In", "cells", "stably", "overexpressing", "mouse", "TREM2", "and", "mouse", "DAP12", "treated", "with", "a", "dose", "titration", "of", "4D9", "mAb", ",", "4D9", "Fab", "or", "isotype", "for", "5", "minutes", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "E", ")", "AlphaLISA", "-", "mediated", "quantification", "of", "pSYK", "levels", "in", "HEK293", "Flp", "-", "In", "cells", "stably", "overexpressing", "mouse", "TREM2", "and", "mouse", "DAP12", "or", "empty", "vector", "treated", "with", "1mg", "/", "ml", "POPC", "/", "POPS", "liposomes", "and", "20µg", "/", "ml", "4D9", "mAb", ",", "4D9", "Fab", "or", "isotype", "for", "5", "minutes", ".", "pSYK", "levels", "were", "also", "determined", "for", "cells", "treated", "with", "liposomes", "only", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Two", "-", "way", "ANOVA", ",", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", "(", "cell", "line", "effect", ":", "F1", ",", "16", "=", "365", ".", "7", ",", "p", "=", "<", "0", ".", "0001", ";", "treatment", "effect", ":", "F3", ",", "16", "=", "39", ".", "35", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "cell", "line", "x", "treatment", "effect", ":", "F3", ",", "16", "=", "38", ".", "75", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ")", ";", "p", "(", "no", "Ab", "vs", "isotype", ")", "=", "0", ".", "6218", ";", "p", "(", "no", "Ab", "vs", "4D9", "mAb", ")", "<", "0", ".", "0001", ";", "p", "(", "no", "Ab", "vs", "4D9", "Fab", ")", "=", "0", ".", "7301", ";", "p", "(", "isotype", "vs", "4D9", "mAb", ")", "<", "0", ".", "0001", ";", "p", "(", "isotype", "vs", "4D9", "Fab", ")", ">", "0", ".", "9999", ";", "p", "(", "4D9", "mAb", "vs", "4D9", "Fab", ")", "<", "0", ".", "0001", ";", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Flow cytometry dose response curve for cell binding of 4D9 mAb (EC50= 0.29nM), 4D9 Fab (EC50=0.17nM), and isotype to HEK cells stably overexpressing mouse TREM2. Data represent the mean ± SEM (n=2).(B) In vitro ADAM17 sheddase activity is blocked by 4D9-effectorless mAb and 4D9 Fab fragment but not an isotype control. Fluorescence polarization of FAM conjugated TREM2 stalk peptide was detected in the presence or absence of ADAM17 and 4D9 mAb, 4D9 Fab and isotype control. Data represent the mean ± SEM (n=6). One-way ANOVA, Tukey's post hoc test; p (4D9 Fab vs 4D9 mAb) = 0.8855; p (4D9 Fab vs uncleaved) < 0.0001; p (4D9 mAb vs uncleaved) < 0.0001; n.s., not significant.(C) ELISA-mediated quantification of sTREM2 in conditioned media from (D) AlphaLISA-mediated quantification of pSYK levels in HEK293 Flp-In cells stably overexpressing mouse TREM2 and mouse DAP12 treated with a dose titration of 4D9 mAb, 4D9 Fab or isotype for 5 minutes. Data represent the mean ± SEM (n=3).(E) AlphaLISA-mediated quantification of pSYK levels in HEK293 Flp-In cells stably overexpressing mouse TREM2 and mouse DAP12 or empty vector treated with 1mg/ml POPC/POPS liposomes and 20µg/ml 4D9 mAb, 4D9 Fab or isotype for 5 minutes. pSYK levels were also determined for cells treated with liposomes only. Data represent the mean ± SEM (n=3). Two-way ANOVA, Tukey's post hoc test (cell line effect: F1,16=365.7, p=<0.0001; treatment effect: F3,16=39.35, p<0.0001; cell line x treatment effect: F3,16=38.75, p<0.0001); p (no Ab vs isotype) = 0.6218; p (no Ab vs 4D9 mAb) < 0.0001; p (no Ab vs 4D9 Fab) = 0.7301; p (isotype vs 4D9 mAb) < 0.0001; p (isotype vs 4D9 Fab) > 0.9999; p (4D9 mAb vs 4D9 Fab) < 0.0001; n.s., not significant."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Flow", "cytometry", "detection", "of", "cell", "surface", "binding", "of", "4D9", "(", "blue", ")", "and", "isotype", "(", "green", ")", "to", "wild", "type", "and", "Trem2", "-", "/", "-", "mouse", "bone", "marrow", "derived", "macrophages", ".", "Representative", "histograms", "are", "shown", "as", "MFI", "(", "mean", "fluorescent", "intensity", ")", ".", "Graphs", "represent", "the", "median", "signal", "intensity", "±", "SEM", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "two", "-", "tailed", ")", ";", "Trem2", "+", "/", "+", ":", "p", "=", "0", ".", "0005", ";", "Trem2", "-", "/", "-", ":", "p", "=", "0", ".", "4435", ";", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ".", "(", "B", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "membrane", "fractions", "of", "bone", "marrow", "derived", "macrophages", "(", "BMDM", ")", "upon", "treatment", "with", "4D9", "antibody", "reveals", "increased", "levels", "of", "membrane", "-", "bound", "TREM2", "relative", "to", "an", "isotype", "antibody", ".", "BMDM", "from", "TREM2", "knockout", "mice", "were", "included", "to", "show", "the", "specificity", "of", "the", "anti", "-", "TREM2", "antibody", ".", "Calnexin", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "Levels", "of", "membrane", "-", "bound", "TREM2", "were", "quantified", "by", "MSD", "ELISA", ".", "TREM2", "antibody", "clone", "5F4", "was", "used", "for", "detection", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "5", "-", "6", ")", ".", "Unpaired", "t", "-", "test", "(", "two", "-", "tailed", ")", "with", "Welch", "'", "s", "correction", ";", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "No", "gender", "-", "specific", "differences", "could", "be", "observed", ".", "(", "C", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "sTREM2", "in", "conditioned", "media", "from", "BMDM", "upon", "treatment", "with", "4D9", "and", "isotype", "antibodies", ".", "BMDM", "from", "TREM2", "knockout", "mice", "were", "included", "to", "show", "the", "specificity", "of", "the", "anti", "-", "TREM2", "antibody", ".", "Soluble", "APP", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "Note", "that", "heavy", "and", "light", "chains", "of", "the", "antibodies", "used", "for", "treatment", "are", "also", "detected", "and", "annotated", "as", "follows", ":", "Ab", "hc", "=", "antibody", "heavy", "chain", ";", "Ab", "lc", "=", "antibody", "light", "chain", ".", "Levels", "of", "sTREM2", "were", "quantified", "by", "MSD", "ELISA", ".", "TREM2", "antibody", "clone", "5F4", "was", "used", "for", "detection", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "Unpaired", "t", "-", "test", "(", "two", "-", "tailed", ")", "with", "Welch", "'", "s", "correction", ";", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "No", "gender", "-", "specific", "differences", "could", "be", "observed", ".", "(", "D", ")", "Wildtype", ",", "Trem2", "+", "/", "-", ",", "and", "Trem2", "-", "/", "-", "BMDMs", "were", "plated", "in", "low", "concentration", "of", "M", "-", "CSF", "on", "4D9", "or", "isotype", "coated", "wells", "for", "5", "days", "and", "cellular", "ATP", "levels", "were", "measured", "by", "luminescence", "detection", "to", "indicate", "cell", "viability", ".", "4D9", "and", "isotype", "data", "for", "each", "genotype", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "2", "and", "n", "=", "1", ",", "respectively", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Flow cytometry detection of cell surface binding of 4D9 (blue) and isotype (green) to wild type and Trem2-/- mouse bone marrow derived macrophages. Representative histograms are shown as MFI (mean fluorescent intensity). Graphs represent the median signal intensity ± SEM (n=3). Student's t-test (two-tailed); Trem2+/+: p = 0.0005; Trem2-/-: p = 0.4435; n.s., not significant.(B) Immunoblot analysis of membrane fractions of bone marrow derived macrophages (BMDM) upon treatment with 4D9 antibody reveals increased levels of membrane-bound TREM2 relative to an isotype antibody. BMDM from TREM2 knockout mice were included to show the specificity of the anti-TREM2 antibody. Calnexin served as a loading control. Levels of membrane-bound TREM2 were quantified by MSD ELISA. TREM2 antibody clone 5F4 was used for detection. Data represent the mean ± SEM (n=5-6). Unpaired t-test (two-tailed) with Welch's correction; p<0.0001. No gender-specific differences could be observed.(C) Immunoblot analysis of sTREM2 in conditioned media from BMDM upon treatment with 4D9 and isotype antibodies. BMDM from TREM2 knockout mice were included to show the specificity of the anti-TREM2 antibody. Soluble APP served as a loading control. Note that heavy and light chains of the antibodies used for treatment are also detected and annotated as follows: Ab hc= antibody heavy chain; Ab lc= antibody light chain. Levels of sTREM2 were quantified by MSD ELISA. TREM2 antibody clone 5F4 was used for detection. Data represent the mean ± SEM (n=6). Unpaired t-test (two-tailed) with Welch's correction; p<0.0001. No gender-specific differences could be observed.(D) Wildtype, Trem2+/-, and Trem2-/- BMDMs were plated in low concentration of M-CSF on 4D9 or isotype coated wells for 5 days and cellular ATP levels were measured by luminescence detection to indicate cell viability. 4D9 and isotype data for each genotype represent the mean ± SEM (n=2 and n=1, respectively)."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Flow", "cytometry", "detection", "of", "cell", "surface", "4D9", "(", "red", ")", "binding", "and", "isotype", "control", "(", "blue", ")", "on", "primary", "wild", "type", "and", "Trem2", "-", "/", "-", "mouse", "microglia", ".", "Data", "are", "shown", "as", "MFI", "(", "mean", "fluorescent", "intensity", ")", ".", "(", "B", ")", "Uptake", "assay", "for", "fluorescently", "labelled", "myelin", ",", "Aβ", "(", "1", "-", "42", ")", "and", "inactivated", "E", ".", "coli", "particles", ".", "The", "top", "row", "shows", "that", "myelin", "and", "Aβ", "(", "pseudocoloured", "in", "white", ")", "accumulate", "within", "the", "plasma", "membrane", "of", "primary", "microglia", "(", "labeled", "with", "dylight", "-", "649", "isolectin", "and", "pseudocoloured", "in", "red", ")", ".", "Overnight", "pre", "-", "treatment", "with", "antibody", "4D9", "significantly", "increased", "the", "percentage", "of", "substrate", "positive", "cells", "(", "middle", "row", ")", ".", "Pre", "-", "treatment", "with", "the", "isotope", "control", "did", "not", "affect", "the", "uptake", "rate", "(", "bottom", "row", ")", ".", "No", "changes", "in", "the", "uptake", "of", "E", ".", "coli", "particles", "were", "observed", ".", "Substrate", "uptake", "in", "the", "absence", "of", "antibody", "is", "shown", "in", "the", "top", "row", ".", "Hoechst", "33342", "was", "used", "to", "counter", "stain", "the", "nuclei", "(", "in", "cyan", ")", "and", "to", "assess", "cell", "density", ".", "Scale", "bar", "=", "20µm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Flow cytometry detection of cell surface 4D9 (red) binding and isotype control (blue) on primary wild type and Trem2-/- mouse microglia. Data are shown as MFI (mean fluorescent intensity).(B) Uptake assay for fluorescently labelled myelin, Aβ(1-42) and inactivated E.coli particles. The top row shows that myelin and Aβ (pseudocoloured in white) accumulate within the plasma membrane of primary microglia (labeled with dylight-649 isolectin and pseudocoloured in red). Overnight pre-treatment with antibody 4D9 significantly increased the percentage of substrate positive cells (middle row). Pre-treatment with the isotope control did not affect the uptake rate (bottom row). No changes in the uptake of E.coli particles were observed. Substrate uptake in the absence of antibody is shown in the top row. Hoechst 33342 was used to counter stain the nuclei (in cyan) and to assess cell density. Scale bar= 20µm."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "4D9", "demonstrates", "standard", "IgG", "pharmacokinetics", "in", "vivo", ".", "Peripheral", "clearance", "rates", "of", "4D9", "on", "a", "human", "IgG", "effectorless", "backbone", "compared", "to", "an", "isotype", "control", "were", "determined", "in", "wild", "type", "mice", "by", "hIgG", "ELISA", "detection", "of", "plasma", "antibody", "concentrations", "1", "and", "24", "hours", ",", "4", "and", "7", "days", "after", "10", "mg", "/", "kg", "intravenous", "injection", "of", "antibody", ".", "(", "B", ")", "Brain", "antibody", "concentration", "was", "measured", "24hrs", "post", "intravenous", "dosing", "of", "isotype", "hIgG", "at", "100mg", "/", "kg", "and", "4D9", "-", "hIgG", "dosed", "intravenously", "at", "100", ",", "50", "and", "10mg", "/", "kg", ".", "Detection", "of", "hIgG", "levels", "by", "ELISA", "demonstrated", "dose", "dependent", "brain", "concentrations", "of", "4D9", "in", "the", "single", "digit", "nM", "range", ".", "Animals", "were", "perfused", "to", "minimize", "IgG", "contribution", "from", "the", "plasma", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "(", "D", ")", "Target", "engagement", "timecourse", "demonstrated", "near", "100", "%", "4D9", "-", "bound", "sTREM2", "in", "CSF", "of", "wildtype", "mice", "at", "24", "hrs", "post", "dose", ".", "Over", "a", "10", "day", "timecourse", "with", "timepoints", "at", "day", "1", ",", "2", ",", "4", ",", "7", "and", "study", "termination", "at", "day", "10", ",", "the", "bound", "/", "total", "sTREM2", "reduces", "gradually", "to", "reach", "~", "50", "%", "by", "day", "10", ".", "Animals", "were", "dosed", "intravenously", "with", "50mg", "/", "kg", "of", "isotype", "and", "4D9", "antibodies", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "(", "E", ")", "Target", "engagement", "dose", "response", "demonstrated", "saturated", "bound", "sTREM2", "at", "50", "and", "10mg", "/", "kg", "with", ">", "50", "%", "bound", "sTREM2", "at", "1mg", "/", "kg", "of", "antibody", ".", "4D9", "-", "bound", "sTREM2", "was", "undetectable", "at", "0", ".", "1mg", "/", "kg", "and", "lower", ".", "4D9", "was", "IV", "-", "dosed", "at", "50", ",", "10", ",", "1", ",", "0", ".", "1", ",", "0", ".", "01", ",", "0", ".", "001", ",", "0", ".", "0001", "mg", "/", "kg", ",", "and", "isotype", "dosed", "at", "50mg", "/", "kg", ".", "CSF", "bound", ":", "total", "sTREM2", "in", "wildtype", "mice", "was", "measured", "at", "24hrs", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "(", "F", ")", "4D9", "antibody", "demonstrates", "dose", "dependent", "increase", "of", "total", "brain", "TREM2", "levels", ".", "Quantification", "of", "total", "TREM2", "in", "brain", "lysates", "from", "wildtype", "mice", "dosed", "with", "4D9", "or", "isotype", "control", "was", "performed", "by", "a", "MSD", "-", "platform", "based", "ELISA", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "5", ")", "and", "are", "shown", "as", "pg", "TREM2", "per", "ug", "of", "total", "protein", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", ",", "Dunnett", "'", "s", "post", "hoc", "test", ",", "p", "(", "isotype", "vs", "4D9", "(", "100mg", "/", "kg", ")", ")", "<", "0", ".", "0001", ";", "p", "(", "isotype", "vs", "4D9", "(", "50mg", "/", "kg", ")", ")", "=", "0", ".", "0007", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) 4D9 demonstrates standard IgG pharmacokinetics in vivo. Peripheral clearance rates of 4D9 on a human IgG effectorless backbone compared to an isotype control were determined in wild type mice by hIgG ELISA detection of plasma antibody concentrations 1 and 24 hours, 4 and 7 days after 10 mg/kg intravenous injection of antibody.(B) Brain antibody concentration was measured 24hrs post intravenous dosing of isotype hIgG at 100mg/kg and 4D9-hIgG dosed intravenously at 100, 50 and 10mg/kg. Detection of hIgG levels by ELISA demonstrated dose dependent brain concentrations of 4D9 in the single digit nM range. Animals were perfused to minimize IgG contribution from the plasma. Data represent the mean ± SEM (n=5).(D) Target engagement timecourse demonstrated near 100% 4D9-bound sTREM2 in CSF of wildtype mice at 24 hrs post dose. Over a 10 day timecourse with timepoints at day 1, 2, 4, 7 and study termination at day 10, the bound/total sTREM2 reduces gradually to reach ~50% by day 10. Animals were dosed intravenously with 50mg/kg of isotype and 4D9 antibodies. Data represent the mean ± SEM (n=5).(E) Target engagement dose response demonstrated saturated bound sTREM2 at 50 and 10mg/kg with >50% bound sTREM2 at 1mg/kg of antibody. 4D9-bound sTREM2 was undetectable at 0.1mg/kg and lower. 4D9 was IV-dosed at 50, 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001, 0.0001 mg/kg, and isotype dosed at 50mg/kg. CSF bound: total sTREM2 in wildtype mice was measured at 24hrs. Data represent the mean ± SEM (n=5).(F) 4D9 antibody demonstrates dose dependent increase of total brain TREM2 levels. Quantification of total TREM2 in brain lysates from wildtype mice dosed with 4D9 or isotype control was performed by a MSD-platform based ELISA. Data represent the mean ± SEM (n=5) and are shown as pg TREM2 per ug of total protein. One-way ANOVA, Dunnett's post hoc test, p (isotype vs 4D9 (100mg/kg)) < 0.0001; p (isotype vs 4D9 (50mg/kg)) = 0.0007."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "B", ")", "Immunohistochemical", "costainings", "of", "TREM2", "(", "magenta", ")", "and", "IBA1", "(", "green", ")", "microglia", "in", "the", "cortex", "of", "isotype", "control", "and", "4D9", "injected", "WT", "and", "APP", "-", "NL", "-", "G", "-", "F", "mice", ".", "Side", "panel", "shows", "images", "from", "each", "staining", "at", "a", "larger", "magnification", "indicated", "by", "the", "dotted", "white", "boxes", ".", "Scale", "bar", "=", "10µm", ";", "scale", "bar", "(", "inset", ")", "=", "2", ".", "5µm", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "cortical", "TREM2", "stainings", "shown", "in", "B", ".", "Two", "-", "way", "ANOVA", ",", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", "(", "Genotype", "effect", ":", "F1", ",", "23", "=", "70", ".", "63", ",", "p", "=", "<", "0", ".", "0001", ";", "Treatment", "effect", ":", "F1", ",", "23", "=", "14", ".", "33", ",", "p", "=", "0", ".", "0010", ";", "Genotype", "x", "Treatment", "effect", ":", "F1", ",", "23", "=", "14", ".", "51", ",", "p", "=", "0", ".", "0009", ")", ";", "p", "(", "WT", "isotype", "vs", "WT", "4D9", ")", ">", "0", ".", "9999", ";", "p", "(", "WT", "isotype", "vs", "APP", "isotype", ")", "=", "0", ".", "02", ";", "p", "(", "WT", "4D9", "vs", "APP", "4D9", ")", "<", "0", ".", "0001", ";", "p", "(", "APP", "isotype", "vs", "APP", "4D9", ")", "=", "0", ".", "0001", ";", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "cortical", "IBA1", "staining", "shown", "in", "B", ".", "Two", "-", "way", "ANOVA", ",", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", "(", "Genotype", "effect", ":", "F1", ",", "21", "=", "215", ".", "4", ",", "p", "=", "<", "0", ".", "0001", ";", "Treatment", "effect", ":", "F1", ",", "21", "=", "0", ".", "5994", ",", "p", "=", "0", ".", "4475", ";", "Genotype", "x", "Treatment", "effect", ":", "F1", ",", "21", "=", "0", ".", "2992", ",", "p", "=", "0", ".", "5902", ")", ";", "p", "(", "WT", "isotype", "vs", "APP", "isotype", ")", "<", "0", ".", "0001", ";", "p", "(", "WT", "4D9", "vs", "APP", "4D9", ")", "<", "0", ".", "0001", ";", "p", "(", "APP", "isotype", "vs", "APP", "4D9", ")", "=", "0", ".", "9986", ";", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ".", "(", "E", ")", "Confocal", "images", "of", "P2RY12", "(", "red", ")", ",", "IBA1", "(", "green", ")", ",", "and", "Aβ", "(", "gray", ")", "costainings", "from", "cortex", ".", "Top", "panel", ":", "Dotted", "white", "boxes", "indicate", "the", "area", "in", "P2RY12", "and", "IBA1", "costainings", "that", "are", "magnified", "as", "inset", ".", "Bottom", "panel", ":", "Insets", "show", "P2RY12", ",", "IBA1", "and", "Aβ", "null", "at", "a", "larger", "magnification", ".", "Of", "note", ",", "we", "did", "not", "observe", "a", "complete", "co", "-", "localization", "of", "P2RY12", "and", "null", "suggesting", "different", "microglial", "populations", ".", "Scale", "bar", "=", "10µm", ";", "scale", "bar", "(", "insets", ")", "=", "5µm", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "P2RY12", "stained", "cells", "in", "the", "cortex", "shown", "in", "E", ".", "Two", "-", "way", "ANOVA", ",", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", "(", "Genotype", "effect", ":", "F1", ",", "23", "=", "71", ".", "99", ",", "p", "=", "<", "0", ".", "0001", ";", "Treatment", "effect", ":", "F1", ",", "23", "=", "9", ".", "029", ",", "p", "=", "0", ".", "0063", ";", "Genotype", "x", "Treatment", "effect", ":", "F1", ",", "23", "=", "5", ".", "93", ",", "p", "=", "0", ".", "0231", ")", ";", "p", "(", "WT", "isotype", "vs", "APP", "isotype", ")", "=", "0", ".", "0018", ";", "p", "(", "WT", "null", "vs", "APP", "4D9", ")", "<", "0", ".", "0001", ";", "p", "(", "APP", "isotype", "vs", "APP", "4D9", ")", "=", "0", ".", "0051", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(B) Immunohistochemical costainings of TREM2 (magenta) and IBA1 (green) microglia in the cortex of isotype control and 4D9 injected WT and APP-NL-G-F mice. Side panel shows images from each staining at a larger magnification indicated by the dotted white boxes. Scale bar = 10µm; scale bar (inset) = 2.5µm.(C) Quantification of cortical TREM2 stainings shown in B. Two-way ANOVA, Tukey's multiple comparison test (Genotype effect: F1,23=70.63, p=<0.0001; Treatment effect: F1,23=14.33, p=0.0010; Genotype x Treatment effect: F1,23=14.51, p=0.0009); p (WT isotype vs WT 4D9) > 0.9999; p (WT isotype vs APP isotype) = 0.02; p (WT 4D9 vs APP 4D9) < 0.0001; p (APP isotype vs APP 4D9) = 0.0001; n.s., not significant.(D) Quantification of cortical IBA1 staining shown in B. Two-way ANOVA, Tukey's multiple comparison test (Genotype effect: F1,21=215.4, p=<0.0001; Treatment effect: F1,21=0.5994, p=0.4475; Genotype x Treatment effect: F1,21=0.2992, p=0.5902); p (WT isotype vs APP isotype) < 0.0001; p (WT 4D9 vs APP 4D9) < 0.0001; p (APP isotype vs APP 4D9) = 0.9986; n.s., not significant.(E) Confocal images of P2RY12 (red), IBA1 (green), and Aβ (gray) costainings from cortex. Top panel: Dotted white boxes indicate the area in P2RY12 and IBA1 costainings that are magnified as inset. Bottom panel: Insets show P2RY12, IBA1 and Aβ null at a larger magnification. Of note, we did not observe a complete co-localization of P2RY12 and null suggesting different microglial populations. Scale bar= 10µm; scale bar (insets) = 5µm.(F) Quantification of P2RY12 stained cells in the cortex shown in E. Two-way ANOVA, Tukey's multiple comparison test (Genotype effect: F1,23=71.99, p=<0.0001; Treatment effect: F1,23=9.029, p=0.0063; Genotype x Treatment effect: F1,23=5.93, p=0.0231); p (WT isotype vs APP isotype) = 0.0018; p (WT null vs APP 4D9) < 0.0001; p (APP isotype vs APP 4D9) = 0.0051."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ",", "B", ")", "Overview", "of", "the", "cortex", "immunohistochemically", "stained", "for", "Aβ", "plaques", "in", "6", "months", "old", "APP", "-", "NL", "-", "G", "-", "F", "mice", "treated", "with", "isotype", "control", "(", "A", ")", "and", "4D9", "antibody", "(", "B", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "100µm", ".", "(", "C", ")", "Higher", "magnification", "images", "of", "cortical", "Aβ", "plaques", "in", "APP", "isotype", "and", "4D9", "injected", "mice", ".", "Scale", "bar", "=", "10µm", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "cortical", "plaque", "area", "from", "stainings", "shown", "in", "C", ".", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ",", "p", "=", "0", ".", "0082", ".", "(", "E", ")", "Quantification", "of", "total", "plaque", "coverage", "of", "Aβ", "stainings", "in", "the", "cortex", "shown", "in", "C", ".", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ",", "p", "=", "0", ".", "014", ".", "(", "F", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "soluble", "(", "DEA", "fraction", ",", "top", ")", "and", "insoluble", "Aβ", "levels", "(", "FA", "fraction", ",", "bottom", ")", "in", "brains", "of", "APP", "-", "NL", "-", "G", "-", "F", "mice", "treated", "with", "either", "isotype", "control", "or", "4D9", "antibody", ".", "While", "a", "reduction", "in", "levels", "of", "soluble", "Aβ", "is", "evident", "from", "the", "DEA", "fractions", "no", "change", "in", "levels", "of", "insoluble", "Aβ", "could", "be", "detected", "in", "the", "FA", "fractions", ".", "Note", "that", "the", "higher", "background", "in", "the", "DEA", "immunoblot", "is", "due", "to", "a", "much", "longer", "exposure", "time", ",", "which", "was", "needed", "to", "visualize", "soluble", "Aβ", ".", "(", "G", ")", "MSD", "ELISA", "quantification", "of", "soluble", "Aβ42", "in", "DEA", "extracts", "as", "shown", "in", "(", "F", ")", ".", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ",", "p", "=", "0", ".", "026", ".", "(", "H", ")", "MSD", "ELISA", "quantification", "of", "insoluble", "Aβ42", "in", "FA", "extracts", "as", "shown", "in", "(", "F", ")", ".", "Unpaired", "t", "-", "test", "(", "two", "-", "tailed", ")", "with", "Welch", "'", "s", "correction", ";", "p", "=", "0", ".", "0877", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A, B) Overview of the cortex immunohistochemically stained for Aβ plaques in 6 months old APP-NL-G-F mice treated with isotype control (A) and 4D9 antibody (B). Scale bar= 100µm.(C) Higher magnification images of cortical Aβ plaques in APP isotype and 4D9 injected mice. Scale bar= 10µm. (D) Quantification of cortical plaque area from stainings shown in C. Mann-Whitney U test, p=0.0082. (E) Quantification of total plaque coverage of Aβ stainings in the cortex shown in C. Mann-Whitney U test, p=0.014.(F) Immunoblot analysis of soluble (DEA fraction, top) and insoluble Aβ levels (FA fraction, bottom) in brains of APP-NL-G-F mice treated with either isotype control or 4D9 antibody. While a reduction in levels of soluble Aβ is evident from the DEA fractions no change in levels of insoluble Aβ could be detected in the FA fractions. Note that the higher background in the DEA immunoblot is due to a much longer exposure time, which was needed to visualize soluble Aβ.(G) MSD ELISA quantification of soluble Aβ42 in DEA extracts as shown in (F). Mann-Whitney U test, p=0.026. (H) MSD ELISA quantification of insoluble Aβ42 in FA extracts as shown in (F). Unpaired t-test (two-tailed) with Welch's correction; p=0.0877. "}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "Maximum", "intensity", "projections", "(", "top", ")", "and", "representative", "sections", "(", "bottom", ")", "of", "typical", "nuclei", "of", "the", "indicated", "cell", "types", "stained", "with", "DAPI", ".", "Scale", "bars", ",", "3", "μm", ".", "(", "C", ")", "Areas", "of", "DAPI", "-", "dense", "regions", "(", "top", ")", ",", "distance", "of", "DAPI", "-", "dense", "regions", "from", "the", "nuclear", "periphery", "(", "middle", ")", ",", "and", "variance", "of", "DAPI", "signals", "(", "bottom", ")", ".", "The", "point", "marks", "the", "median", "while", "the", "thick", "and", "thin", "lines", "correspond", "to", "66", "%", "and", "95", "%", "intervals", ",", "respectively", ".", "Number", "of", "DAPI", "dense", "regions", "=", "950", "/", "1450", "/", "839", "/", "1535", "/", "736", "and", "number", "of", "slices", "=", "90", "/", "115", "/", "95", "/", "135", "/", "110", "for", "mESC", "/", "EpiLC", "/", "d2", "/", "d4c7", "mPGCLC", "/", "GSC", ".", "Significances", "are", "computed", "using", "Wilcoxon", "rank", "-", "sum", "tests", ",", "p", "-", "values", "from", "top", "to", "bottom", "4", ".", "37e", "-", "3", ",", "1", ".", "62e", "-", "3", ",", "2", ".", "99e", "-", "2", ",", "2", ".", "03e", "-", "10", ",", "4", ".", "03e", "-", "1", ",", "<", "2", ".", "2e", "-", "16", ",", "1", ".", "31e", "-", "3", ",", "8", ".", "94e", "-", "3", ",", "1", ".", "06e", "-", "4", ",", "5", ".", "62e", "-", "2", ",", "4", ".", "63e", "-", "5", ",", "7", ".", "65e", "-", "13", ".", "P", "-", "value", "symbol", "brackets", ":", "∗", "∗", "∗", "∗", "=", "[", "0", ",", "0", ".", "0001", ")", ";", "∗", "∗", "∗", "=", "[", "0", ".", "0001", ",", "0", ".", "001", "]", ";", "∗", "∗", "=", "[", "0", ".", "001", ",", "0", ".", "01", ")", ";", "∗", "=", "[", "0", ".", "01", ",", "0", ".", "05", ")", ";", "ns", "=", "[", "0", ".", "05", ",", "(", "D", ")", "(", "left", ")", "Fluorescence", "in", "situ", "hybridization", "(", "FISH", ")", "against", "chromosome", "16", "(", "red", ")", "with", "DAPI", "staining", "(", "grey", ")", ".", "Z", "-", "stacked", "representative", "images", "are", "paired", "with", "magnified", "views", ".", "(", "right", ")", "Distributions", "of", "surface", "volumes", "for", "chr16", ".", "The", "point", "marks", "the", "median", "while", "the", "thick", "and", "thin", "lines", "correspond", "to", "66", "%", "and", "95", "%", "intervals", ",", "respectively", ".", "Number", "of", "cells", "=", "51", "/", "68", "/", "53", "for", "mESC", "/", "EpiLC", "/", "GSC", ".", "Scale", "bars", ",", "5", "μm", ".", "Significances", "are", "computed", "using", "Wilcoxon", "rank", "-", "sum", "tests", ",", "p", "-", "values", "from", "left", "to", "right", ":", "4", ".", "16e", "-", "2", ",", "4", ".", "33e", "-", "6", ",", "8", ".", "68e", "-", "9", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B) Maximum intensity projections (top) and representative sections (bottom) of typical nuclei of the indicated cell types stained with DAPI. Scale bars, 3 μm.(C) Areas of DAPI-dense regions (top), distance of DAPI-dense regions from the nuclear periphery (middle), and variance of DAPI signals (bottom). The point marks the median while the thick and thin lines correspond to 66% and 95% intervals, respectively. Number of DAPI dense regions = 950/1450/839/1535/736 and number of slices = 90/115/95/135/110 for mESC/EpiLC/d2/d4c7 mPGCLC/GSC. Significances are computed using Wilcoxon rank-sum tests, p-values from top to bottom 4.37e-3, 1.62e-3, 2.99e-2, 2.03e-10, 4.03e-1, <2.2e-16, 1.31e-3, 8.94e-3, 1.06e-4, 5.62e-2, 4.63e-5, 7.65e-13. P-value symbol brackets: ∗∗∗∗ = [0, 0.0001); ∗∗∗ = [0.0001, 0.001]; ∗∗ = [0.001, 0.01); ∗ = [0.01, 0.05); ns = [0.05,(D) (left) Fluorescence in situ hybridization (FISH) against chromosome 16 (red) with DAPI staining (grey). Z-stacked representative images are paired with magnified views. (right) Distributions of surface volumes for chr16. The point marks the median while the thick and thin lines correspond to 66% and 95% intervals, respectively. Number of cells = 51/68/53 for mESC/EpiLC/GSC. Scale bars, 5 μm. Significances are computed using Wilcoxon rank-sum tests, p-values from left to right: 4.16e-2, 4.33e-6, 8.68e-9."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "H", ")", "Western", "blot", "for", "lamin", "B1", "in", "different", "cell", "types", "(", "bottom", ")", "and", "quantification", "normalized", "by", "β", "-", "actin", "(", "top", ")", ".", "(", "L", ")", "(", "top", ")", "Representative", "images", "of", "FISH", "against", "major", "satellite", "repeats", "in", "EpiLCs", "and", "GSCs", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ";", "(", "bottom", ")", "percentage", "of", "the", "pericentromeres", "detached", "from", "the", "nuclear", "lamina", "in", "EpiLCs", "and", "GSCs", ".", "The", "point", "marks", "the", "median", "while", "the", "thick", "and", "thin", "lines", "correspond", "to", "66", "%", "and", "95", "%", "intervals", ",", "respectively", ".", "Number", "of", "cells", "=", "18", "/", "22", "for", "EpiLC", "/", "GSC", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(H) Western blot for lamin B1 in different cell types (bottom) and quantification normalized by β-actin (top).(L) (top) Representative images of FISH against major satellite repeats in EpiLCs and GSCs. Scale bars, 10 μm; (bottom) percentage of the pericentromeres detached from the nuclear lamina in EpiLCs and GSCs. The point marks the median while the thick and thin lines correspond to 66% and 95% intervals, respectively. Number of cells = 18/22 for EpiLC/GSC."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "I", ")", "(", "left", ")", "Western", "blot", "for", "G9a", ",", "GLP", ",", "Setdb1", "and", "α", "-", "tubulin", ";", "(", "right", ")", "quantification", "normalized", "by", "α", "-", "Tubulin", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(I) (left) Western blot for G9a, GLP, Setdb1 and α-tubulin; (right) quantification normalized by α-Tubulin."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "K", ")", "(", "top", ")", "FISH", "against", "the", "Y", "chromosome", ";", "(", "bottom", ")", "sphericity", "of", "the", "Y", "chromosome", "FISH", "signals", ";", "(", "right", ")", "distributions", "Y", "chromosome", "surface", "volumes", ".", "The", "point", "marks", "the", "median", "while", "the", "thick", "and", "thin", "lines", "correspond", "to", "66", "%", "and", "95", "%", "intervals", ",", "respectively", ".", "Number", "of", "cells", "=", "89", "/", "76", "/", "69", "for", "mESC", "/", "EpiLC", "/", "GSC", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "Significances", "are", "computed", "using", "Wilcoxon", "rank", "-", "sum", "tests", ",", "p", "-", "values"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(K) (top) FISH against the Y chromosome; (bottom) sphericity of the Y chromosome FISH signals; (right) distributions Y chromosome surface volumes. The point marks the median while the thick and thin lines correspond to 66% and 95% intervals, respectively. Number of cells = 89/76/69 for mESC/EpiLC/GSC. Scale bar, 10 μm. Significances are computed using Wilcoxon rank-sum tests, p-values from"}
{"words": ["Figure", "7", "(", "B", ")", "Maximum", "intensity", "projections", "(", "top", ")", "and", "representative", "sections", "(", "bottom", ")", "of", "typical", "nuclei", "of", "GSCs", "and", "GSCLCs", "stained", "with", "DAPI", ".", "Scale", "bars", ",", "3", "μm", ".", "(", "C", ")", "Areas", "of", "DAPI", "-", "dense", "regions", "(", "left", ")", ",", "distance", "of", "DAPI", "-", "dense", "regions", "from", "the", "nuclear", "periphery", "(", "middle", ")", ",", "and", "variance", "of", "DAPI", "signals", "(", "right", ")", ".", "The", "point", "marks", "the", "median", "while", "the", "thick", "and", "thin", "lines", "correspond", "to", "66", "%", "and", "95", "%", "intervals", ",", "respectively", ".", "Number", "of", "DAPI", "dense", "regions", "=", "1535", "/", "736", "/", "1227", "and", "number", "of", "slices", "=", "135", "/", "110", "/", "120", "for", "d4c7", "mPGCLC", "/", "GSC", "/", "GSCLC", ".", "Significances", "are", "computed", "using", "Wilcoxon", "rank", "-", "sum", "tests", ",", "p", "-", "values", "from", "left", "to", "right", ":", "2", ".", "03e", "-", "10", ",", "1", ".", "69e", "-", "9", ",", "0", ".", "123", ",", "0", ".", "00894", ",", "8", ".", "02e", "-", "8", ",", "0", ".", "0707", ",", "7", ".", "65e", "-", "13", ",", "0", ".", "417", ",", "2", ".", "07e", "-", "12", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(B) Maximum intensity projections (top) and representative sections (bottom) of typical nuclei of GSCs and GSCLCs stained with DAPI. Scale bars, 3 μm. (C) Areas of DAPI-dense regions (left), distance of DAPI-dense regions from the nuclear periphery (middle), and variance of DAPI signals (right). The point marks the median while the thick and thin lines correspond to 66% and 95% intervals, respectively. Number of DAPI dense regions = 1535/736/1227 and number of slices = 135/110/120 for d4c7 mPGCLC/GSC/GSCLC. Significances are computed using Wilcoxon rank-sum tests, p-values from left to right: 2.03e-10, 1.69e-9, 0.123, 0.00894, 8.02e-8, 0.0707, 7.65e-13, 0.417, 2.07e-12."}
{"words": ["Figure", "1D", ",", "Scoring", "of", "the", "PI3Kα", "activation", "transcriptomic", "signature", "was", "used", "to", "cluster", "patients", "with", "high", ",", "medium", "(", "both", "groups", "were", "combined", ",", "high", "+", "medium", ":", "red", ")", "and", "low", "(", "black", ")", "scoring", "levels", "in", "the", "primary", "tumours", "of", "confirmed", "PDAC", "patients", "from", "PAAD", "(", "TCGA", ")", "or", "PACA", "-", "AU", "(", "BH", "corrected", "p", "-", "values", ")", ".", "The", "survival", "curves", "of", "each", "cluster", "were", "then", "plotted", ",", "and", "the", "statistical", "significance", "was", "calculated", "using", "the", "logrank", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1D, Scoring of the PI3Kα activation transcriptomic signature was used to cluster patients with high, medium (both groups were combined, high+medium: red) and low (black) scoring levels in the primary tumours of confirmed PDAC patients from PAAD (TCGA) or PACA-AU (BH corrected p-values). The survival curves of each cluster were then plotted, and the statistical significance was calculated using the logrank test."}
{"words": ["Figure", "2E", ",", "Murine", "pancreatic", "tumour", "cells", "R211", "were", "treated", "with", "the", "vehicle", ",", "α", ",", "β", ",", "β", "/", "δ", ",", "γ", "-", "specific", "or", "pan", "-", "PI3K", "inhibitors", "at", "0", ".", "1", "or", "1", "µM", "and", "simultaneously", "subjected", "to", "a", "Boyden", "chamber", "migration", "assay", ".", "Migrating", "cells", "were", "quantified", "after", "24h", ".", "Representative", "image", "of", "filter", "after", "Crystal", "violet", "staining", "is", "shown", ".", "Scale", "=", "200µm", ".", "n", "=", "3", "in", "each", "group", ".", "F", ",", "Murine", "pancreatic", "tumour", "cells", "R211", "were", "treated", "with", "vehicle", ",", "BYL", "-", "719", "1", "µM", ",", "AZD4547", "2", "µM", "or", "both", "treatments", "and", "subjected", "to", "a", "Boyden", "chamber", "migration", "assay", ".", "Migrating", "cells", "were", "quantified", "after", "24h", ".", "n", "=", "4", "in", "each", "group", ".", "G", "L", ",", "PANC", "-", "1", "-", "transduced", "cells", "were", "subjected", "to", "a", "Boyden", "chamber", "migration", "assay", ".", "Migrating", "cells", "were", "quantified", "after", "24h", ".", "n", "=", "5", "in", "each", "group", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2E, Murine pancreatic tumour cells R211 were treated with the vehicle, α, β, β/δ, γ-specific or pan-PI3K inhibitors at 0.1 or 1 µM and simultaneously subjected to a Boyden chamber migration assay. Migrating cells were quantified after 24h. Representative image of filter after Crystal violet staining is shown. Scale=200µm. n = 3 in each group. F, Murine pancreatic tumour cells R211 were treated with vehicle, BYL-719 1 µM, AZD4547 2 µM or both treatments and subjected to a Boyden chamber migration assay. Migrating cells were quantified after 24h. n = 4 in each group. G L, PANC-1-transduced cells were subjected to a Boyden chamber migration assay. Migrating cells were quantified after 24h. n = 5 in each group."}
{"words": ["Figure", "3A", "-", "B", "A", ",", "Murine", "pancreatic", "tumour", "cells", "R211", "were", "treated", "for", "15", "min", "with", "the", "vehicle", ",", "α", "-", "specific", "A66", "or", "pan", "-", "PI3K", "inhibitor", "BKM120", "at", "0", ".", "01", ",", "0", ".", "05", ",", "0", ".", "1", ",", "0", ".", "5", ",", "1", "or", "5", "µM", "in", "the", "presence", "of", "10", "%", "FBS", "and", "protein", "levels", "of", "P", "-", "Akt", "(", "Ser473", ")", ",", "total", "Akt", "and", "β", "Actin", "were", "observed", "by", "western", "blot", ".", "B", ",", "P", "-", "Akt", "on", "Ser473", "was", "quantified", "and", "normalised", "with", "β", "Actin", ".", "n", "=", "3", "in", "each", "group", ".", "R211", "cells", "were", "treated", "with", "the", "vehicle", ",", "α", "-", "specific", "inhibitor", "A66", "or", "pan", "-", "PI3K", "inhibitor", "BKM120", "at", "1", "µM", "D", ",", "migrating", "cells", "were", "quantified", "after", "24h", "in", "a", "Boyden", "chamber", "assay", "and", "compared", "to", "vehicle", "(", "DMSO", ")", ".", "n", "=", "3", "in", "each", "group", ".", "E", ",", "Murine", "pancreatic", "tumour", "cells", "R211", "were", "treated", "for", "15", "min", "with", "the", "vehicle", "(", "0", ".", "01", "%", "DMSO", ")", "or", "α", "-", "specific", "A66", "or", "pan", "-", "PI3K", "inhibitor", "BKM120", "at", "1µM", ".", "Phospholipids", "were", "extracted", ",", "total", "PIP", ",", "PIP2", "and", "PIP3", "were", "quantified", "and", "compared", "to", "the", "vehicle", "(", "DMSO", ")", ".", "n", "=", "3", "in", "each", "group", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A-B A, Murine pancreatic tumour cells R211 were treated for 15 min with the vehicle, α-specific A66 or pan-PI3K inhibitor BKM120 at 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1 or 5 µM in the presence of 10% FBS and protein levels of P-Akt (Ser473), total Akt and β Actin were observed by western blot. B, P-Akt on Ser473 was quantified and normalised with β Actin. n = 3 in each group.R211 cells were treated with the vehicle, α-specific inhibitor A66 or pan-PI3K inhibitor BKM120 at 1 µM D, migrating cells were quantified after 24h in a Boyden chamber assay and compared to vehicle (DMSO). n = 3 in each group.E, Murine pancreatic tumour cells R211 were treated for 15 min with the vehicle (0.01% DMSO) or α-specific A66 or pan-PI3K inhibitor BKM120 at 1µM. Phospholipids were extracted, total PIP, PIP2 and PIP3 were quantified and compared to the vehicle (DMSO). n = 3 in each group."}
{"words": ["Figure", "4A", ",", "Migration", "inhibition", "capacities", "of", "PI3K", "inhibitors", "at", "1", "µM", "were", "tested", "on", "pancreatic", "tumour", "cells", "(", "R211", ",", "PDAC8661", ",", "PANC", "-", "1", ",", "10593", ",", "10158", ",", "R6344", ",", "R6430", ",", "R6065", ",", "R6141", ")", ".", "The", "mean", "of", "these", "values", "was", "plotted", "against", "the", "in", "vitro", "IC50", "for", "each", "class", "I", "PI3K", "and", "each", "inhibitor", ".", "IC50", "is", "determined", "on", "recombinant", "proteins", ".", "Pearson", "correlation", "tests", "were", "performed", "and", "its", "p", "-", "values", "were", "presented", "separately", "for", "each", "class", "I", "PI3K", "isoform", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A, Migration inhibition capacities of PI3K inhibitors at 1 µM were tested on pancreatic tumour cells (R211, PDAC8661, PANC-1, 10593, 10158, R6344, R6430, R6065, R6141). The mean of these values was plotted against the in vitro IC50 for each class I PI3K and each inhibitor. IC50 is determined on recombinant proteins. Pearson correlation tests were performed and its p-values were presented separately for each class I PI3K isoform."}
{"words": ["Figure", "5A", ",", "Representative", "images", "of", "PI3K", "activation", "(", "as", "shown", "by", "positive", "pAkt", "substrate", "staining", ")", "on", "the", "primary", "tumours", "of", "PDAC", "patients", ",", "with", "values", "of", "quantification", "of", "cfDNA", "and", "mutated", "KRAS", "allele", "frequency", ".", "C", ",", "Survival", "curve", "of", "KPC", "mice", "presenting", "different", "levels", "of", "cfDNA", ".", "n", "in", "each", "group", "is", "indicated", ".", "Log", "rank", "test", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A, Representative images of PI3K activation (as shown by positive pAkt substrate staining) on the primary tumours of PDAC patients, with values of quantification of cfDNA and mutated KRAS allele frequency.C, Survival curve of KPC mice presenting different levels of cfDNA. n in each group is indicated. Log rank test, *** p<0.001"}
{"words": ["Figure", "6G", ",", "Survival", "curve", "of", "KPC", "mice", "treated", "with", "the", "vehicle", "or", "BYL", "-", "719", ".", "Log", "rank", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "H", "-", "J", "H", ",", "Representative", "images", "and", "i", ",", "quantification", "of", "Ki67", "positive", "cells", "in", "pancreatic", "tumours", "and", "in", "J", ",", "metastasized", "liver", "sections", "after", "treatment", "with", "oral", "doses", "of", "vehicle", "(", "0", ".", "5", "%", "methyl", "cellulose", "with", "0", ".", "2", "%", "Tween", "-", "80", ")", "or", "of", "BYL", "-", "719", "(", "50mg", "/", "kg", ")", ".", "K", "-", "L", "K", ",", "Treatment", "regimen", "of", "the", "tail", "vein", "injection", "experiment", "in", "nude", "mice", "treated", "with", "the", "PI3Kα", "inhibitor", "or", "vehicle", "(", "n", "is", "indicated", ")", ",", "quantification", "at", "two", "time", "points", "and", "L", ",", "representative", "images", "of", "luminescence", "via", "IVIS", "®", "Spectrum", "in", "vivo", "imaging", "system", ".", "N", ",", "Tail", "vein", "injection", "experiment", "in", "C57", "/", "B6", "mice", "of", "murine", "syngeneic", "pancreatic", "cancer", "cells", "(", "Kras", "mutated", "A338", ",", "Kras", "mutated", "and", "half", "PI3Kα", "inactive", ",", "A260", ";", "n", ">", "8", "in", "each", "group", ")", ",", "quantification", "of", "micro", "-", "and", "macro", "-", "metastasis", "at", "final", "time", "point", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6G, Survival curve of KPC mice treated with the vehicle or BYL-719. Log rank test, * p<0.05.H-J H, Representative images and i, quantification of Ki67 positive cells in pancreatic tumours and in J, metastasized liver sections after treatment with oral doses of vehicle (0.5% methyl cellulose with 0.2% Tween-80) or of BYL-719 (50mg/kg).K-L K, Treatment regimen of the tail vein injection experiment in nude mice treated with the PI3Kα inhibitor or vehicle (n is indicated), quantification at two time points and L, representative images of luminescence via IVIS® Spectrum in vivo imaging system.N, Tail vein injection experiment in C57/B6 mice of murine syngeneic pancreatic cancer cells (Kras mutated A338, Kras mutated and half PI3Kα inactive, A260; n>8 in each group), quantification of micro- and macro-metastasis at final time point."}
{"words": ["Figure", "7A", "-", "D", "Blood", "count", "of", "A", ",", "white", "blood", "cells", ",", "B", ",", "monocytes", ",", "C", ",", "granulocytes", "and", "D", ",", "lymphocytes", "in", "KPC", "mice", ",", "with", "cohort", "size", "in", "each", "group", ".", "h", "-", "jH", "-", "J", "H", ",", "Representative", "images", "and", "quantification", "of", "I", ",", "F4", "/", "80", "positive", "cells", "and", "J", ",", "CD206", "positive", "cells", "after", "the", "pharmacological", "inhibition", "of", "PI3Kα", ".", "Black", "arrowheads", "show", "positive", "immune", "cells", ".", "S", ",", "Murine", "pancreatic", "tumour", "cells", "R211", "were", "treated", "with", "vehicle", ",", "TNF", "-", "α", "20", "ng", "/", "mL", ",", "BYL", "-", "719", "1", "µM", "or", "both", "treatments", "and", "subjected", "to", "a", "Boyden", "chamber", "migration", "assay", ".", "Migrating", "cells", "were", "quantified", "after", "24h", ".", "n", "=", "4", "independent", "values", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A-D Blood count of A, white blood cells, B, monocytes, C, granulocytes and D, lymphocytes in KPC mice, with cohort size in each group.h-jH-J H, Representative images and quantification of I, F4/80 positive cells and J, CD206 positive cells after the pharmacological inhibition of PI3Kα. Black arrowheads show positive immune cells.S, Murine pancreatic tumour cells R211 were treated with vehicle, TNF-α 20 ng/mL, BYL-719 1 µM or both treatments and subjected to a Boyden chamber migration assay. Migrating cells were quantified after 24h. n= 4 independent values."}
{"words": ["Figure", "1Expression", "pattern", "of", "Rgcc", "in", "the", "embryonic", "day", "14", ".", "5", "(", "E14", ".", "5", ")", "mouse", "cortex", "as", "detected", "by", "in", "situ", "hybridization", ".", "The", "right", "panels", "showed", "the", "expression", "patterns", "of", "NSC", "markers", ",", "including", "Pax6", ",", "Sox2", ",", "and", "Ki67", ",", "along", "the", "ventricular", "zone", "(", "VZ", ")", "of", "the", "E14", ".", "5", "mouse", "cortex", ".", "Scale", "bar", ":", "20", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Expression pattern of Rgcc in the embryonic day 14.5 (E14.5) mouse cortex as detected by in situ hybridization. The right panels showed the expression patterns of NSC markers, including Pax6, Sox2, and Ki67, along the ventricular zone (VZ) of the E14.5 mouse cortex. Scale bar: 20 μm."}
{"words": ["Figure", "2Immunofluorescent", "staining", "of", "coronal", "sections", "of", "the", "E14", ".", "5", "mouse", "cortex", "1", "day", "post", "IUE", ".", "ShRNA", "targeting", "Rgcc", "and", "control", "scramble", "-", "shRNA", "were", "nucleofected", "separately", ".", "Ki67", "were", "co", "-", "stained", "with", "GFP", ".", "To", "quantify", "the", "ratio", "between", "NSC", "markers", "and", "GFP", "positive", "cells", ",", "only", "the", "cells", "in", "VZ", "and", "SVZ", "are", "taken", "into", "account", ".", "And", "ROIs", "of", "800", "*", "1900", "pixel", "were", "randomly", "picked", "for", "counting", ".", "Scale", "bars", ":", "20", "μm", ".", "Quantification", "of", "the", "relative", "ratio", "of", "Ki67", "and", "GFP", "double", "positive", "cells", "versus", "GFP", "positive", "cells", ".", "Immunofluorescent", "staining", "of", "coronal", "sections", "of", "the", "E14", ".", "5", "mouse", "cortex", "1", "day", "post", "IUE", ".", "Sox2", "were", "co", "-", "stained", "with", "GFP", ".", "Scale", "bars", ":", "20", "μm", ".", "Quantification", "of", "the", "relative", "ratio", "of", "Sox2", "and", "GFP", "double", "positive", "cells", "versus", "GFP", "positive", "cells", ".", "Immunofluorescent", "staining", "of", "coronal", "sections", "of", "the", "E14", ".", "5", "mouse", "cortex", "1", "day", "post", "IUE", ".", "Pax6", "were", "co", "-", "stained", "with", "GFP", ".", "Scale", "bars", ":", "20", "μm", ".", "Quantification", "of", "the", "relative", "ratio", "of", "Pax6", "and", "GFP", "double", "positive", "cells", "versus", "GFP", "positive", "cells", ".", "Immunofluorescent", "staining", "of", "coronal", "sections", "of", "the", "E17", ".", "5", "mouse", "cortex", "5", "days", "post", "IUE", ".", "ShRNA", "targeting", "Rgcc", "and", "control", "scramble", "-", "shRNA", "were", "transfected", "separately", "at", "E12", ".", "5", ".", "All", "the", "brains", "were", "harvest", "at", "E17", ".", "5", ".", "Tbr1", "were", "co", "-", "stained", "with", "GFP", ".", "And", "ROIs", "of", "300", "*", "300", "pixel", "were", "randomly", "picked", "along", "Tbr1", "positive", "region", "for", "counting", ".", "Scale", "bars", ":", "100", "μm", ".", "Quantification", "of", "the", "relative", "ratio", "of", "Tbr1", "and", "GFP", "double", "positive", "cells", "versus", "GFP", "positive", "cells", ".", "Immunofluorescent", "staining", "of", "coronal", "sections", "of", "the", "E17", ".", "5", "mouse", "cortex", "4", "days", "post", "IUE", ".", "ShRNA", "targeting", "Rgcc", "and", "control", "scramble", "-", "shRNA", "were", "transfected", "separately", "at", "E13", ".", "5", ".", "All", "the", "brains", "were", "harvest", "at", "E17", ".", "5", ".", "Ctip2", "were", "co", "-", "stained", "with", "GFP", ".", "And", "ROIs", "of", "300", "*", "300", "pixel", "were", "randomly", "picked", "along", "Ctip2", "positive", "region", "for", "counting", ".", "Scale", "bars", ":", "100", "μm", ".", "Quantification", "of", "the", "relative", "ratio", "of", "Ctip2", "and", "GFP", "double", "positive", "cells", "versus", "GFP", "positive", "cells", ".", "Immunofluorescent", "staining", "of", "coronal", "sections", "of", "the", "E17", ".", "5", "mouse", "cortex", "4", "days", "post", "IUE", ".", "ShRNA", "targeting", "Rgcc", "and", "control", "scramble", "-", "shRNA", "were", "transfected", "separately", "at", "E13", ".", "5", ".", "All", "the", "brains", "were", "harvest", "at", "E17", ".", "5", ".", "Satb2", "were", "co", "-", "stained", "with", "GFP", ".", "And", "ROIs", "of", "300", "*", "300", "pixel", "were", "randomly", "picked", "along", "ventricle", "for", "counting", ".", "Scale", "bars", ":", "100", "μm", ".", "Quantification", "of", "the", "relative", "ratio", "of", "Satb2", "and", "GFP", "double", "positive", "cells", "versus", "GFP", "positive", "cells", ".", "Immunofluorescent", "staining", "of", "coronal", "sections", "of", "the", "E17", ".", "5", "mouse", "cortex", "4", "days", "post", "IUE", ".", "Scale", "bars", ":", "100", "μm", ".", "The", "ratio", "of", "GFP", "positive", "cells", "in", "VZ", "/", "SVZ", ",", "IZ", ",", "and", "CP", "were", "counted", "for", "migration", "analysis", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Immunofluorescent staining of coronal sections of the E14.5 mouse cortex 1 day post IUE. ShRNA targeting Rgcc and control scramble-shRNA were nucleofected separately. Ki67 were co-stained with GFP. To quantify the ratio between NSC markers and GFP positive cells, only the cells in VZ and SVZ are taken into account. And ROIs of 800*1900 pixel were randomly picked for counting. Scale bars: 20 μm. Quantification of the relative ratio of Ki67 and GFP double positive cells versus GFP positive cells. Immunofluorescent staining of coronal sections of the E14.5 mouse cortex 1 day post IUE. Sox2 were co-stained with GFP. Scale bars: 20 μm. Quantification of the relative ratio of Sox2 and GFP double positive cells versus GFP positive cells. Immunofluorescent staining of coronal sections of the E14.5 mouse cortex 1 day post IUE. Pax6 were co-stained with GFP. Scale bars: 20 μm. Quantification of the relative ratio of Pax6 and GFP double positive cells versus GFP positive cells.Immunofluorescent staining of coronal sections of the E17.5 mouse cortex 5 days post IUE. ShRNA targeting Rgcc and control scramble-shRNA were transfected separately at E12.5. All the brains were harvest at E17.5. Tbr1 were co-stained with GFP. And ROIs of 300*300 pixel were randomly picked along Tbr1 positive region for counting. Scale bars: 100 μm. Quantification of the relative ratio of Tbr1 and GFP double positive cells versus GFP positive cells. Immunofluorescent staining of coronal sections of the E17.5 mouse cortex 4 days post IUE. ShRNA targeting Rgcc and control scramble-shRNA were transfected separately at E13.5. All the brains were harvest at E17.5. Ctip2 were co-stained with GFP. And ROIs of 300*300 pixel were randomly picked along Ctip2 positive region for counting. Scale bars: 100 μm. Quantification of the relative ratio of Ctip2 and GFP double positive cells versus GFP positive cells. Immunofluorescent staining of coronal sections of the E17.5 mouse cortex 4 days post IUE. ShRNA targeting Rgcc and control scramble-shRNA were transfected separately at E13.5. All the brains were harvest at E17.5. Satb2 were co-stained with GFP. And ROIs of 300*300 pixel were randomly picked along ventricle for counting. Scale bars: 100 μm. Quantification of the relative ratio of Satb2 and GFP double positive cells versus GFP positive cells.Immunofluorescent staining of coronal sections of the E17.5 mouse cortex 4 days post IUE. Scale bars: 100 μm. The ratio of GFP positive cells in VZ/SVZ, IZ, and CP were counted for migration analysis."}
{"words": ["Figure", "3Immunofluorescent", "staining", "were", "performed", "on", "sections", "of", "day", "45", "wildtype", "H9", "and", "RGCC", "-", "KO", "hCOs", ".", "Sections", "were", "stained", "with", "SOX2", ".", "Scale", "bar", ":", "200", "μm", "Quantification", "of", "the", "VZ", "-", "like", "SOX2", "-", "positive", "rosette", "area", ".", "Each", "plot", "represented", "an", "individual", "rosette", ".", "H9", ",", "n", "=", "19", ";", "#", "6", ",", "n", "=", "24", ";", "#", "23", ",", "n", "=", "19", "from", "2", "independent", "experiments", ".", "Immunofluorescent", "staining", "were", "performed", "on", "sections", "of", "day", "45", "wildtype", "H9", "and", "RGCC", "-", "KO", "hCOs", ".", "Sections", "were", "stained", "with", "PAX6", "and", "Phospho", "-", "Histone", "3", "(", "PH3", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "200", "μm", "Quantification", "of", "the", "ratio", "of", "PH3", "and", "PAX6", "double", "positive", "cells", "versus", "the", "total", "number", "of", "PAX6", "positive", "cells", "of", "each", "rosette", ".", "Each", "plot", "represented", "an", "individual", "organoid", "(", "H9", ",", "n", "=", "6", ";", "#", "6", ",", "n", "=", "8", ";", "#", "23", ",", "n", "=", "8", "from", "2", "independent", "experiments", ")", ".", "Three", "to", "five", "rosettes", "were", "analyzed", "for", "each", "organoid", ".", "Immunofluorescent", "staining", "were", "performed", "on", "sections", "of", "day", "45", "wildtype", "H9", "and", "RGCC", "-", "KO", "hCOs", ".", "Sections", "were", "stained", "with", "Ki67", ".", "Scale", "bar", ":", "200", "μm", ".", "Quantification", "of", "the", "VZ", "-", "like", "Ki67", "positive", "rosette", "area", ".", "Each", "plot", "represented", "an", "individual", "rosette", ".", "H9", ",", "n", "=", "60", ";", "#", "6", ",", "n", "=", "54", ";", "#", "23", ",", "n", "=", "96", "from", "2", "independent", "experiments", ".", "Immunofluorescent", "staining", "were", "performed", "on", "sections", "of", "day", "45", "wildtype", "H9", "and", "RGCC", "-", "KO", "hCOs", ".", "Sections", "were", "stained", "with", "TUJ1", "and", "PAX6", ".", "Scale", "bar", ":", "200", "μm", ".", "Quantification", "of", "the", "ratio", "of", "TUJ1", "area", "versus", "PAX6", "area", ".", "(", "H9", ",", "n", "=", "15", ";", "#", "6", ",", "n", "=", "6", ";", "#", "23", ",", "n", "=", "9", "from", "2", "independent", "experiment", ")", ".", "Each", "plot", "represented", "an", "individual", "organoid", ".", "Three", "to", "five", "rosettes", "were", "analyzed", "for", "each", "organoid", ".", "Immunofluorescent", "staining", "were", "performed", "on", "sections", "of", "day", "45", "wildtype", "H9", "and", "RGCC", "-", "KO", "hCOs", ".", "Sections", "were", "stained", "with", "TBR1", "and", "PAX6", ".", "Scale", "bar", ":", "200", "μm", ".", "Quantification", "of", "the", "ratio", "of", "TBR1", "-", "positive", "area", "around", "PAX6", "-", "positive", "area", "versus", "PAX6", "-", "positive", "area", "in", "each", "rosette", ".", "(", "H9", ",", "n", "=", "10", ";", "#", "6", ",", "n", "=", "10", ";", "#", "23", ",", "n", "=", "7", "from", "2", "independent", "experiment", ")", ".", "Each", "plot", "represented", "an", "individual", "organoid", ".", "Three", "to", "five", "rosettes", "were", "analyzed", "for", "each", "organoid", ".", "Immunofluorescent", "staining", "were", "performed", "on", "sections", "of", "day", "45", "wildtype", "H9", "and", "RGCC", "-", "KO", "hCOs", ".", "Sections", "were", "stained", "with", "CTIP2", "and", "PAX6", ".", "Scale", "bar", ":", "200", "μm", ".", "Quantification", "of", "the", "ratio", "of", "CTIP2", "area", "versus", "PAX6", "area", ".", "(", "H9", ",", "n", "=", "8", ";", "#", "6", ",", "n", "=", "8", ";", "#", "23", ",", "n", "=", "8", "from", "2", "independent", "experiment", ")", ".", "Each", "plot", "represented", "an", "individual", "organoid", ".", "Three", "to", "five", "rosettes", "were", "analyzed", "for", "each", "organoid", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Immunofluorescent staining were performed on sections of day 45 wildtype H9 and RGCC-KO hCOs. Sections were stained with SOX2. Scale bar: 200 μm Quantification of the VZ-like SOX2-positive rosette area. Each plot represented an individual rosette. H9, n=19; #6, n=24; #23, n=19 from 2 independent experiments. Immunofluorescent staining were performed on sections of day 45 wildtype H9 and RGCC-KO hCOs. Sections were stained with PAX6 and Phospho-Histone 3 (PH3). Scale bar: 200 μm Quantification of the ratio of PH3 and PAX6 double positive cells versus the total number of PAX6 positive cells of each rosette. Each plot represented an individual organoid (H9, n=6; #6, n=8; #23, n=8 from 2 independent experiments). Three to five rosettes were analyzed for each organoid. Immunofluorescent staining were performed on sections of day 45 wildtype H9 and RGCC-KO hCOs. Sections were stained with Ki67. Scale bar: 200 μm. Quantification of the VZ-like Ki67 positive rosette area. Each plot represented an individual rosette. H9, n=60; #6, n=54; #23, n=96 from 2 independent experiments.Immunofluorescent staining were performed on sections of day 45 wildtype H9 and RGCC-KO hCOs. Sections were stained with TUJ1 and PAX6. Scale bar: 200 μm. Quantification of the ratio of TUJ1 area versus PAX6 area. (H9, n=15; #6, n=6; #23, n=9 from 2 independent experiment). Each plot represented an individual organoid. Three to five rosettes were analyzed for each organoid. Immunofluorescent staining were performed on sections of day 45 wildtype H9 and RGCC-KO hCOs. Sections were stained with TBR1 and PAX6. Scale bar: 200 μm. Quantification of the ratio of TBR1-positive area around PAX6-positive area versus PAX6-positive area in each rosette. (H9, n=10; #6, n=10; #23, n=7 from 2 independent experiment). Each plot represented an individual organoid. Three to five rosettes were analyzed for each organoid. Immunofluorescent staining were performed on sections of day 45 wildtype H9 and RGCC-KO hCOs. Sections were stained with CTIP2 and PAX6. Scale bar: 200 μm. Quantification of the ratio of CTIP2 area versus PAX6 area. (H9, n=8; #6, n=8; #23, n=8 from 2 independent experiment). Each plot represented an individual organoid. Three to five rosettes were analyzed for each organoid."}
{"words": ["Figure", "5Immunofluorescent", "staining", "of", "coronal", "sections", "of", "the", "E14", ".", "5", "mouse", "cortex", "one", "-", "day", "post", "IUE", ".", "ShRNA", "targeting", "Rgcc", "and", "control", "scramble", "-", "shRNA", "were", "nucleofected", "separately", ".", "PH3", "were", "co", "-", "stained", "with", "GFP", ".", "The", "punctuated", "PH3", "cells", "were", "at", "G2", "-", "phase", ",", "while", "PH3", "cells", "with", "continuous", "pattern", "were", "at", "M", "-", "phase", ".", "To", "quantify", "the", "ratio", "between", "PH3", "and", "GFP", "double", "positive", "cells", "and", "GFP", "cells", ",", "only", "the", "cells", "in", "VZ", "and", "SVZ", "are", "taken", "into", "account", ".", "Scale", "bar", ":", "20", "μm", ".", "n", "≥", "3", "mouse", "brains", "for", "each", "group", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "≥", "3", "mouse", "brains", "for", "each", "group", ";", "Statistical", "significance", "was", "tested", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "Representative", "pictures", "of", "mitotic", "NSC", "marked", "by", "P", "-", "Vimentin", "and", "PH3", "revealed", "by", "DAPI", "at", "the", "apical", "surface", "of", "the", "E14", ".", "5", "mouse", "cortex", "after", "IUE", ".", "A", "representative", "vertically", "dividing", "cell", "was", "shown", "in", "upper", "panel", ",", "and", "a", "representative", "horizontally", "dividing", "cell", "was", "shown", "in", "lower", "panel", ".", "White", "dash", "line", "indicates", "the", "apical", "surface", "and", "splitting", "plane", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Immunofluorescent staining of coronal sections of the E14.5 mouse cortex one-day post IUE. ShRNA targeting Rgcc and control scramble-shRNA were nucleofected separately. PH3 were co-stained with GFP. The punctuated PH3 cells were at G2-phase, while PH3 cells with continuous pattern were at M-phase. To quantify the ratio between PH3 and GFP double positive cells and GFP cells, only the cells in VZ and SVZ are taken into account. Scale bar: 20 μm. n≥3 mouse brains for each group. Data are presented as mean ± SEM; n≥3 mouse brains for each group; Statistical significance was tested by Student's t-test. **, p<0.01; ***, p<0.001;Representative pictures of mitotic NSC marked by P-Vimentin and PH3 revealed by DAPI at the apical surface of the E14.5 mouse cortex after IUE. A representative vertically dividing cell was shown in upper panel, and a representative horizontally dividing cell was shown in lower panel. White dash line indicates the apical surface and splitting plane. Scale bar: 5 μm."}
{"words": ["Figure", "6RGCC", "was", "co", "-", "stained", "with", "PCNT", "on", "3D", "hCO", "slices", ".", "RGCC", "was", "with", "stronger", "expression", "in", "NSCs", "during", "M", "-", "phase", ".", "prometaphase", "(", "B", "'", ")", ",", "metaphase", "(", "B", "'", "'", ")", "anaphase", "(", "B", "'", "'", "'", ")", "and", "telophase", "(", "B", "'", "'", "'", "'", ")", ".", "RGCC", "was", "expressed", "around", "nucleus", "in", "interphase", "(", "B", "'", "'", "'", "'", "'", ")", ".", "NSCs", "undergoing", "prometaphase", ",", "metaphase", ",", "anaphase", "and", "telophase", "were", "pointed", "out", "by", "yellow", "arrow", ".", "Interphase", "were", "pointed", "out", "by", "white", "arrow", "(", "B", "'", "'", "'", "'", "'", ")", ".", "Immunostaining", "of", "2D", "-", "differentiated", "NSCs", "in", "metaphase", "showed", "partial", "colocalization", "of", "RGCC", "with", "α", "-", "TUBULIN", "in", "the", "spindle", "(", "B", "'", "'", "'", "'", "'", "'", ",", "yellow", "arrow", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "μm", ".", "The", "Western", "blots", "results", ".", "Proteins", "were", "collected", "from", "WT", "hCOs", "and", "RGCC", "KO", "hCOs", "#", "6", "at", "day", "45", ".", "B", "-", "ACTIN", "were", "used", "as", "references", ".", "PCNT", "was", "co", "-", "stained", "with", "β", "-", "TUBULIN", "on", "WT", "NSCs", "and", "RGCC", "KO", "NSCs", "differentiated", "by", "2D", "cultured", "dual", "-", "SMAD", "inhibition", "method", ".", "Scale", "bar", ":", "5μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6RGCC was co-stained with PCNT on 3D hCO slices. RGCC was with stronger expression in NSCs during M-phase. prometaphase (B'), metaphase (B'') anaphase (B''') and telophase (B''''). RGCC was expressed around nucleus in interphase (B''''') . NSCs undergoing prometaphase, metaphase, anaphase and telophase were pointed out by yellow arrow. Interphase were pointed out by white arrow (B'''''). Immunostaining of 2D-differentiated NSCs in metaphase showed partial colocalization of RGCC with α-TUBULIN in the spindle (B'''''', yellow arrow). Scale bar: 5 μm.The Western blots results. Proteins were collected from WT hCOs and RGCC KO hCOs #6 at day 45. B-ACTIN were used as references.PCNT was co-stained with β -TUBULIN on WT NSCs and RGCC KO NSCs differentiated by 2D cultured dual-SMAD inhibition method. Scale bar: 5μm."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "phosphorylated", "Smad2", "(", "P", "-", "Smad2", ")", "and", "PMEPA1", "(", "high", "and", "low", "exposures", "displayed", ")", "in", "MB", "patient", "sample", "lysates", "from", "different", "groups", ":", "WNT", "(", "blue", ")", ",", "SHH", "(", "red", ")", ",", "Group", "3", "(", "yellow", ")", "or", "Group", "4", "(", "green", ")", ".", "β", "-", "actin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Relative", "quantification", "of", "P", "-", "Smad2", "signal", "to", "β", "-", "actin", "(", "P", "-", "S2", "/", "β", "-", "Actin", ")", "and", "total", "Smad2", "(", "P", "-", "S2", "/", "Tot", "-", "S2", ")", "are", "indicated", "below", "the", "blots", ".", "(", "B", ")", "Boxplots", "summarizing", "the", "expression", "of", "INHBB", ",", "TGFB1", "and", "TGFB3", "ligands", "of", "the", "TGFβ", "/", "Activin", "pathway", "in", "the", "different", "groups", "of", "MB", "(", "blue", "WNT", ",", "red", "SHH", ",", "yellow", "Group", "3", "and", "green", "Group", "4", ")", "and", "in", "fetal", "and", "adult", "cerebellum", "(", "grey", ")", "in", "the", "dataset", "of", "\"", "Data", "ref", ":", "Cavalli", "et", "al", ",", "2017", "\"", ".", "Wilcoxon", "rank", "-", "sum", "tests", "were", "performed", "to", "determine", "p", "-", "values", "for", "panel", "B", ".", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "(", "C", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "phosphorylated", "Smad2", "(", "P", "-", "Smad2", ")", "in", "non", "-", "Group", "3", "(", "blue", ")", "and", "Group", "3", "(", "yellow", ")", "MB", "cell", "lines", "on", "the", "left", "panel", ".", "The", "level", "of", "total", "Smad2", "(", "Smad2", ")", "was", "assessed", "and", "β", "-", "actin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "On", "the", "right", "panel", ",", "relative", "level", "of", "P", "-", "Smad2", "(", "P", "-", "S2", ")", "were", "quantified", "to", "total", "β", "-", "actin", ".", "The", "p", "-", "values", "were", "determined", "by", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "±", "SD", ".", "Number", "of", "replicates", "is", "n", "≥", "3", ".", "(", "D", ")", "RT", "-", "qPCR", "were", "performed", "on", "RNA", "extracted", "from", "non", "-", "Group", "3", "(", "blue", ")", "and", "Group", "3", "(", "yellow", ")", "MB", "cell", "lines", "to", "compare", "expression", "levels", "of", "INHBB", "(", "left", ")", "and", "TGFB3", "(", "right", ")", ".", "The", "p", "-", "values", "were", "determined", "by", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "±", "SD", ".", "Number", "of", "replicates", "is", "n", "≥", "3", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Immunoblot analysis of phosphorylated Smad2 (P-Smad2) and PMEPA1 (high and low exposures displayed) in MB patient sample lysates from different groups: WNT (blue), SHH (red), Group 3 (yellow) or Group 4 (green). β-actin was used as a loading control. Relative quantification of P-Smad2 signal to β-actin (P-S2/β-Actin) and total Smad2 (P-S2/Tot-S2) are indicated below the blots.(B) Boxplots summarizing the expression of INHBB, TGFB1 and TGFB3 ligands of the TGFβ/Activin pathway in the different groups of MB (blue WNT, red SHH, yellow Group 3 and green Group 4) and in fetal and adult cerebellum (grey) in the dataset of \"Data ref: Cavalli et al, 2017\". Wilcoxon rank-sum tests were performed to determine p-values for panel B. p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001.(C) Immunoblot analysis of phosphorylated Smad2 (P-Smad2) in non-Group 3 (blue) and Group 3 (yellow) MB cell lines on the left panel. The level of total Smad2 (Smad2) was assessed and β-actin was used as a loading control. On the right panel, relative level of P-Smad2 (P-S2) were quantified to total β-actin. The p-values were determined by unpaired t-test. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Bars represent the mean ± SD. Number of replicates is n≥3.(D) RT-qPCR were performed on RNA extracted from non-Group 3 (blue) and Group 3 (yellow) MB cell lines to compare expression levels of INHBB (left) and TGFB3 (right). The p-values were determined by unpaired t-test. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001. Bars represent the mean ± SD. Number of replicates is n≥3."}
{"words": ["Figure", "2The", "level", "of", "phosphorylated", "Smad2", "(", "P", "-", "Smad2", ")", "and", "total", "Smad2", "(", "Smad2", ")", "was", "assessed", "by", "immunoblotting", "and", "β", "-", "actin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Lower", "bar", "graphs", "show", "WB", "quantification", "of", "P", "-", "Smad2", "(", "P", "-", "S2", ")", "normalized", "to", "β", "-", "actin", ".", "(", "A", ")", "Activation", "of", "the", "pathway", "was", "assessed", "in", "non", "-", "Group", "3", "(", "blue", ")", "and", "Group", "3", "(", "yellow", ")", "MB", "cell", "lines", "in", "response", "to", "TGFβ", "or", "ActivinB", "stimulation", "for", "1h", ".", "The", "level", "of", "phosphorylated", "Smad2", "(", "P", "-", "Smad2", ")", "and", "total", "Smad2", "(", "Smad2", ")", "was", "assessed", "by", "immunoblotting", "and", "β", "-", "actin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Lower", "bar", "graphs", "show", "WB", "quantification", "of", "P", "-", "Smad2", "(", "P", "-", "S2", ")", "normalized", "to", "β", "-", "actin", ".", "(", "B", ")", "1603MED", "cells", "were", "treated", "with", "PBS", "(", "vehicle", ")", "or", "a", "blocking", "antibody", "targeting", "ActivinB", "(", "Ab", "α", "-", "ActB", ")", "or", "Follistatin", ".", "The", "p", "-", "values", "were", "determined", "by", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "±", "SD", ".", "Number", "of", "replicates", "is", "n", "≥", "3", ".", "The", "level", "of", "phosphorylated", "Smad2", "(", "P", "-", "Smad2", ")", "and", "total", "Smad2", "(", "Smad2", ")", "was", "assessed", "by", "immunoblotting", "and", "β", "-", "actin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Lower", "bar", "graphs", "show", "WB", "quantification", "of", "P", "-", "Smad2", "(", "P", "-", "S2", ")", "normalized", "to", "β", "-", "actin", ".", "(", "C", ")", "Conditioned", "media", "experiments", "were", "performed", "on", "the", "HDMB03", "MB", "cell", "line", ".", "Phosphorylation", "of", "Smad2", "was", "analyzed", "by", "immunoblot", "upon", "treatment", "with", "either", "non", "conditioned", "media", "(", "NCM", ")", ",", "media", "conditioned", "with", "HDMB03", "cells", "(", "CM", "-", "HDMB03", ")", "or", "media", "conditioned", "with", "1603MED", "cells", "(", "CM", "-", "1603", ")", ".", "Pre", "-", "incubation", "with", "blocking", "antibody", "against", "ActivinB", "(", "Ab", "α", "-", "ActB", ")", "or", "vehicule", "(", "PBS", ")", "was", "performed", "before", "HDMB03", "cell", "-", "line", "treatment", "as", "indicated", ".", "Relative", "level", "of", "P", "-", "Smad2", "(", "P", "-", "S2", ")", "were", "quantified", "to", "β", "-", "actin", "(", "below", ")", ".", "The", "p", "-", "values", "were", "determined", "by", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "±", "SD", ".", "Number", "of", "replicates", "is", "n", "≥", "3", ".", "(", "D", ")", "RT", "-", "qPCR", "were", "performed", "on", "total", "RNA", "extracted", "from", "1603MED", "cells", "48", "hours", "after", "transfection", "with", "siRNA", "targeting", "INHBB", ".", "Relative", "INHBB", "expression", "was", "assessed", ".", "siCTRL", "condition", "was", "set", "at", "1", ".", "The", "p", "-", "values", "were", "determined", "by", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "±", "SD", ".", "Number", "of", "replicates", "is", "n", "≥", "3", ".", "The", "level", "of", "phosphorylated", "Smad2", "(", "P", "-", "Smad2", ")", "and", "total", "Smad2", "(", "Smad2", ")", "was", "assessed", "by", "immunoblotting", "and", "β", "-", "actin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Lower", "bar", "graphs", "show", "WB", "quantification", "of", "P", "-", "Smad2", "(", "P", "-", "S2", ")", "normalized", "to", "β", "-", "actin", ".", "(", "E", ")", "1603MED", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "indicated", "control", "siRNA", "(", "siCTRL", ",", "blue", ")", "or", "targeting", "INHBB", "(", "siINHBB", ",", "red", ")", ".", "Lysates", "were", "prepared", "48", "hours", "after", "transfection", ".", "Lower", "bar", "graphs", "represent", "the", "quantification", "of", "the", "relative", "level", "of", "P", "-", "Smad2", "(", "P", "-", "S2", ")", "to", "β", "-", "actin", ".", "The", "p", "-", "values", "were", "determined", "by", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "±", "SD", ".", "Number", "of", "replicates", "is", "n", "≥", "3", ".", "(", "F", ")", "Growth", "curve", "of", "1603MED", "cells", "after", "transfection", "with", "either", "siCTRL", "(", "blue", ")", "or", "siINHBB", "(", "red", ")", ".", "The", "p", "-", "values", "were", "determined", "by", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2The level of phosphorylated Smad2 (P-Smad2) and total Smad2 (Smad2) was assessed by immunoblotting and β-actin was used as a loading control. Lower bar graphs show WB quantification of P-Smad2 (P-S2) normalized to β-actin. (A) Activation of the pathway was assessed in non-Group 3 (blue) and Group 3 (yellow) MB cell lines in response to TGFβ or ActivinB stimulation for 1h.The level of phosphorylated Smad2 (P-Smad2) and total Smad2 (Smad2) was assessed by immunoblotting and β-actin was used as a loading control. Lower bar graphs show WB quantification of P-Smad2 (P-S2) normalized to β-actin. (B) 1603MED cells were treated with PBS (vehicle) or a blocking antibody targeting ActivinB (Ab α-ActB) or Follistatin. The p-values were determined by unpaired t-test. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. Bars represent the mean ± SD. Number of replicates is n≥3.The level of phosphorylated Smad2 (P-Smad2) and total Smad2 (Smad2) was assessed by immunoblotting and β-actin was used as a loading control. Lower bar graphs show WB quantification of P-Smad2 (P-S2) normalized to β-actin. (C) Conditioned media experiments were performed on the HDMB03 MB cell line. Phosphorylation of Smad2 was analyzed by immunoblot upon treatment with either non conditioned media (NCM), media conditioned with HDMB03 cells (CM-HDMB03) or media conditioned with 1603MED cells (CM-1603). Pre-incubation with blocking antibody against ActivinB (Ab α-ActB) or vehicule (PBS) was performed before HDMB03 cell-line treatment as indicated. Relative level of P-Smad2 (P-S2) were quantified to β-actin (below). The p-values were determined by unpaired t-test. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. Bars represent the mean ± SD. Number of replicates is n≥3.(D) RT-qPCR were performed on total RNA extracted from 1603MED cells 48 hours after transfection with siRNA targeting INHBB. Relative INHBB expression was assessed. siCTRL condition was set at 1. The p-values were determined by unpaired t-test. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. Bars represent the mean ± SD. Number of replicates is n≥3.The level of phosphorylated Smad2 (P-Smad2) and total Smad2 (Smad2) was assessed by immunoblotting and β-actin was used as a loading control. Lower bar graphs show WB quantification of P-Smad2 (P-S2) normalized to β-actin. (E) 1603MED cells were transfected with the indicated control siRNA (siCTRL, blue) or targeting INHBB (siINHBB, red). Lysates were prepared 48 hours after transfection. Lower bar graphs represent the quantification of the relative level of P-Smad2 (P-S2) to β-actin. The p-values were determined by unpaired t-test. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. Bars represent the mean ± SD. Number of replicates is n≥3.(F) Growth curve of 1603MED cells after transfection with either siCTRL (blue) or siINHBB (red). The p-values were determined by unpaired t-test. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001."}
{"words": ["Figure", "3D458", "cell", "lines", "were", "treated", "with", "PBS", "(", "vehicle", ",", "black", ")", "or", "with", "ActivinB", "(", "green", ")", ".", "Immunoblot", "of", "phosphorylated", "Smad2", "(", "P", "-", "Smad2", ")", ",", "total", "Smad2", "and", "β", "-", "actin", "in", "response", "to", "ActivinB", "stimulation", "for", "24", "hours", ".", "Quantification", "of", "P", "-", "Smad2", "(", "P", "-", "S2", ")", "to", "β", "-", "actin", "are", "shown", "on", "right", "panels", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "±", "SD", ".", "Number", "of", "replicates", "is", "n", "≥", "3", ".", "D458", "cell", "lines", "were", "treated", "with", "PBS", "(", "vehicle", ",", "black", ")", "or", "with", "ActivinB", "(", "green", ")", ".", "Growth", "curve", "experiments", "showing", "cell", "proliferation", "upon", "ActivinB", "treatment", ".", "The", "p", "-", "values", "were", "determined", "by", "unpaired", "t", "-", "test", "and", "two", "-", "way", "ANOVA", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "D458", "cell", "lines", "were", "treated", "with", "PBS", "(", "vehicle", ",", "black", ")", "or", "with", "ActivinB", "(", "green", ")", ".", "Cell", "cycle", "analysis", "by", "FACS", "measuring", "BrdU", "incorporation", "and", "7AAD", "labelling", "at", "48", "hours", "upon", "ActivinB", "stimulation", ".", "The", "percentage", "of", "cells", "in", "the", "different", "phases", "of", "the", "cell", "cycle", "is", "represented", "(", "G0", "/", "G1", ",", "S", "and", "G2", "/", "M", "phases", ")", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "±", "SD", ".", "Number", "of", "replicates", "is", "n", "≥", "3", ".", "D458", "cell", "lines", "were", "treated", "with", "PBS", "(", "vehicle", ",", "black", ")", "or", "with", "ActivinB", "(", "green", ")", ".", "Percentage", "of", "apoptotic", "cells", "measured", "by", "FACS", "analysis", "of", "cleaved", "caspase3", "48h", "hours", "after", "treatment", "with", "ActivinB", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "±", "SD", ".", "Number", "of", "replicates", "is", "n", "≥", "3", ".", "D283", "cell", "lines", "were", "treated", "with", "PBS", "(", "vehicle", ",", "black", ")", "or", "with", "ActivinB", "(", "green", ")", ".", "Immunoblot", "of", "phosphorylated", "Smad2", "(", "P", "-", "Smad2", ")", ",", "total", "Smad2", "and", "β", "-", "actin", "in", "response", "to", "ActivinB", "stimulation", "for", "24", "hours", ".", "Quantification", "of", "P", "-", "Smad2", "(", "P", "-", "S2", ")", "to", "β", "-", "actin", "are", "shown", "on", "right", "panels", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "±", "SD", ".", "Number", "of", "replicates", "is", "n", "≥", "3", ".", "D283", "cell", "lines", "were", "treated", "with", "PBS", "(", "vehicle", ",", "black", ")", "or", "with", "ActivinB", "(", "green", ")", ".", "Growth", "curve", "experiments", "showing", "cell", "proliferation", "upon", "ActivinB", "treatment", ".", "The", "p", "-", "values", "were", "determined", "by", "unpaired", "t", "-", "test", "and", "two", "-", "way", "ANOVA", "for", "F", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "D283", "cell", "lines", "were", "treated", "with", "PBS", "(", "vehicle", ",", "black", ")", "or", "with", "ActivinB", "(", "green", ")", ".", "Cell", "cycle", "analysis", "by", "FACS", "measuring", "BrdU", "incorporation", "and", "7AAD", "labelling", "at", "48", "hours", "upon", "ActivinB", "stimulation", ".", "The", "percentage", "of", "cells", "in", "the", "different", "phases", "of", "the", "cell", "cycle", "is", "represented", "(", "G0", "/", "G1", ",", "S", "and", "G2", "/", "M", "phases", ")", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "±", "SD", ".", "Number", "of", "replicates", "is", "n", "≥", "3", ".", "D283", "cell", "lines", "were", "treated", "with", "PBS", "(", "vehicle", ",", "black", ")", "or", "with", "ActivinB", "(", "green", ")", ".", "Percentage", "of", "apoptotic", "cells", "measured", "by", "FACS", "analysis", "of", "cleaved", "caspase3", "48h", "hours", "after", "treatment", "with", "ActivinB", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "±", "SD", ".", "Number", "of", "replicates", "is", "n", "≥", "3", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3D458 cell lines were treated with PBS (vehicle, black) or with ActivinB (green). Immunoblot of phosphorylated Smad2 (P-Smad2), total Smad2 and β-actin in response to ActivinB stimulation for 24 hours. Quantification of P-Smad2 (P-S2) to β-actin are shown on right panels. Bars represent the mean ± SD. Number of replicates is n≥3.D458 cell lines were treated with PBS (vehicle, black) or with ActivinB (green). Growth curve experiments showing cell proliferation upon ActivinB treatment. The p-values were determined by unpaired t-test and two-way ANOVA *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.D458 cell lines were treated with PBS (vehicle, black) or with ActivinB (green). Cell cycle analysis by FACS measuring BrdU incorporation and 7AAD labelling at 48 hours upon ActivinB stimulation. The percentage of cells in the different phases of the cell cycle is represented (G0/G1, S and G2/M phases). Bars represent the mean ± SD. Number of replicates is n≥3.D458 cell lines were treated with PBS (vehicle, black) or with ActivinB (green). Percentage of apoptotic cells measured by FACS analysis of cleaved caspase3 48h hours after treatment with ActivinB. Bars represent the mean ± SD. Number of replicates is n≥3.D283 cell lines were treated with PBS (vehicle, black) or with ActivinB (green). Immunoblot of phosphorylated Smad2 (P-Smad2), total Smad2 and β-actin in response to ActivinB stimulation for 24 hours. Quantification of P-Smad2 (P-S2) to β-actin are shown on right panels. Bars represent the mean ± SD. Number of replicates is n≥3.D283 cell lines were treated with PBS (vehicle, black) or with ActivinB (green). Growth curve experiments showing cell proliferation upon ActivinB treatment. The p-values were determined by unpaired t-test and two-way ANOVA for F. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.D283 cell lines were treated with PBS (vehicle, black) or with ActivinB (green). Cell cycle analysis by FACS measuring BrdU incorporation and 7AAD labelling at 48 hours upon ActivinB stimulation. The percentage of cells in the different phases of the cell cycle is represented (G0/G1, S and G2/M phases). Bars represent the mean ± SD. Number of replicates is n≥3.D283 cell lines were treated with PBS (vehicle, black) or with ActivinB (green). Percentage of apoptotic cells measured by FACS analysis of cleaved caspase3 48h hours after treatment with ActivinB. Bars represent the mean ± SD. Number of replicates is n≥3."}
{"words": ["Figure", "41603MED", "cells", "were", "treated", "with", "DMSO", "(", "vehicle", ",", "black", ")", ",", "with", "LY364947", "(", "red", ")", "or", "with", "SB431542", "(", "orange", ")", ".", "Immunoblot", "of", "phosphorylated", "Smad2", "(", "P", "-", "Smad2", ")", ",", "total", "Smad2", "and", "β", "-", "actin", "upon", "inhibition", "of", "TGFβ", "/", "Activin", "signaling", "using", "LY364947", "and", "SB431542", "inhibitors", "for", "24", "hours", ".", "Bar", "graphs", "on", "the", "right", "panel", "represent", "the", "quantification", "of", "the", "relative", "level", "of", "P", "-", "Smad2", "(", "P", "-", "S2", ")", "to", "β", "-", "actin", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "±", "SD", ".", "Number", "of", "replicates", "is", "n", "≥", "3", ".", "1603MED", "cells", "were", "treated", "with", "DMSO", "(", "vehicle", ",", "black", ")", ",", "with", "LY364947", "(", "red", ")", "or", "with", "SB431542", "(", "orange", ")", ".", "Growth", "curve", "experiments", "showing", "cell", "proliferation", "upon", "TGFβ", "/", "Activin", "signaling", "inhibition", ".", "The", "p", "-", "values", "were", "determined", "by", "unpaired", "t", "-", "test", "and", "two", "-", "way", "ANOVA", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "1603MED", "cells", "were", "treated", "with", "DMSO", "(", "vehicle", ",", "black", ")", ",", "with", "LY364947", "(", "red", ")", "or", "with", "SB431542", "(", "orange", ")", ".", "Cell", "cycle", "analysis", "by", "FACS", "measuring", "BrdU", "incorporation", "and", "7AAD", "labelling", "at", "48", "hours", "upon", "inhibition", ".", "The", "percentage", "of", "cells", "in", "the", "different", "phases", "of", "the", "cell", "cycle", "is", "represented", "(", "G0", "/", "G1", ",", "S", "and", "G2", "/", "M", "phases", ")", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "±", "SD", ".", "Number", "of", "replicates", "is", "n", "≥", "3", ".", "1603MED", "cells", "were", "treated", "with", "DMSO", "(", "vehicle", ",", "black", ")", ",", "with", "LY364947", "(", "red", ")", "or", "with", "SB431542", "(", "orange", ")", ".", "Percentage", "of", "apoptotic", "cells", "measured", "by", "FACS", "analysis", "of", "cleaved", "caspase3", "48", "hours", "after", "TGFβ", "/", "Activin", "signaling", "inhibition", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "±", "SD", ".", "Number", "of", "replicates", "is", "n", "≥", "3", ".", "D283", "cells", "were", "treated", "with", "DMSO", "(", "vehicle", ",", "black", ")", ",", "with", "LY364947", "(", "red", ")", "or", "with", "SB431542", "(", "orange", ")", ".", "Immunoblot", "of", "phosphorylated", "Smad2", "(", "P", "-", "Smad2", ")", ",", "total", "Smad2", "and", "β", "-", "actin", "upon", "inhibition", "of", "TGFβ", "/", "Activin", "signaling", "using", "LY364947", "and", "SB431542", "inhibitors", "for", "24", "hours", ".", "Bar", "graphs", "on", "the", "right", "panel", "represent", "the", "quantification", "of", "the", "relative", "level", "of", "P", "-", "Smad2", "(", "P", "-", "S2", ")", "to", "β", "-", "actin", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "±", "SD", ".", "Number", "of", "replicates", "is", "n", "≥", "3", ".", "D283", "cells", "were", "treated", "with", "DMSO", "(", "vehicle", ",", "black", ")", ",", "with", "LY364947", "(", "red", ")", "or", "with", "SB431542", "(", "orange", ")", ".", "Growth", "curve", "experiments", "showing", "cell", "proliferation", "upon", "TGFβ", "/", "Activin", "signaling", "inhibition", ".", "The", "p", "-", "values", "were", "determined", "by", "unpaired", "t", "-", "test", "and", "two", "-", "way", "ANOVA", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "D283", "cells", "were", "treated", "with", "DMSO", "(", "vehicle", ",", "black", ")", ",", "with", "LY364947", "(", "red", ")", "or", "with", "SB431542", "(", "orange", ")", ".", "Cell", "cycle", "analysis", "by", "FACS", "measuring", "BrdU", "incorporation", "and", "7AAD", "labelling", "at", "48", "hours", "upon", "inhibition", ".", "The", "percentage", "of", "cells", "in", "the", "different", "phases", "of", "the", "cell", "cycle", "is", "represented", "(", "G0", "/", "G1", ",", "S", "and", "G2", "/", "M", "phases", ")", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "±", "SD", ".", "Number", "of", "replicates", "is", "n", "≥", "3", ".", "D283", "cells", "were", "treated", "with", "DMSO", "(", "vehicle", ",", "black", ")", ",", "with", "LY364947", "(", "red", ")", "or", "with", "SB431542", "(", "orange", ")", ".", "Percentage", "of", "apoptotic", "cells", "measured", "by", "FACS", "analysis", "of", "cleaved", "caspase3", "48", "hours", "after", "TGFβ", "/", "Activin", "signaling", "inhibition", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "±", "SD", ".", "Number", "of", "replicates", "is", "n", "≥", "3", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 41603MED cells were treated with DMSO (vehicle, black), with LY364947 (red) or with SB431542 (orange). Immunoblot of phosphorylated Smad2 (P-Smad2), total Smad2 and β-actin upon inhibition of TGFβ/Activin signaling using LY364947 and SB431542 inhibitors for 24 hours. Bar graphs on the right panel represent the quantification of the relative level of P-Smad2 (P-S2) to β-actin. Bars represent the mean ± SD. Number of replicates is n≥3.1603MED cells were treated with DMSO (vehicle, black), with LY364947 (red) or with SB431542 (orange). Growth curve experiments showing cell proliferation upon TGFβ/Activin signaling inhibition. The p-values were determined by unpaired t-test and two-way ANOVA *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.1603MED cells were treated with DMSO (vehicle, black), with LY364947 (red) or with SB431542 (orange). Cell cycle analysis by FACS measuring BrdU incorporation and 7AAD labelling at 48 hours upon inhibition. The percentage of cells in the different phases of the cell cycle is represented (G0/G1, S and G2/M phases). Bars represent the mean ± SD. Number of replicates is n≥3.1603MED cells were treated with DMSO (vehicle, black), with LY364947 (red) or with SB431542 (orange). Percentage of apoptotic cells measured by FACS analysis of cleaved caspase3 48 hours after TGFβ/Activin signaling inhibition. Bars represent the mean ± SD. Number of replicates is n≥3.D283 cells were treated with DMSO (vehicle, black), with LY364947 (red) or with SB431542 (orange). Immunoblot of phosphorylated Smad2 (P-Smad2), total Smad2 and β-actin upon inhibition of TGFβ/Activin signaling using LY364947 and SB431542 inhibitors for 24 hours. Bar graphs on the right panel represent the quantification of the relative level of P-Smad2 (P-S2) to β-actin. Bars represent the mean ± SD. Number of replicates is n≥3.D283 cells were treated with DMSO (vehicle, black), with LY364947 (red) or with SB431542 (orange). Growth curve experiments showing cell proliferation upon TGFβ/Activin signaling inhibition. The p-values were determined by unpaired t-test and two-way ANOVA *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.D283 cells were treated with DMSO (vehicle, black), with LY364947 (red) or with SB431542 (orange). Cell cycle analysis by FACS measuring BrdU incorporation and 7AAD labelling at 48 hours upon inhibition. The percentage of cells in the different phases of the cell cycle is represented (G0/G1, S and G2/M phases). Bars represent the mean ± SD. Number of replicates is n≥3.D283 cells were treated with DMSO (vehicle, black), with LY364947 (red) or with SB431542 (orange). Percentage of apoptotic cells measured by FACS analysis of cleaved caspase3 48 hours after TGFβ/Activin signaling inhibition. Bars represent the mean ± SD. Number of replicates is n≥3."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Ranking", "of", "top", "genes", "whose", "expression", "is", "correlated", "with", "INHBB", "in", "Group", "3", "MB", "patient", "samples", ".", "Spearman", "'", "s", "rank", "correlation", "coefficient", "ρ", "and", "p", "-", "value", "are", "indicated", ".", "The", "p", "-", "values", "were", "determined", "by", "Spearman", "rank", "correlation", "test", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "B", ")", "Boxplots", "representing", "PMEPA1", "expression", "levels", "in", "the", "different", "MB", "groups", "(", "WNT", "in", "blue", ",", "SHH", "in", "red", ",", "Group", "3", "in", "yellow", "and", "Group", "4", "in", "green", ")", "and", "in", "fetal", "and", "adult", "cerebellum", "(", "grey", ")", "in", "the", "dataset", "\"", "Data", "ref", ":", "Cavalli", "et", "al", ",", "2017", "\"", ".", "Only", "p", "-", "values", "corresponding", "to", "comparisons", "between", "Group", "3", "and", "the", "other", "groups", "are", "indicated", ".", "The", "p", "-", "values", "were", "determined", "by", "Wilcoxon", "rank", "-", "sum", "test", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "C", ")", "Scatter", "plot", "of", "INHBB", "and", "PMEPA1", "gene", "expression", "levels", "in", "all", "MB", "groups", ".", "Colored", "dots", "represent", "each", "patient", "samples", "and", "colors", "represent", "the", "MB", "groups", "(", "WNT", "in", "blue", ",", "SHH", "in", "red", ",", "Group", "3", "in", "yellow", "and", "Group", "4", "in", "green", ")", ".", "The", "p", "-", "values", "were", "determined", "by", "Spearman", "rank", "correlation", "test", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "D", ")", "Boxplot", "represents", "the", "quantification", "of", "PMEPA1", "protein", "level", "normalized", "to", "β", "-", "actin", "levels", "across", "groups", ".", "The", "p", "-", "values", "were", "determined", "by", "unpaired", "t", "-", "test", "for", "D", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "E", ")", "Scatter", "plot", "represents", "Log2", "relative", "protein", "level", "of", "P", "-", "Smad2", "(", "x", "axis", ")", "and", "PMEPA1", "(", "Y", "axis", ")", "normalized", "to", "β", "-", "actin", "in", "each", "individual", "samples", ".", "The", "p", "-", "values", "were", "determined", "by", "Wilcoxon", "rank", "-", "sum", "test", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "F", ")", "Immunoblots", "of", "phosphorylated", "Smad2", "(", "P", "-", "Smad2", ")", ",", "total", "Smad2", ",", "MYC", ",", "PMEPA1", ",", "OTX2", "and", "β", "-", "actin", "were", "performed", "on", "extracts", "from", "1603MED", "or", "D283", "or", "D458", "cells", "treated", "with", "either", "DMSO", "(", "vehicle", ")", ",", "LY364947", ",", "SB431542", ",", "blocking", "antibody", "against", "ActivinB", "(", "Ab", "α", "-", "ActB", ")", ",", "Follistatin", ",", "PBS", "or", "ActivinB", "(", "ActB", ")", "for", "24", "hours", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "PMEPA1", "levels", "in", "1603MED", "(", "G", ")", "cells", "48", "hours", "after", "transfection", "with", "either", "siCTRL", "(", "blue", ")", "or", "siPMEPA1", "(", "red", ")", ".", "Bar", "graphs", "on", "the", "right", "represent", "the", "quantification", "of", "the", "relative", "level", "of", "PMEPA1", "protein", "level", "normalized", "to", "β", "-", "actin", ".", "The", "p", "-", "values", "were", "determined", "by", "unpaired", "t", "-", "test", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "±", "SD", ".", "Number", "of", "replicates", "is", "n", "≥", "3", ".", "Growth", "curves", "of", "1603MED", "(", "H", ")", "cells", "after", "transfection", "with", "either", "siCTRL", "(", "blue", ")", "or", "siPMEPA1", "(", "red", ")", ".", "The", "p", "-", "values", "were", "determined", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "PMEPA1", "levels", "in", "D283", "(", "I", ")", "cells", "48", "hours", "after", "transfection", "with", "either", "siCTRL", "(", "blue", ")", "or", "siPMEPA1", "(", "red", ")", ".", "Bar", "graphs", "on", "the", "right", "represent", "the", "quantification", "of", "the", "relative", "level", "of", "PMEPA1", "protein", "level", "normalized", "to", "β", "-", "actin", ".", "The", "p", "-", "values", "were", "determined", "by", "unpaired", "t", "-", "test", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "±", "SD", ".", "Number", "of", "replicates", "is", "n", "≥", "3", ".", "Growth", "curves", "of", "D283", "(", "J", ")", "cells", "after", "transfection", "with", "either", "siCTRL", "(", "blue", ")", "or", "siPMEPA1", "(", "red", ")", ".", "The", "p", "-", "values", "were", "determined", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Ranking of top genes whose expression is correlated with INHBB in Group 3 MB patient samples. Spearman's rank correlation coefficient ρ and p-value are indicated. The p-values were determined by Spearman rank correlation test *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.(B) Boxplots representing PMEPA1 expression levels in the different MB groups (WNT in blue, SHH in red, Group 3 in yellow and Group 4 in green) and in fetal and adult cerebellum (grey) in the dataset \" Data ref: Cavalli et al, 2017\". Only p-values corresponding to comparisons between Group 3 and the other groups are indicated. The p-values were determined by Wilcoxon rank-sum test *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.(C) Scatter plot of INHBB and PMEPA1 gene expression levels in all MB groups. Colored dots represent each patient samples and colors represent the MB groups (WNT in blue, SHH in red, Group 3 in yellow and Group 4 in green). The p-values were determined by Spearman rank correlation test *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.(D) Boxplot represents the quantification of PMEPA1 protein level normalized to β-actin levels across groups. The p-values were determined by unpaired t-test for D *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.(E) Scatter plot represents Log2 relative protein level of P-Smad2 (x axis) and PMEPA1 (Y axis) normalized to β-actin in each individual samples. The p-values were determined by Wilcoxon rank-sum test *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.(F) Immunoblots of phosphorylated Smad2 (P-Smad2), total Smad2, MYC, PMEPA1, OTX2 and β-actin were performed on extracts from 1603MED or D283 or D458 cells treated with either DMSO (vehicle), LY364947, SB431542, blocking antibody against ActivinB (Ab α-ActB), Follistatin, PBS or ActivinB (ActB) for 24 hours.Immunoblot analysis of PMEPA1 levels in 1603MED (G) cells 48 hours after transfection with either siCTRL (blue) or siPMEPA1 (red). Bar graphs on the right represent the quantification of the relative level of PMEPA1 protein level normalized to β-actin. The p-values were determined by unpaired t-test *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. Bars represent the mean ± SD. Number of replicates is n≥3.Growth curves of 1603MED (H) cells after transfection with either siCTRL (blue) or siPMEPA1 (red). The p-values were determined by two-way ANOVA *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001.Immunoblot analysis of PMEPA1 levels in D283 (I) cells 48 hours after transfection with either siCTRL (blue) or siPMEPA1 (red). Bar graphs on the right represent the quantification of the relative level of PMEPA1 protein level normalized to β-actin. The p-values were determined by unpaired t-test *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. Bars represent the mean ± SD. Number of replicates is n≥3.Growth curves of D283 (J) cells after transfection with either siCTRL (blue) or siPMEPA1 (red). The p-values were determined by two-way ANOVA *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "phosphorylated", "Smad2", "(", "P", "-", "Smad2", ")", "in", "Group", "3", "MB", "cell", "lines", "and", "PDXs", ".", "The", "level", "of", "total", "Smad2", "(", "Smad2", ")", "was", "assessed", "and", "β", "-", "actin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Quantification", "of", "P", "-", "Smad2", "(", "P", "-", "S2", ")", "to", "β", "-", "actin", "are", "shown", "on", "right", "panel", ".", "Right", "(", "A", ")", "panels", "represent", "the", "relative", "quantification", "of", "P", "-", "Smad2", "normalized", "to", "β", "-", "actin", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "±", "SD", ".", "Number", "of", "replicates", "is", "n", "≥", "3", ".", "(", "B", ")", "Expression", "of", "INHBB", "in", "Group", "3", "MB", "cell", "lines", "and", "PDXs", "relative", "to", "HDMB03", "(", "set", "at", "1", ")", "by", "RT", "-", "qPCR", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "±", "SD", ".", "Number", "of", "replicates", "is", "n", "≥", "3", ".", "(", "C", ")", "Immunoblot", "of", "phosphorylated", "Smad2", "(", "P", "-", "Smad2", ")", ",", "total", "Smad2", "and", "β", "-", "actin", "upon", "ActivinB", "or", "TGFβ", "stimulation", "for", "1", "hour", ".", "lower", "panels", "represent", "the", "relative", "quantification", "of", "P", "-", "Smad2", "normalized", "to", "β", "-", "actin", ".", "The", "p", "-", "values", "were", "determined", "by", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "±", "SD", ".", "Number", "of", "replicates", "is", "n", "≥", "3", ".", "(", "D", ")", "Conditioned", "media", "experiments", "were", "performed", "on", "HDMB03", "MB", "cell", "line", ".", "Phosphorylation", "of", "Smad2", "(", "P", "-", "Smad2", ")", "was", "analyzed", "by", "immunoblot", "upon", "treatment", "with", "either", "non", "-", "conditioned", "media", "(", "NCM", ")", ",", "media", "conditioned", "with", "HDMB03", "cells", "(", "CM", "-", "HDMB03", ")", "or", "media", "conditioned", "on", "PDX4", "cells", "(", "CM", "-", "PDX4", ")", ".", "Pre", "-", "incubation", "with", "blocking", "antibody", "against", "ActivinB", "(", "Ab", "α", "-", "ActB", ")", "or", "with", "vehicle", "was", "performed", "before", "HDMB03", "cell", "-", "line", "treatment", "as", "indicated", ".", "lower", "panels", "represent", "the", "relative", "quantification", "of", "P", "-", "Smad2", "normalized", "to", "β", "-", "actin", ".", "The", "p", "-", "values", "were", "determined", "by", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "±", "SD", ".", "Number", "of", "replicates", "is", "n", "≥", "3", ".", "(", "E", ")", "Immunoblots", "of", "phosphorylated", "Smad2", "(", "P", "-", "Smad2", ")", ",", "total", "Smad2", ",", "MYC", ",", "PMEPA1", ",", "OTX2", "and", "β", "-", "actin", "were", "performed", "on", "extracts", "from", "cell", "cultures", "of", "PDX4", ",", "PDX3", "and", "PDX7", "treated", "by", "either", "DMSO", "(", "vehicle", ")", ",", "LY364947", ",", "SB431542", ",", "blocking", "antibody", "against", "ActivinB", "(", "Ab", "α", "-", "ActB", ")", ",", "Follistatin", ",", "PBS", "or", "ActivinB", "for", "24", "hours", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Immunoblot analysis of phosphorylated Smad2 (P-Smad2) in Group 3 MB cell lines and PDXs. The level of total Smad2 (Smad2) was assessed and β-actin was used as a loading control. Quantification of P-Smad2 (P-S2) to β-actin are shown on right panel. Right (A) panels represent the relative quantification of P-Smad2 normalized to β-actin. Bars represent the mean ± SD. Number of replicates is n≥3.(B) Expression of INHBB in Group 3 MB cell lines and PDXs relative to HDMB03 (set at 1) by RT-qPCR. Bars represent the mean ± SD. Number of replicates is n≥3.(C) Immunoblot of phosphorylated Smad2 (P-Smad2), total Smad2 and β-actin upon ActivinB or TGFβ stimulation for 1 hour. lower panels represent the relative quantification of P-Smad2 normalized to β-actin. The p-values were determined by unpaired t-test. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. Bars represent the mean ± SD. Number of replicates is n≥3.(D) Conditioned media experiments were performed on HDMB03 MB cell line. Phosphorylation of Smad2 (P-Smad2) was analyzed by immunoblot upon treatment with either non-conditioned media (NCM), media conditioned with HDMB03 cells (CM-HDMB03) or media conditioned on PDX4 cells (CM-PDX4). Pre-incubation with blocking antibody against ActivinB (Ab α-ActB) or with vehicle was performed before HDMB03 cell-line treatment as indicated. lower panels represent the relative quantification of P-Smad2 normalized to β-actin. The p-values were determined by unpaired t-test. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. Bars represent the mean ± SD. Number of replicates is n≥3.(E) Immunoblots of phosphorylated Smad2 (P-Smad2), total Smad2, MYC, PMEPA1, OTX2 and β-actin were performed on extracts from cell cultures of PDX4, PDX3 and PDX7 treated by either DMSO (vehicle), LY364947, SB431542, blocking antibody against ActivinB (Ab α-ActB), Follistatin, PBS or ActivinB for 24 hours."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Kaplan", "-", "Meier", "representing", "survival", "of", "mice", "treated", "with", "either", "vehicle", "(", "black", ")", "or", "Galunisertib", "(", "LY2157299", ",", "red", ")", "or", "Cisplatin", "(", "blue", ")", "or", "a", "combination", "of", "Galunisertib", "and", "cisplatin", "(", "purple", ")", "after", "orthotopic", "grafting", "of", "PDX4", "cells", "into", "the", "cerebellum", ".", "The", "pink", "rectangle", "represents", "Galunisertib", "treatment", "duration", ",", "while", "the", "blue", "dotted", "lines", "represent", "the", "3", "cisplatin", "administrations", ".", "The", "p", "-", "values", "were", "determined", "by", "Log", "-", "Rank", "(", "Mantel", "-", "Cox", ")", "test", "on", "panel", "A", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "and", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "±", "SD", ".", "Number", "of", "replicates", "is", "n", "≥", "3", ".", "(", "B", ")", "Boxplot", "of", "tumor", "area", "after", "25", "days", "of", "treatment", ".", "On", "the", "right", ",", "boxplots", "represent", "quantification", "of", "P", "-", "Smad2", "staining", "on", "tumor", "(", "IHC", ")", ".", "The", "p", "-", "values", "were", "determined", "by", "unpaired", "t", "-", "test", "on", "panel", "B", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "and", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "±", "SD", ".", "Number", "of", "replicates", "is", "n", "≥", "3", ".", "(", "C", ")", "P", "-", "Smad2", "staining", "by", "IHC", "in", "3", "representative", "tumors", "per", "group", "after", "25", "days", "of", "treatment", ".", "The", "scale", "represents", "500μm", "and", "100μm", "on", "the", "left", "and", "right", "panels", ",", "respectively", ".", "(", "D", ")", "Boxplots", "representing", "the", "expression", "level", "of", "INHBB", ",", "PMEPA1", ",", "MYC", "and", "NRL", "in", "the", "different", "MB", "subtypes", ",", "as", "defined", "in", "Cavalli", "et", "al", ".", "(", "Cavalli", "et", "al", ".", ",", "2017", ")", ".", "Only", "p", "-", "values", "corresponding", "to", "comparisons", "between", "Group", "3", "subtypes", "are", "indicated", ".", "Patient", "samples", "are", "colored", "by", "subtypes", "as", "indicated", ".", "(", "E", ")", "Scatter", "plot", "of", "INHBB", "and", "PMEPA1", ",", "expression", "levels", "in", "Group", "3", "patient", "samples", ".", "Colored", "dots", "represent", "each", "patient", "sample", "and", "colors", "represent", "the", "group", "3", "MB", "subtypes", "(", "α", "in", "yellow", ",", "β", "in", "brown", "and", "δ", "in", "orange", ")", ".", "Wilcoxon", "rank", "-", "sum", "tests", "were", "performed", "for", "panel", "D", ".", "Spearman", "'", "s", "rank", "correlation", "coefficient", "ρ", "and", "p", "-", "value", "are", "indicated", "on", "panel", "E", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "and", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "±", "SD", ".", "Number", "of", "replicates", "is", "n", "≥", "3", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Kaplan-Meier representing survival of mice treated with either vehicle (black) or Galunisertib (LY2157299, red) or Cisplatin (blue) or a combination of Galunisertib and cisplatin (purple) after orthotopic grafting of PDX4 cells into the cerebellum. The pink rectangle represents Galunisertib treatment duration, while the blue dotted lines represent the 3 cisplatin administrations. The p-values were determined by Log-Rank (Mantel-Cox) test on panel A *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 and ****p < 0.0001. Bars represent the mean ± SD. Number of replicates is n≥3.(B) Boxplot of tumor area after 25 days of treatment. On the right, boxplots represent quantification of P-Smad2 staining on tumor (IHC). The p-values were determined by unpaired t-test on panel B. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 and ****p < 0.0001. Bars represent the mean ± SD. Number of replicates is n≥3.(C) P-Smad2 staining by IHC in 3 representative tumors per group after 25 days of treatment. The scale represents 500μm and 100μm on the left and right panels, respectively.(D) Boxplots representing the expression level of INHBB, PMEPA1, MYC and NRL in the different MB subtypes, as defined in Cavalli et al. (Cavalli et al., 2017). Only p-values corresponding to comparisons between Group 3 subtypes are indicated. Patient samples are colored by subtypes as indicated. (E) Scatter plot of INHBB and PMEPA1, expression levels in Group 3 patient samples. Colored dots represent each patient sample and colors represent the group 3 MB subtypes (α in yellow, β in brown and δ in orange). Wilcoxon rank-sum tests were performed for panel D. Spearman's rank correlation coefficient ρ and p-value are indicated on panel E. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 and ****p < 0.0001. Bars represent the mean ± SD. Number of replicates is n≥3."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "From", "top", "to", "bottom", ":", "experimental", "design", "of", "4D", "induction", ",", "fluorescence", "pictures", "of", "the", "SVZ", "of", "a", "4D", "+", "mouse", "and", "quantification", "of", "the", "proportion", "of", "RFP", "-", "(", "black", ")", "and", "RFP", "+", "(", "red", ")", "progenitors", "among", "B1", ",", "C", "and", "A", "cells", "identified", "with", "markers", "as", "indicated", ".", "(", "C", ")", "From", "top", "to", "bottom", ":", "experimental", "design", ",", "fluorescence", "pictures", "of", "the", "SVZ", "of", "a", "4D", "-", "(", "left", ")", "and", "4D", "+", "(", "right", "and", "insets", "magnified", ")", "mice", "and", "quantification", "of", "the", "proportion", "of", "BrdU", "+", "among", "B1", ",", "C", "and", "A", "cells", "(", "identified", "as", "in", "B", ")", ".", "Note", "that", "in", "4D", "+", "mice", "quantification", "was", "restricted", "to", "the", "RFP", "+", "subpopulation", "(", "red", "bars", ")", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "the", "absolute", "number", "of", "B1", ",", "C", "and", "A", "cells", "(", "identified", "as", "in", "B", ")", "in", "the", "SVZ", "of", "4D", "-", "(", "white", ")", "and", "4D", "+", "(", "black", ")", "mice", "regardless", "of", "RFP", "expression", "(", "RFP", "+", "/", "-", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B) From top to bottom: experimental design of 4D induction, fluorescence pictures of the SVZ of a 4D+ mouse and quantification of the proportion of RFP- (black) and RFP+ (red) progenitors among B1, C and A cells identified with markers as indicated.(C) From top to bottom: experimental design, fluorescence pictures of the SVZ of a 4D- (left) and 4D+ (right and insets magnified) mice and quantification of the proportion of BrdU+ among B1, C and A cells (identified as in B). Note that in 4D+ mice quantification was restricted to the RFP+ subpopulation (red bars).(D) Quantification of the absolute number of B1, C and A cells (identified as in B) in the SVZ of 4D- (white) and 4D+ (black) mice regardless of RFP expression (RFP+/-)."}
{"words": ["Figure", "2From", "top", "to", "bottom", ":", "fluorescence", "pictures", "of", "the", "SVZ", "and", "absolute", "number", "of", "cells", "in", "4D", "-", "(", "white", "bars", ")", "or", "4D", "+", "(", "black", "or", "red", "bars", "for", "all", "or", "RFP", "+", "cells", ",", "respectively", ")", "mice", "scored", "positive", "for", "various", "markers", "as", "indicated", ".", "From", "top", "to", "bottom", ":", "fluorescence", "pictures", "of", "the", "SVZ", "and", "absolute", "number", "of", "cells", "in", "4D", "-", "(", "white", "bars", ")", "or", "4D", "+", "(", "black", "or", "red", "bars", "for", "all", "or", "RFP", "+", "cells", ",", "respectively", ")", "mice", "scored", "positive", "for", "various", "markers", "as", "indicated", ".", "Insets", "in", "(", "C", ")", "are", "magnified", "(", "right", ")", "with", "arrowheads", "pointing", "label", "-", "retaining", "NSC", "(", "white", ")", "or", "astrocytes", "(", "empty", ")", ".", "From", "top", "to", "bottom", ":", "fluorescence", "pictures", "of", "the", "SVZ", "or", "proportions", "(", "C", "-", "E", ")", "of", "cells", "in", "4D", "-", "(", "white", "bars", ")", "or", "4D", "+", "(", "black", "or", "red", "bars", "for", "all", "or", "RFP", "+", "cells", ",", "respectively", ")", "mice", "scored", "positive", "for", "various", "markers", "as", "indicated", ".", "Arrowheads", "in", "(", "D", ")", "point", "cell", "doublets", "(", "among", "RFP", "+", "protein", "-", "reteining", "cells", "in", "4D", "+", ")", ".", "From", "top", "to", "bottom", ":", "fluorescence", "pictures", "of", "OB", "(", "E", ")", "and", "absolute", "number", "or", "proportions", "of", "cells", "in", "4D", "-", "(", "white", "bars", ")", "or", "4D", "+", "(", "black", "or", "red", "bars", "for", "all", "or", "RFP", "+", "cells", ",", "respectively", ")", "mice", "scored", "positive", "for", "various", "markers", "as", "indicated", ".", "(", "E", ")", "GL", "=", "glomerular", ",", "EPL", "=", "external", "plexiform", ",", "MCL", "=", "mitral", "cell", "and", "GCL", "=", "granule", "cell", "layers", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2From top to bottom: fluorescence pictures of the SVZ and absolute number of cells in 4D- (white bars) or 4D+ (black or red bars for all or RFP+ cells, respectively) mice scored positive for various markers as indicated.From top to bottom: fluorescence pictures of the SVZ and absolute number of cells in 4D- (white bars) or 4D+ (black or red bars for all or RFP+ cells, respectively) mice scored positive for various markers as indicated. Insets in (C) are magnified (right) with arrowheads pointing label-retaining NSC (white) or astrocytes (empty).From top to bottom: fluorescence pictures of the SVZ or proportions (C-E) of cells in 4D- (white bars) or 4D+ (black or red bars for all or RFP+ cells, respectively) mice scored positive for various markers as indicated. Arrowheads in (D) point cell doublets (among RFP+ protein-reteining cells in 4D+).From top to bottom: fluorescence pictures of OB (E) and absolute number or proportions of cells in 4D- (white bars) or 4D+ (black or red bars for all or RFP+ cells, respectively) mice scored positive for various markers as indicated. (E) GL=glomerular, EPL=external plexiform, MCL=mitral cell and GCL=granule cell layers."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", ")", "Fluorescence", "pictures", "(", "left", ")", "of", "immunolabeled", "GFP", "+", "RFP", "-", "(", "4D", "-", ")", "and", "GFP", "+", "RFP", "+", "(", "4D", "+", ")", "apical", "dendrites", "of", "superficial", "granule", "neurons", "and", "quantifications", "(", "middle", "and", "right", ")", "of", "spine", "density", "and", "total", "dendritic", "length", "(", "box", "and", "whiskers", ")", "and", "3D", "-", "Sholl", "(", "line", "graph", "profile", ")", "of", "apical", "dendrites", "starting", "from", "the", "soma", "(", "drawings", ")", "as", "the", "mean", "number", "of", "intersections", "at", "10", "μm", "intervals", ".", "(", "C", ")", "3D", "reconstruction", "of", "multi", "-", "channel", "confocal", "stacks", "acquired", "from", "a", "RFP", "+", "apical", "dendrite", "of", "a", "granule", "cell", "showing", "co", "-", "localization", "with", "the", "pre", "-", "and", "post", "-", "synaptic", "markers", "VIAAT", "(", "granule", "neuron", ")", "and", "gephyrin", "(", "mitral", "cell", ")", ",", "respectively", "(", "magnification", "shown", "in", "insets", ")", ".", "(", "D", ")", "Anti", "-", "RFP", "immunogold", "labeling", "of", "a", "cell", "in", "the", "superficial", "granule", "cell", "layer", "of", "a", "4D", "+", "mouse", ".", "Inset", "shows", "a", "representative", "RFP", "+", "synapse", "(", "out", "of", ">", "10", "analyzed", "from", "4D", "+", "mice", ")", ".", "Current", "clamp", "recordings", "showing", "examples", "of", "spontaneous", "barrages", "of", "synaptic", "potentials", "(", "E", ")", ",", "Inset", "in", "E", "(", "4D", "+", "cell", ")", "is", "magnified", "(", "bottom", ")", ".", "Current", "clamp", "recordings", "showing", "examples", "of", "repetitive", "spiking", "in", "response", "to", "depolarizing", "current", "steps", "(", "F", "-", "G", ")", "of", "4D", "-", "(", "top", ")", "and", "4D", "+", "(", "bottom", ")", "mice", ".", "Note", "in", "G", "that", "the", "lag", "preventing", "spike", "initiation", "is", "longer", "at", "lower", "currents", "(", "green", ")", "and", "shorter", "at", "higher", "(", "black", ")", ",", "suggesting", "the", "presence", "of", "an", "A", "-", "type", "K", "current", "typical", "of", "granule", "cells", "in", "4D", "-", "vs", ".", "4D", "+", ".", "(", "H", ")", "Box", "and", "whiskers", "plots", "representing", "electrophysiological", "properties", "of", "neurons", "derived", "from", "4D", "-", "and", "4D", "+", "NSC", "(", "black", "and", "red", ",", "respectively", ")", "including", "from", "left", "to", "right", ":", "spike", "number", ",", "resting", "membrane", "potential", "(", "Vrest", ")", ",", "input", "resistance", "(", "Rin", ")", "and", "lag", "to", "spiking", "of", "the", "recorded", "superficial", "granule", "cells", "(", "see", "Fig", ".", "EV3", "for", "additional", "parameters", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(B) Fluorescence pictures (left) of immunolabeled GFP+RFP- (4D-) and GFP+RFP+ (4D+) apical dendrites of superficial granule neurons and quantifications (middle and right) of spine density and total dendritic length (box and whiskers) and 3D-Sholl (line graph profile) of apical dendrites starting from the soma (drawings) as the mean number of intersections at 10 μm intervals.(C) 3D reconstruction of multi-channel confocal stacks acquired from a RFP+ apical dendrite of a granule cell showing co-localization with the pre- and post-synaptic markers VIAAT (granule neuron) and gephyrin (mitral cell), respectively (magnification shown in insets).(D) Anti-RFP immunogold labeling of a cell in the superficial granule cell layer of a 4D+ mouse. Inset shows a representative RFP+ synapse (out of >10 analyzed from 4D+ mice).Current clamp recordings showing examples of spontaneous barrages of synaptic potentials (E), Inset in E (4D+ cell) is magnified (bottom).Current clamp recordings showing examples of repetitive spiking in response to depolarizing current steps (F-G) of 4D- (top) and 4D+ (bottom) mice. Note in G that the lag preventing spike initiation is longer at lower currents (green) and shorter at higher (black), suggesting the presence of an A-type K current typical of granule cells in 4D- vs. 4D+.(H) Box and whiskers plots representing electrophysiological properties of neurons derived from 4D- and 4D+ NSC (black and red, respectively) including from left to right: spike number, resting membrane potential (Vrest), input resistance (Rin) and lag to spiking of the recorded superficial granule cells (see Fig. EV3 for additional parameters)."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "C", ")", "Line", "graph", "indicating", "the", "proportion", "of", "correct", "responses", "(", "performance", ")", "for", "bins", "of", "100", "trials", "each", "during", "testing", "with", "binary", "mixtures", "of", "concentrated", "octanols", ".", "Discontinuous", "line", "indicates", "the", "similar", "95", "%", "plateau", "performance", "of", "4D", "-", "(", "black", ")", "and", "4D", "+", "(", "red", ")", "mice", ".", "(", "D", ")", "Whiskers", "box", "plots", "of", "performance", "(", "left", ")", "and", "lick", "frequency", "(", "right", ")", "during", "a", "probe", "of", "200", "trials", "with", "1", ":", "10", "diluted", "octanols", "after", "testing", "as", "in", "(", "C", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(C) Line graph indicating the proportion of correct responses (performance) for bins of 100 trials each during testing with binary mixtures of concentrated octanols. Discontinuous line indicates the similar 95% plateau performance of 4D- (black) and 4D+ (red) mice. (D) Whiskers box plots of performance (left) and lick frequency (right) during a probe of 200 trials with 1:10 diluted octanols after testing as in (C)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "ATX", "serum", "protein", "levels", "were", "measured", "in", "blood", "serum", "samples", "from", "IBD", "patients", "and", "healthy", "controls", "using", "ELISA", ":", "active", "UC", "(", "n", "=", "26", ")", ",", "active", "CD", "(", "n", "=", "34", ")", ",", "control", "(", "Con", ")", "(", "n", "=", "26", ")", ".", "(", "B", ")", "Age", "-", "and", "sex", "-", "matched", "Atx", "∆", "ΜΕ", "/", "∆", "ΜΕ", ";", "Il10", "-", "/", "-", "mice", "(", "n", "=", "9", ")", "and", "Atx", "+", "/", "+", ";", "Il10", "-", "/", "-", "littermates", "(", "n", "=", "9", ")", "were", "examined", "for", "the", "development", "of", "spontaneous", "colitis", ".", "Body", "weight", "changes", "were", "monitored", "every", "other", "day", ",", "starting", "at", "the", "age", "of", "37", "days", "and", "ending", "at", "the", "age", "of", "6", "months", ".", "Results", "are", "means", "±", "SD", ".", "Data", "were", "compared", "by", "Two", "-", "way", "ANOVA", "(", "with", "treatment", "and", "times", ")", ",", "followed", "by", "the", "multiple", "-", "comparison", "Bonferroni", "t", "test", "to", "assess", "differences", "between", "groups", ".", "(", "C", ")", "Gross", "appearance", "of", "the", "full", "-", "length", "mouse", "colon", ".", "Each", "line", "on", "a", "ruler", "represents", "a", "millimeter", "(", "mm", ")", ".", "(", "D", "and", "E", ")", "H", "&", "E", "stained", "section", "of", "the", "mouse", "colon", ".", "Insets", "are", "enlarged", "in", "the", "lower", "panel", ".", "Colonic", "mucosa", "thickness", "was", "measured", "using", "ZEISS", "Axio", "Imager", "Z1", "microscope", "(", "n", "=", "14", "/", "group", ")", "(", "E", ")", ".", "(", "F", ")", "Histological", "parameters", "were", "quantified", "with", "H", "&", "E", "-", "colon", "sections", "(", "n", "=", "10", "/", "group", ")", "(", "D", ")", "and", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "(", "G", ")", "Survival", "of", "Atx", "∆", "ΜΕ", "/", "∆", "ΜΕ", ";", "Il10", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "17", ")", "and", "Atx", "+", "/", "+", ";", "Il10", "-", "/", "-", "littermates", "(", "n", "=", "18", ")", "was", "analyzed", "by", "the", "Kaplan", "-", "Meier", "method", "(", "Log", "-", "rank", "P", "=", "0", ".", "0046", ")", ".", "(", "H", ")", "Presented", "are", "H", "&", "E", "-", "stained", "sections", "of", "the", "small", "intestine", "in", "a", "'", "Swiss", "-", "Roll", "'", "form", ".", "Inset", "areas", "are", "enlarged", "in", "the", "right", "panel", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) ATX serum protein levels were measured in blood serum samples from IBD patients and healthy controls using ELISA: active UC (n=26), active CD (n=34), control (Con) (n=26).(B) Age- and sex-matched Atx∆ΜΕ/∆ΜΕ;Il10-/- mice (n=9) and Atx+/+;Il10-/- littermates (n=9) were examined for the development of spontaneous colitis. Body weight changes were monitored every other day, starting at the age of 37 days and ending at the age of 6 months. Results are means ± SD. Data were compared by Two-way ANOVA (with treatment and times), followed by the multiple-comparison Bonferroni t test to assess differences between groups.(C) Gross appearance of the full-length mouse colon. Each line on a ruler represents a millimeter (mm).(D and E) H&E stained section of the mouse colon. Insets are enlarged in the lower panel. Colonic mucosa thickness was measured using ZEISS Axio Imager Z1 microscope (n=14/group) (E).(F) Histological parameters were quantified with H&E-colon sections (n=10/group) (D) and shown as mean ± SEM.(G) Survival of Atx∆ΜΕ/∆ΜΕ;Il10-/- (n=17) and Atx+/+;Il10-/- littermates (n=18) was analyzed by the Kaplan-Meier method (Log-rank P=0.0046).(H) Presented are H&E-stained sections of the small intestine in a 'Swiss-Roll' form. Inset areas are enlarged in the right panel."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Total", "cell", "lysates", "of", "peritoneal", "macrophages", "from", "Atx", "∆", "ΜΕ", "/", "∆", "ΜΕ", "mice", "and", "Atx", "+", "/", "+", "littermates", "were", "subjected", "to", "immunoblotting", "analysis", "to", "confirm", "Atx", "deletion", ".", "(", "B", ")", "Peritoneal", "macrophages", "from", "the", "mice", "were", "subjected", "to", "the", "ESI", "-", "MS", "/", "MS", "method", "to", "quantify", "endogenous", "LPA", ".", "Individual", "molecular", "species", "of", "LPA", "and", "total", "LPA", "(", "inset", "graph", ")", "were", "compared", ".", "The", "data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "3", "/", "group", ")", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "one", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "C", "and", "D", ")", "Thioglycolate", "-", "elicited", "peritoneal", "immune", "cells", "harvested", "from", "the", "mice", "were", "immediately", "fixed", "for", "transmission", "electron", "microscopy", "to", "visualize", "the", "appearance", "of", "macrophages", "(", "C", ")", "and", "DCs", "(", "D", ")", ".", "Scale", "bar", "indicates", "1", "μm", ".", "Lipid", "rafts", "from", "peritoneal", "macrophages", "(", "E", ",", "F", ")", "were", "fractionated", "into", "10", "fractions", "though", "sucrose", "density", "gradient", "ultracentrifugation", "at", "100", ",", "000g", "for", "17", "h", ".", "Protein", "was", "purified", "and", "concentrated", "with", "the", "3K", "cut", "-", "off", "filter", ",", "followed", "by", "Western", "blot", "analysis", "with", "antibody", "recognizing", "the", "lipid", "raft", "marker", "proteins", "Caveolin", "or", "Flotillin", "-", "1", ".", "Lipid", "rafts", "from", "mouse", "macrophage", "Raw264", ".", "7", "cells", "treated", "with", "Atx", "inhibitor", "(", "Atx", "-", "i", ")", "PF8380", "(", "50", "μM", ",", "30", "min", ")", "or", "vehicle", "(", "Veh", ".", ",", "DMSO", "0", ".", "1", "%", ")", "(", "G", ")", "were", "fractionated", "into", "10", "fractions", "though", "sucrose", "density", "gradient", "ultracentrifugation", "at", "100", ",", "000g", "for", "17", "h", ".", "Protein", "was", "purified", "and", "concentrated", "with", "the", "3K", "cut", "-", "off", "filter", ",", "followed", "by", "Western", "blot", "analysis", "with", "antibody", "recognizing", "the", "lipid", "raft", "marker", "proteins", "Flotillin", "-", "1", ".", "(", "H", ")", "Peritoneal", "macrophages", "were", "stained", "with", "Alexa", "Fluor", "594", "-", "cholera", "toxin", "subunit", "B", "(", "Red", ")", ".", "The", "plasma", "membrane", "was", "examined", "with", "FV10i", "confocal", "scanning", "microscopy", ".", "Inset", "areas", "were", "magnified", "at", "the", "right", "panel", ".", "Each", "scale", "bar", "indicates", "10", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Total cell lysates of peritoneal macrophages from Atx∆ΜΕ/∆ΜΕ mice and Atx+/+ littermates were subjected to immunoblotting analysis to confirm Atx deletion.(B) Peritoneal macrophages from the mice were subjected to the ESI-MS/MS method to quantify endogenous LPA. Individual molecular species of LPA and total LPA (inset graph) were compared. The data are shown as mean ± SEM (n=3/group) *P < 0.05 (one-tailed unpaired t-test).(C and D) Thioglycolate-elicited peritoneal immune cells harvested from the mice were immediately fixed for transmission electron microscopy to visualize the appearance of macrophages (C) and DCs (D). Scale bar indicates 1 μm.Lipid rafts from peritoneal macrophages (E, F) were fractionated into 10 fractions though sucrose density gradient ultracentrifugation at 100,000g for 17 h. Protein was purified and concentrated with the 3K cut-off filter, followed by Western blot analysis with antibody recognizing the lipid raft marker proteins Caveolin or Flotillin-1.Lipid rafts from mouse macrophage Raw264.7 cells treated with Atx inhibitor (Atx-i) PF8380 (50 μM, 30 min) or vehicle (Veh., DMSO 0.1%) (G) were fractionated into 10 fractions though sucrose density gradient ultracentrifugation at 100,000g for 17 h. Protein was purified and concentrated with the 3K cut-off filter, followed by Western blot analysis with antibody recognizing the lipid raft marker proteins Flotillin-1.(H) Peritoneal macrophages were stained with Alexa Fluor 594-cholera toxin subunit B (Red). The plasma membrane was examined with FV10i confocal scanning microscopy. Inset areas were magnified at the right panel. Each scale bar indicates 10 μm."}
{"words": ["Figure", "3Peritoneal", "macrophages", "(", "A", ")", "were", "stimulated", "with", "LPS", "(", "20", "ng", "/", "mL", ",", "20", "min", ")", "Cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "co", "-", "immunoprecipitation", "(", "IP", ")", "with", "CD14", "antibody", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "(", "IB", ")", "with", "TLR4", "antibody", ".", "Raw264", ".", "7", "cells", "(", "B", ")", "were", "stimulated", "with", "LPS", "(", "20", "ng", "/", "mL", ",", "20", "min", ")", "in", "the", "presence", "/", "absence", "of", "ATX", "inhibitor", "(", "50", "μM", ",", "30", "min", ")", "or", "vehicle", "(", "Veh", ",", "DMSO", "0", ".", "1", "%", ")", ".", "Cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "co", "-", "immunoprecipitation", "(", "IP", ")", "with", "CD14", "antibody", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "(", "IB", ")", "with", "TLR4", "antibody", ".", "The", "physical", "interaction", "of", "TLR4", "-", "CD14", "was", "examined", "by", "FRET", "analysis", ".", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "TLR4", "-", "EYFP", "(", "yellow", ")", "and", "CD14", "-", "ECFP", "(", "blue", ")", "(", "C", ")", "followed", "by", "ATX", "inhibitor", "(", "50", "μM", ",", "30", "min", ")", "or", "vehicle", "treatment", "(", "Veh", ",", "DMSO", "0", ".", "1", "%", ")", ".", "Cells", "were", "washed", "with", "PBS", "and", "fixed", ",", "then", "visualized", "with", "filter", "sets", "for", "CFP", "and", "YFP", ".", "FRET", "images", "were", "visualized", "with", "the", "FRET", "filter", "set", ",", "expressed", "as", "corrected", "FRET", "efficiency", "and", "displayed", "in", "quantitative", "pseudocolor", "indicating", "the", "distance", "between", "proteins", "(", "arbitrary", "linear", "units", "of", "fluorescence", "intensity", ")", ".", "Presented", "are", "the", "representative", "images", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Scale", "bar", "indicates", "5", "μm", ".", "The", "physical", "interaction", "of", "TLR4", "-", "TLR4", "was", "examined", "by", "FRET", "analysis", ".", "HEK293", "cells", "were", "transfected", "with", "TLR4", "-", "EYFP", "and", "TLR4", "-", "ECFP", "(", "D", ")", ",", "followed", "by", "ATX", "inhibitor", "(", "50", "μM", ",", "30", "min", ")", "or", "vehicle", "treatment", "(", "Veh", ",", "DMSO", "0", ".", "1", "%", ")", ".", "Cells", "were", "washed", "with", "PBS", "and", "fixed", ",", "then", "visualized", "with", "filter", "sets", "for", "CFP", "and", "YFP", ".", "FRET", "images", "were", "visualized", "with", "the", "FRET", "filter", "set", ",", "expressed", "as", "corrected", "FRET", "efficiency", "and", "displayed", "in", "quantitative", "pseudocolor", "indicating", "the", "distance", "between", "proteins", "(", "arbitrary", "linear", "units", "of", "fluorescence", "intensity", ")", ".", "Presented", "are", "the", "representative", "images", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Scale", "bar", "indicates", "5", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Peritoneal macrophages (A) were stimulated with LPS (20 ng/mL, 20 min) Cell lysates were subjected to co-immunoprecipitation (IP) with CD14 antibody, followed by immunoblotting (IB) with TLR4 antibody.Raw264.7 cells (B) were stimulated with LPS (20 ng/mL, 20 min) in the presence/absence of ATX inhibitor (50 μM, 30 min) or vehicle (Veh, DMSO 0.1%). Cell lysates were subjected to co-immunoprecipitation (IP) with CD14 antibody, followed by immunoblotting (IB) with TLR4 antibody.The physical interaction of TLR4-CD14 was examined by FRET analysis. HEK293 cells were transfected with TLR4-EYFP (yellow) and CD14-ECFP (blue) (C) followed by ATX inhibitor (50 μM, 30 min) or vehicle treatment (Veh, DMSO 0.1%). Cells were washed with PBS and fixed, then visualized with filter sets for CFP and YFP. FRET images were visualized with the FRET filter set, expressed as corrected FRET efficiency and displayed in quantitative pseudocolor indicating the distance between proteins (arbitrary linear units of fluorescence intensity). Presented are the representative images from at least three independent experiments. Scale bar indicates 5 μm.The physical interaction of TLR4-TLR4 was examined by FRET analysis. HEK293 cells were transfected with TLR4-EYFP and TLR4-ECFP (D), followed by ATX inhibitor (50 μM, 30 min) or vehicle treatment (Veh, DMSO 0.1%). Cells were washed with PBS and fixed, then visualized with filter sets for CFP and YFP. FRET images were visualized with the FRET filter set, expressed as corrected FRET efficiency and displayed in quantitative pseudocolor indicating the distance between proteins (arbitrary linear units of fluorescence intensity). Presented are the representative images from at least three independent experiments. Scale bar indicates 5 μm."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", "and", "B", ")", "Peritoneal", "macrophages", "from", "Atx", "+", "/", "+", "(", "A", ")", "and", "Atx", "∆", "ΜΕ", "/", "∆", "ΜΕ", "(", "B", ")", "mice", "were", "stimulated", "with", "LPS", "(", "20", "ng", "/", "mL", ",", "20", "min", ")", ",", "followed", "by", "fixation", "in", "4", "%", "paraformaldehyde", "for", "15", "min", "at", "room", "temperature", "and", "staining", "with", "TLR4", "-", "anti", "rabbit", "FITC", "(", "Green", ")", ",", "early", "endosomal", "marker", "EEA1", "-", "anti", "mouse", "Dylight405", "(", "Blue", ")", ",", "and", "Alexa", "Fluor", "594", "-", "CTXB", "(", "Red", ")", ".", "TLR4", "internalization", "was", "examined", "with", "confocal", "microscopy", ".", "Presented", "are", "the", "representative", "from", "3", "independent", "experiments", "in", "which", "more", "than", "95", "%", "of", "the", "cells", "exhibited", "similar", "results", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A and B) Peritoneal macrophages from Atx+/+ (A) and Atx∆ΜΕ/∆ΜΕ (B) mice were stimulated with LPS (20 ng/mL, 20 min), followed by fixation in 4% paraformaldehyde for 15 min at room temperature and staining with TLR4-anti rabbit FITC (Green), early endosomal marker EEA1-anti mouse Dylight405 (Blue), and Alexa Fluor 594-CTXB (Red). TLR4 internalization was examined with confocal microscopy. Presented are the representative from 3 independent experiments in which more than 95% of the cells exhibited similar results. Scale bar, 10 μm."}
{"words": ["Figure", "5The", "macrophages", "from", "Atx", "∆", "ΜΕ", "/", "∆", "ΜΕ", "and", "Atx", "+", "/", "+", "mice", "were", "stimulated", "with", "LPS", "(", "20", "ng", "/", "mL", ",", "20", "min", ")", "The", "cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "(", "IP", ")", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "(", "IB", ")", "analysis", "with", "the", "antibodies", "indicated", ".", "Presented", "is", "the", "representative", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Raw264", ".", "7", "cells", "were", "stimulated", "by", "LPS", "with", "the", "ATX", "inhibitor", "(", "50", "μM", ",", "30", "min", ")", "or", "vehicle", "(", "Veh", ",", "DMSO", "0", ".", "1", "%", ")", "The", "cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "(", "IP", ")", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "(", "IB", ")", "analysis", "with", "the", "antibodies", "indicated", ".", "Presented", "is", "the", "representative", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "The", "macrophages", "from", "Atx", "∆", "ΜΕ", "/", "∆", "ΜΕ", "and", "Atx", "+", "/", "+", "mice", "were", "stimulated", "with", "LPS", "(", "20", "ng", "/", "mL", ",", "20", "min", ")", "The", "cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "(", "IP", ")", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "(", "IB", ")", "analysis", "with", "the", "antibodies", "indicated", ".", "Presented", "is", "the", "representative", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "Raw264", ".", "7", "cells", "were", "stimulated", "by", "LPS", "with", "the", "ATX", "inhibitor", "(", "50", "μM", ",", "30", "min", ")", "or", "vehicle", "(", "Veh", ",", "DMSO", "0", ".", "1", "%", ")", "The", "cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "(", "IP", ")", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "(", "IB", ")", "analysis", "with", "the", "antibodies", "indicated", ".", "Presented", "is", "the", "representative", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "The", "macrophages", "from", "Atx", "∆", "ΜΕ", "/", "∆", "ΜΕ", "and", "Atx", "+", "/", "+", "mice", "were", "stimulated", "with", "LPS", "(", "20", "ng", "/", "mL", ",", "20", "min", ")", "The", "cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "(", "IP", ")", ",", "followed", "by", "immunoblotting", "(", "IB", ")", "analysis", "with", "the", "antibodies", "indicated", ".", "Presented", "is", "the", "representative", "from", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5The macrophages from Atx∆ΜΕ/∆ΜΕ and Atx+/+ mice were stimulated with LPS (20 ng/mL, 20 min) The cell lysates were subjected to immunoprecipitation (IP), followed by immunoblotting (IB) analysis with the antibodies indicated. Presented is the representative from three independent experiments.Raw264.7 cells were stimulated by LPS with the ATX inhibitor (50 μM, 30 min) or vehicle (Veh, DMSO 0.1%) The cell lysates were subjected to immunoprecipitation (IP), followed by immunoblotting (IB) analysis with the antibodies indicated. Presented is the representative from three independent experiments.The macrophages from Atx∆ΜΕ/∆ΜΕ and Atx+/+ mice were stimulated with LPS (20 ng/mL, 20 min) The cell lysates were subjected to immunoprecipitation (IP), followed by immunoblotting (IB) analysis with the antibodies indicated. Presented is the representative from three independent experiments.Raw264.7 cells were stimulated by LPS with the ATX inhibitor (50 μM, 30 min) or vehicle (Veh, DMSO 0.1%) The cell lysates were subjected to immunoprecipitation (IP), followed by immunoblotting (IB) analysis with the antibodies indicated. Presented is the representative from three independent experiments.The macrophages from Atx∆ΜΕ/∆ΜΕ and Atx+/+ mice were stimulated with LPS (20 ng/mL, 20 min) The cell lysates were subjected to immunoprecipitation (IP), followed by immunoblotting (IB) analysis with the antibodies indicated. Presented is the representative from three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "6The", "macrophages", "from", "Atx", "∆", "ΜΕ", "/", "∆", "ΜΕ", "and", "Atx", "+", "/", "+", "mice", "were", "stimulated", "by", "LPS", "[", "20", "ng", "/", "mL", ",", "20", "min", ":", "The", "cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "immunoblotting", "analysis", "with", "antibodies", "as", "indicated", ".", "Regular", "ERK1", "/", "2", ",", "were", "used", "for", "a", "loading", "control", ".", "Presented", "are", "the", "representative", "image", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "The", "macrophages", "from", "Atx", "∆", "ΜΕ", "/", "∆", "ΜΕ", "and", "Atx", "+", "/", "+", "mice", "were", "stimulated", "by", "LPS", "[", "20", "ng", "/", "mL", ",", "20", "min", "The", "cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "immunoblotting", "analysis", "with", "antibodies", "as", "indicated", ".", "regular", "Akt", "were", "used", "for", "a", "loading", "control", ".", "Presented", "are", "the", "representative", "image", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Atx", "-", "heterozygous", "(", "Atx", "-", "Het", ")", "mice", "and", "wild", "type", "littermates", "(", "C", ")", "were", "stimulated", "by", "LPS", "indicated", "time", "point", "The", "cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "immunoblotting", "analysis", "with", "antibodies", "as", "indicated", ".", "RasGAP", "levels", "were", "used", "for", "a", "loading", "control", ".", "Presented", "are", "the", "representative", "image", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "D", ")", "Raw264", ".", "7", "cells", "were", "stimulated", "by", "LPS", "with", "the", "ATX", "inhibitor", ".", "The", "cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "immunoblotting", "analysis", "with", "antibodies", "as", "indicated", ".", ",", "β", "-", "Actin", "were", "used", "for", "a", "loading", "control", ".", "Presented", "are", "the", "representative", "image", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "The", "macrophages", "from", "Atx", "∆", "ΜΕ", "/", "∆", "ΜΕ", "mice", "and", "Atx", "+", "/", "+", "littermates", "were", "activated", "with", "TLR2", "ligand", "Peptidoglycan", "(", "PGN", ",", "30", "ng", "/", "mL", ")", "(", "E", ")", "for", "the", "indicated", "time", "points", ".", "The", "cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "immunoblotting", "analysis", "with", "antibodies", "as", "indicated", ".", "Regular", "ERK1", "/", "2", "were", "used", "for", "a", "loading", "control", ".", "Presented", "are", "the", "representative", "image", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "The", "macrophages", "from", "Atx", "∆", "ΜΕ", "/", "∆", "ΜΕ", "mice", "and", "Atx", "+", "/", "+", "littermates", "were", "activated", "with", "Pam3CSK4", "(", "1", "μg", "/", "mL", ")", "(", "F", ")", "for", "the", "indicated", "time", "points", ".", "The", "cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "immunoblotting", "analysis", "with", "antibodies", "as", "indicated", ".", "Regular", "ERK1", "/", "2", "were", "used", "for", "a", "loading", "control", ".", "Presented", "are", "the", "representative", "image", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "The", "macrophages", "from", "Atx", "∆", "ΜΕ", "/", "∆", "ΜΕ", "mice", "and", "Atx", "+", "/", "+", "littermates", "were", "activated", "with", "IL", "-", "1β", "(", "100", "ng", "/", "mL", ")", "for", "the", "indicated", "time", "points", ".", ":", "The", "cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "immunoblotting", "analysis", "with", "antibodies", "as", "indicated", ".", "Regular", "ERK1", "/", "2", "were", "used", "for", "a", "loading", "control", ".", "Presented", "are", "the", "representative", "image", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "The", "macrophages", "from", "Atx", "∆", "ΜΕ", "/", "∆", "ΜΕ", "mice", "and", "Atx", "+", "/", "+", "littermates", "were", "activated", "with", "TNFα", "(", "25", "ng", "/", "mL", ")", "(", "H", ")", "for", "the", "indicated", "time", "points", ".", "The", "cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "immunoblotting", "analysis", "with", "antibodies", "as", "indicated", ".", "Regular", "ERK1", "/", "2", "were", "used", "for", "a", "loading", "control", ".", "Presented", "are", "the", "representative", "image", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6The macrophages from Atx∆ΜΕ/∆ΜΕ and Atx+/+ mice were stimulated by LPS [20 ng/mL, 20 min : The cell lysates were subjected to immunoblotting analysis with antibodies as indicated. Regular ERK1/2, were used for a loading control. Presented are the representative image from at least three independent experiments.The macrophages from Atx∆ΜΕ/∆ΜΕ and Atx+/+ mice were stimulated by LPS [20 ng/mL, 20 min The cell lysates were subjected to immunoblotting analysis with antibodies as indicated. regular Akt were used for a loading control. Presented are the representative image from at least three independent experiments.Atx-heterozygous (Atx-Het) mice and wild type littermates (C) were stimulated by LPS indicated time point The cell lysates were subjected to immunoblotting analysis with antibodies as indicated. RasGAP levels were used for a loading control. Presented are the representative image from at least three independent experiments.(D) Raw264.7 cells were stimulated by LPS with the ATX inhibitor. The cell lysates were subjected to immunoblotting analysis with antibodies as indicated. , β-Actin were used for a loading control. Presented are the representative image from at least three independent experiments.The macrophages from Atx∆ΜΕ/∆ΜΕ mice and Atx+/+ littermates were activated with TLR2 ligand Peptidoglycan (PGN, 30 ng/mL) (E) for the indicated time points. The cell lysates were subjected to immunoblotting analysis with antibodies as indicated. Regular ERK1/2 were used for a loading control. Presented are the representative image from at least three independent experiments.The macrophages from Atx∆ΜΕ/∆ΜΕ mice and Atx+/+ littermates were activated with Pam3CSK4 (1 μg/mL) (F) for the indicated time points. The cell lysates were subjected to immunoblotting analysis with antibodies as indicated. Regular ERK1/2 were used for a loading control. Presented are the representative image from at least three independent experiments.The macrophages from Atx∆ΜΕ/∆ΜΕ mice and Atx+/+ littermates were activated with IL-1β (100 ng/mL) for the indicated time points. : The cell lysates were subjected to immunoblotting analysis with antibodies as indicated. Regular ERK1/2 were used for a loading control. Presented are the representative image from at least three independent experiments.The macrophages from Atx∆ΜΕ/∆ΜΕ mice and Atx+/+ littermates were activated with TNFα (25 ng/mL) (H) for the indicated time points. The cell lysates were subjected to immunoblotting analysis with antibodies as indicated. Regular ERK1/2 were used for a loading control. Presented are the representative image from at least three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "7Peritoneal", "macrophages", "from", "Atx", "∆", "ΜΕ", "/", "∆", "ΜΕ", "mice", "and", "Atx", "+", "/", "+", "littermates", "(", "A", ")", "were", "stimulated", "with", "LPS", "(", "50", "ng", "/", "mL", ",", "8", "h", ")", "The", "culture", "medium", "was", "collected", "for", "ELISA", "to", "measure", "the", "level", "of", "secreted", "cytokines", ".", "All", "assays", "were", "performed", "in", "triplicate", ",", "and", "data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "Raw264", ".", "7", "cells", "(", "B", ")", "were", "stimulated", "with", "LPS", "(", "50", "ng", "/", "mL", ",", "8", "h", ")", "in", "the", "presence", "/", "absence", "of", "the", "ATX", "inhibitor", "(", "50", "μM", ",", "30", "min", ")", ".", "The", "culture", "medium", "was", "collected", "for", "ELISA", "to", "measure", "the", "level", "of", "secreted", "cytokines", ".", "All", "assays", "were", "performed", "in", "triplicate", ",", "and", "data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "Peritoneal", "macrophages", "were", "stimulated", "with", "LPS", "or", "vehicle", "(", "endotoxin", "free", "water", ")", ",", "after", "which", "intracellular", "cytokine", "production", "was", "measured", "through", "FACS", "analysis", ".", "With", "the", "scatter", "dot", "plot", ",", "the", "gate", "was", "set", "so", "that", "the", "viable", "cells", "were", "selected", "to", "analyze", "the", "intensity", "of", "the", "fluorescence", "signal", "by", "flow", "cytometry", ".", "The", "overlay", "plot", "represents", "the", "cytometry", "data", ".", "Peritoneal", "macrophages", "were", "stimulated", "with", "LPS", "or", "vehicle", "(", "endotoxin", "free", "water", ")", ",", "after", "which", "intracellular", "cytokine", "production", "was", "measured", "through", "FACS", "analysis", ".", "With", "the", "scatter", "dot", "plot", ",", "the", "gate", "was", "set", "so", "that", "the", "viable", "cells", "were", "selected", "to", "analyze", "the", "intensity", "of", "the", "fluorescence", "signal", "by", "flow", "cytometry", ".", "The", "overlay", "plot", "represents", "the", "cytometry", "data", ".", "(", "F", ")", "To", "induce", "sepsis", "via", "LPS", "injection", "(", "Shirey", "et", "al", ".", ",", "2013", ";", "Voss", "et", "al", ".", ",", "2016", ")", ",", "age", "(", "9", "-", "10", "weeks", ")", "-", "and", "sex", "-", "matched", "Atx", "∆", "ΜΕ", "/", "∆", "ΜΕ", "mice", "(", "n", " ", "=", " ", "9", ")", "and", "Atx", "+", "/", "+", "littermates", "(", "n", " ", "=", " ", "21", ")", "were", "injected", "with", "LPS", "(", "i", ".", "p", ".", "25", "mg", "/", "kg", ")", ".", "Survival", "was", "monitored", "for", "up", "to", "16", "h", ",", "and", "analyzed", "by", "the", "Kaplan", "-", "Meier", "method", "(", "Log", "-", "rank", "P", "=", "0", ".", "0004", ")", ".", "(", "G", ")", "Blood", "samples", "were", "collected", "from", "Atx", "∆", "ΜΕ", "/", "∆", "ΜΕ", "(", "n", " ", "=", " ", "7", ")", "and", "Atx", "+", "/", "+", "(", "n", " ", "=", " ", "6", ")", "mice", "10", "h", "after", "LPS", "injection", ",", "after", "which", "the", "serum", "TNFα", "protein", "level", "was", "measured", ".", "The", "data", "are", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Peritoneal macrophages from Atx∆ΜΕ/∆ΜΕ mice and Atx+/+ littermates (A) were stimulated with LPS (50 ng/mL, 8 h) The culture medium was collected for ELISA to measure the level of secreted cytokines. All assays were performed in triplicate, and data are shown as mean ± SEM.Raw264.7 cells (B) were stimulated with LPS (50 ng/mL, 8 h) in the presence/absence of the ATX inhibitor (50 μM, 30 min). The culture medium was collected for ELISA to measure the level of secreted cytokines. All assays were performed in triplicate, and data are shown as mean ± SEM.Peritoneal macrophages were stimulated with LPS or vehicle (endotoxin free water), after which intracellular cytokine production was measured through FACS analysis. With the scatter dot plot, the gate was set so that the viable cells were selected to analyze the intensity of the fluorescence signal by flow cytometry. The overlay plot represents the cytometry data.Peritoneal macrophages were stimulated with LPS or vehicle (endotoxin free water), after which intracellular cytokine production was measured through FACS analysis. With the scatter dot plot, the gate was set so that the viable cells were selected to analyze the intensity of the fluorescence signal by flow cytometry. The overlay plot represents the cytometry data.(F) To induce sepsis via LPS injection (Shirey et al., 2013; Voss et al., 2016), age (9-10 weeks)- and sex-matched Atx∆ΜΕ/∆ΜΕ mice (n = 9) and Atx+/+ littermates (n = 21) were injected with LPS (i.p. 25 mg/kg). Survival was monitored for up to 16 h, and analyzed by the Kaplan-Meier method (Log-rank P=0.0004).(G) Blood samples were collected from Atx∆ΜΕ/∆ΜΕ (n = 7) and Atx+/+ (n = 6) mice 10 h after LPS injection, after which the serum TNFα protein level was measured. The data are shown as mean ± SEM."}
{"words": ["Figure", "8Confocal", "laser", "scanning", "micrographs", "of", "the", "macrophages", "from", "Atx", "∆", "ΜΕ", "/", "∆", "ΜΕ", "mice", "and", "Atx", "+", "/", "+", "littermates", ".", "Cells", "were", "incubated", "with", "IgG", "-", "opsonized", "latex", "beads", "in", "the", "absence", "/", "presence", "of", "LPS", "(", "20", "ng", "/", "mL", ",", "2", "h", ")", "and", "stained", "with", "Phalloidin", "(", "F", "-", "actin", ")", "and", "DAPI", ".", "Internalized", "beads", "were", "examined", "under", "a", "higher", "(", "A", ")", "Confocal", "laser", "scanning", "micrographs", "of", "the", "macrophages", "from", "Atx", "∆", "ΜΕ", "/", "∆", "ΜΕ", "mice", "and", "Atx", "+", "/", "+", "littermates", ".", "Cells", "were", "incubated", "with", "IgG", "-", "opsonized", "latex", "beads", "in", "the", "absence", "/", "presence", "of", "LPS", "(", "20", "ng", "/", "mL", ",", "2", "h", ")", "and", "stained", "with", "Phalloidin", "(", "F", "-", "actin", ")", "and", "DAPI", ".", "Internalized", "beads", "were", "examined", "under", "a", "lower", "magnification", "(", "B", ")", "to", "quantify", "%", "phagocytosis", "by", "dividing", "latex", "bead", "-", "positive", "cell", "numbers", "by", "the", "total", "number", "of", "DAPI", "-", "positive", "cells", "(", "n", "=", "11", "-", "16", "per", "group", ")", ".", "The", "data", "are", "analyzed", "with", "results", "accumulated", "from", "three", "independent", "experiments", "and", "shown", "as", "mean", "±", "SEM", "(", "B", ")", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ")", ".", "(", "C", ")", "LPS", "-", "stimulated", "macrophages", "were", "co", "-", "incubated", "with", "IgG", "-", "opsonized", "latex", "beads", "for", "40", "min", ".", "Phagocytic", "cups", "were", "visualized", "by", "F", "-", "actin", "staining", "with", "Phalloidin", "-", "iFluor", "647", ".", "The", "arrow", "indicates", "the", "phagocytic", "cup", "formed", "in", "the", "plasma", "membrane", ".", "Scale", "bar", "is", "10", "μm", ".", "After", "LPS", "(", "20", "ng", "/", "mL", ",", "4", "h", ")", "treatment", ",", "LPS", "-", "induced", "iNos", ",", "Arginase", "-", "1", "(", "Arg", "-", "1", ")", ",", "and", "Ym", "-", "1", "mRNA", "expression", "were", "evaluated", "by", "semi", "-", "quantitative", "PCR", "(", "D", ")", ".", "With", "LPS", "stimulation", "(", "20", "ng", "/", "mL", ",", "8", "h", ")", ",", "iNOS", "protein", "production", "was", "examined", "by", "immunoblotting", "analysis", "(", "E", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8Confocal laser scanning micrographs of the macrophages from Atx∆ΜΕ/∆ΜΕ mice and Atx+/+ littermates. Cells were incubated with IgG-opsonized latex beads in the absence/presence of LPS (20 ng/mL, 2 h) and stained with Phalloidin (F-actin) and DAPI. Internalized beads were examined under a higher(A)Confocal laser scanning micrographs of the macrophages from Atx∆ΜΕ/∆ΜΕ mice and Atx+/+ littermates. Cells were incubated with IgG-opsonized latex beads in the absence/presence of LPS (20 ng/mL, 2 h) and stained with Phalloidin (F-actin) and DAPI. Internalized beads were examined under a lower magnification (B) to quantify % phagocytosis by dividing latex bead-positive cell numbers by the total number of DAPI-positive cells (n=11 - 16 per group). The data are analyzed with results accumulated from three independent experiments and shown as mean ± SEM (B). **P < 0.01 (Mann-Whitney U test).(C) LPS-stimulated macrophages were co-incubated with IgG-opsonized latex beads for 40 min. Phagocytic cups were visualized by F-actin staining with Phalloidin-iFluor 647. The arrow indicates the phagocytic cup formed in the plasma membrane. Scale bar is 10 μm.After LPS (20 ng/mL, 4 h) treatment, LPS-induced iNos, Arginase-1 (Arg-1), and Ym-1 mRNA expression were evaluated by semi-quantitative PCR (D).With LPS stimulation (20 ng/mL, 8 h), iNOS protein production was examined by immunoblotting analysis (E)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Time", "-", "dependent", "killing", "of", "a", "panel", "of", "bacterial", "isolates", "in", "the", "presence", "of", "meropenem", "(", "MEM10", ",", "10", "µg", "/", "ml", ")", ".", "Cells", "were", "grown", "overnight", "and", "sub", "-", "cultured", "for", "30", "minutes", "at", "37", "°", "C", "before", "being", "exposed", "to", "meropenem", "at", "10", "µg", "/", "mL", "and", "moved", "to", "a", "37", "°", "C", "stationary", "incubator", ".", "Samples", "were", "taken", "at", "each", "indicated", "time", "point", "and", "spot", "-", "titered", "onto", "LB", "medium", "to", "quantify", "colony", "forming", "units", "(", "CFU", "/", "mL", ")", "throughout", "meropenem", "treatment", ".", "(", "B", ")", "images", "of", "cells", "corresponding", "to", "the", "time", "points", "in", "(", "A", ")", "were", "taken", "after", "labeling", "with", "membrane", "stain", "FM4", "-", "64", ".", "E", ".", "cloacae", ",", "Enterobacter", "cloacae", ";", "K", ".", "aerogenes", ",", "Klebsiella", "aerogenes", ";", "K", ".", "pneumoniae", ",", "Klebsiella", "pneumoniae", ";", "E", ".", "coli", ",", "Escherichia", "coli"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Time-dependent killing of a panel of bacterial isolates in the presence of meropenem (MEM10, 10 µg/ml). Cells were grown overnight and sub-cultured for 30 minutes at 37°C before being exposed to meropenem at 10 µg/mL and moved to a 37°C stationary incubator. Samples were taken at each indicated time point and spot-titered onto LB medium to quantify colony forming units (CFU/mL) throughout meropenem treatment. (B) images of cells corresponding to the time points in (A) were taken after labeling with membrane stain FM4-64. E. cloacae, Enterobacter cloacae; K. aerogenes, Klebsiella aerogenes; K. pneumoniae, Klebsiella pneumoniae; E. coli, Escherichia coli "}
{"words": ["Figure", "2", "(", "D", ")", "Regulatory", "modes", "of", "representative", "VxrB", "-", "controlled", "genes", "in", "response", "to", "PenG", ".", "Upper", "plot", "shows", "VxrB", "binding", "patterns", "(", "assessed", "via", "ChIP", "-", "Seq", ")", ",", "lower", "panel", "shows", "transcriptional", "response", "upon", "overexpression", "of", "VxrB", "D78E", "(", "assessed", "via", "RNA", "-", "Seq", ")", ".", "RNA", "expression", "was", "confirmed", "by", "S1", "nuclease", "mapping", "assay", "in", "wild", "type", "and", "ΔvxrAB", "mutant", "strains", "after", "exposure", "to", "PenG", "(", "100", "µg", "/", "ml", "for", "3", "hours", ")", ".", "White", "demarcation", "line", "between", "time", "points", "indicates", "that", "these", "data", "points", "were", "not", "adjacent", "in", "the", "original", "experiment", "but", "were", "cropped", "for", "presentation", "purposes", ".", "Source", "data", "is", "available", "as", "supplemental", "material", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(D) Regulatory modes of representative VxrB-controlled genes in response to PenG. Upper plot shows VxrB binding patterns (assessed via ChIP-Seq), lower panel shows transcriptional response upon overexpression of VxrB D78E (assessed via RNA-Seq). RNA expression was confirmed by S1 nuclease mapping assay in wild type and ΔvxrAB mutant strains after exposure to PenG (100 µg/ml for 3 hours). White demarcation line between time points indicates that these data points were not adjacent in the original experiment but were cropped for presentation purposes. Source data is available as supplemental material."}
{"words": ["Figure", "3Reduction", "of", "cell", "wall", "synthesis", "gene", "expression", "causes", "a", "tolerance", "defect", ".", "(", "C", ")", "Survival", "of", "a", "∆", "pbp1b", "∆", "pbp1a", "Piptg", ":", "pbp1a", "strain", "after", "6", "hours", "of", "PenG", "exposure", ".", "Pup", "indicates", "conditions", "of", "high", "IPTG", "concentrations", "(", "100", "µM", ")", ",", "Pdown", "low", "IPTG", "concentration", "(", "2", "µM", ")", ".", "Survival", "fraction", "is", "cfu", "/", "ml", "of", "PenG", "-", "treated", "cultures", "normalized", "to", "untreated", "cultures", "grown", "in", "and", "plated", "on", "medium", "containing", "the", "same", "IPTG", "concentration", ".", "(", "D", ")", "Time", "-", "dependent", "killing", "experiment", "in", "the", "presence", "of", "PenG", "(", "100", "µg", "/", "ml", ",", "10", "x", "MIC", ")", ".", "All", "data", "are", "means", "(", "+", "/", "-", "standard", "error", ")", "of", "3", "independent", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Reduction of cell wall synthesis gene expression causes a tolerance defect. (C) Survival of a ∆pbp1b ∆pbp1a Piptg:pbp1a strain after 6 hours of PenG exposure. Pup indicates conditions of high IPTG concentrations (100 µM), Pdown low IPTG concentration (2 µM). Survival fraction is cfu/ml of PenG-treated cultures normalized to untreated cultures grown in and plated on medium containing the same IPTG concentration.(D) Time-dependent killing experiment in the presence of PenG (100 µg/ml, 10 x MIC). All data are means (+/- standard error) of 3 independent biological replicates."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "C", ")", "Time", "-", "course", "of", "iron", "accumulation", "in", "PenG", "-", "treated", "WT", "and", "∆", "vxrAB", "cells", "as", "measured", "by", "ICP", "-", "MS", ".", "Data", "are", "average", "of", "3", "independent", "biological", "replicates", ",", "error", "bars", "represent", "standard", "deviation", ".", "∗", "∗", "P", "=", "0", ".", "001", ";", "∗", "∗", "∗", "P", "<", "0", ".", "0003", "(", "paired", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(C) Time-course of iron accumulation in PenG-treated WT and ∆vxrAB cells as measured by ICP-MS. Data are average of 3 independent biological replicates, error bars represent standard deviation. ∗∗P=0.001; ∗∗∗P<0.0003 (paired t-test)."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "B", ")", ".", "To", "test", "PenG", "-", "mediated", "induction", "of", "Fur", "-", "regulated", "genes", ",", "S1", "nuclease", "mapping", "assays", "were", "performed", "on", "the", "small", "RNA", "ryhB", ",", "the", "RyhB", "target", "sodB", ",", "hutA", "/", "B", ",", "coding", "for", "heme", "transport", "systems", "and", "vc2212", ",", "which", "encodes", "a", "component", "of", "a", "ferric", "citrate", "uptake", "system", ")", ".", "Cells", "were", "grown", "to", "mid", "-", "exponential", "phase", "followed", "by", "exposure", "to", "H2O2", "or", "PenG", "for", "the", "indicated", "duration", ".", "Numbers", "represent", "expression", "levels", "normalized", "to", "untreated", "control", "(", "averages", "from", "three", "independent", "replicates", ")", ".", "White", "demarcation", "line", "between", "time", "points", "indicates", "that", "these", "data", "points", "were", "not", "adjacent", "in", "the", "original", "experiment", "but", "were", "cropped", "for", "presentation", "purposes", ".", "Source", "data", "is", "available", "as", "supplemental", "material", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(B). To test PenG-mediated induction of Fur-regulated genes, S1 nuclease mapping assays were performed on the small RNA ryhB, the RyhB target sodB, hutA/B, coding for heme transport systems and vc2212, which encodes a component of a ferric citrate uptake system). Cells were grown to mid-exponential phase followed by exposure to H2O2 or PenG for the indicated duration. Numbers represent expression levels normalized to untreated control (averages from three independent replicates). White demarcation line between time points indicates that these data points were not adjacent in the original experiment but were cropped for presentation purposes. Source data is available as supplemental material."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "B", ")", "and", "(", "C", ")", "Iron", "uptake", "mutants", "restore", "∆", "vxrAB", "growth", "on", "10", "%", "sucrose", ".", "The", "indicated", "strains", "were", "grown", "to", "exponential", "phase", "(", "OD600", "~", "0", ".", "5", ")", "in", "LB", "medium", "and", "spot", "-", "plated", "on", "10", "%", "Sucrose", "plates", "with", "or", "without", "additional", "iron", "sulfate", ".", "An", "example", "is", "shown", "in", "(", "B", ")", ",", "quantification", "of", "cfu", "is", "shown", "in", "(", "C", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "average", "of", "3", "independent", "biological", "replicates", ",", "error", "bars", "represent", "standard", "deviation", ".", "∗", "∗", "∗", "P", "<", "0", ".", "0003", ";", "∗", "∗", "∗", "∗", "P", "<", "0", ".", "0001", "(", "paired", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(B) and (C) Iron uptake mutants restore ∆vxrAB growth on 10% sucrose. The indicated strains were grown to exponential phase (OD600~0.5) in LB medium and spot-plated on 10% Sucrose plates with or without additional iron sulfate. An example is shown in (B), quantification of cfu is shown in (C). Data information: Data are average of 3 independent biological replicates, error bars represent standard deviation. ∗∗∗ P<0.0003; ∗∗∗∗ P<0.0001 (paired t-test)."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "B", ")", "Excretion", "of", "V", ".", "cholerae", ".", "Fecal", "samples", "were", "collected", "every", "two", "hours", "and", "assessed", "for", "their", "viable", "cell", "content", "(", "Colony", "Forming", "Units", ",", "CFU", ")", "to", "monitor", "the", "level", "of", "V", ".", "cholerae", "excretion", ".", "Each", "symbol", "represents", "fecal", "samples", "from", "an", "individual", "mouse", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "The", "number", "of", "bacterial", "CFU", "was", "normalized", "per", "milligram", "of", "feces", "(", "CFU", "/", "mg", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "deviation", ".", "∗", "∗", "P", "<", "0", ".", "005", ";", "∗", "∗", "∗", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "two", "-", "way", "ANOVA", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(B) Excretion of V. cholerae. Fecal samples were collected every two hours and assessed for their viable cell content (Colony Forming Units, CFU) to monitor the level of V. cholerae excretion. Each symbol represents fecal samples from an individual mouse (n=4). The number of bacterial CFU was normalized per milligram of feces (CFU/mg). Error bars represent standard deviation. ∗∗ P<0.005; ∗∗∗ P<0.001 (two-way ANOVA)."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "E", ")", "Time", "-", "dependent", "killing", "of", "respiratory", "chain", "mutants", "(", "∆", "nqrA", ",", "encoding", "NADH", "dehydrogenase", "and", "∆", "ubiA", ",", "encoding", "an", "early", "step", "of", "ubiquinone", "synthesis", ")", "in", "the", "presence", "of", "PenG", "(", "100", "µg", "/", "ml", ",", "10xMIC", ")", ".", "All", "strains", "were", "grown", "in", "LB", "0", ".", "2", "%", "glucose", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "mean", "of", "three", "independent", "biological", "replicates", "and", "error", "bars", "represent", "standard", "deviation", ".", "(", "F", ")", "Growth", "-", "phase", "dependent", "killing", "assay", "of", "ROS", "detoxification", "systems", "(", "∆", "fur", ",", "∆", "sodB", ",", "and", "∆", "oxyR1", "∆", "katG", "∆", "katB", ")", ".", "At", "designated", "time", "-", "points", ",", "a", "5", "ml", "aliquot", "was", "withdrawn", "and", "exposed", "to", "100", "µg", "/", "ml", "PenG", "for", "3", "h", ".", "CFU", "/", "mL", "for", "each", "time", "point", "was", "assessed", "before", "(", "solid", "lines", ")", "and", "after", "addition", "of", "PenG", "(", "dotted", "lines", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "mean", "of", "three", "independent", "biological", "replicates", "and", "error", "bars", "represent", "standard", "deviation", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(E) Time-dependent killing of respiratory chain mutants (∆nqrA, encoding NADH dehydrogenase and ∆ubiA, encoding an early step of ubiquinone synthesis) in the presence of PenG (100 µg/ml, 10xMIC). All strains were grown in LB 0.2 % glucose. Data information: Data are mean of three independent biological replicates and error bars represent standard deviation.(F) Growth-phase dependent killing assay of ROS detoxification systems (∆fur, ∆sodB, and ∆oxyR1∆katG∆katB). At designated time-points, a 5 ml aliquot was withdrawn and exposed to 100 µg/ml PenG for 3 h. CFU/mL for each time point was assessed before (solid lines) and after addition of PenG (dotted lines). Data information: Data are mean of three independent biological replicates and error bars represent standard deviation."}
{"words": ["Figure", "1IIA1", ".", "6", "B", "lymphoma", "cells", "were", "stimulated", "with", "BCR", "-", "ligand", "-", "(", "IgM", ")", "or", "BCR", "-", "ligand", "+", "(", "IgG", ")", "beads", "for", "60", "min", ",", "fixed", "and", "stained", "for", "F", "-", "actin", "(", "top", ")", "and", "α", "-", "tubulin", "(", "bottom", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "3", "µm", ".", "Histograms", "show", "the", "quantifications", "of", "the", "polymerized", "tubulin", "and", "filamentous", "F", "-", "actin", "at", "the", "centrosome", "(", "dashed", "outline", "on", "the", "image", ",", "values", "correspond", "to", "the", "fraction", "of", "fluorescence", "in", "a", "2", "-", "micron", "-", "wide", "area", "around", "the", "centrosome", "relative", "to", "the", "total", "fluorescence", "in", "the", "cell", ")", "and", "the", "total", "amount", "of", "polymerized", "fluorescent", "tubulin", "(", "bottom", "right", ",", "values", "were", "normalized", "with", "respect", "to", "the", "mean", "of", "control", "condition", ")", ".", "Measurements", "were", "pooled", "from", "3", "independent", "experiments", ";", "IgM", "(", "BCR", "-", "ligand", "-", ")", ":", "n", "=", "88", ";", "IgG", "(", "BCR", "-", "ligand", "+", ")", ":", "n", "=", "93", ".", "Error", "bars", "correspond", "to", "standard", "deviations", ".", "P", "values", "were", "calculated", "with", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "Scale", "bar", ":", "2", "µm", ".", "Percentage", "differences", "of", "centrosomal", "F", "-", "actin", "and", "centrosomal", "microtubule", "fluorescence", "intensities", "in", "cells", "stimulated", "with", "BCR", "-", "ligand", "+", "beads", "with", "respect", "to", "cells", "stimulated", "with", "BCR", "-", "ligand", "-", "beads", ".", "The", "data", "set", "is", "identical", "to", "panel", "(", "B", ")", ".", "Measurements", "were", "pooled", "from", "3", "independent", "experiments", ";", "IgM", "(", "BCR", "-", "ligand", "-", ")", ":", "n", "=", "88", ";", "IgG", "(", "BCR", "-", "ligand", "+", ")", ":", "n", "=", "93", ".", "Error", "bars", "correspond", "to", "standard", "deviations", ".", "P", "values", "were", "calculated", "with", "one", "-", "sample", "t", "-", "test", "(", "i", ".", "e", ".", "comparison", "to", "a", "theoretical", "mean", "of", "\"", "0", "\"", ")", ".", "The", "graph", "shows", "the", "variations", "of", "the", "total", "amount", "of", "tubulin", "per", "cell", "with", "respect", "to", "the", "content", "of", "actin", "at", "the", "centrosome", "in", "an", "XY", "representation", "of", "individual", "measurements", ".", "The", "two", "lines", "correspond", "to", "linear", "regressions", "of", "the", "two", "sets", "of", "data", "relative", "to", "cells", "stimulated", "with", "BCR", "-", "ligand", "+", "(", "activated", "cells", ")", "or", "BCR", "-", "ligand", "-", "(", "resting", "cells", ")", "beads", ".", "IIA1", ".", "6", "B", "lymphoma", "cells", "were", "fixed", "and", "immuno", "-", "stained", "for", "F", "-", "actin", "(", "red", ")", "and", "microtubules", "(", "green", ")", ".", "Images", "show", "the", "projection", "of", "maximal", "intensity", "of", "three", "confocal", "slices", "spaced", "by", "0", ".", "5", "µm", "apart", "from", "the", "centrosome", ".", "Scale", "bars", ":", "2", "µm", "(", "0", ".", "5", "µm", "in", "the", "zoomed", "insets", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1IIA1.6 B lymphoma cells were stimulated with BCR-ligand- (IgM) or BCR-ligand+ (IgG) beads for 60 min, fixed and stained for F-actin (top) and α-tubulin (bottom). Scale bar: 3 µm.Histograms show the quantifications of the polymerized tubulin and filamentous F-actin at the centrosome (dashed outline on the image, values correspond to the fraction of fluorescence in a 2-micron-wide area around the centrosome relative to the total fluorescence in the cell) and the total amount of polymerized fluorescent tubulin (bottom right, values were normalized with respect to the mean of control condition). Measurements were pooled from 3 independent experiments; IgM (BCR-ligand-): n= 88; IgG (BCR-ligand+): n= 93. Error bars correspond to standard deviations. P values were calculated with Mann-Whitney test. Scale bar: 2 µm.Percentage differences of centrosomal F-actin and centrosomal microtubule fluorescence intensities in cells stimulated with BCR-ligand+ beads with respect to cells stimulated with BCR-ligand- beads. The data set is identical to panel (B). Measurements were pooled from 3 independent experiments; IgM (BCR-ligand-): n= 88; IgG (BCR-ligand+): n= 93. Error bars correspond to standard deviations. P values were calculated with one-sample t-test (i.e. comparison to a theoretical mean of \"0\").The graph shows the variations of the total amount of tubulin per cell with respect to the content of actin at the centrosome in an XY representation of individual measurements. The two lines correspond to linear regressions of the two sets of data relative to cells stimulated with BCR-ligand+ (activated cells) or BCR-ligand- (resting cells) beads.IIA1.6 B lymphoma cells were fixed and immuno-stained for F-actin (red) and microtubules (green). Images show the projection of maximal intensity of three confocal slices spaced by 0.5 µm apart from the centrosome. Scale bars: 2 µm (0.5 µm in the zoomed insets)."}
{"words": ["Figure", "2IIA1", ".", "6", "B", "lymphoma", "cells", "were", "treated", "45", "min", "with", "indicated", "inhibitors", "(", "CK666", "at", "25", "µM", ",", "SMIFH2", "at", "25µM", ")", "or", "DMSO", "as", "control", "prior", "to", "being", "fixed", "and", "stained", "for", "α", "-", "tubulin", "(", "left", "column", ")", "and", "F", "-", "actin", "(", "right", "column", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "3", "µm", ".", "Histograms", "show", "the", "quantifications", "of", "the", "amount", "of", "polymerized", "fluorescent", "tubulin", "(", "right", ",", "values", "were", "normalized", "with", "respect", "to", "the", "mean", "of", "control", "condition", ")", "and", "filamentous", "actin", "at", "the", "centrosome", "(", "left", ",", "values", "correspond", "to", "the", "fraction", "of", "fluorescence", "in", "a", "2", "-", "micron", "-", "wide", "area", "around", "the", "centrosome", "relative", "to", "the", "total", "fluorescence", "in", "the", "cell", ")", ".", "Measurements", "were", "pooled", "from", "3", "independent", "experiments", ";", "DMSO", ":", "n", "=", "91", ",", "CK666", ":", "n", "=", "82", ",", "SMIFH2", ":", "n", "=", "74", ",", "latrunculinA", ":", "n", "=", "96", ".", "Error", "bars", "correspond", "to", "standard", "deviations", ".", "P", "values", "were", "calculated", "with", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "Percentage", "differences", "of", "centrosomal", "F", "-", "actin", "and", "microtubule", "fluorescence", "intensities", "in", "cells", "treated", "with", "cytoskeleton", "inhibitors", "in", "comparison", "with", "the", "respective", "densities", "in", "cells", "treated", "with", "DMSO", ".", "Errors", "bars", "represent", "standard", "deviations", ".", "P", "values", "were", "calculated", "with", "one", "-", "sample", "t", "-", "test", "(", "i", ".", "e", ".", "comparison", "to", "a", "theoretical", "mean", "of", "\"", "0", "\"", ")", ".", "The", "graph", "shows", "the", "same", "measurements", "as", "in", "panel", "(", "B", ")", "in", "an", "XY", "representation", "of", "individual", "measurements", ".", "The", "three", "lines", "correspond", "to", "linear", "regressions", "of", "the", "three", "sets", "of", "data", "relative", "to", "cells", "stimulated", "with", "each", "actin", "drug", ".", "IIA1", ".", "6", "B", "lymphoma", "cells", "were", "transfected", "to", "transiently", "express", "centrin1", "-", "GFP", "(", "red", ")", "and", "EB3", "-", "mCherry", "(", "green", ")", "and", "video", "-", "recorded", "at", "the", "contact", "site", "with", "the", "glass", "coverslip", "(", "left", ")", "and", "at", "the", "centrosome", "(", "right", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "3", "µm", ".", "The", "duration", "of", "EB3", "-", "positive", "comets", "presence", "in", "the", "bottom", "plane", "was", "measured", "in", "DMSO", "and", "CK666", "treated", "cells", "(", "left", ")", ".", "Error", "bars", "correspond", "to", "standard", "deviations", ".", "The", "number", "of", "EB3", "-", "positive", "comets", "exiting", "the", "a", "2", "-", "µm", "wide", "centrosomal", "area", "was", "also", "compared", "between", "the", "two", "conditions", "(", "right", ")", ".", "In", "both", "cases", "P", "values", "were", "calculated", "with", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "IIA1", ".", "6", "B", "lymphoma", "cells", "were", "transfected", "to", "transiently", "express", "centrin1", "-", "VCA", "-", "GFP", "(", "bottom", ")", "or", "centrin1", "-", "GFP", "(", "top", ")", "as", "control", "prior", "to", "be", "fixed", "and", "stained", "for", "α", "-", "tubulin", "(", "left", "column", ")", "and", "F", "-", "actin", "(", "middle", "column", ")", ".", "The", "GFP", "signal", "of", "centrin1", "or", "centrin1", "-", "VCA", "is", "shown", "in", "the", "right", "column", "to", "illustrate", "the", "proper", "centrosome", "targeting", ".", "Scale", "bar", ":", "3", "µm", ".", "Histograms", "show", "the", "quantifications", "of", "the", "amount", "of", "polymerized", "fluorescent", "tubulin", "(", "right", ")", "and", "filamentous", "actin", "at", "the", "centrosome", "(", "left", ")", ".", "Values", "correspond", "to", "the", "fraction", "of", "fluorescence", "in", "a", "2", "-", "micron", "-", "wide", "area", "around", "the", "centrosome", "relative", "to", "the", "total", "fluorescence", "in", "the", "cell", ".", "Measurements", "were", "pooled", "from", "3", "independent", "experiments", ";", "centrin1", "-", "GFP", ":", "n", "=", "88", ",", "centrin1", "-", "VCA", "-", "GFP", ":", "n", "=", "87", ".", "Errors", "bars", "represent", "standard", "deviations", ".", "P", "values", "were", "calculated", "with", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "Percentage", "differences", "of", "F", "-", "actin", "and", "microtubule", "fluorescence", "intensities", "at", "the", "centrosome", "were", "compared", "in", "cells", "transfected", "either", "with", "centrin1", "-", "VCA", "-", "GFP", "or", "with", "centrin1", "-", "GFP", ".", "Errors", "bars", "represent", "standard", "deviations", ".", "P", "values", "were", "calculated", "with", "one", "-", "sample", "t", "-", "test", "(", "i", ".", "e", ".", "comparison", "to", "a", "theoretical", "mean", "of", "\"", "0", "\"", ")", ".", "The", "graph", "shows", "the", "variations", "of", "the", "total", "amount", "of", "tubulin", "per", "cell", "with", "respect", "to", "the", "content", "of", "actin", "at", "the", "centrosome", ".", "The", "two", "lines", "correspond", "to", "linear", "regressions", "of", "the", "two", "sets", "of", "data", "relative", "to", "cells", "transfected", "with", "centrin1", "-", "VCA", "-", "GFP", "or", "centrin1", "-", "GFP", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2IIA1.6 B lymphoma cells were treated 45 min with indicated inhibitors (CK666 at 25 µM, SMIFH2 at 25µM) or DMSO as control prior to being fixed and stained for α-tubulin (left column) and F-actin (right column). Scale bar: 3 µm.Histograms show the quantifications of the amount of polymerized fluorescent tubulin (right, values were normalized with respect to the mean of control condition) and filamentous actin at the centrosome (left, values correspond to the fraction of fluorescence in a 2-micron-wide area around the centrosome relative to the total fluorescence in the cell). Measurements were pooled from 3 independent experiments; DMSO: n= 91, CK666: n= 82, SMIFH2: n= 74, latrunculinA: n= 96. Error bars correspond to standard deviations. P values were calculated with Mann-Whitney test.Percentage differences of centrosomal F-actin and microtubule fluorescence intensities in cells treated with cytoskeleton inhibitors in comparison with the respective densities in cells treated with DMSO. Errors bars represent standard deviations. P values were calculated with one-sample t-test (i.e. comparison to a theoretical mean of \"0\").The graph shows the same measurements as in panel (B) in an XY representation of individual measurements. The three lines correspond to linear regressions of the three sets of data relative to cells stimulated with each actin drug.IIA1.6 B lymphoma cells were transfected to transiently express centrin1-GFP (red) and EB3-mCherry (green) and video-recorded at the contact site with the glass coverslip (left) and at the centrosome (right). Scale bar: 3 µm.The duration of EB3-positive comets presence in the bottom plane was measured in DMSO and CK666 treated cells (left). Error bars correspond to standard deviations. The number of EB3-positive comets exiting the a 2-µm wide centrosomal area was also compared between the two conditions (right). In both cases P values were calculated with Mann-Whitney test.IIA1.6 B lymphoma cells were transfected to transiently express centrin1-VCA-GFP (bottom) or centrin1-GFP (top) as control prior to be fixed and stained for α-tubulin (left column) and F-actin (middle column). The GFP signal of centrin1 or centrin1-VCA is shown in the right column to illustrate the proper centrosome targeting. Scale bar: 3 µm.Histograms show the quantifications of the amount of polymerized fluorescent tubulin (right) and filamentous actin at the centrosome (left). Values correspond to the fraction of fluorescence in a 2-micron-wide area around the centrosome relative to the total fluorescence in the cell. Measurements were pooled from 3 independent experiments; centrin1-GFP: n= 88, centrin1-VCA-GFP: n= 87. Errors bars represent standard deviations. P values were calculated with Mann-Whitney test.Percentage differences of F-actin and microtubule fluorescence intensities at the centrosome were compared in cells transfected either with centrin1-VCA-GFP or with centrin1-GFP. Errors bars represent standard deviations. P values were calculated with one-sample t-test (i.e. comparison to a theoretical mean of \"0\").The graph shows the variations of the total amount of tubulin per cell with respect to the content of actin at the centrosome. The two lines correspond to linear regressions of the two sets of data relative to cells transfected with centrin1-VCA-GFP or centrin1-GFP."}
{"words": ["Figure", "3Two", "sets", "of", "representative", "images", "showing", "fluorescent", "microtubules", "and", "actin", "filaments", "assembled", "from", "isolated", "centrosomes", ".", "Centrosomes", "were", "isolated", "from", "Jurkat", "cells", "expressing", "centrin1", "-", "GFP", ".", "Upper", "and", "lower", "lines", "show", "actin", "filaments", "and", "microtubules", "radiating", "from", "two", "distinct", "centrosomes", "with", "low", "(", "top", ")", "and", "high", "(", "bottom", ")", "densities", "of", "actin", "filaments", ".", "Scale", "bars", ":", "10", "μm", ".", "The", "graph", "shows", "the", "number", "of", "microtubules", "per", "centrosome", "relative", "to", "the", "density", "of", "actin", "filaments", ".", "Inset", "shows", "actin", "filaments", "at", "the", "centrosome", "with", "a", "FIRE", "look", "-", "up", "table", "and", "a", "20", "µm", "-", "wide", "circle", "in", "which", "actin", "fluorescence", "intensity", "is", "measured", ".", "Measurements", "were", "pooled", "from", "5", "independent", "experiments", ";", "n", "=", "50", ".", "Microtubules", "(", "top", "line", ")", "and", "actin", "filaments", "(", "bottom", "line", ")", "assembly", "from", "isolated", "centrosomes", "in", "the", "presence", "of", "increasing", "concentration", "of", "monomeric", "actin", "(", "from", "left", "to", "right", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "20", "μm", ".", "The", "graph", "shows", "the", "number", "of", "microtubules", "per", "centrosome", "in", "response", "to", "increasing", "concentrations", "of", "monomeric", "actin", ".", "Data", "were", "pooled", "from", "2", "independent", "experiments", ";", "0", "µM", ":", "n", "=", "21", ";", "0", ".", "3", "µM", ":", "n", "=", "17", ";", "0", ".", "5", "µM", ":", "n", "=", "17", ";", "1", ".", "0", "µM", ":", "n", "=", "17", ".", "*", "*", "*", "*", ":", "P", "<", "0", ".", "001", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "The", "image", "shows", "the", "density", "of", "actin", "filaments", "(", "in", "the", "presence", "of", "1µM", "of", "actin", "monomers", ")", "at", "the", "centrosome", "color", "-", "coded", "with", "the", "FIRE", "look", "-", "up", "table", "and", "the", "definition", "of", "central", ",", "peripheral", "and", "distal", "regions", "corresponding", "to", "decreasing", "concentrations", "of", "actin", "filaments", ".", "Scale", "bar", ":", "20", "μm", ".", "The", "graph", "shows", "the", "measurements", "of", "microtubule", "growth", "rate", "in", "each", "region", ".", "Data", "were", "pooled", "from", "3", "independent", "experiments", ":", "central", "zone", ":", "n", "=", "58", ",", "peripheral", ":", "n", "=", "104", ",", "outside", ":", "n", "=", "61", ";", "n", ".", "s", ".", "means", "no", "statistical", "difference", "between", "the", "data", "set", "according", "to", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "The", "graphs", "show", "the", "various", "intensities", "of", "centrosome", "immuno", "-", "staining", "with", "antibodies", "against", "gamma", "-", "tubulin", "on", "the", "same", "coverslip", "depending", "on", "the", "presence", "/", "absence", "of", "actin", "filaments", "(", "left", ")", "or", "on", "the", "amount", "of", "actin", "filaments", "(", "right", ")", ".", "Data", "were", "pooled", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "Left", "graph", ":", "without", "actin", "n", "=", "69", ",", "with", "actin", "n", "=", "26", ",", "right", "graph", "n", "=", "26", ".", "N", ".", "s", ".", "means", "no", "statistical", "difference", "between", "the", "data", "set", "according", "to", "Mann", "-", "Whitney", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Two sets of representative images showing fluorescent microtubules and actin filaments assembled from isolated centrosomes. Centrosomes were isolated from Jurkat cells expressing centrin1-GFP. Upper and lower lines show actin filaments and microtubules radiating from two distinct centrosomes with low (top) and high (bottom) densities of actin filaments. Scale bars: 10 μm.The graph shows the number of microtubules per centrosome relative to the density of actin filaments. Inset shows actin filaments at the centrosome with a FIRE look-up table and a 20 µm-wide circle in which actin fluorescence intensity is measured. Measurements were pooled from 5 independent experiments; n= 50.Microtubules (top line) and actin filaments (bottom line) assembly from isolated centrosomes in the presence of increasing concentration of monomeric actin (from left to right). Scale bar: 20 μm.The graph shows the number of microtubules per centrosome in response to increasing concentrations of monomeric actin. Data were pooled from 2 independent experiments; 0 µM: n=21; 0.3 µM: n=17; 0.5 µM: n=17; 1.0 µM: n=17. ****:P<0.001 Mann-Whitney test.The image shows the density of actin filaments (in the presence of 1µM of actin monomers) at the centrosome color-coded with the FIRE look-up table and the definition of central, peripheral and distal regions corresponding to decreasing concentrations of actin filaments. Scale bar: 20 μm. The graph shows the measurements of microtubule growth rate in each region. Data were pooled from 3 independent experiments: central zone: n=58, peripheral: n=104, outside: n=61; n. s. means no statistical difference between the data set according to Mann-Whitney test.The graphs show the various intensities of centrosome immuno-staining with antibodies against gamma-tubulin on the same coverslip depending on the presence/absence of actin filaments (left) or on the amount of actin filaments (right). Data were pooled from 3 independent experiments. Left graph: without actin n=69, with actin n=26, right graph n=26. N.s. means no statistical difference between the data set according to Mann-Whitney test."}
{"words": ["Figure", "4Schematic", "illustration", "of", "the", "first", "dynamic", "assay", ":", "sequential", "addition", "of", "tubulin", "followed", "by", "tubulin", "and", "actin", "on", "isolated", "centrosomes", ".", "Representative", "images", "showing", "microtubules", "(", "top", "line", ")", "and", "the", "merged", "images", "of", "actin", "and", "microtubules", "(", "bottom", "line", ")", "for", "the", "two", "steps", "of", "the", "assay", ";", "in", "the", "presence", "of", "tubulin", "only", "(", "left", "column", ")", "and", "in", "the", "presence", "of", "tubulin", "and", "actin", "(", "right", "column", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "µm", ".", "Quantification", "of", "the", "differences", "in", "the", "number", "of", "microtubules", "per", "centrosome", "between", "the", "two", "stages", "of", "the", "experiment", "described", "above", "on", "centrosomes", "capable", "(", "first", "condition", ")", ",", "or", "not", "(", "second", "condition", ")", ",", "to", "grow", "actin", "filaments", ".", "Data", "were", "collected", "from", "a", "single", "experiment", ";", "asters", "without", "actin", "filaments", ":", "n", "=", "29", ";", "asters", "with", "actin", "filaments", ":", "n", "=", "13", ".", "Data", "were", "analyzed", "using", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "Schematic", "illustration", "of", "the", "second", "dynamic", "assay", ":", "tubulin", "is", "added", "to", "measure", "centrosome", "nucleation", "capacity", "and", "washed", "out", ".", "Then", "actin", "is", "added", "followed", "by", "actin", "and", "tubulin", ".", "Representative", "images", "showing", "microtubules", "(", "top", "line", ")", "and", "the", "merged", "images", "of", "actin", "and", "microtubule", "(", "bottom", "line", ")", "during", "the", "three", "steps", "of", "the", "assay", ";", "in", "the", "presence", "of", "tubulin", "only", "(", "left", "column", ")", ",", "in", "the", "absence", "of", "tubulin", "and", "presence", "of", "actin", "(", "middle", "column", ")", "and", "in", "the", "presence", "of", "tubulin", "and", "actin", "(", "right", "column", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "µm", ".", "Arrowheads", "indicate", "microtubules", "unable", "to", "re", "-", "grow", "after", "assembly", "of", "actin", "filaments", ".", "Quantification", "of", "the", "differences", "in", "the", "number", "of", "microtubules", "per", "centrosome", "between", "the", "first", "and", "last", "steps", "of", "the", "experiment", "described", "above", "(", "panels", "D", "and", "E", ")", "on", "centrosomes", "capable", "(", "first", "condition", ")", ",", "or", "not", "(", "second", "condition", ")", ",", "to", "grow", "actin", "filaments", ".", "Data", "were", "pooled", "from", "2", "independent", "experiments", ";", "asters", "without", "actin", "filaments", ":", "n", "=", "24", ";", "asters", "with", "actin", "filaments", ":", "n", "=", "13", ".", "*", "*", "*", "*", ":", "P", "<", "0", ".", "001", "Student", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Schematic illustration of the first dynamic assay: sequential addition of tubulin followed by tubulin and actin on isolated centrosomes. Representative images showing microtubules (top line) and the merged images of actin and microtubules (bottom line) for the two steps of the assay; in the presence of tubulin only (left column) and in the presence of tubulin and actin (right column). Scale bar: 10 µm. Quantification of the differences in the number of microtubules per centrosome between the two stages of the experiment described above on centrosomes capable (first condition), or not (second condition), to grow actin filaments. Data were collected from a single experiment; asters without actin filaments: n= 29; asters with actin filaments: n= 13. Data were analyzed using Mann-Whitney test.Schematic illustration of the second dynamic assay: tubulin is added to measure centrosome nucleation capacity and washed out. Then actin is added followed by actin and tubulin. Representative images showing microtubules (top line) and the merged images of actin and microtubule (bottom line) during the three steps of the assay; in the presence of tubulin only (left column), in the absence of tubulin and presence of actin (middle column) and in the presence of tubulin and actin (right column). Scale bar:10 µm. Arrowheads indicate microtubules unable to re-grow after assembly of actin filaments. Quantification of the differences in the number of microtubules per centrosome between the first and last steps of the experiment described above (panels D and E) on centrosomes capable (first condition), or not (second condition), to grow actin filaments. Data were pooled from 2 independent experiments; asters without actin filaments: n= 24; asters with actin filaments: n= 13. ****:P<0.001 Student t-test."}
{"words": ["Figure", "5Representative", "images", "of", "microtubules", "(", "top", ")", "and", "actin", "filaments", "(", "bottom", ")", "growth", "from", "micropatterns", ".", "Scale", "bars", ":", "20", "μm", ".", "Schematic", "illustration", "of", "the", "assay", "on", "micropatterned", "substrate", ".", "Tubulin", "was", "first", "added", "alone", "to", "measure", "the", "nucleation", "capacity", "of", "each", "micropattern", ",", "and", "then", "washed", "out", ".", "Later", "on", ",", "actin", "was", "added", "followed", "by", "actin", "and", "tubulin", ".", "Finally", ",", "actin", "was", "rinsed", "out", "and", "gelsolin", "was", "added", "to", "fully", "disassemble", "actin", "filaments", ".", "Representative", "images", "showing", "microtubules", "(", "top", "line", ")", "and", "the", "merged", "images", "of", "actin", "and", "microtubules", "(", "bottom", "line", ")", "during", "the", "four", "steps", "of", "the", "assay", ";", "in", "the", "presence", "of", "tubulin", "only", ",", "in", "the", "absence", "of", "tubulin", "and", "presence", "of", "actin", ",", "in", "the", "presence", "of", "tubulin", "and", "actin", ",", "and", "finally", "in", "the", "presence", "of", "tubulin", "and", "gelsolin", "but", "in", "the", "absence", "of", "actin", "filaments", "(", "from", "left", "to", "right", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "microtubules", "per", "micropattern", "in", "the", "presence", "of", "tubulin", "only", "(", "left", ")", ",", "actin", "and", "tubulin", "(", "middle", ")", "and", "tubulin", "only", "after", "actin", "filaments", "disassembly", "(", "right", ")", ".", "Data", "were", "pooled", "from", "2", "independent", "experiments", ";", "n", "=", "133", ".", "*", "*", "*", "*", ":", "P", "<", "0", ".", "001", "Student", "t", "-", "test", ".", "The", "graph", "shows", "the", "same", "measurements", "as", "in", "panel", "(", "E", ")", "in", "an", "XY", "representation", "of", "individual", "measurements", ".", "It", "illustrates", "the", "differences", "in", "the", "number", "of", "microtubules", "per", "micropattern", "between", "the", "first", "to", "the", "second", "step", "(", "tubulin", "only", "versus", "actin", "and", "tubulin", "together", ")", "with", "respect", "to", "the", "density", "of", "actin", "filaments", "per", "micropattern", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Representative images of microtubules (top) and actin filaments (bottom) growth from micropatterns. Scale bars: 20 μm.Schematic illustration of the assay on micropatterned substrate. Tubulin was first added alone to measure the nucleation capacity of each micropattern, and then washed out. Later on, actin was added followed by actin and tubulin. Finally, actin was rinsed out and gelsolin was added to fully disassemble actin filaments. Representative images showing microtubules (top line) and the merged images of actin and microtubules (bottom line) during the four steps of the assay; in the presence of tubulin only, in the absence of tubulin and presence of actin, in the presence of tubulin and actin, and finally in the presence of tubulin and gelsolin but in the absence of actin filaments (from left to right). Scale bar: 10 μm.Quantification of the number of microtubules per micropattern in the presence of tubulin only (left), actin and tubulin (middle) and tubulin only after actin filaments disassembly (right). Data were pooled from 2 independent experiments; n= 133. ****:P<0.001 Student t-test. The graph shows the same measurements as in panel (E) in an XY representation of individual measurements. It illustrates the differences in the number of microtubules per micropattern between the first to the second step (tubulin only versus actin and tubulin together) with respect to the density of actin filaments per micropattern."}
{"words": ["Figure", "6RPE1", "cells", "stably", "expressing", "centrin1", "-", "GFP", "were", "plated", "for", "3", "h", "on", "coverslips", "coated", "with", "different", "ratios", "(", "100", ":", "0", ";", "50", ":", "50", "or", "1", ":", "99", ")", "of", "fibronectin", "and", "PLL", "-", "PEG", "prior", "to", "fixation", "and", "staining", "for", "F", "-", "actin", "(", "top", "line", "and", "magnified", "views", "around", "centrosome", "below", ".", "Scale", "bars", ":", "10", "µm", "and", "2", "µm", ",", "respectively", ")", "and", "α", "-", "tubulin", "(", "bottom", "line", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "µm", ")", ".", "IIA1", ".", "6", "B", "lymphoma", "cells", "were", "plated", "for", "60", "min", "on", "poly", "-", "L", "-", "lysine", ",", "fibronectin", "or", "ICAM", "-", "1", "coated", "cover", "slides", "prior", "to", "be", "fixed", "and", "stained", "for", "F", "-", "actin", "(", "top", "line", ")", "and", "α", "-", "tubulin", "(", "bottom", "line", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "3", "µm", ".", "Quantification", "of", "the", "area", "occupied", "by", "RPE1", "cells", "on", "the", "substrate", "(", "top", "left", ")", ",", "F", "-", "actin", "content", "at", "the", "centrosome", "(", "top", "right", ")", "polymerized", "tubulin", "at", "the", "centrosome", "(", "bottom", "left", ")", "and", "in", "the", "entire", "cell", "(", "bottom", "right", ")", "for", "the", "three", "conditions", "of", "cell", "adhesion", "described", "in", "(", "B", ")", ".", "Measurements", "came", "from", "3", "independent", "experiments", "with", "more", "than", "60", "analyzed", "cells", "in", "each", ".", "Errors", "bars", "represent", "standard", "deviations", ".", "F", "-", "actin", "and", "microtubule", "contents", "were", "compared", "using", "Mann", "-", "Whitney", "test", ",", "and", "variations", "of", "the", "cell", "area", "were", "compared", "using", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "Quantification", "of", "the", "area", "occupied", "by", "B", "lymphoma", "cells", "on", "the", "substrate", "(", "top", "left", ")", ",", "F", "-", "actin", "content", "at", "the", "centrosome", "(", "top", "right", ")", "polymerized", "tubulin", "at", "the", "centrosome", "(", "bottom", "left", ")", "and", "in", "the", "entire", "cell", "(", "bottom", "right", ")", "for", "the", "three", "conditions", "of", "cell", "adhesion", "described", "in", "(", "D", ")", ".", "Measurements", "came", "from", "3", "independent", "experiments", "with", "more", "than", "80", "analyzed", "cells", "in", "each", ".", "Errors", "bars", "represent", "standard", "deviations", ".", "F", "-", "actin", "and", "microtubule", "contents", "were", "compared", "using", "Mann", "-", "Whitney", "test", ",", "and", "variations", "of", "the", "cell", "area", "were", "compared", "using", "unpaired", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6RPE1 cells stably expressing centrin1-GFP were plated for 3 h on coverslips coated with different ratios (100:0; 50:50 or 1:99) of fibronectin and PLL-PEG prior to fixation and staining for F-actin (top line and magnified views around centrosome below. Scale bars: 10 µm and 2 µm, respectively) and α-tubulin (bottom line. Scale bar: 10 µm).IIA1.6 B lymphoma cells were plated for 60 min on poly-L-lysine, fibronectin or ICAM-1 coated cover slides prior to be fixed and stained for F-actin (top line) and α-tubulin (bottom line). Scale bar: 3 µm.Quantification of the area occupied by RPE1 cells on the substrate (top left), F-actin content at the centrosome (top right) polymerized tubulin at the centrosome (bottom left) and in the entire cell (bottom right) for the three conditions of cell adhesion described in (B). Measurements came from 3 independent experiments with more than 60 analyzed cells in each. Errors bars represent standard deviations. F-actin and microtubule contents were compared using Mann-Whitney test, and variations of the cell area were compared using unpaired t-test.Quantification of the area occupied by B lymphoma cells on the substrate (top left), F-actin content at the centrosome (top right) polymerized tubulin at the centrosome (bottom left) and in the entire cell (bottom right) for the three conditions of cell adhesion described in (D). Measurements came from 3 independent experiments with more than 80 analyzed cells in each. Errors bars represent standard deviations. F-actin and microtubule contents were compared using Mann-Whitney test, and variations of the cell area were compared using unpaired t-test."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "G", ")", "GTT", "or", "ITT", "in", "17", "-", "week", "-", "old", "wild", "-", "type", "or", "JFKTG", "mice", "fed", "on", "HFD", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "6", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "paired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "H", ")", "H", "&", "E", "and", "Oil", "Red", "O", "staining", "of", "liver", "sections", "from", "wild", "-", "type", "or", "JFKTG", "mice", "fed", "on", "ND", "or", "HFD", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(G) GTT or ITT in 17-week-old wild-type or JFKTG mice fed on HFD. Error bars represent mean ± SEM (n = 6, *p < 0.05, paired two-tailed Student's t-test).(H) H&E and Oil Red O staining of liver sections from wild-type or JFKTG mice fed on ND or HFD. Scale bar, 100 μm."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "D", ")", "The", "body", "weight", "of", "male", "wild", "-", "type", "or", "JfkKO", "mice", "fed", "on", "HFD", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "6", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "paired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "G", ")", "H", "&", "E", "and", "Oil", "Red", "O", "staining", "of", "liver", "sections", "from", "wild", "-", "type", "or", "JfkKO", "mice", "fed", "on", "HFD", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "(", "H", ")", "Wild", "-", "type", "or", "JfkKO", "mice", "were", "fed", "with", "HFD", "for", "11", "weeks", "prior", "to", "injection", "of", "adenovirally", "-", "delivered", "vector", "or", "JFK", "via", "tail", "vein", ".", "Seven", "days", "after", "injection", ",", "total", "proteins", "prepared", "from", "liver", "tissues", "were", "subjected", "to", "western", "blotting", "analysis", "for", "the", "expression", "of", "Jfk", "or", "measurement", "for", "hepatic", "TG", "and", "NEFA", "content", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "6", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "HSD", "test", ")", ".", "H", "&", "E", "and", "Oil", "Red", "O", "staining", "of", "liver", "sections", "are", "shown", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(D) The body weight of male wild-type or JfkKO mice fed on HFD. Error bars represent mean ± SEM (n = 6, *p < 0.05, paired two-tailed Student's t-test).(G) H&E and Oil Red O staining of liver sections from wild-type or JfkKO mice fed on HFD. Scale bar, 100 μm.(H) Wild-type or JfkKO mice were fed with HFD for 11 weeks prior to injection of adenovirally-delivered vector or JFK via tail vein. Seven days after injection, total proteins prepared from liver tissues were subjected to western blotting analysis for the expression of Jfk or measurement for hepatic TG and NEFA content. Error bars represent mean ± SEM (n = 6, *p < 0.05, one-way ANOVA with Tukey's HSD test). H&E and Oil Red O staining of liver sections are shown. Scale bar, 100 μm."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "HepG2", "cells", "were", "stably", "transfected", "with", "vector", "or", "FLAG", "-", "JFK", ".", "Cellular", "extracts", "were", "immunopurified", "with", "anti", "-", "FLAG", "immunoaffinity", "resin", "and", "eluted", "with", "FLAG", "peptides", ".", "The", "eluates", "were", "resolved", "on", "SDS", "-", "PAGE", "and", "silver", "-", "stained", ".", "The", "proteins", "bands", "were", "retrieved", "and", "analyzed", "by", "mass", "spectrometry", ".", "(", "B", ")", "Cellular", "extracts", "from", "HepG2", "cells", "were", "immunoprecipitated", "with", "antibodies", "against", "ING5", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "the", "antibodies", "against", "the", "indicated", "proteins", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) HepG2 cells were stably transfected with vector or FLAG-JFK. Cellular extracts were immunopurified with anti-FLAG immunoaffinity resin and eluted with FLAG peptides. The eluates were resolved on SDS-PAGE and silver-stained. The proteins bands were retrieved and analyzed by mass spectrometry.(B) Cellular extracts from HepG2 cells were immunoprecipitated with antibodies against ING5 followed by immunoblotting with the antibodies against the indicated proteins."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "E", ")", "HepG2", "cells", "were", "transfected", "with", "FLAG", "-", "JFK", "and", "treated", "with", "50", "μg", "/", "ml", "CHX", "for", "the", "indicated", "times", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "MG132", "for", "western", "blotting", "analysis", ".", "Quantitation", "was", "done", "by", "densitometry", "and", "expressed", "as", "signals", "of", "ING5", "/", "β", "-", "actin", ".", "(", "H", ")", "Bacterially", "-", "expressed", "GST", "-", "JFK", "or", "JFK", "mutants", "was", "incubated", "with", "in", "vitro", "transcribed", "/", "translated", "ING5", "for", "in", "vitro", "ubiquitination", "assays", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(E) HepG2 cells were transfected with FLAG-JFK and treated with 50 μg/ml CHX for the indicated times in the presence or absence of MG132 for western blotting analysis. Quantitation was done by densitometry and expressed as signals of ING5/β-actin.(H) Bacterially-expressed GST-JFK or JFK mutants was incubated with in vitro transcribed/translated ING5 for in vitro ubiquitination assays."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "D", ")", "ChIP", "-", "seq", "track", "at", "the", "representative", "promoter", "of", "target", "genes", ".", "The", "red", "rectangles", "indicate", "the", "peak", "regions", "/", "binding", "sites", "of", "ING5", "on", "the", "target", "genes", "promoter", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(D) ChIP-seq track at the representative promoter of target genes. The red rectangles indicate the peak regions/binding sites of ING5 on the target genes promoter."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "C", ")", "HepG2", "cells", "were", "treated", "with", "control", "siRNAs", "or", "siRNAs", "against", "JFK", "or", "/", "and", "ING5", ",", "or", "transfected", "with", "vector", ",", "JFK", ",", "or", "/", "and", "ING5", ".", "Cellular", "extracts", "were", "prepared", "for", "western", "blotting", "analysis", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "(", "D", ")", "HepG2", "cells", "were", "transfected", "with", "vector", "or", "JFK", ",", "AMPKα1", ",", "or", "/", "and", "ING5", ",", "or", "treated", "with", "control", "siRNAs", "or", "siRNAs", "against", "JFK", ",", "AMPKα1", ",", "or", "/", "and", "ING5", ",", "Cellular", "extracts", "were", "prepared", "for", "AMPK", "activity", "assays", "by", "ELISA", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "SD", "for", "triplicate", "experiments", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "paired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(C) HepG2 cells were treated with control siRNAs or siRNAs against JFK or/and ING5, or transfected with vector, JFK, or/and ING5. Cellular extracts were prepared for western blotting analysis with the indicated antibodies.(D) HepG2 cells were transfected with vector or JFK, AMPKα1, or/and ING5, or treated with control siRNAs or siRNAs against JFK, AMPKα1, or/and ING5, Cellular extracts were prepared for AMPK activity assays by ELISA. Error bars represent mean ± SD for triplicate experiments (*p < 0.05, paired two-tailed Student's t-test)."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "D", ")", "The", "measurement", "of", "AMPK", "activity", "and", "the", "rate", "of", "fatty", "acid", "β", "-", "oxidation", "of", "wild", "-", "type", "or", "JfkKO", "mice", ".", "Cellular", "extracts", "prepared", "from", "MEFs", "or", "liver", "tissues", "were", "subjected", "to", "AMPK", "activity", "assays", "by", "ELISA", ".", "Mitochondria", "were", "isolated", "from", "MEFs", "or", "liver", "tissues", ",", "and", "the", "rate", "of", "fatty", "acid", "β", "-", "oxidation", "was", "quantified", "by", "spectrophotometric", "detection", "for", "ferricyanide", "-", "trapped", "reduced", "products", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "6", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "paired", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Wild", "-", "type", "or", "JfkKO", "mice", "were", "fed", "with", "HFD", "for", "11", "weeks", "prior", "to", "injection", "of", "adenovirally", "-", "delivered", "vector", "control", ",", "shIng5", ",", "or", "shAmpkα1", "via", "tail", "vein", ".", "Seven", "days", "after", "injection", ",", "cellular", "extracts", "prepared", "from", "liver", "tissues", "were", "subjected", "to", "western", "blotting", "analysis", "or", "measurement", "for", "hepatic", "TG", "and", "NEFA", "content", "(", "E", ")", ".", "Asterisk", "(", "*", ")", "represents", "significant", "comparison", "to", "wild", "-", "type", "mice", ",", "octothorpe", "(", "#", ")", "represents", "significant", "comparison", "to", "JfkKO", "mice", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "SEM", "(", "n", "=", "6", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "#", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "HSD", "test", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(D) The measurement of AMPK activity and the rate of fatty acid β-oxidation of wild-type or JfkKO mice. Cellular extracts prepared from MEFs or liver tissues were subjected to AMPK activity assays by ELISA. Mitochondria were isolated from MEFs or liver tissues, and the rate of fatty acid β-oxidation was quantified by spectrophotometric detection for ferricyanide-trapped reduced products. Error bars represent mean ± SEM (n = 6, *p < 0.05, paired two-tailed Student's t-test).Wild-type or JfkKO mice were fed with HFD for 11 weeks prior to injection of adenovirally-delivered vector control, shIng5, or shAmpkα1 via tail vein. Seven days after injection, cellular extracts prepared from liver tissues were subjected to western blotting analysis or measurement for hepatic TG and NEFA content (E). Asterisk (*) represents significant comparison to wild-type mice, octothorpe (#) represents significant comparison to JfkKO mice. Error bars represent mean ± SEM (n = 6, *p < 0.05, #p < 0.05, one-way ANOVA with Tukey's HSD test)."}
{"words": ["Figure", "1D", ".", "Expression", "distribution", "of", "lncORF", "in", "both", "groups", "by", "Ribo", "-", "seq", ".", "H", ".", "Scatter", "diagram", "of", "lncRNA", "-", "seq", "in", "HCT116", "/", "L", "-", "OHP", "and", "HCT116", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1D. Expression distribution of lncORF in both groups by Ribo-seq.H. Scatter diagram of lncRNA-seq in HCT116/L-OHP and HCT116 cells."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Schematic", "diagram", "of", "sucrose", "density", "gradient", "ultracentrifugation", "for", "RNC", "isolation", ",", "and", "PCR", "verification", "of", "the", "12", "screened", "lncRNA", "in", "both", "RNC", "-", "RNA", "and", "total", "RNA", "from", "two", "groups", "of", "CRC", "cells", ",", "among", "which", "the", "translation", "level", "of", "lnc", "-", "AP", "(", "marked", "with", "a", "green", "box", ")", "was", "the", "most", "notably", "dysregulated", "in", "both", "groups", "of", "drug", "-", "resistant", "cells", "(", "n", "=", "3", ",", "biological", "replicates", ",", "mean", "±", "SEM", ",", "t", "test", ")", ".", "Data", "information", ":", "*", "for", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "for", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "NS", "for", "no", "significance", ".", "B", ".", "PCR", "analysis", "of", "lnc", "-", "AP", "in", "serum", "samples", "from", "oxaliplatin", "-", "resistant", "(", "PD", ",", "n", "=", "15", ")", "and", "-", "sensitive", "(", "PR", ",", "n", "=", "9", ")", "CRC", "patients", "(", "mean", "±", "SEM", ",", "t", "test", ")", ".", "C", ".", "In", "the", "public", "database", "lncCAR", ",", "high", "expression", "level", "of", "lnc", "-", "AP", "was", "correlated", "with", "long", "overall", "survival", "in", "CRC", "patients", ".", "E", ".", "PCR", "and", "WB", "analysis", "of", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "either", "lnc", "-", "AP", "-", "Flag", "OE", "plasmid", "(", "n", "=", "3", ",", "biological", "replicates", ",", "mean", "±", "SEM", ",", "Dunnett", "-", "t", "test", ")", ".", "F", ".", "PCR", "and", "WB", "analysis", "of", "HCT116", "/", "L", "-", "OHP", "and", "SW480", "/", "L", "-", "OHP", "cells", "transfected", "with", "either", "lnc", "-", "AP", "-", "Flag", "OE", "plasmid", "(", "n", "=", "3", ",", "biological", "replicates", ",", "mean", "±", "SEM", ",", "Dunnett", "-", "t", "test", ")", ".", "Data", "information", ":", "*", "for", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "for", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "NS", "for", "no", "significance", ".", "Control", "referred", "to", "the", "corresponding", "plasmid", "vector", ".", "J", ".", "IF", "detection", "of", "pep", "-", "AP", "in", "HCT116", "/", "L", "-", "OHP", "and", "SW480", "/", "L", "-", "OHP", "cells", "transfected", "with", "either", "HA", "-", "lnc", "-", "AP", "OE", "plasmid", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Schematic diagram of sucrose density gradient ultracentrifugation for RNC isolation, and PCR verification of the 12 screened lncRNA in both RNC-RNA and total RNA from two groups of CRC cells, among which the translation level of lnc-AP (marked with a green box) was the most notably dysregulated in both groups of drug-resistant cells (n = 3, biological replicates, mean±SEM, t test). Data information: * for P < 0.05; ** for P < 0.01; NS for no significance.B. PCR analysis of lnc-AP in serum samples from oxaliplatin-resistant (PD, n = 15) and -sensitive (PR, n = 9) CRC patients (mean±SEM, t test).C. In the public database lncCAR, high expression level of lnc-AP was correlated with long overall survival in CRC patients.E. PCR and WB analysis of HEK293T cells transfected with either lnc-AP-Flag OE plasmid (n = 3, biological replicates, mean±SEM, Dunnett-t test). F. PCR and WB analysis of HCT116/L-OHP and SW480/L-OHP cells transfected with either lnc-AP-Flag OE plasmid (n = 3, biological replicates, mean±SEM, Dunnett-t test). Data information: * for P < 0.05; ** for P < 0.01; NS for no significance. Control referred to the corresponding plasmid vector.J. IF detection of pep-AP in HCT116/L-OHP and SW480/L-OHP cells transfected with either HA-lnc-AP OE plasmid. Scale bar, 10 µm."}
{"words": ["Figure", "3B", ".", "CCK", "-", "8", "assay", "of", "inhibition", "ratio", "by", "L", "-", "OHP", "in", "two", "groups", "of", "CRC", "cells", "with", "down", "-", "or", "up", "-", "regulation", "of", "lnc", "-", "AP", "(", "n", "=", "3", ",", "biological", "replicates", ",", "mean", "±", "SEM", ")", ".", "Data", "information", ":", "*", "si", "-", "NC", "was", "the", "abbreviation", "of", "commercial", "normal", "control", "of", "siRNA", ".", "C", ".", "IF", "detection", "of", "H2AFX", "for", "DNA", "damage", "by", "L", "-", "OHP", "in", "two", "groups", "of", "CRC", "cells", "with", "down", "-", "or", "up", "-", "regulation", "of", "lnc", "-", "AP", ",", "and", "nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "n", "=", "3", ",", "biological", "replicates", ",", "mean", "±", "SEM", ",", "Dunnett", "-", "t", "test", ")", ".", "G", ".", "Verification", "of", "the", "interaction", "between", "CEBPA", "and", "the", "upstream", "region", "of", "AP002387", "via", "ChIP", "assay", "followed", "by", "PCR", "(", "n", "=", "3", ",", "biological", "replicates", ",", "mean", "±", "SEM", ",", "t", "test", ")", ".", "Data", "information", ":", "*", "for", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "for", "P", "<", "0", ".", "01H", ".", "PCR", "analysis", "of", "lnc", "-", "AP", "attenuation", "and", "restoration", "in", "HCT116", "and", "SW480", "cells", "(", "n", "=", "3", ",", "biological", "replicates", ",", "mean", "±", "SEM", ",", "Dunnett", "-", "t", "test", ")", ".", "Data", "information", ":", "*", "for", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "for", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "NS", "for", "no", "significance", ".", "Control", "referred", "to", "the", "corresponding", "plasmid", "vector", "and", "si", "-", "NC", "was", "the", "abbreviation", "of", "commercial", "normal", "control", "of", "siRNA", ".", "J", ".", "CCK", "-", "8", "assay", "of", "inhibition", "ratio", "by", "L", "-", "OHP", "in", "HCT116", "and", "SW480", "cells", "with", "lnc", "-", "AP", "/", "pep", "-", "AP", "attenuation", "and", "restoration", "(", "n", "=", "3", ",", "biological", "replicates", ",", "mean", "±", "SEM", ")", ".", "Data", "information", ":", "*", "si", "-", "NC", "was", "the", "abbreviation", "of", "commercial", "normal", "control", "of", "siRNA", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B. CCK-8 assay of inhibition ratio by L-OHP in two groups of CRC cells with down- or up-regulation of lnc-AP (n = 3, biological replicates, mean±SEM). Data information: * si-NC was the abbreviation of commercial normal control of siRNA.C. IF detection of H2AFX for DNA damage by L-OHP in two groups of CRC cells with down- or up-regulation of lnc-AP, and nuclei were stained with DAPI (n = 3, biological replicates, mean±SEM, Dunnett-t test).G. Verification of the interaction between CEBPA and the upstream region of AP002387 via ChIP assay followed by PCR (n = 3, biological replicates, mean±SEM, t test). Data information: * for P < 0.05; ** for P < 0.01H. PCR analysis of lnc-AP attenuation and restoration in HCT116 and SW480 cells (n = 3, biological replicates, mean±SEM, Dunnett-t test). Data information: * for P < 0.05; ** for P < 0.01; NS for no significance. Control referred to the corresponding plasmid vector and si-NC was the abbreviation of commercial normal control of siRNA.J. CCK-8 assay of inhibition ratio by L-OHP in HCT116 and SW480 cells with lnc-AP/pep-AP attenuation and restoration (n = 3, biological replicates, mean±SEM). Data information: * si-NC was the abbreviation of commercial normal control of siRNA."}
{"words": ["Figure", "4D", ".", "Survival", "analysis", "correlated", "with", "TALDO1", "using", "TCGA", "data", ".", "Upper", ":", "the", "Kaplan", "curve", "of", "overall", "survival", "probability", "for", "patients", "with", "high", "or", "low", "level", "of", "TALDO1", ".", "Lower", ":", "the", "expression", "graph", "of", "TALDO1", "in", "patients", "who", "were", "dead", "or", "not", ".", "F", ".", "IF", "detection", "of", "the", "colocalization", "of", "pep", "-", "AP", "-", "Flag", "and", "TALDO1", "in", "HCT116", "/", "L", "-", "OHP", "and", "SW480", "/", "L", "-", "OHP", "cells", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "G", ".", "WB", "confirmation", "of", "the", "interaction", "between", "HA", "-", "pep", "-", "AP", "and", "TALDO1", "in", "HCT116", "/", "L", "-", "OHP", "and", "SW480", "/", "L", "-", "OHP", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4D. Survival analysis correlated with TALDO1 using TCGA data. Upper: the Kaplan curve of overall survival probability for patients with high or low level of TALDO1. Lower: the expression graph of TALDO1 in patients who were dead or not.F. IF detection of the colocalization of pep-AP-Flag and TALDO1 in HCT116/L-OHP and SW480/L-OHP cells. Scale bar, 10 µm.G. WB confirmation of the interaction between HA-pep-AP and TALDO1 in HCT116/L-OHP and SW480/L-OHP cells."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "WB", "analysis", "of", "TALDO1", "overexpression", "or", "knock", "down", "in", "two", "groups", "of", "CRC", "cells", ",", "which", "was", "quantified", "by", "gray", "analysis", "on", "the", "right", "(", "n", "=", "3", ",", "biological", "replicates", ",", "mean", "±", "SEM", ",", "t", "test", ")", ".", "Data", "information", ":", "*", "for", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "for", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "Control", "referred", "to", "the", "corresponding", "plasmid", "vector", "and", "si", "-", "NC", "was", "the", "abbreviation", "of", "commercial", "normal", "control", "of", "siRNA", ".", "D", ".", "Cellular", "ROS", "was", "measured", "by", "flow", "cytometry", "and", "shown", "in", "both", "curve", "and", "bar", "charts", "(", "n", "=", "3", ",", "biological", "replicates", ",", "mean", "±", "SEM", ",", "t", "test", ")", "Data", "information", ":", "*", "for", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "for", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "Control", "referred", "to", "the", "corresponding", "plasmid", "vector", "and", "si", "-", "NC", "was", "the", "abbreviation", "of", "commercial", "normal", "control", "of", "siRNA", ".", "E", ".", "MMP", "detection", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "F", ".", "IF", "detection", "of", "H2AFX", "for", "DNA", "damage", "by", "L", "-", "OHP", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. WB analysis of TALDO1 overexpression or knock down in two groups of CRC cells, which was quantified by gray analysis on the right (n = 3, biological replicates, mean±SEM, t test). Data information: * for P < 0.05; ** for P < 0.01. Control referred to the corresponding plasmid vector and si-NC was the abbreviation of commercial normal control of siRNA.D. Cellular ROS was measured by flow cytometry and shown in both curve and bar charts (n = 3, biological replicates, mean±SEM, t test) Data information: * for P < 0.05; ** for P < 0.01. Control referred to the corresponding plasmid vector and si-NC was the abbreviation of commercial normal control of siRNA.E. MMP detection. Scale bar, 10 µm. F. IF detection of H2AFX for DNA damage by L-OHP. Scale bar, 10 µm. "}
{"words": ["Figure", "6E", ".", "Cellular", "ROS", "was", "measured", "by", "flow", "cytometry", "and", "shown", "in", "both", "curve", "(", "left", ")", "and", "bar", "(", "right", ")", "charts", "(", "n", "=", "3", ",", "biological", "replicates", ",", "mean", "±", "SEM", ",", "Dunnett", "-", "t", "test", ")", "Data", "information", ":", "*", "for", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "for", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "NS", "for", "no", "significance", ".", "Control", "referred", "to", "the", "corresponding", "plasmid", "vector", "and", "si", "-", "NC", "was", "the", "abbreviation", "of", "commercial", "normal", "control", "of", "siRNA", ".", "F", ".", "MMP", "detection", "with", "down", "-", "or", "up", "-", "regulation", "of", "lnc", "-", "AP", "/", "pep", "-", "AP", "in", "two", "groups", "of", "CRC", "cells", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6E. Cellular ROS was measured by flow cytometry and shown in both curve (left) and bar (right) charts (n = 3, biological replicates, mean±SEM, Dunnett-t test) Data information: * for P < 0.05; ** for P < 0.01; NS for no significance. Control referred to the corresponding plasmid vector and si-NC was the abbreviation of commercial normal control of siRNA.F. MMP detection with down- or up-regulation of lnc-AP/pep-AP in two groups of CRC cells. Scale bar, 10 µm."}
{"words": ["Figure", "7C", ".", "Flow", "cytometry", "of", "the", "cell", "apoptosis", "ratio", "under", "L", "-", "OHP", "with", "down", "-", "or", "up", "-", "regulation", "of", "lnc", "-", "AP", "/", "pep", "-", "AP", "in", "two", "groups", "of", "CRC", "cells", ",", "which", "was", "quantified", "in", "bar", "charts", "on", "the", "right", "(", "n", "=", "3", ",", "biological", "replicates", ",", "mean", "±", "SEM", ",", "Dunnett", "-", "t", "test", ")", ".", "Data", "information", ":", "*", "for", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "for", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "NS", "for", "no", "significance", ".", "Control", "referred", "to", "the", "corresponding", "plasmid", "vector", "and", "si", "-", "NC", "was", "the", "abbreviation", "of", "commercial", "normal", "control", "of", "siRNA", ".", "E", ".", "CCK", "-", "8", "assay", "of", "the", "inhibition", "ratio", "by", "L", "-", "OHP", "with", "inhibitors", "of", "apoptosis", "Z", "-", "VAD", "-", "FMK", "or", "ferroptosis", "Fer", "-", "1", "in", "HCT116", "/", "L", "-", "OHP", "and", "SW480", "/", "L", "-", "OHP", "cells", "(", "n", "=", "3", ",", "biological", "replicates", ",", "mean", "±", "SEM", ")", ".", "Data", "information", ":", "*", "Control", "referred", "to", "the", "corresponding", "plasmid"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7C. Flow cytometry of the cell apoptosis ratio under L-OHP with down- or up-regulation of lnc-AP/pep-AP in two groups of CRC cells, which was quantified in bar charts on the right (n = 3, biological replicates, mean±SEM, Dunnett-t test). Data information: * for P < 0.05; ** for P < 0.01; NS for no significance. Control referred to the corresponding plasmid vector and si-NC was the abbreviation of commercial normal control of siRNA.E. CCK-8 assay of the inhibition ratio by L-OHP with inhibitors of apoptosis Z-VAD-FMK or ferroptosis Fer-1 in HCT116/L-OHP and SW480/L-OHP cells (n = 3, biological replicates, mean±SEM). Data information: * Control referred to the corresponding plasmid vector"}
{"words": ["Figure", "8B", ".", "Alterations", "of", "tumor", "volume", "in", "different", "groups", "with", "or", "without", "pep", "-", "AP", "OE", "(", "n", "=", "6", ",", "biological", "replicates", ",", "mean", "±", "SEM", ")", ".", "Data", "information", ":", "*", "for", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "for", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "NS", "for", "no", "significance", ".", "Control", "referred", "to", "the", "corresponding", "plasmid", "vector", ".", "F", "WB", "analysis", "of", "pep", "-", "AP", ",", "TALDO1", ",", "PARP", ",", "cleaved", "-", "PARP", "and", "cleaved", "-", "caspase", "-", "3", "within", "the", "tumors", "in", "C", "(", "a", ")", ".", "G", ".", "Relative", "NADPH", "/", "NADP", "+", "ratio", "within", "the", "tumors", "in", "C", "(", "a", ")", "(", "n", "=", "6", ",", "mean", "±", "SEM", ",", "Dunnett", "-", "t", "test", ")", ".", "H", ".", "GSH", "contents", "within", "the", "tumors", "in", "C", "(", "a", ")", "(", "n", "=", "6", ",", "mean", "±", "SEM", ",", "Dunnett", "-", "t", "test", ")", ".", "Data", "information", ":", "*", "for", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "for", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "NS", "for", "no", "significance", ".", "Control", "referred", "to", "the", "corresponding", "plasmid", "vector", ".", "I", ".", "IF", "detection", "of", "pep", "-", "AP", ",", "TALDO1", "and", "H2AFX", ",", "TUNEL", "of", "DNA", "fragmentation", "and", "IHC", "of", "Ki67", "within", "the", "tumors", "in", "C", "(", "a", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8B. Alterations of tumor volume in different groups with or without pep-AP OE (n = 6, biological replicates, mean±SEM). Data information: * for P < 0.05; ** for P < 0.01; NS for no significance. Control referred to the corresponding plasmid vector.F WB analysis of pep-AP, TALDO1, PARP, cleaved-PARP and cleaved-caspase-3 within the tumors in C(a).G. Relative NADPH/NADP+ ratio within the tumors in C(a) (n = 6, mean±SEM, Dunnett-t test). H. GSH contents within the tumors in C(a) (n = 6, mean±SEM, Dunnett-t test). Data information: * for P < 0.05; ** for P < 0.01; NS for no significance. Control referred to the corresponding plasmid vector.I. IF detection of pep-AP, TALDO1 and H2AFX, TUNEL of DNA fragmentation and IHC of Ki67 within the tumors in C(a)."}
{"words": ["f1", "(", "a", ",", "b", ")", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "10", "μg", "ml", "−", "1", "N", "-", "Shh", "peptide", "for", "24", "h", ".", "(", "a", ")", "Endogenous", "LC3", "was", "detected", "by", "immunoblot", "in", "total", "cell", "lysates", ",", "quantified", "by", "densitometric", "analysis", "and", "normalized", "to", "actin", ".", "Relative", "levels", "were", "expressed", "in", "percentage", "with", "control", "cells", "set", "to", "100", "and", "shown", "in", "graph", ".", "(", "a", ",", "b", ")", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "10", "μg", "ml", "−", "1", "N", "-", "Shh", "peptide", "for", "24", "h", ".", "(", "b", ")", "mRNA", "was", "obtained", "and", "levels", "of", "Ptch1", "or", "Gli1", "and", "actin", "mRNA", "were", "amplified", "by", "standard", "PCR", "and", "visualized", "in", "agarose", "gels", ".", "Graph", "shows", "mRNA", "levels", "quantified", "by", "densitometric", "analysis", "and", "normalized", "to", "actin", ".", "(", "c", ")", "8xGli", "-", "luciferase", "construct", "was", "transfected", "in", "HeLa", "cells", "for", "24", "h", ",", "followed", "by", "treatment", "with", "10", "μM", "purmorphamine", ",", "or", "DMSO", "as", "a", "control", ",", "for", "another", "24", "h", ".", "Graph", "represents", "the", "mean", "value", "of", "the", "firefly", "luciferase", "activity", "relative", "to", "Renilla", "transfection", "control", ".", "(", "d", ")", "Endogenous", "LC3", "-", "II", "was", "detected", "in", "cell", "lysates", "from", "cells", "treated", "with", "10", "μM", "purmorphamine", "for", "24", "h", ",", "either", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "trehalose", "(", "100", "mM", ")", ".", "Where", "indicated", ",", "bafA1", "(", "400", "nM", ")", "was", "added", "for", "the", "last", "4", "h", ".", "Quantification", "by", "densitometric", "analysis", "relative", "to", "actin", "is", "shown", "in", "the", "graph", ".", "(", "e", ")", "Cells", "were", "treated", "with", "10", " ", "μM", "purmorphamine", "for", "24", " ", "h", "under", "starvation", "conditions", ",", "either", "in", "the", "presence", "of", "bafA1", "or", "DMSO", "as", "a", "control", ",", "and", "LC3", "-", "II", "and", "actin", "levels", "were", "detected", ".", "(", "f", ")", "HA", "-", "HttQ74", "construct", "was", "transfected", "into", "HeLa", "cells", "followed", "by", "treatment", "with", "10", "μM", "purmorphamine", "for", "24", "h", ".", "The", "percentage", "of", "transfected", "cells", "with", "aggregates", "detected", "by", "HA", "immunofluorescence", "is", "shown", "in", "the", "graph", ".", "P", "-", "values", "were", "calculated", "by", "odds", "ratio", ".", "(", "g", ")", "U20S", "cells", "stably", "expressing", "HaloTag", "-", "p62", "were", "labelled", "with", "HaloTag", "ligand", "for", "15", "min", "and", "washed", "out", "followed", "by", "treatment", "with", "purmorphamine", ".", "After", "48", "h", ",", "cells", "were", "lysed", ",", "run", "on", "a", "SDS", "-", "polyacrylamide", "gel", "electrophoresis", "and", "fluorescent", "HaloTag", "was", "visualized", "using", "a", "Typhoon", "8600", "variable", "mode", "imager", ".", "Fluorescence", "was", "normalized", "to", "total", "protein", "levels", ",", "detected", "on", "the", "same", "gels", "by", "Kryton", "Fluorescence", "protein", "stain", ".", "A", "representative", "gel", "and", "its", "quantitated", "normalized", "levels", "are", "shown", ".", "In", "all", "panels", ",", "graphs", "show", "mean", "values", "and", "error", "bars", "represent", "s", ".", "d", ".", "from", "a", "triplicate", "experiment", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "by", "two", "-", "tail", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "unless", "indicated", ":", "*", "*", "*", "P0", ".", "001", ";", "*", "*", "P0", ".", "01", ";", "*", "P0", ".", "05", ".", "SDS", "-", "PAGE", ",", "SDS", "-", "polyacrylamide", "gel", "electrophoresis", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f1(a,b) HeLa cells were treated with 10 μg ml−1 N-Shh peptide for 24 h. (a) Endogenous LC3 was detected by immunoblot in total cell lysates, quantified by densitometric analysis and normalized to actin. Relative levels were expressed in percentage with control cells set to 100 and shown in graph.(a,b) HeLa cells were treated with 10 μg ml−1 N-Shh peptide for 24 h.(b) mRNA was obtained and levels of Ptch1 or Gli1 and actin mRNA were amplified by standard PCR and visualized in agarose gels. Graph shows mRNA levels quantified by densitometric analysis and normalized to actin.(c) 8xGli-luciferase construct was transfected in HeLa cells for 24 h, followed by treatment with 10 μM purmorphamine, or DMSO as a control, for another 24 h. Graph represents the mean value of the firefly luciferase activity relative to Renilla transfection control.(d) Endogenous LC3-II was detected in cell lysates from cells treated with 10 μM purmorphamine for 24 h, either in the absence or presence of trehalose (100 mM). Where indicated, bafA1 (400 nM) was added for the last 4 h. Quantification by densitometric analysis relative to actin is shown in the graph.(e) Cells were treated with 10 μM purmorphamine for 24 h under starvation conditions, either in the presence of bafA1 or DMSO as a control, and LC3-II and actin levels were detected.(f) HA-HttQ74 construct was transfected into HeLa cells followed by treatment with 10 μM purmorphamine for 24 h. The percentage of transfected cells with aggregates detected by HA immunofluorescence is shown in the graph. P-values were calculated by odds ratio.(g) U20S cells stably expressing HaloTag-p62 were labelled with HaloTag ligand for 15 min and washed out followed by treatment with purmorphamine. After 48 h, cells were lysed, run on a SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and fluorescent HaloTag was visualized using a Typhoon 8600 variable mode imager. Fluorescence was normalized to total protein levels, detected on the same gels by Kryton Fluorescence protein stain. A representative gel and its quantitated normalized levels are shown. In all panels, graphs show mean values and error bars represent s.d. from a triplicate experiment representative of at least three independent experiments. Statistical analyses were performed by two-tail Student's t-test unless indicated: ***P0.001; **P0.01; *P0.05. SDS-PAGE, SDS-polyacrylamide gel electrophoresis."}
{"words": ["f2", "(", "a", ")", "HeLa", "cells", "were", "transiently", "transfected", "with", "pcDNA", "(", "vector", ")", ",", "Ptch1", "or", "Ptch2", "constructs", "for", "48", "h", ".", "Where", "indicated", ",", "cells", "were", "treated", "with", "bafA1", "for", "the", "last", "4", "h", ".", "LC3", "-", "II", "levels", "were", "detected", "by", "western", "blotting", "and", "levels", "were", "quantified", "by", "densitometric", "analysis", "relative", "to", "tubulin", "and", "shown", "in", "graph", ".", "(", "b", ")", "HeLa", "were", "transfected", "with", "Ptch1", "or", "Ptch2", "together", "with", "HA", "-", "HttQ74", "and", "the", "percentage", "of", "transfected", "cells", "with", "aggregates", "was", "assessed", "by", "HA", "immunofluorescence", ".", "P", "-", "values", "were", "calculated", "by", "odds", "ratio", ".", "(", "c", ")", "Atg5", "+", "/", "+", "or", "Atg5", "−", "/", "−", "MEFs", "were", "transfected", "with", "GFP", "-", "HttQ74", "for", "48", "h", ",", "cells", "were", "fixed", "and", "the", "percentage", "of", "transfected", "cells", "with", "aggregates", "was", "scored", "by", "direct", "fluorescence", ".", "(", "d", ",", "e", ")", "Endogenous", "LC3", "-", "II", "levels", "were", "detected", "in", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "control", ",", "Ptch1", "or", "Ptch2", "siRNA", "and", "either", "left", "untreated", "or", "treated", "with", "100", " ", "mM", "trehalose", "in", "the", "last", "24", " ", "h", "(", "d", ")", "Quantification", "and", "statistical", "analysis", "is", "shown", "in", "graphs", ".", "(", "d", ",", "e", ")", "Endogenous", "LC3", "-", "II", "levels", "were", "detected", "in", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "control", ",", "Ptch1", "or", "Ptch2", "siRNA", "and", "either", "left", "untreated", "or", "treated", "with400", "nM", "bafA1", "for", "4", "h", "(", "e", ")", ".", "Quantification", "and", "statistical", "analysis", "is", "shown", "in", "graphs", "(", "f", ")", "siRNA", "-", "targeting", "Ptch2", "was", "transfected", "into", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "mRFP", "-", "GFP", "-", "LC3", "and", "representative", "confocal", "microscopy", "images", "are", "shown", ".", "Scale", "bars", "represent", "26", "μm", ".", "Percentage", "of", "GFP", "-", "positive", "vesicles", "(", "autophagosomes", ")", ",", "RFP", "-", "positive", "vesicles", "(", "total", "number", "of", "vesicles", ")", "or", "percentage", "of", "autolysosomes", "(", "calculated", "by", "subtracting", "numbers", "of", "GFP", "from", "RFP", "vesicles", ")", ",", "quantified", "using", "a", "Cellomics", "array", "scan", ",", "was", "calculated", "relative", "to", "control", "siRNA", "-", "transfected", "cells", ".", "Although", "an", "increase", "in", "autophagosome", "biogenesis", "generally", "increases", "both", "the", "number", "of", "GFP", "+", "vesicles", "and", "the", "number", "of", "GFP", "-", "/", "RFP", "+", "vesicles", "as", "a", "result", "of", "an", "enhanced", "autophagy", "flux", ",", "defects", "in", "autophagosome", "degradation", ",", "such", "as", "in", "bafA1", "-", "treated", "cells", ",", "increase", "GFP", "+", "vesicles", "but", "not", "GFP", "−", "/", "RFP", "+", "structures", ",", "as", "GFP", "remains", "intact", ".", "Graph", "shows", "the", "mean", "value", "obtained", "from", "four", "independent", "experiments", "in", "triplicate", "and", "with", "control", "conditions", "set", "to", "100", ".", "In", "all", "panels", ",", "unless", "indicated", ",", "graphs", "show", "mean", "values", "and", "error", "bars", "represent", "s", ".", "d", ".", "from", "a", "triplicate", "experiment", "representative", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "by", "two", "-", "tail", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ":", "*", "*", "P0", ".", "01", ";", "*", "P0", ".", "05", ";", "NS", ",", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f2(a) HeLa cells were transiently transfected with pcDNA (vector), Ptch1 or Ptch2 constructs for 48 h. Where indicated, cells were treated with bafA1 for the last 4 h. LC3-II levels were detected by western blotting and levels were quantified by densitometric analysis relative to tubulin and shown in graph.(b) HeLa were transfected with Ptch1 or Ptch2 together with HA-HttQ74 and the percentage of transfected cells with aggregates was assessed by HA immunofluorescence. P-values were calculated by odds ratio.(c) Atg5+/+ or Atg5−/− MEFs were transfected with GFP-HttQ74 for 48 h, cells were fixed and the percentage of transfected cells with aggregates was scored by direct fluorescence.(d,e) Endogenous LC3-II levels were detected in HeLa cells transfected with control, Ptch1 or Ptch2 siRNA and either left untreated or treated with 100 mM trehalose in the last 24 h (d) Quantification and statistical analysis is shown in graphs.(d,e) Endogenous LC3-II levels were detected in HeLa cells transfected with control, Ptch1 or Ptch2 siRNA and either left untreated or treated with400 nM bafA1 for 4 h (e). Quantification and statistical analysis is shown in graphs(f) siRNA-targeting Ptch2 was transfected into HeLa cells stably expressing mRFP-GFP-LC3 and representative confocal microscopy images are shown. Scale bars represent 26 μm. Percentage of GFP-positive vesicles (autophagosomes), RFP-positive vesicles (total number of vesicles) or percentage of autolysosomes (calculated by subtracting numbers of GFP from RFP vesicles), quantified using a Cellomics array scan, was calculated relative to control siRNA-transfected cells. Although an increase in autophagosome biogenesis generally increases both the number of GFP+ vesicles and the number of GFP-/RFP+ vesicles as a result of an enhanced autophagy flux, defects in autophagosome degradation, such as in bafA1-treated cells, increase GFP+ vesicles but not GFP−/RFP+ structures, as GFP remains intact. Graph shows the mean value obtained from four independent experiments in triplicate and with control conditions set to 100. In all panels, unless indicated, graphs show mean values and error bars represent s.d. from a triplicate experiment representative of at least three independent experiments. Statistical analyses were performed by two-tail Student's t-test: **P0.01; *P0.05; NS, not significant."}
{"words": ["f3", "(", "a", ")", "Smo", "siRNA", "-", "treated", "cells", "were", "transfected", "with", "HA", "-", "HttQ74", "for", "the", "last", "24", "h", "and", "the", "percentage", "of", "transfected", "cells", "with", "aggregates", "scored", "in", "HA", "-", "positive", "cells", "by", "immunofluorescence", ".", "Graphs", "show", "mean", "values", "and", "error", "bars", "represent", "s", ".", "d", ".", "of", "a", "representative", "experiment", "performed", "in", "triplicate", ".", "P", "-", "values", "were", "calculated", "by", "odds", "ratio", ".", "(", "b", ")", "siRNA", "-", "targeting", "Smo", "was", "transfected", "into", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "mRFP", "-", "GFP", "-", "LC3", ".", "Representative", "confocal", "microscopy", "images", "are", "shown", ".", "Bars", "represent", "26", " ", "μm", ".", "The", "number", "of", "vesicles", "was", "analyzed", "in", "a", "Cellomics", "array", "scan", "and", "percentage", "was", "calculated", "relative", "to", "control", "siRNA", "-", "transfected", "cells", ".", "Statistical", "tests", "were", "performed", "on", "data", "from", "three", "independent", "experiments", "in", "triplicate", ".", "*", "P0", ".", "05", ";", "*", "*", "*", "P0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f3(a) Smo siRNA-treated cells were transfected with HA-HttQ74 for the last 24 h and the percentage of transfected cells with aggregates scored in HA-positive cells by immunofluorescence. Graphs show mean values and error bars represent s.d. of a representative experiment performed in triplicate. P-values were calculated by odds ratio.(b) siRNA-targeting Smo was transfected into HeLa cells stably expressing mRFP-GFP-LC3. Representative confocal microscopy images are shown. Bars represent 26 μm. The number of vesicles was analyzed in a Cellomics array scan and percentage was calculated relative to control siRNA-transfected cells. Statistical tests were performed on data from three independent experiments in triplicate. *P0.05; ***P0.001."}
{"words": ["f4", "(", "a", ")", "Wild", "-", "type", "Gli", "+", "/", "+", "or", "Gli1", "−", "/", "−", ",", "Gli2", "−", "/", "−", "and", "Gli3", "−", "/", "−", "MEFs", "were", "treated", "with", "100", " ", "mM", "trehalose", "alone", "or", "in", "combination", "with", "10", " ", "μM", "of", "Pmph", "for", "24", " ", "h", ",", "or", "left", "untreated", ".", "Total", "cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "immunoblot", "with", "anti", "-", "LC3", "and", "anti", "-", "actin", "antibodies", ".", "(", "b", ")", "Gli2", "−", "/", "−", "MEFs", "were", "transfected", "for", "48", " ", "h", "with", "either", "empty", "vector", "or", "Gli2", "DNA", "construct", "and", "treated", "as", "in", "a", ".", "with", "100", " ", "mM", "trehalose", "alone", "or", "in", "combination", "with", "10", " ", "μM", "of", "Pmph", "for", "24", " ", "h", ",", "or", "left", "untreated", ".", "Total", "cell", "lysates", "were", "subjected", "to", "immunoblot", "with", "anti", "-", "LC3", "and", "anti", "-", "actin", "antibodies", ".", "(", "c", ")", "LC3", "-", "II", "levels", "were", "detected", "by", "western", "blotting", "of", "total", "lysates", "from", "wild", "-", "type", "and", "Gli2", "−", "/", "−", "mice", "embryos", "(", "E12", ".", "5", ")", ".", "For", "quantification", ",", "LC3", "-", "II", "levels", "from", "a", "total", "of", "five", "wild", "-", "type", "and", "five", "Gli2", "−", "/", "−", "embryos", "were", "normalized", "to", "actin", ",", "wild", "-", "type", "was", "set", "to", "100", ".", "Graphs", "show", "mean", "values", "and", "error", "bars", "represent", "s", ".", "d", ".", "Statistical", "analysis", "were", "performed", "by", "two", "-", "tail", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "*", "*", "P0", ".", "01", ".", "Pmph", ",", "purmorphamine", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f4(a) Wild-type Gli+/+ or Gli1−/−, Gli2−/− and Gli3−/− MEFs were treated with 100 mM trehalose alone or in combination with 10 μM of Pmph for 24 h, or left untreated. Total cell lysates were subjected to immunoblot with anti-LC3 and anti-actin antibodies.(b) Gli2−/− MEFs were transfected for 48 h with either empty vector or Gli2 DNA construct and treated as in a. with 100 mM trehalose alone or in combination with 10 μM of Pmph for 24 h, or left untreated. Total cell lysates were subjected to immunoblot with anti-LC3 and anti-actin antibodies.(c) LC3-II levels were detected by western blotting of total lysates from wild-type and Gli2−/− mice embryos (E12.5). For quantification, LC3-II levels from a total of five wild-type and five Gli2−/− embryos were normalized to actin, wild-type was set to 100. Graphs show mean values and error bars represent s.d. Statistical analysis were performed by two-tail Student's t-test **P0.01. Pmph, purmorphamine."}
{"words": ["f5", "(", "a", ",", "b", ")", "Control", "(", "a", ")", "or", "hh", "[", "ts2", "]", "(", "b", ")", "larvae", "were", "incubated", "at", "permissive", "temperature", "(", "18", " ", "°", "C", ")", "to", "the", "third", "instar", "stage", ",", "then", "cultured", "at", "non", "-", "permissive", "temperature", "(", "29", " ", "°", "C", ")", "in", "well", "-", "fed", "conditions", "for", "24", " ", "h", ".", "Dissected", "fat", "body", "tissue", "was", "incubated", "in", "Lysotracker", "Red", "and", "DAPI", "and", "imaged", "unfixed", ".", "(", "c", ")", "Lysotracker", "Red", "-", "labelled", "fat", "body", "containing", "single", "-", "cell", "flipout", "clones", "(", "GFP", "positive", ")", "overexpressing", "patched", ".", "Fat", "body", "was", "dissected", "from", "well", "-", "fed", "larvae", ",", "incubated", "in", "Lysotracker", "Red", "/", "DAPI", "and", "imaged", "unfixed", ".", "(", "d", ")", "Confocal", "image", "of", "a", "GFP", "-", "positive", "patched", "-", "expressing", "clone", ",", "with", "mCherry", "-", "Atg8a", "expressed", "in", "all", "cells", ".", "Fat", "body", "was", "dissected", "from", "well", "-", "fed", "larvae", "and", "imaged", "after", "formaldehyde", "fixation", ".", "(", "e", ")", "GFP", "-", "marked", "flipout", "clones", "of", "CiCell", "-", "expressing", "cells", ".", "Fat", "body", "was", "dissected", "from", "well", "-", "fed", "larvae", ",", "incubated", "in", "Lysotracker", "Red", "/", "DAPI", "and", "imaged", "unfixed", ".", "(", "f", ")", "Confocal", "image", "of", "fixed", "mCherry", "-", "Atg8a", "expressing", "fat", "body", "containing", "a", "GFP", "-", "marked", "clone", "of", "CiCell", "-", "expressing", "cells", ".", "(", "g", ")", "Cells", "homozygous", "for", "the", "null", "costal2", "[", "2", "]", "allele", "(", "marked", "by", "lack", "of", "GFP", ")", "were", "generated", "by", "flp", "/", "FRT", "-", "mediated", "recombination", "in", "mCherry", "-", "Atg8a", "expressing", "fat", "body", ".", "Larvae", "were", "starved", "4", " ", "h", "before", "dissection", "and", "fixation", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f5(a,b) Control (a) or hh[ts2] (b) larvae were incubated at permissive temperature (18 °C) to the third instar stage, then cultured at non-permissive temperature (29 °C) in well-fed conditions for 24 h. Dissected fat body tissue was incubated in Lysotracker Red and DAPI and imaged unfixed.(c) Lysotracker Red-labelled fat body containing single-cell flipout clones (GFP positive) overexpressing patched. Fat body was dissected from well-fed larvae, incubated in Lysotracker Red/DAPI and imaged unfixed.(d) Confocal image of a GFP-positive patched-expressing clone, with mCherry-Atg8a expressed in all cells. Fat body was dissected from well-fed larvae and imaged after formaldehyde fixation.(e) GFP-marked flipout clones of CiCell-expressing cells. Fat body was dissected from well-fed larvae, incubated in Lysotracker Red/DAPI and imaged unfixed.(f) Confocal image of fixed mCherry-Atg8a expressing fat body containing a GFP-marked clone of CiCell-expressing cells.(g) Cells homozygous for the null costal2[2] allele (marked by lack of GFP) were generated by flp/FRT-mediated recombination in mCherry-Atg8a expressing fat body. Larvae were starved 4 h before dissection and fixation."}
{"words": ["f6", "(", "a", ")", "Graph", "representing", "fold", "change", "in", "mRNA", "levels", "in", "cells", "treated", "with", "Shh", "against", "untreated", "cells", ".", "Each", "circle", "represents", "an", "autophagy", "gene", ";", "those", "with", "largest", "fold", "-", "changes", "are", "indicated", "in", "red", ".", "The", "central", "line", "represents", "no", "changes", "in", "expression", ";", "above", "the", "central", "line", ",", "genes", "whose", "expression", "is", "increased", ":", "below", ",", "those", "with", "reduced", "levels", ".", "Grey", "lines", "indicate", "2", "-", "fold", "increase", "or", "decrease", ".", "(", "b", ")", "Table", "showing", "the", "10", "genes", "with", "higher", "fold", "changes", "in", "expression", "and", "the", "values", "obtained", ".", "(", "c", ")", "Levels", "of", "PERK", "protein", "were", "assessed", "by", "western", "blotting", "in", "HeLa", "cells", "treated", "with", "10", " ", "μM", "purmorphamine", "for", "24", " ", "h", ".", "Actin", "was", "used", "as", "a", "protein", "loading", "control", ".", "(", "d", ")", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "purmorphamine", "for", "24", " ", "h", "and", "either", "left", "in", "rich", "media", "or", "in", "HBSS", "for", "the", "last", "4", " ", "h", ".", "Levels", "of", "S51", "phoshorylation", "and", "total", "levels", "of", "eIF2α", "were", "detected", "by", "western", "blotting", "using", "LI", "-", "COR", "infra", "-", "red", "imager", ".", "(", "e", ",", "f", ")", "Wild", "-", "type", "and", "PERK", "−", "/", "−", "(", "e", ")", "or", "eIF2α", "S51A", "/", "S51A", "MEFs", "(", "f", ")", "were", "treated", "with", "DMSO", "or", "10", " ", "μM", "purmorphamine", "for", "24", " ", "h", "and", ",", "where", "indicated", ",", "cells", "were", "treated", "with", "bafA1", "for", "the", "last", "4", " ", "h", ".", "tubulin", "-", "II", "and", "tubulin", "or", "tubulin", ",", "as", "a", "loading", "control", ",", "were", "detected", "and", "a", "representative", "blot", "is", "shown", ".", "HBSS", ",", "Hank", "'", "s", "balanced", "salt", "solution", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f6(a) Graph representing fold change in mRNA levels in cells treated with Shh against untreated cells. Each circle represents an autophagy gene; those with largest fold-changes are indicated in red. The central line represents no changes in expression; above the central line, genes whose expression is increased: below, those with reduced levels. Grey lines indicate 2-fold increase or decrease. (b) Table showing the 10 genes with higher fold changes in expression and the values obtained.(c) Levels of PERK protein were assessed by western blotting in HeLa cells treated with 10 μM purmorphamine for 24 h. Actin was used as a protein loading control.(d) HeLa cells were treated with purmorphamine for 24 h and either left in rich media or in HBSS for the last 4 h. Levels of S51 phoshorylation and total levels of eIF2α were detected by western blotting using LI-COR infra-red imager.(e,f) Wild-type and PERK−/− (e) or eIF2α S51A/S51A MEFs (f) were treated with DMSO or 10 μM purmorphamine for 24 h and, where indicated, cells were treated with bafA1 for the last 4 h. tubulin-II and tubulin or tubulin, as a loading control, were detected and a representative blot is shown. HBSS, Hank's balanced salt solution."}
{"words": ["Figure", "1A", ")", "Differential", "interference", "contrast", "(", "DIC", ")", "image", "of", "cortical", "neurons", "in", "culture", ".", "The", "arrowhead", "points", "to", "a", "neuron", "expressing", "Ub", "-", "R", "-", "GFP", ".", "B", ")", "GFP", "fluorescence", "before", "and", "after", "exposure", "to", "lactacystin", "(", "10µM", ")", ".", "C", ")", "A", "neuron", "coexpressing", "Ub", "-", "R", "-", "GFP", "and", "CFP", "before", "(", "left", ")", "and", "10", "hours", "after", "exposure", "to", "lactacystin", "(", "right", ")", ".", "Top", "row", "-", "GFP", "fluorescence", ";", "bottom", "row", "-", "CFP", "fluorescence", ".", "Bars", ":", "50µm", "(", "A", ",", "B", ")", ",", "20", "µm", "(", "C", ")", ".", "D", ")", "Changes", "in", "GFP", "and", "CFP", "fluorescence", "following", "exposure", "to", "lactacystin", "at", "t", "=", "1", "hour", "(", "vertical", "dashed", "line", ")", ".", "Changes", "normalized", "to", "initial", "fluorescence", "in", "same", "cells", ".", "9", "neurons", "from", "5", "experiments", ";", "averages", "and", "SEM", ".", "E", ")", "Same", "as", "in", "D", ",", "except", "that", "here", "neurons", "were", "exposed", "only", "to", "carrier", "solution", ".", "11", "neurons", "from", "5", "experiments", ";", "averages", "and", "SEM", "(", "barely", "observable", ")", ".", "F", ")", "Comparison", "of", "GFP", "fluorescence", "accumulation", "rates", ".", "Linear", "fits", "shown", "as", "black", "lines", ";", "fit", "parameters", "shown", "next", "to", "fits", ".", "Same", "data", "as", "in", "D", ",", "and", "E", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A) Differential interference contrast (DIC) image of cortical neurons in culture. The arrowhead points to a neuron expressing Ub-R-GFP. B) GFP fluorescence before and after exposure to lactacystin (10µM).C) A neuron coexpressing Ub-R-GFP and CFP before (left) and 10 hours after exposure to lactacystin (right). Top row - GFP fluorescence; bottom row - CFP fluorescence. Bars: 50µm (A,B), 20 µm (C). D) Changes in GFP and CFP fluorescence following exposure to lactacystin at t=1 hour (vertical dashed line). Changes normalized to initial fluorescence in same cells. 9 neurons from 5 experiments; averages and SEM. E) Same as in D, except that here neurons were exposed only to carrier solution. 11 neurons from 5 experiments; averages and SEM (barely observable). F) Comparison of GFP fluorescence accumulation rates. Linear fits shown as black lines; fit parameters shown next to fits. Same data as in D, and E."}
{"words": ["Figure", "2A", ")", "Hippocampal", "neurons", "in", "primary", "culture", "immunolabeled", "against", "three", "synaptic", "proteins", "(", "the", "postsynaptic", "scaffold", "molecule", "Dlg4", "/", "PSD", "-", "95", ",", "the", "presynaptic", "active", "zone", "molecule", "RIM", "and", "the", "presynaptic", "vesicle", "protein", "SV2A", ")", "following", "10", "hour", "incubations", "in", "carrier", "solution", "(", "control", ",", "upper", "panels", ")", "or", "Lactacystin", "(", "10", "μM", ";", "bottom", "panels", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "10μmB", ")", "Average", "synaptic", "immunofluorescence", "following", "10", "hour", "incubations", "in", "Lactacystin", "or", "carrier", "solution", ".", "Numbers", "within", "bars", "represent", "the", "number", "of", "fields", "of", "view", "analyzed", "for", "each", "condition", "(", "~", "170", "synapses", "/", "field", "of", "view", ",", "on", "average", ")", ".", "Error", "bars", ",", "SEM", ";", "P", "values", "-", "two", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "Note", "that", "a", "statistically", "significant", "accumulation", "was", "observed", "only", "for", "RIM", ",", "whereas", "immunolabeling", "of", "all", "other", "proteins", "was", "either", "unchanged", "or", "reduced", ".", "C", ")", "Hippocampal", "neurons", "in", "primary", "culture", "were", "grown", "in", "the", "presence", "of", "Lactacystin", "(", "10", "μM", ")", ",", "fixed", "at", "two", "hour", "intervals", "and", "immunolabeled", "against", "Shank3", "/", "ProSAP2", ".", "Two", "representative", "fields", "of", "view", "at", "t", "=", "0", "and", "t", "=", "24h", ".", "Scale", "bar", ",", "10μm", ".", "D", ")", "Average", "synaptic", "Shank3", "/", "ProSAP2", "immunofluorescence", "at", "increasing", "times", "in", "the", "presence", "of", "Lactacystin", ".", "Fluorescence", "was", "normalized", "to", "mean", "fluorescence", "at", "t", "=", "0", ".", "Numbers", "under", "data", "points", "reflect", "the", "numbers", "of", "fields", "of", "view", "analyzed", "at", "each", "time", "point", ".", "Error", "bars", ",", "SEM", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A) Hippocampal neurons in primary culture immunolabeled against three synaptic proteins (the postsynaptic scaffold molecule Dlg4/PSD-95, the presynaptic active zone molecule RIM and the presynaptic vesicle protein SV2A) following 10 hour incubations in carrier solution (control, upper panels) or Lactacystin (10 μM; bottom panels). Scale bar, 10μmB) Average synaptic immunofluorescence following 10 hour incubations in Lactacystin or carrier solution. Numbers within bars represent the number of fields of view analyzed for each condition (~170 synapses/field of view, on average). Error bars, SEM; P values - two tailed unpaired t-test. Note that a statistically significant accumulation was observed only for RIM, whereas immunolabeling of all other proteins was either unchanged or reduced.C) Hippocampal neurons in primary culture were grown in the presence of Lactacystin (10 μM), fixed at two hour intervals and immunolabeled against Shank3/ProSAP2. Two representative fields of view at t=0 and t=24h. Scale bar, 10μm. D) Average synaptic Shank3/ProSAP2 immunofluorescence at increasing times in the presence of Lactacystin. Fluorescence was normalized to mean fluorescence at t=0. Numbers under data points reflect the numbers of fields of view analyzed at each time point. Error bars, SEM."}
{"words": ["Figure", "3B", ")", "Comparisons", "of", "H", "/", "L", "ratios", "obtained", "for", "1409", "proteins", "in", "lactacystin", "and", "untreated", "cells", ".", "H", "/", "L", "ratios", "are", "averages", "of", "2", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B) Comparisons of H/L ratios obtained for 1409 proteins in lactacystin and untreated cells. H/L ratios are averages of 2 experiments."}
{"words": ["Figure", "4A", ")", "Fold", "changes", "in", "the", "H", "/", "L", "ratios", "(", ")", "measured", "for", "each", "protein", "in", "the", "experiments", "described", "in", "Fig", ".", "3", "(", "expressed", "as", "log2", "(", "H", "/", "L", ")", "Lactacystin", "-", "log2", "(", "H", "/", "L", ")", "control", ")", ".", "H", "/", "L", "ratios", "used", "here", "are", "the", "average", "of", "ratios", "obtained", "in", "two", "experiments", "for", "each", "protein", "and", "each", "condition", ".", "Proteins", "were", "sorted", "according", "to", "the", "fold", "change", "in", "H", "/", "L", "ratios", "-", "from", "the", "proteins", "whose", "ratios", "were", "most", "strongly", "reduced", "(", "~", "8", "-", "fold", "reduction", ")", "to", "proteins", "whose", "H", "/", "L", "ratios", "increased", "to", "the", "greatest", "extent", "(", ">", "8", "-", "fold", "increase", ")", ".", "Red", "circles", "indicate", "the", "location", "of", "synaptic", "proteins", "along", "this", "sorted", "list", ".", "The", "names", "of", "34", "synaptic", "proteins", "located", "at", "the", "left", "most", "region", "of", "the", "sorted", "list", "are", "provided", "in", "the", "order", "of", "their", "appearance", ".", "B", ")", "The", "apparent", "fold", "-", "change", "in", "protein", "half", "-", "lives", "under", "certain", "assumptions", "described", "in", "Results", ".", "See", "Materials", "and", "Methods", "for", "further", "details", "on", "the", "calculation", "of", "the", "apparent", "fold", "change", "in", "half", "-", "lives", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A) Fold changes in the H/L ratios ( ) measured for each protein in the experiments described in Fig. 3 (expressed as log2(H/L)Lactacystin - log2(H/L)control). H/L ratios used here are the average of ratios obtained in two experiments for each protein and each condition. Proteins were sorted according to the fold change in H/L ratios - from the proteins whose ratios were most strongly reduced (~8-fold reduction) to proteins whose H/L ratios increased to the greatest extent (>8-fold increase). Red circles indicate the location of synaptic proteins along this sorted list. The names of 34 synaptic proteins located at the left most region of the sorted list are provided in the order of their appearance. B) The apparent fold-change in protein half-lives under certain assumptions described in Results. See Materials and Methods for further details on the calculation of the apparent fold change in half-lives."}
{"words": ["Figure", "6A", ")", "Average", "log2", "(", "H", "/", "M", ")", "ratios", "for", "1", ",", "750", "proteins", "at", "four", "time", "points", "in", "three", "separate", "experiments", ".", "Each", "time", "point", "shows", "the", "average", "and", "standard", "deviation", "of", "three", "mean", "log2", "(", "H", "/", "M", ")", "values", "obtained", "in", "three", "separate", "experiments", ".", "Each", "mean", ",", "in", "turn", ",", "represents", "the", "mean", "log2", "(", "H", "/", "M", ")", "value", "measured", "in", "the", "population", "of", "1", ",", "750", "proteins", "in", "that", "experiment", "and", "time", "point", ".", "B", ")", "Distribution", "of", "log2", "(", "H", "/", "M", ")", "values", "for", "1", ",", "750", "proteins", "at", "t", "=", "0", ".", "The", "log2", "(", "H", "/", "M", ")", "value", "of", "each", "protein", "represents", "the", "average", "value", "for", "that", "protein", "in", "the", "three", "experiments", ".", "In", "principle", ",", "log2", "(", "H", "/", "M", ")", "for", "all", "proteins", "at", "t", "=", "0", "should", "be", "0", ",", "but", "in", "practice", "they", "are", "distributed", "around", "0", "as", "shown", "here", ".", "The", "H", "/", "M", "ratios", "for", "3", "standard", "deviation", "limits", "are", "shown", "beneath", "the", "X", "axis", ".", "C", ",", "D", ")", "The", "same", "as", "in", "A", "and", "B", "but", "for", "two", "experiments", "in", "which", "Epoxomicin", "was", "used", "(", "1", ",", "823", "proteins", ")", ".", "E", ",", "F", ")", "The", "same", "as", "in", "A", "and", "B", "but", "for", "the", "combined", "data", "from", "all", "experiments", "(", "3", "experiments", "in", "which", "lactacystin", "was", "used", "and", "2", "experiments", "in", "which", "epoxomicin", "was", "used", ";", "1", ",", "469", "proteins", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A) Average log2(H/M) ratios for 1,750 proteins at four time points in three separate experiments. Each time point shows the average and standard deviation of three mean log2(H/M) values obtained in three separate experiments. Each mean, in turn, represents the mean log2(H/M) value measured in the population of 1,750 proteins in that experiment and time point. B) Distribution of log2(H/M) values for 1,750 proteins at t=0. The log2(H/M) value of each protein represents the average value for that protein in the three experiments. In principle, log2(H/M) for all proteins at t=0 should be 0, but in practice they are distributed around 0 as shown here. The H/M ratios for 3 standard deviation limits are shown beneath the X axis. C, D) The same as in A and B but for two experiments in which Epoxomicin was used (1,823 proteins). E, F) The same as in A and B but for the combined data from all experiments (3 experiments in which lactacystin was used and 2 experiments in which epoxomicin was used; 1,469 proteins)."}
{"words": ["Figure", "7A", ")", "log2", "(", "H", "/", "M", ")", "values", "for", "5", "synaptic", "proteins", "for", "which", "degradation", "rates", "were", "significantly", "slowed", "down", "in", "the", "presence", "of", "lactacystin", ".", "Each", "point", "represents", "average", "log2", "(", "H", "/", "M", ")", "from", "3", "experiments", ".", "B", ")", "log2", "(", "H", "/", "M", ")", "values", "for", "the", "same", "5", "synaptic", "proteins", "in", "experiments", "in", "which", "epoxomicin", "was", "used", ".", "Each", "point", "represents", "average", "log2", "(", "H", "/", "M", ")", "from", "2", "experiments", ".", "C", ")", "Average", "(", "±", "SEM", ")", "log2", "(", "H", "/", "M", ")", "ratios", "for", "the", "same", "5", "synaptic", "proteins", ",", "based", "on", "all", "five", "experiments", "(", "3", "lactacystin", ",", "2", "epoxomicin", ")", ".", "P", "values", "-", "two", "-", "tailed", "Welch", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "comparing", "the", "five", "log2", "(", "H", "/", "M", ")", "measurements", "at", "t", "=", "24", "to", "those", "measured", "for", "the", "same", "proteins", "at", "t", "=", "0", ".", "D", ",", "E", ",", "F", ")", "Average", "(", "±", "SEM", ")", "Log2", "(", "H", "/", "M", ")", "values", "for", "three", "groups", "of", "synaptic", "proteins", "(", "synaptic", "vesicle", ",", "presynaptic", ",", "postsynaptic", ")", ",", "based", "on", "all", "five", "experiments", ".", "None", "of", "the", "changes", "observed", "for", "these", "proteins", "were", "statistically", "significant", ".", "The", "temporal", "changes", "common", "to", "all", "proteins", "and", "all", "groups", "most", "likely", "represent", "slight", "imperfections", "in", "the", "H", "/", "M", "normalization", "process", "(", "Compare", "with", "Fig", ".", "6E", ";", "see", "Results", "for", "further", "details", ")", ".", "G", ")", "log2", "(", "H", "/", "M", ")", "values", "at", "t", "=", "24", "hours", "for", "a", "group", "of", "well", "-", "studied", "synaptic", "proteins", ",", "sorted", "from", "highest", "to", "lowest", ".", "P", "values", "(", "two", "-", "tailed", "Welch", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "of", "comparisons", "with", "log2", "(", "H", "/", "M", ")", "values", "for", "the", "same", "proteins", "at", "t", "=", "0", "are", "shown", "in", "parentheses", ".", "Proteins", "that", "exhibited", "statistically", "significant", "changes", "(", "P", "≤", "0", ".", "05", ")", "at", "t", "=", "24h", "are", "shown", "in", "red", ".", "Proteins", "for", "which", "(", "0", ".", "05", "<", "P", "≤", "0", ".", "10", ")", "at", "t", "=", "24h", "are", "shown", "in", "blue", "/", "red", ".", "The", "gray", "region", "depicts", "three", "standard", "deviations", "of", "log2", "(", "H", "/", "M", ")", "values", "at", "t", "=", "0", "(", "Fig", ".", "6F", ")", ",", "to", "provide", "a", "measure", "of", "the", "method", "'", "s", "sensitivity", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A) log2(H/M) values for 5 synaptic proteins for which degradation rates were significantly slowed down in the presence of lactacystin. Each point represents average log2(H/M) from 3 experiments. B) log2(H/M) values for the same 5 synaptic proteins in experiments in which epoxomicin was used. Each point represents average log2(H/M) from 2 experiments. C) Average (± SEM) log2(H/M) ratios for the same 5 synaptic proteins, based on all five experiments (3 lactacystin, 2 epoxomicin). P values - two-tailed Welch's t-test, comparing the five log2(H/M) measurements at t=24 to those measured for the same proteins at t=0.D,E,F) Average (± SEM) Log2(H/M) values for three groups of synaptic proteins (synaptic vesicle, presynaptic, postsynaptic), based on all five experiments. None of the changes observed for these proteins were statistically significant. The temporal changes common to all proteins and all groups most likely represent slight imperfections in the H/M normalization process (Compare with Fig. 6E; see Results for further details).G) log2(H/M) values at t=24 hours for a group of well-studied synaptic proteins, sorted from highest to lowest. P values (two-tailed Welch's t-test) of comparisons with log2(H/M) values for the same proteins at t=0 are shown in parentheses. Proteins that exhibited statistically significant changes (P≤0.05) at t=24h are shown in red. Proteins for which (0.05 < P ≤ 0.10) at t=24h are shown in blue/red. The gray region depicts three standard deviations of log2(H/M) values at t=0 (Fig. 6F), to provide a measure of the method's sensitivity."}
{"words": ["Figure", "9Measured", "log2", "(", "H", "/", "M", ")", "values", "at", "four", "time", "points", "as", "a", "function", "of", "their", "half", "-", "lives", "estimated", "here", "and", "elsewhere", "(", "Cohen", "et", "al", ",", "2013", ")", ".", "All", "log2", "(", "H", "/", "M", ")", "values", "shown", "here", "are", "averages", "of", "values", "obtained", "in", "5", "experiments", "(", "3", "using", "lactacystin", ",", "2", "using", "epoxomicin", ")", ".", "Proteins", "for", "which", "statistically", "significant", "differences", "at", "t", "=", "24", "hours", "were", "observed", "(", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "two", "-", "tailed", "Welch", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "are", "shown", "in", "red", ".", "Expected", "log2", "(", "H", "/", "M", ")", "values", "based", "on", "equation", "4", "are", "plotted", "as", "light", "blue", "lines", ".", "To", "minimize", "the", "masking", "of", "potential", "dependencies", "by", "the", "slight", "imperfections", "in", "the", "H", "/", "M", "normalization", "process", "(", "which", "introduces", "small", "offsets", "along", "the", "Y", "scale", ")", ",", "average", "population", "log2", "(", "H", "/", "M", ")", "values", "of", "each", "time", "point", "(", "Fig", ".", "6E", ")", "were", "subtracted", "from", "all", "measured", "Log2", "(", "H", "/", "M", ")", "values", ".", "Data", "for", "1", ",", "416", "proteins", "for", "which", "half", "-", "life", "estimates", "were", "available", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 9Measured log2(H/M) values at four time points as a function of their half-lives estimated here and elsewhere (Cohen et al, 2013). All log2(H/M) values shown here are averages of values obtained in 5 experiments (3 using lactacystin, 2 using epoxomicin). Proteins for which statistically significant differences at t=24 hours were observed (P<0.05, two-tailed Welch's t-test) are shown in red. Expected log2(H/M) values based on equation 4 are plotted as light blue lines. To minimize the masking of potential dependencies by the slight imperfections in the H/M normalization process (which introduces small offsets along the Y scale), average population log2(H/M) values of each time point (Fig. 6E) were subtracted from all measured Log2(H/M) values. Data for 1,416 proteins for which half-life estimates were available."}
{"words": ["Figure", "10Measured", "Log2", "(", "H", "/", "M", ")", "values", "at", "four", "time", "points", "as", "a", "function", "of", "their", "half", "-", "lives", "estimated", "here", "and", "elsewhere", "(", "Cohen", "et", "al", ",", "2013", ")", ".", "All", "log2", "(", "H", "/", "M", ")", "values", "shown", "here", "are", "averages", "of", "values", "obtained", "in", "5", "experiments", "(", "3", "using", "lactacystin", ",", "2", "using", "epoxomicin", ")", ".", "Proteins", "for", "which", "statistically", "significant", "differences", "at", "t", "=", "24", "hours", "were", "observed", "(", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "two", "-", "tailed", "Welch", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "are", "shown", "in", "red", ".", "Expected", "log2", "(", "H", "/", "M", ")", "values", "based", "on", "equation", "4", "are", "plotted", "as", "light", "blue", "lines", ".", "To", "minimize", "the", "masking", "of", "potential", "dependencies", "by", "the", "slight", "imperfections", "in", "the", "H", "/", "M", "normalization", "process", "(", "which", "introduces", "small", "offsets", "along", "the", "Y", "scale", ")", ",", "average", "population", "log2", "(", "H", "/", "M", ")", "values", "of", "each", "time", "point", "(", "Fig", ".", "6E", ")", "were", "subtracted", "from", "all", "measured", "Log2", "(", "H", "/", "M", ")", "values", ".", "Data", "for", "174", "synaptic", "proteins", "for", "which", "half", "-", "life", "estimates", "were", "available", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 10Measured Log2(H/M) values at four time points as a function of their half-lives estimated here and elsewhere (Cohen et al, 2013). All log2(H/M) values shown here are averages of values obtained in 5 experiments (3 using lactacystin, 2 using epoxomicin). Proteins for which statistically significant differences at t=24 hours were observed (P<0.05, two-tailed Welch's t-test) are shown in red. Expected log2(H/M) values based on equation 4 are plotted as light blue lines. To minimize the masking of potential dependencies by the slight imperfections in the H/M normalization process (which introduces small offsets along the Y scale), average population log2(H/M) values of each time point (Fig. 6E) were subtracted from all measured Log2(H/M) values. Data for 174 synaptic proteins for which half-life estimates were available."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Silver", "staining", "of", "proteins", "extracted", "from", "N2A", "mouse", "neuronal", "cells", "expressing", "Flag", "-", "HA", "-", "tagged", "C9ORF72", "and", "captured", "through", "consecutive", "anti", "-", "Flag", "and", "anti", "-", "HA", "affinity", "purification", "steps", ".", "(", "B", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "HA", "-", "immunoprecipitated", "proteins", "and", "lysate", "of", "HEK293", "cells", "co", "-", "expressing", "HA", "-", "tagged", "C9ORF72", "and", "/", "or", "Flag", "-", "tagged", "SMCR8", "and", "/", "or", "Flag", "-", "tagged", "WDR41", ".", "(", "C", ")", "Coomassie", "blue", "staining", "of", "Nickel", "-", "NTA", "affinity", "purification", "of", "HIS", "-", "C9ORF72", ",", "SMCR8", "and", "WDR41", "co", "-", "expressed", "in", "baculovirus", "infected", "insect", "cells", ".", "(", "D", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "HA", "-", "immunoprecipitated", "proteins", "and", "lysate", "of", "HEK293", "cells", "co", "-", "expressing", "HA", "-", "tagged", "C9ORF72", "and", "HA", "-", "tagged", "SMCR8", "with", "various", "Flag", "-", "tagged", "Rab", "GTPases", ".", "(", "E", ")", "Immunoblot", "against", "endogenous", "C9orf72", ",", "Wdr41", ",", "Rab8a", ",", "Rab39b", ",", "Rab5", "and", "Rab7", "of", "control", "(", "IgG", "alone", ")", "or", "endogenous", "Smcr8", "immunoprecipitated", "from", "adult", "mouse", "brain", ".", "(", "F", ")", "αP32", "-", "radiolabelled", "GDP", "release", "from", "GST", "-", "tagged", "purified", "RAB8a", "as", "a", "function", "of", "increased", "concentration", "of", "either", "recombinant", "purified", "C9ORF72", "alone", "or", "in", "complex", "with", "SMCR8", "and", "WDR41", ".", "(", "G", ")", "Identical", "GDP", "release", "assay", "as", "in", "(", "F", ")", "but", "using", "recombinant", "purified", "GST", "-", "tagged", "RAB39b", "instead", "of", "RAB8a", ".", "Error", "bars", "indicate", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Experiments", "were", "repeated", "3", "times", "(", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Silver staining of proteins extracted from N2A mouse neuronal cells expressing Flag-HA-tagged C9ORF72 and captured through consecutive anti-Flag and anti-HA affinity purification steps.(B) Immunoblot analysis of HA-immunoprecipitated proteins and lysate of HEK293 cells co-expressing HA-tagged C9ORF72 and/ or Flag-tagged SMCR8 and/or Flag-tagged WDR41.(C) Coomassie blue staining of Nickel-NTA affinity purification of HIS-C9ORF72, SMCR8 and WDR41 co-expressed in baculovirus infected insect cells.(D) Immunoblot analysis of HA-immunoprecipitated proteins and lysate of HEK293 cells co-expressing HA-tagged C9ORF72 and HA-tagged SMCR8 with various Flag-tagged Rab GTPases.(E) Immunoblot against endogenous C9orf72, Wdr41, Rab8a, Rab39b, Rab5 and Rab7 of control (IgG alone) or endogenous Smcr8 immunoprecipitated from adult mouse brain.(F)αP32-radiolabelled GDP release from GST-tagged purified RAB8a as a function of increased concentration of either recombinant purified C9ORF72 alone or in complex with SMCR8 and WDR41.(G) Identical GDP release assay as in (F) but using recombinant purified GST-tagged RAB39b instead of RAB8a. Error bars indicate s.e.m. Experiments were repeated 3 times (n=3)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Left", "panel", ",", "representative", "images", "of", "organotypic", "cultures", "of", "E18", "mouse", "cortical", "neurons", "transfected", "with", "GFP", "-", "RFP", "-", "LC3B", "and", "transduced", "with", "lentivirus", "expressing", "either", "control", "shRNA", "or", "shRNA", "targeting", "C9orf72", "mRNA", "and", "treated", "or", "not", "with", "Torin", ".", "Right", "panel", ",", "quantification", "of", "LC3B", "puncta", ".", "(", "B", ")", "Upper", "panel", ",", "immunoblot", "analysis", "of", "endogenous", "LC3B", "(", "Map1lc3b", ")", ",", "C9orf72", "and", "control", "Actin", "of", "E18", "mouse", "cortical", "neurons", "transduced", "with", "lentivirus", "expressing", "either", "control", "shRNA", "or", "shRNA", "targeting", "C9orf72", "mRNA", "and", "treated", "or", "not", "with", "Torin", ".", "Lower", "panel", ",", "real", "time", "RT", "-", "qPCR", "quantification", "of", "endogenous", "C9orf72", "mRNA", "expression", "relative", "to", "Rplp0", "mRNA", ".", "(", "C", ")", "Left", "panel", ",", "representative", "images", "of", "immunofluorescence", "labeling", "of", "endogenous", "P62", "(", "Sqstm1", ")", "on", "organotypic", "cultures", "of", "E18", "mouse", "cortical", "neurons", "transduced", "with", "lentiviral", "particles", "expressing", "either", "control", "shRNA", "or", "shRNA", "targeting", "C9orf72", ".", "Right", "panel", ",", "quantification", "of", "P62", "aggregates", ".", "(", "D", ")", "Left", "panel", ",", "representative", "images", "of", "immunofluorescence", "labeling", "of", "transfected", "constructs", "(", "Green", ")", "and", "endogenous", "P62", "(", "Sqstm1", ",", "red", ")", "on", "GT1", "-", "7", "neuronal", "cells", "transfected", "with", "siRNA", "targeting", "C9orf72", "and", "plasmids", "expressing", "control", "GFP", ",", "HA", "tagged", "wild", "type", "or", "mutant", "RAB39b", "(", "CA", ",", "Q68L", "or", "CN", ",", "S22N", ")", ",", "RAB8a", "or", "RAB7", ".", "Right", "panel", ",", "quantification", "of", "P62", "aggregates", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "µm", ".", "Nuclei", "were", "counterstained", "with", "DAPI", ".", "Error", "bars", "indicate", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Student", "T", "-", "test", ",", "*", "indicates", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "indicates", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "n", "=", "3", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Left panel, representative images of organotypic cultures of E18 mouse cortical neurons transfected with GFP-RFP-LC3B and transduced with lentivirus expressing either control shRNA or shRNA targeting C9orf72 mRNA and treated or not with Torin. Right panel, quantification of LC3B puncta.(B) Upper panel, immunoblot analysis of endogenous LC3B (Map1lc3b), C9orf72 and control Actin of E18 mouse cortical neurons transduced with lentivirus expressing either control shRNA or shRNA targeting C9orf72 mRNA and treated or not with Torin. Lower panel, real time RT-qPCR quantification of endogenous C9orf72 mRNA expression relative to Rplp0 mRNA.(C) Left panel, representative images of immunofluorescence labeling of endogenous P62 (Sqstm1) on organotypic cultures of E18 mouse cortical neurons transduced with lentiviral particles expressing either control shRNA or shRNA targeting C9orf72. Right panel, quantification of P62 aggregates.(D) Left panel, representative images of immunofluorescence labeling of transfected constructs (Green) and endogenous P62 (Sqstm1, red) on GT1-7 neuronal cells transfected with siRNA targeting C9orf72 and plasmids expressing control GFP, HA tagged wild type or mutant RAB39b (CA, Q68L or CN, S22N), RAB8a or RAB7. Right panel, quantification of P62 aggregates. Scale bars, 10 µm. Nuclei were counterstained with DAPI. Error bars indicate s.e.m. Student T-test, * indicates p<0.05, *** indicates p<0.001. n=3."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "HA", "-", "immunoprecipitated", "proteins", "and", "lysate", "of", "HEK293", "cells", "co", "-", "expressing", "HA", "-", "tagged", "C9ORF72", "and", "HA", "-", "tagged", "SMCR8", "with", "Flag", "-", "tagged", "TBK1", ",", "NAP1", ",", "TANK", "or", "SINTBAD", ".", "(", "B", ")", "Immunoprecipitated", "HA", "-", "tagged", "C9ORF72", ",", "HA", "-", "tagged", "SMCR8", "and", "HA", "-", "tagged", "WDR41", "expressed", "in", "HEK293", "were", "subjected", "to", "in", "vitro", "TBK1", "kinase", "assay", "in", "the", "presence", "of", "γP32", "-", "radiolabelled", "ATP", ".", "Proteins", "were", "separated", "by", "SDS", "page", "migration", "and", "phosphorylation", "was", "detected", "by", "autoradiography", "(", "upper", "panel", ")", ",", "while", "expression", "was", "detected", "by", "western", "blotting", "(", "lower", "panel", ")", ".", "(", "C", ")", "Mass", "spectrometry", "identification", "of", "SMCR8", "phosphorylation", "sites", "by", "in", "vitro", "TBK1", "kinase", "assay", "of", "HIS", "-", "tagged", "C9ORF72", ":", "SMCR8", ":", "WDR41", "complex", "purified", "from", "baculovirus", "infected", "insect", "cells", ".", "(", "D", ")", "Left", "panel", ",", "representative", "images", "of", "immunofluorescence", "labeling", "of", "transfected", "constructs", "(", "Green", ")", "and", "endogenous", "P62", "(", "Sqstm1", ",", "red", ")", "on", "GT1", "-", "7", "neuronal", "cells", "transfected", "with", "siRNA", "targeting", "the", "3", "'", "UTR", "of", "Smcr8", "mRNA", "and", "plasmids", "expressing", "control", "GFP", ",", "HA", "tagged", "wild", "type", "or", "mutant", "SMCR8", "(", "TA", ",", "S402A", "and", "T796A", ";", "TD", ",", "S402D", "and", "T796D", ";", "UD", ",", "S400D", ",", "S492D", ",", "S562D", "and", "T666D", ")", ".", "Right", "panel", ",", "quantification", "of", "P62", "aggregates", ".", "(", "E", ")", "Left", "panel", ",", "representative", "images", "of", "immunofluorescence", "labeling", "of", "transfected", "constructs", "(", "Green", ")", "and", "endogenous", "P62", "(", "Sqstm1", ",", "red", ")", "on", "GT1", "-", "7", "neuronal", "cells", "transfected", "with", "siRNA", "targeting", "Tbk1", "and", "plasmids", "expressing", "control", "GFP", ",", "HA", "tagged", "wild", "type", "or", "mutant", "SMCR8", "or", "RAB39b", ".", "Right", "panel", ",", "quantification", "of", "P62", "aggregates", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "µm", ".", "Nuclei", "were", "counterstained", "with", "DAPI", ".", "Error", "bars", "indicate", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Student", "T", "-", "test", ",", "*", "indicates", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "indicates", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "n", "=", "3", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Immunoblot analysis of HA-immunoprecipitated proteins and lysate of HEK293 cells co-expressing HA-tagged C9ORF72 and HA-tagged SMCR8 with Flag-tagged TBK1, NAP1, TANK or SINTBAD.(B) Immunoprecipitated HA-tagged C9ORF72, HA-tagged SMCR8 and HA-tagged WDR41 expressed in HEK293 were subjected to in vitro TBK1 kinase assay in the presence of γP32-radiolabelled ATP. Proteins were separated by SDS page migration and phosphorylation was detected by autoradiography (upper panel), while expression was detected by western blotting (lower panel).(C) Mass spectrometry identification of SMCR8 phosphorylation sites by in vitro TBK1 kinase assay of HIS-tagged C9ORF72:SMCR8:WDR41 complex purified from baculovirus infected insect cells.(D) Left panel, representative images of immunofluorescence labeling of transfected constructs (Green) and endogenous P62 (Sqstm1, red) on GT1-7 neuronal cells transfected with siRNA targeting the 3'UTR of Smcr8 mRNA and plasmids expressing control GFP, HA tagged wild type or mutant SMCR8 (TA, S402A and T796A; TD, S402D and T796D; UD, S400D, S492D, S562D and T666D). Right panel, quantification of P62 aggregates.(E) Left panel, representative images of immunofluorescence labeling of transfected constructs (Green) and endogenous P62 (Sqstm1, red) on GT1-7 neuronal cells transfected with siRNA targeting Tbk1 and plasmids expressing control GFP, HA tagged wild type or mutant SMCR8 or RAB39b. Right panel, quantification of P62 aggregates. Scale bars, 10 µm. Nuclei were counterstained with DAPI. Error bars indicate s.e.m. Student T-test, * indicates p<0.05, *** indicates p<0.001. n=3."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Immunoblot", "analysis", "of", "endogenous", "Tdp", "-", "43", ",", "C9orf72", "and", "control", "Gapdh", "of", "E18", "mouse", "cortical", "neurons", "transduced", "with", "lentivirus", "expressing", "either", "control", "shRNA", "or", "shRNA", "targeting", "C9orf72", "mRNA", ".", "(", "B", ")", "Left", "panel", ",", "representative", "images", "of", "immunofluorescence", "labeling", "of", "endogenous", "phosphorylated", "Ser409", "/", "410", "-", "Tdp", "-", "43", "on", "primary", "cultures", "of", "E18", "mouse", "cortical", "neurons", "transduced", "with", "lentiviral", "particles", "expressing", "either", "control", "shRNA", "or", "shRNA", "targeting", "C9orf72", ".", "Right", "panel", ",", "quantification", "of", "cytoplasmic", "Tdp", "-", "43", "aggregates", ".", "(", "C", ")", "Left", "panel", ",", "representative", "images", "of", "immunofluorescence", "labeling", "of", "D169G", "mutant", "GFP", "-", "tagged", "TDP", "-", "43", "on", "primary", "cultures", "of", "E18", "mouse", "cortical", "neurons", "transfected", "with", "either", "HA", "-", "tagged", "control", "or", "HA", "-", "C9ORF72", "plasmid", ".", "Right", "panel", ",", "quantification", "of", "cells", "with", "cytoplasmic", "aggregates", "of", "TDP", "-", "43", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "µm", ".", "Nuclei", "were", "counterstained", "with", "DAPI", ".", "Error", "bars", "indicate", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Student", "T", "-", "test", ",", "*", "*", "*", "indicates", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "n", "=", "3", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Immunoblot analysis of endogenous Tdp-43, C9orf72 and control Gapdh of E18 mouse cortical neurons transduced with lentivirus expressing either control shRNA or shRNA targeting C9orf72 mRNA.(B) Left panel, representative images of immunofluorescence labeling of endogenous phosphorylated Ser409/410-Tdp-43 on primary cultures of E18 mouse cortical neurons transduced with lentiviral particles expressing either control shRNA or shRNA targeting C9orf72. Right panel, quantification of cytoplasmic Tdp-43 aggregates.(C) Left panel, representative images of immunofluorescence labeling of D169G mutant GFP-tagged TDP-43 on primary cultures of E18 mouse cortical neurons transfected with either HA-tagged control or HA-C9ORF72 plasmid. Right panel, quantification of cells with cytoplasmic aggregates of TDP-43. Scale bars, 10 µm. Nuclei were counterstained with DAPI. Error bars indicate s.e.m. Student T-test, *** indicates p<0.001. n=3."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Left", "panel", ",", "representative", "images", "of", "organotypic", "cultures", "of", "E18", "mouse", "cortical", "neurons", "co", "-", "transfected", "with", "HA", "-", "tagged", "ATXN2", "with", "control", "(", "Q22x", ")", "or", "intermediate", "(", "Q30x", ")", "polyQ", "size", "and", "transduced", "with", "lentivirus", "expressing", "either", "control", "shRNA", "or", "shRNA", "targeting", "C9orf72", "mRNA", ".", "Right", "panel", ",", "quantification", "of", "ATXN2", "aggregates", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "µm", ".", "Nuclei", "were", "counterstained", "with", "DAPI", ".", "(", "B", ")", "Cell", "viability", "(", "tetrazolium", "assay", ")", "of", "GT1", "-", "7", "neuronal", "cells", "co", "-", "transfected", "with", "HA", "-", "tagged", "ATXN2", "with", "control", "(", "Q22x", ")", "or", "intermediate", "(", "Q30x", ")", "polyQ", "size", "and", "control", "siRNA", "or", "siRNA", "targeting", "C9orf72", "mRNA", ".", "Error", "bars", "indicate", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Student", "T", "-", "test", ",", "*", "*", "*", "indicates", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "n", "=", "3", ".", "(", "C", ")", "Tracing", "of", "the", "swimming", "trajectories", "of", "48", "hours", "post", "-", "fertilization", "zebrafish", "larvae", "following", "light", "touch", ".", "(", "D", "-", "F", ")", "Quantification", "of", "the", "touch", "-", "evoked", "swimming", "distance", "(", "D", ")", ",", "average", "velocity", "(", "E", ")", ",", "and", "maximum", "velocity", "attained", "(", "F", ")", "shows", "significant", "functional", "impairment", "of", "the", "zebrafish", "injected", "with", "HA", "-", "tagged", "ATXN2", "with", "intermediate", "length", "of", "polyQ", "(", "Q30x", ")", "and", "antisense", "morpholino", "oligonucleotides", "(", "AMOs", ")", "against", "C9orf72", "compared", "to", "control", "HA", "-", "tagged", "ATXN2", "(", "Q22x", ")", "or", "to", "the", "sole", "injection", "of", "AMO", "against", "C9orf72", ".", "(", "G", ")", "Representative", "images", "of", "motor", "neurons", "visualized", "with", "anti", "-", "Sv2", "immunohistochemistry", "show", "severe", "axonopathy", "in", "fish", "injected", "with", "both", "ATXN2", "Q30x", "and", "AMO", "against", "C9orf72", "compared", "to", "zebrafish", "injected", "with", "control", "ATXN2", "Q22x", "or", "with", "AMO", "against", "C9orf72", "alone", ".", "(", "H", ")", "Quantification", "of", "the", "motor", "neuron", "axonal", "length", "demonstrates", "a", "significant", "decrease", "of", "axonal", "length", "in", "48", "hours", "post", "-", "fertilization", "zebrafish", "larvae", "injected", "with", "both", "ATXN2", "Q30x", "and", "AMO", "against", "C9orf72", "compared", "to", "controls", ".", "Error", "bars", "indicate", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", ",", "*", "*", "indicates", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "n", "=", "3", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Left panel, representative images of organotypic cultures of E18 mouse cortical neurons co-transfected with HA-tagged ATXN2 with control (Q22x) or intermediate (Q30x) polyQ size and transduced with lentivirus expressing either control shRNA or shRNA targeting C9orf72 mRNA. Right panel, quantification of ATXN2 aggregates. Scale bars, 10 µm. Nuclei were counterstained with DAPI.(B) Cell viability (tetrazolium assay) of GT1-7 neuronal cells co-transfected with HA-tagged ATXN2 with control (Q22x) or intermediate (Q30x) polyQ size and control siRNA or siRNA targeting C9orf72 mRNA. Error bars indicate s.e.m. Student T-test, *** indicates p<0.001. n=3.(C) Tracing of the swimming trajectories of 48 hours post-fertilization zebrafish larvae following light touch. (D-F) Quantification of the touch-evoked swimming distance (D), average velocity (E), and maximum velocity attained (F) shows significant functional impairment of the zebrafish injected with HA-tagged ATXN2 with intermediate length of polyQ (Q30x) and antisense morpholino oligonucleotides (AMOs) against C9orf72 compared to control HA-tagged ATXN2 (Q22x) or to the sole injection of AMO against C9orf72.(G) Representative images of motor neurons visualized with anti-Sv2 immunohistochemistry show severe axonopathy in fish injected with both ATXN2 Q30x and AMO against C9orf72 compared to zebrafish injected with control ATXN2 Q22x or with AMO against C9orf72 alone. (H) Quantification of the motor neuron axonal length demonstrates a significant decrease of axonal length in 48 hours post-fertilization zebrafish larvae injected with both ATXN2 Q30x and AMO against C9orf72 compared to controls. Error bars indicate s.e.m. One-way ANOVA, ** indicates p<0.01. n=3."}
{"words": ["Figure", "1E", "and", "F", ".", "TLC", "analysis", "of", "cGAMP", ",", "which", "is", "indicative", "of", "cGAS", "activation", ",", "upon", "incubation", "with", "E", ")", "tRNA", "or", "F", ")", "total", "RNA", "(", "n", "=", "2", ",", "biological", "replicates", ",", "data", "from", "one", "representative", "independent", "biological", "replicate", "are", "shown", ")", ".", "The", "FL", "-", "hcGAS", "concentration", "was", "0", ".", "265", "mg", "/", "mL", ".", "The", "tRNA", "concentrations", "from", "low", "to", "high", "were", "0", ".", "025", ",", "0", ".", "05", ",", "0", ".", "1", ",", "0", ".", "25", ",", "and", "0", ".", "85", "mg", "/", "mL", ".", "The", "extracted", "total", "RNA", "concentrations", "from", "low", "to", "high", "were", "0", ".", "025", ",", "0", ".", "05", ",", "0", ".", "1", ",", "0", ".", "25", ",", "and", "0", ".", "5", "mg", "/", "mL", ".", "NC", "indicates", "the", "negative", "control", "that", "has", "only", "the", "FL", "-", "hcGAS", ".", "dsDNA", "ISD", "at", "a", "concentration", "of", "0", ".", "05", "mg", "/", "mL", "was", "used", "as", "a", "positive", "control", ".", "All", "the", "samples", "were", "prepared", "in", "20", "mM", "HEPES", "at", "pH", "7", ".", "5", "and", "150", "mM", "NaCl", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1E and F. TLC analysis of cGAMP, which is indicative of cGAS activation, upon incubation with E) tRNA or F) total RNA (n=2, biological replicates, data from one representative independent biological replicate are shown). The FL-hcGAS concentration was 0.265 mg/mL. The tRNA concentrations from low to high were 0.025, 0.05, 0.1, 0.25, and 0.85 mg/mL. The extracted total RNA concentrations from low to high were 0.025, 0.05, 0.1, 0.25, and 0.5 mg/mL. NC indicates the negative control that has only the FL-hcGAS. dsDNA ISD at a concentration of 0.05 mg/mL was used as a positive control. All the samples were prepared in 20 mM HEPES at pH 7.5 and 150 mM NaCl."}
{"words": ["Figure", "2F", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "the", "OptiPrep", "gradient", "fractions", "with", "or", "without", "DNase", "and", "RNase", "treatments", ".", "G", ".", "The", "three", "images", "on", "the", "left", "showing", "fluorescence", "signals", "of", "endogenous", "cGAS", "and", "RNA", "in", "HeLa", "cells", "(", "n", "=", "13", ",", "biological", "replicates", ",", "data", "from", "one", "representative", "independent", "biological", "replicate", "are", "shown", ")", ".", "The", "scale", "bar", "represents", "10", "µm", ".", "The", "scatterplot", "on", "the", "right", "plots", "the", "signal", "intensities", "of", "cGAS", "versus", "RNA", "at", "each", "pixel", "in", "the", "indicated", "cytoplasmic", "area", "(", "yellow", "circle", ")", ".", "H", ".", "The", "three", "images", "on", "the", "left", "showing", "the", "fluorescence", "signals", "of", "mCherry", "and", "RNA", "in", "HEK293T", "cells", "(", "n", "=", "9", ",", "biological", "replicates", ",", "data", "from", "one", "representative", "independent", "biological", "replicate", "are", "shown", ")", ".", "The", "scale", "bar", "represents", "10", "µm", ".", "The", "scatterplot", "on", "the", "right", "plots", "signal", "intensities", "of", "mCherry", "versus", "RNA", "at", "each", "pixel", "in", "the", "indicated", "cytoplasmic", "area", "(", "yellow", "circle", ")", ".", "I", ".", "Pearson", "'", "s", "correlation", "coefficient", "(", "CC", ")", "analysis", "of", "the", "fluorescence", "signals", "of", "cGAS", "vs", ".", "RNA", "(", "n", "=", "13", ",", "biological", "replicates", ")", ",", "and", "mCherry", "vs", ".", "RNA", "(", "n", "=", "9", ",", "biological", "replicates", ")", ".", "The", "median", "values", "were", "calculated", "and", "used", "for", "evaluation", "of", "significance", ".", "*", "*", "*", "P", " ", "<", " ", "0", ".", "001", "(", "two", "-", "tailed", "Mann", "-", "Whitney", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2F. Western blot analysis of the OptiPrep gradient fractions with or without DNase and RNase treatments.G. The three images on the left showing fluorescence signals of endogenous cGAS and RNA in HeLa cells (n=13, biological replicates, data from one representative independent biological replicate are shown). The scale bar represents 10 µm. The scatterplot on the right plots the signal intensities of cGAS versus RNA at each pixel in the indicated cytoplasmic area (yellow circle). H. The three images on the left showing the fluorescence signals of mCherry and RNA in HEK293T cells (n=9, biological replicates, data from one representative independent biological replicate are shown). The scale bar represents 10 µm. The scatterplot on the right plots signal intensities of mCherry versus RNA at each pixel in the indicated cytoplasmic area (yellow circle). I. Pearson's correlation coefficient (CC) analysis of the fluorescence signals of cGAS vs. RNA (n=13, biological replicates), and mCherry vs. RNA (n=9, biological replicates). The median values were calculated and used for evaluation of significance. ***P < 0.001 (two-tailed Mann-Whitney test)."}
{"words": ["Figure", "4D", ".", "Fluorescence", "microscopy", "images", "showing", "the", "replacement", "of", "FTSC", "-", "tRNA", "by", "Cy5", "-", "ISD", "at", "indicated", "concentrations", "in", "preformed", "granules", "of", "hcGAS", "and", "FTSC", "-", "tRNA", "(", "n", "=", "2", ",", "biological", "replicates", ",", "data", "from", "one", "representative", "independent", "biological", "replicate", "are", "shown", ")", ".", "In", "each", "square", ",", "a", "representative", "area", "that", "is", "1", "/", "16", "of", "the", "raw", "image", "is", "displayed", ".", "The", "scale", "bars", "represent", "20", "µm", ".", "E", ".", "Fluorescence", "microscopy", "images", "showing", "the", "replacement", "of", "FTSC", "-", "tRNA", "by", "TAMRA", "-", "380", "bp", "-", "dsDNA", "at", "indicated", "concentrations", "in", "preformed", "granules", "of", "hcGAS", "and", "FTSC", "-", "tRNA", "(", "n", "=", "2", ",", "biological", "replicates", ",", "data", "from", "one", "representative", "independent", "biological", "replicate", "are", "shown", ")", ".", "In", "each", "square", ",", "a", "representative", "area", "that", "is", "1", "/", "16", "of", "the", "raw", "image", "is", "displayed", ".", "The", "scale", "bars", "represent", "20", "µm", ".", "F", ".", "Quantification", "of", "the", "replacement", "in", "\"", "D", "\"", ".", "For", "each", "square", ",", "the", "raw", "image", "used", "was", "evenly", "divided", "into", "four", "parts", ".", "Fluorescence", "signal", "ratios", "of", "Cy5", "-", "ISD", "over", "FTSC", "-", "tRNA", "in", "the", "four", "parts", "were", "calculated", ",", "averaged", "and", "plotted", ".", "G", ".", "Quantification", "of", "the", "replacement", "in", "\"", "E", "\"", ".", "For", "each", "square", ",", "the", "raw", "image", "used", "was", "evenly", "divided", "into", "four", "parts", ".", "Fluorescence", "signal", "ratios", "of", "TAMRA", "-", "380", "bp", "-", "dsDNA", "over", "FTSC", "-", "tRNA", "in", "the", "four", "parts", "were", "calculated", ",", "averaged", "and", "plotted", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4D. Fluorescence microscopy images showing the replacement of FTSC-tRNA by Cy5-ISD at indicated concentrations in preformed granules of hcGAS and FTSC-tRNA (n=2, biological replicates, data from one representative independent biological replicate are shown). In each square, a representative area that is 1/16 of the raw image is displayed. The scale bars represent 20 µm. E. Fluorescence microscopy images showing the replacement of FTSC-tRNA by TAMRA-380 bp-dsDNA at indicated concentrations in preformed granules of hcGAS and FTSC-tRNA (n=2, biological replicates, data from one representative independent biological replicate are shown). In each square, a representative area that is 1/16 of the raw image is displayed. The scale bars represent 20 µm. F. Quantification of the replacement in \"D\". For each square, the raw image used was evenly divided into four parts. Fluorescence signal ratios of Cy5-ISD over FTSC-tRNA in the four parts were calculated, averaged and plotted. G. Quantification of the replacement in \"E\". For each square, the raw image used was evenly divided into four parts. Fluorescence signal ratios of TAMRA-380 bp-dsDNA over FTSC-tRNA in the four parts were calculated, averaged and plotted."}
{"words": ["Figure", "1", " ", "The", "3", "'", "-", "UTR", "sequence", "of", "mUcp1", "RNA", ".", "Canonical", "CPEs", "(", "UUUUA1", "-", "2U", "in", "bold", ")", ",", "the", "reported", "BRF1", "-", "binding", "site", "(", "UAUUUAU", ",", "gray", "box", ")", "and", "predicted", "IMP2", "-", "binding", "motifs", "(", "AYAYA", "and", "YA2YA", ",", "underlined", ")", "are", "denoted", ".", "Ucp1L", "and", "Ucp1S", "carrying", "long", "and", "short", "3", "'", "-", "UTRs", ",", "respectively", ",", "are", "resulted", "from", "alternative", "use", "of", "two", "polyadenylation", "signals", "(", "Hex", ":", "AAUAAA", ",", "open", "box", ")", ".", "ORF", ",", "open", "reading", "frame", ".", "The", "arrowhead", "marks", "the", "end", "of", "Ucp1S", "sequence", ".", "Northern", "blots", "of", "Ucp1", "using", "5", "µg", "BAT", "total", "RNA", "and", "the", "denoted", "radiolabeled", "probes", " ", " ", "Schematic", "comparison", "of", "mUcp1L", "and", "hUcp1", ".", "Poly", "(", "A", ")", "signal", "(", "Hex", ",", "open", "box", ")", "and", "CPE", "(", "black", "box", ")", "are", "denoted", ".", "The", "RT", "-", "PCR", "results", "from", "human", ",", "WT", "(", "Ucp1", "+", "/", "+", ")", "and", "UCP1", "-", "KO", "(", "Ucp1", "-", "/", "-", ")", "BAT", "RNA", "samples", " ", " ", "Dual", "luciferase", "reporter", "assay", "and", "RT", "-", "qPCR", ".", "The", "reporter", "plasmids", ",", "Fluc", "-", "mUcp1S", ",", "-", "mUcp1L", "or", "-", "hUcp1L", "3", "'", "-", "UTR", ",", "and", "Rluc", "were", "co", "-", "transfected", "into", "differentiated", "HIB1B", " ", "adipocytes", ".", "The", "transfected", "cells", "were", "used", "for", "luciferase", "activity", "assay", "and", "RT", "-", "qPCR", ".", "Data", "are", "mean", "±", "SD", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "Translation", "efficiency", "was", "defined", "as", "normalized", "activity", "(", "Fluc", "/", "Rluc", ")", "divided", "by", "normalized", "RNA", "level", "(", "Fluc", "/", "Rluc", ")", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", "compared", "with", "Fluc", "-", "mUcp1S", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", " "], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1 The 3'-UTR sequence of mUcp1 RNA. Canonical CPEs (UUUUA1-2U in bold), the reported BRF1-binding site (UAUUUAU, gray box) and predicted IMP2-binding motifs (AYAYA and YA2YA, underlined) are denoted. Ucp1L and Ucp1S carrying long and short 3'-UTRs, respectively, are resulted from alternative use of two polyadenylation signals (Hex: AAUAAA, open box). ORF, open reading frame. The arrowhead marks the end of Ucp1S sequence. Northern blots of Ucp1 using 5 µg BAT total RNA and the denoted radiolabeled probes  Schematic comparison of mUcp1L and hUcp1. Poly(A) signal (Hex, open box) and CPE (black box) are denoted. The RT-PCR results from human, WT (Ucp1+/+) and UCP1-KO (Ucp1-/-) BAT RNA samples  Dual luciferase reporter assay and RT-qPCR. The reporter plasmids, Fluc-mUcp1S, -mUcp1L or -hUcp1L 3'-UTR, and Rluc were co-transfected into differentiated HIB1B adipocytes. The transfected cells were used for luciferase activity assay and RT-qPCR. Data are mean ± SD from 3 independent experiments. Translation efficiency was defined as normalized activity (Fluc/Rluc) divided by normalized RNA level (Fluc/Rluc). ***p < 0.001 compared with Fluc-mUcp1S, one-way ANOVA "}
{"words": ["Figure", "2", " ", "Northern", "blotting", "of", "Ucp1", "and", " ", "18S", " ", "rRNA", "and", "RT", "-", "PCR", "of", "Ucp1L", "and", "Ucp1S", "using", "total", "RNAs", "from", "the", "denoted", "BAT", "samples", "(", "2", "mice", "per", "genotype", ",", "2", "-", "3", "mo", "old", ")", ".", "The", "short", "PCR", "fragments", "were", "isolated", "for", "sequencing", " ", " ", "Western", "blot", "analysis", "using", "WT", "and", "Ucp1", "∆", "L", " ", "BAT", " ", "lysates", ".", "The", "protein", "level", "of", "UCP1", "was", "normalized", "to", "GAPDH", "(", "4", "mo", "old", ",", "n", "=", "4", "per", "group", ")", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "Student", "'", "s", "t", " ", "test", " ", " ", "Dual", "luciferase", "reporter", "assay", ".", "The", "reporter", "plasmids", ",", "Fluc", "-", "mUcp1L", "3", "'", "-", "UTR", ",", "and", "Rluc", "were", "co", "-", "transfected", "with", "the", "plasmid", "expressing", "EGFP", ",", "or", "myc", "-", "tagged", "CPEB", "(", "immunoblots", "shown", "at", "the", "left", ")", "into", "differentiated", "HIB1B", "adipocytes", "(", "Data", "from", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "compared", "with", "EGFP", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", " ", " ", "Western", "blot", "analysis", "using", "BAT", "lysates", "prepared", "from", "various", "CPEB", "-", "WT", "and", "KO", "male", "littermates", "(", "4", "mo", "old", ",", "n", "=", "4", "per", "group", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "Student", "'", "s", "t", "test", " "], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2 Northern blotting of Ucp1 and 18S rRNA and RT-PCR of Ucp1L and Ucp1S using total RNAs from the denoted BAT samples (2 mice per genotype, 2-3 mo old). The short PCR fragments were isolated for sequencing  Western blot analysis using WT and Ucp1∆L BAT lysates. The protein level of UCP1 was normalized to GAPDH (4 mo old, n = 4 per group). **p < 0.01, Student's t test  Dual luciferase reporter assay. The reporter plasmids, Fluc-mUcp1L 3'-UTR, and Rluc were co-transfected with the plasmid expressing EGFP, or myc-tagged CPEB (immunoblots shown at the left) into differentiated HIB1B adipocytes (Data from 3 independent experiments). *p < 0.05 compared with EGFP, one-way ANOVA  Western blot analysis using BAT lysates prepared from various CPEB-WT and KO male littermates (4 mo old, n = 4 per group). *p < 0.05, Student's t test "}
{"words": ["Figure", "3", "Northern", "blotting", "of", "Ucp1L", "and", "Ucp1S", "in", "BAT", "from", "CPEB2", "-", "WT", "and", "-", "KO", "male", "mice", "at", "room", "temperature", "or", "after", "5", "-", "h", "cold", "exposure", "(", "CE", ")", "at", "4oC", "(", "5", "mice", "per", "genotype", ",", "4", "-", "7", "mo", "old", ")"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3 Northern blotting of Ucp1L and Ucp1S in BAT from CPEB2-WT and -KO male mice at room temperature or after 5-h cold exposure (CE) at 4oC (5 mice per genotype, 4-7 mo old)"}
{"words": ["Figure", "4Western", "blot", "analysis", "and", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "protein", "and", "mRNA", "levels", "of", "UCP1", "and", "GAPDH", "in", "WT", "and", "KO", "male", " ", "BAT", "(", "13", "mo", "old", ",", "n", "=", "3", "-", "4", "per", "group", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "UCP1", "and", "GAPDH", "in", "BAT", "lysates", "from", "WT", "and", "KO", "female", "mice", "at", "4", "and", "12", "mo", "old", "(", "n", "=", "3", "per", "group", ")", ".", "Protein", "levels", "were", "normalized", "to", "that", "of", "GAPDH", ".", " ", "RT", "-", "qPCR", "analysis", "of", "Ucp1", " ", "mRNA", "level", "in", "BAT", "collected", "from", "(", "B", ")", "relative", "to", "Gapdh", " ", "mRNA", "levelHematoxylin", "and", "eosin", "sections", "of", "BAT", "from", "WT", "and", "CPEB2", "-", "KO", "female", " ", "mice", "at", "4", "and", "12", "mo", "old", ".", "Scale", "bars", ",", "1", "mmLipid", " ", "droplet", "size", "and", "cell", "number", "(", "i", ".", "e", ".", ",", "number", "of", "nuclei", ")", "in", "WT", "and", "KO", "BAT", "(", "representative", "images", "shown", "in", "4D", ")", "were", "quantified", "and", "displayed", "as", "arbitrary", "units", ".", "Three", "tissue", "sections", "from", "each", "BAT", "and", "3", "mice", "per", "group", "were", "analyzedWeight", "and", "representative", "images", "of", "WT", "and", "KO", "BAT", ".", "Three", "mice", "per", "group", "were"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Western blot analysis and RT-qPCR analysis of protein and mRNA levels of UCP1 and GAPDH in WT and KO male BAT (13 mo old, n = 3-4 per group)Western blot analysis of UCP1 and GAPDH in BAT lysates from WT and KO female mice at 4 and 12 mo old (n = 3 per group). Protein levels were normalized to that of GAPDH. RT-qPCR analysis of Ucp1 mRNA level in BAT collected from (B) relative to Gapdh mRNA levelHematoxylin and eosin sections of BAT from WT and CPEB2-KO female mice at 4 and 12 mo old. Scale bars, 1 mmLipid droplet size and cell number (i.e., number of nuclei) in WT and KO BAT (representative images shown in 4D) were quantified and displayed as arbitrary units. Three tissue sections from each BAT and 3 mice per group were analyzedWeight and representative images of WT and KO BAT. Three mice per group were analyzed"}
{"words": ["Figure", "6", " ", "CPEB2", "-", "WT", "and", "-", "KO", "mice", "were", "transduced", "with", "adeno", "-", "associated", "virus", "(", "AAV", ")", "expressing", "full", "-", "length", "(", "AAV", "_", "CP2", ")", "or", "RNA", "-", "binding", "domain", "(", "AAV", "_", "RBD", ")", "of", "CPEB2", ".", "Immunostaining", "of", "CPEB2", "and", "UCP1", "in", "KO", "BAT", "transduced", "with", "AAV", "_", "CP2", "for", "2", "weeks", ",", "with", "Hoechst", "staining", "of", "nuclei", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "See", "more", "images", "in", "Fig", "EV4D", " ", "Western", "blot", "analysis", "of", "UCP1", "in", "BAT", "lysates", "from", "WT", "and", "KO", "male", "mice", "2", "weeks", "after", "AAV", "transduction", "(", "n", "=", "6", "mice", "per", "group", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "Student", "'", "s", "t", "test", " ", "BAT", " ", "temperature", "of", "WT", "and", "KO", "male", "mice", "after", "2", "weeks", "of", "AAV", "transduction", "measured", "during", "12", "-", "h", "light", "time", "(", "n", "=", "7", "mice", "per", "group", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "Student", "'", "s", "t", "test", " ", " ", "BAT", " ", "temperature", "in", "WT", "and", "KO", "male", "mice", ",", "and", "of", "AAV", "_", "CP2", "-", "transduced", "WT", "and", "KO", "male", "mice", "(", "n", "=", "7", "mice", "per", "group", ")", "before", "and", "after", "i", ".", "p", ".", "injection", "of", "CL316243", "(", "CL", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "repeated", "-", "measures", "two", "-", "way", "ANOVA", " "], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6 CPEB2-WT and -KO mice were transduced with adeno-associated virus (AAV) expressing full-length (AAV_CP2) or RNA-binding domain (AAV_RBD) of CPEB2. Immunostaining of CPEB2 and UCP1 in KO BAT transduced with AAV_CP2 for 2 weeks, with Hoechst staining of nuclei. Scale bar, 10 µm. See more images in Fig EV4D  Western blot analysis of UCP1 in BAT lysates from WT and KO male mice 2 weeks after AAV transduction (n = 6 mice per group). *p < 0.05, Student's t test  BAT temperature of WT and KO male mice after 2 weeks of AAV transduction measured during 12-h light time (n = 7 mice per group). *p < 0.05, Student's t test  BAT temperature in WT and KO male mice, and of AAV_CP2-transduced WT and KO male mice (n = 7 mice per group) before and after i.p. injection of CL316243 (CL). * p < 0.05, repeated-measures two-way ANOVA "}
{"words": ["Figure", "2Normalized", "RPF", "count", "profile", "averaged", "for", "all", "E", ".", "coli", "transcripts", ".", "Profiles", "generated", "for", "cells", "grown", "in", "the", "absence", "and", "presence", "of", "IPTG", "(", "1", "mM", ")", ".", "Start", "and", "stop", "codons", "are", "shaded", ".", "Bar", "chart", "of", "all", "measured", "RBS", "initiation", "rates", "ranked", "by", "their", "strength", ".", "Strong", "RBSs", "with", "initiation", "rates", ">", "1", "ribosome", "/", "s", "are", "highlighted", "in", "red", ".", "(", "D", ")", "Bar", "chart", "of", "all", "measured", "translation", "termination", "efficiencies", "at", "stop", "codons", "ranked", "by", "their", "strength", ".", "Stop", "codons", "with", "translation", "termination", "efficiency", ">", "0", ".", "99", "are", "highlighted", "in", "red", ".", "(", "E", ")", "Distribution", "of", "initiation", "rates", "for", "cells", "grown", "in", "the", "absence", "and", "presence", "of", "IPTG", "(", "1", "mM", ")", ".", "(", "F", ")", "Distribution", "of", "translation", "termination", "efficiencies", "for", "cells", "grown", "in", "the", "absence", "and", "presence", "of", "IPTG", "(", "1", "mM", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Normalized RPF count profile averaged for all E. coli transcripts. Profiles generated for cells grown in the absence and presence of IPTG (1 mM). Start and stop codons are shaded.Bar chart of all measured RBS initiation rates ranked by their strength. Strong RBSs with initiation rates >1 ribosome/s are highlighted in red. (D) Bar chart of all measured translation termination efficiencies at stop codons ranked by their strength. Stop codons with translation termination efficiency >0.99 are highlighted in red. (E) Distribution of initiation rates for cells grown in the absence and presence of IPTG (1 mM). (F) Distribution of translation termination efficiencies for cells grown in the absence and presence of IPTG (1 mM)."}
{"words": ["Figure", "3Comparison", "of", "protein", "synthesis", "rate", "of", "endogenous", "E", ".", "coli", "genes", "measured", "using", "Ribo", "-", "seq", "from", "this", "study", "(", "in", "molecules", "/", "s", "units", ")", "and", "from", "that", "by", "Li", "et", "al", ".", "(", "Li", "et", "al", ",", "2014", ")", "(", "in", "molecules", "/", "generation", "units", ")", ".", "Each", "point", "corresponds", "to", "a", "single", "gene", "and", "color", "denotes", "the", "ratio", "of", "transcription", "initiation", "rate", "to", "translation", "initiation", "rate", "(", "giving", "RNAP", "/", "ribosome", ")", "capturing", "whether", "transcription", "(", "light", "yellow", ")", "or", "translation", "(", "dark", "blue", ")", "is", "more", "dominant", ".", "Transcription", "(", "bottom", ")", "and", "translation", "(", "top", ")", "profiles", "for", "yggN", ",", "rpoH", "and", "greA", ",", "computed", "from", "the", "RNA", "-", "seq", "and", "Ribo", "-", "seq", "data", "without", "induction", ".", "Positions", "of", "the", "genetic", "parts", "and", "gene", "are", "shown", "below", "the", "profiles", ".", "(", "C", ")", "Promoter", "strengths", "in", "RNAP", "/", "s", "units", "and", "RBS", "initiation", "rates", "in", "ribosome", "/", "s", "units", ".", "Transcription", "(", "bottom", ")", "and", "translation", "(", "top", ")", "profiles", "for", "lacZ", ".", "Profiles", "are", "shown", "for", "cells", "in", "the", "absence", "and", "presence", "of", "IPTG", "(", "1", "mM", ")", ".", "Position", "of", "genetic", "parts", "and", "gene", "is", "shown", "below", "the", "profiles", ".", "RBS", "is", "omitted", "from", "the", "genetic", "design", "due", "to", "its", "size", ".", "(", "E", ")", "Measured", "promoter", "strength", "in", "RNAP", "/", "s", "units", ",", "RBS", "initiation", "rate", "in", "ribosomes", "/", "s", "units", ",", "and", "the", "transcriptional", "terminator", "and", "translation", "termination", "efficiency", "for", "lacZ", ".", "Data", "shown", "for", "cells", "in", "the", "absence", "and", "presence", "of", "IPTG", "(", "1", "mM", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Comparison of protein synthesis rate of endogenous E. coli genes measured using Ribo-seq from this study (in molecules/s units) and from that by Li et al. (Li et al, 2014) (in molecules/generation units). Each point corresponds to a single gene and color denotes the ratio of transcription initiation rate to translation initiation rate (giving RNAP/ribosome) capturing whether transcription (light yellow) or translation (dark blue) is more dominant.Transcription (bottom) and translation (top) profiles for yggN, rpoH and greA, computed from the RNA-seq and Ribo-seq data without induction. Positions of the genetic parts and gene are shown below the profiles. (C) Promoter strengths in RNAP/s units and RBS initiation rates in ribosome/s units.Transcription (bottom) and translation (top) profiles for lacZ. Profiles are shown for cells in the absence and presence of IPTG (1 mM). Position of genetic parts and gene is shown below the profiles. RBS is omitted from the genetic design due to its size. (E) Measured promoter strength in RNAP/s units, RBS initiation rate in ribosomes/s units, and the transcriptional terminator and translation termination efficiency for lacZ. Data shown for cells in the absence and presence of IPTG (1 mM)."}
{"words": ["Figure", "4Translation", "profiles", "for", "the", "PK", "-", "LacZ", "construct", "in", "cells", "cultured", "in", "the", "absence", "(", "bottom", ")", "and", "presence", "(", "top", ")", "of", "IPTG", "(", "1", "mM", ")", ".", "The", "gene10", ",", "middle", ",", "and", "lacZ", "regions", "are", "labelled", "above", "the", "profiles", ".", "Shaded", "region", "denotes", "the", "PK", ",", "and", "dashed", "lines", "denote", "the", "start", "codon", "and", "stop", "codons", "of", "gene10", "and", "LacZ", ".", "Fraction", "of", "the", "total", "RPFs", "and", "mRNA", "reads", "in", "each", "reading", "frame", "for", "the", "gene10", ",", "PK", "or", "middle", ",", "and", "lacZ", "regions", "schematically", "shown", "below", "and", "are", "of", "the", "PK", "-", "LacZ", "construct", ".", "Data", "shown", "separately", "for", "cells", "cultured", "in", "the", "absence", "and", "presence", "of", "IPTG", "(", "1", "mM", ")", ".", "Violin", "plots", "of", "the", "distributions", "of", "fractions", "of", "total", "RPFs", "and", "mRNA", "reads", "in", "each", "reading", "frame", "for", "all", "E", ".", "coli", "transcripts", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Translation profiles for the PK-LacZ construct in cells cultured in the absence (bottom) and presence (top) of IPTG (1 mM). The gene10, middle, and lacZ regions are labelled above the profiles. Shaded region denotes the PK, and dashed lines denote the start codon and stop codons of gene10 and LacZ.Fraction of the total RPFs and mRNA reads in each reading frame for the gene10, PK or middle, and lacZ regions schematically shown below and are of the PK-LacZ construct. Data shown separately for cells cultured in the absence and presence of IPTG (1 mM).Violin plots of the distributions of fractions of total RPFs and mRNA reads in each reading frame for all E. coli transcripts."}
{"words": ["Figure", "5Change", "in", "expression", "of", "chromosomal", "genes", "in", "E", ".", "coli", "cells", "following", "induction", "of", "PK", "-", "lacZ", "expression", "(", "1", "mM", "IPTG", ")", ".", "Each", "point", "represents", "a", "transcript", ".", "Differentially", "expressed", "genes", "(", "mRNA", "count", ":", "P", "<", "0", ".", "001", "and", "absolute", "log2", "fold", "-", "change", ">", "1", ".", "37", ";", "translation", "efficiency", ":", "P", "<", "0", ".", "01", ")", "are", "highlighted", "in", "color", "and", "by", "an", "alternative", "point", "shape", "(", "transcriptional", "regulation", ":", "purple", "cross", ";", "translational", "regulation", ":", "orange", "open", "circle", ")", ".", "Translation", "initiation", "rates", "for", "all", "E", ".", "coli", "RBSs", "in", "cells", "harboring", "the", "LacZ", "and", "PK", "-", "LacZ", "constructs", "in", "the", "absence", "and", "presence", "of", "IPTG", "(", "1", "mM", ")", ".", "Solid", "line", "shows", "the", "same", "initiation", "rate", "for", "both", "conditions", ".", "Dotted", "lines", "denote", "linear", "regressions", "for", "the", "data", "with", "no", "offset", ".", "Fractions", "of", "mRNA", "reads", "and", "RPFs", "mapping", "to", "each", "synthetic", "expression", "construct", "(", "LacZ", "and", "PK", "-", "LacZ", ")", "and", "E", ".", "coli", "transcripts", ",", "which", "are", "divided", "into", "three", "major", "categories", ":", "ribosomal", ",", "metabolic", ",", "and", "other", "functions", ".", "Data", "shown", "for", "cells", "cultured", "in", "the", "absence", "and", "presence", "of", "IPTG", "(", "1", "mM", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Change in expression of chromosomal genes in E. coli cells following induction of PK-lacZ expression (1 mM IPTG). Each point represents a transcript. Differentially expressed genes (mRNA count: P < 0.001 and absolute log2 fold-change > 1.37; translation efficiency: P < 0.01) are highlighted in color and by an alternative point shape (transcriptional regulation: purple cross; translational regulation: orange open circle).Translation initiation rates for all E. coli RBSs in cells harboring the LacZ and PK-LacZ constructs in the absence and presence of IPTG (1 mM). Solid line shows the same initiation rate for both conditions. Dotted lines denote linear regressions for the data with no offset.Fractions of mRNA reads and RPFs mapping to each synthetic expression construct (LacZ and PK-LacZ) and E. coli transcripts, which are divided into three major categories: ribosomal, metabolic, and other functions. Data shown for cells cultured in the absence and presence of IPTG (1 mM)."}
{"words": ["Figure", "1B", "HeLa", "cells", "were", "infected", "with", "x", "-", "light", "Shigella", "mCherry", "for", "4", "h", "40", "min", "for", "quantitative", "confocal", "microscopy", ".", "IPTG", "was", "added", "30", "min", "prior", "to", "fixation", ",", "and", "then", "samples", "were", "labelled", "with", "antibody", "for", "SEPT7", ".", "The", "scale", "bar", "represents", "5", "μm", ".", "Graph", "represents", "mean", "%", "±", "SEM", "of", "Shigella", "responding", "to", "IPTG", "outside", "(", "-", ")", "or", "inside", "(", "+", ")", "SEPT7", "cages", "from", "4", "independent", "experiments", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "C", "HeLa", "cells", "were", "infected", "with", "x", "-", "light", "Shigella", "mCherry", "for", "4", "h", "40", "min", "for", "quantitative", "confocal", "microscopy", ".", "IPTG", "was", "added", "30", "min", "prior", "to", "fixation", ",", "and", "then", "samples", "were", "labelled", "with", "antibody", "for", "p62", ".", "The", "scale", "bar", "represents", "5", "μm", ".", "Graph", "represents", "mean", "%", "±", "SEM", "of", "Shigella", "responding", "to", "IPTG", "without", "(", "-", ")", "or", "with", "(", "+", ")", "p62", "from", "at", "least", "4", "independent", "experiments", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "D", "Control", "(", "CTRL", ")", "or", "isopropanol", "-", "treated", "x", "-", "light", "Shigella", "GFP", "were", "induced", "with", "IPTG", "for", "30", "min", ",", "then", "labelled", "with", "SYTOX", "Orange", "for", "10", "min", ".", "The", "scale", "bar", "represents", "5", "μm", ".", "E", "HeLa", "cells", "were", "infected", "for", "1", "h", "30", "min", ",", "treated", "with", "ethanol", "(", "CTRL", ")", "or", "erythromycin", "(", "EM", ")", "for", "2", "h", "prior", "to", "fixation", ",", "and", "then", "labelled", "with", "antibody", "for", "SEPT7", ".", "Graph", "represents", "mean", "%", "±", "SEM", "of", "Shigella", "in", "SEPT7", "cages", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B HeLa cells were infected with x-light Shigella mCherry for 4 h 40 min for quantitative confocal microscopy. IPTG was added 30 min prior to fixation, and then samples were labelled with antibody for SEPT7. The scale bar represents 5 μm. Graph represents mean % ± SEM of Shigella responding to IPTG outside (-) or inside (+) SEPT7 cages from 4 independent experiments. Student's t-test, *** = p<0.001.C HeLa cells were infected with x-light Shigella mCherry for 4 h 40 min for quantitative confocal microscopy. IPTG was added 30 min prior to fixation, and then samples were labelled with antibody for p62. The scale bar represents 5 μm. Graph represents mean % ± SEM of Shigella responding to IPTG without (-) or with (+) p62 from at least 4 independent experiments. Student's t-test, *** = p<0.001.D Control (CTRL) or isopropanol-treated x-light Shigella GFP were induced with IPTG for 30 min, then labelled with SYTOX Orange for 10 min. The scale bar represents 5 μm.E HeLa cells were infected for 1 h 30 min, treated with ethanol (CTRL) or erythromycin (EM) for 2 h prior to fixation, and then labelled with antibody for SEPT7. Graph represents mean % ± SEM of Shigella in SEPT7 cages from 3 independent experiments. Student's t-test, *** = p<0.001."}
{"words": ["Figure", "2B", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "SEPT6", "-", "GFP", "were", "infected", "with", "S", ".", "flexneri", "AfaI", "for", "4", "h", ",", "harvested", ",", "and", "then", "tested", "with", "Co", "-", "IP", ".", "Empty", "vector", "and", "/", "or", "uninfected", "HeLa", "cells", "were", "used", "in", "parallel", "as", "control", ".", "GFP", "-", "trap", "magnetic", "agarose", "beads", "were", "used", "to", "isolate", "SEPT6", "-", "GFP", "from", "cells", ",", "and", "extracts", "were", "immunoblotted", "for", "SEPT6", ",", "GFP", ",", "SEPT7", ",", "or", "p62", ".", "The", "lysates", "were", "immunoblotted", "for", "GAPDH", "as", "control", "for", "cellular", "protein", "levels", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B HeLa cells stably expressing SEPT6-GFP were infected with S. flexneri AfaI for 4 h, harvested, and then tested with Co-IP. Empty vector and/or uninfected HeLa cells were used in parallel as control. GFP-trap magnetic agarose beads were used to isolate SEPT6-GFP from cells, and extracts were immunoblotted for SEPT6, GFP, SEPT7, or p62. The lysates were immunoblotted for GAPDH as control for cellular protein levels."}
{"words": ["Figure", "3A", "HeLa", "cells", "were", "labelled", "with", "MitoTracker", "Red", "CMXRos", ",", "treated", "with", "cytochalasin", "D", "for", "30", "min", ",", "then", "fixed", "and", "labelled", "for", "endogenous", "SEPT7", "for", "confocal", "microscopy", ".", "The", "scale", "bar", "represents", "0", ".", "5", "μm", ".", "See", "also", "Fig", "EV3A", ".", "B", "HeLa", "cells", "were", "infected", "with", "S", ".", "flexneri", "for", "4", "h", "40", "min", ",", "labelled", "with", "MitoTracker", "Red", "CMXRos", ",", "fixed", "and", "labelled", "with", "antibody", "for", "endogenous", "SEPT7", "for", "quantitative", "confocal", "microscopy", ".", "The", "scale", "bar", "represents", "1", "μm", ".", "C", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "SEPT6", "-", "GFP", "were", "transfected", "with", "Mito", "-", "BFP", "for", "24", "h", ",", "infected", "with", "Shigella", "-", "mCherry", "for", "4", "h", "40", "min", ",", "and", "processed", "for", "CLEM", ".", "SEPT6", "is", "shown", "in", "green", ",", "mitochondria", "in", "red", ",", "and", "Shigella", "-", "mCherry", "in", "blue", ".", "Septin", "cages", "identified", "by", "fluorescent", "light", "microscopy", "(", "FLM", ")", "were", "processed", "for", "TEM", ".", "The", "right", "-", "most", "image", "is", "enlarged", "from", "the", "boxed", "region", "in", "the", "TEM", "image", ",", "and", "shows", "the", "bacterium", "(", "Sf", ")", "surrounded", "by", "a", "double", "membrane", "of", "autophagy", "(", "Au", ")", "and", "the", "mitochondrial", "membrane", "(", "Mt", ")", ".", "The", "scale", "bar", "represents", "1", "μm", ".", "See", "also", "Fig", "EV3B", ".", "D", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "SEPT6", "-", "GFP", "were", "transfected", "with", "Mito", "-", "BFP", "for", "24", "h", ",", "then", "infected", "with", "Shigella", "-", "mCherry", "for", "2", "h", "for", "live", "confocal", "microscopy", ".", "Time", "frame", "sequence", "shows", "a", "septin", "cage", "assembling", "around", "Shigella", ".", "Mitochondria", "(", "circle", ")", "support", "sites", "of", "septin", "ring", "assembly", "around", "the", "bacterium", ".", "Each", "frame", "was", "acquired", "every", "2", "min", ".", "The", "scale", "bar", "represents", "1", "μm", ".", "See", "also", "Movie", "EV1", ".", "E", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "control", "(", "CTRL", ")", ",", "Drp1", ",", "or", "Mfn1", "siRNA", "for", "72", "h", ".", "Whole", "cell", "lysates", "were", "immunoblotted", "for", "Drp1", "or", "Mfn1", "to", "show", "the", "efficiency", "of", "depletion", ".", "GAPDH", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "siRNA", "-", "treated", "cells", "were", "infected", "with", "S", ".", "flexneri", "for", "4", "h", "40", "min", ",", "then", "fixed", "for", "microscopy", "and", "stained", "for", "endogenous", "SEPT7", "for", "quantitative", "confocal", "microscopy", ".", "Graph", "represents", "the", "mean", "%", "±", "SEM", "of", "Shigella", "inside", "SEPT7", "cages", "from", "at", "least", "4", "independent", "experiments", "per", "treatment", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A HeLa cells were labelled with MitoTracker Red CMXRos, treated with cytochalasin D for 30 min, then fixed and labelled for endogenous SEPT7 for confocal microscopy. The scale bar represents 0.5 μm. See also Fig EV3A.B HeLa cells were infected with S. flexneri for 4 h 40 min, labelled with MitoTracker Red CMXRos, fixed and labelled with antibody for endogenous SEPT7 for quantitative confocal microscopy. The scale bar represents 1 μm.C HeLa cells stably expressing SEPT6-GFP were transfected with Mito-BFP for 24 h, infected with Shigella-mCherry for 4 h 40 min, and processed for CLEM. SEPT6 is shown in green, mitochondria in red, and Shigella-mCherry in blue. Septin cages identified by fluorescent light microscopy (FLM) were processed for TEM. The right-most image is enlarged from the boxed region in the TEM image, and shows the bacterium (Sf) surrounded by a double membrane of autophagy (Au) and the mitochondrial membrane (Mt). The scale bar represents 1 μm. See also Fig EV3B.D HeLa cells stably expressing SEPT6-GFP were transfected with Mito-BFP for 24 h, then infected with Shigella-mCherry for 2 h for live confocal microscopy. Time frame sequence shows a septin cage assembling around Shigella. Mitochondria (circle) support sites of septin ring assembly around the bacterium. Each frame was acquired every 2 min. The scale bar represents 1 μm. See also Movie EV1.E HeLa cells were treated with control (CTRL), Drp1, or Mfn1 siRNA for 72 h. Whole cell lysates were immunoblotted for Drp1 or Mfn1 to show the efficiency of depletion. GAPDH was used as loading control. siRNA-treated cells were infected with S. flexneri for 4 h 40 min, then fixed for microscopy and stained for endogenous SEPT7 for quantitative confocal microscopy. Graph represents the mean % ± SEM of Shigella inside SEPT7 cages from at least 4 independent experiments per treatment. Student's t-test, ** = p <0.01; *** = p<0.001."}
{"words": ["Figure", "4A", "HeLa", "cells", "expressing", "SEPT6", "-", "GFP", "were", "stained", "with", "MitoTracker", "Red", "CMXRos", ",", "and", "fixed", "for", "confocal", "microscopy", ".", "Inset", "image", "highlights", "location", "of", "septins", "at", "sites", "of", "mitochondrial", "fission", ".", "The", "scale", "bar", "represents", "5", "μm", ".", "B", "HeLa", "cells", "were", "fixed", "and", "labelled", "with", "antibody", "against", "SEPT7", "and", "secondary", "antibody", "coupled", "to", "HRP", ",", "and", "processed", "for", "TEM", ".", "The", "right", "image", "is", "enlarged", "from", "the", "boxed", "region", "in", "the", "TEM", "image", ",", "and", "shows", "a", "SEPT7", "(", "S7", ")", "filament", "(", "labelled", "in", "black", ")", "intersecting", "with", "the", "mitochondrial", "(", "Mt", ")", "fission", "site", ".", "The", "scale", "bar", "represents", "100", "nm", ".", "See", "also", "Fig", "EV4", ".", "C", "HeLa", "cells", "expressing", "SEPT6", "-", "GFP", "were", "stained", "with", "MitoTracker", "Red", "CMXRos", "for", "live", "SOFI", "-", "based", "super", "resolution", "microscopy", ".", "Each", "image", "was", "reconstructed", "from", "100", "raw", "TIRF", "frames", "using", "a", "custom", "made", "SOFI", "-", "based", "algorithm", ".", "Arrows", "highlight", "SEPT6", "association", "with", "location", "of", "mitochondrial", "fission", ".", "The", "scale", "bar", "represents", "1", "µm", ".", "See", "also", "Movie", "EV3", ".", "D", "HeLa", "cells", "expressing", "SEPT6", "-", "GFP", "were", "labelled", "with", "MitoTracker", "Red", "CMXRos", ",", "fixed", "for", "widefield", "immunofluorescence", "microscopy", ",", "and", "labelled", "with", "antibodies", "to", "Drp1", ".", "Arrows", "highlight", "one", "example", "of", "Drp1", "and", "SEPT6", "association", "with", "location", "of", "mitochondrial", "fission", ".", "The", "scale", "bar", "represents", "1", "μm", ".", "E", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "Mito", "-", "BFP", "and", "ActA", "-", "SEPT7", "-", "mCherry", ",", "fixed", "and", "labelled", "with", "antibody", "to", "Drp1", "for", "widefield", "immunofluorescence", "microscopy", ".", "The", "scale", "bar", "represents", "5", "μm", ".", "Inset", "images", "highlight", "Drp1", "and", "SEPT7", "associated", "with", "sites", "of", "mitochondrial", "fission", ".", "Pearson", "'", "s", "correlation", "coefficient", "from", "3", "independent", "experiments", "(", "mean", "±", "SEM", ")", "shows", "that", "mitochondria", "in", "ActA", "-", "SEPT7", "transfected", "cells", "recruit", "significantly", "more", "Drp1", "than", "control", "cells", "(", "Mito", "-", "BFP", "transfected", "alone", ")", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A HeLa cells expressing SEPT6-GFP were stained with MitoTracker Red CMXRos, and fixed for confocal microscopy. Inset image highlights location of septins at sites of mitochondrial fission. The scale bar represents 5 μm.B HeLa cells were fixed and labelled with antibody against SEPT7 and secondary antibody coupled to HRP, and processed for TEM. The right image is enlarged from the boxed region in the TEM image, and shows a SEPT7 (S7) filament (labelled in black) intersecting with the mitochondrial (Mt) fission site. The scale bar represents 100 nm. See also Fig EV4.C HeLa cells expressing SEPT6-GFP were stained with MitoTracker Red CMXRos for live SOFI-based super resolution microscopy. Each image was reconstructed from 100 raw TIRF frames using a custom made SOFI-based algorithm. Arrows highlight SEPT6 association with location of mitochondrial fission. The scale bar represents 1 µm. See also Movie EV3.D HeLa cells expressing SEPT6-GFP were labelled with MitoTracker Red CMXRos, fixed for widefield immunofluorescence microscopy, and labelled with antibodies to Drp1. Arrows highlight one example of Drp1 and SEPT6 association with location of mitochondrial fission. The scale bar represents 1 μm.E HeLa cells were transfected with Mito-BFP and ActA-SEPT7-mCherry, fixed and labelled with antibody to Drp1 for widefield immunofluorescence microscopy. The scale bar represents 5 μm. Inset images highlight Drp1 and SEPT7 associated with sites of mitochondrial fission. Pearson's correlation coefficient from 3 independent experiments (mean ± SEM) shows that mitochondria in ActA-SEPT7 transfected cells recruit significantly more Drp1 than control cells (Mito-BFP transfected alone). Student's t-test, * = p<0.05."}
{"words": ["Figure", "5A", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "control", "(", "CTRL", ")", ",", "SEPT7", ",", "or", "Drp1", "siRNA", "for", "72", "h", ".", "Whole", "cell", "lysate", "of", "siRNA", "-", "treated", "cells", "were", "immunoblotted", "for", "GAPDH", ",", "SEPT7", ",", "or", "Drp1", "to", "show", "the", "efficiency", "of", "siRNA", "depletion", ".", "GAPDH", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "siRNA", "-", "treated", "cells", "were", "labelled", "with", "MitoTracker", "Red", "CMXRos", ",", "and", "fixed", "for", "confocal", "microscopy", ".", "The", "scale", "bar", "represents", "5", "μm", ".", "B", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "control", "(", "CTRL", ")", ",", "SEPT2", ",", "SEPT7", ",", "SEPT9", ",", "Drp1", ",", "or", "SEPT7", "+", "Drp1", "siRNA", "for", "72", "h", ",", "labelled", "with", "MitoTracker", "Red", "CMXRos", ",", "and", "fixed", "for", "quantitative", "confocal", "microscopy", ".", "Graph", "represents", "the", "distribution", "in", "length", "(", "μm", ";", "whiskers", "from", "min", "to", "max", ")", "of", "mitochondria", "in", "siRNA", "-", "treated", "cells", "from", "3", "independent", "experiments", "(", "analysis", "of", "at", "least", "100", "measurements", "per", "biological", "replicate", ")", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "C", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "SEPT6", "-", "GFP", "were", "harvested", ",", "and", "then", "tested", "with", "Co", "-", "IP", ".", "HeLa", "cells", "expressing", "GFP", "were", "used", "in", "parallel", "as", "control", ".", "GFP", "-", "trap", "magnetic", "agarose", "beads", "were", "used", "to", "isolate", "SEPT6", "-", "GFP", "from", "cells", ",", "and", "extracts", "were", "immunoblotted", "for", "Drp1", ",", "SEPT2", ",", "SEPT7", ",", "or", "GFP", ".", "The", "lysates", "were", "immunoblotted", "for", "GAPDH", "as", "control", "for", "cellular", "protein", "levels", ".", "D", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "control", "(", "CTRL", ")", "or", "SEPT7", "siRNA", "for", "72", "h", ",", "and", "whole", "cell", "lysates", "were", "immunoblotted", "for", "SEPT7", ",", "Drp1", ",", "phosphorylated", "Drp1", "(", "P", "-", "Drp1", ")", ",", "or", "Mfn1", ".", "GAPDH", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "Graph", "represents", "the", "mean", "%", "±", "SEM", "of", "the", "relative", "amount", "of", "Drp1", ",", "P", "-", "Drp1", ",", "Mfn1", ",", "or", "SEPT7", "proteins", "quantified", "by", "densitometry", "from", "4", "independent", "experiments", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "ns", "=", "non", "-", "significant", ";", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "E", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "control", "(", "CTRL", ")", "or", "SEPT7", "siRNA", "for", "72", "h", ",", "labelled", "with", "MitoTracker", "Red", "CMXRos", ",", "then", "fixed", "and", "labelled", "for", "endogenous", "P", "-", "Drp1", "for", "quantitative", "confocal", "microscopy", ".", "Representative", "images", "shown", "here", ".", "The", "scale", "bar", "represents", "1", "μm", ".", "The", "recruitment", "of", "P", "-", "Drp1", "to", "mitochondria", "was", "significantly", "decreased", "as", "compared", "to", "control", "cells", "as", "measured", "by", "Pearson", "'", "s", "correlation", "coefficient", "from", "at", "least", "5", "independent", "experiments", "(", "mean", "±", "SEM", ",", "analysis", "of", "at", "least", "250", "cells", "per", "biological", "replicate", ")", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", ".", "F", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "control", "(", "CTRL", ")", "or", "SEPT7", "siRNA", "for", "72", "h", ",", "labelled", "with", "MitoTracker", "Red", "CMXRos", ",", "then", "fixed", "and", "labelled", "for", "endogenous", "Mfn1", "for", "quantitative", "confocal", "microscopy", ".", "Representative", "images", "shown", "here", ".", "The", "scale", "bar", "represents", "1", "μm", ".", "The", "recruitment", "of", "Mfn1", "to", "mitochondria", "was", "significantly", "increased", "as", "compared", "to", "control", "cells", "as", "measured", "by", "Pearson", "'", "s", "correlation", "coefficient", "from", "at", "least", "5", "independent", "experiments", "(", "mean", "±", "SEM", ",", "analysis", "of", "at", "least", "250", "cells", "per", "biological", "replicate", ")", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A HeLa cells were treated with control (CTRL), SEPT7, or Drp1 siRNA for 72 h. Whole cell lysate of siRNA-treated cells were immunoblotted for GAPDH, SEPT7, or Drp1 to show the efficiency of siRNA depletion. GAPDH was used as loading control. siRNA-treated cells were labelled with MitoTracker Red CMXRos, and fixed for confocal microscopy. The scale bar represents 5 μm.B HeLa cells were treated with control (CTRL), SEPT2, SEPT7, SEPT9, Drp1, or SEPT7+ Drp1 siRNA for 72 h, labelled with MitoTracker Red CMXRos, and fixed for quantitative confocal microscopy. Graph represents the distribution in length (μm; whiskers from min to max) of mitochondria in siRNA-treated cells from 3 independent experiments (analysis of at least 100 measurements per biological replicate). Student's t-test, *** = p<0.001.C HeLa cells stably expressing SEPT6-GFP were harvested, and then tested with Co-IP. HeLa cells expressing GFP were used in parallel as control. GFP-trap magnetic agarose beads were used to isolate SEPT6-GFP from cells, and extracts were immunoblotted for Drp1, SEPT2, SEPT7, or GFP. The lysates were immunoblotted for GAPDH as control for cellular protein levels.D HeLa cells were treated with control (CTRL) or SEPT7 siRNA for 72 h, and whole cell lysates were immunoblotted for SEPT7, Drp1, phosphorylated Drp1 (P-Drp1), or Mfn1. GAPDH was used as loading control. Graph represents the mean % ± SEM of the relative amount of Drp1, P-Drp1, Mfn1, or SEPT7 proteins quantified by densitometry from 4 independent experiments. Student's t-test, ns = non-significant; ** = p<0.01, *** = p<0.001.E HeLa cells were treated with control (CTRL) or SEPT7 siRNA for 72 h, labelled with MitoTracker Red CMXRos, then fixed and labelled for endogenous P-Drp1 for quantitative confocal microscopy. Representative images shown here. The scale bar represents 1 μm. The recruitment of P-Drp1 to mitochondria was significantly decreased as compared to control cells as measured by Pearson's correlation coefficient from at least 5 independent experiments (mean ± SEM, analysis of at least 250 cells per biological replicate). Student's t-test, * = p<0.05.F HeLa cells were treated with control (CTRL) or SEPT7 siRNA for 72 h, labelled with MitoTracker Red CMXRos, then fixed and labelled for endogenous Mfn1 for quantitative confocal microscopy. Representative images shown here. The scale bar represents 1 μm. The recruitment of Mfn1 to mitochondria was significantly increased as compared to control cells as measured by Pearson's correlation coefficient from at least 5 independent experiments (mean ± SEM, analysis of at least 250 cells per biological replicate). Student's t-test, * = p<0.05."}
{"words": ["Figure", "6A", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "SEPT6", "-", "GFP", "were", "treated", "with", "Drp1", "siRNA", "for", "72", "h", ",", "transfected", "with", "mito", "-", "BFP", "24", "h", ",", "and", "then", "infected", "with", "S", ".", "flexneri", "-", "mCherry", "for", "2", "h", "for", "live", "confocal", "microscopy", ".", "Representative", "image", "shows", "interplay", "between", "two", "Shigella", "-", "septin", "cages", "and", "fused", "mitochondria", ".", "The", "scale", "bar", "represents", "1", "μm", ".", "See", "also", "Movie", "EV3", ".", "B", "HeLa", "cells", "were", "treated", "with", "Drp1", "siRNA", "for", "72", "h", ",", "and", "then", "infected", "with", "x", "-", "light", "Shigella", "mCherry", "for", "4", "h", "40", "min", "for", "quantitative", "confocal", "microscopy", ".", "IPTG", "was", "added", "30", "min", "prior", "to", "fixation", ",", "and", "then", "samples", "were", "labelled", "with", "antibody", "for", "SEPT7", ".", "Graph", "represents", "mean", "%", "±", "SEM", "of", "Shigella", "responding", "to", "IPTG", "outside", "(", "-", ")", "or", "inside", "(", "+", ")", "SEPT7", "cages", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "C", "HeLa", "cells", "were", "infected", "with", "S", ".", "flexneri", "M90T", "for", "4", "h", "40", "min", ",", "labelled", "with", "MitoTracker", "Red", "CMXRos", ",", "and", "fixed", "for", "quantitative", "confocal", "microscopy", ".", "Boxplots", "show", "the", "length", "of", "mitochondrial", "(", "μm", ";", "whiskers", "from", "min", "to", "max", ")", "surrounding", "Shigella", "outside", "(", "-", ")", "or", "inside", "(", "+", ")", "SEPT7", "cages", "from", "3", "independent", "experiments", "(", "analysis", "of", "at", "least", "130", "measurements", "per", "biological", "replicate", ")", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ";", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "D", "HeLa", "cells", "were", "either", "kept", "uninfected", "as", "a", "control", "or", "infected", "with", "S", ".", "flexneri", "M90T", "or", "S", ".", "flexneri", "ΔIcsA", "for", "4", "h", "40", "min", ".", "Samples", "were", "labelled", "with", "MitoTracker", "Red", "CMXRos", ",", "and", "fixed", "for", "quantitative", "confocal", "microscopy", ".", "Boxplots", "show", "length", "of", "mitochondria", "(", "μm", ";", "whiskers", "from", "min", "to", "max", ")", "in", "uninfected", "cells", "(", "CTRL", ")", ",", "surrounding", "S", ".", "flexneri", "M90T", "(", "+", "M90T", ")", "or", "S", ".", "flexneri", "ΔIcsA", "(", "+", "ΔIcsA", ")", "from", "3", "independent", "experiments", "(", "analysis", "of", "at", "least", "250", "measurements", "per", "biological", "replicate", ")", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ";", "*", "*", "*", "=", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A HeLa cells stably expressing SEPT6-GFP were treated with Drp1 siRNA for 72 h, transfected with mito-BFP 24 h, and then infected with S. flexneri-mCherry for 2 h for live confocal microscopy. Representative image shows interplay between two Shigella-septin cages and fused mitochondria. The scale bar represents 1 μm. See also Movie EV3.B HeLa cells were treated with Drp1 siRNA for 72 h, and then infected with x-light Shigella mCherry for 4 h 40 min for quantitative confocal microscopy. IPTG was added 30 min prior to fixation, and then samples were labelled with antibody for SEPT7. Graph represents mean % ± SEM of Shigella responding to IPTG outside (-) or inside (+) SEPT7 cages from 3 independent experiments. Student's t-test, *** = p<0.001.C HeLa cells were infected with S. flexneri M90T for 4 h 40 min, labelled with MitoTracker Red CMXRos, and fixed for quantitative confocal microscopy. Boxplots show the length of mitochondrial (μm; whiskers from min to max) surrounding Shigella outside (-) or inside (+) SEPT7 cages from 3 independent experiments (analysis of at least 130 measurements per biological replicate). Student's t-test; *** = p<0.001.D HeLa cells were either kept uninfected as a control or infected with S. flexneri M90T or S. flexneri ΔIcsA for 4 h 40 min. Samples were labelled with MitoTracker Red CMXRos, and fixed for quantitative confocal microscopy. Boxplots show length of mitochondria (μm; whiskers from min to max) in uninfected cells (CTRL), surrounding S. flexneri M90T (+M90T) or S. flexneri ΔIcsA (+ΔIcsA) from 3 independent experiments (analysis of at least 250 measurements per biological replicate). Student's t-test; *** = p<0.001."}
{"words": ["Figure", "1CSF", "PGRN", "is", "increased", "in", "mutation", "carriers", "(", "MC", ")", "compared", "to", "non", "-", "carriers", "(", "NC", ")", ".", "CSF", "PGRN", "is", "not", "associated", "with", "age", "in", "either", "NC", "or", "MC", ".", "CSF", "PGRN", "is", "increased", "in", "males", "compare", "to", "females", ".", "CSF", "PGRN", "levels", "do", "not", "differ", "among", "MC", "participants", "carrying", "a", "PSEN1", ",", "PSEN2", "or", "APP", "mutation", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1CSF PGRN is increased in mutation carriers (MC) compared to non-carriers (NC).CSF PGRN is not associated with age in either NC or MC.CSF PGRN is increased in males compare to females.CSF PGRN levels do not differ among MC participants carrying a PSEN1, PSEN2 or APP mutation."}
{"words": ["Figure", "2CSF", "PGRN", "as", "a", "function", "of", "EYO", "in", "mutation", "carriers", "(", "MC", ",", "red", ")", "and", "non", "-", "carriers", "(", "NC", ",", "blue", ")", ".", "The", "solid", "lines", "indicate", "the", "regression", "line", "for", "each", "of", "the", "groups", "and", "the", "95", "%", "confidence", "interval", "(", "CI", ")", "calculated", "by", "a", "linear", "model", "adjusting", "by", "gender", ".", "The", "interaction", "term", "of", "mutation", "status", "and", "EYO", "is", "significant", "(", "P", "=", "0", ".", "041", ")", ",", "also", "when", "including", "PGRN", "outliers", "and", "participants", "with", "EYO", ">", "+", "20", "(", "P", "=", "0", ".", "030", ")", ".", "Individual", "data", "points", "are", "not", "displayed", "to", "prevent", "disclosure", "of", "mutation", "status", ".", "The", "graph", "depicts", "the", "standardised", "differences", "of", "CSF", "PGRN", "between", "MCs", "and", "NCs", "as", "a", "function", "of", "EYO", ",", "in", "the", "context", "of", "other", "biomarker", "and", "cognitive", "changes", ".", "The", "curves", "were", "generated", "by", "the", "linear", "model", "that", "best", "fit", "each", "marker", "(", "see", "statistics", "section", "and", "Appendix", "Table", "S2", ")", ".", "CSF", "PGRN", "is", "significantly", "increased", "in", "MC", "compared", "to", "NC", "10", "years", "before", "the", "expected", "symptom", "onset", "(", "shadowed", "area", ")", "after", "brain", "amyloidosis", "and", "brain", "injury", "(", "as", "measured", "by", "CSF", "T", "-", "tau", ")", "have", "started", ",", "and", "shortly", "before", "CSF", "sTREM2", "starts", "to", "increase", ".", "Abbreviations", ":", "Aβ1", "-", "42", ":", "amyloid", "-", "β", "42", ";", "CSF", ",", "cerebrospinal", "fluid", ";", "MC", ",", "mutation", "carriers", ";", "MMSE", ",", "Mini", "-", "Mental", "State", "Examination", ";", "NC", ",", "non", "-", "carriers", ";", "T", "-", "tau", ",", "total", "tau", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2CSF PGRN as a function of EYO in mutation carriers (MC, red) and non-carriers (NC, blue). The solid lines indicate the regression line for each of the groups and the 95% confidence interval (CI) calculated by a linear model adjusting by gender. The interaction term of mutation status and EYO is significant (P = 0.041), also when including PGRN outliers and participants with EYO > +20 (P = 0.030). Individual data points are not displayed to prevent disclosure of mutation status.The graph depicts the standardised differences of CSF PGRN between MCs and NCs as a function of EYO, in the context of other biomarker and cognitive changes. The curves were generated by the linear model that best fit each marker (see statistics section and Appendix Table S2). CSF PGRN is significantly increased in MC compared to NC 10 years before the expected symptom onset (shadowed area) after brain amyloidosis and brain injury (as measured by CSF T-tau) have started, and shortly before CSF sTREM2 starts to increase. Abbreviations: Aβ1-42: amyloid-β 42; CSF, cerebrospinal fluid; MC, mutation carriers; MMSE, Mini-Mental State Examination; NC, non-carriers; T-tau, total tau."}
{"words": ["Figure", "3Scatter", "plot", "representing", "the", "levels", "of", "CSF", "PGRN", "in", "healthy", "controls", "(", "depicted", "in", "blue", ")", "and", "the", "different", "stages", "of", "the", "Alzheimer", "'", "s", "continuum", "(", "depicted", "in", "red", ")", ".", "The", "analysis", "and", "graphs", "were", "performed", "excluding", "CSF", "PGRN", "outliers", "(", "1", "'", "healthy", "control", "'", ",", "1", "'", "Preclinical", "AD", "A", "+", "/", "TN", "-", "'", ",", "4", "'", "AD", "CDR", "=", "0", ".", "5", "'", "and", "1", "'", "AD", "CDR", "=", "1", "'", ")", ".", "Including", "them", "yielded", "a", "similar", "result", "and", "CSF", "PGRN", "was", "still", "significantly", "higher", "in", "the", "'", "AD", "CDR", "=", "1", "'", "group", "compared", "to", "the", "'", "healthy", "controls", "'", "(", "P", "=", "0", ".", "001", ")", "and", "'", "Preclinical", "AD", "A", "+", "/", "TN", "-", "'", "(", "P", "=", "0", ".", "0001", ")", "groups", ".", "Abbreviations", ":", "A", ":", "amyloid", "-", "β", "biomarker", "status", ";", "AD", ":", "Alzheimer", "'", "s", "disease", ";", "CDR", ":", "clinical", "dementia", "rating", ";", "CSF", ",", "cerebrospinal", "fluid", ";", "N", ":", "neurodegeneration", "biomarker", "status", ";", "T", ":", "tau", "pathology", "biomarker", "status", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Scatter plot representing the levels of CSF PGRN in healthy controls (depicted in blue) and the different stages of the Alzheimer's continuum (depicted in red). The analysis and graphs were performed excluding CSF PGRN outliers (1 'healthy control', 1 'Preclinical AD A+/TN-', 4 'AD CDR = 0.5' and 1 'AD CDR = 1'). Including them yielded a similar result and CSF PGRN was still significantly higher in the 'AD CDR = 1' group compared to the 'healthy controls' (P = 0.001) and 'Preclinical AD A+/TN-' (P = 0.0001) groups. Abbreviations: A: amyloid-β biomarker status; AD: Alzheimer's disease; CDR: clinical dementia rating; CSF, cerebrospinal fluid; N: neurodegeneration biomarker status; T: tau pathology biomarker status."}
{"words": ["Figure", "4Scatter", "plots", "representing", "the", "association", "of", "CSF", "PGRN", "with", "different", "cognitive", "tests", ".", "Only", "the", "subjects", "of", "the", "Alzheimer", "'", "s", "continuum", "group", "(", "n", "=", "474", ")", "were", "included", ".", "In", "all", "tests", "studied", ",", "higher", "levels", "of", "CSF", "PGRN", "were", "associated", "with", "worse", "cognitive", "performance", "(", "namely", ",", "lower", "scores", "in", "ADNI", "-", "Mem", ",", "ADNI", "-", "EF", "and", "MMSE", "and", "higher", "scores", "in", "ADAS", "-", "Cog11", ",", "ADAS", "-", "Cog13", "and", "CDR", "-", "SB", ")", ".", "The", "analysis", "and", "the", "graphs", "are", "excluding", "PGRN", "outliers", ";", "including", "them", "rendered", "similar", "results", "(", "Appendix", "Table", "S6", ")", ".", "Abbreviations", ":", "ADAS", "-", "Cog", ",", "Alzheimer", "'", "s", "disease", "Assessment", "Scale", "-", "cognitive", "subscale", ";", "ADNI", "-", "Mem", ":", "ADNI", "memory", "composite", "score", ";", "ADNI", "-", "EF", ":", "ADNI", "executive", "function", "composite", "score", ";", "CDR", "-", "SB", ":", "clinical", "dementia", "rating", "Sum", "of", "Boxes", ";", "MMSE", ",", "Mini", "-", "Mental", "State", "Examination", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Scatter plots representing the association of CSF PGRN with different cognitive tests. Only the subjects of the Alzheimer's continuum group (n = 474) were included. In all tests studied, higher levels of CSF PGRN were associated with worse cognitive performance (namely, lower scores in ADNI-Mem, ADNI-EF and MMSE and higher scores in ADAS-Cog11, ADAS-Cog13 and CDR-SB). The analysis and the graphs are excluding PGRN outliers; including them rendered similar results (Appendix Table S6). Abbreviations: ADAS-Cog, Alzheimer's disease Assessment Scale - cognitive subscale; ADNI-Mem: ADNI memory composite score; ADNI-EF: ADNI executive function composite score; CDR-SB: clinical dementia rating Sum of Boxes; MMSE, Mini-Mental State Examination."}
{"words": ["Figure", "5Scatter", "plots", "representing", "the", "association", "of", "CSF", "PGRN", "with", "temporo", "-", "parietal", "FDG", "-", "PET", "uptake", "within", "the", "subjects", "of", "the", "Alzheimer", "'", "s", "continuum", "group", "(", "n", "=", "474", ")", ".", "Abbreviations", ":", "FDG", "-", "PET", ":", "Fludeoxyglucose", "positron", "emission", "tomographyScatter", "plots", "representing", "the", "association", "of", "CSF", "PGRN", "with", "total", "hippocampal", "volume", "(", "B", ")", "within", "the", "subjects", "of", "the", "Alzheimer", "'", "s", "continuum", "group", "(", "n", "=", "474", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Scatter plots representing the association of CSF PGRN with temporo-parietal FDG-PET uptake within the subjects of the Alzheimer's continuum group (n = 474). Abbreviations: FDG-PET: Fludeoxyglucose positron emission tomographyScatter plots representing the association of CSF PGRN with total hippocampal volume (B) within the subjects of the Alzheimer's continuum group (n = 474)."}
{"words": ["Figure", "6Scatter", "plots", "representing", "the", "associations", "of", "CSF", "PGRN", "with", "CSF", "sTREM2", "and", "each", "of", "the", "AD", "CSF", "core", "biomarkers", "(", "T", "-", "tau", ",", "P", "-", "tau181P", "and", "Aβ1", "−", "42", ")", "in", "non", "-", "carriers", "(", "NC", ",", "blue", ";", "A", ",", "C", ",", "E", "and", "G", ")", "and", "in", "mutation", "carriers", "(", "MC", ",", "red", ";", "B", ",", "D", ",", "F", "and", "H", ")", ".", "Each", "point", "depicts", "the", "value", "of", "CSF", "PGRN", "and", "the", "corresponding", "biomarker", "of", "a", "subject", "and", "the", "solid", "lines", "indicate", "the", "regression", "line", "and", "the", "95", "%", "confidence", "interval", "(", "CI", ")", "for", "each", "of", "the", "groups", ".", "The", "standardized", "regression", "coefficients", "(", "β", ")", "and", "the", "P", "-", "values", "are", "shown", "and", "were", "computed", "using", "a", "linear", "model", "adjusting", "for", "age", ",", "gender", "and", "APOE", "ε4", ".", "The", "sample", "contained", "some", "outliers", "(", "defined", "as", "3", "SDs", "below", "or", "above", "the", "group", "mean", ")", "of", "the", "CSF", "core", "markers", "of", "AD", ".", "Abbreviations", ":", "Aβ1", "-", "42", ":", "amyloid", "-", "β", "42", ";", "T", "-", "tau", ":", "total", "tau", ";", "P", "-", "tau", ":", "tau", "phosphorylated", "at", "Threonine", "181", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Scatter plots representing the associations of CSF PGRN with CSF sTREM2 and each of the AD CSF core biomarkers (T-tau, P-tau181P and Aβ1−42) in non-carriers (NC, blue; A, C, E and G) and in mutation carriers (MC, red; B, D, F and H). Each point depicts the value of CSF PGRN and the corresponding biomarker of a subject and the solid lines indicate the regression line and the 95% confidence interval (CI) for each of the groups. The standardized regression coefficients (β) and the P-values are shown and were computed using a linear model adjusting for age, gender and APOE ε4. The sample contained some outliers (defined as 3 SDs below or above the group mean) of the CSF core markers of AD. Abbreviations: Aβ1-42: amyloid-β 42; T-tau: total tau; P-tau: tau phosphorylated at Threonine 181."}
{"words": ["Figure", "7Scatter", "plots", "representing", "the", "associations", "of", "CSF", "PGRN", "with", "CSF", "sTREM2", "and", "each", "of", "the", "AD", "CSF", "core", "biomarkers", "(", "T", "-", "tau", ",", "P", "-", "tau181P", "and", "Aβ1", "−", "42", ")", "in", "healthy", "controls", "(", "blue", ";", "A", ",", "D", ",", "G", "and", "J", ")", ",", "Alzheimer", "'", "s", "continuum", "(", "red", ";", "B", ",", "E", ",", "H", "and", "K", ")", "and", "'", "suspected", "non", "-", "Alzheimer", "'", "s", "pathophysiology", "(", "SNAP", ")", "'", "groups", "(", "green", ";", "C", ",", "F", ",", "I", "and", "L", ")", ".", "Each", "point", "depicts", "the", "value", "of", "CSF", "PGRN", "and", "the", "corresponding", "biomarker", "of", "a", "subject", "and", "the", "solid", "lines", "indicate", "the", "regression", "line", "and", "the", "95", "%", "confidence", "interval", "(", "CI", ")", "for", "each", "of", "the", "groups", ".", "The", "standardized", "regression", "coefficients", "(", "β", ")", "and", "the", "P", "-", "values", "are", "shown", "and", "were", "computed", "using", "a", "linear", "model", "adjusting", "for", "age", ",", "gender", "and", "APOE", "ε4", ".", "The", "sample", "contained", "some", "outliers", "(", "defined", "as", "3", "SDs", "below", "or", "above", "the", "group", "mean", ")", "of", "the", "CSF", "core", "markers", "of", "AD", ",", "the", "analysis", "including", "these", "outliers", "yielded", "similar", "results", "(", "Appendix", "Table", "S8", ")", ".", "The", "Aβ1", "-", "42", "values", "used", "for", "the", "associations", "test", "are", "those", "based", "on", "an", "extrapolation", "curve", "since", "the", "upper", "technical", "limit", "is", "1700pg", "/", "ml", ".", "We", "also", "tested", "the", "associations", "with", "Aβ1", "-", "42", "values", "truncated", "at", "the", "upper", "technical", "limit", "and", "the", "result", "was", "similar", ".", "Abbreviations", ":", "Aβ1", "-", "42", ":", "amyloid", "-", "β", "42", ";", "T", "-", "tau", ":", "total", "tau", ";", "P", "-", "tau", ":", "tau", "phosphorylated", "at", "Threonine", "181", ";", "SNAP", ":", "suspected", "non", "-", "Alzheimer", "'", "s", "pathophysiology", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Scatter plots representing the associations of CSF PGRN with CSF sTREM2 and each of the AD CSF core biomarkers (T-tau, P-tau181P and Aβ1−42) in healthy controls (blue; A, D, G and J), Alzheimer's continuum (red; B, E, H and K) and 'suspected non-Alzheimer's pathophysiology (SNAP)' groups (green; C, F, I and L). Each point depicts the value of CSF PGRN and the corresponding biomarker of a subject and the solid lines indicate the regression line and the 95% confidence interval (CI) for each of the groups. The standardized regression coefficients (β) and the P-values are shown and were computed using a linear model adjusting for age, gender and APOE ε4. The sample contained some outliers (defined as 3 SDs below or above the group mean) of the CSF core markers of AD, the analysis including these outliers yielded similar results (Appendix Table S8). The Aβ1-42 values used for the associations test are those based on an extrapolation curve since the upper technical limit is 1700pg/ml. We also tested the associations with Aβ1-42 values truncated at the upper technical limit and the result was similar. Abbreviations: Aβ1-42: amyloid-β 42; T-tau: total tau; P-tau: tau phosphorylated at Threonine 181; SNAP: suspected non-Alzheimer's pathophysiology."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Representative", "Western", "Blot", "analysis", "of", "the", "endogenous", "p150Glued", "co", "-", "immunoprecipitated", "with", "EB1", "in", "shCTL", "or", "shSTIM1", "ECs", "(", "left", ")", "and", "its", "quantification", "by", "normalized", "densitometry", "(", "right", ")", ".", "Negative", "control", "(", "CTL", ")", "was", "performed", "incubating", "cell", "lysate", "with", "protein", "A", "-", "or", "G", "-", "Sepharose", "and", "empty", "mouse", "IgG", ".", "Results", "are", "the", "average", "±", "SD", "of", "three", "independent", "assays", ".", "shCTL", "value", "of", "each", "biological", "replicate", "was", "normalized", "on", "itself", "and", "so", "shSTIM1", "experimental", "value", ".", "Results", "were", "analyzed", "by", "a", "parametric", "two", "-", "tailed", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", "with", "Bonferroni", "post", "hoc", "analysis", ".", "ANOVA", "p", "≤", "0", ",", "001", ";", "Bonferroni", "for", "shCTL", "and", "shSTIM1", "p", "≤", "0", ",", "05", "*", ".", "(", "B", ")", "Representative", "of", "three", "Western", "Blot", "analysis", "of", "endogenous", "p150Glued", ",", "light", "-", "intermediate", "chain", "(", "LIC", ")", "of", "cytoplasmic", "dynein", "1", "and", "EB1", "immunoprecipitated", "with", "STIM1", "in", "wild", "-", "type", "ECs", ".", "Negative", "control", "(", "CTL", ")", "was", "performed", "incubating", "cell", "lysate", "with", "protein", "A", "-", "or", "G", "-", "Sepharose", "and", "empty", "rabbit", "IgG", ".", "(", "D", ")", "Representative", "Western", "Blot", "analysis", "of", "increasing", "amount", "of", "GST", "-", "STIM1", "(", "cytoplasmic", "domain", ")", "pulled", "down", "by", "Cap", "-", "Gly", "-", "CC1", "-", "p150Glued", "-", "V5", "-", "coated", "beads", ",", "in", "absence", "or", "presence", "of", "FLAG", "-", "EB1", "C", "-", "terminal", ".", "Colors", "label", "the", "protein", "as", "in", "(", "c", ")", ".", "Negative", "control", "was", "performed", "using", "equal", "amount", "of", "empty", "GST", "protein", ",", "together", "with", "Cap", "-", "Gly", "-", "CC1", "-", "p150Glued", ".", "(", "E", ")", "Representative", "Western", "Blot", "analysis", "of", "mCherry", "-", "p150Glued", "WT", "co", "-", "immunoprecipitated", "with", "GFP", "-", "STIM1", "WT", ",", "NN", ",", "ΔCC1", "-", "3", "/", "WT", "(", "ΔCC", "/", "WT", ")", "or", "ΔCC1", "-", "3", "/", "NN", "(", "ΔCC", "/", "NN", ")", "in", "co", "-", "transfected", "HEK", "293T", "cells", ".", "Negative", "control", "(", "CTL", ")", "was", "performed", "incubating", "cell", "lysate", "from", "HEK", "293T", "co", "-", "transfected", "with", "an", "empty", "GFP", "vector", "together", "with", "mCherry", "-", "P150Glued", "WT", "with", "pre", "-", "cleared", "protein", "A", "or", "G", "-", "Sepharose", "and", "the", "rabbit", "GFP", "antibody", ".", "Below", ",", "its", "quantification", "by", "normalized", "densitometry", ".", "Results", "are", "the", "average", "±", "SD", "of", "three", "independent", "assays", ".", "The", "value", "of", "P150Glued", "co", "-", "immunoprecipitated", "with", "GFP", "-", "STIM1", "WT", "from", "each", "biological", "replicate", "was", "normalized", "on", "itself", "and", "so", "those", "immunoprecipitated", "with", "GFP", "-", "STIM1", "NN", ",", "ΔCC", "/", "WT", "or", "ΔCC", "/", "NN", ".", "Results", "were", "analyzed", "by", "a", "parametric", "two", "-", "tailed", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", "with", "Bonferroni", "post", "hoc", "analysis", ".", "ANOVA", "p", "≤", "0", ",", "001", ";", "Bonferroni", "for", "STIM1", "WT", "and", "NN", "p", ">", "0", ".", "05", "not", "significant", "(", "ns", ")", ",", "for", "STIM1", "WT", "and", "ΔCC", "/", "WT", "p", ">", "0", ".", "05", "not", "significant", "(", "ns", ")", "and", "for", "STIM1", "WT", "and", "ΔCC", "/", "NN", "p", "≤", "0", ",", "05", "*", ".", "(", "F", ")", "Representative", "Western", "Blot", "analysis", "of", "GST", "-", "STIM1", "(", "cytoplasmic", "domain", ")", "pulled", "down", "by", "Cap", "-", "Gly", "-", "CC1", "-", "p150Glued", "-", "V5", "-", "coated", "beads", ",", "in", "presence", "of", "FLAG", "-", "EB1", "C", "-", "terminal", "WT", "or", "ΔY", ".", "Negative", "control", "was", "performed", "using", "equal", "amount", "of", "empty", "GST", "protein", ",", "together", "with", "Cap", "-", "Gly", "-", "CC1", "-", "p150Glued", ".", "(", "G", ")", "Confocal", "microscopy", "analysis", "of", "wild", "-", "type", "ECs", ",", "transiently", "transfected", "with", "GFP", "-", "STIM1", "WT", "or", ",", "NN", "or", "ΔCC1", "-", "3", "/", "WT", "(", "ΔCC", "/", "WT", ")", "together", "with", "mCherry", "-", "P150Glued", ".", "Scale", "bar", "=", "10", "μm", ".", "Right", "insets", "are", "shown", "to", "highlight", "MT", "-", "bound", "p150Glued", "+", "punctae", "(", "arrows", ")", ",", "colocalized", "with", "STIM1", ".", "Scale", "bar", "=", "5", "μm", ".", "(", "H", ")", "Average", "number", "of", "the", "mCherry", "-", "P150Glued", "+", "punctae", "in", "the", "same", "cells", "as", "in", "(", "g", ")", ".", "Counts", "are", "the", "average", "±", "SEM", "of", "three", "independent", "experiments", "for", "a", "total", "of", "150", "punctae", "(", "30", "cells", ")", ".", "Results", "were", "analyzed", "by", "a", "parametric", "two", "-", "tailed", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", "with", "Bonferroni", "post", "hoc", "analysis", ".", "ANOVA", "p", "≤", "0", ",", "001", ";", "Bonferroni", "for", "STIM1", "WT", "and", "NN", "p", "≤", "0", ",", "001", "*", "*", "*", "and", "for", "STIM1", "WT", "and", "ΔCC", "/", "WT", "p", ">", "0", ".", "05", "not", "significant", "(", "ns", ")", ".", "(", "I", ")", "Co", "-", "localization", "analysis", "of", "mCherry", "-", "P150Glued", "with", "GFP", "-", "STIM1", "WT", ",", "NN", "or", "ΔCC1", "-", "3", "/", "WT", "(", "ΔCC", "/", "WT", ")", ",", "transiently", "co", "-", "transfected", "in", "ECs", ",", "as", "in", "(", "g", ")", ".", "Results", "are", "the", "average", "±", "SEM", "of", "three", "independent", "experiments", "for", "a", "total", "of", "150", "punctae", "(", "30", "cells", ")", "and", "analyzed", "by", "a", "parametric", "two", "-", "tailed", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", "with", "Bonferroni", "post", "hoc", "analysis", ".", "ANOVA", "p", "≤", "0", ",", "001", ";", "Bonferroni", "for", "STIM1", "WT", "and", "NN", "p", "≤", "0", ",", "001", "*", "*", "*", "and", "for", "STIM1", "WT", "and", "ΔCC", "/", "WT", "p", ">", "0", ".", "05", "not", "significant", "(", "ns", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Representative Western Blot analysis of the endogenous p150Glued co-immunoprecipitated with EB1 in shCTL or shSTIM1 ECs (left) and its quantification by normalized densitometry (right). Negative control (CTL) was performed incubating cell lysate with protein A- or G-Sepharose and empty mouse IgG. Results are the average ± SD of three independent assays. shCTL value of each biological replicate was normalized on itself and so shSTIM1 experimental value. Results were analyzed by a parametric two-tailed analysis of variance (ANOVA) with Bonferroni post hoc analysis. ANOVA p≤ 0,001; Bonferroni for shCTL and shSTIM1 p≤ 0,05 *. (B) Representative of three Western Blot analysis of endogenous p150Glued, light-intermediate chain (LIC) of cytoplasmic dynein 1 and EB1 immunoprecipitated with STIM1 in wild-type ECs. Negative control (CTL) was performed incubating cell lysate with protein A- or G-Sepharose and empty rabbit IgG. (D) Representative Western Blot analysis of increasing amount of GST-STIM1 (cytoplasmic domain) pulled down by Cap-Gly-CC1-p150Glued-V5-coated beads, in absence or presence of FLAG-EB1 C-terminal. Colors label the protein as in (c). Negative control was performed using equal amount of empty GST protein, together with Cap-Gly-CC1-p150Glued.(E) Representative Western Blot analysis of mCherry-p150Glued WT co-immunoprecipitated with GFP-STIM1 WT, NN, ΔCC1-3/WT (ΔCC/WT) or ΔCC1-3/NN (ΔCC/NN) in co-transfected HEK 293T cells. Negative control (CTL) was performed incubating cell lysate from HEK 293T co-transfected with an empty GFP vector together with mCherry-P150Glued WT with pre-cleared protein A or G-Sepharose and the rabbit GFP antibody. Below, its quantification by normalized densitometry. Results are the average ± SD of three independent assays. The value of P150Glued co-immunoprecipitated with GFP-STIM1 WT from each biological replicate was normalized on itself and so those immunoprecipitated with GFP-STIM1 NN, ΔCC/WT or ΔCC/NN. Results were analyzed by a parametric two-tailed analysis of variance (ANOVA) with Bonferroni post hoc analysis. ANOVA p≤ 0,001; Bonferroni for STIM1 WT and NN p> 0.05 not significant (ns), for STIM1 WT and ΔCC/WT p> 0.05 not significant (ns) and for STIM1 WT and ΔCC/NN p≤ 0,05 *. (F) Representative Western Blot analysis of GST-STIM1 (cytoplasmic domain) pulled down by Cap-Gly-CC1-p150Glued-V5-coated beads, in presence of FLAG-EB1 C-terminal WT or ΔY. Negative control was performed using equal amount of empty GST protein, together with Cap-Gly-CC1-p150Glued.  (G) Confocal microscopy analysis of wild-type ECs, transiently transfected with GFP-STIM1 WT or, NN or ΔCC1-3/WT (ΔCC/WT) together with mCherry-P150Glued. Scale bar = 10 μm. Right insets are shown to highlight MT-bound p150Glued+ punctae (arrows), colocalized with STIM1. Scale bar = 5 μm. (H) Average number of the mCherry-P150Glued+ punctae in the same cells as in (g). Counts are the average ± SEM of three independent experiments for a total of 150 punctae (30 cells). Results were analyzed by a parametric two-tailed analysis of variance (ANOVA) with Bonferroni post hoc analysis. ANOVA p≤ 0,001; Bonferroni for STIM1 WT and NN p≤ 0,001 *** and for STIM1 WT and ΔCC/WT p> 0.05 not significant (ns). (I) Co-localization analysis of mCherry-P150Glued with GFP-STIM1 WT, NN or ΔCC1-3/WT (ΔCC/WT), transiently co-transfected in ECs, as in (g). Results are the average ± SEM of three independent experiments for a total of 150 punctae (30 cells) and analyzed by a parametric two-tailed analysis of variance (ANOVA) with Bonferroni post hoc analysis. ANOVA p≤ 0,001; Bonferroni for STIM1 WT and NN p≤ 0,001 *** and for STIM1 WT and ΔCC/WT p> 0.05 not significant (ns). "}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Confocal", "microscopy", "images", "of", "ECs", "silenced", "with", "a", "control", "siRNA", "(", "siCTL", ")", "or", "one", "targeting", "STIM1", "(", "siSTIM1", ")", "and", "stained", "for", "endogenous", "LAMP", "-", "1", "(", "in", "green", ")", "to", "visualize", "LEs", "and", "DAPI", "(", "in", "blue", ")", "to", "highlight", "the", "nucleus", ".", "The", "yellow", "line", "is", "drawn", "to", "define", "cell", "periphery", ".", "Scale", "bar", "=", "20", "μm", ".", "On", "the", "right", ",", "inset", "panels", "to", "highlight", "respective", "perinuclear", "and", "peripheral", "area", "of", "the", "cell", ".", "Scale", "bar", "=", "5", "μm", ".", "(", "B", ")", "Distribution", "of", "size", ",", "normalized", "on", "cell", "size", ",", "quantified", "by", "image", "(", "as", "in", "a", ")", "segmentation", "(", "see", "Material", "and", "Method", ",", "Confocal", "microscopy", "and", "early", "/", "late", "quantification", ")", "of", "LAMP", "-", "1", "+", "endosomes", ".", "Results", "are", "from", "three", "independent", "experiments", "for", "a", "total", "of", "249", "endosomes", "(", "15", "siCTL", "cells", ")", "and", "441", "endosomes", "(", "13", "siSTIM1", "cells", ")", ".", "In", "the", "right", "inset", ",", "the", "cumulative", "distribution", "used", "for", "the", "Kolmogorov", "-", "Smirnov", "test", ",", "p", "≤", "0", ",", "001", "*", "*", "*", ",", "is", "shown", ".", "The", "p", "-", "value", "refers", "to", "the", "rejection", "of", "the", "null", "hypothesis", "in", "favor", "of", "the", "alternative", "hypothesis", "that", "siCTL", "LE", "distribution", "has", "longer", "tail", "than", "siSTIM1", "LE", "one", ".", "(", "C", ")", "Average", "number", ",", "normalized", "on", "cell", "size", ",", "quantified", "by", "image", "(", "as", "in", "a", ")", "segmentation", "(", "see", "Material", "and", "Method", ",", "Confocal", "microscopy", "and", "early", "/", "late", "quantification", ")", "of", "LAMP", "-", "1", "+", "endosomes", ".", "Results", "are", "the", "average", "±", "SEM", "of", "three", "independent", "experiments", "for", "a", "total", "of", "249", "late", "endosomes", "in", "15", "siCTL", "cells", "(", "16", "±", "2", "endosomes", "per", "cell", ")", "and", "441", "late", "endosomes", "in", "13", "siSTIM1", "cells", "(", "34", "±", "3", "endosomes", "per", "cell", ")", "and", "analyzed", "by", "a", "two", "-", "tailed", "heteroscedastic", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "p", "≤", "0", ",", "001", "*", "*", "*", ".", "(", "D", ")", "Distribution", "of", "distance", "to", "nucleus", ",", "normalized", "on", "cell", "size", ",", "quantified", "by", "image", "(", "as", "in", "a", ")", "segmentation", "(", "see", "Material", "and", "Method", ",", "Confocal", "microscopy", "and", "early", "/", "late", "quantification", ")", "of", "LAMP", "-", "1", "+", "endosomes", ".", "Results", "are", "from", "three", "independent", "experiments", "for", "a", "total", "of", "249", "late", "endosomes", "in", "15", "siCTL", "cells", "(", "16", "±", "2", "endosomes", "per", "cell", ")", "and", "441", "late", "endosomes", "in", "13", "siSTIM1", "cells", "(", "34", "±", "3", "endosomes", "per", "cell", ")", "and", "analyzed", "by", "a", "two", "-", "tailed", "heteroscedastic", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "p", "≤", "0", ",", "001", "*", "*", "*", ".", "(", "E", ")", "Confocal", "microscopy", "images", "of", "ECs", "silenced", "with", "a", "control", "shRNA", "(", "shCTL", ")", "or", "one", "targeting", "STIM1", "(", "shSTIM1", ")", ",", "rescued", "for", "GFP", "expression", "alone", "(", "shCTL", "/", "GFP", "and", "shSTIM1", "/", "GFP", ")", "or", "for", "GFP", "-", "STIM1", "WT", "(", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM1", "WT", ")", ",", "GFP", "-", "STIM1", "NN", "(", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM1", "NN", ")", "or", "GFP", "-", "STIM1", "AA", "(", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM1", "AA", ")", "and", "stained", "for", "endogenous", "LAMP", "-", "1", "(", "in", "red", ")", "to", "visualize", "LEs", "and", "DAPI", "(", "in", "blue", ")", "to", "highlight", "the", "nucleus", ".", "The", "yellow", "line", "is", "drawn", "to", "define", "cell", "periphery", ".", "Scale", "bar", "=", "20", "μm", ".", "On", "the", "right", ",", "inset", "panels", "to", "highlight", "respective", "perinuclear", "and", "peripheral", "area", "of", "the", "cell", ".", "Scale", "bar", "=", "5", "μm", ".", "(", "F", ")", "Upper", "panel", ",", "Distribution", "of", "distance", "to", "nucleus", ",", "normalized", "on", "cell", "size", ",", "quantified", "by", "image", "(", "as", "in", "e", ")", "segmentation", "(", "see", "Material", "and", "Method", ",", "Confocal", "microscopy", "and", "early", "/", "late", "quantification", ")", "of", "LAMP", "-", "1", "+", "endosomes", ".", "Results", "are", "from", "of", "two", "independent", "experiments", "for", "a", "total", "of", "436", "late", "endosomes", "in", "13", "shCTL", "/", "GFP", "cells", "(", "34", "±", "6", "endosomes", "per", "cell", ")", ",", "1452", "late", "endosomes", "in", "12", "shSTIM1", "/", "GFP", "cells", "(", "121", "±", "13", "endosomes", "per", "cell", ")", "and", "498", "late", "endosomes", "in", "10", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM1", "WT", "cells", "(", "50", "±", "5", "endosomes", "per", "cell", ")", "and", "analyzed", "by", "a", "parametric", "two", "-", "tailed", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", "with", "Bonferroni", "post", "hoc", "analysis", ".", "ANOVA", "p", "≤", "0", ",", "01", ";", "Bonferroni", "for", "shCTL", "/", "GFP", "and", "shSTIM1", "/", "GFP", "p", "≤", "0", ",", "001", "*", "*", "*", "(", "orange", ")", "and", "for", "shSTIM1", "/", "GFP", "and", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM1", "WT", "p", "≤", "0", ",", "001", "*", "*", "*", "(", "green", ")", ".", "Lower", "panel", ",", "Distribution", "of", "distance", "to", "nucleus", ",", "normalized", "on", "cell", "size", ",", "quantified", "by", "image", "(", "as", "in", "e", ")", "segmentation", "(", "see", "Material", "and", "Method", ",", "Confocal", "microscopy", "and", "early", "/", "late", "quantification", ")", "of", "LAMP", "-", "1", "+", "endosomes", ".", "Results", "are", "from", "of", "two", "independent", "experiments", "for", "a", "total", "of", "498", "late", "endosomes", "in", "10", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM1", "WT", "cells", "(", "50", "±", "5", "endosomes", "per", "cell", ")", ",", "1057", "late", "endosomes", "in", "11", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM1", "NN", "cells", "(", "96", "±", "12", "endosomes", "per", "cell", ")", "and", "346", "late", "endosomes", "in", "10", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM1", "AA", "cells", "(", "35", "±", "2", "endosomes", "per", "cell", ")", "and", "analyzed", "by", "a", "parametric", "two", "-", "tailed", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", "with", "Bonferroni", "post", "hoc", "analysis", ".", "ANOVA", "p", "≤", "0", ",", "01", ";", "Bonferroni", "for", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM1", "WT", "and", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM1", "NN", "p", "≤", "0", ",", "05", "*", "(", "orange", ")", "and", "for", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM1", "NN", "and", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM1", "AA", "p", "≤", "0", ",", "05", "*", "(", "green", ")", ".", "(", "G", ")", "Average", "size", ",", "normalized", "on", "cell", "size", ",", "quantified", "by", "image", "(", "as", "in", "e", ")", "segmentation", "(", "see", "Material", "and", "Method", ",", "Confocal", "microscopy", "and", "early", "/", "late", "quantification", ")", "of", "LAMP", "-", "1", "+", "endosomes", ".", "Results", "are", "the", "average", "±", "SEM", "of", "two", "independent", "experiments", "for", "a", "total", "of", "436", "late", "endosomes", "in", "13", "shCTL", "/", "GFP", "cells", "(", "34", "±", "6", "endosomes", "per", "cell", ")", ",", "1452", "late", "endosomes", "in", "12", "shSTIM1", "/", "GFP", "cells", "(", "121", "±", "13", "endosomes", "per", "cell", ")", ",", "615", "late", "endosomes", "in", "12", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM1", "WT", "cells", "(", "51", "±", "5", "endosomes", "per", "cell", ")", ",", "1278", "late", "endosomes", "in", "12", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM1", "NN", "cells", "(", "106", "±", "15", "endosomes", "per", "cell", ")", "and", "506", "late", "endosomes", "in", "12", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM1", "AA", "cells", "(", "42", "±", "7", "endosomes", "per", "cell", ")", "and", "analyzed", "by", "a", "parametric", "two", "-", "tailed", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", "with", "Bonferroni", "post", "hoc", "analysis", ".", "ANOVA", "p", "≤", "0", ",", "001", ";", "Bonferroni", "for", "shCTL", "/", "GFP", "and", "shSTIM1", "/", "GFP", "p", "≤", "0", ",", "001", "*", "*", "*", ",", "for", "shCTL", "/", "GFP", "and", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM1", "WT", "p", ">", "0", ".", "05", "not", "significant", "(", "ns", ")", ",", "for", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM", "WT", "and", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM1", "NN", "p", "≤", "0", ",", "001", "*", "*", "*", ",", "for", "shSTIM1", "/", "GFP", "and", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM1", "NN", "p", "≤", "0", ",", "001", "*", "*", "*", "and", "for", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM", "WT", "and", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM1", "AA", "p", ">", "0", ".", "05", "not", "significant", "(", "ns", ")", ".", "(", "H", ")", "Average", "number", ",", "normalized", "on", "cell", "size", ",", "quantified", "by", "image", "(", "as", "in", "e", ")", "segmentation", "(", "see", "Material", "and", "Method", ",", "Confocal", "microscopy", "and", "early", "/", "late", "quantification", ")", "of", "LAMP", "-", "1", "+", "endosomes", ".", "Results", "are", "the", "average", "±", "SEM", "of", "two", "independent", "experiments", "for", "a", "total", "of", "436", "late", "endosomes", "in", "13", "shCTL", "/", "GFP", "cells", "(", "34", "±", "6", "endosomes", "per", "cell", ")", ",", "1452", "late", "endosomes", "in", "12", "shSTIM1", "/", "GFP", "cells", "(", "121", "±", "13", "endosomes", "per", "cell", ")", ",", "615", "late", "endosomes", "in", "12", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM1", "WT", "cells", "(", "51", "±", "5", "endosomes", "per", "cell", ")", ",", "1278", "late", "endosomes", "in", "12", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM1", "NN", "cells", "(", "106", "±", "15", "endosomes", "per", "cell", ")", "and", "506", "late", "endosomes", "in", "12", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM1", "AA", "cells", "(", "42", "±", "7", "endosomes", "per", "cell", ")", "and", "analyzed", "by", "a", "parametric", "two", "-", "tailed", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", "with", "Bonferroni", "post", "hoc", "analysis", ".", "ANOVA", "p", "≤", "0", ",", "001", ";", "Bonferroni", "for", "shCTL", "/", "GFP", "and", "shSTIM1", "/", "GFP", "p", "≤", "0", ",", "001", "*", "*", "*", ",", "for", "shCTL", "/", "GFP", "and", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM1", "WT", "p", "≤", "0", ",", "001", "*", "*", "*", ",", "for", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM", "WT", "and", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM1", "NN", "p", "≤", "0", ",", "05", "*", ",", "for", "shSTIM1", "/", "GFP", "and", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM1", "NN", "p", "≤", "0", ",", "01", "*", "*", "and", "for", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM", "WT", "and", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM1", "AA", "p", ">", "0", ".", "05", "not", "significant", "(", "ns", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Confocal microscopy images of ECs silenced with a control siRNA (siCTL) or one targeting STIM1 (siSTIM1) and stained for endogenous LAMP-1 (in green) to visualize LEs and DAPI (in blue) to highlight the nucleus. The yellow line is drawn to define cell periphery. Scale bar = 20 μm. On the right, inset panels to highlight respective perinuclear and peripheral area of the cell. Scale bar = 5 μm.(B) Distribution of size, normalized on cell size, quantified by image (as in a) segmentation (see Material and Method, Confocal microscopy and early/late quantification) of LAMP-1+ endosomes. Results are from three independent experiments for a total of 249 endosomes (15 siCTL cells) and 441 endosomes (13 siSTIM1 cells). In the right inset, the cumulative distribution used for the Kolmogorov-Smirnov test, p≤ 0,001 ***, is shown. The p-value refers to the rejection of the null hypothesis in favor of the alternative hypothesis that siCTL LE distribution has longer tail than siSTIM1 LE one.(C) Average number, normalized on cell size, quantified by image (as in a) segmentation (see Material and Method, Confocal microscopy and early/late quantification) of LAMP-1+ endosomes. Results are the average ± SEM of three independent experiments for a total of 249 late endosomes in 15 siCTL cells (16 ± 2 endosomes per cell) and 441 late endosomes in 13 siSTIM1 cells (34 ± 3 endosomes per cell) and analyzed by a two-tailed heteroscedastic Student's t-test, p≤ 0,001 ***.(D) Distribution of distance to nucleus, normalized on cell size, quantified by image (as in a) segmentation (see Material and Method, Confocal microscopy and early/late quantification) of LAMP-1+ endosomes. Results are from three independent experiments for a total of 249 late endosomes in 15 siCTL cells (16 ± 2 endosomes per cell) and 441 late endosomes in 13 siSTIM1 cells (34 ± 3 endosomes per cell) and analyzed by a two-tailed heteroscedastic Student's t-test, p≤ 0,001 ***.(E) Confocal microscopy images of ECs silenced with a control shRNA (shCTL) or one targeting STIM1 (shSTIM1), rescued for GFP expression alone (shCTL/GFP and shSTIM1/GFP) or for GFP- STIM1 WT (shSTIM1/GFP-STIM1 WT), GFP- STIM1 NN (shSTIM1/GFP-STIM1 NN) or GFP- STIM1 AA (shSTIM1/GFP-STIM1 AA) and stained for endogenous LAMP-1 (in red) to visualize LEs and DAPI (in blue) to highlight the nucleus. The yellow line is drawn to define cell periphery. Scale bar = 20 μm. On the right, inset panels to highlight respective perinuclear and peripheral area of the cell. Scale bar = 5 μm. (F) Upper panel, Distribution of distance to nucleus, normalized on cell size, quantified by image (as in e) segmentation (see Material and Method, Confocal microscopy and early/late quantification) of LAMP-1+ endosomes. Results are from of two independent experiments for a total of 436 late endosomes in 13 shCTL/GFP cells (34 ± 6 endosomes per cell), 1452 late endosomes in 12 shSTIM1/GFP cells (121 ± 13 endosomes per cell) and 498 late endosomes in 10 shSTIM1/GFP-STIM1 WT cells (50 ± 5 endosomes per cell) and analyzed by a parametric two-tailed analysis of variance (ANOVA) with Bonferroni post hoc analysis. ANOVA p≤ 0,01; Bonferroni for shCTL/GFP and shSTIM1/GFP p≤ 0,001 *** (orange) and for shSTIM1/GFP and shSTIM1/GFP-STIM1 WT p≤ 0,001 *** (green). Lower panel, Distribution of distance to nucleus, normalized on cell size, quantified by image (as in e) segmentation (see Material and Method, Confocal microscopy and early/late quantification) of LAMP-1+ endosomes. Results are from of two independent experiments for a total of 498 late endosomes in 10 shSTIM1/GFP-STIM1 WT cells (50 ± 5 endosomes per cell), 1057 late endosomes in 11 shSTIM1/GFP-STIM1 NN cells (96 ± 12 endosomes per cell) and 346 late endosomes in 10 shSTIM1/GFP-STIM1 AA cells (35 ± 2 endosomes per cell) and analyzed by a parametric two-tailed analysis of variance (ANOVA) with Bonferroni post hoc analysis. ANOVA p≤ 0,01; Bonferroni for shSTIM1/GFP-STIM1 WT and shSTIM1/GFP-STIM1 NN p≤ 0,05 * (orange) and for shSTIM1/GFP-STIM1 NN and shSTIM1/GFP-STIM1 AA p≤ 0,05 * (green).  (G) Average size, normalized on cell size, quantified by image (as in e) segmentation (see Material and Method, Confocal microscopy and early/late quantification) of LAMP-1+ endosomes. Results are the average ± SEM of two independent experiments for a total of 436 late endosomes in 13 shCTL/GFP cells (34 ± 6 endosomes per cell), 1452 late endosomes in 12 shSTIM1/GFP cells (121 ± 13 endosomes per cell), 615 late endosomes in 12 shSTIM1/GFP-STIM1 WT cells (51 ± 5 endosomes per cell), 1278 late endosomes in 12 shSTIM1/GFP-STIM1 NN cells (106 ± 15 endosomes per cell) and 506 late endosomes in 12 shSTIM1/GFP-STIM1 AA cells (42 ± 7 endosomes per cell) and analyzed by a parametric two-tailed analysis of variance (ANOVA) with Bonferroni post hoc analysis. ANOVA p≤ 0,001; Bonferroni for shCTL/GFP and shSTIM1/GFP p≤ 0,001 ***, for shCTL/GFP and shSTIM1/GFP-STIM1 WT p> 0.05 not significant (ns), for shSTIM1/GFP-STIM WT and shSTIM1/GFP-STIM1 NN p≤ 0,001 ***, for shSTIM1/GFP and shSTIM1/GFP-STIM1 NN p≤ 0,001 *** and for shSTIM1/GFP-STIM WT and shSTIM1/GFP-STIM1 AA p> 0.05 not significant (ns).  (H) Average number, normalized on cell size, quantified by image (as in e) segmentation (see Material and Method, Confocal microscopy and early/late quantification) of LAMP-1+ endosomes. Results are the average ± SEM of two independent experiments for a total of 436 late endosomes in 13 shCTL/GFP cells (34 ± 6 endosomes per cell), 1452 late endosomes in 12 shSTIM1/GFP cells (121 ± 13 endosomes per cell), 615 late endosomes in 12 shSTIM1/GFP-STIM1 WT cells (51 ± 5 endosomes per cell), 1278 late endosomes in 12 shSTIM1/GFP-STIM1 NN cells (106 ± 15 endosomes per cell) and 506 late endosomes in 12 shSTIM1/GFP-STIM1 AA cells (42 ± 7 endosomes per cell) and analyzed by a parametric two-tailed analysis of variance (ANOVA) with Bonferroni post hoc analysis. ANOVA p≤ 0,001; Bonferroni for shCTL/GFP and shSTIM1/GFP p≤ 0,001 ***, for shCTL/GFP and shSTIM1/GFP-STIM1 WT p≤ 0,001 ***, for shSTIM1/GFP-STIM WT and shSTIM1/GFP-STIM1 NN p≤ 0,05 *, for shSTIM1/GFP and shSTIM1/GFP-STIM1 NN p≤ 0,01 ** and for shSTIM1/GFP-STIM WT and shSTIM1/GFP-STIM1 AA p> 0.05 not significant (ns). "}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Confocal", "microscopy", "images", "of", "ECs", "silenced", "with", "a", "control", "siRNA", "(", "siCTL", ")", "or", "one", "targeting", "STIM1", "(", "siSTIM1", ")", "and", "stained", "for", "endogenous", "Rab5", "(", "in", "green", ")", "and", "EEA", "-", "1", "(", "in", "red", ")", "to", "visualize", "EEs", "and", "DAPI", "(", "in", "blue", ")", "to", "highlight", "the", "nucleus", ".", "The", "yellow", "line", "is", "drawn", "to", "define", "cell", "periphery", ".", "Scale", "bar", "=", "20", "μm", ".", "On", "the", "right", ",", "inset", "panels", "to", "highlight", "respective", "perinuclear", "and", "peripheral", "area", "of", "the", "cell", ".", "Scale", "bar", "=", "5", "μm", ".", "(", "B", ")", "Average", "size", ",", "normalized", "on", "cell", "size", ",", "of", "EEA", "-", "1", "+", "endosomes", "as", "in", "a", ".", "Results", "are", "the", "average", "±", "SEM", "of", "three", "independent", "experiments", "for", "a", "total", "4483", "early", "endosomes", "in", "18", "siCTL", "cells", "(", "299", "±", "33", "endosomes", "per", "cell", ")", "and", "2454", "early", "endosomes", "in", "13", "siSTIM1", "cells", "(", "189", "±", "17", "endosomes", "per", "cell", ")", "and", "analyzed", "by", "a", "two", "-", "tailed", "heteroscedastic", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "p", "≤", "0", ",", "001", "*", "*", "*", ".", "(", "C", ")", "Average", "number", ",", "normalized", "on", "cell", "size", ",", "of", "EEA", "-", "1", "+", "endosomes", "as", "in", "a", ".", "Results", "are", "the", "average", "±", "SEM", "of", "three", "independent", "experiments", "for", "a", "total", "4483", "early", "endosomes", "in", "18", "siCTL", "cells", "(", "299", "±", "33", "endosomes", "per", "cell", ")", "and", "2454", "early", "endosomes", "in", "13", "siSTIM1", "cells", "(", "189", "±", "17", "endosomes", "per", "cell", ")", "and", "analyzed", "by", "a", "two", "-", "tailed", "heteroscedastic", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "p", "≤", "0", ",", "01", "*", "*", ".", "(", "D", ")", "Distribution", "of", "distance", "to", "nucleus", "overtime", ",", "normalized", "on", "cell", "size", ",", "quantified", "by", "image", "(", "data", "correspond", "to", "movies", "EV1", "and", "EV2", ")", "segmentation", "(", "see", "Material", "and", "Method", ",", "Live", "imaging", "experiments", ")", "of", "Rab5", "+", "endosomes", ",", "appearing", "for", "60", "seconds", ".", "Results", "are", "from", "three", "independent", "experiments", "for", "a", "total", "of", "903", "early", "endosomes", "in", "18", "siCTL", "cells", "(", "50", "±", "5", "endosomes", "per", "cell", ")", "and", "935", "early", "endosomes", "in", "20", "siSTIM1", "cells", "(", "47", "±", "9", "endosomes", "per", "cell", ")", ".", "Data", "are", "analyzed", "by", "a", "two", "-", "tailed", "heteroscedastic", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "p", "≤", "0", ",", "01", "*", "*", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3 (A) Confocal microscopy images of ECs silenced with a control siRNA (siCTL) or one targeting STIM1 (siSTIM1) and stained for endogenous Rab5 (in green) and EEA-1 (in red) to visualize EEs and DAPI (in blue) to highlight the nucleus. The yellow line is drawn to define cell periphery. Scale bar = 20 μm. On the right, inset panels to highlight respective perinuclear and peripheral area of the cell. Scale bar = 5 μm.  (B) Average size, normalized on cell size, of EEA-1+ endosomes as in a. Results are the average ± SEM of three independent experiments for a total 4483 early endosomes in 18 siCTL cells (299 ± 33 endosomes per cell) and 2454 early endosomes in 13 siSTIM1 cells (189 ± 17 endosomes per cell) and analyzed by a two-tailed heteroscedastic Student's t-test, p≤ 0,001 ***.  (C) Average number, normalized on cell size, of EEA-1+ endosomes as in a. Results are the average ± SEM of three independent experiments for a total 4483 early endosomes in 18 siCTL cells (299 ± 33 endosomes per cell) and 2454 early endosomes in 13 siSTIM1 cells (189 ± 17 endosomes per cell) and analyzed by a two-tailed heteroscedastic Student's t-test, p≤ 0,01 **.  (D) Distribution of distance to nucleus overtime, normalized on cell size, quantified by image (data correspond to movies EV1 and EV2) segmentation (see Material and Method, Live imaging experiments) of Rab5+ endosomes, appearing for 60 seconds. Results are from three independent experiments for a total of 903 early endosomes in 18 siCTL cells (50 ± 5 endosomes per cell) and 935 early endosomes in 20 siSTIM1 cells (47 ± 9 endosomes per cell). Data are analyzed by a two-tailed heteroscedastic Student's t-test, p≤ 0,01 **. "}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Confocal", "microscopy", "images", "of", "ECs", "silenced", "with", "a", "control", "shRNA", "(", "shCTL", ")", "or", "one", "targeting", "STIM1", "(", "shSTIM1", ")", ",", "rescued", "for", "GFP", "expression", "alone", "(", "shCTL", "/", "GFP", "and", "shSTIM1", "/", "GFP", ")", "or", "for", "GFP", "-", "STIM1", "WT", "(", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM1", "WT", ")", "or", "GFP", "-", "STIM1", "NN", "(", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM1", "NN", ")", "and", "stained", "for", "endogenous", "EEA", "-", "1", "(", "in", "red", ")", "to", "visualize", "EEs", "and", "DAPI", "(", "in", "blue", ")", "to", "highlight", "the", "nucleus", ".", "The", "yellow", "line", "is", "drawn", "to", "define", "cell", "periphery", ".", "Scale", "bar", "=", "20", "μm", ".", "On", "the", "right", ",", "inset", "panels", "to", "highlight", "respective", "perinuclear", "and", "peripheral", "area", "of", "the", "cell", ".", "Scale", "bar", "=", "5", "μm", ".", "(", "B", ")", "Upper", "panel", ",", "Distribution", "of", "distance", "to", "nucleus", ",", "normalized", "on", "cell", "size", ",", "quantified", "by", "image", "(", "as", "in", "a", ")", "segmentation", "(", "see", "Material", "and", "Method", ",", "Confocal", "microscopy", "and", "early", "/", "late", "quantification", ")", "of", "EEA", "-", "1", "+", "endosomes", ".", "Results", "are", "from", "two", "independent", "experiments", "for", "a", "total", "of", "830", "early", "endosomes", "in", "13", "shCTL", "/", "GFP", "cells", "(", "64", "±", "6", "endosomes", "per", "cell", ")", ",", "719", "early", "endosomes", "in", "10", "shSTIM1", "/", "GFP", "cells", "(", "60", "±", "6", "endosomes", "per", "cell", ")", "and", "820", "early", "endosomes", "in", "12", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM1", "WT", "cells", "(", "68", "±", "6", "endosomes", "per", "cell", ")", "and", "analyzed", "by", "a", "parametric", "two", "-", "tailed", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", "with", "Bonferroni", "post", "hoc", "analysis", ".", "ANOVA", "p", "≤", "0", ",", "001", ";", "Bonferroni", "for", "shCTL", "/", "GFP", "and", "shSTIM1", "/", "GFP", "p", "≤", "0", ",", "001", "*", "*", "*", "(", "orange", ")", "and", "for", "shSTIM1", "/", "GFP", "and", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM1", "WT", "p", "≤", "0", ",", "001", "*", "*", "*", "(", "green", ")", ".", "Lower", "panel", ",", "Distribution", "of", "distance", "to", "nucleus", ",", "normalized", "on", "cell", "size", ",", "quantified", "by", "image", "(", "as", "in", "a", ")", "segmentation", "(", "see", "Material", "and", "Method", ",", "Confocal", "microscopy", "and", "early", "/", "late", "quantification", ")", "of", "EEA", "-", "1", "+", "endosomes", ".", "Results", "are", "from", "two", "independent", "experiments", "for", "a", "total", "of", "820", "early", "endosomes", "in", "12", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM1", "WT", "cells", "(", "68", "±", "6", "endosomes", "per", "cell", ")", "and", "400", "early", "endosomes", "in", "12", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM1", "NN", "cells", "(", "33", "±", "7", "endosomes", "per", "cell", ")", "and", "analyzed", "a", "two", "-", "tailed", "heteroscedastic", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "p", "≤", "0", ",", "001", "*", "*", "*", ".", "(", "C", ")", "Average", "size", ",", "normalized", "on", "cell", "size", ",", "quantified", "by", "image", "(", "as", "in", "a", ")", "segmentation", "(", "see", "Material", "and", "Method", ",", "Confocal", "microscopy", "and", "early", "/", "late", "quantification", ")", "of", "EEA", "-", "1", "+", "endosomes", ".", "Results", "are", "the", "average", "±", "SEM", "of", "two", "independent", "experiments", "for", "a", "total", "830", "early", "endosomes", "in", "13", "shCTL", "/", "GFP", "cells", "(", "64", "±", "6", "endosomes", "per", "cell", ")", ",", "719", "early", "endosomes", "in", "10", "shSTIM1", "/", "GFP", "cells", "(", "60", "±", "6", "endosomes", "per", "cell", ")", ",", "820", "early", "endosomes", "in", "12", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM1", "WT", "cells", "(", "68", "±", "6", "endosomes", "per", "cell", ")", "and", "400", "early", "endosomes", "in", "12", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM1", "NN", "cells", "(", "33", "±", "7", "endosomes", "per", "cell", ")", "and", "analyzed", "by", "a", "parametric", "two", "-", "tailed", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", "with", "Bonferroni", "post", "hoc", "analysis", ".", "ANOVA", "p", "≤", "0", ",", "001", ";", "Bonferroni", "for", "shCTL", "/", "GFP", "and", "shSTIM1", "/", "GFP", "p", "≤", "0", ",", "001", "*", "*", "*", ",", "for", "shCTL", "/", "GFP", "and", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM1", "WT", "p", ">", "0", ".", "05", "not", "significant", "(", "ns", ")", ",", "for", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM", "WT", "and", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM1", "NN", "p", "≤", "0", ",", "001", "*", "*", "*", "and", "for", "shSTIM1", "/", "GFP", "and", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM1", "NN", "p", "≤", "0", ",", "05", "*", ".", "(", "D", ")", "Average", "number", ",", "normalized", "on", "cell", "size", ",", "quantified", "by", "image", "(", "as", "in", "a", ")", "segmentation", "(", "see", "Material", "and", "Method", ",", "Confocal", "microscopy", "and", "early", "/", "late", "quantification", ")", "of", "EEA", "-", "1", "+", "endosomes", ".", "Results", "are", "the", "average", "±", "SEM", "of", "two", "independent", "experiments", "for", "a", "total", "830", "early", "endosomes", "in", "13", "shCTL", "/", "GFP", "cells", "(", "64", "±", "6", "endosomes", "per", "cell", ")", ",", "719", "early", "endosomes", "in", "10", "shSTIM1", "/", "GFP", "cells", "(", "60", "±", "6", "endosomes", "per", "cell", ")", ",", "820", "early", "endosomes", "in", "12", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM1", "WT", "cells", "(", "68", "±", "6", "endosomes", "per", "cell", ")", "and", "400", "early", "endosomes", "in", "12", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM1", "NN", "cells", "(", "33", "±", "7", "endosomes", "per", "cell", ")", "and", "analyzed", "by", "a", "parametric", "two", "-", "tailed", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", "with", "Bonferroni", "post", "hoc", "analysis", ".", "ANOVA", "p", "≤", "0", ",", "001", ";", "Bonferroni", "for", "shCTL", "/", "GFP", "and", "shSTIM1", "/", "GFP", "p", "≤", "0", ",", "01", "*", "*", ",", "for", "shCTL", "/", "GFP", "and", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM1", "WT", "p", ">", "0", ".", "05", "not", "significant", "(", "ns", ")", ",", "for", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM", "WT", "and", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM1", "NN", "p", "≤", "0", ",", "001", "*", "*", "*", "and", "for", "shSTIM1", "/", "GFP", "and", "shSTIM1", "/", "GFP", "-", "STIM1", "NN", "p", "≤", "0", ",", "001", "*", "*", "*", ".", "(", "E", ")", "Confocal", "microscopy", "images", "of", "untreated", "ECs", "(", "UT", ")", "or", "treated", "with", "Ciliobrevin", "D", "(", "CilioD", ")", "and", "stained", "for", "endogenous", "EEA", "-", "1", "(", "in", "green", ")", "and", "LAMP", "-", "1", "(", "in", "red", ")", "to", "visualize", "EEs", "and", "LEs", ",", "respectively", ",", "and", "DAPI", "(", "in", "blue", ")", "to", "highlight", "the", "nucleus", ".", "The", "yellow", "line", "is", "drawn", "to", "define", "cell", "periphery", ".", "Scale", "bar", "=", "20", "μm", ".", "On", "the", "right", ",", "inset", "panels", "to", "highlight", "respective", "perinuclear", "and", "peripheral", "area", "of", "the", "cell", ".", "Scale", "bar", "=", "5", "μm", ".", "(", "F", ")", "Distribution", "of", "distance", "to", "nucleus", "overtime", ",", "normalized", "on", "cell", "size", ",", "quantified", "by", "image", "(", "data", "correspond", "to", "movies", "EV3", "and", "EV4", ")", "segmentation", "(", "see", "Material", "and", "Method", ",", "Live", "imaging", "experiments", ")", "of", "Rab5", "+", "endosomes", ",", "appearing", "for", "30", "seconds", ",", "during", "Ciliobrevin", "D", "(", "CilioD", ")", "treatment", ".", "Results", "are", "from", "three", "independent", "experiments", "for", "a", "total", "of", "and", "853", "early", "endosomes", "in", "6", "untreated", "(", "UT", ")", "cells", "(", "142", "±", "22", "endosomes", "per", "cell", ")", "and", "657", "early", "endosomes", "in", "9", "CilioD", "cells", "(", "73", "±", "23", "endosomes", "per", "cell", ")", "and", "analyzed", "by", "a", "two", "-", "tailed", "heteroscedastic", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "p", "≤", "0", ",", "001", "*", "*", "*", ".", "(", "G", ")", "Distribution", "of", "distance", "to", "nucleus", ",", "normalized", "on", "cell", "size", ",", "quantified", "by", "image", "(", "as", "in", "e", ")", "segmentation", "(", "see", "Material", "and", "Method", ",", "Confocal", "microscopy", "and", "early", "/", "late", "quantification", ")", "of", "LAMP", "-", "1", "+", "endosomes", ".", "Results", "are", "from", "three", "independent", "experiments", "for", "a", "total", "of", "432", "late", "endosomes", "in", "12", "untreated", "(", "UT", ")", "cells", "(", "36", "±", "9", "endosomes", "per", "cell", ")", "and", "1184", "late", "endosomes", "in", "18", "CilioD", "cells", "(", "66", "±", "9", "endosomes", "per", "cell", ")", "and", "analyzed", "by", "a", "two", "-", "tailed", "heteroscedastic", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "p", "≤", "0", ",", "001", "*", "*", "*", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4 (A) Confocal microscopy images of ECs silenced with a control shRNA (shCTL) or one targeting STIM1 (shSTIM1), rescued for GFP expression alone (shCTL/GFP and shSTIM1/GFP) or for GFP-STIM1 WT (shSTIM1/GFP-STIM1 WT) or GFP- STIM1 NN (shSTIM1/GFP-STIM1 NN) and stained for endogenous EEA-1 (in red) to visualize EEs and DAPI (in blue) to highlight the nucleus. The yellow line is drawn to define cell periphery. Scale bar = 20 μm. On the right, inset panels to highlight respective perinuclear and peripheral area of the cell. Scale bar = 5 μm.  (B) Upper panel, Distribution of distance to nucleus, normalized on cell size, quantified by image (as in a) segmentation (see Material and Method, Confocal microscopy and early/late quantification) of EEA-1+ endosomes. Results are from two independent experiments for a total of 830 early endosomes in 13 shCTL/GFP cells (64 ± 6 endosomes per cell), 719 early endosomes in 10 shSTIM1/GFP cells (60 ± 6 endosomes per cell) and 820 early endosomes in 12 shSTIM1/GFP-STIM1 WT cells (68 ± 6 endosomes per cell) and analyzed by a parametric two-tailed analysis of variance (ANOVA) with Bonferroni post hoc analysis. ANOVA p≤ 0,001; Bonferroni for shCTL/GFP and shSTIM1/GFP p≤ 0,001 *** (orange) and for shSTIM1/GFP and shSTIM1/GFP-STIM1 WT p≤ 0,001 *** (green). Lower panel, Distribution of distance to nucleus, normalized on cell size, quantified by image (as in a) segmentation (see Material and Method, Confocal microscopy and early/late quantification) of EEA-1+ endosomes. Results are from two independent experiments for a total of 820 early endosomes in 12 shSTIM1/GFP-STIM1 WT cells (68 ± 6 endosomes per cell) and 400 early endosomes in 12 shSTIM1/GFP-STIM1 NN cells (33 ± 7 endosomes per cell) and analyzed a two-tailed heteroscedastic Student's t-test, p≤ 0,001 ***.  (C) Average size, normalized on cell size, quantified by image (as in a) segmentation (see Material and Method, Confocal microscopy and early/late quantification) of EEA-1+ endosomes. Results are the average ± SEM of two independent experiments for a total 830 early endosomes in 13 shCTL/GFP cells (64 ± 6 endosomes per cell), 719 early endosomes in 10 shSTIM1/GFP cells (60 ± 6 endosomes per cell), 820 early endosomes in 12 shSTIM1/GFP-STIM1 WT cells (68 ± 6 endosomes per cell) and 400 early endosomes in 12 shSTIM1/GFP-STIM1 NN cells (33 ± 7 endosomes per cell) and analyzed by a parametric two-tailed analysis of variance (ANOVA) with Bonferroni post hoc analysis. ANOVA p≤ 0,001; Bonferroni for shCTL/GFP and shSTIM1/GFP p≤ 0,001 ***, for shCTL/GFP and shSTIM1/GFP-STIM1 WT p> 0.05 not significant (ns), for shSTIM1/GFP-STIM WT and shSTIM1/GFP-STIM1 NN p≤ 0,001 *** and for shSTIM1/GFP and shSTIM1/GFP-STIM1 NN p≤ 0,05 *.  (D) Average number, normalized on cell size, quantified by image (as in a) segmentation (see Material and Method, Confocal microscopy and early/late quantification) of EEA-1+ endosomes. Results are the average ± SEM of two independent experiments for a total 830 early endosomes in 13 shCTL/GFP cells (64 ± 6 endosomes per cell), 719 early endosomes in 10 shSTIM1/GFP cells (60 ± 6 endosomes per cell), 820 early endosomes in 12 shSTIM1/GFP-STIM1 WT cells (68 ± 6 endosomes per cell) and 400 early endosomes in 12 shSTIM1/GFP-STIM1 NN cells (33 ± 7 endosomes per cell) and analyzed by a parametric two-tailed analysis of variance (ANOVA) with Bonferroni post hoc analysis. ANOVA p≤ 0,001; Bonferroni for shCTL/GFP and shSTIM1/GFP p≤ 0,01 **, for shCTL/GFP and shSTIM1/GFP-STIM1 WT p> 0.05 not significant (ns), for shSTIM1/GFP-STIM WT and shSTIM1/GFP-STIM1 NN p≤ 0,001 *** and for shSTIM1/GFP and shSTIM1/GFP-STIM1 NN p≤ 0,001 ***.  (E) Confocal microscopy images of untreated ECs (UT) or treated with Ciliobrevin D (CilioD) and stained for endogenous EEA-1 (in green) and LAMP-1 (in red) to visualize EEs and LEs, respectively, and DAPI (in blue) to highlight the nucleus. The yellow line is drawn to define cell periphery. Scale bar = 20 μm. On the right, inset panels to highlight respective perinuclear and peripheral area of the cell. Scale bar = 5 μm.  (F) Distribution of distance to nucleus overtime, normalized on cell size, quantified by image (data correspond to movies EV3 and EV4) segmentation (see Material and Method, Live imaging experiments) of Rab5+ endosomes, appearing for 30 seconds, during Ciliobrevin D (CilioD) treatment. Results are from three independent experiments for a total of and 853 early endosomes in 6 untreated (UT) cells (142 ±22 endosomes per cell) and 657 early endosomes in 9 CilioD cells (73 ± 23 endosomes per cell) and analyzed by a two-tailed heteroscedastic Student's t-test, p≤ 0,001 ***.  (G) Distribution of distance to nucleus, normalized on cell size, quantified by image (as in e) segmentation (see Material and Method, Confocal microscopy and early/late quantification) of LAMP-1+ endosomes. Results are from three independent experiments for a total of 432 late endosomes in 12 untreated (UT) cells (36 ± 9 endosomes per cell) and 1184 late endosomes in 18 CilioD cells (66 ± 9 endosomes per cell) and analyzed by a two-tailed heteroscedastic Student's t-test, p≤ 0,001 ***. "}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "mRNA", "levels", "of", "KIFC1", ",", "KIFC2", "and", "KIFC3", "in", "ECs", ".", "Values", "are", "normalized", "on", "GAPDH", "mRNA", "levels", ".", "Results", "are", "the", "average", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", "and", "analyzed", "by", "a", "parametric", "two", "-", "tailed", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", "with", "Bonferroni", "post", "hoc", "analysis", ".", "ANOVA", "p", "≤", "0", ",", "01", ";", "Bonferroni", "for", "KIFC1", "and", "KIFC2", "p", "≤", "0", ",", "01", "*", "*", "and", "for", "KIFC1", "and", "KIFC3", "p", "≤", "0", ",", "05", "*", ".", "(", "B", ")", "Representative", "Western", "Blot", "analysis", "of", "endogenous", "KIFC1", "and", "STIM1", "proteins", "(", "both", "normalized", "on", "total", "tubulin", "levels", ")", "in", "ECs", "silenced", "with", "a", "control", "siRNA", "(", "siCTL", ")", "or", "one", "targeting", "KIFC1", "(", "siKIFC1", ")", "or", "two", "control", "siRNAs", "(", "siCTLsiCTL", ")", "or", "two", "targeting", "KIFC1", "and", "STIM1", "(", "siKIFC1siSTIM1", ")", ".", "Results", "are", "the", "average", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", "and", "analyzed", "by", "a", "parametric", "two", "-", "tailed", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", "with", "Bonferroni", "post", "hoc", "analysis", ".", "ANOVA", "p", "≤", "0", ",", "01", ";", "Bonferroni", "for", "siCTL", "and", "siKIFC1", ",", "KIFC1", "expression", "p", "≤", "0", ",", "001", "*", "*", "*", ",", "STIM1", "expression", "p", ">", "0", ".", "05", "not", "significant", "(", "ns", ")", "and", "for", "siCTLsiCTL", "and", "siKIFC1siSTIM1", ",", "KIFC1", "expression", "p", "≤", "0", ",", "01", "*", "*", ",", "STIM1", "expression", "p", "≤", "0", ",", "05", "*", ".", "(", "C", ")", "Confocal", "microscopy", "images", "of", "ECs", "silenced", "with", "a", "control", "siRNA", "(", "siCTL", ")", "or", "one", "targeting", "KIFC1", "(", "siKIFC1", ")", "or", "one", "targeting", "STIM1", "(", "siSTIM1", ")", "or", "two", "targeting", "both", "(", "siKIFC1siSTIM1", ")", "and", "stained", "for", "endogenous", "EEA", "-", "1", "(", "in", "green", ")", "and", "LAMP", "-", "1", "(", "in", "red", ")", "to", "visualize", "EEs", "and", "LEs", ",", "respectively", ",", "and", "DAPI", "(", "in", "blue", ")", "to", "highlight", "the", "nucleus", ".", "The", "yellow", "line", "is", "drawn", "to", "define", "cell", "periphery", ".", "Scale", "bar", "=", "20", "μm", ".", "On", "the", "right", ",", "inset", "panels", "to", "highlight", "respective", "perinuclear", "and", "peripheral", "area", "of", "the", "cell", ".", "Scale", "bar", "=", "5", "μm", ".", "(", "D", ")", "Distribution", "of", "distance", "to", "nucleus", ",", "normalized", "on", "cell", "size", ",", "quantified", "by", "image", "(", "as", "in", "c", ")", "segmentation", "(", "see", "Material", "and", "Method", ",", "Confocal", "microscopy", "and", "early", "/", "late", "quantification", ")", "of", "EEA", "-", "1", "+", "endosomes", "in", "siCTL", "and", "siKIFC1", "ECs", ".", "Results", "are", "from", "three", "independent", "experiments", "for", "a", "total", "of", "4091", "early", "endosomes", "in", "19", "siCTL", "cells", "(", "215", "±", "20", "endosomes", "per", "cell", ")", "and", "2275", "early", "endosomes", "in", "20", "siKIFC1", "cells", "(", "114", "±", "10", "endosomes", "per", "cell", ")", "and", "analyzed", "by", "a", "two", "-", "tailed", "heteroscedastic", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "p", "≤", "0", ",", "001", "*", "*", "*", ".", "(", "E", ")", "Distribution", "of", "distance", "to", "nucleus", "quantified", "by", "image", "(", "as", "in", "c", ")", "segmentation", "(", "see", "Material", "and", "Method", ",", "Confocal", "microscopy", "and", "early", "/", "late", "quantification", ")", "of", "EEA", "-", "1", "+", "endosomes", ".", "Results", "are", "from", "three", "independent", "experiments", "for", "a", "total", "of", "4091", "early", "endosomes", "in", "19", "siCTL", "cells", "(", "215", "±", "20", "endosomes", "per", "cell", ")", ",", "2275", "early", "endosomes", "in", "20", "siKIFC1", "cells", "(", "114", "±", "10", "endosomes", "per", "cell", ")", "and", "3257", "early", "endosomes", "in", "18", "siKIFC1", "/", "siSTIM1", "cells", "(", "181", "±", "14", "endosomes", "per", "cell", ")", ".", "Data", "are", "analyzed", "by", "a", "parametric", "two", "-", "tailed", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", "with", "Bonferroni", "post", "hoc", "analysis", ".", "ANOVA", "p", "≤", "0", ",", "001", ";", "Bonferroni", "for", "siCTL", "and", "siKIFC1", "ECs", "p", "≤", "0", ",", "001", "*", "*", "*", "(", "orange", ")", "and", "for", "siKIFC1", "and", "siSTIM1", "/", "siKIFC1", "ECs", "p", "≤", "0", ",", "001", "*", "*", "*", "(", "green", ")", ".", "On", "the", "right", "-", "hand", "side", "of", "the", "plot", ",", "colored", "bands", "represent", "the", "average", "cell", "diameter", ",", "significantly", "changing", "throughout", "the", "conditions", ".", "Data", "are", "analyzed", "by", "a", "parametric", "two", "-", "tailed", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", "with", "Bonferroni", "post", "hoc", "analysis", ".", "ANOVA", "p", "≤", "0", ",", "01", ";", "Bonferroni", "for", "siCTL", "and", "siKIFC1", "ECs", "p", ">", "0", ".", "05", "not", "significant", "(", "orange", "ns", ")", "and", "for", "siKIFC1", "and", "siSTIM1", "/", "siKIFC1", "ECs", "p", "≤", "0", ",", "01", "*", "*", "(", "green", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) mRNA levels of KIFC1, KIFC2 and KIFC3 in ECs. Values are normalized on GAPDH mRNA levels. Results are the average ± SD of three independent experiments and analyzed by a parametric two-tailed analysis of variance (ANOVA) with Bonferroni post hoc analysis. ANOVA p≤ 0,01; Bonferroni for KIFC1 and KIFC2 p≤ 0,01 ** and for KIFC1 and KIFC3 p≤ 0,05 *.(B) Representative Western Blot analysis of endogenous KIFC1 and STIM1 proteins (both normalized on total tubulin levels) in ECs silenced with a control siRNA (siCTL) or one targeting KIFC1 (siKIFC1) or two control siRNAs (siCTLsiCTL) or two targeting KIFC1 and STIM1 (siKIFC1siSTIM1). Results are the average ± SD of three independent experiments and analyzed by a parametric two-tailed analysis of variance (ANOVA) with Bonferroni post hoc analysis. ANOVA p≤ 0,01; Bonferroni for siCTL and siKIFC1, KIFC1 expression p≤ 0,001 ***, STIM1 expression p> 0.05 not significant (ns) and for siCTLsiCTL and siKIFC1siSTIM1, KIFC1 expression p≤ 0,01 **, STIM1 expression p≤ 0,05 *. (C) Confocal microscopy images of ECs silenced with a control siRNA (siCTL) or one targeting KIFC1 (siKIFC1) or one targeting STIM1 (siSTIM1) or two targeting both (siKIFC1siSTIM1) and stained for endogenous EEA-1 (in green) and LAMP-1 (in red) to visualize EEs and LEs, respectively, and DAPI (in blue) to highlight the nucleus. The yellow line is drawn to define cell periphery. Scale bar = 20 μm. On the right, inset panels to highlight respective perinuclear and peripheral area of the cell. Scale bar = 5 μm.  (D) Distribution of distance to nucleus, normalized on cell size, quantified by image (as in c) segmentation (see Material and Method, Confocal microscopy and early/late quantification) of EEA-1+ endosomes in siCTL and siKIFC1 ECs. Results are from three independent experiments for a total of 4091 early endosomes in 19 siCTL cells (215 ± 20 endosomes per cell) and 2275 early endosomes in 20 siKIFC1 cells (114 ± 10 endosomes per cell) and analyzed by a two-tailed heteroscedastic Student's t-test, p≤ 0,001 ***.  (E) Distribution of distance to nucleus quantified by image (as in c) segmentation (see Material and Method, Confocal microscopy and early/late quantification) of EEA-1+ endosomes. Results are from three independent experiments for a total of 4091 early endosomes in 19 siCTL cells (215 ± 20 endosomes per cell), 2275 early endosomes in 20 siKIFC1 cells (114 ± 10 endosomes per cell) and 3257 early endosomes in 18 siKIFC1/siSTIM1 cells (181 ± 14 endosomes per cell). Data are analyzed by a parametric two-tailed analysis of variance (ANOVA) with Bonferroni post hoc analysis. ANOVA p≤ 0,001; Bonferroni for siCTL and siKIFC1 ECs p≤ 0,001 *** (orange) and for siKIFC1 and siSTIM1/siKIFC1 ECs p≤ 0,001 *** (green). On the right-hand side of the plot, colored bands represent the average cell diameter, significantly changing throughout the conditions. Data are analyzed by a parametric two-tailed analysis of variance (ANOVA) with Bonferroni post hoc analysis. ANOVA p≤ 0,01; Bonferroni for siCTL and siKIFC1 ECs p> 0.05 not significant (orange ns) and for siKIFC1 and siSTIM1/siKIFC1 ECs p≤ 0,01 ** (green). "}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Confocal", "microscopy", "images", "of", "untreated", "(", "UT", ")", "or", "treated", "with", "Ciliobrevin", "D", "(", "CilioD", ")", "or", "AZ82", "or", "both", "treatments", "simultaneously", "(", "CilioD", "+", "AZ82", ")", "ECs", "and", "stained", "for", "endogenous", "EEA", "-", "1", "(", "in", "green", ")", "and", "LAMP", "-", "1", "(", "in", "red", ")", "to", "visualize", "EEs", "and", "LEs", ",", "respectively", ",", "and", "Draq5", "(", "in", "blue", ")", "to", "highlight", "the", "nucleus", ".", "The", "yellow", "line", "is", "drawn", "to", "define", "cell", "periphery", ".", "Scale", "bar", "=", "20", "μm", ".", "On", "the", "right", ",", "inset", "panels", "to", "highlight", "respective", "perinuclear", "and", "peripheral", "area", "of", "the", "cell", ".", "Scale", "bar", "=", "5", "μm", ".", "(", "B", ")", "Distribution", "of", "distance", "to", "nucleus", "overtime", ",", "normalized", "on", "cell", "size", ",", "quantified", "by", "image", "(", "data", "correspond", "to", "movies", "EV3", "and", "EV5", ")", "segmentation", "(", "see", "Material", "and", "Method", ",", "Live", "imaging", "experiments", ")", "of", "Rab5", "+", "endosomes", ",", "appearing", "for", "30", "seconds", ",", "during", "AZ82", "treatment", "in", "ECs", ",", "compared", "to", "untreated", "cells", "(", "UT", ")", ".", "Results", "are", "from", "two", "independent", "experiments", "for", "a", "total", "of", "853", "early", "endosomes", "in", "6", "untreated", "cells", "(", "142", "±", "22", "endosomes", "per", "cell", ")", "and", "355", "early", "endosomes", "in", "7", "AZ82", "cells", "(", "51", "±", "12", "endosomes", "per", "cell", ")", ".", "Data", "are", "analyzed", "by", "a", "two", "-", "tailed", "heteroscedastic", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "p", "≤", "0", ",", "001", "*", "*", "*", ".", "(", "C", ")", "Distribution", "of", "retrograde", "velocity", "overtime", ",", "quantified", "by", "image", "(", "data", "correspond", "to", "movies", "EV3", ",", "EV4", "and", "EV5", ")", "segmentation", "(", "see", "Material", "and", "Method", ",", "Live", "imaging", "experiments", ")", "of", "Rab5", "+", "endosomes", ",", "appearing", "for", "30", "seconds", ",", "during", "Ciliobrevin", "D", "(", "CilioD", "D", ")", "or", "AZ82", "treatment", "in", "ECs", ",", "compared", "to", "untreated", "cells", "(", "UT", ")", ".", "Results", "are", "from", "three", "independent", "experiments", "for", "a", "total", "of", "580", "EEs", "in", "6", "UT", "cells", "(", "97", "±", "18", "endosomes", "per", "cell", ")", ",", "432", "EEs", "in", "9", "CilioD", "cells", "(", "48", "±", "15", "endosomes", "per", "cell", ")", "and", "from", "two", "independent", "experiments", "for", "a", "total", "of", "223", "EEs", "in", "7", "AZ82", "cells", "(", "32", "±", "6", "endosomes", "per", "cell", ")", ".", "Data", "are", "analyzed", "by", "a", "parametric", "two", "-", "tailed", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", "with", "Bonferroni", "post", "hoc", "analysis", ".", "ANOVA", "p", "≤", "0", ",", "001", ";", "Bonferroni", "for", "UT", "and", "CilioD", "treated", "ECs", "p", "≤", "0", ",", "01", "*", "*", "and", "for", "UT", "and", "AZ82", "treated", "ECs", "p", "≤", "0", ",", "001", "*", "*", "*", ".", "(", "D", ")", "Distribution", "of", "distance", "to", "nucleus", "overtime", ",", "normalized", "on", "cell", "size", ",", "quantified", "by", "image", "(", "data", "correspond", "to", "movies", "EV3", ",", "EV5", "and", "EV6", ")", "segmentation", "(", "see", "Material", "and", "Method", ",", "Live", "imaging", "experiments", ")", "of", "Rab5", "+", "endosomes", ",", "appearing", "for", "30", "seconds", ",", "during", "AZ82", "treatment", "(", "as", "in", "b", ")", ",", "alone", "or", "in", "combination", "with", "CilioD", "treatment", "(", "CilioD", "+", "AZ82", ")", ",", "compared", "to", "untreated", "EC", "cells", "(", "UT", ")", ".", "Results", "are", "from", "two", "independent", "experiments", "for", "a", "total", "of", "853", "early", "endosomes", "in", "6", "UT", "cells", "(", "142", "±", "22", "endosomes", "per", "cell", ")", ",", "355", "EEs", "in", "7", "AZ82", "cells", "(", "51", "±", "12", "endosomes", "per", "cell", ")", "and", "1106", "EEs", "in", "8", "CilioD", "+", "AZ82", "cells", "(", "136", "±", "42", "endosomes", "per", "cell", ")", "and", "analyzed", "by", "a", "parametric", "two", "-", "tailed", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", "with", "Bonferroni", "post", "hoc", "analysis", ".", "ANOVA", "p", "≤", "0", ",", "001", ";", "Bonferroni", "for", "UT", "and", "AZ82", "treated", "ECs", "p", "≤", "0", ",", "001", "*", "*", "*", "(", "orange", ")", "and", "for", "CilioD", "and", "CilioD", "+", "AZ82", "treated", "ECs", "p", "≤", "0", ",", "001", "*", "*", "*", "(", "green", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6 (A) Confocal microscopy images of untreated (UT) or treated with Ciliobrevin D (CilioD) or AZ82 or both treatments simultaneously (CilioD + AZ82) ECs and stained for endogenous EEA-1 (in green) and LAMP-1 (in red) to visualize EEs and LEs, respectively, and Draq5 (in blue) to highlight the nucleus. The yellow line is drawn to define cell periphery. Scale bar = 20 μm. On the right, inset panels to highlight respective perinuclear and peripheral area of the cell. Scale bar = 5 μm.  (B) Distribution of distance to nucleus overtime, normalized on cell size, quantified by image (data correspond to movies EV3 and EV5) segmentation (see Material and Method, Live imaging experiments) of Rab5+ endosomes, appearing for 30 seconds, during AZ82 treatment in ECs, compared to untreated cells (UT). Results are from two independent experiments for a total of 853 early endosomes in 6 untreated cells (142 ± 22 endosomes per cell) and 355 early endosomes in 7 AZ82 cells (51±12 endosomes per cell). Data are analyzed by a two-tailed heteroscedastic Student's t-test, p≤ 0,001 ***.  (C) Distribution of retrograde velocity overtime, quantified by image (data correspond to movies EV3, EV4 and EV5) segmentation (see Material and Method, Live imaging experiments) of Rab5+ endosomes, appearing for 30 seconds, during Ciliobrevin D (CilioD D) or AZ82 treatment in ECs, compared to untreated cells (UT). Results are from three independent experiments for a total of 580 EEs in 6 UT cells (97 ± 18 endosomes per cell), 432 EEs in 9 CilioD cells (48 ± 15 endosomes per cell) and from two independent experiments for a total of 223 EEs in 7 AZ82 cells (32 ± 6 endosomes per cell). Data are analyzed by a parametric two-tailed analysis of variance (ANOVA) with Bonferroni post hoc analysis. ANOVA p≤ 0,001; Bonferroni for UT and CilioD treated ECs p≤ 0,01 ** and for UT and AZ82 treated ECs p≤ 0,001 ***.  (D) Distribution of distance to nucleus overtime, normalized on cell size, quantified by image (data correspond to movies EV3, EV5 and EV6) segmentation (see Material and Method, Live imaging experiments) of Rab5+ endosomes, appearing for 30 seconds, during AZ82 treatment (as in b), alone or in combination with CilioD treatment (CilioD + AZ82), compared to untreated EC cells (UT). Results are from two independent experiments for a total of 853 early endosomes in 6 UT cells (142 ±22 endosomes per cell), 355 EEs in 7 AZ82 cells (51 ± 12 endosomes per cell) and 1106 EEs in 8 CilioD+AZ82 cells (136 ± 42 endosomes per cell) and analyzed by a parametric two-tailed analysis of variance (ANOVA) with Bonferroni post hoc analysis. ANOVA p≤ 0,001; Bonferroni for UT and AZ82 treated ECs p≤ 0,001 *** (orange) and for CilioD and CilioD + AZ82 treated ECs p≤ 0,001 *** (green). "}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Representative", "of", "three", "Western", "Blot", "analysis", "of", "endogenous", "light", "-", "intermediate", "chain", "(", "LIC", ")", "of", "cytoplasmic", "dynein", "1", ",", "KIFC1", "and", "p150Glued", "immunoprecipitated", "with", "HOOK1", "in", "wild", "-", "type", "ECs", ".", "Negative", "control", "(", "CTL", ")", "was", "performed", "incubating", "cell", "lysate", "with", "protein", "A", "-", "or", "G", "-", "Sepharose", "and", "empty", "rabbit", "IgG", ".", "(", "B", ")", "Representative", "of", "three", "Western", "Blot", "analysis", "of", "endogenous", "p150Glued", ",", "HOOK3", "and", "p50", "(", "or", "Dynamitin", ")", "immunoprecipitated", "with", "KIFC1", "in", "wild", "-", "type", "ECs", ".", "Negative", "control", "(", "CTL", ")", "was", "performed", "incubating", "cell", "lysate", "with", "protein", "A", "-", "or", "G", "-", "Sepharose", "and", "empty", "mouse", "IgG", ".", "(", "C", ")", "Representative", "Western", "Blot", "analysis", "of", "endogenous", "HOOK1", "or", "HOOK3", "and", "total", "tubulin", "proteins", "in", "ECs", ",", "silenced", "with", "a", "control", "siRNA", "(", "siCTL", ")", "or", "one", "targeting", "HOOK1", "(", "siHOOK1", ";", "on", "the", "left", ")", "or", "one", "targeting", "HOOK3", "(", "siHOOK3", ";", "on", "the", "right", ")", ".", "(", "D", ")", "Confocal", "microscopy", "images", "of", "ECs", "silenced", "with", "a", "control", "siRNA", "(", "siCTL", ")", "or", "one", "targeting", "HOOK1", "(", "siHOOK1", ")", "or", "one", "targeting", "HOOK3", "(", "siHOOK3", ")", "or", "two", "targeting", "both", "(", "siHOOK1siHOOK3", ")", "and", "stained", "for", "endogenous", "EEA", "-", "1", "(", "in", "green", ")", "and", "LAMP", "-", "1", "(", "in", "red", ")", "to", "visualize", "EEs", "and", "LEs", ",", "respectively", ",", "and", "DAPI", "(", "in", "blue", ")", "to", "highlight", "the", "nucleus", ".", "The", "yellow", "line", "is", "drawn", "to", "define", "cell", "periphery", ".", "Scale", "bar", "=", "20", "μm", ".", "On", "the", "right", ",", "inset", "panels", "to", "highlight", "respective", "perinuclear", "and", "peripheral", "area", "of", "the", "cell", ".", "Scale", "bar", "=", "5", "μm", ".", "(", "E", ")", "Distribution", "of", "distance", "to", "nucleus", ",", "normalized", "on", "cell", "size", ",", "quantified", "by", "image", "(", "as", "in", "d", ")", "segmentation", "(", "see", "Material", "and", "Method", ",", "Confocal", "microscopy", "and", "early", "/", "late", "quantification", ")", "of", "EEA", "-", "1", "+", "endosomes", ".", "Results", "are", "from", "three", "independent", "experiments", "for", "a", "total", "of", "1193", "early", "endosomes", "in", "12", "siCTL", "cells", "(", "99", "±", "9", "endosomes", "per", "cell", ")", "and", "1104", "early", "endosomes", "in", "21", "siHOOK1", "cells", "(", "53", "±", "4", "endosomes", "per", "cell", ")", "and", "analyzed", "by", "a", "two", "-", "tailed", "heteroscedastic", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "p", "≤", "0", ",", "001", "*", "*", "*", ".", "(", "F", ")", "Distribution", "of", "distance", "to", "nucleus", ",", "normalized", "on", "cell", "size", ",", "quantified", "by", "image", "(", "as", "in", "d", ")", "segmentation", "(", "see", "Material", "and", "Method", ",", "Confocal", "microscopy", "and", "early", "/", "late", "quantification", ")", "of", "EEA", "-", "1", "+", "endosomes", ".", "Results", "are", "from", "three", "independent", "experiments", "for", "a", "total", "of", "1193", "early", "endosomes", "in", "12", "siCTL", "cells", "(", "99", "±", "7", "endosomes", "per", "cell", ")", "and", "1282", "early", "endosomes", "in", "22", "siHOOK3", "cells", "(", "58", "±", "5", "endosomes", "per", "cell", ")", "and", "analyzed", "by", "a", "two", "-", "tailed", "heteroscedastic", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "p", "≤", "0", ",", "001", "*", "*", "*", ".", "(", "G", ")", "Distribution", "of", "distance", "to", "nucleus", "quantified", "by", "image", "(", "as", "in", "d", ")", "segmentation", "(", "see", "Material", "and", "Method", ",", "Confocal", "microscopy", "and", "early", "/", "late", "quantification", ")", "of", "EEA", "-", "1", "+", "endosomes", ".", "Results", "are", "from", "three", "independent", "experiments", "for", "a", "total", "of", "1193", "early", "endosomes", "in", "12", "siCTL", "cells", "(", "99", "±", "7", "endosomes", "per", "cell", ")", ",", "1104", "EEs", "in", "21", "siHOOK1", "cells", "(", "53", "±", "4", "endosomes", "per", "cell", ")", "and", "2340", "EEs", "in", "19", "siHOOK1", "/", "siHOOK3", "cells", "(", "123", "±", "11", "endosomes", "per", "cell", ")", "and", "analyzed", "by", "a", "parametric", "two", "-", "tailed", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", "with", "Bonferroni", "post", "hoc", "analysis", ".", "ANOVA", "p", "≤", "0", ",", "001", ";", "Bonferroni", "for", "siCTL", "and", "siHOOK1", "ECs", "p", "≤", "0", ",", "001", "*", "*", "*", "(", "orange", ")", "and", "for", "siHOOK1", "and", "siHOOK1", "/", "siHOOK3", "ECs", "p", "≤", "0", ",", "001", "*", "*", "*", "(", "green", ")", ".", "On", "the", "right", "hand", "side", "of", "the", "plot", ",", "colored", "bands", "represent", "the", "average", "cell", "diameter", ",", "significantly", "changing", "throughout", "the", "conditions", ".", "Data", "are", "analyzed", "by", "a", "parametric", "two", "-", "tailed", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", "with", "Bonferroni", "post", "hoc", "analysis", ".", "ANOVA", "p", "≤", "0", ",", "001", ";", "Bonferroni", "for", "siCTL", "and", "siHOOK1", "ECs", "p", ">", "0", ".", "05", "not", "significant", "(", "orange", "ns", ")", "and", "for", "siHOOK1", "and", "siHOOK1", "/", "siHOOK3", "ECs", "p", "≤", "0", ",", "001", "*", "*", "*", "(", "green", ")", ".", "(", "H", ")", "Representative", "Western", "Blot", "analysis", "of", "the", "endogenous", "P150Glued", "co", "-", "immunoprecipitated", "with", "HOOK1", "in", "untreated", "(", "UT", ")", "and", "AZ82", "treated", "ECs", "(", "left", ")", "and", "its", "quantification", "by", "normalized", "densitometry", "(", "right", ")", ".", "Negative", "control", "(", "CTL", ")", "was", "performed", "incubating", "cell", "lysate", "with", "protein", "A", "-", "or", "G", "-", "Sepharose", "and", "empty", "rabbit", "IgG", ".", "Results", "are", "the", "average", "±", "SD", "of", "three", "independent", "assays", ".", "UT", "value", "of", "each", "biological", "replicate", "was", "normalized", "on", "itself", "and", "so", "AZ82", "experimental", "value", ".", "Results", "were", "analyzed", "by", "a", "parametric", "two", "-", "tailed", "analysis", "of", "variance", "(", "ANOVA", ")", "with", "Bonferroni", "post", "hoc", "analysis", ".", "ANOVA", "p", "≤", "0", ",", "001", ";", "Bonferroni", "for", "UT", "and", "AZ82", "p", "≤", "0", ",", "05", "*", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Representative of three Western Blot analysis of endogenous light-intermediate chain (LIC) of cytoplasmic dynein 1, KIFC1 and p150Glued immunoprecipitated with HOOK1 in wild-type ECs. Negative control (CTL) was performed incubating cell lysate with protein A- or G-Sepharose and empty rabbit IgG. (B) Representative of three Western Blot analysis of endogenous p150Glued, HOOK3 and p50 (or Dynamitin) immunoprecipitated with KIFC1 in wild-type ECs. Negative control (CTL) was performed incubating cell lysate with protein A- or G-Sepharose and empty mouse IgG.  (C) Representative Western Blot analysis of endogenous HOOK1 or HOOK3 and total tubulin proteins in ECs, silenced with a control siRNA (siCTL) or one targeting HOOK1 (siHOOK1; on the left) or one targeting HOOK3 (siHOOK3; on the right).  (D) Confocal microscopy images of ECs silenced with a control siRNA (siCTL) or one targeting HOOK1 (siHOOK1) or one targeting HOOK3 (siHOOK3) or two targeting both (siHOOK1siHOOK3) and stained for endogenous EEA-1 (in green) and LAMP-1 (in red) to visualize EEs and LEs, respectively, and DAPI (in blue) to highlight the nucleus. The yellow line is drawn to define cell periphery. Scale bar = 20 μm. On the right, inset panels to highlight respective perinuclear and peripheral area of the cell. Scale bar = 5 μm.  (E) Distribution of distance to nucleus, normalized on cell size, quantified by image (as in d) segmentation (see Material and Method, Confocal microscopy and early/late quantification) of EEA-1+ endosomes. Results are from three independent experiments for a total of 1193 early endosomes in 12 siCTL cells (99 ± 9 endosomes per cell) and 1104 early endosomes in 21 siHOOK1 cells (53 ± 4 endosomes per cell) and analyzed by a two-tailed heteroscedastic Student's t-test, p≤ 0,001 ***.  (F) Distribution of distance to nucleus, normalized on cell size, quantified by image (as in d) segmentation (see Material and Method, Confocal microscopy and early/late quantification) of EEA-1+ endosomes. Results are from three independent experiments for a total of 1193 early endosomes in 12 siCTL cells (99 ± 7 endosomes per cell) and 1282 early endosomes in 22 siHOOK3 cells (58 ± 5 endosomes per cell) and analyzed by a two-tailed heteroscedastic Student's t-test, p≤ 0,001 ***.  (G) Distribution of distance to nucleus quantified by image (as in d) segmentation (see Material and Method, Confocal microscopy and early/late quantification) of EEA-1+ endosomes. Results are from three independent experiments for a total of 1193 early endosomes in 12 siCTL cells (99 ± 7 endosomes per cell), 1104 EEs in 21 siHOOK1 cells (53 ± 4 endosomes per cell) and 2340 EEs in 19 siHOOK1/siHOOK3 cells (123 ± 11 endosomes per cell) and analyzed by a parametric two-tailed analysis of variance (ANOVA) with Bonferroni post hoc analysis. ANOVA p≤ 0,001; Bonferroni for siCTL and siHOOK1 ECs p≤ 0,001 *** (orange) and for siHOOK1 and siHOOK1/siHOOK3 ECs p≤ 0,001 *** (green). On the right hand side of the plot, colored bands represent the average cell diameter, significantly changing throughout the conditions. Data are analyzed by a parametric two-tailed analysis of variance (ANOVA) with Bonferroni post hoc analysis. ANOVA p≤ 0,001; Bonferroni for siCTL and siHOOK1 ECs p> 0.05 not significant (orange ns) and for siHOOK1 and siHOOK1/siHOOK3 ECs p≤ 0,001 *** (green).  (H) Representative Western Blot analysis of the endogenous P150Glued co-immunoprecipitated with HOOK1 in untreated (UT) and AZ82 treated ECs (left) and its quantification by normalized densitometry (right). Negative control (CTL) was performed incubating cell lysate with protein A- or G-Sepharose and empty rabbit IgG. Results are the average ± SD of three independent assays. UT value of each biological replicate was normalized on itself and so AZ82 experimental value. Results were analyzed by a parametric two-tailed analysis of variance (ANOVA) with Bonferroni post hoc analysis. ANOVA p≤ 0,001; Bonferroni for UT and AZ82 p≤ 0,05 *. "}
{"words": ["Figure", "8", "(", "A", ")", "Confocal", "microscopy", "images", "of", "ECs", "silenced", "with", "a", "control", "shRNA", "(", "shCTL", ")", "or", "one", "targeting", "STIM1", "(", "shSTIM1", ")", ",", "to", "which", "the", "pH", "-", "sensitive", "dye", "pHrodo", "Green", "was", "given", "and", "then", "cells", "were", "stained", "for", "LAMP", "-", "1", "(", "in", "red", ")", "to", "visualize", "LEs", "and", "DAPI", "(", "in", "blue", ")", "to", "highlight", "the", "nucleus", ".", "Scale", "bar", "=", "20", "μm", ".", "(", "B", ")", "Relative", "amount", "of", "LAMP", "-", "1", "+", "LEs", "positive", "to", "the", "pH", "-", "sensitive", "dye", "pHrodo", "(", "as", "in", "a", ")", "in", "shCTL", "and", "shSTIM1", "ECs", ".", "Results", "are", "the", "average", "±", "SEM", "of", "three", "independent", "experiments", "for", "a", "total", "of", "90", "cells", "(", "30", "cell", "for", "experiment", ")", "and", "analyzed", "by", "a", "two", "-", "tailed", "heteroscedastic", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "p", "≤", "0", ",", "001", "*", "*", "*", ".", "(", "C", ")", "Representative", "Western", "Blot", "analysis", "of", "endogenous", "Raptor", ",", "total", "and", "phospho", "-", "Thr389", "S6K1", "proteins", "(", "normalized", "on", "total", "tubulin", "levels", ")", "in", "ECs", "silenced", "with", "a", "control", "shRNA", "(", "shCTL", ")", "or", "one", "targeting", "STIM1", "(", "siSTIM1", ")", ".", "Numbers", "above", "each", "band", "represent", "respective", "N", ".", "O", ".", "D", ".", "average", "(", "two", "biological", "replicates", ")", "quantification", ".", "(", "D", ")", "Representative", "Western", "Blot", "analysis", "of", "endogenous", "LC3", "-", "I", "and", "-", "II", "proteins", "(", "both", "normalized", "on", "total", "tubulin", "levels", "and", "represented", "as", "ratio", "LC3", "-", "II", "/", "LC3", "-", "I", ")", "in", "ECs", "silenced", "with", "a", "control", "shRNA", "(", "shCTL", ")", "or", "one", "targeting", "STIM1", "(", "siSTIM1", ")", ".", "Results", "are", "the", "average", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", "and", "analyzed", "by", "a", "two", "-", "tailed", "heteroscedastic", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "p", "≤", "0", ",", "01", "*", "*", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8 (A) Confocal microscopy images of ECs silenced with a control shRNA (shCTL) or one targeting STIM1 (shSTIM1), to which the pH-sensitive dye pHrodo Green was given and then cells were stained for LAMP-1 (in red) to visualize LEs and DAPI (in blue) to highlight the nucleus. Scale bar = 20 μm. (B) Relative amount of LAMP-1+ LEs positive to the pH-sensitive dye pHrodo (as in a) in shCTL and shSTIM1 ECs. Results are the average ± SEM of three independent experiments for a total of 90 cells (30 cell for experiment) and analyzed by a two-tailed heteroscedastic Student's t-test, p≤ 0,001 ***.  (C) Representative Western Blot analysis of endogenous Raptor, total and phospho-Thr389 S6K1 proteins (normalized on total tubulin levels) in ECs silenced with a control shRNA (shCTL) or one targeting STIM1 (siSTIM1). Numbers above each band represent respective N.O.D. average (two biological replicates) quantification. (D) Representative Western Blot analysis of endogenous LC3-I and -II proteins (both normalized on total tubulin levels and represented as ratio LC3-II/LC3-I) in ECs silenced with a control shRNA (shCTL) or one targeting STIM1 (siSTIM1). Results are the average ± SD of three independent experiments and analyzed by a two-tailed heteroscedastic Student's t-test, p≤ 0,01 **."}
{"words": ["figf1a", ",", "Autophagosome", "formation", "in", "the", "heart", "indicated", "by", "GFP", "-", "LC3", ".", "Hearts", "were", "isolated", "from", "GFP", "-", "LC3", "transgenic", "mice", "at", "multiple", "stages", ",", "including", "18", ".", "5", " ", "day", "embryos", "and", "0", ".", "5", " ", "h", ",", "3", " ", "h", ",", "6", " ", "h", ",", "24", " ", "h", "and", "2", ".", "5", " ", "day", "neonates", ",", "immediately", "fixed", ",", "cryosectioned", ",", "and", "analysed", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "10", " ", "µm", ".", "b", ",", "Quantification", "of", "GFP", "-", "LC3", "dots", "in", "neonatal", "tissues", ".", "Cryosections", "were", "prepared", "from", "tissues", "isolated", "at", "the", "indicated", "times", ".", "The", "ratio", "of", "the", "total", "area", "of", "GFP", "-", "LC3", "dots", "to", "the", "total", "cellular", "area", "is", "shown", "as", "a", "percentage", ".", "Values", "represent", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "of", "three", "mice", ".", "Diaph", ".", ",", "diaphragm", ";", "Panc", ".", ",", "pancreas", ";", "Muscle", ";", "gastrocnemius", "muscle", ".", "c", ",", "Electron", "microscopic", "analysis", "of", "the", "heart", "from", "wild", "-", "type", "neonates", ".", "Typical", "autophagosomes", "(", "arrows", ")", "and", "autolysosomes", "(", "arrowhead", ")", "were", "observed", "in", "the", "heart", "at", "10", " ", "h", "after", "birth", ".", "Scale", "bar", ",", "1", " ", "µm", ".", "d", ",", "Conversion", "of", "LC3", "-", "I", "to", "LC3", "-", "II", "in", "neonatal", "hearts", ".", "Heart", "homogenates", "from", "five", "embryos", "/", "neonates", "were", "pooled", "and", "analysed", "by", "immunoblotting", "using", "an", "anti", "-", "LC3", "antibody", ".", "The", "bands", "representing", "LC3", "-", "I", "and", "LC3", "-", "II", "are", "marked", "with", "arrows", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf1a, Autophagosome formation in the heart indicated by GFP-LC3. Hearts were isolated from GFP-LC3 transgenic mice at multiple stages, including 18.5 day embryos and 0.5 h, 3 h, 6 h, 24 h and 2.5 day neonates, immediately fixed, cryosectioned, and analysed by fluorescence microscopy. Scale bar, 10 µm.b, Quantification of GFP-LC3 dots in neonatal tissues. Cryosections were prepared from tissues isolated at the indicated times. The ratio of the total area of GFP-LC3 dots to the total cellular area is shown as a percentage. Values represent mean ± s.d. of three mice. Diaph., diaphragm; Panc., pancreas; Muscle; gastrocnemius muscle.c, Electron microscopic analysis of the heart from wild-type neonates. Typical autophagosomes (arrows) and autolysosomes (arrowhead) were observed in the heart at 10 h after birth. Scale bar, 1 µm.d, Conversion of LC3-I to LC3-II in neonatal hearts. Heart homogenates from five embryos/neonates were pooled and analysed by immunoblotting using an anti-LC3 antibody. The bands representing LC3-I and LC3-II are marked with arrows."}
{"words": ["figf2a", ",", "Detection", "of", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "targeted", "alleles", ".", "Genomic", "DNA", "was", "prepared", "from", "mouse", "tails", "and", "analysed", "by", "Southern", "blot", "analysis", ".", "Restriction", "enzymes", "used", "were", "HpaI", "for", "the", "5", "′", "probe", "and", "SpeI", "for", "the", "3", "′", "probe", "(", "see", "Supplementary", "Fig", ".", "S2", "for", "the", "restriction", "map", ")", ".", "KO", ",", "knockout", "(", "targeted", ")", "allele", ".", "b", ",", "Photograph", "of", "a", "representative", "Atg5", "-", "/", "-", "neonate", "compared", "to", "a", "wild", "-", "type", "littermate", ".", "c", ",", "Immunoblot", "analysis", "of", "Atg5", "and", "LC3", ".", "Heart", "homogenates", "were", "prepared", "from", "neonates", "10", " ", "h", "after", "birth", ".", "MEFs", "were", "cultured", "in", "Dulbeccos", "modified", "Eagles", "medium", "supplemented", "with", "10", "%", "FBS", "(", "unstarved", ")", "or", "Hanks", "'", "solution", "for", "2", " ", "h", "(", "starved", ")", ",", "and", "total", "cell", "lysates", "were", "prepared", ".", "Immunoblot", "analysis", "was", "performed", "using", "anti", "-", "Atg5", "and", "anti", "-", "LC3", "antibodies", ".", "The", "position", "of", "the", "Atg12", "-", "Atg5", "conjugate", "on", "the", "blot", "is", "indicated", ".", "d", ",", "Absence", "of", "GFP", "-", "LC3", "dot", "formation", "in", "Atg5", "-", "/", "-", "mouse", "heart", ".", "Various", "tissues", "from", "Atg5", "-", "/", "-", "mice", "expressing", "GFP", "-", "LC3", "were", "analysed", "for", "dot", "formation", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "A", "representative", "result", "from", "a", "neonatal", "heart", "at", "3", " ", "h", "after", "birth", "is", "shown", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf2a, Detection of wild-type (WT) and targeted alleles. Genomic DNA was prepared from mouse tails and analysed by Southern blot analysis. Restriction enzymes used were HpaI for the 5′ probe and SpeI for the 3′ probe (see Supplementary Fig.S2 for the restriction map). KO, knockout (targeted) allele.b, Photograph of a representative Atg5-/- neonate compared to a wild-type littermate.c, Immunoblot analysis of Atg5 and LC3. Heart homogenates were prepared from neonates 10 h after birth. MEFs were cultured in Dulbeccos modified Eagles medium supplemented with 10% FBS (unstarved) or Hanks' solution for 2 h (starved), and total cell lysates were prepared. Immunoblot analysis was performed using anti-Atg5 and anti-LC3 antibodies. The position of the Atg12-Atg5 conjugate on the blot is indicated.d, Absence of GFP-LC3 dot formation in Atg5-/- mouse heart. Various tissues from Atg5-/- mice expressing GFP-LC3 were analysed for dot formation by fluorescence microscopy. A representative result from a neonatal heart at 3 h after birth is shown."}
{"words": ["figf3Neonates", "were", "obtained", "by", "caesarean", "delivery", ".", "a", ",", "b", ",", "Successfully", "resuscitated", "pups", "were", "monitored", "in", "a", "humidified", "chamber", "without", "milk", "feeding", "(", "a", ")", "or", "with", "artificial", "milk", "feeding", "provided", "every", "3", "-", "6", "h", "through", "a", "tube", "inserted", "into", "the", "stomach", "(", "b", ")", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf3Neonates were obtained by caesarean delivery. a, b, Successfully resuscitated pups were monitored in a humidified chamber without milk feeding (a) or with artificial milk feeding provided every 3-6 h through a tube inserted into the stomach (b)."}
{"words": ["figf4a", ",", "Plasma", "and", "tissue", "amino", "acid", "concentrations", ".", "Amino", "acid", "concentrations", "were", "measured", "at", "0", "and", "10", " ", "h", "after", "the", "caesarean", "delivery", "under", "fasting", "conditions", ".", "'", "Total", "'", "indicates", "the", "sum", "of", "the", "Asp", ",", "Thr", ",", "Ser", ",", "Asn", ",", "Glu", ",", "Gln", ",", "Pro", ",", "Gly", ",", "Ala", ",", "Val", ",", "Cys", ",", "Met", ",", "Ile", ",", "Leu", ",", "Tyr", ",", "Phe", ",", "Lys", ",", "His", "and", "Arg", "concentrations", ";", "'", "Essential", "'", "indicates", "the", "sum", "of", "Thr", ",", "Val", ",", "Met", ",", "Ile", ",", "Leu", ",", "Phe", ",", "Lys", ",", "His", "and", "Arg", "concentrations", ";", "'", "BCAA", "'", "indicates", "the", "sum", "of", "the", "Val", ",", "Ile", "and", "Leu", "concentrations", ".", "Tissue", "amino", "acid", "concentrations", "are", "expressed", "as", "mmol", " ", "kg", "-", "1", "of", "wet", "weight", ".", "Bars", "represent", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "of", "three", "mice", ".", "Single", "and", "double", "asterisks", "indicate", "a", "significant", "difference", "between", "mutant", "and", "control", "(", "wild", "-", "type", "plus", "heterozygous", ")", "mice", "at", "P", "0", ".", "05", "and", "P", "0", ".", "01", ",", "respectively", ".", "b", ",", "Activation", "of", "AMPK", "in", "Atg5", "-", "/", "-", "mice", ".", "Hearts", "were", "isolated", "from", "unfed", "neonates", "at", "0", "h", "(", "lanes", "1", ",", "3", ",", "5", ")", "and", "10", "h", "(", "lanes", "2", ",", "4", ",", "6", ")", ",", "and", "force", "-", "fed", "mice", "at", "10", "h", "(", "lane", "7", ")", "after", "the", "caesarean", "delivery", ".", "Homogenates", "were", "prepared", "in", "the", "presence", "of", "phosphatase", "inhibitors", "and", "analysed", "by", "immunoblotting", "using", "anti", "-", "AMPK", "and", "anti", "-", "phospho", "-", "AMPK", "antibodies", ".", "c", ",", "ECGs", "from", "neonatal", "mice", "at", "the", "indicated", "time", "after", "caesarean", "delivery", ".", "ST", "elevation", "was", "observed", "in", "all", "Atg5", "-", "/", "-", "mice", "(", "n", "=", "4", ")", "at", "8", "-", "9", " ", "h", "after", "delivery", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf4a, Plasma and tissue amino acid concentrations. Amino acid concentrations were measured at 0 and 10 h after the caesarean delivery under fasting conditions. 'Total' indicates the sum of the Asp, Thr, Ser, Asn, Glu, Gln, Pro, Gly, Ala, Val, Cys, Met, Ile, Leu, Tyr, Phe, Lys, His and Arg concentrations; 'Essential' indicates the sum of Thr, Val, Met, Ile, Leu, Phe, Lys, His and Arg concentrations; 'BCAA' indicates the sum of the Val, Ile and Leu concentrations. Tissue amino acid concentrations are expressed as mmol kg-1 of wet weight. Bars represent mean ± s.d. of three mice. Single and double asterisks indicate a significant difference between mutant and control (wild-type plus heterozygous) mice at P 0.05 and P 0.01, respectively.b, Activation of AMPK in Atg5-/- mice. Hearts were isolated from unfed neonates at 0 h (lanes 1, 3, 5) and 10 h (lanes 2, 4, 6), and force-fed mice at 10 h (lane 7) after the caesarean delivery. Homogenates were prepared in the presence of phosphatase inhibitors and analysed by immunoblotting using anti-AMPK and anti-phospho-AMPK antibodies.c, ECGs from neonatal mice at the indicated time after caesarean delivery. ST elevation was observed in all Atg5-/- mice (n = 4) at 8-9 h after delivery."}
{"words": ["Figure", "1B", ",", "Mouse", "embryonic", "fibroblasts", "genetically", "modified", "using", "CRISPR", "to", "introduce", "a", "GFP", "sequence", "immediately", "after", "the", "start", "codon", "of", "Syne2", "display", "fluorescence", "at", "the", "nuclear", "envelope", ".", "C", ",", "Brightfield", "and", "fluorescence", "images", "of", "a", "cell", "migrating", "through", "a", "2", "µm", "constriction", ".", "Arrows", "indicate", "areas", "of", "accumulation", "of", "nesprin", "-", "2", "at", "the", "front", "of", "the", "nucleus", "as", "it", "is", "deformed", "through", "the", "constriction", ".", "E", ",", "Brightfield", "and", "fluorescence", "images", "of", "a", "cell", "migrating", "along", "a", "15", "µm", "control", "channel", ".", "F", ",", "Quantification", "of", "the", "intensity", "of", "the", "fluorescent", "signal", "around", "the", "perimeter", "of", "the", "nucleus", "in", "a", "2", "µm", "constriction", "and", "a", "15", "µm", "control", "channel", ".", "The", "average", "intensity", "at", "the", "front", "and", "the", "back", "is", "normalized", "to", "the", "intensity", "at", "the", "sides", ",", "demonstrating", "an", "increase", "in", "the", "signal", "at", "the", "front", "of", "the", "nucleus", "as", "it", "is", "deformed", "and", "a", "reduction", "after", "deformation", ".", "Error", "bars", "correspond", "to", "the", "standard", "deviation", ".", "Constriction", ":", "n", "=", "17", "cells", "over", "4", "biological", "replicates", ",", "15", "µm", "channels", ":", "n", "=", "20", "cells", "over", "3", "biological", "replicates", ".", "A", "Wilcoxon", "signed", "-", "rank", "test", "is", "used", "to", "compare", "matched", "samples", ",", "stars", "(", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ")", "denote", "comparisons", "to", "the", "measurement", "at", "the", "side", ",", "and", "pounds", "(", "#", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "#", "#", "P", "<", "0", ".", "01", ")", "denote", "a", "comparison", "to", "the", "\"", "before", "\"", "time", "point", ".", "G", ",", "GFP", "-", "nesprin", "-", "2", "cells", "deformed", "by", "the", "pressure", "gradient", "in", "a", "micropipette", "aspiration", "device", ".", "Note", "that", "the", "GFP", "signal", "does", "not", "increase", "at", "the", "tip", "but", "increases", "at", "sides", "of", "the", "nucleus", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B, Mouse embryonic fibroblasts genetically modified using CRISPR to introduce a GFP sequence immediately after the start codon of Syne2 display fluorescence at the nuclear envelope.C, Brightfield and fluorescence images of a cell migrating through a 2 µm constriction. Arrows indicate areas of accumulation of nesprin-2 at the front of the nucleus as it is deformed through the constriction.E, Brightfield and fluorescence images of a cell migrating along a 15 µm control channel.F, Quantification of the intensity of the fluorescent signal around the perimeter of the nucleus in a 2 µm constriction and a 15 µm control channel. The average intensity at the front and the back is normalized to the intensity at the sides, demonstrating an increase in the signal at the front of the nucleus as it is deformed and a reduction after deformation. Error bars correspond to the standard deviation. Constriction: n=17 cells over 4 biological replicates, 15 µm channels: n=20 cells over 3 biological replicates. A Wilcoxon signed-rank test is used to compare matched samples, stars (*P < 0.05, **P < 0.01) denote comparisons to the measurement at the side, and pounds (#P < 0.05, ##P < 0.01) denote a comparison to the \"before\" time point.G, GFP-nesprin-2 cells deformed by the pressure gradient in a micropipette aspiration device. Note that the GFP signal does not increase at the tip but increases at sides of the nucleus."}
{"words": ["Figure", "2A", ",", "CRISPR", "-", "modified", "cells", "(", "Brightfield", ",", "left", ")", "that", "express", "GFP", "-", "nesprin", "-", "2", "(", "middle", ")", "and", "mCh", "-", "LAC", "(", "right", ")", "show", "nesprin", "(", "orange", "arrow", ")", "but", "not", "lamin", "accumulation", "at", "the", "front", "of", "the", "nucleus", "as", "it", "is", "deformed", "through", "a", "narrow", "constriction", ".", "B", ",", "Quantification", "of", "intensity", "of", "GFP", "-", "nesprin", "-", "2", "and", "mCh", "-", "LAC", ",", "normalized", "to", "the", "intensity", "at", "the", "sides", ".", "Error", "bars", "correspond", "to", "the", "standard", "deviation", ".", "Constriction", ":", "n", "=", "19", "cells", "over", "5", "biological", "replicates", ",", "15", "µm", ":", "n", "=", "27", "over", "6", "biological", "replicates", ".", "A", "Wilcoxon", "signed", "-", "rank", "test", "is", "used", "to", "compare", "matched", "samples", ",", "stars", "(", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ")", "denote", "comparisons", "to", "the", "measurement", "at", "the", "side", ",", "and", "pounds", "(", "#", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "#", "#", "P", "<", "0", ".", "01", ")", "denote", "a", "comparison", "to", "the", "\"", "before", "\"", "time", "point", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A, CRISPR-modified cells (Brightfield, left) that express GFP-nesprin-2 (middle) and mCh-LAC (right) show nesprin (orange arrow) but not lamin accumulation at the front of the nucleus as it is deformed through a narrow constriction. B, Quantification of intensity of GFP-nesprin-2 and mCh-LAC, normalized to the intensity at the sides. Error bars correspond to the standard deviation. Constriction: n=19 cells over 5 biological replicates, 15 µm: n= 27 over 6 biological replicates. A Wilcoxon signed-rank test is used to compare matched samples, stars (*P < 0.05, **P < 0.01) denote comparisons to the measurement at the side, and pounds (#P < 0.05, ##P < 0.01) denote a comparison to the \"before\" time point."}
{"words": ["Figure", "3A", ",", "The", "deformed", "nucleus", "of", "cells", "migrating", "through", "narrow", "constrictions", "was", "bleached", "at", "the", "front", "and", "the", "side", "to", "determine", "mobility", ".", "Inset", "are", "shown", "close", "-", "up", "views", "of", "the", "bleached", "areas", "at", "the", "front", "of", "the", "nucleus", ".", "B", ",", "Quantification", "of", "the", "recovery", ".", "Error", "bars", "correspond", "to", "the", "standard", "error", "of", "the", "mean", ",", "n", "=", "24", "over", "3", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A, The deformed nucleus of cells migrating through narrow constrictions was bleached at the front and the side to determine mobility. Inset are shown close-up views of the bleached areas at the front of the nucleus. B, Quantification of the recovery. Error bars correspond to the standard error of the mean, n=24 over 3 biological replicates."}
{"words": ["Figure", "4A", ",", "Expression", "of", "the", "artificial", "mini", "-", "nesprin", "-", "2G", "construct", "results", "in", "significant", "nesprin", "accumulation", "(", "orange", "arrow", ")", "in", "cells", "migrating", "through", "narrow", "constrictions", ".", "C", ",", "Quantification", "of", "the", "mini", "-", "nesprin", "-", "2G", "accumulation", "of", "cells", "migrating", "through", "narrow", "constrictions", ".", "Note", "that", "the", "mutant", "construct", "does", "not", "accumulate", "at", "the", "front", "of", "the", "nucleus", ".", "Error", "bars", "correspond", "to", "the", "standard", "deviation", ".", "Mini", "-", "nesprin", "-", "2G", ":", "n", "=", "10", "cells", "over", "4", "biological", "replicates", ";", "Mutant", ":", "n", "=", "11", "cells", "over", "4", "biological", "replicates", ".", "A", "Wilcoxon", "signed", "-", "rank", "test", "is", "used", "to", "compare", "matched", "samples", ",", "stars", "(", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ")", "denote", "comparisons", "to", "the", "measurement", "at", "the", "side", ",", "and", "pounds", "(", "#", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "#", "#", "P", "<", "0", ".", "01", ")", "denote", "a", "comparison", "to", "the", "\"", "before", "\"", "time", "point", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A, Expression of the artificial mini-nesprin-2G construct results in significant nesprin accumulation (orange arrow) in cells migrating through narrow constrictions.C, Quantification of the mini-nesprin-2G accumulation of cells migrating through narrow constrictions. Note that the mutant construct does not accumulate at the front of the nucleus. Error bars correspond to the standard deviation. Mini-nesprin-2G: n=10 cells over 4 biological replicates; Mutant: n=11 cells over 4 biological replicates. A Wilcoxon signed-rank test is used to compare matched samples, stars(*P< 0.05, **P < 0.01) denote comparisons to the measurement at the side, and pounds (#P < 0.05, ##P < 0.01) denote a comparison to the \"before\" time point."}
{"words": ["Figure", "5A", ",", "Fixed", "cells", "labelled", "with", "phalloidin", "shows", "filamentous", "actin", "accumulation", "on", "the", "edges", "of", "the", "pillars", "and", "along", "the", "top", "and", "bottom", "surfaces", ".", "Cross", "-", "sections", "along", "the", "direction", "of", "migration", "(", "yellow", ")", "and", "perpendicular", "to", "the", "direction", "of", "migration", "(", "blue", ",", "1", "-", "4", ")", "are", "shown", "below", ".", "B", ",", "A", "confocal", "slice", "on", "the", "surface", "of", "the", "nucleus", "indicates", "that", "GFP", "-", "nesprin", "-", "2", "co", "-", "localizes", "with", "actin", "cables", "at", "the", "surface", "of", "the", "nucleus", ".", "Dashed", "white", "lines", "represent", "the", "outlines", "of", "the", "constriction", ".", "C", ",", "Spinning", "disk", "confocal", "microscopy", "on", "live", "cells", "reveals", "the", "elongation", "state", "of", "nesprins", "at", "the", "nuclear", "envelope", ".", "Dashed", "white", "lines", "represent", "the", "outlines", "of", "the", "constriction", ".", "The", "distance", "between", "mCh", "-", "LAC", "and", "GFP", "-", "nesprin", "-", "2", "was", "measured", "at", "the", "back", ",", "at", "the", "constriction", ",", "at", "the", "front", "near", "the", "constriction", ",", "and", "at", "the", "center", "of", "the", "front", ".", "(", "N", "=", "17", "cells", ",", "over", "3", "biological", "replicates", ".", "The", "alignment", "of", "the", "two", "channels", "was", "corrected", "using", "at", "least", "28", "fluorescent", "beads", ".", ")", "D", ",", "Two", "-", "photon", "laser", "ablation", "reveals", "that", "ablation", "at", "the", "front", "of", "the", "nucleus", "results", "in", "a", "rearward", "movement", "of", "the", "nucleus", ",", "but", "not", "ablation", "at", "the", "back", ".", "The", "nuclei", "of", "DN", "-", "KASH", ",", "which", "show", "a", "decrease", "of", "endogenous", "nesprin", "at", "the", "nuclear", "envelope", "show", "a", "dampened", "rearward", "movement", "upon", "ablation", "at", "the", "front", "of", "nuclei", ".", "Bars", "represent", "the", "average", "value", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "standard", "error", "on", "the", "mean", ".", "Back", ":", "N", "=", "9", ",", "Front", ":", "N", "=", "30", ",", "Cell", "Front", ":", "N", "=", "16", ",", "and", "DNKASH", ":", "N", "=", "31", ",", "3", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A, Fixed cells labelled with phalloidin shows filamentous actin accumulation on the edges of the pillars and along the top and bottom surfaces. Cross-sections along the direction of migration (yellow) and perpendicular to the direction of migration (blue, 1-4) are shown below.B, A confocal slice on the surface of the nucleus indicates that GFP-nesprin-2 co-localizes with actin cables at the surface of the nucleus. Dashed white lines represent the outlines of the constriction.C, Spinning disk confocal microscopy on live cells reveals the elongation state of nesprins at the nuclear envelope. Dashed white lines represent the outlines of the constriction. The distance between mCh-LAC and GFP-nesprin-2 was measured at the back, at the constriction, at the front near the constriction, and at the center of the front. (N = 17 cells, over 3 biological replicates. The alignment of the two channels was corrected using at least 28 fluorescent beads.)D, Two-photon laser ablation reveals that ablation at the front of the nucleus results in a rearward movement of the nucleus, but not ablation at the back. The nuclei of DN-KASH, which show a decrease of endogenous nesprin at the nuclear envelope show a dampened rearward movement upon ablation at the front of nuclei. Bars represent the average value. Error bars represent the standard error on the mean. Back: N= 9, Front: N= 30, Cell Front: N = 16, and DNKASH: N=31, 3 biological replicates."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "BMDMs", "from", "WT", "(", "Pml", "+", "/", "+", ")", "and", "Pml", "-", "/", "-", "mice", "were", "pre", "-", "treated", "with", "zVAD", "(", "20", "μM", ")", ",", "Nec", "-", "1", "(", "40", "μM", ")", "or", "GSK872", "(", "10", "μM", ")", ",", "as", "indicated", ",", "for", "30", "min", "followed", "by", "co", "-", "treatment", "with", "AT", "-", "406", "(", "1", "μM", ")", ".", "Cell", "viability", "was", "evaluated", "by", "ATP", "release", "after", "18", "h", ".", "Data", "show", "mean", "±", "SD", "of", "four", "biological", "replicates", ".", "(", "B", ")", "WT", "and", "Pml", "-", "/", "-", "BMDM", "were", "treated", "with", "TNF", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", ",", "zVAD", "(", "20", "μM", ")", "and", "Nec", "-", "1", "(", "40", "μM", ")", "or", "GSK872", "(", "10", "μM", ")", ",", "as", "indicated", ",", "for", "16", "h", ".", "Cell", "viability", "was", "determined", "by", "ATP", "release", ".", "Data", "show", "mean", "±", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "(", "D", ")", "WT", "and", "Pml", "-", "/", "-", "immortalized", "MEFs", "were", "treated", "with", "TNF", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", ",", "zVAD", "(", "20", "μM", ")", ",", "Nec", "-", "1", "(", "40", "μM", ")", ",", "and", "GSK872", "(", "10", "μM", ")", ",", "as", "indicated", ",", "for", "8", "h", ".", "Cell", "viability", "was", "determined", "by", "ATP", "assay", ".", "Data", "show", "mean", "±", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "(", "E", ")", "WT", "and", "Pml", "-", "/", "-", "immortalized", "MEFs", "were", "treated", "with", "TNF", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", ",", "IKK", "inhibitor", "BMS", "-", "345541", "(", "10", "mM", ")", "and", "Nec", "-", "1", ",", "as", "indicated", ",", "for", "6", "h", "and", "then", "cell", "death", "was", "assayed", ".", "Data", "show", "mean", "±", "SD", "of", "five", "biological", "replicates", ",", "except", "the", "Nec", "-", "1", "-", "containing", "experiment", "(", "n", "=", "2", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) BMDMs from WT (Pml+/+) and Pml-/- mice were pre-treated with zVAD (20 μM), Nec-1 (40 μM) or GSK872 (10 μM), as indicated, for 30 min followed by co-treatment with AT-406 (1 μM). Cell viability was evaluated by ATP release after 18 h. Data show mean ± SD of four biological replicates. (B) WT and Pml-/- BMDM were treated with TNF (100 ng/ml), zVAD (20 μM) and Nec-1 (40 μM) or GSK872 (10 μM), as indicated, for 16 h. Cell viability was determined by ATP release. Data show mean ± SD of three biological replicates. (D) WT and Pml-/- immortalized MEFs were treated with TNF (100 ng/ml), zVAD (20 μM), Nec-1 (40 μM), and GSK872 (10 μM), as indicated, for 8 h. Cell viability was determined by ATP assay. Data show mean ± SD of three biological replicates. (E) WT and Pml-/- immortalized MEFs were treated with TNF (100 ng/ml),IKK inhibitor BMS-345541 (10 mM) and Nec-1, as indicated, for 6 h and then cell death was assayed. Data show mean ± SD of five biological replicates, except the Nec-1-containing experiment (n=2). "}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ",", "B", ")", "Pml", "+", "/", "+", "and", "Pml", "-", "/", "-", "BMDMs", "were", "treated", "with", "zVAD", "+", "AT406", "(", "zA", ")", "(", "A", ")", "or", "TNF", "+", "zVAD", "(", "Tz", ")", "(", "B", ")", ",", "as", "in", "Fig", ".", "1", ",", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Contents", "of", "RIPK1", ",", "p", "-", "RIPK1", "[", "S166", "]", ",", "RIPK3", ",", "p", "-", "RIPK3", ",", "MLKL", ",", "and", "p", "-", "MLKL", "in", "cell", "lysates", "was", "analysed", "by", "immunoblots", ".", "Bottom", "panels", ",", "quantitation", "of", "p", "-", "RIPK1", "[", "S166", "]", "from", "three", "biological", "replicates", "using", "normalized", "intensity", "of", "p", "-", "RIPK1", "[", "S166", "]", "in", "WT", "cells", "at", "4", "h", "as", "1", ".", "Data", "show", "mean", "±", "SD", ".", "(", "D", ")", "BMDMs", "were", "treated", "with", "zVAD", "(", "20", "μM", ")", "+", "AT", "-", "406", "(", "1", "μM", ")", "for", "18", "h", ",", "and", "TNF", "generated", "was", "then", "analyzed", "by", "ELISA", ".", "Data", "show", "mean", "±", "SD", "of", "four", "biological", "replicates", ".", "(", "E", ")", "BMDMs", "were", "treated", "with", "zVAD", "+", "AT", "-", "406", "(", "1", "μM", ")", ",", "with", "or", "without", "anti", "-", "TNF", "for", "18", "h", ",", "and", "cell", "viability", "quantitated", ".", "Data", "show", "mean", "±", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A, B) Pml+/+ and Pml-/- BMDMs were treated with zVAD + AT406 (zA) (A) or TNF + zVAD (Tz) (B), as in Fig. 1, for the indicated times. Contents of RIPK1, p-RIPK1[S166], RIPK3, p-RIPK3, MLKL, and p-MLKL in cell lysates was analysed by immunoblots. Bottom panels, quantitation of p-RIPK1[S166] from three biological replicates using normalized intensity of p-RIPK1[S166] in WT cells at 4 h as 1. Data show mean ± SD.(D) BMDMs were treated with zVAD (20 μM) +AT-406 (1 μM) for 18 h, and TNF generated was then analyzed by ELISA. Data show mean ± SD of four biological replicates. (E) BMDMs were treated with zVAD + AT-406 (1 μM), with or without anti-TNF for 18 h, and cell viability quantitated. Data show mean ± SD of three biological replicates. "}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Pml", "+", "/", "+", "and", "Pml", "-", "/", "-", "BMDMs", "were", "treated", "with", "zVAD", "for", "30", "min", ",", "followed", "by", "AT", "-", "406", "(", "zA", ")", "treatment", "at", "the", "indicated", "time", "-", "points", ",", "before", "preparing", "total", "cell", "lysates", "(", "TCL", ")", ".", "TCL", "were", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "FADD", "and", "the", "amounts", "of", "p", "-", "RIPK1", "[", "S166", "]", ",", "RIPK1", "and", "caspase", "-", "8", "in", "the", "precipitates", "and", "TCL", "were", "analysed", ".", "(", "B", ")", "Pml", "+", "/", "+", "and", "Pml", "-", "/", "-", "BMDMs", "were", "treated", "with", "zVAD", "+", "AT406", "(", "zA", ")", "as", "in", "(", "A", ")", ",", "and", "TCL", "were", "then", "harvested", ".", "TCL", "were", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "caspase", "-", "8", ",", "and", "the", "contents", "of", "p", "-", "RIPK1", "[", "S166", "]", "and", "RIPK1", "in", "the", "precipitates", "and", "TCL", "was", "analysed", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Pml+/+ and Pml-/- BMDMs were treated with zVAD for 30 min, followed by AT-406 (zA) treatment at the indicated time-points, before preparing total cell lysates (TCL). TCL were immunoprecipitated with anti-FADD and the amounts of p-RIPK1[S166], RIPK1 and caspase-8 in the precipitates and TCL were analysed. (B) Pml+/+ and Pml-/- BMDMs were treated with zVAD + AT406 (zA) as in (A), and TCL were then harvested. TCL were immunoprecipitated with anti-caspase-8, and the contents of p-RIPK1[S166] and RIPK1 in the precipitates and TCL was analysed. "}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ",", "B", ")", "WT", "(", "Pml", "+", "/", "+", ")", "and", "Pml", "-", "/", "-", "mice", "(", "n", "=", "12", "in", "each", "group", ")", "were", "injected", "with", "mouse", "TNF", "(", "1", ".", "5", "μg", "/", "g", "body", "weight", ")", ",", "and", "rectal", "body", "temperature", "(", "A", ")", "and", "survival", "(", "B", ")", "were", "determined", "at", "the", "indicated", "time", "-", "points", ".", "#", ",", "the", "temperature", "of", "only", "six", "mice", "was", "measured", "at", "the", "indicated", "time", "-", "points", ".", "Mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", "is", "shown", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "as", "determined", "by", "two", "-", "way", "ANOVA", "(", "A", ")", ",", "or", "by", "Log", "-", "rank", "(", "Mantel", "-", "Cox", ")", "test", "(", "B", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A, B) WT (Pml+/+) and Pml-/- mice (n = 12 in each group) were injected with mouse TNF (1.5 μg/g body weight), and rectal body temperature (A) and survival (B) were determined at the indicated time-points. #, the temperature of only six mice was measured at the indicated time-points. Mean ± S.E.M is shown. *P < 0.05 as determined by two-way ANOVA (A), or by Log-rank (Mantel-Cox) test (B)."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Pml", "+", "/", "+", "and", "Pml", "-", "/", "-", "BMDMs", "were", "treated", "with", "TNF", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", "+", "zVAD", "(", "20", "μM", ")", "for", "the", "indicated", "timeframes", ".", "The", "contents", "of", "p", "-", "IKKα", "/", "β", ",", "IKKα", "/", "β", ",", "IκBα", ",", "p", "-", "MK2", "and", "MK2", "was", "analysed", "by", "immunoblotting", ".", "(", "B", ")", "Pml", "+", "/", "+", "and", "Pml", "-", "/", "-", "BMDMs", "were", "treated", "with", "TNF", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", "+", "zVAD", "(", "20", "μM", ")", "for", "the", "indicated", "times", ",", "and", "levels", "of", "p", "-", "RIPK1", "[", "S321", "]", ",", "RIPK1", ",", "p", "-", "JNK", ",", "JNK", ",", "p", "-", "ERK", ",", "ERK", ",", "p", "-", "p38", ",", "and", "p38", "at", "the", "indicated", "time", "points", "were", "then", "determined", ".", "(", "C", ",", "D", ",", "E", ",", "F", ")", "WT", "(", "Pml", "+", "/", "+", ")", "and", "Pml", "-", "/", "-", "mice", "were", "treated", "with", "DMSO", "or", "Nec", "-", "1s", "(", "6", "μg", "/", "g", ")", "or", "MK2", "inhibitor", "PF", "-", "3644022", "(", "75", "μg", "/", "mouse", ")", "by", "intraperitoneal", "injection", "15", "min", "before", "and", "60", "min", "after", "intravenous", "TNF", "(", "1", ".", "5", "μg", "/", "g", "body", "weight", ")", "injection", ".", "Body", "temperature", "(", "C", ",", "E", ")", "and", "survival", "(", "D", ",", "F", ")", "were", "monitored", ".", "Experiments", "C", "-", "F", "were", "conducted", "concurrently", ".", "Mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", "is", "shown", "(", "C", ",", "E", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Pml+/+ and Pml-/- BMDMs were treated with TNF (100 ng/ml) + zVAD (20 μM) for the indicated timeframes. The contents of p-IKKα/β, IKKα/β, IκBα, p-MK2 and MK2 was analysed by immunoblotting. (B) Pml+/+and Pml-/- BMDMs were treated with TNF (100 ng/ml) + zVAD (20 μM) for the indicated times, and levels of p-RIPK1[S321], RIPK1, p-JNK, JNK, p-ERK, ERK, p-p38, and p38 at the indicated time points were then determined. (C, D, E, F) WT (Pml+/+) and Pml-/- mice were treated with DMSO or Nec-1s (6 μg/g) or MK2 inhibitor PF-3644022 (75 μg/mouse) by intraperitoneal injection 15 min before and 60 min after intravenous TNF (1.5 μg/g body weight) injection. Body temperature (C, E) and survival (D, F) were monitored. Experiments C-F were conducted concurrently. Mean ± S.E.M is shown (C, E)."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ",", "B", ")", "WT", "and", "Mk2", "-", "/", "-", "BMDMs", "were", "treated", "with", "TNF", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", "+", "zVAD", "(", "20", "μM", ")", "(", "A", ")", "or", "with", "zVAD", "(", "20", "μM", ")", "+", "AT", "-", "406", "(", "1", "μM", ")", "(", "B", ")", ",", "and", "then", "the", "contents", "of", "p", "-", "RIPK1", "[", "S321", "]", ",", "RIPK1", ",", "p", "-", "p38", ",", "p38", "was", "determined", "at", "the", "indicated", "time", "-", "points", ".", "(", "C", ")", "WT", ",", "Pml", "-", "/", "-", ",", "Mk2", "-", "/", "-", "and", "Pml", "-", "/", "-", "Mk2", "-", "/", "-", "BMDMs", "were", "treated", "with", "zVAD", "(", "20", "μM", ")", ",", "AT", "-", "406", "(", "1", "μM", ")", ",", "Nec", "-", "1", "(", "40", "μM", ")", "and", "GSK872", "(", "10", "μM", ")", ",", "as", "indicated", ",", "for", "18", "h", ".", "Cell", "viability", "was", "determined", "by", "ATP", "release", ".", "Data", "show", "mean", "±", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "for", "multiple", "t", "-", "tests", "according", "to", "the", "Holm", "-", "Sidak", "method", ".", "(", "D", ")", "WT", ",", "Pml", "-", "/", "-", ",", "Mk2", "-", "/", "-", "and", "Pml", "-", "/", "-", "Mk2", "-", "/", "-", "BMDMs", "were", "treated", "with", "TNF", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", ",", "zVAD", "(", "20", "μM", ")", ",", "Nec", "-", "1", "(", "40", "μM", ")", "and", "GSK872", "(", "10", "μM", ")", ",", "as", "indicated", ",", "for", "16", "h", ".", "Cell", "viability", "was", "determined", "by", "ATP", "release", ".", "Data", "show", "mean", "±", "SD", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "for", "multiple", "t", "-", "tests", "according", "to", "the", "Holm", "-", "Sidak", "method", ".", "(", "F", ")", "WT", ",", "Pml", "-", "/", "-", ",", "Mk2", "-", "/", "-", "and", "Pml", "-", "/", "-", "Mk2", "-", "/", "-", "mice", "were", "injected", "i", ".", "v", ".", "with", "TNF", "(", "1", ".", "5", "mg", "/", "kg", ")", ",", "and", "survival", "was", "monitored", "for", "24", "h", ".", "Data", "represent", "a", "combination", "of", "two", "independent", "experiments", "(", "n", "=", "10", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "for", "Log", "-", "rank", "(", "Mantel", "-", "Cox", ")", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A, B) WT and Mk2-/- BMDMs were treated with TNF (100 ng/ml) + zVAD (20 μM) (A) or with zVAD (20 μM) + AT-406 (1 μM) (B), and then the contents of p-RIPK1[S321], RIPK1, p-p38, p38 was determined at the indicated time-points.(C) WT, Pml-/-, Mk2-/- and Pml-/-Mk2 -/- BMDMs were treated with zVAD (20 μM), AT-406 (1 μM), Nec-1 (40 μM) and GSK872 (10 μM), as indicated, for 18 h. Cell viability was determined by ATP release. Data show mean ± SD of three biological replicates. *P < 0.05 for multiple t-tests according to the Holm-Sidak method. (D) WT, Pml-/-, Mk2-/- and Pml-/-Mk2 -/- BMDMs were treated with TNF (100 ng/ml), zVAD (20 μM), Nec-1 (40 μM) and GSK872 (10 μM), as indicated, for 16 h. Cell viability was determined by ATP release. Data show mean ± SD of three biological replicates. *P < 0.05 for multiple t-tests according to the Holm-Sidak method. (F) WT, Pml-/-, Mk2-/- and Pml-/-Mk2 -/- mice were injected i.v. with TNF (1.5 mg/kg), and survival was monitored for 24 h. Data represent a combination of two independent experiments (n=10). *P < 0.05 for Log-rank (Mantel-Cox) test."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "D", ")", "WT", "and", "Pml", "-", "/", "-", "BMDMs", "were", "treated", "with", "TNF", "(", "100", "ng", "/", "ml", ")", "+", "zVAD", "(", "20", "μM", ")", "for", "the", "indicated", "times", ".", "p38", "MAPK", "was", "immunoprecipitated", ",", "and", "its", "association", "with", "MK2", "was", "then", "analysed", ".", "(", "E", ")", "Recombinant", "Flag", "-", "PML", "-", "I", ",", "GST", "-", "MK2", "(", "60", "ng", ")", "and", "His", "-", "p38", "(", "60", "ng", ")", "were", "incubated", ",", "as", "indicated", ",", "at", "4", "°", "C", "for", "2", "h", ".", "p38", "was", "pulled", "down", "by", "anti", "-", "p38", "and", "then", "PML", ",", "MK2", "and", "p38", "contents", "in", "the", "precipitate", "and", "reaction", "mixture", "(", "input", ")", "were", "detected", "by", "immunoblotting", ".", "(", "F", ")", "Recombinant", "Flag", "-", "PML", "-", "I", ",", "GST", "-", "MK2", "(", "100", "ng", ")", "and", "His", "-", "p38", "(", "200", "ng", ")", "were", "incubated", ",", "as", "indicated", ",", "at", "30", "°", "C", "in", "in", "vitro", "kinase", "assay", "buffer", "(", "20", "mM", "HEPES", ",", "10", "mM", "MgCl2", ",", "100", "nM", "ATP", ",", "1", "mM", "DTT", ")", "for", "20", "min", ".", "The", "levels", "of", "p", "-", "MK2", ",", "MK2", ",", "p38", ",", "and", "PML", "(", "FLAG", ")", "in", "the", "reaction", "mixture", "were", "then", "determined", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(D) WT and Pml-/- BMDMs were treated with TNF (100 ng/ml) + zVAD (20 μM) for the indicated times. p38 MAPK was immunoprecipitated, and its association with MK2 was then analysed.(E) Recombinant Flag-PML-I, GST-MK2 (60 ng) and His-p38 (60 ng) were incubated, as indicated, at 4 °C for 2 h. p38 was pulled down by anti-p38 and then PML, MK2 and p38 contents in the precipitate and reaction mixture (input) were detected by immunoblotting.(F) Recombinant Flag-PML-I, GST-MK2 (100 ng) and His-p38 (200 ng) were incubated, as indicated, at 30 °C in in vitro kinase assay buffer (20 mM HEPES, 10 mM MgCl2, 100 nM ATP, 1 mM DTT) for 20 min. The levels of p-MK2, MK2, p38, and PML (FLAG) in the reaction mixture were then determined."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "mH2A1", ".", "2", "and", "different", "neurogenesis", "markers", "are", "present", "in", "cortical", "lysates", "collected", "at", "various", "time", "points", "(", "E13", ",", "E15", ",", "E17", ",", "and", "P0", ")", ".", "(", "C", ")", "A", "scatter", "diagram", "shows", "the", "change", "trend", "of", "mH2A1", ".", "2", "and", "different", "neurogenesis", "markers", ".", "n", "=", "5", "mice", ",", "independent", "replicates", ".", "(", "E", ")", "Electroporation", "of", "mH2A1", ".", "2", "-", "shRNA", "results", "in", "abnormal", "cell", "distribution", "in", "the", "developing", "neocortex", ".", "Electroporation", "was", "performed", "at", "E13", ".", "5", ",", "and", "the", "mouse", "was", "harvested", "at", "E16", ".", "5", ".", "Scale", "bar", "represents", "50", "μm", ".", "(", "F", ")", "Graph", "shows", "the", "percentage", "of", "GFP", "-", "positive", "cells", "distributed", "in", "the", "VZ", "/", "SVZ", ",", "IZ", "and", "CP", ".", "n", "=", "7", "mice", ",", "independent", "replicates", ".", "Date", "information", ":", "Representative", "images", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "means", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ".", ";", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "*", "*", ")", "or", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "*", "*", "*", ")", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) mH2A1.2 and different neurogenesis markers are present in cortical lysates collected at various time points (E13, E15, E17, and P0).(C) A scatter diagram shows the change trend of mH2A1.2 and different neurogenesis markers. n = 5 mice, independent replicates.(E) Electroporation of mH2A1.2-shRNA results in abnormal cell distribution in the developing neocortex. Electroporation was performed at E13.5, and the mouse was harvested at E16.5. Scale bar represents 50 μm. (F) Graph shows the percentage of GFP-positive cells distributed in the VZ/SVZ, IZ and CP. n = 7 mice, independent replicates. Date information: Representative images from at least three independent experiments. Error bars represent the means ± S.E.M.; Two-tailed unpaired t-test, P < 0.01(**) or P < 0.001(***). n.s., not significant."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "D", ")", "Abnormal", "cell", "distribution", "was", "observed", "in", "the", "mH2A1", ".", "2", "silenced", "neocortex", ".", "The", "GFP", "plasmid", "was", "electroporated", "into", "WT", "and", "KO", "mice", "brains", "at", "E13", ".", "5", ",", "and", "the", "mice", "were", "sacrificed", "at", "E16", ".", "5", ".", "Scale", "bar", "represents", "50", "μm", ".", "(", "E", ")", "Graphs", "of", "the", "percentage", "of", "GFP", "-", "positive", "cells", "in", "the", "VZ", "/", "SVZ", ",", "IZ", "and", "CP", ".", "n", "=", "5", "mice", ",", "independent", "replicates", ".", "Date", "information", ":", "Representative", "images", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "means", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ".", ";", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "*", ")", ",", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "*", "*", ")", "or", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "*", "*", "*", ")", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ".", "(", "F", ")", "Brain", "sections", "of", "WT", "and", "KO", "mice", "at", "E16", ".", "5", "were", "immunostained", "with", "the", "mitotic", "marker", "pH3", "and", "DAPI", ".", "Scale", "bar", "represents", "20", "μm", ".", "(", "G", ")", "Statistics", "of", "pH3", "+", "cells", "of", "the", "cortex", ".", "n", "=", "6", "mice", ",", "independent", "replicates", ".", "Date", "information", ":", "Representative", "images", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "means", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ".", ";", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "*", ")", ",", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "*", "*", ")", "or", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "*", "*", "*", ")", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ".", "(", "H", ")", "Representative", "images", "of", "E16", ".", "5", "coronal", "brain", "sections", "were", "immunostained", "for", "PAX6", ".", "The", "GFP", "plasmid", "was", "electroporated", "into", "WT", "and", "KO", "mice", "brains", "at", "E13", ".", "5", ",", "and", "the", "mice", "were", "sacrificed", "at", "E16", ".", "5", ".", "Scale", "bar", "represents", "50", "μm", ".", "(", "I", ")", "Quantification", "of", "GFP", "and", "Pax6", "double", "positive", "cells", "in", "the", "VZ", "/", "SVZ", ".", "n", "=", "6", "mice", ",", "independent", "replicates", ".", "Date", "information", ":", "Representative", "images", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "means", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ".", ";", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "*", ")", ",", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "*", "*", ")", "or", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "*", "*", "*", ")", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(D)Abnormal cell distribution was observed in the mH2A1.2 silenced neocortex. The GFP plasmid was electroporated into WT and KO mice brains at E13.5, and the mice were sacrificed at E16.5. Scale bar represents 50 μm. (E) Graphs of the percentage of GFP-positive cells in the VZ/SVZ, IZ and CP. n = 5 mice, independent replicates. Date information: Representative images from at least three independent experiments. Error bars represent the means ± S.E.M.; Two-tailed unpaired t-test, P < 0.05(*), P < 0.01(**) or P < 0.001(***). n.s., not significant.(F) Brain sections of WT and KO mice at E16.5 were immunostained with the mitotic marker pH3 and DAPI. Scale bar represents 20 μm. (G) Statistics of pH3+ cells of the cortex. n=6 mice, independent replicates. Date information: Representative images from at least three independent experiments. Error bars represent the means ± S.E.M.; Two-tailed unpaired t-test, P < 0.05(*), P < 0.01(**) or P < 0.001(***). n.s., not significant.(H) Representative images of E16.5 coronal brain sections were immunostained for PAX6. The GFP plasmid was electroporated into WT and KO mice brains at E13.5, and the mice were sacrificed at E16.5. Scale bar represents 50 μm. (I) Quantification of GFP and Pax6 double positive cells in the VZ/SVZ. n=6 mice, independent replicates. Date information: Representative images from at least three independent experiments. Error bars represent the means ± S.E.M.; Two-tailed unpaired t-test, P < 0.05(*), P < 0.01(**) or P < 0.001(***). n.s., not significant."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Representative", "images", "of", "E16", ".", "5", "coronal", "brain", "sections", "immune", "stained", "for", "Tbr2", "and", "BrdU", ".", "BrdU", "was", "injected", "intraperitoneally", "into", "pregnant", "mice", "at", "E16", ".", "5", "for", "2h", "of", "pulse", "labeling", ".", "Scale", "bar", "represents", "20", "μm", ".", "(", "B", ")", "Statistics", "of", "TBR2", "+", "cells", "per", "100μm2", "surface", "of", "VZ", "/", "SVZ", ".", "The", "number", "of", "TBR2", "+", "cells", "increased", "significantly", "in", "KO", "mice", "compared", "to", "WT", "mice", ".", "n", "=", "6", "mice", ",", "independent", "replicates", ".", "(", "C", ")", "Statistics", "of", "BrdU", "+", "cells", "per", "100μm2", "surface", "of", "VZ", "/", "SVZ", ".", "The", "number", "of", "BrdU", "+", "cells", "increased", "significantly", "in", "KO", "mice", "compared", "to", "WT", "mice", ".", "n", "=", "6", "mice", ",", "independent", "replicates", ".", "Date", "information", ":", "Representative", "images", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "means", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ".", ";", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "*", ")", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ".", "(", "E", ")", "Cell", "cycle", "exit", "was", "decreased", "in", "KO", "mice", ".", "E16", ".", "5", "brain", "sections", "were", "stained", "with", "anti", "-", "BrdU", "and", "anti", "-", "Ki67", "in", "WT", "mice", "and", "KO", "mice", "that", "were", "administered", "BrdU", "(", "100", "mg", "/", "kg", ")", "for", "24", "h", "and", "harvested", "at", "E16", ".", "5", ".", "Scale", "bar", "represents", "20", "μm", ".", "(", "F", ")", "Percentage", "of", "cell", "cycle", "exit", "(", "BrdU", "+", "Ki67", "−", "/", "BrdU", "+", ")", "in", "WT", "mice", "and", "KO", "mice", ".", "n", "=", "7", "mice", ",", "independent", "replicates", ".", "Date", "information", ":", "Error", "bars", "represent", "the", "means", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ".", ";", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "*", ")", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ".", "(", "G", ")", "Western", "blot", "analysis", "showed", "that", "the", "protein", "expression", "levels", "of", "neural", "stem", "cell", "marker", ",", "including", "TBR2", ",", "PCNA", ",", "and", "PAX6", "are", "increased", "in", "mH2A1", ".", "2", "KO", "mice", "compared", "with", "WT", ".", "(", "H", ")", "Statistics", "of", "the", "normalized", "density", "of", "TBR2", ",", "PCNA", ",", "and", "PAX6", ".", "n", "=", "5", "mice", ",", "independent", "replicates", ".", "Date", "information", ":", "Error", "bars", "represent", "the", "means", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ".", ";", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "*", ")", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ".", "(", "K", ")", "Coronal", "brain", "slices", "of", "E16", ".", "5", "WT", "mice", "and", "KO", "mice", "were", "immunostained", "using", "anti", "-", "TUJ1", ".", "Scale", "bar", "represents", "20", "μm", ".", "(", "L", ")", "Relative", "TUJ1", "+", "cells", "in", "the", "VZ", "of", "WT", "mice", "and", "KO", "mice", ".", "TUJ1", "was", "reduced", "in", "cortical", ".", "n", "=", "6", "mice", ",", "independent", "replicates", ".", "Date", "information", ":", "Representative", "images", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "means", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ".", ";", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "*", ")", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ".", "(", "M", ")", "The", "apoptosis", "levels", "between", "WT", "and", "KO", "brains", "showed", "no", "significant", "difference", ".", "E16", ".", "5", "brain", "sections", "of", "WT", "and", "KO", "mice", "were", "subjected", "to", "TUNEL", "assay", ".", "Scale", "bar", "represents", "50", "μm", ".", "(", "N", ")", "Graph", "shows", "the", "numbers", "of", "apoptotic", "cells", "per", "field", ".", "n", "=", "4mice", ",", "independent", "replicates", ".", "Date", "information", ":", "Representative", "images", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "means", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ".", ";", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "*", ")", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Representative images of E16.5 coronal brain sections immune stained for Tbr2 and BrdU. BrdU was injected intraperitoneally into pregnant mice at E16.5 for 2h of pulse labeling. Scale bar represents 20 μm. (B) Statistics of TBR2+ cells per 100μm2 surface of VZ/SVZ. The number of TBR2+ cells increased significantly in KO mice compared to WT mice. n=6 mice, independent replicates. (C) Statistics of BrdU+ cells per 100μm2 surface of VZ/SVZ. The number of BrdU+ cells increased significantly in KO mice compared to WT mice. n=6 mice, independent replicates. Date information: Representative images from at least three independent experiments. Error bars represent the means ± S.E.M.; Two-tailed unpaired t-test, P < 0.05(*). n.s., not significant.(E) Cell cycle exit was decreased in KO mice. E16.5 brain sections were stained with anti-BrdU and anti-Ki67 in WT mice and KO mice that were administered BrdU (100 mg/kg) for 24 h and harvested at E16.5. Scale bar represents 20 μm. (F) Percentage of cell cycle exit (BrdU+Ki67−/ BrdU+) in WT mice and KO mice. n=7 mice, independent replicates. Date information: Error bars represent the means ± S.E.M.; Two-tailed unpaired t-test, P < 0.05(*). n.s., not significant.(G)Western blot analysis showed that the protein expression levels of neural stem cell marker, including TBR2, PCNA, and PAX6 are increased in mH2A1.2 KO mice compared with WT. (H) Statistics of the normalized density of TBR2, PCNA, and PAX6. n=5 mice, independent replicates. Date information: Error bars represent the means ± S.E.M.; Two-tailed unpaired t-test, P < 0.05(*). n.s., not significant.(K) Coronal brain slices of E16.5 WT mice and KO mice were immunostained using anti-TUJ1. Scale bar represents 20 μm. (L) Relative TUJ1+ cells in the VZ of WT mice and KO mice. TUJ1 was reduced in cortical. n=6 mice, independent replicates. Date information: Representative images from at least three independent experiments. Error bars represent the means ± S.E.M.; Two-tailed unpaired t-test, P < 0.05(*). n.s., not significant.(M) The apoptosis levels between WT and KO brains showed no significant difference. E16.5 brain sections of WT and KO mice were subjected to TUNEL assay. Scale bar represents 50 μm. (N) Graph shows the numbers of apoptotic cells per field. n=4mice, independent replicates. Date information: Representative images from at least three independent experiments. Error bars represent the means ± S.E.M.; Two-tailed unpaired t-test, P < 0.05(*). n.s., not significant."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Representative", "images", "of", "neurons", "after", "4", "days", "of", "culture", "in", "vitro", ".", "GFP", "expressing", "plasmid", "was", "electroporated", "into", "the", "E13", ".", "5", "cerebral", "cortices", "of", "WT", "and", "KO", "mice", "to", "label", "neural", "progenitor", "cells", ".", "After", "24", "h", ",", "the", "GFP", "+", "cells", "were", "isolated", "and", "cultured", "in", "differentiation", "medium", "for", "4", "days", ".", "Scale", "bar", "represents", "15", "μm", ".", "(", "B", ")", "Graph", "shows", "that", "the", "total", "dendritic", "length", "of", "neurons", "is", "decreased", "when", "mH2A1", ".", "2", "is", "deleted", ".", "n", "=", "25", "cells", "from", "four", "samples", ".", "(", "C", ")", "Statistics", "show", "that", "the", "number", "of", "branch", "points", "is", "reduced", "upon", "mH2A1", ".", "2", "deletion", ".", "n", "=", "25", "cells", "from", "four", "samples", ".", "Date", "information", ":", "Representative", "images", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "means", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ".", ";", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "*", ")", ",", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "*", "*", ")", ".", "(", "F", ")", "The", "brain", "sections", "were", "immunostained", "with", "CUX1", "and", "CTIP2", "(", "marker", "of", "layer", "I", ";", "marker", "of", "layer", "V", ")", "at", "P0", ".", "Scale", "bar", "represents", "20", "μm", ".", "n", "=", "4", "mice", ",", "independent", "replicates", ".", "(", "G", ")", "Statistics", "of", "CUX1", "+", "cells", "in", "the", "upper", "layer", ".", "CUX1", "+", "cells", "were", "increased", "in", "KO", "mice", "n", "=", "4", "mice", ",", "independent", "replicates", ".", "(", "H", ")", "Statistics", "of", "CTIP2", "+", "cells", "in", "the", "deep", "layer", ".", "CTIP2", "+", "cells", "were", "reduced", "in", "KO", "mice", ".", "n", "=", "4", "mice", ",", "independent", "replicates", ".", "Date", "information", ":", "Representative", "images", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "means", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ".", ";", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "*", ")", ",", "P", "<", "0", ".", "01", "("], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Representative images of neurons after 4 days of culture in vitro. GFP expressing plasmid was electroporated into the E13.5 cerebral cortices of WT and KO mice to label neural progenitor cells. After 24 h, the GFP+ cells were isolated and cultured in differentiation medium for 4 days. Scale bar represents 15 μm. (B) Graph shows that the total dendritic length of neurons is decreased when mH2A1.2 is deleted. n = 25 cells from four samples. (C) Statistics show that the number of branch points is reduced upon mH2A1.2 deletion. n = 25 cells from four samples. Date information: Representative images from at least three independent experiments. Error bars represent the means ± S.E.M.; Two-tailed unpaired t-test, P < 0.05(*), P < 0.01(**).(F) The brain sections were immunostained with CUX1 and CTIP2 (marker of layer I; marker of layer V) at P0. Scale bar represents 20 μm. n=4 mice, independent replicates. (G) Statistics of CUX1+cells in the upper layer. CUX1+cells were increased in KO mice n=4 mice, independent replicates. (H)Statistics of CTIP2+ cells in the deep layer. CTIP2+ cells were reduced in KO mice. n=4 mice, independent replicates. Date information: Representative images from at least three independent experiments. Error bars represent the means ± S.E.M.; Two-tailed unpaired t-test, P < 0.05(*), P < 0.01("}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Representative", "tracing", "path", "of", "WT", "mice", "and", "KO", "mice", "in", "the", "open", "field", "test", ".", "(", "B", ")", "The", "total", "traveling", "distance", "was", "not", "different", "between", "WT", "and", "KO", "mice", ".", "(", "C", ")", "KO", "mice", "spent", "less", "time", "in", "the", "center", "than", "WT", "mice", ".", "Date", "information", ":", "All", "mice", "were", "male", ",", "8", "-", "12", "weeks", "old", ".", "WT", ",", "n", "=", "12", "mice", ";", "KO", ",", "n", "=", "12", "mice", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "means", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ".", ";", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "*", ")", ",", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "*", "*", ")", "or", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "*", "*", "*", ")", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ".", "Analysis", "was", "performed", "by", "researcher", "blinded", "to", "the", "experimental", "conditions", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Representative tracing path of WT mice and KO mice in the open field test. (B) The total traveling distance was not different between WT and KO mice. (C) KO mice spent less time in the center than WT mice. Date information: All mice were male, 8-12 weeks old. WT, n=12 mice; KO, n=12 mice. Error bars represent the means ± S.E.M.; Two-tailed unpaired t-test, P < 0.05 (*), P < 0.01(**) or P< 0.001(***). n.s., not significant. Analysis was performed by researcher blinded to the experimental conditions."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "E", ")", "Graph", "shows", "the", "percentage", "of", "GFP", "+", "cells", "in", "the", "VZ", "/", "SVZ", ",", "IZ", "and", "CP", ".", "The", "number", "of", "GFP", "+", "cells", "in", "the", "VZ", "/", "SVZ", "region", "increased", "significantly", ",", "and", "the", "number", "of", "GFP", "+", "in", "the", "CP", "layer", "decreased", "significantly", ".", "n", "=", "5", "mice", ",", "independent", "replicates", ".", "Date", "information", ":", "Error", "bars", "represent", "the", "means", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ".", ";", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "*", ")", ",", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "*", "*", ")", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ".", "(", "I", ")", "Representative", "images", "of", "E16", ".", "5", "cortices", "that", "had", "been", "electroporated", "with", "GFP", "or", "GFP", "+", "NKX2", ".", "2", "into", "WT", "and", "KO", "brains", "at", "E13", ".", "5", ".", "Scale", "bar", "represents", "50", "μm", ".", "(", "J", ")", "Graphs", "of", "the", "percentage", "of", "GFP", "+", "cells", "in", "the", "VZ", "/", "SVZ", ",", "IZ", "and", "CP", ".", "Overexpression", "of", "NKX2", "-", "2", "restored", "the", "distribution", "of", "GFP", "+", "cells", "to", "the", "normal", "state", ".", "n", "=", "5", "mice", ",", "independent", "replicates", ".", "Date", "information", ":", "Representative", "images", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "means", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ".", ";", "Two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "*", ")", ",", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "*", "*", ")", ".", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(E) Graph shows the percentage of GFP+ cells in the VZ/SVZ, IZ and CP. The number of GFP+ cells in the VZ/SVZ region increased significantly, and the number of GFP+ in the CP layer decreased significantly. n =5 mice, independent replicates. Date information: Error bars represent the means ± S.E.M.; Two-tailed unpaired t-test, P < 0.05 (*), P < 0.01(**). n.s., not significant.(I) Representative images of E16.5 cortices that had been electroporated with GFP or GFP+NKX2.2 into WT and KO brains at E13.5. Scale bar represents 50 μm. (J) Graphs of the percentage of GFP+ cells in the VZ/SVZ, IZ and CP. Overexpression of NKX2-2 restored the distribution of GFP+ cells to the normal state. n=5 mice, independent replicates. Date information: Representative images from at least three independent experiments. Error bars represent the means ± S.E.M.; Two-tailed unpaired t-test, P < 0.05 (*), P < 0.01(**). n.s., not significant."}
{"words": ["Figure", "4A", ")", "ALS", "patients", "from", "the", "UPenn", "Biobank", "neuroimaging", "cohort", "with", "higher", "wPRS", "exhibited", "greater", "reduction", "of", "cortical", "thickness", "in", "the", "orbital", "prefrontal", "cortex", ",", "anterior", "cingulate", "cortex", ",", "premotor", "cortex", ",", "lateral", "temporal", "cortex", ",", "and", "hippocampus", ".", "The", "heatmap", "indicates", "the", "associated", "T", "-", "statistic", "for", "each", "voxel", ",", "with", "light", "blue", "representing", "the", "highest", "value", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A) ALS patients from the UPenn Biobank neuroimaging cohort with higher wPRS exhibited greater reduction of cortical thickness in the orbital prefrontal cortex, anterior cingulate cortex, premotor cortex, lateral temporal cortex, and hippocampus. The heatmap indicates the associated T-statistic for each voxel, with light blue representing the highest value."}
{"words": ["Figure", "1Sites", "that", "bound", "either", "HIF", "-", "1α", "(", "A", "&", "B", ")", "or", "HIF", "-", "2α", "(", "C", "&", "D", ")", "in", "both", "replicates", "were", "identified", "by", "the", "MACS", "peak", "caller", "and", "ordered", "on", "the", "y", "-", "axis", "according", "to", "HIF", "-", "1β", "signal", "intensity", ".", "Heatmaps", "show", "HIF", "ChIP", "-", "seq", "signal", "(", "read", "counts", "per", "million", "mapped", "reads", ",", "CPM", ";", "expressed", "as", "colour", "intensity", ",", "averaged", "across", "two", "independent", "ChIP", "-", "seq", "experiments", ")", "at", "HIF", "binding", "sites", "and", "across", "the", "flanking", "±", "5kb", "regions", "(", "x", "-", "axis", ")", ".", "(", "A", ")", "HIF", "-", "1β", "signal", "intensity", "and", "(", "B", ")", "HIF", "-", "1α", "signal", "intensity", "at", "HIF", "-", "1α", "binding", "sites", "and", "(", "C", ")", "HIF", "-", "1β", "signal", "intensity", "and", "(", "D", ")", "HIF", "-", "2α", "signal", "intensity", "at", "HIF", "-", "2α", "binding", "sites", ".", "HIF", "-", "1β", "signal", "intensity", "above", "local", "background", "levels", "is", "observed", "at", "all", "HIF", "-", "1α", "and", "HIF", "-", "2α", "binding", "sites", ".", "(", "E", "&", "F", ")", "Line", "plots", "showing", "average", "(", "n", "=", "2", ",", "independent", "ChIP", "-", "seq", "experiments", ")", "HIF", "-", "1β", "signal", "intensity", "(", "solid", "blue", "lines", ")", "within", "the", "MACS", "defined", "(", "E", ")", "HIF", "-", "1α", "and", "(", "F", ")", "HIF", "-", "2α", "binding", "sites", "compared", "to", "the", "average", "background", "HIF", "-", "1β", "binding", "signal", "(", "dashed", "black", "line", ")", "at", "non", "-", "HIF", "-", "α", "-", "binding", "accessible", "sites", "(", "defined", "by", "FAIRE", "-", "seq", ")", ".", "Sites", "are", "ranked", "on", "the", "x", "-", "axis", "according", "to", "HIF", "-", "1β", "signal", ".", "HIF", "-", "1β", "signal", "intensity", "at", "both", "HIF", "-", "1α", "and", "HIF", "-", "2α", "binding", "sites", "was", "consistently", "above", "genome", "-", "wide", "background", "levels", ".", "(", "G", ")", "HIF", "-", "1β", "signal", "intensity", "was", "plotted", "against", "total", "HIF", "-", "α", "(", "HIF", "-", "1α", "+", "HIF", "-", "2α", ")", "signal", "intensity", "for", "all", "sites", "that", "bound", "one", "or", "more", "HIF", "subunits", ".", "Strong", "correlation", "was", "observed", "between", "HIF", "-", "α", "and", "HIF", "-", "1β", "signal", "intensities", ".", "(", "H", ")", "The", "ratio", "of", "total", "HIF", "-", "α", "signal", "to", "HIF", "-", "1β", "signal", "(", "x", "-", "axis", ")", "was", "determined", "for", "each", "site", "and", "plotted", "as", "a", "frequency", "distribution", "(", "y", "-", "axis", ")", "showing", "a", "tight", "unimodal", "distribution", ".", "(", "I", ")", "The", "non", "-", "reproducibility", "of", "the", "total", "HIF", "-", "α", "/", "HIF", "-", "1β", "ratio", "was", "assessed", "by", "plotting", "the", "ratio", "in", "replicate", "1", "versus", "that", "in", "replicate"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Sites that bound either HIF-1α (A & B) or HIF-2α (C&D) in both replicates were identified by the MACS peak caller and ordered on the y-axis according to HIF-1β signal intensity. Heatmaps show HIF ChIP-seq signal (read counts per million mapped reads, CPM; expressed as colour intensity, averaged across two independent ChIP-seq experiments) at HIF binding sites and across the flanking ±5kb regions (x-axis). (A) HIF-1β signal intensity and (B) HIF-1α signal intensity at HIF-1α binding sites and (C) HIF-1β signal intensity and (D) HIF-2α signal intensity at HIF-2α binding sites. HIF-1β signal intensity above local background levels is observed at all HIF-1α and HIF-2α binding sites. (E & F) Line plots showing average (n = 2, independent ChIP-seq experiments) HIF-1β signal intensity (solid blue lines) within the MACS defined (E) HIF-1α and (F) HIF-2α binding sites compared to the average background HIF-1β binding signal (dashed black line) at non-HIF-α-binding accessible sites (defined by FAIRE-seq). Sites are ranked on the x-axis according to HIF-1β signal. HIF-1β signal intensity at both HIF-1α and HIF-2α binding sites was consistently above genome-wide background levels. (G) HIF-1β signal intensity was plotted against total HIF-α (HIF-1α + HIF-2α) signal intensity for all sites that bound one or more HIF subunits. Strong correlation was observed between HIF-α and HIF-1β signal intensities. (H) The ratio of total HIF-α signal to HIF-1β signal (x-axis) was determined for each site and plotted as a frequency distribution (y-axis) showing a tight unimodal distribution. (I) The non-reproducibility of the total HIF-α/HIF-1β ratio was assessed by plotting the ratio in replicate 1 versus that in replicate 2"}
{"words": ["Figure", "2For", "each", "cell", "line", ",", "genes", "were", "ranked", "according", "to", "hypoxic", "induction", "(", "0", ".", "5", "%", "hypoxia", "for", "16", "hours", ")", "in", "RNA", "-", "seq", "analyses", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Enrichment", "of", "genes", "(", "TSS", ")", "closest", "to", "each", "canonical", "HIF", "-", "α", "/", "β", "binding", "site", "(", "i", ".", "e", ".", "identified", "in", "both", "HIF", "-", "1α", "(", "or", "HIF", "-", "2α", ")", "and", "both", "HIF", "-", "1β", "ChIP", "-", "seq", "experiments", ")", "was", "then", "examined", "using", "Gene", "Set", "Enrichment", "Analysis", "(", "ES", "=", "enrichment", "score", ",", "NES", "=", "normalized", "enrichment", "score", ")"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2For each cell line, genes were ranked according to hypoxic induction (0.5% hypoxia for 16 hours) in RNA-seq analyses (n = 3). Enrichment of genes (TSS) closest to each canonical HIF-α/β binding site (i.e. identified in both HIF-1α (or HIF-2α) and both HIF-1β ChIP-seq experiments) was then examined using Gene Set Enrichment Analysis (ES = enrichment score, NES = normalized enrichment score)"}
{"words": ["Figure", "3Immunoblots", "show", "progressive", "induction", "of", "HIF", "-", "1α", "and", "HIF", "-", "2α", "protein", "levels", "with", "increasing", "severity", "of", "hypoxiaHIF", "-", "1α", "ChIP", "-", "seq", "signal", "intensity", "(", "averaged", "across", "two", "independent", "ChIP", "-", "seq", "experiments", ")", "at", "0", ".", "5", "%", "hypoxia", "is", "plotted", "against", "that", "at", "3", "%", "hypoxia", "for", "all", "canonical", "HIF", "-", "binding", "sites", "that", "bound", "at", "one", "oxygen", "concentration", "or", "the", "other", "or", "both", ".", "ChIP", "-", "seq", "signal", "was", "increased", "at", "0", ".", "5", "%", "oxygen", ",", "but", "correlated", "well", "with", "that", "at", "3", "%", "oxygen", "and", "no", "new", "sites", "were", "generated", "(", "C", ")", "HIF", "-", "2α", "and", "(", "D", ")", "HIF", "-", "1β", "ChIP", "-", "seq", "signal", "intensity", "(", "averaged", "across", "two", "independent", "ChIP", "-", "seq", "experiments", ")", "at", "0", ".", "5", "%", "hypoxia", "is", "plotted", "against", "that", "at", "3", "%", "hypoxia", "for", "all", "canonical", "HIF", "-", "binding", "sites", "that", "bound", "at", "one", "oxygen", "concentration", "or", "the", "other", "or", "both", ".", "ChIP", "-", "seq", "signal", "was", "increased", "at", "0", ".", "5", "%", "oxygen", ",", "but", "correlated", "well", "with", "that", "at", "3", "%", "oxygen", "and", "no", "new", "sites", "were", "generatedFrequency", "distribution", "of", "ChIP", "-", "seq", "signals", "at", "0", ".", "5", "%", "oxygen", "compared", "to", "3", "%", "oxygen", ".", "The", "ratio", "of", "total", "HIF", "-", "α", "signal", "was", "unimodally", "distributed", "(", "purple", "line", ")", ".", "Upper", "tertile", "HIF", "-", "α", "sites", "(", "solid", "red", "line", ")", "had", "a", "significantly", "(", "p", "=", "10", "-", "7", ",", "Wilcox", "rank", "sum", "test", ")", "higher", "ratio", "of", "HIF", "-", "1β", "signal", "(", "dotted", "red", "line", ")", "and", "vice", "versa", "(", "blue", "lines", ")", "The", "ratio", "of", "HIF", "-", "1α", "to", "HIF", "-", "2α", "ChIP", "-", "seq", "signal", "for", "all", "canonical", "HIF", "-", "binding", "sites", "at", "0", ".", "5", "%", "oxygen", "was", "plotted", "against", "that", "at", "3", "%", "oxygen", ".", "Strong", "correlation", "in", "the", "HIF", "-", "1α", "to", "HIF", "-", "2α", "ratio", "was", "observed", "between", "the", "two", "oxygen"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Immunoblots show progressive induction of HIF-1α and HIF-2α protein levels with increasing severity of hypoxiaHIF-1α ChIP-seq signal intensity (averaged across two independent ChIP-seq experiments) at 0.5% hypoxia is plotted against that at 3% hypoxia for all canonical HIF-binding sites that bound at one oxygen concentration or the other or both. ChIP-seq signal was increased at 0.5% oxygen, but correlated well with that at 3% oxygen and no new sites were generated(C) HIF-2α and (D) HIF-1β ChIP-seq signal intensity (averaged across two independent ChIP-seq experiments) at 0.5% hypoxia is plotted against that at 3% hypoxia for all canonical HIF-binding sites that bound at one oxygen concentration or the other or both. ChIP-seq signal was increased at 0.5% oxygen, but correlated well with that at 3% oxygen and no new sites were generatedFrequency distribution of ChIP-seq signals at 0.5% oxygen compared to 3% oxygen. The ratio of total HIF-α signal was unimodally distributed (purple line). Upper tertile HIF-α sites (solid red line) had a significantly (p = 10-7, Wilcox rank sum test) higher ratio of HIF-1β signal (dotted red line) and vice versa (blue lines)The ratio of HIF-1α to HIF-2α ChIP-seq signal for all canonical HIF-binding sites at 0.5% oxygen was plotted against that at 3% oxygen. Strong correlation in the HIF-1α to HIF-2α ratio was observed between the two oxygen concentrations"}
{"words": ["Figure", "4Immunoblots", "show", "induction", "of", "HIF", "-", "1α", "and", "HIF", "-", "2α", "protein", "level", ",", "which", "is", "highest", "at", "6", "hours", "and", "falls", "by", "48", "hoursHIF", "-", "1α", ",", "(", "C", ")", "HIF", "-", "2α", "and", "(", "D", ")", "HIF", "-", "1β", "ChIP", "-", "seq", "signal", "intensity", "(", "averaged", "across", "two", "independent", "ChIP", "-", "seq", "experiments", ")", "at", "16", "hours", "is", "plotted", "against", "that", "at", "6", "hours", "for", "all", "canonical", "HIF", "-", "binding", "sites", "that", "bound", "at", "any", "of", "the", "three", "timepoints", ".", "ChIP", "-", "seq", "signal", "was", "increased", "at", "16", "hours", "hypoxia", "compared", "to", "6", "hours", "hypoxia", ",", "but", "correlated", "well", "between", "the", "two", "timepoints", "and", "no", "novel", "sites", "were", "observed", "at", "either", "timepoint", ".", "(", "E", "-", "F", ")", "The", "same", "plots", "comparing", "(", "E", ")", "HIF", "-", "1α", ",", "(", "F", ")", "HIF", "-", "2α", "and", "(", "G", ")", "HIF", "-", "1β", "ChIP", "-", "seq", "signals", "at", "48", "hours", "and", "6", "hours", "hypoxia", ".", "ChIP", "-", "seq", "signal", "at", "48", "hours", "correlated", "well", "with", "that", "at", "6", "hours", "and", "again", "no", "novel", "sites", "were", "observed", "at", "either", "timepointFrequency", "distribution", "of", "ChIP", "-", "seq", "signals", "at", "48", "hours", "compared", "to", "6", "hours", "hypoxia", ".", "The", "ratio", "of", "total", "HIF", "-", "α", "signal", "had", "a", "unimodal", "distribution", "(", "purple", "line", ")", ".", "However", ",", "upper", "tertile", "HIF", "-", "α", "sites", "(", "solid", "red", "line", ")", "had", "a", "comparable", "ratio", "of", "HIF", "-", "1β", "signal", "(", "dotted", "red", "line", ")", "to", "the", "ratio", "of", "HIF", "-", "1β", "signal", "in", "the", "lower", "tertile", "HIF", "-", "α", "sites", "(", "blue", "lines", ")", "suggesting", "that", "differences", "in", "HIF", "-", "α", "signal", "resulted", "from", "random", "variation", "rather", "than", "a", "true", "biological", "differenceThe", "ratio", "of", "HIF", "-", "1α", "to", "HIF", "-", "2α", "ChIP", "-", "seq", "signal", "for", "all", "canonical", "HIF", "-", "binding", "sites", "at", "(", "I", ")", "16", "hours", "hypoxia", "and", "at", "(", "J", ")", "48", "hours", "hypoxia", "was", "plotted", "against", "that", "at", "6", "hours", "hypoxia", ".", "Strong", "correlation", "in", "the", "HIF", "-", "1α", "to", "HIF", "-", "2α", "ratio", "was", "observed", "between", "the", "various"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Immunoblots show induction of HIF-1α and HIF-2α protein level, which is highest at 6 hours and falls by 48 hoursHIF-1α, (C) HIF-2α and (D) HIF-1β ChIP-seq signal intensity (averaged across two independent ChIP-seq experiments) at 16 hours is plotted against that at 6 hours for all canonical HIF-binding sites that bound at any of the three timepoints. ChIP-seq signal was increased at 16 hours hypoxia compared to 6 hours hypoxia, but correlated well between the two timepoints and no novel sites were observed at either timepoint. (E-F) The same plots comparing (E) HIF-1α, (F) HIF-2α and (G) HIF-1β ChIP-seq signals at 48 hours and 6 hours hypoxia. ChIP-seq signal at 48 hours correlated well with that at 6 hours and again no novel sites were observed at either timepointFrequency distribution of ChIP-seq signals at 48 hours compared to 6 hours hypoxia. The ratio of total HIF-α signal had a unimodal distribution (purple line). However, upper tertile HIF-α sites (solid red line) had a comparable ratio of HIF-1β signal (dotted red line) to the ratio of HIF-1β signal in the lower tertile HIF-α sites (blue lines) suggesting that differences in HIF-α signal resulted from random variation rather than a true biological differenceThe ratio of HIF-1α to HIF-2α ChIP-seq signal for all canonical HIF-binding sites at (I) 16 hours hypoxia and at (J) 48 hours hypoxia was plotted against that at 6 hours hypoxia. Strong correlation in the HIF-1α to HIF-2α ratio was observed between the various timepoints"}
{"words": ["Figure", "5Cells", "were", "incubated", "in", "0", ".", "5", "%", "ambient", "oxygen", "for", "16", "hours", ".", "Immunoblots", "show", "HIF", "-", "1α", ",", "HIF", "-", "2α", "and", "HIF", "-", "1β", "protein", "levels", "in", "the", "wild", "type", "and", "single", "clones", "of", "CRISPR", "-", "Cas9", "engineered", "cell", "linesHIF", "-", "1α", "ChIP", "-", "seq", "signal", "in", "the", "HIF", "-", "2α", "KO", "cells", "was", "plotted", "against", "that", "in", "the", "wild", "-", "type", "cells", "for", "all", "canonical", "HIF", "-", "1", "binding", "sites", "in", "either", "cell", "typeHIF", "-", "2α", "ChIP", "-", "seq", "signal", "in", "the", "HIF", "-", "1α", "KO", "cells", "was", "plotted", "against", "that", "in", "the", "wild", "-", "type", "cells", "for", "all", "canonical", "HIF", "-", "2", "binding", "sites", "in", "either", "cell", "type", ".", "No", "significant", "increase", "(", "Wilcoxon", "rank", "sum", "test", ")", "in", "binding", "of", "either", "isoform", "was", "observed", "following", "deletion", "of", "the", "otherBox", "-", "and", "-", "whisker", "plots", "showing", ":", "(", "D", ")", "The", "effect", "of", "HIF", "-", "2α", "inactivation", "on", "HIF", "-", "1α", "ChIP", "-", "seq", "signal", "at", "sites", "that", "specifically", "bound", "HIF", "-", "2α", ",", "but", "not", "HIF", "-", "1α", "in", "wild", "-", "type", "cells", "showing", "a", "slight", ",", "but", "significant", "(", "p", "=", "4", "x", "10", "-", "5", ",", "Wilcoxon", "signed", "rank", "test", ")", "decrease", "rather", "than", "increase", "(", "compare", "red", "boxes", ")", "consistent", "with", "the", "reduction", "in", "HIF", "-", "1α", "protein", "observed", "in", "panel", "AThe", "effect", "of", "HIF", "-", "1α", "inactivation", "on", "HIF", "-", "2α", "ChIP", "-", "seq", "signal", "(", "compare", "blue", "boxes", ")", "at", "sites", "that", "specifically", "bound", "HIF", "-", "1α", ",", "but", "not", "HIF", "-", "2α", "in", "wild", "-", "type", "cells", "showing", "no", "significant", "effect", "(", "p", "=", "0", ".", "5", ",", "Wilcoxon", "signed", "rank", "test", ")", "The", "effect", ",", "at", "sites", "that", "bind", "both", "isoforms", "in", "wild", "-", "type", "cells", ",", "of", "(", "F", ")", "HIF", "-", "2α", "inactivation", "on", "HIF", "-", "1α", "binding", "intensity", "showing", "a", "similar", "small", "but", "significant", "reduction", "rather", "than", "increase", "(", "p", "=", "2", "x", "10", "-", "16", ",", "Wilcoxon", "Signed", "rank", "test", ")", "as", "abovThe", "effect", ",", "at", "sites", "that", "bind", "both", "isoforms", "in", "wild", "-", "type", "cells", ",", "o", "HIF", "-", "1α", "inactivation", "on", "HIF", "-", "2α", "binding", "intensity", "showing", "no", "significant", "effect", "(", "p", "=", "0", ".", "4", ",", "Wilcoxon", "signed", "rank", "test", ")"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Cells were incubated in 0.5% ambient oxygen for 16 hours. Immunoblots show HIF-1α, HIF-2α and HIF-1β protein levels in the wild type and single clones of CRISPR-Cas9 engineered cell linesHIF-1α ChIP-seq signal in the HIF-2α KO cells was plotted against that in the wild-type cells for all canonical HIF-1 binding sites in either cell typeHIF-2α ChIP-seq signal in the HIF-1α KO cells was plotted against that in the wild-type cells for all canonical HIF-2 binding sites in either cell type. No significant increase (Wilcoxon rank sum test) in binding of either isoform was observed following deletion of the otherBox-and-whisker plots showing: (D) The effect of HIF-2α inactivation on HIF-1α ChIP-seq signal at sites that specifically bound HIF-2α, but not HIF-1α in wild-type cells showing a slight, but significant (p = 4 x 10-5, Wilcoxon signed rank test) decrease rather than increase (compare red boxes) consistent with the reduction in HIF-1α protein observed in panel AThe effect of HIF-1α inactivation on HIF-2α ChIP-seq signal (compare blue boxes) at sites that specifically bound HIF-1α, but not HIF-2α in wild-type cells showing no significant effect (p = 0.5, Wilcoxon signed rank test)The effect, at sites that bind both isoforms in wild-type cells, of (F) HIF-2α inactivation on HIF-1α binding intensity showing a similar small but significant reduction rather than increase (p = 2 x 10-16, Wilcoxon Signed rank test) as abovThe effect, at sites that bind both isoforms in wild-type cells, o HIF-1α inactivation on HIF-2α binding intensity showing no significant effect (p = 0.4, Wilcoxon signed rank test)"}
{"words": ["Figure", "6Canonical", "HIF", "-", "1", "and", "HIF", "-", "2", "binding", "sites", "were", "determined", "by", "overlap", "of", "HIF", "-", "α", "and", "HIF", "-", "1β", "binding", "sites", "identified", "by", "the", "MACS", "peak", "caller", "as", "for", "Figure", "4", ".", "The", "distance", "from", "each", "binding", "site", "to", "the", "nearest", "annotated", "gene", "promoter", "was", "determined", "and", "plotted", "as", "a", "frequency", "distribution", "for", "(", "A", ")", "HIF", "-", "1", "and", "(", "B", ")", "HIF", "-", "2", "sites", "in", "HKC", "-", "8", "cells", ",", "(", "C", ")", "HIF", "-", "1", "and", "(", "D", ")", "HIF", "-", "2", "sites", "in", "RCC4", "cells", ",", "(", "E", ")", "HIF", "-", "1", "and", "(", "F", ")", "HIF", "-", "2", "sites", "in", "HepG2", "cells", ".", "The", "distribution", "of", "HIF", "-", "1", "binding", "sites", "was", "consistently", "more", "promoter", "proximal", "than", "HIF", "-", "2", "sites", "despite", "the", "sites", "themselves", "differing", "between", "cell", "typesThe", "distribution", "of", "accessible", "HRE", "motifs", "was", "also", "plotted", "in", "HepG2", "cells", "and", "differed", "significantly", "from", "that", "of", "both", "HIF", "-", "1", "(", "p", "~", "10", "-", "50", ")", "and", "HIF", "-", "2", "(", "p", "~", "10", "-", "80", ")", "binding", "sites", "(", "Chi", "-", "squared", "test", ")"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Canonical HIF-1 and HIF-2 binding sites were determined by overlap of HIF-α and HIF-1β binding sites identified by the MACS peak caller as for Figure 4. The distance from each binding site to the nearest annotated gene promoter was determined and plotted as a frequency distribution for (A) HIF-1 and (B) HIF-2 sites in HKC-8 cells, (C) HIF-1 and (D) HIF-2 sites in RCC4 cells, (E) HIF-1 and (F) HIF-2 sites in HepG2 cells. The distribution of HIF-1 binding sites was consistently more promoter proximal than HIF-2 sites despite the sites themselves differing between cell typesThe distribution of accessible HRE motifs was also plotted in HepG2 cells and differed significantly from that of both HIF-1 (p~10-50) and HIF-2 (p~10-80) binding sites (Chi-squared test)"}
{"words": ["Figure", "7Immunoblots", "showing", "HIF", "-", "1α", ",", "HIF", "-", "2α", "and", "HIF", "-", "1β", "protein", "levels", "in", "HKC", "-", "8", ",", "HepG2", ",", "RCC4", "and", "MCF", "-", "7", "cell", "lines", "in", "normoxia", "and", "following", "16", "hours", "incubation", "at", "0", ".", "5", "%", "oxygenSites", "that", "bound", "(", "B", ")", "canonical", "HIF", "-", "1", "(", "i", ".", "e", ".", "identified", "in", "both", "HIF", "-", "1α", "and", "both", "HIF", "-", "1β", "ChIP", "-", "seq", "experiments", ")", "or", "(", "C", ")", "canonical", "HIF", "-", "2", "(", "i", ".", "e", ".", "identified", "in", "both", "HIF", "-", "2α", "and", "both", "HIF", "-", "1β", "ChIP", "-", "seq", "experiments", ")", "were", "identified", "from", "ChIP", "-", "seq", "datasets", "in", "HepG2", "and", "HKC", "-", "8", "cells", "following", "16", "hours", "incubation", "in", "0", ".", "5", "%", "oxygen", "and", "from", "normoxic", "RCC4", "cells", "and", "compared", "with", "previously", "published", "data", "from", "MCF", "-", "7", "cells", ".", "(", "D", ")", "The", "proportion", "of", "total", "HIF", "-", "1", "or", "HIF", "-", "2", "sites", "that", "were", "shared", "between", "2", ",", "3", "or", "4", "cell", "lines", "is", "plotted", ".", "For", "sites", "that", "are", "shared", "between", "(", "E", ")", "HepG2", "and", "HKC", "-", "8", "cells", ",", "(", "F", ")", "HKC", "-", "8", "and", "RCC4", "cells", ",", "or", "(", "G", ")", "RCC4", "and", "HepG2", "cells", ",", "the", "ratio", "of", "HIF", "-", "1α", "/", "HIF", "-", "2α", "signal", "for", "one", "cell", "line", "was", "plotted", "against", "the", "other", ".", "The", "ratio", "of", "HIF", "-", "1α", "/", "HIF", "-", "2α", "in", "one", "cell", "line", "correlates", "well", "with", "that", "in", "the", "other", ".", "ChIP", "-", "seq", "signal", "is", "averaged", "across", "two", "independent"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Immunoblots showing HIF-1α, HIF-2α and HIF-1β protein levels in HKC-8, HepG2, RCC4 and MCF-7 cell lines in normoxia and following 16 hours incubation at 0.5% oxygenSites that bound (B) canonical HIF-1 (i.e. identified in both HIF-1α and both HIF-1β ChIP-seq experiments) or (C) canonical HIF-2 (i.e. identified in both HIF-2α and both HIF-1β ChIP-seq experiments) were identified from ChIP-seq datasets in HepG2 and HKC-8 cells following 16 hours incubation in 0.5% oxygen and from normoxic RCC4 cells and compared with previously published data from MCF-7 cells. (D) The proportion of total HIF-1 or HIF-2 sites that were shared between 2, 3 or 4 cell lines is plotted. For sites that are shared between (E) HepG2 and HKC-8 cells, (F) HKC-8 and RCC4 cells, or (G) RCC4 and HepG2 cells, the ratio of HIF-1α/HIF-2α signal for one cell line was plotted against the other. The ratio of HIF-1α/HIF-2α in one cell line correlates well with that in the other. ChIP-seq signal is averaged across two independent experiments"}
{"words": ["Figure", "8Heatmaps", "showing", "average", "(", "n", "=", "2", ",", "independent", "ChIP", "-", "seq", "experiments", ")", "ChIP", "-", "seq", "signal", "(", "read", "counts", "per", "million", "mapped", "reads", ",", "CPM", ";", "expressed", "as", "colour", "intensity", ")", "at", "canonical", "HIF", "-", "1", "and", "HIF", "-", "2", "binding", "sites", "and", "across", "the", "flanking", "±", "5kb", "regions", "(", "x", "-", "axis", ")", "in", "HepG2", "cells", "incubated", "in", "0", ".", "5", "%", "oxygen", "for", "16", "hours", ".", "Sites", "are", "ordered", "on", "the", "y", "-", "axis", "according", "to", "HIF", "signal", "derived", "from", "HepG2", "cells", "incubated", "in", "hypoxia", ".", "ChIP", "-", "seq", "signal", "for", "histone", "modifications", "was", "obtained", "from", "ENCODE", "and", "was", "derived", "from", "HepG2", "cells", "incubated", "in", "normoxiaBar", "chart", "showing", "enrichment", "of", "transcription", "factor", "binding", "sites", "(", "TFBS", ")", "at", "canonical", "HIF", "-", "1", "and", "HIF", "-", "2", "sites", "in", "HepG2", "cells", "(", "identified", "as", "in", "Figure", "4", ")", ".", "TFBSs", "for", "61", "additional", "DNA", "-", "binding", "proteins", "were", "determined", "from", "ENCODE", "ChIP", "-", "seq", "data", "in", "normoxic", "HepG2", "cells", ".", "The", "significance", "of", "the", "overlap", "between", "each", "set", "of", "binding", "sites", "and", "canonical", "HIF", "-", "1", "and", "HIF", "-", "2", "sites", ",", "was", "determined", "using", "a", "hypergeometric", "test", ".", "Accessible", "sites", "determined", "from", "ENCODE", "DNAse", "-", "seq", "data", "in", "HepG2", "cells", "was", "used", "as", "a", "negative"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8Heatmaps showing average (n = 2, independent ChIP-seq experiments) ChIP-seq signal (read counts per million mapped reads, CPM; expressed as colour intensity) at canonical HIF-1 and HIF-2 binding sites and across the flanking ±5kb regions (x-axis) in HepG2 cells incubated in 0.5% oxygen for 16 hours. Sites are ordered on the y-axis according to HIF signal derived from HepG2 cells incubated in hypoxia. ChIP-seq signal for histone modifications was obtained from ENCODE and was derived from HepG2 cells incubated in normoxiaBar chart showing enrichment of transcription factor binding sites (TFBS) at canonical HIF-1 and HIF-2 sites in HepG2 cells (identified as in Figure 4). TFBSs for 61 additional DNA-binding proteins were determined from ENCODE ChIP-seq data in normoxic HepG2 cells. The significance of the overlap between each set of binding sites and canonical HIF-1 and HIF-2 sites, was determined using a hypergeometric test. Accessible sites determined from ENCODE DNAse-seq data in HepG2 cells was used as a negative control"}
{"words": ["Figure", "1Flow", "cytometric", "evaluation", "of", "CXCR4", "surface", "expression", "using", "an", "anti", "-", "CXCR4", "-", "PE", "antibody", ".", "Left", ":", "positive", "patient", ";", "right", ":", "negative", "patient", ";", "representative", "data", "are", "shown", ".", "The", "gating", "strategy", "is", "depicted", "in", "Supplementary", "Fig", "S1", ".", "Representative", "histograms", "revealing", "the", "magnitude", "of", "CXCR4", "expression", "in", "myeloma", "cells", "as", "compared", "to", "the", "indicated", "bone", "marrow", "cell", "subtype", ".", "Median", "fluorescence", "intensity", "of", "surface", "CXCR4", "expression", "relative", "to", "isotype", "control", "(", "n", "=", "7", "-", "10", "patients", ")", ".", "Horizontal", "bars", "indicate", "mean", "of", "all", "individual", "patient", "values", ";", "asterisks", "indicate", "statistical", "significance", "(", "plasma", "cells", "vs", "B", "cells", ":", "P", "=", "0", ".", "0082", ";", "plasma", "cells", "vs", "T", "cells", ":", "P", "=", "0", ".", "0091", ";", "plasma", "cells", "vs", "CD34", "+", "cells", ":", "P", "=", "0", ".", "011", ";", "plasma", "cells", "vs", "monocytes", ":", "P", "=", "0", ".", "0423", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "to", "compare", "mean", "plasmacell", "relative", "expression", "with", "mean", "relative", "expression", "of", "each", "further", "indicated", "cell", "subtype", ")", ".", "MM", "patients", "judged", "positive", "for", "CXCR4", "expression", "were", "selected", "for", "this", "analysis", ".", "Representative", "MM", "bone", "marrow", "staining", "of", "a", "patient", "positive", "for", "MM", "CXCR4", "expression", ":", "hematoxylin", "and", "eosin", "(", "H", "&", "amp", ";", "amp", ";", "E", ")", "staining", ".", "Immunohistochemistry", "for", "CD138", ",", "CXCR4", ",", "light", "chain", "kappa", ",", "and", "light", "chain", "lambda", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Flow cytometric evaluation of CXCR4 surface expression using an anti-CXCR4-PE antibody. Left: positive patient; right: negative patient; representative data are shown. The gating strategy is depicted in Supplementary Fig S1.Representative histograms revealing the magnitude of CXCR4 expression in myeloma cells as compared to the indicated bone marrow cell subtype.Median fluorescence intensity of surface CXCR4 expression relative to isotype control (n = 7-10 patients). Horizontal bars indicate mean of all individual patient values; asterisks indicate statistical significance (plasma cells vs B cells: P = 0.0082; plasma cells vs T cells: P = 0.0091; plasma cells vs CD34+ cells: P = 0.011; plasma cells vs monocytes: P = 0.0423; Student's t-test to compare mean plasmacell relative expression with mean relative expression of each further indicated cell subtype). MM patients judged positive for CXCR4 expression were selected for this analysis.Representative MM bone marrow staining of a patient positive for MM CXCR4 expression: hematoxylin and eosin (H&amp;amp;E) staining. Immunohistochemistry for CD138, CXCR4, light chain kappa, and light chain lambda."}
{"words": ["Figure", "2Real", "-", "time", "PCR", "analysis", "of", "cxcr4", "transcript", "expression", "levels", "in", "HeLa", "(", "negative", "control", ")", "and", "in", "MM", "cell", "lines", "MM", ".", "1S", "and", "OPM", "-", "2", ".", "Shown", "is", "the", "mean", "relative", "expression", "±", "SEM", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "Values", "are", "normalized", "to", "the", "expression", "of", "ubiquitin", "(", "Ub", ")", ".", "The", "asterisk", "indicates", "statistically", "significant", "differences", "(", "HeLa", "vs", "MM", ".", "1S", ":", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "HeLa", "vs", "OPM", "-", "2", ":", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "CXCR4", "protein", "expression", "assessed", "by", "immunoblotting", "(", "one", "representative", "blot", "out", "of", "3", "is", "shown", ")", ".", "Binding", "of", "[", "68Ga", "]", "Pentixafor", "to", "MM", ".", "1S", "and", "OPM", "-", "2", "cells", "after", "the", "indicated", "incubation", "periods", "(", "n", "=", "3", "per", "cell", "line", "and", "time", "point", ")", ".", "Shown", "is", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "The", "difference", "between", "the", "OPM", "-", "2", "groups", "is", "statistically", "significant", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "0017", "(", "one", "-", "way", "ANOVA", ")", ".", "Mean", "tumor", "-", "to", "-", "background", "ratio", "(", "TBR", ")", "for", "[", "18F", "]", "FDG", "(", "left", ")", "and", "for", "[", "68Ga", "]", "Pentixafor", "(", "right", ")", "in", "MM", ".", "1S", "and", "OPM", "-", "2", "xenograft", "-", "bearing", "NOD", "SCID", "mice", ".", "Shown", "is", "the", "mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "8", "tumors", "(", "4", "mice", ")", ";", "*", "P", "=", "0", ".", "0111", "for", "[", "18F", "]", "FDG", "and", "*", "P", "=", "0", ".", "0113", "for", "[", "68Ga", "]", "Pentixafor", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "revealed", "significant", "differences", "between", "the", "groups", ";", "P", "<", "0", ".", "0001", "(", "not", "graphically", "shown", ")", ".", "Representative", "[", "68Ga", "]", "Pentixafor", "PET", "images", "of", "three", "mice", "bearing", "MM", ".", "1S", "(", "right", "shoulder", ")", "and", "OPM", "-", "2", "(", "left", "shoulder", ")", "tumors", ".", "Flow", "cytometric", "quantification", "of", "CXCR4", "cell", "surface", "expression", "on", "resected", "MM", ".", "1S", "and", "OPM", "-", "2", "tumors", ".", "Data", "are", "the", "mean", "±", "SEM", ",", "n", "=", "4", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "0286", ";", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", ".", "Correlation", "of", "[", "68Ga", "]", "Pentixafor", "PET", "mean", "TBR", "and", "CXCR4", "cell", "surface", "expression", "assessed", "by", "flow", "cytometry", ".", "n", "=", "8", "tumors", "were", "analyzed", ".", "Mice", "(", "n", "=", "4", ")", "bearing", "OPM", "-", "2", "and", "MM", ".", "1S", "xenografts", "were", "coinjected", "with", "AMD3100", "(", "right", "image", ",", "one", "representative", "mouse", ")", "or", "not", "pretreated", "(", "left", "image", ")", "before", "undergoing", "[", "68Ga", "]", "PentixaforPET", ".", "The", "white", "arrows", "point", "to", "the", "bladder", ".", "Quantification", "is", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", "S3A", ".", "Source", "data", "are", "available", "online", "for", "this", "figure", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Real-time PCR analysis of cxcr4 transcript expression levels in HeLa (negative control) and in MM cell lines MM.1S and OPM-2. Shown is the mean relative expression ± SEM (n = 3 independent experiments). Values are normalized to the expression of ubiquitin (Ub). The asterisk indicates statistically significant differences (HeLa vs MM.1S: P < 0.001; HeLa vs OPM-2: P < 0.0001; Student's t-test).CXCR4 protein expression assessed by immunoblotting (one representative blot out of 3 is shown).Binding of [68Ga]Pentixafor to MM.1S and OPM-2 cells after the indicated incubation periods (n = 3 per cell line and time point). Shown is the mean ± SEM. The difference between the OPM-2 groups is statistically significant; *P < 0.0017 (one-way ANOVA).Mean tumor-to-background ratio (TBR) for [18F]FDG (left) and for [68Ga]Pentixafor (right) in MM.1S and OPM-2 xenograft-bearing NOD SCID mice. Shown is the mean ± SEM, n = 8 tumors (4 mice); *P = 0.0111 for [18F]FDG and *P = 0.0113 for [68Ga]Pentixafor (Student's t-test). One-way ANOVA revealed significant differences between the groups; P < 0.0001 (not graphically shown).Representative [68Ga]Pentixafor PET images of three mice bearing MM.1S (right shoulder) and OPM-2 (left shoulder) tumors.Flow cytometric quantification of CXCR4 cell surface expression on resected MM.1S and OPM-2 tumors. Data are the mean ± SEM, n = 4. *P = 0.0286; Mann-Whitney U-test.Correlation of [68Ga]Pentixafor PET mean TBR and CXCR4 cell surface expression assessed by flow cytometry. n = 8 tumors were analyzed.Mice (n = 4) bearing OPM-2 and MM.1S xenografts were coinjected with AMD3100 (right image, one representative mouse) or not pretreated (left image) before undergoing [68Ga]PentixaforPET. The white arrows point to the bladder. Quantification is shown in Supplementary Fig S3A.Source data are available online for this figure."}
{"words": ["Figure", "3", "[", "68Ga", "]", "PentixaforPET", "/", "CT", "and", "[", "18F", "]", "FDGPET", "/", "CTA", "-", "D", "Maximum", "intensity", "projections", "(", "MIP", ")", "of", "[", "68Ga", "]", "Pentixafor", "(", "A", ")", "and", "[", "18F", "]", "FDGPET", "/", "CT", "(", "B", ")", "of", "a", "68", "-", "year", "-", "old", "male", "with", "histologically", "proven", "multiple", "myeloma", "indicating", "the", "better", "lesion", "-", "to", "-", "background", "contrast", "for", "[", "68Ga", "]", "Pentixafor", "in", "the", "corresponding", "myeloma", "manifestations", ".", "Trans", "-", "axial", "views", "of", "the", "upper", "thorax", "(", "C", ")", "and", "the", "pelvis", "(", "D", ")", "underline", "the", "higher", "uptake", "values", "of", "the", "bone", "manifestations", "(", "yellow", "arrows", ")", "of", "[", "68Ga", "]", "Pentixafor", "compared", "to", "[", "18F", "]", "FDG", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3[68Ga]PentixaforPET/CT and [18F]FDGPET/CTA-D Maximum intensity projections (MIP) of [68Ga]Pentixafor (A) and [18F]FDGPET/CT (B) of a 68-year-old male with histologically proven multiple myeloma indicating the better lesion-to-background contrast for [68Ga]Pentixafor in the corresponding myeloma manifestations. Trans-axial views of the upper thorax (C) and the pelvis (D) underline the higher uptake values of the bone manifestations (yellow arrows) of [68Ga]Pentixafor compared to [18F]FDG."}
{"words": ["Figure", "4Visual", "comparison", "of", "[", "18F", "]", "FDG", "-", "and", "[", "68Ga", "]", "Pentixafor", "PET", "scansNumber", "of", "patients", "with", "visual", "positivity", "for", "the", "indicated", "PET", "tracer", "(", "total", ":", "n", "=", "14", ")", ".", "Number", "of", "patients", "(", "total", "n", "=", "14", ")", "for", "whom", "imaging", "with", "[", "18F", "]", "FDG", "PET", "(", "FDG", ",", "n", "=", "2", ")", "or", "[", "68Ga", "]", "Pentixafor", "PET", "(", "Pentixafor", ",", "n", "=", "7", ")", "was", "superior", ",", "with", "comparable", "positivity", "(", "comparable", ",", "n", "=", "3", ")", ",", "and", "with", "dual", "imaging", "providing", "complementary", "visual", "information", "(", "complementary", ",", "n", "=", "2", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Visual comparison of [18F]FDG- and [68Ga]Pentixafor PET scansNumber of patients with visual positivity for the indicated PET tracer (total: n = 14).Number of patients (total n = 14) for whom imaging with [18F]FDG PET (FDG, n = 2) or [68Ga]Pentixafor PET (Pentixafor, n = 7) was superior, with comparable positivity (comparable, n = 3), and with dual imaging providing complementary visual information (complementary, n = 2)."}
{"words": ["Figure", "5", "[", "68Ga", "]", "PentixaforPET", "/", "MRimagesA", "-", "C", "Coronal", "views", "of", "[", "68Ga", "]", "Pentixafor", "(", "A", ")", ",", "T2", "STIR", "weighted", "MRI", "(", "B", ")", "and", "CTbone", "window", "(", "C", ")", "of", "a", "maleuptake", "with", "histologically", "proven", "multiple", "myeloma", ".", "The", "increased", "[", "68Ga", "]", "Pentixaforbone", "correlates", "with", "the", "hyperintense", "T2", "STIR", "signal", ";", "however", ",", "the", "myeloma", "manifestations", "are", "underestimated", "in", "the", "corresponding", "bone", "window", "CT", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5[68Ga]PentixaforPET/MRimagesA-C Coronal views of [68Ga]Pentixafor (A), T2 STIR weighted MRI (B) and CTbone window (C) of a maleuptake with histologically proven multiple myeloma. The increased [68Ga]Pentixaforbone correlates with the hyperintense T2 STIR signal; however, the myeloma manifestations are underestimated in the corresponding bone window CT."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", "′", ")", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "pEGFP", "-", "RAB11", "were", "fixed", "in", "basal", "conditions", "and", "stained", "for", "mATG9", ".", "Pearson", "'", "s", "coefficient", ":", "0", ".", "452", "±", "0", ".", "034", "(", "SEM", ")", ".", "(", "A", "″", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "ATG9L1", "-", "pEGFP", ",", "fixed", "in", "basal", "condition", ",", "and", "labeled", "for", "RAB11", ".", "Pearson", "'", "s", "coefficient", ":", "0", ".", "413", "±", "0", ".", "020", "(", "SEM", ")", ".", "(", "B", ")", "HeLa", "cells", "were", "incubated", "for", "1", "hr", "at", "37", "°", "C", "or", "18", "°", "C", "to", "reach", "the", "correct", "temperature", ",", "loaded", "with", "transferrin", "Alexa", "-", "555", "for", "1", "hr", ",", "fixed", ",", "and", "labeled", "with", "anti", "-", "ATG9", "and", "anti", "-", "TGN46", "(", "marker", "for", "Trans", "Golgi", "Network", ")", ".", "Histogram", "shows", "Pearson", "'", "s", "coefficient", "between", "ATG9", "and", "transferrin", "(", "Tf", ")", "or", "TGN46", ".", "Error", "bar", ",", "SEM", ".", "∗", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "Inserts", "show", "merge", "at", "higher", "magnification", ".", "(", "C", ")", "HeLa", "cells", "were", "incubated", "in", "serum", "-", "free", "medium", "containing", "Dynasore", "100", "μM", "or", "DMSO", "for", "2", "hr", "and", "loaded", "for", "30", "min", "with", "transferrin", "Alexa", "-", "555", ".", "Cells", "were", "then", "fixed", "and", "labeled", "for", "mATG9", "and", "TGN46", ".", "Pearson", "'", "s", "coefficient", "between", "mATG9", "and", "transferrin", "or", "TGN46", "was", "quantified", ".", "Error", "bar", ",", "SEM", ".", "∗", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "Inserts", "show", "the", "merge", "at", "higher", "magnification", ".", "(", "D", ")", "Cells", "treated", "or", "not", "treated", "with", "Dynasore", "or", "transfected", "with", "Dynamin", "K44A", "mutant", "or", "AP2", "siRNA", "were", "fixed", "and", "then", "analyzed", "by", "TIRF", "microscopy", ".", "Pictures", "are", "at", "the", "same", "magnification", "and", "brightness", ".", "Cells", "transfected", "with", "Dynamin", "mutant", "were", "identified", "by", "abnormal", "transferrin", "accumulation", "at", "the", "plasma", "membrane", ".", "(", "E", ")", "HeLa", "cells", "were", "incubated", "for", "1", "hr", "at", "4", "°", "C", "with", "ice", "-", "cold", "NHS", "-", "LC", "-", "Biotin", "(", "Pierce", ")", "solution", ",", "rinsed", ",", "and", "lysed", "in", "RIPA", "buffer", ".", "Biotinylated", "proteins", "were", "precipitated", "using", "streptavidin", "-", "agarose", "beads", "(", "Pierce", ")", "and", "blotted", "for", "mATG9", "to", "assess", "protein", "localization", "at", "the", "plasma", "membrane", ".", "(", "F", ")", "HeLa", "cells", "treated", "as", "in", "(", "C", ")", "were", "processed", "for", "immunogold", "labeling", "on", "cryosections", "and", "stained", "with", "anti", "-", "mATG9", "antibody", ".", "Arrows", "show", "clathrin", "-", "coated", "structures", ".", "Scale", "bar", "in", "a", "and", "c", ",", "150", "nm", ";", "scale", "bar", "in", "b", ",", "100", "nm", ".", "(", "G", ")", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "GFP", "-", "ATG16L1", "were", "fixed", ",", "labeled", "for", "mATG9", ",", "and", "then", "analyzed", "by", "TIRF", "microscopy", ".", "Control", "cells", "were", "cotransfected", "with", "GFP", "-", "ATG16L1", "and", "Straw", "-", "ATG16L1", ".", "Pictures", "are", "at", "the", "same", "magnification", "and", "brightness", ".", "See", "Figure", "S1J", "for", "quantification", ".", "(", "H", ")", "HeLa", "cells", "treated", "with", "Dynasore", "were", "processed", "for", "immunogold", "labeling", "on", "cryosections", "and", "double", "labeled", "with", "ATG16L1", "(", "10", "nm", ")", "and", "mATG9", "(", "15", "nm", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "nm", ".", "(", "I", ")", "HeLa", "cells", "treated", "as", "in", "(", "H", ")", "were", "processed", "for", "triple", "labeling", "on", "cryosections", "(", "clathrin", ",", "5", "nm", ";", "ATG16L1", ",", "10", "nm", ";", "and", "mATG9", ",", "15", "nm", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "150", "nm", ".", "(", "J", ")", "Table", "shows", "quantification", "of", "numbers", "of", "clathrin", "-", "coated", "structures", "carrying", "mATG9", "and", "ATG16L1", "alone", "or", "together", "or", "neither", "protein", ".", "A", "minimum", "of", "50", "clathrin", "-", "coated", "structures", "were", "examined", "from", "three", "different", "experiments", ".", "We", "constructed", "a", "2", "×", "2", "table", "with", "0", "or", "1", "-", "3", "gold", "particles", "for", "mATG9", "or", "ATG16L1", "for", "a", "X2", "test", "to", "avoid", "statistical", "cells", "with", "0", "counts", ".", "X2", "=", "10", ".", "4", ",", "df", "=", "1", ",", "and", "p", "=", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A′) HeLa cells transfected with pEGFP-RAB11 were fixed in basal conditions and stained for mATG9. Pearson's coefficient: 0.452 ± 0.034 (SEM).(A″) HeLa cells were transfected with ATG9L1-pEGFP, fixed in basal condition, and labeled for RAB11. Pearson's coefficient: 0.413 ± 0.020 (SEM).(B) HeLa cells were incubated for 1 hr at 37°C or 18°C to reach the correct temperature, loaded with transferrin Alexa-555 for 1 hr, fixed, and labeled with anti-ATG9 and anti-TGN46 (marker for Trans Golgi Network). Histogram shows Pearson's coefficient between ATG9 and transferrin (Tf) or TGN46. Error bar, SEM. ∗∗∗p < 0.001. Inserts show merge at higher magnification.(C) HeLa cells were incubated in serum-free medium containing Dynasore 100 μM or DMSO for 2 hr and loaded for 30 min with transferrin Alexa-555. Cells were then fixed and labeled for mATG9 and TGN46. Pearson's coefficient between mATG9 and transferrin or TGN46 was quantified. Error bar, SEM. ∗∗∗p < 0.001. Inserts show the merge at higher magnification.(D) Cells treated or not treated with Dynasore or transfected with Dynamin K44A mutant or AP2 siRNA were fixed and then analyzed by TIRF microscopy. Pictures are at the same magnification and brightness. Cells transfected with Dynamin mutant were identified by abnormal transferrin accumulation at the plasma membrane.(E) HeLa cells were incubated for 1 hr at 4°C with ice-cold NHS-LC-Biotin (Pierce) solution, rinsed, and lysed in RIPA buffer. Biotinylated proteins were precipitated using streptavidin-agarose beads (Pierce) and blotted for mATG9 to assess protein localization at the plasma membrane.(F) HeLa cells treated as in (C) were processed for immunogold labeling on cryosections and stained with anti-mATG9 antibody. Arrows show clathrin-coated structures. Scale bar in a and c, 150 nm; scale bar in b, 100 nm.(G) HeLa cells transfected with GFP-ATG16L1 were fixed, labeled for mATG9, and then analyzed by TIRF microscopy. Control cells were cotransfected with GFP-ATG16L1 and Straw-ATG16L1. Pictures are at the same magnification and brightness. See Figure S1J for quantification.(H) HeLa cells treated with Dynasore were processed for immunogold labeling on cryosections and double labeled with ATG16L1 (10 nm) and mATG9 (15 nm). Scale bar, 100 nm.(I) HeLa cells treated as in (H) were processed for triple labeling on cryosections (clathrin, 5 nm; ATG16L1, 10 nm; and mATG9, 15 nm). Scale bar, 150 nm.(J) Table shows quantification of numbers of clathrin-coated structures carrying mATG9 and ATG16L1 alone or together or neither protein. A minimum of 50 clathrin-coated structures were examined from three different experiments. We constructed a 2 × 2 table with 0 or 1-3 gold particles for mATG9 or ATG16L1 for a X2 test to avoid statistical cells with 0 counts. X2 = 10.4, df = 1, and p = 0.001."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "GFP", "-", "ATG16L1", "for", "24", "hr", "were", "incubated", "for", "15", "min", "with", "2", ".", "5", "μg", "/", "ml", "with", "HRP", "-", "cholera", "toxin", "subunit", "B", "at", "4", "°", "C", "and", "then", "for", "10", "min", "at", "37", "°", "C", ".", "Cells", "were", "then", "fixed", "and", "treated", "for", "immunogold", "labeling", "on", "cryosections", ".", "ATG16L1", "was", "detected", "with", "anti", "-", "ATG16L1", "antibody", "(", "15", "nm", ")", ",", "and", "cholera", "toxin", "was", "detected", "using", "anti", "-", "HRP", "antibody", ".", "Scale", "bar", ",", "150", "nm", ".", "(", "B", ")", "HeLa", "cells", "were", "transiently", "transfected", "with", "GFP", "-", "ATG16L1", "for", "20", "hr", ".", "Cells", "in", "basal", "conditions", "were", "fixed", "and", "labeled", "with", "anti", "-", "RAB11", "antibody", ".", "(", "C", ")", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "mStrawberry", "-", "ATG16L1", "(", "20", "hr", ")", "and", "starved", "(", "4", "hr", ")", "were", "processed", "for", "immunogold", "labeling", "on", "cryosections", ".", "Double", "labeling", "was", "performed", "with", "rabbit", "anti", "-", "ATG16L1", "(", "10", "nm", "gold", ")", "and", "rabbit", "anti", "-", "RAB11", "(", "15", "nm", "gold", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "150", "nm", ".", "Schematic", "diagram", "shows", "membrane", "outlines", "from", "EM", ".", "Green", "lines", "indicate", "structures", "positive", "for", "both", "ATG16L1", "and", "RAB11", ",", "whereas", "red", "lines", "are", "only", "positive", "for", "RAB11", ".", "Histogram", "shows", "the", "percentage", "by", "EM", "of", "ATG16L1", "tubulovesicular", "structures", "that", "carry", "RAB11", ".", "281", "tubulovesiclular", "structures", "from", "different", "experiments", "were", "analyzed", ".", "Error", "bars", ",", "SD", ".", "(", "D", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "EGFP", "-", "ATG16L1", "and", "mCherry", "-", "RAB11", ",", "and", "5", "min", "movies", "were", "recorded", ".", "Representative", "images", "from", "movies", "are", "shown", ".", "(", "E", ")", "HeLa", "cells", "were", "loaded", "with", "mouse", "anti", "-", "transferrin", "receptor", "antibody", "(", "5E9C11", ")", "for", "30", "min", "and", "fixed", "for", "immunogold", "labeling", "for", "cryosections", ".", "The", "sample", "was", "labeled", "with", "rabbit", "anti", "-", "mouse", "antibody", "to", "recognize", "transferrin", "receptor", "(", "5", "nm", ")", ",", "anti", "-", "ATG16L1", "(", "10", "nm", ")", ",", "and", "anti", "-", "mATG9", "(", "15", "nm", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "150", "nm", ".", "(", "F", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "pmStrawberry", "-", "ATG16L1", "and", "ATG9L1", "-", "pEGFP", ",", "and", "5", "min", "movies", "were", "recorded", ".", "Representative", "images", "from", "the", "movies", "are", "shown", ".", "(", "G", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "pmStrawberry", "-", "ATG16L1", "and", "pEGFP", "-", "LC3", ",", "starved", "for", "2", "hr", ",", "fixed", ",", "and", "labeled", "for", "mATG9", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) HeLa cells transfected with GFP-ATG16L1 for 24 hr were incubated for 15 min with 2.5 μg/ml with HRP-cholera toxin subunit B at 4°C and then for 10 min at 37°C. Cells were then fixed and treated for immunogold labeling on cryosections. ATG16L1 was detected with anti-ATG16L1 antibody (15 nm), and cholera toxin was detected using anti-HRP antibody. Scale bar, 150 nm.(B) HeLa cells were transiently transfected with GFP-ATG16L1 for 20 hr. Cells in basal conditions were fixed and labeled with anti-RAB11 antibody.(C) HeLa cells transfected with mStrawberry-ATG16L1 (20 hr) and starved (4 hr) were processed for immunogold labeling on cryosections. Double labeling was performed with rabbit anti-ATG16L1 (10 nm gold) and rabbit anti-RAB11 (15 nm gold). Scale bar, 150 nm. Schematic diagram shows membrane outlines from EM. Green lines indicate structures positive for both ATG16L1 and RAB11, whereas red lines are only positive for RAB11. Histogram shows the percentage by EM of ATG16L1 tubulovesicular structures that carry RAB11. 281 tubulovesiclular structures from different experiments were analyzed. Error bars, SD.(D) HeLa cells were transfected with EGFP-ATG16L1 and mCherry-RAB11, and 5 min movies were recorded. Representative images from movies are shown.(E) HeLa cells were loaded with mouse anti-transferrin receptor antibody (5E9C11) for 30 min and fixed for immunogold labeling for cryosections. The sample was labeled with rabbit anti-mouse antibody to recognize transferrin receptor (5 nm), anti-ATG16L1 (10 nm), and anti-mATG9 (15 nm). Scale bar, 150 nm.(F) HeLa cells were transfected with pmStrawberry-ATG16L1 and ATG9L1-pEGFP, and 5 min movies were recorded. Representative images from the movies are shown.(G) HeLa cells were transfected with pmStrawberry-ATG16L1 and pEGFP-LC3, starved for 2 hr, fixed, and labeled for mATG9."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", "and", "B", ")", "(", "A", ")", "HeLa", "cells", "were", "incubated", "for", "4", "hr", "at", "37", "°", "C", "or", "18", "°", "C", "and", "processed", "for", "LC3II", "western", "blot", ".", "Some", "cells", "were", "incubated", "overnight", "with", "20", "mM", "NH4Cl", "in", "full", "medium", "(", "to", "block", "lysosomal", "degradation", ")", "at", "37", "°", "C", "or", "18", "°", "C", "(", "B", ")", ".", "(", "C", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "pEGFP", "-", "LC3", "for", "20", "hr", "and", "incubated", "for", "4", "hr", "at", "37", "°", "C", "or", "18", "°", "C", ".", "(", "D", "and", "E", ")", "(", "D", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "pEGFP", "-", "ATG16L1", "for", "20", "hr", "and", "incubated", "for", "4", "hr", "at", "37", "°", "C", "or", "18", "°", "C", ".", "The", "size", "and", "the", "number", "(", "E", ")", "of", "vesicles", "were", "scored", "(", "a", "minimum", "of", "20", "cells", "were", "examined", "for", "each", "condition", ")", ".", "Error", "bar", ",", "SEM", ".", "∗", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "001", "and", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "(", "D", "and", "E", ")", "(", "D", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "pEGFP", "-", "ATG16L1", "for", "20", "hr", "and", "incubated", "for", "4", "hr", "at", "37", "°", "C", "or", "18", "°", "C", ".", "The", "size", "and", "the", "number", "(", "E", ")", "of", "vesicles", "were", "scored", "(", "a", "minimum", "of", "20", "cells", "were", "examined", "for", "each", "condition", ")", ".", "Error", "bar", ",", "SEM", ".", "∗", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "001", "and", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "(", "F", "and", "G", ")", "(", "F", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "pEGFP", "-", "ATG16L1", "for", "20", "hr", ",", "incubated", "for", "4", "hr", "at", "37", "°", "C", "or", "18", "°", "C", ",", "and", "labeled", "with", "EEA1", "or", "RAB11", "to", "visualize", "early", "endosomes", "or", "recycling", "endosomes", ".", "Histogram", "in", "(", "G", ")", "shows", "the", "amount", "of", "colocalization", "of", "ATG16L1", "in", "EEA1", "or", "in", "RAB11", "compartment", "(", "Manders", "'", "coefficient", ")", ".", "Error", "bar", ",", "SEM", ".", "NS", ",", "not", "significant", ";", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "(", "H", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "pmStrawberry", "-", "ATG16L1", "for", "20", "hr", ",", "fixed", ",", "and", "labeled", "for", "mATG9", ".", "The", "histograms", "show", "quantification", "of", "colocalization", "and", "the", "size", "of", "the", "vesicles", "labeled", "with", "ATG16L1", "and", "mATG9", "at", "37", "°", "C", "or", "18", "°", "C", ".", "Error", "bar", ",", "SEM", ".", "∗", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "001", "and", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "(", "I", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "pEGFP", "-", "RAB11", "or", "pEGFP", "-", "Myosin", "Vb", "tail", "(", "MVb", ")", "and", "incubated", "during", "the", "last", "16", "hr", "with", "Bafilomycin", "A1", "(", "Baf", ")", "or", "DMSO", "and", "processed", "for", "LC3", "-", "II", "western", "blot", ".", "Control", "cells", "were", "transfected", "with", "pEGFP", "empty", "vector", ".", "(", "J", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "ATG16L1", "-", "mStrawberry", "and", "RAB11", "-", "EGFP", "or", "MVb", "tail", "-", "EGFP", ".", "The", "size", "of", "ATG16L1", "vesicles", "was", "scored", "in", "RAB11", "and", "MVb", "tail", "overexpression", "conditions", ".", "The", "inserts", "show", "just", "the", "ATG16L1", "vesicles", "as", "quantified", "in", "histogram", ".", "Error", "bar", ",", "SEM", ".", "∗", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "K", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "as", "in", "(", "C", ")", "and", "loaded", "with", "transferrin", "Alexa", "-", "647", "for", "30", "min", ".", "Histogram", "and", "the", "inserts", "show", "the", "correlation", "between", "ATG16L1", "and", "the", "loaded", "transferrin", "(", "Pearson", "'", "s", "coefficient", ")", ".", "Error", "bar", ",", "SEM", ".", "∗", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "L", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "as", "in", "(", "C", ")", "and", "labeled", "for", "mATG9", ".", "Histogram", "and", "the", "inserts", "show", "the", "correlation", "between", "ATG16L1", "and", "mATG9", "in", "RAB11", "and", "MVb", "tail", "overexpression", "conditions", "(", "Pearson", "'", "s", "coefficient", ")", ".", "Error", "bar", ",", "SEM", ".", "∗", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "M", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "mStrawberry", "-", "ATG16L1", "for", "20", "hr", ",", "starved", "in", "HBSS", "for", "4", "hr", ",", "or", "maintained", "in", "full", "medium", ",", "loaded", "with", "transferrin", "Alexa", "-", "488", "(", "Tf", ")", ".", "Pictures", "and", "histogram", "show", "the", "correlation", "between", "ATG16L1", "and", "transferrin", "in", "basal", "and", "starving", "condition", "(", "Pearson", "'", "s", "coefficient", ")", ".", "Error", "bar", ",", "SEM", ".", "∗", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "N", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "mStrawberry", "-", "ATG16L1", "for", "20", "hr", ",", "starved", "in", "HBSS", "for", "4", "hr", ",", "or", "maintained", "in", "full", "medium", "and", "then", "fixed", "and", "labeled", "with", "anti", "-", "mATG9", "antibody", ".", "Pictures", "and", "histogram", "show", "the", "correlation", "between", "ATG16L1", "and", "mATG9", "in", "basal", "and", "starved", "cells", "(", "Pearson", "'", "s", "coefficient", ")", ".", "Error", "bar", ",", "SEM", ".", "∗", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A and B) (A) HeLa cells were incubated for 4 hr at 37°C or 18°C and processed for LC3II western blot. Some cells were incubated overnight with 20 mM NH4Cl in full medium (to block lysosomal degradation) at 37°C or 18°C (B).(C) HeLa cells were transfected with pEGFP-LC3 for 20 hr and incubated for 4 hr at 37°C or 18°C.(D and E) (D) HeLa cells were transfected with pEGFP-ATG16L1 for 20 hr and incubated for 4 hr at 37°C or 18°C. The size and the number (E) of vesicles were scored (a minimum of 20 cells were examined for each condition). Error bar, SEM. ∗∗∗p < 0.001 and ∗∗p < 0.01.(D and E) (D) HeLa cells were transfected with pEGFP-ATG16L1 for 20 hr and incubated for 4 hr at 37°C or 18°C. The size and the number (E) of vesicles were scored (a minimum of 20 cells were examined for each condition). Error bar, SEM. ∗∗∗p < 0.001 and ∗∗p < 0.01.(F and G) (F) HeLa cells were transfected with pEGFP-ATG16L1 for 20 hr, incubated for 4 hr at 37°C or 18°C, and labeled with EEA1 or RAB11 to visualize early endosomes or recycling endosomes. Histogram in (G) shows the amount of colocalization of ATG16L1 in EEA1 or in RAB11 compartment (Manders' coefficient). Error bar, SEM. NS, not significant; ∗∗p < 0.01.(H) HeLa cells were transfected with pmStrawberry-ATG16L1 for 20 hr, fixed, and labeled for mATG9. The histograms show quantification of colocalization and the size of the vesicles labeled with ATG16L1 and mATG9 at 37°C or 18°C. Error bar, SEM. ∗∗∗p < 0.001 and ∗∗p < 0.01.(I) HeLa cells were transfected with pEGFP-RAB11 or pEGFP-Myosin Vb tail (MVb) and incubated during the last 16 hr with Bafilomycin A1 (Baf) or DMSO and processed for LC3-II western blot. Control cells were transfected with pEGFP empty vector.(J) HeLa cells were transfected with ATG16L1-mStrawberry and RAB11-EGFP or MVb tail-EGFP. The size of ATG16L1 vesicles was scored in RAB11 and MVb tail overexpression conditions. The inserts show just the ATG16L1 vesicles as quantified in histogram. Error bar, SEM. ∗∗∗p<0.001.(K) HeLa cells were transfected as in (C) and loaded with transferrin Alexa-647 for 30 min. Histogram and the inserts show the correlation between ATG16L1 and the loaded transferrin (Pearson's coefficient). Error bar, SEM. ∗∗∗p < 0.001.(L) HeLa cells were transfected as in (C) and labeled for mATG9. Histogram and the inserts show the correlation between ATG16L1 and mATG9 in RAB11 and MVb tail overexpression conditions (Pearson's coefficient). Error bar, SEM. ∗∗∗p < 0.001.(M) HeLa cells were transfected with mStrawberry-ATG16L1 for 20 hr, starved in HBSS for 4 hr, or maintained in full medium, loaded with transferrin Alexa-488 (Tf). Pictures and histogram show the correlation between ATG16L1 and transferrin in basal and starving condition (Pearson's coefficient). Error bar, SEM. ∗∗∗p < 0.001.(N) HeLa cells were transfected with mStrawberry-ATG16L1 for 20 hr, starved in HBSS for 4 hr, or maintained in full medium and then fixed and labeled with anti-mATG9 antibody. Pictures and histogram show the correlation between ATG16L1 and mATG9 in basal and starved cells (Pearson's coefficient). Error bar, SEM. ∗∗∗p < 0.001."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "mStrawberry", "-", "ATG16", "for", "20", "hr", "and", "treated", "for", "10", "min", "with", "N", "-", "ethylmaleimide", "(", "NEM", ";", "100", "μM", ")", "in", "full", "medium", ",", "fixed", ",", "and", "stained", "for", "mATG9", ".", "Histogram", "shows", "correlation", "between", "mATG9", "and", "ATG16L1", "(", "Pearson", "'", "s", "coefficient", ")", ".", "Error", "bar", ",", "SEM", ".", "∗", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "C", "and", "D", ")", "(", "C", ")", "Representative", "fields", "of", "in", "vitro", "fusion", "assay", "of", "ATG16L1", "and", "mATG9", "vesicles", ".", "The", "quantification", "in", "(", "D", ")", "was", "performed", "on", "ten", "fields", "(", "similar", "to", "that", "shown", "in", "the", "figure", ")", "per", "experiment", ".", "The", "quantification", "is", "expressed", "as", "Pearson", "'", "s", "coefficient", ".", "Error", "bar", ",", "SEM", ".", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) HeLa cells were transfected with mStrawberry-ATG16 for 20 hr and treated for 10 min with N-ethylmaleimide (NEM; 100 μM) in full medium, fixed, and stained for mATG9. Histogram shows correlation between mATG9 and ATG16L1 (Pearson's coefficient). Error bar, SEM. ∗∗∗p < 0.001.(C and D) (C) Representative fields of in vitro fusion assay of ATG16L1 and mATG9 vesicles. The quantification in (D) was performed on ten fields (similar to that shown in the figure) per experiment. The quantification is expressed as Pearson's coefficient. Error bar, SEM. ∗∗p < 0.001."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "siRNAs", "for", "different", "R", "-", "SNAREs", ",", "and", "we", "assessed", "the", "levels", "of", "the", "autophagy", "substrate", "p62", "versus", "actin", ".", "(", "B", ")", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "control", "or", "VAMP3", "siRNA", "(", "oligo", "A", ")", "for", "4", "days", "were", "treated", "during", "the", "last", "16", "hr", "with", "Bafilomycin", "A1", "(", "Baf", "A1", ")", "or", "DMSO", "(", "basal", ")", "and", "processed", "for", "LC3", "-", "II", "western", "blots", ".", "(", "C", ")", "Endogenous", "LC3", "immunocytochemistry", "in", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "control", "or", "VAMP3", "siRNA", "for", "4", "days", ".", "The", "histogram", "shows", "the", "number", "of", "vesicles", "(", "LC3", "positive", ")", "in", "a", "minimum", "of", "30", "cells", ".", "Error", "bar", ",", "SEM", ".", "∗", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "D", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "VAMP3", "-", "HA", "for", "20", "hr", "and", "stained", "for", "EEA1", "or", "RAB11", ".", "Histogram", "shows", "colocalization", "between", "VAMP3", "-", "HA", "and", "EEA1", "or", "VAMP3", "-", "HA", "and", "RAB11", "(", "Manders", "'", "coefficient", ")", ".", "Error", "bar", ",", "SEM", ".", "(", "E", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "for", "20", "hr", "with", "VAMP3", "-", "HA", ",", "incubated", "for", "1", "hr", "at", "37", "°", "C", "or", "18", "°", "C", ",", "fixed", ",", "and", "labeled", "for", "HA", "and", "mATG9", ".", "Histogram", "shows", "the", "percentage", "of", "colocalization", "between", "VAMP3", "with", "mATG9", "(", "Manders", "'", "coefficient", ")", ".", "Error", "bar", ",", "SEM", ".", "NS", ",", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) HeLa cells were transfected with siRNAs for different R-SNAREs, and we assessed the levels of the autophagy substrate p62 versus actin.(B) HeLa cells transfected with control or VAMP3 siRNA (oligo A) for 4 days were treated during the last 16 hr with Bafilomycin A1 (Baf A1) or DMSO (basal) and processed for LC3-II western blots.(C) Endogenous LC3 immunocytochemistry in HeLa cells transfected with control or VAMP3 siRNA for 4 days. The histogram shows the number of vesicles (LC3 positive) in a minimum of 30 cells. Error bar, SEM. ∗∗∗p < 0.001.(D) HeLa cells were transfected with VAMP3-HA for 20 hr and stained for EEA1 or RAB11. Histogram shows colocalization between VAMP3-HA and EEA1 or VAMP3-HA and RAB11 (Manders' coefficient). Error bar, SEM.(E) HeLa cells were transfected for 20 hr with VAMP3-HA, incubated for 1 hr at 37°C or 18°C, fixed, and labeled for HA and mATG9. Histogram shows the percentage of colocalization between VAMP3 with mATG9 (Manders' coefficient). Error bar, SEM. NS, not significant."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", "-", "C", ")", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "control", ",", "VAMP3", "siRNA", "for", "4", "days", "were", "transfected", "during", "the", "last", "20", "hr", "with", "ATG9L1", "-", "pEGFP", "and", "labeled", "with", "anti", "-", "EEA1", "(", "for", "early", "endosomes", ")", "or", "anti", "-", "RAB11", "(", "for", "recycling", "endosomes", ")", ".", "The", "histogram", "in", "(", "C", ")", "shows", "the", "quantification", "of", "the", "colocalization", "of", "mATG9", "in", "EEA1", "or", "RAB11", "(", "Manders", "'", "coefficient", ")", ".", "Error", "bars", ",", "SEM", ".", "∗", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "D", "-", "F", ")", "HeLa", "cells", "were", "treated", "as", "in", "(", "A", ")", "-", "(", "C", ")", "and", "transfected", "during", "the", "last", "20", "hr", "with", "pEGFP", "-", "ATG16L1", "and", "labeled", "with", "anti", "-", "EEA1", "(", "early", "endosomes", ")", "or", "anti", "-", "RAB11", "(", "recycling", "endosomes", ")", ".", "Histogram", "in", "(", "D", ")", "shows", "quantification", "of", "the", "colocalization", "of", "ATG16L1", "in", "EEA1", "or", "RAB11", "(", "Manders", "'", "coefficient", ")", ".", "Error", "bars", ",", "SEM", ".", "∗", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "NS", ",", "not", "significant", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A-C) HeLa cells transfected with control, VAMP3 siRNA for 4 days were transfected during the last 20 hr with ATG9L1-pEGFP and labeled with anti-EEA1 (for early endosomes) or anti-RAB11 (for recycling endosomes). The histogram in (C) shows the quantification of the colocalization of mATG9 in EEA1 or RAB11 (Manders' coefficient). Error bars, SEM. ∗∗∗p < 0.001.(D-F) HeLa cells were treated as in (A)-(C) and transfected during the last 20 hr with pEGFP-ATG16L1 and labeled with anti-EEA1 (early endosomes) or anti-RAB11 (recycling endosomes). Histogram in (D) shows quantification of the colocalization of ATG16L1 in EEA1 or RAB11 (Manders' coefficient). Error bars, SEM. ∗∗∗p < 0.001; NS, not significant."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "control", ",", "VAMP3", "siRNA", "for", "4", "days", "were", "transfected", "during", "the", "last", "20", "hr", "with", "mStrawberry", "-", "ATG16L1", "and", "labeled", "for", "mATG9", ".", "The", "correlation", "between", "mATG9", "and", "ATG16L1", "was", "quantified", "(", "Pearson", "'", "s", "coefficient", ")", ".", "Error", "bar", ",", "SEM", ".", "∗", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "(", "B", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "control", "or", "VAMP3", "siRNA", "and", "then", "with", "mStrawberry", "-", "ATG16", ",", "and", "5", "min", "movies", "were", "recorded", ".", "Homotypic", "fusion", "events", "between", "mStrawberry", "-", "ATG16", "vesicles", "were", "assessed", "in", "control", "and", "VAMP3", "knockdown", "cells", ".", "Error", "bar", ",", "SEM", ".", "NS", ",", "not", "significant", ".", "(", "C", ")", "In", "vitro", "fusion", "assay", "of", "ATG16L1", "and", "mATG9", "vesicles", ".", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "control", "or", "VAMP3", "siRNA", "for", "4", "days", "separately", "and", ",", "on", "the", "fourth", "day", ",", "either", "transfected", "with", "mStrawberry", "-", "ATG16L1", "or", "ATG9L1", "-", "pEGFP", ".", "PNS", "of", "cells", "expressing", "the", "two", "constructs", "were", "mixed", "for", "1", "hr", "at", "37C", "°", "and", "observed", "by", "confocal", "microscopy", ".", "Histogram", "shows", "the", "correlation", "of", "vesicles", "carrying", "ATG16L1", "that", "fuse", "with", "vesicles", "carrying", "mATG9", "(", "Pearson", "'", "s", "coefficient", ")", ".", "Error", "bar", ",", "SEM", ".", "∗", "∗", "∗", "p", "<", "0", ".", "001", ".", "The", "total", "number", "of", "structures", "per", "field", "(", "ATG16L1", "and", "ATG9L1", ")", "is", "not", "significantly", "different", "in", "the", "control", "and", "KD", "samples", "(", "control", ",", "37", "±", "3", ";", "VAMP3", "KD", ",", "45", "±", "3", ";", "±", "SEM", ";", "p", "=", "0", ".", "106", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) HeLa cells transfected with control, VAMP3 siRNA for 4 days were transfected during the last 20 hr with mStrawberry-ATG16L1 and labeled for mATG9. The correlation between mATG9 and ATG16L1 was quantified (Pearson's coefficient). Error bar, SEM. ∗∗∗p < 0.001.(B) HeLa cells were transfected with control or VAMP3 siRNA and then with mStrawberry-ATG16, and 5 min movies were recorded. Homotypic fusion events between mStrawberry-ATG16 vesicles were assessed in control and VAMP3 knockdown cells. Error bar, SEM. NS, not significant.(C) In vitro fusion assay of ATG16L1 and mATG9 vesicles. HeLa cells were transfected with control or VAMP3 siRNA for 4 days separately and, on the fourth day, either transfected with mStrawberry-ATG16L1 or ATG9L1-pEGFP. PNS of cells expressing the two constructs were mixed for 1 hr at 37C° and observed by confocal microscopy. Histogram shows the correlation of vesicles carrying ATG16L1 that fuse with vesicles carrying mATG9 (Pearson's coefficient). Error bar, SEM. ∗∗∗p < 0.001. The total number of structures per field (ATG16L1 and ATG9L1) is not significantly different in the control and KD samples (control, 37 ± 3; VAMP3 KD, 45 ± 3; ± SEM; p = 0.106)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "THP", "-", "1", "cells", "were", "subjected", "to", "knockdowns", "as", "indicated", "and", "treated", "with", "100", "ng", "/", "mL", "LPS", "overnight", ",", "followed", "by", "0", ".", "25", "mM", "LLOMe", "for", "3", "h", ",", "and", "the", "levels", "of", "IL", "-", "1β", "were", "determined", "in", "supernatants", ".", "(", "B", ")", "THP", "-", "1", "cells", "were", "subjected", "to", "GABARAP", "knockdown", "and", "processed", "as", "in", "A", ".", "(", "C", ")", "IL", "-", "1β", "levels", "in", "supernatants", "of", "THP", "-", "1", "cells", "subjected", "to", "TRIM", "knockdowns", "and", "treated", "with", "LPS", "and", "then", "with", "LLOMe", ".", "(", "D", ")", "Confocal", "microscopy", "of", "THP", "-", "1", "cells", "treated", "sequentially", "with", "LPS", "and", "LLOMe", ",", "and", "stained", "for", "LC3B", "and", "TRIM16", ".", "Line", "tracings", "correspond", "to", "arrows", ".", "Arrowheads", "indicate", "colocalization", ".", "Scale", "bars", ",", "5", "μm", ".", "(", "E", ")", "IL", "-", "1β", "levels", "in", "supernatants", "of", "THP", "-", "1", "cells", "subjected", "to", "TRIM", "knockdowns", "and", "treated", "with", "LPS", "and", "then", "with", "LLOMe", ".", "(", "F", ")", "Levels", "of", "IL", "-", "1β", "were", "determine", "in", "supernatants", "from", "THP", "-", "1", "cells", "subjected", "to", "knockdown", "as", "indicated", ",", "treated", "with", "100", "ng", "/", "mL", "LPS", "for", "overnight", "and", "then", "with", "0", ".", "25mM", "of", "Silica", ",", "Alum", ",", "or", "monosodium", "urate", "(", "MSU", ")", ".", "(", "G", ")", "IL", "-", "1β", "in", "supernatants", "of", "primary", "human", "macrophages", "(", "MDM", ")", "subjected", "to", "knockdowns", "and", "sequentially", "treated", "with", "LPS", "and", "LLOMe", ".", "Data", ",", "means", "±", "SEM", ";", "n", "≥", "5", "(", "except", "for", "B", "where", "a", "representative", "data", "set", "from", "3", "repeats", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "t", "test", "or", "ANOVA", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) THP-1 cells were subjected to knockdowns as indicated and treated with 100 ng/mL LPS overnight, followed by 0.25 mM LLOMe for 3 h, and the levels of IL-1β were determined in supernatants.(B) THP-1 cells were subjected to GABARAP knockdown and processed as in A.(C) IL-1β levels in supernatants of THP-1 cells subjected to TRIM knockdowns and treated with LPS and then with LLOMe.(D) Confocal microscopy of THP-1 cells treated sequentially with LPS and LLOMe, and stained for LC3B and TRIM16. Line tracings correspond to arrows. Arrowheads indicate colocalization. Scale bars, 5 μm.(E) IL-1β levels in supernatants of THP-1 cells subjected to TRIM knockdowns and treated with LPS and then with LLOMe.(F) Levels of IL-1β were determine in supernatants from THP-1 cells subjected to knockdown as indicated, treated with 100 ng/mL LPS for overnight and then with 0.25mM of Silica, Alum, or monosodium urate (MSU).(G) IL-1β in supernatants of primary human macrophages (MDM) subjected to knockdowns and sequentially treated with LPS and LLOMe. Data, means ± SEM; n≥5 (except for B where a representative data set from 3 repeats). *P < 0.05 (t test or ANOVA)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", "and", "B", ")", "Levels", "of", "IL", "-", "1β", "in", "supernatants", "from", "THP", "-", "1", "cells", "that", "were", "subjected", "to", "knockdown", "as", "indicated", "and", "were", "treated", "with", "LPS", ",", "and", "then", "(", "A", ")", "treated", "with", "LLOMe", "or", "(", "B", ")", "starved", "in", "EBSS", ".", "(", "C", ")", "IL", "-", "1β", "in", "supernatants", "of", "primary", "human", "macrophages", "(", "MDM", ")", "subjected", "to", "knockdowns", "and", "sequentially", "treated", "with", "LPS", "and", "LLOMe", ".", "(", "D", ")", "Co", "-", "immunoprecipitation", "(", "co", "-", "IP", ")", "of", "flag", "-", "galectin", "-", "8", "(", "Gal", "-", "8", ")", "and", "GFP", "-", "TRIM16", "(", "T16", ")", "in", "HEK293T", "cells", ".", "(", "E", ")", "Co", "-", "IP", "analysis", "of", "endogenous", "galectin", "-", "8", "and", "TRIM16", "in", "protein", "complexes", "from", "LLOMe", "-", "treated", "THP", "-", "1", "cells", ".", "(", "F", ")", "Confocal", "microscopy", "of", "THP", "-", "1", "cells", "treated", "with", "LPS", "and", "LLOMe", ",", "and", "stained", "for", "TRIM16", "and", "galectin", "-", "8", ".", "Line", "tracings", "correspond", "to", "arrowed", "dashed", "lines", ".", "Pearson", "correlation", "coefficient", "was", "calculated", "using", "SlideBook", "as", "described", "previously", ".", "Scale", "bars", ",", "5", "μm", ".", "(", "G", ")", "In", "vitro", "translated", "and", "radiolabeled", "[", "35S", "]", "myc", "-", "HA", "-", "TRIM16", "was", "incubated", "with", "GST", "-", "galectin", "-", "8", "in", "the", "presence", "(", "+", ")", "or", "absence", "(", "-", ")", "of", "flag", "-", "ULK1", "and", "cold", "ATP", ",", "GST", "pulldowns", "were", "performed", ",", "and", "[", "35S", "]", "radiolabeled", "Myc", "-", "HA", "-", "TRIM16", "in", "pulled", "-", "down", "material", "detected", "by", "PAGE", "and", "autoradiography", ".", "Amounts", "of", "GST", "fusion", "proteins", "are", "shown", "in", "coommassie", "brilliant", "blue", "(", "CBB", ")", "-", "stained", "gels", ".", "Data", ",", "means", "", "SEM", ";", "n", "≥", "5", ",", "except", "for", "immunoblot", "quantifications", "where", "n", "≥", "3", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "†", "P", "≥", "0", ".", "05", "(", "t", "test", "or", "ANOVA", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A and B) Levels of IL-1β in supernatants from THP-1 cells that were subjected to knockdown as indicated and were treated with LPS, and then (A) treated with LLOMe or (B) starved in EBSS.(C) IL-1β in supernatants of primary human macrophages (MDM) subjected to knockdowns and sequentially treated with LPS and LLOMe.(D) Co-immunoprecipitation (co-IP) of flag-galectin-8 (Gal-8) and GFP-TRIM16 (T16) in HEK293T cells.(E) Co-IP analysis of endogenous galectin-8 and TRIM16 in protein complexes from LLOMe-treated THP-1 cells.(F) Confocal microscopy of THP-1 cells treated with LPS and LLOMe, and stained for TRIM16 and galectin-8. Line tracings correspond to arrowed dashed lines. Pearson correlation coefficient was calculated using SlideBook as described previously. Scale bars, 5 μm.(G) In vitro translated and radiolabeled [35S] myc-HA-TRIM16 was incubated with GST-galectin-8 in the presence (+) or absence (-) of flag-ULK1 and cold ATP, GST pulldowns were performed, and [35S] radiolabeled Myc-HA-TRIM16 in pulled-down material detected by PAGE and autoradiography. Amounts of GST fusion proteins are shown in coommassie brilliant blue (CBB)-stained gels. Data, means  SEM; n≥5, except for immunoblot quantifications where n≥3. *P < 0.05, †P ≥ 0.05 (t test or ANOVA)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", "and", "B", ")", "Immunoblot", "analyses", "of", "indicated", "membrane", "fractions", "prepared", "by", "differential", "centrifugation", ".", "HeLa", "cells", "reconstituted", "with", "flag", "-", "pro", "-", "IL", "-", "1β", "and", "myc", "-", "pro", "-", "Caspase", "-", "1", "were", "treated", "with", "1mM", "LLOMe", "for", "1h", ",", "and", "lysates", "were", "subjected", "to", "differential", "centrifugations", "at", "3", ",", "000xg", "(", "3k", ")", ",", "25", ",", "000xg", "(", "25k", ")", "and", "100", ",", "000xg", "(", "100k", ")", "as", "depicted", "in", "the", "cartoon", ".", "Arrows", ",", "two", "ways", "the", "membranes", "were", "analyzed", "-", "pellets", "from", "velocity", "sedimentation", "were", "analyzed", "in", "panels", "B", "-", "D", ",", "or", "by", "further", "sucrose", "and", "OptiPrep", "density", "separation", "of", "25k", "pellets", "in", "panels", "F", "and", "G", ".", "(", "C", ")", "IL", "-", "1β", "levels", "in", "25k", "membrane", "fractions", "(", "pellets", ")", "from", "HeLa", "cells", "and", "their", "CRISPR", "knockout", "derivatives", "(", "TRIM16KO", ")", "that", "were", "reconstituted", "for", "IL", "-", "1β", "secretion", "and", "treated", "with", "1mM", "LLOMe", "for", "1", "h", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "analyses", "in", "(", "B", ")", ".", "RI", ",", "relative", "intensity", ".", "(", "E", ")", "Whole", "cell", "lysates", "(", "immunoblots", ")", "analyzed", "in", "F", "and", "G", ".", "(", "F", ",", "G", ")", "Sucrose", "density", "gradient", "analysis", "of", "25k", "membranes", ".", "Note", "that", "mature", "IL", "-", "1β", "(", "mIL", "-", "1β", ")", "is", "recruited", "to", "and", "co", "-", "fractionates", "with", "TRIM16", "+", ",", "Sec22b", "+", ",", "and", "LC3", "-", "II", "+", "membranes", "in", "TRIM16wt", "HeLa", "cells", "reconstituted", "with", "pro", "-", "IL", "-", "1β", "and", "pro", "-", "caspase", "1", ",", "but", "not", "in", "TRIM16KO", "mutant", "cells", ".", "(", "H", ")", "Confocal", "images", "of", "LC3", "in", "HeLa", "cells", "expressing", "GFP", "-", "Sec22b", "treated", "with", "LLOMe", "or", "untreated", "(", "control", ")", ".", "Arrowheads", ",", "colocalization", ".", "Scale", "bars", ",", "5", "μm", ".", "(", "I", ")", "GFP", "-", "Sec22b", "and", "LC3", "overlapping", "area", "obtained", "by", "high", "content", "microscopy", ".", "(", "J", ")", "Co", "-", "IP", "analysis", "between", "flag", "-", "TRIM16", "with", "GFP", "-", "Sec22b", "or", "GFP", "-", "syntaxin", "-", "17", "co", "-", "expressed", "in", "HEK293T", "cells", ".", "(", "K", ")", "Co", "-", "IP", "analysis", "of", "endogenous", "proteins", ",", "TRIM16", "and", "Sec22b", ",", "in", "lysates", "from", "THP", "-", "1", "cells", "treated", "with", "LLOMe", ".", "(", "L", ")", "Co", "-", "IP", "analysis", "of", "interactions", "between", "deletion", "variants", "of", "flag", "-", "TRIM16", "with", "GFP", "-", "Sec22b", "in", "HEK293T", "cells", ".", "(", "M", "and", "N", ")", "IL", "-", "1β", "secretion", "complementation", "experiments", "of", "TRIM16KO", "cells", "with", "TRIM16", "Sec22b", "-", "interacting", "and", "its", "Sec22b", "-", "nonbinding", "mutant", "shown", ".", "(", "O", ")", "Two", "color", "super", "-", "resolution", "image", "showing", "co", "-", "clustering", "of", "flag", "-", "TRIM16", "(", "red", ")", "and", "GFP", "-", "Sec22b", "(", "green", ")", ";", "Scale", "bar", ",", "200", "nm", ".", "(", "P", ")", "Cross", "-", "correlation", "analysis", "of", "flag", "-", "TRIM16", "and", "GFP", "-", "Sec22b", "super", "-", "resolution", "data", "showing", "a", "characteristic", "separation", "of", "~", "70", "nm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A and B) Immunoblot analyses of indicated membrane fractions prepared by differential centrifugation. HeLa cells reconstituted with flag-pro-IL-1β and myc-pro-Caspase-1 were treated with 1mM LLOMe for 1h, and lysates were subjected to differential centrifugations at 3,000xg (3k), 25,000xg (25k) and 100,000xg (100k) as depicted in the cartoon. Arrows, two ways the membranes were analyzed - pellets from velocity sedimentation were analyzed in panels B-D, or by further sucrose and OptiPrep density separation of 25k pellets in panels F and G.(C) IL-1β levels in 25k membrane fractions (pellets) from HeLa cells and their CRISPR knockout derivatives (TRIM16KO) that were reconstituted for IL-1β secretion and treated with 1mM LLOMe for 1 h.(D) Quantification of analyses in (B). RI, relative intensity.(E) Whole cell lysates (immunoblots) analyzed in F and G.(F,G) Sucrose density gradient analysis of 25k membranes. Note that mature IL-1β (mIL-1β) is recruited to and co-fractionates with TRIM16+, Sec22b+, and LC3-II+ membranes in TRIM16wt HeLa cells reconstituted with pro-IL-1β and pro-caspase 1, but not in TRIM16KO mutant cells.(H) Confocal images of LC3 in HeLa cells expressing GFP-Sec22b treated with LLOMe or untreated (control). Arrowheads, colocalization. Scale bars, 5 μm. (I) GFP-Sec22b and LC3 overlapping area obtained by high content microscopy.(J) Co-IP analysis between flag-TRIM16 with GFP-Sec22b or GFP-syntaxin-17 co-expressed in HEK293T cells.(K) Co-IP analysis of endogenous proteins, TRIM16 and Sec22b, in lysates from THP-1 cells treated with LLOMe.(L) Co-IP analysis of interactions between deletion variants of flag-TRIM16 with GFP-Sec22b in HEK293T cells.(M and N) IL-1β secretion complementation experiments of TRIM16KO cells with TRIM16 Sec22b-interacting and its Sec22b-nonbinding mutant shown.(O) Two color super-resolution image showing co-clustering of flag-TRIM16 (red) and GFP-Sec22b (green); Scale bar, 200 nm. (P) Cross-correlation analysis of flag-TRIM16 and GFP-Sec22b super-resolution data showing a characteristic separation of ~ 70 nm."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", "and", "B", ")", "IL", "-", "1β", "levels", "in", "supernatants", "of", "THP", "-", "1", "cells", "subjected", "to", "knockdowns", ",", "treated", "with", "LPS", ",", "and", "then", "(", "A", ")", "with", "LLOMe", "or", "(", "B", ")", "starved", "in", "EBSS", ".", "(", "C", ")", "IL", "-", "1β", "levels", "in", "supernatants", "of", "primary", "human", "macrophages", "(", "MDM", ")", "subjected", "to", "knockdowns", "and", "sequentially", "treated", "with", "LPS", "and", "LLOMe", ".", "(", "D", ")", "Immunoblot", "analyses", "of", "p62", "levels", "in", "THP", "-", "1", "cells", "subjected", "to", "knockdowns", "as", "indicated", "and", "starved", "for", "3", "h", ".", "(", "E", ")", "mRFP", "-", "GFP", "overlapping", "areas", "of", "tandem", "HeLa", "cells", "reconstituted", "with", "flag", "-", "pro", "-", "IL", "-", "1β", "and", "myc", "-", "Caspase", "1", "and", "starved", "for", "3", "h", ".", "Mask", "overlay", ",", "iDev", "software", "-", "defined", "objects", "(", "primary", "objects", ",", "cell", "outlines", ";", "internal", "secondary", "objects", ",", "GFP", "(", "top", ")", ",", "mRFP", "(", "middle", ")", ",", "or", "their", "overlapping", "area", "(", "bottom", ")", ")", ".", "Bars", ",", "10", "μm", ".", "(", "F", ")", "IL", "-", "1β", "levels", "in", "supernatants", "of", "starved", "tandem", "HeLa", "cells", "reconstituted", "with", "flag", "-", "pro", "-", "IL", "-", "1β", "and", "myc", "-", "Caspase", "1", "as", "in", "E", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A and B) IL-1β levels in supernatants of THP-1 cells subjected to knockdowns, treated with LPS, and then (A) with LLOMe or (B) starved in EBSS.(C) IL-1β levels in supernatants of primary human macrophages (MDM) subjected to knockdowns and sequentially treated with LPS and LLOMe.(D) Immunoblot analyses of p62 levels in THP-1 cells subjected to knockdowns as indicated and starved for 3 h.(E) mRFP-GFP overlapping areas of tandem HeLa cells reconstituted with flag-pro-IL-1β and myc-Caspase 1 and starved for 3 h. Mask overlay, iDev software-defined objects (primary objects, cell outlines; internal secondary objects, GFP (top), mRFP (middle), or their overlapping area (bottom)). Bars, 10 μm.(F) IL-1β levels in supernatants of starved tandem HeLa cells reconstituted with flag-pro-IL-1β and myc-Caspase 1 as in E."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", "-", "C", ")", "IL", "-", "1β", "levels", "in", "supernatants", "of", "THP", "-", "1", "cells", "subjected", "to", "knockdowns", ",", "treated", "with", "LPS", ",", "and", "then", "with", "LLOMe", "(", "A", "and", "C", ")", "or", "starved", "in", "EBSS", "(", "B", ")", ".", "(", "A", "-", "C", ")", "IL", "-", "1β", "levels", "in", "supernatants", "of", "THP", "-", "1", "cells", "subjected", "to", "knockdowns", ",", "treated", "with", "LPS", ",", "and", "then", "with", "LLOMe", "(", "A", "and", "C", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A-C) IL-1β levels in supernatants of THP-1 cells subjected to knockdowns, treated with LPS, and then with LLOMe (A and C) or starved in EBSS (B).(A-C) IL-1β levels in supernatants of THP-1 cells subjected to knockdowns, treated with LPS, and then with LLOMe (A and C)."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "C", ")", "Ferritin", "levels", "in", "supernatants", "of", "THP", "-", "1", "cells", "subjected", "to", "knockdowns", "as", "indicated", "and", "sequentially", "treated", "with", "LPS", "and", "LLOMe", ".", "(", "D", ")", "Ferritin", "levels", "in", "supernatants", "of", "THP", "-", "1", "cells", "subjected", "to", "knockdowns", "as", "indicated", "and", "infected", "with", "M", ".", "tuberculosis", "as", "indicated", ".", "(", "E", ")", "Levels", "of", "ferritin", "were", "determine", "in", "supernatants", "from", "THP", "-", "1", "cells", "that", "were", "subjected", "to", "knockdown", "as", "indicated", "and", "were", "sequentially", "treated", "with", "LPS", "and", "LLOMe", ".", "(", "F", ")", "Confocal", "microscopy", "of", "HeLa", "cells", "expressing", "GFP", "-", "Sec22b", "were", "treated", "with", "LLOMe", ",", "and", "stained", "for", "FTH1", ".", "Line", "tracings", "correspond", "to", "arrows", ".", "Scale", "bars", ",", "5", "μm", ";"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(C) Ferritin levels in supernatants of THP-1 cells subjected to knockdowns as indicated and sequentially treated with LPS and LLOMe.(D) Ferritin levels in supernatants of THP-1 cells subjected to knockdowns as indicated and infected with M. tuberculosis as indicated.(E) Levels of ferritin were determine in supernatants from THP-1 cells that were subjected to knockdown as indicated and were sequentially treated with LPS and LLOMe.(F) Confocal microscopy of HeLa cells expressing GFP-Sec22b were treated with LLOMe, and stained for FTH1. Line tracings correspond to arrows. Scale bars, 5 μm;"}
{"words": ["Figure", "1", "(", "F", ")", "Malate", "dehydrogenase", "(", "MDH", ";", "0", ".", "2", "µM", ")", "was", "incubated", "at", "40", "°", "C", "in", "the", "absence", "(", "black", ")", "or", "presence", "of", "0", ".", "5", "µM", "WT", "HSP27", "(", "red", ")", "or", "0", ".", "5", "µM", "P182L", "HSP27", "(", "blue", ")", ".", "(", "G", ")", "Insulin", "(", "40", "µM", ")", "was", "incubated", "at", "40", "°", "C", "in", "the", "absence", "(", "black", ")", "or", "presence", "of", "20", "µM", "WT", "HSP27", "(", "red", ")", "or", "20", "µM", "P182L", "HSP27", "(", "blue", ")", ".", "The", "y", "-", "axes", "depict", "the", "absorbance", "at", "340", "nm", "due", "to", "the", "formation", "of", "large", "aggregates", ".", "The", "solid", "lines", "represent", "the", "average", "of", "three", "replicates", "with", "the", "filled", "area", "reflecting", "±", "one", "standard", "deviation", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(F) Malate dehydrogenase (MDH; 0.2 µM) was incubated at 40 °C in the absence (black) or presence of 0.5 µM WT HSP27 (red) or 0.5 µM P182L HSP27 (blue). (G) Insulin (40 µM) was incubated at 40 °C in the absence (black) or presence of 20 µM WT HSP27 (red) or 20 µM P182L HSP27 (blue). The y-axes depict the absorbance at 340 nm due to the formation of large aggregates. The solid lines represent the average of three replicates with the filled area reflecting ± one standard deviation."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "SEC", "-", "MALS", "data", "from", "WT", "HSP27", "and", "the", "P182L", "variant", ",", "with", "cHSP27", "included", "for", "comparison", ".", "All", "samples", "were", "injected", "at", "40", "µM", "concentration", "(", "monomer", ")", ".", "The", "respective", "average", "molecular", "masses", "are", "14", "MDa", ",", "470", "kDa", ",", "and", "18", "kDa", "for", "P182L", ",", "WT", "HSP27", ",", "and", "cHSP27", ".", "The", "normalized", "UV", "signals", "are", "plotted", "on", "the", "left", "y", "-", "axis", "as", "solid", "lines", "and", "the", "molecular", "masses", "are", "plotted", "on", "the", "right", "y", "-", "axis", "as", "circles", ".", "(", "B", ")", "Fractionation", "of", "HeLa", "cells", "overexpressing", "either", "HSP27", "or", "the", "P182L", "mutant", "by", "a", "10", "%", "to", "80", "%", "sucrose", "gradient", ".", "Western", "blot", "against", "anti", "-", "V5", "is", "shown", ".", "(", "C", ")", "Expression", "of", "V5", "-", "epitope", "-", "tagged", "HSP27", "(", "WT", "or", "P182L", "mutant", ")", "in", "HSP27", "knock", "-", "out", "HeLa", "cells", "and", "immunostaining", "of", "HSP27", ".", "The", "scale", "bars", "correspond", "to", "the", "non", "-", "expanded", "dimensions", ",", "derived", "by", "dividing", "by", "the", "sample", "expansion", "factor", "of", "4", ".", "3", ".", "(", "D", ")", "The", "P182L", "mutation", "decreases", "the", "density", "of", "HSP27", "spots", "upon", "detection", "of", "local", "fluorescence", "intensity", "maxima", "and", "quantification", "of", "the", "number", "of", "detected", "spots", "in", "expanded", "samples", "(", "n", "=", "30", ")", ".", "The", "error", "bar", "is", "the", "standard", "deviation", "for", "the", "different", "cytoplasmic", "regions", ".", "(", "E", ")", "Distribution", "of", "the", "intensity", "of", "individual", "spots", "(", "n", "=", "3342", ")", "after", "Gaussian", "fitting", "of", "fluorescence", "intensity", "in", "the", "neighborhood", "of", "detected", "spots", ".", "(", "F", ")", "Immunostaining", "of", "HSP27", "(", "white", ")", "in", "motor", "neurons", "differentiated", "from", "CMT", "patient", "-", "derived", "iPSCs", "that", "harbor", "the", "heterozygous", "P182L", "mutation", "reveals", "large", ",", "cytoplasmic", "aggregates", "(", "center", "and", "right", "panels", ")", ".", "The", "control", "motor", "neurons", "that", "contain", "WT", "HSP27", "do", "not", "show", "evidence", "of", "any", "aggregates", ".", "The", "nucleus", "is", "stained", "with", "Hoechst", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) SEC-MALS data from WT HSP27 and the P182L variant, with cHSP27 included for comparison. All samples were injected at 40 µM concentration (monomer). The respective average molecular masses are 14 MDa, 470 kDa, and 18 kDa for P182L, WT HSP27, and cHSP27. The normalized UV signals are plotted on the left y-axis as solid lines and the molecular masses are plotted on the right y-axis as circles.(B) Fractionation of HeLa cells overexpressing either HSP27 or the P182L mutant by a 10% to 80% sucrose gradient. Western blot against anti-V5 is shown.(C) Expression of V5-epitope-tagged HSP27 (WT or P182L mutant) in HSP27 knock-out HeLa cells and immunostaining of HSP27. The scale bars correspond to the non-expanded dimensions, derived by dividing by the sample expansion factor of 4.3. (D) The P182L mutation decreases the density of HSP27 spots upon detection of local fluorescence intensity maxima and quantification of the number of detected spots in expanded samples (n = 30). The error bar is the standard deviation for the different cytoplasmic regions. (E) Distribution of the intensity of individual spots (n = 3342) after Gaussian fitting of fluorescence intensity in the neighborhood of detected spots.(F) Immunostaining of HSP27 (white) in motor neurons differentiated from CMT patient-derived iPSCs that harbor the heterozygous P182L mutation reveals large, cytoplasmic aggregates (center and right panels). The control motor neurons that contain WT HSP27 do not show evidence of any aggregates. The nucleus is stained with Hoechst (blue). Scale bar, 10 µm."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Primary", "sequences", "of", "the", "WT", "peptide", "(", "red", ")", "and", "P182L", "peptide", "(", "blue", ")", ".", "The", "IxI", "/", "V", "motif", "is", "indicated", "with", "white", "text", ".", "Below", ":", "regions", "of", "2D", "1H", "-", "15N", "HSQC", "spectra", "of", "15N", "-", "labeled", "cHSP27", "(", "black", ")", "in", "the", "presence", "of", "increasing", "amounts", "of", "WT", "(", "red", ")", "or", "P182L", "peptide", "(", "blue", ")", ".", "Resonances", "in", "the", "β4", "and", "β8", "strands", "broaden", "and", "disappear", "upon", "peptide", "binding", ",", "indicative", "of", "intermediate", "exchange", ".", "(", "B", ")", "Zoomed", "-", "in", "regions", "of", "resonances", "during", "the", "peptide", "titrations", ".", "The", "color", "bars", "indicate", "the", "amount", "of", "added", "WT", "or", "P182L", "peptide", ".", "(", "C", ")", "The", "combined", "1HN", "and", "15N", "chemical", "shift", "changes", ",", "denoted", "as", "chemical", "shift", "perturbation", "(", "CSP", ")", ",", "are", "plotted", "as", "a", "function", "of", "added", "peptide", "concentration", ".", "(", "D", ")", "CSPs", "shown", "as", "a", "function", "of", "residue", "number", "for", "the", "WT", "(", "red", ")", "and", "P182L", "peptide", "(", "blue", ")", ".", "(", "E", ")", "X", "-", "ray", "structure", "of", "cHSP27", "bound", "to", "the", "WT", "peptide", "(", "PDB", ":", "4mjh", ")", ",", "shown", "in", "white", "sticks", ",", "with", "the", "results", "from", "(", "D", ")", "plotted", "onto", "the", "structure", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Primary sequences of the WT peptide (red) and P182L peptide (blue). The IxI/V motif is indicated with white text. Below: regions of 2D 1H-15N HSQC spectra of 15N-labeled cHSP27 (black) in the presence of increasing amounts of WT (red) or P182L peptide (blue). Resonances in the β4 and β8 strands broaden and disappear upon peptide binding, indicative of intermediate exchange. (B) Zoomed-in regions of resonances during the peptide titrations. The color bars indicate the amount of added WT or P182L peptide. (C) The combined 1HN and 15N chemical shift changes, denoted as chemical shift perturbation (CSP), are plotted as a function of added peptide concentration. (D) CSPs shown as a function of residue number for the WT (red) and P182L peptide (blue). (E) X-ray structure of cHSP27 bound to the WT peptide (PDB: 4mjh), shown in white sticks, with the results from (D) plotted onto the structure."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ",", "B", ")", "i", ".", "15N", "CPMG", "RD", "data", "for", "residues", "in", "the", "β4", "strand", "(", "T113", ")", "and", "the", "β8", "strand", "(", "S154", ")", "in", "the", "absence", "of", "added", "peptide", ".", "CPMG", "data", "are", "shown", "for", "the", "same", "residues", "in", "the", "presence", "of", "ii", ".", "ca", ".", "2", "%", "cHSP27", "-", "WT", "peptide", "complex", "or", "iii", ".", "ca", ".", "2", "%", "of", "the", "cHSP27", "-", "P182L", "peptide", "complex", ".", "Uncertainties", "in", "R2", ",", "eff", "values", "are", "derived", "from", "the", "standard", "deviations", "of", "fitted", "peak", "intensities", "obtained", "from", "duplicated", "νCPMG", "values", ".", "(", "C", ")", "i", ".", "The", "association", "(", "kon", ")", "and", "dissociation", "(", "koff", ")", "rates", "for", "WT", "(", "red", ")", "and", "P182L", "(", "blue", ")", "IxI", "/", "V", "peptide", "binding", "to", "the", "ACD", ",", "calculated", "directly", "from", "the", "CPMG", "RD", "data", ".", "Residues", "that", "are", "impacted", "by", "the", "presence", "of", "a", "small", "amount", "of", "peptide", "are", "indicated", "by", "red", "(", "ii", ".", ",", "WT", ")", "and", "blue", "(", "iii", ".", ",", "P182L", ")", "spheres", ".", "In", "both", "cases", ",", "residues", "in", "similar", "ACD", "regions", "show", "enhanced", "Rex", ",", "indicative", "of", "chemical", "exchange", "at", "similar", "sites", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A, B) i. 15N CPMG RD data for residues in the β4 strand (T113) and the β8 strand (S154) in the absence of added peptide. CPMG data are shown for the same residues in the presence of ii. ca. 2% cHSP27-WT peptide complex or iii. ca. 2% of the cHSP27-P182L peptide complex. Uncertainties in R2,eff values are derived from the standard deviations of fitted peak intensities obtained from duplicated νCPMG values. (C) i. The association (kon) and dissociation (koff) rates for WT (red) and P182L (blue) IxI/V peptide binding to the ACD, calculated directly from the CPMG RD data. Residues that are impacted by the presence of a small amount of peptide are indicated by red (ii., WT) and blue (iii., P182L) spheres. In both cases, residues in similar ACD regions show enhanced Rex, indicative of chemical exchange at similar sites."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "B", ")", "Volcano", "plot", "representing", "the", "interactors", "that", "are", "enriched", "for", "the", "P182L", "mutant", "versus", "GFP", "as", "a", "negative", "control", ",", "obtained", "with", "affinity", "-", "enrichment", "mass", "spectrometry", ".", "Proteins", "that", "co", "-", "immunoprecipitated", "significantly", "more", "(", "p", "<", "0", ".", "05", ")", "with", "the", "P182L", "variant", "are", "shown", "in", "the", "upper", "right", "quadrant", ".", "Interactors", "with", "one", "or", "more", "[", "I", "/", "V", "]", "-", "x", "-", "[", "I", "/", "V", "]", "motifs", "are", "displayed", "in", "red", "while", "other", "significantly", "enriched", "interactors", "are", "displayed", "in", "black", ".", "(", "C", "-", "D", ")", "Co", "-", "immunoprecipitation", "from", "HeLa", "cells", "stably", "overexpressing", "V5", "-", "epitope", "-", "tagged", "HSP27", "(", "WT", "or", "P182L", "mutant", ")", "using", "anti", "-", "V5", "beads", ".", "Co", "-", "immunoprecipitation", "was", "quantified", "and", "presented", "as", "a", "percentage", "relative", "to", "the", "P182L", "variant", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "The", "mean", "±", "one", "standard", "deviation", "(", "n", "=", "3", ")", "is", "shown", ".", "Right", ":", "the", "location", "of", "Pro182", "(", "red", ")", "in", "the", "crystal", "structure", "of", "peptide", "-", "bound", "cHSP27", "(", "PDB", ":", "4mjh", ")", "and", "in", "silico", "creation", "of", "the", "P182L", "mutation", "(", "blue", ")", ".", "The", "peptide", "is", "shown", "in", "white", "sticks", ".", "P182L", "specifically", "weakens", "binding", "of", "the", "HSP27", "IxI", "/", "V", "motif", ".", "(", "E", ")", "Co", "-", "immunoprecipitation", "from", "HeLa", "cells", "stably", "overexpressing", "V5", "-", "epitope", "-", "tagged", "HSP27", "(", "WT", "or", "P182L", "mutant", ")", "and", "transiently", "transfected", "with", "BAG3", "-", "eGFP", "(", "WT", "or", "IPV", "-", "mutant", ")", "using", "anti", "-", "GFP", "beads", ".", "Western", "blots", "for", "anti", "-", "GFP", "(", "BAG3", ")", ",", "V5", "(", "HSPB1", ")", ",", "and", "α", "-", "tubulin", ".", "NS", "indicates", "a", "non", "-", "specific", "band", ".", "Note", "that", "detection", "of", "BAG3", "(", "anti", "-", "GFP", ")", "and", "HSP27", "(", "anti", "-", "V5", ")", "occurs", "with", "different", "antibodies", ".", "The", "locations", "of", "the", "IPV", "-", "to", "-", "GPG", "mutations", "in", "BAG3", "are", "depicted", "below", ".", "(", "F", ")", "Co", "-", "immunoprecipitation", "from", "HeLa", "cells", "transiently", "transfected", "with", "V5", "-", "epitope", "-", "tagged", "HSP27", "(", "P182L", "or", "S155Q", "/", "P182L", "mutant", ")", "using", "anti", "-", "V5", "beads", "(", "n", "=", "2", ")", ".", "Right", ":", "the", "location", "of", "Ser155", "(", "red", ")", "in", "the", "crystal", "structure", "of", "peptide", "-", "bound", "cHSP27", "(", "PDB", ":", "4mjh", ")", "and", "in", "silico", "creation", "of", "the", "S155Q", "mutation", "(", "purple", ")", "showing", "a", "clash", "with", "the", "bound", "peptide", ".", "The", "peptide", "is", "shown", "in", "white", "sticks", ".", "S155Q", "disrupts", "binding", "of", "all", "IxI", "/", "V", "motifs", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(B) Volcano plot representing the interactors that are enriched for the P182L mutant versus GFP as a negative control, obtained with affinity-enrichment mass spectrometry. Proteins that co-immunoprecipitated significantly more (p<0.05) with the P182L variant are shown in the upper right quadrant. Interactors with one or more [I/V]-x-[I/V] motifs are displayed in red while other significantly enriched interactors are displayed in black.(C-D) Co-immunoprecipitation from HeLa cells stably overexpressing V5-epitope-tagged HSP27 (WT or P182L mutant) using anti-V5 beads. Co-immunoprecipitation was quantified and presented as a percentage relative to the P182L variant (n=3). The mean ± one standard deviation (n=3) is shown. Right: the location of Pro182 (red) in the crystal structure of peptide-bound cHSP27 (PDB: 4mjh) and in silico creation of the P182L mutation (blue). The peptide is shown in white sticks. P182L specifically weakens binding of the HSP27 IxI/V motif.(E) Co-immunoprecipitation from HeLa cells stably overexpressing V5-epitope-tagged HSP27 (WT or P182L mutant) and transiently transfected with BAG3-eGFP (WT or IPV-mutant) using anti-GFP beads. Western blots for anti-GFP (BAG3), V5 (HSPB1), and α-tubulin. NS indicates a non-specific band. Note that detection of BAG3 (anti-GFP) and HSP27 (anti-V5) occurs with different antibodies. The locations of the IPV-to-GPG mutations in BAG3 are depicted below.(F) Co-immunoprecipitation from HeLa cells transiently transfected with V5-epitope-tagged HSP27 (P182L or S155Q/P182L mutant) using anti-V5 beads (n=2). Right: the location of Ser155 (red) in the crystal structure of peptide-bound cHSP27 (PDB: 4mjh) and in silico creation of the S155Q mutation (purple) showing a clash with the bound peptide. The peptide is shown in white sticks.S155Q disrupts binding of all IxI/V motifs."}
{"words": ["Figure", "2B", ")", "Western", "blot", "assays", "for", "the", "expression", "level", "of", "TFAM", "in", "ten", "HCC", "cell", "lines", ",", "one", "normal", "liver", "cell", "line", "(", "LO2", ")", "and", "two", "non", "-", "tumor", "liver", "tissues", ".", "The", "protein", "level", "was", "quantified", "as", "ratios", "between", "TFAM", "and", "GAPDH", "(", "n", " ", "=", " ", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "Data", "information", ":", "Graphs", "show", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "(", "C", ")", "Western", "blot", "and", "quantitative", "analysis", "for", "the", "expression", "of", "TFAM", "in", "HCC", "cells", "with", "TFAM", "stable", "knockdown", "and", "control", "cells", "(", "n", " ", "=", " ", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "shCtrl", ",", "control", "shRNA", ";", "shTFAM", ",", "shRNA", "against", "TFAM", ";", "EV", ",", "empty", "vector", ";", "TFAM", ",", "expression", "vector", "encoding", "TFAM", ".", "Data", "information", ":", "Graphs", "show", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "(", "D", ",", "E", ")", "Wound", "-", "healing", "migration", "assay", "(", "D", ")", "and", "Transwell", "migration", "and", "invasion", "assays", "(", "E", ")", "for", "HCC", "cells", "with", "treatment", "as", "indicated", "(", "n", " ", "=", " ", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "100μm", ".", "Data", "information", ":", "Graphs", "show", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "(", "G", ")", "Representative", "H", "&", "E", "images", "of", "lung", "metastasis", "in", "mice", "used", "in", "(", "F", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "100μm", ".", "(", "H", ",", "Number", "of", "metastatic", "nodules", "per", "lung", "(", "H", ")", "in", "mice", "used", "in", "(", "F", ")", ".", "Data", "information", ":", "Graphs", "show", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B) Western blot assays for the expression level of TFAM in ten HCC cell lines, one normal liver cell line (LO2) and two non-tumor liver tissues. The protein level was quantified as ratios between TFAM and GAPDH (n = 3 independent experiments). Data information: Graphs show mean ± s.e.m., two-tailed unpaired t-test. **P < 0.01.(C) Western blot and quantitative analysis for the expression of TFAM in HCC cells with TFAM stable knockdown and control cells (n = 3 independent experiments). shCtrl, control shRNA; shTFAM, shRNA against TFAM; EV, empty vector; TFAM, expression vector encoding TFAM. Data information: Graphs show mean ± s.e.m., two-tailed unpaired t-test. **P < 0.01.(D, E) Wound-healing migration assay (D) and Transwell migration and invasion assays (E) for HCC cells with treatment as indicated (n = 3 independent experiments). Scale bars, 100μm. Data information: Graphs show mean ± s.e.m., two-tailed unpaired t-test. **P < 0.01.(G) Representative H&E images of lung metastasis in mice used in (F). Scale bars, 100μm. (H, Number of metastatic nodules per lung (H) in mice used in (F). Data information: Graphs show mean ± s.e.m., two-tailed unpaired t-test. **P < 0.01."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "C", ")", "Immunofluorescence", "analysis", "of", "TFAM", "and", "Phalloidin", "staining", "in", "human", "HCC", "cells", "from", "paired", "clinical", "samples", "(", "n", "=", "100", ")", ".", "The", "3D", "reconstruction", "of", "z", "-", "stacks", "from", "nuclear", "region", "is", "showed", "in", "the", "right", "side", ".", "Red", ":", "LifeAct", ",", "Blue", ":", "DAPI", ",", "Green", ":", "TFAM", ".", "Scale", "bars", ",", "20μm", "for", "microscopy", "images", ",", "40μm", "for", "3D", "reconstruction", ".", "(", "D", ")", "Statistical", "analysis", "for", "fluorescent", "intensity", "of", "nuclear", "F", "-", "actin", "in", "(", "A", ")", ",", "(", "B", ")", "and", "(", "C", ")", ".", "Fluorescence", "intensity", "are", "quantified", "from", "at", "least", "30", "cells", "for", "each", "group", "in", "(", "A", ")", "and", "(", "B", ")", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(C) Immunofluorescence analysis of TFAM and Phalloidin staining in human HCC cells from paired clinical samples (n=100). The 3D reconstruction of z-stacks from nuclear region is showed in the right side. Red: LifeAct, Blue: DAPI, Green: TFAM. Scale bars, 20μm for microscopy images, 40μm for 3D reconstruction.(D) Statistical analysis for fluorescent intensity of nuclear F-actin in (A), (B) and (C). Fluorescence intensity are quantified from at least 30 cells for each group in (A) and (B). One-way ANOVA. *P < 0.05; **P < 0.01."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "E", ")", "Representative", "H", "&", "E", "images", "of", "lung", "metastasis", "in", "mice", "used", "in", "(", "D", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "100μm", ".", "(", "F", "and", "G", ")", "Number", "of", "metastatic", "nodules", "per", "lung", "in", "mice", "used", "in", "(", "F", ")", "and", "the", "incidence", "of", "lung", "metastasis", "(", "G", ")", "in", "mice", "used", "in", "(", "D", ")", ".", "Data", "information", ":", "Graphs", "show", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(E) Representative H&E images of lung metastasis in mice used in (D). Scale bars, 100μm. (F and G) Number of metastatic nodules per lung in mice used in (F) and the incidence of lung metastasis (G) in mice used in (D). Data information: Graphs show mean ± s.e.m., two-tailed unpaired t-test. **P < 0.01."}
{"words": ["Figure", "5F", ")", "Western", "blot", "assays", "for", "protein", "expression", "levels", "of", "metastasis", "related", "gene", "in", "HCC", "cells", "(", "n", " ", "=", " ", "3", "independent", "experiments", ")", "and", "tumor", "tissues", "from", "mice", "(", "n", "=", "4", "per", "group", ")", "with", "treatments", "as", "indicated", ".", "Data", "information", ":", "Graphs", "show", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "(", "H", "Western", "blot", "assays", "levels", "of", "FN1", ",", "ITGB3", "in", "HCC", "cells", "with", "treatment", "as", "indicated", "(", "n", " ", "=", " ", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "Data", "information", ":", "Graphs", "show", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5F) Western blot assays for protein expression levels of metastasis related gene in HCC cells (n = 3 independent experiments) and tumor tissues from mice (n =4 per group) with treatments as indicated. Data information: Graphs show mean ± s.e.m., two-tailed unpaired t-test. *P < 0.05; **P < 0.01.(H Western blot assays levels of FN1, ITGB3 in HCC cells with treatment as indicated (n = 3 independent experiments). Data information: Graphs show mean ± s.e.m., two-tailed unpaired t-test. *P < 0.05; **P < 0.01."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Western", "blot", "analyses", "for", "the", "protein", "level", "of", "key", "regulators", "of", "actin", "polymerization", "in", "the", "cytoplasm", "and", "nucleus", "of", "HCC", "cells", "with", "treatment", "as", "indicated", ".", "Tublin", "and", "Lamin", "B1", "were", "used", "as", "loading", "controls", "for", "the", "cytoplasm", "and", "nucleus", ",", "respectively", "(", "n", " ", "=", " ", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "(", "B", ")", "Western", "blot", "analyses", "for", "the", "protein", "level", "in", "tissues", "of", "mouse", "liver", "tumor", "induced", "by", "Akt", "/", "β", "-", "catenin", "(", "n", " ", "=", " ", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "Representative", "IHC", "images", "of", "mDia2", "nuclear", "translocation", "in", "human", "(", "E", ")", "HCC", "tissues", ".", "NT", ",", "non", "-", "tumor", "liver", "tissues", ",", "n", "=", "100", ";", "MT", ",", "metastatic", "tumor", "tissues", ",", "n", "=", "58", ";", "NMT", ",", "non", "-", "metastatic", "tumor", "tissues", "n", "=", "42", ".", "Scale", "bars", ",", "25μm", ".", "(", "F", ")", "Positive", "rates", "of", "mDia2", "in", "nucleus", "and", "cytoplasm", "was", "calculated", "based", "on", "the", "IHC", "assay", "in", "(", "E", ")", ".", "Graphs", "show", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "(", "H", "and", "I", ")", "Spearman", "correlation", "analysis", "between", "the", "positive", "rates", "of", "nuclear", "mDia2", "and", "the", "TFAM", "expression", "level", "(", "or", "positive", "rates", "of", "nuclear", "F", "-", "actin", ")", "based", "on", "the", "IHC", "assay", "in", "(", "E", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Western blot analyses for the protein level of key regulators of actin polymerization in the cytoplasm and nucleus of HCC cells with treatment as indicated. Tublin and Lamin B1 were used as loading controls for the cytoplasm and nucleus, respectively (n = 3 independent experiments).(B) Western blot analyses for the protein level in tissues of mouse liver tumor induced by Akt/β-catenin (n = 3 independent experiments).Representative IHC images of mDia2 nuclear translocation in human (E) HCC tissues. NT, non-tumor liver tissues, n=100; MT, metastatic tumor tissues, n=58; NMT, non-metastatic tumor tissues n=42. Scale bars, 25μm. (F) Positive rates of mDia2 in nucleus and cytoplasm was calculated based on the IHC assay in (E). Graphs show mean ± s.e.m. One-way ANOVA. **P < 0.01.(H and I) Spearman correlation analysis between the positive rates of nuclear mDia2 and the TFAM expression level (or positive rates of nuclear F-actin) based on the IHC assay in (E)."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "D", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "anti", "-", "mDia2", "IPs", "and", "whole", "-", "cell", "lysates", "(", "WCL", ")", "derived", "from", "HCC", "cells", "and", "mouse", "tumor", "tissues", "(", "n", " ", "=", " ", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "NT", ",", "non", "-", "tumor", "liver", "tissues", ";", "MT", ",", "metastatic", "tumor", "tissues", ";", "NMT", ",", "non", "-", "metastatic", "tumor", "tissues", ".", "(", "E", ")", "The", "level", "of", "malonylated", "mDia2", ".", "Equal", "amount", "of", "immunoprecipitated", "mDia2", "either", "from", "TFAM", "knockdown", "or", "control", "cells", "was", "loaded", "in", "Western", "blot", "assay", ".", "(", "F", ")", "Western", "blot", "analysis", "for", "the", "distribution", "of", "mDia2", "in", "SNU", "-", "368", "cells", "incubated", "with", "malonyl", "-", "CoA", "(", "5", "μM", ")", "or", "ND", "-", "630", "(", "10", "μM", ")", "(", "n", " ", "=", " ", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "(", "H", ")", "Representative", "H", "&", "E", "images", "of", "lung", "metastasis", "in", "mice", "used", "in", "(", "G", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "100μm", ".", "(", "I", ")", "Number", "of", "metastatic", "nodules", "per", "lung", "in", "mice", "used", "in", "(", "G", ")", ".", "Data", "information", ":", "Graphs", "show", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", "for", ",", "I", ")", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(D) Western blot analysis of anti-mDia2 IPs and whole-cell lysates (WCL) derived from HCC cells and mouse tumor tissues (n = 3 independent experiments). NT, non-tumor liver tissues; MT, metastatic tumor tissues; NMT, non-metastatic tumor tissues.(E) The level of malonylated mDia2. Equal amount of immunoprecipitated mDia2 either from TFAM knockdown or control cells was loaded in Western blot assay.(F) Western blot analysis for the distribution of mDia2 in SNU-368 cells incubated with malonyl-CoA (5 μM) or ND-630 (10 μM) (n = 3 independent experiments).(H) Representative H&E images of lung metastasis in mice used in (G). Scale bars, 100μm. (I) Number of metastatic nodules per lung in mice used in (G). Data information: Graphs show mean ± s.e.m., two-tailed unpaired t-test for , I). *P < 0.05; **P < 0.01."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "A", ")", "IHC", "scores", "of", "TFAM", "in", "429", "paired", "tissues", "from", "HCC", "patients", ".", "The", "relative", "expression", "ratio", "of", "tumor", "to", "non", "-", "tumor", "was", "log2", "-", "transformed", ".", "T", ",", "tumor", "tissues", ";", "NT", ",", "non", "-", "tumor", "liver", "tissues", ".", "(", "B", ")", "mRNA", "level", "of", "TFAM", "in", "50", "HCC", "patients", "'", "paired", "tissues", "from", "TCGA", "database", ".", "The", "relative", "expression", "ratio", "of", "tumor", "to", "non", "-", "tumor", "was", "log2", "-", "transformed", ".", "(", "C", ")", "Representative", "images", "of", "IHC", "staining", "of", "TFAM", "(", "top", "panel", ")", "and", "scores", "(", "bottom", "panel", ")", "in", "HCC", "tumor", "tissues", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "MT", ",", "metastatic", "tumor", "tissues", ";", "NMT", ",", "non", "-", "metastatic", "tumor", "tissues", ".", "Scale", "bars", ",", "25μm", ".", "Boxes", ":", "first", "quartile", "to", "third", "quartile", ";", "Whiskers", ":", "minimum", "value", "to", "maximum", "value", ";", "Central", "band", ":", "median", ".", "(", "D", "Kaplan", "-", "Meier", "curves", "for", "overall", "survival", "of", "HCC", "patients", "stratified", "by", "TFAM", "expression", ".", "(", "F", "Kaplan", "-", "Meier", "curves", "for", "overall", "survival", "of", "HCC", "patients", "stratified", "by", "nuclear", "F", "-", "actin", "positive", "rates", ".", "E", ")", "the", "recurrence", "of", "HCC", "patients", "stratified", "by", "TFAM", "expression", ".", "G", ")", "the", "recurrence", "of", "HCC", "patients", "stratified", "by", "nuclear", "F", "-", "actin", "positive", "rates", ".", "(", "H", ")", "Representative", "images", "of", "IHC", "staining", "of", "TFAM", ",", "FN1", "and", "ITGB3", "from", "two", "HCC", "patients", ".", "Scale", "bars", ",", "25μm", ".", "(", "I", ")", "Spearman", "correlation", "analysis", "between", "the", "levels", "of", "TFAM", "and", "FN1", ",", "IL", "-", "6", ",", "TGFB1", "or", "ITGB3", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(A) IHC scores of TFAM in 429 paired tissues from HCC patients. The relative expression ratio of tumor to non-tumor was log2-transformed. T, tumor tissues; NT, non-tumor liver tissues.(B) mRNA level of TFAM in 50 HCC patients' paired tissues from TCGA database. The relative expression ratio of tumor to non-tumor was log2-transformed.(C) Representative images of IHC staining of TFAM (top panel) and scores (bottom panel) in HCC tumor tissues. One-way ANOVA. *P < 0.05; **P < 0.01. MT, metastatic tumor tissues; NMT, non-metastatic tumor tissues. Scale bars, 25μm. Boxes: first quartile to third quartile; Whiskers: minimum value to maximum value; Central band: median.(D Kaplan-Meier curves for overall survival of HCC patients stratified by TFAM expression. (F Kaplan-Meier curves for overall survival of HCC patients stratified by nuclear F-actin positive rates.E) the recurrence of HCC patients stratified by TFAM expression. G) the recurrence of HCC patients stratified by nuclear F-actin positive rates.(H) Representative images of IHC staining of TFAM, FN1 and ITGB3 from two HCC patients. Scale bars, 25μm. (I) Spearman correlation analysis between the levels of TFAM and FN1, IL-6, TGFB1 or ITGB3."}
{"words": ["Figure", "1b", ",", "Representative", "confocal", "images", "of", "NeuN", "(", "green", ")", "and", "Npas4", "(", "red", ")", "immunostaining", "performed", "1h", "after", "the", "last", "injection", "of", "cocaine", "or", "saline", "(", "scale", "bar", ":", "50", "µm", ")", ".", "c", ",", "Quantifications", "of", "Npas4", "-", "positive", "cells", "(", "fold", "change", "normalized", "to", "the", "30min", "saline", "control", "group", ")", "in", "the", "NAc", "and", "dStr", ".", "Mean", "+", "SEM", ";", "n", "=", "4", "mice", "per", "group", ".", "10", "images", "(", "5", "per", "hemisphere", ")", "per", "mouse", "for", "the", "NAc", "and", "10", "images", "(", "5", "per", "hemisphere", ")", "for", "the", "dStr", ".", "p", "*", "*", "<", "0", ".", "01", ",", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1b, Representative confocal images of NeuN (green) and Npas4 (red) immunostaining performed 1h after the last injection of cocaine or saline (scale bar: 50 µm).c, Quantifications of Npas4-positive cells (fold change normalized to the 30min saline control group) in the NAc and dStr. Mean + SEM; n = 4 mice per group. 10 images (5 per hemisphere) per mouse for the NAc and 10 images (5 per hemisphere) for the dStr. p** < 0.01, unpaired Student's t-test."}
{"words": ["Figure", "2c", ",", "MSN", "cultures", "at", "DIV11", "were", "treated", "for", "2h", "with", "either", "10", "µM", "of", "the", "D1", "-", "agonist", "SKF", "-", "38393", "(", "SKF", ")", "alone", "or", "with", "SKF", "and", "10", "µM", "of", "the", "selective", "D1", "-", "antagonist", "SCH", "-", "23390", "(", "SCH", ")", ".", "qPCR", "was", "performed", "to", "determine", "the", "relative", "mRNA", "levels", "of", "the", "immediate", "early", "genes", "cFos", "and", "Arc", ".", "Mean", "+", "SEM", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Holm", "-", "Sidak", "post", "-", "hoc", "correction", ";", "p", "*", "*", "<", "0", ".", "01", ",", "p", "*", "*", "*", "*", "<", "0", ".", "0001", ";", "n", "=", "3", "independent", "cultures", "as", "biological", "replicates", ".", "d", ",", "MSNs", "were", "depolarized", "with", "potassium", "chloride", "(", "HiK", ",", "55", "mM", ")", "or", "treated", "with", "the", "D1", "-", "agonist", "SKF", "-", "38393", "(", "10", "µM", ")", "for", "1h", ",", "2h", "or", "4h", ".", "Subsequently", ",", "qPCR", "was", "performed", "to", "assess", "immediate", "early", "gene", "mRNA", "levels", ".", "Mean", "+", "SEM", ";", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "post", "-", "hoc", "test", ";", "indicated", "p", "-", "values", "for", "induction", "over", "control", "for", "each", "treatment", ";", "p", "*", "<", "0", ".", "05", ",", "p", "*", "*", "<", "0", ".", "01", ",", "p", "*", "*", "*", "<", "0", ".", "001", ";", "n", "=", "4", "independent", "cultures", "as", "biological", "replicates", ".", "g", ",", "Differential", "induction", "of", "Npas4", "through", "HiK", "and", "not", "forskolin", "in", "hiPSC", "-", "derived", "forebrain", "organoids", ".", "Organoids", "were", "treated", "with", "HiK", "(", "55", "mM", ")", "or", "the", "PKA", "activator", "forskolin", "plus", "TTX", "(", "Fsk", ",", "10", "µM", ";", "TTX", "1", "µM", ")", "for", "1h", "before", "qPCR", "analysis", "was", "performed", "to", "assess", "mRNA", "levels", "of", "Npas4", "and", "Arc", ".", "Mean", "+", "SEM", ";", "n", "=", "7", "organoids", "in", "control", "condition", ",", "n", "=", "5", "organoids", "for", "HiK", ",", "n", "=", "5", "organoids", "for", "Fsk", "/", "TTX", ".", "One", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "hoc", "test", ",", "ns", "=", "not", "significant", ",", "p", "*", "<", "0", ".", "05", ",", "p", "*", "*", "*", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2c, MSN cultures at DIV11 were treated for 2h with either 10 µM of the D1-agonist SKF-38393 (SKF) alone or with SKF and 10 µM of the selective D1-antagonist SCH-23390 (SCH). qPCR was performed to determine the relative mRNA levels of the immediate early genes cFos and Arc. Mean + SEM; one-way ANOVA with Holm-Sidak post-hoc correction; p** < 0.01, p**** < 0.0001; n = 3 independent cultures as biological replicates.d, MSNs were depolarized with potassium chloride (HiK, 55 mM) or treated with the D1-agonist SKF-38393 (10 µM) for 1h, 2h or 4h. Subsequently, qPCR was performed to assess immediate early gene mRNA levels. Mean + SEM; two-way ANOVA with Bonferroni post-hoc test; indicated p-values for induction over control for each treatment; p* < 0.05, p** < 0.01, p***<0.001; n = 4 independent cultures as biological replicates.g, Differential induction of Npas4 through HiK and not forskolin in hiPSC-derived forebrain organoids. Organoids were treated with HiK (55 mM) or the PKA activator forskolin plus TTX (Fsk, 10 µM; TTX 1 µM) for 1h before qPCR analysis was performed to assess mRNA levels of Npas4 and Arc. Mean + SEM; n = 7 organoids in control condition, n = 5 organoids for HiK, n = 5 organoids for Fsk/TTX. One-way ANOVA with Tukey's post-hoc test, ns = not significant, p* < 0.05, p***<0.001."}
{"words": ["Figure", "3MSN", "cultures", "were", "stimulated", "with", "HiK", "(", "55", "mM", ")", "for", "1h", "in", "the", "presence", "of", "various", "pharmacologicals", "to", "dissect", "the", "synapse", "-", "to", "-", "nucleus", "cascades", "mediating", "transcription", "of", "Npas4", ",", "Fosb", "and", "Arc", ".", "Values", "were", "normalized", "to", "the", "induced", "condition", "to", "compare", "for", "differences", "in", "induction", "between", "treatments", ".", "Mean", "+", "SEM", "and", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "post", "-", "hoc", "correction", "were", "used", "in", "all", "experiments", ".", "p", "*", "<", "0", ".", "05", ",", "p", "*", "*", "<", "0", ".", "01", ",", "p", "*", "*", "*", "<", "0", ".", "001", ",", "p", "*", "*", "*", "*", "<", "0", ".", "0001", ".", "n", "-", "number", "indicated", "in", "each", "panel", ".", "a", ",", "co", "-", "incubation", "with", "the", "NMDA", "receptor", "blocker", "APV", "(", "100", "mM", ",", "applied", "5min", "before", ")", "reveals", "that", "all", "IEG", "inductions", "through", "HiK", "in", "MSNs", "depend", "on", "NDMA", "receptor", "activity", ".", "Mean", "+", "SEM", ";", "n", "=", "4", "independent", "cultures", "as", "biological", "replicates", ".", "b", ",", "blockade", "of", "voltage", "-", "dependent", "calcium", "channels", "through", "verapamil", "(", "30", "µM", ",", "5min", "before", ")", "and", "TTX", "(", "1", "µM", ",", "5min", ",", "to", "prevent", "verapamil", "-", "induced", "bursting", ")", "leads", "to", "significant", "reduction", "in", "gene", "-", "inductions", "for", "Npas4", "and", "Fosb", ".", "Mean", "+", "SEM", ";", "n", "=", "4", "independent", "cultures", "as", "biological", "replicates", ".", "c", ",", "inhibition", "of", "ERK1", "/", "2", "through", "UO126", "(", "10", "µM", ",", "20min", "before", ")", "leads", "to", "significant", "blockade", "of", "mRNA", "induction", "for", "Arc", "and", "Fosb", ",", "but", "not", "Npas4", ".", "Mean", "+", "SEM", ";", "n", "=", "3", "independent", "cultures", "as", "biological", "replicates", ".", "d", ",", "inhibition", "of", "p38alpha", "and", "p38beta", "through", "SB203580", "or", "SB202190", "respectively", "(", "both", "10", "µM", "and", "20min", "before", ")", "leads", "to", "significant", "reductions", "in", "mRNA", "induction", "for", "Arc", "and", "Fosb", ",", "but", "not", "Npas4", ".", "Mean", "+", "SEM", ";", "n", "=", "3", "independent", "cultures", "as", "biological", "replicates", ".", "e", ",", "blockade", "of", "PKA", "activity", "through", "H", "-", "89", "(", "10", "µM", ",", "20min", "before", ")", "leads", "to", "reduced", "induction", "of", "Arc", ",", "unaffected", "induction", "of", "Fosb", "and", "a", "superinduction", "of", "Npas4", ".", "Mean", "+", "SEM", ";", "n", "=", "3", "independent", "cultures", "as", "biological", "replicates", ".", "f", ",", "inhibition", "of", "calcineurin", "through", "co", "-", "application", "of", "Cyclosporin", "and", "FK506", "(", "1", "µM", "each", ",", "20min", "before", ")", "leads", "to", "unaffected", "induction", "of", "mRNAs", "for", "Arc", "and", "Fosb", ",", "but", "significantly", "reduced", "levels", "of", "Npas4", ".", "Mean", "+", "SEM", ";", "n", "=", "3", "independent", "cultures", "as", "biological", "replicates", ".", "MSN", "cultures", "were", "stimulated", "with", "HiK", "(", "55", "mM", ")", "for", "1h", "in", "the", "presence", "of", "various", "pharmacologicals", "to", "dissect", "the", "synapse", "-", "to", "-", "nucleus", "cascades", "mediating", "transcription", "of", "Npas4", ",", "Fosb", "and", "Arc", ".", "Values", "were", "normalized", "to", "the", "induced", "condition", "to", "compare", "for", "differences", "in", "induction", "between", "treatments", ".", "Mean", "+", "SEM", "and", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "post", "-", "hoc", "correction", "were", "used", "in", "all", "experiments", ".", "p", "*", "<", "0", ".", "05", ",", "p", "*", "*", "<", "0", ".", "01", ",", "p", "*", "*", "*", "<", "0", ".", "001", ",", "p", "*", "*", "*", "*", "<", "0", ".", "0001", ".", "n", "-", "number", "indicated", "in", "each", "panel", ".", "g", ",", "blockade", "of", "CaMKII", "/", "IV", "through", "application", "of", "KN", "-", "93", "(", "1", "µM", ",", "20min", "before", ")", "leads", "to", "significantly", "reduced", "mRNA", "inductions", "of", "Arc", ",", "Fosb", "and", "Npas4", ".", "Mean", "+", "SEM", ";", "n", "=", "4", "independent", "cultures", "as", "biological", "replicates", ".", "h", ",", "co", "-", "application", "of", "HiK", "and", "SKF", "reveals", "synergistic", "effects", "on", "mRNA", "induction", "of", "Fosb", "but", "not", "Arc", "or", "Npas4", ",", "Mean", "+", "SEM", ";", "n", "=", "6", "independent", "cultures", "as", "biological", "replicates", ".", "investigating", "the", "role", "of", "nuclear", "calcium", "signaling", "in", "mRNA", "induction", "of", "Arc", ",", "Fosb", "and", "Npas4", ".", "k", ",", "immunohistochemical", "analysis", "of", "MSNs", "infected", "with", "mCherry", "-", "NLS", "as", "control", "or", "the", "competitive", "nuclear", "Ca2", "+", "/", "CaM", "antagonist", "CaMBP4", "-", "mCherry", ".", "Infection", "on", "DIV4", ",", "fixation", "on", "DIV11", ".", "D32", "=", "anti", "-", "Darpp", "-", "32", ".", "scale", "bar", "=", "10", "µm", ".", "l", ",", "MSNs", "expressing", "rAAV", "-", "mCherry", "-", "control", "or", "CaMBP4", "(", "BP4", ")", "were", "treated", "with", "55mM", "HiK", "for", "1h", "and", "qPCR", "analysis", "was", "performed", "for", "the", "indicated", "IEGs", ".", "Mean", "+", "SEM", ";", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "post", "-", "hoc", "test", ",", "ns", "=", "not", "significant", ",", "p", "*", "*", "*", "*", "<", "0", ".", "0001", ".", "n", "=", "5", "independent", "cultures", "as", "biological", "replicates", ".", "m", ",", "immunohistochemical", "analysis", "of", "MSNs", "infected", "with", "mCherry", "-", "NLS", "as", "control", "or", "the", "nuclear", "Ca2", "+", "-", "buffer", "Parvalbumin", "-", "NLS", "-", "mCherry", ".", "Infection", "on", "DIV4", ",", "fixation", "on", "DIV11", ".", "D32", "=", "anti", "-", "Darpp", "-", "32", ".", "n", ",", "MSNs", "expressing", "rAAV", "-", "mCherry", "-", "control", "or", "PV", "-", "NLS", "were", "treated", "with", "55mM", "HiK", "for", "1h", "and", "qPCR", "analysis", "was", "performed", "for", "the", "indicated", "IEGs", ".", "Mean", "+", "SEM", ";", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "post", "-", "hoc", "test", ",", "p", "*", "<", "0", ".", "05", ",", "p", "*", "*", "<", "0", ".", "01", ",", "p", "*", "*", "*", "*", "<", "0", ".", "0001", ".", "n", "=", "3", "independent", "cultures", "as", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3MSN cultures were stimulated with HiK (55 mM) for 1h in the presence of various pharmacologicals to dissect the synapse-to-nucleus cascades mediating transcription of Npas4, Fosb and Arc. Values were normalized to the induced condition to compare for differences in induction between treatments. Mean + SEM and one-way ANOVA with Bonferroni post-hoc correction were used in all experiments. p* < 0.05, p** < 0.01, p***<0.001, p****<0.0001. n-number indicated in each panel. a, co-incubation with the NMDA receptor blocker APV (100 mM, applied 5min before) reveals that all IEG inductions through HiK in MSNs depend on NDMA receptor activity. Mean + SEM; n = 4 independent cultures as biological replicates. b, blockade of voltage-dependent calcium channels through verapamil (30 µM, 5min before) and TTX (1 µM, 5min, to prevent verapamil-induced bursting) leads to significant reduction in gene-inductions for Npas4 and Fosb. Mean + SEM; n =4 independent cultures as biological replicates. c, inhibition of ERK1/2 through UO126 (10 µM, 20min before) leads to significant blockade of mRNA induction for Arc and Fosb, but not Npas4. Mean + SEM; n = 3 independent cultures as biological replicates. d, inhibition of p38alpha and p38beta through SB203580 or SB202190 respectively (both 10 µM and 20min before) leads to significant reductions in mRNA induction for Arc and Fosb, but not Npas4. Mean + SEM; n = 3 independent cultures as biological replicates. e, blockade of PKA activity through H-89 (10 µM, 20min before) leads to reduced induction of Arc, unaffected induction of Fosb and a superinduction of Npas4. Mean + SEM; n = 3 independent cultures as biological replicates. f, inhibition of calcineurin through co-application of Cyclosporin and FK506 (1 µM each, 20min before) leads to unaffected induction of mRNAs for Arc and Fosb, but significantly reduced levels of Npas4. Mean + SEM; n = 3 independent cultures as biological replicates.MSN cultures were stimulated with HiK (55 mM) for 1h in the presence of various pharmacologicals to dissect the synapse-to-nucleus cascades mediating transcription of Npas4, Fosb and Arc. Values were normalized to the induced condition to compare for differences in induction between treatments. Mean + SEM and one-way ANOVA with Bonferroni post-hoc correction were used in all experiments. p* < 0.05, p** < 0.01, p***<0.001, p****<0.0001. n-number indicated in each panel. g, blockade of CaMKII/IV through application of KN-93 (1 µM, 20min before) leads to significantly reduced mRNA inductions of Arc, Fosb and Npas4. Mean + SEM; n = 4 independent cultures as biological replicates. h, co-application of HiK and SKF reveals synergistic effects on mRNA induction of Fosb but not Arc or Npas4, Mean + SEM; n = 6 independent cultures as biological replicates. investigating the role of nuclear calcium signaling in mRNA induction of Arc, Fosb and Npas4. k, immunohistochemical analysis of MSNs infected with mCherry-NLS as control or the competitive nuclear Ca2+/CaM antagonist CaMBP4-mCherry. Infection on DIV4, fixation on DIV11. D32 = anti-Darpp-32. scale bar = 10 µm. l, MSNs expressing rAAV-mCherry-control or CaMBP4 (BP4) were treated with 55mM HiK for 1h and qPCR analysis was performed for the indicated IEGs. Mean + SEM; two-way ANOVA with Bonferroni post-hoc test, ns = not significant, p****<0.0001. n = 5 independent cultures as biological replicates. m, immunohistochemical analysis of MSNs infected with mCherry-NLS as control or the nuclear Ca2+-buffer Parvalbumin-NLS-mCherry. Infection on DIV4, fixation on DIV11. D32 = anti-Darpp-32. n, MSNs expressing rAAV-mCherry-control or PV-NLS were treated with 55mM HiK for 1h and qPCR analysis was performed for the indicated IEGs. Mean + SEM; two-way ANOVA with Bonferroni post-hoc test, p* < 0.05, p** < 0.01, p****<0.0001. n = 3 independent cultures as biological replicates."}
{"words": ["Figure", "4e", ",", "Npas4", "controls", "activity", "-", "dependent", "upregulation", "of", "genes", "for", "glutamatergic", "synapse", "formation", "and", "Ca2", "+", "channels", ".", "MSNs", "were", "infected", "with", "rAAVs", "expressing", "shRNA", "-", "scrambled", "(", "control", ")", "or", "shNpas4", "(", "Npas4", "knockdown", ")", "on", "DIV5", ".", "On", "DIV", "12", ",", "cultures", "were", "stimulated", "with", "HiK", "(", "55", "mM", ")", "for", "1h", "or", "6h", "and", "mRNA", "levels", "were", "analysed", "by", "qPCR", ".", "mRNA", "level", "=", "fold", "change", "in", "mRNA", "compared", "to", "shscrambled", "unstimulated", "control", ".", "Mean", "+", "SEM", ";", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "post", "-", "hoc", "test", ",", "p", "*", "<", "0", ".", "05", ",", "p", "*", "*", "*", "<", "0", ".", "001", ".", "n", "=", "5", "independent", "cultures", "as", "biological", "replicates", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4e, Npas4 controls activity-dependent upregulation of genes for glutamatergic synapse formation and Ca2+ channels. MSNs were infected with rAAVs expressing shRNA-scrambled (control) or shNpas4 (Npas4 knockdown) on DIV5. On DIV 12, cultures were stimulated with HiK (55 mM) for 1h or 6h and mRNA levels were analysed by qPCR. mRNA level = fold change in mRNA compared to shscrambled unstimulated control. Mean + SEM; two-way ANOVA with Bonferroni post-hoc test, p* < 0.05, p***<0.001. n = 5 independent cultures as biological replicates."}
{"words": ["Figure", "5e", ",", "Confocal", "images", "of", "tdTomato", "-", "labelled", "D1", "-", "MSNs", "expressing", "shscr", "-", "GFP", "or", "shNpas4", "-", "GFP", "(", "left", "panels", ";", "scale", "bar", ":", "20", "µm", ")", ".", "3D", "volume", "-", "renderings", "of", "MSN", "dendrites", "from", "the", "NAc", "shell", "(", "right", "panels", ";", "scale", "bar", ":", "2", "µm", ")", ".", "g", ",", "Confocal", "images", "of", "tdTomato", "-", "labelled", "D2", "-", "MSNs", "expressing", "shscr", "-", "GFP", "or", "shNpas4", "-", "GFP", "(", "left", "panels", ";", "scale", "bar", ":", "20", "µm", ")", ".", "3D", "volume", "-", "renderings", "of", "MSN", "dendrites", "from", "the", "NAc", "shell", "(", "right", "panels", ";", "scale", "bar", ":", "2", "µm", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5e, Confocal images of tdTomato-labelled D1-MSNs expressing shscr-GFP or shNpas4-GFP (left panels; scale bar: 20 µm). 3D volume-renderings of MSN dendrites from the NAc shell (right panels; scale bar: 2 µm).g, Confocal images of tdTomato-labelled D2-MSNs expressing shscr-GFP or shNpas4-GFP (left panels; scale bar: 20 µm). 3D volume-renderings of MSN dendrites from the NAc shell (right panels; scale bar: 2 µm)."}
{"words": ["Figure", "6a", "-", "d", ",", "Scatter", "plot", "of", "passive", "and", "active", "membrane", "properties", "of", "MSNs", "in", "ex", "vivo", "slice", "preparations", "from", "shRNA", "-", "AAV", "-", "infected", "mice", ",", "plotted", "for", "MSNs", "as", "D1", "-", "positive", "(", "D1", "+", ")", ",", "D1", "-", "negative", "(", "D1", "-", ")", "and", "those", "two", "populations", "pooled", "(", "all", ")", ".", "a", ",", "rheobase", ";", "mean", "±", "SEM", ".", "b", ",", "firing", "rate", "estimated", "at", "twice", "the", "value", "of", "the", "rheobase", ";", "mean", "±", "SEM", ".", "c", ",", "input", "/", "output", "gain", "values", "recorded", "in", "shscr", "-", "or", "shNpas4", "-", "injected", "mice", ",", "mean", "±", "SEM", ".", "The", "increased", "rheobase", "and", "lower", "input", "-", "output", "gain", "indicate", "a", "lower", "excitability", "for", "MSNs", "in", "the", "Npas4", "-", "knockdown", "group", ".", "d", ",", "facilitation", "at", "corticostriatal", "synapses", "examined", "in", "MSNs", "with", "paired", "-", "pulse", "stimulation", "at", "20", "and", "4", "Hz", ".", "Representative", "current", "traces", "and", "scatter", "plots", "of", "paired", "-", "pulse", "experiments", "illustrate", "a", "potent", "facilitation", "in", "MSNs", "in", "mice", "injected", "with", "scr", "-", "shRNA", "and", "a", "significant", "decrease", "of", "the", "facilitation", "in", "mice", "injected", "with", "shNpas4", ",", "with", "a", "stronger", "effect", "in", "D1", "-", "negative", "MSNs", ".", "Mean", "±", "SEM", ".", "Data", "information", ":", "For", "n", "-", "numbers", ",", "please", "see", "Table", "EV1", ".", "Mann", "-", "Whitney", "-", "Test", ",", "p", "*", "<", "0", ".", "05", ",", "p", "*", "*", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6a-d, Scatter plot of passive and active membrane properties of MSNs in ex vivo slice preparations from shRNA-AAV-infected mice, plotted for MSNs as D1-positive (D1+), D1-negative (D1-) and those two populations pooled (all). a, rheobase; mean ± SEM. b, firing rate estimated at twice the value of the rheobase; mean ± SEM. c, input/output gain values recorded in shscr- or shNpas4-injected mice, mean ± SEM. The increased rheobase and lower input-output gain indicate a lower excitability for MSNs in the Npas4-knockdown group. d, facilitation at corticostriatal synapses examined in MSNs with paired-pulse stimulation at 20 and 4 Hz. Representative current traces and scatter plots of paired-pulse experiments illustrate a potent facilitation in MSNs in mice injected with scr-shRNA and a significant decrease of the facilitation in mice injected with shNpas4, with a stronger effect in D1-negative MSNs. Mean ± SEM. Data information: For n-numbers, please see Table EV1. Mann-Whitney-Test, p*<0.05, p**<0.01. "}
{"words": ["Figure", "7b", ",", "cocaine", "-", "induced", "hyperlocomotion", "is", "attenuated", "by", "Npas4", "-", "knockdown", "while", "locomotor", "behaviour", "after", "saline", "injection", "is", "unaffected", "on", "all", "days", ".", "Mean", "+", "SEM", ";", "two", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Bonferroni", "post", "hoc", "test", ".", "p", "*", "<", "0", ".", "05", ",", "p", "*", "*", "<", "0", ".", "01", ",", "ns", "=", "not", "significant", ".", "n", "=", "12", "-", "16", "animals", "per", "condition", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7b, cocaine-induced hyperlocomotion is attenuated by Npas4-knockdown while locomotor behaviour after saline injection is unaffected on all days. Mean + SEM; two-way ANOVA followed by Bonferroni post hoc test. p* < 0.05, p** < 0.01, ns = not significant. n = 12 - 16 animals per condition."}
{"words": ["Figure", "1B", "GFP", "+", "EBs", "derived", "from", "CT", "and", "RA", "cultures", "at", "day", "10", ";", "scale", "bar", ":", "100", "μm", ".", "C", "Representative", "FC", "plots", "depicting", "percentage", "of", "GFP", "+", "cells", "obtained", "at", "day", "15", ",", "from", "CT", "and", "RA", "cultures", "in", "a", "typical", "experiment", ".", "D", "Heat", "map", "demonstrating", "enrichment", "of", "cardiac", "genes", "in", "GFP", "+", "fractions", "(", "CT", "+", ",", "RA", "+", ")", "compared", "to", "GFP", "−", "fractions", "(", "CT", "−", ",", "RA", "−", ")", "at", "day", "31", ".", "E", ",", "F", "Heat", "map", "of", "a", "select", "list", "of", "genes", "(", "E", ")", "upregulated", "and", "(", "F", ")", "downregulated", "in", "RA", "+", "compared", "to", "CT", "+", "at", "day", "31", ".", "Fold", "change", ">", "2", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B GFP+ EBs derived from CT and RA cultures at day 10; scale bar: 100 μm.C Representative FC plots depicting percentage of GFP+ cells obtained at day 15, from CT and RA cultures in a typical experiment.D Heat map demonstrating enrichment of cardiac genes in GFP+ fractions (CT+, RA+) compared to GFP− fractions (CT−, RA−) at day 31.E, F Heat map of a select list of genes (E) upregulated and (F) downregulated in RA+ compared to CT+ at day 31. Fold change > 2."}
{"words": ["Figure", "2A", "-", "C", "qPCR", "of", "selected", "transcripts", "at", "day", "31", "to", "validate", "(", "A", ")", "enrichment", "of", "cardiac", "markers", "in", "GFP", "+", "fractions", "against", "GFP", "−", "fractions", ",", "(", "B", ")", "upregulation", "of", "atrial", "and", "(", "C", ")", "downregulation", "of", "ventricular", "genes", "in", "RA", "+", "compared", "to", "CT", "+", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "In", "(", "A", "-", "C", ")", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "In", "(", "A", ")", ",", "for", "TNNT2", ",", "P", "=", "0", ".", "0001", "for", "CT", "−", "against", "CT", "+", "and", "P", "=", "0", ".", "0002", "for", "RA", "−", "against", "RA", "+", ";", "for", "NKX2", ".", "5", ",", "P", "=", "0", ".", "00005", "for", "CT", "−", "against", "CT", "+", "and", "P", "=", "0", ".", "00007", "for", "RA", "−", "against", "RA", "+", ".", "In", "(", "B", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "0006", "for", "NPPA", "and", "P", "=", "0", ".", "0002", "for", "PITX2", ".", "In", "(", "C", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "02", "for", "HEY2", "and", "P", "=", "0", ".", "007", "for", "IRX4", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A-C qPCR of selected transcripts at day 31 to validate (A) enrichment of cardiac markers in GFP+ fractions against GFP− fractions, (B) upregulation of atrial and (C) downregulation of ventricular genes in RA+ compared to CT+ (n = 3).Data information: Data are presented as mean ± SEM. In (A-C), *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 by unpaired t-test. In (A), for TNNT2, P = 0.0001 for CT− against CT+ and P = 0.0002 for RA− against RA+; for NKX2.5, P = 0.00005 for CT− against CT+ and P = 0.00007 for RA− against RA+. In (B), P = 0.0006 for NPPA and P = 0.0002 for PITX2. In (C), P = 0.02 for HEY2 and P = 0.007 for IRX4."}
{"words": ["Figure", "3B", "Representative", "APs", "of", "day", "31", "CMs", "from", "control", "(", "CT", ")", "and", "RA", "-", "treated", "(", "RA", ")", "groups", "at", "1", "Hz", ".", "C", "-", "E", "RMP", ",", "APAmax", "and", "APAplat", "(", "C", ")", ",", "dV", "/", "dtmax", "(", "D", ")", "and", "APD20", ",", "APD50", "and", "APD90", "of", "CT", "and", "RA", "CMs", "(", "E", ")", ".", "F", "Plot", "showing", "all", "measured", "APAplat", "values", "of", "CT", "and", "RA", "CMs", ".", "G", "Representative", "APs", "of", "CT", "and", "RA", "CMs", "at", "0", ".", "5", "-", "4", "Hz", ".", "H", "Average", "APAplat", "at", "0", ".", "5", "-", "4", "Hz", ".", "Please", "note", "that", "the", "AP", "differences", "in", "morphology", "are", "present", "at", "all", "measured", "frequencies", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B Representative APs of day 31 CMs from control (CT) and RA-treated (RA) groups at 1 Hz.C-E RMP, APAmax and APAplat (C), dV/dtmax (D) and APD20, APD50 and APD90 of CT and RA CMs (E).F Plot showing all measured APAplat values of CT and RA CMs.G Representative APs of CT and RA CMs at 0.5-4 Hz.H Average APAplat at 0.5-4 Hz. Please note that the AP differences in morphology are present at all measured frequencies."}
{"words": ["Figure", "4A", ",", "B", "Line", "plot", "illustrating", "relative", "mRNA", "levels", "of", "(", "A", ")", "COUP", "-", "TFI", "and", "(", "B", ")", "COUP", "-", "TFII", "in", "VM", "and", "AM", "differentiations", "from", "day", "5", "through", "day", "9", "(", "left", ")", "and", "in", "GFP", "+", "CMs", "at", "day", "31", "(", "right", ")", ";", "n", "=", "3", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "In", "(", "A", ",", "B", ")", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "In", "(", "A", ")", ",", "left", "panel", ",", "P", "=", "0", ".", "03", ",", "0", ".", "02", ",", "0", ".", "03", ",", "0", ".", "005", "and", "0", ".", "0004", "for", "comparison", "of", "COUP", "-", "TFI", "expression", "between", "AM", "and", "VM", "at", "days", "5", ",", "6", ",", "7", ",", "8", "and", "9", "of", "differentiation", ".", "In", "(", "A", ")", ",", "right", "panel", ",", "P", "=", "0", ".", "0002", "for", "comparison", "of", "COUP", "-", "TFI", "expression", "at", "day", "31", "between", "AM", "and", "VM", ".", "In", "(", "B", ")", ",", "left", "panel", ",", "P", "=", "0", ".", "02", ",", "0", ".", "03", ",", "0", ".", "006", ",", "0", ".", "004", "and", "0", ".", "003", "for", "comparison", "of", "COUP", "-", "TFII", "expression", "between", "AM", "and", "VM", "at", "days", "5", ",", "6", ",", "7", ",", "8", "and", "9", "of", "differentiation", ".", "In", "(", "B", ")", ",", "right", "panel", ",", "P", "=", "0", ".", "0001", "for", "comparison", "of", "COUP", "-", "TFII", "expression", "at", "day", "31", "between", "AM", "and", "VM", ".", "CT", "=", "control", "differentiation", ";", "hESC", "-", "atrial", "(", "AM", ")", ";", "hESC", "-", "ventricular", "(", "VM", ")", ".", "C", ",", "D", "COUP", "-", "TFI", "(", "C", ")", "and", "COUP", "-", "TFII", "(", "D", ")", "immunofluorescence", "at", "day", "31", "in", "AM", "(", "top", ")", "and", "VM", "(", "bottom", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "40", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A, B Line plot illustrating relative mRNA levels of (A) COUP-TFI and (B) COUP-TFII in VM and AM differentiations from day 5 through day 9 (left) and in GFP+CMs at day 31 (right); n = 3.Data information: Data are presented as mean ± SEM. In (A, B), *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 by unpaired t-test. In (A), left panel, P = 0.03, 0.02, 0.03, 0.005 and 0.0004 for comparison of COUP-TFI expression between AM and VM at days 5, 6, 7, 8 and 9 of differentiation. In (A), right panel, P = 0.0002 for comparison of COUP-TFI expression at day 31 between AM and VM. In (B), left panel, P = 0.02, 0.03, 0.006, 0.004 and 0.003 for comparison of COUP-TFII expression between AM and VM at days 5, 6, 7, 8 and 9 of differentiation. In (B), right panel, P = 0.0001 for comparison of COUP-TFII expression at day 31 between AM and VM. CT = control differentiation; hESC-atrial (AM); hESC-ventricular (VM).C, D COUP-TFI (C) and COUP-TFII (D) immunofluorescence at day 31 in AM (top) and VM (bottom). Scale bars: 40 μm."}
{"words": ["Figure", "5A", ",", "B", "mRNA", "expression", "of", "COUP", "-", "TFI", "and", "COUP", "-", "TFII", "following", "shRNA", "-", "mediated", "knockdown", "of", "(", "A", ")", "COUP", "-", "TFI", "or", "(", "B", ")", "COUP", "-", "TFII", "in", "hESC", "-", "atrial", "cardiomyocytes", "(", "AM", ")", "at", "day", "30", ".", "C", ",", "D", "mRNA", "expression", "of", "ion", "channel", "genes", "KCNA5", ",", "KCNJ3", "and", "KCNJ5", "after", "knockdown", "of", "(", "C", ")", "COUP", "-", "TFI", "or", "(", "D", ")", "COUP", "-", "TFII", "in", "AM", "at", "day", "30", ".", "E", ",", "F", "Schematic", "of", "NR2F", "binding", "sites", "in", "(", "E", ")", "KCNA5", "and", "(", "F", ")", "KCNJ3", "promoters", ".", "G", ",", "H", "ChIP", "-", "qPCR", "analysis", "at", "day", "30", "shows", "enriched", "binding", "of", "COUP", "-", "TFI", "and", "COUP", "-", "TFII", "to", "the", "promoter", "region", "of", "(", "G", ")", "KCNA5", "and", "(", "H", ")", "KCNJ3", ",", "compared", "to", "IgG", "in", "AM", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A, B mRNA expression of COUP-TFI and COUP-TFII following shRNA-mediated knockdown of (A) COUP-TFI or (B) COUP-TFII in hESC-atrial cardiomyocytes (AM) at day 30.C, D mRNA expression of ion channel genes KCNA5, KCNJ3 and KCNJ5 after knockdown of (C) COUP-TFI or (D) COUP-TFII in AM at day 30.E, F Schematic of NR2F binding sites in (E) KCNA5 and (F) KCNJ3 promoters.G, H ChIP-qPCR analysis at day 30 shows enriched binding of COUP-TFI and COUP-TFII to the promoter region of (G) KCNA5 and (H) KCNJ3, compared to IgG in AM."}
{"words": ["Figure", "6A", "Expression", "of", "KCNA5", "(", "left", ")", "and", "KCNJ3", "(", "right", ")", "in", "GFP", "+", "pools", "of", "VM", "and", "AM", "CMs", "at", "day", "31", ",", "as", "well", "as", "in", "ventricles", "and", "atria", "of", "human", "heart", ".", "B", ",", "C", "Typical", "examples", "(", "left", ")", "and", "current", "-", "voltage", "relationships", "(", "right", ")", "of", "(", "B", ")", "IKur", "and", "(", "C", ")", "IK", ",", "ACh", "in", "VM", "and", "AMCMs", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "In", "(", "A", ")", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "by", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "In", "(", "B", ",", "C", ")", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "by", "two", "-", "way", "repeated", "measures", "ANOVA", "followed", "by", "pairwise", "comparison", "using", "the", "Student", "-", "Newman", "-", "Keuls", "test", "for", "(", "B", ")", "and", "Mann", "-", "Whitney", "rank", "-", "sum", "test", "for", "(", "C", ")", ".", "In", "(", "B", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "778", ",", "0", ".", "350", ",", "0", ".", "03", ",", "0", ".", "02", ",", "0", ".", "002", ",", "0", ".", "001", ",", "<", "0", ".", "001", "and", "<", "0", ".", "001", ",", "respectively", ",", "for", "comparison", "between", "VM", "and", "AM", "within", "membrane", "potentials", "of", "−", "20", ",", "−", "10", ",", "0", ",", "10", ",", "20", ",", "30", ",", "40", "and", "50", "mV", ".", "In", "(", "C", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "01", ",", "0", ".", "01", ",", "0", ".", "01", ",", "0", ".", "01", ",", "0", ".", "03", ",", "0", ".", "397", ",", "0", ".", "397", ",", "0", ".", "397", ",", "0", ".", "671", ",", "0", ".", "207", ",", "0", ".", "207", ",", "0", ".", "09", ",", "0", ".", "01", ",", "0", ".", "039", "and", "0", ".", "015", ",", "respectively", ",", "for", "comparison", "between", "VM", "and", "AM", "within", "membrane", "potentials", "of", "−", "120", ",", "−", "110", ",", "−", "100", ",", "−", "90", ",", "−", "80", ",", "−", "70", ",", "−", "60", ",", "−", "50", ",", "−", "40", ",", "−", "30", ",", "−", "20", ",", "−", "10", ",", "0", ",", "10", "and", "20", "mV", ".", "CMs", "=", "cardiomyocytes", ";", "hESC", "-", "atrial", "(", "AM", ")", "and", "hESC", "-", "ventricular", "(", "VM", ")", "CMs", ";", "IK", ",", "ACh", "=", "acetylcholine", "-", "activated", "potassium", "current", ";", "IKur", "=", "potassium", "ultra", "-", "rapid", "delayed", "rectifier", "current", ".", "4", "-", "AP", "=", "4", "-", "aminopyridine", ";", "CCh", "=", "carbachol", ".", "D", ",", "E", "Representative", "APs", "of", "VM", "and", "AM", "at", "1", "Hz", "in", "response", "to", "(", "D", ")", "IKur", "block", "by", "4", "-", "AP", "and", "(", "E", ")", "IK", ",", "ACh", "activation", "by", "CCh", ".", "AP", "parameters", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Table", "S5", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A Expression of KCNA5 (left) and KCNJ3 (right) in GFP+ pools of VM and AM CMs at day 31, as well as in ventricles and atria of human heart.B, C Typical examples (left) and current-voltage relationships (right) of (B) IKur and (C) IK,ACh in VM and AMCMs.Data information: Data are presented as mean ± SEM. In (A), *P < 0.05 by unpaired t-test. In (B, C), *P < 0.05 by two-way repeated measures ANOVA followed by pairwise comparison using the Student-Newman-Keuls test for (B) and Mann-Whitney rank-sum test for (C). In (B), P = 0.778, 0.350, 0.03, 0.02, 0.002, 0.001, < 0.001 and < 0.001, respectively, for comparison between VM and AM within membrane potentials of −20, −10, 0, 10, 20, 30, 40 and 50 mV. In (C), P = 0.01, 0.01, 0.01, 0.01, 0.03, 0.397, 0.397, 0.397, 0.671, 0.207, 0.207, 0.09, 0.01, 0.039 and 0.015, respectively, for comparison between VM and AM within membrane potentials of −120, −110, −100, −90, −80, −70, −60, −50, −40, −30, −20, −10, 0, 10 and 20 mV. CMs = cardiomyocytes; hESC-atrial (AM) and hESC-ventricular (VM) CMs; IK,ACh = acetylcholine-activated potassium current; IKur = potassium ultra-rapid delayed rectifier current. 4-AP = 4-aminopyridine; CCh = carbachol.D, E Representative APs of VM and AM at 1 Hz in response to (D) IKur block by 4-AP and (E) IK,ACh activation by CCh. AP parameters are shown in Supplementary Table S5."}
{"words": ["Figure", "7A", "Representative", "APs", "at", "1", "Hz", "of", "VM", "and", "AM", "CMs", "in", "response", "to", "vernakalant", ".", "Inset", "shows", "dV", "/", "dtmax", ".", "B", ",", "C", "Average", "APAplat", "(", "B", ")", "and", "dV", "/", "dtmax", "(", "C", ")", "in", "the", "absence", "and", "presence", "of", "vernakalant", "at", "1", "-", "4", "Hz", ".", "AP", "parameters", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Table", "S6", ".", "Abbreviations", "as", "in", "Figs3", "and", "6", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "by", "Mann", "-", "Whitney", "rank", "-", "sum", "test", "for", "(", "B", ")", ".", "P", "=", "0", ".", "01", ",", "0", ".", "008", ",", "0", ".", "008", "and", "0", ".", "007", ",", "respectively", ",", "for", "comparison", "of", "APAplat", "between", "VM", "and", "AM", "groups", "at", "frequencies", "of", "1", ".", "0", ",", "2", ".", "0", ",", "3", ".", "0", "and", "4", ".", "0", "Hz", ".", "Two", "-", "way", "repeated", "measures", "ANOVA", "followed", "by", "pairwise", "comparison", "using", "the", "Student", "-", "Newman", "-", "Keuls", "test", "for", "(", "C", ")", ".", "P", "=", "0", ".", "686", "between", "VM", "and", "AM", "groups", "and", "hence", "not", "statistically", "significant", ".", "For", "VM", ",", "P", "=", "0", ".", "06", "for", "1", "versus", "2", "Hz", ";", "P", "<", "0", ".", "001", "for", "1", "versus", "3", "Hz", ";", "P", "<", "0", ".", "001", "for", "1", "versus", "4", "Hz", ";", "P", "=", "0", ".", "001", "for", "2", "versus", "3", "Hz", ";", "P", "=", "0", ".", "002", "for", "2", "versus", "4", "Hz", ";", "and", "P", "=", "0", ".", "857", "for", "3", "versus", "4", "Hz", ".", "For", "AM", ",", "P", "=", "0", ".", "03", "for", "1", "versus", "2", "Hz", ";", "P", "<", "0", ".", "001", "for", "1", "versus", "3", "Hz", ";", "P", "<", "0", ".", "001", "for", "1", "versus", "4", "Hz", ";", "P", "=", "0", ".", "02", "for", "2", "versus", "3", "Hz", ";", "P", "=", "0", ".", "02", "for", "2", "versus", "4", "Hz", ";", "and", "P", "=", "0", ".", "621", "for", "3", "versus", "4", "Hz", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A Representative APs at 1 Hz of VM and AM CMs in response to vernakalant. Inset shows dV/dtmax.B, C Average APAplat (B) and dV/dtmax (C)in the absence and presence of vernakalant at 1-4 Hz. AP parameters are shown in Supplementary Table S6. Abbreviations as in Figs3 and 6.Data information: Data are presented as mean ± SEM. *P < 0.05 by Mann-Whitney rank-sum test for (B). P = 0.01, 0.008, 0.008 and 0.007, respectively, for comparison of APAplat between VM and AM groups at frequencies of 1.0, 2.0, 3.0 and 4.0 Hz. Two-way repeated measures ANOVA followed by pairwise comparison using the Student-Newman-Keuls test for (C). P = 0.686 between VM and AM groups and hence not statistically significant. For VM, P = 0.06 for 1 versus 2 Hz; P < 0.001 for 1 versus 3 Hz; P < 0.001 for 1 versus 4 Hz; P = 0.001 for 2 versus 3 Hz; P = 0.002 for 2 versus 4 Hz; and P = 0.857 for 3 versus 4 Hz. For AM, P = 0.03 for 1 versus 2 Hz; P < 0.001 for 1 versus 3 Hz; P < 0.001 for 1 versus 4 Hz; P = 0.02 for 2 versus 3 Hz; P = 0.02 for 2 versus 4 Hz; and P = 0.621 for 3 versus 4 Hz."}
{"words": ["Figure", "8A", "Representative", "APs", "of", "VM", "and", "AM", "CMs", "in", "the", "absence", ",", "presence", "and", "following", "washout", "of", "3", "μmol", "/", "l", "XEN", "-", "D0101", ".", "AP", "parameters", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Table", "S7", ".", "B", "Representative", "APs", "(", "1", "Hz", ")", "of", "VM", "and", "AM", "in", "the", "CCh", ",", "to", "activate", "IK", ",", "ACh", "and", "subsequent", "addition", "of", "XEN", "-", "R0703", ".", "AP", "parameters", "are", "shown", "in", "Supplementary", "Table", "S9", ".", "C", ",", "D", "Experiments", "performed", "in", "RAP", "conscious", "dogs", "in", "the", "presence", "of", "vehicle", "or", "following", "1", ",", "3", "and", "10", "mg", "/", "kg", "XEN", "-", "R0703", "show", "(", "C", ")", "mean", "right", "AERP", "values", "(", "left", ")", ",", "mean", "Van", "de", "Water", "'", "s", "QTc", "(", "right", ")", "and", "(", "D", ")", "AF", "inducibility", "plotted", "as", "a", "function", "of", "dose", ".", "Data", "information", ":", "For", "RAP", "dog", "experiments", ",", "n", "=", "5", ";", "statistical", "significance", "tested", "with", "paired", "t", "-", "test", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "AERP", "=", "atrial", "effective", "refractory", "period", ";", "AF", "=", "atrial", "fibrillation", ";", "RAP", "=", "rapid", "atrial", "pacing", ";", "N", ".", "S", ".", "=", "not", "significant", ".", "Other", "abbreviations", "as", "in", "Figs3", ",", "6", "and", "7", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8A Representative APs of VM and AM CMs in the absence, presence and following washout of 3 μmol/l XEN-D0101. AP parameters are shown in Supplementary Table S7.B Representative APs (1 Hz) of VM and AM in the CCh, to activate IK,ACh and subsequent addition of XEN-R0703. AP parameters are shown in Supplementary Table S9.C, D Experiments performed in RAP conscious dogs in the presence of vehicle or following 1, 3 and 10 mg/kg XEN-R0703 show (C) mean right AERP values (left), mean Van de Water's QTc (right) and (D) AF inducibility plotted as a function of dose.Data information: For RAP dog experiments, n = 5; statistical significance tested with paired t-test. Data are presented as mean ± SEM. AERP = atrial effective refractory period; AF = atrial fibrillation; RAP = rapid atrial pacing; N.S. = not significant. Other abbreviations as in Figs3, 6 and 7."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "B", ")", "Disintegration", "reaction", "(", "1", "hour", ")", "performed", "by", "RAG1", "aa", "216", "-", "1008", "R848M", "/", "E649V", ",", "RAG2", "aa", "1", "-", "361", "and", "full", "length", "human", "HMGB1", "with", "Mg2", "+", "or", "Mn2", "+", "at", "the", "indicated", "temperatures", ".", "Denaturing", "gel", "displays", "the", "fluorophore", "-", "labeled", "DNA", "strand", "from", "the", "RAG", "STC", "before", "(", "16", "nt", "band", ",", "lane", "2", ")", "and", "after", "(", "37", "nt", ")", "the", "disintegration", "reaction", ".", "Lane", "1", ",", "fluorophore", "-", "labeled", "37", "nt", "DNA", "marker", ".", "Representative", "of", "2", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(B) Disintegration reaction (1 hour) performed by RAG1 aa 216-1008 R848M/E649V, RAG2 aa 1-361 and full length human HMGB1 with Mg2+ or Mn2+ at the indicated temperatures. Denaturing gel displays the fluorophore-labeled DNA strand from the RAG STC before (16 nt band, lane 2) and after (37 nt) the disintegration reaction. Lane 1, fluorophore-labeled 37 nt DNA marker. Representative of 2 independent experiments."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "D", ")", "Results", "of", "in", "vivo", "plasmid", "-", "to", "-", "plasmid", "transposition", "assay", "using", "WT", "or", "R848M", "RAG1", "and", "the", "indicated", "forms", "of", "RAG2", "containing", "or", "lacking", "(", "∆", "L", ")", "the", "four", "amino", "acids", "at", "the", "tip", "of", "the", "333", "-", "342", "loop", ",", "performed", "as", "described", "in", "(", "Zhang", "et", "al", ".", ",", "2019", ")", ";", "(", "*", "*", "*", "*", ",", "p", "<", "0", ".", "0001", ")", ".", "Three", "biological", "replicates", "for", "each", "condition", "except", "in", "the", "last", "two", "columns", "where", "data", "from", "11", "biological", "replicates", "are", "presented", ".", "(", "E", ")", "Results", "of", "in", "vivo", "plasmid", "-", "to", "-", "genome", "transposition", "assay", "using", "WT", "or", "R848M", "RAG1", "and", "different", "forms", "of", "RAG2", "as", "indicated", ".", "As", "previously", "demonstrated", "(", "Zhang", "et", "al", ".", ",", "2019", ")", ",", "R848", "(", "present", "in", "WT", "RAG1", ")", "and", "RAG2", "acidic", "hinge", "residues", "362", "-", "383", "each", "potently", "suppress", "transposition", ".", "Substantial", "transposition", "is", "observed", "with", "the", "combination", "of", "RAG1", "R848M", "and", "RAG2", "1", "-", "361", ",", "which", "is", "further", "increased", "by", "∆", "L", ";", "(", "*", "*", "*", ",", "p", "=", "0", ".", "001", ")", ".", "Four", "biological", "replicates", "for", "each", "condition", ".", "(", "F", ")", "In", "vivo", "recombination", "activity", "in", "HEK293T", "cells", "of", "mouse", "wild", "-", "type", "RAG1", "or", "RAG1", "R848M", "with", "RAG2", "1", "-", "361", "or", "1", "-", "361", "∆", "L", ".", "(", "p", "=", "0", ".", "42", "for", "wild", "-", "type", "RAG1", "group", ",", "p", "=", "0", ".", "41", "for", "RAG1", "R848M", "group", ")", ".", "Three", "biological", "replicates", "for", "each", "condition", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(D) Results of in vivo plasmid-to-plasmid transposition assay using WT or R848M RAG1 and the indicated forms of RAG2 containing or lacking (∆L) the four amino acids at the tip of the 333-342 loop, performed as described in (Zhang et al., 2019); (****, p<0.0001). Three biological replicates for each condition except in the last two columns where data from 11 biological replicates are presented.(E) Results of in vivo plasmid-to-genome transposition assay using WT or R848M RAG1 and different forms of RAG2 as indicated. As previously demonstrated (Zhang et al., 2019), R848 (present in WT RAG1) and RAG2 acidic hinge residues 362-383 each potently suppress transposition. Substantial transposition is observed with the combination of RAG1 R848M and RAG2 1-361, which is further increased by ∆L; (***, p=0.001). Four biological replicates for each condition.(F) In vivo recombination activity in HEK293T cells of mouse wild-type RAG1 or RAG1 R848M with RAG2 1-361 or 1-361 ∆L. (p=0.42 for wild-type RAG1 group, p=0.41 for RAG1 R848M group). Three biological replicates for each condition."}
{"words": ["Figure", "1NoV", "levels", "in", "the", "vaccinated", "mice", "hindlimb", "muscle", "tissue", "at", "2", ",", "3", "or", "4", "days", "post", "infection", "(", "dpi", ")", "with", "WT", "NoV", "were", "determined", "by", "Western", "blotting", "to", "detect", "the", "viral", "coat", "protein", "(", "CP", ")", "and", "B2", "Staining", "of", "β", "-", "actin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", "(", "B", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1NoV levels in the vaccinated mice hindlimb muscle tissue at 2, 3 or 4 days post infection (dpi) with WT NoV were determined by Western blotting to detect the viral coat protein (CP) and B2 Staining of β-actin was used as a loading control (B)."}
{"words": ["Figure", "2D", ",", "Western", "blotting", "of", "HSP70", ",", "tsg", "101", ",", "CD81", ",", "CD63", ",", "and", "CD9", "in", "EVs", ",", "whole", "blood", ",", "and", "blood", "clot", "derived", "from", "suckling", "mice", "infected", "with", "DMEM", "or", "NoVΔB2", ".", "Staining", "of", "β", "-", "actin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2D, Western blotting of HSP70, tsg 101, CD81, CD63, and CD9 in EVs, whole blood, and blood clot derived from suckling mice infected with DMEM or NoVΔB2. Staining of β-actin was used as a loading control."}
{"words": ["Figure", "4J", ",", "Total", "proteins", "were", "extracted", "from", "the", "hindlimb", "muscle", "tissue", "of", "NoVWT", "-", "infected", "BALB", "/", "c", "suckling", "mice", "to", "measure", "the", "viral", "coat", "protein", "(", "CP", ")", "and", "B2", "protein", "by", "Western", "blotting", ".", "Staining", "of", "β", "-", "actin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4J, Total proteins were extracted from the hindlimb muscle tissue of NoVWT-infected BALB/c suckling mice to measure the viral coat protein (CP) and B2 protein by Western blotting. Staining of β-actin was used as a loading control."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Nissl", "-", "stained", "sagittal", "brain", "sections", "reveal", "no", "change", "in", "hippocampal", "morphology", "between", "Clcn3unc", "/", "unc", "and", "Clcn3", "+", "/", "+", "mice", "at", "P45", "or", "after", "20", "months", ".", "In", "contrast", ",", "the", "hippocampus", "was", "absent", "(", "indicated", "by", "asterisk", ")", "in", "3", "months", "-", "old", "Clcn3", "-", "/", "-", "mice", "(", "scale", "bar", ":", "200", "µm", ")", ".", "(", "B", ")", "Nissl", "-", "stained", "paraffin", "sections", "show", "intact", "retinal", "layers", "in", "20", "months", "old", "Clcn3unc", "/", "un", "mice", ".", "Neurodegeneration", "in", "Clcn3", "-", "/", "-", "mice", "however", ",", "results", "in", "a", "loss", "of", "retinal", "structure", "already", "at", "11", "weeks", "of", "age", "(", "scale", "bar", ":", "100", "µm", ")", ".", "RPE", ",", "retinal", "pigment", "epithelium", ";", "OS", ",", "photoreceptor", "outer", "segments", ";", "IS", ",", "photoreceptor", "inner", "segments", ";", "ONL", ",", "outer", "nuclear", "layer", ";", "OPL", ",", "outer", "plexiform", "layer", ";", "INL", ",", "inner", "nuclear", "layer", ";", "IPL", ",", "inner", "plexiform", "layer", ";", "GCL", ",", "ganglion", "cell", "layer", ".", "(", "C", ")", "Immunoblots", "for", "ClC", "-", "3", ",", "-", "4", "and", "-", "5", "of", "membrane", "fractions", "of", "WT", "(", "+", "/", "+", ")", ",", "Clcn3unc", "/", "unc", "(", "unc", "/", "unc", ")", ",", "Clcn3unc", "/", "+", "(", "unc", "/", "+", ")", "and", "Clcn3", "-", "/", "-", "(", "-", "/", "-", ")", "mice", ".", "β", "-", "actin", ",", "loading", "control", ".", "(", "D", ")", "Representative", "Western", "blot", "for", "ClC", "-", "4", "of", "membrane", "fractions", "from", "brain", "and", "kidney", "of", "WT", "(", "+", "/", "+", ")", ",", "Clcn3", "+", "/", "-", "(", "+", "/", "-", ")", "and", "Clcn3", "-", "/", "-", "(", "-", "/", "-", ")", "mice", ".", "β", "-", "actin", ",", "loading", "control", ".", "(", "E", ")", "Quantification", "of", "ClC", "-", "4", "immunoblots", "including", "those", "shown", "in", "(", "C", "and", "D", ")", "(", "normalized", "to", "actin", ")", ".", "Mean", "values", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Average", "from", "≥", "5", "animals", "per", "genotype", "and", "at", "≥", "2", "immunoblots", "per", "animal", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0005", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "(", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "test", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Nissl-stained sagittal brain sections reveal no change in hippocampal morphology between Clcn3unc/unc and Clcn3+/+ mice at P45 or after 20 months. In contrast, the hippocampus was absent (indicated by asterisk) in 3 months-old Clcn3-/- mice (scale bar: 200 µm).(B) Nissl-stained paraffin sections show intact retinal layers in 20 months old Clcn3unc/un mice. Neurodegeneration in Clcn3-/- mice however, results in a loss of retinal structure already at 11 weeks of age (scale bar: 100 µm). RPE, retinal pigment epithelium; OS, photoreceptor outer segments; IS, photoreceptor inner segments; ONL, outer nuclear layer; OPL, outer plexiform layer; INL, inner nuclear layer; IPL, inner plexiform layer; GCL, ganglion cell layer.(C) Immunoblots for ClC-3, -4 and -5 of membrane fractions of WT (+/+), Clcn3unc/unc (unc/unc), Clcn3unc/+ (unc/+) and Clcn3-/- (-/-) mice. β-actin, loading control.(D) Representative Western blot for ClC-4 of membrane fractions from brain and kidney of WT (+/+), Clcn3+/- (+/-) and Clcn3-/- (-/-) mice. β-actin, loading control. (E) Quantification of ClC-4 immunoblots including those shown in (C and D) (normalized to actin). Mean values ± s.e.m. Average from ≥5 animals per genotype and at ≥2 immunoblots per animal. *** p < 0.0005 , ** p < 0.005, * p < 0.05 (two-tailed unpaired t test). "}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Co", "-", "immunoprecipitation", "reveals", "a", "ClC", "-", "3", "-", "ClC", "-", "4", "complex", ".", "10", "%", "of", "solubilized", "brain", "membranes", "of", "WT", "and", "Clcn3unc", "/", "unc", "mice", "were", "directly", "loaded", "on", "the", "gel", "(", "input", ",", "or", "first", "immunoprecipitated", "(", "IP", ")", "with", "antibodies", "against", "ClC", "-", "3", "or", "ClC", "-", "4", ".", "Western", "blots", "were", "probed", "for", "ClC", "-", "3", "and", "ClC", "-", "4", ".", "Equivalent", "amounts", "of", "lysates", "and", "precipitates", "were", "loaded", ".", "*", "unspecific", "band", "/", "contamination", ".", "(", "B", ")", "FRET", "experiments", "show", "homo", "-", "and", "heteromerization", "of", "ClC", "-", "3", "and", "ClC", "-", "4", "constructs", "(", "fused", "to", "yellow", "fluorescent", "protein", "(", "YFP", ")", "and", "cyan", "fluorescent", "protein", "(", "CFP", ")", ")", "overexpressed", "in", "COS", "-", "7", "cells", ".", "Co", "-", "expressed", "constructs", "are", "indicated", ".", "Graph", "represents", "energy", "transfer", "efficiencies", "from", "acceptor", "photobleaching", ",", "depicted", "as", "bleach", "corrected", "values", "(", "subtraction", "of", "ClC", "-", "4CFP", "alone", ")", ".", "Mean", "values", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "N", "=", "20", "(", "ClC", "-", "3YFP", "/", "ClC", "-", "4CFP", ")", ";", "33", "(", "ClC", "-", "3YFP", "/", "ClC", "-", "3CFP", ")", ";", "26", "(", "ClC", "-", "4YFP", "/", "ClC", "-", "4CFP", ")", ";", "42", "(", "ClC", "-", "3YFP", "/", "Lamp", "-", "1CFP", ")", "cells", ".", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0005", "(", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "test", ")", "(", "C", ")", "Immunolabelling", "shows", "subcellular", "localization", "of", "hClC", "-", "4", "(", "top", ",", "green", "in", "merge", ")", ",", "hClC", "-", "3", "(", "middle", ",", "green", "in", "merge", ")", "and", "hClC", "-", "3unc", "(", "bottom", ",", "green", "in", "merge", ")", "of", "transiently", "transfected", "COS", "-", "7", "cells", ",", "in", "comparison", "to", "either", "PDI", "or", "Lamp", "-", "1", "(", "both", "red", ")", "as", "marker", "for", "the", "ER", "and", "late", "endosomes", "/", "lysosomes", ",", "respectively", ".", "(", "D", ")", "Co", "-", "localization", "of", "hClC", "-", "3", "and", "hClC", "-", "4", "in", "cytoplasmic", "vesicles", "of", "COS", "-", "7", "cells", "transfected", "with", "hClC", "-", "4", "cDNA", "(", "hemagglutinin", "(", "HA", ")", "tagged", ")", "together", "with", "either", "hClC", "-", "3", "or", "hClC", "-", "3unc", ".", "Immunostaining", "used", "antibodies", "against", "ClC", "-", "3", "and", "HA", "tag", "(", "green", "and", "red", "in", "merge", ",", "respectively", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Co-immunoprecipitation reveals a ClC-3-ClC-4 complex. 10% of solubilized brain membranes of WT and Clcn3unc/unc mice were directly loaded on the gel (input, or first immunoprecipitated (IP) with antibodies against ClC-3 or ClC-4. Western blots were probed for ClC-3 and ClC-4. Equivalent amounts of lysates and precipitates were loaded. * unspecific band / contamination.(B) FRET experiments show homo- and heteromerization of ClC-3 and ClC-4 constructs (fused to yellow fluorescent protein (YFP) and cyan fluorescent protein (CFP)) overexpressed in COS-7 cells. Co-expressed constructs are indicated. Graph represents energy transfer efficiencies from acceptor photobleaching, depicted as bleach corrected values (subtraction of ClC-4CFP alone). Mean values ± s.e.m. N = 20 (ClC-3YFP / ClC-4CFP); 33 (ClC-3YFP / ClC-3CFP); 26 (ClC-4YFP / ClC-4CFP); 42 (ClC-3YFP / Lamp-1CFP) cells. *** p < 0.0005 (two-tailed unpaired t test)(C) Immunolabelling shows subcellular localization of hClC-4 (top, green in merge), hClC-3 (middle, green in merge) and hClC-3unc (bottom, green in merge) of transiently transfected COS-7 cells, in comparison to either PDI or Lamp-1 (both red) as marker for the ER and late endosomes/lysosomes, respectively.(D) Co-localization of hClC-3 and hClC-4 in cytoplasmic vesicles of COS-7 cells transfected with hClC-4 cDNA (hemagglutinin (HA) tagged) together with either hClC-3 or hClC-3unc. Immunostaining used antibodies against ClC-3 and HA tag (green and red in merge, respectively)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Clcn3unc", "/", "unc", "/", "Clcn4", "-", "/", "-", "and", "Clcn3", "-", "/", "-", "mice", "died", "within", "3", "-", "4", "weeks", "after", "birth", ".", "Approximately", "20", "%", "of", "the", "animals", "survived", "in", "either", "line", "(", "Clcn3unc", "/", "unc", "/", "Clcn4", "-", "/", "-", ",", "n", "=", "136", "and", "Clcn3", "-", "/", "-", ",", "n", "=", "187", ")", ".", "All", "Clcn3", "-", "/", "-", "/", "Clcn4", "-", "/", "-", "mice", "(", "n", "=", "4", ")", "died", "within", "1", "-", "2", "weeks", "after", "birth", ".", "(", "B", ")", "Nissl", "-", "stained", "paraffin", "sections", "show", "progressive", "neuronal", "cell", "loss", "(", "arrows", ")", "that", "begins", "in", "hippocampal", "CA1", "region", "of", "P14", "Clcn3unc", "/", "unc", "/", "Clcn4", "-", "/", "-", "mice", "and", "results", "in", "a", "complete", "loss", "of", "the", "hippocampus", "at", "P28", ".", "Neurodegeneration", "progresses", "slower", "in", "Clcn3", "-", "/", "-", "mice", "Stobrawa", "et", "al", ",", "2001", "(", ")", "(", "scale", "bar", ":", "200", "µm", ")", ".", "(", "C", ")", "Semi", "-", "thin", "sections", "of", "P28", "retinae", "revealed", "degeneration", "of", "photoreceptor", "cells", "in", "the", "outer", "nuclear", "layer", "and", "outer", "and", "inner", "segment", "of", "Clcn3unc", "/", "unc", "/", "Clcn4", "-", "/", "-", ",", "but", "not", "of", "Clcn3unc", "/", "unc", "or", "Clcn4", "-", "/", "-", "mice", "(", "scale", "bar", ":", "50", "µm", ")", ".", "RPE", ",", "retinal", "pigment", "epithelium", ";", "OS", ",", "photoreceptor", "outer", "segments", ";", "IS", ",", "photoreceptor", "inner", "segments", ";", "ONL", ",", "outer", "nuclear", "layer", ";", "OPL", ",", "outer", "plexiform", "layer", ";", "INL", ",", "inner", "nuclear", "layer", ";", "IPL", ",", "inner", "plexiform", "layer", ";", "GCL", ",", "ganglion", "cell", "layer", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Clcn3unc/unc/Clcn4-/- and Clcn3-/- mice died within 3-4 weeks after birth. Approximately 20% of the animals survived in either line (Clcn3unc/unc/Clcn4-/-, n = 136 and Clcn3-/-, n = 187). All Clcn3-/-/Clcn4-/- mice (n= 4) died within 1-2 weeks after birth.(B) Nissl-stained paraffin sections show progressive neuronal cell loss (arrows) that begins in hippocampal CA1 region of P14 Clcn3unc/unc/Clcn4-/- mice and results in a complete loss of the hippocampus at P28. Neurodegeneration progresses slower in Clcn3-/- mice Stobrawa et al, 2001() (scale bar: 200 µm).(C) Semi-thin sections of P28 retinae revealed degeneration of photoreceptor cells in the outer nuclear layer and outer and inner segment of Clcn3unc/unc/Clcn4-/-, but not of Clcn3unc/unc or Clcn4-/- mice (scale bar: 50 µm). RPE, retinal pigment epithelium; OS, photoreceptor outer segments; IS, photoreceptor inner segments; ONL, outer nuclear layer; OPL, outer plexiform layer; INL, inner nuclear layer; IPL, inner plexiform layer; GCL, ganglion cell layer."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "GFP", "antibodies", "immunolabel", "VenusClC", "-", "3", "(", "green", ")", "in", "the", "somata", "of", "CA1", "pyramidal", "neurons", "of", "Clcn3ven", "/", "ven", ",", "but", "not", "Clcn3", "+", "/", "+", "brain", "sections", ".", "sp", ",", "stratum", "pyramidale", "(", "scale", "bar", ":", "20", "µm", ")", ".", "(", "B", ")", "Co", "-", "immunolabelling", "of", "VenusClC", "-", "3", "(", "green", ")", "with", "ClC", "-", "4", "(", "red", ")", "in", "the", "CA3", "region", "of", "Clcn3ven", "/", "ven", "mice", "(", "scale", "bar", ":", "20", "µm", ")", ".", "sl", ",", "stratum", "lucidum", ";", "sp", ",", "stratum", "pyramidale", ".", "(", "C", ")", "Co", "-", "immunostaining", "of", "VenusClC", "-", "3", "(", "green", ")", "with", "EEA1", "(", "red", ",", "left", "panel", ")", ",", "Lamp", "-", "1", "(", "red", ",", "middle", "panel", ")", "or", "synaptophysin", "(", "red", ",", "right", "panel", ")", "in", "either", "CA1", "or", "CA3", "region", "of", "Clcn3ven", "/", "ven", "mice", ".", "Arrows", "indicate", "structures", "of", "overlap", "(", "scale", "bar", ":", "5", "µm", ")", ".", "(", "D", ")", "GFP", "antibody", "immunolabels", "VenusClC", "-", "3", "(", "green", ")", "in", "neurites", "of", "cultured", "neurons", ".", "EEA1", "and", "VGLUT1", "are", "co", "-", "stained", "(", "both", "in", "red", ";", "left", "and", "right", "panel", ",", "respectively", ")", ".", "The", "dendritic", "marker", "MAP2", "is", "stained", "in", "blue", "(", "right", "panel", ")", "(", "scale", "bars", ":", "10", "µm", ")", ".", "DNA", "stained", "with", "DAPI", ".", "(", "E", ")", "Immuno", "-", "blot", "analysis", "of", "fractions", "collected", "during", "preparation", "of", "SVs", "from", "brain", "of", "Clcn3ven", "/", "ven", "mice", ".", "VenusClC", "-", "3", "(", "detected", "with", "GFP", "antibody", ")", "co", "-", "purified", "with", "SV", "marker", "protein", "synaptophysin", ".", "(", "F", ")", "Fluorescence", "of", "immobilized", "Venus", "-", "tagged", "SVs", "imaged", "with", "TIRF", "microscopy", ".", "Scale", "bar", ",", "2", "µm", ".", "(", "G", ",", "H", ")", "Co", "-", "localization", "between", "the", "Venus", "-", "tagged", "vesicles", "with", "antibodies", "against", "VGLUT1", "and", "synaptophysin", "was", "analyzed", ".", "(", "G", ")", "11", ".", "4", "±", "0", ".", "6", "(", "SD", ")", "of", "VGLUT1", "-", "labeled", "SVs", "and", "8", ".", "2", "±", "2", "(", "SD", ")", "of", "synaptophysin", "-", "labeled", "SVs", "showed", "Venus", "fluorescence", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "(", "H", ")", "65", "±", "5", ".", "4", "(", "SD", ")", "and", "79", ".", "4", "±", "3", ".", "8", "(", "SD", ")", "of", "Venus", "-", "tagged", "SVs", "showed", "co", "-", "localization", "with", "VGLUT1", "and", "synaptophysin", ",", "respectively", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "(", "I", ")", "Co", "-", "immunolabelling", "of", "VenusClC", "-", "3", "(", "green", ")", "with", "synaptophysin", "(", "red", ")", "of", "immobilized", "SVs", "imaged", "with", "TIRF", "microscopy", ".", "Vesicle", "in", "quadrant", "delimited", "by", "dashed", "line", "is", "shown", "in", "higher", "magnification", "in", "merge", ".", "Scale", "bar", ",", "2", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) GFP antibodies immunolabel VenusClC-3 (green) in the somata of CA1 pyramidal neurons of Clcn3ven/ven, but not Clcn3+/+ brain sections. sp, stratum pyramidale (scale bar: 20 µm).(B) Co-immunolabelling of VenusClC-3 (green) with ClC-4 (red) in the CA3 region of Clcn3ven/ven mice (scale bar: 20 µm). sl, stratum lucidum; sp, stratum pyramidale.(C) Co-immunostaining of VenusClC-3 (green) with EEA1 (red, left panel), Lamp-1 (red, middle panel) or synaptophysin (red, right panel) in either CA1 or CA3 region of Clcn3ven/ven mice. Arrows indicate structures of overlap (scale bar: 5 µm).(D) GFP antibody immunolabels VenusClC-3 (green) in neurites of cultured neurons. EEA1 and VGLUT1 are co-stained (both in red; left and right panel, respectively). The dendritic marker MAP2 is stained in blue (right panel) (scale bars: 10 µm). DNA stained with DAPI.(E) Immuno-blot analysis of fractions collected during preparation of SVs from brain of Clcn3ven/ven mice. VenusClC-3 (detected with GFP antibody) co-purified with SV marker protein synaptophysin.(F) Fluorescence of immobilized Venus-tagged SVs imaged with TIRF microscopy. Scale bar, 2 µm.(G, H) Co-localization between the Venus-tagged vesicles with antibodies against VGLUT1 and synaptophysin was analyzed. (G) 11.4 ± 0.6 (SD) of VGLUT1-labeled SVs and 8.2 ± 2 (SD) of synaptophysin-labeled SVs showed Venus fluorescence (n=6). (H) 65 ± 5.4 (SD) and 79.4 ± 3.8 (SD) of Venus-tagged SVs showed co-localization with VGLUT1 and synaptophysin, respectively (n=6).(I) Co-immunolabelling of VenusClC-3 (green) with synaptophysin (red) of immobilized SVs imaged with TIRF microscopy. Vesicle in quadrant delimited by dashed line is shown in higher magnification in merge. Scale bar, 2 µm."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Immunoblots", "for", "ClC", "-", "3", ",", "ClC", "-", "4", ",", "VGLUT1", ",", "VGLUT2", ",", "VGAT", ",", "GluR4", "and", "GABAA", "-", "R", "-", "α1", "of", "whole", "lysates", "from", "brain", "of", "Clcn3", "+", "/", "+", "and", "Clcn3", "-", "/", "-", "mice", "at", "2", ",", "6", "and", "12", "weeks", "of", "age", ".", "(", "B", ")", "Acidification", "of", "synaptic", "vesicle", "LP2", "fractions", "from", "Clcn3unc", "/", "unc", "and", "Clcn3", "+", "/", "+", "mice", "at", "one", "year", "of", "age", "(", "upper", "panel", ",", "n", "=", "2", "animals", "each", "and", "≥", "3", "measurements", "per", "animal", ")", ",", "10", "-", "weeks", "-", "old", "Clcn4", "-", "/", "-", "and", "WT", "mice", "(", "middle", "panel", ",", "n", "=", "3", "animals", "each", "and", "≥", "3", "measurements", "per", "animal", ")", ",", "and", "4", "-", "6", "-", "weeks", "-", "old", "Clcn3unc", "/", "unc", "/", "Clcn4", "-", "/", "-", "and", "control", "mice", "(", "lower", "panel", ",", "6", "animals", "each", "with", "≥", "2", "measurements", "per", "animal", ")", ".", "A", "decrease", "in", "fluorescence", "reflects", "acidification", ".", "The", "protonophore", "FCCP", "dissipated", "the", "pH", "gradient", ".", "Mean", "values", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "ATP", "-", "induced", "acidification", "of", "LP2", "fractions", "derived", "from", "2", ",", "6", ",", "and", "10", "-", "12", "weeks", "-", "old", "Clcn3", "-", "/", "-", "compared", "to", "wild", "-", "type", "mice", ".", "Acidification", "measured", "by", "acridine", "orange", "fluorescence", "in", "the", "presence", "of", "60", "mM", "KCl", ".", "At", "least", "2", "animals", "in", "at", "least", "2", "independent", "experiments", "were", "pooled", ".", "Each", "measurement", "was", "performed", "at", "least", "3", "times", ".", "Mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "is", "shown", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0005", "(", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "test", ")", ".", "(", "D", ")", "Immunoblot", "revealed", "strong", "reduction", "of", "VGLUT1", "levels", "in", "the", "homogenate", "(", "H", ")", "and", "LP2", "fraction", "of", "Clcn3unc", "/", "unc", "/", "Clcn4", "-", "/", "-", "mice", ".", "(", "E", ")", "Endosomal", "pH", "of", "Clcn3", "+", "/", "+", "and", "Clcn3", "-", "/", "-", "primary", "hippocampal", "neurons", "determined", "with", "a", "pH", "-", "sensitive", "transferrin", "conjugate", ".", "N", "=", "5", "independent", "cell", "lines", "with", "at", "least", "2", "live", "cell", "dishes", "per", "cell", "line", "with", "about", "10", "images", "each", "and", "≥", "10", "Tfn", "-", "positive", "compartments", "per", "image", "and", "genotype", "were", "analysed", ".", "Mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "is", "shown", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Immunoblots for ClC-3, ClC-4, VGLUT1, VGLUT2, VGAT, GluR4 and GABAA-R-α1 of whole lysates from brain of Clcn3+/+ and Clcn3-/- mice at 2, 6 and 12 weeks of age.(B) Acidification of synaptic vesicle LP2 fractions from Clcn3unc/unc and Clcn3+/+ mice at one year of age (upper panel, n= 2 animals each and ≥3 measurements per animal), 10-weeks-old Clcn4-/- and WT mice (middle panel, n= 3 animals each and ≥3 measurements per animal), and 4-6-weeks-old Clcn3unc/unc/Clcn4-/- and control mice (lower panel, 6 animals each with ≥2 measurements per animal). A decrease in fluorescence reflects acidification. The protonophore FCCP dissipated the pH gradient. Mean values ± s.e.m.(C) Quantification of ATP-induced acidification of LP2 fractions derived from 2, 6, and 10-12 weeks-old Clcn3-/- compared to wild-type mice. Acidification measured by acridine orange fluorescence in the presence of 60 mM KCl. At least 2 animals in at least 2 independent experiments were pooled. Each measurement was performed at least 3 times. Mean ± s.e.m. is shown.* p < 0.05, *** p < 0.0005 (two-tailed unpaired t test).(D) Immunoblot revealed strong reduction of VGLUT1 levels in the homogenate (H) and LP2 fraction of Clcn3unc/unc/Clcn4-/- mice.(E) Endosomal pH of Clcn3+/+ and Clcn3-/- primary hippocampal neurons determined with a pH-sensitive transferrin conjugate. N= 5 independent cell lines with at least 2 live cell dishes per cell line with about 10 images each and ≥10 Tfn-positive compartments per image and genotype were analysed. Mean ± s.e.m. is shown."}
{"words": ["Figure", "6Miniature", "inhibitory", "postsynaptic", "currents", "(", "mIPSCs", ")", "measured", "in", "CA1", "pyramidal", "neurons", "in", "different", "mouse", "models", "at", "P14", "-", "P16", ".", "(", "A", ")", "example", "mIPSCs", "of", "WT", "(", "left", ")", "and", "Clcn3", "-", "/", "-", "neurons", ".", "Mean", "values", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "and", "cumulative", "histogram", "of", "amplitude", "(", "top", ")", "and", "frequency", "/", "interevent", "-", "interval", "(", "bottom", ")", "of", "mIPSCs", "in", "different", "mouse", "-", "models", "as", "indicated", ".", "Several", "cells", "of", "3", "mice", "of", "each", "genotype", "were", "analyzed", ".", "Compared", "genotypes", "were", "siblings", ".", "No", "difference", "in", "amplitude", "or", "frequency", "/", "interevent", "-", "interval", "distribution", "of", "mIPSCs", "was", "found", "in", "(", "B", ")", "Clcn3", "-", "/", "-", "and", "Clcn3", "+", "/", "+", "(", "Clcn3", "+", "/", "+", ":", "16", "cells", ",", "Clcn3", "-", "/", "-", ":", "15", "cells", ";", "mean", "amplitude", ":", "p", ">", "0", ".", "8", ",", "t", "test", ";", "mean", "frequency", ":", "p", ">", "0", ".", "4", ",", "MW", "-", "test", ")", ",", "in", "(", "C", ")", "Clcn3unc", "/", "unc", "and", "Clcn3", "+", "/", "+", "(", "Clcn3", "+", "/", "+", ":", "21", "cells", ",", "Clcn3unc", "/", "unc", ":", "13", "cells", ";", "mean", "amplitude", ":", "p", ">", "0", ".", "7", ";", "mean", "frequency", ":", "p", "=", "0", ".", "3", ",", "t", "test", ")", ",", "and", "in", "(", "D", ")", "Clcn4", "-", "/", "-", "and", "Clcn3", "+", "/", "+", "(", "Clcn3", "+", "/", "+", ":", "18", "cells", ",", "Clcn4", "-", "/", "-", ":", "18", "cells", ";", "mean", "amplitude", ":", "p", ">", "0", ".", "3", ",", "t", "-", "test", ";", "mean", "frequency", ":", "p", "=", "0", ".", "6", ",", "MW", "-", "test", ")", ".", "(", "E", ")", "No", "difference", "in", "mean", "amplitude", "(", "p", ">", "0", ".", "5", ",", "t", "test", ")", ",", "in", "cumulative", "amplitude", "and", "mean", "frequency", "of", "mIPSCs", "(", "p", ">", "0", ".", "1", ",", "t", "test", ")", "was", "found", "in", "Clcn3unc", "/", "unc", "/", "Clcn4", "-", "/", "-", "and", "Clcn3", "+", "/", "+", "/", "Clcn4", "-", "/", "-", ".", "The", "interevent", "-", "interval", "distribution", "was", "shifted", "to", "the", "right", ",", "indicating", "a", "reduced", "frequency", "of", "mIPSCs", "in", "Clcn3unc", "/", "unc", "/", "Clcn4", "-", "/", "-", "(", "KS", "-", "test", ",", "p", "<", "0", ",", "05", ")", "(", "Clcn3", "+", "/", "+", "/", "Clcn4", "-", "/", "-", ":", "16", "cells", ",", "Clcn3unc", "/", "unc", "/", "Clcn4", "-", "/", "-", ":", "12", "cells", ")", ".", "(", "F", ",", "G", ")", "miniature", "excitatory", "postsynaptic", "currents", "(", "mEPSCs", ")", ".", "(", "F", ")", "example", "traces", "of", "mEPSCs", "in", "WT", "and", "Clcn3", "-", "/", "-", "neurons", "(", "G", ")", "No", "significant", "difference", "between", "Clcn3unc", "/", "unc", "/", "Clcn4", "-", "/", "-", "and", "Clcn3", "+", "/", "+", "/", "Clcn4", "-", "/", "-", "mEPSCs", "in", "mean", "amplitudes", "(", "p", ">", "0", ".", "9", ",", "t", "test", ")", "or", "in", "the", "distribution", "of", "amplitudes", "(", "Clcn4", "-", "/", "-", ":", "12", "cells", ",", "2", "mice", ";", "Clcn3unc", "/", "unc", "/", "Clcn4", "-", "/", "-", ":", "8", "cells", ",", "2", "mice", ")", ".", "(", "H", ")", "Primary", "hippocampal", "neurons", "co", "-", "transfected", "with", "ClC", "-", "3", "and", "synaptobrevin", "(", "syb2", ")", ",", "both", "luminally", "tagged", "with", "pHluorin", "or", "the", "pH", "-", "sensitive", "mOrange", "Ramirez", "et", "al", ",", "2012", "(", ")", ",", "respectively", ",", "were", "stimulated", "by", "200", "action", "potentials", "(", "APs", ")", "at", "20", "Hz", "(", "indicated", "by", "bar", ")", ".", "Vesicle", "exocytosis", "was", "monitored", "by", "fluorescence", "increase", "upon", "exposure", "to", "extracellular", "neutral", "pH", ".", "Note", "that", "only", "Syb2", "and", "not", "ClC", "-", "3", "shows", "signs", "of", "exocytosis", ".", "Traces", "were", "corrected", "for", "photobleaching", ".", "The", "initial", "decay", "of", "the", "pHluorin", "signal", "is", "probably", "due", "to", "the", "high", "light", "exposure", ",", "which", "forces", "the", "fluorophores", "into", "a", "transient", "dark", "-", "state", "Dean", "et", "al", ",", "2011", "(", ")", ".", "Averaged", "fluorescence", "traces", "(", "n", "=", "10", ")", ",", "error", "bars", ",", "s", ".", "e", ".", "m", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Miniature inhibitory postsynaptic currents (mIPSCs) measured in CA1 pyramidal neurons in different mouse models at P14-P16. (A) example mIPSCs of WT (left) and Clcn3-/- neurons.Mean values ± s.e.m. and cumulative histogram of amplitude (top) and frequency/interevent-interval (bottom) of mIPSCs in different mouse-models as indicated . Several cells of 3 mice of each genotype were analyzed. Compared genotypes were siblings. No difference in amplitude or frequency/ interevent-interval distribution of mIPSCs was found in (B) Clcn3-/- and Clcn3+/+ (Clcn3+/+: 16 cells, Clcn3-/-: 15 cells; mean amplitude: p > 0.8, t test; mean frequency: p > 0.4, MW-test), in (C) Clcn3unc/unc and Clcn3+/+ (Clcn3+/+: 21 cells, Clcn3unc/unc: 13 cells; mean amplitude: p > 0.7; mean frequency: p = 0.3, t test), and in (D) Clcn4-/- and Clcn3+/+ (Clcn3+/+: 18 cells, Clcn4-/-: 18 cells; mean amplitude: p > 0.3, t-test; mean frequency: p = 0.6, MW-test).(E) No difference in mean amplitude (p > 0.5, t test), in cumulative amplitude and mean frequency of mIPSCs (p > 0.1, t test) was found in Clcn3unc/unc/Clcn4-/- and Clcn3+/+/Clcn4-/-. The interevent-interval distribution was shifted to the right, indicating a reduced frequency of mIPSCs in Clcn3unc/unc/Clcn4-/- (KS-test, p < 0,05) (Clcn3+/+/Clcn4-/-: 16 cells, Clcn3unc/unc/Clcn4-/-: 12 cells).(F,G) miniature excitatory postsynaptic currents (mEPSCs). (F) example traces of mEPSCs in WT and Clcn3-/- neurons (G) No significant difference between Clcn3unc/unc/Clcn4-/- and Clcn3+/+/Clcn4-/- mEPSCs in mean amplitudes (p > 0.9, t test) or in the distribution of amplitudes (Clcn4-/-: 12 cells, 2 mice; Clcn3unc/unc/Clcn4-/-: 8 cells, 2 mice).(H) Primary hippocampal neurons co-transfected with ClC-3 and synaptobrevin (syb2), both luminally tagged with pHluorin or the pH-sensitive mOrange Ramirez et al, 2012(), respectively, were stimulated by 200 action potentials (APs) at 20 Hz (indicated by bar). Vesicle exocytosis was monitored by fluorescence increase upon exposure to extracellular neutral pH. Note that only Syb2 and not ClC-3 shows signs of exocytosis. Traces were corrected for photobleaching. The initial decay of the pHluorin signal is probably due to the high light exposure, which forces the fluorophores into a transient dark-state Dean et al, 2011(). Averaged fluorescence traces (n=10), error bars, s.e.m."}
{"words": ["Figure", "1B", "Pim1", ",", "2", ",", "or", "3", "and", "GFP", "-", "EDC3", "expression", "vectors", "were", "transfected", "into", "HEK", "-", "293T", ".", "GFP", "-", "Trap", "Nano", "-", "body", "beads", "(", "GFP", "-", "Trap", ")", "were", "used", "to", "immunoprecipitate", "(", "IP", ")", "GFP", "-", "EDC3", ",", "and", "the", "associated", "proteins", "were", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "with", "the", "indicated", "Abs", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B Pim1, 2, or 3 and GFP-EDC3 expression vectors were transfected into HEK-293T. GFP-Trap Nano-body beads (GFP-Trap) were used to immunoprecipitate (IP) GFP-EDC3, and the associated proteins were analyzed by Western blotting with the indicated Abs."}
{"words": ["Figure", "2B", "HEK", "-", "293T", "cells", "were", "transfected", "with", "Pim1", "and", "each", "EDC3", "domain", "(", "Fig", ".", "2A", ")", "fused", "to", "the", "C", "-", "terminus", "of", "the", "GFP", "-", "tagged", "vector", ".", "The", "individual", "fragments", "were", "immunoprecipitated", "with", "GFP", "-", "Trap", "beads", "and", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "with", "the", "indicated", "Abs", ".", "EDC3", "wild", "type", "(", "W", ")", ",", "F1", ",", "F2", ",", "F3", ",", "F4", "were", "EDC3", "fragments", "vector", "fused", "to", "GFP", ".", "The", "C1", "lane", "was", "only", "transfected", "with", "the", "GFP", "Flag", "vector", "while", "C2", "contained", "EDC3", "wild", "type", "fused", "to", "GFP", "and", "no", "Pim1", "but", "empty", "vector", "control", "(", "pcDNA3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B HEK-293T cells were transfected with Pim1 and each EDC3 domain (Fig. 2A) fused to the C-terminus of the GFP-tagged vector. The individual fragments were immunoprecipitated with GFP-Trap beads and analyzed by Western blotting with the indicated Abs. EDC3 wild type (W), F1, F2, F3, F4 were EDC3 fragments vector fused to GFP. The C1 lane was only transfected with the GFP Flag vector while C2 contained EDC3 wild type fused to GFP and no Pim1 but empty vector control (pcDNA3)."}
{"words": ["Figure", "3F", "PC3", "-", "LN4", "CRISPR", "-", "Ctr", "and", "Pim1", "KO", "cells", "were", "treated", "with", "PIMi", "(", "PIM447", ",", "3μM", ")", ",", "AKTi", "(", "GSK690693", ",", "5μM", ")", ",", "or", "the", "combination", "for", "24", "h", ".", "Extracts", "were", "subjected", "to", "Western", "blotting", "with", "the", "indicated", "Abs", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3F PC3-LN4 CRISPR-Ctr and Pim1 KO cells were treated with PIMi (PIM447, 3μM), AKTi (GSK690693, 5μM), or the combination for 24 h. Extracts were subjected to Western blotting with the indicated Abs."}
{"words": ["Figure", "4Quantification", "of", "EDC3", "/", "DCP1a", "foci", "number", "from", "Control", "(", "Ctrl", ")", ",", "PIMi", ",", "AKTi", "and", "the", "AKTi", "+", "PIMi", "combination", "in", "(", "A", ")", ".", "Data", "information", ":", "The", "quantification", "data", "of", "(", "B", "are", "presented", "as", "mean", "+", "/", "-", "SEM", "(", "n", "=", "30", "cells", "/", "treatment", "group", ")", ".", "p", "values", "<", "0", ".", "05", ",", "calculated", "using", "unpaired", "student", "t", "-", "test", ",", "are", "considered", "significant", ".", "p", "values", ">", "0", ".", "05", "not", "significant", "(", "n", ".", "s", ".", ")", ".", "The", "analyses", "done", "included", "multiple", "independent", "fields", ".", "D", "Quantification", "of", "DCP1a", "foci", "number", "for", "Control", "(", "Ctrl", ")", ",", "PIMi", ",", "AKTi", ",", "and", "AKTi", "+", "PIMi", "combination", "in", "(", "C", ")", ".", "Data", "information", ":", "The", "quantification", "data", "of", "D", ")", "are", "presented", "as", "mean", "+", "/", "-", "SEM", "(", "n", "=", "30", "cells", "/", "treatment", "group", ")", ".", "p", "values", "<", "0", ".", "05", ",", "calculated", "using", "unpaired", "student", "t", "-", "test", ",", "are", "considered", "significant", ".", "p", "values", ">", "0", ".", "05", "not", "significant", "(", "n", ".", "s", ".", ")", ".", "The", "analyses", "done", "included", "multiple", "independent", "fields", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Quantification of EDC3/DCP1a foci number from Control (Ctrl), PIMi, AKTi and the AKTi + PIMi combination in (A). Data information: The quantification data of (B are presented as mean +/- SEM (n = 30 cells/treatment group). p values<0.05, calculated using unpaired student t-test, are considered significant. p values>0.05 not significant (n.s.). The analyses done included multiple independent fields.D Quantification of DCP1a foci number for Control (Ctrl), PIMi, AKTi, and AKTi + PIMi combination in (C). Data information: The quantification data of D) are presented as mean +/- SEM (n = 30 cells/treatment group). p values<0.05, calculated using unpaired student t-test, are considered significant. p values>0.05 not significant (n.s.). The analyses done included multiple independent fields."}
{"words": ["Figure", "5A", ",", "B", "Western", "blot", "of", "whole", "-", "cell", "(", "WCL", ")", "and", "P", "-", "body", "(", "PB", ")", "purified", "from", "PC3", "-", "LN4", "cells", "stably", "expressing", "GFP", "-", "DCP1a", "used", "as", "a", "P", "-", "body", "tag", ".", "The", "P", "-", "bodies", "(", "PB", ")", "were", "isolated", "with", "GFP", "-", "Trap", "beads", "and", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "with", "the", "indicated", "Abs", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A, B Western blot of whole-cell (WCL) and P-body (PB) purified from PC3-LN4 cells stably expressing GFP-DCP1a used as a P-body tag. The P-bodies (PB) were isolated with GFP-Trap beads and analyzed by Western blotting with the indicated Abs."}
{"words": ["Figure", "7A", "PC3", "-", "LN4", "Naïve", "and", "CRISPR", "/", "Cas9", "genome", "-", "edited", "EDC3", "S161A", "(", "SA", ")", ",", "S161D", "(", "Fredriksson", "et", "al", ".", ")", ",", "and", "EDC3", "knock", "-", "out", "(", "KO", ")", "cell", "lines", "were", "plated", "(", "4000", "cells", "/", "well", "in", "24", "well", "plates", ")", "and", "imaged", "every", "12", "h", "using", "phase", "contrast", "in", "the", "IncuCyte", "ZOOM", "platform", ".", "The", "graph", "shown", "was", "generated", "with", "IncuCyte", "Basic", "Software", "following", "5", "days", "of", "growth", ".", "The", "experiments", "were", "done", "in", "triplicates", ".", "Values", "are", "mean", "+", "/", "-", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "p", "values", "<", "0", ".", "05", ",", "calculated", "using", "unpaired", "student", "t", "-", "test", ".", "Data", "information", ":", "All", "invasion", "and", "migration", "assays", "were", "performed", "in", "triplicates", "and", "6", "different", "fields", "at", "10x", "magnification", "were", "counted", "in", "3", "separate", "inserts", ".", "The", "data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "+", "/", "-", "S", ".", "D", ".", "p", "values", "<", "0", ".", "05", ",", "calculated", "using", "unpaired", "student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "H", "Relative", "mRNA", "expression", "of", "ITGA6", ",", "ITGB1", ",", "and", "KLF4", "in", "PC3", "-", "LN4", "EDC3", "KO", "-", "C60", "cells", ",", "containing", "reexpressed", "EDC3", "WT", "or", "EDC3", "S161A", "mutant", "cDNAs", "Data", "information", ":", "Real", "-", "time", "PCR", "dataJ", "Western", "blot", "analysis", "of", "proteins", "extracted", "from", "PC3", "-", "LN4", "cells", "treated", "with", "DMSO", "or", "the", "combination", "of", "Pim447", "and", "AZD5363", "for", "96", "h", "using", "the", "specified", "antibodies", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A PC3-LN4 Naïve and CRISPR/Cas9 genome-edited EDC3 S161A (SA), S161D (Fredriksson et al.), and EDC3 knock-out (KO) cell lines were plated (4000 cells/well in 24 well plates) and imaged every 12 h using phase contrast in the IncuCyte ZOOM platform. The graph shown was generated with IncuCyte Basic Software following 5 days of growth. The experiments were done in triplicates. Values are mean +/- S.E.M. p values<0.05, calculated using unpaired student t-test. Data information: All invasion and migration assays were performed in triplicates and 6 different fields at 10x magnification were counted in 3 separate inserts. The data are presented as the mean +/- S.D. p values<0.05, calculated using unpaired student's t-test.H Relative mRNA expression of ITGA6, ITGB1, and KLF4 in PC3-LN4 EDC3 KO-C60 cells, containing reexpressed EDC3 WT or EDC3 S161A mutant cDNAs Data information: Real-time PCR dataJ Western blot analysis of proteins extracted from PC3-LN4 cells treated with DMSO or the combination of Pim447 and AZD5363 for 96 h using the specified antibodies."}
{"words": ["Figure", "8A", "Two", "independently", "derived", "CRISPR", "/", "Cas9", "PC3", "-", "LN4", "EDC3", "S161A", "mutants", "(", "EDC3", "SA", "#", "1", ",", "#", "2", ")", "and", "wild", "type", "cells", "were", "injected", "subcutaneously", "in", "the", "flank", "(", "5X106", ")", "of", "SCID", "mice", "(", "n", "=", "8", "/", "group", ")", ",", "and", "tumor", "growth", "was", "monitored", "until", "the", "control", "group", "reached", "1000", "mm3", ".", "The", "subcutaneous", "tumor", "volume", "measurement", "(", "mm3", ")", "was", "done", "as", "outlined", "in", "Materials", "and", "Methods", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ",", "(", "n", "=", "8", "/", "group", ")", ".", "B", "Phosphorylated", "EDC3", "levels", "were", "examined", "in", "normal", "immortalized", "breast", "cell", "lines", ",", "MCF10A", "and", "MCF12A", ",", "human", "breast", "cancer", "cell", "lines", "HCC38", ",", "HCC1954", ",", "MDA", "-", "MB", "-", "231", ",", "MDA", "-", "MD", "-", "468", ",", "BT", "-", "549", ",", "MRKNU1", ",", "and", "mouse", "4T1", "by", "Western", "blotting", "with", "the", "indicated", "Abs", ".", "C", "Dual", "immunohistochemistry", "staining", "of", "human", "breast", "tumor", "with", "p", "-", "EDC3", "Ab", "(", "Fredriksson", "et", "al", ".", ")", "and", "total", "EDC3", "(", "brown", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "50µm", ".", "D", "Dual", "immunohistochemistry", "staining", "of", "human", "normal", "resected", "breast", "tissue", "sections", "with", "p", "-", "EDC3", "Ab", "(", "Fredriksson", "et", "al", ".", ")", "and", "total", "EDC3", "(", "brown", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "50µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8A Two independently derived CRISPR/Cas9 PC3-LN4 EDC3 S161A mutants (EDC3 SA#1, #2) and wild type cells were injected subcutaneously in the flank (5X106) of SCID mice (n=8/group), and tumor growth was monitored until the control group reached 1000 mm3. The subcutaneous tumor volume measurement (mm3) was done as outlined in Materials and Methods. Data are presented as mean ± SEM, (n = 8/group).B Phosphorylated EDC3 levels were examined in normal immortalized breast cell lines, MCF10A and MCF12A, human breast cancer cell lines HCC38, HCC1954, MDA-MB-231, MDA-MD-468, BT-549, MRKNU1, and mouse 4T1 by Western blotting with the indicated Abs.C Dual immunohistochemistry staining of human breast tumor with p-EDC3 Ab (Fredriksson et al.) and total EDC3 (brown). Scale bar: 50µm. D Dual immunohistochemistry staining of human normal resected breast tissue sections with p-EDC3 Ab (Fredriksson et al.) and total EDC3 (brown). Scale bar: 50µm. "}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Immunofluorescence", "of", "HEK", "‐", "293T", "cells", "that", "express", "TFEB", "-", "3", "×", "FLAG", ",", "subjected", "to", "the", "indicated", "treatments", "and", "stained", "with", "antibodies", "against", "FLAG", "and", "the", "lysosomal", "marker", "LAMP2", ".", "The", "FLAG", "and", "LAMP2", "channels", "are", "in", "green", "and", "red", ",", "respectively", ",", "in", "the", "merge", ".", "DAPI", "(", "blue", ")", "is", "included", "in", "the", "merge", ".", "Scale", "bars", "represent", "10", "μm", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "cells", "with", "nuclear", "TFEB", "-", "3", "×", "FLAG", "in", "the", "four", "conditions", "in", "(", "A", ")", ".", "Each", "value", "represents", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "from", "three", "independent", "fields", "with", "N", "=", "300", ".", "(", "C", ")", "Immunofluorescence", "of", "HEK", "‐", "293T", "cells", "treated", "as", "indicated", "and", "stained", "with", "antibodies", "against", "endogenous", "TFEB", "and", "the", "lysosomal", "protein", "RagC", "(", "green", "and", "red", ",", "respectively", ",", "in", "the", "merge", ")", ".", "DAPI", "is", "included", "in", "the", "merge", ".", "Scale", "bars", "represent", "10", "μm", ".", "(", "D", ")", "Immunoblotting", "of", "proteins", "extracted", "from", "HeLa", "cells", "that", "express", "TFEB", "-", "3", "×", "FLAG", "treated", "with", "DMSO", ",", "chloroquine", "(", "CQ", ")", "or", "SalA", ",", "subjected", "to", "nuclear", "/", "cytosolic", "fractionation", "and", "blotted", "with", "antibody", "against", "FLAG", "to", "detect", "TFEB", ".", "H3", "and", "tubulin", "were", "used", "as", "nuclear", "and", "cytosolic", "markers", ",", "respectively", ".", "Blots", "are", "representative", "of", "triplicate", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Immunofluorescence of HEK‐293T cells that express TFEB-3 × FLAG, subjected to the indicated treatments and stained with antibodies against FLAG and the lysosomal marker LAMP2. The FLAG and LAMP2 channels are in green and red, respectively, in the merge. DAPI (blue) is included in the merge. Scale bars represent 10 μm.(B) Quantification of the number of cells with nuclear TFEB-3 × FLAG in the four conditions in (A). Each value represents mean±s.d. from three independent fields with N=300.(C) Immunofluorescence of HEK‐293T cells treated as indicated and stained with antibodies against endogenous TFEB and the lysosomal protein RagC (green and red, respectively, in the merge). DAPI is included in the merge. Scale bars represent 10 μm.(D) Immunoblotting of proteins extracted from HeLa cells that express TFEB-3 × FLAG treated with DMSO, chloroquine (CQ) or SalA, subjected to nuclear/cytosolic fractionation and blotted with antibody against FLAG to detect TFEB. H3 and tubulin were used as nuclear and cytosolic markers, respectively. Blots are representative of triplicate experiments."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Lysosomal", "stress", "inhibits", "mTOR", "signalling", ".", "Immunoblotting", "of", "protein", "extracts", "isolated", "from", "HeLa", "cells", "treated", "overnight", "as", "indicated", ".", "Membranes", "were", "probed", "with", "antibodies", "against", "p", "‐", "T202", "/", "Y204", "‐", "ERK1", "/", "2", ",", "ERK1", "/", "2", ",", "p", "‐", "T389", "‐", "S6K", ",", "and", "S6K", "to", "measure", "ERK", "and", "mTORC1", "activities", ".", "(", "B", ")", "Torin", "1", "induces", "TFEB", "dephosphorylation", "and", "nuclear", "translocation", ".", "FLAG", "immunoblotting", "of", "cytosolic", "and", "nuclear", "fractions", "isolated", "from", "TFEB", "-", "3", "×", "FLAG", "HeLa", "cells", "starved", "in", "amino", "acid", "‐", "free", "media", "and", "subsequently", "stimulated", "as", "indicated", "for", "at", "least", "3", "h", ".", "Correct", "subcellular", "fractionation", "was", "verified", "with", "H3", "and", "tubulin", "antibodies", ".", "(", "C", ")", "Effects", "of", "ERK", "and", "mTOR", "inhibitors", "on", "TFEB", "nuclear", "translocation", ".", "TFEB", "-", "GFP", "HeLa", "cells", "were", "seeded", "in", "96", "‐", "well", "plates", ",", "cultured", "for", "12", "h", ",", "and", "then", "treated", "with", "the", "indicated", "concentrations", "of", "the", "ERK", "inhibitor", "U0126", ",", "or", "the", "mTOR", "inhibitors", "Rapamycin", ",", "Torin", "1", ",", "and", "Torin", "2", ".", "After", "3", "h", "at", "37", "°", "C", ",", "cells", "were", "processed", "and", "images", "were", "acquired", "using", "the", "OPERA", "automated", "confocal", "microscope", "(", "Perkin", "‐", "Elmer", ")", ".", "Scale", "bars", "represent", "30", "μm", ".", "(", "D", ")", "Dose", "-", "response", "curves", "of", "the", "effects", "of", "ERK", "and", "mTOR", "inhibitors", "on", "TFEBnuclear", "translocation", ".", "TFEB", "-", "GFPHeLa", "cells", "were", "seeded", "in", "384", "‐", "well", "plates", ",", "cultured", "for", "12", "h", ",", "and", "treated", "with", "10", "different", "concentrations", "of", "the", "ERK", "inhibitor", "U0126", ",", "or", "the", "mTOR", "inhibitors", "Rapamycin", ",", "Torin", "1", ",", "and", "Torin", "2", "ranging", "from", "2", ".", "54", "nM", "to", "50", "μM", ".", "The", "graph", "shows", "the", "percentage", "of", "nuclear", "translocation", "at", "the", "different", "concentrations", "of", "each", "compound", "(", "in", "log", "of", "the", "concentration", ")", ".", "The", "EC50", "for", "each", "compound", "was", "calculated", "using", "Prism", "software", "(", "see", "Materials", "and", "methods", "for", "details", ")", ".", "(", "E", ")", "Immunofluorescence", "of", "HEK", "‐", "293T", "cells", "treated", "with", "DMSO", "or", "Torin", "1", "and", "stained", "with", "antibodies", "against", "endogenous", "TFEB", "and", "the", "lysosomal", "protein", "RagC", "(", "green", "and", "red", ",", "respectively", ",", "in", "the", "merge", ")", ".", "DAPI", "is", "included", "in", "the", "merge", ".", "Scale", "bars", "represent", "10", "μM", ".", "(", "F", ")", "Rag", "GTPase", "knockdown", "induces", "TFEB", "nuclear", "translocation", ".", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "TFEB", "-", "3", "×", "FLAG", "were", "infected", "with", "lentiviruses", "encoding", "Short", "hairpin", "(", "Sh", "‐", ")", "RNAs", "targeting", "luciferase", "(", "control", ")", "or", "RagC", "and", "RagD", "mRNAs", ".", "In", "all", "samples", ",", "96", "h", "post", "infection", ",", "cells", "were", "left", "untreated", "(", "N", "=", "normal", "media", ")", ",", "starved", "(", "S", "=", "starved", "media", ")", "or", "treated", "with", "Torin", "1", "(", "T", "=", "Torin", "1", ")", "for", "4", "h", "and", "then", "subjected", "to", "nuclear", "/", "cytosolic", "fractionation", ".", "TFEB", "localization", "was", "detected", "with", "a", "FLAG", "antibody", ",", "whereas", "tubulin", "and", "H3", "were", "used", "as", "controls", "for", "the", "cytosolic", "and", "nuclear", "fraction", ",", "respectively", ";", "levels", "of", "S6K", "phosphorylation", "were", "used", "to", "test", "RagC", "and", "RagD", "knockdown", "efficiency", ".", "(", "G", ")", "Loss", "of", "mTORC2", "does", "not", "affect", "TFEB", "phosphorylation", ".", "Mouse", "embryonic", "fibroblasts", "(", "MEFs", ")", "isolated", "from", "Sin1", "−", "/", "−", "or", "control", "embryos", "(", "E14", ".", "5", ")", "were", "infected", "with", "a", "retrovirus", "encoding", "TFEB", "-", "3", "×", "FLAG", ";", "48", "h", "post", "infection", ",", "cells", "were", "treated", "with", "Torin", "1", "(", "T", ")", "for", "4", "h", "where", "indicated", ",", "subjected", "to", "nuclear", "/", "cytosolic", "fractionation", "and", "immunoblotted", "for", "FLAG", ",", "tubulin", ",", "and", "H3", ".", "(", "H", ")", "Binding", "of", "TFEB", "to", "mTORC1", ".", "HEK", "‐", "293T", "cells", "that", "express", "TFEB", "-", "3", "×", "FLAG", "were", "lysed", "and", "subjected", "to", "FLAG", "immunoprecipitation", "followed", "by", "immunoblotting", "for", "mTOR", ",", "the", "mTORC1", "subunit", "raptor", "and", "the", "mTORC2", "components", "rictor", "and", "Sin1", ".", "FLAG", "-", "Rap2A", "served", "as", "negative", "control", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Lysosomal stress inhibits mTOR signalling. Immunoblotting of protein extracts isolated from HeLa cells treated overnight as indicated. Membranes were probed with antibodies against p‐T202/Y204‐ERK1/2, ERK1/2, p‐T389‐S6K, and S6K to measure ERK and mTORC1 activities.(B) Torin 1 induces TFEB dephosphorylation and nuclear translocation. FLAG immunoblotting of cytosolic and nuclear fractions isolated from TFEB-3 × FLAG HeLa cells starved in amino acid‐free media and subsequently stimulated as indicated for at least 3 h. Correct subcellular fractionation was verified with H3 and tubulin antibodies.(C) Effects of ERK and mTOR inhibitors on TFEB nuclear translocation. TFEB-GFP HeLa cells were seeded in 96‐well plates, cultured for 12 h, and then treated with the indicated concentrations of the ERK inhibitor U0126, or the mTOR inhibitors Rapamycin, Torin 1, and Torin 2. After 3 h at 37°C, cells were processed and images were acquired using the OPERA automated confocal microscope (Perkin‐Elmer). Scale bars represent 30 μm.(D) Dose-response curves of the effects of ERK and mTOR inhibitors on TFEBnuclear translocation. TFEB-GFPHeLa cells were seeded in 384‐well plates, cultured for 12 h, and treated with 10 different concentrations of the ERK inhibitor U0126, or the mTOR inhibitors Rapamycin, Torin 1, and Torin 2 ranging from 2.54 nM to 50 μM. The graph shows the percentage of nuclear translocation at the different concentrations of each compound (in log of the concentration). The EC50 for each compound was calculated using Prism software (see Materials and methods for details).(E) Immunofluorescence of HEK‐293T cells treated with DMSO or Torin 1 and stained with antibodies against endogenous TFEB and the lysosomal protein RagC (green and red, respectively, in the merge). DAPI is included in the merge. Scale bars represent 10 μM.(F) Rag GTPase knockdown induces TFEB nuclear translocation. HeLa cells stably expressing TFEB-3 × FLAG were infected with lentiviruses encoding Short hairpin (Sh‐) RNAs targeting luciferase (control) or RagC and RagD mRNAs. In all samples, 96 h post infection, cells were left untreated (N=normal media), starved (S=starved media) or treated with Torin 1 (T=Torin 1) for 4 h and then subjected to nuclear/cytosolic fractionation. TFEB localization was detected with a FLAG antibody, whereas tubulin and H3 were used as controls for the cytosolic and nuclear fraction, respectively; levels of S6K phosphorylation were used to test RagC and RagD knockdown efficiency.(G) Loss of mTORC2 does not affect TFEB phosphorylation. Mouse embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from Sin1−/− or control embryos (E14.5) were infected with a retrovirus encoding TFEB-3 × FLAG; 48 h post infection, cells were treated with Torin 1 (T) for 4 h where indicated, subjected to nuclear/cytosolic fractionation and immunoblotted for FLAG, tubulin, and H3.(H) Binding of TFEB to mTORC1. HEK‐293T cells that express TFEB-3 × FLAG were lysed and subjected to FLAG immunoprecipitation followed by immunoblotting for mTOR, the mTORC1 subunit raptor and the mTORC2 components rictor and Sin1. FLAG-Rap2A served as negative control."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Torin", "1", "induces", "S142", "dephosphorylation", ".", "HeLa", "cells", "were", "treated", "as", "indicated", "and", "total", "and", "nuclear", "extracts", "were", "probed", "with", "a", "TFEB", "p", "‐", "S142", "phosphoantibody", "and", "with", "anti", "‐", "FLAG", "antibody", ".", "Disappearance", "of", "TFEB", "S142", "phosphorylation", "upon", "starvation", "or", "Torin", "1", "treatment", "correlates", "with", "accumulation", "of", "TFEB", "in", "the", "nuclear", "fraction", ".", "(", "B", ")", "mTORC1", "in", "‐", "vitro", "kinase", "assays", ".", "Highly", "purified", "FLAG", "-", "S6K1", ",", "TFEB", "-", "3", "×", "FLAG", ",", "or", "TFEBS142A", "-", "3", "×", "FLAG", "were", "incubated", "with", "radiolabelled", "ATP", "without", "kinase", ",", "with", "purified", "mTORC1", "or", "with", "mTORC1", "+", "Torin", "1", ",", "and", "analysed", "by", "autoradiography", ".", "The", "lower", "panel", "shows", "a", "FLAG", "immunoblot", "of", "the", "substrates", ".", "(", "D", ")", "Sequence", "conservation", "scores", "of", "the", "phosphosites", "and", "quantitative", "agreement", "between", "mTOR", "consensus", "motif", "and", "the", "sequence", "around", "the", "phosphosites", "of", "TFEB", ".", "(", "E", ")", "S142", "and", "S211", "regulate", "TFEB", "localization", ".", "FLAGimmunostaining", "(", "red", ")", "of", "HeLa", "cells", "expressing", "serine", "‐", "to", "‐", "alanine", "mutated", "versions", "of", "TFEB", "-", "3", "×", "FLAG", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Values", "are", "means", "of", "five", "fields", "containing", "at", "least", "50", "transfected", "cells", ".", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", "(", "unpaired", ")", "*", "*", "*", "P0", ".", "001", ".", "Scale", "bars", "represent", "30", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Torin 1 induces S142 dephosphorylation. HeLa cells were treated as indicated and total and nuclear extracts were probed with a TFEB p‐S142 phosphoantibody and with anti‐FLAG antibody. Disappearance of TFEB S142 phosphorylation upon starvation or Torin 1 treatment correlates with accumulation of TFEB in the nuclear fraction.(B) mTORC1 in‐vitro kinase assays. Highly purified FLAG-S6K1, TFEB-3 × FLAG, or TFEBS142A-3 × FLAG were incubated with radiolabelled ATP without kinase, with purified mTORC1 or with mTORC1+Torin 1, and analysed by autoradiography. The lower panel shows a FLAG immunoblot of the substrates.(D) Sequence conservation scores of the phosphosites and quantitative agreement between mTOR consensus motif and the sequence around the phosphosites of TFEB.(E) S142 and S211 regulate TFEB localization. FLAGimmunostaining (red) of HeLa cells expressing serine‐to‐alanine mutated versions of TFEB-3 × FLAG. Nuclei were stained with DAPI (blue). Values are means of five fields containing at least 50 transfected cells. Student's t‐test (unpaired) ***P0.001. Scale bars represent 30 μm."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Spinning", "disk", "confocal", "image", "of", "a", "MEF", "cell", "that", "co", "‐", "expresses", "TFEB", "-", "GFP", "and", "mRFP", "-", "Rab7", "(", "green", "and", "red", "in", "the", "merge", ",", "respectively", ")", ".", "(", "B", ")", "Time", "‐", "lapse", "of", "TFEB", "‐", "and", "Rab7", "‐", "positive", "lysosomes", "from", "the", "boxed", "region", "in", "(", "A", ")", ".", "Time", "intervals", "are", "in", "seconds", ".", "(", "C", ")", "Time", "‐", "lapse", "analysis", "of", "Torin", "1", "treatment", "in", "a", "MEF", "cell", "expressing", "TFEB", "-", "GFP", ".", "Arrow", "indicates", "the", "time", "of", "Torin", "1", "addition", ".", "Yellow", "arrowheads", "indicate", "Torin", "1", "‐", "induced", "lysosomal", "accumulation", "of", "TFEB", "-", "GFP", ".", "Time", "intervals", "are", "in", "minutes", ".", "(", "D", ")", "Immunofluorescence", "of", "HEK", "‐", "293T", "cells", "expressing", "TFEB", "-", "3", "×", "FLAG", ",", "treated", "with", "DMSO", "(", "top", ")", "or", "Torin1", "(", "bottom", ")", "and", "stained", "with", "antibodies", "against", "FLAG", "and", "mTOR", "(", "green", "and", "red", "in", "the", "merge", ",", "respectively", ";", "DAPI", "is", "in", "blue", ")", ".", "(", "E", ")", "FRAP", "analysis", "of", "TFEB", "-", "GFP", "‐", "positive", "lysosomes", "from", "control", "MEFs", "(", "blue", ")", "or", "MEFs", "treated", "with", "Torin", "1", "(", "red", ")", ".", "Each", "data", "point", "represents", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "from", "five", "independent", "spots", ".", "(", "F", ")", "Time", "‐", "lapse", "of", "photobleaching", "and", "fluorescence", "recovery", "of", "TFEB", "-", "GFP", "‐", "positive", "lysosomes", "from", "control", "‐", "treated", "MEFs", "(", "top", ")", "or", "MEFs", "treated", "with", "Torin", "1", "(", "bottom", ")", ".", "Red", "arrowheads", "indicate", "time", "of", "photobleaching", ".", "Time", "intervals", "are", "in", "seconds", ".", "(", "G", ")", "Torin", "1", "increases", "binding", "of", "TFEB", "to", "mTORC1", ".", "HEK", "‐", "293T", "cells", "that", "express", "TFEB", "-", "3", "×", "FLAG", "along", "with", "HAGST", "‐", "Rap2A", "or", "HAGST", "‐", "RagsDN", "were", "treated", "with", "vehicle", "or", "with", "Torin1", ",", "lysed", "and", "subjected", "to", "FLAG", "immunoprecipitation", "followed", "by", "immunoblotting", "for", "mTOR", "and", "raptor", ".", "FLAG", "-", "Metap2", "served", "as", "negative", "control", ".", "(", "H", ")", "Immunofluorescence", "of", "HEK", "‐", "293T", "cells", "that", "express", "TFEB", "-", "3", "×", "FLAG", "along", "with", "Rap2A", "(", "top", ")", "or", "the", "RagsDN", "mutants", "(", "bottom", ")", ",", "treated", "with", "Torin", "1", "and", "stained", "with", "antibodies", "against", "FLAG", "and", "LAMP2", "(", "green", "and", "red", "in", "the", "merge", ",", "respectively", ";", "DAPI", "is", "in", "blue", ")", ".", "In", "all", "images", ",", "scale", "bars", "represent", "10", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Spinning disk confocal image of a MEF cell that co‐expresses TFEB-GFP and mRFP-Rab7 (green and red in the merge, respectively).(B) Time‐lapse of TFEB‐ and Rab7‐positive lysosomes from the boxed region in (A). Time intervals are in seconds.(C) Time‐lapse analysis of Torin 1 treatment in a MEF cell expressing TFEB-GFP. Arrow indicates the time of Torin 1 addition. Yellow arrowheads indicate Torin 1‐induced lysosomal accumulation of TFEB-GFP. Time intervals are in minutes.(D) Immunofluorescence of HEK‐293T cells expressing TFEB-3 × FLAG, treated with DMSO (top) or Torin1 (bottom) and stained with antibodies against FLAG and mTOR (green and red in the merge, respectively; DAPI is in blue).(E) FRAP analysis of TFEB-GFP‐positive lysosomes from control MEFs (blue) or MEFs treated with Torin 1 (red). Each data point represents mean±s.d. from five independent spots.(F) Time‐lapse of photobleaching and fluorescence recovery of TFEB-GFP‐positive lysosomes from control‐treated MEFs (top) or MEFs treated with Torin 1 (bottom). Red arrowheads indicate time of photobleaching. Time intervals are in seconds.(G) Torin 1 increases binding of TFEB to mTORC1. HEK‐293T cells that express TFEB-3 × FLAG along with HAGST‐Rap2A or HAGST‐RagsDN were treated with vehicle or with Torin1, lysed and subjected to FLAG immunoprecipitation followed by immunoblotting for mTOR and raptor. FLAG-Metap2 served as negative control.(H) Immunofluorescence of HEK‐293T cells that express TFEB-3 × FLAG along with Rap2A (top) or the RagsDN mutants (bottom), treated with Torin 1 and stained with antibodies against FLAG and LAMP2 (green and red in the merge, respectively; DAPI is in blue). In all images, scale bars represent 10 μm."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", "-", "C", ")", "Immunofluorescence", "of", "HEK", "‐", "293T", "cells", "that", "express", "TFEB", "-", "3", "×", "FLAG", "along", "with", "a", "control", "GTPase", "or", "the", "indicated", "Rag", "mutants", ".", "Cells", "were", "deprived", "of", "amino", "acids", "(", "top", ")", "or", "deprived", "and", "then", "stimulated", "(", "bottom", ")", "for", "the", "indicated", "times", "and", "stained", "for", "FLAG", "and", "mTOR", "(", "green", "and", "red", "in", "the", "merge", ",", "respectively", ";", "DAPI", "is", "in", "blue", ")", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "cells", "with", "nuclear", "TFEB", "from", "each", "condition", "in", "(", "A", "-", "C", ")", ".", "(", "E", ",", "F", ")", "Immunofluorescence", "of", "HEK", "‐", "293T", "cells", "that", "express", "TFEB", "-", "3", "×", "FLAG", "along", "with", "Rap2A", "(", "E", ")", "or", "the", "RagsCA", "mutants", "(", "F", ")", ",", "subjected", "to", "the", "indicated", "treatments", "and", "stained", "with", "antibodies", "against", "FLAG", "and", "mTOR", "(", "green", "and", "red", "in", "the", "merge", ",", "respectively", ";", "DAPI", "is", "in", "blue", ")", ".", "(", "G", ")", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "cells", "with", "nuclear", "TFEB", "from", "DMSO", "‐", "and", "CQ", "‐", "treated", "fields", "in", "(", "E", ")", "and", "(", "F", ")", ".", "In", "all", "fields", ",", "scale", "bars", "represent", "10", "μm", ".", "In", "all", "histograms", ",", "each", "value", "represents", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "from", "three", "independent", "fields", "with", "N", "=", "300", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A-C) Immunofluorescence of HEK‐293T cells that express TFEB-3 × FLAG along with a control GTPase or the indicated Rag mutants. Cells were deprived of amino acids (top) or deprived and then stimulated (bottom) for the indicated times and stained for FLAG and mTOR (green and red in the merge, respectively; DAPI is in blue).(D) Quantification of the number of cells with nuclear TFEB from each condition in (A-C).(E, F) Immunofluorescence of HEK‐293T cells that express TFEB-3 × FLAG along with Rap2A (E) or the RagsCA mutants (F), subjected to the indicated treatments and stained with antibodies against FLAG and mTOR (green and red in the merge, respectively; DAPI is in blue).(G) Quantification of the number of cells with nuclear TFEB from DMSO‐ and CQ‐treated fields in (E) and (F). In all fields, scale bars represent 10 μm. In all histograms, each value represents mean±s.d. from three independent fields with N=300."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Chloroquine", "treatment", "inhibits", "mTORC1", "activity", "in", "primary", "hepatocytes", ".", "Primary", "hepatocytes", "isolated", "from", "2", "‐", "month", "‐", "old", "Tcfebflox", "/", "flox", "(", "control", ")", "and", "Tcfebflox", "/", "flox", ";", "Alb", "‐", "Cre", "(", "Tcfeb", "−", "/", "−", ")", "mice", "were", "left", "untreated", ",", "or", "treated", "overnight", "with", "Torin", "1", ",", "U0126", ",", "or", "Chloroquine", ".", "Subsequently", ",", "cells", "were", "lysed", "and", "protein", "extracts", "were", "immunoblotted", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "(", "B", ",", "C", ")", "TFEB", "mediates", "the", "transcriptional", "response", "to", "chloroquine", "and", "Torin", "1", ".", "Quantitative", "PCR", "(", "qPCR", ")", "of", "TFEB", "target", "genes", "in", "primary", "hepatocytes", "from", "control", "(", "flox", "/", "flox", ")", "and", "Tcfeb", "−", "/", "−", "mice", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "Chloroquine", "(", "left", ")", "or", "Torin", "1", "(", "right", ")", ".", "The", "graphs", "show", "the", "relative", "increased", "expression", "in", "the", "treated", "versus", "the", "corresponding", "untreated", "samples", ".", "Values", "represent", "means", "±", "s", ".", "d", ".", "of", "three", "independent", "hepatocyte", "preparations", "(", "three", "mice", "/", "genotype", ")", ".", "Student", "'", "s", "t", "‐", "test", "(", "two", "tailed", ")", "*", "P", "‐", "value", "⩽", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Chloroquine treatment inhibits mTORC1 activity in primary hepatocytes. Primary hepatocytes isolated from 2‐month‐old Tcfebflox/flox (control) and Tcfebflox/flox;Alb‐Cre(Tcfeb−/−) mice were left untreated, or treated overnight with Torin 1, U0126, or Chloroquine. Subsequently, cells were lysed and protein extracts were immunoblotted with the indicated antibodies.(B, C) TFEB mediates the transcriptional response to chloroquine and Torin 1. Quantitative PCR (qPCR) of TFEB target genes in primary hepatocytes from control (flox/flox) and Tcfeb−/− mice. Cells were treated with Chloroquine (left) or Torin 1 (right). The graphs show the relative increased expression in the treated versus the corresponding untreated samples. Values represent means±s.d. of three independent hepatocyte preparations (three mice/genotype). Student's t‐test (two tailed) *P‐value ⩽0.05."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", "-", "B", ")", "Levels", "of", "miR", "-", "122", "in", "Huh7", "cells", "and", "released", "EVs", "either", "untreated", "(", "Fed", ")", "or", "subjected", "to", "starvation", "for", "metabolites", "including", "amino", "acids", "for", "16h", "(", "Starved", ")", ".", "miR", "-", "122", "signals", "were", "detected", "by", "Northern", "blotting", "and", "position", "of", "the", "32P", "-", "labelled", "Oligos", "that", "served", "as", "size", "markers", "are", "shown", "in", "the", "lane", "(", "A", ")", ".", "U6", "snRNA", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "(", "A", "-", "B", ")", "Levels", "of", "miR", "-", "122", "in", "Huh7", "cells", "and", "released", "EVs", "either", "untreated", "(", "Fed", ")", "or", "subjected", "to", "starvation", "for", "metabolites", "including", "amino", "acids", "for", "16h", "(", "Starved", ")", ".", "Cellular", "CAT", "-", "1", "levels", "were", "measured", "by", "qRT", "-", "PCR", "using", "GAPDH", "mRNA", "as", "control", "(", "B", ")", ".", "A", "scheme", "of", "experiment", "is", "shown", "in", "the", "top", "panel", "in", "B", ".", "(", "C", "-", "D", ")", "Cellular", "and", "extracellular", "levels", "of", "different", "miRNAs", "and", "EV", "associated", "proteins", "in", "Fed", "and", "Starved", "Huh7", "cells", ".", "Relative", "changes", "in", "cellular", "and", "extracellular", "levels", "(", "EV", "associated", ")", "of", "miR", "-", "122", "and", "miR", "-", "24", "in", "Fed", "or", "8h", "Starved", "Huh7", "cells", "were", "quantified", "by", "qRT", "-", "PCR", "and", "plotted", "(", "mean", "+", "/", "-", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "n", "=", "3", ")", ".", "Levels", "of", "individual", "miRNAs", "in", "Fed", "condition", "were", "taken", "as", "unit", ".", "Fold", "change", "(", "with", "SD", ")", "in", "the", "cellular", "level", "of", "all", "miRNAs", "and", "pre", "-", "miR", "-", "122", "measured", "were", "shown", "in", "the", "bottom", "panel", "(", "C", ")", ".", "Cellular", "miRNA", "levels", "were", "normalized", "against", "U6", "snRNA", ".", "(", "C", "-", "D", ")", "Cellular", "and", "extracellular", "levels", "of", "different", "miRNAs", "and", "EV", "associated", "proteins", "in", "Fed", "and", "Starved", "Huh7", "cells", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "different", "exosomal", "proteins", "and", "Ago2", "in", "EVs", "isolated", "under", "Fed", "or", "Starved", "conditions", ".", "CD63", "is", "an", "exosomal", "marker", "protein", "and", "levels", "of", "HuR", "in", "EVs", "were", "quantified", "against", "respective", "CD63", "levels", ".", "Mean", "of", "three", "independent", "measurements", "are", "plotted", "(", "middle", "panel", "in", "D", ")", ".", "Calnexin", "and", "GAPDH", "are", "not", "detected", "in", "EVs", "but", "visible", "in", "the", "cellular", "extract", ".", "EV", "associated", "HA", "-", "HuR", "levels", "for", "Fed", "and", "Starved", "Huh7", "cells", "expressing", "HA", "-", "HuR", "were", "also", "detected", "in", "the", "bottom", "panel", "in", "D", ".", "(", "E", ")", "Effect", "of", "GW4869", "treatment", "on", "cellular", "miRNA", "content", "in", "Fed", "and", "Starved", "cells", ".", "Levels", "of", "miRNAs", "were", "measured", "by", "real", "-", "time", "quantification", "and", "normalized", "against", "U6", "snRNA", ".", "Mean", "data", "are", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "DMSO", "treatment", "was", "used", "as", "control", "for", "GW4869", "treated", "cells", ".", "(", "F", ")", "CAT", "-", "1", "and", "Aldolase", "mRNA", "expression", "in", "DMSO", "or", "GW4869", "treated", "starved", "Huh7", "cells", ".", "qRT", "-", "PCR", "techniques", "was", "adopted", "for", "quantification", "using", "18S", "rRNA", "values", "for", "normalization", "(", "mean", "+", "/", "-", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "G", ")", "Effect", "of", "siSMPD2", "treatment", "on", "miR", "-", "122", "content", "of", "EVs", "from", "Fed", "and", "Starved", "Huh7", "cells", ".", "EVs", "from", "Fed", "and", "Starved", "Huh7", "cells", ",", "depleted", "for", "SMPD2", ",", "were", "isolated", "and", "miR", "-", "122", "content", "were", "measured", "by", "qRT", "-", "PCR", "and", "normalized", "against", "protein", "content", "of", "EVs", ".", "Fold", "change", "in", "EV", "associated", "miR", "-", "122", "levels", "upon", "starvation", "both", "for", "control", "and", "siSMPD2", "treated", "cells", "were", "shown", "above", "the", "respective", "bars", ".", "(", "H", ")", "Effect", "of", "siSMPD2", "treatment", "on", "CAT", "-", "1", "mRNA", "content", "(", "left", "panel", ")", "and", "miR", "-", "122", "levels", "(", "right", "panel", ")", "in", "Huh7", "cells", ".", "RNAs", ",", "from", "Fed", "and", "Starved", "Huh7", "cells", ",", "depleted", "for", "SMPD2", ",", "were", "isolated", "and", "miR", "-", "122", "and", "CAT", "-", "1", "mRNA", "contents", "were", "measured", "by", "qRT", "-", "PCR", ".", "miR", "-", "122", "contents", "were", "normalized", "against", "U6", "snRNA", ".", "GAPDH", "mRNA", "was", "used", "for", "normalization", "of", "CAT", "-", "1", "mRNA", "levels", "(", "mean", "+", "/", "-", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "n", "=", "3", ")", ".", "miR", "-", "122", "levels", "for", "siCon", "treated", "cells", "(", "Fed", "and", "Starved", ")", "were", "considered", "as", "units", ".", "(", "I", "-", "J", ")", "A", "schematic", "representation", "of", "the", "experiment", "to", "separate", "Extracellular", "Vesicles", "(", "EVs", ")", "on", "OptiPrep", "@", "density", "gradient", "(", "left", "panel", ")", ".", "Densities", "of", "fractions", "1", "-", "10", "are", "plotted", "and", "a", "best", "-", "fit", "curve", "is", "drawn", "(", "right", "upper", "panel", ")", ".", "CD63", "levels", "in", "individual", "fractions", "of", "Fed", "and", "Starved", "cells", "were", "detected", "by", "western", "blots", "to", "confirm", "the", "presence", "of", "exosomes", "of", "Fed", "and", "Straved", "cells", "(", "right", "lower", "panel", ")", ".", "Mean", "Ct", "values", "of", "miR", "-", "122", "in", "RNAs", "isolated", "from", "Exosome", "enriched", "(", "8", "-", "9", ")", "vs", "Non", "-", "exosomal", "(", "1", "-", "3", ")", "fractions", "were", "analyzed", "and", "plotted", "(", "J", ")", "(", "mean", "+", "/", "-", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "K", ")", "Effect", "of", "Starvation", "on", "apoptic", "cell", "numbers", "in", "Huh7", "cells", ".", "Western", "Blot", "detection", "of", "apoptosis", "marker", "Cytochrome", "C", "in", "cellular", "and", "in", "EV", "associated", "fractions", "of", "Fed", "and", "Starved", "Huh", "7", "cells", ".", "β", "-", "Actin", "and", "CD63", "are", "used", "as", "loading", "control", "for", "cellular", "and", "EV", "associated", "fraction", "respectively", "(", "left", "panel", ")", ".", "TUNEL", "positive", "cells", "in", "Fed", "and", "Starved", "Huh7", "cells", ".", "TUNEL", "assays", "of", "Fed", "and", "Starved", "Huh", "7", "cells", "were", "performed", "and", "TUNEL", "positive", "cells", "were", "quantified", ".", "Fed", ",", "but", "DNase", "treated", ",", "cells", "were", "used", "as", "positive", "control", "(", "+", "ve", "control", ")", "(", "right", "panel", ")", ".", "(", "L", ")", "Effect", "of", "thapsigargain", "(", "TG", ")", "treatment", "of", "Huh7", "cells", "on", "cellular", "and", "EV", "associated", "miR", "-", "122", "level", ".", "A", "schematic", "representation", "of", "the", "experiment", "(", "upper", "panel", ")", ".", "miR", "-", "122", "levels", "were", "measured", "by", "qRT", "-", "PCR", "in", "total", "cellular", "RNA", "and", "in", "EVs", "released", "by", "the", "treated", "cells", ".", "Values", "were", "normalized", "either", "against", "U6", "snRNA", "or", "protein", "content", "of", "EVs", "(", "mean", "+", "/", "-", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "n", "=", "3", ")", "(", "lower", "panels", ")", "for", "cellular", "and", "EV", "associated", "RNA", "respectively", ".", "(", "M", ")", "Effect", "of", "TG", "on", "cellular", "level", "of", "eIF2", "-", "a", "and", "its", "phosphorylated", "form", ",", "and", "Ago2", "and", "CD63", "in", "EVs", ".", "b", "-", "Actin", "was", "used", "as", "loading", "control", "for", "cellular", "samples", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A-B) Levels of miR-122 in Huh7 cells and released EVs either untreated (Fed) or subjected to starvation for metabolites including amino acids for 16h (Starved). miR-122 signals were detected by Northern blotting and position of the 32P-labelled Oligos that served as size markers are shown in the lane (A). U6 snRNA was used as loading control.(A-B) Levels of miR-122 in Huh7 cells and released EVs either untreated (Fed) or subjected to starvation for metabolites including amino acids for 16h (Starved). Cellular CAT-1 levels were measured by qRT-PCR using GAPDH mRNA as control (B). A scheme of experiment is shown in the top panel in B.(C-D) Cellular and extracellular levels of different miRNAs and EV associated proteins in Fed and Starved Huh7 cells. Relative changes in cellular and extracellular levels (EV associated) of miR-122 and miR-24 in Fed or 8h Starved Huh7 cells were quantified by qRT-PCR and plotted (mean+/- s.e.m., n=3). Levels of individual miRNAs in Fed condition were taken as unit. Fold change (with SD) in the cellular level of all miRNAs and pre-miR-122 measured were shown in the bottom panel (C). Cellular miRNA levels were normalized against U6 snRNA.(C-D) Cellular and extracellular levels of different miRNAs and EV associated proteins in Fed and Starved Huh7 cells. Western blot analysis of different exosomal proteins and Ago2 in EVs isolated under Fed or Starved conditions. CD63 is an exosomal marker protein and levels of HuR in EVs were quantified against respective CD63 levels. Mean of three independent measurements are plotted (middle panel in D). Calnexin and GAPDH are not detected in EVs but visible in the cellular extract. EV associated HA-HuR levels for Fed and Starved Huh7 cells expressing HA-HuR were also detected in the bottom panel in D.(E) Effect of GW4869 treatment on cellular miRNA content in Fed and Starved cells. Levels of miRNAs were measured by real-time quantification and normalized against U6 snRNA. Mean data are from three independent experiments. DMSO treatment was used as control for GW4869 treated cells.(F) CAT-1 and Aldolase mRNA expression in DMSO or GW4869 treated starved Huh7 cells. qRT-PCR techniques was adopted for quantification using 18S rRNA values for normalization (mean +/- s.e.m., n=3).(G) Effect of siSMPD2 treatment on miR-122 content of EVs from Fed and Starved Huh7 cells. EVs from Fed and Starved Huh7 cells, depleted for SMPD2, were isolated and miR-122 content were measured by qRT-PCR and normalized against protein content of EVs. Fold change in EV associated miR-122 levels upon starvation both for control and siSMPD2 treated cells were shown above the respective bars.(H) Effect of siSMPD2 treatment on CAT-1 mRNA content (left panel) and miR-122 levels (right panel) in Huh7 cells. RNAs, from Fed and Starved Huh7 cells, depleted for SMPD2, were isolated and miR-122 and CAT-1 mRNA contents were measured by qRT-PCR. miR-122 contents were normalized against U6 snRNA. GAPDH mRNA was used for normalization of CAT-1 mRNA levels (mean +/- s.e.m., n=3). miR-122 levels for siCon treated cells (Fed and Starved) were considered as units.(I-J) A schematic representation of the experiment to separate Extracellular Vesicles (EVs) on OptiPrep@ density gradient (left panel). Densities of fractions 1-10 are plotted and a best-fit curve is drawn (right upper panel). CD63 levels in individual fractions of Fed and Starved cells were detected by western blots to confirm the presence of exosomes of Fed and Straved cells (right lower panel). Mean Ct values of miR-122 in RNAs isolated from Exosome enriched (8-9) vs Non-exosomal (1-3) fractions were analyzed and plotted (J) (mean +/- s.e.m., n=3).(K) Effect of Starvation on apoptic cell numbers in Huh7 cells. Western Blot detection of apoptosis marker Cytochrome C in cellular and in EV associated fractions of Fed and Starved Huh 7 cells. β-Actin and CD63 are used as loading control for cellular and EV associated fraction respectively (left panel). TUNEL positive cells in Fed and Starved Huh7 cells. TUNEL assays of Fed and Starved Huh 7 cells were performed and TUNEL positive cells were quantified. Fed, but DNase treated, cells were used as positive control (+ve control) (right panel).(L) Effect of thapsigargain (TG) treatment of Huh7 cells on cellular and EV associated miR-122 level. A schematic representation of the experiment (upper panel). miR-122 levels were measured by qRT-PCR in total cellular RNA and in EVs released by the treated cells. Values were normalized either against U6 snRNA or protein content of EVs (mean+/- s.e.m., n=3) (lower panels) for cellular and EV associated RNA respectively.(M) Effect of TG on cellular level of eIF2-a and its phosphorylated form, and Ago2 and CD63 in EVs. b-Actin was used as loading control for cellular samples."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Relative", "amount", "of", "miRNAs", "bound", "to", "HuR", "that", "are", "immunoprecipitated", "either", "from", "Fed", "or", "Starved", "Huh7", "cells", ".", "Immunoprecipitated", "materials", "were", "separated", "into", "two", "equal", "halves", "to", "do", "western", "blot", "analysis", "of", "HuR", "and", "relative", "quantification", "of", "associated", "miR", "-", "122", "and", "miR", "-", "21", "were", "done", "by", "quantitative", "RT", "-", "PCR", "(", "mean", "+", "/", "-", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "n", "=", "3", ")", ".", "GFP", "used", "as", "negative", "control", "to", "confer", "the", "specificity", "of", "the", "anti", "-", "HuR3A2", "antibody", "in", "immunoprecipitating", "HuR", ".", "The", "miR", "-", "122", "content", "in", "the", "GFP", "-", "antibody", "immunoprecipitated", "materials", "was", "too", "low", "to", "get", "detected", "reliably", "using", "the", "qRT", "-", "PCR", ".", "(", "B", "-", "C", ")", "Effect", "of", "HuR", "depletion", "on", "cellular", "and", "EV", "content", "of", "miRNAs", "in", "Huh7", "cells", ".", "Schemes", "of", "HuR", "depletion", "experiments", "in", "Huh7", "cells", "(", "B", ")", ".", "In", "siHuR", "treated", "cells", ",", "depletion", "of", "HuR", "was", "monitored", "by", "western", "blotting", "(", "mean", "+", "/", "-", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "n", "=", "4", ")", "(", "B", "-", "C", ")", "Effect", "of", "HuR", "depletion", "on", "cellular", "and", "EV", "content", "of", "miRNAs", "in", "Huh7", "cells", ".", "Relative", "levels", "of", "miRNAs", "were", "measured", "in", "EVs", "released", "from", "siCon", "or", "siHuR", "treated", "cells", "by", "qRT", "-", "PCR", ".", "Cellular", "miRNA", "contents", "were", "normalized", "against", "U6", "snRNA", ".", "Levels", "of", "each", "miRNA", "in", "control", "siRNA", "(", "siCon", ")", "treated", "set", "were", "taken", "as", "unit", ".", "(", "C", ")", ".", "CAT", "-", "1", "and", "Aldolase", "mRNA", "levels", "of", "siHuR", "and", "siCon", "treated", "Fed", "Huh7", "cells", "were", "quantified", "by", "qRT", "-", "PCR", "and", "normalized", "against", "GAPDH", "mRNA", ".", "(", "D", ")", "Effect", "of", "HuR", "knockdown", "on", "cellular", "level", "of", "different", "miRNAs", "in", "starved", "Huh7", "cells", ".", "Relative", "levels", "were", "estimated", "by", "real", "time", "qPCR", ",", "normalized", "with", "respect", "to", "U6", "snRNA", "and", "plotted", "in", "the", "left", "panel", ".", "Levels", "of", "miR", "-", "122", "in", "EVs", "of", "starved", "siHuR", "and", "siCon", "treated", "Huh7", "cells", "were", "also", "measured", "by", "RT", "-", "PCR", "and", "plotted", "in", "the", "right", "panel", "(", "mean", "+", "/", "-", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "E", ")", "Level", "of", "eIF", "-", "2a", "and", "its", "phosphorylated", "form", ",", "estimated", "by", "western", "blot", "using", "specific", "antibodies", ",", "in", "siCon", "or", "siHuR", "treated", "and", "starved", "Huh7", "cell", "extracts", ".", "Western", "blot", "data", "of", "HuR", "confirm", "reduction", "of", "this", "protein", "upon", "siRNA", "treatment", ".", "CAT", "-", "1", "and", "Aldolase", "mRNA", "levels", "were", "estimated", "by", "real", "time", "quantification", "and", "normalized", "against", "GAPDH", "level", ".", "Values", "of", "siCon", "treated", "samples", "were", "taken", "as", "unit", "(", "mean", "+", "/", "-", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "n", "=", "3", ")", ".", "In", "the", "right", "panel", "the", "relative", "quantity", "of", "phosphorylated", "eIF", "-", "2a", "measured", "by", "densitometry", "were", "plotted", ".", "Levels", "of", "p38", "and", "phosphor", "-", "p38", "levels", "in", "siCon", "and", "siHuR", "treated", "Starved", "Huh7", "cells", "were", "detected", "by", "western", "blot", ".", "(", "F", ")", "Western", "blot", "analysis", "to", "detect", "the", "level", "of", "phosphorylated", "eIF", "-", "2a", "and", "eIF", "-", "4E", "-", "BP1", "in", "lysates", "of", "Starved", "and", "HuR", "depleted", "Huh7", "cells", "either", "transfected", "with", "ant", "-", "let", "-", "7a", "or", "anti", "-", "miR", "-", "122", "oligos", ".", "miR", "-", "122", "inactivation", "was", "monitored", "by", "measuring", "cat", "-", "1", "level", "by", "qRT", "-", "PCR", "using", "GAPDH", "as", "control", "(", "mean", "+", "/", "-", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "denotes", "the", "phosphorylated", "eIF", "-", "4E", "-", "BP1", ".", "b", "-", "Actin", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "Relative", "levels", "of", "phosphorylated", "eIF", "-", "2a", "were", "measured", "by", "densitometric", "estimation", "of", "three", "independent", "measurements", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Relative amount of miRNAs bound to HuR that are immunoprecipitated either from Fed or Starved Huh7 cells. Immunoprecipitated materials were separated into two equal halves to do western blot analysis of HuR and relative quantification of associated miR-122 and miR-21 were done by quantitative RT-PCR (mean +/- s.e.m., n=3). GFP used as negative control to confer the specificity of the anti-HuR3A2 antibody in immunoprecipitating HuR. The miR-122 content in the GFP-antibody immunoprecipitated materials was too low to get detected reliably using the qRT-PCR.(B-C) Effect of HuR depletion on cellular and EV content of miRNAs in Huh7 cells. Schemes of HuR depletion experiments in Huh7 cells (B). In siHuR treated cells, depletion of HuR was monitored by western blotting (mean+/- s.e.m., n=4)(B-C) Effect of HuR depletion on cellular and EV content of miRNAs in Huh7 cells. Relative levels of miRNAs were measured in EVs released from siCon or siHuR treated cells by qRT-PCR. Cellular miRNA contents were normalized against U6 snRNA. Levels of each miRNA in control siRNA (siCon) treated set were taken as unit. (C). CAT-1 and Aldolase mRNA levels of siHuR and siCon treated Fed Huh7 cells were quantified by qRT-PCR and normalized against GAPDH mRNA.(D) Effect of HuR knockdown on cellular level of different miRNAs in starved Huh7 cells. Relative levels were estimated by real time qPCR, normalized with respect to U6 snRNA and plotted in the left panel. Levels of miR-122 in EVs of starved siHuR and siCon treated Huh7 cells were also measured by RT-PCR and plotted in the right panel (mean+/- s.e.m., n=3).(E) Level of eIF-2a and its phosphorylated form, estimated by western blot using specific antibodies, in siCon or siHuR treated and starved Huh7 cell extracts. Western blot data of HuR confirm reduction of this protein upon siRNA treatment. CAT-1 and Aldolase mRNA levels were estimated by real time quantification and normalized against GAPDH level. Values of siCon treated samples were taken as unit (mean+/- s.e.m., n=3). In the right panel the relative quantity of phosphorylated eIF-2a measured by densitometry were plotted. Levels of p38 and phosphor-p38 levels in siCon and siHuR treated Starved Huh7 cells were detected by western blot.(F) Western blot analysis to detect the level of phosphorylated eIF-2a and eIF-4E-BP1 in lysates of Starved and HuR depleted Huh7 cells either transfected with ant-let-7a or anti-miR-122 oligos. miR-122 inactivation was monitored by measuring cat-1 level by qRT-PCR using GAPDH as control (mean+/- s.e.m., n=3). * denotes the phosphorylated eIF-4E-BP1. b-Actin was used as loading control. Relative levels of phosphorylated eIF-2a were measured by densitometric estimation of three independent measurements."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Northern", "blot", "of", "miR", "-", "122", "in", "Huh7", "cells", "expressing", "the", "Control", "and", "HA", "-", "HuR", "expression", "plasmids", ".", "The", "U6", "was", "used", "for", "loading", "control", ".", "Position", "of", "the", "32P", "-", "labelled", "Oligos", ",", "blotted", "to", "the", "membrane", "used", "for", "Northern", "blotting", ",", "served", "as", "size", "markers", "are", "shown", "in", "the", "M", "lane", ".", "(", "B", ")", "Schematic", "representation", "of", "experiments", "done", "in", "Huh7", "cells", "expressing", "HA", "-", "HuR", "(", "bottom", ")", ".", "For", "control", ",", "pCIneo", "transfected", "Huh7", "cells", "were", "used", ".", "Relative", "expression", "of", "HuR", "in", "transfected", "cells", "were", "analysed", "by", "western", "blot", "(", "top", ")", ".", "b", "-", "actin", "blots", "were", "used", "as", "loading", "controls", ".", "(", "C", ")", "Cellular", "and", "EV", "-", "associated", "miRNA", "levels", "were", "measured", "in", "Huh7", "cells", "either", "expressing", "the", "pCIneo", "or", "HA", "-", "HuR", "expressing", "vectors", "by", "qRT", "-", "PCR", "(", "mean", "+", "/", "-", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "n", "=", "5", ")", ".", "Cellular", "miRNA", "levels", "were", "normalized", "against", "U6", "snRNA", ".", "(", "E", ")", "Effect", "of", "HA", "-", "HuR", "expression", "on", "miRNA", "levels", "on", "EV", "and", "non", "-", "EV", "fractions", "of", "the", "culture", "supernatant", "collected", "from", "control", "and", "HA", "-", "HuR", "encoding", "plasmid", "transfected", "Huh7", "cells", ".", "For", "isolation", "of", "non", "-", "EV", "fraction", ",", "supernatant", "obtained", "after", "removal", "of", "EVs", "by", "ultracentrifugation", "was", "used", "for", "RNA", "preparation", "(", "left", "panel", ")", "(", "mean", "+", "/", "-", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "n", "=", "3", ")", ".", "Effect", "of", "HuR", "expression", "on", "CD63", ",", "Alix", "and", "HuR", "levels", "in", "EVs", ".", "Extracts", "from", "EVs", "isolated", "from", "control", "or", "HA", "-", "HuR", "expressing", "Huh7", "cells", "were", "western", "blotted", "for", "respective", "proteins", "(", "right", "panel", ")", ".", "(", "F", ")", "Relative", "miR", "-", "122", "levels", "in", "CD63", "positive", "affinity", "purified", "EVs", "isolated", "from", "HA", "-", "HuR", "and", "pCIneo", "transfected", "Huh7", "cells", "were", "quantified", "by", "qRT", "-", "PCR", "(", "mean", "+", "/", "-", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "n", "=", "3", ")", ".", "The", "levels", "of", "miR", "-", "122", "were", "normalized", "against", "CD63", "content", "of", "EVs", ".", "(", "G", ")", "Effect", "of", "GW4869", "on", "EV", "associated", "content", "of", "three", "different", "miRNAs", "in", "HA", "-", "HuR", "expressing", "Huh7", "cells", "quantified", "by", "qRT", "-", "PCR", "(", "mean", "+", "/", "-", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "n", "=", "5", ")", ".", "EVs", "from", "DMSO", "treated", "cells", "were", "used", "as", "control", ".", "(", "H", ")", "A", "schematic", "representation", "of", "the", "experiment", "done", "to", "characterize", "EVs", "isolated", "from", "Huh7", "cells", "expressing", "HA", "-", "HuR", "or", "pCIneo", "respectively", "by", "running", "OptiPrepTM", "density", "gradient", "(", "left", "panel", ")", "and", "western", "blotting", "for", "CD63", "(", "right", "upper", "panel", ")", ".", "Relative", "miR", "-", "122", "levels", "in", "fractions", "1", "-", "2", "and", "8", "-", "9", "were", "compared", "by", "qRT", "-", "PCR", "(", "right", "lower", "panel", ")", ".", "(", "I", ")", "Levels", "of", "apoptic", "cells", "in", "HA", "-", "HuR", "expressing", "Huh7", "cells", ".", "Western", "Blot", "detection", "of", "apoptosis", "marker", "Cytochrome", "C", "was", "done", "(", "top", ")", "for", "EV", "associated", "and", "cellular", "fractions", "of", "HA", "-", "HuR", "and", "pCIneo", "(", "control", ")", "expressing", "Huh", "7", "cells", "respectively", ".", "Western", "blot", "for", "HA", "-", "HuR", "was", "done", "to", "analyse", "the", "expression", "of", "HA", "-", "HuR", "in", "EVs", "isolated", "from", "HA", "-", "HuR", "and", "pCIneo", "expressing", "Huh7", "cells", ".", "CD63", "and", "β", "-", "actin", "are", "used", "as", "loading", "control", "for", "EV", "associated", "fractions", "and", "cellular", "fractions", "respectively", "(", "upper", "panels", ")", ".", "TUNEL", "assay", "of", "HA", "-", "HuR", "and", "pCIneo", "expressing", "and", "non", "-", "transfected", "Huh", "7", "cells", "was", "performed", "and", "representative", "pictures", "of", "HA", "-", "HuR", "and", "pCIneo", "expressing", "cells", "along", "with", "picture", "of", "non", "-", "transfected", "but", "DNase", "treated", "(", "positive", "control", ")", "cells", "were", "compared", "(", "lower", "panels", ")", ".", "Scale", "bar", "50", "µM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Northern blot of miR-122 in Huh7 cells expressing the Control and HA-HuR expression plasmids. The U6 was used for loading control. Position of the 32P-labelled Oligos, blotted to the membrane used for Northern blotting, served as size markers are shown in the M lane.(B) Schematic representation of experiments done in Huh7 cells expressing HA-HuR (bottom). For control, pCIneo transfected Huh7 cells were used. Relative expression of HuR in transfected cells were analysed by western blot (top). b-actin blots were used as loading controls.(C) Cellular and EV-associated miRNA levels were measured in Huh7 cells either expressing the pCIneo or HA-HuR expressing vectors by qRT-PCR (mean+/- s.e.m., n=5). Cellular miRNA levels were normalized against U6 snRNA.(E) Effect of HA-HuR expression on miRNA levels on EV and non-EV fractions of the culture supernatant collected from control and HA-HuR encoding plasmid transfected Huh7 cells. For isolation of non-EV fraction, supernatant obtained after removal of EVs by ultracentrifugation was used for RNA preparation (left panel) (mean+/- s.e.m., n=3). Effect of HuR expression on CD63, Alix and HuR levels in EVs. Extracts from EVs isolated from control or HA-HuR expressing Huh7 cells were western blotted for respective proteins (right panel).(F) Relative miR-122 levels in CD63 positive affinity purified EVs isolated from HA-HuR and pCIneo transfected Huh7 cells were quantified by qRT-PCR (mean+/- s.e.m., n=3). The levels of miR-122 were normalized against CD63 content of EVs.(G) Effect of GW4869 on EV associated content of three different miRNAs in HA-HuR expressing Huh7 cells quantified by qRT-PCR (mean+/- s.e.m., n=5). EVs from DMSO treated cells were used as control.(H) A schematic representation of the experiment done to characterize EVs isolated from Huh7 cells expressing HA-HuR or pCIneo respectively by running OptiPrepTM density gradient (left panel) and western blotting for CD63 (right upper panel). Relative miR-122 levels in fractions 1-2 and 8-9 were compared by qRT-PCR (right lower panel).(I) Levels of apoptic cells in HA-HuR expressing Huh7 cells. Western Blot detection of apoptosis marker Cytochrome C was done (top) for EV associated and cellular fractions of HA-HuR and pCIneo (control) expressing Huh 7 cells respectively. Western blot for HA-HuR was done to analyse the expression of HA-HuR in EVs isolated from HA-HuR and pCIneo expressing Huh7 cells. CD63 and β-actin are used as loading control for EV associated fractions and cellular fractions respectively (upper panels). TUNEL assay of HA-HuR and pCIneo expressing and non-transfected Huh 7 cells was performed and representative pictures of HA-HuR and pCIneo expressing cells along with picture of non-transfected but DNase treated (positive control ) cells were compared (lower panels). Scale bar 50 µM."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "B", ")", "Change", "in", "miR", "-", "122", "level", "in", "starved", "mouse", "liver", ".", "Endogenous", "miR", "-", "122", "(", "left", "panel", ")", "and", "CAT", "-", "1", "mRNA", "(", "middle", "panel", ")", "levels", "in", "mouse", "liver", "starved", "for", "12h", "were", "quantified", "by", "qRT", "-", "PCR", ".", "miR", "-", "122", "levels", "in", "the", "blood", "serum", "of", "corresponding", "animals", "were", "also", "measured", "(", "right", "panel", ")", ".", "The", "Ct", "values", "of", "miR", "-", "122", "and", "CAT", "-", "1", "mRNA", "obtained", "for", "each", "individual", "animal", "liver", "and", "blood", "serum", "were", "plotted", "(", "mean", "+", "/", "-", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "n", "=", "5", ")", ".", "(", "C", ")", "Relative", "level", "of", "HuR", "in", "both", "liver", "and", "lung", "of", "Fed", "and", "Starved", "mice", "were", "analysed", "by", "western", "blots", ",", "β", "-", "actin", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "(", "E", ")", "Western", "Blot", "analysis", "to", "check", "expression", "of", "HA", "-", "HuR", "in", "liver", "samples", "of", "injected", "mice", ".", "β", "-", "Actin", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "HA", "-", "HuR", "expressing", "Huh7", "cells", "lysate", "was", "used", "as", "positive", "control", ".", "(", "F", ")", ".", "Change", "in", "miR", "-", "122", "level", "upon", "expression", "of", "HA", "-", "HuR", "in", "mouse", "liver", ".", "Endogenous", "miR", "-", "122", "level", "in", "HA", "-", "HuR", "expression", "plasmid", "injected", "mouse", "liver", "were", "quantified", "by", "RT", "-", "PCR", "and", "compared", "against", "liver", "RNA", "samples", "collected", "from", "control", "(", "pCIneo", "injected", ")", "group", "of", "animals", "(", "mean", "+", "/", "-", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "n", "=", "5", ")", ".", "(", "G", ")", "Endogenous", "miR", "-", "122", "target", "CAT", "-", "1", "(", "left", "panel", ")", "and", "Aldolase", "(", "right", "panel", ")", "mRNA", "levels", "in", "HA", "-", "HuR", "or", "pCIneo", "(", "control", ")", "injected", "mouse", "liver", "were", "quantified", "by", "RT", "-", "PCR", "(", "mean", "+", "/", "-", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "n", "=", "4", ")", ".", "(", "H", ")", "miR", "-", "122", "levels", "in", "the", "blood", "serum", "of", "pCIneo", "(", "control", ")", "or", "HA", "-", "HuR", "expression", "plasmid", "injected", "mice", "were", "measured", ".", "The", "Ct", "values", "of", "miR", "-", "122", "and", "CAT", "-", "1", "and", "Aldolase", "mRNAs", "obtained", "for", "each", "individual", "animal", "liver", "and", "blood", "serum", "were", "plotted", "(", "mean", "+", "/", "-", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "n", "=", "5", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(B) Change in miR-122 level in starved mouse liver. Endogenous miR-122 (left panel) and CAT-1 mRNA (middle panel) levels in mouse liver starved for 12h were quantified by qRT-PCR. miR-122 levels in the blood serum of corresponding animals were also measured (right panel). The Ct values of miR-122 and CAT-1 mRNA obtained for each individual animal liver and blood serum were plotted (mean+/- s.e.m., n=5).(C)Relative level of HuR in both liver and lung of Fed and Starved mice were analysed by western blots, β-actin was used as loading control .(E) Western Blot analysis to check expression of HA-HuR in liver samples of injected mice. β-Actin was used as loading control. HA-HuR expressing Huh7 cells lysate was used as positive control.(F). Change in miR-122 level upon expression of HA-HuR in mouse liver. Endogenous miR-122 level in HA-HuR expression plasmid injected mouse liver were quantified by RT-PCR and compared against liver RNA samples collected from control (pCIneo injected) group of animals (mean+/- s.e.m., n=5).(G) Endogenous miR-122 target CAT-1 (left panel) and Aldolase (right panel) mRNA levels in HA-HuR or pCIneo (control) injected mouse liver were quantified by RT-PCR (mean+/- s.e.m., n=4).(H) miR-122 levels in the blood serum of pCIneo (control) or HA-HuR expression plasmid injected mice were measured. The Ct values of miR-122 and CAT-1 and Aldolase mRNAs obtained for each individual animal liver and blood serum were plotted (mean+/- s.e.m., n=5)."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Time", "course", "experiment", "of", "HuR", "binding", "of", "miR", "-", "122", "replaced", "from", "Ago2miRNPs", ".", "A", "schematic", "representation", "of", "in", "vitro", "miRNA", "binding", "assay", "of", "HuR", "(", "left", "panel", ")", ".", "Equal", "amounts", "of", "recombinant", "HuR", "(", "rHuR", ")", ",", "after", "indicated", "time", "of", "the", "miRNP", "interaction", "on", "FLAG", "-", "beads", ",", "were", "immunoprecipitated", "and", "HuR", "associated", "miR", "-", "122", "levels", "were", "detected", "by", "qRT", "-", "PCR", "(", "right", "top", "panel", ")", ".", "Ago2western", "blot", "detects", "its", "presence", "in", "the", "FLAG", "beads", "used", "in", "the", "assay", "and", "its", "absence", "in", "HuRimmunoprecipitated", "materials", ".", "HuRwestern", "blot", "was", "used", "to", "confirm", "its", "presence", "and", "quantification", "of", "its", "levels", "in", "the", "immunoprecipitated", "materials", ",", "at", "different", "time", "points", "(", "right", "bottom", "panel", ")", ".", "(", "C", ")", "Coomassie", "stained", "gel", "picture", "denotes", "the", "purity", "of", "the", "recombinant", "HuR", "used", "in", "the", "assay", ".", "The", "same", "proteins", "were", "western", "blotted", "for", "HuR", "to", "show", "the", "specificity", "of", "the", "antibody", "used", "for", "immunoprecipitation", ".", "The", "recombinant", "P", "protein", "and", "N", "protein", "of", "Chandipura", "virus", "was", "used", "as", "negative", "control", "to", "confirm", "the", "specificity", "of", "3A2", "anti", "-", "HuR", "antibody", ".", "(", "D", ")", "HuR", "western", "blot", "in", "middle", "right", "panel", "confirmed", "the", "presence", "of", "HuR", "and", "the", "truncated", "version", "of", "it", "in", "the", "immunoprecipitated", "materials", ".", "A", "representative", "domain", "picture", "of", "HuR", "and", "HuRΔIII", "are", "shown", "in", "the", "upper", "panel", ".", "Relative", "levels", "of", "HuR", "bound", "miR", "-", "122", "were", "determined", "by", "qRT", "-", "PCR", "(", "mean", "+", "/", "-", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "n", "=", "3", ")", "(", "middle", "left", "panel", ")", ".", "Amount", "of", "miR", "-", "122", "recovered", "from", "the", "immunoprecipitated", "materials", "were", "normalized", "against", "the", "amount", "of", "HuR", "or", "HuRΔIII", "present", "in", "the", "Immunoprecipitated", "materials", ".", "Ago2", "western", "blot", "confirmed", "its", "presence", "in", "the", "FLAG", "beads", "used", "in", "the", "assay", "while", "Ago2", "was", "not", "detected", "in", "HuR", "immunoprecipitated", "materials", "(", "bottom", "panel", ")", ".", "(", "E", ")", "RNA", "electrophoretic", "mobility", "shift", "assay", "done", "with", "32P", "-", "labeled", "synthetic", "miR", "-", "122", "and", "recombinant", "HuR", "proteins", ".", "Radiolabelled", "miR", "-", "122", "(", "100", "fmol", ")", "was", "incubated", "with", "increasing", "concentration", "of", "FL", "-", "HuR", "(", "5", "-", "100nM", ")", "or", "HuRΔIII", "(", "100", "nM", ")", "and", "gel", "shifting", "of", "miR", "-", "122", "were", "marked", "by", "arrowhead", ".", "Position", "of", "the", "free", "probes", "is", "marked", "by", "an", "arrow", ".", "In", "the", "right", "panel", ",", "1pmol", "of", "unlabelled", "TNF", "-", "alpha", "AU", "-", "rich", "element", "encoding", "synthetic", "RNA", "was", "used", "to", "compete", "with", "miR", "-", "122", "binding", "of", "full", "length", "HuR", ".", "Amount", "of", "HuR", "or", "HuRΔIII", "used", "for", "gel", "shift", "assay", "were", "premeasured", "by", "densitometric", "estimation", "of", "coomassie", "stained", "gel", "bands", "from", "SDS", "page", ".", "(", "F", ")", "Association", "of", "miRNAs", "with", "recombinant", "HuR", "in", "vitro", ".", "Small", "RNA", "pool", "of", "Huh7", "cell", "isolated", "by", "miRVana", "miRNA", "isolation", "kit", "were", "incubated", "with", "recombinant", "HuR", "in", "an", "in", "vitro", "binding", "reaction", "and", "HuR", "associated", "RNA", ",", "recovered", "from", "immunoprecipitated", "HuR", "after", "the", "binding", "reaction", ",", "were", "quantified", "along", "with", "the", "input", "RNA", "used", "for", "binding", ".", "The", "mean", "Ct", "values", "of", "RNA", "from", "samples", "from", "three", "independent", "binding", "reactions", "along", "with", "input", "RNA", "were", "measured", "and", "plotted", "(", "mean", "+", "/", "-", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "n", "=", "3", ")", ".", "The", "Input", "recombinant", "HuR", "used", "in", "the", "binding", "assay", "and", "in", "the", "immunoprecipitated", "materials", "were", "detected", "by", "western", "blot", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Time course experiment of HuR binding of miR-122 replaced from Ago2miRNPs. A schematic representation of in vitro miRNA binding assay of HuR (left panel). Equal amounts of recombinant HuR (rHuR), after indicated time of the miRNP interaction on FLAG-beads, were immunoprecipitated and HuR associated miR-122 levels were detected by qRT-PCR (right top panel). Ago2western blot detects its presence in the FLAG beads used in the assay and its absence in HuRimmunoprecipitated materials. HuRwestern blot was used to confirm its presence and quantification of its levels in the immunoprecipitated materials, at different time points (right bottom panel).(C) Coomassie stained gel picture denotes the purity of the recombinant HuR used in the assay. The same proteins were western blotted for HuR to show the specificity of the antibody used for immunoprecipitation. The recombinant P protein and N protein of Chandipura virus was used as negative control to confirm the specificity of 3A2 anti-HuR antibody.(D) HuR western blot in middle right panel confirmed the presence of HuR and the truncated version of it in the immunoprecipitated materials. A representative domain picture of HuR and HuRΔIII are shown in the upper panel. Relative levels of HuR bound miR-122 were determined by qRT-PCR (mean+/- s.e.m., n=3) (middle left panel). Amount of miR-122 recovered from the immunoprecipitated materials were normalized against the amount of HuR or HuRΔIII present in the Immunoprecipitated materials. Ago2 western blot confirmed its presence in the FLAG beads used in the assay while Ago2 was not detected in HuR immunoprecipitated materials (bottom panel).(E) RNA electrophoretic mobility shift assay done with 32P-labeled synthetic miR-122 and recombinant HuR proteins. Radiolabelled miR-122 (100 fmol) was incubated with increasing concentration of FL-HuR (5-100nM) or HuRΔIII (100 nM) and gel shifting of miR-122 were marked by arrowhead. Position of the free probes is marked by an arrow. In the right panel, 1pmol of unlabelled TNF-alpha AU-rich element encoding synthetic RNA was used to compete with miR-122 binding of full length HuR. Amount of HuR or HuRΔIII used for gel shift assay were premeasured by densitometric estimation of coomassie stained gel bands from SDS page.(F) Association of miRNAs with recombinant HuR in vitro. Small RNA pool of Huh7 cell isolated by miRVana miRNA isolation kit were incubated with recombinant HuR in an in vitro binding reaction and HuR associated RNA, recovered from immunoprecipitated HuR after the binding reaction, were quantified along with the input RNA used for binding. The mean Ct values of RNA from samples from three independent binding reactions along with input RNA were measured and plotted (mean+/- s.e.m., n=3). The Input recombinant HuR used in the binding assay and in the immunoprecipitated materials were detected by western blot."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Subcellular", "distribution", "of", "HuR", "and", "Ago2", "in", "Huh7", "cells", ".", "Isotonic", "lysates", "of", "Huh7", "cells", "transfected", "with", "HA", "-", "HuR", "expression", "or", "pCIneo", "control", "vector", "were", "analyzed", "on", "3", "-", "30", "%", "OptiprepTM", "gradients", "for", "separation", "of", "organelles", "and", "localization", "of", "Ago2", "and", "HuR", "were", "determined", "by", "western", "blotting", "analysis", ".", "Alix", "and", "Calnexin", "were", "used", "as", "markers", "of", "late", "endosome", "/", "MVB", "and", "ER", "respectively", ".", "Positions", "of", "specific", "organelle", "containing", "fractions", "were", "marked", "above", "the", "panels", ".", "*", "denotes", "the", "position", "of", "the", "high", "molecular", "weight", "HuR", "bands", "detected", "in", "the", "MVB", "fractions", ".", "(", "B", ")", "Detection", "of", "ubiquitinated", "HuR", "in", "Huh7", "cells", "expressing", "HA", "-", "Ub", ".", "HuR", "was", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "HuR", "antibody", "from", "cell", "lysate", "of", "Huh7", "cells", "transfected", "with", "HA", "-", "Ub", "expression", "or", "pCIneo", "(", "control", ")", "plasmids", "and", "western", "blotted", "for", "HA", "or", "HuR", "(", "left", "panel", ")", ".", "In", "vitro", "ubiquitination", "assay", "was", "done", "with", "recombinant", "His", "-", "tagged", "HuR", "and", "cell", "extract", "of", "Huh7", "cells", "expressing", "HA", "-", "Ub", ".", "The", "scheme", "of", "the", "experiment", "and", "western", "blot", "data", "for", "input", "and", "cell", "extract", "along", "with", "immunoprecipitated", "materials", "are", "shown", ".", "Specific", "bands", "of", "Ub", "-", "HuR", "are", "marked", "by", "arrows", "and", "HuR", "is", "marked", "by", "arrowhead", ".", "(", "C", ")", "Changes", "in", "relative", "level", "of", "miR", "-", "122", "in", "the", "subcellular", "ER", "and", "MVB", "associated", "fractions", "of", "OptiprepTM", "gradients", "done", "with", "the", "cell", "lysates", "from", "pCIneo", "or", "HA", "-", "HuR", "expression", "vector", "transfected", "cells", "were", "measured", "by", "qRT", "-", "PCR", "(", "mean", "+", "/", "-", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "n", "=", "5", ")", ".", "(", "D", ")", "Detection", "of", "ubiquitinated", "HuR", "in", "HuR", "-", "immunoprecipitated", "materials", "obtained", "from", "ER", "and", "MVB", "enriched", "fractions", "of", "Huh7", "cells", ".", "Organelles", "were", "separated", "on", "OptiprepTM", "gradients", ",", "and", "HuR", "in", "organeller", "lysates", "were", "immunoprecipitated", "with", "HuR", "specific", "antibody", "and", "western", "blotted", "for", "ubiquitin", "to", "detect", "ubiquitinated", "form", "of", "HuR", ".", "Whole", "cell", "lysates", "used", "for", "optiprep", "analysis", "were", "western", "blotted", "for", "ubiquitinated", "proteins", ".", "Positions", "of", "the", "high", "molecular", "weight", "bands", "of", "ubiquitinated", "HuR", "are", "marked", "by", "arrowheads", ".", "Levels", "of", "HuR", "in", "the", "immunoprecipitated", "materials", "were", "detected", "using", "anti", "-", "HuR", "antibody", ".", "Anti", "-", "GFP", "antibody", "immnoprecipitated", "materials", "were", "used", "as", "control", ".", "(", "E", ")", "Detection", "of", "ubiquitinated", "HuR", "in", "HuR", "-", "immunoprecipitated", "materials", "obtained", "from", "ER", "and", "MVB", "enriched", "fractions", "of", "cells", "co", "-", "expressing", "HA", "-", "Ubiquitin", "and", "FLAG", "-", "HuR", ".", "Cells", "were", "lysed", "and", "organelles", "were", "separated", "on", "OptiprepTM", "gradients", ",", "and", "HuR", "in", "organeller", "lysates", "were", "immunoprecipitated", "with", "HuR", "specific", "antibody", "and", "western", "blotted", "for", "HA", "to", "detect", "ubiquitinated", "form", "of", "HuR", ".", "HuR", "in", "the", "lysate", "of", "the", "FLAG", "-", "HuR", "and", "HA", "-", "Ub", "co", "expressing", "cells", "were", "detected", "by", "HuR", "specific", "antibody", ".", "(", "F", ")", "Loss", "of", "miRNA", "association", "of", "HuR", "on", "MVB", ".", "HA", "-", "HuR", "expressing", "Huh7", "cell", "lysates", "separated", "on", "OptiprepTM", "gradients", "were", "used", "for", "immunoprecipitation", "of", "HA", "-", "HuR", "and", "associated", "miRNA", "levels", "were", "measured", "by", "qRT", "-", "PCR", "and", "normalized", "against", "immunoprecipitated", "proteins", ".", "Levels", "of", "immunoprecipitated", "HA", "-", "HuR", "were", "detected", "by", "western", "blotting", "and", "quantified", "by", "densitometry", ".", "Data", "represented", "as", "mean", "+", "/", "-", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "n", "=", "3", ".", "(", "G", ")", "Loss", "of", "miRNA", "from", "ubiquitinated", "form", "of", "HuR", ".", "Scheme", "of", "the", "double", "immunoprecipitation", "experiment", "is", "shown", "in", "the", "left", "panel", ".", "Western", "blot", "analysis", "for", "HuR", "in", "the", "anti", "-", "HA", "and", "anti", "-", "HuRimmunoprecipitatedFLAG", "-", "HuR", "along", "with", "the", "input", "of", "FLAG", "-", "HuR", "used", ".", "Lysates", "of", "cell", "expressing", "the", "FLAG", "-", "HuR", "and", "used", "for", "FLAGHuR", "purification", "is", "also", "shown", "(", "right", "upper", "panels", ")", ".", "qRT", "-", "PCR", "based", "estimation", "of", "the", "miRNA", "per", "unit", "of", "HuRimmunoprecipitated", "were", "estimated", "for", "both", "HA", "and", "HuRimmunoprecipitated", "materials", "and", "normalized", "against", "respective", "protein", "levels", "quantified", "by", "densitometric", "quantification", "of", "western", "blots", "(", "right", "lower", "panel", ")", ".", "Data", "represented", "as", "mean", "+", "/", "-", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "n", "=", "3", ".", "Position", "of", "ubiquitinated", "band", "of", "FLAG", "-", "HuR", "is", "marked", "by", "arrow", ".", "(", "H", ")", "Increase", "in", "ubiquitinated", "form", "of", "HuR", "in", "Starved", "Huh7", "cells", ".", "Levels", "of", "ubiquitinated", "HuR", "in", "Fed", "and", "Starved", "(", "5h", ")", "HA", "-", "Ub", "expressing", "Huh7", "cells", "treated", "either", "with", "ethanol", "or", "MG132", "(", "20µM", ")", "for", "same", "duration", ".", "The", "lysates", "were", "immunoprecipitated", "with", "HuR", "and", "western", "blotted", "for", "HA", "and", "HuR", ".", "Position", "of", "ubiquitinated", "bands", "were", "marked", "by", "arrows", ".", "The", "levels", "of", "ubiquitinated", "HuR", "were", "measured", "by", "densitometry", "and", "relative", "increase", "in", "ubiquitinated", "HuR", "levels", "against", "the", "non", "-", "ubiquitinated", "form", "were", "measured", "and", "plotted", "(", "mean", "+", "/", "-", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "I", ")", "Full", "length", "and", "a", "truncated", "version", "of", "HA", "-", "HuR", "without", "the", "hinge", "region", "(", "graphical", "scheme", "in", "upper", "panel", ")", "was", "used", "to", "score", "the", "effect", "of", "deletion", "of", "hinge", "region", "on", "EV", "associated", "miR", "-", "122", "content", "measured", "by", "qRT", "-", "PCR", "(", "bottom", "panel", ")", ".", "Western", "blots", "to", "check", "expression", "of", "HuR", "and", "its", "truncated", "variants", "are", "also", "shown", ".", "\"", "*", "\"", "denotes", "the", "HA", "-", "HuR", "band", "(", "left", "lower", "panel", ")", ".", "Data", "represented", "as", "mean", "+", "/", "-", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "n", "=", "3", ".", "(", "J", ")", "Ubiquitination", "status", "of", "full", "length", "and", "a", "truncated", "version", "of", "HA", "-", "HuR", "without", "the", "hinge", "region", "between", "RRMII", "and", "RRMIII", "in", "Huh7", "cells", ".", "HuR", "(", "full", "lenght", "or", "truncated", "version", ")", "were", "immunoprecipitated", "from", "cell", "lysates", "of", "Huh7", "cells", "expressing", "these", "proteins", "and", "the", "immunoprecipitated", "materials", "were", "western", "blotted", "for", "HA", "-", "HuR", "and", "ubiquitination", ".", "Ubiquinitated", "HuR", "bands", "are", "marked", "by", "arrows", ".", "postion", "of", "non", "-", "ubiquitinated", "proteins", "were", "marked", "by", "arrowheads", "(", "upper", "panel", ")", ".", "qRT", "-", "PCR", "based", "estimation", "of", "associated", "miRNA", "per", "unit", "of", "HA", "-", "HuR", "immunoprecipitated", "materials", "were", "estimated", "and", "normalized", "against", "respective", "protein", "levels", "quantified", "by", "densitometric", "quantification", "of", "western", "blots", "(", "lower", "panel", ")", ".", "Data", "represented", "as", "mean", "+", "/", "-", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "n", "=", "3", ".", "PCIneo", "transfected", "cells", "were", "used", "as", "control", "in", "immunoprecipitation", "reaction", "but", "no", "amplification", "of", "miR", "-", "122", "were", "detected", "for", "HA", "immunoprecipitated", "materials", "from", "pCIneo", "tranfected", "cells", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Subcellular distribution of HuR and Ago2 in Huh7 cells. Isotonic lysates of Huh7 cells transfected with HA-HuR expression or pCIneo control vector were analyzed on 3-30% OptiprepTM gradients for separation of organelles and localization of Ago2 and HuR were determined by western blotting analysis. Alix and Calnexin were used as markers of late endosome/MVB and ER respectively. Positions of specific organelle containing fractions were marked above the panels. * denotes the position of the high molecular weight HuR bands detected in the MVB fractions.(B) Detection of ubiquitinated HuR in Huh7 cells expressing HA-Ub. HuR was immunoprecipitated with anti-HuR antibody from cell lysate of Huh7 cells transfected with HA-Ub expression or pCIneo (control) plasmids and western blotted for HA or HuR (left panel). In vitro ubiquitination assay was done with recombinant His-tagged HuR and cell extract of Huh7 cells expressing HA-Ub. The scheme of the experiment and western blot data for input and cell extract along with immunoprecipitated materials are shown. Specific bands of Ub-HuR are marked by arrows and HuR is marked by arrowhead.(C) Changes in relative level of miR-122 in the subcellular ER and MVB associated fractions of OptiprepTM gradients done with the cell lysates from pCIneo or HA-HuR expression vector transfected cells were measured by qRT-PCR (mean+/- s.e.m., n=5).(D) Detection of ubiquitinated HuR in HuR-immunoprecipitated materials obtained from ER and MVB enriched fractions of Huh7 cells. Organelles were separated on OptiprepTM gradients, and HuR in organeller lysates were immunoprecipitated with HuR specific antibody and western blotted for ubiquitin to detect ubiquitinated form of HuR. Whole cell lysates used for optiprep analysis were western blotted for ubiquitinated proteins. Positions of the high molecular weight bands of ubiquitinated HuR are marked by arrowheads. Levels of HuR in the immunoprecipitated materials were detected using anti-HuR antibody. Anti-GFP antibody immnoprecipitated materials were used as control.(E) Detection of ubiquitinated HuR in HuR-immunoprecipitated materials obtained from ER and MVB enriched fractions of cells co-expressing HA-Ubiquitin and FLAG-HuR. Cells were lysed and organelles were separated on OptiprepTM gradients, and HuR in organeller lysates were immunoprecipitated with HuR specific antibody and western blotted for HA to detect ubiquitinated form of HuR. HuR in the lysate of the FLAG-HuR and HA-Ub co expressing cells were detected by HuR specific antibody.(F) Loss of miRNA association of HuR on MVB. HA-HuR expressing Huh7 cell lysates separated on OptiprepTM gradients were used for immunoprecipitation of HA-HuR and associated miRNA levels were measured by qRT-PCR and normalized against immunoprecipitated proteins. Levels of immunoprecipitated HA-HuR were detected by western blotting and quantified by densitometry. Data represented as mean+/- s.e.m., n=3.(G) Loss of miRNA from ubiquitinated form of HuR. Scheme of the double immunoprecipitation experiment is shown in the left panel. Western blot analysis for HuR in the anti-HA and anti-HuRimmunoprecipitatedFLAG-HuR along with the input of FLAG-HuR used. Lysates of cell expressing the FLAG-HuR and used for FLAGHuR purification is also shown (right upper panels). qRT-PCR based estimation of the miRNA per unit of HuRimmunoprecipitated were estimated for both HA and HuRimmunoprecipitated materials and normalized against respective protein levels quantified by densitometric quantification of western blots (right lower panel). Data represented as mean+/- s.e.m., n=3. Position of ubiquitinated band of FLAG-HuR is marked by arrow.(H) Increase in ubiquitinated form of HuR in Starved Huh7 cells. Levels of ubiquitinated HuR in Fed and Starved (5h) HA-Ub expressing Huh7 cells treated either with ethanol or MG132 (20µM) for same duration. The lysates were immunoprecipitated with HuR and western blotted for HA and HuR. Position of ubiquitinated bands were marked by arrows. The levels of ubiquitinated HuR were measured by densitometry and relative increase in ubiquitinated HuR levels against the non-ubiquitinated form were measured and plotted (mean+/- s.e.m., n=3).(I) Full length and a truncated version of HA-HuR without the hinge region (graphical scheme in upper panel) was used to score the effect of deletion of hinge region on EV associated miR-122 content measured by qRT-PCR (bottom panel). Western blots to check expression of HuR and its truncated variants are also shown.\" * \" denotes the HA-HuR band (left lower panel). Data represented as mean+/- s.e.m., n=3.(J) Ubiquitination status of full length and a truncated version of HA-HuR without the hinge region between RRMII and RRMIII in Huh7 cells. HuR (full lenght or truncated version) were immunoprecipitated from cell lysates of Huh7 cells expressing these proteins and the immunoprecipitated materials were western blotted for HA-HuR and ubiquitination. Ubiquinitated HuR bands are marked by arrows. postion of non-ubiquitinated proteins were marked by arrowheads (upper panel). qRT-PCR based estimation of associated miRNA per unit of HA-HuR immunoprecipitated materials were estimated and normalized against respective protein levels quantified by densitometric quantification of western blots (lower panel). Data represented as mean+/- s.e.m., n=3. PCIneo transfected cells were used as control in immunoprecipitation reaction but no amplification of miR-122 were detected for HA immunoprecipitated materials from pCIneo tranfected cells."}
{"words": ["Figure", "1Bar", "graph", "represents", "IL", "-", "2", "secretion", "by", "NKT", "cell", "hybridoma", "(", "2C12", ")", "co", "-", "cultured", "with", "(", "A", ")", "a", "murine", "macrophage", "cell", "line", "(", "J774", ".", "2", ")", "treated", "either", "with", "thapsigargin", "(", "black", "bars", ")", ",", "tunicamycin", "(", "red", "bars", ")", "or", "DMSO", "(", "white", "bars", ")", ".", "Graphs", "show", "mean", "±", "SEM", "from", "n", "=", "3biological", "replicates", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "(", "Unpaired", "t", "test", ")", ".", "Bar", "graph", "represents", "IL", "-", "2", "secretion", "by", "NKT", "cell", "hybridoma", "(", "2C12", ")", "co", "-", "cultured", "with", "a", "human", "macrophage", "cell", "line", "(", "U937", ")", ",", "treated", "either", "with", "thapsigargin", "(", "black", "bars", ")", ",", "tunicamycin", "(", "red", "bars", ")", "or", "DMSO", "(", "white", "bars", ")", ".", "Graphs", "show", "mean", "±", "SEM", "from", "n", "=", "3biological", "replicates", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "(", "Unpaired", "t", "test", ")", ".", "Heat", "map", "represents", "cytokine", "secretion", "by", "in", "vitro", "expanded", "(", "C", ")", "murine", "splenic", "iNKT", "cells", "co", "-", "cultured", "either", "with", "thapsigargin", "-", "or", "tunicamycin", "-", "or", "DMSO", "-", "treated", "murine", "BMDMs", ".", "The", "heat", "map", "shows", "the", "average", "result", "of", "two", "pooled", "biological", "replicates", ".", "Heat", "map", "represents", "cytokine", "secretion", "by", "in", "vitro", "expanded", "human", "peripheral", "blood", "iNKT", "cells", "co", "-", "cultured", "either", "with", "thapsigargin", "-", "or", "tunicamycin", "-", "or", "DMSO", "-", "treated", "murine", "BMDMs", ".", "The", "heat", "map", "shows", "the", "average", "result", "of", "two", "pooled", "biological", "replicates", ".", "Wild", "type", "C57BL", "/", "6", "mice", "were", "injected", "intravenously", "with", "thapsigargin", "-", "loaded", "PLGA", "nanoparticles", "or", "vehicle", ",", "and", "12", "h", "later", ",", "hepatic", "iNKT", "cells", "were", "analysed", "by", "flow", "cytometry", ".", "Histograms", "represent", "expression", "of", "intracellular", "IL", "-", "4", "and", "IFN", "-", "γ", "levels", "in", "hepatic", "iNKT", "cells", "from", "mice", "injected", "with", "thapsigargin", "-", "loaded", "PLGA", "nanoparticles", "(", "red", "histogram", ")", "or", "vehicle", "-", "treated", "(", "grey", "histogram", ")", "mice", ".", "Dot", "plots", "represents", "MFI", "for", "intracellular", "IL", "-", "4", "and", "IFN", "-", "γ", "expression", "in", "hepatic", "iNKT", "cells", "from", "thapsigargin", "-", "loaded", "PLGA", "nanoparticles", "(", "red", "dots", ")", "or", "vehicle", "-", "treated", "(", "black", "dots", ")", "mice", ".", "Data", "plots", "show", "mean", "±", "SEM", "from", "n", "=", "5", "mice", "per", "group", ".", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "001", "(", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Bar graph represents IL-2 secretion by NKT cell hybridoma (2C12) co-cultured with (A) a murine macrophage cell line (J774.2) treated either with thapsigargin (black bars),tunicamycin (red bars) or DMSO (white bars). Graphs show mean ± SEM from n=3biological replicates. ****P < 0.0001 (Unpaired t test).Bar graph represents IL-2 secretion by NKT cell hybridoma (2C12) co-cultured with a human macrophage cell line (U937), treated either with thapsigargin (black bars),tunicamycin (red bars) or DMSO (white bars). Graphs show mean ± SEM from n=3biological replicates. ****P < 0.0001 (Unpaired t test).Heat map represents cytokine secretion by in vitro expanded (C) murine splenic iNKT cells co-cultured either with thapsigargin- or tunicamycin- or DMSO-treated murine BMDMs. The heat map shows the average result of two pooled biological replicates.Heat map represents cytokine secretion by in vitro expanded human peripheral blood iNKT cells co-cultured either with thapsigargin- or tunicamycin- or DMSO-treated murine BMDMs. The heat map shows the average result of two pooled biological replicates.Wild type C57BL/6 mice were injected intravenously with thapsigargin-loaded PLGA nanoparticles or vehicle, and 12 h later, hepatic iNKT cells were analysed by flow cytometry. Histograms represent expression of intracellular IL-4 and IFN-γ levels in hepatic iNKT cells from mice injected with thapsigargin-loaded PLGA nanoparticles (red histogram) or vehicle-treated (grey histogram) mice. Dot plots represents MFI for intracellular IL-4 and IFN-γ expression in hepatic iNKT cells from thapsigargin-loaded PLGA nanoparticles (red dots) or vehicle-treated (black dots) mice. Data plots show mean ± SEM from n = 5 mice per group. **P≤ 0.001 (Mann-Whitney U test)."}
{"words": ["Figure", "2Thapsigargin", "or", "αGalCer", "treated", "J774", ".", "2", "cells", "were", "cocultured", "with", "2C12", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "the", "murine", "CD1d", "-", "specific", "antibody", "(", "black", "circles", ")", "or", "isotype", "(", "red", "squares", ")", "for", "16", "hours", ".", "The", "addition", "of", "an", "anti", "-", "CD1d", "antibody", "blocked", "the", "activation", "of", "2C12", "demonstrating", "that", "the", "NKT", "-", "cell", "activation", "was", "CD1d", "-", "specific", ".", "Graphs", "show", "mean", "±", "SEM", "from", "n", "=", "2", "biological", "replicates", ".", "Bar", "graph", "represents", "IL", "-", "2", "secretion", "by", "NKT", "cell", "hybridoma", "(", "2C12", ")", "co", "-", "cultured", "murine", "macrophage", "cell", "line", "(", "J774", ".", "2", ")", "treated", "either", "with", "thapsigargin", "-", "or", "tunicamycin", "-", "treated", "CD1d", "knockdown", "(", "white", "bars", ")", "or", "untransfected", "(", "black", "bars", ")", ".", "Knockdown", "of", "CD1d", "blocked", "IL", "-", "2", "secretion", "by", "2C12", ".", "In", "total", ",", "n", "=", "2", "biological", "replicates", "were", "performed", "(", "three", "technical", "replicates", "per", "biological", "replicate", ")", ".", "Graphs", "show", "mean", "±", "SEM", "of", "each", "biological", "replicate", ".", "Bar", "graph", "represents", "IL", "-", "2", "secretion", "by", "NKT", "cell", "hybridoma", "(", "2C12", ")", "co", "-", "cultured", "either", "with", "thapsigargin", "-", "or", "tunicamycin", "-", "treated", "primary", "BMDM", "isolated", "from", "CD1d", "-", "/", "-", "(", "white", "bars", ")", "or", "wild", "type", "(", "black", "bars", ")", "mice", ".", "2C12", "cocultured", "with", "CD1d", "-", "/", "-", "BMDMs", "resulted", "in", "reduced", "IL", "-", "2", "secretion", ".", "Graphs", "show", "mean", "±", "SEM", "from", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "Unpaired", "t", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Thapsigargin or αGalCer treated J774.2 cells were cocultured with 2C12 in the presence or absence of the murine CD1d-specific antibody (black circles) or isotype (red squares) for 16 hours. The addition of an anti-CD1d antibody blocked the activation of 2C12 demonstrating that the NKT-cell activation was CD1d-specific. Graphs show mean ± SEM from n=2 biological replicates.Bar graph represents IL-2 secretion by NKT cell hybridoma (2C12) co-cultured murine macrophage cell line (J774.2) treated either with thapsigargin- or tunicamycin-treated CD1d knockdown (white bars) or untransfected (black bars). Knockdown of CD1d blocked IL-2 secretion by 2C12. In total, n=2 biological replicates were performed (three technical replicates per biological replicate). Graphs show mean ± SEM of each biological replicate.Bar graph represents IL-2 secretion by NKT cell hybridoma (2C12) co-cultured either with thapsigargin- or tunicamycin-treated primary BMDM isolated from CD1d-/- (white bars) or wild type (black bars) mice. 2C12 cocultured with CD1d-/- BMDMs resulted in reduced IL-2 secretion. Graphs show mean ± SEM from n=3 biological replicates. ***P < 0.001 (Unpaired t test)."}
{"words": ["Figure", "3qPCR", "analyses", "showing", "the", "expression", "(", "fold", "induction", ")", "of", "UPR", "signature", "genes", "compared", "to", "DMSO", "in", "murine", "macrophage", "cell", "lines", "J774", ".", "2", "stimulated", "either", "with", "thapsigargin", ",", "tunicamycin", "or", "DMSO", "for", "4", "or", "8", "hours", ".", "Graphs", "show", "mean", "±", "SEM", "from", "n", "=", "2", "biological", "replicates", "(", "two", "technical", "replicates", "per", "biological", "replicate", ")", ".", "qPCR", "analyses", "showing", "the", "expression", "(", "fold", "induction", ")", "of", "UPR", "signature", "genes", "compared", "to", "DMSO", "in", "human", "macrophage", "cell", "lines", "U937", "stimulated", "either", "with", "thapsigargin", ",", "tunicamycin", "or", "DMSO", "for", "4", "or", "8", "hours", ".", "Graphs", "show", "mean", "±", "SEM", "from", "n", "=", "2", "biological", "replicates", "(", "two", "technical", "replicates", "per", "biological", "replicate", ")", ".", "Bar", "graph", "represents", "percentage", "of", "IL", "-", "2", "secretion", "by", "NKT", "cell", "hybridoma", "(", "2C12", ")", "co", "-", "cultured", "with", "murine", "macrophage", "cell", "line", "(", "J774", ".", "2", ")", "treated", "either", "with", "thapsigargin", "or", "tunicamycin", "in", "the", "presence", "of", "IRE1α", "inhibitor", "(", "4μ8c", ")", "(", "black", "bar", ")", "or", "PERK", "inhibitor", "(", "GSK", ")", "(", "grey", "bar", ")", "or", "ATF6α", "inhibitor", "(", "Ceapin", "-", "a7", ")", "(", "red", "bar", ")", "respectively", ".", "Inhibition", "of", "IRE1α", "or", "PERK", "resulted", "in", "significant", "reduction", "in", "IL", "-", "2", "secretion", "by", "iNKT", "hybridoma", "compared", "to", "controls", ".", "In", "total", ",", "n", "=", "2", "biological", "replicates", "were", "performed", "(", "two", "and", "four", "technical", "replicates", "per", "biological", "replicate", "respectively", ")", ".", "Graphs", "show", "mean", "±", "SEM", "of", "each", "biological", "replicate", ".", "Immunoblots", "represents", "the", "knockdown", "efficiency", "for", "IRE1α", "and", "PERK", "protein", "in", "J774", ".", "2", "cell", "line", "transduced", "with", "lentiviral", "particles", "carrying", "gRNA", "against", "the", "IRE1α", "or", "PERK", "gene", ".", "Bar", "graph", "represents", "percentage", "of", "IL", "-", "2", "secretion", "by", "NKT", "cell", "hybridoma", "(", "2C12", ")", "co", "-", "cultured", "with", "thapsigargin", "-", "treated", "murine", "IRE1α", "or", "PERK", "knockdown", "macrophage", "cell", "line", "(", "J774", ".", "2", ")", ".", "Knockdown", "of", "IRE1α", "(", "black", "bar", ")", "or", "PERK", "(", "grey", "bar", ")", "resulted", "in", "significant", "reduction", "in", "IL", "-", "2", "secretion", "by", "iNKT", "hybridoma", ".", "In", "total", "n", "=", "2", "biological", "replicates", "were", "performed", "(", "three", "technical", "replicates", "per", "biological", "replicate", ")", ".", "Graphs", "show", "mean", "±", "SEM", "of", "each", "biological", "replicate", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3qPCR analyses showing the expression (fold induction) of UPR signature genes compared to DMSO in murine macrophage cell lines J774.2 stimulated either with thapsigargin, tunicamycin or DMSO for 4 or 8 hours. Graphs show mean ± SEM from n=2 biological replicates (two technical replicates per biological replicate).qPCR analyses showing the expression (fold induction) of UPR signature genes compared to DMSO in human macrophage cell lines U937 stimulated either with thapsigargin, tunicamycin or DMSO for 4 or 8 hours. Graphs show mean ± SEM from n=2 biological replicates (two technical replicates per biological replicate).Bar graph represents percentage of IL-2 secretion by NKT cell hybridoma (2C12) co-cultured with murine macrophage cell line (J774.2) treated either with thapsigargin or tunicamycin in the presence of IRE1α inhibitor (4μ8c) (black bar) or PERK inhibitor (GSK) (grey bar) or ATF6α inhibitor (Ceapin-a7) (red bar) respectively. Inhibition of IRE1α or PERK resulted in significant reduction in IL-2 secretion by iNKT hybridoma compared to controls. In total, n=2 biological replicates were performed (two and four technical replicates per biological replicate respectively). Graphs show mean ± SEM of each biological replicate.Immunoblots represents the knockdown efficiency for IRE1α and PERK protein in J774.2 cell line transduced with lentiviral particles carrying gRNA against the IRE1α or PERK gene.Bar graph represents percentage of IL-2 secretion by NKT cell hybridoma (2C12) co-cultured with thapsigargin-treated murine IRE1α or PERK knockdown macrophage cell line (J774.2). Knockdown of IRE1α (black bar) or PERK (grey bar) resulted in significant reduction in IL-2 secretion by iNKT hybridoma. In total n=2 biological replicates were performed (three technical replicates per biological replicate). Graphs show mean ± SEM of each biological replicate."}
{"words": ["Figure", "4Neutral", "(", "Fractions", "1", "-", "3", ")", "and", "polar", "lipids", "(", "Fractions", "4", "-", "6", ")", "were", "isolated", "from", "J774", ".", "2", "macrophages", "stimulated", "with", "thapsigargin", ",", "tunicamycin", "or", "DMSO", "and", "fractionated", "using", "solid", "-", "phase", "extraction", "(", "SPE", ")", "cartridges", ".", "Bar", "graph", "represents", "NKT", "cell", "activation", "by", "CD1d", "protein", "bound", "neutral", "lipids", "fractions", "isolated", "from", "thapsigargin", "-", "(", "black", "bars", ")", "or", "tunicamycin", "-", "treated", "(", "red", "bars", ")", "J774", ".", "2", "cells", ".", "Polar", "lipid", "fractions", "induce", "very", "little", "IL", "-", "2", "secretion", "by", "2C12", ".", "In", "total", ",", "n", "=", "2", "biological", "replicates", "were", "performed", "(", "two", "technical", "replicates", "per", "biological", "replicate", ")", ".", "Graphs", "show", "mean", "±", "SEM", "of", "each", "biological", "replicate", ".", "Graph", "represents", "enhancement", "of", "loading", "with", "neutral", "lipid", "fractions", "isolated", "from", "thapsigargin", "-", "treated", "J774", ".", "2", "at", "acidic", "pH", "and", "reduced", "mCD1d", "loading", "at", "neutral", "pH", ".", "Graphs", "show", "mean", "±", "SEM", "from", "n", "=", "2", "biological", "replicates", "(", "two", "technical", "replicates", "per", "biological", "replicate", ")", ".", "Neutral", "(", "Fractions", "1", "-", "3", ")", "and", "polar", "lipids", "(", "Fractions", "4", "-", "5", ")", ",", "isolated", "from", "murine", "bone", "marrow", "derived", "macrophages", "stimulated", "with", "thapsigargin", "or", "DMSO", "and", "fractionated", "using", "solid", "-", "phase", "extraction", "(", "SPE", ")", "cartridges", ",", "were", "co", "-", "cultured", "with", "purified", "NKT1", "subsets", ".", "Bar", "graphs", "represent", "IFN", "-", "γ", "release", "by", "NKT1", "cells", "induced", "by", "CD1d", "protein", "bound", "neutral", "lipids", "fractions", "isolated", "from", "thapsigargin", "-", "(", "black", "bars", ")", "or", "DMSO", "-", "treated", "(", "white", "bars", ")", "primary", "murine", "macrophages", ".", "Polar", "lipid", "fractions", "induce", "a", "minimal", "amount", "of", "IFN", "-", "γ", "secretion", "by", "the", "NKT1", "sublineage", ".", "In", "total", ",", "n", "=", "2", "biological", "replicates", "were", "performed", "(", "two", "technical", "replicates", "per", "biological", "replicate", ")", ".", "Graphs", "shows", "mean", "±", "SEM", "of", "each", "biological", "replicate", ".", "Neutral", "(", "Fractions", "1", "-", "3", ")", "and", "polar", "lipids", "(", "Fractions", "4", "-", "5", ")", "were", "isolated", "from", "primary", "macrophages", "derived", "from", "human", "peripheral", "blood", "stimulated", "with", "thapsigargin", "or", "DMSO", "and", "fractionated", "using", "solid", "-", "phase", "extraction", "(", "SPE", ")", "cartridges", ".", "Bar", "graph", "represents", "IFN", "-", "γ", "release", "by", "NKT1", "cells", "by", "CD1d", "protein", "bound", "neutral", "lipids", "fractions", "isolated", "from", "thapsigargin", "-", "(", "black", "bars", ")", "or", "DMSO", "-", "treated", "(", "white", "bars", ")", "human", "primary", "macrophages", ".", "Polar", "lipid", "fractions", "induce", "only", "minimal", "amounts", "of", "IFN", "-", "γ", "secretion", "by", "the", "NKT1", "sublineage", ".", "In", "total", ",", "n", "=", "2", "biological", "replicates", "were", "performed", "(", "two", "technical", "replicates", "per", "biological", "replicate", ")", ".", "Graphs", "shows", "mean", "±", "SEM", "of", "each", "biological", "replicate", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Neutral (Fractions 1-3) and polar lipids (Fractions 4-6) were isolated from J774.2 macrophages stimulated with thapsigargin, tunicamycin or DMSO and fractionated using solid-phase extraction (SPE) cartridges. Bar graph represents NKT cell activation by CD1d protein bound neutral lipids fractions isolated from thapsigargin- (black bars) or tunicamycin-treated (red bars) J774.2 cells. Polar lipid fractions induce very little IL-2 secretion by 2C12. In total, n=2 biological replicates were performed (two technical replicates per biological replicate). Graphs show mean ± SEM of each biological replicate.Graph represents enhancement of loading with neutral lipid fractions isolated from thapsigargin-treated J774.2 at acidic pH and reduced mCD1d loading at neutral pH. Graphs show mean ± SEM from n=2 biological replicates (two technical replicates per biological replicate).Neutral (Fractions 1-3) and polar lipids (Fractions 4-5), isolated from murine bone marrow derived macrophages stimulated with thapsigargin or DMSO and fractionated using solid-phase extraction (SPE) cartridges, were co-cultured with purified NKT1 subsets. Bar graphs represent IFN-γ release by NKT1 cells induced by CD1d protein bound neutral lipids fractions isolated from thapsigargin- (black bars) or DMSO-treated (white bars) primary murine macrophages. Polar lipid fractions induce a minimal amount of IFN-γ secretion by the NKT1 sublineage. In total, n=2 biological replicates were performed (two technical replicates per biological replicate). Graphs shows mean ± SEM of each biological replicate.Neutral (Fractions 1-3) and polar lipids (Fractions 4-5) were isolated from primary macrophages derived from human peripheral blood stimulated with thapsigargin or DMSO and fractionated using solid-phase extraction (SPE) cartridges. Bar graph represents IFN-γ release by NKT1 cells by CD1d protein bound neutral lipids fractions isolated from thapsigargin- (black bars) or DMSO-treated (white bars) human primary macrophages. Polar lipid fractions induce only minimal amounts of IFN-γ secretion by the NKT1 sublineage. In total, n=2 biological replicates were performed (two technical replicates per biological replicate). Graphs shows mean ± SEM of each biological replicate."}
{"words": ["Figure", "5Bar", "graph", "represents", "that", "recycling", "of", "CD1d", "between", "various", "endomembrane", "compartments", "and", "the", "cell", "surface", "is", "required", "for", "optimal", "IL", "-", "2", "secretion", "by", "NKT", "cells", ".", "In", "total", ",", "n", "=", "2", "biological", "replicates", "were", "performed", "(", "three", "technical", "replicates", "per", "biological", "replicate", ")", ".", "Graphs", "show", "mean", "±", "SEM", "of", "each", "biological", "replicate", ".", "qPCR", "analyses", "showing", "the", "expression", "(", "fold", "induction", ")", "of", "genes", "encoding", "for", "glycosphingolipid", "degrading", "enzymes", "compared", "to", "DMSO", "in", "murine", "macrophage", "cell", "lines", "J774", ".", "2", "stimulated", "either", "with", "thapsigargin", "or", "DMSO", "for", "8", "hours", ".", "In", "total", "n", "=", "2", "biological", "replicates", "were", "performed", "(", "two", "technical", "replicates", "per", "biological", "replicate", ")", ".", "Graphs", "show", "mean", "±", "SEM", "of", "each", "biological", "replicate", ".", "Glycolipid", "processing", "in", "intracellular", "compartments", "is", "not", "required", "prior", "to", "presentation", "to", "NKT", "cells", ".", "IL", "-", "2", "secretion", "in", "UPR", "-", "induced", "NKT", "cell", "activation", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "castanospermine", "or", "deoxygalactonojirimycin", ".", "Graphs", "show", "mean", "±", "SEM", "from", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "n", ".", "s", "(", "non", "-", "significant", ")", "(", "One", "-", "way", "ANOVA", ")", "biological", "replicates", ".", "L363", "antibody", "does", "not", "impact", "UPR", "-", "induced", "NKT", "cell", "activation", ".", "2C12", "NKT", "cells", "were", "co", "-", "cultured", "with", "ER", "-", "stressed", "macrophages", "J774", ".", "2", "cells", "and", "treated", "with", "L363", "antibody", "or", "isotype", "control", ".", "α", "-", "GalCer", "induced", "responses", "served", "as", "positive", "control", ".", "In", "total", ",", "n", "=", "2", "biological", "replicates", "were", "performed", "(", "Four", "technical", "replicates", "per", "biological", "replicate", ")", ".", "Graphs", "show", "mean", "±", "SEM", "of", "each", "biological", "replicate", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Bar graph represents that recycling of CD1d between various endomembrane compartments and the cell surface is required for optimal IL-2 secretion by NKT cells. In total, n=2 biological replicates were performed (three technical replicates per biological replicate). Graphs show mean ± SEM of each biological replicate.qPCR analyses showing the expression (fold induction) of genes encoding for glycosphingolipid degrading enzymes compared to DMSO in murine macrophage cell lines J774.2 stimulated either with thapsigargin or DMSO for 8 hours. In total n=2 biological replicates were performed (two technical replicates per biological replicate). Graphs show mean ± SEM of each biological replicate.Glycolipid processing in intracellular compartments is not required prior to presentation to NKT cells. IL-2 secretion in UPR-induced NKT cell activation in the presence or absence of castanospermine or deoxygalactonojirimycin. Graphs show mean ± SEM from n = 3 biological replicates. n.s (non-significant) (One-way ANOVA) biological replicates.L363 antibody does not impact UPR-induced NKT cell activation. 2C12 NKT cells were co-cultured with ER-stressed macrophages J774.2 cells and treated with L363 antibody or isotype control. α-GalCer induced responses served as positive control. In total, n=2 biological replicates were performed (Four technical replicates per biological replicate). Graphs show mean ± SEM of each biological replicate."}
{"words": ["Figure", "2Representative", "confocal", "3D", "images", "of", "LysoTracker", "(", "red", ")", ",", "DAPI", "(", "blue", ")", ",", "and", "BODIPY", "(", "green", ")", "stained", "ATM", "subsets", "obtained", "from", "eWAT", "of", "HFD", "(", "16", "weeks", ")", "treated", "mice", "(", "n", "=", "8", "mice", "from", "two", "independent", "experiments", ")", ".", "The", "merged", "figures", "are", "the", "result", "of", "the", "overlap", "of", "all", "three", "fluorochromes", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "Mito", "Stress", "assay", "of", "sorted", "ATM", "subsets", "(", "red", ",", "MHCIIlow", ";", "green", ",", "MHCIIhi", ";", "and", "blue", ",", "CD11c", "+", ")", "from", "16", "-", "week", "-", "HFD", "obese", "mice", "showing", "overall", "oxygen", "consumption", "rate", "(", "OCR", ")", ",", "maximal", "respiration", ",", "spare", "capacity", "respiration", ",", "basal", "respiration", ",", "ATP", "production", ",", "and", "non", "-", "mitochondrial", "respiration", ".", "OCR", "data", "shown", "are", "representative", "of", "four", "independent", "experiments", "and", "expressed", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "4", "MHCIIlow", ";", "n", "=", "7", "MHCIIhi", ";", "n", "=", "5", "CD11c", "+", ")", ",", "with", "statistical", "significance", "determined", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "test", "(", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "ns", ":", "no", "significant", "difference", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Representative confocal 3D images of LysoTracker (red), DAPI (blue), and BODIPY (green) stained ATM subsets obtained from eWAT of HFD (16 weeks) treated mice (n = 8 mice from two independent experiments). The merged figures are the result of the overlap of all three fluorochromes. Scale bar, 10 μm.Mito Stress assay of sorted ATM subsets (red, MHCIIlow; green, MHCIIhi; and blue, CD11c+) from 16-week-HFD obese mice showing overall oxygen consumption rate (OCR), maximal respiration, spare capacity respiration, basal respiration, ATP production, and non-mitochondrial respiration. OCR data shown are representative of four independent experiments and expressed as mean ± SD (n= 4 MHCIIlow; n= 7 MHCIIhi; n=5 CD11c+), with statistical significance determined using one-way ANOVA test (*P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; ns: no significant difference)."}
{"words": ["Figure", "3Representative", "flow", "cytometric", "showing", "the", "specific", "depletion", "efficiency", "of", "ATM", "subsets", "from", "eWAT", "of", "CD169", "-", "DTR", "ND", "-", "(", "A", ")", "or", "HFD", "-", "treated", "(", "16", "weeks", ")", "(", "B", ")", "mice", ".", "A", "representative", "analysis", "of", "three", "independent", "experiments", "is", "shown", ".", "eWAT", "was", "collected", "from", "lean", "(", "C", ")", "and", "obese", "(", "HFD", "16", "weeks", ")", "(", "D", ")", "WT", "or", "CD169", "-", "DTR", "mice", "after", "12", "days", "DT", "-", "mediated", "ATM", "depletion", ".", "Representative", "pictures", "of", "dissected", "eWAT", "are", "shown", "on", "the", "left", ",", "the", "corresponding", "eWAT", "weights", "expressed", "as", "mean", "±", "SD", "of", "more", "than", "12", "samples", "are", "shown", "in", "the", "right", ",", "with", "statistical", "significance", "calculated", "using", "the", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ")", ".", "The", "zoomed", "-", "in", "area", "shows", "clear", ",", "oily", "lipid", "accumulation", "in", "the", "absence", "of", "ATMs", "(", "lower", "left", "part", ")", ".", "Adipocyte", "hypertrophy", "is", "visible", "in", "the", "absence", "of", "ATMs", ".", "Representative", "images", "of", "hematoxylin", "and", "eosin", "staining", "(", "H", "&", "E", ")", "(", "E", ")", "and", "corresponding", "adipocyte", "diameters", "(", "F", ")", "of", "lean", "and", "obese", "(", "HFD", "16", "weeks", ")", "eWAT", "from", "WT", "or", "CD169", "-", "DTR", "mice", "treated", "for", "7", "or", "12", "days", "with", "DT", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "Each", "group", "comprised", "3", "-", "5", "mice", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "test", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "ns", ":", "no", "significant", "difference", ".", "The", "box", "and", "whisker", "plots", "show", "the", "median", "value", "and", "10", "-", "90", "percentiles", "of", "adipocyte", "diameters", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Representative flow cytometric showing the specific depletion efficiency of ATM subsets from eWAT of CD169-DTR ND- (A) or HFD-treated (16 weeks) (B) mice. A representative analysis of three independent experiments is shown.eWAT was collected from lean (C) and obese (HFD 16 weeks) (D) WT or CD169-DTR mice after 12 days DT-mediated ATM depletion. Representative pictures of dissected eWAT are shown on the left, the corresponding eWAT weights expressed as mean ± SD of more than 12 samples are shown in the right, with statistical significance calculated using the Student's t-test (**P < 0.01 and ****P < 0.0001). The zoomed-in area shows clear, oily lipid accumulation in the absence of ATMs (lower left part).Adipocyte hypertrophy is visible in the absence of ATMs. Representative images of hematoxylin and eosin staining (H&E) (E) and corresponding adipocyte diameters (F) of lean and obese (HFD 16 weeks) eWAT from WT or CD169-DTR mice treated for 7 or 12 days with DT. Scale bar, 50 μm. Each group comprised 3-5 mice. Statistical significance was determined using one-way ANOVA test. **P < 0.01; ****P < 0.0001; ns: no significant difference. The box and whisker plots show the median value and 10-90 percentiles of adipocyte diameters."}
{"words": ["Figure", "4qPCR", "showing", "the", "relative", "expression", "of", "genes", "for", "adipogenesis", "(", "Pparγ", ")", ",", "lipolysis", "(", "Lpl", ")", ",", "and", "lipogenesis", "(", "Dgat1", ")", ",", "plus", "other", "lipid", "receptor", "/", "transporters", "(", "Cd36", ",", "Abca1", ")", "or", "chaperones", "(", "Fabp4", ")", "in", "obese", "(", "HFD", "16", "weeks", ")", "eWAT", "of", "CD169", "-", "DTR", "(", "red", "bars", ")", "mice", "and", "DT", "-", "injected", "WT", "controls", "(", "blue", "bars", ")", "(", "upper", "panel", ")", "and", "obese", "eWAT", "of", "anti", "-", "CSF1R", "antibody", "-", "injected", "mice", "(", "green", "bars", ")", "mice", "and", "isotype", "control", "-", "injected", "WT", "controls", "(", "white", "bars", ")", "(", "lower", "panel", ")", ".", "Mice", "were", "under", "DT", "or", "anti", "-", "CSF1R", "antibody", "treatment", "for", "12", "days", ".", "(", "n", "=", "5", "pooled", "mice", "per", "group", ",", "mean", "±", "SD", ")", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "using", "an", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "ns", ":", "no", "significant", "difference", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4qPCR showing the relative expression of genes for adipogenesis (Pparγ), lipolysis (Lpl), and lipogenesis (Dgat1), plus other lipid receptor/transporters (Cd36, Abca1) or chaperones (Fabp4) in obese (HFD 16 weeks) eWAT of CD169-DTR (red bars) mice and DT-injected WT controls (blue bars) (upper panel) and obese eWAT of anti-CSF1R antibody-injected mice (green bars) mice and isotype control-injected WT controls (white bars) (lower panel). Mice were under DT or anti-CSF1R antibody treatment for 12 days. (n = 5 pooled mice per group, mean ± SD). Statistical significance was determined using an unpaired Student's t-test. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ns: no significant difference."}
{"words": ["Figure", "5Violin", "plots", "depicting", "the", "expression", "of", "representative", "marker", "genes", "for", "each", "CD45", "-", "cell", "cluster", ":", "ASC1", "(", "Gsn", ",", "Pdgfrb", ",", "Eln", ")", "(", "red", ")", ",", "ASC2", "(", "Pi16", ",", "Pdgfra", ",", "Cebpd", ")", "(", "yellow", ")", ",", "stromal", "cells", "(", "Col1a1", ",", "Col1a2", ",", "Myl9", ")", "(", "green", ")", ",", "VEC1", "/", "VEC2", "(", "Pecam", "-", "1", ",", "Cldn5", ",", "Aqp1", ")", "(", "purple", "and", "blue", ")", ",", "and", "mesothelial", "-", "like", "cells", "(", "MLCs", ")", "(", "Upk3b", ",", "Msln", ",", "Acta2", ")", "(", "orange", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Violin plots depicting the expression of representative marker genes for each CD45- cell cluster: ASC1 (Gsn, Pdgfrb, Eln) (red), ASC2 (Pi16, Pdgfra, Cebpd) (yellow), stromal cells (Col1a1, Col1a2, Myl9) (green), VEC1/VEC2 (Pecam-1, Cldn5, Aqp1) (purple and blue), and mesothelial-like cells (MLCs) (Upk3b, Msln, Acta2) (orange)."}
{"words": ["Figure", "6Representative", "3D", "fluorescence", "imaging", "of", "lean", "and", "obese", "(", "HFD", "16", "weeks", ")", "eWAT", "samples", "stained", "with", "anti", "-", "MHCII", "(", "green", "in", "lean", "samples", ")", ",", "anti", "-", "CD11c", "(", "green", "in", "obese", "samples", ")", ",", "anti", "-", "CD31", "(", "blue", ")", ",", "anti", "-", "CD169", "(", "pink", ")", ",", "and", "DAPI", "(", "white", ")", ".", "The", "two", "images", "at", "the", "bottom", "show", "the", "images", "merged", "for", "the", "lean", "and", "obese", "conditions", "without", "DAPI", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "μm", "(", "lean", ")", "and", "70", "μm", "(", "obese", ")", ".", "Higher", "magnification", "of", "specific", "eWAT", "areas", ".", "Scale", "bar", ":", "30", "μm", "(", "lean", ")", "and", "50", "μm", "(", "obese", ")", ".", "(", "left", "panels", ")", "Distance", "of", "different", "ATM", "subsets", "to", "blood", "vessels", ".", "Distances", "(", "in", "μm", ")", "were", "calculated", "using", "the", "Imaris", "software", ",", "as", "described", "in", "the", "Materials", "and", "Methods", "section", ".", "The", "box", "and", "whisker", "plots", "show", "the", "median", "value", "and", "10", "-", "90", "percentiles", "of", "distance", "values", ".", "The", "right", "panels", "show", "the", "distribution", "of", "ATM", "subsets", "to", "blood", "vessels", "within", "a", "certain", "distance", "(", "≤", "1", "μm", ",", "1", "-", "10", "μm", ",", "≥", "10", "μm", ")", ".", "C", ":", "CD169", "+", "MHCIIlow", "and", "CD169", "+", "MHChi", "ATMs", "in", "lean", "eWAT", ".", "D", ":", "CD169", "+", "CD11c", "-", "and", "CD169", "+", "CD11c", "+", "ATMs", "in", "obese", "(", "HFD", "16", "weeks", ")", "eWAT", ".", "Four", "mice", "from", "two", "independent", "experiments", "were", "analyzed", "(", "n", "=", "4", "-", "5", ";", "mean", "±", "SD", ")", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "using", "an", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "bars", "with", "no", "asterisks", "showed", "no", "significant", "difference", ".", "Model", "construction", "based", "on", "3D", "reconstructed", "images", "showing", "the", "relative", "distance", "of", "CD11c", "+", "ATMs", "from", "traced", "large", "blood", "vessels", ".", "Blood", "vessels", "larger", "than", "10µm", "diameter", "in", "the", "image", "were", "marked", "out", "on", "the", "image", "by", "tracing", "(", "white", "filaments", ")", ".", "CD11c", "+", "ATMs", "are", "close", "(", "<", "10µm", ")", "to", "the", "traced", "large", "blood", "vessels", "(", "red", "ellipsoids", ")", "or", "far", "(", ">", "10", "µm", ")", "(", "grey", "ellipsoids", ")", "from", "the", "traced", "blood", "vessel", ".", "Blood", "vessels", "are", "shown", "in", "green", ".", "Scale", "bar", ":", "100", "μm", ".", "The", "graph", "to", "the", "right", "shows", "the", "percentage", "of", "CD11chi", "ATMs", "showing", "a", "proximity", "of", "≤", "10", "or", ">", "10", "μm", "to", "blood", "vessels", "quantified", "from", "3", "biological", "replicates", "from", "1", "experiment", ",", "data", "was", "expressed", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "using", "an", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Representative 3D fluorescence imaging of lean and obese (HFD 16 weeks) eWAT samples stained with anti-MHCII (green in lean samples), anti-CD11c (green in obese samples), anti-CD31 (blue), anti-CD169 (pink), and DAPI (white). The two images at the bottom show the images merged for the lean and obese conditions without DAPI. Scale bar: 100 μm (lean) and 70 μm (obese).Higher magnification of specific eWAT areas. Scale bar: 30 μm (lean) and 50 μm (obese). (left panels) Distance of different ATM subsets to blood vessels. Distances (in μm) were calculated using the Imaris software, as described in the Materials and Methods section. The box and whisker plots show the median value and 10-90 percentiles of distance values. The right panels show the distribution of ATM subsets to blood vessels within a certain distance (≤1 μm, 1-10 μm, ≥10 μm). C: CD169+MHCIIlow and CD169+MHChi ATMs in lean eWAT. D: CD169+CD11c- and CD169+CD11c+ ATMs in obese (HFD 16 weeks) eWAT. Four mice from two independent experiments were analyzed (n = 4-5; mean ± SD). Statistical significance was determined using an unpaired Student's t-test. *P < 0.05, ****P < 0.0001, bars with no asterisks showed no significant difference.Model construction based on 3D reconstructed images showing the relative distance of CD11c+ ATMs from traced large blood vessels. Blood vessels larger than 10µm diameter in the image were marked out on the image by tracing (white filaments). CD11c+ ATMs are close (< 10µm) to the traced large blood vessels (red ellipsoids) or far (>10 µm) (grey ellipsoids) from the traced blood vessel. Blood vessels are shown in green. Scale bar: 100 μm. The graph to the right shows the percentage of CD11chi ATMs showing a proximity of ≤10 or >10 μm to blood vessels quantified from 3 biological replicates from 1 experiment, data was expressed as mean ± SD. Statistical significance was determined using an unpaired Student's t-test. ***P < 0.001."}
{"words": ["Figure", "7Two", "representative", "images", "of", "eWAT", "dissected", "from", "Evans", "blue", "-", "injected", "obese", "(", "HFD", "16", "weeks", ")", "WT", "and", "CD169", "-", "DTR", "mice", "treated", "for", "7", "days", "with", "DT", ".", "Evans", "blue", "dye", "was", "extracted", "from", "eWAT", "using", "formamide", "and", "the", "absorption", "of", "the", "extract", "was", "measured", "at", "620", "nm", "(", "the", "absorption", "values", "were", "normalized", "to", "the", "tissue", "weight", "in", "grams", ")", ".", "A", "chart", "showing", "the", "normalized", "mean", "optical", "density", "±", "SD", "(", "n", "=", "5", "-", "7", "mice", "per", "group", ")", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "using", "an", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Mmp12", "(", "H", ")", "and", "Vegfα", "(", "F", ")", "are", "highly", "expressed", "in", "MHCIIhi", "and", "CD11c", "+", "ATMs", "purified", "from", "obese", "(", "HFD", "16", "weeks", ")", "eWAT", ".", "qPCR", "analysis", "showed", "the", "relative", "expression", "in", "all", "three", "ATM", "subsets", "(", "n", "=", "3", ")", ",", "data", "was", "expressed", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Statistical", "significance", "between", "the", "three", "ATM", "subpopulations", "was", "determined", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "test", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "qPCR", "analysis", "showing", "the", "relative", "expression", "of", "Vegfα", "in", "obese", "(", "HFD", "16", "weeks", ")", "eWAT", "of", "WT", "(", "n", "=", "3", ")", "or", "CD169", "-", "DTR", "mice", "(", "n", "=", "5", ")", "treated", "for", "7", "days", "with", "DT", ",", "data", "was", "expressed", "as", "mean", "±", "SD", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "using", "an", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Two representative images of eWAT dissected from Evans blue-injected obese (HFD 16 weeks) WT and CD169-DTR mice treated for 7 days with DT. Evans blue dye was extracted from eWAT using formamide and the absorption of the extract was measured at 620 nm (the absorption values were normalized to the tissue weight in grams). A chart showing the normalized mean optical density ± SD (n = 5-7 mice per group). Statistical significance was determined using an unpaired Student's t-test. ***P < 0.001.Mmp12 (H) and Vegfα (F) are highly expressed in MHCIIhi and CD11c+ ATMs purified from obese (HFD 16 weeks) eWAT. qPCR analysis showed the relative expression in all three ATM subsets (n=3), data was expressed as mean ± SD . Statistical significance between the three ATM subpopulations was determined using one-way ANOVA test. *P < 0.05, **P < 0.01. qPCR analysis showing the relative expression of Vegfα in obese (HFD 16 weeks) eWAT of WT (n=3) or CD169-DTR mice (n=5) treated for 7 days with DT, data was expressed as mean ± SD. Statistical significance was determined using an unpaired Student's t-test. ****P < 0.0001."}
{"words": ["Figure", "8Elastin", "staining", "showing", "more", "pronounced", "ECM", "accumulation", "in", "eWAT", "of", "CD169", "-", "DTR", "(", "HFD", "16", "weeks", ")", "when", "compared", "with", "ECM", "accumulation", "in", "the", "WT", "obese", "(", "HFD", "16", "weeks", ")", "control", "(", "DAPI", ",", "blue", ";", "elastin", ",", "red", ";", "CD31", ",", "green", ")", ".", "The", "fourth", "image", "in", "each", "row", "shows", "the", "three", "channels", "merged", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "Picrosirius", "red", "-", "staining", "depicts", "excessive", "collagen", "deposits", "in", "obese", "(", "HFD", "16", "weeks", ")", "eWAT", "of", "CD169", "-", "DTR", "mice", "when", "compared", "with", "collagen", "deposits", "in", "WT", "controls", ".", "Scale", "bar", ":", "250", "μm", ".", "Upper", "panels", ":", "brightfield", "microscopy", ";", "lower", "panels", ":", "fluorescence", "microscopy", ".", "Violin", "plots", "showing", "the", "pro", "-", "inflammatory", "cytokine", "profile", "(", "Il", "-", "6", ",", "Tnf", "-", "α", ",", "and", "Il", "-", "1β", ")", "of", "all", "23", "cell", "clusters", "obtained", "from", "obese", "(", "HFD", "16", "weeks", ")", "WT", "and", "CD169", "-", "DTR", "eWAT", ".", "Cluster", "0", ":", "ASC1", ";", "Cluster", "1", ":", "Stromal", "cells", ";", "Cluster", "2", ":", "VEC1", ";", "Cluster", "3", ":", "VEC2", ";", "Cluster", "4", ":", "NK1", ";", "Cluster", "5", ":", "MAC", "/", "Mono1", ";", "Cluster", "6", ":", "ASC2", ";", "Cluster", "7", ":", "B", ";", "Cluster", "8", ":", "cDC1", ";", "Cluster", "9", ":", "mono", "-", "derived", "cDC", ";", "Cluster", "10", ":", "Th2", "/", "ILC2", "/", "Treg", ";", "Cluster", "11", ":", "MAC", "/", "Mono3", ";", "Cluster", "12", ":", "Th17", ";", "Cluster", "13", ":", "VEC2", ";", "Cluster", "14", ":", "CD8", ";", "Cluster", "15", ":", "MLCs", ";", "Cluster", "16", ":", "CD11b", "+", "DC", ";", "Cluster", "17", ":", "Neutrophils", ";", "Cluster", "18", ":", "cDC2", ";", "Cluster", "19", ":", "cDC", ";", "Cluster", "20", ":", "NKT", ";", "Cluster", "21", ":", "NK2", ";", "Cluster", "22", ":", "Mast", "cells", "/", "Basophils", ".", "ASC", ":", "adipocyte", "stem", "cell", ";", "VEC", ":", "vascular", "endothelial", "cell", ";", "MLC", ":", "mesothelial", "-", "like", "cell", ";", "NK", ":", "natural", "killer", ";", "MAC", ":", "macrophage", ";", "Mono", ":", "monocyte", ";", "DC", ":", "dendritic", "cell", ";", "NKT", ":", "natural", "killer", "T", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8Elastin staining showing more pronounced ECM accumulation in eWAT of CD169-DTR (HFD 16 weeks) when compared with ECM accumulation in the WT obese (HFD 16 weeks) control (DAPI, blue; elastin, red; CD31, green). The fourth image in each row shows the three channels merged. Scale bar: 50 μm. Picrosirius red-staining depicts excessive collagen deposits in obese (HFD 16 weeks) eWAT of CD169-DTR mice when compared with collagen deposits in WT controls. Scale bar: 250 μm. Upper panels: brightfield microscopy; lower panels: fluorescence microscopy.Violin plots showing the pro-inflammatory cytokine profile (Il-6, Tnf-α, and Il-1β) of all 23 cell clusters obtained from obese (HFD 16 weeks) WT and CD169-DTR eWAT. Cluster 0: ASC1; Cluster 1: Stromal cells; Cluster 2: VEC1; Cluster 3: VEC2; Cluster 4: NK1; Cluster 5: MAC/Mono1; Cluster 6: ASC2; Cluster 7: B; Cluster 8: cDC1; Cluster 9: mono-derived cDC; Cluster 10: Th2/ILC2/Treg; Cluster 11: MAC/Mono3; Cluster 12: Th17; Cluster 13: VEC2; Cluster 14: CD8; Cluster 15: MLCs; Cluster 16: CD11b+ DC; Cluster 17: Neutrophils; Cluster 18: cDC2; Cluster 19: cDC; Cluster 20: NKT; Cluster 21: NK2; Cluster 22: Mast cells/Basophils. ASC: adipocyte stem cell; VEC: vascular endothelial cell; MLC: mesothelial-like cell; NK: natural killer; MAC: macrophage; Mono: monocyte; DC: dendritic cell; NKT: natural killer T cells."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Confocal", "laser", "scanning", "micrographs", "showing", "the", "localization", "of", "a", "functional", "CDKA", ";", "1", ":", "mVenus", "fusion", "protein", "in", "the", "wildtype", "(", "WT", ")", "and", "cartoons", "on", "top", "highlighting", "the", "changes", "in", "abundance", "of", "CDKA", ";", "1", ":", "mVenus", "in", "the", "nucleus", "and", "cytoplasm", "during", "the", "course", "of", "meiosis", ".", "The", "region", "colored", "in", "beige", "represents", "the", "cytoplasm", ",", "in", "green", "the", "nucleoplasm", ",", "and", "in", "white", "the", "nucleolus", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", ".", "(", "B", ")", "Quantitative", "analysis", "of", "the", "signal", "distribution", "of", "the", "nuclear", "versus", "cytoplasmic", "fraction", "of", "CDKA", ";", "1", ":", "mVenus", "during", "prophase", "I", "of", "meiosis", "as", "revealed", "by", "live", "cell", "imaging", "Twenty", "cells", "at", "each", "time", "point", "were", "used", "for", "the", "analysis", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "SD", "and", "two", "biological", "replicates", "were", "performed", ".", "(", "C", ")", "Immunolocalization", "of", "CDKA", ";", "1", "(", "green", ")", "and", "ASY1", "(", "red", ")", "on", "spread", "chromsomes", "in", "leptotene", "and", "zygotene", "of", "wild", "-", "type", "plants", "expressing", "a", "functional", "PROCDKA", ";", "1", ":", "CDKA", ";", "1", ":", "Strep", "construct", ".", "The", "last", "lane", "shows", "a", "magnification", "of", "the", "region", "marked", "by", "the", "red", "rectangle", ".", "Arrowheads", "indicate", "synapsed", "regions", "of", "homologous", "chromosomes", "where", "CDKA", ";", "1", "is", "no", "longer", "present", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "μm", ".", "(", "D", ")", "Chromosome", "spread", "analysis", "of", "the", "wildtype", "and", "the", "hypomorphic", "cdka", ";", "1", "mutant", "CDKA", ";", "1T161D", ".", "(", "a", ",", "h", ")", "zygotene", "or", "zygotene", "-", "like", "stages", ";", "(", "b", ",", "i", ")", "pachytene", "or", "pachytene", "-", "like", "stages", ";", "(", "c", ",", "j", ",", "k", ")", "diakinesis", "or", "dikinesis", "-", "like", "stages", ";", "(", "d", ")", "metaphase", "I", ";", "(", "e", ",", "i", ",", "m", ",", "n", ")", "end", "of", "meiosis", "I", "with", "two", "(", "e", ",", "m", ")", "or", "three", "(", "i", ")", "pools", "of", "chromosomes", ";", "(", "f", ")", "metaphase", "II", ";", "(", "g", ")", "tetrad", ".", "Red", "arrowheads", "indicate", "the", "initiated", "formation", "of", "a", "phragmoplast", ".", "White", "arrowheads", "depict", "mitochondria", ".", "Scale", "bars", ":", "10", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Confocal laser scanning micrographs showing the localization of a functional CDKA;1:mVenus fusion protein in the wildtype (WT) and cartoons on top highlighting the changes in abundance of CDKA;1:mVenus in the nucleus and cytoplasm during the course of meiosis. The region colored in beige represents the cytoplasm, in green the nucleoplasm, and in white the nucleolus. Scale bar: 10 μm.(B) Quantitative analysis of the signal distribution of the nuclear versus cytoplasmic fraction of CDKA;1:mVenus during prophase I of meiosis as revealed by live cell imaging Twenty cells at each time point were used for the analysis. Error bars represent mean ± SD and two biological replicates were performed.(C) Immunolocalization of CDKA;1 (green) and ASY1 (red) on spread chromsomes in leptotene and zygotene of wild-type plants expressing a functional PROCDKA;1:CDKA;1:Strep construct. The last lane shows a magnification of the region marked by the red rectangle. Arrowheads indicate synapsed regions of homologous chromosomes where CDKA;1 is no longer present. Scale bar: 5 μm.(D) Chromosome spread analysis of the wildtype and the hypomorphic cdka;1 mutant CDKA;1T161D. (a, h) zygotene or zygotene-like stages; (b, i) pachytene or pachytene-like stages; (c, j, k) diakinesis or dikinesis-like stages; (d) metaphase I; (e, i, m, n) end of meiosis I with two (e, m) or three (i) pools of chromosomes; (f) metaphase II; (g) tetrad. Red arrowheads indicate the initiated formation of a phragmoplast. White arrowheads depict mitochondria. Scale bars: 10 μm."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "ASY1", ":", "GFP", "and", "ASY1T142D", ":", "GFP", "localization", "in", "late", "G2", "and", "leptotene", "of", "male", "meiocytes", "of", "the", "wildtype", "and", "CDKA", ";", "1T161D", "mutants", ".", "ASY3", ":", "RFP", ",", "highlighting", "chromsomes", ",", "was", "used", "as", "a", "marker", "for", "the", "staging", "of", "meiosis", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "μm", ".", "(", "B", ")", "Kinase", "assays", "of", "CDKA", ";", "1", "-", "SDS", ",", "-", "TAM", ",", "and", "-", "CYCA3", ";", "1", "complexes", "using", "ASY1", "puried", "from", "baculovirus", "-", "infected", "insect", "cells", "as", "a", "substrate", ".", "The", "upper", "panel", "shows", "the", "autoradiograph", ".", "The", "control", "reaction", "without", "CDKA", ";", "1", "-", "cyclin", "complex", "indicates", "a", "background", "activity", "co", "-", "purified", "from", "insect", "cells", ".", "The", "lower", "panel", "indicates", "protein", "loading", "by", "coomassie", "briliant", "blue", "(", "CBB", ")", "staining", ".", "Arrowheads", "indicate", "ASY1", "proteins", "and", "asterisks", "depict", "the", "relevant", "cyclin", "used", "which", "also", "gets", "phosphorylated", "in", "the", "assay", ".", "Numbers", "indicate", "the", "relative", "intensities", "of", "ASY1", "bands", ".", "(", "C", ")", "The", "upper", "panel", "shows", "a", "phos", "-", "tag", "gel", "analysis", "of", "ASY11", "-", "300", "and", "ASY11", "-", "300", "/", "T142V", ";", "T184V", "with", "and", "without", "CDKA", ";", "1", "-", "SDS", "kinase", "complexes", "using", "an", "anti", "-", "MBP", "antibody", ".", "The", "lower", "panel", "denotes", "loading", "of", "CDKA", ";", "1", "using", "an", "anti", "-", "Strep", "antibody", ".", "Arrowheads", "represent", "the", "proteins", "as", "indicated", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) ASY1:GFP and ASY1T142D:GFP localization in late G2 and leptotene of male meiocytes of the wildtype and CDKA;1T161D mutants. ASY3:RFP, highlighting chromsomes, was used as a marker for the staging of meiosis. Scale bar: 5 μm.(B) Kinase assays of CDKA;1-SDS, -TAM, and -CYCA3;1 complexes using ASY1 puried from baculovirus-infected insect cells as a substrate. The upper panel shows the autoradiograph. The control reaction without CDKA;1-cyclin complex indicates a background activity co-purified from insect cells. The lower panel indicates protein loading by coomassie briliant blue (CBB) staining. Arrowheads indicate ASY1 proteins and asterisks depict the relevant cyclin used which also gets phosphorylated in the assay. Numbers indicate the relative intensities of ASY1 bands.(C) The upper panel shows a phos-tag gel analysis of ASY11-300 and ASY11-300/T142V;T184V with and without CDKA;1-SDS kinase complexes using an anti-MBP antibody. The lower panel denotes loading of CDKA;1 using an anti-Strep antibody. Arrowheads represent the proteins as indicated."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", ")", "Localization", "patterns", "of", "different", "ASY1", ":", "GFP", "variants", "together", "with", "ASY3", ":", "RFP", "(", "for", "staging", "of", "zygotene", "and", "pachytene", ")", "in", "a", "asy1", "mutant", "background", "during", "prophase", "I", ".", "Bar", ":", "5", "μ", "(", "C", ")", "Signal", "distribution", "profiles", "of", "ASY1", ":", "GFP", "and", "ASY1T142V", ":", "GFP", "at", "leptotene", "The", "many", "small", "peaks", "with", "low", "amplitude", "in", "ASY1T142V", ":", "GFP", "indicate", "diffused", "localization", "as", "opposed", "to", "the", "clear", "peaks", "seen", "in", "the", "wildtype", ".", "(", "D", ",", "E", ")", "Immunolocalization", "of", "ASY1", "(", "D", ")", "and", "ZYP1", "(", "E", ")", "in", "ASY1", ":", "GFP", "(", "asy1", ")", "and", "ASY1T142V", ":", "GFP", "(", "asy1", ")", "plants", "using", "anti", "-", "GFP", "and", "anti", "-", "ZYP1", "antibodies", ",", "respectively", ".", "DNA", "was", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bars", ":", "5", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(B) Localization patterns of different ASY1:GFP variants together with ASY3:RFP (for staging of zygotene and pachytene) in a asy1 mutant background during prophase I. Bar: 5 μ(C) Signal distribution profiles of ASY1:GFP and ASY1T142V:GFP at leptotene The many small peaks with low amplitude in ASY1T142V:GFP indicate diffused localization as opposed to the clear peaks seen in the wildtype.(D, E) Immunolocalization of ASY1 (D) and ZYP1 (E) in ASY1:GFP (asy1) and ASY1T142V:GFP (asy1) plants using anti-GFP and anti-ZYP1 antibodies, respectively. DNA was stained with DAPI (blue). Scale bars: 5 μm."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Yeast", "two", "-", "hybrid", "interaction", "assays", "of", "ASY3", "with", "different", "ASY1", "variants", ".", "Monomeric", "GFP", "(", "mGFP", ")", "fused", "with", "AD", "(", "activating", "domain", ")", "and", "BD", "(", "binding", "domain", ")", "were", "used", "as", "controls", ".", "Yeast", "cells", "harboring", "both", "the", "AD", "and", "BD", "plasmids", "were", "grown", "on", "synthetic", "medium", "supplied", "with", "glucose", "in", "the", "absence", "of", "Leu", "and", "Trp", "(", "-", "L", "/", "T", ",", "left", "panel", ")", ",", "on", "Synthetic", "Drop", "-", "out", "(", "SD", ")", "medium", "in", "the", "absence", "of", "Leu", ",", "Trp", ",", "and", "His", "(", "-", "L", "/", "T", "/", "H", ",", "middle", "panel", ")", ",", "and", "on", "SD", "medium", "in", "the", "absence", "of", "Leu", ",", "Trp", ",", "His", "and", "Ade", "(", "-", "L", "/", "T", "/", "H", "/", "A", ",", "right", "panel", ")", ".", "Yeast", "cells", "were", "incubated", "until", "OD600", "=", "1", "and", "then", "diluted", "10", "-", ",", "100", "-", "and", "1000", "-", "fold", "for", "the", "assays", ".", "(", "B", ")", "GST", "pull", "down", "of", "ASY3", "with", "different", "ASY1", "variants", ".", "The", "numbers", "above", "the", "bands", "show", "the", "relative", "intensity", "of", "the", "bands", ".", "The", "input", "and", "pull", "down", "fractions", "were", "analyzed", "by", "immuno", "-", "blotting", "with", "the", "anti", "-", "GST", "(", "ASY3", ")", "and", "anti", "-", "MBP", "(", "ASY1", ")", "antibodies", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "the", "pull", "down", "fractions", "of", "ASY1", "as", "shown", "in", "(", "B", ")", ".", "The", "band", "intensity", "in", "the", "pull", "down", "of", "ASY11", "-", "300", "/", "T142V", ";", "T184V", "at", "a", "Triton", "X", "-", "100", "concentration", "of", "0", ".", "5", "%", "was", "defined", "as", "1", ".", "The", "relative", "amount", "of", "ASY1", "in", "the", "pull", "down", "fractions", "was", "normalized", "by", "the", "band", "intensity", "of", "the", "pulled", "-", "down", "ASY3", "fraction", ".", "The", "average", "band", "intensity", "of", "ASY1", "at", "different", "concentrations", "of", "Triton", "X", "-", "100", "used", "was", "plotted", ".", "Asteriks", "indicate", "significant", "difference", "(", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "±", "SD", "and", "two", "biological", "replicates", "were", "performed", ".", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Yeast two-hybrid interaction assays of ASY3 with different ASY1 variants. Monomeric GFP (mGFP) fused with AD (activating domain) and BD (binding domain) were used as controls. Yeast cells harboring both the AD and BD plasmids were grown on synthetic medium supplied with glucose in the absence of Leu and Trp (-L/T, left panel), on Synthetic Drop-out (SD) medium in the absence of Leu, Trp, and His (-L/T/H, middle panel), and on SD medium in the absence of Leu,Trp, His and Ade (-L/T/H/A, right panel). Yeast cells were incubated until OD600 = 1 and then diluted 10-, 100- and 1000-fold for the assays.(B) GST pull down of ASY3 with different ASY1 variants. The numbers above the bands show the relative intensity of the bands. The input and pull down fractions were analyzed by immuno-blotting with the anti-GST (ASY3) and anti-MBP (ASY1) antibodies. (C) Quantification of the pull down fractions of ASY1 as shown in (B). The band intensity in the pull down of ASY11-300/T142V;T184V at a Triton X-100 concentration of 0.5% was defined as 1. The relative amount of ASY1 in the pull down fractions was normalized by the band intensity of the pulled-down ASY3 fraction. The average band intensity of ASY1 at different concentrations of Triton X-100 used was plotted. Asteriks indicate significant difference (two-tailed t-test, p < 0.05). Error bars represent mean ± SD and two biological replicates were performed.. "}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Localization", "patterns", "of", "ASY1T142V", ";", "T184V", ":", "GFP", "together", "with", "ASY3", "-", "RFP", "in", "the", "wildtype", "and", "pch2", "mutants", ".", "Please", "note", "that", "images", "of", "ASY1T142V", ";", "T184V", ":", "GFP", "in", "pch2", "mutants", "were", "taken", "with", "increased", "sensitivity", "for", "a", "better", "visibility", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "μm", ".", "(", "B", ")", "Seed", "sets", "(", "mean", "±", "SD", ",", "n", "=", "5", ")", "of", "WT", ",", "asy1", ",", "pch2", ",", "asy1", "pch2", ",", "ASY1T142V", ";", "T184V", ":", "GFP", "(", "asy1", ")", "and", "ASY1T142V", ";", "T184V", ":", "GFP", "(", "asy1", "pch2", ")", "plants", ".", "Asteriks", "indicate", "significant", "differences", "(", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ",", "P", "<", "0", ".", "01", ")", "and", "ns", "depicts", "no", "significant", "difference", ".", "Scale", "bar", ":", "2", "mm", ".", "(", "C", ")", "Localization", "patterns", "of", "ASY1", ":", "GFP", ",", "ASY1T142V", ";", "T184V", ":", "GFP", ",", "and", "ASY11", "-", "570", ":", "GFP", "in", "the", "wildtype", "(", "WT", ")", "and", "/", "or", "in", "pch2", "mutant", "plants", "at", "early", "prophase", "I", ".", "Scale", "bars", ":", "5", "μm", ".", "(", "D", ")", "Localization", "pattern", "of", "PCH2", ":", "GFP", "together", "with", "ASY1", ":", "RFP", "in", "the", "male", "meiocytes", "of", "wildtype", ".", "Arrowheads", "indicate", "the", "chromosomal", "regions", "where", "the", "ASY1", "removal", "was", "concomitant", "with", "the", "localization", "of", "PCH2", ".", "Scale", "bar", ":", "10", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Localization patterns of ASY1T142V;T184V:GFP together with ASY3-RFP in the wildtype and pch2 mutants. Please note that images of ASY1T142V;T184V:GFP in pch2 mutants were taken with increased sensitivity for a better visibility. Scale bar: 5 μm.(B) Seed sets (mean ± SD, n = 5) of WT, asy1, pch2, asy1 pch2, ASY1T142V;T184V:GFP (asy1) and ASY1T142V;T184V:GFP (asy1 pch2) plants. Asteriks indicate significant differences (two-tailed t-test, P < 0.01) and ns depicts no significant difference. Scale bar: 2 mm.(C) Localization patterns of ASY1:GFP, ASY1T142V;T184V:GFP, and ASY11-570:GFP in the wildtype (WT) and/or in pch2 mutant plants at early prophase I. Scale bars: 5 μm.(D) Localization pattern of PCH2:GFP together with ASY1:RFP in the male meiocytes of wildtype. Arrowheads indicate the chromosomal regions where the ASY1 removal was concomitant with the localization of PCH2. Scale bar: 10 μm."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "B", ")", "Interaction", "assays", "of", "different", "ASY1", "fragments", "(", "with", "and", "without", "the", "closure", "motif", ")", ".", "(", "C", ")", "Interaction", "analysis", "of", "the", "ASY1", "closure", "motif", "(", "ASY1571", "-", "596", ")", "with", "different", "ASY1", "HORMA", "domain", "variants", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(B) Interaction assays of different ASY1 fragments (with and without the closure motif).(C) Interaction analysis of the ASY1 closure motif (ASY1571-596) with different ASY1 HORMA domain variants."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "GalNAc", "-", "T", "expression", "levels", "in", "human", "liver", "(", "The", "body", "map", "data", "for", "human", "liver", "was", "kindly", "provided", "by", "the", "\"", "Gene", "Expression", "Applications", "research", "group", "at", "Illumina", "\"", ",", "http", ":", "/", "/", "www", ".", "ebi", ".", "ac", ".", "uk", "/", "arrayexpress", "/", "experiments", "/", "E", "-", "MTAB", "-", "513", "/", ")", "and", "HepG2", "wild", "type", "cells", "quantified", "by", "RNAseq", "(", "n", "=", "2", ",", "bars", "representing", "mean", "with", "SD", ")", ".", "(", "B", ")", "VVA", "lectin", "immunoblot", "of", "secretomes", "from", "HepG2", "SC", ",", "SCΔT1", ",", "SCΔT2", "and", "SCΔT3", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) GalNAc-T expression levels in human liver (The body map data for human liver was kindly provided by the \"Gene Expression Applications research group at Illumina\", http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-MTAB-513/) and HepG2 wild type cells quantified by RNAseq (n=2, bars representing mean with SD).(B) VVA lectin immunoblot of secretomes from HepG2 SC, SCΔT1, SCΔT2 and SCΔT3."}
{"words": ["Figure", "3Histograms", "showing", "the", "distribution", "of", "M", "/", "L", "quantitation", "ratios", "of", "monoglycosylated", "peptides", "identified", "in", "(", "A", ")", "HepG2SCΔT1", ",", "(", "B", ")", "ΔT2", "and", "(", "C", ")", "+", "T3", ".", "Glycopeptides", "with", "M", "/", "L", "ratio", "<", "-", "1", "are", "colored", "red", "and", "glycopeptides", "with", "a", "M", "/", "L", "ratio", ">", "+", "1", "are", "colored", "green", ".", "(", "D", ")", "Venn", "diagram", "showing", "the", "distribution", "of", "candidates", "for", "isoform", "-", "specific", "sites", "among", "HepG2SCΔT1", ",", "T2", "and", "+", "T3", "applying", "a", "log10", "(", "+", "/", "-", "1", ")", "cut", "-", "off", "(", "excluding", "sites", "identified", "in", "both", "TCL", "and", "SEC", "for", "each", "isoform", ")", ",", "and", "(", "E", ")", "TCL", "alone", "and", "(", "F", ")", "SEC", "alone", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Histograms showing the distribution of M/L quantitation ratios of monoglycosylated peptides identified in (A) HepG2SCΔT1, (B) ΔT2 and (C) +T3. Glycopeptides with M/L ratio < -1 are colored red and glycopeptides with a M/L ratio > +1 are colored green. (D) Venn diagram showing the distribution of candidates for isoform-specific sites among HepG2SCΔT1, T2 and +T3 applying a log10 (+/-1) cut-off (excluding sites identified in both TCL and SEC for each isoform), and (E) TCL alone and (F) SEC alone."}
{"words": ["Figure", "1Primary", "human", "NK", "cells", "(", "n", "=", "19", "different", "donors", "per", "condition", ")", "were", "co", "-", "incubated", "with", "either", "no", "target", "cells", "(", "NK", "(", "-", ")", ")", ",", "autologous", "CD4", "T", "cells", "(", "Mock", ")", "or", "enriched", "in", "vitro", "HIV", "-", "1", "-", "infected", "(", "NL4", "-", "3", ")", "CD4", "T", "cells", "(", "HIV", ")", "at", "an", "effector", ":", "target", "cell", "ratio", "of", "1", ":", "2", ".", "NK", "cell", "degranulation", "was", "quantified", "by", "measuring", "CD107a", "surface", "expression", "using", "flow", "cytometry", ".", "(", "A", ")", "Representative", "histograms", "(", "overlay", ")", "displaying", "CD107a", "expression", "on", "NK", "cells", "after", "culture", "with", "the", "described", "culture", "conditions", "(", "NK", "(", "-", ")", ",", "Mock", ",", "HIV", ")", ".", "For", "the", "HIV", "-", "1", "co", "-", "culture", "condition", ",", "subsequent", "analyses", "of", "antigen", "expression", "were", "conducted", "by", "gating", "non", "-", "responsive", "(", "CD107a", "-", ")", "and", "responsive", "(", "CD107a", "+", ")", "NK", "cell", "subsets", ".", "(", "B", ")", "Relative", "frequency", "of", "CD107a", "+", "NK", "cells", "(", "y", "-", "axis", ")", "after", "culture", "in", "the", "described", "conditions", "(", "x", "-", "axis", ")", "(", "n", "=", "19", "different", "donors", ")", ".", "Box", "plots", "represent", "the", "median", "and", "25", "%", "/", "75", "%", "percentile", ".", "Whiskers", "indicate", "the", "minimum", "and", "maximum", "data", "points", ".", "Primary", "human", "NK", "cells", "(", "n", "=", "19", "different", "donors", "per", "condition", ")", "were", "co", "-", "incubated", "with", "either", "no", "target", "cells", "(", "NK", "(", "-", ")", ")", ",", "autologous", "CD4", "T", "cells", "(", "Mock", ")", "or", "enriched", "in", "vitro", "HIV", "-", "1", "-", "infected", "(", "NL4", "-", "3", ")", "CD4", "T", "cells", "(", "HIV", ")", "at", "an", "effector", ":", "target", "cell", "ratio", "of", "1", ":", "2", ".", "NK", "cell", "degranulation", "was", "quantified", "by", "measuring", "CD107a", "surface", "expression", "using", "flow", "cytometry", ".", "(", "C", ")", "HIV", "-", "specific", "response", "of", "bulk", "NK", "cells", "displayed", "as", "percentage", "points", "(", "p", ".", "p", ".", ")", "CD107a", "+", "NK", "cells", "after", "normalization", "to", "mock", "CD4", "T", "cells", "(", "y", "-", "axis", ")", "(", "n", "=", "19", "different", "donors", ")", ".", "Box", "plots", "represent", "the", "median", "and", "25", "%", "/", "75", "%", "percentile", ".", "Whiskers", "indicate", "the", "minimum", "and", "maximum", "data", "points", ".", "Primary", "human", "NK", "cells", "(", "n", "=", "19", "different", "donors", "per", "condition", ")", "were", "co", "-", "incubated", "with", "HIV", "-", "1", "-", "infected", "(", "NL4", "-", "3", ")", "CD4", "T", "cells", "(", "HIV", ")", "(", "E", ")", "Representative", "histograms", "(", "overlay", ")", "showing", "TRAIL", "surface", "expression", "as", "fluorescence", "intensity", "on", "NK", "cells", "after", "co", "-", "incubation", "with", "HIV", "-", "1", "-", "infected", "CD4", "T", "cells", ".", "Histograms", "show", "TRAIL", "expression", "for", "CD107a", "+", "and", "CD107a", "-", "NK", "cell", "subsets", "(", "solid", "lines", ")", "as", "well", "as", "their", "corresponding", "FMO", "controls", "(", "dotted", "lines", ")", ".", "Gate", "defining", "TRAIL", "+", "cells", "is", "indicated", "as", "well", ".", "(", "F", ")", "Left", "panel", ":", "Relative", "frequency", "of", "TRAIL", "+", "cells", "(", "y", "-", "axis", ")", "of", "CD107a", "+", "and", "CD107a", "-", "NK", "cell", "subsets", "(", "x", "-", "axis", ")", "after", "co", "-", "incubation", "with", "HIV", "-", "1", "-", "infected", "CD4", "T", "cells", ".", "Right", "panel", ":", "Difference", "in", "relative", "frequency", "of", "TRAIL", "+", "cells", "(", "y", "-", "axis", ")", "between", "CD107a", "+", "and", "CD107a", "-", "cells", "displayed", "as", "p", ".", "p", ".", "(", "n", "=", "19", "different", "donors", ")", ".", "Data", "information", ":", "Wilcoxon", "signed", "-", "rank", "test", ".", "Adjustment", "for", "multiplicity", ":", "Benjamini", "and", "Hochberg", "false", "discovery", "rate", "(", "FDR", ")", "F", ",", "left", "panel", ":", ")", ";", "Bonferroni", "(", "F", ",", "right", "panel", "Box", "plots", "represent", "the", "median", "and", "25", "%", "/", "75", "%", "percentile", ".", "Whiskers", "indicate", "the", "minimum", "and", "maximum", "data", "points", ".", "Lines", "connecting", "CD107a", "-", "and", "CD107a", "+", "cells", "refer", "to", "measured", "values", "of", "the", "same", "donor", ".", "Primary", "human", "NK", "cells", "(", "n", "=", "19", "different", "donors", "per", "condition", ")", "were", "co", "-", "incubated", "with", "HIV", "-", "1", "-", "infected", "(", "NL4", "-", "3", ")", "CD4", "T", "cells", "(", "HIV", ")", "(", "G", ")", "Left", "panel", ":", "TRAIL", "surface", "expression", "(", "y", "-", "axis", ")", "of", "CD107a", "+", "and", "CD107a", "-", "NK", "cell", "subsets", "(", "x", "-", "axis", ")", "after", "co", "-", "incubation", "with", "HIV", "-", "1", "-", "infected", "CD4", "T", "cells", "displayed", "as", "median", "fluorescence", "intensity", ".", "Right", "panel", ":", "Differences", "in", "TRAIL", "surface", "expression", "(", "y", "-", "axis", ")", "between", "CD107a", "+", "and", "CD107a", "-", "cells", "displayed", "as", "fold", "-", "difference", "(", "n", "=", "19", "different", "donors", ")", ".", "Data", "information", ":", "Wilcoxon", "signed", "-", "rank", "test", ".", "Adjustment", "for", "multiplicity", ":", ";", "Bonferroni", "G", ")", ".", "Box", "plots", "represent", "the", "median", "and", "25", "%", "/", "75", "%", "percentile", ".", "Whiskers", "indicate", "the", "minimum", "and", "maximum", "data", "points", ".", "Lines", "connecting", "CD107a", "-", "and", "CD107a", "+", "cells", "refer", "to", "measured", "values", "of", "the", "same", "donor", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Primary human NK cells (n = 19 different donors per condition) were co-incubated with either no target cells (NK(-)), autologous CD4 T cells (Mock) or enriched in vitro HIV-1-infected (NL4-3) CD4 T cells (HIV) at an effector:target cell ratio of 1:2. NK cell degranulation was quantified by measuring CD107a surface expression using flow cytometry. (A) Representative histograms (overlay) displaying CD107a expression on NK cells after culture with the described culture conditions (NK(-), Mock, HIV). For the HIV-1 co-culture condition, subsequent analyses of antigen expression were conducted by gating non-responsive (CD107a-) and responsive (CD107a+) NK cell subsets. (B) Relative frequency of CD107a+ NK cells (y-axis) after culture in the described conditions (x-axis) (n = 19 different donors). Box plots represent the median and 25%/75% percentile. Whiskers indicate the minimum and maximum data points.Primary human NK cells (n = 19 different donors per condition) were co-incubated with either no target cells (NK(-)), autologous CD4 T cells (Mock) or enriched in vitro HIV-1-infected (NL4-3) CD4 T cells (HIV) at an effector:target cell ratio of 1:2. NK cell degranulation was quantified by measuring CD107a surface expression using flow cytometry. (C) HIV-specific response of bulk NK cells displayed as percentage points (p.p.) CD107a+ NK cells after normalization to mock CD4 T cells (y-axis) (n = 19 different donors). Box plots represent the median and 25%/75% percentile. Whiskers indicate the minimum and maximum data points.Primary human NK cells (n = 19 different donors per condition) were co-incubated with HIV-1-infected (NL4-3) CD4 T cells (HIV) (E) Representative histograms (overlay) showing TRAIL surface expression as fluorescence intensity on NK cells after co-incubation with HIV-1-infected CD4 T cells. Histograms show TRAIL expression for CD107a+ and CD107a- NK cell subsets (solid lines) as well as their corresponding FMO controls (dotted lines). Gate defining TRAIL+ cells is indicated as well. (F) Left panel: Relative frequency of TRAIL+ cells (y-axis) of CD107a+ and CD107a- NK cell subsets (x-axis) after co-incubation with HIV-1-infected CD4 T cells. Right panel: Difference in relative frequency of TRAIL+ cells (y-axis) between CD107a+ and CD107a- cells displayed as p.p. (n = 19 different donors). Data information: Wilcoxon signed-rank test. Adjustment for multiplicity: Benjamini and Hochberg false discovery rate (FDR) F, left panel:); Bonferroni (F, right panel Box plots represent the median and 25%/75% percentile. Whiskers indicate the minimum and maximum data points. Lines connecting CD107a- and CD107a+ cells refer to measured values of the same donor.Primary human NK cells (n = 19 different donors per condition) were co-incubated with HIV-1-infected (NL4-3) CD4 T cells (HIV) (G) Left panel: TRAIL surface expression (y-axis) of CD107a+ and CD107a- NK cell subsets (x-axis) after co-incubation with HIV-1-infected CD4 T cells displayed as median fluorescence intensity. Right panel: Differences in TRAIL surface expression (y-axis) between CD107a+ and CD107a- cells displayed as fold-difference (n = 19 different donors). Data information: Wilcoxon signed-rank test. Adjustment for multiplicity: ; Bonferroni G). Box plots represent the median and 25%/75% percentile. Whiskers indicate the minimum and maximum data points. Lines connecting CD107a- and CD107a+ cells refer to measured values of the same donor."}
{"words": ["Figure", "2Comparison", "of", "CD107a", "expression", "levels", "between", "various", "NK", "cell", "subsets", "after", "co", "-", "incubation", "with", "either", "no", "target", "cells", "present", "(", "-", ")", ",", "autologous", "CD4", "T", "cells", "(", "Mock", ")", ",", "or", "enriched", "in", "vitro", "HIV", "-", "1", "-", "infected", "(", "NL4", "-", "3", ")", "CD4", "T", "cells", "(", "HIV", ")", "(", "n", "=", "13", "different", "donors", "per", "condition", ")", ".", "Predefined", "NK", "cell", "subsets", "comprise", "CD56Dim", ",", "CD56Bright", ",", "KIR", "-", "educated", "cells", ",", "defined", "as", "expressing", "at", "least", "one", "self", "-", "inhibitory", "KIR", "(", "2DL1", "/", "L2", "/", "L3", ",", "3DL1", ")", "and", "negative", "for", "NKG2A", ",", "NKG2A", "-", "educated", "cells", ",", "expressing", "NKG2A", "but", "lacking", "self", "-", "inhibitory", "KIR", ",", "and", "uneducated", "cells", ",", "lacking", "self", "-", "inhibitory", "KIR", "and", "NKG2A", "altogether", ".", "(", "A", ")", "Relative", "frequency", "of", "CD107a", "+", "cells", "(", "y", "-", "axis", ")", "of", "predefined", "NK", "cell", "subsets", "(", "x", "-", "axis", ")", ".", "Left", "panel", "displays", "data", "for", "bulk", "NK", "cells", ",", "middle", "panel", "for", "CD56Dim", "and", "CD56Bright", "NK", "cells", ",", "right", "panel", "for", "uneducated", ",", "KIR", "-", "educated", "and", "NKG2A", "-", "educated", "cells", "(", "n", "=", "13", "different", "donors", ")", ".", "Data", "information", ":", "Wilcoxon", "signed", "-", "rank", "test", "adjusted", "for", "multiple", "comparisons", "(", "Bonferroni", ")", ".", "Box", "plots", "represent", "the", "median", "and", "25", "%", "/", "75", "%", "percentile", ".", "Whiskers", "indicate", "the", "minimum", "and", "maximum", "data", "points", ".", "Comparison", "of", "CD107a", "expression", "levels", "between", "various", "NK", "cell", "subsets", "after", "co", "-", "incubation", "with", "either", "no", "target", "cells", "present", "(", "-", ")", ",", "autologous", "CD4", "T", "cells", "(", "Mock", ")", ",", "or", "enriched", "in", "vitro", "HIV", "-", "1", "-", "infected", "(", "NL4", "-", "3", ")", "CD4", "T", "cells", "(", "HIV", ")", "(", "n", "=", "13", "different", "donors", "per", "condition", ")", ".", "Predefined", "NK", "cell", "subsets", "comprise", "CD56Dim", ",", "CD56Bright", ",", "KIR", "-", "educated", "cells", ",", "defined", "as", "expressing", "at", "least", "one", "self", "-", "inhibitory", "KIR", "(", "2DL1", "/", "L2", "/", "L3", ",", "3DL1", ")", "and", "negative", "for", "NKG2A", ",", "NKG2A", "-", "educated", "cells", ",", "expressing", "NKG2A", "but", "lacking", "self", "-", "inhibitory", "KIR", ",", "and", "uneducated", "cells", ",", "lacking", "self", "-", "inhibitory", "KIR", "and", "NKG2A", "altogether", ".", "(", "B", ")", "HIV", "-", "specific", "responses", "of", "predefined", "NK", "cell", "sub", "-", "populations", "(", "x", "-", "axis", ")", "displayed", "as", "percentage", "points", "(", "p", ".", "p", ".", ")", "CD107a", "+", "NK", "cells", "after", "normalization", "to", "mock", "CD4", "T", "cells", "(", "y", "-", "axis", ")", "(", "n", "=", "13", "different", "donors", ")", ".", "Data", "information", ":", "Wilcoxon", "signed", "-", "rank", "test", "adjusted", "for", "multiple", "comparisons", "(", "Bonferroni", ")", ".", "Box", "plots", "represent", "the", "median", "and", "25", "%", "/", "75", "%", "percentile", ".", "Whiskers", "indicate", "the", "minimum", "and", "maximum", "data", "points", ".", "Comparison", "of", "TRAIL", "expression", "levels", "between", "various", "NK", "cell", "subsets", "after", "co", "-", "incubation", "with", "either", "no", "target", "cells", "present", "(", "-", ")", ",", "autologous", "CD4", "T", "cells", "(", "Mock", ")", ",", "or", "enriched", "in", "vitro", "HIV", "-", "1", "-", "infected", "(", "NL4", "-", "3", ")", "CD4", "T", "cells", "(", "HIV", ")", "(", "n", "=", "13", "different", "donors", "per", "condition", ")", ".", "Predefined", "NK", "cell", "subsets", "comprise", "CD56Dim", ",", "CD56Bright", ",", "KIR", "-", "educated", "cells", ",", "defined", "as", "expressing", "at", "least", "one", "self", "-", "inhibitory", "KIR", "(", "2DL1", "/", "L2", "/", "L3", ",", "3DL1", ")", "and", "negative", "for", "NKG2A", ",", "NKG2A", "-", "educated", "cells", ",", "expressing", "NKG2A", "but", "lacking", "self", "-", "inhibitory", "KIR", ",", "and", "uneducated", "cells", ",", "lacking", "self", "-", "inhibitory", "KIR", "and", "NKG2A", "altogether", ".", "(", "C", ")", "TRAIL", "expression", "levels", "(", "y", "-", "axis", ")", "of", "predefined", "NK", "cell", "subsets", "(", "x", "-", "axis", ")", ".", "Left", "panel", "displays", "data", "for", "bulk", "NK", "cells", ",", "middle", "panel", "for", "CD56Dim", "and", "CD56Bright", "NK", "cells", ",", "right", "panel", "for", "uneducated", ",", "KIR", "-", "educated", "and", "NKG2A", "-", "educated", "cells", ".", "Expression", "is", "displayed", "as", "median", "fluorescence", "intensity", "(", "MdFI", ")", "(", "n", "=", "13", "different", "donors", ")", ".", "Data", "information", ":", "Wilcoxon", "signed", "-", "rank", "test", "adjusted", "for", "multiple", "comparisons", "(", "Bonferroni", ")", ".", "Box", "plots", "represent", "the", "median", "and", "25", "%", "/", "75", "%", "percentile", ".", "Whiskers", "indicate", "the", "minimum", "and", "maximum", "data", "points", ".", "Comparison", "of", "TRAIL", "expression", "levels", "between", "various", "NK", "cell", "subsets", "after", "co", "-", "incubation", "with", "either", "no", "target", "cells", "present", "(", "-", ")", ",", "autologous", "CD4", "T", "cells", "(", "Mock", ")", ",", "or", "enriched", "in", "vitro", "HIV", "-", "1", "-", "infected", "(", "NL4", "-", "3", ")", "CD4", "T", "cells", "(", "HIV", ")", "(", "n", "=", "13", "different", "donors", "per", "condition", ")", ".", "Predefined", "NK", "cell", "subsets", "comprise", "CD56Dim", ",", "CD56Bright", ",", "KIR", "-", "educated", "cells", ",", "defined", "as", "expressing", "at", "least", "one", "self", "-", "inhibitory", "KIR", "(", "2DL1", "/", "L2", "/", "L3", ",", "3DL1", ")", "and", "negative", "for", "NKG2A", ",", "NKG2A", "-", "educated", "cells", ",", "expressing", "NKG2A", "but", "lacking", "self", "-", "inhibitory", "KIR", ",", "and", "uneducated", "cells", ",", "lacking", "self", "-", "inhibitory", "KIR", "and", "NKG2A", "altogether", ".", "(", "D", ")", "Comparison", "of", "TRAIL", "expression", "levels", "(", "y", "-", "axis", ")", "between", "CD107a", "-", "and", "CD107a", "+", "cells", "of", "predefined", "NK", "cell", "subsets", ".", "Left", "panel", "displays", "data", "for", "bulk", "NK", "cells", ",", "middle", "panel", "for", "CD56Dim", "and", "CD56Bright", "NK", "cells", ",", "right", "panel", "for", "uneducated", ",", "KIR", "-", "educated", "and", "NKG2A", "-", "educated", "cells", ".", "Expression", "is", "displayed", "as", "MdFI", ".", "(", "n", "=", "13", "different", "donors", ")", ".", "(", "E", ")", "Fold", "-", "differences", "in", "TRAIL", "surface", "expression", "(", "y", "-", "axis", ")", "between", "CD107a", "+", "and", "CD107a", "-", "cells", "of", "pre", "-", "defined", "NK", "cell", "sub", "-", "populations", "(", "x", "-", "axis", ")", ".", "(", "n", "=", "13", "different", "donors", ")", ".", "Data", "information", ":", "Wilcoxon", "signed", "-", "rank", "test", "adjusted", "for", "multiple", "comparisons", "(", "Bonferroni", ")", ".", "Box", "plots", "represent", "the", "median", "and", "25", "%", "/", "75", "%", "percentile", ".", "Whiskers", "indicate", "the", "minimum", "and", "maximum", "data", "points", ".", "Lines", "connecting", "CD107a", "-", "and", "CD107a", "+", "cells", "refer", "to", "measured", "values", "of", "the", "same", "donor", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Comparison of CD107a expression levels between various NK cell subsets after co-incubation with either no target cells present (-), autologous CD4 T cells (Mock), or enriched in vitro HIV-1-infected (NL4-3) CD4 T cells (HIV) (n = 13 different donors per condition). Predefined NK cell subsets comprise CD56Dim, CD56Bright, KIR-educated cells, defined as expressing at least one self-inhibitory KIR (2DL1/L2/L3, 3DL1) and negative for NKG2A, NKG2A-educated cells, expressing NKG2A but lacking self-inhibitory KIR, and uneducated cells, lacking self-inhibitory KIR and NKG2A altogether. (A) Relative frequency of CD107a+ cells (y-axis) of predefined NK cell subsets (x-axis). Left panel displays data for bulk NK cells, middle panel for CD56Dim and CD56Bright NK cells, right panel for uneducated, KIR-educated and NKG2A-educated cells (n = 13 different donors). Data information: Wilcoxon signed-rank test adjusted for multiple comparisons (Bonferroni). Box plots represent the median and 25%/75% percentile. Whiskers indicate the minimum and maximum data points.Comparison of CD107a expression levels between various NK cell subsets after co-incubation with either no target cells present (-), autologous CD4 T cells (Mock), or enriched in vitro HIV-1-infected (NL4-3) CD4 T cells (HIV) (n = 13 different donors per condition). Predefined NK cell subsets comprise CD56Dim, CD56Bright, KIR-educated cells, defined as expressing at least one self-inhibitory KIR (2DL1/L2/L3, 3DL1) and negative for NKG2A, NKG2A-educated cells, expressing NKG2A but lacking self-inhibitory KIR, and uneducated cells, lacking self-inhibitory KIR and NKG2A altogether. (B) HIV-specific responses of predefined NK cell sub-populations (x-axis) displayed as percentage points (p.p.) CD107a+ NK cells after normalization to mock CD4 T cells (y-axis) (n = 13 different donors). Data information: Wilcoxon signed-rank test adjusted for multiple comparisons (Bonferroni). Box plots represent the median and 25%/75% percentile. Whiskers indicate the minimum and maximum data points.Comparison of TRAIL expression levels between various NK cell subsets after co-incubation with either no target cells present (-), autologous CD4 T cells (Mock), or enriched in vitro HIV-1-infected (NL4-3) CD4 T cells (HIV) (n = 13 different donors per condition). Predefined NK cell subsets comprise CD56Dim, CD56Bright, KIR-educated cells, defined as expressing at least one self-inhibitory KIR (2DL1/L2/L3, 3DL1) and negative for NKG2A, NKG2A-educated cells, expressing NKG2A but lacking self-inhibitory KIR, and uneducated cells, lacking self-inhibitory KIR and NKG2A altogether. (C) TRAIL expression levels (y-axis) of predefined NK cell subsets (x-axis). Left panel displays data for bulk NK cells, middle panel for CD56Dim and CD56Bright NK cells, right panel for uneducated, KIR-educated and NKG2A-educated cells. Expression is displayed as median fluorescence intensity (MdFI) (n = 13 different donors). Data information: Wilcoxon signed-rank test adjusted for multiple comparisons (Bonferroni). Box plots represent the median and 25%/75% percentile. Whiskers indicate the minimum and maximum data points.Comparison of TRAIL expression levels between various NK cell subsets after co-incubation with either no target cells present (-), autologous CD4 T cells (Mock), or enriched in vitro HIV-1-infected (NL4-3) CD4 T cells (HIV) (n = 13 different donors per condition). Predefined NK cell subsets comprise CD56Dim, CD56Bright, KIR-educated cells, defined as expressing at least one self-inhibitory KIR (2DL1/L2/L3, 3DL1) and negative for NKG2A, NKG2A-educated cells, expressing NKG2A but lacking self-inhibitory KIR, and uneducated cells, lacking self-inhibitory KIR and NKG2A altogether. (D) Comparison of TRAIL expression levels (y-axis) between CD107a- and CD107a+ cells of predefined NK cell subsets. Left panel displays data for bulk NK cells, middle panel for CD56Dim and CD56Bright NK cells, right panel for uneducated, KIR-educated and NKG2A-educated cells. Expression is displayed as MdFI. (n = 13 different donors). (E) Fold-differences in TRAIL surface expression (y-axis) between CD107a+ and CD107a- cells of pre-defined NK cell sub-populations (x-axis). (n = 13 different donors). Data information: Wilcoxon signed-rank test adjusted for multiple comparisons (Bonferroni). Box plots represent the median and 25%/75% percentile. Whiskers indicate the minimum and maximum data points. Lines connecting CD107a- and CD107a+ cells refer to measured values of the same donor."}
{"words": ["Figure", "3Primary", "human", "CD4", "T", "cells", "from", "eight", "different", "donors", "(", "n", "=", "8", ")", "were", "separately", "infected", "with", "lab", "-", "adapted", "and", "primary", "HIV", "-", "1", "strains", ".", "Combined", "expression", "of", "DR4", "and", "DR5", "was", "assessed", "by", "flow", "cytometry", "four", "days", "after", "infection", ".", "Uninfected", "CD4", "T", "cells", "were", "determined", "as", "CD4", "-", "positive", "and", "HIV", "-", "1", "p24", "-", "negative", ",", "infected", "cells", "as", "CD4", "-", "negative", "and", "p24", "-", "positive", ".", "(", "A", ")", "Histograms", "(", "overlay", ")", "of", "one", "representative", "donor", "displaying", "combined", "DR4", "/", "5", "surface", "expression", "on", "CD4", "T", "cells", "previously", "incubated", "with", "either", "NL4", "-", "3", ",", "JR", "-", "CSF", ",", "WITO", ",", "CH198", ",", "or", "CH236", ".", "Expression", "is", "displayed", "as", "fluorescence", "intensity", "(", "x", "-", "axis", ")", ".", "(", "B", ")", "Comparison", "of", "the", "combined", "surface", "expression", "of", "DR4", "/", "5", "between", "mock", "(", "white", "circles", ")", ",", "uninfected", "(", "grey", "circles", ")", "and", "infected", "CD4", "T", "cells", "(", "orange", "circles", ")", ",", "from", "left", "to", "right", ":", "Mock", ":", "n", "=", "8", ";", "NL4", "-", "3", ":", "n", "=", "8", ";", "JR", "-", "CSF", ":", "n", "=", "8", ";", "WITO", ":", "n", "=", "7", ";", "CH198", ":", "n", "=", "7", ";", "CH236", ":", "n", "=", "8", "(", "7", "-", "8", "different", "donors", "per", "condition", ")", ".", "Expression", "is", "displayed", "as", "relative", "fluorescence", "intensity", "(", "RFI", ")", "after", "normalization", "to", "the", "respective", "secondary", "-", "AB", "-", "only", "control", "(", "y", "-", "axis", ")", ".", "Data", "information", "Wilcoxon", "signed", "-", "rank", "test", ".", "Values", "for", "non", "-", "infected", "and", "infected", "cells", "of", "the", "same", "donor", "are", "connected", "with", "lines", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Primary human CD4 T cells from eight different donors (n = 8) were separately infected with lab-adapted and primary HIV-1 strains. Combined expression of DR4 and DR5 was assessed by flow cytometry four days after infection. Uninfected CD4 T cells were determined as CD4-positive and HIV-1 p24-negative, infected cells as CD4-negative and p24-positive. (A) Histograms (overlay) of one representative donor displaying combined DR4/5 surface expression on CD4 T cells previously incubated with either NL4-3, JR-CSF, WITO, CH198, or CH236. Expression is displayed as fluorescence intensity (x-axis). (B) Comparison of the combined surface expression of DR4/5 between mock (white circles), uninfected (grey circles) and infected CD4 T cells (orange circles), from left to right: Mock: n = 8; NL4-3: n = 8; JR-CSF: n = 8; WITO: n = 7; CH198: n = 7; CH236: n = 8 (7-8 different donors per condition). Expression is displayed as relative fluorescence intensity (RFI) after normalization to the respective secondary-AB-only control (y-axis). Data information Wilcoxon signed-rank test. Values for non-infected and infected cells of the same donor are connected with lines."}
{"words": ["Figure", "4Degranulation", "of", "primary", "human", "NK", "cells", "after", "co", "-", "culture", "with", "various", "target", "cells", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "αTRAIL", "(", "A", ")", "Comparison", "of", "CD107a", "expression", "after", "co", "-", "culture", "with", "721", ".", "221", "target", "cells", "with", "either", "10", "µg", "/", "ml", "αTRAIL", "or", "isotype", "control", "(", "Iso", ")", "using", "flow", "cytometry", "(", "n", "=", "10", "different", "donors", "per", "condition", ")", ".", "Each", "data", "point", "represents", "the", "mean", "of", "2", "technical", "replicates", ".", "Effector", ":", "target", "ratio", "was", "1", ":", "1", ".", "Left", "panel", ":", "Concatenated", "density", "plot", "depicting", "CD107a", "expression", "as", "fluorescence", "intensity", "for", "one", "representative", "donor", ".", "Right", "panel", ":", "Box", "plots", "showing", "relative", "frequency", "of", "CD107a", "+", "NK", "cells", "(", "y", "-", "axis", ")", ".", "(", "B", ")", "Box", "plots", "display", "inhibition", "of", "degranulation", "(", "y", "-", "axis", ")", "after", "co", "-", "culture", "with", "721", ".", "221", "target", "cells", "in", "presence", "of", "either", "isotype", "or", "αTRAIL", "as", "relative", "reduction", "compared", "to", "no", "antibody", "(", "n", "=", "10", "different", "donors", "per", "condition", ")", ".", "(", "C", ")", "Comparison", "of", "CD107a", "expression", "after", "co", "-", "culture", "with", "autologous", "HIV", "-", "I", "-", "infected", "CD4", "T", "cells", "with", "either", "10", "µg", "/", "ml", "αTRAIL", "or", "isotype", "control", "(", "Iso", ")", "using", "flow", "cytometry", "(", "n", "=", "9", "different", "donors", "per", "condition", ")", "Each", "data", "point", "represents", "the", "mean", "of", "2", "technical", "replicates", ".", "Left", "panel", ":", "Concatenated", "density", "plot", "depicting", "CD107a", "expression", "as", "fluorescence", "intensity", "for", "one", "representative", "donor", ".", "Right", "panel", ":", "Box", "plots", "showing", "relative", "frequency", "of", "CD107a", "+", "NK", "cells", "(", "y", "-", "axis", ")", ".", "(", "D", ")", "Box", "plots", "display", "inhibition", "of", "degranulation", "(", "y", "-", "axis", ")", "after", "co", "-", "culture", "with", "autologous", "HIV", "-", "I", "-", "infected", "CD4", "T", "cells", "in", "the", "presence", "of", "either", "isotype", "or", "αTRAIL", "as", "relative", "reduction", "compared", "to", "no", "antibody", "(", "n", "=", "9", "different", "donors", "per", "condition", ")", ".", "Data", "information", ":", "Wilcoxon", "signed", "-", "rank", "test", ".", "Adjustment", "for", "multiple", "comparisons", "was", "performed", "using", "Bonferroni", ".", "Box", "plots", "represent", "the", "median", "and", "25", "%", "/", "75", "%", "percentile", ".", "Whiskers", "indicate", "minimum", "and", "maximum", "data", "points", ".", "Bar", "graphs", "represent", "the", "mean", "and", "the", "associated", "whiskers", "display", "the", "SD", ".", "Degranulation", "of", "primary", "human", "NK", "cells", "after", "co", "-", "culture", "with", "various", "target", "cells", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "αDR4", "/", "5", ".", "(", "E", ")", "Representative", "histograms", "(", "overlay", ",", "left", "panel", ")", "and", "bar", "graphs", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ",", "right", "panel", ")", "showing", "the", "individual", "and", "combined", "surface", "expression", "of", "DR4", "and", "DR5", "on", "721", ".", "221", "cells", ".", "Each", "data", "point", "represents", "the", "mean", "of", "3", "technical", "replicates", ".", "Data", "information", ":", "Wilcoxon", "signed", "-", "rank", "test", ".", "Adjustment", "for", "multiple", "comparisons", "was", "performed", "using", "Bonferroni", ".", "Box", "plots", "represent", "the", "median", "and", "25", "%", "/", "75", "%", "percentile", ".", "Whiskers", "indicate", "minimum", "and", "maximum", "data", "points", ".", "Bar", "graphs", "represent", "the", "mean", "and", "the", "associated", "whiskers", "display", "the", "SD", ".", "Degranulation", "of", "primary", "human", "NK", "cells", "after", "co", "-", "culture", "with", "various", "target", "cells", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "αDR4", "/", "5", ".", "(", "F", ")", "Comparison", "of", "CD107a", "expression", "after", "co", "-", "culture", "with", "721", ".", "221", "target", "cells", "in", "the", "presence", "of", "either", "αDR4", "/", "5", "(", "10", "µg", "/", "ml", "each", ")", ",", "or", "20", "µg", "/", "ml", "isotype", "control", "(", "Iso", ")", "using", "flow", "cytometry", "(", "n", "=", "9", "different", "donors", "per", "condition", ")", ".", "Effector", ":", "target", "ratio", "was", "1", ":", "1", ".", "Box", "plots", "showing", "relative", "frequency", "of", "CD107a", "+", "NK", "cells", "(", "y", "-", "axis", ")", ".", "(", "G", ")", "Box", "plots", "display", "inhibition", "of", "degranulation", "after", "co", "-", "culture", "with", "721", ".", "221", "target", "cells", "in", "presence", "of", "either", "isotype", "or", "αDR4", "/", "5", "as", "relative", "reduction", "compared", "to", "no", "antibody", "(", "n", "=", "9", "different", "donors", "per", "condition", ")", ".", "Data", "information", ":", "Wilcoxon", "signed", "-", "rank", "test", ".", "Adjustment", "for", "multiple", "comparisons", "was", "performed", "using", "Bonferroni", ".", "Box", "plots", "represent", "the", "median", "and", "25", "%", "/", "75", "%", "percentile", ".", "Whiskers", "indicate", "minimum", "and", "maximum", "data", "points", ".", "Bar", "graphs", "represent", "the", "mean", "and", "the", "associated", "whiskers", "display", "the", "SD", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Degranulation of primary human NK cells after co-culture with various target cells in the presence or absence of αTRAIL (A) Comparison of CD107a expression after co-culture with 721.221 target cells with either 10 µg/ml αTRAIL or isotype control (Iso) using flow cytometry (n = 10 different donors per condition). Each data point represents the mean of 2 technical replicates. Effector:target ratio was 1:1. Left panel: Concatenated density plot depicting CD107a expression as fluorescence intensity for one representative donor. Right panel: Box plots showing relative frequency of CD107a+ NK cells (y-axis). (B) Box plots display inhibition of degranulation (y-axis) after co-culture with 721.221 target cells in presence of either isotype or αTRAIL as relative reduction compared to no antibody (n = 10 different donors per condition). (C) Comparison of CD107a expression after co-culture with autologous HIV-I-infected CD4 T cells with either 10 µg/ml αTRAIL or isotype control (Iso) using flow cytometry (n = 9 different donors per condition) Each data point represents the mean of 2 technical replicates. Left panel: Concatenated density plot depicting CD107a expression as fluorescence intensity for one representative donor. Right panel: Box plots showing relative frequency of CD107a+ NK cells (y-axis). (D) Box plots display inhibition of degranulation (y-axis) after co-culture with autologous HIV-I-infected CD4 T cells in the presence of either isotype or αTRAIL as relative reduction compared to no antibody (n = 9 different donors per condition). Data information: Wilcoxon signed-rank test. Adjustment for multiple comparisons was performed using Bonferroni. Box plots represent the median and 25%/75% percentile. Whiskers indicate minimum and maximum data points. Bar graphs represent the mean and the associated whiskers display the SD.Degranulation of primary human NK cells after co-culture with various target cells in the presence or absence of αDR4/5. (E) Representative histograms (overlay, left panel) and bar graphs (n = 3 independent experiments, right panel) showing the individual and combined surface expression of DR4 and DR5 on 721.221 cells. Each data point represents the mean of 3 technical replicates. Data information: Wilcoxon signed-rank test. Adjustment for multiple comparisons was performed using Bonferroni. Box plots represent the median and 25%/75% percentile. Whiskers indicate minimum and maximum data points. Bar graphs represent the mean and the associated whiskers display the SD.Degranulation of primary human NK cells after co-culture with various target cells in the presence or absence of αDR4/5. (F) Comparison of CD107a expression after co-culture with 721.221 target cells in the presence of either αDR4/5 (10 µg/ml each), or 20 µg/ml isotype control (Iso) using flow cytometry (n = 9 different donors per condition). Effector:target ratio was 1:1. Box plots showing relative frequency of CD107a+ NK cells (y-axis). (G) Box plots display inhibition of degranulation after co-culture with 721.221 target cells in presence of either isotype or αDR4/5 as relative reduction compared to no antibody (n = 9 different donors per condition). Data information: Wilcoxon signed-rank test. Adjustment for multiple comparisons was performed using Bonferroni. Box plots represent the median and 25%/75% percentile. Whiskers indicate minimum and maximum data points. Bar graphs represent the mean and the associated whiskers display the SD."}
{"words": ["Figure", "5Degranulation", "of", "primary", "human", "NK", "cells", "after", "incubation", "with", "plate", "-", "coated", "antibodies", "(", "A", ")", "Comparison", "of", "CD107a", "expression", "after", "incubation", "in", "either", "uncoated", "wells", "(", "PBS", ")", "or", "wells", "coated", "with", "αTRAIL", ",", "αNKG2D", ",", "αNKp46", ",", "or", "isotype", "using", "flow", "cytometry", "(", "n", "=", "12", "different", "donors", "per", "condition", ")", ".", "Left", "panel", ":", "Concatenated", "density", "plot", "depicting", "CD107a", "expression", "as", "fluorescence", "intensity", "(", "y", "-", "axis", ")", "for", "one", "representative", "donor", "and", "10", "µg", "/", "ml", "antibody", "concentration", ".", "Right", "panel", ":", "Box", "plots", "showing", "relative", "frequency", "of", "CD107a", "+", "NK", "cells", "(", "y", "-", "axis", ")", "after", "incubation", "with", "plate", "-", "coated", "antibodies", "of", "different", "concentrations", "(", "x", "-", "axis", ")", ".", "(", "B", ")", "Comparison", "of", "CD107a", "expression", "after", "incubation", "with", "plate", "-", "coated", "DR4", "protein", ",", "DR5", "protein", "or", "human", "IgG", "using", "flow", "cytometry", "(", "n", "=", "11", "different", "donors", "per", "condition", ")", ".", "Left", "panel", ":", "Concatenated", "density", "plot", "depicting", "CD107a", "expression", "as", "fluorescence", "intensity", "(", "y", "-", "axis", ")", "for", "one", "representative", "donor", "and", "10", "µg", "/", "ml", "protein", "concentration", ".", "Right", "panel", ":", "Box", "plots", "showing", "relative", "frequency", "of", "CD107a", "+", "NK", "cells", "(", "y", "-", "axis", ")", "after", "incubation", "with", "plate", "-", "coated", "proteins", "of", "different", "concentrations", "(", "x", "-", "axis", ")", ".", "Data", "information", ":", "Wilcoxon", "signed", "-", "rank", "test", "adjusted", "for", "multiple", "comparisons", "(", "Bonferroni", ")", ".", "Spearman", "rank", "analysis", ".", "(", "A", ",", "B", ",", "Each", "data", "point", "represents", "the", "mean", "of", "2", "technical", "replicates", ".", "Box", "plots", "represent", "the", "median", "and", "25", "%", "/", "75", "%", "percentile", ".", "Whiskers", "indicate", "minimum", "and", "maximum", "data", "points", ".", "Degranulation", "of", "primary", "human", "NK", "cells", "after", "incubation", "with", "plate", "-", "coated", "antibodies", "(", "C", ")", "Comparison", "of", "granzyme", "B", "release", "after", "incubation", "with", "various", "stimuli", "(", "10", "µg", "/", "ml", "each", ")", ".", "Box", "plots", "showing", "Granzyme", "B", "concentration", "in", "the", "supernatant", "as", "determined", "by", "ELISA", "(", "left", "panel", ":", "n", "=", "8", "different", "donors", "per", "condition", ",", "right", "panel", ":", "n", "=", "9", "different", "donors", "per", "condition", ")", ".", "Data", "information", ":", "Wilcoxon", "signed", "-", "rank", "test", "adjusted", "for", "multiple", "comparisons", "(", "Bonferroni", ")", ".", "Spearman", "rank", "analysis", ".", "C", ",", "Each", "data", "point", "represents", "the", "mean", "of", "2", "technical", "replicates", ".", "Box", "plots", "represent", "the", "median", "and", "25", "%", "/", "75", "%", "percentile", ".", "Whiskers", "indicate", "minimum", "and", "maximum", "data", "points", ".", "Degranulation", "of", "primary", "human", "NK", "cells", "after", "incubation", "with", "plate", "-", "coated", "antibodies", "(", "D", ")", "Correlation", "analysis", "between", "relative", "frequency", "of", "CD107a", "+", "NK", "cells", "and", "granzyme", "B", "concentration", "(", "n", "=", "53", ",", "data", "points", "obtained", "from", "A", ",", "B", ",", "and", "C", ",", "11", "different", "donors", ")", ".", "Degranulation", "of", "primary", "human", "NK", "cells", "after", "incubation", "with", "plate", "-", "coated", "whole", "proteins", ".", "(", "E", ")", "Comparison", "of", "CD107a", "expression", "after", "incubation", "with", "plate", "-", "coated", "DcR1", "protein", ",", "osteoprotegerin", "(", "OPG", ")", "or", "human", "IgG", "using", "flow", "cytometry", "(", "n", "=", "9", "different", "donors", ")", ".", "Box", "plots", "showing", "relative", "frequency", "of", "CD107a", "+", "NK", "cells", "(", "y", "-", "axis", ")", "after", "incubation", "with", "plate", "-", "coated", "proteins", "of", "different", "concentrations", "(", "x", "-", "axis", ")", ".", "Data", "information", ":", "Wilcoxon", "signed", "-", "rank", "test", "adjusted", "for", "multiple", "comparisons", "(", "Bonferroni", ")", ".", "Spearman", "rank", "analysis", ".", "E", ")", "Each", "data", "point", "represents", "the", "mean", "of", "2", "technical", "replicates", ".", "Box", "plots", "represent", "the", "median", "and", "25", "%", "/", "75", "%", "percentile", ".", "Whiskers", "indicate", "minimum", "and", "maximum", "data", "points", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Degranulation of primary human NK cells after incubation with plate-coated antibodies (A) Comparison of CD107a expression after incubation in either uncoated wells (PBS) or wells coated with αTRAIL, αNKG2D, αNKp46, or isotype using flow cytometry (n = 12 different donors per condition). Left panel: Concatenated density plot depicting CD107a expression as fluorescence intensity (y-axis) for one representative donor and 10 µg/ml antibody concentration. Right panel: Box plots showing relative frequency of CD107a+ NK cells (y-axis) after incubation with plate-coated antibodies of different concentrations (x-axis). (B) Comparison of CD107a expression after incubation with plate-coated DR4 protein, DR5 protein or human IgG using flow cytometry (n = 11 different donors per condition). Left panel: Concatenated density plot depicting CD107a expression as fluorescence intensity (y-axis) for one representative donor and 10 µg/ml protein concentration. Right panel: Box plots showing relative frequency of CD107a+ NK cells (y-axis) after incubation with plate-coated proteins of different concentrations (x-axis). Data information: Wilcoxon signed-rank test adjusted for multiple comparisons (Bonferroni). Spearman rank analysis. (A, B, Each data point represents the mean of 2 technical replicates. Box plots represent the median and 25%/75% percentile. Whiskers indicate minimum and maximum data points.Degranulation of primary human NK cells after incubation with plate-coated antibodies (C) Comparison of granzyme B release after incubation with various stimuli (10 µg/ml each). Box plots showing Granzyme B concentration in the supernatant as determined by ELISA (left panel: n = 8 different donors per condition, right panel: n = 9 different donors per condition). Data information: Wilcoxon signed-rank test adjusted for multiple comparisons (Bonferroni). Spearman rank analysis. C, Each data point represents the mean of 2 technical replicates. Box plots represent the median and 25%/75% percentile. Whiskers indicate minimum and maximum data points.Degranulation of primary human NK cells after incubation with plate-coated antibodies (D) Correlation analysis between relative frequency of CD107a+ NK cells and granzyme B concentration (n = 53, data points obtained from A, B, and C, 11 different donors).Degranulation of primary human NK cells after incubation with plate-coated whole proteins. (E) Comparison of CD107a expression after incubation with plate-coated DcR1 protein, osteoprotegerin (OPG) or human IgG using flow cytometry (n = 9 different donors). Box plots showing relative frequency of CD107a+ NK cells (y-axis) after incubation with plate-coated proteins of different concentrations (x-axis). Data information: Wilcoxon signed-rank test adjusted for multiple comparisons (Bonferroni). Spearman rank analysis. E) Each data point represents the mean of 2 technical replicates. Box plots represent the median and 25%/75% percentile. Whiskers indicate minimum and maximum data points."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Comparison", "of", "IFNγ", "production", "(", "y", "-", "axis", ")", "after", "incubation", "with", "plate", "-", "coated", "antibodies", "or", "proteins", "(", "10", "µg", "/", "ml", "each", ")", "(", "x", "-", "axis", ")", ".", "Box", "plots", "showing", "IFNγ", "concentration", "in", "the", "supernatant", "as", "determined", "by", "ELISA", "(", "left", "panel", ":", "n", "=", "8", "different", "donors", "per", "condition", ",", "right", "panel", ":", "n", "=", "9", "different", "donors", "per", "condition", ")", ".", "Data", "information", ":", "Wilcoxon", "signed", "-", "rank", "test", ".", "(", "A", ",", "Samples", "were", "acquired", "in", "duplicate", "and", "the", "mean", "was", "calculated", "for", "each", "donor", "and", "condition", ".", "Box", "plots", "represent", "the", "median", "and", "25", "%", "/", "75", "%", "percentile", ".", "Whiskers", "indicate", "minimum", "and", "maximum", "data", "points", ".", "(", "B", ")", "Comparison", "of", "IFNγ", "levels", "in", "the", "supernatant", "after", "co", "-", "culture", "of", "NK", "cells", "with", "721", ".", "221", "target", "cells", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "either", "10", "µg", "/", "ml", "αTRAIL", "or", "isotype", "control", "(", "Iso", ")", "using", "ELISA", "(", "n", "=", "8", "different", "donors", "per", "condition", ")", ".", "Effector", ":", "target", "ratio", "was", "1", ":", "1", ".", "Left", "panel", ":", "Box", "plots", "showing", "IFNγ", "levels", "(", "y", "-", "axis", ")", "for", "the", "described", "culture", "conditions", "(", "x", "-", "axis", ")", ".", "Right", "panel", ":", "Box", "plots", "display", "inhibition", "of", "IFNγ", "production", "by", "NK", "cells", "(", "y", "-", "axis", ")", "in", "presence", "of", "either", "isotype", "or", "αTRAIL", "as", "relative", "reduction", "compared", "to", "no", "antibody", ".", "Data", "information", ":", "Wilcoxon", "signed", "-", "rank", "test", ".", "B", ",", "Samples", "were", "acquired", "in", "duplicate", "and", "the", "mean", "was", "calculated", "for", "each", "donor", "and", "condition", ".", "Box", "plots", "represent", "the", "median", "and", "25", "%", "/", "75", "%", "percentile", ".", "Whiskers", "indicate", "minimum", "and", "maximum", "data", "points", ".", "(", "C", ")", "Representative", "contour", "plots", "showing", "conjugate", "formation", "between", "NK", "cells", "and", "721", ".", "221", "target", "cells", "as", "determined", "by", "flow", "cytometry", ".", "Plots", "showing", "three", "distinct", "populations", "at", "the", "beginning", "of", "the", "co", "-", "culture", "(", "0", "min", ")", "and", "after", "50", "min", ":", "single", "721", ".", "221", "cells", "(", "CT", "Orange", "-", "positive", ")", ",", "single", "NK", "cells", "(", "CT", "Violet", "-", "positive", ")", "and", "conjugates", "(", "double", "-", "positive", ")", ".", "Relative", "frequency", "of", "NK", "cells", "in", "conjugates", "is", "calculated", "based", "on", "the", "total", "number", "of", "gated", "NK", "cells", ".", "(", "D", ")", "Comparison", "of", "conjugate", "formation", "after", "co", "-", "culture", "between", "NK", "cells", "and", "722", ".", "221", "cells", "after", "0", "min", "and", "after", "50", "min", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "10", "µg", "/", "ml", "αTRAIL", "or", "isotype", "control", "(", "n", "=", "8", "different", "donors", ")", ".", "Left", "panel", ":", "Box", "plots", "showing", "relative", "frequency", "of", "NK", "cells", "in", "conjugates", "(", "y", "-", "axis", ")", "for", "different", "time", "points", "and", "conditions", "(", "x", "-", "axis", ")", ".", "Right", "panel", ":", "Box", "plots", "display", "inhibition", "of", "conjugate", "formation", "(", "y", "-", "axis", ")", "in", "the", "presence", "of", "either", "isotype", "or", "αTRAIL", "as", "relative", "reduction", "compared", "to", "no", "antibody", ".", "Data", "information", ":", "Wilcoxon", "signed", "-", "rank", "test", ".", "D", ")", "Samples", "were", "acquired", "in", "duplicate", "and", "the", "mean", "was", "calculated", "for", "each", "donor", "and", "condition", ".", "Box", "plots", "represent", "the", "median", "and", "25", "%", "/", "75", "%", "percentile", ".", "Whiskers", "indicate", "minimum", "and", "maximum", "data", "points", ".", "(", "E", ")", "Expression", "levels", "of", "phosphorylated", "signaling", "proteins", ".", "Upper", "panel", ":", "Concatenated", "contour", "plots", "of", "one", "donor", "depicting", "the", "expression", "of", "phosphorylated", "signaling", "proteins", "Syk", ",", "p38", "MAPK", ",", "Akt", "and", "PLC", "-", "γ2", "for", "the", "following", "culture", "conditions", "and", "controls", "(", "x", "-", "axis", ":", "left", "to", "right", ")", ":", "FMO", ",", "PBS", ",", "isotype", ",", "αTRAIL", ",", "αNKp46", ",", "αNKG2D", ",", "αCD16", ".", "Lower", "panel", ":", "Bar", "graphs", "showing", "the", "percentage", "of", "p", "-", "Syk", "+", ",", "p", "-", "p38", "MAPK", "+", ",", "p", "-", "Akt", "+", "and", "p", "-", "PLC", "-", "γ2", "+", "NK", "cells", "after", "30", "min", "of", "stimulation", "(", "n", "=", "3", "different", "donors", ")", ".", "Bar", "graphs", "represent", "the", "median", ",", "whiskers", "display", "minimum", "and", "maximum", "data", "points", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Comparison of IFNγ production (y-axis) after incubation with plate-coated antibodies or proteins (10 µg/ml each) (x-axis). Box plots showing IFNγ concentration in the supernatant as determined by ELISA (left panel: n = 8 different donors per condition, right panel: n = 9 different donors per condition). Data information: Wilcoxon signed-rank test. (A, Samples were acquired in duplicate and the mean was calculated for each donor and condition. Box plots represent the median and 25%/75% percentile. Whiskers indicate minimum and maximum data points.(B) Comparison of IFNγ levels in the supernatant after co-culture of NK cells with 721.221 target cells in the presence or absence of either 10 µg/ml αTRAIL or isotype control (Iso) using ELISA (n = 8 different donors per condition). Effector:target ratio was 1:1. Left panel: Box plots showing IFNγ levels (y-axis) for the described culture conditions (x-axis). Right panel: Box plots display inhibition of IFNγ production by NK cells (y-axis) in presence of either isotype or αTRAIL as relative reduction compared to no antibody. Data information: Wilcoxon signed-rank test. B, Samples were acquired in duplicate and the mean was calculated for each donor and condition. Box plots represent the median and 25%/75% percentile. Whiskers indicate minimum and maximum data points.(C) Representative contour plots showing conjugate formation between NK cells and 721.221 target cells as determined by flow cytometry. Plots showing three distinct populations at the beginning of the co-culture (0 min) and after 50 min: single 721.221 cells (CT Orange-positive), single NK cells (CT Violet-positive) and conjugates (double-positive). Relative frequency of NK cells in conjugates is calculated based on the total number of gated NK cells. (D) Comparison of conjugate formation after co-culture between NK cells and 722.221 cells after 0 min and after 50 min in the presence or absence of 10 µg/ml αTRAIL or isotype control (n = 8 different donors). Left panel: Box plots showing relative frequency of NK cells in conjugates (y-axis) for different time points and conditions (x-axis). Right panel: Box plots display inhibition of conjugate formation (y-axis) in the presence of either isotype or αTRAIL as relative reduction compared to no antibody. Data information: Wilcoxon signed-rank test. D) Samples were acquired in duplicate and the mean was calculated for each donor and condition. Box plots represent the median and 25%/75% percentile. Whiskers indicate minimum and maximum data points.(E) Expression levels of phosphorylated signaling proteins. Upper panel: Concatenated contour plots of one donor depicting the expression of phosphorylated signaling proteins Syk, p38 MAPK, Akt and PLC-γ2 for the following culture conditions and controls (x-axis: left to right): FMO, PBS, isotype, αTRAIL, αNKp46, αNKG2D, αCD16. Lower panel: Bar graphs showing the percentage of p-Syk+, p-p38 MAPK+, p-Akt+ and p-PLC-γ2+ NK cells after 30 min of stimulation (n = 3 different donors). Bar graphs represent the median, whiskers display minimum and maximum data points."}
{"words": ["Figure", "7Lysis", "of", "different", "target", "cells", "in", "co", "-", "culture", "with", "NK", "cells", "was", "quantified", "in", "various", "cytotoxicity", "assays", ".", "(", "A", ")", "Left", "panel", ":", "Representative", "contour", "plots", "showing", "depletion", "of", "721", ".", "221", "target", "cells", "in", "the", "presence", "of", "NK", "cells", ".", "Middle", "panel", ":", "Percentage", "of", "target", "cells", "remaining", "(", "y", "-", "axis", ")", "after", "co", "-", "culture", "with", "NK", "cells", "in", "the", "presence", "of", "either", "αTRAIL", "or", "isotype", "control", ",", "in", "reference", "to", "target", "cells", "kept", "alone", ".", "Right", "panel", ":", "Box", "plots", "displaying", "difference", "of", "target", "cells", "remaining", "(", "y", "-", "axis", ")", "between", "αTRAIL", "and", "isotype", "conditions", "displayed", "as", "p", ".", "p", ".", "(", "n", "=", "12", "different", "donors", ")", ".", "Each", "data", "point", "represents", "the", "mean", "of", "at", "least", "2", "technical", "replicates", ".", "Data", "information", ":", "Wilcoxon", "signed", "-", "rank", "test", ".", "Experiments", "were", "performed", "in", "four", "batches", "with", "three", "different", "donors", "each", ".", "\"", "No", "NK", "\"", "control", "samples", "served", "as", "a", "reference", "for", "all", "donors", "in", "each", "batch", ".", "Lines", "connect", "each", "data", "value", "of", "the", "NK", "cell", "condition", "with", "their", "designated", "\"", "No", "NK", "\"", "control", ".", "Box", "plots", "represent", "the", "median", "and", "25", "%", "/", "75", "%", "percentile", ".", "Whiskers", "indicate", "minimum", "and", "maximum", "data", "points", ".", "Lysis", "of", "different", "target", "cells", "in", "co", "-", "culture", "with", "NK", "cells", "was", "quantified", "in", "various", "cytotoxicity", "assays", ".", "(", "B", ")", "Left", "panel", ":", "Representative", "contour", "plots", "showing", "the", "percentage", "of", ".", "221", "-", "DR4", "/", "5KO", "(", "control", ")", "and", ".", "221", "-", "Cas9", "cells", "(", "target", ")", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "NK", "cells", ".", "Middle", "panel", ":", "Ratio", "between", ".", "221", "-", "DR4", "/", "5KO", "and", ".", "221", "-", "Cas9", "cells", "(", "y", "-", "axis", ")", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "NK", "cells", ".", "Right", "panel", ":", "Specific", "lysis", "of", ".", "221", "-", "Cas9", "cells", "displayed", "as", "%", "(", "n", "=", "12", "different", "donors", ")", ".", "Each", "data", "point", "represents", "the", "mean", "of", "at", "least", "3", "technical", "replicates", ".", "Data", "information", ":", "Wilcoxon", "signed", "-", "rank", "test", ".", "Experiments", "were", "performed", "in", "four", "batches", "with", "three", "different", "donors", "each", ".", "\"", "No", "NK", "\"", "control", "samples", "served", "as", "a", "reference", "for", "all", "donors", "in", "each", "batch", ".", "Lines", "connect", "each", "data", "value", "of", "the", "NK", "cell", "condition", "with", "their", "designated", "\"", "No", "NK", "\"", "control", ".", "Box", "plots", "represent", "the", "median", "and", "25", "%", "/", "75", "%", "percentile", ".", "Whiskers", "indicate", "minimum", "and", "maximum", "data", "points", ".", "Lysis", "of", "different", "target", "cells", "in", "co", "-", "culture", "with", "NK", "cells", "was", "quantified", "in", "various", "cytotoxicity", "assays", ".", "(", "C", ")", "Left", "panel", ":", "Representative", "contour", "plots", "showing", "the", "percentage", "of", "Raji", "-", "pSIP", "(", "control", ")", "and", "Raji", "-", "DR5", "+", "+", "(", "target", ")", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "NK", "cells", ".", "Middle", "panel", ":", "Ratio", "between", "Raji", "-", "pSIP", "and", "Raji", "-", "DR5", "+", "+", "(", "y", "-", "axis", ")", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "NK", "cells", ".", "Right", "panel", ":", "Specific", "lysis", "of", "Raji", "-", "DR5", "+", "+", "cells", "displayed", "as", "%", "(", "n", "=", "12", "different", "donors", ")", ".", "Each", "data", "point", "represents", "the", "mean", "of", "at", "least", "three", "technical", "replicates", ".", "Data", "information", ":", "Wilcoxon", "signed", "-", "rank", "test", ".", "Experiments", "were", "performed", "in", "four", "batches", "with", "three", "different", "donors", "each", ".", "\"", "No", "NK", "\"", "control", "samples", "served", "as", "a", "reference", "for", "all", "donors", "in", "each", "batch", ".", "Lines", "connect", "each", "data", "value", "of", "the", "NK", "cell", "condition", "with", "their", "designated", "\"", "No", "NK", "\"", "control", ".", "Box", "plots", "represent", "the", "median", "and", "25", "%", "/", "75", "%", "percentile", ".", "Whiskers", "indicate", "minimum", "and", "maximum", "data", "points", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Lysis of different target cells in co-culture with NK cells was quantified in various cytotoxicity assays. (A) Left panel: Representative contour plots showing depletion of 721.221 target cells in the presence of NK cells. Middle panel: Percentage of target cells remaining (y-axis) after co-culture with NK cells in the presence of either αTRAIL or isotype control, in reference to target cells kept alone. Right panel: Box plots displaying difference of target cells remaining (y-axis) between αTRAIL and isotype conditions displayed as p.p. (n = 12 different donors). Each data point represents the mean of at least 2 technical replicates. Data information: Wilcoxon signed-rank test. Experiments were performed in four batches with three different donors each. \"No NK\" control samples served as a reference for all donors in each batch. Lines connect each data value of the NK cell condition with their designated \"No NK\" control. Box plots represent the median and 25%/75% percentile. Whiskers indicate minimum and maximum data points.Lysis of different target cells in co-culture with NK cells was quantified in various cytotoxicity assays. (B) Left panel: Representative contour plots showing the percentage of .221-DR4/5KO (control) and .221-Cas9 cells (target) in the presence or absence of NK cells. Middle panel: Ratio between .221-DR4/5KO and .221-Cas9 cells (y-axis) in the presence or absence of NK cells. Right panel: Specific lysis of .221-Cas9 cells displayed as % (n = 12 different donors). Each data point represents the mean of at least 3 technical replicates. Data information: Wilcoxon signed-rank test. Experiments were performed in four batches with three different donors each. \"No NK\" control samples served as a reference for all donors in each batch. Lines connect each data value of the NK cell condition with their designated \"No NK\" control. Box plots represent the median and 25%/75% percentile. Whiskers indicate minimum and maximum data points.Lysis of different target cells in co-culture with NK cells was quantified in various cytotoxicity assays. (C) Left panel: Representative contour plots showing the percentage of Raji-pSIP (control) and Raji-DR5++ (target) in the presence or absence of NK cells. Middle panel: Ratio between Raji-pSIP and Raji-DR5++ (y-axis) in the presence or absence of NK cells. Right panel: Specific lysis of Raji-DR5++ cells displayed as % (n = 12 different donors). Each data point represents the mean of at least three technical replicates. Data information: Wilcoxon signed-rank test. Experiments were performed in four batches with three different donors each. \"No NK\" control samples served as a reference for all donors in each batch. Lines connect each data value of the NK cell condition with their designated \"No NK\" control. Box plots represent the median and 25%/75% percentile. Whiskers indicate minimum and maximum data points."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "the", "levels", "of", "the", "indicated", "proteins", "in", "lysates", "from", "non", "-", "infected", "(", "ni", ")", "and", "infected", "wild", "-", "type", "iBMDMs", "for", "60", "or", "120", "min", ".", "C", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "Klf4", "and", "tubulin", "levels", "in", "lysates", "from", "non", "-", "infected", "(", "ni", ")", "and", "infected", "wild", "-", "type", "iBMDMs", "for", "60", "or", "120", "min", ".", "H", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "Arg1", "and", "tubulin", "levels", "in", "lysates", "from", "non", "-", "infected", "(", "ni", ")", "and", "infected", "wild", "-", "type", "and", "stat6", "-", "/", "-", "iBMDMs", "for", "60", "or", "120", "min", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Immunoblot analysis of the levels of the indicated proteins in lysates from non-infected (ni) and infected wild-type iBMDMs for 60 or 120 min.C. Immunoblot analysis of Klf4 and tubulin levels in lysates from non-infected (ni) and infected wild-type iBMDMs for 60 or 120 min.H. Immunoblot analysis of Arg1 and tubulin levels in lysates from non-infected (ni) and infected wild-type and stat6-/- iBMDMs for 60 or 120 min."}
{"words": ["Figure", "3D", ".", "Immunofluorescence", "confocal", "microscopy", "of", "the", "colocalization", "of", "Kp52145", "harbouring", "pFPV25", ".", "1Cm", ",", "and", "cresyl", "violet", "dye", "in", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "stat6", "-", "/", "-", "macrophages", ".", "The", "images", "were", "taken", "90", "min", "post", "infection", ".", "Images", "are", "representative", "of", "duplicate", "coverslips", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "E", ".", "Percentage", "of", "Kp52145", "harbouring", "pFPV25", ".", "1Cm", "co", "-", "localization", "with", "cresyl", "violet", "over", "a", "time", "course", ".", "Values", "are", "given", "as", "mean", "percentage", "of", "Kp52145", "co", "-", "localizing", "with", "the", "marker", " ", "±", " ", "SEM", ".", "The", "number", "of", "infected", "cells", "counted", "per", "time", "in", "three", "independent", "experiments", "are", "indicated", "in", "the", "figure", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3D. Immunofluorescence confocal microscopy of the colocalization of Kp52145 harbouring pFPV25.1Cm, and cresyl violet dye in wild-type (WT) and stat6-/- macrophages. The images were taken 90 min post infection. Images are representative of duplicate coverslips of three independent experiments. E. Percentage of Kp52145 harbouring pFPV25.1Cm co-localization with cresyl violet over a time course. Values are given as mean percentage of Kp52145 co-localizing with the marker ± SEM. The number of infected cells counted per time in three independent experiments are indicated in the figure."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "phospho", "-", "STAT6", "(", "pSTAT6", ")", "and", "tubulin", "levels", "in", "lysates", "from", "non", "-", "infected", "(", "ni", ")", "and", "infected", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", ",", "tlr2", "-", "/", "-", ",", "tlr4", "-", "/", "-", "and", "tlr2", "/", "4", "-", "/", "-", "iBMDMs", "for", "60", "or", "120", "min", ".", "B", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "Arg1and", "tubulin", "levels", "in", "lysates", "from", "non", "-", "infected", "(", "ni", ")", "and", "infected", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", ",", "tlr2", "-", "/", "-", ",", "tlr4", "-", "/", "-", "and", "tlr2", "/", "4", "-", "/", "-", "iBMDMs", "for", "60", "or", "120", "min", ".", "F", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "phospho", "-", "STAT6", "(", "pSTAT6", ")", "and", "tubulin", "levels", "in", "lysates", "from", "non", "-", "infected", "(", "ni", ")", "and", "infected", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", ",", "myd88", "-", "/", "-", ",", "tram", "/", "trif", "-", "/", "-", "for", "60", "or", "120", "min", ".", "G", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "Arg1", "and", "tubulin", "levels", "in", "lysates", "from", "non", "-", "infected", "(", "ni", ")", "and", "infected", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", ",", "myd88", "-", "/", "-", ",", "tram", "/", "trif", "-", "/", "-", "for", "60", "or", "120", "min", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. Immunoblot analysis of phospho-STAT6 (pSTAT6) and tubulin levels in lysates from non-infected (ni) and infected wild-type (WT), tlr2-/-, tlr4-/- and tlr2/4-/- iBMDMs for 60 or 120 min. B. Immunoblot analysis of Arg1and tubulin levels in lysates from non-infected (ni) and infected wild-type (WT), tlr2-/-, tlr4-/- and tlr2/4-/- iBMDMs for 60 or 120 min.F. Immunoblot analysis of phospho-STAT6 (pSTAT6) and tubulin levels in lysates from non-infected (ni) and infected wild-type (WT), myd88-/-, tram/trif-/- for 60 or 120 min. G. Immunoblot analysis of Arg1 and tubulin levels in lysates from non-infected (ni) and infected wild-type (WT), myd88-/-, tram/trif-/- for 60 or 120 min."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "phospho", "-", "STAT6", "(", "pSTAT6", ")", "and", "tubulin", "levels", "in", "lysates", "from", "non", "-", "infected", "(", "ni", ")", "and", "infected", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", ",", "or", "ifnar1", "-", "/", "-", "for", "60", "or", "120", "min", ".", "B", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "Arg1", "and", "tubulin", "levels", "in", "lysates", "from", "non", "-", "infected", "(", "ni", ")", "and", "infected", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", ",", "or", "ifnar1", "-", "/", "-", "for", "60", "or", "120", "min", ".", "K", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "phospho", "-", "STAT6", "(", "pSTAT6", ")", "and", "tubulin", "levels", "in", "lysates", "from", "non", "-", "infected", "(", "ni", ")", "and", "infected", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", ",", "or", "irf3", "-", "/", "-", "for", "60", "or", "120", "min", ".", "L", "Immunoblot", "analysis", "of", "Arg1", "and", "tubulin", "levels", "in", "lysates", "from", "non", "-", "infected", "(", "ni", ")", "and", "infected", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", ",", "or", "irf31", "-", "/", "-", "for", "60", "or", "120", "min", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. Immunoblot analysis of phospho-STAT6 (pSTAT6) and tubulin levels in lysates from non-infected (ni) and infected wild-type (WT), or ifnar1-/- for 60 or 120 min. B. Immunoblot analysis of Arg1 and tubulin levels in lysates from non-infected (ni) and infected wild-type (WT), or ifnar1-/- for 60 or 120 min.K. Immunoblot analysis of phospho-STAT6 (pSTAT6) and tubulin levels in lysates from non-infected (ni) and infected wild-type (WT), or irf3-/- for 60 or 120 min. L Immunoblot analysis of Arg1 and tubulin levels in lysates from non-infected (ni) and infected wild-type (WT), or irf31-/- for 60 or 120 min."}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "phospho", "-", "CREB", "(", "pCREB", ")", "and", "tubulin", "levels", "in", "lysates", "from", "non", "-", "infected", "(", "ni", ")", "and", "infected", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", ",", "or", "tlr4", "-", "/", "-", "for", "60", "or", "120", "min", ".", "B", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "phospho", "-", "CREB", "(", "pCREB", ")", "and", "tubulin", "levels", "in", "lysates", "from", "non", "-", "infected", "(", "ni", ")", "and", "infected", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", ",", "or", "myd88", "-", "/", "-", "for", "60", "or", "120", "min", ".", "D", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "phospho", "-", "STAT6", "(", "pSTAT6", ")", "and", "tubulin", "levels", "in", "lysates", "from", "non", "-", "infected", "(", "ni", ")", "and", "infected", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", ",", "or", "il10", "-", "/", "-", "for", "60", "or", "120", "min", ".", "F", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "Arg1", "and", "tubulin", "levels", "in", "lysates", "from", "non", "-", "infected", "(", "ni", ")", "and", "infected", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", ",", "or", "il10", "-", "/", "-", "for", "60", "or", "120", "min", ".", "L", ".", "Immunofluorescence", "confocal", "microscopy", "of", "the", "colocalization", "of", "Kp52145", "harbouring", "pFPV25", ".", "1Cm", ",", "and", "cresyl", "violet", "dye", "in", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "il10", "-", "/", "-", "macrophages", ".", "The", "images", "were", "taken", "90", "min", "post", "infection", ".", "Images", "are", "representative", "of", "duplicate", "coverslips", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "M", ".", "Percentage", "of", "Kp52145", "harbouring", "pFPV25", ".", "1Cm", "co", "-", "localization", "with", "cresyl", "violet", "over", "a", "time", "course", "in", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "and", "il10", "-", "/", "-", "macrophages", ".", "Values", "are", "given", "as", "mean", "percentage", "of", "Kp52145", "co", "-", "localizing", "with", "the", "marker", " ", "±", " ", "SEM", ".", "The", "number", "of", "infected", "cells", "counted", "per", "time", "in", "three", "independent", "experiments", "are", "indicated", "in", "the", "figure", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A. Immunoblot analysis of phospho-CREB (pCREB) and tubulin levels in lysates from non-infected (ni) and infected wild-type (WT), or tlr4-/- for 60 or 120 min. B. Immunoblot analysis of phospho-CREB (pCREB) and tubulin levels in lysates from non-infected (ni) and infected wild-type (WT), or myd88-/- for 60 or 120 min.D. Immunoblot analysis of phospho-STAT6 (pSTAT6) and tubulin levels in lysates from non-infected (ni) and infected wild-type (WT), or il10-/- for 60 or 120 min.F. Immunoblot analysis of Arg1 and tubulin levels in lysates from non-infected (ni) and infected wild-type (WT), or il10-/- for 60 or 120 min.L. Immunofluorescence confocal microscopy of the colocalization of Kp52145 harbouring pFPV25.1Cm, and cresyl violet dye in wild-type (WT) and il10-/- macrophages. The images were taken 90 min post infection. Images are representative of duplicate coverslips of three independent experiments. M. Percentage of Kp52145 harbouring pFPV25.1Cm co-localization with cresyl violet over a time course in wild-type (WT) and il10-/- macrophages. Values are given as mean percentage of Kp52145 co-localizing with the marker ± SEM. The number of infected cells counted per time in three independent experiments are indicated in the figure."}
{"words": ["Figure", "7A", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "phospho", "-", "STAT6", "(", "pSTAT6", ")", "and", "tubulin", "levels", "in", "lysates", "from", "wild", "-", "type", "macrophages", "non", "-", "infected", "(", "ni", ")", ",", "or", "infected", "with", "Kp52145", "or", "the", "LPS", "O", "-", "polysaccharide", "mutant", ",", "strain", "52145", "-", "Δglf", ",", "for", "60", "or", "120", "min", ".", "C", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "phospho", "-", "STAT6", "(", "pSTAT6", ")", "and", "tubulin", "levels", "in", "lysates", "from", "wild", "-", "type", "macrophages", "non", "-", "infected", "(", "ni", ")", ",", "or", "infected", "with", "Kp52145", "or", "the", "CPS", "mutant", ",", "strain", "52145", "-", "ΔwcaK2", ",", "for", "60", "or", "120", "min", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A. Immunoblot analysis of phospho-STAT6 (pSTAT6) and tubulin levels in lysates from wild-type macrophages non-infected (ni), or infected with Kp52145 or the LPS O-polysaccharide mutant, strain 52145-Δglf, for 60 or 120 min.C. Immunoblot analysis of phospho-STAT6 (pSTAT6) and tubulin levels in lysates from wild-type macrophages non-infected (ni), or infected with Kp52145 or the CPS mutant, strain 52145-ΔwcaK2, for 60 or 120 min."}
{"words": ["Figure", "8A", ".", "arg1", "mRNA", "levels", "were", "assessed", "by", "qPCR", "in", "hM", "-", "CSF", "-", "treated", "PBMCs", "from", "6", "donors", "non", "-", "infected", "(", "ni", ")", "or", "infected", "Kp52145", "for", "1", ",", "3", "or", "5", "h", ".", "D", ".", "ido", "mRNA", "levels", "were", "assessed", "by", "qPCR", "in", "hM", "-", "CSF", "-", "treated", "PBMCs", "from", "6", "donors", "non", "-", "infected", "(", "ni", ")", "or", "infected", "Kp52145", "for", "1", ",", "3", "or", "5", "h", ".", "B", ".", "il10", "mRNA", "levels", "were", "assessed", "by", "qPCR", "in", "M", "-", "CSF", "-", "treated", "PBMCs", "from", "6", "donors", "non", "-", "infected", "(", "ni", ")", "or", "infected", "Kp52145", "for", "1", ",", "3", "or", "5", "h", ".", "C", ".", "chi3l", "mRNA", "levels", "were", "assessed", "by", "qPCR", "in", "hM", "-", "CSF", "-", "treated", "PBMCs", "from", "6", "donors", "non", "-", "infected", "(", "ni", ")", "or", "infected", "Kp52145", "for", "1", ",", "3", "or", "5", "h", ".", "E", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "phospho", "-", "STAT6", "(", "pSTAT6", ")", "and", "tubulin", "levels", "in", "lysates", "from", "PMA", "-", "treated", "THP", "-", "1", "macrophages", "non", "-", "infected", "(", "ni", ")", ",", "or", "infected", "with", "Kp52145", "for", "60", "or", "120", "minO", ".", "Immunoblot", "analysis", "of", "phospho", "-", "STAT6", "(", "pSTAT6", ")", "and", "tubulin", "levels", "in", "lysates", "from", "PMA", "-", "treated", "THP", "-", "1", "macrophages", "non", "-", "infected", "(", "ni", ")", ",", "or", "infected", "with", "Kp52145", "or", "the", "CPS", "mutant", ",", "strain", "52145", "-", "ΔwcaK2", ",", "for", "60", "or", "120", "min", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8A. arg1 mRNA levels were assessed by qPCR in hM-CSF-treated PBMCs from 6 donors non-infected (ni) or infected Kp52145 for 1, 3 or 5 h. D. ido mRNA levels were assessed by qPCR in hM-CSF-treated PBMCs from 6 donors non-infected (ni) or infected Kp52145 for 1, 3 or 5 h.B. il10 mRNA levels were assessed by qPCR in M-CSF-treated PBMCs from 6 donors non-infected (ni) or infected Kp52145 for 1, 3 or 5 h. C. chi3l mRNA levels were assessed by qPCR in hM-CSF-treated PBMCs from 6 donors non-infected (ni) or infected Kp52145 for 1, 3 or 5 h.E. Immunoblot analysis of phospho-STAT6 (pSTAT6) and tubulin levels in lysates from PMA-treated THP-1 macrophages non-infected (ni), or infected with Kp52145 for 60 or 120 minO. Immunoblot analysis of phospho-STAT6 (pSTAT6) and tubulin levels in lysates from PMA-treated THP-1 macrophages non-infected (ni), or infected with Kp52145 or the CPS mutant, strain 52145-ΔwcaK2, for 60 or 120 min."}
{"words": ["Figure", "1", ".", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", ".", "For", "weigh", "loss", "record", ",", "hACE2", "mice", "(", "n", "=", "7", ")", "and", "WT", "mice", "(", "n", "=", "3", ")", "were", "experimentally", "challenged", "intranasally", "with", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", ",", "and", "the", "ACE2", "-", "Mock", "mice", "(", "n", "=", "3", ")", "were", "used", "as", "control", ".", "And", "then", "the", "weight", "loss", "was", "recorded", "over", "14", "days", "(", "a", ",", "ANOVA", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "To", "screen", "virus", "replication", ",", "12", "mice", "were", "infected", "in", "each", "group", ",", "and", "3", "mice", "per", "group", "were", "sacrificed", "and", "their", "major", "organs", "harvested", "for", "viral", "load", "and", "virus", "titer", "at", "1", "dpi", ",", "3", "dpi", ",", "5", "dpi", "and", "7", "dpi", "respectively", ".", "The", "distribution", "of", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "in", "the", "primary", "organs", "of", "ACE2", "-", "HB", "-", "01", "mice", "was", "detected", "by", "qRT", "-", "PCR", "(", "b", ")", ".", "Virus", "titers", "of", "lungs", "were", "determined", "on", "Vero", "E6", "cells", "(", "c", ",", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", "the", "virus", "isolated", "from", "lungs", "of", "ACE2", "-", "HB", "-", "01", "mice", "at", "3", "dpi", "was", "observed", "by", "electron", "microscope", "(", "d", ")", ".", "The", "specific", "IgG", "against", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "was", "detected", "at", "21", "dpi", "by", "ELISA", "(", "e", ",", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1.SARS-CoV-2.For weigh loss record, hACE2 mice (n=7) and WT mice (n=3) were experimentally challenged intranasally with SARS-CoV-2, and the ACE2-Mock mice (n=3) were used as control. And then the weight loss was recorded over 14 days (a, ANOVA, ***p<0.001).To screen virus replication, 12 mice were infected in each group, and 3 mice per group were sacrificed and their major organs harvested for viral load and virus titer at 1 dpi, 3 dpi, 5 dpi and 7 dpi respectively. The distribution of SARS-CoV-2 in the primary organs of ACE2-HB-01 mice was detected by qRT-PCR (b).Virus titers of lungs were determined on Vero E6 cells (c, unpaired t-test, ***p<0.001)the virus isolated from lungs of ACE2-HB-01 mice at 3 dpi was observed by electron microscope (d).The specific IgG against SARS-CoV-2 was detected at 21 dpi by ELISA (e, unpaired t-test, ***p<0.001)."}
{"words": ["Figure", "2", ".", "mice", ".", "a", ".", "Gross", "pathology", "and", "histopathology", "of", "lungs", "from", "WT", "-", "HB", "-", "01", "mice", "(", "3", "dpi", ")", ",", "ACE2", "-", "Mock", "mice", "(", "3", "dpi", ")", "and", "ACE2", "-", "HB", "-", "01", "mice", "(", "3", "dpi", "and", "5", "dpi", ")", ".", "Postmortem", "examinations", "showed", "focal", "dark", "red", "lesions", "(", "red", "arrow", ")", "throughout", "the", "dorsal", "of", "the", "right", "middle", "lobe", "of", "the", "lung", "at", "3dpi", ".", "The", "lesions", "progressed", "into", "multifocally", "scattered", "-", "dark", "reddish", "purple", "areas", "and", "palpable", "nodules", "(", "red", "arrow", ")", "throughout", "the", "right", "lobe", "of", "the", "lung", "at", "5", "dpi", ".", "Histopathological", "observation", "indicated", "that", "moderate", "interstitial", "pneumonia", "with", "thickened", "alveolar", "septa", "(", "black", "arrows", ")", "and", "infiltration", "of", "lymphocytes", "(", "red", "arrows", ")", ".", "The", "swollen", "and", "degenerative", "alveolar", "macrophages", "(", "green", "arrows", ")", "are", "scattered", "within", "the", "alveolar", "cavities", "at", "3dpi", "and", "5", "dpi", ".", "b", ".", "Immunohistochemical", "examination", "of", "lungs", "of", "each", "group", ".", "The", "sequential", "sections", "were", "stained", "by", "HE", "and", "IHC", ",", "respectively", ".", "The", "viral", "antigens", "were", "observed", "in", "the", "alveolar", "macrophage", "(", "green", "arrows", ")", ",", "the", "alveolar", "epithelia", "(", "blue", "arrows", ")", ",", "and", "the", "degenerative", "and", "being", "desquamated", "bronchial", "epithelial", "cells", "(", "black", "arrows", ")", ".", "Black", "bar", "=", "100", "µm", ",", "red", "bar", "=", "50", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2.mice.a. Gross pathology and histopathology of lungs from WT-HB-01 mice (3 dpi), ACE2-Mock mice (3 dpi) and ACE2-HB-01 mice (3 dpi and 5 dpi). Postmortem examinations showed focal dark red lesions (red arrow) throughout the dorsal of the right middle lobe of the lung at 3dpi. The lesions progressed into multifocally scattered-dark reddish purple areas and palpable nodules (red arrow) throughout the right lobe of the lung at 5 dpi. Histopathological observation indicated that moderate interstitial pneumonia with thickened alveolar septa (black arrows) and infiltration of lymphocytes (red arrows). The swollen and degenerative alveolar macrophages (green arrows) are scattered within the alveolar cavities at 3dpi and 5 dpi.b. Immunohistochemical examination of lungs of each group. The sequential sections were stained by HE and IHC, respectively. The viral antigens were observed in the alveolar macrophage (green arrows), the alveolar epithelia (blue arrows), and the degenerative and being desquamated bronchial epithelial cells (black arrows). Black bar = 100 µm, red bar = 50 µm."}
{"words": ["Figure", "3", ".", "Immunofluorescence", "analysis", "of", "viral", "antigens", "in", "lungs", "of", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "-", "infected", "hACE2", "mice", ".", "Co", "-", "localization", "of", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "S", "protein", "and", "hACE2", "receptor", "in", "hACE2", "mouse", "lungs", ",", "the", "sections", "were", "incubated", "with", "anti", "-", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "S", "protein", "antibody", ",", "anti", "-", "human", "ACE2", "antibody", ",", "and", "DAPI", ".", "The", "lung", "sections", "of", "ACE2", "-", "Mock", "mice", "(", "a", "-", "d", ")", ".", "The", "lung", "sections", "of", "ACE2", "-", "HB", "-", "01", "mice", "(", "e", "-", "h", ")", ".", "The", "white", "arrows", "showed", "the", "viral", "S", "protein", "(", "f", ")", "and", "hACE2", "(", "g", ")", ",", "respectively", ",", "the", "yellow", "arrow", "showed", "the", "merge", "of", "viral", "S", "protein", "and", "hACE2", "(", "h", ")", ".", "White", "bar", "=", "25", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3. Immunofluorescence analysis of viral antigens in lungs of SARS-CoV-2-infected hACE2 mice.Co-localization of SARS-CoV-2 S protein and hACE2 receptor in hACE2 mouse lungs, the sections were incubated with anti-SARS-CoV-2 S protein antibody, anti-human ACE2 antibody, and DAPI. The lung sections of ACE2-Mock mice (a-d). The lung sections of ACE2-HB-01 mice (e-h). The white arrows showed the viral S protein (f) and hACE2 (g), respectively, the yellow arrow showed the merge of viral S protein and hACE2 (h). White bar=25 µm. "}
{"words": ["Figure", "1", "(", "C", ")", "Clonal", "cell", "lines", "expressing", "p53", "-", "Venus", "were", "engineered", "to", "monitor", "p53", "expression", "dynamics", "(", "\"", "input", "\"", ")", "and", "two", "canonically", "regulated", "p53", "target", "promoters", "expressing", "mCherry", "(", "\"", "output", "\"", ")", "in", "response", "to", "Nutlin", "-", "3", "treatment", ".", "(", "D", ")", "Representative", "phase", "contrast", "and", "yellow", "fluorescent", "(", "indicating", "p53", "-", "Venus", "levels", ")", "images", "at", "the", "indicated", "time", "points", "for", "a", "cell", "exposed", "to", "the", "\"", "natural", "dynamics", "\"", "Nutlin", "-", "3", "dosing", "regimen", ".", "(", "E", "-", "F", ")", "p53", "-", "Venus", "expression", "in", "response", "to", "the", "\"", "natural", "dynamics", "\"", "Nutlin", "-", "3", "dosing", "regimen", ".", "Single", "cell", "traces", "(", "gray", ";", "E", ")", "and", "the", "mean", "(", "red", ";", "E", ")", "are", "shown", "for", "p53", "-", "Venus", "expression", "in", "response", "to", "each", "Nutlin", "-", "3", "regimen", ".", "Heat", "map", "(", "F", ")", "shows", "an", "alternative", "representation", "of", "all", "traces", "as", "shown", "in", "(", "E", ")", ".", "N", "=", "51", "cells", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(C) Clonal cell lines expressing p53-Venus were engineered to monitor p53 expression dynamics (\"input\") and two canonically regulated p53 target promoters expressing mCherry (\"output\") in response to Nutlin-3 treatment.(D) Representative phase contrast and yellow fluorescent (indicating p53-Venus levels) images at the indicated time points for a cell exposed to the \"natural dynamics\" Nutlin-3 dosing regimen.(E-F) p53-Venus expression in response to the \"natural dynamics\" Nutlin-3 dosing regimen. Single cell traces (gray; E) and the mean (red; E) are shown for p53-Venus expression in response to each Nutlin-3 regimen. Heat map (F) shows an alternative representation of all traces as shown in (E). N = 51 cells."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Representative", "phase", "contrast", ",", "yellow", "fluorescent", "(", "indicating", "p53", "-", "Venus", "levels", ")", ",", "and", "red", "fluorescent", "(", "indicating", "reporter", "mCherry", "levels", ")", "images", "at", "the", "indicated", "time", "points", "for", "MDM2", "promoter", "reporter", "cells", "exposed", "to", "the", "\"", "natural", "dynamics", "\"", "Nutlin", "-", "3", "dosing", "regimen", ".", "(", "B", "-", "G", ")", "Single", "cell", "traces", "of", "mCherry", "expression", "for", "the", "\"", "responding", "\"", "(", "light", "gray", ")", "or", "\"", "not", "responding", "\"", "(", "dark", "gray", ")", "MDM2", "promoter", "or", "CDKN1A", "promoter", "cells", "exposed", "to", "the", "natural", "dynamics", "(", "B", ")", ",", "low", "amplitude", "(", "D", ")", ",", "high", "amplitude", "(", "D", ")", ",", "high", "frequency", "(", "E", ")", ",", "low", "frequency", "/", "short", "duration", "(", "F", ")", ",", "or", "long", "duration", "(", "G", ")", "Nutlin", "-", "3", "dosing", "regimens", ".", "The", "average", "trace", "for", "responding", "and", "not", "responding", "cells", "is", "shown", "in", "red", "and", "blue", ",", "respectively", ".", "Heat", "maps", "show", "alternative", "representation", "of", "all", "single", "cell", "traces", "below", "each", "associated", "time", "course", "plot", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Representative phase contrast, yellow fluorescent (indicating p53-Venus levels), and red fluorescent (indicating reporter mCherry levels) images at the indicated time points for MDM2 promoter reporter cells exposed to the \"natural dynamics\" Nutlin-3 dosing regimen.(B-G) Single cell traces of mCherry expression for the \"responding\" (light gray) or \"not responding\" (dark gray) MDM2 promoter or CDKN1A promoter cells exposed to the natural dynamics (B), low amplitude (D), high amplitude (D), high frequency (E), low frequency/short duration (F), or long duration (G) Nutlin-3 dosing regimens. The average trace for responding and not responding cells is shown in red and blue, respectively. Heat maps show alternative representation of all single cell traces below each associated time course plot."}
{"words": ["Figure", "3Dose", "-", "response", "curves", "representing", "the", "rate", "of", "mCherry", "expression", "from", "the", "MDM2", "(", "pink", "dots", ")", "and", "CDKN1A", "(", "purple", "dots", ")", "promoters", "as", "a", "function", "of", "total", "p53", "levels", ".", "Values", "of", "expression", "levels", "were", "averaged", "across", "all", "cells", "in", "the", "first", "15", "-", "h", "response", "to", "the", "long", "duration", "Nutlin", "-", "3", "dosing", "regimen", ".", "Solid", "black", "lines", "represent", "the", "best", "fit", "to", "a", "Hill", "function", "model", "of", "promoter", "activation", ".", "Dashed", "lines", "indicate", "the", "half", "-", "maximal", "threshold", "of", "p53", "levels", "for", "promoter", "activation", "and", "the", "half", "maximal", "promoter", "activity", "for", "each", "promoter", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Dose-response curves representing the rate of mCherry expression from the MDM2 (pink dots) and CDKN1A (purple dots) promoters as a function of total p53 levels. Values of expression levels were averaged across all cells in the first 15-h response to the long duration Nutlin-3 dosing regimen. Solid black lines represent the best fit to a Hill function model of promoter activation. Dashed lines indicate the half-maximal threshold of p53 levels for promoter activation and the half maximal promoter activity for each promoter."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "B", "-", "G", ")", "Effects", "of", "p53", "duration", "modulation", "on", "target", "promoter", "activation", "in", "terms", "of", "the", "mean", "timing", "(", "B", ",", "E", ")", ",", "magnitude", "(", "C", ",", "F", ")", ",", "and", "rate", "(", "D", ",", "G", ")", "for", "the", "MDM2", "(", "B", "-", "D", ")", "and", "CDKN1A", "(", "E", "-", "G", ")", "promoters", "in", "response", "to", "short", "(", "light", "green", ")", "and", "long", "(", "dark", "green", ")", "p53", "durations", ".", "N", "=", "at", "least", "45", "cells", "per", "condition", ",", "error", "bars", "=", "SEM", ".", "(", "H", ")", "Mean", "nuclear", "MDM2", "-", "YFP", "levels", "in", "single", "cells", "at", "times", "corresponding", "to", "the", "first", "pulse", "(", "5", ".", "5", "h", ")", "or", "second", "pulse", "(", "11", "h", ")", "of", "p53", "expression", "in", "response", "to", "natural", "and", "long", "duration", "Nutlin", "-", "3", "dosing", "regimens", ".", "N", "=", "at", "least", "40", "cells", "per", "condition", ",", "error", "bars", "=", "SEM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(B-G) Effects of p53 duration modulation on target promoter activation in terms of the mean timing (B, E), magnitude (C, F), and rate (D, G) for the MDM2 (B-D) and CDKN1A (E-G) promoters in response to short (light green) and long (dark green) p53 durations. N = at least 45 cells per condition, error bars = SEM.(H) Mean nuclear MDM2-YFP levels in single cells at times corresponding to the first pulse (5.5 h) or second pulse (11 h) of p53 expression in response to natural and long duration Nutlin-3 dosing regimens. N = at least 40 cells per condition, error bars = SEM."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Effects", "of", "p53", "frequency", "modulation", "on", "target", "promoter", "activation", "in", "terms", "of", "the", "mean", "timing", "(", "A", ",", "D", ")", ",", "magnitude", "(", "B", ",", "E", ")", ",", "and", "rate", "(", "C", ",", "F", ")", "for", "the", "MDM2", "(", "A", "-", "C", ")", "and", "CDKN1A", "(", "D", "-", "F", ")", "promoters", "in", "response", "to", "low", "(", "light", "blue", ")", ",", "natural", "(", "medium", "blue", ")", ",", "high", "(", "dark", "blue", ")", "p53", "frequencies", ".", "N", "=", "at", "least", "45", "cells", "per", "condition", ",", "error", "bars", "=", "SEM", ".", "(", "H", ")", "Percentage", "of", "responding", "cells", "for", "the", "MDM2", "and", "CDKN1A", "promoters", "in", "response", "to", "low", ",", "natural", ",", "and", "high", "frequency", "p53", "pulses", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Effects of p53 frequency modulation on target promoter activation in terms of the mean timing (A, D), magnitude (B, E), and rate (C, F) for the MDM2 (A-C) and CDKN1A (D-F) promoters in response to low (light blue), natural (medium blue), high (dark blue) p53 frequencies. N = at least 45 cells per condition, error bars = SEM.(H) Percentage of responding cells for the MDM2 and CDKN1A promoters in response to low, natural, and high frequency p53 pulses."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", "-", "B", ")", "Representative", "phase", "contrast", ",", "red", "fluorescence", "(", "indicating", "geminin", "-", "mCherry", "levels", ")", ",", "and", "yellow", "fluorescence", "(", "indicating", "p53", "-", "Venus", "levels", ")", "images", "of", "cells", "in", "response", "to", "a", "low", "(", "A", ")", "or", "high", "(", "B", ")", "frequency", "Nutlin", "-", "3", "dosing", "regimen", "over", "40", "h", ".", "(", "C", ")", "Geminin", "-", "mCherry", "traces", "in", "single", "cells", "treated", "with", "the", "low", ",", "natural", ",", "or", "high", "frequency", "Nutlin", "-", "3", "dosing", "regimens", ".", "N", "=", "at", "least", "50", "cells", "per", "condition", ".", "Percentage", "of", "cells", "undergoing", "cell", "division", "(", "D", ")", "within", "the", "40", "h", "imaging", "in", "response", "to", "the", "low", ",", "natural", ",", "and", "high", "frequency", "Nutlin", "-", "3", "dosing", "regimensPercentage", "of", "cells", "positive", "for", "geminin", "-", "mCherry", "expression", "(", "E", ")", "within", "the", "40", "h", "imaging", "in", "response", "to", "the", "low", ",", "natural", ",", "and", "high", "frequency", "Nutlin", "-", "3", "dosing"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A-B) Representative phase contrast, red fluorescence (indicating geminin-mCherry levels), and yellow fluorescence (indicating p53-Venus levels) images of cells in response to a low (A) or high (B) frequency Nutlin-3 dosing regimen over 40 h.(C) Geminin-mCherry traces in single cells treated with the low, natural, or high frequency Nutlin-3 dosing regimens. N = at least 50 cells per condition.Percentage of cells undergoing cell division (D) within the 40 h imaging in response to the low, natural, and high frequency Nutlin-3 dosing regimensPercentage of cells positive for geminin-mCherry expression (E) within the 40 h imaging in response to the low, natural, and high frequency Nutlin-3 dosing regimens"}
{"words": ["Figure", "1A", "Representative", "immunofluorescence", "for", "PH3", "(", "green", ")", ",", "combined", "with", "DAPI", "staining", "(", "white", ")", ",", "of", "E14", ".", "5", "wildtype", "(", "WT", ")", "and", "11B", "mouse", "dorsolateral", "neocortex", "rostrally", ".", "B", "Representative", "immunofluorescence", "for", "pVim", "(", "yellow", ")", ",", "combined", "with", "DAPI", "staining", "(", "white", ")", ",", "of", "E14", ".", "5", "WT", "and", "11B", "mouse", "dorsolateral", "neocortex", "rostrally", ".", "Boxes", "(", "50", "µm", "x", "65", "µm", ")", "in", "(", "B", ")", "indicate", "areas", "that", "are", "shown", "at", "higher", "magnification", "in", "(", "B", "'", ")", ".", "Arrow", ",", "pVim", "+", "BP", "with", "basal", "process", "(", "mitotic", "bRG", ")", ";", "notched", "arrowheads", ",", "basal", "process", ";", "arrowhead", ",", "pVim", "+", "BP", "without", "basal", "process", "(", "mitotic", "bIP", ")", ".", "C", "-", "E", "Quantification", "of", "PH3", "+", "APs", "(", "C", ")", ",", "PH3", "+", "BPs", "(", "D", ")", "and", "pVim", "+", "bRG", "(", "E", "left", ")", "and", "bIPs", "(", "E", "right", ")", "in", "a", "200", "µm", "-", "wide", "field", "of", "E14", ".", "5", "WT", "(", "white", ")", "and", "11B", "(", "black", ")", "mouse", "dorsolateral", "neocortex", "rostrally", ".", "Note", "the", "difference", "in", "ordinate", "scales", "in", "(", "E", ")", ".", "F", "Data", "information", ":", "Images", "are", "single", "optical", "sections", "Scale", "bars", ",", "50", "µm", "10", "µm", "Data", "are", "the", "mean", "of", "6", "-", "19", "(", "WT", ")", "and", "6", "-", "26", "(", "11B", ")", "littermate", "embryos", ",", "which", "were", "derived", "from", "3", "-", "9", "separate", "litters", ".", "Error", "bars", "indicate", "SD", ",", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "P", "=", "0", ".", "0269", "(", "D", ")", ";", "P", "=", "0", ".", "0302", "(", "E", ",", "left", ")", ";", "P", "=", "0", ".", "0139", "(", "E", ",", "right", ")", "F", "Representative", "immunofluorescence", "for", "Pax6", "(", "cyan", ")", "and", "Tbr2", "(", "magenta", ")", ",", "combined", "with", "DAPI", "staining", "(", "white", ")", ",", "of", "E14", ".", "5", "WT", "and", "11B", "mouse", "dorsolateral", "neocortex", "rostrally", ".", "Boxes", "(", "25", "µm", "x", "25", "µm", ")", "in", "(", "F", ")", "indicate", "areas", "that", "are", "shown", "at", "higher", "magnification", "in", "(", "F", "'", ")", ".", "Outlined", "by", "dashed", "white", "lines", ",", "Pax6", "+", "&", "Tbr2", "+", "BP", ";", "outlined", "by", "solid", "white", "lines", ",", "Pax6", "+", "&", "Tbr2", "-", "BP", ".", "G", "-", "K", "Quantification", "of", "Pax6", "+", "&", "Tbr2", "-", "cells", "in", "VZ", "(", "G", ")", ",", "Pax6", "+", "&", "Tbr2", "+", "cells", "in", "VZ", "(", "H", ")", ",", "Pax6", "+", "&", "Tbr2", "-", "cells", "in", "SVZ", "and", "IZ", "(", "I", ")", ",", "Pax6", "+", "&", "Tbr2", "+", "cells", "in", "SVZ", "and", "IZ", "(", "J", ")", "and", "Pax6", "-", "&", "Tbr2", "+", "cells", "in", "SVZ", "and", "IZ", "(", "K", ")", "in", "a", "200", "µm", "-", "wide", "field", "of", "E14", ".", "5", "WT", "(", "white", ")", "and", "11B", "(", "black", ")", "mouse", "dorsolateral", "neocortex", "rostrally", ".", "L", "Data", "information", ":", "Images", "are", "Z", "projections", "of", "4", "optical", "sections", "Scale", "bars", ",", "50", "µm", "10", "µm", "Data", "are", "the", "mean", "of", "6", "-", "19", "(", "WT", ")", "and", "6", "-", "26", "(", "11B", ")", "littermate", "embryos", ",", "which", "were", "derived", "from", "3", "-", "9", "separate", "litters", ".", "Error", "bars", "indicate", "SD", ",", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "P", "=", "0", ".", "0281", "(", "I", ")", ";", "P", "=", "0", ".", "0088", "(", "J", ")", ";", "P", "=", "0", ".", "0014", "(", "K", ")", "L", "-", "N", ",", "Sequential", "BrdU", "-", "EdU", "labelling", ".", "BrdU", "was", "injected", "into", "pregnant", "mice", "at", "E13", ".", "5", ",", "i", ".", "e", ".", "24", "hr", "before", "sacrifice", "at", "E14", ".", "5", ",", "and", "EdU", "was", "injected", "into", "the", "same", "pregnant", "mice", "0", ".", "5", "hr", "before", "sacrifice", "at", "E14", ".", "5", ".", "(", "L", ")", "Representative", "immunofluorescence", "for", "BrdU", "(", "magenta", ")", ",", "combined", "with", "EdU", "staining", "(", "cyan", ")", "and", "DAPI", "staining", "(", "white", ")", ",", "of", "E14", ".", "5", "WT", "and", "11B", "mouse", "dorsolateral", "neocortex", "rostrally", ".", "(", "M", ",", "N", ")", "Quantification", "of", "BrdU", "+", "&", "EdU", "+", "cells", "(", "M", ")", "and", "the", "percentage", "of", "BrdU", "+", "cells", "that", "are", "BrdU", "+", "&", "EdU", "+", "(", "N", ")", "in", "VZ", "and", "SVZ", "in", "a", "200", "µm", "-", "wide", "field", "of", "E14", ".", "5", "WT", "(", "white", ")", "and", "11B", "(", "black", ")", "mouse", "dorsolateral", "neocortex", "rostrally", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "the", "mean", "of", "6", "-", "19", "(", "WT", ")", "and", "6", "-", "26", "(", "11B", ")", "littermate", "embryos", ",", "which", "were", "derived", "from", "3", "-", "9", "separate", "litters", ".", "Error", "bars", "indicate", "SD", ",", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "P", "=", "0", ".", "0049", "(", "M", ",", "SVZ", ")", ";", "P", "=", "0", ".", "0323", "(", "N", ",", "SVZ", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A Representative immunofluorescence for PH3 (green), combined with DAPI staining (white), of E14.5 wildtype (WT) and 11B mouse dorsolateral neocortex rostrally. B Representative immunofluorescence for pVim (yellow), combined with DAPI staining (white), of E14.5 WT and 11B mouse dorsolateral neocortex rostrally. Boxes (50 µm x 65 µm) in (B) indicate areas that are shown at higher magnification in (B'). Arrow, pVim+ BP with basal process (mitotic bRG); notched arrowheads, basal process; arrowhead, pVim+ BP without basal process (mitotic bIP). C-E Quantification of PH3+ APs (C), PH3+ BPs (D) and pVim+ bRG (E left) and bIPs (E right) in a 200 µm-wide field of E14.5 WT (white) and 11B (black) mouse dorsolateral neocortex rostrally. Note the difference in ordinate scales in (E). F Data information: Images are single optical sections Scale bars, 50 µm 10 µm Data are the mean of 6-19 (WT) and 6-26 (11B) littermate embryos, which were derived from 3-9 separate litters. Error bars indicate SD, two-tailed unpaired Student's t-test, * P < 0.05; ** P < 0.01 P = 0.0269 (D); P = 0.0302 (E, left); P = 0.0139 (E, right)F Representative immunofluorescence for Pax6 (cyan) and Tbr2 (magenta), combined with DAPI staining (white), of E14.5 WT and 11B mouse dorsolateral neocortex rostrally. Boxes (25 µm x 25 µm) in (F) indicate areas that are shown at higher magnification in (F'). Outlined by dashed white lines, Pax6+ & Tbr2+ BP; outlined by solid white lines, Pax6+ & Tbr2- BP. G-K Quantification of Pax6+ & Tbr2- cells in VZ (G), Pax6+ & Tbr2+ cells in VZ (H), Pax6+ & Tbr2- cells in SVZ and IZ (I), Pax6+ & Tbr2+ cells in SVZ and IZ (J) and Pax6- & Tbr2+ cells in SVZ and IZ (K) in a 200 µm-wide field of E14.5 WT (white) and 11B (black) mouse dorsolateral neocortex rostrally. L Data information: Images are Z projections of 4 optical sections Scale bars, 50 µm 10 µm Data are the mean of 6-19 (WT) and 6-26 (11B) littermate embryos, which were derived from 3-9 separate litters. Error bars indicate SD, two-tailed unpaired Student's t-test, * P < 0.05; ** P < 0.01 P = 0.0281 (I); P = 0.0088 (J); P = 0.0014 (K)L-N, Sequential BrdU-EdU labelling. BrdU was injected into pregnant mice at E13.5, i.e. 24 hr before sacrifice at E14.5, and EdU was injected into the same pregnant mice 0.5 hr before sacrifice at E14.5. (L) Representative immunofluorescence for BrdU (magenta), combined with EdU staining (cyan) and DAPI staining (white), of E14.5 WT and 11B mouse dorsolateral neocortex rostrally. (M, N) Quantification of BrdU+ & EdU+ cells (M) and the percentage of BrdU+ cells that are BrdU+ & EdU+ (N) in VZ and SVZ in a 200 µm-wide field of E14.5 WT (white) and 11B (black) mouse dorsolateral neocortex rostrally. Data information: Data are the mean of 6-19 (WT) and 6-26 (11B) littermate embryos, which were derived from 3-9 separate litters. Error bars indicate SD, two-tailed unpaired Student's t-test, * P < 0.05; ** P < 0.01 P = 0.0049 (M, SVZ); P = 0.0323 (N, SVZ).  "}
{"words": ["Figure", "2H", "Representative", "immunofluorescence", "for", "Tbr1", "(", "cyan", ")", ",", "Ctip2", "(", "magenta", ")", "and", "Satb2", "(", "green", ")", ",", "combined", "with", "DAPI", "staining", "(", "white", ")", ",", "of", "E18", ".", "5", "WT", "and", "11B", "mouse", "neocortex", "at", "the", "position", "where", "cortical", "thickness", "was", "measured", "(", "A", ",", "red", "lines", ")", ".", "I", "Quantification", "of", "zone", "thickness", "of", "E18", ".", "5", "WT", "(", "white", ")", "and", "11B", "(", "black", ")", "mouse", "neocortex", "at", "the", "position", "where", "cortical", "thickness", "was", "measured", "(", "A", ",", "red", "lines", ")", ".", "J", "Data", "information", ":", "Images", "are", "single", "optical", "sections", "Scale", "bar", ",", "20", "µm", "Data", "are", "the", "mean", "of", "7", "(", "WT", ")", "and", "8", "-", "12", "(", "11B", ")", "littermate", "embryos", ",", "which", "were", "derived", "from", "4", "separate", "litters", ".", "Error", "bars", "indicate", "SD", ".", "Two", "-", "way", "ANOVA", ",", "followed", "by", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "(", "B", "-", "D", ")", ";", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "P", "=", "0", ".", "0287", "(", "I", ",", "IZ", ")", ";", "P", "=", "0", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2H Representative immunofluorescence for Tbr1 (cyan), Ctip2 (magenta) and Satb2 (green), combined with DAPI staining (white), of E18.5 WT and 11B mouse neocortex at the position where cortical thickness was measured (A, red lines). I Quantification of zone thickness of E18.5 WT (white) and 11B (black) mouse neocortex at the position where cortical thickness was measured (A, red lines). J Data information: Images are single optical sections Scale bar, 20 µm Data are the mean of 7 (WT) and 8-12 (11B) littermate embryos, which were derived from 4 separate litters. Error bars indicate SD. Two-way ANOVA, followed by Bonferroni's multiple comparisons test (B-D); two-tailed unpaired Student's t-test P = 0.0287 (I, IZ); P = 0.0039"}
{"words": ["Figure", "3A", "Dorsal", "view", "of", "adult", "wildtype", "(", "WT", ")", "and", "11B", "mouse", "brain", "at", "P56", ".", "Orange", "lines", "illustrate", "the", "measurements", "of", "neocortex", "width", "and", "length", ";", "red", "lines", "illustrate", "the", "measurements", "of", "neocortex", "area", ".", "B", ",", "C", "Quantification", "of", "neocortex", "width", ",", "length", "and", "area", ".", "D", "Data", "information", ":", "Scale", "bar", ",", "1", "mm", "Data", "are", "the", "mean", "of", "8", "(", "WT", ")", "and", "8", "(", "11B", ")", "adult", "littermate", "mice", ".", "Error", "bars", "indicate", "SD", ",", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "P", "<", "0", ".", "0001", "(", "B", ",", "neocortex", "width", ")", ";", "P", "<", "0", ".", "0001", "(", "C", ")", "G", ",", "H", "Representative", "immunofluorescence", "for", "Ctip2", "(", "magenta", ")", ",", "Satb2", "(", "green", ")", "and", "Brn2", "(", "yellow", ")", ",", "combined", "with", "DAPI", "staining", "(", "white", ")", ",", "of", "P56", "adult", "WT", "and", "11B", "mouse", "neocortex", "at", "the", "position", "where", "cortical", "thickness", "was", "measured", "(", "D", ",", "red", "lines", ")", ".", "Data", "information", ":", "Images", "are", "single", "optical", "sections", "Scale", "bar", ",", "20"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Dorsal view of adult wildtype (WT) and 11B mouse brain at P56. Orange lines illustrate the measurements of neocortex width and length; red lines illustrate the measurements of neocortex area. B, C Quantification of neocortex width, length and area. D Data information: Scale bar, 1 mm Data are the mean of 8 (WT) and 8 (11B) adult littermate mice. Error bars indicate SD, two-tailed unpaired Student's t-test , * P < 0.05, ** P < 0.01, **** P < 0.0001. P < 0.0001 (B, neocortex width); P < 0.0001 (C)G, H Representative immunofluorescence for Ctip2 (magenta), Satb2 (green) and Brn2 (yellow), combined with DAPI staining (white), of P56 adult WT and 11B mouse neocortex at the position where cortical thickness was measured (D, red lines). Data information: Images are single optical sections Scale bar, 20 µm"}
{"words": ["Figure", "4IntelliCage", "was", "used", "to", "evaluate", "the", "memory", "flexibility", "of", "adult", "11B", "mice", ".", "Four", "separate", "sessions", "were", "carried", "out", ":", "(", "i", ")", "5", "WT", "males", "together", "with", "5", "11B", "males", ";", "(", "ii", ")", "5", "other", "WT", "males", "together", "with", "5", "other", "11B", "males", ";", "(", "iii", ")", "5", "WT", "females", "together", "with", "7", "11B", "females", ";", "(", "iv", ")", "4", "other", "WT", "females", "together", "with", "8", "other", "11B", "females", ".", "Data", "are", "the", "mean", "of", "the", "total", "10", "males", "(", "WT", ")", ",", "10", "males", "(", "11B", ")", ",", "9", "females", "(", "WT", ")", "and", "15", "females", "(", "11B", ")", "adult", "littermate", "mice", ".", "Data", "points", "were", "obtained", "at", "consecutive", "days", ",", "error", "bars", "indicate", "SD", ".", "(", "A", ",", "B", ")", "Quantification", "of", "the", "discrimination", "error", "rate", "in", "the", "first", "100", "visits", "during", "the", "drinking", "phase", "of", "the", "acquisition", "stage", "of", "adult", "wildtype", "(", "WT", ")", "and", "11B", "mice", "(", "male", ",", "A", ";", "female", ",", "B", ")", "in", "the", "IntelliCage", ".", "Overall", "place", "learning", "performance", "of", "WT", "and", "11B", "mice", "was", "analysed", "using", "two", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Fisher", "'", "s", "LSD", "test", ";", "all", "data", "points", "during", "the", "acquisition", "phase", "were", "included", ".", "For", "males", "(", "A", ")", ",", "WT", "vs", ".", "11B", ",", "P", ">", "0", ".", "05", ";", "data", "over", "time", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "interaction", ",", "P", ">", "0", ".", "05", ".", "For", "females", "(", "B", ")", ",", "WT", "vs", ".", "11B", ",", "P", ">", "0", ".", "05", ";", "data", "over", "time", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ";", "interaction", ",", "P", ">", "0", ".", "05", ".", "Note", "that", "(", "i", ")", "the", "two", "male", "sessions", "and", "the", "two", "female", "sessions", "yielded", "essentially", "the", "same", "results", ",", "and", "(", "ii", ")", "not", "shown", "in", "panels", "the", "two", "separate", "male", "sessions", "yielded", "essentially", "the", "same", "results", ",", "and", "the", "two", "separate", "female", "sessions", "yielded", "essentially", "the", "same", "results", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4IntelliCage was used to evaluate the memory flexibility of adult 11B mice. Four separate sessions were carried out: (i) 5 WT males together with 5 11B males; (ii) 5 other WT males together with 5 other 11B males; (iii) 5 WT females together with 7 11B females; (iv) 4 other WT females together with 8 other 11B females. Data are the mean of the total 10 males (WT), 10 males (11B), 9 females (WT) and 15 females (11B) adult littermate mice. Data points were obtained at consecutive days, error bars indicate SD. (A, B) Quantification of the discrimination error rate in the first 100 visits during the drinking phase of the acquisition stage of adult wildtype (WT) and 11B mice (male, A; female, B) in the IntelliCage. Overall place learning performance of WT and 11B mice was analysed using two-way ANOVA followed by Fisher's LSD test; all data points during the acquisition phase were included. For males (A), WT vs. 11B, P > 0.05; data over time, **** P < 0.0001; interaction, P > 0.05. For females (B), WT vs. 11B, P > 0.05; data over time, **** P < 0.0001; interaction, P > 0.05. Note that (i) the two male sessions and the two female sessions yielded essentially the same results, and (ii) not shown in panels the two separate male sessions yielded essentially the same results, and the two separate female sessions yielded essentially the same results."}
{"words": ["Figure", "1Quantification", "of", "NANOG", "-", "positive", "iPSC", "colonies", "obtained", "after", "14", "days", "of", "OSKM", "induction", "in", "MEFs", "treated", "with", "either", "non", "-", "target", "or", "Kdm3b", "siRNA", "in", "FBS", "media", ".", "Values", "represent", "fold", "change", "over", "non", "-", "target", "control", "providing", "relative", "quantitation", ".", "Quantification", "of", "NANOG", "-", "positive", "iPSC", "colonies", "obtained", "after", "12", "or", "14", "days", "of", "OSKM", "induction", "in", "MEFs", "treated", "with", "either", "non", "-", "targeting", "or", "Kdm3b", "siRNA", "in", "KSR", "media", ".", "Values", "represent", "fold", "change", "over", "non", "-", "target", "control", "providing", "relative", "quantitation", ".", "Quantification", "of", "NANOG", "positive", "colonies", "after", "retroviral", "expression", "of", "OSKM", "(", "Left", ")", "or", "OSK", "(", "Right", ")", "in", "MEF", "treated", "with", "non", "-", "targeting", "or", "siRNA", "targeting", "Kdm3", ".", "Nanog", "counts", "were", "performed", "on", "Day", "16", "for", "OSKM", "or", "Day", "21", "for", "OSK", "reprogramming", ".", "Values", "represent", "fold", "change", "over", "non", "-", "target", "control", "providing", "relative", "quantitation", ".", "Immunoblot", "of", "H3K9me1", "/", "2", "histone", "demethylase", "in", "WT", "or", "Kdm3b", "CRISPR", "targeted", "pre", "-", "iPSC", "clones", ".", "These", "pre", "-", "iPSCs", "carry", "a", "Nanog", "-", "GFP", "reporter", ".", "Parent", "line", "(", "WT", ")", ",", "and", "two", "Kdm3b", "-", "KO", "clones", "using", "gRNA", "targeting", "either", "exon", "1", "(", "KO", "#", "1", ")", "or", "exon", "2", "(", "KO", "#", "2", ")", "are", "shown", ".", "RNA", "Polymerase", "II", "levels", "are", "the", "loading", "control", ".", "Quantification", "of", "Nanog", "-", "GFP", "positive", "cells", "after", "10", "days", "of", "AA", "+", "2i", "treatment", "of", "WT", "or", "Kdm3b", "-", "deleted", "pre", "-", "iPSCs", ".", "Immunoblot", "of", "H3K9", "methylation", "levels", "upon", "addition", "of", "H3K9", "methyltransferase", "inhibitor", "UNC0638", "in", "WT", "or", "Kdm3b", "-", "KO", "pre", "-", "iPSCs", ".", "Quantification", "of", "percent", "Nanog", "-", "GFP", "positive", "cells", "after", "10", "days", "of", "AA", "+", "2i", "or", "AA", "+", "2i", "with", "5µM", "UNC0638", "in", "WT", "or", "Kdm3b", "deleted", "pre", "-", "iPSCs", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Quantification of NANOG-positive iPSC colonies obtained after 14 days of OSKM induction in MEFs treated with either non-target or Kdm3b siRNA in FBS media. Values represent fold change over non-target control providing relative quantitation. Quantification of NANOG-positive iPSC colonies obtained after 12 or 14 days of OSKM induction in MEFs treated with either non-targeting or Kdm3b siRNA in KSR media. Values represent fold change over non-target control providing relative quantitation.Quantification of NANOG positive colonies after retroviral expression of OSKM (Left) or OSK (Right) in MEF treated with non-targeting or siRNA targeting Kdm3. Nanog counts were performed on Day 16 for OSKM or Day 21 for OSK reprogramming. Values represent fold change over non-target control providing relative quantitation.Immunoblot of H3K9me1/2 histone demethylase in WT or Kdm3b CRISPR targeted pre-iPSC clones. These pre-iPSCs carry a Nanog-GFP reporter. Parent line (WT), and two Kdm3b-KO clones using gRNA targeting either exon 1 (KO#1) or exon 2 (KO#2) are shown. RNA Polymerase II levels are the loading control.Quantification of Nanog-GFP positive cells after 10 days of AA+2i treatment of WT or Kdm3b-deleted pre-iPSCs.Immunoblot of H3K9 methylation levels upon addition of H3K9 methyltransferase inhibitor UNC0638 in WT or Kdm3b-KO pre-iPSCs.Quantification of percent Nanog-GFP positive cells after 10 days of AA+2i or AA+2i with 5µM UNC0638 in WT or Kdm3b deleted pre-iPSCs."}
{"words": ["Figure", "2Pearson", "correlation", "of", "transcripts", "per", "million", "(", "TPM", ")", "of", "WT", "and", "Kdm3b", "-", "KO", "pre", "-", "iPSC", "upon", "DMSO", "or", "AA", "+", "2i", "treatment", "for", "2", "or", "10", "days", "and", "mESC", ",", "reprogramming", "populations", "from", "Chronis", "et", ".", "al", "(", "2017", ")", ",", "(", "labelled", "as", "CC", ")", ".", "k", "-", "means", "clustering", "of", "the", "union", "of", "DEG", "(", "FDR", ">", "0", ".", "99", ")", "between", "day", "2", "and", "DMSO", "in", "WT", "and", "Kdm3b", "-", "KO", "pre", "-", "iPSCs", ".", "Values", "represent", "a", "log2", "-", "fold", "change", "of", "day", "2", "over", "DMSO", ".", "Key", "pluripotency", "genes", "are", "shown", "on", "the", "right", ".", "k", "-", "means", "clustering", "of", "the", "union", "of", "DEG", "(", "FDR", ">", "0", ".", "99", ")", "between", "day", "10", "and", "DMSO", "in", "WT", "and", "Kdm3b", "-", "KO", "pre", "-", "iPSCs", ".", "Values", "represent", "a", "log2", "-", "fold", "change", "of", "day", "10", "over", "DMSO", ".", "Key", "pluripotency", "genes", "or", "epigenetic", "regulators", "are", "shown", "on", "the", "right", ".", "Expression", "of", "Tet", "enzymes", "and", "Tdg", "during", "AA", "+", "2i", "treatment", "in", "WT", "or", "Kdm3b", "-", "KO", "pre", "-", "iPSCs", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "standard", "deviation", "of", "two", "biological", "replicates", "from", "the", "RNA", "-", "Seq", "sample", ".", "Quantification", "of", "percent", "Nanog", "-", "GFP", "cells", "of", "WT", ",", "Kdm3b", "-", "KO", "and", "Kdm3b", "-", "KO", "pre", "-", "iPSC", "clones", "expressing", "Tet1", "catalytic", "domain", "(", "Tet1CD", ")", ",", "Nanog", ",", "or", "both", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Pearson correlation of transcripts per million (TPM) of WT and Kdm3b-KO pre-iPSC upon DMSO or AA+2i treatment for 2 or 10 days and mESC, reprogramming populations from Chronis et. al (2017), (labelled as CC).k-means clustering of the union of DEG (FDR > 0.99) between day 2 and DMSO in WT and Kdm3b-KO pre-iPSCs. Values represent a log2-fold change of day 2 over DMSO. Key pluripotency genes are shown on the right. k-means clustering of the union of DEG (FDR > 0.99) between day 10 and DMSO in WT and Kdm3b-KO pre-iPSCs. Values represent a log2-fold change of day 10 over DMSO. Key pluripotency genes or epigenetic regulators are shown on the right.Expression of Tet enzymes and Tdg during AA+2i treatment in WT or Kdm3b-KO pre-iPSCs. Error bars represent the standard deviation of two biological replicates from the RNA-Seq sample.Quantification of percent Nanog-GFP cells of WT, Kdm3b-KO and Kdm3b-KO pre-iPSC clones expressing Tet1 catalytic domain (Tet1CD), Nanog, or both."}
{"words": ["Figure", "3Representative", "5hmC", "profiles", "during", "AA", "+", "2i", "conversion", "of", "WT", "pre", "-", "iPSCs", ".", "Illustration", "of", "the", "5hmC", "pattern", "is", "shown", "in", "the", "bottom", "panel", ".", "Heatmap", "of", "k", "-", "means", "clustered", "5hmC", "patterns", "with", "histone", "modifications", "in", "pre", "-", "iPSCs", "and", "mESCs", "from", "Chronis", "et", "al", "(", "2017", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Representative 5hmC profiles during AA+2i conversion of WT pre-iPSCs. Illustration of the 5hmC pattern is shown in the bottom panel.Heatmap of k-means clustered 5hmC patterns with histone modifications in pre-iPSCs and mESCs from Chronis et al (2017)."}
{"words": ["Figure", "4Representative", "profiles", "of", "regions", "that", "undergo", "demethylation", "through", "a", "5hmC", "intermediate", ".", "Top", "-", "5hmC", "profile", "during", "AA", "+", "2i", "treatment", ".", "Middle", "-", "Percent", "methylation", "via", "bisulfite", "sequencing", "in", "MEFs", "and", "iPSCs", ",", "data", "from", "Rais", "et", "al", "2013", ".", "Bottom", "-", "Percent", "5hmC", "via", "Tet", "-", "assisted", "bisulfite", "sequencing", "of", "MEFs", "expressing", "OSKM", "for", "0", "or", "5", "days", ",", "data", "from", "Hu", "et", "al", "2014", ".", "Left", "-", "Quantification", "of", "percent", "Nanog", "-", "GFP", "positive", "colonies", ".", "Right", "-", "Total", "Nanog", "-", "GFP", "positive", "colonies", "obtained", "after", "ten", "days", "of", "AA", "+", "2i", "treatment", "in", "Tdg", "-", "depleted", "pre", "-", "iPSC", "(", "Tdg", ")", "or", "control", "(", "Empty", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Representative profiles of regions that undergo demethylation through a 5hmC intermediate. Top - 5hmC profile during AA+2i treatment. Middle - Percent methylation via bisulfite sequencing in MEFs and iPSCs, data from Rais et al 2013. Bottom - Percent 5hmC via Tet-assisted bisulfite sequencing of MEFs expressing OSKM for 0 or 5 days, data from Hu et al 2014.Left - Quantification of percent Nanog-GFP positive colonies. Right - Total Nanog-GFP positive colonies obtained after ten days of AA+2i treatment in Tdg-depleted pre-iPSC (Tdg) or control (Empty)."}
{"words": ["Figure", "5Quantification", "of", "percent", "Nanog", "-", "GFP", "positive", "cells", "of", "WT", "or", "Kdm3b", "-", "KO", "pre", "-", "IPSC", "clones", "expressing", "Nanog", ",", "Tet1CD", ",", "or", "Nanog", "+", "Tet1CD", "after", "15", "days", "of", "AA", "+", "2i", "or", "AA", "+", "2i", "with", "4", "or", "5µM", "of", "UNC0638", ".", "Left", "-", "Heatmap", "of", "K", "-", "mean", "clustered", "5hmC", "patterns", "in", "WT", "pre", "-", "iPSC", "with", "5hmC", "profile", "of", "Kdm3b", "-", "KO", "pre", "-", "iPSC", "treated", "with", "AA", "+", "2i", "for", "0", ",", "2", "or", "10", "days", ".", "Middle", "-", "Metaplot", "of", "5hmC", "signal", "on", "day", "10", "between", "WT", "(", "orange", ")", "and", "Kdm3b", "-", "KO", "(", "black", ")", "for", "each", "cluster", ".", "Y", "-", "axis", "scale", "is", "in", "normalized", "coverage", "data", "(", "1x106", "/", "Total", "Count", ")", ".", "Right", "-", "Illustration", "of", "5hmC", "pattern", "in", "WT", "and", "Kdm3b", "-", "KO", "during", "AA", "+", "2i", "treatment", ".", "Representative", "5hmC", "profiles", "during", "AA", "+", "2i", "conversion", "of", "WT", "and", "Kdm3b", "-", "KO", "pre", "-", "iPSC", ".", "Scheme", "for", "identifying", "genes", "with", "both", "misregulated", "5hmC", "and", "expression", ".", "Heatmap", "of", "two", "-", "fold", "misregulated", "5hmC", "and", "two", "-", "fold", "differential", "expression", "between", "WT", "and", "Kdm3b", "-", "KO", "after", "10", "days", "of", "AA", "+", "2i", "treatment", "(", "607", "genes", ")", ".", "Peaks", "are", "sorted", "by", "5hmC", "signal", "in", "WT", ".", "RNA", "seq", "values", "represent", "a", "log2", "-", "fold", "change", "of", "day", "10", "over", "DMSO", "for", "either", "WT", "or", "Kdm3b", "KO", "pre", "-", "iPSCs", ".", "Box", "plot", "of", "expression", "for", "genes", "that", "are", "two", "-", "fold", "misregulated", "5hmC", "and", "expression", "between", "WT", "and", "Kdm3b", "-", "KO", "on", "day", "10", "(", "607", "genes", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Quantification of percent Nanog-GFP positive cells of WT or Kdm3b-KO pre-IPSC clones expressing Nanog, Tet1CD, or Nanog+Tet1CD after 15 days of AA+2i or AA+2i with 4 or 5µM of UNC0638.Left - Heatmap of K-mean clustered 5hmC patterns in WT pre-iPSC with 5hmC profile of Kdm3b-KO pre-iPSC treated with AA+2i for 0, 2 or 10 days. Middle - Metaplot of 5hmC signal on day 10 between WT (orange) and Kdm3b-KO (black) for each cluster. Y-axis scale is in normalized coverage data (1x106/Total Count). Right - Illustration of 5hmC pattern in WT and Kdm3b-KO during AA+2i treatment.Representative 5hmC profiles during AA+2i conversion of WT and Kdm3b-KO pre-iPSC.Scheme for identifying genes with both misregulated 5hmC and expression. Heatmap of two-fold misregulated 5hmC and two-fold differential expression between WT and Kdm3b-KO after 10 days of AA+2i treatment (607 genes). Peaks are sorted by 5hmC signal in WT. RNA seq values represent a log2-fold change of day 10 over DMSO for either WT or Kdm3b KO pre-iPSCs.Box plot of expression for genes that are two-fold misregulated 5hmC and expression between WT and Kdm3b-KO on day 10 (607 genes)."}
{"words": ["Figure", "6Heatmap", "of", "POU5F1", "bound", "peaks", "in", "both", "mESC", "and", "pre", "-", "IPSC", "(", "Cluster", "1", ")", "and", "mESC", "alone", "(", "Cluster", "2", ")", "with", "5hmC", "levels", "during", "Day", "0", ",", "2", "and", "10", "of", "AA", "+", "2i", "treatment", ".", "Metaplots", "of", "POU5F1", "binding", "for", "Cluster", "1", "(", "Left", ")", "and", "Cluster", "2", "(", "Right", ")", "regions", "in", "pre", "-", "iPSCs", "and", "mESCs", ".", "Metaplots", "of", "5hmC", "Enrichment", "for", "Cluster", "1", "(", "Left", ")", "and", "Cluster", "2", "(", "Right", ")", "regions", "for", "Day", "0", ",", "2", "and", "10", "of", "AA", "+", "2i", "treatment", ".", "Left", "-", "Scheme", "for", "identifying", "sites", "that", "lose", "5hmC", "and", "their", "association", "with", "POU5F1", "binding", ".", "Right", "-", "Heatmap", "of", "5hmC", "profile", "during", "AA", "+", "2i", "treatment", "of", "WT", "pre", "-", "iPSC", "and", "POU5F1", "binding", "in", "pre", "-", "iPSCs", "or", "mESCs", "at", "the", "loci", "identified", "in", "the", "left", "panel", ".", "Representative", "5hmC", "profiles", "during", "AA", "+", "2i", "conversion", "of", "WT", "and", "Kdm3b", "-", "KO", "pre", "-", "iPSC", "with", "POU5F1", "binding", "in", "pre", "-", "iPSCs", "and", "mESCs", ".", "Loci", "were", "assigned", "to", "the", "nearest", "gene", ".", "ChIP", "-", "PCR", "for", "POU5F1", "during", "AA", "+", "2i", "reprogramming", "of", "WT", "and", "Kdm3b", "-", "KO", "pre", "-", "iPSCs", ".", "Values", "are", "fold", "change", "of", "enrichment", "between", "WT", "and", "Kdm3b", "KO", "(", "WT", "/", "Kdm3bKO", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Heatmap of POU5F1 bound peaks in both mESC and pre-IPSC (Cluster 1) and mESC alone (Cluster 2) with 5hmC levels during Day 0, 2 and 10 of AA+2i treatment.Metaplots of POU5F1 binding for Cluster 1 (Left) and Cluster 2 (Right) regions in pre-iPSCs and mESCs.Metaplots of 5hmC Enrichment for Cluster 1 (Left) and Cluster 2 (Right) regions for Day 0, 2 and 10 of AA+2i treatment.Left - Scheme for identifying sites that lose 5hmC and their association with POU5F1 binding. Right - Heatmap of 5hmC profile during AA+2i treatment of WT pre-iPSC and POU5F1 binding in pre-iPSCs or mESCs at the loci identified in the left panel.Representative 5hmC profiles during AA+2i conversion of WT and Kdm3b-KO pre-iPSC with POU5F1 binding in pre-iPSCs and mESCs. Loci were assigned to the nearest gene.ChIP-PCR for POU5F1 during AA+2i reprogramming of WT and Kdm3b-KO pre-iPSCs. Values are fold change of enrichment between WT and Kdm3b KO (WT/Kdm3bKO)."}
{"words": ["Figure", "7tSNE", "of", "Tet1", ",", "Tet2", ",", "Nanog", ",", "and", "Cdh1", "expression", "in", "single", "cell", "RNA", "sequencing", "of", "MEF", "undergoing", "OSKM", "reprogramming", "from", "Tran", "et", "al", "2019b", ".", "MEF", ",", "Reprogramming", "(", "REPROG", ")", ",", "and", "mESCs", "cells", "are", "highlighted", "in", "red", "dotted", "lines", ".", "Specific", "reprogramming", "timepoints", "are", "highlighted", "within", "the", "reprogramming", "cluster", "in", "arrows", ".", "Color", "corresponds", "to", "log10", "of", "transcript", "counts", "for", "each", "individual", "cell", ".", "Bar", "graphs", "indicating", "number", "of", "cells", "expressing", "Tet1", ",", "Tet2", ",", "Cdh1", "or", "Nanog", "from", "the", "reprograming", "population", "(", "Day", "3", ",", "6", ",", "9", "and", "12", ")", ".", "Number", "of", "cells", "per", "reprogramming", "population", "is", "highlighted", "within", "legend", ".", "Scheme", "for", "deriving", "Tet1", "and", "Tet2", "double", "knockout", "pre", "-", "iPSC", "lines", ".", "Tet1KO", "/", "KO", "Tet2fl", "/", "fl", "or", "Tet1WT", "/", "WT", "Tet2fl", "/", "fl", "MEFs", "were", "treated", "with", "retroviruses", "containing", "OSKM", ".", "Tet1KO", "/", "KO", "Tet2fl", "/", "fl", "or", "Tet1WT", "/", "WT", "Tet2fl", "/", "fl", "pre", "-", "iPSC", "clones", "were", "isolated", "and", "treated", "with", "either", "Adenoviral", "expressed", "Cre", "recombinase", "or", "Empty", "vector", "to", "generate", "a", "population", "of", "pre", "-", "iPSCs", "with", "Tet1KO", "/", "KO", "Tet2fl", "/", "fl", ",", "Tet1KO", "/", "KO", "Tet2KO", "/", "KO", ",", "Tet1WT", "/", "WT", "Tet2fl", "/", "fl", ",", "and", "Tet1WT", "/", "WT", ",", "and", "Tet2KO", "/", "KO", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "Quantification", "of", "percent", "Nanog", "positive", "cells", "by", "intracellular", "flow", "cytometry", "in", "each", "genotype", "as", "indicated", "of", "Tet1WT", "/", "WT", "Tet2fl", "/", "fl", ",", "Tet1WT", "/", "WT", "Tet2KO", "/", "KO", ",", "Tet1KO", "/", "KO", "Tet2fl", "/", "fl", ",", "and", "Tet1KO", "/", "KO", "Tet2KO", "/", "KO", "after", "10", "days", "of", "AA", "+", "2i", "treatment", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7tSNE of Tet1, Tet2, Nanog, and Cdh1 expression in single cell RNA sequencing of MEF undergoing OSKM reprogramming from Tran et al 2019b. MEF, Reprogramming (REPROG), and mESCs cells are highlighted in red dotted lines. Specific reprogramming timepoints are highlighted within the reprogramming cluster in arrows. Color corresponds to log10 of transcript counts for each individual cell.Bar graphs indicating number of cells expressing Tet1, Tet2, Cdh1 or Nanog from the reprograming population (Day 3, 6, 9 and 12). Number of cells per reprogramming population is highlighted within legend.Scheme for deriving Tet1 and Tet2 double knockout pre-iPSC lines. Tet1KO/KO Tet2fl/fl or Tet1WT/WT Tet2fl/fl MEFs were treated with retroviruses containing OSKM. Tet1KO/KO Tet2fl/fl or Tet1WT/WT Tet2fl/fl pre-iPSC clones were isolated and treated with either Adenoviral expressed Cre recombinase or Empty vector to generate a population of pre-iPSCs with Tet1KO/KO Tet2fl/fl, Tet1KO/KO Tet2KO/KO, Tet1WT/WT Tet2fl/fl, and Tet1WT/WT, and Tet2KO/KO. Scale bar, 50 μm.Quantification of percent Nanog positive cells by intracellular flow cytometry in each genotype as indicated of Tet1WT/WT Tet2fl/fl, Tet1WT/WT Tet2KO/KO, Tet1KO/KO Tet2fl/fl, and Tet1KO/KO Tet2KO/KO after 10 days of AA+2i treatment."}
{"words": ["Figure", "1RT", "-", "PCR", "analysis", "of", "SPPL2c", "expression", "in", "different", "murine", "tissues", ".", "Total", "RNA", "from", "the", "indicated", "tissues", "was", "either", "transcribed", "into", "cDNA", "prior", "to", "PCR", "amplification", "(", "+", "RT", ")", "or", ",", "as", "negative", "control", ",", "used", "directly", "as", "template", "(", "-", "RT", ")", ".", "A", "fragment", "of", "the", "actin", "ORF", "was", "amplified", "as", "control", ".", "Western", "Blot", "analysis", "of", "total", "lysates", "from", "testis", "isolated", "from", "wild", "type", "or", "SPPL2c", "-", "/", "-", "using", "antibodies", "against", "C", "-", "(", "D", ")", "or", "N", "-", "terminal", "(", "E", ")", "epitopes", "of", "SPPL2c", ".", "Lysates", "from", "HeLa", "cells", "transiently", "expressing", "the", "SPPL2c", "isoforms", "were", "analysed", "in", "parallel", ".", "SPPL2c", "was", "visualised", "by", "indirect", "immunofluorescence", "in", "HeLa", "cells", "transiently", "expressing", "C", "-", "terminally", "Myc", "-", "tagged", "murine", "SPPL2c", "isoform", "A", ".", "For", "detection", "of", "SPPL2c", ",", "either", "anti", "-", "Myc", "or", "the", "SPPL2c", "antiserum", "(", "C", "-", "terminal", "epitope", ")", "were", "employed", "as", "indicated", "together", "with", "anti", "-", "KDEL", ",", "anti", "-", "GM130", "or", "anti", "-", "ERGIC53", "as", "indicated", "in", "order", "to", "label", "the", "ER", ",", "the", "cis", "Golgi", "apparatus", "or", "the", "ER", "-", "Golgi", "intermediate", "compartment", "(", "ERGIC", ")", ",", "respectively", ".", "Lysates", "from", "HEK293", "cells", "transiently", "transfected", "with", "murine", "SPPL2c", "-", "myc", "(", "isoform", "A", ")", "were", "treated", "with", "the", "glycosidases", "PNGase", "F", "or", "Endo", "H", "as", "indicated", "prior", "to", "Western", "blot", "analysis", "with", "anti", "-", "SPPL2c", "(", "C", "-", "term", ")", ".", "Deglycosylation", "of", "endogenously", "expressed", "LIMP2", "was", "analysed", "as", "control", ".", "N", "-", "glycosylation", "of", "endogenous", "SPPL2c", "is", "similar", "to", "the", "overexpressed", "protein", ".", "Total", "lysates", "from", "testis", "of", "wild", "type", "or", "SPPL2c", "-", "/", "-", "mice", "were", "treatedSubcellular", "fractionation", "of", "postnuclear", "supernatant", "from", "murine", "testis", "using", "a", "self", "-", "forming", "Percoll", "density", "gradient", ".", "Fractions", "were", "collected", "from", "bottom", "to", "top", "and", "subjected", "to", "Western", "blot", "analysis", "for", "SPPL2c", ".", "Protein", "disulfide", "isomerase", "(", "PDI", ")", ",", "Cathepsin", "D", "and", "CD44", "were", "detected", "as", "organelle", "marker", "proteins", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1RT-PCR analysis of SPPL2c expression in different murine tissues. Total RNA from the indicated tissues was either transcribed into cDNA prior to PCR amplification (+RT) or, as negative control, used directly as template (-RT). A fragment of the actin ORF was amplified as control.Western Blot analysis of total lysates from testis isolated from wild type or SPPL2c-/- using antibodies against C- (D) or N-terminal (E) epitopes of SPPL2c. Lysates from HeLa cells transiently expressing the SPPL2c isoforms were analysed in parallel.SPPL2c was visualised by indirect immunofluorescence in HeLa cells transiently expressing C-terminally Myc-tagged murine SPPL2c isoform A. For detection of SPPL2c, either anti-Myc or the SPPL2c antiserum (C-terminal epitope) were employed as indicated together with anti-KDEL, anti-GM130 or anti-ERGIC53 as indicated in order to label the ER, the cis Golgi apparatus or the ER-Golgi intermediate compartment (ERGIC), respectively.Lysates from HEK293 cells transiently transfected with murine SPPL2c-myc (isoform A) were treated with the glycosidases PNGase F or Endo H as indicated prior to Western blot analysis with anti-SPPL2c (C-term). Deglycosylation of endogenously expressed LIMP2 was analysed as control.N-glycosylation of endogenous SPPL2c is similar to the overexpressed protein. Total lysates from testis of wild type or SPPL2c-/- mice were treatedSubcellular fractionation of postnuclear supernatant from murine testis using a self-forming Percoll density gradient. Fractions were collected from bottom to top and subjected to Western blot analysis for SPPL2c. Protein disulfide isomerase (PDI), Cathepsin D and CD44 were detected as organelle marker proteins."}
{"words": ["Figure", "2HEK293", "cells", "were", "transiently", "transfected", "with", "murine", "N", "-", "terminally", "HA", "-", "tagged", "heme", "oxygenase", "1", "(", "HA", "-", "mHO", "-", "1", ")", "alone", "or", "in", "combination", "with", "active", "or", "inactive", "(", "D", "/", "A", ")", "murine", "SPP", "or", "SPPL2c", ".", "Substrate", "levels", "were", "determined", "by", "Western", "blot", "analysis", "with", "anti", "-", "HA", ".", "For", "detection", "of", "SPP", ",", "an", "antiserum", "recognizing", "both", "endogenous", "human", "(", "h", ")", "and", "overexpressed", "murine", "(", "m", ")", "SPP", "was", "employed", ".", "Murine", "SPPL2c", "was", "visualised", "using", "the", "antiserum", "generated", "against", "the", "C", "-", "terminus", "of", "the", "protein", ".", "Actin", "was", "detected", "to", "control", "for", "equal", "protein", "loading", ".", "Immunofluorescence", "analysis", "of", "HeLa", "cells", "transiently", "expressing", "murine", "HO", "-", "1", "(", "HA", "-", "mHO", "-", "1", ")", "alone", "or", "together", "with", "active", "or", "inactive", "(", "D", "/", "A", ")", "SPPL2c", "-", "myc", ".", "Substrate", "and", "proteases", "were", "visualised", "using", "the", "HA", "and", "Myc", "epitopes", ",", "respectively", ".", "The", "TA", "protein", "Ube2J1", "is", "not", "proteolysed", "by", "co", "-", "expressed", "SPP", "or", "SPPL2c", "in", "HEK293", "cells", ".", "Western", "blot", "analysis", "was", "performedDifferential", "cleavage", "of", "CYB5a", ",", "RAMP4", "-", "2", "and", "RAMP4", "by", "SPPL2c", "and", "SPP", ".", "Substrates", "and", "proteases", "were", "co", "-", "expressed", "in", "HEK293", "cells", "followed", "by", "Western", "blot", "analysis", "as", "described", "above", ".", "Densitometric", "quantification", "from", "at", "least", "n", "=", "3", "independent", "experiments", "was", "performed", ".", "Substrate", "levels", "were", "normalised", "and", "compared", "to", "cells", "without", "protease", "-", "overexpression", ".", "HEK293", "cells", "expressing", "HA", "-", "RAMP4", "-", "2", "alone", "or", "in", "combination", "with", "SPPL2c", "or", "SPP", "were", "treated", "with", "100", "µM", "(", "Z", "-", "LL", ")", "2", "-", "ketone", "(", "ZLL", ")", ",", "5", "µM", "inhibitor", "X", "(", "InX", ")", ",", "5", "µM", "DAPT", "or", "DMSO", "as", "control", ".", "RAMP4", "-", "2", "band", "intensity", "was", "quantified", "from", "blots", "of", "three", "independent", "experiments", "and", "normalised", "to", "cells", "just", "over", "-", "expressing", "the", "substrate", ".", "Microsomes", "isolated", "from", "testis", "of", "wild", "type", "and", "SPPL2c", "-", "/", "-", "mice", "were", "solubilised", "in", "1", "%", "digitonin", "and", "proteins", "were", "separated", "by", "blue", "native", "PAGE", ".", "After", "transfer", "to", "PVDF", "membrane", ",", "SPPL2c", "and", "SPP", "were", "detected", "using", "the", "polyclonal", "antisera", "introduced", "above", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2HEK293 cells were transiently transfected with murine N-terminally HA-tagged heme oxygenase 1 (HA-mHO-1) alone or in combination with active or inactive (D/A) murine SPP or SPPL2c. Substrate levels were determined by Western blot analysis with anti-HA. For detection of SPP, an antiserum recognizing both endogenous human (h) and overexpressed murine (m) SPP was employed. Murine SPPL2c was visualised using the antiserum generated against the C-terminus of the protein. Actin was detected to control for equal protein loading.Immunofluorescence analysis of HeLa cells transiently expressing murine HO-1 (HA-mHO-1) alone or together with active or inactive (D/A) SPPL2c-myc. Substrate and proteases were visualised using the HA and Myc epitopes, respectively.The TA protein Ube2J1 is not proteolysed by co-expressed SPP or SPPL2c in HEK293 cells. Western blot analysis was performedDifferential cleavage of CYB5a, RAMP4-2 and RAMP4 by SPPL2c and SPP. Substrates and proteases were co-expressed in HEK293 cells followed by Western blot analysis as described above. Densitometric quantification from at least n=3 independent experiments was performed. Substrate levels were normalised and compared to cells without protease-overexpression.HEK293 cells expressing HA-RAMP4-2 alone or in combination with SPPL2c or SPP were treated with 100 µM (Z-LL)2-ketone (ZLL), 5 µM inhibitor X (InX), 5 µM DAPT or DMSO as control. RAMP4-2 band intensity was quantified from blots of three independent experiments and normalised to cells just over-expressing the substrate.Microsomes isolated from testis of wild type and SPPL2c-/- mice were solubilised in 1% digitonin and proteins were separated by blue native PAGE. After transfer to PVDF membrane, SPPL2c and SPP were detected using the polyclonal antisera introduced above."}
{"words": ["Figure", "3Histochemical", "visualization", "of", "β", "-", "galactosidase", "(", "β", "-", "gal", ")", "reporter", "activity", "revealed", "SPPL2c", "expression", "within", "seminiferous", "tubules", ".", "Cryo", "-", "sections", "from", "PFA", "-", "fixed", "wild", "type", "and", "SPPL2c", "-", "/", "-", "testis", "were", "stained", "with", "X", "-", "Gal", "as", "β", "-", "gal", "substrate", ".", "SPPL2c", "protein", "levels", "were", "analysed", "in", "germ", "cell", "populations", "from", "testis", "of", "wild", "type", "mice", "sorted", "for", "their", "DNA", "content", "which", "was", "determined", "by", "Hoechst", "33342", "staining", "as", "depicted", "in", "Fig", "EV4D", ".", "While", "for", "4C", ",", "2C", "and", "1C", "fractions", "10", "µg", "of", "protein", "were", "loaded", ",", "for", "the", "testis", "control", "samples", "(", "=", "total", "lysates", ")", "20", "µg", "of", "protein", "were", "subjected", "to", "electrophoresis", ".", "*", ",", "non", "-", "specific", "band", ".", "Immunohistochemical", "detection", "of", "SPPL2c", "was", "performed", "on", "cryosections", "of", "Bouin", "-", "fixed", "wild", "type", "and", "SPPL2c", "-", "/", "-", "testis", ".", "The", "SPPL2c", "antiserum", "directed", "against", "a", "C", "-", "terminal", "epitope", "of", "the", "protease", "and", "diaminobenzidine", "as", "peroxidase", "substrate", "were", "employed", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "hematoxylin", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "µm", "(", "upper", "panel", ")", "or", "50", "µm", "(", "lower", "panel", ")", ".", "SPPL2c", "levels", "were", "compared", "in", "total", "lysates", "prepared", "from", "testis", "of", "wild", "type", "mice", "sacrificed", "at", "the", "age", "of", "4", ",", "6", ",", "8", "or", "12", "weeks", "by", "Western", "blotting", ".", "A", "testis", "lysate", "from", "an", "adult", "SPPL2c", "-", "/", "-", "mouse", "was", "used", "as", "negative", "control", ".", "The", "weight", "of", "both", "testicles", "of", "wild", "type", "and", "SPPL2c", "-", "/", "-", "mice", "(", "n", "=", "12", "per", "genotype", ")", "was", "determined", "and", "normalised", "to", "the", "body", "weight", ".", "Paraffin", "sections", "from", "Bouin", "-", "fixed", "wild", "type", "and", "SPPL2c", "-", "/", "-", "testis", "were", "stained", "with", "hematoxylin", "&", "eosin", "(", "H", "&", "E", ")", ".", "Scale", "bars", ",", "100", "µm", ".", "In", "H", "&", "E", "stained", "paraffin", "-", "sections", "from", "Bouin", "-", "fixed", "wild", "type", "and", "SPPL2c", "-", "/", "-", "testis", ",", "the", "mean", "number", "of", "elongated", "spermatids", "per", "seminiferous", "tubule", "was", "determined", ".", "Cells", "were", "counted", "in", "20", "tubuli", "in", "sections", "from", "n", "=", "6", "mice", "per", "genotype", ".", "SPPL2c", "is", "not", "present", "in", "mature", "spermatozoa", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "total", "lysates", "of", "wild", "type", "(", "+", "/", "+", ")", "and", "SPPL2c", "-", "/", "-", "testis", ",", "epididymis", "and", "spermatozoa", "recovered", "from", "the", "cauda", "epididymidis", "/", "vas", "deferens", "for", "SPPL2c", ".", "Mature", "sperm", "were", "isolated", "from", "the", "epididymis", "of", "wild", "type", "or", "SPPL2c", "-", "deficient", "mice", "and", "analysed", "by", "phase", "-", "contrast", "microscopy", ".", "Representative", "pictures", "of", "morphologically", "normal", "spermatozoa", "are", "depicted", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "µm", ".", "Reduced", "motility", "of", "SPPL2c", "-", "/", "-", "sperm", "cells", ".", "Spermatozoa", "were", "recovered", "from", "the", "cauda", "epididymidis", "of", "wild", "type", "and", "SPPL2c", "-", "/", "-", "mice", "(", "n", "=", "3", ")", "and", "subjected", "to", "computer", "-", "assisted", "sperm", "analysis", ".", "Average", "path", "velocity", "(", "VAP", ")", ",", "straight", "line", "velocity", "(", "VSL", ")", "and", "curvilinear", "velocity", "(", "VCL", ")", "were", "determined", "in", "micrometer", "per", "second", ".", "Mean", "litter", "sizes", "for", "different", "breeding", "schemes", ".", "The", "data", "depicted", "are", "based", "on", "n", "=", "12", "(", "+", "/", "+", "X", "+", "/", "+", ")", ",", "n", "=", "57", "(", "+", "/", "-", "X", "+", "/", "-", ")", ",", "n", "=", "11", "(", "-", "/", "-", "X", "-", "/", "-", ")", ",", "n", "=", "10", "(", "-", "/", "-", "X", "+", "/", "+", ")", "and", "n", "=", "11", "(", "+", "/", "+", "X", "-", "/", "-", ")", "different", "breedings", ",", "respectively", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Histochemical visualization of β-galactosidase (β-gal) reporter activity revealed SPPL2c expression within seminiferous tubules. Cryo-sections from PFA-fixed wild type and SPPL2c-/- testis were stained with X-Gal as β-gal substrate.SPPL2c protein levels were analysed in germ cell populations from testis of wild type mice sorted for their DNA content which was determined by Hoechst 33342 staining as depicted in Fig EV4D. While for 4C, 2C and 1C fractions 10 µg of protein were loaded, for the testis control samples (=total lysates) 20 µg of protein were subjected to electrophoresis. *, non-specific band.Immunohistochemical detection of SPPL2c was performed on cryosections of Bouin-fixed wild type and SPPL2c-/- testis. The SPPL2c antiserum directed against a C-terminal epitope of the protease and diaminobenzidine as peroxidase substrate were employed. Nuclei were stained with hematoxylin. Scale bar, 100 µm (upper panel) or 50 µm (lower panel).SPPL2c levels were compared in total lysates prepared from testis of wild type mice sacrificed at the age of 4, 6, 8 or 12 weeks by Western blotting. A testis lysate from an adult SPPL2c-/- mouse was used as negative control.The weight of both testicles of wild type and SPPL2c-/- mice (n=12 per genotype) was determined and normalised to the body weight.Paraffin sections from Bouin-fixed wild type and SPPL2c-/- testis were stained with hematoxylin & eosin (H&E). Scale bars, 100 µm.In H&E stained paraffin-sections from Bouin-fixed wild type and SPPL2c-/- testis, the mean number of elongated spermatids per seminiferous tubule was determined. Cells were counted in 20 tubuli in sections from n=6 mice per genotype.SPPL2c is not present in mature spermatozoa. Western blot analysis of total lysates of wild type (+/+) and SPPL2c-/- testis, epididymis and spermatozoa recovered from the cauda epididymidis/vas deferens for SPPL2c.Mature sperm were isolated from the epididymis of wild type or SPPL2c-deficient mice and analysed by phase-contrast microscopy. Representative pictures of morphologically normal spermatozoa are depicted. Scale bars, 10 µm.Reduced motility of SPPL2c-/- sperm cells. Spermatozoa were recovered from the cauda epididymidis of wild type and SPPL2c-/- mice (n=3) and subjected to computer-assisted sperm analysis. Average path velocity (VAP), straight line velocity (VSL) and curvilinear velocity (VCL) were determined in micrometer per second.Mean litter sizes for different breeding schemes. The data depicted are based on n=12 (+/+X+/+), n=57 (+/-X+/-), n=11 (-/-X-/-), n=10 (-/-X+/+) and n=11 (+/+X-/-) different breedings, respectively."}
{"words": ["Figure", "4Carbonate", "-", "washed", "total", "membrane", "fractions", "from", "wild", "type", "and", "SPPL2c", "-", "/", "-", "testis", "(", "n", "=", "5", ")", "were", "subjected", "to", "a", "label", "-", "free", "quantitative", "proteome", "analysis", ".", "For", "each", "quantified", "protein", ",", "a", "log2", "intensity", "ratio", "between", "SPPL2c", "-", "deficient", "and", "wild", "type", "samples", "was", "calculated", ".", "Negative", "values", "indicate", "a", "depletion", "and", "positive", "values", "an", "enrichment", "in", "SPPL2c", "-", "/", "-", "samples", ".", "In", "the", "depicted", "volcano", "plot", "the", "negative", "log10", "of", "the", "p", "value", "(", "y", "axis", ")", "is", "plotted", "versus", "the", "log2", "intensity", "ratio", "of", "SPPL2c", "-", "/", "-", "versus", "wild", "type", "samples", "(", "x", "axis", ")", ".", "All", "proteins", "above", "the", "significance", "level", "of", "p", "<", "0", ".", "01", "(", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", "are", "coloured", "in", "red", ".", "The", "hyperbolic", "curve", "indicates", "the", "threshold", "for", "a", "permutation", "-", "based", "FDR", "correction", "for", "multiple", "hypotheses", "with", "p", "=", "0", ".", "05", "and", "s0", "=", "0", ".", "1", ".", "HeLa", "cells", "were", "transiently", "transfected", "with", "N", "-", "terminally", "HA", "-", "tagged", "PLN", "(", "HA", "-", "PLN", ")", "and", "inactive", "(", "D", "/", "A", ")", "SPPL2c", "-", "myc", "The", "expressed", "proteins", "were", "visualised", "by", "indirect", "immunofluorescence", "via", "their", "HA", "and", "Myc", "epitopes", ".", "HEK293", "cells", "were", "transiently", "transfected", "with", "HA", "-", "PLN", "alone", "or", "in", "combination", "with", "active", "or", "inactive", "(", "D", "/", "A", ")", "murine", "SPPL2c", "Isoform", "A", "(", "D", ")", "or", "Isoform", "B", "(", "E", ")", ".", "Substrate", "processing", "was", "analysed", "by", "Western", "blotting", "with", "anti", "-", "HA", ".", "SPPL2c", "expression", "was", "confirmed", "with", "the", "antiserum", "against", "the", "C", "-", "terminal", "epitope", ".", "Actin", "was", "detected", "to", "confirm", "equal", "protein", "loading", ".", "Subcellular", "localisation", "of", "the", "PLN", "mutants", "was", "analysed", "by", "indirect", "immunofluorescence", "using", "anti", "-", "HA", "in", "combination", "with", "anti", "-", "protein", "disulphide", "isomerase", "A6", "(", "PDIA6", ")", "to", "stain", "the", "ER", ".", "The", "37", "-", "41A", "and", "47", "-", "51", "PLN", "mutants", "were", "not", "expressed", "in", "relevant", "amounts", ".", "HEK293", "cells", "were", "transiently", "transfected", "with", "wild", "type", "or", "mutated", "HA", "-", "PLN", "alone", "or", "together", "with", "SPPL2c", "isoform", "A", ".", "Quantification", "of", "n", "=", "5", "experiments", "as", "shown", "in", "(", "H", ")", ".", "For", "each", "PLN", "variant", ",", "the", "residual", "PLN", "in", "SPPL2c", "co", "-", "expressing", "cells", "is", "depicted", "as", "%", "of", "PLN", "in", "absence", "of", "the", "protease", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Carbonate-washed total membrane fractions from wild type and SPPL2c-/- testis (n=5) were subjected to a label-free quantitative proteome analysis. For each quantified protein, a log2 intensity ratio between SPPL2c-deficient and wild type samples was calculated. Negative values indicate a depletion and positive values an enrichment in SPPL2c-/- samples. In the depicted volcano plot the negative log10 of the p value (y axis) is plotted versus the log2 intensity ratio of SPPL2c-/- versus wild type samples (x axis). All proteins above the significance level of p<0.01 (unpaired Student's t test) are coloured in red. The hyperbolic curve indicates the threshold for a permutation-based FDR correction for multiple hypotheses with p = 0.05 and s0 = 0.1.HeLa cells were transiently transfected with N-terminally HA-tagged PLN (HA-PLN) and inactive (D/A) SPPL2c-myc The expressed proteins were visualised by indirect immunofluorescence via their HA and Myc epitopes.HEK293 cells were transiently transfected with HA-PLN alone or in combination with active or inactive (D/A) murine SPPL2c Isoform A (D) or Isoform B (E). Substrate processing was analysed by Western blotting with anti-HA. SPPL2c expression was confirmed with the antiserum against the C-terminal epitope. Actin was detected to confirm equal protein loading.Subcellular localisation of the PLN mutants was analysed by indirect immunofluorescence using anti-HA in combination with anti-protein disulphide isomerase A6 (PDIA6) to stain the ER. The 37-41A and 47-51 PLN mutants were not expressed in relevant amounts.HEK293 cells were transiently transfected with wild type or mutated HA-PLN alone or together with SPPL2c isoform A.Quantification of n=5 experiments as shown in (H). For each PLN variant, the residual PLN in SPPL2c co-expressing cells is depicted as % of PLN in absence of the protease."}
{"words": ["Figure", "5Accumulation", "of", "endogenous", "PLN", "in", "the", "testis", "of", "SPPL2c", "-", "/", "-", "mice", ".", "PLN", "was", "immuno", "-", "precipitated", "(", "IP", ")", "from", "equal", "protein", "amounts", "of", "total", "lysates", "of", "wild", "type", "or", "SPPL2c", "-", "/", "-", "testis", "with", "the", "mouse", "monoclonal", "antibody", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "the", "IPs", "was", "performed", "with", "the", "rabbit", "monoclonal", "PLN", "antibody", ".", "SPPL2c", "and", "actin", "were", "detected", "from", "total", "lysates", "directly", ".", "Quantification", "of", "normalised", "PLN", "/", "Actin", "ratios", "from", "n", "=", "3", "biological", "replicates", "per", "genotype", ".", "Expression", "of", "PLN", "in", "murine", "testis", "from", "wild", "type", "(", "wt", ")", "SPPL2c", "-", "/", "-", "(", "2c", "-", "/", "-", ")", "was", "quantified", "by", "qPCR", ".", "Immunohistochemical", "detection", "of", "PLN", "in", "paraformaldehyde", "(", "PFA", ")", "-", "fixed", "testis", "from", "wild", "type", "and", "SPPL2c", "-", "/", "-", "mice", ".", "Cryosections", "were", "stained", "using", "a", "rabbit", "monoclonal", "PLN", "antibody", "or", "normal", "rabbit", "IgG", "as", "negative", "control", "and", "diaminobenzidine", "as", "peroxidase", "substrate", ".", "Testis", "suspensions", "were", "stained", "with", "2", ".", "5", "µM", "DRAQ5", "to", "determine", "cellular", "DNA", "amount", ".", "1C", "-", "co", "=", "elongated", "spermatids", ",", "1C", "=", "other", "haploid", "cells", "including", "round", "spermatids", ",", "2C", "=", "spermatogonia", ",", "secondary", "spermatocytes", ",", "Sertoli", "cells", ",", "other", "somatic", "cells", ",", "4C", "=", "primary", "spermatocytes", ",", "G2", "spermatogonia", ".", "Intracellular", "Ca2", "+", "concentrations", "were", "analysed", "in", "testis", "suspensions", "from", "either", "wild", "type", "or", "SPPL2c", "-", "deficient", "mice", "using", "the", "Ca2", "+", "-", "sensitive", "probe", "Fluo4", "-", "AM", ".", "Individual", "germ", "cell", "populations", "were", "identified", "Bars", "indicate", "Median", "Fluo4", "-", "AM", "fluorescence", "±", "SD", "of", "8", "individual", "samples", "from", "3", "mice", "per", "genotype", "normalised", "to", "those", "of", "wild", "type", "samples", ".", "Median", "forward", "scatter", "(", "FSC", ")", "was", "controlled", "in", "the", "1C", "-", "co", "population", "from", "the", "datasets", "Median", "FSC", "±", "SD", "of", "8", "individual", "samples", "from", "3", "mice", "per", "genotype", ".", "Expression", "of", "SPPL2c", "in", "human", "testis", ".", "(", "H", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "lysates", "from", "HEK293", "cells", "expressing", "human", "(", "h", ")", "SPPL2c", ",", "human", "and", "murine", "testis", "using", "antisera", "against", "a", "C", "-", "terminal", "epitope", "of", "murine", "SPPL2c", "or", "human", "SPPL2c", "as", "indicated", ".", "Immunohistochemical", "detection", "of", "SPPL2c", "with", "the", "monoclonal", "1A1", "antibody", "in", "paraffin", "-", "sections", "from", "Bouin", "'", "s", "-", "fixed", "human", "testis", ".", "In", "addition", ",", "sections", "were", "incubated", "with", "control", "immunoglobulins", ".", "Arrows", "indicate", "elongated", "spermatids", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Accumulation of endogenous PLN in the testis of SPPL2c-/- mice. PLN was immuno-precipitated (IP) from equal protein amounts of total lysates of wild type or SPPL2c-/- testis with the mouse monoclonal antibody. Western blot analysis of the IPs was performed with the rabbit monoclonal PLN antibody. SPPL2c and actin were detected from total lysates directly.Quantification of normalised PLN/Actin ratios from n=3 biological replicates per genotype.Expression of PLN in murine testis from wild type (wt) SPPL2c-/- (2c-/-) was quantified by qPCR.Immunohistochemical detection of PLN in paraformaldehyde (PFA)-fixed testis from wild type and SPPL2c-/- mice. Cryosections were stained using a rabbit monoclonal PLN antibody or normal rabbit IgG as negative control and diaminobenzidine as peroxidase substrate.Testis suspensions were stained with 2.5 µM DRAQ5 to determine cellular DNA amount. 1C-co = elongated spermatids, 1C = other haploid cells including round spermatids, 2C = spermatogonia, secondary spermatocytes, Sertoli cells, other somatic cells, 4C = primary spermatocytes, G2 spermatogonia.Intracellular Ca2+ concentrations were analysed in testis suspensions from either wild type or SPPL2c-deficient mice using the Ca2+-sensitive probe Fluo4-AM. Individual germ cell populations were identified Bars indicate Median Fluo4-AM fluorescence ± SD of 8 individual samples from 3 mice per genotype normalised to those of wild type samples.Median forward scatter (FSC) was controlled in the 1C-co population from the datasets Median FSC ± SD of 8 individual samples from 3 mice per genotype.Expression of SPPL2c in human testis. (H) Western blot analysis of lysates from HEK293 cells expressing human (h) SPPL2c, human and murine testis using antisera against a C-terminal epitope of murine SPPL2c or human SPPL2c as indicated.Immunohistochemical detection of SPPL2c with the monoclonal 1A1 antibody in paraffin-sections from Bouin's-fixed human testis. In addition, sections were incubated with control immunoglobulins. Arrows indicate elongated spermatids."}
{"words": ["Figure", "1", "A", "The", "intrinsic", "fluorescence", "of", "NAD", "(", "P", ")", "H", "co", "-", "localizes", "extensively", "with", "mitochondria", "(", "marked", "by", "Mitotracker", "CMXRos", ")", "B", "2P", "-", "FLIM", "detects", "the", "fraction", "of", "NAD", "(", "P", ")", "H", "bound", "to", "enzyme", "partners", "(", "a2", "%", ")", "a2", "%", "values", "(", "starved", ",", "and", "after", "insulin", "or", "R", "+", "L", "addition", ")", "were", "recorded", "pixel", "by", "pixel", "for", "mouse", "cortical", "(", "C", "neurons", ".", "Each", "colored", "line", "in", "the", "center", "panel", "graphs", "refers", "to", "a", "single", "field", "of", "view", "containing", "2", "-", "15", "cells", ",", "and", "each", "pair", "of", "solid", "and", "dotted", "lines", "(", "same", "color", ")", "refers", "to", "the", "same", "field", "of", "view", "before", "and", "after", "stimulation", ",", "respectively", ".", "Using", "the", "same", "raw", "data", ",", "the", "relative", "contributions", "of", "NADH", "and", "NADPH", "to", "the", "total", "a2", "%", "values", "were", "calculated", "(", "Blacker", "et", "al", ",", "2014", ")", "and", "are", "shown", "in", "the", "right", "panel", "bar", "graphs", ".", "NADH", "and", "NAD", "(", "P", ")", "H", "contributed", "an", "average", "of", "63", "%", "and", "37", "%", ",", "respectively", ",", "of", "the", "total", "a2", "%", "values", ".", "All", "statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "Student", "'", "s", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "testsD", "a2", "%", "values", "(", "starved", ",", "and", "after", "insulin", "or", "R", "+", "L", "addition", ")", "were", "recorded", "pixel", "by", "pixel", "fo", "human", "(", "D", ")", "neurons", ".", "Each", "colored", "line", "in", "the", "center", "panel", "graphs", "refers", "to", "a", "single", "field", "of", "view", "containing", "2", "-", "15", "cells", ",", "and", "each", "pair", "of", "solid", "and", "dotted", "lines", "(", "same", "color", ")", "refers", "to", "the", "same", "field", "of", "view", "before", "and", "after", "stimulation", ",", "respectively", ".", "Using", "the", "same", "raw", "data", ",", "the", "relative", "contributions", "of", "NADH", "and", "NADPH", "to", "the", "total", "a2", "%", "values", "were", "calculated", "(", "Blacker", "et", "al", ",", "2014", ")", "and", "are", "shown", "in", "the", "right", "panel", "bar", "graphs", ".", "NADH", "and", "NAD", "(", "P", ")", "H", "contributed", "an", "average", "of", "63", "%", "and", "37", "%", ",", "respectively", ",", "of", "the", "total", "a2", "%", "values", ".", "All", "statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "Student", "'", "s", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1 A The intrinsic fluorescence of NAD(P)H co-localizes extensively with mitochondria (marked by Mitotracker CMXRos)  B 2P-FLIM detects the fraction of NAD(P)H bound to enzyme partners (a2%) a2% values (starved, and after insulin or R+L addition) were recorded pixel by pixel for mouse cortical (C neurons. Each colored line in the center panel graphs refers to a single field of view containing 2-15 cells, and each pair of solid and dotted lines (same color) refers to the same field of view before and after stimulation, respectively. Using the same raw data, the relative contributions of NADH and NADPH to the total a2% values were calculated (Blacker et al, 2014) and are shown in the right panel bar graphs. NADH and NAD(P)H contributed an average of 63% and 37%, respectively, of the total a2% values. All statistical analyses were performed using Student's two-tailed unpaired t-testsD a2% values (starved, and after insulin or R+L addition) were recorded pixel by pixel fo human (D) neurons. Each colored line in the center panel graphs refers to a single field of view containing 2-15 cells, and each pair of solid and dotted lines (same color) refers to the same field of view before and after stimulation, respectively. Using the same raw data, the relative contributions of NADH and NADPH to the total a2% values were calculated (Blacker et al, 2014) and are shown in the right panel bar graphs. NADH and NAD(P)H contributed an average of 63% and 37%, respectively, of the total a2% values. All statistical analyses were performed using Student's two-tailed unpaired t-tests"}
{"words": ["Figure", "2Wild", "type", "(", "WT", ")", "mouse", "cortical", "neurons", "cultured", "for", "10", "days", "in", "vitro", "(", "A", "were", "serum", "-", "starved", "in", "Hank", "'", "s", "balanced", "salt", "solution", "for", "2", "hours", ".", "Next", ",", "the", "cells", "were", "imaged", "immediately", "(", "starved", ")", ",", "after", "which", "either", "amino", "acids", "(", "R", "+", "L", ")", "or", "insulin", "were", "added", ".", "Thirty", "minutes", "later", "the", "cells", "were", "imaged", "again", ".", "Finally", ",", "the", "mTOR", "inhibitor", ",", "Torin1", "was", "added", ",", "and", "after", "an", "additional", "30", "minutes", ",", "the", "cells", "were", "imaged", "for", "the", "last", "time", ".", "Histograms", "represent", "changes", "in", "the", "fraction", "of", "enzyme", "-", "bound", "NAD", "(", "P", ")", "H", "(", "a2", "%", ")", "for", "each", "condition", ".", "Note", "that", "insulin", "and", "amino", "acids", "significantly", "increased", "the", "a2", "%", "values", ",", "which", "was", "reversed", "by", "Torin1", "-", "mediated", "inhibition", "of", "mTORC1", ".", "Average", "data", "from", "5", "fields", "of", "view", "per", "condition", "are", "shown", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "Student", "'", "s", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "testhuman", "neurons", "differentiated", "in", "culture", "for", "30", "days", "from", "ReNcell", "VM", "neuronal", "progenitor", "cells", "(", "B", ")", "were", "serum", "-", "starved", "in", "Hank", "'", "s", "balanced", "salt", "solution", "for", "2", "hours", ".", "Next", ",", "the", "cells", "were", "imaged", "immediately", "(", "starved", ")", ",", "after", "which", "either", "amino", "acids", "(", "R", "+", "L", ")", "or", "insulin", "were", "added", ".", "Thirty", "minutes", "later", "the", "cells", "were", "imaged", "again", ".", "Finally", ",", "the", "mTOR", "inhibitor", ",", "Torin1", "was", "added", ",", "and", "after", "an", "additional", "30", "minutes", ",", "the", "cells", "were", "imaged", "for", "the", "last", "time", ".", "Histograms", "represent", "changes", "in", "the", "fraction", "of", "enzyme", "-", "bound", "NAD", "(", "P", ")", "H", "(", "a2", "%", ")", "for", "each", "condition", ".", "Note", "that", "insulin", "and", "amino", "acids", "significantly", "increased", "the", "a2", "%", "values", ",", "which", "was", "reversed", "by", "Torin1", "-", "mediated", "inhibition", "of", "mTORC1", ".", "Average", "data", "from", "5", "fields", "of", "view", "per", "condition", "are", "shown", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "Student", "'", "s", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", "C", "Raptor", "-", "depleted", ",", "WT", "cortical", "neurons", "were", "imaged", "by", "2P", "-", "FLIM", "before", "and", "30", "minutes", "after", "treatment", "with", "insulin", ".", "Inhibiting", "mTORC1", "by", "depleting", "Raptor", "with", "shRNA", "made", "mitochondria", "insensitive", "to", "insulin", ".", "Shown", "here", "are", "average", "data", "from", "4", "fields", "of", "view", "of", "a", "single", "replicate", "out", "of", "a", "total", "of", "3", "replicates", ".", "Western", "blots", "are", "representative", "of", "3", "independent", "assays", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "Student", "'", "s", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Wild type (WT) mouse cortical neurons cultured for 10 days in vitro (A were serum-starved in Hank's balanced salt solution for 2 hours. Next, the cells were imaged immediately (starved), after which either amino acids (R+L) or insulin were added. Thirty minutes later the cells were imaged again. Finally, the mTOR inhibitor, Torin1 was added, and after an additional 30 minutes, the cells were imaged for the last time. Histograms represent changes in the fraction of enzyme-bound NAD(P)H (a2%) for each condition. Note that insulin and amino acids significantly increased the a2% values, which was reversed by Torin1-mediated inhibition of mTORC1. Average data from 5 fields of view per condition are shown. Statistical analyses were performed using Student's two-tailed unpaired t-testhuman neurons differentiated in culture for 30 days from ReNcell VM neuronal progenitor cells (B) were serum-starved in Hank's balanced salt solution for 2 hours. Next, the cells were imaged immediately (starved), after which either amino acids (R+L) or insulin were added. Thirty minutes later the cells were imaged again. Finally, the mTOR inhibitor, Torin1 was added, and after an additional 30 minutes, the cells were imaged for the last time. Histograms represent changes in the fraction of enzyme-bound NAD(P)H (a2%) for each condition. Note that insulin and amino acids significantly increased the a2% values, which was reversed by Torin1-mediated inhibition of mTORC1. Average data from 5 fields of view per condition are shown. Statistical analyses were performed using Student's two-tailed unpaired t-test C Raptor-depleted, WT cortical neurons were imaged by 2P-FLIM before and 30 minutes after treatment with insulin. Inhibiting mTORC1 by depleting Raptor with shRNA made mitochondria insensitive to insulin. Shown here are average data from 4 fields of view of a single replicate out of a total of 3 replicates. Western blots are representative of 3 independent assays. Statistical analyses were performed using Student's two-tailed unpaired t-test "}
{"words": ["Figure", "3", "A", "Human", "neurons", "differentiated", "in", "culture", "for", "30", "days", "from", "ReNcell", "VM", "neuronal", "progenitor", "cells", "were", "serum", "-", "starved", "in", "Hank", "'", "s", "balanced", "salt", "solution", "(", "HBSS", ")", "for", "2", "hours", ".", "Next", ",", "amino", "acids", "(", "R", "+", "L", ")", ",", "insulin", ",", "insulin", "+", "R", "+", "L", ",", "or", "the", "oxidative", "phosphorylation", "inhibitor", ",", "NaN3", ",", "were", "added", ",", "or", "the", "HBSS", "was", "replaced", "with", "complete", "medium", ".", "One", "hour", "later", "cellular", "reactive", "oxygen", "species", "(", "ROS", ")", ",", "ATP", "levels", "and", "oxygen", "consumption", "were", "measured", ".", "The", "data", "were", "collected", "from", "3", "independent", "assays", "in", "which", "each", "experimental", "condition", "contained", "6", "-", "8", "replicates", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "Student", "'", "s", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", "B", "MP", "-", "PAM", "imaging", "of", "wild", "type", "(", "WT", ")", "mouse", "cerebral", "cortex", "through", "an", "open", "-", "skull", "window", "1", "hour", "after", "topical", "application", "of", "amino", "acids", "(", "R", "+", "L", ")", ".", "A", "decrease", "in", "blood", "oxygenation", "of", "the", "cortical", "vasculature", "was", "observed", ",", "indicating", "elevated", "oxygen", "extraction", "and", "consumption", "due", "to", "upregulation", "of", "mitochondrial", "activity", ".", "Data", "were", "obtained", "from", "3", "mice", ",", "each", "of", "which", "was", "measured", "once", "for", "O2", "saturation", ",", "oxygen", "extraction", "fraction", "(", "OEF", ")", "and", "cerebral", "metabolic", "rate", "of", "oxygen", "(", "CMRO2", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "s", ".", "e", ".", "m", "C", "MP", "-", "PAM", "imaging", "of", "WT", "mouse", "cerebral", "cortex", "through", "an", "open", "-", "skull", "window", "beginning", "at", "baseline", ",", "which", "corresponded", "to", "30", "minutes", "after", "suppression", "of", "mTORC1", "activity", "by", "a", "single", "topical", "application", "of", "1", "µM", "rapamycin", ".", "Baseline", "levels", "of", "O2", "saturation", "and", "blood", "flow", "speed", "were", "recorded", ",", "after", "which", "R", "+", "L", "was", "applied", "to", "the", "open", "skull", "window", ".", "One", "hour", "later", ",", "O2", "saturation", "and", "blood", "flow", "speed", "were", "recorded", "again", ".", "Data", "were", "obtained", "from", "4", "mice", ",", "each", "of", "which", "was", "measured", "once", "for", "O2", "saturation", ",", "oxygen", "extraction", "fraction", "(", "OEF", ")", "and", "cerebral", "metabolic", "rate", "of", "oxygen", "(", "CMRO2", ")", ".", "Note", "that", "no", "significant", "changes", "in", "O2", "saturation", "or", "OEF", "were", "observed", "after", "R", "+", "L", "stimulation", ",", "in", "contrast", "to", "what", "was", "observed", "in", "the", "absence", "of", "rapamycin", "(", "Fig", "3B", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "s", ".", "e", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3 A Human neurons differentiated in culture for 30 days from ReNcell VM neuronal progenitor cells were serum-starved in Hank's balanced salt solution (HBSS) for 2 hours. Next, amino acids (R+L), insulin, insulin + R+L, or the oxidative phosphorylation inhibitor, NaN3, were added, or the HBSS was replaced with complete medium. One hour later cellular reactive oxygen species (ROS), ATP levels and oxygen consumption were measured. The data were collected from 3 independent assays in which each experimental condition contained 6-8 replicates. Error bars represent ± s.e.m. Statistical analyses were performed using Student's two-tailed unpaired t-test B MP-PAM imaging of wild type (WT) mouse cerebral cortex through an open-skull window 1 hour after topical application of amino acids (R+L). A decrease in blood oxygenation of the cortical vasculature was observed, indicating elevated oxygen extraction and consumption due to upregulation of mitochondrial activity. Data were obtained from 3 mice , each of which was measured once for O2 saturation, oxygen extraction fraction (OEF) and cerebral metabolic rate of oxygen (CMRO2). Error bars represent ± s.e.m C MP-PAM imaging of WT mouse cerebral cortex through an open-skull window beginning at baseline, which corresponded to 30 minutes after suppression of mTORC1 activity by a single topical application of 1 µM rapamycin. Baseline levels of O2 saturation and blood flow speed were recorded, after which R+L was applied to the open skull window. One hour later, O2 saturation and blood flow speed were recorded again. Data were obtained from 4 mice, each of which was measured once for O2 saturation, oxygen extraction fraction (OEF) and cerebral metabolic rate of oxygen (CMRO2). Note that no significant changes in O2 saturation or OEF were observed after R+L stimulation, in contrast to what was observed in the absence of rapamycin (Fig 3B). Error bars represent ± s.e.m"}
{"words": ["Figure", "4", "A", "Human", "neurons", "differentiated", "in", "culture", "for", "30", "days", "from", "ReNcell", "VM", "neuronal", "progenitors", "(", "Control", ")", ",", "or", "otherwise", "identical", "cells", "expressing", "Flag", "-", "Raptor", "fused", "to", "either", "the", "plasma", "membrane", "targeting", "signal", "of", "H", "-", "Ras", "or", "the", "lysosomal", "targeting", "signal", "of", "Rheb", "were", "serum", "-", "starved", "in", "Hank", "'", "s", "balanced", "salt", "solution", "for", "2", "hours", ",", "and", "then", "imaged", "by", "2P", "-", "FLIM", "before", "and", "30", "minutes", "after", "addition", "of", "insulin", ".", "Each", "colored", "line", "refers", "to", "a", "single", "field", "of", "view", "containing", "5", "-", "15", "cells", ",", "and", "each", "pair", "of", "solid", "and", "dotted", "lines", "(", "same", "color", ")", "refers", "to", "the", "same", "field", "of", "view", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "Student", "'", "s", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", "(", "ns", ":", "not", "significant", ")", ".", "Expression", "of", "the", "Flag", "-", "Raptor", "fusion", "proteins", "was", "confirmed", "by", "western", "blotting", "(", "right", "panel", ")", ".", "Note", "that", "NiMA", "was", "supported", "when", "mTORC1", "was", "targeted", "to", "lysosomes", "(", "Flag", "-", "Raptor", "Rheb15", ")", ",", "but", "not", "to", "the", "plasma", "membrane", "(", "Flag", "-", "Raptor", "H", "-", "Ras25", ")", ".", "Western", "blots", "are", "representative", "of", "3", "independent", "assays", "B", "Mouse", "cortical", "neurons", "starved", "in", "Hank", "'", "s", "balanced", "salt", "solution", "for", "2", "hours", "were", "treated", "with", "AβOs", ",", "insulin", "or", "amino", "acids", "(", "R", "+", "L", ")", "for", "30", "minutes", ",", "and", "then", "were", "fixed", "and", "double", "labeled", "with", "anti", "-", "mTOR", ",", "and", "either", "anti", "-", "LAMP1", "or", "Mitotracker", "CMXRos", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Data", "are", "representative", "of", "3", "independent", "assays", "C", "Reducing", "Bcl", "-", "xL", "expression", "in", "WT", "mouse", "cortical", "neurons", "does", "not", "affect", "NiMA", ".", "Western", "blots", "are", "representative", "of", "3", "independent", "assays", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "Student", "'", "s", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4 A Human neurons differentiated in culture for 30 days from ReNcell VM neuronal progenitors (Control), or otherwise identical cells expressing Flag-Raptor fused to either the plasma membrane targeting signal of H-Ras or the lysosomal targeting signal of Rheb were serum-starved in Hank's balanced salt solution for 2 hours, and then imaged by 2P-FLIM before and 30 minutes after addition of insulin. Each colored line refers to a single field of view containing 5-15 cells, and each pair of solid and dotted lines (same color) refers to the same field of view. Statistical analyses were performed using Student's two-tailed unpaired t-test (ns: not significant). Expression of the Flag-Raptor fusion proteins was confirmed by western blotting (right panel). Note that NiMA was supported when mTORC1 was targeted to lysosomes (Flag-Raptor Rheb15), but not to the plasma membrane (Flag-Raptor H-Ras25). Western blots are representative of 3 independent assays B Mouse cortical neurons starved in Hank's balanced salt solution for 2 hours were treated with AβOs, insulin or amino acids (R+L) for 30 minutes, and then were fixed and double labeled with anti-mTOR, and either anti-LAMP1 or Mitotracker CMXRos. Error bars represent ± s.e.m. Data are representative of 3 independent assays  C Reducing Bcl-xL expression in WT mouse cortical neurons does not affect NiMA. Western blots are representative of 3 independent assays. Statistical analyses were performed using Student's two-tailed unpaired t-test "}
{"words": ["Figure", "5A", "DNA", "replication", "in", "mitochondrial", "replisomes", "was", "detected", "in", "mouse", "cortical", "neurons", "after", "a", "3", "-", "hour", "pulse", "of", "the", "thymidine", "analog", ",", "EdU", ".", "Cells", "were", "labeled", "additionally", "with", "the", "mitochondrial", "marker", ",", "Mitotracker", "CMXRos", ",", "and", "with", "an", "antibody", "to", "the", "neuron", "marker", ",", "MAP2B", "Quantification", "of", "EdU", "uptake", "into", "mouse", "cortical", "neuron", "replisomes", "showed", "that", "nutrients", "inhibit", "­", "mtDNA", "replication", "by", "~", "60", "%", ",", "an", "effect", "that", "was", "blocked", "by", "AβOs", ".", "Error", "bars", "represent", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "Student", "\"", "s", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", "and", "are", "representative", "of", "3", "independent", "aC", "WT", "mouse", "cortical", "neurons", "expressing", "either", "Flag", "-", "Raptor", "H", "-", "Ras25", "or", "Flag", "-", "Raptor", "Rheb15", "were", "serum", "-", "starved", "in", "AβO", "-", "containing", "Hank", "\"", "s", "balanced", "salt", "solution", "for", "2", "hours", ".", "Next", ",", "the", "cells", "were", "pulse", "-", "labeled", "for", "3", "hours", "with", "EdU", ".", "Note", "that", "forcing", "mTORC1", "to", "the", "plasma", "membrane", "(", "Flag", "-", "Raptor", "H", "-", "Ras25", ")", "yielded", "an", "~", "80", "%", "increase", "in", "EdU", "incorporation", "into", "mtDNA", "in", "the", "presence", "of", "AβOs", "regardless", "of", "whether", "or", "not", "the", "neurons", "had", "been", "stimulated", "with", "insulin", "+", "R", "+", "L", ".", "In", "contrast", ",", "EdU", "uptake", "into", "mitochondrial", "replisomes", "was", "not", "stimulated", "by", "AβOs", "in", "neurons", "whose", "mTORC1", "was", "forced", "to", "lysosomes", "(", "Flag", "-", "Raptor", "-", "Rheb15", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "±"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A DNA replication in mitochondrial replisomes was detected in mouse cortical neurons after a 3-hour pulse of the thymidine analog, EdU. Cells were labeled additionally with the mitochondrial marker, Mitotracker CMXRos, and with an antibody to the neuron marker, MAP2B Quantification of EdU uptake into mouse cortical neuron replisomes showed that nutrients inhibit ­mtDNA replication by ~60%, an effect that was blocked by AβOs. Error bars represent ± s.e.m. Statistical analyses were performed using Student\"s two-tailed unpaired t-test and are representative of 3 independent aC WT mouse cortical neurons expressing either Flag-Raptor H-Ras25 or Flag-Raptor Rheb15 were serum-starved in AβO-containing Hank\"s balanced salt solution for 2 hours. Next, the cells were pulse-labeled for 3 hours with EdU. Note that forcing mTORC1 to the plasma membrane (Flag-Raptor H-Ras25) yielded an ~80% increase in EdU incorporation into mtDNA in the presence of AβOs regardless of whether or not the neurons had been stimulated with insulin+R+L. In contrast, EdU uptake into mitochondrial replisomes was not stimulated by AβOs in neurons whose mTORC1 was forced to lysosomes (Flag-Raptor-Rheb15). Error bars represent ±"}
{"words": ["Figure", "6", "A", "Unmodified", "ReNcell", "VM", "human", "neuronal", "progenitor", "cells", "were", "co", "-", "plated", "with", "comparable", "Ren", "-", "GFP", "or", "Ren", "-", "APPSL", "cells", "into", "3", "-", "dimensional", "Matrigel", "matrices", ",", "and", "differentiated", "into", "neurons", "for", "60", "days", ".", "Cytosolic", "GFP", "is", "produced", "by", "both", "Ren", "-", "GFP", "and", "Ren", "-", "APPSL", "cells", ",", "and", "the", "latter", "also", "produce", "pathogenic", "human", "APP", "with", "the", "Swedish", "and", "London", "mutations", ",", "and", "secrete", "Aβ", "that", "becomes", "entrapped", "in", "the", "Matrige", "Following", "neuronal", "differentiation", ",", "2P", "-", "FLIM", "was", "used", "to", "monitor", "NiMA", "in", "the", "ReNcell", "VM", "neurons", ",", "which", "were", "discriminated", "from", "Ren", "-", "GFP", "and", "Ren", "-", "APPSL", "neurons", "because", "they", "lack", "GFP", ".", "Note", "that", "NiMA", "was", "observed", "in", "ReNcell", "VM", "neurons", "when", "they", "were", "co", "-", "cultured", "with", "Ren", "-", "GFP", "neurons", ",", "but", "not", "when", "they", "were", "co", "-", "cultured", "with", "Ren", "-", "APPSL", "neurons", ".", "Each", "colored", "line", "refers", "to", "a", "single", "field", "of", "view", "containing", "5", "-", "15", "cells", ",", "and", "each", "pair", "of", "solid", "and", "dotted", "lines", "of", "the", "same", "color", "refers", "to", "the", "same", "field", "of", "view", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "Student", "'", "s", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", "B", "ReNcell", "VM", "cells", "were", "differentiated", "into", "neurons", "for", "30", "days", "in", "2D", "cultures", ".", "Subsequent", "AβO", "exposure", "for", "16", "hours", "blocked", "NiMA", ",", "but", "expression", "of", "Flag", "-", "Raptor", "-", "Rheb15", ",", "which", "forces", "mTORC1", "to", "lysosomes", ",", "prevented", "NiMA", "inhibition", "by", "AβOs", ".", "Each", "colored", "line", "refers", "to", "a", "single", "field", "of", "view", "containing", "5", "-", "15", "cells", ",", "and", "each", "identically", "colored", "pair", "of", "solid", "and", "dotted", "lines", "refers", "to", "the", "same", "field", "of", "view", ".", "Flag", "-", "Raptor", "-", "Rheb15", "expression", "was", "confirmed", "by", "western", "blot", "­", "ting", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "Student", "'", "s", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", ".", "Western", "blots", "are", "representative", "of", "3", "independent"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6 A Unmodified ReNcell VM human neuronal progenitor cells were co-plated with comparable Ren-GFP or Ren-APPSL cells into 3-dimensional Matrigel matrices, and differentiated into neurons for 60 days. Cytosolic GFP is produced by both Ren-GFP and Ren-APPSL cells, and the latter also produce pathogenic human APP with the Swedish and London mutations, and secrete Aβ that becomes entrapped in the Matrige Following neuronal differentiation, 2P-FLIM was used to monitor NiMA in the ReNcell VM neurons, which were discriminated from Ren-GFP and Ren-APPSL neurons because they lack GFP. Note that NiMA was observed in ReNcell VM neurons when they were co-cultured with Ren-GFP neurons, but not when they were co-cultured with Ren-APPSL neurons. Each colored line refers to a single field of view containing 5-15 cells, and each pair of solid and dotted lines of the same color refers to the same field of view. Statistical analyses were performed using Student's two-tailed unpaired t-test B ReNcell VM cells were differentiated into neurons for 30 days in 2D cultures. Subsequent AβO exposure for 16 hours blocked NiMA, but expression of Flag-Raptor-Rheb15, which forces mTORC1 to lysosomes, prevented NiMA inhibition by AβOs. Each colored line refers to a single field of view containing 5-15 cells, and each identically colored pair of solid and dotted lines refers to the same field of view. Flag-Raptor -Rheb15 expression was confirmed by western blot­ting. Statistical analyses were performed using Student's two-tailed unpaired t-test. Western blots are representative of 3 independent assays"}
{"words": ["Figure", "7", "A", "Cortical", "mouse", "neurons", "from", "tau", "knockout", "(", "KO", ")", "mice", "were", "serum", "-", "starved", "in", "Hank", "'", "s", "balanced", "salt", "solution", "for", "2", "hours", ".", "The", "cells", "were", "then", "imaged", "for", "NiMA", ",", "after", "which", "insulin", "or", "amino", "acids", "were", "immediately", "added", ",", "and", "the", "cells", "were", "then", "imaged", "again", "30", "minutes", "later", "Data", "information", ":", "Each", "colored", "lin", "refers", "to", "a", "single", "field", "of", "view", "containing", "2", "-", "15", "cells", ",", "and", "each", "pair", "of", "solid", "and", "dotted", "lines", "(", "same", "color", ")", "refers", "to", "the", "same", "field", "of", "view", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "Student", "'", "s", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", "B", "Cortical", "mouse", "neurons", "from", "tau", "KO", "mice", "were", "treated", "with", "AβOs", "for", "18", "hours", "before", "being", "serum", "-", "starved", "in", "AβO", "-", "containing", "Hank", "'", "s", "balanced", "salt", "solution", "for", "2", "hours", ".", "The", "cells", "were", "then", "imaged", "for", "NiMA", ",", "after", "which", "insulin", "was", "immediately", "added", ",", "and", "the", "cells", "were", "then", "imaged", "again", "30", "minutes", "later", ".", "Note", "that", "NiMA", "occurred", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "AβOs", ",", "which", "inhibited", "NiMA", "in", "wild", "type", "human", "neuron", "Data", "information", ":", "Each", "colored", "lin", "refers", "to", "a", "single", "field", "of", "view", "containing", "2", "-", "15", "cells", ",", "and", "each", "pair", "of", "solid", "and", "dotted", "lines", "(", "same", "color", ")", "refers", "to", "the", "same", "field", "of", "view", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "Student", "'", "s", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7 A Cortical mouse neurons from tau knockout (KO) mice were serum-starved in Hank's balanced salt solution for 2 hours. The cells were then imaged for NiMA, after which insulin or amino acids were immediately added, and the cells were then imaged again 30 minutes later Data information: Each colored lin refers to a single field of view containing 2-15 cells, and each pair of solid and dotted lines (same color) refers to the same field of view. Statistical analyses were performed using Student's two-tailed unpaired t-test B Cortical mouse neurons from tau KO mice were treated with AβOs for 18 hours before being serum-starved in AβO-containing Hank's balanced salt solution for 2 hours. The cells were then imaged for NiMA, after which insulin was immediately added, and the cells were then imaged again 30 minutes later. Note that NiMA occurred in the absence or presence of AβOs, which inhibited NiMA in wild type human neuron Data information: Each colored lin refers to a single field of view containing 2-15 cells, and each pair of solid and dotted lines (same color) refers to the same field of view. Statistical analyses were performed using Student's two-tailed unpaired t-test"}
{"words": ["Figure", "8Wild", "type", "mouse", "cortical", "neurons", "depleted", "of", "Nprl", "with", "shRNA", "had", "mitochondria", "that", "were", "insensitive", "to", "amino", "acids", "(", "R", "+", "L", "Each", "colored", "line", "refers", "to", "a", "single", "field", "of", "view", "containing", "5", "-", "15", "cells", ",", "and", "each", "pair", "of", "solid", "and", "dotted", "lines", "(", "same", "color", ")", "refers", "to", "the", "same", "field", "of", "view", ".", "Knockdown", "efficiency", "was", "monitored", "by", "western", "blotting", "of", "phosphorylated", "ribosomal", "S6", "protein", ",", "a", "downstream", "target", "of", "the", "mTORC1", "-", "S6K", "pathway", ".", "Western", "blots", "are", "representative", "of", "3", "independent", "assays", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "Student", "'", "s", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "testWild", "type", "mouse", "cortical", "neurons", "depleted", "o", "Tsc2", "with", "shRNA", "had", "mitochondria", "tha", "were", "insensitive", "t", "insuli", "Each", "colored", "line", "refers", "to", "a", "single", "field", "of", "view", "containing", "5", "-", "15", "cells", ",", "and", "each", "pair", "of", "solid", "and", "dotted", "lines", "(", "same", "color", ")", "refers", "to", "the", "same", "field", "of", "view", ".", "Knockdown", "efficiency", "was", "monitored", "by", "western", "blotting", "of", "phosphorylated", "ribosomal", "S6", "protein", ",", "a", "downstream", "target", "of", "the", "mTORC1", "-", "S6K", "pathway", ".", "Western", "blots", "are", "representative", "of", "3", "independent", "assays", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "Student", "'", "s", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", "(", "D", "Human", "fibroblasts", "deficient", "in", "Tsc2", "(", "TSC2", "Δexons1", "-", "14", ")", "were", "imaged", "before", "and", "30", "minutes", "after", "insulin", "addition", ".", "Lack", "of", "Tsc2", "made", "mitochondria", "insensitive", "to", "insulin", "Cultures", "were", "serum", "-", "starved", "in", "Hank", "'", "s", "balanced", "salt", "solution", "for", "2", "hours", "before", "stimulation", "with", "insulin", "or", "amino", "acids", ",", "and", "were", "imaged", "before", "and", "30", "minutes", "after", "stimulation", ".", "Each", "colored", "line", "refers", "to", "a", "single", "field", "of", "view", "containing", "2", "-", "5", "cells", ",", "and", "each", "pair", "of", "solid", "and", "dotted", "lines", "of", "the", "same", "color", "refers", "to", "the", "same", "field", "of", "view", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "Student", "'", "s", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test", "(", "E", ")", "Re", "-", "expression", "of", "human", "Tsc2", "rescues", "mitochondrial", "responses", "to", "insulin", ".", "Cultures", "were", "serum", "-", "starved", "in", "Hank", "'", "s", "balanced", "salt", "solution", "for", "2", "hours", "before", "stimulation", "with", "insulin", "or", "amino", "acids", ",", "and", "were", "imaged", "before", "and", "30", "minutes", "after", "stimulation", ".", "Each", "colored", "line", "refers", "to", "a", "single", "field", "of", "view", "containing", "2", "-", "5", "cells", ",", "and", "each", "pair", "of", "solid", "and", "dotted", "lines", "of", "the", "same", "color", "refers", "to", "the", "same", "field", "of", "view", ".", "Re", "-", "expression", "of", "the", "Flag", "-", "WT", "Tsc2", "was", "corroborated", "by", "indirect", "immun", "­", "o", "­", "fluorescence", "(", "IF", ")", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "Student", "'", "s", "two", "-", "tailed", "unpaired", "t", "-", "test"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8Wild type mouse cortical neurons depleted of Nprl with shRNA had mitochondria that were insensitive to amino acids (R+L Each colored line refers to a single field of view containing 5-15 cells, and each pair of solid and dotted lines (same color) refers to the same field of view. Knockdown efficiency was monitored by western blotting of phosphorylated ribosomal S6 protein, a downstream target of the mTORC1-S6K pathway. Western blots are representative of 3 independent assays. Statistical analyses were performed using Student's two-tailed unpaired t-testWild type mouse cortical neurons depleted o Tsc2 with shRNA had mitochondria tha were insensitive t insuli Each colored line refers to a single field of view containing 5-15 cells, and each pair of solid and dotted lines (same color) refers to the same field of view. Knockdown efficiency was monitored by western blotting of phosphorylated ribosomal S6 protein, a downstream target of the mTORC1-S6K pathway. Western blots are representative of 3 independent assays. Statistical analyses were performed using Student's two-tailed unpaired t-test(D Human fibroblasts deficient in Tsc2 (TSC2 Δexons1-14) were imaged before and 30 minutes after insulin addition. Lack of Tsc2 made mitochondria insensitive to insulin Cultures were serum-starved in Hank's balanced salt solution for 2 hours before stimulation with insulin or amino acids, and were imaged before and 30 minutes after stimulation. Each colored line refers to a single field of view containing 2-5 cells, and each pair of solid and dotted lines of the same color refers to the same field of view Statistical analyses were performed using Student's two-tailed unpaired t-test(E) Re-expression of human Tsc2 rescues mitochondrial responses to insulin. Cultures were serum-starved in Hank's balanced salt solution for 2 hours before stimulation with insulin or amino acids, and were imaged before and 30 minutes after stimulation. Each colored line refers to a single field of view containing 2-5 cells, and each pair of solid and dotted lines of the same color refers to the same field of view. Re-expression of the Flag-WT Tsc2 was corroborated by indirect immun­o­fluorescence (IF). Statistical analyses were performed using Student's two-tailed unpaired t-test "}
{"words": ["Figure", "1C", "Sequences", "of", "synthetic", "PrP", "alleles", "differing", "in", "the", "octarepeat", "region", "of", "mousePrP", ".", "Conserved", "histidines", "in", "octarepeats", "2", "-", "5", "are", "coloured", "blue", "and", "missense", "mutations", "are", "shown", "in", "red", ".", "Overproduction", "of", "C2", "fragment", "is", "indicated", "by", "+", "+", "signs", "to", "the", "right", "of", "the", "panel", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1C Sequences of synthetic PrP alleles differing in the octarepeat region of mousePrP. Conserved histidines in octarepeats 2-5 are coloured blue and missense mutations are shown in red. Overproduction of C2 fragment is indicated by ++ signs to the right of the panel."}
{"words": ["Figure", "2A", "Lysates", "from", "RK13", "cells", "transfected", "with", "WT", ",", "S1", ",", "S3", "and", "S3", ".", "F88W", "PrP", "were", "probed", "with", "antibody", "Sha31", ",", "9A2", "and", "12B2", "after", "digestion", "with", "PNGaseF", ".", "B", ",", "C", "Additional", "PrP", "mutants", "were", "examined", "by", "Western", "blot", "with", "Sha31", "after", "PNGaseF", "digestion", "of", "RK13", "cell", "lysates", ".", "A", "schematic", "of", "the", "different", "lengths", "of", "C2", "caused", "by", "single", "mutations", "in", "the", "OR", "is", "shown", "in", "the", "lower", "portion", "of", "(", "C", ")", ".", "B", ",", "C", "Additional", "PrP", "mutants", "were", "examined", "by", "Western", "blot", "with", "Sha31", "after", "PNGaseF", "digestion", "of", "RK13", "cell", "lysates", ".", "A", "schematic", "of", "the", "different", "lengths", "of", "C2", "caused", "by", "single", "mutations", "in", "the", "OR", "is", "shown", "in", "the", "lower", "portion", "of", "(", "C", ")", ".", "D", "Lysates", "of", "N2a", ",", "HEK", ",", "SMB", "-", "PS", "and", "SH", "-", "SY5Y", "cells", "not", "transfected", "(", "−", ")", "and", "transiently", "transfected", "with", "WT", "PrP", "or", "S3", "PrP", "plasmids", "were", "digested", "with", "PNGaseF", "and", "analysed", "by", "Western", "blot", "using", "Sha31", ".", "E", "Analysis", "of", "lysates", "from", "RK13", "cells", "transfected", "with", "plasmids", "incorporating", "Phe", "substitutions", "into", "the", "hydrophobic", "domain", "of", "WT", "PrP", ",", "S1", "PrP", "and", "S3", "PrP", ".", "Lysates", "were", "PNGaseF", "-", "digested", "before", "Western", "blot", "using", "the", "Sha31", "antibody", ".", "F1", ":", "A114F", ",", "F2", ":", "G118F", ",", "F3", ":", "G122F", ",", "F4", ":"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A Lysates from RK13 cells transfected with WT, S1, S3 and S3.F88W PrP were probed with antibody Sha31, 9A2 and 12B2 after digestion with PNGaseF.B, C Additional PrP mutants were examined by Western blot with Sha31 after PNGaseF digestion of RK13 cell lysates. A schematic of the different lengths of C2 caused by single mutations in the OR is shown in the lower portion of (C).B, C Additional PrP mutants were examined by Western blot with Sha31 after PNGaseF digestion of RK13 cell lysates. A schematic of the different lengths of C2 caused by single mutations in the OR is shown in the lower portion of (C).D Lysates of N2a, HEK, SMB-PS and SH-SY5Y cells not transfected (−) and transiently transfected with WT PrP or S3 PrP plasmids were digested with PNGaseF and analysed by Western blot using Sha31.E Analysis of lysates from RK13 cells transfected with plasmids incorporating Phe substitutions into the hydrophobic domain of WT PrP, S1 PrP and S3 PrP. Lysates were PNGaseF-digested before Western blot using the Sha31 antibody. F1: A114F, F2: G118F, F3: G122F, F4: G126F"}
{"words": ["Figure", "3A", "Brain", "homogenates", "of", "TgPrP", "(", "WT", ")", ",", "TgPrP", "(", "S1", ")", "-", "17", "and", "TgPrP", "(", "S3", ".", "F88W", ")", "-", "35", "mice", "were", "analysed", "by", "Western", "blot", "before", "and", "after", "PNGaseF", "digestion", "using", "the", "PrP", "antibodies", "Sha31", ",", "12B2", "and", "9A2", ".", "Prnp0", "/", "0", ",", "and", "WT", "brain", "homogenates", "were", "used", "as", "controls", ".", "B", "The", "ratio", "of", "C2", "to", "full", "-", "length", "PrP", "in", "TgPrP", "(", "S3", ".", "F88W", ")", "-", "35", "and", "WT", "mice", "(", "left", "panel", ",", "n", "=", "7", ",", "P", "=", "1", ".", "46E", "-", "06", ")", "and", "in", "RK13", "cells", "expressing", "WT", "and", "S3", "PrP", "(", "right", "panel", ",", "n", "=", "5", ",", "P", "=", "4", ".", "01E", "-", "05", ")", "is", "shown", ".", "Values", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "Unpaired", ",", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "C", "Different", "tissue", "homogenates", "from", "a", "TgPrP", "(", "S3", ".", "F88W", ")", "-", "35", "mouse", "were", "PNGaseF", "-", "digested", "and", "analysed", "for", "PrP", "using", "the", "antibody", "1A6", ".", "FL", ",", "full", "-", "length", "PrP", ";", "ns", ",", "non", "-", "specific", "signal", "detected", "in", "the", "immunoblotting", "procedure", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A Brain homogenates of TgPrP(WT), TgPrP(S1)-17 and TgPrP(S3.F88W)-35 mice were analysed by Western blot before and after PNGaseF digestion using the PrP antibodies Sha31, 12B2 and 9A2. Prnp0/0, and WT brain homogenates were used as controls.B The ratio of C2 to full-length PrP in TgPrP(S3.F88W)-35 and WT mice (left panel, n = 7, P = 1.46E-06) and in RK13 cells expressing WT and S3 PrP (right panel, n = 5, P = 4.01E-05) is shown. Values are presented as mean ± SEM. Unpaired, two-tailed t-test, ****P < 0.0001.C Different tissue homogenates from a TgPrP(S3.F88W)-35 mouse were PNGaseF-digested and analysed for PrP using the antibody 1A6. FL, full-length PrP; ns, non-specific signal detected in the immunoblotting procedure."}
{"words": ["Figure", "4A", "Sections", "of", "sciatic", "nerve", "from", "TgPrP", "(", "S3", ".", "F88W", ")", "-", "14", "female", "mice", "(", "all", "610", "days", "old", ")", "and", "TgPrP", "(", "S3", ".", "F88W", ")", "-", "35", "female", "mice", "(", "614", ",", "570", "and", "614", "days", "old", ",", "respectively", ")", "were", "analysed", "using", "toluidine", "blue", "staining", "(", "upper", "row", ")", ",", "with", "the", "third", "panels", "for", "each", "line", "showing", "a", "hypermyelinated", "phenotype", ".", "Scale", "bar", "in", "left", "panel", "represents", "50", "μm", ".", "The", "lower", "rows", "show", "EM", "analyses", "of", "mice", "of", "the", "indicated", "genotypes", ".", "Scale", "bar", "is", "10", "μm", "for", "panels", "1", "-", "4", ",", "with", "the", "fifth", "panel", "showing", "a", "high", "power", "view", "to", "illustrate", "hypermyelinated", "fibres", "in", "a", "mouse", "expressing", "S3", ".", "F88W", "PrP", "(", "scale", "bar", ",", "5", "μm", ")", ".", "B", "Western", "blot", "analysis", "of", "sciatic", "nerve", "protein", "extracts", "(", "10", "μg", ")", "from", "female", "mice", "after", "PNGaseF", "treatment", "shows", "a", "similar", "hierarchy", "of", "PrP", "expression", "in", "Tg", "lines", "to", "that", "of", "brain", "(", "see", "Fig3", ")", ".", "The", "asterisk", "indicates", "a", "greater", "than", "full", "-", "length", "fragment", "present", "in", "TgPrP", "(", "S3", ".", "F88W", ")", "mice", ",", "possibly", "corresponding", "to", "incomplete", "removal", "of", "the", "N", "-", "terminal", "signal", "peptide", ".", "C", "Quantification", "of", "fibre", "morphology", "in", "aged", "animals", "(", "492", "-", "608", "days", "old", ")", ",", "representing", "the", "percentage", "of", "the", "nerve", "occupied", "by", "fibres", "versus", "the", "total", "cross", "-", "sectional", "area", "of", "the", "nerve", ".", "The", "S1", "and", "S3", ".", "F88W", "alleles", "rescue", "Prnp0", "/", "0", "nerves", "to", "a", "similar", "percentage", "as", "the", "WT", "allele", ",", "but", "the", "variance", "and", "P", "-", "value", "is", "greater", "for", "the", "two", "Tg", "lines", "expressing", "the", "TgPrP", "(", "S3", ".", "F88W", ")", "allele", ".", "Unpaired", ",", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ".", "Sample", "sizes", "and", "exact", "P", "-", "values", "compared", "with", "Prnp0", "/", "0", "(", "n", "=", "9", ")", "were", "as", "follows", ":", "TgPrP", "(", "WT", ")", "n", "=", "6", ",", "P", "=", "3", ".", "63E", "-", "05", ";", "Prnp0", "/", "0", ",", "n", "=", "9", ";", "TgPrP", "(", "S1", ")", "-", "17", "n", "=", "5", ",", "P", "=", "3", ".", "54E", "-", "05", ";", "TgPrP", "(", "S1", ")", "-", "19", "n", "=", "3", ",", "P", "=", "6", ".", "35E", "-", "06", ";", "TgPrP", "(", "S3", ".", "F88W", ")", "-", "14", "n", "=", "3", ",", "P", "=", "3", ".", "70E", "-", "03", ";", "and", "TgPrP", "(", "S3", ".", "F88W", ")", "-", "35", "n", "=", "7", ",", "P", "=", "7", ".", "18E", "-", "03", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A Sections of sciatic nerve from TgPrP(S3.F88W)-14 female mice (all 610 days old) and TgPrP(S3.F88W)-35 female mice (614, 570 and 614 days old, respectively) were analysed using toluidine blue staining (upper row), with the third panels for each line showing a hypermyelinated phenotype. Scale bar in left panel represents 50 μm. The lower rows show EM analyses of mice of the indicated genotypes. Scale bar is 10 μm for panels 1-4, with the fifth panel showing a high power view to illustrate hypermyelinated fibres in a mouse expressing S3.F88W PrP (scale bar, 5 μm).B Western blot analysis of sciatic nerve protein extracts (10 μg) from female mice after PNGaseF treatment shows a similar hierarchy of PrP expression in Tg lines to that of brain (see Fig3). The asterisk indicates a greater than full-length fragment present in TgPrP(S3.F88W) mice, possibly corresponding to incomplete removal of the N-terminal signal peptide.C Quantification of fibre morphology in aged animals (492-608 days old), representing the percentage of the nerve occupied by fibres versus the total cross-sectional area of the nerve. The S1 and S3.F88W alleles rescue Prnp0/0 nerves to a similar percentage as the WT allele, but the variance and P-value is greater for the two Tg lines expressing the TgPrP(S3.F88W) allele. Unpaired, two-tailed t-test, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. Sample sizes and exact P-values compared with Prnp0/0 (n = 9) were as follows: TgPrP(WT) n = 6, P = 3.63E-05; Prnp0/0, n = 9; TgPrP(S1)-17 n = 5, P = 3.54E-05; TgPrP(S1)-19 n = 3, P = 6.35E-06; TgPrP(S3.F88W)-14 n = 3, P = 3.70E-03; and TgPrP(S3.F88W)-35 n = 7, P = 7.18E-03."}
{"words": ["Figure", "5A", ",", "B", "Infected", "brain", "homogenates", "were", "PK", "-", "digested", "and", "analysed", "by", "Western", "blot", "using", "(", "A", ")", "Sha31", "antibody", "and", "(", "B", ")", "after", "PK", "and", "PNGaseF", "digestion", "using", "Sha31", ".", "C", "Conformational", "stability", "assay", "on", "RML", "-", "infected", "brain", "homogenates", "incubated", "with", "increasing", "concentrations", "of", "GdnHCl", ".", "The", "best", "-", "fit", "alignments", "of", "the", "data", "are", "presented", ".", "Genotypes", "are", "noted", "on", "the", "individual", "panels", ".", "Source", "data", "are", "available", "online", "for", "this", "figure", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A, B Infected brain homogenates were PK-digested and analysed by Western blot using (A) Sha31 antibody and (B) after PK and PNGaseF digestion using Sha31.C Conformational stability assay on RML-infected brain homogenates incubated with increasing concentrations of GdnHCl. The best-fit alignments of the data are presented. Genotypes are noted on the individual panels.Source data are available online for this figure."}
{"words": ["Figure", "6Pathology", "of", "RML", "-", "infected", "miceA", "-", "H", "The", "pattern", "of", "PrPSc", "deposition", "(", "A", "-", "D", ")", "and", "GFAP", "immunostaining", "(", "E", "-", "H", ")", "is", "presented", ".", "I", "-", "P", "A", "higher", "power", "view", "of", "H", "&", "amp", ";", "amp", ";", "E", "stained", "hippocampus", "(", "I", "-", "L", ")", "and", "thalamus", "(", "M", "-", "P", ")", "to", "reveal", "vacuolation", "is", "presented", ".", "Data", "information", ":", "Animals", "of", "the", "same", "genotype", "are", "shown", "within", "a", "column", ",", "and", "incubation", "times", "of", "the", "presented", "animals", "with", "the", "RML", "prion", "isolate", "are", "shown", "(", "days", ")", ".", "Mice", "expressing", "PrP", "S1", "and", "S3", "alleles", "(", "central", "columns", ")", "exhibit", "attenuated", "PrPSc", "deposition", ",", "gliosis", "and", "spongy", "change", ".", "Pathological", "features", "of", "the", "RML", "isolate", "are", "not", "altered", "upon", "sequential", "passage", "through", "TgPrP", "(", "S3", ".", "88W", ")", "-", "35", "mice", "(", "see", "schematic", "at", "bottom", "of", "the", "diagram", "indicating", "sequential", "passages", "and", "finally", ",", "passage", "back", "into", "WT", "mice", ",", "compare", "the", "data", "in", "first", "and", "fourth", "columns", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Pathology of RML-infected miceA-H The pattern of PrPSc deposition (A-D) and GFAP immunostaining (E-H) is presented.I-P A higher power view of H&amp;amp;E stained hippocampus (I-L) and thalamus (M-P) to reveal vacuolation is presented.Data information: Animals of the same genotype are shown within a column, and incubation times of the presented animals with the RML prion isolate are shown (days). Mice expressing PrP S1 and S3 alleles (central columns) exhibit attenuated PrPSc deposition, gliosis and spongy change. Pathological features of the RML isolate are not altered upon sequential passage through TgPrP(S3.88W)-35 mice (see schematic at bottom of the diagram indicating sequential passages and finally, passage back into WT mice, compare the data in first and fourth columns)."}
{"words": ["Figure", "7A", "Spot", "counts", "in", "the", "scrapie", "cell", "assay", "using", "WT", ",", "TgPrP", "(", "S1", ")", "-", "17", "and", "TgPrP", "(", "S3", ".", "F88W", ")", "-", "14", "brain", "homogenates", "(", "0", ".", "1", "%", "or", "0", ".", "01", "%", ")", "from", "mice", "infected", "with", "RML", "are", "shown", "in", "the", "upper", "panel", "(", "WT", "vs", "S1", "P", "=", "2", ".", "09E", "-", "05", "and", "vs", "S3", "P", "=", "4", ".", "62E", "-", "08", ")", "with", "numbers", "corrected", "for", "PrPC", "expression", "levels", "as", "per", "Table1", "presented", "in", "the", "lower", "panel", "(", "WT", "vs", "S1", "P", "=", "1", ".", "04E", "-", "13", "and", "vs", "S3", "P", "=", "3", ".", "39E", "-", "20", ";", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ",", "n", "=", "3", ")", ".", "B", "A", "comparison", "of", "incubation", "time", "vs", "PrPC", ":", "PrPSc", "ratio", "for", "mice", "expressing", "different", "levels", "of", "WT", "PrP", "(", "WT", ",", "TgPrP", "(", "WT", ")", ",", "tga20", ")", ",", "S1", "PrP", "(", "TgPrP", "(", "S1", ")", "-", "17", ",", "TgPrP", "(", "S1", ")", "-", "19", ",", "TgPrP", "(", "S1", ")", "-", "39", ")", "and", "S3", "PrP", "(", "TgPrP", "(", "S3", ".", "F88W", ")", "-", "14", ",", "TgPrP", "(", "S3", ".", "F88W", ")", "-", "35", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A Spot counts in the scrapie cell assay using WT, TgPrP(S1)-17 and TgPrP(S3.F88W)-14 brain homogenates (0.1% or 0.01%) from mice infected with RML are shown in the upper panel (WT vs S1 P = 2.09E-05 and vs S3 P = 4.62E-08) with numbers corrected for PrPC expression levels as per Table1 presented in the lower panel (WT vs S1 P = 1.04E-13 and vs S3 P = 3.39E-20; two-tailed t-test, n = 3).B A comparison of incubation time vs PrPC:PrPSc ratio for mice expressing different levels of WT PrP (WT, TgPrP(WT), tga20), S1 PrP (TgPrP(S1)-17, TgPrP(S1)-19, TgPrP(S1)-39) and S3 PrP (TgPrP(S3.F88W)-14, TgPrP(S3.F88W)-35)."}
{"words": ["Figure", "1B", ")", "Co", "-", "immunoprecipitation", "analysis", "to", "elucidate", "the", "interaction", "between", "Suv39h1", "and", "HP1", ".", "Whole", "-", "cell", "extracts", "of", "HEK293T", "cells", "expressing", "3xFlag", "-", "Suv39h1", "or", "3xFlag", "-", "ΔN", "-", "Suv39h1", "were", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "with", "the", "anti", "-", "Flag", "tag", "antibody", "followed", "by", "immunoblotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "IgG", "represents", "the", "heavy", "or", "light", "chainF", ")", "Co", "-", "immunoprecipitation", "analysis", "to", "elucidate", "the", "interaction", "between", "Setdb1", "and", "HP1", ".", "Whole", "-", "cell", "extracts", "of", "HEK293T", "cells", "expressing", "3xFlag", "-", "Setdb1", "or", "3xFlag", "-", "Setdb1", "mutants", "were", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "with", "the", "anti", "-", "HP1β", "antibody", "The", "immunocomplex", "was", "analyzed", "by", "immunoblotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "G", ")", "Protein", "decay", "analysis", "of", "HP1", "interaction", "-", "defective", "Setdb1", "mutant", ".", "mESC", "lines", "stably", "expressing", "3xFlag", "-", "Setdb1", "or", "3xFlag", "-", "Setdb1", "-", "3A", "were", "treated", "with", "CHX", "and", "MG132", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Stacked", "bar", "plots", "show", "the", "summarized", "protein", "amounts", "of", "Setdb1", "(", "right", ")", ".", "Data", "represented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "4", ",", "biological", "replicates", ")", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "(", "Tukey", "'", "s", "honestly", "significant", "difference", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B) Co-immunoprecipitation analysis to elucidate the interaction between Suv39h1 and HP1. Whole-cell extracts of HEK293T cells expressing 3xFlag-Suv39h1 or 3xFlag-ΔN-Suv39h1 were subjected to immunoprecipitation with the anti-Flag tag antibody followed by immunoblotting with the indicated antibodies. IgG represents the heavy or light chainF) Co-immunoprecipitation analysis to elucidate the interaction between Setdb1 and HP1. Whole-cell extracts of HEK293T cells expressing 3xFlag-Setdb1 or 3xFlag-Setdb1 mutants were subjected to immunoprecipitation with the anti-HP1β antibody The immunocomplex was analyzed by immunoblotting with the indicated antibodies.G) Protein decay analysis of HP1 interaction-defective Setdb1 mutant. mESC lines stably expressing 3xFlag-Setdb1 or 3xFlag-Setdb1-3A were treated with CHX and MG132 for the indicated times. Stacked bar plots show the summarized protein amounts of Setdb1 (right). Data represented as mean ± SD (n = 4, biological replicates). **p < 0.01 (Tukey's honestly significant difference test)."}
{"words": ["Figure", "2B", ")", "Protein", "expression", "levels", "of", "H3K9", "MTs", "and", "histone", "modification", "levels", "in", "HP1", "-", "cTKO", "cells", "were", "monitored", "by", "immunoblotting", ".", "The", "intensities", "were", "quantified", "using", "ImageJ", "software", "and", "summarized", "on", "the", "right", ".", "The", "thin", "gray", "line", "and", "bold", "colored", "line", "show", "individual", "data", "and", "means", "of", "the", "experimental", "replicates", "(", "n", "≥", "3", ",", "biological", "replicates", ")", ",", "respectively", ".", "C", ")", "Comparison", "of", "H3K9me3", "levels", "between", "HP1", "-", "deficient", "cells", "and", "Suv39h", "/", "Setdb1", "-", "deficient", "cells", ".", "H3K9me", "levels", "were", "quantified", "using", "ImageJ", "software", "and", "are", "summarized", "at", "the", "bottom", ";", "the", "horizontal", "line", "represents", "the", "mean", "intensity", "of", "each", "cell", ".", "More", "than", "75", "nuclei", "were", "counted", "for", "each", "staining", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "(", "Tukey", "'", "s", "honestly", "significant", "difference", "test", ")", ".", "D", ")", "Electron", "microscopy", "images", "of", "HP1", "-", "cTKO", "cells", "in", "the", "absence", "of", "4OHT", "(", "left", ")", "and", "of", "cells", "treated", "with", "4OHT", "for", "4", "days", "(", "right", ")", ".", "Boxes", "represent", "enlarged", "images", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B) Protein expression levels of H3K9 MTs and histone modification levels in HP1-cTKO cells were monitored by immunoblotting. The intensities were quantified using ImageJ software and summarized on the right. The thin gray line and bold colored line show individual data and means of the experimental replicates (n ≥ 3, biological replicates), respectively.C) Comparison of H3K9me3 levels between HP1-deficient cells and Suv39h/Setdb1-deficient cells. H3K9me levels were quantified using ImageJ software and are summarized at the bottom; the horizontal line represents the mean intensity of each cell. More than 75 nuclei were counted for each staining. **p < 0.01 (Tukey's honestly significant difference test).D) Electron microscopy images of HP1-cTKO cells in the absence of 4OHT (left) and of cells treated with 4OHT for 4 days (right). Boxes represent enlarged images."}
{"words": ["Figure", "3B", ")", "Subcellular", "distribution", "of", "H3K9", "MTs", "in", "the", "HP1", "-", "cTKO", "cells", "was", "examined", "by", "immunoblotting", ".", "α", "-", "Tubulin", ",", "Ezh2", ",", "and", "histone", "H3", "were", "used", "as", "representative", "markers", "for", "each", "fraction", ".", "Stacked", "bar", "plots", "show", "the", "abundance", "ratios", "of", "H3K9", "MTs", "among", "the", "three", "fractions", "(", "right", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B) Subcellular distribution of H3K9 MTs in the HP1-cTKO cells was examined by immunoblotting. α-Tubulin, Ezh2, and histone H3 were used as representative markers for each fraction. Stacked bar plots show the abundance ratios of H3K9 MTs among the three fractions (right)."}
{"words": ["Figure", "4B", ",", "Elucidation", "of", "protein", "-", "protein", "interaction", "between", "HP1", "and", "H3K9", "MTs", "by", "co", "-", "immunoprecipitation", "analysis", ".", "Whole", "-", "cell", "extracts", "of", "HEK293T", "cells", "co", "-", "expressing", "HA", "-", "HP1β", "mutants", "and", "epitope", "-", "tagged", "proteins", "of", "interest", "were", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "with", "the", "anti", "-", "HA", "tag", "antibody", ".", "The", "immunocomplex", "was", "analyzed", "by", "immunoblotting", "with", "the", "indicated", "antibodies", ".", "The", "intensities", "were", "quantified", "using", "ImageJ", "software", ",", "normalized", ",", "and", "shown", "on", "the", "top", ".", "E", ")", "Evaluation", "of", "HP1β", "mutants", "for", "maintaining", "H3K9me2", "/", "3", "and", "ensuring", "protein", "stability", "of", "H3K9", "MTs", ".", "H3K9me2", "/", "3", "levels", "and", "protein", "levels", "of", "H3K9", "MTs", "in", "HP1", "-", "cTKO", "lines", "expressing", "3xFlag", "-", "hHP1β", "mutants", "were", "compared", "before", "and", "after", "4OHT", "treatment", ".", "The", "intensities", "were", "quantified", "with", "ImageJ", "software", "and", "are", "summarized", "on", "the", "right", ".", "Data", "represented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", ">", "3", ",", "biological", "replicates", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "(", "Welch", "'", "s", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B, Elucidation of protein-protein interaction between HP1 and H3K9 MTs by co-immunoprecipitation analysis. Whole-cell extracts of HEK293T cells co-expressing HA-HP1β mutants and epitope-tagged proteins of interest were subjected to immunoprecipitation with the anti-HA tag antibody. The immunocomplex was analyzed by immunoblotting with the indicated antibodies. The intensities were quantified using ImageJ software, normalized, and shown on the top.E) Evaluation of HP1β mutants for maintaining H3K9me2/3 and ensuring protein stability of H3K9 MTs. H3K9me2/3 levels and protein levels of H3K9 MTs in HP1-cTKO lines expressing 3xFlag-hHP1β mutants were compared before and after 4OHT treatment. The intensities were quantified with ImageJ software and are summarized on the right. Data represented as mean ± SD (n > 3, biological replicates). *p < 0.05, **p < 0.01 (Welch's test)."}
{"words": ["Figure", "5B", ")", "Protein", "expression", "levels", "of", "Jmjd1a", "/", "b", "in", "HP1", "-", "cTKO", "cells", "were", "monitored", "by", "immunoblotting", ".", "The", "intensities", "were", "quantified", "using", "ImageJ", "software", "and", "summarized", "on", "the", "right", ".", "The", "thin", "gray", "line", "and", "bold", "colored", "line", "show", "individual", "data", "and", "the", "mean", "of", "experimental", "replicates", ",", "respectively", ".", "C", ")", "Evaluation", "of", "HP1β", "mutants", "for", "ensuring", "protein", "stability", "of", "Jmjd1a", "/", "b", ".", "Protein", "levels", "of", "Jmjd1a", "/", "b", "in", "HP1", "-", "cTKO", "lines", "expressing", "3xFlag", "-", "hHP1β", "mutants", "were", "compared", "before", "and", "after", "4OHT", "treatment", ".", "The", "intensities", "were", "quantified", "with", "ImageJ", "software", "and", "are", "summarized", "on", "the", "right", ".", "Data", "represented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", ">", "3", ",", "biological", "replicates", ")", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "(", "Welch", "'", "s", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5B) Protein expression levels of Jmjd1a/b in HP1-cTKO cells were monitored by immunoblotting. The intensities were quantified using ImageJ software and summarized on the right. The thin gray line and bold colored line show individual data and the mean of experimental replicates, respectively.C) Evaluation of HP1β mutants for ensuring protein stability of Jmjd1a/b. Protein levels of Jmjd1a/b in HP1-cTKO lines expressing 3xFlag-hHP1β mutants were compared before and after 4OHT treatment. The intensities were quantified with ImageJ software and are summarized on the right. Data represented as mean ± SD (n > 3, biological replicates). *p < 0.05, **p < 0.01 (Welch's test)."}
{"words": ["Figure", "6C", ")", "Impact", "of", "Suv39h", "/", "Setdb1", "/", "G9a", "depletion", "on", "HP1", "-", "mediated", "protein", "stability", "regulation", "of", "Jmjd1a", "/", "b", ".", "Jmjd1a", "/", "b", "were", "destabilized", "in", "mESCs", "lacking", "Suv39h", "/", "Setdb1", "/", "G9a", ",", "even", "though", "HP1", "was", "present", ".", "D", ")", "Functional", "evaluation", "of", "H3K9me2", "/", "3", "for", "confining", "HP1", "to", "chromatin", ".", "Subcellular", "localizations", "of", "HP1α", ",", "β", "and", "γ", "in", "TT2", "and", "mESCs", "lacking", "Suv39h", "/", "Setdb1", "/", "G9a", "were", "compared", ".", "α", "-", "Tubulin", ",", "Ezh2", ",", "and", "histone", "H3", "were", "used", "as", "representative", "markers", "for", "each", "fraction", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6C) Impact of Suv39h/Setdb1/G9a depletion on HP1-mediated protein stability regulation of Jmjd1a/b. Jmjd1a/b were destabilized in mESCs lacking Suv39h/Setdb1/G9a, even though HP1 was present.D) Functional evaluation of H3K9me2/3 for confining HP1 to chromatin. Subcellular localizations of HP1α, β and γ in TT2 and mESCs lacking Suv39h/Setdb1/G9a were compared. α-Tubulin, Ezh2, and histone H3 were used as representative markers for each fraction."}
{"words": ["Figure", "1Growth", "suppression", "in", "cancer", "cells", "after", "72h", "of", "treatment", "with", "APR", "-", "246", "+", "/", "-", "MRP1", "inhibitor", "MK", "-", "571", "as", "shown", "by", "the", "WST", "-", "1", "assay", "(", "n", "≥", "3", ",", "n", "shown", "in", "Table", "S1", ")", ".", "Cross", "in", "heatmap", "indicates", "no", "data", "available", ".", "Growth", "suppression", "in", "human", "dermal", "fibroblasts", "(", "HDF", ")", "by", "WST", "-", "1", "assay", "after", "72h", "of", "with", "APR", "-", "246", "+", "/", "-", "MK", "-", "571", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Mean", "IC50", "values", "(", "µM", ")", "for", "APR", "-", "246", "+", "/", "-", "20", "μM", "MK", "-", "571", "of", "21", "cell", "lines", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "Wilcoxon", "test", ".", "Each", "dot", "represents", "one", "cell", "line", ".", "Mean", "IC50", "values", "and", "n", "shown", "in", "Table", "S1", ".", "ZIP", "synergy", "scores", "of", "most", "synergistic", "area", "sub", "-", "grouped", "according", "to", "TP53", "gene", "status", "for", "21", "cell", "lines", ".", "Each", "dot", "represents", "one", "cell", "line", ".", "Scores", "and", "n", "are", "shown", "in", "Table", "S1", ".", "Sub", "-", "G1", "DNA", "content", "of", "OVCAR", "-", "3", "cells", "(", "R248Q", ")", "after", "APR", "-", "246", "+", "/", "-", "MK", "-", "571", "treatment", "as", "assessed", "by", "propidium", "iodide", "staining", "at", "48h", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "OVCAR", "-", "3", "cell", "confluency", "by", "IncuCyte", "®", "during", "72h", "of", "treatment", "with", "APR", "-", "246", "+", "/", "-", "MK", "-", "571", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Growth", "suppression", "in", "HCT116", "WT", "(", "n", "=", "4", ")", "and", "R248W", "cells", "(", "n", "=", "3", ")", "after", "72h", "treatment", "with", "APR", "-", "246", "+", "/", "-", "MRP1", "inhibitor", "Reversan", ",", "as", "shown", "by", "WST", "-", "1", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "MRP1", "(", "Cell", "Signaling", ".", ")", ",", "p53", "(", "DO", "-", "1", ")", "and", "GAPDH", "of", "HCT116", "WT", "and", "R248W", "cells", "48h", "after", "transfection", "with", "negative", "control", "siRNAs", "or", "siRNAs", "targeting", "MRP1", "or", "p53", ".", "Growth", "suppression", "(", "WST", "-", "1", "assay", ")", "of", "HCT116", "WT", "and", "R248W", "cells", "transfected", "with", "MRP1", "siRNA", "(", "n", "≥", "5", "and", "n", "≥", "2", "respectively", ")", "after", "48h", "APR", "-", "246", "treatment", ".", "Indicated", "values", "are", "average", "of", "four", "individual", "siRNAs", "targeting", "MRP1", "and", "two", "individual", "negative", "control", "siRNAs", ".", "Data", "and", "n", "of", "individual", "siRNAs", "are", "shown", "in", "Fig", "S1J", ",", "data", "is", "also", "part", "of", "Fig", "7B", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "MRP1", "(", "Cell", "Signaling", ".", ")", ",", "p53", "(", "DO", "-", "1", ")", "and", "GAPDH", "of", "HCT116", "WT", "and", "R248W", "cells", "72h", "after", "transfection", "with", "empty", "vector", "(", "EV", ")", "and", "MRP1", "expression", "vector", ".", "Growth", "suppression", "(", "WST", "-", "1", "assay", ")", "of", "HCT116", "WT", "and", "R248W", "cells", "transfected", "with", "empty", "vector", "(", "EV", ")", "and", "MRP1", "vector", "after", "72h", "APR", "-", "246", "treatment", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Data", "is", "also", "part", "of", "Fig", "S7E", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Growth suppression in cancer cells after 72h of treatment with APR-246 +/- MRP1 inhibitor MK-571 as shown by the WST-1 assay (n ≥ 3, n shown in Table S1). Cross in heatmap indicates no data available.Growth suppression in human dermal fibroblasts (HDF) by WST-1 assay after 72h of with APR-246 +/- MK-571 (n = 3). Mean IC50 values (µM) for APR-246 +/- 20 μM MK-571 of 21 cell lines. *p < 0.0001, Wilcoxon test. Each dot represents one cell line. Mean IC50 values and n shown in Table S1. ZIP synergy scores of most synergistic area sub-grouped according to TP53 gene status for 21 cell lines. Each dot represents one cell line. Scores and n are shown in Table S1. Sub-G1 DNA content of OVCAR-3 cells (R248Q) after APR-246 +/- MK-571 treatment as assessed by propidium iodide staining at 48h (n = 3).OVCAR-3 cell confluency by IncuCyte® during 72h of treatment with APR-246 +/- MK-571 (n = 3).Growth suppression in HCT116 WT (n = 4) and R248W cells (n = 3) after 72h treatment with APR-246 +/- MRP1 inhibitor Reversan, as shown by WST-1.Western blot analysis of MRP1 (Cell Signaling.), p53 (DO-1) and GAPDH of HCT116 WT and R248W cells 48h after transfection with negative control siRNAs or siRNAs targeting MRP1 or p53.Growth suppression (WST-1 assay) of HCT116 WT and R248W cells transfected with MRP1 siRNA (n ≥ 5 and n ≥ 2 respectively) after 48h APR-246 treatment. Indicated values are average of four individual siRNAs targeting MRP1 and two individual negative control siRNAs. Data and n of individual siRNAs are shown in Fig S1J, data is also part of Fig 7B.Western blot analysis of MRP1 (Cell Signaling.), p53 (DO-1) and GAPDH of HCT116 WT and R248W cells 72h after transfection with empty vector (EV) and MRP1 expression vector.Growth suppression (WST-1 assay) of HCT116 WT and R248W cells transfected with empty vector (EV) and MRP1 vector after 72h APR-246 treatment (n = 4). Data is also part of Fig S7E."}
{"words": ["Figure", "2Growth", "of", "Eso26", "xenografts", "(", "R248W", "mutant", "TP53", ")", "in", "mice", "treated", "with", "vehicle", ",", "APR", "-", "246", "(", "50mg", "/", "kg", ")", ",", "MK", "-", "571", "(", "50mg", "/", "kg", ")", "or", "APR", "-", "246", "and", "MK", "-", "571", "for", "16", "days", ".", "p", "values", "determined", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "correction", "at", "day", "18", ",", "n", "is", "indicated", "in", "the", "figure", ".", "Kaplan", "-", "Meier", "plot", "of", "time", "to", "reach", "1400", "mm3", "tumor", "volume", "in", "mice", "treated", "with", "vehicle", ",", "APR", "-", "246", "(", "50mg", "/", "kg", ")", ",", "MK", "-", "571", "(", "50mg", "/", "kg", ")", "or", "APR", "-", "246", "and", "MK", "-", "571", "for", "16", "days", ".", "Mice", "that", "were", "culled", "at", "ethical", "endpoints", "prior", "to", "reaching", "a", "tumor", "volume", "of", ">", "1400mm3", "are", "marked", "as", "censored", "observations", ".", "p", "values", "were", "determined", "by", "Log", "-", "rank", "(", "Mantell", "-", "Cox", ")", "test", "between", "different", "treatment", "groups", ".", "n", "is", "indicated", "in", "the", "figure", ".", "Quantification", "of", "Ki67", "immunohistochemistry", "staining", "of", "Eso26", "xenograft", "tumors", "at", "an", "early", "timepoint", "(", "5", "days", ")", "or", "post", "treatment", "/", "late", "timepoint", "(", ">", "22", "days", ")", "after", "treatment", "initiation", "with", "APR", "-", "246", "(", "50mg", "/", "kg", ")", "+", "/", "-", "MK", "-", "571", "(", "50mg", "/", "kg", ")", ".", "Dots", "indicate", "individual", "tumors", ".", "Quantification", "of", "cleaved", "caspase", "3", "immunohistochemistry", "staining", "of", "Eso26", "xenograft", "tumors", "in", "same", "tumors", "as", "shown", "in", "Fig", ".", "2C", ".", "Dots", "indicate", "individual", "tumors", ".", "Representative", "images", "of", "hematoxylin", "/", "eosin", "(", "H", "&", "E", ")", "staining", "and", "immunostaining", "of", "Ki67", ",", "cleaved", "caspase", "3", "and", "p53", ",", "post", "treatment", "/", "late", "timepoint", "(", ">", "22", "days", "after", "treatment", "initiation", ")", "with", "APR", "-", "246", "(", "50mg", "/", "kg", ")", "+", "/", "-", "MK", "-", "571", "(", "50mg", "/", "kg", ")", ".", "Growth", "suppression", "determined", "by", "the", "ATP", "-", "based", "CTG", "assay", "in", "colorectal", "cancer", "patient", "-", "derived", "organoids", "(", "colo", "-", "PDO", ")", "after", "treatment", "with", "APR", "-", "246", "+", "/", "-", "MK", "-", "571", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "IC50", "values", "(", "µM", ")", "APR", "-", "246", "+", "/", "-", "20", "μM", "MK", "-", "571", "in", "indicated", "PDOs", ".", "*", "p", "=", "0", ".", "04", ",", "paired", "t", "test", "(", "n", "=", "3", "except", "colo", "-", "PDO2", "and", "eso", "-", "PDO3", "where", "n", "=", "2", ")", ".", "Organoid", "area", "(", "in", "black", ",", "left", "y", "-", "axis", ")", "and", "PI", "intensity", "(", "in", "red", ",", "right", "y", "-", "axis", ")", "of", "colo", "-", "PDO1", "and", "colo", "-", "PDO2", "as", "determined", "by", "image", "analysis", "72h", "after", "treatment", "with", "APR", "-", "246", "+", "/", "-", "MK", "-", "571", "(", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Growth of Eso26 xenografts (R248W mutant TP53) in mice treated with vehicle, APR-246 (50mg/kg), MK-571 (50mg/kg) or APR-246 and MK-571 for 16 days. p values determined by one-way ANOVA with Tukey's correction at day 18, n is indicated in the figure.   Kaplan-Meier plot of time to reach 1400 mm3 tumor volume in mice treated with vehicle, APR-246 (50mg/kg), MK-571 (50mg/kg) or APR-246 and MK-571 for 16 days. Mice that were culled at ethical endpoints prior to reaching a tumor volume of >1400mm3 are marked as censored observations. p values were determined by Log-rank (Mantell-Cox) test between different treatment groups. n is indicated in the figure.   Quantification of Ki67 immunohistochemistry staining of Eso26 xenograft tumors at an early timepoint (5 days) or post treatment / late timepoint (>22 days) after treatment initiation with APR-246 (50mg/kg) +/- MK-571 (50mg/kg). Dots indicate individual tumors.Quantification of cleaved caspase 3 immunohistochemistry staining of Eso26 xenograft tumors in same tumors as shown in Fig. 2C. Dots indicate individual tumors. Representative images of hematoxylin/eosin (H&E) staining and immunostaining of Ki67, cleaved caspase 3 and p53, post treatment / late timepoint (>22 days after treatment initiation) with APR-246 (50mg/kg) +/- MK-571 (50mg/kg). Growth suppression determined by the ATP-based CTG assay in colorectal cancer patient-derived organoids (colo-PDO) after treatment with APR-246 +/- MK-571 (n = 3).IC50 values (µM) APR-246 +/- 20 μM MK-571 in indicated PDOs. *p = 0.04, paired t test (n = 3 except colo-PDO2 and eso-PDO3 where n = 2).Organoid area (in black, left y-axis) and PI intensity (in red, right y-axis) of colo-PDO1 and colo-PDO2 as determined by image analysis 72h after treatment with APR-246 +/- MK-571 (n = 3)."}
{"words": ["Figure", "314C", "accumulation", "(", "cpm", "/", "mg", "x", "ml", "-", "1", ")", "in", "11", "cell", "lines", "after", "24h", "14C", "-", "APR", "-", "246", "+", "/", "-", "MK", "-", "571", "treatment", "(", "n", "≥", "3", ")", ".", "*", "p", "=", "0", ".", "0006", ",", "paired", "t", "-", "test", ".", "14C", "-", "accumulation", "and", "n", "of", "individual", "cell", "lines", "as", "shown", "in", "Table", "S3", ".", "14C", "accumulation", "(", "cpm", "/", "mg", "x", "ml", "-", "1", ")", "in", "HCT116", "(", "WT", "and", "R248W", ")", "cells", "after", "24h", "+", "treatment", "with", "14C", "-", "APR", "-", "246", "+", "/", "-", "MK", "-", "571", "or", "Reversan", "(", "n", "≥", "3", ",", "each", "dots", "in", "figure", ")", ".", "14C", "accumulation", "(", "cpm", "/", "mg", "x", "ml", "-", "1", ")", "in", "HCT116", "WT", "and", "R248W", "cells", "(", "n", "≥", "3", "and", "≥", "2", ")", "transfected", "with", "MRP1", "siRNAs", "after", "24h", "of", "14C", "-", "APR", "-", "246", "treatment", ".", "Indicated", "values", "represent", "four", "individual", "MRP1", "siRNAs", "and", "two", "individual", "negative", "control", "(", "Ctrl", ")", "siRNAs", ",", "where", "each", "dot", "is", "an", "individual", "siRNA", ".", "Mean", "of", "14C", "-", "accumulation", "after", "treatment", "and", "n", "with", "individual", "siRNA", "sequences", "is", "shown", "in", "Table", "S4", ".", "*", "p", "=", "0", ".", "04", "and", "for", "R248W", "p", "=", "0", ".", "06", ",", "Wilcoxon", "matched", "pairs", "signed", "rank", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 314C accumulation (cpm/mg x ml-1) in 11 cell lines after 24h 14C -APR-246 +/- MK-571 treatment (n ≥ 3). *p = 0.0006, paired t-test. 14C-accumulation and n of individual cell lines as shown in Table S3.14C accumulation (cpm/mg x ml-1) in HCT116 (WT and R248W) cells after 24h +treatment with 14C -APR-246 +/- MK-571 or Reversan (n ≥ 3, each dots in figure).14C accumulation (cpm/mg x ml-1) in HCT116 WT and R248W cells (n ≥ 3 and ≥ 2) transfected with MRP1 siRNAs after 24h of 14C-APR-246 treatment. Indicated values represent four individual MRP1 siRNAs and two individual negative control (Ctrl) siRNAs, where each dot is an individual siRNA. Mean of 14C-accumulation after treatment and n with individual siRNA sequences is shown in Table S4. *p = 0.04 and for R248W p = 0.06, Wilcoxon matched pairs signed rank test."}
{"words": ["Figure", "4APR", "-", "246", "content", "in", "OVCAR", "-", "3", "cells", "(", "TP53", "R248Q", ")", "24h", "after", "treatment", "with", "APR", "-", "246", "+", "/", "-", "MK", "-", "571", ",", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "information", ":", "Indicated", "values", "are", "assessed", "by", "LC", "-", "MS", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "See", "also", "Appendix", "Figure", "S4", ".", "Glutathione", "-", "conjugated", "MQ", "(", "GS", "-", "MQ", ")", "in", "OVCAR", "-", "3", "cells", "after", "24h", "treatment", "with", "APR", "-", "246", "+", "/", "-", "MK", "-", "571", "(", "n", "=", "2", ")", ".", "Data", "information", ":", "Indicated", "values", "are", "assessed", "by", "LC", "-", "MS", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "See", "also", "Appendix", "Figure", "S4", ".", "Amount", "of", "GS", "-", "MQ", "at", "indicated", "timepoints", "after", "incubation", "of", "GS", "-", "MQ", "+", "/", "-", "NAC", "(", "n", "=", "2", ")", ".", "See", "Fig", ".", "EV4", "for", "chemical", "reaction", ".", "Data", "information", ":", "Indicated", "values", "are", "assessed", "by", "LC", "-", "MS", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "See", "also", "Appendix", "Figure", "S4", ".", "Amount", "of", "GS", "-", "MQ", "by", "LC", "-", "MS", "(", "green", "line", ",", "left", "axis", ")", "and", "NAC", "-", "MQ", "(", "purple", "line", ",", "right", "axis", ")", "over", "time", "after", "incubation", "of", "GS", "-", "MQ", "with", "NAC", "(", "n", "=", "2", ")", ".", "Values", "on", "y", "-", "axes", "are", "not", "comparable", "because", "GS", "-", "MQ", "and", "NAC", "-", "MQ", "have", "different", "response", "signals", "on", "MS", ".", "Data", "information", ":", "Indicated", "values", "are", "assessed", "by", "LC", "-", "MS", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "See", "also", "Appendix", "Figure", "S4", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4APR-246 content in OVCAR-3 cells (TP53 R248Q) 24h after treatment with APR-246 +/- MK-571, (n = 3). Data information: Indicated values are assessed by LC-MS. Data are represented as mean ± SEM. See also Appendix Figure S4.Glutathione-conjugated MQ (GS-MQ) in OVCAR-3 cells after 24h treatment with APR-246 +/- MK-571 (n = 2). Data information: Indicated values are assessed by LC-MS. Data are represented as mean ± SEM. See also Appendix Figure S4.Amount of GS-MQ at indicated timepoints after incubation of GS-MQ +/- NAC (n = 2). See Fig. EV4 for chemical reaction. Data information: Indicated values are assessed by LC-MS. Data are represented as mean ± SEM. See also Appendix Figure S4.Amount of GS-MQ by LC-MS (green line, left axis) and NAC-MQ (purple line, right axis) over time after incubation of GS-MQ with NAC (n = 2). Values on y-axes are not comparable because GS-MQ and NAC-MQ have different response signals on MS. Data information: Indicated values are assessed by LC-MS. Data are represented as mean ± SEM. See also Appendix Figure S4."}
{"words": ["Figure", "5Mean", "IC50", "(", "µM", ")", "values", "of", "APR", "-", "246", "in", "17", "different", "cell", "lines", "(", "n", "≥", "3", ")", "as", "shown", "by", "WST", "-", "1", ".", "*", "p", "=", "0", ".", "03", ",", "Mann", "Whitney", "test", ".", "Mean", "IC50", "(", "µM", ")", "values", "for", "APR", "-", "246", "treatment", "and", "n", "for", "individual", "cell", "lines", "are", "also", "shown", "in", "Fig", "1C", "and", "listed", "in", "Table", "S1", ".", "Data", "information", ":", "TP53", "status", "is", "indicated", "for", "each", "cell", "line", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "See", "also", "Figure", "EV5", "and", "Appendix", "Figure", "S5", ".", "Box", "-", "and", "-", "whisker", "plot", "of", "Pearson", "correlations", "between", "PRIMA", "-", "1", "area", "-", "under", "-", "the", "-", "curve", "(", "AUC", ")", "and", "the", "levels", "of", "225", "different", "metabolites", "from", "the", "DepMap", "portal", ".", "Central", "band", "indicates", "median", ",", "boxes", "indicate", "25th", "and", "75th", "percentile", ",", "and", "whiskers", "show", "2", ".", "5th", "and", "97", ".", "5th", "percentile", "outlier", "metabolites", ".", "High", "GSH", "and", "GSSG", "(", "in", "red", ")", "correlate", "with", "low", "PRIMA", "-", "1", "sensitivity", ".", "Data", "information", ":", "TP53", "status", "is", "indicated", "for", "each", "cell", "line", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "See", "also", "Figure", "EV5", "and", "Appendix", "Figure", "S5", ".", "Total", "intracellular", "glutathione", "(", "GSH", "+", "GSSG", ")", "as", "shown", "by", "glutathione", "reductase", "(", "GR", ")", "re", "-", "cycling", "assay", "in", "H1299", "R175H", "(", "tet", "-", "off", ")", "(", "+", "/", "-", "doxycycline", ")", "and", "H1299", "-", "/", "-", "cells", "24h", "after", "seeding", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Indicated", "values", "are", "fold", "change", "compared", "to", "mutant", "TP53", "cells", ".", "Data", "information", ":", "TP53", "status", "is", "indicated", "for", "each", "cell", "line", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "See", "also", "Figure", "EV5", "and", "Appendix", "Figure", "S5", ".", "Total", "intracellular", "glutathione", "(", "GSH", "+", "GSSG", ")", "as", "shown", "by", "GR", "re", "-", "cycling", "assay", "in", "untreated", "HCT116", "(", "R248W", ",", "WT", "and", "-", "/", "-", ")", "cells", "48h", "after", "seeding", "(", "n", "=", "3", ",", "5", "or", "2", "respectively", ")", ".", "Indicated", "values", "are", "fold", "change", "to", "mutant", "TP53", "cells", ".", "Part", "of", "this", "data", "is", "shown", "in", "Fig", ".", "EV4", ".", "Data", "information", ":", "TP53", "status", "is", "indicated", "for", "each", "cell", "line", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "See", "also", "Figure", "EV5", "and", "Appendix", "Figure", "S5", ".", "Thiol", "tracker", "staining", "by", "flow", "cytometry", "48h", "after", "seeding", "of", "the", "indicated", "untreated", "cells", "(", "n", "=", "2", ")", "Data", "information", ":", "TP53", "status", "is", "indicated", "for", "each", "cell", "line", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "See", "also", "Figure", "EV5", "and", "Appendix", "Figure", "S5", ".", "Correlation", "between", "14C", "accumulation", "(", "cpm", "/", "mg", "x", "ml", "-", "1", ")", "after", "treatment", "with", "25", "µM", "14C", "-", "APR", "-", "246", "and", "IC50", "(", "µM", ")", "values", "for", "APR", "-", "246", "in", "11", "cell", "lines", "(", "n", "≥", "3", ")", "(", "r", "=", "-", "0", ".", "66", ",", "p", "=", "0", ".", "03", ",", "Pearson", "correlation", ")", ".", "Each", "dot", "represents", "one", "cell", "line", ",", "14C", "accumulation", "data", "are", "shown", "in", "Fig", "3B", "and", "values", "and", "n", "for", "individual", "cell", "lines", "are", "listed", "in", "Table", "S1", "and", "S3", ".", "Data", "information", ":", "TP53", "status", "is", "indicated", "for", "each", "cell", "line", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "See", "also", "Figure", "EV5", "and", "Appendix", "Figure", "S5", ".", "ABCC1", "mRNA", "Expression", ",", "RSEM", "(", "Batch", "normalized", "from", "Illumina", "HiSeq", "_", "RNASeqV2", ")", "in", "lung", "cancer", "(", "luad", "&", "lusc", "studies", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ")", "and", "colon", "adenocarcinoma", "(", "coad", "study", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "005", ")", "grouped", "into", "having", "no", "alterations", "or", "putative", "driver", "missense", "mutations", "in", "TP53", ".", "Statistical", "analysis", "by", "Mann", "Whitney", "test", ",", "n", "is", "indicated", "in", "the", "figure", ".", "Data", "information", ":", "TP53", "status", "is", "indicated", "for", "each", "cell", "line", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "See", "also", "Figure", "EV5", "and", "Appendix", "Figure", "S5", ".", "14C", "accumulation", "(", "cpm", "/", "mg", "x", "ml", "-", "1", ")", "in", "H1299", "R175H", "cells", "(", "+", "/", "-", "doxycycline", ")", "and", "H1299", "-", "/", "-", "cells", "after", "24h", "treatment", "with", "14C", "-", "APR", "-", "246", "(", "n", "=", "2", ")", ".", "Data", "information", ":", "TP53", "status", "is", "indicated", "for", "each", "cell", "line", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "See", "also", "Figure", "EV5", "and", "Appendix", "Figure", "S5", ".", "Growth", "suppression", "in", "H1299", "R175H", "cells", "(", "+", "/", "-", "doxycycline", ")", "and", "H1299", "-", "/", "-", "cells", "treated", "for", "72h", "with", "APR", "-", "246", "as", "shown", "by", "WST", "-", "1", "assay", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "information", ":", "TP53", "status", "is", "indicated", "for", "each", "cell", "line", ".", "Data", "are", "represented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "See", "also", "Figure", "EV5", "and", "Appendix", "Figure", "S5", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Mean IC50 (µM) values of APR-246 in 17 different cell lines (n ≥ 3) as shown by WST-1. *p = 0.03, Mann Whitney test. Mean IC50 (µM) values for APR-246 treatment and n for individual cell lines are also shown in Fig 1C and listed in Table S1. Data information: TP53 status is indicated for each cell line. Data are represented as mean ± SEM. See also Figure EV5 and Appendix Figure S5.Box-and-whisker plot of Pearson correlations between PRIMA-1 area-under-the-curve (AUC) and the levels of 225 different metabolites from the DepMap portal. Central band indicates median, boxes indicate 25th and 75th percentile, and whiskers show 2.5th and 97.5th percentile outlier metabolites. High GSH and GSSG (in red) correlate with low PRIMA-1 sensitivity. Data information: TP53 status is indicated for each cell line. Data are represented as mean ± SEM. See also Figure EV5 and Appendix Figure S5. Total intracellular glutathione (GSH+GSSG) as shown by glutathione reductase (GR) re-cycling assay in H1299 R175H (tet-off) (+/- doxycycline) and H1299 -/- cells 24h after seeding (n = 3). Indicated values are fold change compared to mutant TP53 cells. Data information: TP53 status is indicated for each cell line. Data are represented as mean ± SEM. See also Figure EV5 and Appendix Figure S5.  Total intracellular glutathione (GSH+GSSG) as shown by GR re-cycling assay in untreated HCT116 (R248W, WT and -/-) cells 48h after seeding (n = 3, 5 or 2 respectively). Indicated values are fold change to mutant TP53 cells. Part of this data is shown in Fig. EV4. Data information: TP53 status is indicated for each cell line. Data are represented as mean ± SEM. See also Figure EV5 and Appendix Figure S5. Thiol tracker staining by flow cytometry 48h after seeding of the indicated untreated cells (n = 2) Data information: TP53 status is indicated for each cell line. Data are represented as mean ± SEM. See also Figure EV5 and Appendix Figure S5. Correlation between 14C accumulation (cpm/mg x ml-1) after treatment with 25 µM 14C-APR-246 and IC50 (µM) values for APR-246 in 11 cell lines (n ≥ 3) (r = -0.66, p = 0.03, Pearson correlation). Each dot represents one cell line, 14C accumulation data are shown in Fig 3B and values and n for individual cell lines are listed in Table S1 and S3. Data information: TP53 status is indicated for each cell line. Data are represented as mean ± SEM. See also Figure EV5 and Appendix Figure S5.  ABCC1 mRNA Expression, RSEM (Batch normalized from Illumina HiSeq_RNASeqV2) in lung cancer (luad & lusc studies, *p<0.0001) and colon adenocarcinoma (coad study, *p=0.005) grouped into having no alterations or putative driver missense mutations in TP53. Statistical analysis by Mann Whitney test, n is indicated in the figure. Data information: TP53 status is indicated for each cell line. Data are represented as mean ± SEM. See also Figure EV5 and Appendix Figure S5.  14C accumulation (cpm/mg x ml-1) in H1299 R175H cells (+/- doxycycline) and H1299 -/- cells after 24h treatment with 14C-APR-246 (n = 2). Data information: TP53 status is indicated for each cell line. Data are represented as mean ± SEM. See also Figure EV5 and Appendix Figure S5.  Growth suppression in H1299 R175H cells (+/- doxycycline) and H1299 -/- cells treated for 72h with APR-246 as shown by WST-1 assay (n = 3). Data information: TP53 status is indicated for each cell line. Data are represented as mean ± SEM. See also Figure EV5 and Appendix Figure S5. "}
{"words": ["Figure", "6", "Total", "intracellular", "glutathione", "(", "GSH", "+", "GSSG", "per", "106", "cells", ")", ",", "as", "determined", "by", "GR", "re", "-", "cycling", "assay", "after", "24h", "MK", "-", "571", "treatment", "in", "six", "different", "cell", "lines", "(", "n", "≥", "3", ",", "except", "HCT116", "WT", "n", "=", "2", ")", ".", "*", "p", "=", "0", ".", "014", ",", "Paired", "t", "test", ".", "Each", "dot", "represents", "one", "cell", "line", ",", "see", "Fig", ".", "EV6A", "for", "individual", "cell", "lines", "and", "n", ".", "Intracellular", "oxidized", "glutathione", "(", "GSSG", "per", "106", "cells", ")", "as", "shown", "by", "LC", "-", "MS", "in", "OVCAR", "-", "3", "(", "R248Q", "TP53", ")", "cells", "at", "24h", "treatment", "with", "APR", "-", "246", "+", "/", "-", "MK", "-", "571", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Intracellular", "reduced", "glutathione", "(", "GSH", "per", "106", "cells", ")", "as", "shown", "by", "LC", "-", "MS", "in", "OVCAR", "-", "3", "cells", "at", "24h", "treatment", "with", "APR", "-", "246", "+", "/", "-", "MK", "-", "571", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "MRP1", "(", "Cell", "Signaling", ")", ",", "xCT", "and", "GAPDH", "of", "OVCAR", "-", "3", "cells", "treated", "with", "APR", "-", "246", "+", "/", "-", "MK", "-", "571", "for", "24h", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "MRP1", "(", "Cell", "Signaling", ")", ",", "xCT", "and", "GAPDH", "of", "HCT116", "WT", "and", "R248W", "cells", "treated", "with", "APR", "-", "246", "+", "/", "-", "MK", "-", "571", "for", "24h", ".", "Intracellular", "cystine", "(", "CySS", "per", "106", "cells", ")", "as", "shown", "by", "LC", "-", "MS", "in", "OVCAR", "-", "3", "cells", "at", "24h", "treatment", "with", "APR", "-", "246", "+", "/", "-", "MK", "-", "571", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Intracellular", "cysteine", "(", "Cys", "per", "106", "cells", ")", "as", "shown", "by", "LC", "-", "MS", "in", "OVCAR", "-", "3", "cells", "at", "24h", "treatment", "with", "APR", "-", "246", "+", "/", "-", "MK", "-", "571", "(", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6 Total intracellular glutathione (GSH + GSSG per 106 cells), as determined by GR re-cycling assay after 24h MK-571 treatment in six different cell lines (n ≥ 3, except HCT116 WT n = 2). *p = 0.014, Paired t test. Each dot represents one cell line, see Fig. EV6A for individual cell lines and n. Intracellular oxidized glutathione (GSSG per 106 cells) as shown by LC-MS in OVCAR-3 (R248Q TP53) cells at 24h treatment with APR-246 +/- MK-571 (n = 3). Intracellular reduced glutathione (GSH per 106 cells) as shown by LC-MS in OVCAR-3 cells at 24h treatment with APR-246 +/- MK-571 (n = 3).  Western blot analysis of MRP1 (Cell Signaling), xCT and GAPDH of OVCAR-3 cells treated with APR-246 +/- MK-571 for 24h. Western blot analysis of MRP1 (Cell Signaling), xCT and GAPDH of HCT116 WT and R248W cells treated with APR-246 +/- MK-571 for 24h. Intracellular cystine (CySS per 106 cells) as shown by LC-MS in OVCAR-3 cells at 24h treatment with APR-246 +/- MK-571 (n = 3).  Intracellular cysteine (Cys per 106 cells) as shown by LC-MS in OVCAR-3 cells at 24h treatment with APR-246 +/- MK-571 (n = 3). "}
{"words": ["Figure", "7", "14C", "accumulation", "(", "cpm", "/", "mg", "x", "ml", "-", "1", ")", "in", "HCT116", "WT", "and", "R248W", "mutant", "TP53", "cells", "+", "-", "transfected", "with", "MRP1", "or", "xCT", "siRNA", "following", "24h", "of", "14C", "-", "APR", "-", "246", "treatment", "+", "/", "-", "MK", "-", "571", ".", "Indicated", "values", "are", "mean", "values", "from", "four", "MRP1", "siRNAs", "(", "n", "≥", "3", ")", ",", "three", "xCT", "siRNAs", "(", "n", "=", "1", "-", "2", ")", "and", "two", "control", "siRNAs", "(", "n", "≥", "3", ")", ".", "Mean", "14C", "-", "accumulation", "after", "treatment", "and", "n", "of", "individual", "siRNAs", "is", "shown", "in", "Table", "S4", ".", "Data", "for", "control", "and", "MRP1", "siRNA", "after", "14C", "-", "APR", "-", "246", "treatment", "is", "also", "shown", "in", "Fig", "3D", ".", "Growth", "suppression", "in", "HCT116", "WT", "and", "R248W", "cells", "transfected", "with", "MRP1", "or", "xCT", "siRNA", "after", "48h", "of", "APR", "-", "246", "treatment", "as", "shown", "by", "WST", "-", "1", "assay", ".", "Indicated", "values", "are", "mean", "values", "of", "four", "MRP1", "siRNAs", "(", "n", "≥", "3", ")", ",", "three", "xCT", "siRNAs", "(", "n", "=", "1", "-", "2", ")", "and", "two", "control", "siRNAs", "(", "n", "≥", "3", ")", ".", "Data", "for", "control", "and", "MRP1", "siRNA", "after", "APR", "-", "246", "single", "treatment", "are", "also", "included", "in", "Fig", "1I", ".", "Values", "and", "n", "for", "individual", "siRNA", "shown", "in", "Fig", ".", "S7C", ".", "Total", "intracellular", "glutathione", "(", "GSH", "+", "GSSG", "per", "106", "cells", ")", "in", "HCT116", "WT", "cells", "as", "shown", "by", "GR", "re", "-", "cycling", "assay", "48h", "post", "transfection", "of", "siRNA", ".", "Indicated", "values", "are", "means", "from", "four", "MRP1", "siRNAs", "(", "n", "=", "3", ")", ",", "two", "xCT", "siRNA", "(", "n", "=", "2", "-", "3", ")", "and", "two", "control", "siRNA", "(", "n", "=", "2", "-", "3", ")", ".", "Total", "intracellular", "glutathione", "(", "GSH", "+", "GSSG", "per", "106", "cells", ")", "in", "HCT116", "WT", "and", "R248W", "cells", "measured", "by", "GR", "re", "-", "cycling", "assay", "after", "24h", "of", "MK", "-", "571", "or", "sulfasalazine", "(", "SSZ", ")", "treatment", "(", "n", "≥", "3", ",", "except", "SSZ", "where", "n", "=", "2", ",", "n", "indicated", "by", "dots", ")", ".", "14C", "accumulation", "(", "cpm", "/", "mg", "x", "ml", "-", "1", ")", "in", "HCT116", "WT", "and", "R248W", "cells", "at", "24h", "treatment", "with", "14C", "-", "APR", "-", "246", ",", "combined", "with", "MK", "-", "571", "or", "sulfasalazine", "(", "SSZ", ")", ",", "(", "n", "≥", "4", ",", "except", "SSZ", "where", "n", "=", "2", ",", "n", "indicated", "by", "dots", ")", ".", "Data", "for", "14C", "-", "APR", "-", "246", "+", "/", "-", "MK", "-", "571", "is", "also", "shown", "in", "Fig", "3C", "and", "S3D", ".", "Protein", "concentration", "of", "HCT116", "WT", "and", "R248W", "assessed", "by", "DCTM", "Protein", "assay", "at", "24h", "treatment", "with", "APR", "-", "246", "+", "/", "-", "MK", "-", "571", "or", "sulfasalazine", "(", "SSZ", ")", ",", "or", "untreated", "(", "n", "≥", "4", ",", "except", "SSZ", "where", "n", "=", "2", ",", "n", "indicated", "by", "dots", ")", "OVCAR", "-", "3", "(", "R248Q", "TP53", ")", "confluence", "by", "IncuCyte", "®", "during", "72h", "treatment", "with", "APR", "-", "246", "+", "/", "-", "MK", "-", "571", "or", "sulfasalzine", "(", "SSZ", ")", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Part", "of", "the", "data", "are", "shown", "in", "Fig", "1G", ".", "Growth", "suppression", "in", "OVCAR", "-", "3", "cells", "as", "determined", "by", "IncuCyte", "®", "during", "72h", "treatment", "with", "APR", "-", "246", "+", "/", "-", "MK", "-", "571", "or", "sulfasalazine", "(", "SSZ", ")", "depicted", "as", "heatmaps", "(", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7 14C accumulation (cpm/mg x ml-1) in HCT116 WT and R248W mutant TP53 cells +-transfected with MRP1 or xCT siRNA following 24h of 14C -APR-246 treatment +/- MK-571 . Indicated values are mean values from four MRP1 siRNAs (n ≥ 3), three xCT siRNAs (n = 1-2) and two control siRNAs (n ≥ 3). Mean 14C -accumulation after treatment and n of individual siRNAs is shown in Table S4 . Data for control and MRP1 siRNA after 14C -APR-246 treatment is also shown in Fig 3D.  Growth suppression in HCT116 WT and R248W cells transfected with MRP1 or xCT siRNA after 48h of APR-246 treatment as shown by WST-1 assay. Indicated values are mean values of four MRP1 siRNAs (n ≥ 3), three xCT siRNAs (n =1-2) and two control siRNAs (n ≥ 3). Data for control and MRP1 siRNA after APR-246 single treatment are also included in Fig 1I. Values and n for individual siRNA shown in Fig. S7C.  Total intracellular glutathione (GSH + GSSG per 106 cells) in HCT116 WT cells as shown by GR re-cycling assay 48h post transfection of siRNA. Indicated values are means from four MRP1 siRNAs (n = 3), two xCT siRNA (n = 2-3) and two control siRNA (n = 2-3).  Total intracellular glutathione (GSH + GSSG per 106 cells) in HCT116 WT and R248W cells measured by GR re-cycling assay after 24h of MK-571 or sulfasalazine (SSZ) treatment (n ≥ 3, except SSZ where n = 2, n indicated by dots).  14C accumulation (cpm/mg x ml-1) in HCT116 WT and R248W cells at 24h treatment with 14C -APR-246, combined with MK-571 or sulfasalazine (SSZ), (n ≥ 4, except SSZ where n = 2, n indicated by dots). Data for 14C -APR-246 +/- MK-571 is also shown in Fig 3C and S3D.  Protein concentration of HCT116 WT and R248W assessed by DCTM Protein assay at 24h treatment with APR-246 +/- MK-571 or sulfasalazine (SSZ), or untreated (n ≥ 4, except SSZ where n = 2, n indicated by dots)  OVCAR-3 (R248Q TP53) confluence by IncuCyte® during 72h treatment with APR-246 +/- MK-571 or sulfasalzine (SSZ) (n = 3). Part of the data are shown in Fig 1G. Growth suppression in OVCAR-3 cells as determined by IncuCyte® during 72h treatment with APR-246 +/- MK-571 or sulfasalazine (SSZ) depicted as heatmaps (n = 3). "}
{"words": ["figf1a", ",", "The", "2", "-", "bp", "deletion", "identified", "in", "exon", "9b", "of", "patient", "1", ".", "b", ",", "The", "T", "-", "to", "-", "A", "nonsense", "mutation", "in", "exon", "4", "of", "patient", "2", "(", "stop", "codon", "is", "underlined", ")", ".", "c", ",", "Upper", "panel", ",", "intronic", "mutation", "in", "patient", "3", ";", "lower", "panel", ",", "sequencing", "of", "the", "RT", "-", "PCR", "product", "in", "patient", "3", ",", "showing", "exon", "-", "6", "skipping", ".", "d", ",", "Upper", "panel", ",", "The", "G", "-", "to", "-", "A", "point", "mutation", "at", "the", "splice", "-", "donor", "site", "in", "intron", "5", "of", "patient", "6", ";", "lower", "panel", ",", "sequencing", "of", "the", "RT", "-", "PCR", "product", "in", "patient", "6", ",", "showing", "a", "6", "-", "bp", "insertion", "at", "the", "junction", "between", "exons", "5", "and", "6", ".", "The", "inserted", "sequence", "(", "underlined", ")", "is", "derived", "from", "the", "first", "six", "nucleotides", "of", "intron", "5", "(", "underlined", ")", ",", "which", "creates", "a", "stop", "codon", "(", "dotted", ")", ".", "Most", "probably", ",", "nucleotides", "7", "and", "8", ",", "GT", "(", "double", "underlined", ")", ",", "in", "intron", "5", "are", "alternatively", "recognized", "as", "a", "splice", "-", "donor", "site", ".", "e", ",", "Upper", "panel", ",", "the", "10", "-", "bp", "deletion", "in", "patient", "9", ".", "This", "mutation", "deletes", "four", "nucleotides", "from", "intron", "5", "and", "six", "from", "exon", "6", ".", "Lower", "panel", ",", "sequence", "of", "the", "RT", "-", "PCR", "product", "in", "patient", "9", "reveals", "the", "deletion", "of", "the", "10", "nucleotides", "at", "the", "5", "′", "end", "of", "exon", "6", ".", "The", "'", "AG", "'", "(", "double", "underlined", ")", "in", "exon", "6", "immediately", "after", "the", "genomic", "DNA", "deletion", "appears", "to", "be", "recognized", "as", "an", "alternative", "splice", "-", "acceptor", "site", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf1a, The 2-bp deletion identified in exon 9b of patient 1. b, The T-to-A nonsense mutation in exon 4 of patient 2 (stop codon is underlined). c, Upper panel, intronic mutation in patient 3; lower panel, sequencing of the RT-PCR product in patient 3, showing exon-6 skipping. d, Upper panel, The G-to-A point mutation at the splice-donor site in intron 5 of patient 6; lower panel, sequencing of the RT-PCR product in patient 6, showing a 6-bp insertion at the junction between exons 5 and 6. The inserted sequence (underlined) is derived from the first six nucleotides of intron 5 (underlined), which creates a stop codon (dotted). Most probably, nucleotides 7 and 8, GT (double underlined), in intron 5 are alternatively recognized as a splice-donor site. e, Upper panel, the 10-bp deletion in patient 9. This mutation deletes four nucleotides from intron 5 and six from exon 6. Lower panel, sequence of the RT-PCR product in patient 9 reveals the deletion of the 10 nucleotides at the 5′ end of exon 6. The 'AG' (double underlined) in exon 6 immediately after the genomic DNA deletion appears to be recognized as an alternative splice-acceptor site."}
{"words": ["figf2Figure", "2", "Representation", "of", "the", "mutant", "LAMP", "-", "2b", ".", "'", "Normal", "'", "represents", "the", "LAMP", "-", "2b", "amino", "-", "acid", "sequence", ".", "Because", "patient", "1", ",", "who", "developed", "full", "DD", "symptoms", ",", "has", "a", "mutation", "in", "exon", "9b", ",", "the", "LAMP", "-", "2b", "isoform", "is", "most", "probably", "responsible", "for", "DD", ".", "Residue", "265", ",", "one", "of", "the", "putative", "disulphide", "-", "bond", "-", "creating", "cysteines", ",", "and", "two", "glycosylation", "sites", "are", "lost", "by", "exon", "-", "6", "skipping", "in", "patient", "3", ",", "which", "probably", "results", "in", "a", "significant", "change", "in", "the", "secondary", "structure", ".", "Black", "boxes", "represent", "the", "loops", "created", "between", "two", "cystein", "residues", "flanking", "each", "of", "the", "four", "loop", "regions", ";", "Y", "depicts", "a", "glycosylation", "site", ";", "hatched", "boxes", "show", "altered", "amino", "acids", "caused", "by", "frameshift", "mutations", ";", "dashes", "represent", "missing", "amino", "acids", "due", "to", "exon", "-", "6", "skipping", "in", "patient", "3", ".", "All", "of", "the", "other", "mutant", "proteins", "lack", "the", "transmembrane", "domain", "(", "grey", "bar", ")", "because", "of", "nonsense", "or", "frameshift", "mutations", ".", "Thus", ",", "those", "molecules", "cannot", "function", "as", "lysosomal", "'", "membrane", "'", "proteins", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf2Figure 2 Representation of the mutant LAMP-2b. 'Normal' represents the LAMP-2b amino-acid sequence. Because patient 1, who developed full DD symptoms, has a mutation in exon 9b, the LAMP-2b isoform is most probably responsible for DD. Residue 265, one of the putative disulphide-bond-creating cysteines, and two glycosylation sites are lost by exon-6 skipping in patient 3, which probably results in a significant change in the secondary structure. Black boxes represent the loops created between two cystein residues flanking each of the four loop regions; Y depicts a glycosylation site; hatched boxes show altered amino acids caused by frameshift mutations; dashes represent missing amino acids due to exon-6 skipping in patient 3. All of the other mutant proteins lack the transmembrane domain (grey bar) because of nonsense or frameshift mutations. Thus, those molecules cannot function as lysosomal 'membrane' proteins."}
{"words": ["figf3a", ",", "Skeletal", "muscle", ".", "Muscle", "extracts", "from", "patients", "1", "-", "6", "and", "10", "and", "a", "control", "were", "blotted", "and", "labelled", "with", "antibodies", "against", "LAMP", "-", "2", "(", "top", "panel", ")", "and", "β", "-", "actin", "(", "bottom", "panel", ")", ".", "LAMP", "-", "2", "is", "deficient", "in", "all", "muscles", "examined", "except", "the", "sample", "from", "patient", "1", "that", "showed", "a", "trace", "amount", "of", "protein", ",", "which", "is", "probably", "the", "LAMP", "-", "2a", "isoform", ".", "In", "support", "of", "this", "idea", ",", "LAMP", "-", "2b", "is", "the", "principal", "LAMP", "-", "2", "species", "in", "skeletal", "muscle6", ".", "Numbers", "denote", "patients", "as", "in", "Table", "1", ";", "C", ",", "control", ".", "b", ",", "Heart", ".", "Protein", "was", "extracted", "from", "cardiac", "muscle", "of", "patient", "4", "and", "a", "control", ",", "blotted", "onto", "a", "nitrocellulose", "membrane", ",", "and", "labelled", "with", "the", "antibodies", "against", "LAMP", "-", "2", "(", "too", "panel", ")", "and", "β", "-", "actin", "(", "bottom", "panel", ")", ".", "LAMP", "-", "2", "is", "deficient", "also", "in", "cardiac", "muscle", ".", "C", ",", "control", ";", "4", ",", "patient", "4", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf3a, Skeletal muscle. Muscle extracts from patients 1-6 and 10 and a control were blotted and labelled with antibodies against LAMP-2 (top panel) and β-actin (bottom panel). LAMP-2 is deficient in all muscles examined except the sample from patient 1 that showed a trace amount of protein, which is probably the LAMP-2a isoform. In support of this idea, LAMP-2b is the principal LAMP-2 species in skeletal muscle6. Numbers denote patients as in Table 1; C, control. b, Heart. Protein was extracted from cardiac muscle of patient 4 and a control, blotted onto a nitrocellulose membrane, and labelled with the antibodies against LAMP-2 (too panel) and β-actin (bottom panel). LAMP-2 is deficient also in cardiac muscle. C, control; 4, patient 4."}
{"words": ["figf4Serial", "transverse", "sections", "of", "the", "biopsiedmuscle", "from", "six", "DD", "patients", ",", "and", "samples", "from", "a", "XMEA", "patient", "and", "a", "normal", "control", ",", "were", "immunostained", "with", "antibodies", "against", "LAMP", "-", "2", "and", "limp", "-", "I", ".", "LAMP", "-", "2", "is", "absent", "in", "all", "DD", "muscles", "(", "patient", "6", "shown", "here", ")", ",", "whereas", "it", "is", "present", "in", "the", "XMEA", "muscle", ".", "The", "antibody", "against", "limp", "-", "I", "highlighted", "vacuoles", "in", "both", "DD", "and", "XMEA", "muscles", ".", "LAMP", "-", "1", "antibody", "faintly", "stained", "both", "DD", "and", "XMEA", "muscles", ",", "suggesting", "that", "the", "expression", "level", "of", "LAMP", "-", "1", "might", "be", "lower", "in", "skeletal", "muscle", "than", "LAMP", "-", "2", "or", "limp", "-", "I", "(", "data", "not", "shown", ")", ".", "The", "muscle", "from", "the", "patient", "without", "a", "lamp", "-", "2", "mutation", "also", "showed", "LAMP", "-", "2", "deficiency", "on", "immunohistochemistry", "similar", "to", "genetically", "proven", "DD", "patients", "with", "primary", "LAMP", "-", "2", "deficiency", "(", "data", "not", "shown", ")", ".", "The", "immunohistochemical", "stains", "of", "LAMP", "-", "2", ",", "limp", "-", "I", ",", "and", "LAMP", "-", "1", "in", "normal", "muscle", "shows", "numerous", "tiny", "particles", "and", "accentuates", "type", "1", "fibres", ".", "H", "&", "amp", ";", "amp", ";", "E", ",", "haematoxylin", "and", "eosin", ",", "original", "magnification", "×", "150", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf4Serial transverse sections of the biopsiedmuscle from six DD patients, and samples from a XMEA patient and a normal control, were immunostained with antibodies against LAMP-2 and limp-I. LAMP-2 is absent in all DD muscles (patient 6 shown here), whereas it is present in the XMEA muscle. The antibody against limp-I highlighted vacuoles in both DD and XMEA muscles. LAMP-1 antibody faintly stained both DD and XMEA muscles, suggesting that the expression level of LAMP-1 might be lower in skeletal muscle than LAMP-2 or limp-I (data not shown). The muscle from the patient without a lamp-2 mutation also showed LAMP-2 deficiency on immunohistochemistry similar to genetically proven DD patients with primary LAMP-2 deficiency (data not shown). The immunohistochemical stains of LAMP-2, limp-I, and LAMP-1 in normal muscle shows numerous tiny particles and accentuates type 1 fibres. H&amp;amp;E, haematoxylin and eosin, original magnification ×150."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "Representative", "immunofluorescence", "images", "of", "HeLa", "cells", "in", "various", "mitotic", "stages", ".", "Cells", "were", "extracted", ",", "fixed", ",", "and", "co", "-", "stained", "for", "Cyclin", "B2", "(", "green", ")", ",", "ACA", "(", "red", ")", ",", "and", "DNA", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "(", "C", ")", "Representative", "immunofluorescence", "images", "of", "HeLa", "cells", "that", "were", "fixed", "and", "co", "-", "stained", "for", "Cyclin", "B2", "(", "green", ")", ",", "mAb414", "(", "red", ")", ",", "and", "DNA", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "Representative", "immunofluorescence", "images", "of", "HeLa", "cells", "treated", "with", "an", "indicated", "siRNA", "Cells", "were", "extracted", ",", "fixed", ",", "and", "co", "-", "stained", "for", "Cyclin", "B2", "(", "green", ")", ",", "ACA", "(", "red", ")", ",", "and", "DNA", "(", "blue", ")", ".", "Representative", "immunofluorescence", "images", "of", "HeLa", "cells", "treated", "with", "an", "indicated", "various", "drugs", "(", "E", ")", ".", "Cells", "were", "extracted", ",", "fixed", ",", "and", "co", "-", "stained", "for", "Cyclin", "B2", "(", "green", ")", ",", "ACA", "(", "red", ")", ",", "and", "DNA", "(", "blue", ")", ".", "(", "F", ")", "HeLa", "cells", "were", "synchronized", "by", "double", "thymidine", ",", "then", "released", "and", "collected", "at", "selected", "time", "points", ".", "Cell", "lysate", "samples", "were", "resolved", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "using", "anti", "-", "Cyclin", "B1", "antibody", ",", "anti", "-", "Cyclin", "B2", "antibody", ",", "or", "anti", "-", "β", "-", "Actin", "antibody", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B) Representative immunofluorescence images of HeLa cells in various mitotic stages. Cells were extracted, fixed, and co-stained for Cyclin B2 (green), ACA (red), and DNA (blue). Scale bar, 10 µm.(C) Representative immunofluorescence images of HeLa cells that were fixed and co-stained for Cyclin B2 (green), mAb414 (red), and DNA (blue). Scale bar, 10 µm.Representative immunofluorescence images of HeLa cells treated with an indicated siRNA Cells were extracted, fixed, and co-stained for Cyclin B2 (green), ACA (red), and DNA (blue).Representative immunofluorescence images of HeLa cells treated with an indicated various drugs (E). Cells were extracted, fixed, and co-stained for Cyclin B2 (green), ACA (red), and DNA (blue).(F) HeLa cells were synchronized by double thymidine, then released and collected at selected time points. Cell lysate samples were resolved by SDS-PAGE and analyzed by Western blotting using anti-Cyclin B1 antibody, anti-Cyclin B2 antibody, or anti-β-Actin antibody."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "B", ")", "Immunoprecipitation", "assay", "performed", "with", "two", "different", "rabbit", "Cyclin", "B2", "antibodies", ".", "Nocodazole", "-", "arrested", "mitotic", "cells", "were", "collected", "and", "lysed", ".", "Immunoprecipitation", "was", "accomplished", "using", "control", "IgG", ",", "anti", "-", "Cyclin", "B2", "-", "1", "(", "Abcam", ",", "ab185622", ")", ",", "and", "anti", "-", "Cyclin", "B2", "-", "2", "(", "Proteintech", ",", "21644", "-", "1", "-", "AP", ")", ".", "Immunoprecipitation", "samples", "were", "resolved", "by", "Western", "blotting", "using", "a", "mouse", "anti", "-", "Cyclin", "B2", "antibody", "(", "Santa", "Cruz", ",", "sc", "-", "28303", ")", "and", "a", "mouse", "anti", "-", "Mad2", "antibody", "(", "Santa", "Cruz", ",", "sc", "-", "47747", ")", "(", "C", "and", "D", ")", "Flag", "immunoprecipitation", "assay", ".", "293T", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "Flag", "-", "C", "-", "Mad2", "and", "GFP", "-", "Cyclin", "B1", "/", "B2", "(", "C", ")", ",", "and", "with", "Flag", "-", "Mad1", "-", "1", "-", "215", "and", "GFP", "-", "Cyclin", "B1", "/", "B2", "(", "D", ")", ".", "After", "36", "h", ",", "the", "cells", "were", "collected", "and", "lysed", ",", "and", "immunoprecipitation", "was", "accomplished", "with", "anti", "-", "Flag", "M2", "beads", ".", "Immunoprecipitates", "were", "resolved", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "using", "anti", "-", "Flag", "antibody", "and", "anti", "-", "GFP", "antibody", "(", "E", ")", "GST", "pulldown", "assay", ".", "Purified", "GST", ",", "GST", "-", "Cyclin", "B1", "-", "165", "-", "433", ",", "and", "GST", "-", "Cyclin", "B2", "-", "130", "-", "398", "-", "bound", "agarose", "beads", "were", "used", "as", "affinity", "matrices", "to", "absorb", "purified", "Trx", "-", "6", "×", "His", "-", "tagged", "C", "-", "Mad2", "recombinant", "protein", ".", "Absorbed", "proteins", "were", "analyzed", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "Coomassie", "Brilliant", "Blue", "staining", "(", "F", "-", "I", ")", "Representative", "immunofluorescence", "images", "of", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "GFP", "-", "Cyclin", "B2", "(", "F", ")", "or", "GFP", "-", "Cyclin", "B1", "(", "H", ")", ".", "The", "cells", "were", "transfected", "with", "siControl", "or", "siMad2", "for", "36", "h", "followed", "by", "treatment", "with", "nocodazole", "plus", "MG132", "for", "2", "h", ".", "Then", "cells", "were", "fixed", "and", "co", "-", "stained", "for", "Mad2", "(", "red", ")", "and", "DNA", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "Scatter", "graphs", "illustrating", "kinetochore", "intensity", "of", "GFP", "-", "Cyclin", "B2", "(", "G", ")", "or", "GFP", "-", "Cyclin", "B1", "(", "I", ")", "in", "cells", "treated", "as", "in", "F", "and", "H", ",", "respectively", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "kinetochore", "intensity", "(", "±", "SD", ")", "normalized", "to", "values", "of", "the", "siControl", "group", ".", "Each", "dot", "represents", "one", "cell", "(", "≥", "30", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", ")"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(B) Immunoprecipitation assay performed with two different rabbit Cyclin B2 antibodies. Nocodazole-arrested mitotic cells were collected and lysed. Immunoprecipitation was accomplished using control IgG, anti-Cyclin B2-1 (Abcam, ab185622), and anti-Cyclin B2-2 (Proteintech, 21644-1-AP). Immunoprecipitation samples were resolved by Western blotting using a mouse anti-Cyclin B2 antibody ( Santa Cruz, sc-28303) and a mouse anti-Mad2 antibody (Santa Cruz, sc-47747)(C and D) Flag immunoprecipitation assay. 293T cells were co-transfected with Flag-C-Mad2 and GFP-Cyclin B1/B2 (C), and with Flag-Mad1-1-215 and GFP-Cyclin B1/B2 (D). After 36 h, the cells were collected and lysed, and immunoprecipitation was accomplished with anti-Flag M2 beads. Immunoprecipitates were resolved by SDS-PAGE and analyzed by Western blotting using anti-Flag antibody and anti-GFP antibody(E) GST pulldown assay. Purified GST, GST-Cyclin B1-165-433, and GST-Cyclin B2-130-398-bound agarose beads were used as affinity matrices to absorb purified Trx-6×His-tagged C-Mad2 recombinant protein. Absorbed proteins were analyzed by SDS-PAGE and Coomassie Brilliant Blue staining(F-I) Representative immunofluorescence images of HeLa cells stably expressing GFP-Cyclin B2 (F) or GFP-Cyclin B1 (H). The cells were transfected with siControl or siMad2 for 36 h followed by treatment with nocodazole plus MG132 for 2 h. Then cells were fixed and co-stained for Mad2 (red) and DNA (blue). Scale bar, 10 µm. Scatter graphs illustrating kinetochore intensity of GFP-Cyclin B2 (G) or GFP-Cyclin B1 (I) in cells treated as in F and H, respectively. Bars represent the mean kinetochore intensity (±SD) normalized to values of the siControl group. Each dot represents one cell (≥30 cells from three independent experiments)"}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", ")", "Flag", "immunoprecipitation", "assay", ".", "Flag", "-", "tagged", "Cyclin", "B2", "-", "WT", ",", "Cyclin", "B2", "-", "4A", ",", "or", "Cyclin", "B1", "were", "expressed", "in", "293T", "cells", "and", "purified", "with", "anti", "-", "Flag", "M2", "beads", ".", "Subsequently", ",", "the", "beads", "were", "incubated", "with", "mitotic", "HeLa", "lysates", "for", "2", "h", ",", "and", ",", "following", "extensive", "washes", ",", "immunoprecipitatates", "were", "resolved", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "using", "anti", "-", "Flag", "antibody", "and", "anti", "-", "Mad2", "antibody", ".", "(", "C", ")", "Flag", "immunoprecipitation", "assay", ".", "293T", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "Flag", "-", "Cyclin", "B2", "-", "WT", "or", "Flag", "-", "Cyclin", "B2", "-", "4A", "together", "with", "GFP", "(", "negative", "control", ")", "and", "GFP", "-", "CDK1", ".", "After", "36", "h", ",", "the", "cells", "were", "collected", "and", "lysed", ",", "and", "immunoprecipitation", "was", "accomplished", "with", "anti", "-", "Flag", "M2", "beads", ".", "Immunoprecipitation", "samples", "were", "resolved", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "using", "anti", "-", "GFP", "antibody", "and", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "(", "D", ")", "Representative", "immunofluorescence", "images", "of", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "GFP", "-", "Cyclin", "B2", "-", "WT", "or", "GFP", "-", "Cyclin", "B2", "-", "4A", ".", "After", "36", "h", "of", "transfection", ",", "cells", "were", "treated", "with", "nocodazole", "for", "2", "h", ".", "Then", "cells", "were", "fixed", "and", "co", "-", "stained", "for", "ACA", "(", "red", ")", "and", "DNA", "(", "blue", ")", ".", "(", "E", ")", "Scatter", "graphs", "illustrating", "kinetochore", "intensity", "of", "GFP", "-", "Cyclin", "B2", "-", "WT", "/", "4A", "treated", "as", "in", "D", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "kinetochore", "intensity", "(", "±", "SD", ")", "normalized", "to", "the", "values", "of", "GFP", "-", "Cyclin", "B2", "-", "WT", ".", "Each", "dot", "represents", "one", "cell", "(", "≥", "30", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(B) Flag immunoprecipitation assay. Flag-tagged Cyclin B2-WT, Cyclin B2-4A, or Cyclin B1 were expressed in 293T cells and purified with anti-Flag M2 beads. Subsequently, the beads were incubated with mitotic HeLa lysates for 2 h, and, following extensive washes, immunoprecipitatates were resolved by SDS-PAGE and analyzed by Western blotting using anti-Flag antibody and anti-Mad2 antibody.(C) Flag immunoprecipitation assay. 293T cells were co-transfected with Flag-Cyclin B2-WT or Flag-Cyclin B2-4A together with GFP (negative control) and GFP-CDK1. After 36 h, the cells were collected and lysed, and immunoprecipitation was accomplished with anti-Flag M2 beads. Immunoprecipitation samples were resolved by SDS-PAGE and analyzed by Western blotting using anti-GFP antibody and anti-Flag antibody.(D) Representative immunofluorescence images of HeLa cells transfected with GFP-Cyclin B2-WT or GFP-Cyclin B2-4A. After 36 h of transfection, cells were treated with nocodazole for 2 h. Then cells were fixed and co-stained for ACA (red) and DNA (blue). (E) Scatter graphs illustrating kinetochore intensity of GFP-Cyclin B2-WT/4A treated as in D. Bars represent the mean kinetochore intensity (±SD) normalized to the values of GFP-Cyclin B2-WT. Each dot represents one cell (≥30 cells from three independent experiments)."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "siControl", "or", "siCyclin", "B2", ".", "At", "36", "h", "after", "transfection", ",", "cells", "were", "collected", "and", "lysed", ".", "The", "samples", "were", "resolved", "by", "SDS", "-", "PAGE", "and", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "using", "anti", "-", "Cyclin", "B2", "antibody", ",", "anti", "-", "Cyclin", "B1", "antibody", ",", "and", "anti", "-", "tubulin", "antibody", "(", "B", ")", "Representative", "stills", "illustrating", "mitotic", "progression", "in", "mCherry", "-", "H2B", "expressed", "cells", "treated", "with", "Control", "siRNA", "or", "Cyclin", "B2", "siRNA", ".", "Images", "were", "acquired", "at", "the", "indicated", "time", "points", "after", "the", "start", "of", "NEBD", ".", "The", "arrow", "indicates", "lagging", "chromosomes", "(", "C", ")", "Bar", "graph", "illustrating", "the", "percentage", "of", "cells", "with", "normal", "anaphase", "or", "with", "anaphase", "lagging", "chromosomes", "in", "cells", "treated", "as", "in", "B", ".", "Bars", "are", "means", "±", "SD", "(", "≥", "30", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", ")", "(", "D", ")", "Scatter", "graph", "of", "the", "time", "from", "NEBD", "to", "the", "beginning", "of", "anaphase", "in", "cells", "treated", "as", "in", "B", "(", "n", "=", "30", "cells", ")", "(", "E", ")", "Representative", "stills", "illustrating", "mitotic", "progression", "in", "mCherry", "-", "H2B", "expressed", "cells", "depleted", "of", "endogenous", "Cyclin", "B2", "and", "rescued", "with", "GFP", "-", "Cyclin", "B2", "-", "WT", "or", "GFP", "-", "Cyclin", "B2", "-", "4A", ".", "Images", "were", "acquired", "at", "the", "indicated", "time", "points", "after", "the", "start", "of", "NEBD", "(", "F", ")", "Bar", "graph", "illustrating", "the", "percentage", "of", "cells", "with", "normal", "anaphase", "and", "cells", "with", "anaphase", "lagging", "chromosomes", "in", "cells", "treated", "as", "in", "E", ".", "Bars", "are", "means", "±", "SD", "(", "≥", "30", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", ")"], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) HeLa cells were transfected with siControl or siCyclin B2. At 36 h after transfection, cells were collected and lysed. The samples were resolved by SDS-PAGE and analyzed by Western blotting using anti-Cyclin B2 antibody, anti-Cyclin B1 antibody, and anti-tubulin antibody(B) Representative stills illustrating mitotic progression in mCherry-H2B expressed cells treated with Control siRNA or Cyclin B2 siRNA. Images were acquired at the indicated time points after the start of NEBD. The arrow indicates lagging chromosomes(C) Bar graph illustrating the percentage of cells with normal anaphase or with anaphase lagging chromosomes in cells treated as in B. Bars are means ±SD (≥30 cells from three independent experiments)(D) Scatter graph of the time from NEBD to the beginning of anaphase in cells treated as in B (n = 30 cells)(E) Representative stills illustrating mitotic progression in mCherry-H2B expressed cells depleted of endogenous Cyclin B2 and rescued with GFP-Cyclin B2-WT or GFP-Cyclin B2-4A. Images were acquired at the indicated time points after the start of NEBD(F) Bar graph illustrating the percentage of cells with normal anaphase and cells with anaphase lagging chromosomes in cells treated as in E. Bars are means ±SD (≥30 cells from three independent experiments)"}
{"words": ["Figure", "5Representative", "immunofluorescence", "images", "of", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "siControl", "or", "siCyclin", "B2", ".", "After", "36", "h", "of", "transfection", ",", "cells", "were", "treated", "with", "nocodazole", "for", "2", "h", ".", "Then", "cells", "were", "fixed", "and", "co", "-", "stained", "for", "Mad2", "(", "green", ")", "in", "D", ",", "ACA", "(", "red", ")", ",", "and", "DNA", "(", "blue", ")", "Representative", "immunofluorescence", "images", "of", "HeLa", "cells", "co", "-", "transfected", "with", "siCyclin", "B2", "plus", "GFP", "-", "tagged", "Cyclin", "B2", "-", "WT", "or", "Cyclin", "B2", "-", "4A", ".", "At", "36", "h", "post", "-", "transfection", ",", "cells", "were", "treated", "with", "nocodazole", "for", "2", "h", ".", "Then", "cells", "were", "fixed", "and", "co", "-", "stained", "for", "Mad2", "(", "red", ")", "in", "DNA", "(", "blue", ")", "Scatter", "graphs", "illustrating", "kinetochore", "intensity", "of", "Mad2", "(", "cells", "treated", "as", "in", "A", "and", "B", "Bars", "represent", "the", "mean", "kinetochore", "intensity", "(", "±", "SD", ")", "normalized", "to", "the", "values", "of", "the", "siControl", "groupRepresentative", "immunofluorescence", "images", "of", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "siControl", "or", "siCyclin", "B2", ".", "After", "36", "h", "of", "transfection", ",", "cells", "were", "treated", "with", "nocodazole", "for", "2", "h", ".", "Then", "cells", "were", "fixed", "and", "co", "-", "stained", "fo", "Cdc20", "(", "green", ")", "in", "D", ",", "ACA", "(", "red", ")", ",", "and", "DNA", "(", "blue", ")", "E", ")", "Representative", "immunofluorescence", "images", "of", "HeLa", "cells", "co", "-", "transfected", "with", "siCyclin", "B2", "plus", "GFP", "-", "tagged", "Cyclin", "B2", "-", "WT", "or", "Cyclin", "B2", "-", "4A", ".", "At", "36", "h", "post", "-", "transfection", ",", "cells", "were", "treated", "with", "nocodazole", "for", "2", "h", ".", "Then", "cells", "were", "fixed", "and", "co", "-", "stained", "fo", "Cdc20", "(", "red", ")", "in", "E", ",", "and", "DNA", "(", "blue", ")", "Scatter", "graphs", "illustrating", "kinetochore", "intensity", "o", "Cdc20", "(", "F", ",", "cells", "treated", "as", "in", "D", "and", "E", ")", "Bars", "represent", "the", "mean", "kinetochore", "intensity", "(", "±", "SD", ")", "normalized", "to", "the", "values", "of", "the", "siControl", "group", "(", "G", ")", "Bar", "graph", "illustrating", "the", "mitotic", "index", "in", "cells", "treated", "with", "low", "concentrations", "of", "nocodazole", "for", "12", "h", "(", "H", ")", "Immunoprecipitation", "assay", "performed", "with", "Cdc20", "antibody", ".", "HeLa", "cells", "were", "transfected", "with", "siControl", "or", "siCyclin", "B2", ".", "At", "36", "h", "after", "transfection", ",", "cells", "were", "arrested", "in", "mitosis", ",", "collected", ",", "and", "lysed", ".", "Cell", "lysates", "were", "incubated", "with", "Protein", "A", "/", "G", "beads", "bound", "with", "Cdc20", "antibody", ".", "Following", "extensive", "washes", ",", "immunoprecipitates", "were", "resolved", "by", "SAS", "-", "PAGE", "and", "analyzed", "by", "Western", "blotting", "using", "anti", "-", "Cdc20", ",", "anti", "-", "BubR1", ",", "anti", "-", "Bub3", ",", "and", "anti", "-", "Mad2"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Representative immunofluorescence images of HeLa cells transfected with siControl or siCyclin B2. After 36 h of transfection, cells were treated with nocodazole for 2 h. Then cells were fixed and co-stained for Mad2 (green) in D, ACA (red), and DNA (blue) Representative immunofluorescence images of HeLa cells co-transfected with siCyclin B2 plus GFP-tagged Cyclin B2-WT or Cyclin B2-4A. At 36 h post-transfection, cells were treated with nocodazole for 2 h. Then cells were fixed and co-stained for Mad2 (red) in DNA (blue)Scatter graphs illustrating kinetochore intensity of Mad2 ( cells treated as in A and B Bars represent the mean kinetochore intensity (±SD) normalized to the values of the siControl groupRepresentative immunofluorescence images of HeLa cells transfected with siControl or siCyclin B2. After 36 h of transfection, cells were treated with nocodazole for 2 h. Then cells were fixed and co-stained fo Cdc20 (green) in D, ACA (red), and DNA (blue) E) Representative immunofluorescence images of HeLa cells co-transfected with siCyclin B2 plus GFP-tagged Cyclin B2-WT or Cyclin B2-4A. At 36 h post-transfection, cells were treated with nocodazole for 2 h. Then cells were fixed and co-stained fo Cdc20 (red) in E, and DNA (blue)Scatter graphs illustrating kinetochore intensity o Cdc20 (F, cells treated as in D and E) Bars represent the mean kinetochore intensity (±SD) normalized to the values of the siControl group(G) Bar graph illustrating the mitotic index in cells treated with low concentrations of nocodazole for 12 h(H) Immunoprecipitation assay performed with Cdc20 antibody. HeLa cells were transfected with siControl or siCyclin B2. At 36 h after transfection, cells were arrested in mitosis, collected, and lysed. Cell lysates were incubated with Protein A/G beads bound with Cdc20 antibody. Following extensive washes, immunoprecipitates were resolved by SAS-PAGE and analyzed by Western blotting using anti-Cdc20, anti-BubR1, anti-Bub3, and anti-Mad2 antibodies"}
{"words": ["Figure", "1Subcellular", "localization", "of", "NeoR", "and", "NucNeoR", "and", "T", "cell", "recognition", "of", "NeoR", "‐", "and", "NucNeoR", "‐", "expressing", "cells", ".", "RCC1", ".", "24", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "NeoR", " ", "(", "A", ")", "and", "NucNeoR", " ", "(", "B", ")", "expression", "constructs", ".", "After", "2", " ", "days", ",", "the", "subcellular", "localization", "of", "the", "proteins", "was", "analyzed", "by", "immunofluorescence", "using", "the", "anti", "c", "‐", "myc", "antibody", "9E10", ".", "While", "NeoR", "was", "evenly", "distributed", "in", "nucleus", "and", "cytoplasm", " ", "(", "a", ")", ",", "NucNeoR", "was", "confined", "to", "the", "cell", "nucleus", " ", "(", "b", ")", ".", "Daylight", "photographs", "of", "the", "stained", "cells", "are", "shown", "in", "(", "a", "'", ")", "and", "(", "b", "'", ")", ".", "(", "C", ")", "NeoR", "‐", "and", "NucNeoR", "‐", "transfected", "RCC1", ".", "24", "cells", "were", "treated", "with", "100", " ", "U", "/", "mL", "IFN", "‐", "γ", "for", "48", " ", "h", "to", "induce", "MHC", "class", " ", "II", "expression", ".", "Subsequently", ",", "the", "cells", "were", "washed", "and", "co", "‐", "cultured", "with", "the", "CD4", "clone", "20", "‐", "4", "/", "A4", ",", "which", "recognizes", "a", "peptide", "derived", "from", "NeoR", "on", "HLA", "‐", "DP3", ".", "GM", "‐", "CSF", "secretion", "by", "the", "T", "cells", "was", "measured", "20", " ", "h", "later", "by", "ELISA", ".", "Both", "transfectants", "were", "recognized", "after", "IFN", "‐", "γ", "treatment", ",", "indicating", "that", "directing", "NeoR", "into", "the", "cell", "nucleus", "does", "not", "abrogate", "antigen", "presentation", ".", "(", "D", ")", "LCL1", ".", "11", "cells", "were", "transfected", "with", "NeoR", "or", "NucNeoR", "expression", "plasmids", "and", "antigen", "presentation", "was", "assessed", "48", " ", "h", "later", "with", "the", "NeoR", "‐", "specific", "T", "cell", "clone", "20", "‐", "4", "/", "A4", ".", "Antigen", "‐", "transfected", "LCL1", ".", "11", "cells", "were", "recognized", "irrespectively", "of", "NeoR", "localization", ",", "while", "untransfected", "cells", "or", "cells", "transfected", "with", "a", "GFP", "‐", "expressing", "control", "plasmid", "were", "not", "recognized", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Subcellular localization of NeoR and NucNeoR and T cell recognition of NeoR‐ and NucNeoR‐expressing cells. RCC1.24 cells were transfected with the NeoR (A) and NucNeoR (B) expression constructs. After 2 days, the subcellular localization of the proteins was analyzed by immunofluorescence using the anti c‐myc antibody 9E10. While NeoR was evenly distributed in nucleus and cytoplasm (a), NucNeoR was confined to the cell nucleus (b). Daylight photographs of the stained cells are shown in (a') and (b').(C) NeoR‐ and NucNeoR‐transfected RCC1.24 cells were treated with 100 U/mL IFN‐γ for 48 h to induce MHC class II expression. Subsequently, the cells were washed and co‐cultured with the CD4 clone 20‐4/A4, which recognizes a peptide derived from NeoR on HLA‐DP3. GM‐CSF secretion by the T cells was measured 20 h later by ELISA. Both transfectants were recognized after IFN‐γ treatment, indicating that directing NeoR into the cell nucleus does not abrogate antigen presentation.(D) LCL1.11 cells were transfected with NeoR or NucNeoR expression plasmids and antigen presentation was assessed 48 h later with the NeoR‐specific T cell clone 20‐4/A4. Antigen‐transfected LCL1.11 cells were recognized irrespectively of NeoR localization, while untransfected cells or cells transfected with a GFP‐expressing control plasmid were not recognized."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "RCC1", ".", "24", "‐", "NeoR", "and", "‐", "NucNeoR", "cells", "were", "incubated", "for", "48", " ", "h", "with", "IFN", "‐", "γ", "and", "in", "addition", "with", "7", ".", "5", " ", "mM", "3", "‐", "MA", "or", "200", " ", "µM", "leupeptin", "or", "100", " ", "µM", "chloroquine", "for", "the", "last", "20", " ", "h", ".", "Subsequently", ",", "the", "cells", "were", "fixed", "with", "0", ".", "5", "%", "paraformaldehyde", "and", "tested", "with", "20", "‐", "4", "/", "A4", "cells", "in", "a", "GM", "‐", "CSF", "release", "assay", ".", "Both", "NeoR", "and", "NucNeoR", "were", "presented", "by", "a", "pathway", "that", "involves", "autophagy", "and", "lysosomal", "processing", ".", "(", "B", ")", "LCL1", ".", "11", "cells", "transfected", "with", "NeoR", "or", "NucNeoR", "expression", "plasmids", "were", "tested", "likewise", ".", "Presentation", "of", "endogenous", "NeoR", "and", "NucNeoR", "was", "blocked", "by", "all", "inhibitors", ",", "indicating", "that", "NeoR", "and", "NucNeoR", "presentation", "is", "dependent", "on", "autophagy", "and", "lysosomal", "processing", ".", "(", "C", ")", "To", "exclude", "toxic", "side", "effects", "of", "the", "inhibitors", ",", "LCL1", ".", "11", "cells", "were", "incubated", "for", "20", " ", "h", "with", "200", " ", "ng", "/", "mL", "recombinant", "NeoR", "protein", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "the", "inhibitors", ".", "Afterwards", ",", "residual", "protein", "and", "inhibitors", "were", "removed", "by", "washing", "and", "the", "cells", "were", "co", "‐", "cultured", "with", "the", "NeoR", "‐", "specific", "CD4", "+", "T", "cell", "clone", "20", "‐", "4", "/", "A4", ".", "The", "presentation", "of", "exogenous", "NeoR", "on", "MHC", "class", " ", "II", "was", "not", "affected", "by", "3", "‐", "MA", ",", "but", "was", "impaired", "when", "lysosomal", "processing", "was", "blocked", "with", "chloroquine", "or", "leupeptin", ".", "(", "D", ")", "LCL1", ".", "11", "cells", "were", "transfected", "with", "siRNA", "specific", "for", "Atg12", "or", "GFP", ",", "and", "Atg12", "mRNA", "levels", "were", "determined", "24", " ", "h", "later", "by", "qPCR", ".", "The", "relative", "amount", "of", "Atg12", "mRNA", "was", "reduced", "approximately", "fourfold", ".", "(", "E", ")", "At", "24", " ", "h", "after", "siRNA", "transfection", ",", "NeoR", "and", "NucNeoR", "were", "expressed", "in", "these", "cells", "and", "antigen", "presentation", "was", "assessed", "36", " ", "h", "later", ".", "In", "cells", "transfected", "with", "Atg12", "siRNA", ",", "but", "not", "in", "mock", "‐", "transfected", "cells", "or", "cells", "transfected", "with", "GFP", "siRNA", ",", "antigen", "presentation", "of", "both", "NeoR", "and", "NucNeoR", "was", "greatly", "reduced", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) RCC1.24‐NeoR and ‐NucNeoR cells were incubated for 48 h with IFN‐γ and in addition with 7.5 mM 3‐MA or 200 µM leupeptin or 100 µM chloroquine for the last 20 h. Subsequently, the cells were fixed with 0.5% paraformaldehyde and tested with 20‐4/A4 cells in a GM‐CSF release assay. Both NeoR and NucNeoR were presented by a pathway that involves autophagy and lysosomal processing.(B) LCL1.11 cells transfected with NeoR or NucNeoR expression plasmids were tested likewise. Presentation of endogenous NeoR and NucNeoR was blocked by all inhibitors, indicating that NeoR and NucNeoR presentation is dependent on autophagy and lysosomal processing.(C) To exclude toxic side effects of the inhibitors, LCL1.11 cells were incubated for 20 h with 200 ng/mL recombinant NeoR protein in the presence or absence of the inhibitors. Afterwards, residual protein and inhibitors were removed by washing and the cells were co‐cultured with the NeoR‐specific CD4+ T cell clone 20‐4/A4. The presentation of exogenous NeoR on MHC class II was not affected by 3‐MA, but was impaired when lysosomal processing was blocked with chloroquine or leupeptin.(D) LCL1.11 cells were transfected with siRNA specific for Atg12 or GFP, and Atg12 mRNA levels were determined 24 h later by qPCR. The relative amount of Atg12 mRNA was reduced approximately fourfold.(E) At 24 h after siRNA transfection, NeoR and NucNeoR were expressed in these cells and antigen presentation was assessed 36 h later. In cells transfected with Atg12 siRNA, but not in mock‐transfected cells or cells transfected with GFP siRNA, antigen presentation of both NeoR and NucNeoR was greatly reduced."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "RCC1", ".", "24", "cells", "were", "transfected", "with", "the", "NES", "‐", "GFP", "‐", "NeoR", "‐", "GFP", "‐", "NLS", "expression", "construct", "and", "subcellular", "localization", "of", "the", "fusion", "protein", "was", "monitored", "by", "UV", "fluorescence", ".", "As", "compared", "to", "untreated", "cells", " ", "(", "a", ")", ",", "cells", "treated", "with", "8", " ", "nM", "LMB", "for", "20", " ", "h", " ", "(", "b", ")", "showed", "a", "strong", "accumulation", "of", "the", "protein", "in", "the", "nucleus", ".", "(", "a", "'", ")", "and", "(", "b", "'", ")", "are", "the", "corresponding", "daylight", "photographs", "of", "the", "transfected", "cells", ".", "(", "B", ")", "NeoR", "‐", "and", "NucNeoR", "‐", "transfected", "LCL1", ".", "11", "cells", "were", "either", "left", "untreated", "or", "incubated", "for", "20", " ", "h", "with", "8", " ", "nM", "LMB", ".", "Subsequently", ",", "the", "cells", "were", "fixed", "with", "0", ".", "5", "%", "paraformaldehyde", "and", "probed", "with", "the", "NeoR", "‐", "specific", "T", "cells", ".", "LMB", "treatment", "had", "no", "significant", "effect", "on", "the", "presentation", "of", "NeoR", "or", "NucNeoR", "on", "MHC", "class", " ", "II", ",", "indicating", "that", "CRM1", "‐", "dependent", "nuclear", "export", "is", "not", "involved", "in", "the", "presentation", "of", "this", "nuclear", "antigen", "on", "MHC", "class", " ", "II", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) RCC1.24 cells were transfected with the NES‐GFP‐NeoR‐GFP‐NLS expression construct and subcellular localization of the fusion protein was monitored by UV fluorescence. As compared to untreated cells (a), cells treated with 8 nM LMB for 20 h (b) showed a strong accumulation of the protein in the nucleus. (a') and (b') are the corresponding daylight photographs of the transfected cells.(B) NeoR‐ and NucNeoR‐transfected LCL1.11 cells were either left untreated or incubated for 20 h with 8 nM LMB. Subsequently, the cells were fixed with 0.5% paraformaldehyde and probed with the NeoR‐specific T cells. LMB treatment had no significant effect on the presentation of NeoR or NucNeoR on MHC class II, indicating that CRM1‐dependent nuclear export is not involved in the presentation of this nuclear antigen on MHC class II."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "G", ")", "Immunostaining", "of", "pS6", "(", "Ser240", "/", "244", ")", "in", "skin", "lesions", "from", "control", "and", "LL37", "-", "induced", "mice", ".", "Bottom", "right", "panels", ",", "magnified", "images", "of", "boxed", "areas", ".", "DAPI", "staining", "(", "blue", ")", "indicates", "nuclear", "localization", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "Right", "panel", ",", "the", "quantification", "of", "relative", "fluorescence", "intensity", "for", "pS6", "(", "Ser240", "/", "244", ")", "in", "control", "and", "LL37", "group", "(", "n", "=", "5", "for", "each", "group", ")", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(G) Immunostaining of pS6 (Ser240/244) in skin lesions from control and LL37-induced mice. Bottom right panels, magnified images of boxed areas. DAPI staining (blue) indicates nuclear localization. Scale bar: 50 μm. Right panel, the quantification of relative fluorescence intensity for pS6 (Ser240/244) in control and LL37 group (n=5 for each group). Data represent the mean ± SEM. **P < 0.01. two-tailed unpaired Student's t-test was used."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "D", ")", "HE", "staining", "of", "lesional", "skin", "sections", "from", "WT", "and", "Raptor", "cKO", "mice", "injected", "with", "LL37", "or", "control", "vehicle", "(", "n", "=", "6", "for", "each", "group", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "(", "E", ")", "Dermal", "infiltrating", "cells", "were", "quantified", "(", "n", "=", "6", "for", "each", "group", ")", "for", "each", "high", "power", "field", "(", "HPF", ")", ".", "(", "F", ")", "The", "mRNA", "expression", "levels", "of", "Tnf", "-", "α", ",", "Il6", ",", "Mmp9", "and", "Vegf", "in", "skin", "lesions", "(", "n", "=", "6", "for", "each", "group", ")", ".", "(", "I", ")", "HE", "staining", "of", "lesional", "skin", "sections", "from", "LL37", "or", "control", "mice", "topically", "applied", "with", "RAPA", "or", "vehicle", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "(", "J", ")", "Dermal", "infiltrating", "cells", "were", "quantified", "(", "n", "=", "6", "for", "each", "group", ")", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "1", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "'", "s", "post", "hoc", "test", "was", "used", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(D) HE staining of lesional skin sections from WT and Raptor cKO mice injected with LL37 or control vehicle (n=6 for each group). Scale bar: 50 μm. (E) Dermal infiltrating cells were quantified (n = 6 for each group) for each high power field (HPF). (F) The mRNA expression levels of Tnf-α, Il6, Mmp9 and Vegf in skin lesions (n = 6 for each group).(I) HE staining of lesional skin sections from LL37 or control mice topically applied with RAPA or vehicle. Scale bar: 50 μm. (J) Dermal infiltrating cells were quantified (n = 6 for each group). Data represent the mean ± SEM. **P < 0.01. 1-way ANOVA with Bonferroni's post hoc test was used. "}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "The", "back", "skins", "of", "WT", "(", "Tsc2", "+", "/", "+", ")", "and", "Tsc2", "+", "/", "-", "mice", "were", "intradermally", "injected", "with", "LL37", "or", "control", "vehicle", "(", "n", "=", "5", "for", "each", "group", ")", ".", "Pictures", "were", "taken", "on", "day", "0", ".", "5", ",", "2", ",", "5", ",", "8", ",", "12", "after", "the", "first", "LL37", "injection", ".", "The", "mouse", "experiments", "were", "repeated", "for", "three", "times", ",", "and", "5", "mice", "were", "included", "in", "each", "group", "for", "each", "time", ".", "The", "results", "of", "a", "representative", "mouse", "experiment", "were", "displayed", ".", "Scale", "bar", ":", "2", "mm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) The back skins of WT (Tsc2+/+) and Tsc2+/- mice were intradermally injected with LL37 or control vehicle (n=5 for each group). Pictures were taken on day 0.5, 2, 5, 8, 12 after the first LL37 injection. The mouse experiments were repeated for three times, and 5 mice were included in each group for each time. The results of a representative mouse experiment were displayed. Scale bar: 2 mm."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "The", "mRNA", "expression", "level", "of", "human", "cathelicidin", "(", "CAMP", ")", "in", "skin", "lesions", "from", "healthy", "individuals", "(", "n", "=", "10", ")", "and", "patients", "with", "rosacea", "(", "n", "=", "15", ")", ".", "Data", "(", "G", ")", "Immunostaining", "of", "cathelicidin", "in", "HaCaT", "keratinocytes", "treated", "with", "LL37", "(", "4", "μM", ")", "±", "RAPA", "for", "24", "h", ".", "DAPI", "staining", "(", "blue", ")", "indicates", "nuclear", "localization", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "All", "results", "are", "representative", "of", "at", "least", "3", "independent", "experiments", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) The mRNA expression level of human cathelicidin (CAMP) in skin lesions from healthy individuals (n = 10) and patients with rosacea (n = 15). Data(G) Immunostaining of cathelicidin in HaCaT keratinocytes treated with LL37 (4 μM) ± RAPA for 24 h. DAPI staining (blue) indicates nuclear localization. Scale bar: 50 μm. All results are representative of at least 3 independent experiments. Data represent the mean ± SEM."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "E", ")", "Primary", "human", "keratinocytes", "expressing", "TLR2", "shRNAs", "or", "scramble", "shRNA", "were", "treated", "with", "FITC", "-", "labeled", "LL37", "or", "sLL37", "±", "PKH26", "for", "30", "min", "followed", "by", "PBS", "washed", ",", "then", "live", "cells", "were", "analyzed", "by", "fluorescent", "microscope", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "(", "F", ",", "G", ")", "Primary", "human", "keratinocytes", "were", "incubated", "with", "sLL37", "-", "flag", "or", "LL37", "-", "flag", "for", "1", "h", ".", "Cell", "lysates", "were", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "flag", "or", "anti", "-", "TLR2", "antibodies", ",", "showing", "an", "interaction", "between", "LL37", "and", "TLR2", ".", "Medium", ",", "the", "medium", "of", "primary", "human", "keratinocytes", "treated", "with", "sLL37", "-", "flag", "or", "LL37", "-", "flag", ".", "All", "results", "are", "representative", "of", "at", "least", "3", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(E) Primary human keratinocytes expressing TLR2 shRNAs or scramble shRNA were treated with FITC-labeled LL37 or sLL37 ± PKH26 for 30 min followed by PBS washed, then live cells were analyzed by fluorescent microscope. Scale bar: 50 μm.(F, G) Primary human keratinocytes were incubated with sLL37-flag or LL37-flag for 1 h. Cell lysates were immunoprecipitated with anti-flag or anti-TLR2 antibodies, showing an interaction between LL37 and TLR2. Medium, the medium of primary human keratinocytes treated with sLL37-flag or LL37-flag. All results are representative of at least 3 independent experiments."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "E", ")", "Immunostaining", "of", "phospho", "-", "p65", "(", "p", "-", "p65", ")", "in", "skin", "sections", ".", "Bottom", "right", "panels", ",", "magnified", "images", "of", "dotted", "line", "areas", ".", "Epi", ",", "epidermis", ".", "Der", ",", "dermis", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "relative", "fluorescence", "intensity", "for", "p", "-", "p65", "in", "epidermis", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "(", "G", ")", "The", "mRNA", "expression", "levels", "of", "NF", "-", "κB", "family", "of", "transcription", "factors", "(", "Nfκb1", ",", "Nfκb1", ",", "Rela", "and", "Relb", ")", "in", "mice", "skin", "lesions", "(", "n", "=", "6", "for", "each", "group", ")", ".", "(", "I", ")", "IHC", "of", "p65", "on", "skin", "sections", "from", "HS", "and", "rosacea", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", ".", "(", "J", ")", "Percentage", "of", "nuclear", "p65", "positive", "cells", "in", "the", "epidermis", "from", "HS", "(", "n", "=", "8", ")", "and", "rosacea", "(", "n", "=", "13", ")", ".", "All", "results", "are", "representative", "of", "at", "least", "3", "independent", "experiments", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "1", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "'", "s", "post", "hoc", "test", "(", "F", "and", "G", ")", "or", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "J", ")", "was", "used", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(E) Immunostaining of phospho-p65 (p-p65) in skin sections. Bottom right panels, magnified images of dotted line areas. Epi, epidermis. Der, dermis. Scale bar: 50 μm. (F) Quantification of relative fluorescence intensity for p-p65 in epidermis (n=6). (G) The mRNA expression levels of NF-κB family of transcription factors (Nfκb1, Nfκb1, Rela and Relb) in mice skin lesions (n=6 for each group).(I) IHC of p65 on skin sections from HS and rosacea. Scale bar, 50 μm. (J) Percentage of nuclear p65 positive cells in the epidermis from HS (n = 8) and rosacea (n = 13). All results are representative of at least 3 independent experiments. Data represent the mean ± SEM. **P < 0.01. 1-way ANOVA with Bonferroni's post hoc test (F and G) or two-tailed unpaired Student's t-test (J) was used. "}
{"words": ["Figure", "7", "(", "B", ")", "The", "mRNA", "expression", "levels", "of", "mouse", "chemokines", "(", "Cxcl11", ",", "Cxcl12", ",", "Ccl2", "and", "Ccl3", ")", "in", "skin", "lesions", "(", "n", "=", "6", "for", "each", "group", ")", ".", "(", "E", ")", "Heatmap", "of", "upregulated", "chemokines", "and", "cytokines", "in", "rosacea", "skin", "lesions", "determined", "by", "RNA", "-", "sequencing", ".", "All", "results", "are", "representative", "of", "at", "least", "3", "independent", "experiments", ".", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ".", "1", "-", "way", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "'", "s", "post", "hoc", "test", "was", "used", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(B) The mRNA expression levels of mouse chemokines (Cxcl11, Cxcl12, Ccl2 and Ccl3) in skin lesions (n=6 for each group).(E) Heatmap of upregulated chemokines and cytokines in rosacea skin lesions determined by RNA-sequencing. All results are representative of at least 3 independent experiments. Data represent the mean ± SEM. *P < 0.05, **P < 0.01. 1-way ANOVA with Bonferroni's post hoc test was used."}
{"words": ["Figure", "8Topical", "rapamycin", "treatment", "twice", "daily", "for", "4", "weeks", "showed", "an", "obvious", "therapeutic", "effect", "in", "rosacea", "patients", ".", "(", "C", ")", "The", "change", "of", "patients", "'", "CEA", "score", "showed", "in", "scatter", "histogram", "at", "0", "week", "and", "4th", "week", ".", "(", "D", ")", "The", "change", "of", "patients", "'", "IGA", "score", "showed", "in", "scatter", "histogram", "at", "0", "week", "and", "4th", "week", ".", "\"", "The", "Change", "value", "<", "0", "\"", "indicates", "that", "skin", "lesions", "show", "positive", "improvement", "after", "treatment", ";", "\"", "The", "Change", "value", ">", "0", "\"", "indicates", "skin", "lesions", "show", "exacerbation", "after", "treatment", ";", "\"", "The", "Change", "value", "=", "0", "\"", "indicates", "that", "skin", "lesions", "show", "no", "change", "after", "treatment", ";", "Data", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ",", "and", "two", "-", "tailed", "unpaired", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "was", "used", "(", "C", ",", "D", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8Topical rapamycin treatment twice daily for 4 weeks showed an obvious therapeutic effect in rosacea patients. (C) The change of patients' CEA score showed in scatter histogram at 0 week and 4th week. (D) The change of patients' IGA score showed in scatter histogram at 0 week and 4th week. \"The Change value < 0\" indicates that skin lesions show positive improvement after treatment; \"The Change value > 0\" indicates skin lesions show exacerbation after treatment; \"The Change value = 0\" indicates that skin lesions show no change after treatment; Data represent the mean ± SEM, and two-tailed unpaired Student's t-test was used (C, D)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "ARPE", "-", "19", "cells", "were", "incubated", "in", "the", "presence", "of", "DMSO", "(", "Control", ")", ",", "Tunicamycin", "(", "5", "µg", "/", "ml", ")", ",", "or", "starved", "(", "EBSS", ")", "for", "16", "h", ".", "Cells", "were", "fixed", ",", "permeabilized", "and", "stained", "with", "an", "antibody", "against", "TFE3", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "B", ")", "Immunoblot", "of", "protein", "lysates", "of", "ARPE", "-", "19", "cells", "treated", "as", "shown", "in", "(", "A", ")", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "C", ")", "ARPE", "-", "19", "cells", "incubated", "with", "Tunicamycin", "as", "indicated", "in", "(", "A", ")", "were", "immunostained", "with", "antibody", "against", "CHOP", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "the", "percentage", "of", "ARPE", "-", "19", "cells", "with", "nuclear", "TFE3", "upon", "Tunicamycin", "(", "Tun", ".", ")", "or", "starvation", "(", "Strv", ".", ")", "treatments", "as", "indicated", "in", "(", "A", ")", "(", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "analysis", "versus", "Control", "treated", "cells", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "n", ">", "400", "cells", "per", "condition", ")", ".", "(", "E", ")", "Wild", "-", "type", "mouse", "embryonic", "fibroblast", "(", "MEF", ")", "cells", "were", "incubated", "in", "the", "presence", "of", "DMSO", "(", "Control", ")", "or", "Tunicamycin", "(", "0", ".", "1", "µg", "/", "ml", ")", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Cells", "were", "fixed", ",", "permeabilized", "and", "stained", "with", "antibodies", "against", "TFE3", "(", "green", ")", "and", "CHOP", "(", "red", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "F", ")", "Wild", "-", "type", "MEF", "cells", "were", "incubated", "in", "the", "presence", "of", "DMSO", "(", "Control", ")", "or", "BFA", "(", "2", ".", "5", "µg", "/", "ml", ")", "for", "16", "h", ".", "Cells", "were", "fixed", ",", "permeabilized", "and", "stained", "with", "antibodies", "against", "TFE3", "(", "green", ")", "and", "CHOP", "(", "red", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "G", ")", "Quantification", "of", "the", "percentage", "of", "MEF", "cells", "with", "nuclear", "TFE3", "upon", "DMSO", "(", "Control", ")", "or", "BFA", "16", "h", "treatment", "(", "mean", "±", "SD", "of", "two", "independent", "experiments", ",", "student", "'", "s", "t", "-", "test", "analysis", "versus", "DMSO", "treated", "cells", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "n", ">", "400", "cells", "per", "condition", ")", ".", "(", "H", ")", "Immunoblots", "of", "the", "subcellular", "distribution", "of", "TFE3", "and", "TFEB", "in", "MEF", "cells", "incubated", "with", "DMSO", "(", "Ctrl", ".", ")", "or", "Tunicamycin", "(", "Tun", ".", ")", "for", "16", "h", "using", "TFE3", ",", "TFEB", ",", "Lamp1", "(", "as", "a", "lysosomal", "membrane", "marker", ")", ",", "and", "H3b", "(", "as", "a", "nuclear", "marker", ")", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) ARPE-19 cells were incubated in the presence of DMSO (Control), Tunicamycin (5 µg/ml), or starved (EBSS) for 16 h. Cells were fixed, permeabilized and stained with an antibody against TFE3. Scale bar, 10 µm. Data are representative of three independent experiments.(B) Immunoblot of protein lysates of ARPE-19 cells treated as shown in (A). Data are representative of three independent experiments.(C) ARPE-19 cells incubated with Tunicamycin as indicated in (A) were immunostained with antibody against CHOP. Scale bar, 10 µm. Data are representative of three independent experiments.(D) Quantification of the percentage of ARPE-19 cells with nuclear TFE3 upon Tunicamycin (Tun.) or starvation (Strv.) treatments as indicated in (A) (mean ± SD of three independent experiments, one-way ANOVA analysis versus Control treated cells, ***p < 0.001; n>400 cells per condition).(E) Wild-type mouse embryonic fibroblast (MEF) cells were incubated in the presence of DMSO (Control) or Tunicamycin (0.1 µg/ml) for the indicated times. Cells were fixed, permeabilized and stained with antibodies against TFE3 (green) and CHOP (red). Scale bar, 10 µm. Data are representative of three independent experiments.(F) Wild-type MEF cells were incubated in the presence of DMSO (Control) or BFA (2.5 µg/ml) for 16 h. Cells were fixed, permeabilized and stained with antibodies against TFE3 (green) and CHOP (red). Scale bar, 10 µm. Data are representative of three independent experiments.(G) Quantification of the percentage of MEF cells with nuclear TFE3 upon DMSO (Control) or BFA 16 h treatment (mean ± SD of two independent experiments, student's t-test analysis versus DMSO treated cells, ***p < 0.001; n>400 cells per condition).(H) Immunoblots of the subcellular distribution of TFE3 and TFEB in MEF cells incubated with DMSO (Ctrl.) or Tunicamycin (Tun.) for 16 h using TFE3, TFEB, Lamp1 (as a lysosomal membrane marker), and H3b (as a nuclear marker). Data are representative of three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Immunoblot", "of", "protein", "lysates", "from", "wild", "-", "type", ",", "PERK", "-", "KO", "and", "GCN2", "-", "KO", "MEF", "cells", "incubated", "in", "the", "presence", "of", "DMSO", "(", "Control", ")", ",", "Tunicamycin", "(", "0", ".", "1", "µg", "/", "ml", ")", ",", "or", "starved", "in", "EBSS", "for", "16", "h", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "B", "-", "D", ")", "Wild", "-", "type", "(", "B", ")", ",", "GCN2", "-", "KO", "(", "C", ")", ",", "and", "PERK", "-", "KO", "(", "D", ")", "MEF", "cells", "incubated", "in", "the", "presence", "of", "DMSO", "(", "Control", ")", "or", "Tunicamycin", "(", "0", ".", "1", "µg", "/", "ml", ")", "as", "indicated", "in", "(", "A", ")", ".", "Cells", "were", "fixed", ",", "permeabilized", "and", "stained", "with", "antibodies", "against", "TFE3", "(", "green", ")", "and", "CHOP", "(", "red", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "E", "-", "F", ")", "Quantification", "of", "the", "percentage", "of", "MEF", "cells", "with", "nuclear", "TFE3", "upon", "DMSO", "(", "Control", ")", ",", "Tunicamycin", "treatments", "for", "16", "h", "(", "E", ")", ",", "or", "starvation", "for", "2", "h", "(", "F", ")", "(", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "analysis", "versus", "DMSO", "treated", "cells", ",", "ns", "=", "not", "significant", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "n", ">", "400", "cells", "per", "condition", ")", ".", "(", "G", ")", "Quantification", "of", "phospho", "-", "4EBP1", "protein", "levels", "in", "wild", "-", "type", "and", "GCN2", "-", "KO", "MEF", "cells", "upon", "starvation", "for", "2", "h", "(", "the", "mean", "±", "SD", "of", "the", "fold", "increase", "of", "the", "phospho", "-", "4EBP1", "to", "total", "4EBP1", "ratio", "from", "three", "independent", "experiments", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "analysis", "versus", "starvation", "treated", "wild", "-", "type", "cells", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "(", "H", ")", "Quantification", "of", "the", "percentage", "of", "MEF", "cells", "with", "nuclear", "TFE3", "upon", "DMSO", "(", "Control", ")", "or", "Torin", "-", "1", "(", "250", "nM", ")", "treatments", "for", "1", "h", "(", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "analysis", "versus", "DMSO", "treated", "wild", "-", "type", "cells", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "n", ">", "400", "cells", "per", "condition", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Immunoblot of protein lysates from wild-type, PERK-KO and GCN2-KO MEF cells incubated in the presence of DMSO (Control), Tunicamycin (0.1 µg/ml), or starved in EBSS for 16 h. Data are representative of three independent experiments.(B-D) Wild-type (B), GCN2-KO (C), and PERK-KO (D) MEF cells incubated in the presence of DMSO (Control) or Tunicamycin (0.1 µg/ml) as indicated in (A). Cells were fixed, permeabilized and stained with antibodies against TFE3 (green) and CHOP (red). Scale bar, 10 µm. Data are representative of three independent experiments.(E-F) Quantification of the percentage of MEF cells with nuclear TFE3 upon DMSO (Control), Tunicamycin treatments for 16 h (E), or starvation for 2 h (F) (mean ± SD of three independent experiments, one-way ANOVA analysis versus DMSO treated cells, ns= not significant, ***p < 0.001; n>400 cells per condition).(G) Quantification of phospho-4EBP1 protein levels in wild-type and GCN2-KO MEF cells upon starvation for 2 h (the mean ± SD of the fold increase of the phospho-4EBP1 to total 4EBP1 ratio from three independent experiments, one-way ANOVA analysis versus starvation treated wild-type cells, ***p < 0.001).(H) Quantification of the percentage of MEF cells with nuclear TFE3 upon DMSO (Control) or Torin-1 (250 nM) treatments for 1 h (mean ± SD of three independent experiments, one-way ANOVA analysis versus DMSO treated wild-type cells, ***p < 0.001; n>400 cells per condition)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "ARPE", "-", "19", "cells", "infected", "with", "either", "adenovirus", "expressing", "TFE3", "-", "WT", "-", "Myc", "or", "TFE3", "-", "S321A", "-", "Myc", "for", "16h", ".", "Cells", "were", "fixed", ",", "permeabilized", "and", "stained", "with", "antibodies", "against", "Myc", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", ".", "Quantification", "of", "the", "percentage", "of", "ARPE", "-", "19", "cells", "with", "nuclear", "TFE3", "-", "Myc", "(", "means", "±", "SD", "of", "3", "independent", "experiments", ",", "students", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ";", "n", ">", "400", "cells", "per", "condition", ")", ".", "(", "B", ")", "Immunoblots", "of", "protein", "lysates", "from", "ARPE", "-", "19", "cells", "infected", "as", "indicated", "in", "(", "A", ")", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "C", ")", "Immunoblots", "of", "TFE3", "-", "Ser321", "phosphorylation", "state", "in", "nuclear", "fractions", "of", "ARPE", "-", "19", "cells", "incubated", "with", "DMSO", "(", "Ctrl", ".", ")", ",", "Tunicamycin", "(", "Tun", ".", ")", ",", "or", "Torin", "-", "1", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "D", ")", "Immunoblots", "of", "protein", "of", "a", "GST", "pull", "-", "down", "from", "nuclear", "fractions", "of", "MEF", "cells", "treated", "with", "DMSO", "or", "Tunicamycin", "(", "5", "µg", "/", "ml", ")", "(", "Tun", ".", ")", "for", "16", "h", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "E", ")", "Immunoblots", "of", "protein", "lysates", "from", "ARPE", "-", "19", "cells", "incubated", "in", "the", "presence", "of", "DMSO", "(", "Ctrl", ".", ")", ",", "Tunicamycin", "(", "5", "µg", "/", "ml", ")", "(", "Tun", ".", ")", ",", "or", "starved", "in", "EBSS", "(", "Strv", ".", ")", "for", "16", "h", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "the", "percentage", "of", "ARPE", "-", "19", "cells", "with", "nuclear", "TFE3", "upon", "Tunicamycin", "(", "Tun", ".", ")", "or", "Tunicamycin", "+", "FK506", "treatments", "for", "16", "h", "(", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "analysis", "versus", "Tunicamycin", "treated", "cells", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "n", ">", "400", "cells", "per", "condition", ")", ".", "(", "G", ")", "Quantification", "of", "the", "percentage", "of", "calcineurin", "depleted", "ARPE", "-", "19", "cells", "with", "nuclear", "TFE3", "upon", "Tunicamycin", "(", "Tun", ".", ")", "or", "Starvation", "(", "Strv", ".", ")", "treatments", "for", "16", "h", "(", "mean", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "analysis", "versus", "siNon", "-", "target", "treated", "cells", "within", "the", "indicated", "treatment", ",", "ns", "=", "not", "significant", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "n", ">", "400", "cells", "per", "condition", ")", ".", "(", "H", ")", "Immunoblots", "of", "protein", "lysates", "from", "ARPE", "-", "19", "cells", "depleted", "of", "Calcineurin", "catalytic", "subunits", "PPP3CA", "and", "PPP3CB", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "I", ")", "Relative", "Quantitative", "Real", "-", "Time", "PCR", "analysis", "of", "PPP3CA", "and", "PPP3CB", "mRNA", "transcript", "levels", "in", "ARPE", "-", "19", "cells", "depleted", "of", "Calcineurin", "catalytic", "subunits", "PPP3CA", "and", "PPP3CB", "(", "mean", "±", "SD", "of", "the", "RNA", "fold", "change", "of", "indicated", "gene", "mRNAs", "normalized", "to", "actin", "mRNA", "from", "three", "independent", "experiments", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "analsysis", "versus", "the", "siNon", "-", "Target", "(", "siNT", ")", "treated", "cells", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "(", "J", ")", "Quantification", "of", "the", "percentage", "of", "ATF4", "depleted", "ARPE", "-", "19", "cells", "with", "nuclear", "TFE3", "upon", "Tunicamycin", "treatment", "for", "16", "h", "(", "mean", "±", "SD", "of", "two", "independent", "experiments", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "analysis", "versus", "siNon", "-", "target", "treated", "cells", "within", "the", "indicated", "treatment", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ";", "n", ">", "400", "cells", "per", "condition", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) ARPE-19 cells infected with either adenovirus expressing TFE3-WT-Myc or TFE3-S321A-Myc for 16h. Cells were fixed, permeabilized and stained with antibodies against Myc. Scale bar, 10 µm. Quantification of the percentage of ARPE-19 cells with nuclear TFE3-Myc (means ± SD of 3 independent experiments, students t-test, ****p < 0.0001; n>400 cells per condition).(B) Immunoblots of protein lysates from ARPE-19 cells infected as indicated in (A). Data are representative of three independent experiments.(C) Immunoblots of TFE3-Ser321 phosphorylation state in nuclear fractions of ARPE-19 cells incubated with DMSO (Ctrl.), Tunicamycin (Tun.), or Torin-1. Data are representative of three independent experiments.(D) Immunoblots of protein of a GST pull-down from nuclear fractions of MEF cells treated with DMSO or Tunicamycin (5 µg/ml) (Tun.) for 16 h. Data are representative of three independent experiments.(E) Immunoblots of protein lysates from ARPE-19 cells incubated in the presence of DMSO (Ctrl.), Tunicamycin (5 µg/ml) (Tun.), or starved in EBSS (Strv.) for 16 h. Data are representative of three independent experiments.(F) Quantification of the percentage of ARPE-19 cells with nuclear TFE3 upon Tunicamycin (Tun.) or Tunicamycin + FK506 treatments for 16 h (mean ± SD of three independent experiments, one-way ANOVA analysis versus Tunicamycin treated cells, ***p < 0.001; n>400 cells per condition).(G) Quantification of the percentage of calcineurin depleted ARPE-19 cells with nuclear TFE3 upon Tunicamycin (Tun.) or Starvation (Strv.) treatments for 16 h (mean ± SD of three independent experiments, one-way ANOVA analysis versus siNon-target treated cells within the indicated treatment, ns= not significant, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001; n>400 cells per condition).(H) Immunoblots of protein lysates from ARPE-19 cells depleted of Calcineurin catalytic subunits PPP3CA and PPP3CB. Data are representative of three independent experiments.(I) Relative Quantitative Real-Time PCR analysis of PPP3CA and PPP3CB mRNA transcript levels in ARPE-19 cells depleted of Calcineurin catalytic subunits PPP3CA and PPP3CB (mean ± SD of the RNA fold change of indicated gene mRNAs normalized to actin mRNA from three independent experiments, one-way ANOVA analsysis versus the siNon-Target (siNT) treated cells, ***p < 0.001).(J) Quantification of the percentage of ATF4 depleted ARPE-19 cells with nuclear TFE3 upon Tunicamycin treatment for 16 h (mean ± SD of two independent experiments, one-way ANOVA analysis versus siNon-target treated cells within the indicated treatment***p < 0.001; n>400 cells per condition)."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Relative", "Quantitative", "Real", "-", "Time", "PCR", "analysis", "of", "TFEB", "and", "TFE3", "mRNA", "transcript", "levels", "in", "ARPE", "-", "19", "cells", "depleted", "of", "TFEB", "and", "TFE3", "(", "mean", "±", "SD", "of", "the", "RNA", "fold", "change", "of", "indicated", "gene", "mRNAs", "normalized", "to", "actin", "mRNA", "from", "three", "independent", "experiments", ",", "student", "'", "s", "t", "-", "test", "versus", "siNon", "-", "Target", "(", "siNT", ")", "treated", "cells", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "(", "B", ")", "Relative", "Quantitative", "Real", "-", "Time", "PCR", "analysis", "of", "MCOLN1", ",", "ATP6V1C1", ",", "HEXA", "and", "UVRAG", "mRNA", "transcript", "levels", "in", "ARPE", "-", "19", "cells", "depleted", "of", "TFEB", "and", "TFE3", "upon", "incubation", "with", "DMSO", "(", "Control", ")", "or", "Tunicamycin", "(", "5", "µg", "/", "ml", ")", "for", "16", "h", "(", "mean", "±", "SD", "of", "the", "RNA", "fold", "change", "of", "indicated", "gene", "mRNAs", "normalized", "to", "actin", "mRNA", "from", "three", "independent", "experiments", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "analysis", "versus", "the", "same", "treatment", "condition", "in", "the", "siNon", "-", "Target", "(", "siNT", ")", "treated", "cells", "or", "versus", "the", "DMSO", "condition", "in", "siNon", "-", "Target", "(", "siNT", ")", "treated", "cells", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Relative Quantitative Real-Time PCR analysis of TFEB and TFE3 mRNA transcript levels in ARPE-19 cells depleted of TFEB and TFE3 (mean ± SD of the RNA fold change of indicated gene mRNAs normalized to actin mRNA from three independent experiments, student's t-test versus siNon-Target (siNT) treated cells, ***p < 0.001).(B) Relative Quantitative Real-Time PCR analysis of MCOLN1, ATP6V1C1, HEXA and UVRAG mRNA transcript levels in ARPE-19 cells depleted of TFEB and TFE3 upon incubation with DMSO (Control) or Tunicamycin (5 µg/ml) for 16 h (mean ± SD of the RNA fold change of indicated gene mRNAs normalized to actin mRNA from three independent experiments, one-way ANOVA analysis versus the same treatment condition in the siNon-Target (siNT) treated cells or versus the DMSO condition in siNon-Target (siNT) treated cells, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001)."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Immunoblots", "of", "protein", "lysates", "from", "ARPE", "-", "19", "cells", "infected", "with", "either", "adenovirus", "expressing", "Null", ",", "TFEB", "-", "S211A", ",", "or", "TFE3", "upon", "incubation", "with", "DMSO", "(", "Control", ")", ",", "Tunicamycin", "(", "5", "µg", "/", "ml", ")", "or", "starved", "in", "EBSS", "for", "16", "h", ".", "Data", "are", "representative", "of", "five", "independent", "experiments", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "ATF4", ",", "CHOP", "and", "GADD34", "protein", "levels", "in", "ARPE", "-", "19", "cells", "treated", "as", "indicated", "in", "(", "A", ")", "(", "mean", "±", "SD", "of", "the", "fold", "change", "of", "the", "indicated", "protein", "to", "actin", "ratio", "from", "three", "independent", "experiments", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "analysis", "versus", "the", "corresponding", "treatment", "condition", "in", "the", "adenovirus", "-", "Null", "infected", "cells", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "(", "C", ")", "Relative", "Quantitative", "Real", "-", "Time", "PCR", "analysis", "of", "ATF4", ",", "CHOP", ",", "GADD34", "and", "MCOLN1", "mRNA", "transcript", "levels", "in", "ARPE", "-", "19", "cells", "treated", "as", "indicated", "in", "(", "A", ")", "(", "mean", "±", "SD", "of", "the", "RNA", "fold", "change", "of", "indicated", "genes", "normalized", "to", "actin", "mRNA", "from", "three", "independent", "experiments", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "analysis", "versus", "the", "corresponding", "treatment", "condition", "in", "the", "adenovirus", "-", "Null", "infected", "cells", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Immunoblots of protein lysates from ARPE-19 cells infected with either adenovirus expressing Null, TFEB-S211A, or TFE3 upon incubation with DMSO (Control), Tunicamycin (5 µg/ml) or starved in EBSS for 16 h. Data are representative of five independent experiments.(B) Quantification of ATF4, CHOP and GADD34 protein levels in ARPE-19 cells treated as indicated in (A) (mean ± SD of the fold change of the indicated protein to actin ratio from three independent experiments, one-way ANOVA analysis versus the corresponding treatment condition in the adenovirus-Null infected cells, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001).(C) Relative Quantitative Real-Time PCR analysis of ATF4, CHOP, GADD34 and MCOLN1 mRNA transcript levels in ARPE-19 cells treated as indicated in (A) (mean ± SD of the RNA fold change of indicated genes normalized to actin mRNA from three independent experiments, one-way ANOVA analysis versus the corresponding treatment condition in the adenovirus-Null infected cells, **p < 0.01, ***p < 0.001)."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", "-", "D", ")", "Relative", "Quantitative", "Real", "-", "Time", "PCR", "analysis", "of", "ATF4", "(", "A", ")", ",", "ASNS", "(", "B", ")", ",", "CAT1", "(", "C", ")", "and", "xCT", "(", "D", ")", "mRNA", "transcript", "levels", "in", "ATF4", "-", "depleted", "ARPE", "-", "19", "cells", "infected", "with", "either", "adenovirus", "expressing", "Null", "or", "TFEB", "-", "S211A", "upon", "incubation", "with", "DMSO", "(", "Control", ")", ",", "Tunicamycin", "(", "5", "µg", "/", "ml", ")", ",", "or", "starved", "in", "EBSS", "for", "16", "h", "(", "mean", "±", "SD", "of", "the", "RNA", "fold", "change", "of", "indicated", "gene", "mRNAs", "normalized", "to", "actin", "mRNA", "from", "three", "independent", "experiments", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "analysis", "versus", "the", "corresponding", "treatment", "condition", "in", "the", "adenovirus", "-", "Null", "infected", "and", "siRNA", "Non", "-", "Target", "(", "siNT", ")", "treated", "cells", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "(", "E", ")", "ChIP", "-", "qPCR", "analysis", "of", "the", "ATF4", "promoter", "and", "2000bp", "upstream", "of", "the", "region", "of", "interest", "(", "ATF4", "-", "Control", ")", "from", "MEF", "cells", "that", "were", "untreated", "(", "control", ")", ",", "starved", "for", "2", "h", ",", "or", "treated", "with", "Tunicamycin", "(", "0", ".", "1", "µg", "/", "ml", ")", "for", "16", "h", ".", "Amplification", "regions", "are", "indicated", "by", "arrows", ".", "Chromatin", "DNA", "was", "immunoprecipitated", "with", "antibodies", "for", "anti", "-", "TFE3", ".", "Bar", "graphs", "show", "the", "amount", "of", "immunoprecipitated", "DNA", "detected", "by", "the", "real", "-", "time", "PCR", "assay", ".", "Values", "were", "normalized", "to", "the", "input", "and", "plotted", "as", "relative", "enrichment", "compared", "to", "untreated", "conditions", "(", "means", "±", "SD", "of", "three", "independent", "experiments", ",", "students", "t", "-", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A-D) Relative Quantitative Real-Time PCR analysis of ATF4 (A), ASNS (B), CAT1 (C) and xCT (D) mRNA transcript levels in ATF4-depleted ARPE-19 cells infected with either adenovirus expressing Null or TFEB-S211A upon incubation with DMSO (Control), Tunicamycin (5 µg/ml), or starved in EBSS for 16 h (mean ± SD of the RNA fold change of indicated gene mRNAs normalized to actin mRNA from three independent experiments, one-way ANOVA analysis versus the corresponding treatment condition in the adenovirus-Null infected and siRNA Non-Target (siNT) treated cells, *p < 0.05, ***p < 0.001).(E) ChIP-qPCR analysis of the ATF4 promoter and 2000bp upstream of the region of interest (ATF4-Control) from MEF cells that were untreated (control), starved for 2 h, or treated with Tunicamycin (0.1 µg/ml) for 16 h. Amplification regions are indicated by arrows. Chromatin DNA was immunoprecipitated with antibodies for anti-TFE3. Bar graphs show the amount of immunoprecipitated DNA detected by the real-time PCR assay. Values were normalized to the input and plotted as relative enrichment compared to untreated conditions (means ± SD of three independent experiments, students t-test, *p < 0.05, **p < 0.01)."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "F", ")", "Relative", "Quantitative", "Real", "-", "Time", "PCR", "analysis", "of", "SUMF1", ",", "DERL1", ",", "ATF6", ",", "APEX1", "and", "GPX1", "mRNA", "transcript", "levels", "in", "ARPE", "-", "19", "cells", "infected", "with", "either", "adenovirus", "expressing", "Null", "or", "TFEB", "-", "S211A", "(", "mean", "±", "SD", "of", "the", "RNA", "fold", "change", "of", "indicated", "gene", "mRNAs", "normalized", "to", "actin", "mRNA", "from", "three", "independent", "experiments", ",", "students", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "(", "G", ")", "Immunoblots", "of", "protein", "lysates", "from", "ARPE", "-", "19", "cells", "infected", "with", "either", "adenovirus", "expressing", "Null", "or", "TFEB", "-", "S211A", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "H", ")", "Quantification", "of", "IRE1α", "and", "APEX1", "protein", "levels", "in", "ARPE", "-", "19", "cells", "infected", "as", "indicated", "in", "(", "G", ")", "(", "mean", "±", "SD", "of", "the", "fold", "increase", "of", "the", "indicated", "protein", "to", "actin", "ratio", "from", "three", "independent", "experiments", ",", "students", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(F) Relative Quantitative Real-Time PCR analysis of SUMF1, DERL1, ATF6, APEX1 and GPX1 mRNA transcript levels in ARPE-19 cells infected with either adenovirus expressing Null or TFEB-S211A (mean ± SD of the RNA fold change of indicated gene mRNAs normalized to actin mRNA from three independent experiments, students t-test, **p < 0.01, ***p < 0.001).(G) Immunoblots of protein lysates from ARPE-19 cells infected with either adenovirus expressing Null or TFEB-S211A. Data are representative of three independent experiments.(H) Quantification of IRE1α and APEX1 protein levels in ARPE-19 cells infected as indicated in (G) (mean ± SD of the fold increase of the indicated protein to actin ratio from three independent experiments, students t-test, ***p < 0.001)."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "A", ")", "Immunoblots", "of", "protein", "lysates", "from", "Null", "-", "or", "TFEB", "/", "3", "knockout", "-", "MEF", "cells", "incubated", "in", "the", "presence", "of", "DMSO", "(", "Control", ")", "or", "Tunicamycin", "(", "Tun", ".", ")", "(", "0", ".", "1", "µg", "/", "ml", ")", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "ATF4", "protein", "levels", "in", "Null", "-", "or", "TFEB", "/", "3", "knockout", "-", "MEF", "cells", "treated", "as", "indicated", "in", "(", "A", ")", "(", "mean", "±", "SD", "of", "the", "ATF4", "to", "actin", "protein", "ratio", "from", "three", "independent", "experiments", ",", "student", "'", "s", "t", "-", "test", "versus", "the", "corresponding", "time", "point", "in", "Null", "-", "MEF", "cells", ",", "ns", "=", "not", "significant", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "(", "C", ")", "Cell", "viability", "was", "determined", "in", "Null", "-", "or", "TFEB", "/", "3", "knockout", "-", "MEF", "cells", "incubated", "in", "the", "presence", "of", "DMSO", "(", "Control", ")", "or", "Tunicamycin", "(", "Tun", ".", ")", "(", "0", ".", "1", "µg", "/", "ml", ")", "for", "the", "indicated", "times", "(", "mean", "±", "SD", "of", "the", "percentage", "of", "viable", "cells", "compared", "to", "control", "from", "three", "independent", "experiments", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "analysis", "versus", "the", "corresponding", "time", "point", "in", "Null", "-", "MEF", "cells", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "(", "D", ")", "Chromatin", "condensation", ",", "an", "indication", "of", "cells", "undergoing", "apoptosis", ",", "was", "assessed", "in", "Null", "-", "or", "TFEB", "/", "3", "knockout", "-", "MEF", "cells", "incubated", "in", "the", "presence", "of", "DMSO", "(", "Control", ")", "or", "Tunicamycin", "(", "0", ".", "1", "µg", "/", "ml", ")", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Confocal", "microscopy", "images", "were", "obtained", "from", "fixed", "cells", "stained", "with", "Hoechst", "33342", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "µm", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "E", ")", "Immunoblots", "of", "protein", "lysates", "from", "Null", "-", "or", "TFEB", "/", "3", "knockout", "-", "MEF", "cells", "treated", "as", "described", "in", "(", "A", ")", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "F", "-", "H", ")", "Quantification", "of", "CHOP", "(", "F", ")", ",", "PUMA", "(", "G", ")", "and", "NOXA", "(", "H", ")", "protein", "levels", "in", "Null", "-", "or", "TFEB", "/", "3", "knockout", "-", "MEF", "cells", "treated", "as", "indicated", "in", "(", "E", ")", "(", "mean", "±", "SD", "of", "the", "indicated", "protein", "to", "actin", "ratio", "from", "three", "independent", "experiments", ",", "student", "'", "s", "t", "-", "test", "analysis", "versus", "the", "corresponding", "time", "point", "in", "Null", "-", "MEF", "cells", ",", "ns", "=", "not", "significant", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "(", "I", ")", "adenovirus", "of", "protein", "lysates", "from", "ARPE", "-", "19", "cells", "infected", "with", "either", "adenovirus", "expressing", "Null", ",", "TFEB", "-", "S211A", "or", "TFE3", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", ".", "(", "J", ")", "Quantification", "of", "PUMA", "protein", "levels", "in", "ARPE", "-", "19", "cells", "infected", "as", "indicated", "in", "(", "I", ")", "(", "mean", "±", "SD", "of", "the", "fold", "change", "of", "the", "indicated", "protein", "to", "actin", "ratio", "from", "three", "independent", "experiments", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "analysis", "versus", "the", "adenovirus", "-", "Null", "infected", "cells", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(A) Immunoblots of protein lysates from Null- or TFEB/3 knockout-MEF cells incubated in the presence of DMSO (Control) or Tunicamycin (Tun.) (0.1 µg/ml) for the indicated times. Data are representative of three independent experiments.(B) Quantification of ATF4 protein levels in Null- or TFEB/3 knockout-MEF cells treated as indicated in (A) (mean ± SD of the ATF4 to actin protein ratio from three independent experiments, student's t-test versus the corresponding time point in Null-MEF cells, ns= not significant, **p < 0.01).(C) Cell viability was determined in Null- or TFEB/3 knockout-MEF cells incubated in the presence of DMSO (Control) or Tunicamycin (Tun.) (0.1 µg/ml) for the indicated times (mean ± SD of the percentage of viable cells compared to control from three independent experiments, one-way ANOVA analysis versus the corresponding time point in Null-MEF cells ***p < 0.001).(D) Chromatin condensation, an indication of cells undergoing apoptosis, was assessed in Null- or TFEB/3 knockout-MEF cells incubated in the presence of DMSO (Control) or Tunicamycin (0.1 µg/ml) for the indicated times. Confocal microscopy images were obtained from fixed cells stained with Hoechst 33342. Scale bar, 20 µm. Data are representative of three independent experiments.(E) Immunoblots of protein lysates from Null- or TFEB/3 knockout-MEF cells treated as described in (A). Data are representative of three independent experiments.(F-H) Quantification of CHOP (F), PUMA (G) and NOXA (H) protein levels in Null- or TFEB/3 knockout-MEF cells treated as indicated in (E) (mean ± SD of the indicated protein to actin ratio from three independent experiments, student's t-test analysis versus the corresponding time point in Null-MEF cells, ns= not significant, *p < 0.05, **p < 0.01).(I) adenovirus of protein lysates from ARPE-19 cells infected with either adenovirus expressing Null, TFEB-S211A or TFE3. Data are representative of three independent experiments.(J) Quantification of PUMA protein levels in ARPE-19 cells infected as indicated in (I) (mean ± SD of the fold change of the indicated protein to actin ratio from three independent experiments, one-way ANOVA analysis versus the adenovirus-Null infected cells, *p < 0.05, ***p < 0.001)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Serum", "IgG", "ELISA", "reactivity", "with", "MTB", "(", "H37Rv", ")", "whole", "cell", "lysate", ",", "purified", "cell", "membrane", "fraction", "and", "secreted", "culture", "filtrate", "proteins", "(", "CFP", ")", "for", "TB", "patients", "and", "healthy", "donors", "(", "HD", ")", ".", "ELISA", "graphs", "(", "left", ";", "TB", ":", "black", "lines", ";", "n", "=", "25", ";", "HD", ":", "red", "dotted", "lines", ";", "n", "=", "2", ")", "and", "area", "under", "the", "curve", "(", "AUC", ")", "values", "for", "all", "tested", "samples", "(", "right", ";", "TB", ":", "n", "=", "25", ";", "HD", ":", "n", "=", "17", ")", "are", "shown", ".", "Median", "is", "shown", ".", "(", "B", ")", "AUC", "values", "for", "the", "IgA", "serum", "ELISA", "response", "against", "MTB", "whole", "cell", "lysate", ",", "purified", "cell", "membrane", "fraction", "and", "secreted", "culture", "filtrate", "proteins", "(", "CFP", ")", "of", "TB", "patients", "(", "n", "=", "25", ")", "and", "healthy", "donors", "(", "HD", ";", "n", "=", "9", ")", ".", "Median", "is", "shown", ".", "(", "C", ")", "Flow", "cytometry", "gating", "strategy", "and", "frequency", "of", "circulating", "plasmablasts", "(", "CD19", "+", "CD27", "+", "+", "CD38", "+", ")", "for", "one", "representative", "TB", "patient", "(", "TB24", ")", "and", "HD", "(", "left", ")", ".", "Frequency", "of", "circulating", "CD19", "+", "CD27", "+", "+", "CD38", "+", "plasmablasts", "of", "all", "CD19", "+", "B", "cells", "in", "peripheral", "blood", "of", "TB", "patients", "(", "n", "=", "24", ")", "and", "HD", "(", "n", "=", "8", ")", ".", "Dashed", "line", "indicates", "threshold", "for", "detectable", "plasmablast", "populations", "(", "right", ")", ".", "Median", "and", "SEM", "are", "shown", ".", "(", "D", ")", "Expression", "of", "CD19", "and", "activation", "markers", "(", "CD86", ",", "CD84", "and", "CD24", ")", "in", "plasmablasts", "and", "memory", "B", "cells", "as", "measured", "by", "flow", "cytometry", ".", "(", "E", ")", "Plasmablast", "response", "of", "patient", "TB7", "(", "top", ")", "and", "IgG", "serum", "response", "against", "MTB", "cell", "lysate", "of", "patient", "TB7", ",", "TB19", "and", "TB39", "(", "bottom", ")", "and", "one", "HD", "at", "the", "indicated", "time", "points", "before", "and", "after", "treatment", "onset", ".", "(", "F", ")", "Dots", "indicate", "AUC", "values", "for", "the", "anti", "-", "MTB", "cell", "lysate", "IgG", "serum", "ELISA", "response", "(", "y", "-", "axis", ")", "versus", "frequency", "of", "circulating", "plasmablasts", "(", "x", "-", "axis", ")", "for", "individual", "TB", "patients", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Serum IgG ELISA reactivity with MTB (H37Rv) whole cell lysate, purified cell membrane fraction and secreted culture filtrate proteins (CFP) for TB patients and healthy donors (HD). ELISA graphs (left; TB: black lines; n=25; HD: red dotted lines; n=2) and area under the curve (AUC) values for all tested samples (right; TB: n=25; HD: n=17) are shown. Median is shown.(B) AUC values for the IgA serum ELISA response against MTB whole cell lysate, purified cell membrane fraction and secreted culture filtrate proteins (CFP) of TB patients (n=25) and healthy donors (HD; n=9). Median is shown.(C) Flow cytometry gating strategy and frequency of circulating plasmablasts (CD19+CD27++CD38+) for one representative TB patient (TB24) and HD (left). Frequency of circulating CD19+CD27++CD38+plasmablasts of all CD19+ B cells in peripheral blood of TB patients (n=24) and HD (n=8). Dashed line indicates threshold for detectable plasmablast populations (right). Median and SEM are shown.(D) Expression of CD19 and activation markers (CD86, CD84 and CD24) in plasmablasts and memory B cells as measured by flow cytometry.(E) Plasmablast response of patient TB7 (top) and IgG serum response against MTB cell lysate of patient TB7, TB19 and TB39 (bottom) and one HD at the indicated time points before and after treatment onset.(F) Dots indicate AUC values for the anti-MTB cell lysate IgG serum ELISA response (y-axis) versus frequency of circulating plasmablasts (x-axis) for individual TB patients."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Gating", "strategy", ",", "phenotype", "and", "frequency", "of", "circulating", "plasmablasts", "(", "CD19", "+", "CD27", "+", "+", "CD38", "+", ")", "isolated", "by", "flow", "cytometric", "cell", "sorting", "from", "3", "TB", "patients", "(", "TB7", ",", "TB24", ",", "TB33", ")", "in", "comparison", "to", "one", "representative", "HD", ".", "Boxes", "indicate", "sort", "gates", ".", "The", "plasmablast", "frequency", "is", "indicated", ".", "(", "B", ")", "Absolute", "number", "of", "somatic", "hypermutations", "(", "SHM", ")", "in", "the", "IGHV", ",", "IGKV", "and", "IGLV", "segments", "of", "IgA", "and", "IgG", "plasmablast", "antibody", "genes", "sequenced", "from", "TB7", ",", "TB24", "and", "TB33", ".", "The", "absolute", "number", "of", "sequences", "analyzed", "is", "indicated", "below", "the", "graph", ".", "Geometric", "means", "with", "SEM", "are", "indicated", "in", "grey", ".", "SHM", "means", "of", "historic", "data", "from", "sorted", "CD27", "+", "IgA", "+", "or", "CD27", "+", "IgG", "+", "cells", "from", "peripheral", "blood", "of", "HD", "are", "indicated", "in", "red", "for", "comparison", "(", "Berkowska", "et", "al", ",", "2015a", ";", "Tiller", "et", "al", ",", "2007", ")", ".", "(", "C", ")", "Isotype", "distribution", "of", "plasmablast", "and", "memory", "B", "cells", "from", "TB7", ",", "TB24", "and", "TB33", ".", "PB", ",", "plasmablasts", "(", "CD19", "+", "CD27", "+", "+", "CD38", "+", ")", ";", "M", ",", "memory", "B", "cells", "(", "CD19", "+", "CD27", "+", ")", ".", "(", "D", ")", "Gating", "strategy", ",", "phenotype", "and", "frequency", "of", "HBHA", "-", "reactive", "memory", "B", "cells", "(", "CD19", "+", "CD27", "+", "HBHA", "+", ")", "in", "peripheral", "blood", "of", "one", "representative", "TB", "patient", "(", "TB29", ")", ",", "health", "-", "care", "worker", "(", "HCW", ")", "2", "and", "HD", ",", "respectively", ".", "(", "E", ")", "Dots", "indicate", "frequency", "of", "HBHA", "-", "reactive", "memory", "B", "cells", "out", "of", "all", "CD27", "+", "memory", "B", "cells", "in", "individual", "TB", "patients", "(", "n", "=", "23", ")", "and", "HCWs", "(", "n", "=", "7", ")", ".", "Mean", "and", "SEM", "are", "indicated", ".", "P", "-", "value", "was", "determined", "using", "Wilcoxon", "-", "Mann", "-", "Whitney", "test", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ".", "(", "F", ")", "Dots", "indicate", "the", "frequency", "of", "resting", "memory", "B", "cells", "(", "CD19", "+", "CD27", "+", "CD10", "-", ")", "out", "of", "all", "B", "cells", "in", "peripheral", "blood", "of", "individual", "TB", "patients", "compared", "to", "HD", ".", "(", "G", ")", "Anti", "-", "HBHA", "serum", "IgG", "ELISA", "reactivity", "for", "TB", "patients", "and", "HCW", "(", "black", "lines", ")", "compared", "to", "two", "representative", "HD", "(", "red", "lines", ")", ".", "Dashed", "line", "indicates", "the", "threshold", "OD405nm", "for", "positive", "reactivity", "(", "left", ")", ".", "Asterisks", "indicate", "serum", "responses", "of", "donors", "selected", "for", "single", "sorting", "of", "HBHA", "-", "reactive", "memory", "B", "cells", ".", "Data", "are", "representative", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "(", "H", ")", "Absolute", "number", "of", "somatic", "hypermutations", "(", "SHM", ")", "in", "the", "IGHV", "(", "IGHA", ",", "IGHG", "and", "IGHM", ")", ",", "IGKV", "or", "IGLV", "segments", "of", "sorted", "anti", "-", "HBHAmemory", "cells", "from", "TB", "patients", "and", "HCWs", ".", "Geometric", "means", "with", "SEM", "are", "indicated", "in", "grey", ".", "For", "comparison", ",", "red", "lines", "indicate", "the", "historic", "SHM", "means", "for", "randomly", "sorted", "CD27", "+", "IgA", "+", ",", "CD27", "+", "IgG", "+", "or", "CD27", "+", "IgM", "+", "cells", "from", "peripheral", "blood", "of", "HDs", "(", "Berkowska", "et", "al", ",", "2015a", ";", "Tiller", "et", "al", ",", "2007", ";", "Tsuiji", "et", "al", ",", "2006", ")", ".", "(", "I", ")", "Number", "and", "size", "of", "clonally", "expanded", "B", "cell", "clusters", "among", "HBHA", "-", "reactive", "memory", "B", "cells", "from", "two", "TB", "patients", "(", "TB35", ",", "TB29", ")", "and", "HCWs", "(", "HCW1", ",", "HCW", "2", ")", ".", "Cells", "in", "clusters", "are", "indicated", "in", "grey", ",", "single", "cells", "are", "indicated", "in", "white", ".", "No", "B", "cell", "clusters", "were", "shared", "between", "donors", ".", "(", "J", ")", "IgA", ",", "IgG", "and", "IgM", "isotype", "distribution", "of", "single", "-", "cell", "-", "sorted", "HBHA", "-", "reactive", "memory", "cells", ".", "Mean", "and", "SEM", "are", "indicated", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Gating strategy, phenotype and frequency of circulating plasmablasts (CD19+CD27++CD38+) isolated by flow cytometric cell sorting from 3 TB patients (TB7, TB24, TB33) in comparison to one representative HD. Boxes indicate sort gates. The plasmablast frequency is indicated.(B) Absolute number of somatic hypermutations (SHM) in the IGHV, IGKV and IGLV segments of IgA and IgG plasmablast antibody genes sequenced from TB7, TB24 and TB33. The absolute number of sequences analyzed is indicated below the graph. Geometric means with SEM are indicated in grey. SHM means of historic data from sorted CD27+IgA+ or CD27+IgG+ cells from peripheral blood of HD are indicated in red for comparison (Berkowska et al, 2015a; Tiller et al, 2007).(C) Isotype distribution of plasmablast and memory B cells from TB7, TB24 and TB33. PB, plasmablasts (CD19+CD27++CD38+); M, memory B cells (CD19+CD27+).(D) Gating strategy, phenotype and frequency of HBHA-reactive memory B cells (CD19+CD27+HBHA+) in peripheral blood of one representative TB patient (TB29), health-care worker (HCW) 2 and HD, respectively.(E) Dots indicate frequency of HBHA-reactive memory B cells out of all CD27+ memory B cells in individual TB patients (n=23) and HCWs (n=7). Mean and SEM are indicated. P-value was determined using Wilcoxon-Mann-Whitney test; ****p<0.0001.(F) Dots indicate the frequency of resting memory B cells (CD19+CD27+CD10-) out of all B cells in peripheral blood of individual TB patients compared to HD.(G) Anti-HBHA serum IgG ELISA reactivity for TB patients and HCW (black lines) compared to two representative HD (red lines). Dashed line indicates the threshold OD405nm for positive reactivity (left). Asterisks indicate serum responses of donors selected for single sorting of HBHA-reactive memory B cells. Data are representative of two independent experiments.(H) Absolute number of somatic hypermutations (SHM) in the IGHV (IGHA, IGHG and IGHM), IGKV or IGLV segments of sorted anti-HBHAmemory cells from TB patients and HCWs. Geometric means with SEM are indicated in grey. For comparison, red lines indicate the historic SHM means for randomly sorted CD27+IgA+, CD27+IgG+ or CD27+IgM+ cells from peripheral blood of HDs (Berkowska et al, 2015a; Tiller et al, 2007; Tsuiji et al, 2006).(I) Number and size of clonally expanded B cell clusters among HBHA-reactive memory B cells from two TB patients (TB35, TB29) and HCWs (HCW1, HCW 2). Cells in clusters are indicated in grey, single cells are indicated in white. No B cell clusters were shared between donors.(J) IgA, IgG and IgM isotype distribution of single-cell-sorted HBHA-reactive memory cells. Mean and SEM are indicated."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ",", "B", ")", "Representative", "ELISA", "graphs", "show", "reactivity", "of", "antibodies", "from", "patient", "TB7", "to", "(", "A", ")", "MTB", "whole", "cell", "lysate", "or", "(", "B", ")", "MTB", "bacteria", "(", "left", ")", ".", "Dashed", "red", "line", "indicates", "the", "threshold", "OD405nm", "for", "positive", "reactivity", ".", "Green", "line", "indicates", "negative", "control", "antibody", "(", "mGO53", ";", "(", "Wardemann", "et", "al", ",", "2003", ")", ")", ".", "AUC", "(", "area", "under", "curve", ")", "values", "indicate", "the", "reactivity", "to", "(", "A", ")", "MTB", "cell", "lysate", "or", "(", "B", ")", "whole", "MTB", "bacteria", "for", "antibodies", "from", "TB7", ",", "TB24", ",", "TB33", ".", "Total", "numbers", "of", "analyzed", "antibodies", "are", "indicated", "(", "right", ")", ".", "(", "D", ")", "ELISA", "graph", "shows", "reactivity", "to", "the", "MTB", "cell", "membrane", "fraction", "for", "MTB", "-", "reactive", "(", "n", "=", "26", ")", "and", "non", "-", "reactive", "(", "n", "=", "14", ")", "antibodies", ".", "(", "E", ")", "Reactivity", "to", "whole", "BCG", "bacteria", "as", "determined", "by", "flow", "cytometry", "for", "three", "representative", "MTB", "cell", "lysate", "-", "reactive", "antibodies", "and", "one", "non", "-", "reactive", "antibody", "(", "isotype", "control", ",", "mGO53", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A, B) Representative ELISA graphs show reactivity of antibodies from patient TB7 to (A) MTB whole cell lysate or (B) MTB bacteria (left). Dashed red line indicates the threshold OD405nm for positive reactivity. Green line indicates negative control antibody (mGO53; (Wardemann et al, 2003)). AUC (area under curve) values indicate the reactivity to (A) MTB cell lysate or (B) whole MTB bacteria for antibodies from TB7, TB24, TB33. Total numbers of analyzed antibodies are indicated (right).(D) ELISA graph shows reactivity to the MTB cell membrane fraction for MTB-reactive (n=26) and non-reactive (n=14) antibodies.(E) Reactivity to whole BCG bacteria as determined by flow cytometry for three representative MTB cell lysate-reactive antibodies and one non-reactive antibody (isotype control, mGO53)."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Binding", "of", "antibodies", "TB24PB037", "and", "TB33PB123", "to", "LAM", "purified", "from", "MTB", "as", "determined", "by", "Western", "Blot", ".", "The", "negative", "isotype", "control", "(", "mGO53", ")", "and", "a", "commercially", "available", "anti", "-", "LAM", "antibody", "(", "positive", "control", ")", "are", "shown", "for", "comparison", ".", "(", "B", ")", "Anti", "-", "BCG", "specificity", "of", "the", "LAM", "-", "reactive", "antibody", "TB24PB037", "(", "black", ")", "compared", "to", "E", ".", "coli", "as", "determined", "by", "ELISA", "with", "whole", "bacteria", "(", "left", ")", "and", "flow", "cytometry", "(", "right", ")", ".", "(", "C", ")", "Anti", "-", "LAMELISA", "for", "TB24PB037", "or", "negative", "control", "antibody", "at", "the", "indicated", "concentrations", ".", "The", "mean", "±", "SD", "of", "the", "absorbance", "was", "calculated", ".", "(", "D", ")", "Antibody", "TB24PB037", "binds", "to", "MTB", "-", "LAM", "but", "not", "to", "LAM", "from", "M", ".", "smegmatis", ".", "ELISA", "performed", "as", "described", "in", "(", "C", ")", ".", "(", "E", ")", "Representative", "HBHA", "ELISA", "for", "antibodies", "cloned", "from", "HBHA", "-", "reactive", "memory", "B", "cells", "of", "patient", "TB35", "and", "HCW1", ".", "Dashed", "red", "line", "indicates", "the", "threshold", "OD405nm", "for", "positive", "reactivity", ".", "Green", "line", "indicates", "negative", "control", "antibody", "(", "mGO53", ";", "(", "Wardemann", "et", "al", ",", "2003", ")", ")", ".", "(", "F", ")", "Reactivity", "to", "HBHA", "was", "confirmed", "by", "Western", "Blot", "for", "a", "selected", "set", "of", "antibodies", "with", "HBHA", "ELISA", "reactivity", ".", "(", "G", ")", "Fluorescence", "microscopy", "shows", "BCG", "-", "and", "MTB", "-", "reactivity", "of", "representative", "anti", "-", "HBHA", "antibodies", "compared", "to", "a", "non", "-", "reactive", "isotype", "control", "antibody", ".", "Scale", "bar", "10", "μm", "(", "top", "/", "bottom", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Binding of antibodies TB24PB037 and TB33PB123 to LAM purified from MTB as determined by Western Blot. The negative isotype control (mGO53) and a commercially available anti-LAM antibody (positive control) are shown for comparison.(B) Anti-BCG specificity of the LAM-reactive antibody TB24PB037 (black) compared to E.coli as determined by ELISA with whole bacteria (left) and flow cytometry (right).(C) Anti-LAMELISA for TB24PB037 or negative control antibody at the indicated concentrations. The mean ±SD of the absorbance was calculated.(D) Antibody TB24PB037 binds to MTB-LAM but not to LAM from M. smegmatis. ELISA performed as described in (C).(E) Representative HBHA ELISA for antibodies cloned from HBHA-reactive memory B cells of patient TB35 and HCW1. Dashed red line indicates the threshold OD405nm for positive reactivity. Green line indicates negative control antibody (mGO53; (Wardemann et al, 2003)).(F) Reactivity to HBHA was confirmed by Western Blot for a selected set of antibodies with HBHA ELISA reactivity.(G) Fluorescence microscopy shows BCG- and MTB-reactivity of representative anti-HBHA antibodies compared to a non-reactive isotype control antibody. Scale bar 10 μm (top/bottom)."}
{"words": ["Figure", "5Relative", "bacterial", "counts", "(", "CFU", ")", "compared", "to", "the", "medium", "control", "(", "100", "%", ")", "in", "human", "lung", "epithelial", "A549", "cells", "1", "h", "after", "infection", "with", "MTB", ",", "pre", "-", "incubated", "with", "recombinant", "MTB", "-", "reactive", "IgA1", ",", "IgA2", "or", "IgG1", "antibodies", "and", "non", "-", "reactive", "isotype", "control", "as", "indicated", ".", "(", "A", ")", "Representative", "results", "for", "individual", "MTB", "-", "reactive", "plasmablast", "antibodies", ".", "Mean", "and", "SEM", "are", "indicated", ".", "Relative", "bacterial", "counts", "(", "CFU", ")", "compared", "to", "the", "medium", "control", "(", "100", "%", ")", "in", "human", "lung", "epithelial", "A549", "cells", "1", "h", "after", "infection", "with", "MTB", ",", "pre", "-", "incubated", "with", "recombinant", "MTB", "-", "reactive", "IgA1", ",", "IgA2", "or", "IgG1", "antibodies", "and", "non", "-", "reactive", "isotype", "control", "as", "indicated", ".", "(", "B", ")", "Direct", "comparison", "of", "all", "tested", "MTB", "-", "reactive", "IgA", "(", "n", "=", "12", ")", "and", "IgG", "(", "n", "=", "26", ")", "antibodies", ".", "Mean", "and", "SEM", "are", "indicated", ".", "Relative", "bacterial", "counts", "(", "CFU", ")", "compared", "to", "the", "medium", "control", "(", "100", "%", ")", "in", "human", "lung", "epithelial", "A549", "cells", "1", "h", "after", "infection", "with", "MTB", ",", "pre", "-", "incubated", "with", "recombinant", "MTB", "-", "reactive", "IgA1", ",", "IgA2", "or", "IgG1", "antibodies", "and", "non", "-", "reactive", "isotype", "control", "as", "indicated", ".", "(", "C", ")", "Representative", "results", "for", "individual", "HBHA", "-", "reactive", "memory", "B", "cell", "antibodies", "from", "TB", "patients", "and", "HCW", ".", "Relative", "bacterial", "counts", "(", "CFU", ")", "compared", "to", "the", "medium", "control", "(", "100", "%", ")", "in", "human", "lung", "epithelial", "A549", "cells", "1", "h", "after", "infection", "with", "MTB", ",", "pre", "-", "incubated", "with", "recombinant", "MTB", "-", "reactive", "IgA1", ",", "IgA2", "or", "IgG1", "antibodies", "and", "non", "-", "reactive", "isotype", "control", "as", "indicated", ".", "(", "D", ")", "Same", "as", "in", "(", "B", ")", "but", "with", "HBHA", "-", "reactive", "antibodies", "as", "shown", "in", "(", "C", ")", ".", "(", "D", ")", "Direct", "comparison", "all", "tested", "HBHA", "-", "reactive", "IgA", "(", "n", "=", "6", ")", "and", "IgG", "(", "n", "=", "7", ")", "antibodies", ".", "Relative", "bacterial", "counts", "(", "CFU", ")", "compared", "to", "the", "medium", "control", "(", "100", "%", ")", "in", "human", "lung", "epithelial", "A549", "cells", "1", "h", "after", "infection", "with", "MTB", ",", "pre", "-", "incubated", "with", "recombinant", "MTB", "-", "reactive", "IgA1", ",", "IgA2", "or", "IgG1", "antibodies", "and", "non", "-", "reactive", "isotype", "control", "as", "indicated", ".", "(", "E", ")", "Direct", "comparison", "of", "the", "indicated", "MTB", "-", "reactive", "antibodies", "expressed", "as", "IgA", "and", "IgG", ".", "Mean", "and", "SEM", "are", "indicated", ".", "P", "-", "values", "were", "determined", "using", "non", "-", "parameric", "t", "-", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "1", ";", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "ns", ":", "p", ">", "0", ".", "5", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Relative bacterial counts (CFU) compared to the medium control (100%) in human lung epithelial A549 cells 1 h after infection with MTB, pre-incubated with recombinant MTB-reactive IgA1, IgA2 or IgG1 antibodies and non-reactive isotype control as indicated. (A) Representative results for individual MTB-reactive plasmablast antibodies. Mean and SEM are indicated.Relative bacterial counts (CFU) compared to the medium control (100%) in human lung epithelial A549 cells 1 h after infection with MTB, pre-incubated with recombinant MTB-reactive IgA1, IgA2 or IgG1 antibodies and non-reactive isotype control as indicated. (B) Direct comparison of all tested MTB-reactive IgA (n=12) and IgG (n=26) antibodies. Mean and SEM are indicated.Relative bacterial counts (CFU) compared to the medium control (100%) in human lung epithelial A549 cells 1 h after infection with MTB, pre-incubated with recombinant MTB-reactive IgA1, IgA2 or IgG1 antibodies and non-reactive isotype control as indicated. (C) Representative results for individual HBHA-reactive memory B cell antibodies from TB patients and HCW.Relative bacterial counts (CFU) compared to the medium control (100%) in human lung epithelial A549 cells 1 h after infection with MTB, pre-incubated with recombinant MTB-reactive IgA1, IgA2 or IgG1 antibodies and non-reactive isotype control as indicated. (D) Same as in (B) but with HBHA-reactive antibodies as shown in (C). (D) Direct comparison all tested HBHA-reactive IgA (n=6) and IgG (n=7) antibodies.Relative bacterial counts (CFU) compared to the medium control (100%) in human lung epithelial A549 cells 1 h after infection with MTB, pre-incubated with recombinant MTB-reactive IgA1, IgA2 or IgG1 antibodies and non-reactive isotype control as indicated. (E) Direct comparison of the indicated MTB-reactive antibodies expressed as IgA and IgG. Mean and SEM are indicated. P-values were determined using non-parameric t-test, * p<0.1; **p<0.01, ns: p>0.5."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Human", "lung", "epithelial", "A549", "cells", "and", "primary", "bronchial", "epithelial", "cells", "(", "hAECB", ")", "lack", "FcγR", "(", "CD16", ",", "CD64", "and", "CD32", ")", "and", "FcαR", "(", "CD89", ")", "cell", "surface", "expression", "as", "analyzed", "by", "flow", "cytometry", ".", "Human", "THP1", "cells", "serve", "as", "positive", "control", ".", "(", "B", ")", "The", "neonatal", "FcR", "(", "FcRn", ")", "is", "expressed", "in", "both", "A549", "cells", "and", "human", "THP1", "cells", "as", "determined", "by", "Western", "Blotting", ".", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "independent", "experiments", ".", "(", "C", ")", "Absolute", "bacterial", "counts", "(", "CFUs", ")", "in", "human", "THP1", "macrophages", "1", "h", "after", "infection", "with", "MTB", "pre", "-", "incubated", "with", "the", "LAM", "-", "reactive", "IgA1", "(", "left", ")", "or", "IgG1", "(", "right", ")", "antibody", "TB24PB037", "or", "the", "respective", "isotype", "control", "antibody", "as", "indicated", ".", "Mean", "and", "SEM", "are", "indicated", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Human lung epithelial A549 cells and primary bronchial epithelial cells (hAECB) lack FcγR (CD16, CD64 and CD32) and FcαR (CD89) cell surface expression as analyzed by flow cytometry. Human THP1 cells serve as positive control.(B) The neonatal FcR (FcRn) is expressed in both A549 cells and human THP1 cells as determined by Western Blotting. Data are representative of at least two independent experiments.(C) Absolute bacterial counts (CFUs) in human THP1 macrophages 1 h after infection with MTB pre-incubated with the LAM-reactive IgA1 (left) or IgG1 (right) antibody TB24PB037 or the respective isotype control antibody as indicated. Mean and SEM are indicated."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Absolute", "bacterial", "counts", "(", "CFUs", ")", "in", "human", "lung", "epithelial", "A549", "cells", "1", "h", "after", "infection", "with", "MTB", "pre", "-", "incubated", "with", "purified", "serum", "IgA", "(", "left", ")", "or", "IgG", "(", "right", ")", "antibodies", "from", "TB", "patients", "(", "TB", ")", "compared", "to", "HD", "as", "indicated", ".", "Mean", "and", "SEM", "are", "indicated", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "with", "three", "technical", "replicates", "each", ".", "(", "B", ")", "Direct", "comparison", "of", "purified", "serum", "IgA", "and", "IgG", "antibodies", "on", "epithelial", "cell", "invasion", "as", "measured", "in", "(", "A", ")", ".", "P", "-", "value", "was", "determined", "using", "Wilcoxon", "-", "Mann", "-", "Whitney", "test", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Absolute bacterial counts (CFUs) in human lung epithelial A549 cells 1 h after infection with MTB pre-incubated with purified serum IgA (left) or IgG (right) antibodies from TB patients (TB) compared to HD as indicated. Mean and SEM are indicated. Data are representative of three independent experiments with three technical replicates each.(B) Direct comparison of purified serum IgA and IgG antibodies on epithelial cell invasion as measured in (A). P-value was determined using Wilcoxon-Mann-Whitney test; ****p<0.0001."}
{"words": ["Figure", "1Ten", "-", "fold", "serial", "dilutions", "of", "1", "OD600", "unit", "/", "mL", "of", "the", "indicated", "strains", "were", "spotted", "on", "SD", "plates", "containing", "0", "(", "C", "-", ")", "or", "1", "mM", "choline", "(", "C", "+", ")", "and", "0", "(", "I", "-", ")", "or", "75", "μM", "inositol", "(", "I", "+", ")", "and", "incubated", "at", "30oC", "for", "3", "d", ".", "A", "representative", "experiment", "is", "shown", "(", "from", "n", "=", "5", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Ten-fold serial dilutions of 1 OD600 unit/mL of the indicated strains were spotted on SD plates containing 0 (C-) or 1 mM choline (C+) and 0 (I-) or 75 μM inositol (I+) and incubated at 30oC for 3 d. A representative experiment is shown (from n=5)."}
{"words": ["Figure", "2A", "-", "L", "Wild", "type", "cultured", "in", "C", "-", "(", "A", ")", ",", "cho2opi3", "cultured", "in", "C", "+", "(", "B", ")", ",", "coS", "#", "4", "(", "C", "-", "D", ")", ",", "coS", "#", "3", "(", "E", "-", "G", ")", ",", "and", "coS", "#", "2", "(", "I", "-", "K", ")", "cultured", "in", "C", "-", "were", "analyzed", "by", "electron", "microscopy", ".", "In", "addition", ",", "coS", "#", "3", "(", "H", ")", "and", "coS", "#", "2", "(", "L", ")", "are", "shown", "after", "culture", "in", "C", "+", "for", "3", "generations", ".", "The", "arrow", "heads", "(", "F", ",", "I", ",", "J", ")", "point", "to", "protrusions", "in", "the", "nuclear", "envelope", ".", "CW", ",", "cell", "wall", ";", "ER", ",", "endoplasmic", "reticulum", ";", "PM", ",", "plasma", "membrane", ";", "M", ",", "mitochondria", ";", "N", ",", "nucleus", ";", "V", ",", "vacuole", ";", "*", ",", "lipid", "droplet", ".", "Scale", "bars", "correspond", "to", "200", "nm", "(", "A", ",", "B", ",", "D", ",", "F", ",", "G", ")", "or", "500", "nm", "(", "C", ",", "E", ",", "H", ",", "I", ",", "J", ",", "K", ",", "L", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A-L Wild type cultured in C- (A), cho2opi3 cultured in C+ (B ), coS#4 (C-D), coS#3 (E-G), and coS#2 (I-K) cultured in C- were analyzed by electron microscopy. In addition, coS#3 (H) and coS#2 (L) are shown after culture in C+ for 3 generations. The arrow heads (F, I, J) point to protrusions in the nuclear envelope. CW, cell wall; ER, endoplasmic reticulum; PM, plasma membrane; M, mitochondria; N, nucleus; V, vacuole; *, lipid droplet. Scale bars correspond to 200 nm (A, B, D, F, G) or 500 nm (C, E, H, I, J, K, L)."}
{"words": ["Figure", "3Serial", "dilutions", "of", "the", "strains", "indicated", "were", "spotted", "on", "SD", "C", "+", "/", "-", "I", "+", "/", "-", "and", "incubated", "at", "30", "oC", "for", "4", "d", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Serial dilutions of the strains indicated were spotted on SD C+/- I+/- and incubated at 30 oC for 4 d."}
{"words": ["Figure", "4Membrane", "lipid", "and", "TAG", "content", ",", "and", "ergosterolester", "content", "(", "EE", ",", "inset", ")", "per", "OD600", "unit", "of", "the", "yeast", "strains", "indicated", "after", "culture", "to", "mid", "-", "log", "phase", "in", "SD", "with", "or", "without", "1", "mM", "choline", "(", "C", ")", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", "of", "the", "indicated", "bar", "compared", "to", "the", "C", "+", "condition", ".", "Data", "information", ":", "All", "data", "were", "obtained", "by", "mass", "spectrometry", "and", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SD", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", "of", "the", "indicated", "bar", "compared", "to", "the", "cho2opi3", "parent", "unless", "indicated", "otherwise", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Membrane lipid and TAG content, and ergosterolester content (EE, inset) per OD600 unit of the yeast strains indicated after culture to mid-log phase in SD with or without 1 mM choline (C); * p < 0.05, ** p < 0.01, unpaired two-tailed t-test of the indicated bar compared to the C+ condition. Data information: All data were obtained by mass spectrometry and are presented as mean ±SD (n=3 biological replicates); * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001, **** p < 0.0001, unpaired two-tailed t-test of the indicated bar compared to the cho2opi3 parent unless indicated otherwise."}
{"words": ["Figure", "5Generation", "of", "suppressors", "of", "choline", "auxotrophy", "of", "cho2opi3", ",", "cho2opi3lro1", ",", "and", "cho2opi3lro1", "pLRO1", "on", "choline", "-", "free", "medium", "as", "indicated", "at", "30", "oC", "for", "7", "d", ".", "Growth", "(", "30", "oC", "for", "6", "d", ")", "and", "phospholipid", "composition", "of", "co", "acc1N", "/", "H", "lro1", "pLRO1", "cultured", "in", "SD", "C", "-", "ura", "-", ",", "containing", "glucose", "/", "galactose", "mixtures", "(", "2", "%", ",", "w", "/", "v", ")", "as", "carbon", "source", "with", "the", "percentage", "of", "galactose", "indicated", ".", "Phospholipid", "composition", "analyzed", "by", "TLC", "is", "presented", "as", "mean", "percentage", "of", "total", "phospholipid", "of", "3", "biological", "replicates", "with", "the", "individual", "values", "indicated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Generation of suppressors of choline auxotrophy of cho2opi3, cho2opi3lro1, and cho2opi3lro1 pLRO1 on choline-free medium as indicated at 30 oC for 7 d.Growth (30 oC for 6 d) and phospholipid composition of co acc1N/H lro1 pLRO1 cultured in SD C- ura-, containing glucose/galactose mixtures (2%, w/v) as carbon source with the percentage of galactose indicated. Phospholipid composition analyzed by TLC is presented as mean percentage of total phospholipid of 3 biological replicates with the individual values indicated."}
{"words": ["Figure", "6ACC1", "transcript", "levels", "after", "switching", "the", "strains", "indicated", "from", "SD", "C", "+", "I", "+", "to", "the", "medium", "indicated", "at", "OD600", "0", ".", "02", "or", "0", ".", "2", "(", "co", "diploid", "in", "C", "-", ")", ",", "and", "culture", "for", "24", "h", "at", "30", "oC", ".", "Data", "were", "normalized", "to", "ACT1", "and", "expressed", "as", "means", "of", "3", "biological", "replicates", "relative", "to", "the", "corresponding", "strain", "cultured", "in", "C", "+", "I", "+", ",", "with", "the", "individual", "values", "indicated", ".", "(", "F", "-", "G", ")", "EM", "analysis", "of", "cho2opi3", "cells", "that", "after", "preculture", "in", "SD", "C", "+", ",", "were", "transferred", "to", "OD600", "0", ".", "05", "and", "subsequently", "cultured", "to", "mid", "-", "log", "phase", "in", "SD", "C", "+", "(", "F", ")", "or", "SD", "C", "-", "(", "G", ")", "both", "containing", "0", ".", "05", "μg", "/", "mL", "SorA", ".", "CW", ",", "cell", "wall", ";", "ER", ",", "endoplasmic", "reticulum", ";", "M", ",", "mitochondria", ";", "N", ",", "nucleus", ";", "V", ",", "vacuole", ";", "*", ",", "lipid", "droplet", ".", "Scale", "bars", "correspond", "to", "500", "nm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6ACC1 transcript levels after switching the strains indicated from SD C+I+ to the medium indicated at OD600 0.02 or 0.2 (co diploid in C-), and culture for 24 h at 30 oC. Data were normalized to ACT1 and expressed as means of 3 biological replicates relative to the corresponding strain cultured in C+I+, with the individual values indicated.(F-G) EM analysis of cho2opi3 cells that after preculture in SD C+, were transferred to OD600 0.05 and subsequently cultured to mid-log phase in SD C+ (F) or SD C- (G) both containing 0.05 μg/mL SorA. CW, cell wall; ER, endoplasmic reticulum; M, mitochondria; N, nucleus; V, vacuole; *, lipid droplet. Scale bars correspond to 500 nm."}
{"words": ["Figure", "7POX1", "transcript", "levels", "after", "switching", "the", "strains", "indicated", "from", "SD", "C", "+", "I", "+", "to", "the", "medium", "indicated", "at", "OD600", "0", ".", "02", "or", "0", ".", "2", "(", "co", "diploid", "in", "C", "-", ")", ",", "and", "culture", "for", "24", "h", "at", "30", "oC", ".", "Data", "were", "normalized", "to", "ACT1", "and", "expressed", "as", "means", "of", "3", "biological", "replicates", "relative", "to", "the", "corresponding", "strain", "cultured", "in", "C", "+", "I", "+", ",", "with", "the", "individual", "values", "indicated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7POX1 transcript levels after switching the strains indicated from SD C+I+ to the medium indicated at OD600 0.02 or 0.2 (co diploid in C-), and culture for 24 h at 30 oC. Data were normalized to ACT1 and expressed as means of 3 biological replicates relative to the corresponding strain cultured in C+I+, with the individual values indicated."}
{"words": ["Figure", "8Growth", "of", "co", "S", "(", "2n", "-", "1", ")", "in", "the", "absence", "of", "choline", "is", "lost", "when", "GPT2", "or", "DGA1", "is", "overexpressed", ",", "and", "restored", "by", "SorA", ".", "Plasmids", "pHEYg", "-", "1", "-", "DGA1", ",", "pHEYg", "-", "1", "-", "GPT2", "and", "the", "empty", "vector", "control", "(", "pEV", ")", "were", "transformed", "into", "the", "strains", "indicated", ".", "After", "preculture", "in", "SD", "C", "+", ",", "ten", "-", "fold", "serial", "dilutions", "were", "spotted", "on", "SD", "C", "+", "/", "-", "with", "or", "without", "0", ".", "1", "μg", "/", "mL", "SorA", "and", "incubated", "at", "30", "oC", "for", "3", "d", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8Growth of co S(2n-1) in the absence of choline is lost when GPT2 or DGA1 is overexpressed, and restored by SorA. Plasmids pHEYg-1-DGA1, pHEYg-1-GPT2 and the empty vector control (pEV) were transformed into the strains indicated. After preculture in SD C+, ten-fold serial dilutions were spotted on SD C+/- with or without 0.1 μg/mL SorA and incubated at 30 oC for 3 d."}
{"words": ["Figure", "9Intensity", "encoded", "GP", "-", "images", "of", "the", "indicated", "C", "-", "Laurdan", "-", "stained", "yeast", "strains", "cultured", "with", "or", "without", "choline", ",", "accompanied", "by", "the", "corresponding", "intensity", "weighted", "GP", "-", "histogram", "fitted", "to", "a", "single", "Gaussian", "function", "(", "light", "blue", "line", ")", ",", "and", "transmission", "image", ".", "White", "arrows", "point", "to", "plasma", "membranes", "exhibiting", "higher", "lipid", "packing", "than", "internal", ",", "organellar", "membranes", ";", "blue", "horizontal", "arrows", "indicate", "highly", "packed", "lipid", "material", "in", "co", "S", "(", "2n", "-", "1", ")", ".", "To", "deplete", "the", "cho2opi3", "parent", "of", "PC", ",", "cells", "were", "transferred", "to", "SD", "C", "-", "at", "OD600", "0", ".", "1", ",", "and", "cultured", "into", "mid", "-", "log", "phase", ".", "White", "scale", "bars", "correspond", "to", "10", "µm", ";", "red", "scale", "bars", "in", "transmission", "images", "correspond", "to", "5", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 9Intensity encoded GP-images of the indicated C-Laurdan-stained yeast strains cultured with or without choline, accompanied by the corresponding intensity weighted GP-histogram fitted to a single Gaussian function (light blue line), and transmission image. White arrows point to plasma membranes exhibiting higher lipid packing than internal, organellar membranes; blue horizontal arrows indicate highly packed lipid material in co S(2n-1). To deplete the cho2opi3 parent of PC, cells were transferred to SD C- at OD600 0.1, and cultured into mid-log phase. White scale bars correspond to 10 µm; red scale bars in transmission images correspond to 5 µm."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Mettl14", "cKO", "leads", "to", "perinatal", "lethality", ".", "Newborn", "cKO", "pups", "are", "smaller", "with", "tight", "and", "shiny", "skin", ".", "(", "B", ")", "Immunohistochemistry", "confirms", "loss", "of", "Mettl14", "expression", "in", "skin", "in", "cKO", "animals", ".", "(", "C", ")", "H", "/", "E", "staining", "of", "newborn", "skin", "sections", "from", "WT", "and", "Mettl14", "cKO", "mice", ".", "(", "D", ")", "Expression", "of", "p63", "in", "skin", "epidermis", "was", "examined", "by", "immunofluorescence", "staining", "in", "WT", "and", "cKO", "mice", ".", "(", "E", ")", "Number", "of", "p63", "-", "positive", "cells", "in", "WT", "and", "cKO", "skin", "was", "quantified", "and", "shown", "as", "box", "and", "whisker", "plots", ".", "The", "plot", "indicates", "the", "mean", "(", "solid", "diamond", "within", "the", "box", ")", ",", "25th", "percentile", "(", "bottom", "line", "of", "the", "box", ")", ",", "median", "(", "middle", "line", "of", "the", "box", ")", ",", "75th", "percentile", "(", "top", "line", "of", "the", "box", ")", ",", "5th", "and", "95th", "percentile", "(", "whiskers", ")", ",", "1st", "and", "99th", "percentile", "(", "solid", "triangles", ")", "and", "minimum", "and", "maximum", "measurements", "(", "solid", "squares", ")", ".", "n", "=", "6", "(", "biological", "repeats", ")", ",", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "F", ")", "Skin", "stratification", "in", "WT", "and", "cKO", "skin", "was", "determined", "by", "immunofluorescence", "staining", "with", "different", "antibodies", "as", "indicated", ".", "Krt14", ":", "Keratin", "14", ";", "Krt10", ":", "Keratin", "10", ";", "β4", ":", "β4", "-", "integrin", ";", "DAPI", "for", "nucleus", "staining", ".", "The", "dashed", "line", "denotes", "the", "basement", "membrane", "that", "separates", "dermis", "and", "epidermis", "(", "Epi", ")", ".", "(", "G", ")", "Wound", "healing", "as", "monitored", "by", "wound", "size", "8", "days", "post", "injury", ".", "n", "=", "3", ";", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Error", "bar", "represents", "S", ".", "D", ".", "(", "standard", "deviation", ")", ".", "H", ")", "Histological", "staining", "of", "skin", "sections", "at", "the", "wound", "edges", ".", "Halves", "of", "wound", "sections", "are", "shown", ".", "Note", "significant", "reduction", "of", "HPE", "(", "hyperproliferative", "epidermis", ")", "in", "cKO", "skin", ".", "Es", ":", "eschar", ".", "Dotted", "lines", "denote", "epidermal", "boundaries", ".", "(", "I", ")", "Quantification", "of", "Ki67", "-", "positive", "cells", "present", "in", "wound", "HPE", ".", "The", "plot", "indicates", "the", "mean", "(", "open", "circles", "within", "the", "box", ")", ",", "25th", "percentile", "(", "bottom", "line", "of", "the", "box", ")", ",", "median", "(", "middle", "line", "of", "the", "box", ")", ",", "75th", "percentile", "(", "top", "line", "of", "the", "box", ")", ",", "5th", "and", "95th", "percentile", "(", "whiskers", ")", ",", "1st", "and", "99th", "percentile", "(", "solid", "triangles", ")", "and", "minimum", "and", "maximum", "measurements", "(", "solid", "squares", ")", ".", "n", "=", "19", ",", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Mettl14 cKO leads to perinatal lethality. Newborn cKO pups are smaller with tight and shiny skin.(B) Immunohistochemistry confirms loss of Mettl14 expression in skin in cKO animals.(C) H/E staining of newborn skin sections from WT and Mettl14 cKO mice.(D) Expression of p63 in skin epidermis was examined by immunofluorescence staining in WT and cKO mice. (E) Number of p63-positive cells in WT and cKO skin was quantified and shown as box and whisker plots. The plot indicates the mean (solid diamond within the box), 25th percentile (bottom line of the box), median (middle line of the box), 75th percentile (top line of the box), 5th and 95th percentile (whiskers), 1st and 99th percentile (solid triangles) and minimum and maximum measurements (solid squares). n=6 (biological repeats), P<0.05 (Student's t-test). (F) Skin stratification in WT and cKO skin was determined by immunofluorescence staining with different antibodies as indicated. Krt14: Keratin 14; Krt10: Keratin 10; β4: β4-integrin; DAPI for nucleus staining. The dashed line denotes the basement membrane that separates dermis and epidermis (Epi).(G) Wound healing as monitored by wound size 8 days post injury. n=3; P<0.01 (Student's t-test). Error bar represents S.D. (standard deviation).H) Histological staining of skin sections at the wound edges. Halves of wound sections are shown. Note significant reduction of HPE (hyperproliferative epidermis) in cKO skin. Es: eschar. Dotted lines denote epidermal boundaries. (I) Quantification of Ki67-positive cells present in wound HPE. The plot indicates the mean (open circles within the box), 25th percentile (bottom line of the box), median (middle line of the box), 75th percentile (top line of the box), 5th and 95th percentile (whiskers), 1st and 99th percentile (solid triangles) and minimum and maximum measurements (solid squares). n=19, P<0.01 (Student's t-test). "}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "EdU", "staining", "of", "WT", "or", "Mettl14", "cKO", "skin", "after", "pulse", "-", "chase", "labeling", ".", "Skin", "samples", "were", "counterstained", "with", "antibody", "against", "β4", "-", "integrin", ".", "Note", "reduced", "EdU", "label", "-", "retaining", "cells", "in", "cKO", "skin", "epidermis", ".", "Arrows", "indicate", "Edu", "-", "positive", "cells", ".", "(", "B", ")", "Label", "-", "retaining", "cells", "in", "WT", "or", "Mettl14", "cKO", "skin", "were", "quantified", "and", "shown", "as", "box", "plots", ".", "The", "plot", "indicates", "the", "mean", "(", "solid", "diamond", "within", "the", "box", ")", ",", "25th", "percentile", "(", "bottom", "line", "of", "the", "box", ")", ",", "median", "(", "middle", "line", "of", "the", "box", ")", ",", "75th", "percentile", "(", "top", "line", "of", "the", "box", ")", ",", "5th", "and", "95th", "percentile", "(", "whiskers", ")", ",", "1st", "and", "99th", "percentile", "(", "solid", "triangles", ")", "and", "minimum", "and", "maximum", "measurements", "(", "solid", "squares", ")", ".", "n", "=", "6", "(", "biological", "repeats", ")", ",", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "n", "=", "19", ",", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "C", ")", "Number", "of", "holoclones", "derived", "from", "WT", "and", "Mettl14", "cKO", "skin", "was", "quantified", "and", "shown", "as", "box", "and", "whisker", "plots", ".", "The", "plot", "indicates", "the", "mean", "(", "solid", "diamond", "within", "the", "box", ")", ",", "25th", "percentile", "(", "bottom", "line", "of", "the", "box", ")", ",", "median", "(", "middle", "line", "of", "the", "box", ")", ",", "75th", "percentile", "(", "top", "line", "of", "the", "box", ")", ",", "5th", "and", "95th", "percentile", "(", "whiskers", ")", ",", "1st", "and", "99th", "percentile", "(", "solid", "triangles", ")", "and", "minimum", "and", "maximum", "measurements", "(", "solid", "squares", ")", ".", "n", "=", "6", "(", "biological", "repeats", ")", ",", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "n", "=", "24", ",", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "D", ")", "Morphology", "of", "primary", "keratinocytes", "isolated", "from", "WT", "or", "Mettl14", "cKO", "skin", ".", "(", "E", ")", "Expression", "of", "Mettl14", "and", "p63", "in", "WT", "and", "KO", "cells", "was", "determined", "by", "immunoblots", "with", "respective", "antibodies", ".", "Immunoblot", "for", "GAPDH", "was", "used", "as", "loading", "control", ".", "(", "F", ")", "Proliferation", "of", "WT", "and", "Mettl14", "null", "cells", "in", "vitro", "was", "quantified", "and", "shown", "as", "dot", "plots", ".", "n", "=", "3", ",", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "for", "Day", "6", ",", "9", ",", "and", "12", ",", "and", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "for", "Day", "3", ".", "Error", "bar", "represents", "S", ".", "D", ".", "(", "G", "-", "H", ")", "CFE", "(", "colony", "formation", "efficiency", ")", "of", "WT", "and", "Mettl14", "null", "cells", "was", "determined", "in", "vitro", ".", "Results", "were", "quantified", "and", "shown", "as", "bar", "graph", "(", "F", ")", ".", "n", "=", "19", ",", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Error", "bar", "represents", "S", ".", "D", ".", "(", "I", ")", "Fluorescence", "microscopy", "demonstrates", "different", "survival", "capability", "of", "WT", "and", "Mettl14", "inducible", "KO", "cells", "with", "or", "without", "Tamoxifen", "(", "TAM", ")", "treatment", ".", "(", "J", ")", "Ratio", "of", "WT", "and", "Mettl14", "inducible", "KO", "cells", "in", "the", "co", "-", "culture", "model", "was", "quantified", "and", "shown", "as", "dot", "plots", ".", "n", "=", "8", ",", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "for", "KO", "cells", "with", "TAM", "treatment", "compared", "with", "WT", "cells", "or", "KO", "cells", "without", "TAM", "stimulation", "at", "both", "Day", "7", "and", "14", ".", "Error", "bar", "represents", "S", ".", "D", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) EdU staining of WT or Mettl14 cKO skin after pulse-chase labeling. Skin samples were counterstained with antibody against β4-integrin. Note reduced EdU label-retaining cells in cKO skin epidermis. Arrows indicate Edu-positive cells. (B) Label-retaining cells in WT or Mettl14 cKO skin were quantified and shown as box plots. The plot indicates the mean (solid diamond within the box), 25th percentile (bottom line of the box), median (middle line of the box), 75th percentile (top line of the box), 5th and 95th percentile (whiskers), 1st and 99th percentile (solid triangles) and minimum and maximum measurements (solid squares). n=6 (biological repeats), P<0.05 (Student's t-test). n=19, P<0.01 (Student's t-test). (C) Number of holoclones derived from WT and Mettl14 cKO skin was quantified and shown as box and whisker plots. The plot indicates the mean (solid diamond within the box), 25th percentile (bottom line of the box), median (middle line of the box), 75th percentile (top line of the box), 5th and 95th percentile (whiskers), 1st and 99th percentile (solid triangles) and minimum and maximum measurements (solid squares). n=6 (biological repeats), P<0.05 (Student's t-test). n=24, P<0.01 (Student's t-test).(D) Morphology of primary keratinocytes isolated from WT or Mettl14 cKO skin.(E) Expression of Mettl14 and p63 in WT and KO cells was determined by immunoblots with respective antibodies. Immunoblot for GAPDH was used as loading control.(F) Proliferation of WT and Mettl14 null cells in vitro was quantified and shown as dot plots. n=3, P<0.01 (Student's t-test) for Day 6, 9, and 12, and P<0.05 (Student's t-test) for Day 3. Error bar represents S.D.(G-H) CFE (colony formation efficiency) of WT and Mettl14 null cells was determined in vitro. Results were quantified and shown as bar graph (F). n=19, P<0.01 (Student's t-test). Error bar represents S.D.(I) Fluorescence microscopy demonstrates different survival capability of WT and Mettl14 inducible KO cells with or without Tamoxifen (TAM) treatment. (J) Ratio of WT and Mettl14 inducible KO cells in the co-culture model was quantified and shown as dot plots. n=8, P<0.01 (Student's t-test) for KO cells with TAM treatment compared with WT cells or KO cells without TAM stimulation at both Day 7 and 14. Error bar represents S.D. "}
{"words": ["Figure", "3B", ")", "Mutations", "in", "the", "predicted", "m6A", "modification", "sites", "can", "significantly", "reduce", "Pvt1", "methylation", ".", "n", "=", "3", ".", "Error", "bar", "represents", "S", ".", "D", ".", "C", ")", "Deletion", "of", "endogenous", "Pvt1", "by", "an", "inducible", "Cas9", "(", "iCas9", ")", "system", "can", "significantly", "reduce", "Pvt1", "RNA", "level", "(", "quantification", "from", "RT", "-", "PCR", ",", "left", "panel", ")", "and", "MYC", "protein", "level", "(", "quantification", "from", "immunoblot", ",", "right", "panel", ")", "expression", ".", "n", "=", "3", ",", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Error", "bar", "represents", "S", ".", "D", ".", "D", ")", "CFE", "of", "WT", ",", "Pvt1", "inducible", "KO", ",", "and", "Pvt1", "inducible", "KO", "cells", "rescued", "with", "WT", "or", "mutant", "Pvt1", "was", "quantified", "and", "presented", "as", "bar", "graph", ".", "n", "=", "3", ",", "*", "*", ":", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Error", "bar", "represents", "S", ".", "D", ".", "E", ")", "Skin", "organoids", "derived", "from", "WT", "or", "Pvt1", "inducible", "KO", "cells", "were", "grafted", "to", "nude", "mice", ".", "The", "regenerated", "skin", "was", "analyzed", "by", "H", "/", "E", "staining", ".", "F", ")", "Epidermal", "thickness", "of", "WT", "and", "Pvt1", "KO", "skin", "grafts", "was", "quantified", "and", "presented", "as", "box", "and", "whisker", "plots", ".", "The", "plot", "indicates", "the", "mean", "(", "solid", "diamond", "within", "the", "box", ")", ",", "25th", "percentile", "(", "bottom", "line", "of", "the", "box", ")", ",", "median", "(", "middle", "line", "of", "the", "box", ")", ",", "75th", "percentile", "(", "top", "line", "of", "the", "box", ")", ",", "5th", "and", "95th", "percentile", "(", "whiskers", ")", ",", "1st", "and", "99th", "percentile", "(", "solid", "triangles", ")", "and", "minimum", "and", "maximum", "measurements", "(", "solid", "squares", ")", ".", "n", "=", "6", "(", "biological", "repeats", ")", ",", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "n", "=", "18", ",", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "G", ")", "Number", "of", "p63", "-", "positive", "cells", "in", "WT", "and", "cKO", "skin", "was", "quantified", "and", "shown", "as", "bar", "graph", ".", "n", "=", "5", ",", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Error", "bar", "represents", "S", ".", "D", ".", "H", ")", "Fluorescence", "microscopy", "demonstrates", "different", "survival", "capability", "of", "WT", "and", "Pvt1", "inducible", "KO", "cells", "with", "or", "without", "Doxycycline", "(", "Dox", ")", "treatment", ".", "I", ")", "Ratio", "of", "WT", "and", "Pvt1", "inducible", "KO", "cells", "in", "the", "co", "-", "culture", "model", "was", "quantified", "and", "shown", "as", "dot", "plots", ".", "n", "=", "8", ",", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "for", "KO", "cells", "with", "Dox", "treatment", "compared", "with", "WT", "cells", "or", "KO", "cells", "without", "Dox", "stimulation", "at", "both", "Day", "7", "and", "14", ".", "Error", "bar", "represents", "S", ".", "D", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3B) Mutations in the predicted m6A modification sites can significantly reduce Pvt1 methylation.n=3. Error bar represents S.D.C) Deletion of endogenous Pvt1 by an inducible Cas9 (iCas9) system can significantly reduce Pvt1 RNA level (quantification from RT-PCR, left panel) and MYC protein level (quantification from immunoblot, right panel) expression. n=3, P<0.01 (Student's t-test). Error bar represents S.D.D) CFE of WT, Pvt1 inducible KO, and Pvt1 inducible KO cells rescued with WT or mutant Pvt1 was quantified and presented as bar graph. n=3, **: P<0.01 (Student's t-test). Error bar represents S.D.E) Skin organoids derived from WT or Pvt1 inducible KO cells were grafted to nude mice. The regenerated skin was analyzed by H/E staining.F) Epidermal thickness of WT and Pvt1 KO skin grafts was quantified and presented as box and whisker plots. The plot indicates the mean (solid diamond within the box), 25th percentile (bottom line of the box), median (middle line of the box), 75th percentile (top line of the box), 5th and 95th percentile (whiskers), 1st and 99th percentile (solid triangles) and minimum and maximum measurements (solid squares). n=6 (biological repeats), P<0.05 (Student's t-test). n=18, P<0.01 (Student's t-test).G) Number of p63-positive cells in WT and cKO skin was quantified and shown as bar graph. n=5, P<0.01 (Student's t-test). Error bar represents S.D.H) Fluorescence microscopy demonstrates different survival capability of WT and Pvt1 inducible KO cells with or without Doxycycline (Dox) treatment.I) Ratio of WT and Pvt1 inducible KO cells in the co-culture model was quantified and shown as dot plots. n=8, P<0.01 (Student's t-test) for KO cells with Dox treatment compared with WT cells or KO cells without Dox stimulation at both Day 7 and 14. Error bar represents S.D."}
{"words": ["Figure", "4A", ")", "Interaction", "between", "Pvt1", "and", "MYC", "was", "determined", "by", "immunoprecipitation", "followed", "with", "RT", "-", "PCR", ".", "Note", "significant", "decrease", "in", "Pvt1", "and", "MYC", "interaction", "upon", "FTO", "treatment", "(", "left", "panel", ")", ",", "calcium", "shift", "-", "induced", "differentiation", "(", "middle", "panel", ",", "Hi", ":", "high", "calcium", ")", ",", "and", "Pvt1", "methylation", "site", "mutations", "(", "right", "panel", ")", ".", "n", "=", "3", ",", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Error", "bar", "represents", "S", ".", "D", ".", "B", ")", "Immunoblots", "show", "decreased", "MYC", "protein", "level", "in", "differentiated", "keratinocytes", "and", "Mettl14", "KO", "cells", ".", "Undifferentiated", "WT", "and", "Mettl14", "KO", "cells", "(", "C", ")", "were", "treated", "with", "cycloheximide", ".", "Cell", "lysates", "were", "collected", "at", "0", ",", "30", ",", "60", ",", "90", ",", "120", ",", "180", ",", "and", "300", "minutes", "post", "treatment", "and", "subjected", "to", "immunoblotting", "with", "different", "antibodies", "as", "indicated", ".", "undifferentiated", "WT", "and", "Pvt1", "KO", "cells", "(", "D", ")", "were", "treated", "with", "cycloheximide", ".", "Cell", "lysates", "were", "collected", "at", "0", ",", "30", ",", "60", ",", "90", ",", "120", ",", "180", ",", "and", "300", "minutes", "post", "treatment", "and", "subjected", "to", "immunoblotting", "with", "different", "antibodies", "as", "indicated", ".", "WT", "cells", "before", "and", "after", "calcium", "shift", "-", "induced", "differentiation", "(", "E", ")", "were", "treated", "with", "cycloheximide", ".", "Cell", "lysates", "were", "collected", "at", "0", ",", "30", ",", "60", ",", "90", ",", "120", ",", "180", ",", "and", "300", "minutes", "post", "treatment", "and", "subjected", "to", "immunoblotting", "with", "different", "antibodies", "as", "indicated", ".", "(", "F", ")", "Skin", "organoids", "derived", "from", "Mettl14", "KO", "cells", "or", "KO", "cells", "rescued", "with", "exogenous", "expression", "of", "MYC", "were", "grafted", "to", "nude", "mice", ".", "The", "regenerated", "skin", "was", "analyzed", "by", "H", "/", "E", "staining", ".", "(", "G", ")", "Epidermal", "thickness", "of", "KO", "and", "KO", "skin", "rescued", "with", "MYC", "expression", "was", "quantified", "and", "presented", "as", "box", "and", "whisker", "plots", ".", "The", "plot", "indicates", "the", "mean", "(", "solid", "diamond", "within", "the", "box", ")", ",", "25th", "percentile", "(", "bottom", "line", "of", "the", "box", ")", ",", "median", "(", "middle", "line", "of", "the", "box", ")", ",", "75th", "percentile", "(", "top", "line", "of", "the", "box", ")", ",", "5th", "and", "95th", "percentile", "(", "whiskers", ")", ",", "1st", "and", "99th", "percentile", "(", "solid", "triangles", ")", "and", "minimum", "and", "maximum", "measurements", "(", "solid", "squares", ")", ".", "n", "=", "6", "(", "biological", "repeats", ")", ",", "P", "<", "0", ".", "05", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "n", "=", "18", ",", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "(", "H", ")", "Number", "of", "p63", "-", "positive", "cells", "in", "KO", "and", "KO", "skin", "rescued", "with", "MYC", "expression", "was", "quantified", "and", "shown", "as", "bar", "graph", ".", "n", "=", "5", ",", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", ".", "Error", "bar", "represents", "S", ".", "D", ".", "(", "I", ")", "Fluorescence", "microscopy", "demonstrates", "different", "survival", "capability", "of", "WT", "and", "Mettl14", "KO", "cells", "with", "inducible", "expression", "of", "MYC", ".", "(", "J", ")", "Ratio", "of", "WT", "and", "Mettl14", "KO", "cells", "with", "inducible", "expression", "of", "MYC", "in", "the", "co", "-", "culture", "model", "was", "quantified", "and", "shown", "as", "dot", "plots", ".", "n", "=", "8", ",", "P", "<", "0", ".", "01", "(", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ")", "for", "KO", "cells", "without", "Dox", "treatment", "(", "no", "MYC", "expression", ")", "compared", "with", "WT", "cells", "or", "KO", "cells", "with", "Dox", "stimulation", "(", "exogenous", "MYC", "expression", ")", "at", "both", "Day", "7", "and", "14", ".", "Error", "bar", "represents", "S", ".", "D", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A) Interaction between Pvt1 and MYC was determined by immunoprecipitation followed with RT-PCR. Note significant decrease in Pvt1 and MYC interaction upon FTO treatment (left panel), calcium shift-induced differentiation (middle panel, Hi: high calcium), and Pvt1 methylation site mutations (right panel). n=3, P<0.01 (Student's t-test). Error bar represents S.D.B) Immunoblots show decreased MYC protein level in differentiated keratinocytes and Mettl14 KO cells.Undifferentiated WT and Mettl14 KO cells (C) were treated with cycloheximide. Cell lysates were collected at 0, 30, 60, 90, 120, 180, and 300 minutes post treatment and subjected to immunoblotting with different antibodies as indicated.undifferentiated WT and Pvt1 KO cells (D) were treated with cycloheximide. Cell lysates were collected at 0, 30, 60, 90, 120, 180, and 300 minutes post treatment and subjected to immunoblotting with different antibodies as indicated.WT cells before and after calcium shift-induced differentiation (E) were treated with cycloheximide. Cell lysates were collected at 0, 30, 60, 90, 120, 180, and 300 minutes post treatment and subjected to immunoblotting with different antibodies as indicated.(F) Skin organoids derived from Mettl14 KO cells or KO cells rescued with exogenous expression of MYC were grafted to nude mice. The regenerated skin was analyzed by H/E staining.(G) Epidermal thickness of KO and KO skin rescued with MYC expression was quantified and presented as box and whisker plots. The plot indicates the mean (solid diamond within the box), 25th percentile (bottom line of the box), median (middle line of the box), 75th percentile (top line of the box), 5th and 95th percentile (whiskers), 1st and 99th percentile (solid triangles) and minimum and maximum measurements (solid squares). n=6 (biological repeats), P<0.05 (Student's t-test). n=18, P<0.01 (Student's t-test).(H) Number of p63-positive cells in KO and KO skin rescued with MYC expression was quantified and shown as bar graph. n=5, P<0.01 (Student's t-test). Error bar represents S.D.(I) Fluorescence microscopy demonstrates different survival capability of WT and Mettl14 KO cells with inducible expression of MYC.(J) Ratio of WT and Mettl14 KO cells with inducible expression of MYC in the co-culture model was quantified and shown as dot plots. n=8, P<0.01 (Student's t-test) for KO cells without Dox treatment (no MYC expression) compared with WT cells or KO cells with Dox stimulation (exogenous MYC expression) at both Day 7 and 14. Error bar represents S.D."}
{"words": ["f1a", ",", "b", ",", "Analysis", "of", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "YFP", "fused", "to", "the", "indicated", "galectins", "and", "infected", "with", "S", ".", "Typhimurium", "for", "1", " ", "h", ".", "a", ",", "Percentage", "of", "bacteria", "coated", "by", "the", "indicated", "galectins", ".", "YFP", "-", "positive", "bacteria", "were", "counted", "by", "microscopy", ".", "Mean", "and", "standard", "deviation", "(", "s", ".", "d", ".", ")", "of", "triplicate", "HeLa", "cultures", ",", "n", " ", ">", " ", "100", "bacteria", "per", "coverslip", ".", "b", ",", "Confocal", "microscopy", ".", "Arrowheads", ",", "bacteria", "shown", "in", "insets", ".", "DAPI", ",", "4", "′", ",", "6", "-", "diamidino", "-", "2", "-", "phenylindole", ".", "c", ",", "Kinetics", "of", "fold", "replication", "for", "S", ".", "Typhimurium", "in", "HeLa", "cells", "transfected", "with", "the", "indicated", "siRNAs", ".", "Bacteria", "were", "counted", "on", "the", "basis", "of", "their", "ability", "to", "form", "colonies", "on", "agar", "plates", ".", "Mean", "and", "s", ".", "d", ".", "of", "triplicate", "HeLa", "cultures", "and", "duplicate", "colony", "counts", ".", "siRNAs", "are", "further", "characterized", "in", "Supplementary", "Fig", ".", "2a", "-", "c", ".", "*", "*", "P", " ", " ", "0", ".", "01", ",", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Scale", "bar", ",", "10", " ", "µm", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f1a, b, Analysis of HeLa cells stably expressing YFP fused to the indicated galectins and infected with S. Typhimurium for 1 h. a, Percentage of bacteria coated by the indicated galectins. YFP-positive bacteria were counted by microscopy. Mean and standard deviation (s.d.) of triplicate HeLa cultures, n > 100 bacteria per coverslip. b, Confocal microscopy. Arrowheads, bacteria shown in insets. DAPI, 4′,6-diamidino-2-phenylindole.c, Kinetics of fold replication for S. Typhimurium in HeLa cells transfected with the indicated siRNAs. Bacteria were counted on the basis of their ability to form colonies on agar plates. Mean and s.d. of triplicate HeLa cultures and duplicate colony counts. siRNAs are further characterized in Supplementary Fig. 2a-c. **P  0.01, Student's t-test. Scale bar, 10 µm."}
{"words": ["f2a", ",", "LUMIER", "binding", "assay", ":", "normalized", "ratio", "between", "luciferase", "activity", "bound", "to", "beads", "and", "present", "in", "lysates", ".", "Lysates", "of", "293ET", "cells", "expressing", "NDP52", ",", "p62", "or", "optineurin", "each", "fused", "to", "luciferase", ",", "and", "the", "indicated", "Flag", "-", "tagged", "galectins", "were", "incubated", "with", "anti", "-", "Flag", "beads", ".", "Flag", "-", "tagged", "proteins", "are", "further", "characterized", "in", "Supplementary", "Fig", ".", "4ab", ",", "Lysates", "of", "293ET", "cells", ",", "expressing", "Flag", "-", "tagged", "proteins", "as", "indicated", ",", "were", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "Flag", "beads", ".", "Lysates", "and", "immunoprecipitates", "(", "IP", ")", "were", "blotted", "for", "the", "presence", "of", "Flag", "-", "tagged", "proteins", "and", "endogenous", "NDP52", ".", "c", ",", "Confocal", "images", "of", "HeLa", "cells", "infected", "with", "S", ".", "Typhimurium", "for", "1", "h", "and", "stained", "with", "antisera", "against", "NDP52", "and", "galectin", "8", ".", "Arrowheads", ",", "bacteria", "shown", "in", "insets", ".", "d", ",", "Co", "-", "localization", "of", "NDP52", "with", "galectin", "-", "positive", "bacteria", "in", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "YFP", "fused", "to", "the", "indicated", "galectins", ",", "infected", "with", "S", ".", "Typhimurium", "and", "stained", "with", "NDP52", "antiserum", "1", " ", "h", "after", "infection", ".", "Mean", "and", "s", ".", "d", ".", "of", "duplicate", "HeLa", "cultures", ",", "n", " ", ">", " ", "100", "bacteria", "per", "coverslip", ",", "representative", "of", "two", "independent", "experiments", ".", "Scale", "bar", ",", "10", " ", "µm", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f2a, LUMIER binding assay: normalized ratio between luciferase activity bound to beads and present in lysates. Lysates of 293ET cells expressing NDP52, p62 or optineurin each fused to luciferase, and the indicated Flag-tagged galectins were incubated with anti-Flag beads. Flag-tagged proteins are further characterized in Supplementary Fig. 4ab, Lysates of 293ET cells, expressing Flag-tagged proteins as indicated, were immunoprecipitated with anti-Flag beads. Lysates and immunoprecipitates (IP) were blotted for the presence of Flag-tagged proteins and endogenous NDP52.c, Confocal images of HeLa cells infected with S. Typhimurium for 1 h and stained with antisera against NDP52 and galectin 8. Arrowheads, bacteria shown in insets.d, Co-localization of NDP52 with galectin-positive bacteria in HeLa cells stably expressing YFP fused to the indicated galectins, infected with S. Typhimurium and stained with NDP52 antiserum 1 h after infection. Mean and s.d. of duplicate HeLa cultures, n > 100 bacteria per coverslip, representative of two independent experiments. Scale bar, 10 µm."}
{"words": ["f3a", ",", "Percentage", "of", "S", ".", "Typhimurium", "coated", "by", "the", "indicated", "galectins", ".", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "YFP", "-", "tagged", "galectins", "were", "treated", "with", "the", "indicated", "siRNAs", ".", "YFP", "-", "positive", "bacteria", "were", "counted", "by", "microscopy", "at", "1", " ", "h", "p", ".", "i", ".", "siRNAs", "are", "further", "characterized", "in", "Supplementary", "Fig", ".", "2", ".", "b", ",", "Analysis", "of", "HeLa", "cells", "treated", "with", "the", "indicated", "siRNAs", "and", "stained", "with", "NDP52", "antiserum", ".", "NDP52", "-", "positive", "bacteria", "were", "counted", "by", "microscopy", "1", " ", "h", "after", "infection", "with", "S", ".", "Typhimurium", ".", "siRNAs", "are", "further", "characterized", "in", "Supplementary", "Fig", ".", "2", ".", "c", ",", "Percentage", "of", "bacteria", "coated", "by", "the", "indicated", "galectin", "8", "alleles", ".", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "the", "indicated", "galectin", "8", "alleles", "fused", "to", "YFP", "were", "infected", "with", "S", ".", "Typhimurium", ".", "YFP", "-", "positive", "S", ".", "Typhimurium", "were", "counted", "by", "microscopy", "at", "75", " ", "min", "p", ".", "i", ".", "WT", ",", "wild", "type", ".", "d", ",", "Binding", "of", "galectin", "8", "to", "bacteria", "and", "HeLa", "cells", ".", "The", "indicated", "bacteria", "and", "HeLa", "cells", "were", "incubated", "with", "His", "-", "GST", "-", "ubiquitin", "(", "Ub", ")", ",", "His", "-", "GST", "-", "galectin", "8", "or", "buffer", "as", "indicated", ",", "followed", "by", "murine", "anti", "-", "His", "antibody", "and", "PE", "-", "labelled", "anti", "-", "mouse", "serum", ".", "e", ",", "Percentage", "of", "S", ".", "Typhimurium", "coated", "by", "the", "indicated", "galectins", ".", "Wild", "-", "type", "CHO", "cells", "and", "mutant", "Lec3", ".", "2", ".", "8", ".", "1", "cells", "stably", "expressing", "YFP", "-", "tagged", "galectins", "were", "infected", "with", "S", ".", "Typhimurium", ".", "YFP", "-", "positive", "bacteria", "were", "counted", "by", "microscopy", "at", "1", "h", "p", ".", "i", ".", "f", ",", "Confocal", "images", "of", "HeLa", "cells", "expressing", "the", "indicated", "YFP", "-", "tagged", "galectins", ".", "Cells", "were", "left", "untreated", "or", "were", "exposed", "to", "hypertonic", "conditions", ",", "with", "or", "without", "(", "w", "/", "o", ")", "PEG", "as", "indicated", ",", "followed", "by", "hypotonic", "shock", ".", "g", ",", "Fold", "replication", "of", "S", ".", "Typhimurium", "in", "HeLa", "cells", "expressing", "the", "indicated", "galectin", "3", "variants", "and", "transfected", "with", "the", "indicated", "siRNAs", ".", "At", "2", "h", "and", "6", "h", "after", "infection", ",", "cells", "were", "lysed", "and", "bacteria", "counted", "on", "the", "basis", "of", "their", "ability", "to", "form", "colonies", "on", "agar", "plates", ".", "Galectin", "3", "proteins", "are", "further", "characterized", "in", "Supplementary", "Fig", ".", "4b", ".", "Mean", "and", "s", ".", "d", ".", "of", "duplicate", "coverslips", ">", "100", "bacteria", "counted", "per", "coverslip", ".", "Data", "are", "representative", "of", "at", "least", "two", "repeats", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "µm", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f3a, Percentage of S. Typhimurium coated by the indicated galectins. HeLa cells stably expressing YFP-tagged galectins were treated with the indicated siRNAs. YFP-positive bacteria were counted by microscopy at 1 h p.i. siRNAs are further characterized in Supplementary Fig. 2.b, Analysis of HeLa cells treated with the indicated siRNAs and stained with NDP52 antiserum. NDP52-positive bacteria were counted by microscopy 1 h after infection with S. Typhimurium. siRNAs are further characterized in Supplementary Fig. 2.c, Percentage of bacteria coated by the indicated galectin 8 alleles. HeLa cells stably expressing the indicated galectin 8 alleles fused to YFP were infected with S. Typhimurium. YFP-positive S. Typhimurium were counted by microscopy at 75 min p.i. WT, wild type.d, Binding of galectin 8 to bacteria and HeLa cells. The indicated bacteria and HeLa cells were incubated with His-GST-ubiquitin (Ub), His-GST-galectin 8 or buffer as indicated, followed by murine anti-His antibody and PE-labelled anti-mouse serum.e, Percentage of S. Typhimurium coated by the indicated galectins. Wild-type CHO cells and mutant Lec3.2.8.1 cells stably expressing YFP-tagged galectins were infected with S. Typhimurium. YFP-positive bacteria were counted by microscopy at 1 h p.i.f, Confocal images of HeLa cells expressing the indicated YFP-tagged galectins. Cells were left untreated or were exposed to hypertonic conditions, with or without (w/o) PEG as indicated, followed by hypotonic shock.g, Fold replication of S. Typhimurium in HeLa cells expressing the indicated galectin 3 variants and transfected with the indicated siRNAs. At 2 h and 6 h after infection, cells were lysed and bacteria counted on the basis of their ability to form colonies on agar plates. Galectin 3 proteins are further characterized in Supplementary Fig. 4b. Mean and s.d. of duplicate coverslips>100 bacteria counted per coverslip. Data are representative of at least two repeats. *P< 0.05, Student's t-test. Scale bar, 10 µm."}
{"words": ["f4a", ",", "Confocal", "micrograph", "of", "HeLa", "cells", "expressing", "GFP", "-", "LC3", "and", "mCherry", "-", "galectin", "-", "8", ",", "stained", "for", "NDP52", "1", " ", "h", "after", "infection", "with", "S", ".", "Typhimurium", ".", "The", "lower", "right", "panel", "contains", "a", "fluorescence", "line", "scan", "along", "the", "yellow", "line", "in", "the", "merge", "inset", ".", "Arrowheads", ",", "bacteria", "shown", "in", "insets", ".", "b", ",", "Percentage", "of", "GFP", "-", "LC3", "-", "positive", "S", ".", "Typhimurium", "at", "1", " ", "h", "p", ".", "i", ".", "in", "HeLa", "cells", "treated", "with", "the", "indicated", "siRNAs", ".", "c", ",", "Percentage", "of", "bacteria", "positive", "for", "NDP52", ".", "HeLa", "cells", "expressing", "the", "indicated", "NDP52", "variants", "fused", "to", "YFP", "were", "infected", "with", "S", ".", "Typhimurium", ".", "d", ",", "Percentage", "of", "bacteria", "positive", "for", "the", "indicated", "markers", ".", "HeLa", "cells", ",", "either", "wild", "type", "or", "expressing", "YFP", "-", "galectin", "-", "8", "as", "indicated", ",", "were", "infected", "with", "S", ".", "Typhimurium", ".", "Ubiquitin", "was", "detected", "by", "antibody", "staining", ".", "e", ",", "HeLa", "cells", "treated", "with", "the", "indicated", "siRNAs", "were", "infected", "with", "S", ".", "Typhimurium", "and", "stained", "for", "NDP52", "at", "the", "indicated", "time", "points", ".", "Fluorescent", "bacteria", "were", "counted", "by", "microscopy", "at", "the", "indicated", "time", "points", ".", "Graphs", ",", "representing", "at", "least", "two", "independent", "repeats", ",", "show", "mean", "and", "s", ".", "d", ".", "of", "duplicate", "coverslips", "for", "which", ">", "200", "bacteria", "were", "counted", ".", "*", "P", " ", " ", "0", ".", "05", ",", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Scale", "bar", ",", "10", " ", "µm", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f4a, Confocal micrograph of HeLa cells expressing GFP-LC3 and mCherry-galectin-8, stained for NDP52 1 h after infection with S. Typhimurium. The lower right panel contains a fluorescence line scan along the yellow line in the merge inset. Arrowheads, bacteria shown in insets.b, Percentage of GFP-LC3-positive S. Typhimurium at 1 h p.i. in HeLa cells treated with the indicated siRNAs.c, Percentage of bacteria positive for NDP52. HeLa cells expressing the indicated NDP52 variants fused to YFP were infected with S. Typhimurium.d, Percentage of bacteria positive for the indicated markers. HeLa cells, either wild type or expressing YFP-galectin-8 as indicated, were infected with S. Typhimurium. Ubiquitin was detected by antibody staining.e, HeLa cells treated with the indicated siRNAs were infected with S. Typhimurium and stained for NDP52 at the indicated time points. Fluorescent bacteria were counted by microscopy at the indicated time points. Graphs, representing at least two independent repeats, show mean and s.d. of duplicate coverslips for which >200 bacteria were counted. *P  0.05, Student's t-test. Scale bar, 10 µm."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Representative", "transmission", "electron", "microscope", "(", "TEM", ")", "image", "showing", "the", "presence", "of", "EVs", "in", "the", "CSF", "in", "two", "independent", "experiments", ".", "(", "B", ")", "NanoSightquantification", "of", "the", "amount", "of", "particles", "in", "the", "CSF", "0", ",", "1", ",", "2", ",", "4", "and", "6", "hours", "after", "i", ".", "p", ".", "LPS", "injection", "(", "n", "=", "3", "-", "5", ")", ".", "(", "C", ")", "Size", "distribution", "of", "the", "EVsin", "vivo", "in", "the", "CSF", "before", "(", "black", ";", "n", "=", "5", ")", "and", "6", "h", "after", "(", "grey", ";", "n", "=", "3", ")", "LPS", "treatment", "determined", "by", "NanoSight", "analysis", ".", "(", "D", "-", "G", ")", "Quantitative", "real", "-", "time", "polymerase", "chain", "reaction", "analysis", "of", "miR", "-", "1a", "(", "D", ")", ",", "miR", "-", "9", "(", "E", ")", ",", "miR", "-", "146a", "(", "F", ")", ",", "and", "miR", "-", "155", "(", "G", ")", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "RNA", "was", "isolated", "from", "pooled", "CSF", "(", "50", "µl", ")", "from", "different", "mice", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "are", "displayed", "as", "mean", "±", "SEM", "and", "analyzed", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Significance", "levels", "are", "indicated", "on", "the", "graphs", ":", "*", ",", "0", ".", "01", "≤", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "0", ".", "001", "≤", "P", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Representative transmission electron microscope (TEM) image showing the presence of EVs in the CSF in two independent experiments.(B) NanoSightquantification of the amount of particles in the CSF 0, 1, 2, 4 and 6 hours after i.p. LPS injection (n=3-5).(C) Size distribution of the EVsin vivo in the CSF before (black; n=5) and 6 h after (grey; n=3) LPS treatment determined by NanoSight analysis.(D-G) Quantitative real-time polymerase chain reaction analysis of miR-1a (D), miR-9 (E), miR-146a (F), and miR-155 (G) (n=4). RNA was isolated from pooled CSF (50 µl) from different mice (n=3). Data are displayed as mean ± SEM and analyzed by Student's t-test. Significance levels are indicated on the graphs: *, 0.01 ≤ P < 0.05; **, 0.001 ≤ P < 0.01."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", "-", "B", ")", "In", "vitro", "quantification", "(", "A", ")", "and", "size", "distribution", "(", "B", ")", "of", "EVs", "isolated", "from", "conditioned", "medium", "of", "primary", "CPE", "cells", "grown", "in", "transwell", "system", "after", "12", "h", "in", "the", "absence", "(", "black", ")", "or", "presence", "(", "grey", ")", "of", "LPS", "(", "n", "=", "5", ")", "determined", "by", "NanoSight", "analysis", ".", "(", "C", "-", "E", ")", "TaqMan", "qPCR", "assay", "for", "the", "quantification", "of", "miR", "-", "9", "(", "C", ")", ",", "miR", "-", "146a", "(", "D", ")", "and", "miR", "-", "155", "(", "E", ")", "on", "the", "exosomal", "pellet", "isolated", "from", "conditioned", "medium", "of", "primary", "CPE", "cells", "grown", "in", "a", "transwell", "system", "and", "stimulated", "for", "12", "h", "with", "LPS", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "F", "-", "I", ")", "Quantification", "of", "the", "miRNAs", "miR", "-", "1a", "(", "F", ")", ",", "miR", "-", "9", "(", "G", ")", ",", "miR", "-", "146a", "(", "H", ")", "and", "miR", "-", "155", "(", "I", ")", "by", "TaqMan", "qPCR", "assay", "from", "primary", "CPE", "cells", "grown", "in", "a", "transwell", "system", "without", "or", "with", "LPS", "stimulation", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Significance", "levels", "are", "indicated", "on", "the", "graphs", ":", "*", ",", "0", ".", "01", "≤", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "0", ".", "001", "≤", "P", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A-B) In vitro quantification (A) and size distribution (B) of EVs isolated from conditioned medium of primary CPE cells grown in transwell system after 12 h in the absence (black) or presence (grey) of LPS (n=5) determined by NanoSight analysis.(C-E) TaqMan qPCR assay for the quantification of miR-9 (C), miR-146a (D) and miR-155 (E) on the exosomal pellet isolated from conditioned medium of primary CPE cells grown in a transwell system and stimulated for 12 h with LPS (n=3).(F-I) Quantification of the miRNAs miR-1a (F), miR-9 (G), miR-146a (H) and miR-155 (I) by TaqMan qPCR assay from primary CPE cells grown in a transwell system without or with LPS stimulation (n=3). Significance levels are indicated on the graphs: *, 0.01 ≤ P < 0.05; **, 0.001 ≤ P < 0.01."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "In", "vitro", "quantification", "of", "EVs", "isolated", "from", "conditioned", "medium", "of", "LPS", "-", "stimulated", "primary", "CPE", "cells", "grown", "in", "a", "transwell", "system", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "the", "exosome", "inhibitor", "GW4869", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "B", "-", "D", ")", "TaqMan", "assay", "quantification", "of", "the", "miRNAs", "miR", "-", "9", "(", "B", ")", ",", "miR", "-", "146a", "(", "C", ")", "and", "miR", "-", "155", "(", "D", ")", "in", "supernatant", "of", "LPS", "-", "stimulated", "primary", "CPE", "cells", "grown", "in", "a", "transwell", "system", "and", "either", "left", "untreated", "or", "pretreated", "with", "GW4869", "to", "inhibit", "exosome", "secretion", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "miR", "-", "1a", "levels", "were", "below", "detection", "limit", ".", "(", "E", "-", "H", ")", "TaqMan", "assay", "quantification", "of", "the", "miRNAs", "miR", "-", "1a", "(", "E", ")", ",", "miR", "-", "9", "(", "F", ")", ",", "miR", "-", "146a", "(", "G", ")", "and", "miR", "-", "155", "(", "H", ")", "in", "cell", "lysate", "of", "LPS", "-", "stimulated", "primary", "CPE", "cells", "grown", "in", "a", "transwell", "system", "left", "untreated", "or", "treated", "with", "GW4869", "to", "inhibit", "exosome", "secretion", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "are", "displayed", "as", "mean", "±", "SEM", "and", "analyzed", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Significance", "levels", "are", "indicated", "on", "the", "graphs", ":", "*", ",", "0", ".", "01", "≤", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "0", ".", "001", "≤", "P", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) In vitro quantification of EVs isolated from conditioned medium of LPS-stimulated primary CPE cells grown in a transwell system in the absence or presence of the exosome inhibitor GW4869 (n=3).(B-D) TaqMan assay quantification of the miRNAs miR-9 (B), miR-146a (C) and miR-155 (D) in supernatant of LPS-stimulated primary CPE cells grown in a transwell system and either left untreated or pretreated with GW4869 to inhibit exosome secretion (n=3). miR-1a levels were below detection limit.(E-H) TaqMan assay quantification of the miRNAs miR-1a (E), miR-9 (F), miR-146a (G) and miR-155 (H) in cell lysate of LPS-stimulated primary CPE cells grown in a transwell system left untreated or treated with GW4869 to inhibit exosome secretion (n=3). Data are displayed as mean ± SEM and analyzed by Student's t-test. Significance levels are indicated on the graphs: *, 0.01 ≤ P < 0.05; **, 0.001 ≤ P < 0.01."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "CD63", ",", "RAB5", "and", "ANXA2", "(", "red", ")", "in", "the", "choroid", "plexus", "(", "CP", ")", "0", ",", "4", "and", "8", "h", "after", "LPS", "treatment", ".", "Hoechst", "(", "blue", ")", "was", "used", "to", "stain", "the", "nucleus", ".", "The", "dotted", "line", "indicates", "the", "ependymal", "cells", "that", "line", "the", "ventricle", "and", "the", "square", "boxes", "indicate", "the", "zoomed", "insert", "images", "displayed", "at", "the", "right", "corner", "of", "each", "image", ".", "Scalebar", "=", "100", "µm", ".", "(", "B", "-", "C", ")", "Representative", "TEM", "images", "showing", "the", "presence", "of", "MVBs", "in", "the", "CPE", "cells", "before", "(", "B", ")", "and", "6", "hours", "after", "(", "C", ")", "LPS", "administration", "in", "vivo", ".", "White", "arrow", "heads", "point", "to", "exosomes", "present", "in", "MVBs", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "9", "µm", ".", "(", "D", "-", "F", ")", "Quantification", "of", "amount", "of", "MVBs", "per", "cell", "section", "(", "D", ")", ",", "amount", "of", "exosomes", "per", "MVB", "(", "E", ")", ",", "and", "amount", "of", "exosomes", "per", "cell", "section", "(", "F", ")", ",", "based", "on", "TEM", "analysis", ".", "(", "G", "-", "J", ")", "Quantitative", "real", "-", "time", "polymerase", "chain", "reaction", "(", "qPCR", ")", "analysis", "of", "miR", "-", "1a", "(", "G", ")", ",", "miR", "-", "9", "(", "H", ")", ",", "miR", "-", "146a", "(", "I", ")", ",", "and", "miR", "-", "155", "(", "J", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "relative", "expression", "normalized", "with", "housekeeping", "miRs", "by", "TaqMan", "qPCR", "assay", "(", "0", "h", ",", "n", "=", "4", ";", "1", "h", ",", "n", "=", "5", ";", "6", "h", ",", "n", "=", "5", ";", "24", "h", ",", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "K", ")", "NanoSight", "analysis", "of", "CSF", "isolated", "from", "LPS", "-", "injected", "mice", "followed", "by", "icv", "injection", "of", "vehicle", "or", "GW4869", ",", "a", "neutral", "sphingomyelinase", "inhibitor", "that", "inhibits", "exosome", "secretion", "(", "n", "=", "8", ")", ".", "(", "L", ")", "qPCR", "analysis", "of", "the", "expression", "of", "miR", "-", "1a", ",", "miR", "-", "9", ",", "miR", "-", "146a", "and", "miR", "-", "155", "in", "the", "choroid", "plexus", "of", "mice", "injected", "with", "LPS", "and", "then", "icv", "injected", "with", "vehicle", "(", "black", ")", "or", "GW4869", "(", "grey", ")", ",", "a", "neutral", "sphingomyelinase", "inhibitor", "that", "inhibits", "exosome", "secretion", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "(", "M", ")", "NanoSight", "analysis", "of", "supernatant", "of", "choroid", "plexus", "explants", "from", "PBS", "-", "or", "LPS", "-", "injected", "mice", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "Data", "are", "displayed", "as", "mean", "±", "SEM", "and", "analyzed", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Significance", "levels", "are", "indicated", "on", "the", "graphs", ":", "*", ",", "0", ".", "01", "≤", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "0", ".", "001", "≤", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "0", ".", "0001", "≤", "P", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Representative confocal images of CD63, RAB5 and ANXA2 (red) in the choroid plexus (CP) 0, 4 and 8 h after LPS treatment. Hoechst (blue) was used to stain the nucleus. The dotted line indicates the ependymal cells that line the ventricle and the square boxes indicate the zoomed insert images displayed at the right corner of each image. Scalebar = 100 µm.(B-C) Representative TEM images showing the presence of MVBs in the CPE cells before (B) and 6 hours after (C) LPS administration in vivo. White arrow heads point to exosomes present in MVBs (n=3). Scale bar = 9 µm.(D-F) Quantification of amount of MVBs per cell section (D), amount of exosomes per MVB (E), and amount of exosomes per cell section (F), based on TEM analysis.(G-J) Quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) analysis of miR-1a (G), miR-9 (H), miR-146a (I), and miR-155 (J). Data are presented as relative expression normalized with housekeeping miRs by TaqMan qPCR assay (0 h, n=4; 1 h, n=5; 6 h, n=5; 24 h, n=3).(K) NanoSight analysis of CSF isolated from LPS-injected mice followed by icv injection of vehicle or GW4869, a neutral sphingomyelinase inhibitor that inhibits exosome secretion (n = 8).(L) qPCR analysis of the expression of miR-1a, miR-9, miR-146a and miR-155 in the choroid plexus of mice injected with LPS and then icv injected with vehicle (black) or GW4869 (grey), a neutral sphingomyelinase inhibitor that inhibits exosome secretion (n = 4).(M) NanoSight analysis of supernatant of choroid plexus explants from PBS- or LPS-injected mice (n = 6). Data are displayed as mean ± SEM and analyzed by Student's t-test. Significance levels are indicated on the graphs: *, 0.01 ≤ P < 0.05; **, 0.001 ≤ P < 0.01; ***, 0.0001 ≤ P < 0.001."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", "-", "B", ")", "Representative", "confocal", "images", "of", "choroid", "plexus", "(", "CP", ")", "on", "brain", "sections", "from", "naive", "mice", "and", "four", "hours", "after", "LPS", "injection", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Brain", "sections", "were", "stained", "for", "TLR4", "(", "A", ")", "and", "TNFR1", "(", "B", ")", "(", "red", ")", ",", "pan", "-", "cytokeratine", "(", "panCK", ";", "green", ")", "and", "the", "nuclei", "were", "stained", "with", "Hoechst", "(", "blue", ")", ".", "The", "ependymal", "cells", "aligning", "the", "ventricles", "are", "marked", "with", "a", "dotted", "line", ".", "Scalebar", "=", "100", "µm", ".", "(", "C", ")", "NanoSight", "analysis", "of", "EVs", "in", "the", "CSF", "in", "sham", "-", "operated", "(", "black", ")", "relative", "to", "CLP", "-", "treated", "(", "grey", ")", "mice", "10", "hours", "after", "surgery", ".", "(", "D", ")", "qPCR", "analysis", "of", "the", "expression", "of", "miR", "-", "1a", ",", "miR", "-", "9", ",", "miR", "-", "146a", "and", "miR", "-", "155", "in", "the", "choroid", "plexus", "of", "sham", "-", "operated", "mice", "(", "black", ")", "and", "mice", "subjected", "to", "CLP", "(", "grey", ")", "10", "hours", "after", "surgery", ".", "(", "E", ")", "qPCR", "analysis", "of", "the", "expression", "of", "miR", "-", "1a", ",", "miR", "-", "9", ",", "miR", "-", "146a", "and", "miR", "-", "155", "in", "the", "CSF", "of", "sham", "-", "operated", "mice", "(", "black", ")", "and", "mice", "subjected", "to", "CLP", "(", "grey", ")", "10", "hours", "after", "surgery", ".", "(", "F", ")", "NanoSight", "analysis", "of", "EVs", "in", "CSF", "of", "control", "(", "black", ")", "and", "TNF", "-", "injected", "(", "25", "µg", "/", "20", "g", ";", "grey", ")", "mice", "6", "hours", "after", "TNF", "challenge", ".", "(", "G", ")", "qPCR", "analysis", "of", "the", "expression", "of", "miR", "-", "1a", ",", "miR", "-", "9", ",", "miR", "-", "146a", "and", "miR", "-", "155", "in", "the", "choroid", "plexus", "of", "control", "mice", "(", "black", ")", "and", "in", "mice", "injected", "with", "TNF", "(", "grey", ")", "6", "hours", "after", "injection", ".", "(", "H", ")", "qPCR", "analysis", "of", "the", "expression", "of", "miR", "-", "1a", ",", "miR", "-", "9", ",", "miR", "-", "146a", "and", "miR", "-", "155", "in", "the", "CSF", "of", "control", "mice", "(", "black", ")", "and", "on", "mice", "6", "hours", "after", "TNF", "injection", "(", "grey", ")", ".", "Data", "are", "displayed", "as", "mean", "±", "SEM", "and", "analyzed", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Scalebar", "100", "µm", ".", "Significance", "levels", "are", "indicated", "on", "the", "graphs", ":", "*", ",", "0", ".", "01", "≤", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "0", ".", "001", "≤", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "0", ".", "0001", "≤", "P", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A-B) Representative confocal images of choroid plexus (CP) on brain sections from naive mice and four hours after LPS injection (n=3). Brain sections were stained for TLR4 (A) and TNFR1 (B) (red), pan-cytokeratine (panCK; green) and the nuclei were stained with Hoechst (blue). The ependymal cells aligning the ventricles are marked with a dotted line. Scalebar = 100 µm.(C) NanoSight analysis of EVs in the CSF in sham-operated (black) relative to CLP-treated (grey) mice 10 hours after surgery.(D) qPCR analysis of the expression of miR-1a, miR-9, miR-146a and miR-155 in the choroid plexus of sham-operated mice (black) and mice subjected to CLP (grey) 10 hours after surgery. (E) qPCR analysis of the expression of miR-1a, miR-9, miR-146a and miR-155 in the CSF of sham-operated mice (black) and mice subjected to CLP (grey) 10 hours after surgery.(F) NanoSight analysis of EVs in CSF of control (black) and TNF-injected (25 µg/20 g; grey) mice 6 hours after TNF challenge.(G) qPCR analysis of the expression of miR-1a, miR-9, miR-146a and miR-155 in the choroid plexus of control mice (black) and in mice injected with TNF (grey) 6 hours after injection. (H) qPCR analysis of the expression of miR-1a, miR-9, miR-146a and miR-155 in the CSF of control mice (black) and on mice 6 hours after TNF injection (grey). Data are displayed as mean ± SEM and analyzed by Student's t-test. Scalebar 100 µm. Significance levels are indicated on the graphs: *, 0.01 ≤ P < 0.05; **, 0.001 ≤ P < 0.01; ***, 0.0001 ≤ P < 0.001."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Representative", "confocal", "image", "of", "brain", "parenchyma", ",", "four", "hours", "after", "intracerebroventricular", "injection", "of", "PKH26", "labelled", "EVs", "(", "red", ")", ".", "Astrocytes", "are", "stained", "with", "GFAP", "(", "white", ")", ",", "nuclei", "with", "Hoechst", "(", "blue", ")", ",", "and", "pan", "-", "cytokeratin", "(", "panCK", ";", "green", ")", "was", "used", "to", "label", "the", "choroid", "plexus", ".", "The", "dotted", "line", "shows", "the", "ventricular", "border", "and", "the", "white", "arrow", "heads", "point", "to", "EVs", "that", "crossed", "the", "ependymal", "cell", "layer", ".", "(", "B", "-", "C", ")", "Representative", "confocal", "images", "showing", "the", "uptake", "of", "double", "-", "labelled", "EVs", "(", "Ribogreen", ";", "green", ",", "PKH26", ",", "red", ")", "by", "astrocytes", "stained", "with", "GFAP", "(", "white", ")", "(", "B", ")", "and", "microglia", "cells", "stained", "with", "IBA1", "(", "white", ")", "(", "C", ")", "incubated", "on", "mixed", "cortical", "cultures", ".", "Boxed", "areas", "are", "shown", "as", "zoomed", "images", "on", "right", ".", "Cell", "nuclei", "are", "stained", "with", "Hoechst", "(", "blue", ")", ".", "The", "in", "vivo", "and", "in", "vitro", "uptake", "experiments", "were", "performed", "3", "and", "2", "times", "(", "n", "=", "3", ")", ",", "respectively", ".", "Scalebar", "100", "=", "µm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Representative confocal image of brain parenchyma, four hours after intracerebroventricular injection of PKH26 labelled EVs (red). Astrocytes are stained with GFAP (white), nuclei with Hoechst (blue), and pan-cytokeratin (panCK; green) was used to label the choroid plexus. The dotted line shows the ventricular border and the white arrow heads point to EVs that crossed the ependymal cell layer.(B-C) Representative confocal images showing the uptake of double-labelled EVs (Ribogreen; green, PKH26, red) by astrocytes stained with GFAP (white) (B) and microglia cells stained with IBA1 (white) (C) incubated on mixed cortical cultures. Boxed areas are shown as zoomed images on right. Cell nuclei are stained with Hoechst (blue). The in vivo and in vitro uptake experiments were performed 3 and 2 times (n=3), respectively. Scalebar 100 = µm."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "A", "-", "B", ")", "qPCR", "gene", "expression", "analysis", "of", "miRNA", "target", "genes", "Mapk3", ",", "Notch1", ",", "Dicer", ",", "Tab2", ",", "Sox2", ",", "Calm2", ",", "Smad2", ",", "Smad5", ",", "Dnmt3", "and", "Irak1", "in", "mixed", "cortical", "cultures", "incubated", "with", "EVs", "isolated", "from", "CSF", "from", "untreated", "(", "black", ")", "or", "LPS", "treated", "(", "grey", ")", "mice", "(", "A", ")", "and", "in", "brain", "tissue", "(", "B", ")", "before", "(", "black", ")", "and", "8", "h", "after", "LPS", "injection", "(", "grey", ")", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "C", ")", "qPCR", "gene", "expression", "analysis", "of", "inflammatory", "genes", "Il", "-", "1β", ",", "Tnf", ",", "Il", "-", "6", ",", "iNos", "and", "iκbα", "by", "qPCR", "in", "mixed", "cortical", "cultures", "(", "left", ";", "in", "vitro", ")", "incubated", "with", "EVs", "isolated", "from", "CSF", "from", "untreated", "(", "black", ")", "or", "LPS", "treated", "(", "grey", ")", "mice", "and", "in", "brain", "tissue", "(", "right", ";", "in", "vivo", ")", "before", "(", "black", ")", "and", "8", "h", "after", "LPS", "injection", "(", "grey", ")", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "D", ")", "Cytokine", "analysis", "(", "IL", "-", "6", ",", "IL", "-", "1β", "and", "TNF", ")", "of", "supernatant", "of", "mixed", "cortical", "cultures", "(", "left", ";", "in", "vitro", ")", "incubated", "with", "EVs", "isolated", "from", "untreated", "(", "black", ";", "n", "=", "3", ")", "or", "LPS", "treated", "(", "grey", ";", "n", "=", "3", ")", "mice", "and", "of", "CSF", "(", "right", ";", "in", "vivo", ")", "from", "untreated", "(", "black", ";", "n", "=", "3", ")", "and", "LPS", "treated", "mice", "(", "grey", ";", "n", "=", "6", ")", ".", "(", "E", "-", "F", ")", "qPCR", "gene", "expression", "analysis", "of", "inflammatory", "genes", "Il", "-", "1β", ",", "Tnf", ",", "Il", "-", "6", ",", "iNos", "and", "iκbα", "(", "E", ")", "and", "miRNA", "target", "genes", "Mapk3", ",", "Notch1", ",", "Dicer", ",", "Tab2", ",", "Sox2", ",", "Calm2", ",", "Smad2", ",", "Smad5", ",", "Dnmt3", "and", "Irak1", "(", "F", ")", "in", "mixed", "cortical", "cultures", "incubated", "with", "CD63", "-", "depleted", "EVs", "isolated", "from", "untreated", "mice", "(", "black", ")", "and", "mice", "treated", "with", "LPS", "for", "6", "h", "(", "grey", ")", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "G", "-", "H", ")", "qPCR", "gene", "expression", "analysis", "of", "miRNA", "target", "genes", "Mapk3", ",", "Notch1", ",", "Dicer", ",", "Tab2", ",", "Sox2", ",", "Calm2", ",", "Smad2", ",", "Smad5", ",", "Dnmt3", "and", "Irak1", "(", "G", ")", "and", "inflammatory", "genes", "Il", "-", "1β", ",", "Tnf", ",", "Il", "-", "6", ",", "iNos", "and", "iκbα", "(", "H", ")", "in", "brain", "tissue", "from", "LPS", "-", "injected", "mice", "icv", "injected", "with", "vehicle", "(", "black", ")", "or", "GW4869", "(", "grey", ";", "n", "=", "7", ")", ".", "Data", "are", "displayed", "as", "mean", "±", "SEM", "and", "analyzed", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "Significance", "levels", "are", "indicated", "on", "the", "graphs", ":", "*", ",", "0", ".", "01", "≤", "P", "<", "0", ".", "05", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(A-B) qPCR gene expression analysis of miRNA target genes Mapk3, Notch1, Dicer, Tab2, Sox2, Calm2, Smad2, Smad5, Dnmt3 and Irak1 in mixed cortical cultures incubated with EVs isolated from CSF from untreated (black) or LPS treated (grey) mice (A) and in brain tissue (B) before (black) and 8 h after LPS injection (grey) (n=3).(C) qPCR gene expression analysis of inflammatory genes Il-1β, Tnf, Il-6, iNos and iκbα by qPCR in mixed cortical cultures (left; in vitro) incubated with EVs isolated from CSF from untreated (black) or LPS treated (grey) mice and in brain tissue (right; in vivo) before (black) and 8 h after LPS injection (grey) (n=3).(D) Cytokine analysis (IL-6, IL-1β and TNF) of supernatant of mixed cortical cultures (left; in vitro) incubated with EVs isolated from untreated (black; n=3) or LPS treated (grey; n=3) mice and of CSF (right; in vivo) from untreated (black; n=3) and LPS treated mice (grey; n=6).(E-F) qPCR gene expression analysis of inflammatory genes Il-1β, Tnf, Il-6, iNos and iκbα (E) and miRNA target genes Mapk3, Notch1, Dicer, Tab2, Sox2, Calm2, Smad2, Smad5, Dnmt3 and Irak1 (F) in mixed cortical cultures incubated with CD63-depleted EVs isolated from untreated mice (black) and mice treated with LPS for 6 h (grey) (n=3).(G-H) qPCR gene expression analysis of miRNA target genes Mapk3, Notch1, Dicer, Tab2, Sox2, Calm2, Smad2, Smad5, Dnmt3 and Irak1 (G) and inflammatory genes Il-1β, Tnf, Il-6, iNos and iκbα (H) in brain tissue from LPS-injected mice icv injected with vehicle (black) or GW4869 (grey; n=7). Data are displayed as mean ± SEM and analyzed by Student's t-test. Significance levels are indicated on the graphs: *, 0.01 ≤ P < 0.05."}
{"words": ["Figure", "1A", ")", "Double", "fluorescence", "in", "situ", "hybridization", "using", "Nrg3", "(", "green", ")", "and", "Gad1", "(", "red", ")", "specific", "probes", ";", "DAPI", "was", "used", "as", "a", "counter", "stain", ".", "Nrg3", "is", "present", "in", "Gad1", "-", "positive", "(", "filled", "arrowheads", ")", "and", "-", "negative", "neurons", ".", "(", "A", "'", ")", "and", "(", "A", "'", "'", ")", "show", "higher", "magnifications", "of", "boxed", "areas", "indicated", "in", "(", "A", ")", ".", "Nrg3", "-", "negative", "neurons", "are", "indicated", "by", "open", "arrowheads", ";", "note", "that", "many", "but", "not", "all", "neurons", "express", "Nrg3", ".", "B", ")", "Comparison", "of", "mRNA", "levels", "of", "Nrg3", ",", "Nrg1β", "type", "III", "(", "Nrg1β", "−", "III", ")", ",", "Nrg2β", ",", "Nrg1β", "type", "II", "(", "Nrg1β", "−", "II", ")", ",", "Nrg2α", "and", "Nrg1β", "type", "I", "(", "Nrg1β", "−", "I", ")", "in", "the", "cortex", "(", "Cx", ")", ",", "hippocampus", "(", "HC", ")", "and", "striatum", "(", "Str", ")", "of", "juvenile", " ", "mice", "(", "P30", "-", "60", ")", "by", "quantitative", "RT", "-", "PCR", ".", "Data", "represent", "means", "±", "SD", "of", "4", "biological", "replicates", ".", "2", "-", "way", "-", "ANOVA", "with", "Bonferroni", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "was", "performed", "to", "assess", "statistical", "significance", "(", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "ns", "=", "not", "significant", ")", ".", "D", ")", "Detection", "of", "Nrg3", "by", "western", "blot", "analysis", "in", "fractions", "from", "brain", "lysates", ":", "S1", ",", "crude", "lysate", ";", "S2", ",", "cytosol", "and", "light", "membranes", ";", "S2", "'", ",", "cytosol", ";", "LM", ",", "light", "membranes", ";", "P2", "'", ",", "crude", "synaptosomes", ";", "S3", "'", ",", "synaptosomal", "cytoplasm", ";", "SV", ",", "synaptic", "vesicles", ";", "P3", ",", "synaptosomal", "membranes", ";", "SPM", ",", "synaptic", "plasma", "membranes", ".", "E", ",", "F", ")", "Immunohistochemical", "analysis", "in", "the", "hippocampus", "of", "wildtype", "(", "E", ",", "E", "'", ",", "E", "'", "'", ")", "and", "ErbB4", "mutant", "mice", "(", "F", ")", "at", "2", "month", "of", "age", "using", "Nrg3", "-", ",", "ErbB4", "-", "and", "parvalbumin", "(", "Parv", ")", "-", "specific", "antibodies", ".", "The", "white", "box", "in", "(", "E", ")", "is", "displayed", "magnified", "in", "(", "E", "'", ",", "E", "'", "'", ")", ".", "In", "control", "mice", ",", "Nrg3", "is", "enriched", "on", "dendrites", "of", "ErbB4", "+", "PV", " ", "interneurons", ",", "compared", "to", "the", "surrounding", "neuropil", "(", "E", "'", ",", "E", "'", "'", ")", ".", "In", "ErbB4", "mutants", ",", "the", "Nrg3", "enrichment", "on", "PV", " ", "interneurons", "is", "not", "apparent", "(", "F", ")", ".", "G", ")", "Nrg3", ",", "ErbB4", "and", "GluA4", "were", "identified", "by", "immunohistology", "and", "co", "-", "localized", "in", "synaptic", "puncta", "on", "dendrites", "of", "interneurons", "in", "the", "stratum", "radiatum", "of", "the", "hippocampal", "CA1", ".", "Note", "that", "(", "G", ")", "displays", "Nrg3", "/", "ErbB4", ",", "(", "G", "'", ")", "Nrg3", "/", "GluA4", ",", "and", "(", "G", "'", "'", ")", "ErbB4", "/", "GluA4", "signals", "of", "the", "same", "triple", "-", "stained", "image", ";", "false", "colors", "were", "assigned", "for", "better", "signal", "visualization", ".", "H", ")", "Quantification", "of", "GluA4", "puncta", "present", "on", "ErbB4", "+", "dendrites", "in", "the", "CA1", "stratum", "radiatum", "of", "adult", "wildtype", "(", "wt", ")", "and", "Nrg3", "-", "/", "-", "mice", "(", "age", "P90", "-", "120", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "box", "plots", "with", "Tukey", "'", "s", "whiskers", "and", "outliers", ";", "means", "are", "indicated", "by", "a", "Plus", "symbols", ".", "n", "=", "65", "(", "wt", ")", "and", "n", "=", "62", "(", "Nrg3", "-", "/", "-", ")", "from", "5", "animals", "each", ".", "Unpaired", "t", "-", "test", "(", "2", "-", "tailed", ")", "with", "Welch", "'", "s", "correction", "was", "performed", "to", "assess", "statistical", "significance", "(", "*", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "0001", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A) Double fluorescence in situ hybridization using Nrg3 (green) and Gad1 (red) specific probes; DAPI was used as a counter stain. Nrg3 is present in Gad1-positive (filled arrowheads) and -negative neurons. (A') and (A'') show higher magnifications of boxed areas indicated in (A). Nrg3-negative neurons are indicated by open arrowheads; note that many but not all neurons express Nrg3.B) Comparison of mRNA levels of Nrg3, Nrg1β type III (Nrg1β−III), Nrg2β, Nrg1β type II (Nrg1β−II), Nrg2α and Nrg1β type I (Nrg1β−I) in the cortex (Cx), hippocampus (HC) and striatum (Str) of juvenile mice (P30-60) by quantitative RT-PCR. Data represent means ± SD of 4 biological replicates. 2-way-ANOVA with Bonferroni's multiple comparisons test was performed to assess statistical significance (****P<0.0001, ***P<0.001, ns=not significant).D) Detection of Nrg3 by western blot analysis in fractions from brain lysates: S1, crude lysate; S2, cytosol and light membranes; S2', cytosol; LM, light membranes; P2', crude synaptosomes; S3', synaptosomal cytoplasm; SV, synaptic vesicles; P3, synaptosomal membranes; SPM, synaptic plasma membranes.E, F) Immunohistochemical analysis in the hippocampus of wildtype (E,E',E'') and ErbB4 mutant mice (F) at 2 month of age using Nrg3-, ErbB4- and parvalbumin (Parv)-specific antibodies. The white box in (E) is displayed magnified in (E',E''). In control mice, Nrg3 is enriched on dendrites of ErbB4+ PV interneurons, compared to the surrounding neuropil (E',E''). In ErbB4 mutants, the Nrg3 enrichment on PV interneurons is not apparent (F).G) Nrg3, ErbB4 and GluA4 were identified by immunohistology and co-localized in synaptic puncta on dendrites of interneurons in the stratum radiatum of the hippocampal CA1. Note that (G) displays Nrg3/ErbB4, (G') Nrg3/GluA4, and (G'') ErbB4/GluA4 signals of the same triple-stained image; false colors were assigned for better signal visualization.H) Quantification of GluA4 puncta present on ErbB4+ dendrites in the CA1 stratum radiatum of adult wildtype (wt) and Nrg3-/- mice (age P90-120). Data are presented as box plots with Tukey's whiskers and outliers; means are indicated by a Plus symbols. n=65 (wt) and n=62 (Nrg3-/-) from 5 animals each. Unpaired t-test (2-tailed) with Welch's correction was performed to assess statistical significance (****P<0.0001)."}
{"words": ["Figure", "4", " ", "A", ")", " ", "His6", "-", "tagged", "EGF", "domains", "of", "Nrg1β", "and", "Nrg3", "were", "added", "to", "neuronal", "cultures", "at", "the", "indicated", "concentrations", ".", "Western", "blot", "analyses", "of", "ErbB4", " ", "immunoprecipitates", "using", "antibodies", "against", "phospho", "-", "tyrosine", "(", "pY", ")", "and", "ErbB4", ",", "and", "of", "whole", "lysates", "using", "antibodies", "against", "pErk1", "/", "2", "and", "pAkt", " ", " ", "A", ")", " ", "His6", "-", "tagged", "EGF", "domains", "of", "Nrg1β", "and", "Nrg3", "were", "added", "to", "neuronal", "cultures", "at", "the", "indicated", "concentrations", ".", "Western", "blot", "analyses", "of", "ErbB4", " ", "immunoprecipitates", "using", "antibodies", "against", "phospho", "-", "tyrosine", "(", "pY", ")", "and", "ErbB4", ",", "and", "of", "whole", "lysates", "using", "antibodies", "against", "pErk1", "/", "2", "and", "pAkt", " ", " ", "C", ",", "D", ")", " ", "Neurons", "from", "Nrg3", "-", "/", "-", ";", "ErbB4", "-", "/", "-", ";", "vGAT", "-", "Cre", " ", "mice", "were", "transduced", "with", "a", "lentivirus", "expressing", "either", "(", "C", ")", "ErbB4wt", "or", "(", "D", ")", "ErbB4kd", "(", "kinase", "dead", "ErbB4", ")", "in", "a", "Cre", "-", "dependent", "manner", ",", "and", "with", "a", "second", "virus", "at", "a", "low", "titer", "expressing", "Nrg3", "/", "SypCFP", ".", "Immunocytochemical", "analysis", "of", "ErbB4", "and", "SypCFP", ";", "(", "C", ",", "C", "'", ")", "and", "(", "D", ",", "D", "'", ")", "each", "show", "the", "same", "image", ",", "(", "C", "'", ",", "D", "'", ")", "show", "the", "SypCFP", "signal", " ", " ", "E", "-", "G", ")", "Quantification", "of", "Synapse", "preference", "towards", "ErbB4", "+", "neurons", "(", "E", ")", ",", "ErbB4", "enrichment", "(", "F", ")", "and", "SypCFP", "enrichment", "(", "G", ")", "in", "synapses", "on", "neurons", "expressing", "wildtype", "ErbB4", "(", "wt", ")", "or", "ErbB4kd", "(", "kd", ")", " ", " ", "H", ")", " ", "Nrg3", "-", "/", "-", "neuron", "cultures", "were", "transfected", "with", "a", "plasmid", "that", "strongly", "overexpresses", "Nrg3", "and", "GFP", "and", "immunostained", "with", "antibodies", "against", "ErbB4", ",", "GFP", "and", "GluA", ";", "(", "H", ")", "shows", "the", "triple", "stained", "image", ",", "while", "(", "H", "'", ")", "and", "(", "H", "'", "'", ")", "only", "show", "ErbB4", "and", "GluA", "signals", ",", "respectively", " ", " ", "I", ")", "Co", "-", "cultures", "of", "Nrg3", "-", "/", "-", "neurons", "with", "HEK293", "cells", "expressing", "Nrg3", ".", "Cultures", "were", "stained", "with", "antibodies", "against", "Nrg3", ",", "ErbB4", "and", "GluA", ".", "Note", "that", "Nrg3", ",", "ErbB4", "and", "GluA", "are", "enriched", "at", "the", "contact", "sites", "between", "Nrg3", "-", "expressing", "HEK293", "cells", "and", "ErbB4", "+", "neurons", " "], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4 A) His6-tagged EGF domains of Nrg1β and Nrg3 were added to neuronal cultures at the indicated concentrations. Western blot analyses of ErbB4 immunoprecipitates using antibodies against phospho-tyrosine (pY) and ErbB4, and of whole lysates using antibodies against pErk1/2 and pAkt  A) His6-tagged EGF domains of Nrg1β and Nrg3 were added to neuronal cultures at the indicated concentrations. Western blot analyses of ErbB4 immunoprecipitates using antibodies against phospho-tyrosine (pY) and ErbB4, and of whole lysates using antibodies against pErk1/2 and pAkt  C, D) Neurons from Nrg3-/-;ErbB4-/-;vGAT-Cre mice were transduced with a lentivirus expressing either (C) ErbB4wt or (D) ErbB4kd (kinase dead ErbB4) in a Cre-dependent manner, and with a second virus at a low titer expressing Nrg3/SypCFP. Immunocytochemical analysis of ErbB4 and SypCFP; (C,C') and (D,D') each show the same image, (C',D') show the SypCFP signal  E-G) Quantification of Synapse preference towards ErbB4+ neurons (E), ErbB4 enrichment (F) and SypCFP enrichment (G) in synapses on neurons expressing wildtype ErbB4 (wt) or ErbB4kd (kd)  H) Nrg3-/- neuron cultures were transfected with a plasmid that strongly overexpresses Nrg3 and GFP and immunostained with antibodies against ErbB4, GFP and GluA; (H) shows the triple stained image, while (H') and (H'') only show ErbB4 and GluA signals, respectively  I) Co-cultures of Nrg3-/- neurons with HEK293 cells expressing Nrg3. Cultures were stained with antibodies against Nrg3, ErbB4 and GluA. Note that Nrg3, ErbB4 and GluA are enriched at the contact sites between Nrg3-expressing HEK293 cells and ErbB4+ neurons "}
{"words": ["Figure", "5", "C", ")", "Example", "traces", "of", "evoked", "excitatory", "postsynaptic", "currents", "(", "eEPSCs", ")", "averaged", "over", "50", "sweeps", ".", "D", ",", "E", ")", "Quantification", "of", "the", "peak", "amplitude", "of", "the", "first", "eEPSC", "(", "D", ")", "and", "of", "the", "paired", "pulse", "ratio", "(", "E", ")", "F", "-", "I", ")", "sEPSC", "recordings", "from", "CA1", "pyramidal", "(", "F", ",", "H", ")", "and", "PV", "neurons", "(", "G", ",", "I", ")", "in", "acute", "slices", ".", "sEPSC", "frequencies", "(", "F", ",", "G", ")", "and", "amplitudes", "(", "H", ",", "I", ")", "are"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5 C) Example traces of evoked excitatory postsynaptic currents (eEPSCs) averaged over 50 sweeps. D, E) Quantification of the peak amplitude of the first eEPSC (D) and of the paired pulse ratio (E)  F-I) sEPSC recordings from CA1 pyramidal (F,H) and PV neurons (G, I) in acute slices. sEPSC frequencies (F,G) and amplitudes (H,I) are shown"}
{"words": ["Figure", "1TRF1", "immunofluorescence", "of", "the", "lungs", ".", "Notice", "the", "absence", "and", "presence", "of", "TRF1", "signal", "in", "the", "carcinomas", "and", "surrounding", "healthy", "tissue", "of", "Trf1Δ", "/", "Δ", "mice", ",", "respectively", ".", "Analysis", "of", "Trf1", "excision", "by", "PCR", ".", "Notice", "the", "completed", "excision", "in", "carcinomas", "of", "Trf1lox", "/", "lox", "lungs", ".", "Detection", "of", "β", "-", "galactosidase", "activity", "in", "the", "lungs", "as", "a", "surrogate", "marker", "of", "oncogenic", "K", "-", "RasG12V", "expression", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1TRF1 immunofluorescence of the lungs. Notice the absence and presence of TRF1 signal in the carcinomas and surrounding healthy tissue of Trf1Δ/Δ mice, respectively.Analysis of Trf1 excision by PCR. Notice the completed excision in carcinomas of Trf1lox/lox lungs.Detection of β-galactosidase activity in the lungs as a surrogate marker of oncogenic K-RasG12V expression."}
{"words": ["Figure", "2Tumor", "growth", "curve", "of", "Trf1", "+", "/", "+", "K", "-", "Ras", "+", "/", "G12Vp53", "+", "/", "+", "and", "Trf1Δ", "/", "ΔK", "-", "Ras", "+", "/", "G12Vp53", "+", "/", "+", "measured", "by", "computed", "tomography", "(", "CT", ")", ".", "Quantification", "of", "the", "number", "and", "size", "of", "Trf1", "+", "/", "+", "K", "-", "Ras", "+", "/", "G12Vp53", "+", "/", "+", "and", "Trf1Δ", "/", "ΔK", "-", "Ras", "+", "/", "G12Vp53", "+", "/", "+", "carcinomas", "at", "death", "point", ".", "Percentage", "of", "tumors", "that", "have", "deleted", "Trf1", "quantified", "by", "TRF1", "immunofluorescence", "after", "mice", "had", "been", "sacrificed", ".", "Post", "-", "mortem", "analysis", "of", "Trf1", "deletion", "in", "each", "tumor", "revealed", "that", "none", "of", "the", "Trf1lox", "/", "lox", "K", "-", "Ras", "+", "/", "G12V", "p53", "+", "/", "+", "ones", "had", "excised", "Trf1", ".", "Tumor", "growth", "curve", "and", "tumor", "growth", "slope", "of", "Trf1", "+", "/", "+", "K", "-", "Ras", "+", "/", "G12V", "p53", "−", "/", "−", "and", "Trf1", "−", "/", "−", "K", "-", "Ras", "+", "/", "G12V", "p53", "−", "/", "−", "measured", "by", "CT", ".", "Tumor", "maximal", "section", "of", "Trf1", "+", "/", "+", "K", "-", "Ras", "+", "/", "G12Vp53", "−", "/", "−", "and", "Trf1Δ", "/", "ΔK", "-", "Ras", "+", "/", "G12Vp53", "−", "/", "−", "lungs", "measured", "by", "histological", "analysis", "before", "death", "point", "by", "CT", ".", "Maximum", "18F", "-", "FDG", "-", "glucose", "uptake", "by", "Trf1", "+", "/", "+", "K", "-", "Ras", "+", "/", "G12Vp53", "−", "/", "−", "and", "Trf1Δ", "/", "ΔK", "-", "Ras", "+", "/", "G12Vp53", "−", "/", "−", "tumors", "22", "weeks", "after", "infection", "by", "positron", "emission", "tomography", "(", "PET", ")", ".", "Representative", "PET", "-", "CT", "image", "of", "Trf1", "+", "/", "+", "K", "-", "Ras", "+", "/", "G12Vp53", "−", "/", "−", "and", "Trf1Δ", "/", "ΔK", "-", "Ras", "+", "/", "G12Vp53", "−", "/", "−", "lungs", ".", "Survival", "curve", "of", "Trf1", "+", "/", "+", "K", "-", "Ras", "+", "/", "G12V", "p53", "−", "/", "−", "and", "Trf1", "−", "/", "−", "K", "-", "Ras", "+", "/", "G12V", "p53", "−", "/", "−", "mice", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Tumor growth curve of Trf1+/+K-Ras+/G12Vp53+/+ and Trf1Δ/ΔK-Ras+/G12Vp53+/+ measured by computed tomography (CT).Quantification of the number and size of Trf1+/+K-Ras+/G12Vp53+/+ and Trf1Δ/ΔK-Ras+/G12Vp53+/+carcinomas at death point.Percentage of tumors that have deleted Trf1 quantified by TRF1 immunofluorescence after mice had been sacrificed. Post-mortem analysis of Trf1 deletion in each tumor revealed that none of the Trf1lox/lox K-Ras+/G12V p53+/+ ones had excised Trf1.Tumor growth curve and tumor growth slope of Trf1+/+ K-Ras+/G12V p53−/− and Trf1−/− K-Ras+/G12V p53−/− measured by CT.Tumor maximal section of Trf1+/+K-Ras+/G12Vp53−/− and Trf1Δ/ΔK-Ras+/G12Vp53−/−lungs measured by histological analysis before death point by CT.Maximum 18F-FDG-glucose uptake by Trf1+/+K-Ras+/G12Vp53−/− and Trf1Δ/ΔK-Ras+/G12Vp53−/−tumors 22 weeks after infection by positron emission tomography (PET).Representative PET-CT image of Trf1+/+K-Ras+/G12Vp53−/− and Trf1Δ/ΔK-Ras+/G12Vp53−/−lungs.Survival curve of Trf1+/+ K-Ras+/G12V p53−/− and Trf1−/− K-Ras+/G12V p53−/− mice."}
{"words": ["Figure", "3Percentage", "of", "cells", "showing", "γH2AX", "foci", "in", "carcinomas", "of", "the", "indicated", "genotypes", "(", "left", "panel", ")", ".", "Representative", "images", "of", "γH2AX", "immunohistochemistry", "(", "right", "panel", ")", ".", "Percentage", "of", "cells", "showing", "3", "or", "more", "γH2AX", "and", "RAP1", "colocalizing", "foci", "(", "TIFs", ")", "(", "left", "panel", ")", ".", "Representative", "images", "of", "γH2AX", "and", "RAP1", "double", "immunofluorescence", "(", "right", "panel", ")", ".", "Yellow", "arrowheads", ":", "colocalization", "of", "γH2AX", "and", "RAP1", ".", "Percentage", "of", "active", "caspase", "-", "3", "(", "AC3", ")", "-", "positive", "cells", "(", "left", "panel", ")", ".", "Representative", "images", "of", "AC3", "immunohistochemistry", "(", "right", "panel", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Percentage of cells showing γH2AX foci in carcinomas of the indicated genotypes (left panel). Representative images of γH2AX immunohistochemistry (right panel).Percentage of cells showing 3 or more γH2AX and RAP1 colocalizing foci (TIFs) (left panel). Representative images of γH2AX and RAP1 double immunofluorescence (right panel). Yellow arrowheads: colocalization of γH2AX and RAP1.Percentage of active caspase-3 (AC3)-positive cells (left panel). Representative images of AC3 immunohistochemistry (right panel)."}
{"words": ["Figure", "4Percentage", "of", "Ki67", "-", "positive", "cells", "in", "the", "carcinomas", "of", "the", "indicated", "genotypes", "(", "left", "panel", ")", ".", "Representative", "images", "of", "Ki67", "immunohistochemistry", "(", "right", "panel", ")", ".", "Percentage", "of", "pH3", "-", "positive", "cells", "in", "the", "carcinomas", "of", "the", "indicated", "genotypes", "(", "left", "panel", ")", ".", "Representative", "images", "of", "pH3", "immunohistochemistry", "(", "right", "panel", ")", ".", "Red", "arrowheads", ":", "pH3", "-", "positive", "cells", ".", "Percentage", "of", "giant", "nuclei", "in", "the", "carcinomas", "of", "the", "indicated", "genotype", ".", "Percentage", "of", "anaphase", "bridges", "out", "of", "total", "anaphases", "in", "the", "carcinomas", "of", "the", "indicated", "genotypes", ".", "Representative", "images", "of", "giant", "nuclei", ",", "multilobulated", "nuclei", ",", "anaphase", "bridges", ",", "and", "multipolar", "mitoses", ".", "Red", "arrowheads", "indicate", "the", "corresponding", "mitotic", "aberrations", "indicated", "in", "the", "image", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Percentage of Ki67-positive cells in the carcinomas of the indicated genotypes (left panel). Representative images of Ki67 immunohistochemistry (right panel).Percentage of pH3-positive cells in the carcinomas of the indicated genotypes (left panel). Representative images of pH3 immunohistochemistry (right panel). Red arrowheads: pH3-positive cells.Percentage of giant nuclei in the carcinomas of the indicated genotype.Percentage of anaphase bridges out of total anaphases in the carcinomas of the indicated genotypes.Representative images of giant nuclei, multilobulated nuclei, anaphase bridges, and multipolar mitoses. Red arrowheads indicate the corresponding mitotic aberrations indicated in the image."}
{"words": ["Figure", "5A", "-", "C", "The", "latency", "(", "A", ")", ",", "volume", "(", "B", ")", ",", "and", "weight", "(", "C", ")", "of", "subcutaneous", "tumors", "generated", "by", "control", "and", "Trf1", "-", "downregulated", "K", "-", "RasG12V", "-", "transformed", "lung", "cells", "in", "athymic", "mice", ".", "D", "Representative", "images", "of", "the", "subcutaneous", "tumors", ".", "E", "Trf1", "expression", "levels", "measured", "by", "qPCR", "in", "the", "injected", "cell", "line", "and", "in", "the", "generated", "subcutaneous", "tumors", ".", "F", "-", "H", "Number", "of", "Ki67", "-", "positive", "(", "F", ")", ",", "number", "of", "γH2AX", "-", "positive", "(", "G", ")", ",", "and", "number", "of", "active", "caspase", "-", "3", "-", "positive", "(", "H", ")", "cells", "per", "field", "in", "the", "subcutaneous", "tumors", ".", "I", "Representative", "images", "of", "aberrant", "giant", "nuclei", "and", "anaphase", "bridges", "in", "the", "Trf1", "-", "downregulated", "subcutaneous", "tumors", "compared", "to", "the", "normal", "nuclei", "of", "control", "tumors", ".", "J", "TRF1", "immunofluorescence", "shows", "the", "downregulation", "of", "Trf1", "in", "lung", "tumors", "of", "the", "mice", "intravenously", "injected", "with", "control", "and", "Trf1", "-", "downregulated", "cells", ".", "K", "Tumor", "area", "measured", "in", "the", "lungs", "of", "the", "mice", "intravenously", "injected", "with", "control", "and", "Trf1", "-", "downregulated", "cells", ".", "L", "Representative", "images", "of", "the", "lungs", "colonized", "by", "control", "and", "Trf1", "-", "downregulated", "cells", ",", "respectively", ".", "M", "-", "O", "Number", "of", "Ki67", "-", "positive", "(", "M", ")", ",", "number", "of", "γH2AX", "-", "positive", "(", "N", ")", ",", "and", "number", "of", "active", "caspase", "-", "3", "-", "positive", "(", "O", ")", "cells", "per", "field", "in", "the", "lung", "tumors", ".", "P", "Trf1", "expression", "levels", "measured", "by", "qPCR", "in", "the", "A549", "cell", "line", "infected", "either", "with", "sh", "-", "scrambled", "or", "sh", "-", "Trf1", ".", "Q", "Growth", "of", "A549", "-", "derived", "tumors", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A-C The latency (A), volume (B), and weight (C) of subcutaneous tumors generated by control and Trf1-downregulated K-RasG12V-transformed lung cells in athymic mice.D Representative images of the subcutaneous tumors.E Trf1 expression levels measured by qPCR in the injected cell line and in the generated subcutaneous tumors.F-H Number of Ki67-positive (F), number of γH2AX-positive (G), and number of active caspase-3-positive (H) cells per field in the subcutaneous tumors.I Representative images of aberrant giant nuclei and anaphase bridges in the Trf1-downregulated subcutaneous tumors compared to the normal nuclei of control tumors.J TRF1 immunofluorescence shows the downregulation of Trf1 in lung tumors of the mice intravenously injected with control and Trf1-downregulated cells.K Tumor area measured in the lungs of the mice intravenously injected with control and Trf1-downregulated cells.L Representative images of the lungs colonized by control and Trf1-downregulated cells, respectively.M-O Number of Ki67-positive (M), number of γH2AX-positive (N), and number of active caspase-3-positive (O) cells per field in the lung tumors.P Trf1 expression levels measured by qPCR in the A549 cell line infected either with sh-scrambled or sh-Trf1.Q Growth of A549-derived tumors."}
{"words": ["Figure", "6Trf1", "expression", "levels", "in", "the", "indicated", "tissues", "of", "wild", "-", "type", "and", "Trf1lox", "/", "lox", "hUBC", "-", "CreERT2", "mice", "subjected", "to", "a", "tamoxifen", "-", "containing", "diet", "for", "7", "weeks", ".", "Representative", "images", "of", "TRF1", "immunofluorescence", "and", "quantification", "of", "the", "percentage", "of", "TRF1", "-", "positive", "cells", "in", "skin", "and", "intestine", "sections", "of", "wild", "-", "type", "and", "Trf1lox", "/", "lox", "hUBC", "-", "CreERT2", "mice", "subjected", "to", "a", "tamoxifen", "-", "containing", "diet", "for", "7", "weeks", ".", "Survival", "curve", "of", "wild", "-", "type", "and", "Trf1lox", "/", "lox", "hUBC", "-", "CreERT2", "mice", "subjected", "to", "a", "tamoxifen", "-", "containing", "diet", "for", "7", "weeks", ".", "Quantification", "of", "the", "histological", "alterations", "observed", "in", "tamoxifen", "-", "treated", "Trf1lox", "/", "lox", "hUBC", "-", "CreERT2", "mice", "and", "4", "months", "after", "tamoxifen", "retrieval", "compared", "to", "their", "wild", "-", "type", "counterparts", ".", "Quantification", "of", "blood", "cell", "populations", "in", "wild", "-", "type", "and", "Trf1lox", "/", "lox", "hUBC", "-", "CreERT2mice", "subjected", "to", "a", "tamoxifen", "-", "containing", "diet", "for", "7", "weeks", "and", "after", "3", "weeks", "and", "4", "months", "of", "tamoxifen", "retrieval", ".", "Trf1", "expression", "levels", "in", "blood", ",", "intestine", ",", "skin", ",", "and", "bone", "marrow", "of", "Trf1lox", "/", "lox", "hUBC", "-", "CreERT2", "mice", "subjected", "to", "a", "tamoxifen", "-", "containing", "diet", "either", "for", "7", "weeks", "or", "for", "6", "months", "and", "after", "3", "weeks", "tamoxifen", "retrieval", "compared", "to", "wild", "-", "type", "mice", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Trf1 expression levels in the indicated tissues of wild-type and Trf1lox/lox hUBC-CreERT2 mice subjected to a tamoxifen-containing diet for 7 weeks.Representative images of TRF1 immunofluorescence and quantification of the percentage of TRF1-positive cells in skin and intestine sections of wild-type and Trf1lox/lox hUBC-CreERT2 mice subjected to a tamoxifen-containing diet for 7 weeks.Survival curve of wild-type and Trf1lox/lox hUBC-CreERT2 mice subjected to a tamoxifen-containing diet for 7 weeks.Quantification of the histological alterations observed in tamoxifen-treated Trf1lox/lox hUBC-CreERT2 mice and 4 months after tamoxifen retrieval compared to their wild-type counterparts.Quantification of blood cell populations in wild-type and Trf1lox/lox hUBC-CreERT2mice subjected to a tamoxifen-containing diet for 7 weeks and after 3 weeks and 4 months of tamoxifen retrieval.Trf1 expression levels in blood, intestine, skin, and bone marrow of Trf1lox/lox hUBC-CreERT2 mice subjected to a tamoxifen-containing diet either for 7 weeks or for 6 months and after 3 weeks tamoxifen retrieval compared to wild-type mice."}
{"words": ["Figure", "7Quantification", "of", "TRF1", "levels", "by", "immunofluorescence", "in", "lung", "tumor", "-", "derived", "cell", "line", "treated", "with", "DMSO", ",", "with", "10", "μM", "ETP", "-", "47228", "(", "24", "h", ")", ",", "and", "with", "10", "μM", "ETP", "-", "47037", "(", "48", "h", ")", ".", "Representative", "images", "are", "shown", "to", "the", "right", ".", "Quantification", "of", "γH2AX", "levels", "by", "immunofluorescence", "in", "lung", "tumor", "-", "derived", "cell", "line", "treated", "with", "DMSO", ",", "with", "ETP", "-", "47228", "(", "24", "h", ")", ",", "and", "with", "ETP", "-", "47037", "(", "48", "h", ")", ".", "Representative", "images", "are", "shown", "to", "the", "right", ".", "Quantification", "of", "telomere", "-", "induced", "foci", "(", "TIFs", ")", "by", "double", "immunofluorescence", "with", "anti", "-", "RAP1", "and", "anti", "-", "γH2AX", "antibodies", ".", "Representative", "images", "are", "shown", "to", "the", "right", ".", "White", "arrowheads", ":", "colocalization", "of", "γH2AX", "and", "RAP1", ".", "Effect", "of", "different", "ETP", "-", "47228", "and", "ETP", "-", "47037", "concentrations", "during", "24", "h", "on", "proliferation", "in", "lung", "tumor", "-", "derived", "cell", "line", "relative", "to", "the", "growth", "of", "DMSO", "-", "treated", "cells", ".", "Tumor", "growth", "quantification", "in", "allograft", "model", "ETP", "-", "47037", "or", "with", "ETP", "-", "47228", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Quantification of TRF1 levels by immunofluorescence in lung tumor-derived cell line treated with DMSO, with 10 μM ETP-47228 (24 h), and with 10 μM ETP-47037 (48 h). Representative images are shown to the right.Quantification of γH2AX levels by immunofluorescence in lung tumor-derived cell line treated with DMSO, with ETP-47228 (24 h), and with ETP-47037 (48 h). Representative images are shown to the right.Quantification of telomere-induced foci (TIFs) by double immunofluorescence with anti-RAP1 and anti-γH2AX antibodies. Representative images are shown to the right. White arrowheads: colocalization of γH2AX and RAP1.Effect of different ETP-47228 and ETP-47037 concentrations during 24 h on proliferation in lung tumor-derived cell line relative to the growth of DMSO-treated cells.Tumor growth quantification in allograft model ETP-47037 or with ETP-47228."}
{"words": ["Figure", "8Quantification", "of", "tumor", "growth", "relative", "to", "initial", "tumor", "size", ".", "Representative", "CT", "images", "are", "shown", "to", "the", "right", ".", "The", "white", "arrowhead", "indicates", "a", "tumor", "within", "a", "highly", "inflammatory", "region", ".", "Quantification", "of", "TRF1", "levels", "by", "immunofluorescence", "in", "intestine", "and", "lung", "tumors", "samples", "of", "mice", "treated", "with", "vehicle", "or", "with", "ETP", "-", "47037", "for", "10", "days", ".", "Representative", "images", "are", "shown", "to", "the", "right", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Number", "of", "cells", "showing", "γH2AX", "foci", "in", "intestine", "and", "lung", "tumors", "samples", "of", "mice", "treated", "with", "vehicle", "or", "with", "ETP", "-", "47037", "for", "10", "days", ".", "Representative", "images", "are", "shown", "to", "the", "right", "(", "n", "=", "4", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8Quantification of tumor growth relative to initial tumor size. Representative CT images are shown to the right. The white arrowhead indicates a tumor within a highly inflammatory region.Quantification of TRF1 levels by immunofluorescence in intestine and lung tumors samples of mice treated with vehicle or with ETP-47037 for 10 days. Representative images are shown to the right (n = 4).Number of cells showing γH2AX foci in intestine and lung tumors samples of mice treated with vehicle or with ETP-47037 for 10 days. Representative images are shown to the right (n = 4)."}
{"words": ["Figure", "9A", "-", "C", "Quantification", "of", "the", "number", "of", "(", "A", ")", "Ki67", "-", ",", "(", "B", ")", "pan", "-", "nuclear", "p", "-", "H3", "pattern", "-", ",", "and", "(", "C", ")", "foci", "p", "-", "H3", "pattern", "-", "positive", "cells", "in", "untreated", "and", "ETP", "-", "470037", "-", "treated", "lungcarcinomas", ".", "The", "data", "represent", "the", "mean", "values", "obtained", "for", "three", "mice", "in", "each", "group", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "errors", ".", "D", "Representative", "Ki67", "and", "p", "-", "H3", "images", ".", "E", "Representative", "H", "&", "amp", ";", "amp", ";", "E", "images", "of", "intestine", "samples", "corresponding", "to", "untreated", "and", "ETP", "-", "47037", "-", "treated", "animals", ".", "High", "-", "magnification", "images", "are", "shown", "to", "the", "right", "indicating", "the", "presence", "of", "normal", "mitosis", ",", "giant", "multinucleated", "and", "aberrant", "mitotic", "figures", ".", "F", "Representative", "H", "&", "amp", ";", "amp", ";", "E", "images", "of", "bone", "marrow", "and", "skin", "samples", "corresponding", "to", "untreated", "and", "ETP", "-", "47037", "-", "treated", "animals", ".", "High", "-", "magnification", "images", "are", "shown", "indicating", "the", "presence", "of", "necrosis", ",", "hemosiderosis", ",", "multinucleated", "cells", ",", "and", "giant", "nuclei", ".", "Bone", "marrow", "showed", "moderated", "aplasia", ".", "G", "Telomere", "length", "in", "untreated", "and", "ETP", "-", "47037", "-", "treated", "lung", "tumor", "samples", ".", "Representative", "images", "are", "shown", "to", "the", "right", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 9A-C Quantification of the number of (A) Ki67-, (B) pan-nuclear p-H3 pattern-, and (C) foci p-H3 pattern-positive cells in untreated and ETP-470037-treated lungcarcinomas. The data represent the mean values obtained for three mice in each group. Error bars represent standard errors.D Representative Ki67 and p-H3 images.E Representative H&amp;amp;E images of intestine samples corresponding to untreated and ETP-47037-treated animals. High-magnification images are shown to the right indicating the presence of normal mitosis, giant multinucleated and aberrant mitotic figures.F Representative H&amp;amp;E images of bone marrow and skin samples corresponding to untreated and ETP-47037-treated animals. High-magnification images are shown indicating the presence of necrosis, hemosiderosis, multinucleated cells, and giant nuclei. Bone marrow showed moderated aplasia.G Telomere length in untreated and ETP-47037-treated lung tumor samples. Representative images are shown to the right."}
{"words": ["Figure", "1A", "Location", "of", "missense", "variants", "of", "PDIA1", "and", "ERp57", "identified", "in", "ALS", "cases", ".", "PDI", "primary", "structure", ":", "catalytic", "a", "and", "a", "'", "domains", "containing", "the", "active", "site", "motif", "CXXC", "sequence", "(", "dark", "purple", "and", "dark", "green", ")", ",", "non", "-", "catalytic", "domains", "b", "and", "b", "'", "containing", "ligand", "binding", "sites", "(", "light", "purple", "and", "light", "green", ")", ",", "and", "x", "-", "linker", "region", "(", "light", "gray", ")", ".", "The", "constructs", "used", "in", "this", "study", "contained", "a", "V5", "-", "tag", "(", "orange", ")", "at", "the", "C", "-", "terminus", "that", "was", "inserted", "previous", "to", "the", "ER", "-", "retention", "signal", "(", "dark", "gray", ")", ".", "B", "Expression", "of", "PDI", "variants", "in", "zebrafish", ".", "Zebrafish", "embryos", "at", "1", "-", "2", "cell", "stage", "were", "injected", "with", "sense", "mRNA", "coding", "for", "the", "indicated", "PDIs", "(", "PDIA1WT", ",", "PDIA1D292N", "and", "PDIA1R300H", ":", "200", "pg", "/", "embryo", ";", "ERp57WT", ",", "ERp57D217N", "and", "ERp57Q481K", ":", "80", "pg", "/", "embryo", ")", ".", "Protein", "expression", "was", "confirmed", "by", "Western", "blot", "analysis", "using", "anti", "-", "V5", "antibody", "in", "total", "embryo", "extracts", "at", "24", "h", "post", "-", "fertilization", "(", "hpf", ")", ".", "Actin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "In", "the", "left", "panel", "80", "µg", "protein", "and", "in", "the", "right", "panel", "120", "µg", "protein", "extract", "were", "used", ".", "C", "and", "D", ",", "Motoneuron", "defects", "induced", "in", "zebrafish", "embryos", "after", "expression", "of", "the", "indicated", "ALS", "-", "linked", "PDI", "mutants", "and", "wild", "-", "type", "controls", "(", "PDIA1WT", "and", "PDIA1R300H", ":", "80", "pg", "mRNA", "/", "embryo", ";", "ERp57WT", ",", "ERp57D217N", ",", "ERp57D217N", "and", "ERp57Q481K", ":", "30", "pgtba", "mRNA", "/", "embryo", ")", ".", "The", "most", "frequent", "global", "phenotypes", "induced", "by", "PDI", "injection", "are", "shown", "in", "lateral", "views", "of", "embryos", "at", "24", "hpf", "(", "left", "column", ")", ".", "Black", "arrows", "indicate", "the", "presence", "of", "curly", "tail", "and", "/", "or", "shorter", "axis", "phenotypes", "(", "see", "details", "in", "Appendix", "Table", "S1", ")", ".", "Axon", "motoneuron", "morphology", "was", "visualized", "using", "confocal", "microscopy", "in", "lateral", "views", "of", "the", "trunk", "region", "in", "transgenic", "Tg", "(", "Huc", ":", "Kaede", ")", "zebrafish", "at", "36", "hpf", "(", "middle", "and", "right", "columns", ")", ".", "Images", "in", "the", "right", "column", "correspond", "to", "magnification", "views", "of", "the", "rectangular", "regions", "depicted", "in", "left", "and", "middle", "columns", ".", "Asterisks", "and", "arrows", "point", "to", "examples", "of", "increased", "axonal", "branching", "and", "reduced", "axonal", "length", ",", "respectively", ".", "C", "and", "D", ",", "Motoneuron", "defects", "induced", "in", "zebrafishembryos", "after", "expression", "of", "the", "indicated", "ALS", "-", "linked", "PDI", "mutants", "and", "wild", "-", "type", "controls", "(", "PDIA1WT", "and", "PDIA1R300H", ":", "80", "pg", "mRNA", "/", "embryo", ";", "ERp57WT", ",", "ERp57D217N", ",", "ERp57D217N", "and", "ERp57Q481K", ":", "30", "pgtba", "mRNA", "/", "embryo", ")", ".", "The", "most", "frequent", "global", "phenotypes", "induced", "by", "PDI", "injection", "are", "shown", "in", "lateral", "views", "of", "embryos", "at", "24", "hpf", "(", "left", "column", ")", ".", "Black", "arrows", "indicate", "the", "presence", "of", "curly", "tail", "and", "/", "or", "shorter", "axis", "phenotypes", "(", "see", "details", "in", "Appendix", "Table", "S1", ")", ".", "Axonmotoneuronmorphology", "was", "visualized", "using", "confocalmicroscopy", "in", "lateral", "views", "of", "the", "trunk", "region", "in", "transgenic", "Tg", "(", "Huc", ":", "Kaede", ")", "zebrafish", "at", "36", "hpf", "(", "middle", "and", "right", "columns", ")", ".", "Images", "in", "the", "right", "column", "correspond", "to", "magnification", "views", "of", "the", "rectangular", "regions", "depicted", "in", "left", "and", "middle", "columns", ".", "Asterisks", "and", "arrows", "point", "to", "examples", "of", "increased", "axonal", "branching", "and", "reduced", "axonal", "length", ",", "respectively", ".", "E", "and", "F", "Quantification", "of", "motoneuron", "axon", "length", "and", "axon", "branching", "in", "36hpf", "Tg", "(", "Huc", ":", "Kaede", ")", "embryos", "injected", "with", "the", "indicated", "PDIA1", "(", "D", ")", "and", "ERp57", "(", "E", ")", "mutants", ".", "E", "and", "F", "Quantification", "of", "motoneuron", "axon", "length", "and", "axon", "branching", "in", "36hpf", "Tg", "(", "Huc", ":", "Kaede", ")", "embryos", "injected", "with", "the", "indicated", "PDIA1", "(", "D", ")", "and", "ERp57", "(", "E", ")", "mutants", ".", "G", "Touch", "-", "evoked", "escape", "responses", "of", "48", "hpf", "zebrafish", "embryos", "injected", "with", "ALS", "-", "linked", "PDI", "mutants", "(", "Kabashi", "et", "al", ",", "2011", ";", "Kabashi", "et", "al", ",", "2009", ")", ".", "The", "number", "of", "touches", "necessary", "to", "evoke", "an", "escape", "response", "(", "top", ")", "and", "speed", "(", "bottom", ",", "in", "mm", "/", "s", ")", "of", "the", "escape", "response", "was", "determined", "for", "each", "condition", ".", "The", "total", "number", "of", "analyzed", "embryos", "is", "indicated", "in", "parenthesis", ".", "Experiments", "of", "D", "-", "F", "were", "performed", "in", "selected", "animals", "sharing", "normal", "overall", "embryo", "morphology", "and", "viability", ",", "to", "avoid", "unspecific", "effects", "of", "axial", "shortening", "or", "curvature", "in", "motoneuron", "morphology", "and", "/", "or", "animal", "behavior", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Bonferroni", "´", "s", "post", "hoc", "tests", ".", "Mean", "±", "SEM", "with", "only", "statistically", "significant", "p", "values", "are", "shown", ":", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "001", ".", "Abbreviations", ":", "A", "(", "anterior", ")", ",", "D", "(", "dorsal", ")", ",", "P", "(", "posterior", ")", ",", "V", "(", "ventral", ")", ".", "Scale", "bars", "represent", "500", "m", "(", "C", "and", "D", ":", "a", ",", "d", ".", "g", ",", "j", ")", ",", "200", "m", "(", "C", "and", "D", ":", "b", ",", "e", ",", "h", ",", "k", ")", ",", "100", "m", "(", "C", "and", "D", ":", "c", ",", "f", ",", "i", ",", "l", ")", ",", "and", "25", "µm", "(", "G", "-", "H", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A Location of missense variants of PDIA1 and ERp57 identified in ALS cases. PDI primary structure: catalytic a and a' domains containing the active site motif CXXC sequence (dark purple and dark green), non-catalytic domains b and b' containing ligand binding sites (light purple and light green), and x-linker region (light gray). The constructs used in this study contained a V5-tag (orange) at the C-terminus that was inserted previous to the ER-retention signal (dark gray).B Expression of PDI variants in zebrafish. Zebrafish embryos at 1-2 cell stage were injected with sense mRNA coding for the indicated PDIs (PDIA1WT, PDIA1D292N and PDIA1R300H: 200 pg/embryo; ERp57WT, ERp57D217N and ERp57Q481K: 80 pg/embryo). Protein expression was confirmed by Western blot analysis using anti-V5 antibody in total embryo extracts at 24 h post-fertilization (hpf). Actin was used as a loading control. In the left panel 80 µg protein and in the right panel 120 µg protein extract were used.C and D, Motoneuron defects induced in zebrafish embryos after expression of the indicated ALS-linked PDI mutants and wild-type controls (PDIA1WT and PDIA1R300H: 80 pg mRNA/embryo; ERp57WT, ERp57D217N, ERp57D217N and ERp57Q481K: 30 pgtba mRNA/embryo). The most frequent global phenotypes induced by PDI injection are shown in lateral views of embryos at 24 hpf (left column). Black arrows indicate the presence of curly tail and/or shorter axis phenotypes (see details in Appendix Table S1). Axon motoneuron morphology was visualized using confocal microscopy in lateral views of the trunk region in transgenic Tg(Huc:Kaede) zebrafish at 36 hpf (middle and right columns). Images in the right column correspond to magnification views of the rectangular regions depicted in left and middle columns. Asterisks and arrows point to examples of increased axonal branching and reduced axonal length, respectively.C and D, Motoneuron defects induced in zebrafishembryos after expression of the indicated ALS-linked PDI mutants and wild-type controls (PDIA1WT and PDIA1R300H: 80 pg mRNA/embryo; ERp57WT, ERp57D217N, ERp57D217N and ERp57Q481K: 30 pgtba mRNA/embryo). The most frequent global phenotypes induced by PDI injection are shown in lateral views of embryos at 24 hpf (left column). Black arrows indicate the presence of curly tail and/or shorter axis phenotypes (see details in Appendix Table S1). Axonmotoneuronmorphology was visualized using confocalmicroscopy in lateral views of the trunk region in transgenic Tg(Huc:Kaede) zebrafish at 36 hpf (middle and right columns). Images in the right column correspond to magnification views of the rectangular regions depicted in left and middle columns. Asterisks and arrows point to examples of increased axonal branching and reduced axonal length, respectively.E and F Quantification of motoneuron axon length and axon branching in 36hpf Tg(Huc:Kaede) embryos injected with the indicated PDIA1 (D) and ERp57 (E) mutants.E and F Quantification of motoneuron axon length and axon branching in 36hpf Tg(Huc:Kaede) embryos injected with the indicated PDIA1 (D) and ERp57 (E) mutants.G Touch-evoked escape responses of 48 hpf zebrafish embryos injected with ALS-linked PDI mutants (Kabashi et al, 2011; Kabashi et al, 2009). The number of touches necessary to evoke an escape response (top) and speed (bottom, in mm/s) of the escape response was determined for each condition. The total number of analyzed embryos is indicated in parenthesis. Experiments of D-F were performed in selected animals sharing normal overall embryo morphology and viability, to avoid unspecific effects of axial shortening or curvature in motoneuron morphology and/or animal behavior. Statistical analyses were performed using one-way ANOVA and Bonferroni´s post hoc tests. Mean ± SEM with only statistically significant p values are shown: *, p ≤ 0.05; **, p ≤ 0.01; ***, p ≤ 0.001. Abbreviations: A (anterior), D (dorsal), P (posterior), V (ventral). Scale bars represent 500 m (C and D: a,d.g,j), 200 m (C and D: b,e,h,k), 100 m (C and D: c,f,i,l), and 25 µm (G-H)."}
{"words": ["Figure", "2A", "NSC34cells", "were", "transiently", "transfected", "with", "expression", "vectors", "for", "V5", "-", "tagged", "wild", "-", "type", "and", "mutant", "PDIs", ".", "After", "48", "h", ",", "overexpressed", "PDI", "variants", "was", "assessed", "under", "reducing", "conditions", "in", "an", "8", "%", "SDS", "-", "PAGE", ".", "An", "antibody", "detecting", "total", "PDIA1", "(", "endogenous", "mousePDIA1", "and", "exogenous", "humanV5", "-", "tagged", "PDIA1", ")", "(", "first", "panel", ")", ".", "A", "second", "antibody", "detects", "only", "humanPDIA1", ",", "therefore", "only", "V5", "-", "tagged", "PDIA1", "appears", "(", "second", "panel", ")", ".", "A", "mouse", "and", "human", "specific", "antibody", "was", "used", "to", "detect", "total", "ERp57", "(", "third", "panel", ")", ".", "Anti", "-", "V5", "was", "used", "to", "detect", "the", "exogenous", "PDI", "variants", ".", "Anti", "-", "β", "-", "actin", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "B", "and", "C", "NSC34", "cells", "were", "transiently", "transfected", "with", "the", "indicated", "PDIs", "constructs", "together", "with", "a", "GFP", "expression", "plasmid", ".", "Cell", "were", "then", "differentiated", "for", "24", "h", "in", "Neurobasal", "medium", "containing", "B27", "supplement", "to", "induce", "cell", "differentiation", ".", "Increased", "neurite", "outgrowth", "is", "indicated", "with", "white", "arrow", "heads", ".", "B", "Quantification", "of", "the", "average", "primary", "neurite", "lengths", "was", "performed", ",", "all", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", "were", "compiled", ".", "A", "minimum", "of", "100", "cells", "per", "experiment", "was", "analyzed", ".", "In", "addition", ",", "C", "the", "percentage", "of", "cells", "with", "neurites", "was", "quantified", "in", "the", "three", "independent", "experiments", "(", "right", "panel", ")", ".", "B", "and", "C", "NSC34", "cells", "were", "transiently", "transfected", "with", "the", "indicated", "PDIs", "constructs", "together", "with", "a", "GFP", "expression", "plasmid", ".", "Cell", "were", "then", "differentiated", "for", "24", "h", "in", "Neurobasal", "medium", "containing", "B27", "supplement", "to", "induce", "cell", "differentiation", ".", "Increased", "neurite", "outgrowth", "is", "indicated", "with", "white", "arrow", "heads", ".", "B", "Quantification", "of", "the", "average", "primary", "neurite", "lengths", "was", "performed", ",", "all", "cells", "from", "three", "independent", "experiments", "were", "compiled", ".", "A", "minimum", "of", "100", "cells", "per", "experiment", "was", "analyzed", ".", "In", "addition", ",", "C", "the", "percentage", "of", "cells", "with", "neurites", "was", "quantified", "in", "the", "three", "independent", "experiments", "(", "right", "panel", ")", ".", "D", "Primary", "rat", "ventral", "spinal", "cordneurons", "were", "prepared", "and", "after", "4", "daysin", "vitro", "(", "DIV", ")", "transfected", "with", "GFP", "alone", "or", "together", "with", "the", "indicated", "PDIs", "constructs", ".", "Cells", "were", "fixed", "at", "10", "DIV", "and", "SMI32", "staining", "was", "performed", "to", "identify", "motoneurons", ".", "Images", "were", "taken", "and", "the", "total", "outgrowth", "of", "GFP", "and", "SMI32", "positive", "cells", "was", "quantified", ".", "Results", "are", "compiled", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "E", "Human", "motoneurons", "were", "differentiated", "from", "the", "human", "embryonic", "stem", "cell", "(", "ESC", ")", "HuESC", "3", "Hb9", ":", ":", "GFP", "line", ".", "Differentiated", "neurons", "were", "transduced", "with", "lentivirus", "expressing", "GFP", "alone", "or", "together", "with", "PDIs", "-", "expressing", "plasmids", ".", "Transduced", "cells", "were", "cultured", "for", "another", "10", "days", ".", "To", "identify", "motoneurons", "after", "lentiviral", "transduction", ",", "immunocytochemistry", "analyses", "were", "performed", ".", "Quantification", "of", "neurite", "outgrowth", "in", "the", "different", "experimental", "conditions", "of", "GFP", "and", "HB9", "positive", "neurons", "were", "obtained", ".", "Neurite", "number", "and", "assessment", "of", "the", "length", "of", "each", "neurite", "was", "performed", "in", "a", "similar", "manner", "as", "for", "primary", "rat", "motoneurons", "(", "see", "methods", ")", ".", "Four", "independent", "experiments", "were", "performed", ".", "F", "NSC34", "cell", "lines", "stably", "knocked", "down", "for", "PDIA1", "or", "ERp57", "were", "differentiated", "for", "24", "h", "in", "Neurobasal", "medium", "containing", "B27", "supplement", "to", "induce", "cell", "differentiation", ".", "The", "percentage", "of", "cells", "with", "neurites", "was", "quantified", "in", "the", "three", "independent", "experiments", ".", "A", "minimum", "of", "100", "cells", "per", "experiment", "was", "analyzed", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "and", "Bonferroni", "´", "s", "post", "hoc", "tests", ".", "Mean", "±", "SEM", "with", "only", "statistically", "significant", "p", "values", "are", "shown", ":", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "05", ";", "*", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", ",", "p", "≤", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A NSC34cells were transiently transfected with expression vectors for V5-tagged wild-type and mutant PDIs. After 48 h, overexpressed PDI variants was assessed under reducing conditions in an 8% SDS-PAGE. An antibody detecting total PDIA1 (endogenous mousePDIA1 and exogenous humanV5-tagged PDIA1) (first panel). A second antibody detects only humanPDIA1, therefore only V5-tagged PDIA1 appears (second panel). A mouse and human specific antibody was used to detect total ERp57 (third panel). Anti-V5 was used to detect the exogenous PDI variants. Anti-β-actin was used as a loading control.B and C NSC34 cells were transiently transfected with the indicated PDIs constructs together with a GFP expression plasmid. Cell were then differentiated for 24 h in Neurobasal medium containing B27 supplement to induce cell differentiation. Increased neurite outgrowth is indicated with white arrow heads. B Quantification of the average primary neurite lengths was performed, all cells from three independent experiments were compiled. A minimum of 100 cells per experiment was analyzed. In addition, C the percentage of cells with neurites was quantified in the three independent experiments (right panel).B and C NSC34 cells were transiently transfected with the indicated PDIs constructs together with a GFP expression plasmid. Cell were then differentiated for 24 h in Neurobasal medium containing B27 supplement to induce cell differentiation. Increased neurite outgrowth is indicated with white arrow heads. B Quantification of the average primary neurite lengths was performed, all cells from three independent experiments were compiled. A minimum of 100 cells per experiment was analyzed. In addition, C the percentage of cells with neurites was quantified in the three independent experiments (right panel).D Primary rat ventral spinal cordneurons were prepared and after 4 daysin vitro (DIV) transfected with GFP alone or together with the indicated PDIs constructs. Cells were fixed at 10 DIV and SMI32 staining was performed to identify motoneurons. Images were taken and the total outgrowth of GFP and SMI32 positive cells was quantified. Results are compiled from 3 independent experiments.E Human motoneurons were differentiated from the human embryonic stem cell (ESC) HuESC 3 Hb9::GFP line. Differentiated neurons were transduced with lentivirus expressing GFP alone or together with PDIs-expressing plasmids. Transduced cells were cultured for another 10 days. To identify motoneurons after lentiviral transduction, immunocytochemistry analyses were performed. Quantification of neurite outgrowth in the different experimental conditions of GFP and HB9 positive neurons were obtained. Neurite number and assessment of the length of each neurite was performed in a similar manner as for primary rat motoneurons (see methods). Four independent experiments were performed.F NSC34 cell lines stably knocked down for PDIA1 or ERp57 were differentiated for 24 h in Neurobasal medium containing B27 supplement to induce cell differentiation. The percentage of cells with neurites was quantified in the three independent experiments. A minimum of 100 cells per experiment was analyzed.Statistical analyses were performed using one-way ANOVA and Bonferroni´s post hoc tests. Mean ± SEM with only statistically significant p values are shown: *, p ≤ 0.05; **, p ≤ 0.01; ***, p ≤ 0.001."}
{"words": ["Figure", "3A", "PDI", "mutants", "form", "abnormal", "disulfide", "-", "dependent", "protein", "complexes", ".", "NSC34", "cells", "were", "transiently", "transfected", "with", "expression", "vectors", "for", "V5", "-", "tagged", "wild", "-", "type", "and", "mutant", "PDIA1", ".", "After", "48", "h", ",", "differential", "disulfide", "-", "dependent", "interactions", "/", "aggregations", "of", "overexpressed", "PDI", "variants", "was", "assessed", "under", "reducing", "(", "+", "DTT", ")", "and", "non", "-", "reducing", "(", "-", "DTT", ")", "conditions", "in", "an", "8", "%", "SDS", "-", "PAGE", ".", "Anti", "-", "V5", "was", "used", "for", "detection", "in", "Western", "blot", ".", "B", "Analysis", "of", "the", "PDIA1", "structure", "to", "model", "the", "effects", "of", "the", "R300H", "mutation", ".", "The", "close", "association", "between", "Arg300", "located", "to", "the", "b", "'", "domain", "of", "PDIA1", "with", "Trp396", "located", "to", "the", "a", "'", "domain", "adjacent", "to", "the", "active", "site", "motif", "CGHC", "(", "designated", "as", "AS", "in", "yellow", ")", "is", "shown", "in", "comparison", "to", "the", "mutated", "version", "of", "PDIA1R300H", "highlighting", "the", "same", "residues", ".", "A", "potential", "stabilization", "of", "the", "interaction", "between", "the", "b", "'", "and", "a", "'", "domain", "is", "shown", "that", "may", "be", "caused", "by", "the", "interaction", "of", "the", "imidazole", "rings", "of", "mutated", "His300", "with", "Trp396", ".", "C", "ALS", "-", "linked", "PDIA1", "variants", "were", "generated", "as", "recombinant", "proteins", "and", "then", "analyzed", "by", "circular", "dichroism", "(", "CD", ")", ".", "Averages", "for", "CD", "spectroscopic", "scans", "of", "PDIA1WT", "and", "mutants", "are", "shown", ".", "D", "Averages", "for", "CD", "spectroscopic", "thermal", "denaturation", "of", "recombinant", "PDIA1WT", "and", "mutants", ".", "E", "Representative", "electrophoresis", "analysis", "of", "Proteinase", "K", "-", "treated", "recombinant", "PDIA1", "variants", ".", "Mass", "spectrometric", "analysis", "of", "Proteinase", "K", "digested", "samples", "from", "total", "sample", "and", "from", "in", "gel", "trypsin", "digested", "protein", "samples", "(", "arrows", "indicate", "band", "1", "and", "band", "2", ")", "indicated", "differences", "in", "the", "removal", "of", "the", "x", "-", "linker", "region", ".", "Bottom", "panel", ":", "Ratios", "of", "band", "1", "to", "band", "2", "were", "quantified", "in", "4", "independent", "experiments", ".", "F", "Representative", "fluorescence", "spectra", "of", "recombinant", "PDIA1b", "'", "xWT", "fragments", "and", "the", "equivalent", "ALS", "-", "linked", "mutants", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "Ratios", "from", "the", "two", "peak", "areas", "and", "change", "compared", "to", "PDIA1", "b", "'", "xWT", ".", "Both", "mutants", "analyzed", "show", "a", "significant", "shift", "in", "peak", "position", "compared", "to", "wild", "-", "type", ",", "but", "in", "opposite", "directions", ",", "suggesting", "that", "PDIA1D292N", "shifts", "equilibrium", "towards", "the", "capped", "version", "(", "x", "region", "over", "the", "binding", "pocket", ")", "and", "the", "PDIA1R300H", "mutant", "towards", "the", "uncapped", "version", "(", "Nguyen", "et", "al", ",", "2008", ")", ".", "G", "The", "activity", "of", "recombinant", "PDIA1", "was", "measured", "in", "vitro", "using", "a", "BPTI", "refolding", "assay", "following", "by", "mass", "spectrometry", "analysis", ".", "The", "percentages", "of", "different", "BPTI", "species", "was", "calculated", "(", "6H", ",", "fully", "reduced", ";", "1S", ",", "one", "disulfide", "bond", ";", "2S", ",", "two", "disulfide", "bonds", ";", "3S", ",", "three", "disulfide", "bonds", ")", "at", "time", "point", "2", ".", "5", "min", "in", "four", "independent", "experiments", ".", "H", "Measurement", "of", "H2O2", "levels", "at", "the", "ER", "lumen", "of", "living", "NSC34", ".", "Left", "panel", ":", "Reduced", "PDIs", "can", "be", "oxidized", "by", "oxidized", "ERO1Lα", "that", "then", "transfers", "electrons", "to", "molecular", "oxygen", "(", "O2", ")", ",", "generating", "hydrogen", "peroxide", "(", "H2O2", ")", "as", "a", "product", "of", "PDIs", "activity", ".", "Right", "panel", ":", "NSC34", "cells", "were", "transiently", "co", "-", "transfected", "with", "ER", "luminal", "HyPer", "sensor", "and", "indicated", "PDIs", ".", "After", "48", "h", "the", "490", "/", "420", "nm", "fluorescence", "ratio", "was", "recorded", "for", "2", "min", "under", "basal", "conditions", ".", "Means", "and", "SEM", "derived", "from", "all", "cells", "per", "condition", "(", "n", "=", "55", "-", "74", ")", "monitored", "in", "four", "independent", "experiments", "are", "shown", ".", "I", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "expression", "vectors", "for", "V5", "-", "tagged", "wild", "-", "type", "and", "mutant", "PDIA1", ",", "as", "well", "as", "empty", "vector", ".", "After", "48", "h", ",", "V5", "-", "tagged", "proteins", "were", "immunoprecipitated", "and", "eluted", "with", "V5", "peptide", ".", "The", "interaction", "with", "endogenous", "ERO1Lα", "was", "analyzed", "by", "western", "blot", ".", "The", "inputs", "and", "elutions", "are", "shown", "as", "control", ".", "Right", "panel", ":", "Quantification", "of", "the", "degree", "of", "interaction", "is", "presented", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A PDI mutants form abnormal disulfide-dependent protein complexes. NSC34 cells were transiently transfected with expression vectors for V5-tagged wild-type and mutant PDIA1. After 48 h, differential disulfide-dependent interactions/aggregations of overexpressed PDI variants was assessed under reducing (+DTT) and non-reducing (-DTT) conditions in an 8% SDS-PAGE. Anti-V5 was used for detection in Western blot.B Analysis of the PDIA1 structure to model the effects of the R300H mutation. The close association between Arg300 located to the b' domain of PDIA1 with Trp396 located to the a' domain adjacent to the active site motif CGHC (designated as AS in yellow) is shown in comparison to the mutated version of PDIA1R300H highlighting the same residues. A potential stabilization of the interaction between the b' and a' domain is shown that may be caused by the interaction of the imidazole rings of mutated His300 with Trp396.C ALS-linked PDIA1 variants were generated as recombinant proteins and then analyzed by circular dichroism (CD). Averages for CD spectroscopic scans of PDIA1WT and mutants are shown.D Averages for CD spectroscopic thermal denaturation of recombinant PDIA1WT and mutants.E Representative electrophoresis analysis of Proteinase K-treated recombinant PDIA1 variants. Mass spectrometric analysis of Proteinase K digested samples from total sample and from in gel trypsin digested protein samples (arrows indicate band 1 and band 2) indicated differences in the removal of the x-linker region. Bottom panel: Ratios of band 1 to band 2 were quantified in 4 independent experiments.F Representative fluorescence spectra of recombinant PDIA1b'xWT fragments and the equivalent ALS-linked mutants (n=6). Ratios from the two peak areas and change compared to PDIA1 b'xWT. Both mutants analyzed show a significant shift in peak position compared to wild-type, but in opposite directions, suggesting that PDIA1D292N shifts equilibrium towards the capped version (x region over the binding pocket) and the PDIA1R300H mutant towards the uncapped version (Nguyen et al, 2008).G The activity of recombinant PDIA1 was measured in vitro using a BPTI refolding assay following by mass spectrometry analysis. The percentages of different BPTI species was calculated (6H, fully reduced; 1S, one disulfide bond; 2S, two disulfide bonds; 3S, three disulfide bonds) at time point 2.5 min in four independent experiments.H Measurement of H2O2 levels at the ER lumen of living NSC34. Left panel: Reduced PDIs can be oxidized by oxidized ERO1Lα that then transfers electrons to molecular oxygen (O2), generating hydrogen peroxide (H2O2) as a product of PDIs activity. Right panel: NSC34 cells were transiently co-transfected with ER luminal HyPer sensor and indicated PDIs. After 48 h the 490/420 nm fluorescence ratio was recorded for 2 min under basal conditions. Means and SEM derived from all cells per condition (n=55-74) monitored in four independent experiments are shown.I HEK293T cells were transfected with expression vectors for V5-tagged wild-type and mutant PDIA1, as well as empty vector. After 48 h, V5-tagged proteins were immunoprecipitated and eluted with V5 peptide. The interaction with endogenous ERO1Lα was analyzed by western blot. The inputs and elutions are shown as control. Right panel: Quantification of the degree of interaction is presented."}
{"words": ["Figure", "4A", "PDI", "mutants", "form", "abnormal", "disulfide", "-", "dependent", "protein", "complexes", ".", "NSC34", "cells", "were", "transiently", "transfected", "with", "expression", "vectors", "for", "V5", "-", "tagged", "wild", "-", "type", "and", "mutant", "ERp57", ".", "After", "48", "h", ",", "differential", "disulfide", "-", "dependent", "interactions", "/", "aggregations", "of", "overexpressed", "PDI", "variants", "was", "assessed", "under", "reducing", "(", "+", "DTT", ")", "and", "non", "-", "reducing", "(", "-", "DTT", ")", "conditions", "in", "an", "8", "%", "SDS", "-", "PAGE", ".", "Anti", "-", "V5", "was", "used", "for", "detection", "in", "Western", "blot", ".", "B", "ALS", "-", "linked", "ERp57", "variants", "were", "generated", "as", "recombinant", "proteins", "and", "then", "analyzed", "by", "circular", "dichroism", "(", "CD", ")", ".", "Averages", "for", "CD", "spectroscopic", "scans", "of", "recombinant", "ERp57WT", "and", "mutants", "are", "shown", ".", "C", "A", "thermal", "denaturation", "curve", "of", "ERp57WT", "and", "mutants", "was", "performed", ".", "D", "Representative", "electrophoresis", "of", "Proteinase", "K", "treated", "ERp57", "recombinant", "proteins", ".", "E", "Surface", "Plasmon", "Resonance", "was", "performed", "to", "monitor", "the", "affinity", "of", "recombinant", "ERp57", "for", "recombinant", "CRT", "P", "-", "domain", ".", "KD", "values", "are", "expressed", "as", "percentage", "of", "ERp57WT", ".", "Values", "are", "derived", "from", "four", "independent", "experiments", ".", "For", "absolute", "KD", "values", "please", "see", "Appendix", "Table", "S2", ".", "FHEK293T", "NSC34", "were", "transfected", "with", "expression", "vectors", "for", "V5", "-", "tagged", "wild", "-", "type", "and", "mutant", "ERp57", ",", "as", "well", "as", "empty", "vector", ".", "After", "48", "h", ",", "V5", "-", "tagged", "proteins", "were", "immunoprecipitated", "and", "eluted", "with", "V5", "peptide", ".", "The", "interaction", "with", "endogenous", "calnexin", "(", "CNX", ")", "and", "calreticulin", "(", "CRT", ")", "was", "analyzed", "by", "Western", "blot", ".", "The", "inputs", "and", "elutions", "are", "shown", ".", "Right", "panel", ":", "Quantification", "of", "the", "degree", "of", "interaction", "is", "presented", ".", "G", "The", "gain", "of", "an", "N", "-", "glycosylation", "site", "of", "ERp57D217N", "was", "predicted", "after", "the", "analysis", "of", "the", "protein", "sequence", "since", "the", "change", "of", "Asp217", "to", "an", "Asn", "creates", "the", "NXT", "/", "S", "consensus", "sequence", ".", "Neuro2a", "cells", "were", "transfected", "with", "expression", "vectors", "for", "V5", "-", "tagged", "wild", "-", "type", "and", "mutant", "ERp57", ",", "as", "well", "as", "empty", "vector", "and", "treated", "with", "1", "µg", "/", "ml", "tunicamycin", "(", "Tm", ")", "for", "20", "h", "to", "inhibit", "N", "-", "glycosylation", ".", "Alternatively", ",", "protein", "extracts", "were", "digested", "with", "PNGase", "F", "and", "the", "possible", "removal", "of", "the", "N", "-", "glycosylation", "was", "analyzed", "by", "Western", "blot", "using", "anti", "-", "V5", "antibody", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A PDI mutants form abnormal disulfide-dependent protein complexes. NSC34 cells were transiently transfected with expression vectors for V5-tagged wild-type and mutant ERp57. After 48 h, differential disulfide-dependent interactions/aggregations of overexpressed PDI variants was assessed under reducing (+DTT) and non-reducing (-DTT) conditions in an 8% SDS-PAGE. Anti-V5 was used for detection in Western blot.B ALS-linked ERp57 variants were generated as recombinant proteins and then analyzed by circular dichroism (CD). Averages for CD spectroscopic scans of recombinant ERp57WT and mutants are shown.C A thermal denaturation curve of ERp57WT and mutants was performed.D Representative electrophoresis of Proteinase K treated ERp57 recombinant proteins.E Surface Plasmon Resonance was performed to monitor the affinity of recombinant ERp57 for recombinant CRT P-domain. KD values are expressed as percentage of ERp57WT. Values are derived from four independent experiments. For absolute KD values please see Appendix Table S2.FHEK293T NSC34 were transfected with expression vectors for V5-tagged wild-type and mutant ERp57, as well as empty vector. After 48 h, V5-tagged proteins were immunoprecipitated and eluted with V5 peptide. The interaction with endogenous calnexin (CNX) and calreticulin (CRT) was analyzed by Western blot. The inputs and elutions are shown. Right panel: Quantification of the degree of interaction is presented.G The gain of an N-glycosylation site of ERp57D217N was predicted after the analysis of the protein sequence since the change of Asp217 to an Asn creates the NXT/S consensus sequence. Neuro2a cells were transfected with expression vectors for V5-tagged wild-type and mutant ERp57, as well as empty vector and treated with 1 µg/ml tunicamycin (Tm) for 20 h to inhibit N-glycosylation. Alternatively, protein extracts were digested with PNGase F and the possible removal of the N-glycosylation was analyzed by Western blot using anti-V5 antibody."}
{"words": ["Figure", "5A", "ERp57flox", "/", "flox", "mice", "were", "crossed", "with", "Nestin", "Cre", "transgenic", "mice", "to", "generate", "nervous", "system", "specific", "ERp57", "deficient", "animals", ".", "The", "levels", "of", "ERp57", "protein", "in", "the", "spinal", "cord", "were", "monitored", "by", "Western", "blot", ".", "ERp57WT", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "ERp57Nes", "+", "/", "-", "(", "n", "=", "5", ")", "and", "ERp57Nes", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "4", ")", "mice", ".", "HSP90", "levels", "were", "determined", "as", "a", "loading", "control", ".", "Right", "panel", ":", "Quantification", "of", "ERp57", "levels", "was", "performed", "relative", "to", "Hsp90", "levels", ".", "B", "Body", "weight", "measurements", "were", "performed", "for", "indicated", "time", "points", "in", "ERp57WT", "(", "n", "=", "50", ")", ",", "ERp57Nes", "+", "/", "-", "(", "n", "=", "32", ")", "and", "ERp57Nes", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "19", ")", "mice", ".", "C", "Rotarod", "performance", "was", "performed", "ERp57WT", "(", "n", "=", "20", ")", ",", "ERp57Nes", "+", "/", "-", "(", "n", "=", "15", ")", "and", "ERp57Nes", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "8", ")", "mice", ".", "D", "Hanging", "test", "performance", "was", "assessed", "in", "ERp57WT", "(", "n", "=", "41", ")", ",", "ERp57Nes", "+", "/", "-", "(", "n", "=", "32", ")", "and", "ERp57Nes", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "12", ")", "mice", ".", "E", "Kaplan", "-", "Meier", "survival", "curve", "for", "ERp57Nes", "-", "/", "-", "mice", "(", "N", "=", "19", ")", "that", "prematurely", "died", "or", "had", "to", "be", "sacrificed", "because", "of", "health", "reasons", "between", "the", "ages", "22", "and", "73", "days", ".", "Mean", "survival", "of", "this", "subgroup", "of", "animals", "was", "57", "days", ".", "ERp57WT", "(", "n", "=", "50", ")", "and", "ERp57Nes", "+", "/", "-", "(", "n", "=", "32", ")", "mice", "are", "shown", "as", "a", "reference", ".", "F", "Histological", "analysis", "of", "NeuN", "and", "GFAP", "staining", "was", "performed", "in", "spinal", "cord", "tissue", "from", "ERp57WT", "and", "ERp57Nes", "-", "/", "-", "mice", "in", "three", "animals", "per", "group", "using", "indirect", "immunofluorescence", ".", "The", "nucleus", "was", "stained", "with", "Hoechst", ".", "Representative", "images", "from", "one", "mouse", "per", "group", "are", "shown", ".", "Scale", "bar", ":", "50", "μm", ".", "G", "Stereological", "analysis", "of", "the", "spinal", "cord", "from", "ERp57WT", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "ERp57Nes", "+", "/", "-", "(", "n", "=", "4", ")", "and", "ERp57Nes", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "4", ")", "mice", ".", "Alternate", "series", "of", "sections", "from", "the", "spinal", "cord", "of", "the", "mice", "were", "either", "stained", "for", "Nissl", "(", "top", "row", "images", ")", "or", "processed", "for", "immunohistochemistry", "for", "the", "cholinergic", "cell", "marker", "Choline", "Acetyl", "Transferase", "(", "ChAT", ",", "bottom", "row", "images", ")", ".", "The", "nucleoli", "of", "the", "motoneurons", ",", "as", "stained", "in", "the", "Nissl", "series", ",", "were", "counted", "inside", "the", "motoneurons", "pools", "previously", "defined", "using", "the", "adjacent", "ChAT", "series", "(", "contours", "not", "shown", ")", ".", "Cell", "densities", "of", "the", "three", "genotypes", "are", "shown", "on", "the", "right", "plots", ".", "No", "significant", "differences", "were", "found", "between", "the", "genotypes", ".", "Scale", "bar", "represents", "200", "μm", "and", "50", "μm", "on", "large", "and", "inset", "images", ",", "respectively", ".", "H", "Representative", "images", "of", "the", "spinal", "cord", "myelination", "of", "ERp57WT", "and", "ERp57Nes", "-", "/", "-", "mice", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A ERp57flox/flox mice were crossed with Nestin Cre transgenic mice to generate nervous system specific ERp57 deficient animals. The levels of ERp57 protein in the spinal cord were monitored by Western blot. ERp57WT (n=4), ERp57Nes+/- (n=5) and ERp57Nes-/- (n=4) mice. HSP90 levels were determined as a loading control. Right panel: Quantification of ERp57 levels was performed relative to Hsp90 levels.B Body weight measurements were performed for indicated time points in ERp57WT (n=50), ERp57Nes+/- (n=32) and ERp57Nes-/- (n=19) mice.C Rotarod performance was performed ERp57WT (n=20), ERp57Nes+/- (n=15) and ERp57Nes-/- (n=8) mice.D Hanging test performance was assessed in ERp57WT (n=41), ERp57Nes+/- (n=32) and ERp57Nes-/- (n=12) mice.E Kaplan-Meier survival curve for ERp57Nes-/- mice (N = 19) that prematurely died or had to be sacrificed because of health reasons between the ages 22 and 73 days. Mean survival of this subgroup of animals was 57 days. ERp57WT (n=50) and ERp57Nes+/- (n=32) mice are shown as a reference.F Histological analysis of NeuN and GFAP staining was performed in spinal cord tissue from ERp57WT and ERp57Nes-/- mice in three animals per group using indirect immunofluorescence. The nucleus was stained with Hoechst. Representative images from one mouse per group are shown. Scale bar: 50 μm.G Stereological analysis of the spinal cord from ERp57WT (n = 4), ERp57Nes+/- (n = 4) and ERp57Nes-/- (n = 4) mice. Alternate series of sections from the spinal cord of the mice were either stained for Nissl (top row images) or processed for immunohistochemistry for the cholinergic cell marker Choline Acetyl Transferase (ChAT, bottom row images). The nucleoli of the motoneurons, as stained in the Nissl series, were counted inside the motoneurons pools previously defined using the adjacent ChAT series (contours not shown). Cell densities of the three genotypes are shown on the right plots. No significant differences were found between the genotypes. Scale bar represents 200 μm and 50 μm on large and inset images, respectively.H Representative images of the spinal cord myelination of ERp57WT and ERp57Nes-/- mice."}
{"words": ["Figure", "6A", "Representative", "EMG", "recordings", "of", "ERp57WT", "(", "n", "=", "16", ")", ",", "ERp57Nes", "-", "/", "+", "(", "n", "=", "12", ")", "and", "ERp57Nes", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "5", ")", "mice", "is", "presented", ".", "The", "presence", "of", "positive", "sharp", "waves", "(", "PSW", ")", "in", "ERp57Nes", "+", "/", "-", "and", "ERp57Nes", "-", "/", "-", "mice", "indicated", "muscle", "denervation", ".", "B", "Analysis", "of", "NMJ", "and", "muscle", "morphologies", "were", "performed", "from", "ERp57WT", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "ERp57Nes", "+", "/", "-", "(", "n", "=", "5", ")", "and", "ERp57Nes", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Quantifications", "of", "endplate", "width", ",", "measuring", "the", "most", "ventral", "region", "of", "the", "diaphragms", "every", "134", "µm", "considering", "both", "sides", "of", "the", "innervation", "profile", ".", "Twenty", "to", "forty", "measurements", "per", "diaphragm", "were", "obtained", "per", "animal", ".", "C", "Whole", "-", "mounted", "diaphragms", "from", "ERp57WT", "and", "ERp57Nes", "-", "/", "-", "mice", "were", "co", "-", "stained", "with", "anti", "-", "neurofilament", "(", "red", ")", "and", "α", "-", "BTX", "to", "reveal", "the", "postsynaptic", "densities", "(", "green", ")", ".", "3D", "reconstructions", "(", "lower", "panel", ")", "of", "higher", "magnification", ".", "ERp57WT", "NMJs", "are", "fully", "innervated", "pretzel", "-", "like", ",", "whereas", "ERp57Nes", "-", "/", "-", "NMJs", "display", "less", "complex", "postsynaptic", "densities", "and", "an", "incomplete", "or", "aberrantly", "distributed", "innervation", "pattern", "(", "Movies", "EV4", "-", "7", ")", ".", "D", "Representative", "3D", "reconstructions", "of", "z", "-", "stacks", "showing", "the", "five", "categories", "in", "which", "NMJs", "morphologies", "were", "grouped", ":", "Pretzel", ",", "fragmented", ",", "O", "shaped", ",", "C", "shaped", ",", "and", "dismantled", "NMJs", ".", "Histogram", "of", "the", "distribution", "frequency", "of", ">", "200", "different", "NMJ", "per", "animal", "is", "shown", ".", "E", "Quantitative", "morphometry", "of", ">", "60", "NMJs", "in", "the", "different", "genotypes", "analyzed", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A Representative EMG recordings of ERp57WT (n=16), ERp57Nes-/+ (n=12) and ERp57Nes-/- (n=5) mice is presented. The presence of positive sharp waves (PSW) in ERp57Nes+/- and ERp57Nes-/- mice indicated muscle denervation.B Analysis of NMJ and muscle morphologies were performed from ERp57WT (n=5), ERp57Nes+/- (n=5) and ERp57Nes-/- (n=4). Quantifications of endplate width, measuring the most ventral region of the diaphragms every 134 µm considering both sides of the innervation profile. Twenty to forty measurements per diaphragm were obtained per animal.C Whole-mounted diaphragms from ERp57WT and ERp57Nes-/- mice were co-stained with anti-neurofilament (red) and α-BTX to reveal the postsynaptic densities (green). 3D reconstructions (lower panel) of higher magnification. ERp57WT NMJs are fully innervated pretzel-like, whereas ERp57Nes-/- NMJs display less complex postsynaptic densities and an incomplete or aberrantly distributed innervation pattern (Movies EV4-7).D Representative 3D reconstructions of z-stacks showing the five categories in which NMJs morphologies were grouped: Pretzel, fragmented, O shaped, C shaped, and dismantled NMJs. Histogram of the distribution frequency of >200 different NMJ per animal is shown.E Quantitative morphometry of >60 NMJs in the different genotypes analyzed."}
{"words": ["Figure", "7A", "The", "levels", "of", "ERp57", "protein", "in", "the", "muscle", "were", "monitored", "by", "Western", "blot", ".", "ERp57WT", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "ERp57Nes", "+", "/", "-", "(", "n", "=", "5", ")", "and", "ERp57Nes", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "4", ")", "mice", ".", "HSP90", "was", "determined", "as", "loading", "control", ".", "B", "Tibialis", "anterior", "muscles", "from", "ERp57WT", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "ERp57Nes", "+", "/", "-", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "and", "ERp57Nes", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "4", ")", "mice", "were", "dissected", "and", "cryosectioned", "(", "20", "µm", ")", "for", "the", "analysis", "of", "several", "parameters", "of", "muscle", "physiology", ".", "Upper", "panel", ":", "hyaluronic", "acid", "(", "HA", ")", "staining", "was", "performed", "to", "assess", "the", "gross", "morphology", "of", "the", "muscle", ".", "Middle", "panel", ":", "Bismarck", "brown", "staining", "to", "monitor", "skeletal", "muscles", "fibrosis", ".", "Lower", "panel", ":", "Cryosections", "were", "then", "double", "stained", "with", "wheat", "germ", "agglutinin", "(", "WGA", ")", "to", "visualize", "plasmamembrane", "and", "nuclei", ".", "The", "absence", "of", "central", "nuclei", "in", "all", "genotypes", "suggests", "that", "ERp57", "deficiency", "does", "not", "affect", "degeneration", "/", "regeneration", "cycles", ".", "Images", "are", "representative", "of", "each", "genotype", "and", "where", "acquired", "in", "the", "same", "anatomical", "region", "of", "the", "TA", "muscles", ".", "C", "Tibialis", "anterior", "cryosections", "(", "20", "µm", ")", "from", "ERp57WT", ",", "ERp57Nes", "+", "/", "-", ",", "and", "ERp57Nes", "-", "/", "-", "mice", "were", "stained", "for", "NADH", "-", "TR", "activity", "to", "identify", "oxidative", "myofibers", "(", "upper", "panel", ")", ".", "Representative", "micrographs", "of", "transversal", "cryosections", "show", "variable", "proportions", "of", "light", ",", "intermediate", "and", "dark", "positive", "staining", "in", "the", "different", "genotypes", ":", "(", "middle", "panel", ")", "NADH", "-", "TR", "positive", "(", "slow", "-", "twitch", ")", "and", "negative", "(", "fast", "-", "twitch", ")", "myofibers", "were", "quantified", "as", "percentage", "of", "total", "for", "every", "genotype", "(", "lower", "panel", ")", "The", "mean", "diameter", "of", "slow", "-", "and", "fast", "-", "twitch", "muscle", "fibers", "was", "evaluated", "at", "the", "light", "microscope", "using", "the", "ImageJ", "software", ".", "Data", "represent", "the", "average", "±", "SEM", "of", ">", "300", "fibers", "per", "animal", ".", "Scale", "bars", "represent", "50", "m", "in", "B", "and", "C", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A The levels of ERp57 protein in the muscle were monitored by Western blot. ERp57WT (n = 4), ERp57Nes+/- (n = 5) and ERp57Nes-/- (n = 4) mice. HSP90 was determined as loading control.B Tibialis anterior muscles from ERp57WT (n = 5), ERp57Nes+/- (n = 5), and ERp57Nes-/- (n = 4) mice were dissected and cryosectioned (20 µm) for the analysis of several parameters of muscle physiology. Upper panel: hyaluronic acid (HA) staining was performed to assess the gross morphology of the muscle. Middle panel: Bismarck brown staining to monitor skeletal muscles fibrosis. Lower panel: Cryosections were then double stained with wheat germ agglutinin (WGA) to visualize plasmamembrane and nuclei. The absence of central nuclei in all genotypes suggests that ERp57 deficiency does not affect degeneration/regeneration cycles. Images are representative of each genotype and where acquired in the same anatomical region of the TA muscles.C Tibialis anterior cryosections (20 µm) from ERp57WT, ERp57Nes+/-, and ERp57Nes-/- mice were stained for NADH-TR activity to identify oxidative myofibers (upper panel). Representative micrographs of transversal cryosections show variable proportions of light, intermediate and dark positive staining in the different genotypes: (middle panel) NADH-TR positive (slow-twitch) and negative (fast-twitch) myofibers were quantified as percentage of total for every genotype (lower panel) The mean diameter of slow- and fast-twitch muscle fibers was evaluated at the light microscope using the ImageJ software. Data represent the average ± SEM of >300 fibers per animal.Scale bars represent 50 m in B and C."}
{"words": ["Figure", "8A", "The", "levels", "of", "synaptic", "proteins", "SV2", ",", "NMDAR2A", ",", "PSD95", "and", "Synaptophysin", "in", "the", "cortex", "were", "monitored", "by", "Western", "blot", ".", "ERp57WT", "(", "n", "=", "4", ")", ",", "ERp57Nes", "+", "/", "-", "(", "n", "=", "5", ")", "and", "ERp57Nes", "-", "/", "-", "(", "n", "=", "4", ")", "mice", ".", "HSP90", "and", "β", "-", "Actin", "were", "determined", "as", "loading", "controls", ".", "B", "Quantification", "of", "SV2", "monomer", "(", "left", "panel", ")", "and", "SV2", "high", "molecular", "weight", "species", "(", "right", "panel", ")", ".", "β", "-", "Actin", "was", "used", "as", "the", "reference", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8A The levels of synaptic proteins SV2, NMDAR2A, PSD95 and Synaptophysin in the cortex were monitored by Western blot. ERp57WT (n = 4), ERp57Nes+/- (n = 5) and ERp57Nes-/- (n = 4) mice. HSP90 and β-Actin were determined as loading controls.B Quantification of SV2 monomer (left panel) and SV2 high molecular weight species (right panel). β-Actin was used as the reference."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Tumor", "volume", "at", "the", "indicated", "time", "points", "after", "CT26", "cell", "transplant", "in", "mice", "treated", "or", "not", "with", "LPS", "n", "(", "number", "of", "animals", "per", "group", ")", "=", "6", ".", "(", "B", ")", "Tumor", "volume", "in", "mice", "depleted", "of", "DCs", "or", "NK", "cells", "before", "tumor", "cell", "transplant", "and", "LPS", "administration", "n", "(", "number", "of", "animals", "per", "group", ")", "=", "5", ".", "(", "C", ")", "Tumor", "volume", "in", "SCIDmice", "treated", "or", "not", "with", "LPS", "n", "(", "number", "of", "animals", "per", "group", ")", "=", "5", ".", "(", "D", ")", "Tumor", "volume", "at", "the", "indicated", "time", "point", "after", "repetitive", "LPS", "injections", "as", "depicted", "in", "the", "bottom", "scheme", "n", "(", "number", "of", "animals", "per", "group", ")", "=", "6", ".", "(", "E", ")", "Percent", "of", "NK", "cells", "within", "the", "tumor", "in", "mice", "treated", "or", "not", "with", "LPS", "and", "depleted", "or", "not", "of", "DCs", "n", "(", "number", "of", "animals", "per", "group", ")", "≥", "4", ".", "NT", ",", "control", ";", "DT", ",", "diphtheria", "toxin", "treated", "animals", "to", "deplete", "DCs", ";", "LPS", ",", "mice", "treated", "with", "LPS", ".", "Error", "bars", "depict", "SEM", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "with", "a", "two", "-", "tail", "t", "test", ".", "NT", ",", "untreated", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Tumor volume at the indicated time points after CT26 cell transplant in mice treated or not with LPS n (number of animals per group)=6.(B) Tumor volume in mice depleted of DCs or NK cells before tumor cell transplant and LPS administration n (number of animals per group)=5.(C) Tumor volume in SCIDmice treated or not with LPS n (number of animals per group)=5.(D) Tumor volume at the indicated time point after repetitive LPS injections as depicted in the bottom scheme n (number of animals per group)=6.(E) Percent of NK cells within the tumor in mice treated or not with LPS and depleted or not of DCs n (number of animals per group) ≥ 4. NT, control; DT, diphtheria toxin treated animals to deplete DCs; LPS, mice treated with LPS. Error bars depict SEM. Statistical significance was determined with a two-tail t test. NT, untreated."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Explanted", "tumors", "at", "Day", "12", "after", "repetitive", "injections", "of", "LPS", "as", "depicted", "in", "the", "scheme", "at", "the", "bottom", "of", "the", "panel", ".", "(", "B", ")", "Detection", "of", "blood", "vessels", "by", "immunohistochemistry", "using", "anti", "-", "CD31", "antibody", "(", "brown", "staining", ")", "in", "frozen", "sections", "of", "tumors", "from", "mice", "treated", "or", "not", "with", "with", "LPS", "as", "in", "the", "scheme", "in", "(", "A", ")", ".", "Nuclei", "are", "stained", "with", "hematoxylin", ".", "Two", "representative", "sections", "are", "shown", ",", "magnification", "20X", ".", "Left", "panel", "scale", "bars", ",", "500m", ";", "right", "panel", "scale", "bars", "100", "m", ".", "Quantification", "of", "vessel", "mean", "dimensions", "and", "area", "coverage", "by", "vessels", "is", "also", "shown", ".", "Three", "sections", "from", "three", "tumors", "have", "been", "analyzed", ".", "Error", "bars", "depict", "SEM", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "with", "a", "two", "-", "tail", "t", "test", ".", "NT", ",", "untreated", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Explanted tumors at Day 12 after repetitive injections of LPS as depicted in the scheme at the bottom of the panel.(B) Detection of blood vessels by immunohistochemistry using anti-CD31 antibody (brown staining) in frozen sections of tumors from mice treated or not with with LPS as in the scheme in (A). Nuclei are stained with hematoxylin. Two representative sections are shown, magnification 20X. Left panel scale bars, 500m; right panel scale bars 100 m. Quantification of vessel mean dimensions and area coverage by vessels is also shown. Three sections from three tumors have been analyzed. Error bars depict SEM. Statistical significance was determined with a two-tail t test. NT, untreated."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ",", "B", ")", "Absolute", "numbers", "of", "IFN", "-", "γ", "+", "and", "total", "NK", "cells", "in", "draining", "lymph", "nodes", "at", "the", "indicated", "time", "points", "before", "and", "after", "LPS", "administration", "in", "mice", "treated", "or", "not", "with", "FTY720", "(", "25g", "/", "mouse", ")", "to", "reduce", "the", "ingress", "of", "lymphocytes", "in", "the", "efferent", "lymphatics", ".", "(", "C", ")", "Tumor", "volume", "in", "mice", "treated", "or", "not", "with", "LPS", "and", "/", "or", "FTY720", "according", "to", "the", "scheme", ".", "(", "D", ")", "Percent", "of", "IFN", "-", "γ", "+", "NK", "cells", "within", "the", "tumor", "in", "mice", "treated", "or", "not", "with", "LPS", "and", "with", "FTY720", ".", "n", "(", "number", "of", "animals", "per", "group", ")", "=", "4", ".", "Error", "bars", "depict", "SEM", ".", "FTY", ":", "FTY720", ".", "Statistical", "significance", "was", "determined", "with", "a", "two", "-", "tail", "t", "test", ".", "NT", ",", "untreated", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A,B) Absolute numbers of IFN-γ+ and total NK cells in draining lymph nodes at the indicated time points before and after LPS administration in mice treated or not with FTY720 (25g/mouse) to reduce the ingress of lymphocytes in the efferent lymphatics.(C) Tumor volume in mice treated or not with LPS and/or FTY720 according to the scheme.(D) Percent of IFN-γ+ NK cells within the tumor in mice treated or not with LPS and with FTY720. n (number of animals per group)=4. Error bars depict SEM. FTY: FTY720. Statistical significance was determined with a two-tail t test. NT, untreated."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Absolute", "numbers", "of", "NK", "cells", "in", "one", "of", "the", "4", "draining", "lymph", "nodes", "in", "mice", "treated", "or", "not", "with", "the", "anti", "-", "CD62L", "antibody", "to", "inhibit", "NK", "cel", "ingress", "in", "the", "lymph", "node", "from", "blood", ".", "Where", "indicated", "mice", "were", "challenged", "with", "LPS", ".", "(", "B", ")", "Absolute", "numbers", "of", "IFN", "-", "γ", "+", "NK", "cells", "in", "one", "of", "the", "4", "draining", "lymph", "nodes", "before", "and", "after", "LPS", "administration", "in", "mice", "in", "which", "NK", "cell", "entry", "in", "the", "lymph", "node", "was", "blocked", "or", "not", "by", "anti", "-", "CD62L", "treatment", ".", "(", "C", ")", "(", "left", "panel", ")", "Absolute", "numbers", "of", "endogenous", "and", "adoptively", "transferred", "(", "CFSE", "+", ")", "NK", "cells", "in", "the", "draining", "and", "contralateral", "lymph", "node", "5", "hours", "after", "LPS", "administration", ";", "(", "right", "panel", ")", "percent", "of", "endogenous", "and", "adoptively", "transferred", "NK", "cells", "on", "total", "lymphocytes", "in", "the", "draining", "and", "contralateral", "lymph", "node", "5", "hours", "after", "LPS", "administration", ".", "(", "D", ")", "Flow", "cytometry", "analysis", "of", "LPS", "draining", "and", "contralateral", "lymph", "node", "from", "mice", "that", "received", "CFSE", "labeled", "cells", "at", "the", "moment", "of", "LPS", "administration", ".", "Lymph", "node", "cells", "were", "stained", "with", "anti", "-", "CD3", ",", "anti", "-", "DX5", "and", "anti", "-", "IFN", "-", "γ", "antibodies", "and", "the", "analysis", "performed", "on", "gated", "CD3", "-", "DX5high", "cells", ".", "One", "representative", "of", "4", "independent", "experiments", "is", "shown", ".", "(", "E", ")", "Tumor", "volume", "in", "mice", "treated", "or", "not", "with", "LPS", ",", "where", "indicated", "mice", "received", "anti", "-", "CD62L", "antibody", "12h", "before", "LPS", "treatment", ".", "(", "F", ")", "Percent", "of", "IFN", "-", "γ", "+", "NK", "cells", "within", "the", "tumor", "in", "mice", "treated", "or", "not", "with", "LPS", "and", "with", "the", "anti", "-", "CD62L", "antibody", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Absolute numbers of NK cells in one of the 4 draining lymph nodes in mice treated or not with the anti-CD62L antibody to inhibit NK cel ingress in the lymph node from blood. Where indicated mice were challenged with LPS.(B) Absolute numbers of IFN-γ+ NK cells in one of the 4 draining lymph nodes before and after LPS administration in mice in which NK cell entry in the lymph node was blocked or not by anti-CD62L treatment.(C) (left panel) Absolute numbers of endogenous and adoptively transferred (CFSE+) NK cells in the draining and contralateral lymph node 5 hours after LPS administration; (right panel) percent of endogenous and adoptively transferred NK cells on total lymphocytes in the draining and contralateral lymph node 5 hours after LPS administration.(D) Flow cytometry analysis of LPS draining and contralateral lymph node from mice that received CFSE labeled cells at the moment of LPS administration. Lymph node cells were stained with anti-CD3, anti-DX5 and anti-IFN-γ antibodies and the analysis performed on gated CD3-DX5high cells. One representative of 4 independent experiments is shown.(E) Tumor volume in mice treated or not with LPS, where indicated mice received anti-CD62L antibody 12h before LPS treatment.(F) Percent of IFN-γ+ NK cells within the tumor in mice treated or not with LPS and with the anti-CD62L antibody."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Representative", "image", "of", "an", "NK", "cell", "(", "red", ")", "interacting", "with", "four", "DCs", "(", "green", ")", ".", "(", "B", ",", "C", ",", "D", ")", "Plot", "of", "the", "confinement", "ratio", "(", "CR", ",", "black", "squares", ")", ",", "the", "normalized", "NK", "speed", "Vthr", "(", "ti", ")", "(", "red", "circles", ")", "and", "the", "digitalized", "NK", "-", "DC", "distance", ",", "DistD", "(", "ti", ")", "(", "green", "triangles", ")", "as", "a", "function", "of", "time", "for", "the", "NK", "cell", "reported", "in", "the", "image", ".", "The", "B", ",", "C", "and", "D", "panels", "correspond", "respectively", "to", "the", "interaction", "with", "the", "DC1", ",", "DC2", "and", "DC4", "displayed", "in", "(", "A", ")", ".", "For", "reference", "also", "the", "normalized", "distance", "Dist", "(", "ti", ")", "is", "reported", "in", "the", "plots", "(", "blue", "down", "triangles", ")", ".", "The", "time", "periods", "in", "which", "all", "the", "three", "conditions", "discussed", "in", "the", "text", "are", "fulfilled", "are", "marked", "with", "red", "striped", "rectangles", "in", "the", "plots", ".", "The", "green", "up", "-", "triangles", "indicate", "the", "parameter", "TonToff", "defined", "as", "TonToff", "=", "-", "1", "if", "Dist", "(", "ti", ")", "<", "d", "=", "25", "µm", "and", "TonToff", "=", "-", "1", "if", "Dist", "(", "ti", ")", "d", "and", "indicate", "the", "putative", "interactions", "according", "to", "a", "more", "simplified", "algorithm", "based", "on", "the", "DC", "-", "NK", "cell", "distance", "alone", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Representative image of an NK cell (red) interacting with four DCs (green). (B, C, D) Plot of the confinement ratio (CR, black squares), the normalized NK speed Vthr(ti) (red circles) and the digitalized NK-DC distance, DistD(ti) (green triangles) as a function of time for the NK cell reported in the image. The B, C and D panels correspond respectively to the interaction with the DC1, DC2 and DC4 displayed in (A). For reference also the normalized distance Dist(ti) is reported in the plots (blue down triangles). The time periods in which all the three conditions discussed in the text are fulfilled are marked with red striped rectangles in the plots. The green up-triangles indicate the parameter TonToff defined as TonToff = -1 if Dist(ti) < d = 25 µm and TonToff = -1 if Dist(ti) d and indicate the putative interactions according to a more simplified algorithm based on the DC-NK cell distance alone."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "NK", "and", "DC", "trajectories", "as", "they", "are", "tracked", "by", "Volocity", "software", "on", "the", "4D", "volumes", "collected", "in", "lymph", "nodes", "on", "the", "TPE", "microscope", ".", "The", "sequence", "of", "images", "shows", "the", "interaction", "between", "an", "NK", "cell", "(", "red", ")", "and", "a", "DC", "(", "green", ")", ".", "In", "the", "top", "panels", "the", "NK", "cell", "moves", "according", "to", "a", "directional", "random", "motion", "while", "in", "the", "lower", "left", "and", "middle", "panels", "the", "NK", "cell", "seems", "to", "recognize", "the", "DC", "and", "to", "go", "back", ".", "In", "the", "right", "lower", "panel", "the", "stable", "contact", "DC", "-", "NK", "cell", "is", "clearly", "visible", ".", "(", "B", ")", "Time", "duration", "of", "the", "DC", "-", "NK", "contacts", "in", "steady", "state", "(", "-", "LPS", ")", "and", "inflammatory", "(", "+", "LPS", ")", "conditions", ".", "Bars", "indicate", "the", "mean", "of", "the", "distribution", ".", "The", "percent", "of", "cells", "showing", "long", "interaction", "times", "(", "≥", "15", "min", ")", "are", "shown", ".", "(", "C", ")", "NK", "cell", "3D", "velocities", ".", "3D", "velocities", "of", "NK", "cells", "taking", "contacts", "with", "DCs", "before", "(", "black", ")", "and", "5", "h", "(", "green", ")", "after", "LPS", "treatment", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) NK and DC trajectories as they are tracked by Volocity software on the 4D volumes collected in lymph nodes on the TPE microscope. The sequence of images shows the interaction between an NK cell (red) and a DC (green). In the top panels the NK cell moves according to a directional random motion while in the lower left and middle panels the NK cell seems to recognize the DC and to go back. In the right lower panel the stable contact DC-NK cell is clearly visible. (B) Time duration of the DC-NK contacts in steady state (-LPS) and inflammatory (+LPS) conditions. Bars indicate the mean of the distribution. The percent of cells showing long interaction times (≥ 15 min) are shown. (C) NK cell 3D velocities. 3D velocities of NK cells taking contacts with DCs before (black) and 5 h (green) after LPS treatment."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Differential", "interference", "contrast", "images", "(", "left", "panels", ")", "and", "confocal", "microscopy", "analysis", "of", "IL", "-", "18", "(", "right", "panels", ")", "in", "a", "DC", "/", "NK", "cell", "conjugate", "after", "2", "hours", "of", "coculture", "in", "the", "presence", "of", "LPS", "and", "in", "unstimulated", "cells", "(", "NT", ")", ".", "Representative", "images", "from", "3", "experiments", "are", "shown", ",", "magnification", "63X", ".", "Scale", "bars", ",", "4", ".", "36", "m", ".", "(", "B", ")", "IFN", "-", "γ", "release", "by", "NK", "cells", "cultured", "in", "the", "presence", "of", "supernatants", "recovered", "from", "untreated", "DCs", "(", "untreated", ")", "or", "DCs", "treated", "O", "/", "N", "with", "LPS", "(", "LPS", ")", ".", "Where", "indicated", "IL", "-", "18", "was", "added", "to", "the", "cultures", ".", "(", "C", ")", "Cell", "-", "contact", "dependent", "activation", "of", "NK", "cells", "by", "DCs", "depends", "on", "IL", "-", "18", ".", "Unstimulated", "or", "LPS", "-", "activated", "DCs", "and", "NK", "cells", "were", "cocultured", "in", "the", "same", "wells", "(", "DC", "+", "NK", "+", "LPS", ")", "or", "separated", "by", "a", "porous", "membrane", "(", "(", "DC", "+", "LPS", ")", "/", "NK", ")", ".", "Where", "indicated", "IL", "-", "18", "was", "added", "to", "the", "transwells", "(", "(", "DCs", "+", "LPS", ")", "/", "(", "NK", "+", "IL", "-", "18", ")", ")", ".", "NK", "cells", "alone", "were", "also", "cultured", "in", "the", "presence", "of", "the", "three", "selected", "cytokines", ";", "IL", "-", "2", "and", "IFN", "-", "β", "in", "the", "upper", "chamber", "and", "NK", "cells", "and", "IL", "-", "18", "in", "the", "lower", "chamber", ".", "IFN", "-", "γ", "in", "the", "supernatant", "was", "then", "measured", "by", "ELISA", "after", "8", "hours", "of", "coculture", ".", "(", "B", ",", "C", ")", ".", "n", "(", "number", "of", "independent", "experiments", ")", "=", "3", ".", "Error", "bars", "depict", "SEM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Differential interference contrast images (left panels) and confocal microscopy analysis of IL-18 (right panels) in a DC/NK cell conjugate after 2 hours of coculture in the presence of LPS and in unstimulated cells (NT). Representative images from 3 experiments are shown, magnification 63X. Scale bars, 4.36 m.(B) IFN-γ release by NK cells cultured in the presence of supernatants recovered from untreated DCs (untreated) or DCs treated O/N with LPS (LPS). Where indicated IL-18 was added to the cultures.(C) Cell-contact dependent activation of NK cells by DCs depends on IL-18. Unstimulated or LPS-activated DCs and NK cells were cocultured in the same wells (DC + NK + LPS) or separated by a porous membrane ((DC+LPS)/NK). Where indicated IL-18 was added to the transwells ((DCs+LPS)/(NK+IL-18)). NK cells alone were also cultured in the presence of the three selected cytokines; IL-2 and IFN-β in the upper chamber and NK cells and IL-18 in the lower chamber. IFN-γ in the supernatant was then measured by ELISA after 8 hours of coculture. (B, C). n (number of independent experiments)=3. Error bars depict SEM."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "IFT22", "nucleotide", "-", "binding", "experiments", ".", "Fluorescence", "measurements", "using", "increasing", "amounts", "of", "TbIFT22", "and", "TbIFT22", "/", "74342", "-", "401", "/", "81397", "-", "450", "core", "complex", "incubated", "with", "mant", "-", "labeled", "GDP", "(", "mant", "-", "GDP", ")", "or", "non", "-", "hydrolysable", "GTP", "/", "ATP", "analogs", "(", "mant", "-", "GMPPNP", "/", "mant", "-", "AMPPNP", ")", ".", "The", "fluorescence", "intensity", "is", "plotted", "as", "a", "function", "of", "protein", "concentration", ".", "Data", "were", "fitted", "to", "a", "single", "-", "site", "binding", "equation", "for", "determination", "of", "the", "dissociation", "constant", "(", "Kd", ")", ".", "Kd", "values", "and", "standard", "deviations", "are", "calculated", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "D", ".", "Top", ":", "Cartoon", "representation", "of", "IFT22", "(", "grey", ")", "with", "positions", "of", "two", "nucleotide", "-", "binding", "mutants", "highlighted", ".", "GTP", "is", "shown", "in", "stick", "representation", "and", "Mg2", "+", "as", "a", "ball", ".", "D175", "(", "blue", ")", "is", "the", "unusual", "residue", "binding", "the", "guanine", "base", "while", "S19", "(", "pink", ")", "is", "a", "conserved", "residue", "required", "for", "coordination", "of", "the", "Mg2", "+", "cation", "and", "is", "commonly", "mutated", "to", "an", "asparagine", "to", "prevent", "nucleotide", "binding", ".", "Bottom", ":", "Nucleotide", "-", "binding", "experiments", "of", "IFT22", "nucleotide", "-", "binding", "mutants", "D175E", ",", "D175A", "and", "S19N", "with", "fluorescently", "labeled", "nucleotides", ".", "Only", "the", "S19N", "mutation", "(", "light", "pink", ")", "abolished", "IFT22", "nucleotide", "-", "binding", "ability", "completely", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. IFT22 nucleotide-binding experiments. Fluorescence measurements using increasing amounts of TbIFT22 and TbIFT22/74342-401/81397-450 core complex incubated with mant-labeled GDP (mant-GDP) or non-hydrolysable GTP / ATP analogs (mant-GMPPNP / mant-AMPPNP). The fluorescence intensity is plotted as a function of protein concentration. Data were fitted to a single-site binding equation for determination of the dissociation constant (Kd). Kd values and standard deviations are calculated from three independent experiments.D. Top: Cartoon representation of IFT22 (grey) with positions of two nucleotide-binding mutants highlighted. GTP is shown in stick representation and Mg2+ as a ball. D175 (blue) is the unusual residue binding the guanine base while S19 (pink) is a conserved residue required for coordination of the Mg2+ cation and is commonly mutated to an asparagine to prevent nucleotide binding. Bottom: Nucleotide-binding experiments of IFT22 nucleotide-binding mutants D175E, D175A and S19N with fluorescently labeled nucleotides. Only the S19N mutation (light pink) abolished IFT22 nucleotide-binding ability completely."}
{"words": ["Figure", "3C", ".", "SDS", "-", "PAGE", "gel", "of", "a", "Ni2", "+", "-", "NTA", "pulldown", "using", "His", "-", "tagged", "TbIFT22", "(", "WT", "and", "mutants", ")", "and", "untagged", "CrIFT25", "/", "27", "/", "74", "/", "81", ".", "WT", "TbIFT22", "is", "able", "to", "pull", "down", "the", "Cr", "tetrameric", "complex", ",", "thus", "forming", "a", "chimeric", "IFT", "-", "B1", "pentamer", ",", "while", "both", "the", "A86R", "and", "S19N", "mutant", "fail", "to", "bind", "the", "complex", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3C. SDS-PAGE gel of a Ni2+-NTA pulldown using His-tagged TbIFT22 (WT and mutants) and untagged CrIFT25/27/74/81. WT TbIFT22 is able to pull down the Cr tetrameric complex, thus forming a chimeric IFT-B1 pentamer, while both the A86R and S19N mutant fail to bind the complex."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "SDS", "-", "PAGE", "gel", "of", "a", "Ni2", "+", "-", "NTA", "pulldown", "using", "His", "-", "tagged", "IFT74342", "-", "401", "/", "81397", "-", "450", "and", "untagged", "IFT22", "(", "WT", "and", "mutants", ")", ".", "Pulldowns", "were", "done", "from", "cell", "lysates", "of", "co", "-", "expressed", "proteins", ".", "Lanes", "1", "-", "4", "show", "similar", "total", "expression", "levels", "of", "the", "different", "co", "-", "expressed", "constructs", "(", "input", "samples", ")", ".", "Lanes", "5", "-", "8", "show", "pulldown", "elutions", ".", "The", "IFT22S19N", "(", "inactive", "GTPase", "mutant", ")", "and", "the", "IFT22A86R", "mutant", "(", "IFT74", "/", "81", "-", "binding", "mutant", ")", "did", "not", "interact", "with", "the", "IFT74342", "-", "401", "/", "81397", "-", "450", "complex", "in", "the", "pull", "-", "down", "experiment", ".", "B", ".", "SDS", "-", "PAGE", "gel", "of", "a", "Ni2", "+", "-", "NTA", "pulldown", "using", "the", "His", "-", "tagged", "IFT7479", "-", "401", "/", "811", "-", "450", "and", "untagged", "IFT22", "(", "WT", "and", "mutants", ")", ".", "Pulldowns", "were", "done", "from", "cell", "lysates", "of", "co", "-", "expressed", "proteins", ".", "Lanes", "1", "-", "4", "show", "similar", "total", "expression", "levels", "of", "the", "different", "co", "-", "expressed", "constructs", "(", "input", "samples", ")", ".", "Lanes", "5", "-", "8", "show", "pulldown", "elutions", ".", "The", "IFT22S19N", "(", "inactive", "GTPase", "mutant", ")", "and", "the", "IFT22A86R", "mutant", "(", "IFT74", "/", "81", "-", "binding", "mutant", ")", "did", "not", "interact", "with", "the", "IFT7479", "-", "401", "/", "811", "-", "450", "complex", "in", "the", "pull", "-", "down", "experiment", ".", "C", ".", "SDS", "-", "PAGE", "gel", "of", "a", "Ni2", "+", "-", "NTA", "pull", "-", "down", "of", "full", "-", "length", "IFT25", "/", "27", "/", "74", "/", "81", "complex", "with", "His", "-", "tagged", "IFT22", "(", "WT", "and", "S19N", "mutant", ")", ".", "The", "nucleotide", "-", "binding", "deficient", "mutant", "IFT22S19N", "interacts", "with", "IFT25", "/", "27", "/", "74", "/", "81", "in", "the", "pull", "-", "down", "experiment", ".", "D", ".", "SDS", "-", "PAGE", "gel", "of", "a", "Ni2", "+", "-", "NTA", "pull", "-", "down", "of", "full", "-", "length", "IFT25", "/", "27", "/", "74", "/", "81", "complex", "with", "His", "-", "tagged", "IFT22", "(", "WT", "and", "A86R", "mutant", ")", ".", "The", "IFT74", "/", "81", "-", "binding", "mutant", "IFT22A86R", "fails", "to", "pull", "down", "the", "full", "-", "length", "tetrameric", "complex", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. SDS-PAGE gel of a Ni2+-NTA pulldown using His-tagged IFT74342-401/81397-450 and untagged IFT22 (WT and mutants). Pulldowns were done from cell lysates of co-expressed proteins. Lanes 1-4 show similar total expression levels of the different co-expressed constructs (input samples). Lanes 5-8 show pulldown elutions. The IFT22S19N (inactive GTPase mutant) and the IFT22A86R mutant (IFT74/81-binding mutant) did not interact with the IFT74342-401/81397-450 complex in the pull-down experiment.B. SDS-PAGE gel of a Ni2+-NTA pulldown using the His-tagged IFT7479-401/811-450 and untagged IFT22 (WT and mutants). Pulldowns were done from cell lysates of co-expressed proteins. Lanes 1-4 show similar total expression levels of the different co-expressed constructs (input samples). Lanes 5-8 show pulldown elutions. The IFT22S19N (inactive GTPase mutant) and the IFT22A86R mutant (IFT74/81-binding mutant) did not interact with the IFT7479-401/811-450 complex in the pull-down experiment.C. SDS-PAGE gel of a Ni2+-NTA pull-down of full-length IFT25/27/74/81 complex with His-tagged IFT22 (WT and S19N mutant). The nucleotide-binding deficient mutant IFT22S19N interacts with IFT25/27/74/81 in the pull-down experiment.D. SDS-PAGE gel of a Ni2+-NTA pull-down of full-length IFT25/27/74/81 complex with His-tagged IFT22 (WT and A86R mutant). The IFT74/81-binding mutant IFT22A86R fails to pull down the full-length tetrameric complex."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "the", "IFT22RNAi", "+", "GFP", ":", ":", "IFT22S19N", "cell", "line", "probed", "with", "the", "anti", "-", "IFT22", "antibody", "(", "bottom", ")", "and", "with", "an", "anti", "-", "paraflagellar", "rod", "(", "PFR", ")", "as", "loading", "control", "(", "top", ")", ".", "B", ".", "IFA", "of", "the", "indicated", "trypanosome", "cell", "lines", "using", "the", "mAb25", "(", "marker", "for", "the", "axoneme", ",", "left", "panels", ")", "and", "an", "anti", "-", "IFT172", "antibody", "(", "marker", "for", "IFT", ",", "right", "panels", ")", ".", "The", "top", "panels", "show", "the", "phase", "contrast", "images", "merged", "with", "DAPI", "(", "cyan", ")", "that", "stains", "nuclear", "and", "mitochondrial", "DNA", ".", "Scale", "bars", "correspond", "to", "5", "µm", ".", "C", ".", "Kymographs", "showing", "the", "movement", "of", "the", "GFP", ":", ":", "IFT22S19N", "in", "the", "presence", "(", "left", ")", "or", "the", "absence", "(", "right", ")", "of", "the", "IFT22", "endogenous", "protein", ".", "Note", "the", "improved", "signal", "-", "to", "-", "noise", "ratio", "in", "the", "absence", "of", "endogenous", "IFT22", ".", "P", "and", "D", "mark", "the", "proximal", "and", "distal", "ends", "of", "the", "flagellum", ",", "respectively", ".", "Scale", "bars", "are", "5", "seconds", "(", "time", ",", "vertical", ")", "and", "5", "µm", "(", "length", ",", "horizontal", ")", "D", ".", "Dot", "plot", "representation", "of", "flagellum", "length", "in", "the", "indicated", "cell", "lines", "and", "conditions", ".", "For", "each", "condition", ",", "100", "flagella", "were", "measured", "and", "statistical", "analysis", "was", "performed", "with", "the", "ANOVA", "test", ".", "Significant", "differences", "are", "indicated", "with", "a", "star", "(", "P", "<", "0", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. Western blot analysis of the IFT22RNAi+GFP::IFT22S19N cell line probed with the anti-IFT22 antibody (bottom) and with an anti-paraflagellar rod (PFR) as loading control (top).B. IFA of the indicated trypanosome cell lines using the mAb25 (marker for the axoneme, left panels) and an anti-IFT172 antibody (marker for IFT, right panels). The top panels show the phase contrast images merged with DAPI (cyan) that stains nuclear and mitochondrial DNA. Scale bars correspond to 5 µm.C. Kymographs showing the movement of the GFP::IFT22S19N in the presence (left) or the absence (right) of the IFT22 endogenous protein. Note the improved signal-to-noise ratio in the absence of endogenous IFT22. P and D mark the proximal and distal ends of the flagellum, respectively. Scale bars are 5 seconds (time, vertical) and 5 µm (length, horizontal)D. Dot plot representation of flagellum length in the indicated cell lines and conditions. For each condition, 100 flagella were measured and statistical analysis was performed with the ANOVA test. Significant differences are indicated with a star (P<0.0001"}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "the", "IFT22RNAi", "+", "GFP", ":", ":", "IFT22A86R", "cell", "line", "probed", "with", "the", "anti", "-", "IFT22", "antibody", "(", "bottom", ")", "and", "with", "an", "anti", "-", "BiP", "as", "loading", "control", "(", "top", ")", ".", "B", ".", "IFA", "with", "the", "indicated", "cell", "lines", "using", "the", "mAb25", "(", "marker", "for", "the", "axoneme", ",", "central", "panels", ")", "and", "an", "anti", "-", "IFT172", "antibody", "(", "marker", "for", "IFT", ",", "bottom", "panels", ")", ".", "The", "top", "panels", "show", "the", "phase", "contrast", "images", "merged", "with", "DAPI", "(", "cyan", ")", "that", "stains", "nuclear", "and", "mitochondrial", "DNA", ".", "The", "arrowheads", "indicate", "the", "presence", "of", "short", "flagella", "stained", "with", "the", "Mab25", "antibody", "in", "the", "IFT22RNAi", "cells", ".", "Scale", "bars", "correspond", "to", "5", "µm", ".", "C", ".", "Sections", "of", "IFT22RNAi", "+", "GFP", ":", ":", "IFT22rescue", "(", "top", "panels", ")", "or", "IFT22RNAi", "+", "GFP", ":", ":", "IFT22A86R", "cells", "(", "bottom", "panels", ")", "were", "analysed", "by", "transmission", "electron", "microscopy", ".", "Sections", "through", "the", "flagellar", "pocket", ",", "the", "transition", "zone", "and", "the", "flagellum", "are", "shown", ".", "Scale", "bars", "are", "500", "nm", "(", "flagellar", "pocket", "sections", ")", "or", "200", "nm", "(", "transition", "zone", "and", "flagellum", "sections", ")", ".", "The", "white", "arrow", "indicates", "an", "endocytic", "vesicle", "budding", "off", "the", "flagellar", "pocket", "whereas", "the", "black", "one", "points", "at", "an", "IFT", "train", ".", "(", "Axo", "=", "axoneme", ",", "TZ", "=", "transition", "zone", ",", "BB", "=", "basal", "body", ")"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A. Western blot analysis of the IFT22RNAi+GFP::IFT22A86R cell line probed with the anti-IFT22 antibody (bottom) and with an anti-BiP as loading control (top).B. IFA with the indicated cell lines using the mAb25 (marker for the axoneme, central panels) and an anti-IFT172 antibody (marker for IFT, bottom panels). The top panels show the phase contrast images merged with DAPI (cyan) that stains nuclear and mitochondrial DNA. The arrowheads indicate the presence of short flagella stained with the Mab25 antibody in the IFT22RNAi cells. Scale bars correspond to 5 µm.C. Sections of IFT22RNAi+GFP::IFT22rescue (top panels) or IFT22RNAi+GFP::IFT22A86R cells (bottom panels) were analysed by transmission electron microscopy. Sections through the flagellar pocket, the transition zone and the flagellum are shown. Scale bars are 500 nm (flagellar pocket sections) or 200 nm (transition zone and flagellum sections). The white arrow indicates an endocytic vesicle budding off the flagellar pocket whereas the black one points at an IFT train. (Axo = axoneme, TZ = transition zone, BB = basal body)"}
{"words": ["Figure", "2E", ".", "Naïve", "MCF7", "cells", "and", "MCF7aTT", "cells", "were", "exposed", "to", "the", "indicated", "stress", "conditions", "for", "3", "h", ",", "and", "cell", "viability", "was", "assessed", "by", "staining", "dead", "cells", "with", "trypan", "blue", ".", "The", "bar", "graphs", "represent", "the", "percentage", "of", "trypan", "blue", "excluding", "cells", ".", "(", "means", "+", "/", "-", "SD", ",", "n", "=", "3", ",", "numbers", "above", "bars", "indicate", "p", "values", "calculated", "with", "the", "two", "-", "stage", "linear", "step", "-", "up", "procedure", "of", "Benjamini", ",", "Krieger", "and", "Yekutieli", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2E. Naïve MCF7 cells and MCF7aTT cells were exposed to the indicated stress conditions for 3 h, and cell viability was assessed by staining dead cells with trypan blue. The bar graphs represent the percentage of trypan blue excluding cells. (means +/- SD, n = 3, numbers above bars indicate p values calculated with the two-stage linear step-up procedure of Benjamini, Krieger and Yekutieli)."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "Whole", "lysates", "of", "MCF7", "and", "MCF7aTT", "cells", "exposed", "to", "heat", "shock", "and", "/", "or", "proteasome", "(", "MG132", ",", "20", "μM", ",", "1h", ")", "and", "HSP70", "(", "VER", "-", "155008", ",", "50", "μM", ",", "1h", ")", "inhibitors", "were", "prepared", "as", "described", "in", "Materials", "and", "Methods", ".", "Total", "lysate", ",", "soluble", "fractions", "and", "insoluble", "fractions", "were", "stained", "by", "SYPRO", "Ruby", "(", "left", ")", "and", "quantified", "(", "right", ")", ".", "(", "means", "+", "/", "-", "SD", ",", "n", "=", "3", ",", "numbers", "above", "the", "bars", "indicate", "p", "values", "calculated", "with", "the", "two", "-", "stage", "linear", "step", "-", "up", "procedure", "of", "Benjamini", ",", "Krieger", "and", "Yekutieli", ")", ".", "C", ".", "The", "soluble", "and", "insoluble", "fractions", "shown", "in", "(", "A", ")", "were", "assayed", "for", "the", "level", "of", "K48", "-", "linked", "polyubiquitin", ",", "and", "polyubiquitylated", "proteins", "were", "quantified", "(", "blue", "line", "graph", ",", "means", "+", "/", "-", "SEM", ",", "n", "=", "4", ",", "numbers", "above", "the", "bars", "indicate", "p", "values", ")", ".", "The", "data", "for", "bulk", "protein", "obtained", "in", "(", "A", ")", "were", "overlaid", "onto", "the", "graph", "for", "comparison", "(", "red", "line", ",", "means", "+", "/", "-", "SEM", ",", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. Whole lysates of MCF7 and MCF7aTT cells exposed to heat shock and/or proteasome (MG132, 20 μM, 1h) and HSP70 (VER-155008, 50 μM, 1h) inhibitors were prepared as described in Materials and Methods. Total lysate, soluble fractions and insoluble fractions were stained by SYPRO Ruby (left) and quantified (right). (means +/- SD, n = 3, numbers above the bars indicate p values calculated with the two-stage linear step-up procedure of Benjamini, Krieger and Yekutieli).C. The soluble and insoluble fractions shown in (A) were assayed for the level of K48-linked polyubiquitin, and polyubiquitylated proteins were quantified (blue line graph, means +/- SEM, n = 4, numbers above the bars indicate p values). The data for bulk protein obtained in (A) were overlaid onto the graph for comparison (red line, means +/- SEM, n = 3)."}
{"words": ["Figure", "4B", ".", "The", "same", "experiment", "as", "described", "in", "(", "A", ")", "but", "with", "MCF7", "cells", "exposed", "to", "MG132", "(", "20", "μM", ",", "1", "h", ")", "or", "puromycin", "(", "100", "μg", "/", "ml", ",", "10", "min", ")", ".", "Means", "+", "/", "-", "SEM", ",", "n", "=", "2", ".", "C", ".", "Lysate", "from", "MCF7", "cells", "exposed", "to", "MG132", "(", "20", "μM", ",", "1", "h", ")", "or", "puromycin", "(", "100", "μg", "/", "ml", ",", "10", "min", ")", "as", "indicated", "were", "subjected", "to", "immunoprecipitation", "with", "anti", "-", "puromycin", "antibodies", ",", "followed", "by", "assaying", "for", "co", "-", "precipitation", "of", "K48", "-", "ubiquitylated", "proteins", ".", "Actin", "is", "shown", "as", "a", "reference", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B. The same experiment as described in (A) but with MCF7 cells exposed to MG132 (20 μM, 1 h) or puromycin (100 μg/ml, 10 min). Means +/- SEM, n = 2. C. Lysate from MCF7 cells exposed to MG132 (20 μM, 1 h) or puromycin (100 μg/ml, 10 min) as indicated were subjected to immunoprecipitation with anti-puromycin antibodies, followed by assaying for co-precipitation of K48-ubiquitylated proteins. Actin is shown as a reference. "}
{"words": ["Figure", "5B", ".", "Same", "experiment", "as", "in", "(", "A", ")", "with", "thermotolerant", "MCF7aTT", "cells", "incubated", "with", "the", "HSP70", "inhibitor", "VER", "-", "155008", "(", "50", "μM", ",", "1h", ")", "or", "MG132", "(", "20", "μM", ",", "1h", ")", ".", "The", "signal", "obtained", "for", "ribosomal", "protein", "RPS19", "and", "RPL7", "are", "shown", "for", "reference", ",", "documenting", "residual", "polysomes", "despite", "the", "flat", "UV", "trace", ".", "Right", "panels", "are", "quantifications", "of", "K48", "-", "ub", "(", "means", "+", "/", "-", "SEM", ",", "n", "=", "2", ")", ",", "black", "vertical", "lines", "indicate", "splicing", "of", "lanes", "that", "were", "run", "on", "different", "gels", "due", "to", "limitations", "in", "lane", "capacity", ".", "The", "bar", "graphs", "represent", "the", "P", "/", "M", "ratios", "(", "means", "+", "/", "-", "SD", ",", "n", "=", "3", ",", "numbers", "above", "bars", "indicate", "p", "values", "calculated", "with", "the", "two", "-", "stage", "linear", "step", "-", "up", "procedure", "of", "Benjamini", ",", "Krieger", "and", "Yekutieli", ")", ".", "C", ".", "Sucrose", "density", "gradient", "fractions", "described", "in", "(", "B", ")", "were", "assayed", "for", "partitioning", "of", "HSPA1", "and", "HSPH1", "by", "immunoblotting", ".", "HSPA1", "data", "were", "quantified", "in", "a", "line", "graph", "(", "means", "+", "/", "-", "SEM", ",", "n", "=", "4", ")", ".", "D", "D", ".", "Cell", "lysate", "was", "spun", "through", "a", "30", "%", "sucrose", "cushion", "to", "pellet", "polysomes", ".", "Nascent", "proteins", "were", "released", "from", "polysomes", "by", "dissociating", "80S", "ribosomes", "with", "EDTA", "(", "see", "Appendix", "Figures", "S3", ")", ".", "Soluble", "and", "insoluble", "fractions", "were", "prepared", "by", "centrifugation", "and", "assayed", "for", "the", "level", "of", "K48", "-", "linked", "polyubiquitin", ".", "The", "levels", "of", "K48", "-", "linked", "polyubiquitin", "were", "quantified", "(", "means", "+", "/", "-", "SD", ",", "n", "=", "3", ")", ".", "Immunoblots", "within", "black", "squares", "were", "run", "on", "the", "same", "gel", "but", "irrelevant", "lanes", "were", "removed", "as", "indicated", "by", "white", "lines", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5B. Same experiment as in (A) with thermotolerant MCF7aTT cells incubated with the HSP70 inhibitor VER-155008 (50 μM, 1h) or MG132 (20 μM, 1h). The signal obtained for ribosomal protein RPS19 and RPL7 are shown for reference, documenting residual polysomes despite the flat UV trace. Right panels are quantifications of K48-ub (means +/- SEM, n = 2), black vertical lines indicate splicing of lanes that were run on different gels due to limitations in lane capacity. The bar graphs represent the P/M ratios (means +/- SD, n = 3, numbers above bars indicate p values calculated with the two-stage linear step-up procedure of Benjamini, Krieger and Yekutieli). C. Sucrose density gradient fractions described in (B) were assayed for partitioning of HSPA1 and HSPH1 by immunoblotting. HSPA1 data were quantified in a line graph (means +/- SEM, n = 4). D D. Cell lysate was spun through a 30% sucrose cushion to pellet polysomes. Nascent proteins were released from polysomes by dissociating 80S ribosomes with EDTA (see Appendix Figures S3). Soluble and insoluble fractions were prepared by centrifugation and assayed for the level of K48-linked polyubiquitin. The levels of K48-linked polyubiquitin were quantified (means +/- SD, n = 3). Immunoblots within black squares were run on the same gel but irrelevant lanes were removed as indicated by white lines."}
{"words": ["Figure", "6D", ".", "Total", "cell", "lysates", "were", "prepared", "from", "naïve", "MCF7", "and", "thermoresistant", "MCF7aTT", "cells", ",", "and", "puromycin", "labeled", "peptides", "were", "pull", "down", "as", "illustrated", "in", "the", "scheme", ".", "Precipitates", "were", "assayed", "for", "the", "presence", "of", "K48", "-", "linked", "polyubiquitin", ",", "chaperones", ",", "and", "proteasome", "subunits", "by", "immunoblotting", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6D. Total cell lysates were prepared from naïve MCF7 and thermoresistant MCF7aTT cells, and puromycin labeled peptides were pull down as illustrated in the scheme. Precipitates were assayed for the presence of K48-linked polyubiquitin, chaperones, and proteasome subunits by immunoblotting."}
{"words": ["Figure", "7E", ".", "Whole", "lysates", "of", "cells", "KYSE150", "and", "KYSE150HSPH1", "-", "/", "-", "cells", "exposed", "to", "the", "indicated", "temperature", "conditions", "(", "aTT", "scheme", "and", "heat", "shock", ")", "were", "fractionated", "into", "soluble", "and", "insoluble", "fractions", "as", "described", "in", "Materials", "and", "Methods", ".", "Insoluble", "fractions", "were", "assayed", "for", "the", "level", "of", "K48", "-", "linked", "polyubiquitin", "(", "left", "panel", ")", ".", "Total", "levels", "of", "HSPA1", "and", "HSPH1", "are", "shown", "for", "reference", ".", "K48", "ubiquitin", "signals", "were", "quantified", "and", "displayed", "in", "a", "bar", "graph", "(", "means", "+", "/", "-", "SD", ",", "n", "=", "4", ")", ".", "F", ".", "Lysates", "of", "cells", "KYSE150", "and", "KYSE150HSPH1", "-", "/", "-", "cells", "exposed", "to", "the", "indicated", "temperature", "conditions", "(", "aTT", "scheme", "and", "heat", "shock", ")", "were", "obtained", "and", "polysomes", "were", "isolated", "by", "centrifugation", "through", "a", "30", "%", "sucrose", "cushion", ".", "Whole", "cell", "lysates", "(", "left", "panel", ")", "and", "the", "polysomal", "pellets", "(", "right", "panel", ")", "were", "assayed", "by", "immunoblotting", "for", "the", "levels", "of", "HSPH1", ",", "HSPA1", "and", "proteasome", "subunits", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7E. Whole lysates of cells KYSE150 and KYSE150HSPH1-/- cells exposed to the indicated temperature conditions (aTT scheme and heat shock) were fractionated into soluble and insoluble fractions as described in Materials and Methods. Insoluble fractions were assayed for the level of K48-linked polyubiquitin (left panel). Total levels of HSPA1 and HSPH1 are shown for reference. K48 ubiquitin signals were quantified and displayed in a bar graph (means +/- SD, n = 4).F. Lysates of cells KYSE150 and KYSE150HSPH1-/- cells exposed to the indicated temperature conditions (aTT scheme and heat shock) were obtained and polysomes were isolated by centrifugation through a 30% sucrose cushion. Whole cell lysates (left panel) and the polysomal pellets (right panel) were assayed by immunoblotting for the levels of HSPH1, HSPA1 and proteasome subunits."}
{"words": ["Figure", "8A", ".", "Representative", "micrographs", "of", "tissue", "sections", "derived", "from", "oral", "squamous", "cell", "carcinomas", "(", "OSCC", ")", "and", "esophageal", "squamous", "cell", "carcinomas", "(", "ESCC", ")", "stained", "with", "the", "indicated", "antibodies", "by", "immunohistochemistry", "(", "IHC", ")", ".", "Top", "panels", "show", "routine", "H", "&", "E", "staining", ".", "Black", "squares", "point", "to", "regions", "magnified", "in", "the", "adjacent", "panels", "to", "the", "right", ".", "C", ".", "Kaplan", "-", "Meier", "plots", "showing", "the", "correlation", "between", "HSPH1", "mRNA", "expression", "level", "and", "the", "survival", "of", "patients", "with", "ESCC", ".", "The", "expression", "data", "was", "obtained", "from", "and", "visualized", "with", "KM", "Plotter", "(", "www", ".", "kmplot", ".", "com", ",", "(", "Nagy", "et", "al", ",", "2018", ")", "using", "the", "Pan", "Cancer", "algorithm", "at", "default", "settings", ".", "D", ".", "KYSE150", "and", "KYSE150HSPH1", "-", "/", "-", "cells", "were", "injected", "into", "nude", "mice", ",", "and", "xenograft", "tumor", "growth", "was", "monitored", "over", "time", "(", "left", "panel", ";", "mean", "tumor", "volume", "+", "/", "-", "SEM", ",", "n", "=", "4", "with", "5", "animals", "per", "n", ")", ".", "Mean", "tumor", "weights", "at", "the", "end", "of", "the", "experiments", "were", "determined", "(", "means", "+", "/", "-", "SD", ",", "n", "=", "4", "with", "5", "animals", "per", "n", ",", "number", "above", "the", "bar", "graph", "represent", "p", "values", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "(", "calculated", "with", "the", "two", "-", "stage", "linear", "step", "-", "up", "procedure", "of", "Benjamini", ",", "Krieger", "and", "Yekutieli", ")", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8A. Representative micrographs of tissue sections derived from oral squamous cell carcinomas (OSCC) and esophageal squamous cell carcinomas (ESCC) stained with the indicated antibodies by immunohistochemistry (IHC). Top panels show routine H&E staining. Black squares point to regions magnified in the adjacent panels to the right.C. Kaplan-Meier plots showing the correlation between HSPH1 mRNA expression level and the survival of patients with ESCC. The expression data was obtained from and visualized with KM Plotter (www.kmplot.com, (Nagy et al, 2018) using the Pan Cancer algorithm at default settings.D. KYSE150 and KYSE150HSPH1-/- cells were injected into nude mice, and xenograft tumor growth was monitored over time (left panel; mean tumor volume +/- SEM, n = 4 with 5 animals per n). Mean tumor weights at the end of the experiments were determined (means +/- SD, n = 4 with 5 animals per n, number above the bar graph represent p values, * p<0.05, **p<0.01 (calculated with the two-stage linear step-up procedure of Benjamini, Krieger and Yekutieli))."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Representative", "images", "of", "WT", ",", "Mfn1", "KO", "and", "Mfn2", "KO", "MEFs", "transfected", "for", "48", "h", "with", "a", "plasmid", "encoding", "mitochondria", "-", "targeted", "RFP", "(", "mt", "-", "RFP", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "μm", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Representative images of WT, Mfn1 KO and Mfn2 KO MEFs transfected for 48 h with a plasmid encoding mitochondria-targeted RFP (mt-RFP). Scale bar: 5 μm."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Representative", "images", "of", "WT", "and", "Mfn2", "KO", "MEFs", "co", "-", "transfected", "with", "plasmids", "encoding", "mitochondria", "-", "targeted", "RFP", "and", "ER", "-", "targeted", "GFP", ".", "Scale", "bar", ":", "5", "μm", ".", "(", "B", ")", "After", "48", "h", ",", "the", "cells", "were", "fixed", "and", "the", "degree", "of", "colocalization", "between", "ER", "and", "mitochondria", "based", "on", "red", "and", "green", "fluorescent", "pixel", "overlap", "was", "analyzed", "using", "Mander", "'", "s", "coefficient", "(", "n", "=", "30", "cells", "analyzed", "in", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "two", "-", "tailed", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "I", "-", "K", ")", "Mitochondrial", "Ca2", "+", "was", "determined", "in", "WT", "and", "Mfn2", "KO", "MEFs", "loaded", "with", "Rhod2", ".", "The", "effect", "of", "(", "I", ")", "caffeine", "-", "induced", "(", "20", "mM", ")", ",", "(", "J", ")", "IP3R", "activation", "with", "ATP", "-", "induced", "(", "100", "μM", ")", "and", "(", "K", ")", "histamine", "-", "induced", "(", "100", "μM", ")", "ER", "Ca2", "+", "release", "on", "mitochondrial", "Ca2", "+", "was", "measured", "(", "n", "=", "30", "cells", "from", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Representative images of WT and Mfn2 KO MEFs co-transfected with plasmids encoding mitochondria-targeted RFP and ER-targeted GFP. Scale bar: 5 μm.(B) After 48 h, the cells were fixed and the degree of colocalization between ER and mitochondria based on red and green fluorescent pixel overlap was analyzed using Mander's coefficient (n= 30 cells analyzed in 3 independent experiments). Data are presented as mean ± SEM. *p<0.05, two-tailed Student's t-test.I-K) Mitochondrial Ca2+ was determined in WT and Mfn2 KO MEFs loaded with Rhod2. The effect of (I) caffeine-induced (20 mM), (J) IP3R activation with ATP-induced (100 μM) and (K) histamine-induced (100 μM) ER Ca2+ release on mitochondrial Ca2+ was measured (n= 30 cells from 3 independent experiments). Data are presented as mean ± SEM."}
{"words": ["Figure", "3WT", "and", "Mfn2", "KO", "cells", "were", "transfected", "with", "plasmids", "encoding", ":", "GFP", "and", "the", "indicated", "combination", "of", "non", "-", "targeting", "siRNA", "(", "siCT", ")", ",", "siRNA", "targeting", "MCU", "(", "siMCU", ")", ",", "ChiMERA", "or", "control", "(", "indicated", "as", "WT", "or", "Mfn2", "alone", ")", "plasmids", ".", "(", "R", ")", "MMP", "was", "analyzed", "(", "n", "=", "90", "cells", "analyzed", "in", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "WT", "and", "Mfn2", "KO", "cells", "were", "transfected", "with", "plasmids", "encoding", "GFP", "and", "the", "indicated", "combination", "of", "non", "-", "targeting", "siRNA", "(", "siCT", ")", ",", "siRNA", "targeting", "MCU", "(", "siMCU", ")", ",", "ChiMERA", "or", "control", "(", "indicated", "as", "WT", "or", "Mfn2", "alone", ")", "plasmids", ".", "(", "S", ")", "ATP", "levels", "of", "GFP", "+", "cells", "was", "analyzed", "after", "24", "h", "treatment", "with", "2DG", "(", "10", "mM", ")", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3WT and Mfn2 KO cells were transfected with plasmids encoding: GFP and the indicated combination of non-targeting siRNA (siCT), siRNA targeting MCU (siMCU), ChiMERA or control (indicated as WT or Mfn2 alone) plasmids. (R) MMP was analyzed (n= 90 cells analyzed in 3 independent experiments).WT and Mfn2 KO cells were transfected with plasmids encoding GFP and the indicated combination of non-targeting siRNA (siCT), siRNA targeting MCU (siMCU), ChiMERA or control (indicated as WT or Mfn2 alone) plasmids. (S) ATP levels of GFP+ cells was analyzed after 24 h treatment with 2DG (10 mM) (n= 3 independent experiments)."}
{"words": ["Figure", "4WT", "and", "Mfn2", "KO", "MEFs", "were", "co", "-", "transfected", "with", "plasmids", "encoding", ":", "mt", "-", "RFP", "and", "ER", "-", "Mfn2", "or", "control", "(", "CT", ")", "plasmid", ".", "After", "48", "h", ",", "the", "cells", "were", "fixed", ".", "(", "C", ")", "Representative", "images", ".", "Scale", "bar", "=", "5", "μm", ".", "WT", "and", "Mfn2", "KO", "MEFs", "were", "co", "-", "transfected", "with", "plasmids", "encoding", ":", "J", "-", "N", ")", "GFP", "and", "ER", "-", "Mfn2", "or", "control", "(", "CT", ")", "plasmid", ".", "(", "J", ")", "MMP", "was", "determined", ".", "The", "values", "were", "normalized", "to", "surrounding", "untransfected", "cells", ".", "(", "n", "=", "90", "cells", "analyzed", "in", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "(", "K", ")", "After", "24", "h", ",", "the", "transfected", "cells", "were", "sorted", "and", "plated", "for", "another", "24", "h", ",", "after", "which", "cells", "were", "treated", "with", "2", "-", "DG", "(", "10", "mM", ")", "for", "6", "h", ",", "and", "ATP", "levels", "were", "measured", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "(", "L", ")", "Oxygen", "consumption", "was", "measured", "and", "(", "M", ")", "RCR", "and", "(", "N", ")", "SRC", "was", "calculated", "(", "n", "=", "4", "independent", "experiments", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "Data", "information", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", ".", "Note", "that", "experiments", "were", "performed", "at", "the", "same", "time", ",", "so", "the", "values", "of", "WT", "and", "Mfn2", "KO", "transfected", "with", "control", "plasmid", "are", "the", "same", "but", "the", "figures", "have", "been", "split", "in", "two", "for", "the", "sake", "of", "linearity", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4WT and Mfn2 KO MEFs were co-transfected with plasmids encoding: mt-RFP and ER-Mfn2 or control (CT) plasmid. After 48 h, the cells were fixed. (C) Representative images. Scale bar= 5 μm.WT and Mfn2 KO MEFs were co-transfected with plasmids encoding: J-N) GFP and ER-Mfn2 or control (CT) plasmid. (J) MMP was determined. The values were normalized to surrounding untransfected cells. (n= 90 cells analyzed in 3 independent experiments). (K) After 24 h, the transfected cells were sorted and plated for another 24 h, after which cells were treated with 2-DG (10 mM) for 6 h, and ATP levels were measured (n= 3 independent experiments). (L) Oxygen consumption was measured and (M) RCR and (N) SRC was calculated (n= 4 independent experiments). Data are presented as mean ± SEM. Data information: *p<0.05, one-way ANOVA followed by Tukey's post hoc test. Note that experiments were performed at the same time, so the values of WT and Mfn2 KO transfected with control plasmid are the same but the figures have been split in two for the sake of linearity."}
{"words": ["Figure", "5WT", "and", "Mfn1", "/", "2", "double", "KO", "were", "transfected", "with", ":", "A", ")", "mt", "-", "RFP", ",", "ER", "-", "GFP", "and", "plasmids", "expressing", "the", "indicated", "proteins", ".", "Mitochondria", "-", "ER", "colocalization", "was", "analyzed", "using", "Mander", "'", "s", "coefficient", "(", "n", "=", "15", "cells", "analyzed", "in", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "B", ")", "GFP", "and", "ERMITO", "-", "RLuc", "and", "indicated", "expression", "vectors", ".", "After", "24", "h", ",", "the", "transfected", "cells", "were", "sorted", "and", "plated", "for", "another", "24", "h", ",", "after", "which", "RLuc", "was", "analyzed", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "C", ")", "Data", "information", ":", "The", "red", "dashed", "line", "indicates", "the", "WT", "cells", "results", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "versus", "Mfn1", "/", "2", "DKO", "cells", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", ".", "Note", "that", "experiments", "were", "performed", "at", "the", "same", "time", ",", "so", "the", "values", "of", "WT", "and", "Mfn2", "KO", "transfected", "with", "control", "plasmid", "are", "the", "same", "but", "the", "figures", "have", "been", "split", "in", "two", "for", "the", "sake", "of", "linearity", ".", "WT", "and", "Mfn1", "/", "2", "double", "KO", "were", "transfected", "with", ":", "C", ")", "GFP", "and", "the", "indicated", "plasmids", ".", "After", "48", "h", ",", "mitochondrial", "Ca2", "+", "was", "determined", "(", "n", "=", "30", "cells", "from", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "Data", "information", ":", "The", "red", "dashed", "line", "indicates", "the", "WT", "cells", "results", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "versus", "Mfn1", "/", "2", "DKO", "cells", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", ".", "Note", "that", "experiments", "were", "performed", "at", "the", "same", "time", ",", "so", "the", "values", "of", "WT", "and", "Mfn2", "KO", "transfected", "with", "control", "plasmid", "are", "the", "same", "but", "the", "figures", "have", "been", "split", "in", "two", "for", "the", "sake", "of", "linearity", ".", "WT", "and", "Mfn1", "/", "2", "double", "KO", "were", "transfected", "with", ":", "D", ")", "LAR", "-", "GECO1", "and", "the", "indicated", "plasmids", ".", "After", "48", "h", "ER", "Ca2", "+", "was", "released", "with", "caffeine", "(", "20", "mM", ")", "as", "indicated", "(", "n", "=", "25", "-", "27", "cells", "from", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "Data", "information", ":", "The", "red", "dashed", "line", "indicates", "the", "WT", "cells", "results", ".", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "versus", "Mfn1", "/", "2", "DKO", "cells", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "post", "hoc", "test", ".", "Note", "that", "experiments", "were", "performed", "at", "the", "same", "time", ",", "so", "the", "values", "of", "WT", "and", "Mfn2", "KO", "transfected", "with", "control", "plasmid", "are", "the", "same", "but", "the", "figures", "have", "been", "split", "in", "two", "for", "the", "sake", "of", "linearity", ".", "WT", "and", "Mfn1", "/", "2", "double", "KO", "were", "transfected", "with", ":", "E", ")", "GFP", "and", "the", "indicated", "plasmid", ".", "After", "48", "h", ",", "the", "effect", "of", "caffeine", "-", "induced", "(", "20", "mM", ")", "ER", "Ca2", "+", "release", "on", "mitochondrial", "Ca2", "+", "was", "measured", "(", "n", "=", "25", "cells", "from", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5WT and Mfn1/2 double KO were transfected with: A) mt-RFP, ER-GFP and plasmids expressing the indicated proteins. Mitochondria-ER colocalization was analyzed using Mander's coefficient (n= 15 cells analyzed in 3 independent experiments). Data are presented as mean ± SEM. B) GFP and ERMITO-RLuc and indicated expression vectors. After 24 h, the transfected cells were sorted and plated for another 24 h, after which RLuc was analyzed (n= 3 independent experiments). Data are presented as mean ± SEM. C) Data information: The red dashed line indicates the WT cells results. *p<0.05 versus Mfn1/2 DKO cells, one-way ANOVA followed by Tukey's post hoc test. Note that experiments were performed at the same time, so the values of WT and Mfn2 KO transfected with control plasmid are the same but the figures have been split in two for the sake of linearity.WT and Mfn1/2 double KO were transfected with: C) GFP and the indicated plasmids. After 48 h, mitochondrial Ca2+ was determined (n= 30 cells from 3 independent experiments). Data are presented as mean ± SEM. Data information: The red dashed line indicates the WT cells results. *p<0.05 versus Mfn1/2 DKO cells, one-way ANOVA followed by Tukey's post hoc test. Note that experiments were performed at the same time, so the values of WT and Mfn2 KO transfected with control plasmid are the same but the figures have been split in two for the sake of linearity.WT and Mfn1/2 double KO were transfected with: D) LAR-GECO1 and the indicated plasmids. After 48 h ER Ca2+ was released with caffeine (20 mM) as indicated (n= 25-27 cells from 3 independent experiments). Data are presented as mean ± SEM. Data information: The red dashed line indicates the WT cells results. *p<0.05 versus Mfn1/2 DKO cells, one-way ANOVA followed by Tukey's post hoc test. Note that experiments were performed at the same time, so the values of WT and Mfn2 KO transfected with control plasmid are the same but the figures have been split in two for the sake of linearity.WT and Mfn1/2 double KO were transfected with: E) GFP and the indicated plasmid. After 48 h, the effect of caffeine-induced (20 mM) ER Ca2+ release on mitochondrial Ca2+ was measured (n= 25 cells from 3 independent experiments). Data are presented as mean ± SEM."}
{"words": ["Figure", "6B", ")", "Representative", "Western", "blots", "of", "the", "indicated", "proteins", "during", "the", "neuronal", "maturation", "in", "vitro", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "C", ")", "Representative", "Western", "blots", "of", "the", "indicated", "proteins", "of", "WT", "and", "Mfn2", "KO", "neurons", "at", "DIV7", "(", "n", "=", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "D", "D", ")", "Primary", "neurons", "of", "tamoxifen", "-", "inducible", "Mfn2", "KO", "mice", "were", "transfected", "at", "DIV3", "with", "ER", "-", "GFP", ",", "mt", "-", "RFP", "plus", "the", "indicated", "plasmids", ".", "Tamoxifen", "-", "treated", "(", "for", "72", "h", ")", "and", "vehicle", "-", "treated", "neurons", "(", "WT", ";", "red", "dashed", "line", ")", "were", "fixed", "and", "mitochondria", "-", "ER", "co", "-", "localization", "was", "analyzed", "using", "Mander", "'", "s", "coefficient", "(", "n", "=", "15", "neurons", "analyzed", "in", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "Data", "information", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "versus", "WT", ";", "#", "p", "<", "0", ".", "05", "versus", "Mfn2", "KO", "neurons", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "hoc", "test", ".", "Scale", "bar", ":", "500", "μm", ".", "(", "F", ")", "neurite", "length", "measurement", "and", "representative", "tracings", "(", "G", ")", "of", "primary", "cortical", "neurons", "of", "WT", "and", "Mfn2", "KO", "mice", "co", "-", "transfected", "at", "DIV4", "with", "GFP", "and", "the", "indicated", "plasmids", ".", "After", "72", "h", ",", "the", "neurons", "were", "fixed", ",", "immunofluorescence", "with", "anti", "-", "GFP", "antibodies", "was", "performed", "and", "neurite", "length", "was", "measured", "(", "n", "=", "30", "neurons", "from", "3", "independent", "experiments", ")", ".", "Data", "are", "presented", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "Data", "information", ":", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "versus", "WT", ";", "#", "p", "<", "0", ".", "05", "versus", "Mfn2", "KO", "neurons", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "post", "-", "hoc", "test", ".", "Scale", "bar", ":", "500", "μm", ".", "E"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6B) Representative Western blots of the indicated proteins during the neuronal maturation in vitro (n= 3 independent experiments). C) Representative Western blots of the indicated proteins of WT and Mfn2 KO neurons at DIV7 (n= 3 independent experiments). D D) Primary neurons of tamoxifen-inducible Mfn2 KO mice were transfected at DIV3 with ER-GFP, mt-RFP plus the indicated plasmids. Tamoxifen-treated (for 72 h) and vehicle-treated neurons (WT; red dashed line) were fixed and mitochondria-ER co-localization was analyzed using Mander's coefficient (n= 15 neurons analyzed in 3 independent experiments). Data are presented as mean ± SEM. Data information: *p<0.05 versus WT; #p<0.05 versus Mfn2 KO neurons, one-way ANOVA followed by Tukey's post-hoc test. Scale bar: 500 μm.(F) neurite length measurement and representative tracings (G) of primary cortical neurons of WT and Mfn2 KO mice co-transfected at DIV4 with GFP and the indicated plasmids. After 72 h, the neurons were fixed, immunofluorescence with anti-GFP antibodies was performed and neurite length was measured (n= 30 neurons from 3 independent experiments). Data are presented as mean ± SEM. Data information: *p<0.05 versus WT; #p<0.05 versus Mfn2 KO neurons, one-way ANOVA followed by Tukey's post-hoc test. Scale bar: 500 μm. E "}
{"words": ["figf1", "(", "a", ")", "Representative", "differential", "interference", "contrast", "microscopy", "images", "of", "midgut", "cells", "from", "wild", "-", "type", "animals", "at", "the", "early", "third", "instar", "larval", "(", "Early", "3rd", ")", ",", "late", "third", "instar", "larval", "(", "Late", "3rd", ")", "and", "at", "puparium", "formation", "(", "white", "prepupal", ",", "WPP", ")", "stages", ".", "(", "b", ")", "Autophagy", "detected", "by", "formation", "of", "mCherry", "-", "Atg8a", "punctate", "spots", "in", "midgut", "cells", "from", "wild", "-", "type", "animals", "at", "indicated", "stages", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "(", "c", ")", "Midguts", "from", "control", "Atg18KG03090", "/", "wild", "-", "type", "(", "Atg18", "/", "+", ")", ",", "n", " ", "=", " ", "14", ",", "and", "Atg18KG03090", "/", "Df", "(", "3L", ")", "6112", "mutant", "(", "Atg18", "/", "Df", ")", ",", "n", " ", "=", " ", "11", ",", "animals", "at", "puparium", "formation", "analysed", "by", "differential", "interference", "contrast", "microscopy", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "(", "d", ")", "Wild", "-", "type", ",", "control", "(", "Atg18KG03090", "/", "+", ")", "and", "Atg18", "mutant", "(", "Atg18", "/", "Df", ")", "midgut", "cell", "size", "quantification", "(", "μm2", ")", "at", "indicated", "stages", ";", "n", " ", "=", " ", "10", "animal", "intestines", "per", "genotype", "with", "5", "cells", "measured", "per", "intestine", "per", "stage", ".", "(", "e", ")", "Differential", "interference", "contrast", "images", "of", "midgut", "cells", "from", "Atg2EP3697", "/", "wild", "-", "type", "control", "(", "Atg2", "/", "+", ")", "and", "Atg2EP3697", "/", "Df", "(", "3L", ")", "6091", "mutant", "(", "Atg2", "/", "Df", ")", "animals", "at", "puparium", "formation", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "(", "f", ")", "Cell", "size", "quantification", "(", "μm2", ")", "from", "e", ",", "n", " ", "=", " ", "12", "(", "Atg2", "/", "+", ")", "and", "n", " ", "=", " ", "7", "(", "Atg2", "/", "Df", ")", "animal", "intestines", "per", "genotype", "with", "5", "cells", "measured", "per", "intestine", ".", "(", "g", "-", "j", ")", "Representative", "TEM", "images", "of", "intestine", "cells", "2", " ", "h", "after", "puparium", "formation", ".", "(", "g", ",", "i", ")", "Control", "Atg18KG03090", "/", "wild", "-", "type", "(", "Atg18", "/", "+", ",", "g", ")", "and", "control", "Atg2EP3697", "/", "wild", "-", "type", "(", "Atg2", "/", "+", ",", "i", ")", "cells", "with", "an", "enlarged", "image", "showing", "a", "double", "-", "membrane", "structure", "(", "arrowhead", ")", "that", "surrounds", "a", "mitochondrion", "and", "endoplasmic", "reticulum", ".", "Arrows", "indicate", "autolysosomes", ".", "(", "h", ",", "j", ")", "Atg18KG03090", "/", "Df", "(", "3L", ")", "6112mutant", "(", "Atg18", "/", "Df", ",", "h", ")", "and", "Atg2EP3697", "/", "Df", "(", "Atg2", "/", "Df", ",", "j", ")", "mutant", "cells", "lacking", "autophagic", "structures", ".", "Quantification", "is", "shown", "as", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "Scale", "bars", ",", "20", " ", "μm", "(", "a", "-", "c", "and", "e", ")", "and", "1", " ", "μm", "(", "g", "-", "j", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf1(a) Representative differential interference contrast microscopy images of midgut cells from wild-type animals at the early third instar larval (Early 3rd), late third instar larval (Late 3rd) and at puparium formation (white prepupal, WPP) stages.(b) Autophagy detected by formation of mCherry-Atg8a punctate spots in midgut cells from wild-type animals at indicated stages. Representative images are shown.(c) Midguts from control Atg18KG03090/wild-type (Atg18/+), n = 14, and Atg18KG03090/Df(3L)6112 mutant (Atg18/Df), n = 11, animals at puparium formation analysed by differential interference contrast microscopy. Representative images are shown. (d) Wild-type, control (Atg18KG03090/+) and Atg18 mutant (Atg18/Df) midgut cell size quantification (μm2) at indicated stages; n = 10 animal intestines per genotype with 5 cells measured per intestine per stage.(e) Differential interference contrast images of midgut cells from Atg2EP3697/wild-type control (Atg2/+) and Atg2EP3697/Df(3L)6091 mutant (Atg2/Df) animals at puparium formation. Representative images are shown. (f) Cell size quantification (μm2) from e, n = 12 (Atg2/+) and n = 7 (Atg2/Df) animal intestines per genotype with 5 cells measured per intestine.(g-j) Representative TEM images of intestine cells 2 h after puparium formation. (g,i) Control Atg18KG03090/wild-type (Atg18/+, g) and control Atg2EP3697/wild-type (Atg2/+, i) cells with an enlarged image showing a double-membrane structure (arrowhead) that surrounds a mitochondrion and endoplasmic reticulum. Arrows indicate autolysosomes. (h,j) Atg18KG03090/Df(3L)6112mutant (Atg18/Df, h) and Atg2EP3697/Df (Atg2/Df, j) mutant cells lacking autophagic structures. Quantification is shown as mean ± s.d. Scale bars, 20 μm (a-c and e) and 1 μm (g-j)."}
{"words": ["figf2", "(", "a", ")", "Midguts", "dissected", "from", "animals", "expressing", "Atg18IR", "specifically", "in", "DsRed", "-", "marked", "clones", "of", "cells", "at", "puparium", "formation", "and", "analysed", "by", "fluorescence", "and", "differential", "interference", "contrast", "(", "DIC", ")", "microscopy", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "(", "b", ")", "Quantification", "(", "μm2", ")", "from", "a", ",", "n", " ", "=", " ", "12", "animal", "intestines", "per", "genotype", "with", "1", "-", "5", "cells", "measured", "per", "intestine", ".", "(", "c", ")", "Midguts", "expressing", "mCherry", "-", "Atg8a", "in", "all", "cells", ",", "and", "expressing", "Atg18IR", "specifically", "in", "GFP", "-", "marked", "cell", "clones", "dissected", "from", "animals", "at", "2", " ", "h", "after", "puparium", "formation", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "(", "d", ")", "Midguts", "dissected", "from", "animals", "at", "puparium", "formation", "that", "contain", "an", "Atg1Δ3D", "loss", "-", "of", "-", "function", "mutant", "cell", "clone", "(", "lacking", "GFP", ")", "and", "analysed", "by", "fluorescence", "and", "differential", "interference", "contrast", "microscopy", ".", "Wild", "-", "type", "(", "+", "/", "+", ")", "control", "cell", "possesses", "stronger", "GFP", "and", "heterozygous", "Atg1Δ3D", "/", "wild", "-", "type", "(", "Δ3D", "/", "+", ")", "cells", "have", "weaker", "GFP", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "(", "e", ")", "Quantification", "(", "μm2", ")", "from", "d", ",", "n", " ", "=", " ", "7", "(", "+", "/", "+", ")", ",", "n", " ", "=", " ", "8", "(", "Δ3D", "/", "+", ")", "and", "n", " ", "=", " ", "8", "(", "Δ3D", "/", "Δ3D", ")", "animal", "intestines", "per", "genotype", "with", "1", "-", "5", "cells", "measured", "per", "intestine", ".", "(", "f", ")", "Midguts", "dissected", "from", "animals", "expressing", "mCherry", "-", "Atg8a", "in", "all", "cells", ",", "and", "expressing", "Atg1IR", "specifically", "in", "GFP", "-", "marked", "clones", "of", "cells", "at", "2", " ", "h", "after", "puparium", "formation", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "(", "g", "-", "j", ")", "Representative", "cut", "views", "from", "three", "-", "dimensional", "reconstitution", "images", "from", "wild", "-", "type", "(", "g", ",", "h", ")", "and", "Atg1", "knockdown", "(", "i", ",", "j", ")", "cells", "at", "early", "third", "instar", "larval", "stage", "(", "g", ",", "i", ")", "and", "at", "puparium", "formation", "(", "h", ",", "j", ")", ".", "(", "k", ")", "Quantification", "of", "cell", "volume", "(", "μm3", ")", "from", "g", "-", "j", ",", "n", " ", "=", " ", "5", "animal", "intestines", "per", "genotype", "with", "1", "-", "5", "cells", "measured", "per", "intestine", "per", "stage", ".", "Black", "columns", ":", "early", "third", "instar", "larval", "stage", ".", "White", "columns", ":", "puparium", "formation", "stage", ".", "Quantification", "is", "shown", "as", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "NS", ",", "not", "significant", ".", "Scale", "bars", ",", "20", " ", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf2(a) Midguts dissected from animals expressing Atg18IR specifically in DsRed-marked clones of cells at puparium formation and analysed by fluorescence and differential interference contrast (DIC) microscopy. Representative images are shown. (b) Quantification (μm2) from a, n = 12 animal intestines per genotype with 1-5 cells measured per intestine.(c) Midguts expressing mCherry-Atg8a in all cells, and expressing Atg18IR specifically in GFP-marked cell clones dissected from animals at 2 h after puparium formation. Representative images are shown.(d) Midguts dissected from animals at puparium formation that contain an Atg1Δ3D loss-of-function mutant cell clone (lacking GFP) and analysed by fluorescence and differential interference contrast microscopy. Wild-type (+/+) control cell possesses stronger GFP and heterozygous Atg1Δ3D/wild-type (Δ3D/+) cells have weaker GFP. Representative images are shown. (e) Quantification (μm2) from d, n = 7 (+/+), n = 8 (Δ3D/+) and n = 8 (Δ3D/Δ3D) animal intestines per genotype with 1-5 cells measured per intestine.(f) Midguts dissected from animals expressing mCherry-Atg8a in all cells, and expressing Atg1IR specifically in GFP-marked clones of cells at 2 h after puparium formation. Representative images are shown.(g-j) Representative cut views from three-dimensional reconstitution images from wild-type (g,h) and Atg1 knockdown (i,j) cells at early third instar larval stage (g,i) and at puparium formation (h,j). (k) Quantification of cell volume (μm3) from g-j, n = 5 animal intestines per genotype with 1-5 cells measured per intestine per stage. Black columns: early third instar larval stage. White columns: puparium formation stage. Quantification is shown as mean ± s.d. NS, not significant. Scale bars, 20 μm."}
{"words": ["figf3", "(", "a", ")", "Midguts", "dissected", "from", "animals", "at", "puparium", "formation", "that", "contain", "Vps34Δm22", "loss", "-", "of", "-", "function", "mutant", "cell", "clones", "(", "lacking", "GFP", ")", "and", "analysed", "by", "fluorescence", "and", "differential", "interference", "contrast", "(", "DIC", ")", "microscopy", ".", "Wild", "-", "type", "(", "+", "/", "+", ")", "control", "cells", "possess", "stronger", "GFP", "and", "heterozygous", "Vps34Δm22", "/", "wild", "-", "type", "(", "Δm22", "/", "+", ")", "cells", "have", "weaker", "GFP", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "(", "b", ")", "Quantification", "(", "μm2", ")", "from", "a", ",", "n", " ", "=", " ", "14", "animal", "intestines", "per", "genotype", "with", "1", "-", "5", "cells", "measured", "per", "intestine", ".", "(", "c", ")", "Midguts", "dissected", "from", "animals", "expressing", "Atg8aIR", "specifically", "in", "GFP", "-", "marked", "clones", "of", "cells", "at", "puparium", "formation", "and", "analysed", "by", "fluorescence", "and", "differential", "interference", "contrast", "microscopy", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "(", "d", ")", "Cell", "size", "quantification", "(", "μm2", ")", "from", "c", ",", "n", " ", "=", " ", "10", "animal", "intestines", "per", "genotype", "with", "1", "-", "5", "cells", "measured", "per", "intestine", ".", "(", "e", ")", "Midguts", "dissected", "from", "animals", "expressing", "Atg12IR", "specifically", "in", "DsRed", "-", "marked", "clones", "of", "cells", "at", "puparium", "formation", "and", "analysed", "by", "fluorescence", "and", "differential", "interference", "contrast", "microscopy", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "(", "f", ")", "Cell", "size", "quantification", "(", "μm2", ")", "from", "e", ",", "n", " ", "=", " ", "14", "animal", "intestines", "per", "genotype", "with", "1", "-", "5", "cells", "measured", "per", "intestine", ".", "(", "g", "-", "i", ")", "Midguts", "dissected", "from", "early", "third", "instar", "larvae", "that", "mis", "-", "express", "Atg1GS10797", "(", "Atg1", ";", "g", ",", "GFP", "in", "nucleus", "and", "cytoplasm", ")", ",", "both", "Atg1", "+", "Atg8aIR", "(", "h", ")", ",", "or", "both", "Atg1", "+", "Atg7IR", "(", "i", ")", "and", "stained", "to", "detect", "Discs", "large", "(", "green", ")", "on", "the", "cortex", "of", "all", "cells", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "(", "g", "'", "and", "i", "'", ")", "DIC", "images", "of", "midguts", "expressing", "mCherry", "-", "Atg8a", "in", "all", "cells", ",", "Atg1", "(", "g", "'", ")", ",", "and", "Atg1", "+", "Atg7IR", "(", "i", "'", ")", "in", "GFP", "-", "marked", "clones", "of", "cells", ".", "mCherry", "-", "Atg8a", "puncta", "are", "shown", "in", "insets", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "Quantification", "is", "shown", "as", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "Scale", "bars", ",", "20", " ", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf3(a) Midguts dissected from animals at puparium formation that contain Vps34Δm22 loss-of-function mutant cell clones (lacking GFP) and analysed by fluorescence and differential interference contrast (DIC) microscopy. Wild-type (+/+) control cells possess stronger GFP and heterozygous Vps34Δm22/wild-type (Δm22/+) cells have weaker GFP. Representative images are shown. (b) Quantification (μm2) from a, n = 14 animal intestines per genotype with 1-5 cells measured per intestine.(c) Midguts dissected from animals expressing Atg8aIR specifically in GFP-marked clones of cells at puparium formation and analysed by fluorescence and differential interference contrast microscopy. Representative images are shown. (d) Cell size quantification (μm2) from c, n = 10 animal intestines per genotype with 1-5 cells measured per intestine.(e) Midguts dissected from animals expressing Atg12IR specifically in DsRed-marked clones of cells at puparium formation and analysed by fluorescence and differential interference contrast microscopy. Representative images are shown. (f) Cell size quantification (μm2) from e, n = 14 animal intestines per genotype with 1-5 cells measured per intestine.(g-i) Midguts dissected from early third instar larvae that mis-express Atg1GS10797 (Atg1; g, GFP in nucleus and cytoplasm), both Atg1 +Atg8aIR (h), or both Atg1 +Atg7IR (i) and stained to detect Discs large (green) on the cortex of all cells. Representative images are shown. (g' and i') DIC images of midguts expressing mCherry-Atg8a in all cells, Atg1 (g'), and Atg1+Atg7IR (i') in GFP-marked clones of cells. mCherry-Atg8a puncta are shown in insets. Representative images are shown. Quantification is shown as mean ± s.d. Scale bars, 20 μm."}
{"words": ["figf4", "(", "a", ")", "Midguts", "dissected", "from", "animals", "at", "puparium", "formation", "that", "contain", "Atg7d4", "loss", "-", "of", "-", "function", "mutant", "cell", "clones", "(", "lacking", "GFP", ")", "and", "analysed", "by", "fluorescence", "and", "differential", "interference", "contrast", "(", "DIC", ")", "microscopy", ".", "Wild", "-", "type", "(", "+", "/", "+", ")", "control", "cells", "possess", "stronger", "GFP", "and", "heterozygous", "Atg7d4", "/", "wild", "-", "type", "(", "d4", "/", "+", ")", "cells", "have", "weaker", "GFP", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "(", "b", ")", "Cell", "size", "quantification", "(", "μm2", ")", "from", "a", ",", "n", " ", "=", " ", "8", "animal", "intestines", "per", "genotype", "with", "1", "-", "5", "cells", "measured", "per", "intestine", ".", "(", "c", ")", "Midguts", "expressing", "mCherry", "-", "Atg8a", "in", "all", "cells", ",", "and", "with", "Atg7d4", "loss", "-", "of", "-", "function", "clone", "cells", "(", "lacking", "GFP", ")", "at", "2", " ", "h", "after", "puparium", "formation", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "(", "e", ")", "Midguts", "dissected", "from", "animals", "expressing", "Atg12IR", "specifically", "in", "DsRed", "-", "marked", "clones", "of", "cells", "at", "puparium", "formation", "and", "analysed", "by", "fluorescence", "and", "differential", "interference", "contrast", "microscopy", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "(", "f", ")", "Cell", "size", "quantification", "(", "μm2", ")", "from", "e", ",", "n", " ", "=", " ", "14", "animal", "intestines", "per", "genotype", "with", "1", "-", "5", "cells", "measured", "per", "intestine", ".", "(", "f", ")", "Midguts", "expressing", "GFP", "-", "Atg5", "in", "enterocytes", "(", "larger", "nuclei", ")", "with", "an", "Atg7d4", "loss", "-", "of", "-", "function", "clone", "cell", "(", "lacking", "RFP", ")", "at", "puparium", "formation", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "(", "g", ",", "h", ")", "Representative", "TEM", "images", "of", "intestine", "cells", "2", " ", "h", "after", "puparium", "formation", ".", "Arrows", "indicate", "autolysosomes", ".", "(", "g", ",", "h", ")", "Control", "(", "Atg7d30", "/", "d14", ";", "g", ")", "and", "Atg7", "mutant", "(", "Atg7d77", "/", "d14", ";", "h", ")", "cells", "both", "contain", "autophagic", "structures", ".", "(", "h", ",", "right", ")", "Enlarged", "Atg7", "mutant", "cell", "image", "of", "a", "double", "-", "membrane", "autophagosome", "(", "arrowhead", ")", "surrounding", "a", "mitochondrion", ".", "Quantification", "is", "shown", "as", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "NS", ",", "not", "significant", ".", "Scale", "bars", ",", "20", " ", "μm", "(", "a", ",", "c", ",", "d", "and", "f", ")", "and", "1", " ", "μm", "(", "g", ",", "h", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf4(a) Midguts dissected from animals at puparium formation that contain Atg7d4 loss-of-function mutant cell clones (lacking GFP) and analysed by fluorescence and differential interference contrast (DIC) microscopy. Wild-type (+/+) control cells possess stronger GFP and heterozygous Atg7d4/wild-type (d4/+) cells have weaker GFP. Representative images are shown. (b) Cell size quantification (μm2) from a, n = 8 animal intestines per genotype with 1-5 cells measured per intestine.(c) Midguts expressing mCherry-Atg8a in all cells, and with Atg7d4 loss-of-function clone cells (lacking GFP) at 2 h after puparium formation. Representative images are shown.(e) Midguts dissected from animals expressing Atg12IR specifically in DsRed-marked clones of cells at puparium formation and analysed by fluorescence and differential interference contrast microscopy. Representative images are shown. (f) Cell size quantification (μm2) from e, n = 14 animal intestines per genotype with 1-5 cells measured per intestine.(f) Midguts expressing GFP-Atg5 in enterocytes (larger nuclei) with an Atg7d4 loss-of-function clone cell (lacking RFP) at puparium formation. Representative images are shown.(g,h) Representative TEM images of intestine cells 2 h after puparium formation. Arrows indicate autolysosomes. (g,h) Control (Atg7d30/d14; g) and Atg7 mutant (Atg7d77/d14; h) cells both contain autophagic structures. (h, right) Enlarged Atg7 mutant cell image of a double-membrane autophagosome (arrowhead) surrounding a mitochondrion. Quantification is shown as mean ± s.d. NS, not significant. Scale bars, 20 μm (a,c,d and f) and 1 μm (g,h)."}
{"words": ["figf5", "(", "a", ")", "Quantification", "of", "mitochondria", "numbers", "from", "Atg18", "control", "(", "Atg18KG03090", "/", "wild", "type", ")", "and", "mutant", "(", "Atg18KG03090", "/", "Df", "(", "3L", ")", "6112", ")", "or", "Atg7", "control", "(", "Atg7d30", "/", "d14", ")", "and", "mutant", "(", "Atg7d77", "/", "d14", ")", "TEM", "images", ".", "Mitochondria", "were", "quantified", "from", "2", "distinct", "25", " ", "μm2", "regions", "per", "cell", "from", "2", "cells", "per", "animal", "from", "at", "least", "3", "different", "animals", "per", "genotype", ".", "(", "b", ",", "c", ")", "Midguts", "dissected", "from", "either", "early", "third", "instar", "larvae", "(", "b", ")", "or", "at", "puparium", "formation", "(", "c", ")", "that", "express", "GFP", "-", "labelled", "mitochondria", "in", "all", "cells", "and", "contain", "an", "Atg1Δ3D", "loss", "-", "of", "-", "function", "mutant", "cell", "clone", "(", "lacking", "RFP", ")", ".", "Wild", "-", "type", "control", "cells", "possess", "stronger", "RFP", "and", "heterozygous", "cells", "have", "weaker", "RFP", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "Quantification", "is", "shown", "as", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "NS", ",", "not", "significant", ".", "Scale", "bars", ",", "0", " ", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf5(a) Quantification of mitochondria numbers from Atg18 control (Atg18KG03090/wild type) and mutant (Atg18KG03090/Df(3L)6112) or Atg7 control (Atg7d30/d14) and mutant (Atg7d77/d14) TEM images. Mitochondria were quantified from 2 distinct 25 μm2 regions per cell from 2 cells per animal from at least 3 different animals per genotype.(b,c) Midguts dissected from either early third instar larvae (b) or at puparium formation (c) that express GFP-labelled mitochondria in all cells and contain an Atg1Δ3D loss-of-function mutant cell clone (lacking RFP). Wild-type control cells possess stronger RFP and heterozygous cells have weaker RFP. Representative images are shown. Quantification is shown as mean ± s.d. NS, not significant. Scale bars, 0 μm."}
{"words": ["figf6", "(", "a", ")", "Midguts", "dissected", "from", "animals", "expressing", "Uba1IR", "specifically", "in", "GFP", "-", "marked", "clones", "of", "cells", "at", "puparium", "formation", "and", "analysed", "by", "fluorescence", "and", "differential", "interference", "contrast", "(", "DIC", ")", "microscopy", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "(", "b", ")", "Cell", "size", "quantification", "(", "μm2", ")", "from", "a", ";", "n", " ", "=", " ", "16", "animal", "intestines", "per", "genotype", "with", "1", "-", "5", "cells", "measured", "per", "intestine", ".", "(", "c", ")", "Midguts", "dissected", "from", "animals", "at", "puparium", "formation", "that", "contain", "Uba1H33", "loss", "-", "of", "-", "function", "mutant", "cell", "clones", "(", "lacking", "RFP", ")", "and", "analysed", "by", "fluorescence", "and", "differential", "interference", "contrast", "microscopy", ".", "Wild", "-", "type", "(", "+", "/", "+", ")", "control", "cells", "possess", "stronger", "RFP", "and", "heterozygous", "Uba1H33", "/", "wild", "-", "type", "(", "H33", "/", "+", ")", "cells", "have", "weaker", "RFP", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "(", "d", ")", "Quantification", "(", "μm2", ")", "from", "c", ",", "n", " ", "=", " ", "8", "(", "+", "/", "+", ")", ",", "n", " ", "=", " ", "11", "(", "H33", "/", "+", ")", "and", "n", " ", "=", " ", "11", "(", "H33", "/", "H33", ")", "animal", "intestines", "per", "genotype", "with", "1", "-", "5", "cells", "measured", "per", "intestine", ".", "(", "e", ")", "Midguts", "dissected", "from", "animals", "at", "puparium", "formation", "that", "contain", "Uba1H33", "loss", "-", "of", "-", "function", "MARCM", "mutant", "cell", "clones", "(", "GFP", "-", "positive", ")", "that", "also", "have", "mCherry", "-", "Atg8a", "expressed", "in", "all", "cells", "and", "analysed", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "Control", "wild", "-", "type", "and", "heterozygous", "cells", "have", "no", "GFP", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "(", "f", ")", "Midguts", "expressing", "GFP", "-", "Atg5", "in", "enterocytes", "(", "larger", "nuclei", ")", ",", "and", "with", "an", "Uba1H33", "loss", "-", "of", "-", "function", "clone", "cell", "(", "lacking", "RFP", ")", "at", "puparium", "formation", "analysed", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "(", "g", ")", "Midguts", "dissected", "from", "animals", "at", "puparium", "formation", "that", "contain", "Uba1H33", "loss", "-", "of", "-", "function", "MARCM", "mutant", "cell", "clones", "(", "GFP", "-", "positive", ")", "that", "are", "stained", "with", "p62", "antibody", "and", "analysed", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "Control", "wild", "-", "type", "and", "heterozygous", "cells", "have", "no", "GFP", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "(", "h", ")", "Midguts", "dissected", "from", "animals", "expressing", "Dts7", ",", "a", "dominant", "temperature", "-", "sensitive", "mutant", "of", "the", "β2", "subunit", "of", "the", "proteasome", ",", "specifically", "in", "GFP", "-", "marked", "cells", "at", "puparium", "formation", "and", "analysed", "by", "fluorescence", "and", "differential", "interference", "contrast", "microscopy", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "(", "i", ")", "Cell", "size", "quantification", "(", "μm2", ")", "from", "h", ",", "n", " ", "=", " ", "6", "animal", "intestines", "per", "genotype", "with", "1", "-", "5", "cells", "measured", "per", "intestine", ".", "Quantification", "is", "shown", "as", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "NS", ",", "not", "significant", ".", "Scale", "bars", ",", "20", " ", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf6(a) Midguts dissected from animals expressing Uba1IR specifically in GFP-marked clones of cells at puparium formation and analysed by fluorescence and differential interference contrast (DIC) microscopy. Representative images are shown. (b) Cell size quantification (μm2) from a; n = 16 animal intestines per genotype with 1-5 cells measured per intestine.(c) Midguts dissected from animals at puparium formation that contain Uba1H33 loss-of-function mutant cell clones (lacking RFP) and analysed by fluorescence and differential interference contrast microscopy. Wild-type (+/+) control cells possess stronger RFP and heterozygous Uba1H33/wild-type (H33/+) cells have weaker RFP. Representative images are shown. (d) Quantification (μm2) from c, n = 8 (+/+), n = 11 (H33/+) and n = 11 (H33/H33) animal intestines per genotype with 1-5 cells measured per intestine.(e) Midguts dissected from animals at puparium formation that contain Uba1H33 loss-of-function MARCM mutant cell clones (GFP-positive) that also have mCherry-Atg8a expressed in all cells and analysed by fluorescence microscopy. Control wild-type and heterozygous cells have no GFP. Representative images are shown.(f) Midguts expressing GFP-Atg5 in enterocytes (larger nuclei), and with an Uba1H33 loss-of-function clone cell (lacking RFP) at puparium formation analysed by fluorescence microscopy. Representative images are shown.(g) Midguts dissected from animals at puparium formation that contain Uba1H33 loss-of-function MARCM mutant cell clones (GFP-positive) that are stained with p62 antibody and analysed by fluorescence microscopy. Control wild-type and heterozygous cells have no GFP. Representative images are shown.(h) Midguts dissected from animals expressing Dts7, a dominant temperature-sensitive mutant of the β2 subunit of the proteasome, specifically in GFP-marked cells at puparium formation and analysed by fluorescence and differential interference contrast microscopy. Representative images are shown. (i) Cell size quantification (μm2) from h, n = 6 animal intestines per genotype with 1-5 cells measured per intestine. Quantification is shown as mean ± s.d. NS, not significant. Scale bars, 20 μm."}
{"words": ["figf7", "(", "a", ",", "b", ")", "E1", "-", "charging", "assay", "for", "Uba1", "and", "Atg7", "with", "either", "Atg8a", "(", "a", ")", "or", "ubiquitin", "(", "Ub", ";", "b", ")", ",", "n", " ", "=", " ", "2", "experiments", "with", "independently", "isolated", "proteins", "and", "analyses", ".", "Flag", "-", "tagged", "baculoviral", "-", "expressed", "E1s", "were", "incubated", "with", "either", "His", "-", "tagged", "Atg8a", "or", "Ub", "in", "the", "presence", "or", "absence", "of", "β", "-", "mercaptoethanol", ",", "separated", "by", "electrophoresis", "and", "blotted", ".", "Band", "shift", "was", "detected", "with", "anti", "-", "Flag", "antibody", ".", "Relative", "molecular", "mass", "(", "Mr", " ", "K", ")", "ladders", "are", "indicated", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "Relative", "molecular", "masses", ":", "Flag", "-", "Uba1", ",", "135K", ";", "Flag", "-", "Atg7", ",", "81K", ";", "His", "-", "Atg8a", ",", "29K", ";", "Ub", ",", "9K", ".", "(", "c", ")", "Midgut", "protein", "extracts", "at", "puparium", "formation", "from", "wild", "-", "type", ",", "Atg7", "mutant", "(", "Atg7d77", "/", "d14", ")", "and", "Atg8", "(", "Atg8KG07569", ")", "mutant", "animals", "blotted", "with", "anti", "-", "Atg8", "and", "anti", "-", "Tubulin", ",", "n", " ", "=", " ", "3", "independent", "biological", "experiments", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "(", "d", ")", "Midguts", "from", "control", "Atg310", "/", "wild", "-", "type", "(", "Atg3", "/", "+", ")", "and", "Atg310", "/", "Df", "(", "3L", ")", "cat", "mutant", "(", "Atg3", "/", "Df", ")", "animals", "at", "puparium", "formation", "analysed", "by", "differential", "interference", "contrast", "microscopy", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "(", "e", ")", "Cell", "size", "quantification", "(", "μm2", ")", "from", "d", ",", "n", " ", "=", " ", "11", "(", "Atg3", "/", "+", ")", "and", "n", " ", "=", " ", "9", "(", "Atg3", "/", "Df", ")", "animal", "intestines", "per", "genotype", "with", "5", "cells", "measured", "per", "intestine", ".", "(", "f", ")", "Midguts", "dissected", "from", "early", "third", "instar", "larvae", "that", "mis", "-", "express", "Atg1GS10797", "(", "Atg1", ")", "and", "Atg3IR", "only", "in", "the", "DsRed", "-", "marked", "cell", "clone", "and", "analysed", "by", "fluorescence", "and", "differential", "interference", "contrast", "(", "DIC", ")", "microscopy", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "(", "g", ")", "Midguts", "dissected", "from", "animals", "expressing", "Atg4DN", "specifically", "in", "DsRed", "-", "marked", "clones", "of", "cells", "at", "puparium", "formation", "and", "analysed", "by", "fluorescence", "and", "differential", "interference", "contrast", "microscopy", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "(", "h", ")", "Cell", "size", "quantification", "(", "μm2", ")", "from", "g", ",", "n", " ", "=", " ", "10", "animal", "intestines", "per", "genotype", "with", "1", "-", "5", "cells", "measured", "per", "intestine", ".", "(", "i", ")", "Midguts", "dissected", "from", "animals", "expressing", "mCherry", "-", "Atg8a", "in", "all", "cells", ",", "and", "expressing", "UbIR", "specifically", "in", "GFP", "-", "marked", "clones", "of", "cells", "at", "puparium", "formation", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "(", "j", ")", "Midguts", "dissected", "from", "animals", "expressing", "UbIR", "specifically", "in", "GFP", "-", "marked", "clones", "of", "cells", "at", "puparium", "formation", "and", "analysed", "by", "fluorescence", "and", "differential", "interference", "contrast", "microscopy", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "(", "k", ")", "Cell", "size", "quantification", "(", "μm2", ")", "from", "(", "j", ")", ",", "n", " ", "=", " ", "12", "animal", "intestines", "per", "genotype", "with", "1", "-", "5", "cells", "measured", "per", "intestine", ".", "(", "l", ",", "m", ")", "Midguts", "dissected", "from", "early", "third", "instar", "larvae", "that", "exhibit", "Atg1GS10797", "(", "Atg1", ")", "mis", "-", "expression", "in", "either", "a", "wild", "-", "type", "GFP", "-", "positive", "cell", "clone", "(", "l", ")", "or", "a", "Uba1H33", "loss", "-", "of", "-", "function", "MARCM", "mutant", "cell", "clone", "(", "GFP", "-", "positive", ";", "m", ")", "and", "analysed", "by", "fluorescence", "and", "differential", "interference", "contrast", "microscopy", ".", "Control", "wild", "-", "type", "and", "heterozygous", "Uba1H33", "/", "wild", "-", "type", "cells", "have", "no", "GFP", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "(", "n", ")", "Quantification", "(", "μm2", ")", "from", "l", "and", "m", ",", "n", " ", "=", " ", "22", "(", "control", ")", ",", "n", " ", "=", " ", "16", "(", "Atg1", ")", "and", "n", " ", "=", " ", "6", "(", "Atg1", "+", "Uba1H33", ")", "animal", "intestines", "per", "genotype", "with", "1", "-", "5", "cells", "measured", "per", "intestine", ".", "Quantification", "data", "for", "control", "cells", "(", "l", ",", "m", ")", "were", "pooled", "because", "they", "are", "genetically", "identical", ".", "Quantification", "is", "shown", "as", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "NS", ",", "not", "significant", ".", "Scale", "bars", ",", "20", " ", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf7(a,b) E1-charging assay for Uba1 and Atg7 with either Atg8a (a) or ubiquitin (Ub; b), n = 2 experiments with independently isolated proteins and analyses. Flag-tagged baculoviral-expressed E1s were incubated with either His-tagged Atg8a or Ub in the presence or absence of β-mercaptoethanol, separated by electrophoresis and blotted. Band shift was detected with anti-Flag antibody. Relative molecular mass (Mr K) ladders are indicated. Representative images are shown. Relative molecular masses: Flag-Uba1, 135K; Flag-Atg7, 81K; His-Atg8a, 29K; Ub, 9K.(c) Midgut protein extracts at puparium formation from wild-type, Atg7 mutant (Atg7d77/d14) and Atg8 (Atg8KG07569) mutant animals blotted with anti-Atg8 and anti-Tubulin, n = 3 independent biological experiments. Representative images are shown.(d) Midguts from control Atg310/wild-type (Atg3/+) and Atg310/Df(3L)cat mutant (Atg3/Df) animals at puparium formation analysed by differential interference contrast microscopy. Representative images are shown. (e) Cell size quantification (μm2) from d, n = 11 (Atg3/+) and n = 9 (Atg3/Df) animal intestines per genotype with 5 cells measured per intestine.(f) Midguts dissected from early third instar larvae that mis-express Atg1GS10797 (Atg1) and Atg3IR only in the DsRed-marked cell clone and analysed by fluorescence and differential interference contrast (DIC) microscopy. Representative images are shown.(g) Midguts dissected from animals expressing Atg4DN specifically in DsRed-marked clones of cells at puparium formation and analysed by fluorescence and differential interference contrast microscopy. Representative images are shown. (h) Cell size quantification (μm2) from g, n = 10 animal intestines per genotype with 1-5 cells measured per intestine.(i) Midguts dissected from animals expressing mCherry-Atg8a in all cells, and expressing UbIR specifically in GFP-marked clones of cells at puparium formation. Representative images are shown.(j) Midguts dissected from animals expressing UbIR specifically in GFP-marked clones of cells at puparium formation and analysed by fluorescence and differential interference contrast microscopy. Representative images are shown. (k) Cell size quantification (μm2) from (j), n = 12 animal intestines per genotype with 1-5 cells measured per intestine.(l,m) Midguts dissected from early third instar larvae that exhibit Atg1GS10797 (Atg1) mis-expression in either a wild-type GFP-positive cell clone (l) or a Uba1H33 loss-of-function MARCM mutant cell clone (GFP-positive; m) and analysed by fluorescence and differential interference contrast microscopy. Control wild-type and heterozygous Uba1H33/wild-type cells have no GFP. Representative images are shown. (n) Quantification (μm2) from l and m, n = 22 (control), n = 16 (Atg1) and n = 6 (Atg1 +Uba1H33) animal intestines per genotype with 1-5 cells measured per intestine. Quantification data for control cells (l,m) were pooled because they are genetically identical. Quantification is shown as mean ± s.d. NS, not significant. Scale bars, 20 μm."}
{"words": ["figf8", "(", "a", ",", "b", ")", "Midguts", "dissected", "from", "either", "early", "third", "instar", "larvae", "(", "a", ")", "or", "at", "puparium", "formation", "(", "b", ")", "that", "express", "GFP", "-", "labelled", "mitochondria", "in", "enterocytes", "(", "larger", "nuclei", ")", "and", "contain", "Uba1H33", "loss", "-", "of", "-", "function", "mutant", "cell", "clones", "(", "lacking", "RFP", ")", ".", "Wild", "-", "type", "control", "cells", "possess", "stronger", "RFP", "and", "heterozygous", "cells", "have", "weaker", "RFP", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "(", "c", ")", "Midguts", "dissected", "at", "puparium", "formation", "that", "express", "Uba1IR", "(", "GFP", "in", "nucleus", "and", "cytoplasm", ")", "and", "stained", "with", "ATP", "synthase", "complex", "V", "(", "ATPV", ")", "to", "detect", "mitochondria", "in", "all", "cells", ".", "Representative", "images", "are", "shown", ".", "(", "d", "-", "f", ")", "Representative", "immuno", "-", "TEM", "images", "of", "Uba1IRclone", "cells", "at", "puparium", "formation", ".", "Uba1IR", "-", "expressing", "cells", "possess", "gold", "particles", ";", "control", "cells", "lack", "gold", "particles", "(", "d", ")", ".", "Control", "cells", "possess", "numerous", "autolysosomes", "in", "the", "cytoplasm", "(", "arrowheads", ")", "and", "few", "mitochondria", "(", "asterisks", ")", ";", "Uba1IR", "-", "expressing", "cells", "possess", "numerous", "mitochondria", "and", "few", "autophagic", "structures", ".", "Scale", "bars", ",", "20", " ", "μm", "(", "a", "-", "c", ")", "and", "1", " ", "μm", "(", "d", "-", "f", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf8(a,b) Midguts dissected from either early third instar larvae (a) or at puparium formation (b) that express GFP-labelled mitochondria in enterocytes (larger nuclei) and contain Uba1H33 loss-of-function mutant cell clones (lacking RFP). Wild-type control cells possess stronger RFP and heterozygous cells have weaker RFP. Representative images are shown.(c) Midguts dissected at puparium formation that express Uba1IR (GFP in nucleus and cytoplasm) and stained with ATP synthase complex V (ATPV) to detect mitochondria in all cells. Representative images are shown.(d-f) Representative immuno-TEM images of Uba1IRclone cells at puparium formation. Uba1IR-expressing cells possess gold particles; control cells lack gold particles (d). Control cells possess numerous autolysosomes in the cytoplasm (arrowheads) and few mitochondria (asterisks); Uba1IR-expressing cells possess numerous mitochondria and few autophagic structures. Scale bars, 20 μm (a-c) and 1 μm (d-f)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "C", "-", "I", ")", "BMDMs", "were", "primed", "with", "LPS", "for", "4", "h", "and", "then", "treated", "with", "LicoB", "for", "1", "h", ",", "prior", "to", "stimulation", "with", "nigericin", "for", "45", "min", "or", "ATP", "for", "1", "h", ".", "Western", "blot", "analyses", "of", "pro", "-", "caspase", "-", "1", "(", "p45", ")", ",", "pro", "-", "IL", "-", "1β", ",", "NLRP3", ",", "and", "ASC", "(", "the", "arrow", "indicates", "ASC", "in", "the", "whole", "cell", "lysate", "(", "WCL", ")", ";", "activated", "caspase", "-", "1", "(", "p20", ")", "and", "cleaved", "IL", "-", "1β", "(", "p17", ")", "in", "the", "culture", "supernatants", "(", "SN", ")", "of", "BMDMs", "(", "C", ",", "G", ")", ".", "Caspase", "-", "1", "activity", "(", "D", ",", "H", ")", ",", "IL", "-", "1β", "secretion", "(", "E", ",", "I", ")", ",", "and", "LDH", "release", "(", "F", ",", "J", ")", "in", "the", "SN", "were", "measured", ".", "Coomassie", "Blue", "staining", "was", "used", "as", "the", "supernatant", "loading", "control", ",", "while", "lamin", "B", "was", "used", "as", "the", "lysate", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(C-I) BMDMs were primed with LPS for 4 h and then treated with LicoB for 1 h, prior to stimulation with nigericin for 45 min or ATP for 1 h. Western blot analyses of pro-caspase-1 (p45), pro-IL-1β, NLRP3, and ASC (the arrow indicates ASC in the whole cell lysate (WCL); activated caspase-1 (p20) and cleaved IL-1β (p17) in the culture supernatants (SN) of BMDMs (C, G). Caspase-1 activity (D, H), IL-1β secretion (E, I), and LDH release (F, J) in the SN were measured. Coomassie Blue staining was used as the supernatant loading control, while lamin B was used as the lysate loading control."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", "-", "C", ")", "BMDMs", "were", "primed", "with", "LPS", "and", "then", "treated", "with", "LicoB", "(", "20", "μΜ", ")", "for", "1", "h", ",", "followed", "by", "stimulation", "with", "nigericin", ",", "ATP", ",", "poly", "(", "I", ":", "C", ")", ",", "or", "MSU", ".", "Pam3CSK4", "-", "primed", "BMDMs", "were", "treated", "with", "LicoB", "(", "20", "μM", ")", "and", "then", "transfected", "with", "LPS", ".", "Western", "blot", "analyses", "of", "pro", "-", "caspase", "-", "1", "(", "p45", ")", ",", "pro", "-", "IL", "-", "1β", ",", "NLRP3", ",", "and", "ASC", "in", "the", "whole", "cell", "lysate", "(", "WCL", ")", ";", "and", "activated", "caspase", "-", "1", "(", "p20", ")", "and", "cleaved", "IL", "-", "1β", "(", "p17", ")", "in", "the", "culture", "supernatants", "(", "SN", ")", "of", "BMDMs", ".", "(", "A", ")", ".", "Caspase", "-", "1", "activity", "(", "B", ")", "and", "IL", "-", "1β", "secretion", "(", "C", ")", "in", "the", "SN", "were", "measured", ".", "(", "D", "-", "F", ")", "LPS", "-", "primed", "BMDMs", "were", "treated", "with", "LicoB", "(", "20", "μM", ")", "for", "1", "h", "and", "then", "stimulated", "with", "nigericin", "for", "45", "min", ",", "or", "poly", "(", "dA", ":", "dT", ")", "/", "Salmonella", "for", "6", "h", ".", "Western", "blot", "analyses", "of", "pro", "-", "caspase", "-", "1", "(", "p45", ")", ",", "pro", "-", "IL", "-", "1β", ",", "NLRP3", ",", "and", "ASC", "in", "the", "whole", "cell", "lysate", "(", "WCL", ")", ";", "and", "activated", "caspase", "-", "1", "(", "p20", ")", "and", "cleaved", "IL", "-", "1β", "(", "p17", ")", "in", "the", "culture", "supernatants", "(", "SN", ")", "of", "BMDMs", "(", "D", ")", ".", "Caspase", "-", "1", "activity", "(", "E", ")", "and", "IL", "-", "1β", "secretion", "(", "F", ")", "in", "the", "SN", "were", "measured", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A-C) BMDMs were primed with LPS and then treated with LicoB (20 μΜ) for 1 h, followed by stimulation with nigericin, ATP, poly (I:C), or MSU. Pam3CSK4-primed BMDMs were treated with LicoB (20 μM) and then transfected with LPS. Western blot analyses of pro-caspase-1 (p45), pro-IL-1β, NLRP3, and ASC in the whole cell lysate (WCL); and activated caspase-1 (p20) and cleaved IL-1β (p17) in the culture supernatants (SN) of BMDMs. (A). Caspase-1 activity (B) and IL-1β secretion (C) in the SN were measured.(D-F) LPS-primed BMDMs were treated with LicoB (20 μM) for 1 h and then stimulated with nigericin for 45 min, or poly(dA:dT)/Salmonella for 6 h. Western blot analyses of pro-caspase-1 (p45), pro-IL-1β, NLRP3, and ASC in the whole cell lysate (WCL); and activated caspase-1 (p20) and cleaved IL-1β (p17) in the culture supernatants (SN) of BMDMs (D). Caspase-1 activity (E) and IL-1β secretion (F) in the SN were measured."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", "-", "C", ")", "LPS", "-", "primed", "BMDMs", "were", "pre", "-", "treated", "with", "the", "indicated", "dose", "of", "LicoB", "for", "1", "h", "and", "then", "stimulated", "with", "ATP", "for", "1", "h", ".", "Western", "blot", "analysis", "was", "used", "to", "detect", "cross", "-", "linked", "ASC", "in", "the", "Triton", "X", "-", "insoluble", "pellet", ",", "the", "arrow", "indicates", "ASC", "(", "A", ")", ".", "Caspase", "-", "1", "activity", "(", "B", ")", "and", "IL", "-", "1β", "secretion", "(", "C", ")", "in", "the", "SN", "were", "measured", "again", "to", "verify", "NLRP3", "activation", ".", "(", "E", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "cross", "-", "linked", "ASC", "in", "the", "Triton", "X", "-", "insoluble", "pellet", "from", "LPS", "-", "primed", "BMDMs", "pre", "-", "treated", "with", "LicoB", "(", "20", "μM", ")", "or", "vehicle", "and", "then", "stimulated", "with", "nigericin", ",", "poly", "(", "dA", ":", "dT", ")", ",", "or", "Salmonella", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A-C) LPS-primed BMDMs were pre-treated with the indicated dose of LicoB for 1 h and then stimulated with ATP for 1 h. Western blot analysis was used to detect cross-linked ASC in the Triton X-insoluble pellet, the arrow indicates ASC (A). Caspase-1 activity (B) and IL-1β secretion (C) in the SN were measured again to verify NLRP3 activation.(E) Western blot analysis of cross-linked ASC in the Triton X-insoluble pellet from LPS-primed BMDMs pre-treated with LicoB (20 μM) or vehicle and then stimulated with nigericin, poly (dA:dT), or Salmonella."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Western", "blot", "analysis", "of", "protein", "in", "whole", "cell", "lysates", "(", "WCL", ")", "from", "BMDMs", "stimulated", "with", "LPS", "for", "3", "h", "and", "then", "treated", "with", "LicoB", "for", "1", "h", "(", "LicoB", "after", "LPS", ")", ",", "or", "BMDMs", "first", "treated", "with", "LicoB", "for", "1", "h", "and", "then", "stimulated", "with", "LPS", "for", "3", "h", "(", "LicoB", "before", "LPS", ")", ".", "(", "I", ")", "Cell", "lysates", "of", "LPS", "-", "primed", "BMDMs", "treated", "with", "/", "without", "nigericin", "were", "incubated", "with", "sepharose", "or", "LicoB", "-", "sepharose", ".", "The", "pull", "-", "down", "samples", "and", "input", "were", "analysed", "using", "Western", "blot", "analysis", ".", "(", "J", ")", "Cell", "lysates", "of", "LPS", "-", "primed", "BMDMs", "were", "incubated", "with", "sepharose", "or", "LicoB", "-", "sepharose", "in", "the", "presence", "of", "different", "concentrations", "of", "free", "LicoB", "(", "0", ".", "5", "mM", "and", "1", "mM", ")", ".", "The", "pull", "-", "down", "samples", "and", "input", "were", "analysed", "using", "Western", "blot", ".", "(", "K", ")", "HEK", "-", "293T", "cells", "were", "transfected", "with", "Flag", "-", "NLRP3", "or", "Flag", "-", "vector", "and", "then", "treated", "with", "LicoB", "(", "40", "μM", ")", ".", "Immunoprecipitation", "was", "performed", "with", "anti", "-", "DYKDDDDK", "(", "Flag", ")", "affinity", "gel", "agarose", "beads", ";", "Western", "blot", "analysis", "has", "been", "shown", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Western blot analysis of protein in whole cell lysates (WCL) from BMDMs stimulated with LPS for 3 h and then treated with LicoB for 1 h (LicoB after LPS), or BMDMs first treated with LicoB for 1 h and then stimulated with LPS for 3 h (LicoB before LPS).(I) Cell lysates of LPS-primed BMDMs treated with/without nigericin were incubated with sepharose or LicoB-sepharose. The pull-down samples and input were analysed using Western blot analysis. (J) Cell lysates of LPS-primed BMDMs were incubated with sepharose or LicoB-sepharose in the presence of different concentrations of free LicoB (0.5 mM and 1 mM). The pull-down samples and input were analysed using Western blot.(K) HEK-293T cells were transfected with Flag-NLRP3 or Flag-vector and then treated with LicoB (40 μM). Immunoprecipitation was performed with anti-DYKDDDDK (Flag) affinity gel agarose beads; Western blot analysis has been shown."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Survival", "of", "WT", "mice", "pre", "-", "treated", "with", "vehicle", ",", "LicoB", "(", "20", "mg", "/", "kg", ")", ",", "LicoB", "(", "40", "mg", "/", "kg", ")", ",", "MCC950", "(", "40", "mg", "/", "kg", ")", ",", "or", "LicoB", "(", "40", "mg", "/", "kg", ")", "+", "MCC950", "(", "40", "mg", "/", "kg", ")", ",", "followed", "by", "i", ".", "p", ".", "injection", "with", "LPS", "(", "20", "mg", "/", "kg", ")", ";", "mice", "survival", "was", "monitored", "for", "72", "h", "(", "n", "=", "10", "mice", "per", "group", ")", ".", "C57BL", "/", "6", "mice", "received", "vehicle", "or", "LicoB", "(", "40", "mg", "/", "kg", ")", "for", "17", "consecutive", "doses", ",", "once", "every", "two", "days", "for", "34", "days", ".", "Following", "that", "treatment", ",", "the", "serum", "levels", "of", "ALT", "(", "H", ")", "(", "n", "=", "8", "mice", "per", "group", ")", ".", "C57BL", "/", "6", "mice", "received", "vehicle", "or", "LicoB", "(", "40", "mg", "/", "kg", ")", "for", "17", "consecutive", "doses", ",", "once", "every", "two", "days", "for", "34", "days", ".", "Following", "that", "treatment", ",", "the", "serum", "levels", "of", "AST", "(", "I", ")", ",", "and", "CRE", "(", "J", ")", "were", "measured", ",", "(", "n", "=", "8", "mice", "per", "group", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Survival of WT mice pre-treated with vehicle, LicoB (20 mg/kg), LicoB (40 mg/kg), MCC950 (40 mg/kg), or LicoB (40 mg/kg) + MCC950 (40 mg/kg), followed by i.p. injection with LPS (20 mg/kg); mice survival was monitored for 72 h (n=10 mice per group).C57BL/6 mice received vehicle or LicoB (40 mg/kg) for 17 consecutive doses, once every two days for 34 days. Following that treatment, the serum levels of ALT (H) (n=8 mice per group).C57BL/6 mice received vehicle or LicoB (40 mg/kg) for 17 consecutive doses, once every two days for 34 days. Following that treatment, the serum levels of AST (I), and CRE (J) were measured, (n=8 mice per group)."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", "-", "D", ")", "Mice", "were", "pre", "-", "treated", "with", "LicoB", "or", "MCC950", "for", "1", "h", ",", "then", "i", ".", "p", ".", "injected", "with", "MSU", "(", "50", "mg", "/", "kg", ")", "and", "treated", "for", "6", "h", "(", "n", "=", "6", "mice", "per", "group", ")", ".", "The", "levels", "of", "IL", "-", "1β", "in", "the", "peritoneal", "lavage", "fluid", "(", "A", ")", "and", "serum", "(", "B", ")", "were", "measured", "using", "ELISA", ".", "Quantification", "of", "peritoneal", "exudate", "cells", "(", "PECs", ")", "(", "C", ")", "and", "neutrophils", "(", "Ly6G", "and", "CD11b", ")", "(", "D", ")", "using", "flow", "cytometry", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A-D) Mice were pre-treated with LicoB or MCC950 for 1 h, then i.p. injected with MSU (50 mg/kg) and treated for 6 h (n=6 mice per group). The levels of IL-1β in the peritoneal lavage fluid (A) and serum (B) were measured using ELISA. Quantification of peritoneal exudate cells (PECs) (C) and neutrophils (Ly6G and CD11b) (D) using flow cytometry."}
{"words": ["Figure", "7Under", "the", "same", "growth", "conditions", "(", "permitted", "water", ",", "free", "food", ",", "and", "a", "12", "h", "/", "12", "h", "dark", "/", "light", "cycle", "at", "20", "±", "2", "°", "C", ")", ",", "eight", "-", "week", "-", "old", "male", "C57BL", "/", "6", "mice", "were", "continuously", "fed", "with", "methionine", "-", "and", "choline", "-", "supplemented", "(", "MCS", ")", "or", "methionine", "-", "and", "choline", "-", "deficient", "(", "MCD", ")", "diets", "for", "6", "weeks", ",", "and", "at", "the", "same", "time", ",", "gavaged", "with", "LicoB", ",", "MCC950", ",", "or", "a", "combination", "of", "LicoB", "and", "MCC950", "(", "n", "=", "8", "mice", "per", "group", "(", "B", ",", "C", "(", "A", ")", "Representative", "liver", "section", "images", "stained", "with", "H", "&", "E", ",", "Sirius", "Red", ",", "and", "Masson", "'", "s", "trichrome", "stains", ".", "Scale", "bar", ":", "0", ".", "5", "cm", "(", "top", "row", ")", "and", "200", "μm", "(", "3", "bottom", "ows", ")", ".", "(", "B", ",", "C", ")", "The", "serum", "levels", "of", "ALT", "and", "AST", "(", "n", "=", "8", "mice", "per", "group", ")", "were", "measured", "using", "ELISA", ".", "Under", "the", "same", "growth", "conditions", "(", "permitted", "water", ",", "free", "food", ",", "and", "a", "12", "h", "/", "12", "h", "dark", "/", "light", "cycle", "at", "20", "±", "2", "°", "C", ")", ",", "eight", "-", "week", "-", "old", "male", "C57BL", "/", "6", "mice", "were", "continuously", "fed", "with", "methionine", "-", "and", "choline", "-", "supplemented", "(", "MCS", ")", "or", "methionine", "-", "and", "choline", "-", "deficient", "(", "MCD", ")", "diets", "for", "6", "weeks", ",", "and", "at", "the", "same", "time", ",", "gavaged", "with", "LicoB", ",", "MCC950", "n", "=", "6", "mice", "per", "group", "Real", "-", "time", "quantitative", "PCR", "was", "used", "to", "detect", "the", "mRNA", "levels", "of", "Col1a1", "(", "E", ")", ",", "TNF", "-", "α", "(", "F", ")", "in", "the", "mice", "livers", ",", "as", "described", "in", "(", "A", ")", "(", "n", "=", "6", "mice", "per", "group", ")", ".", "Under", "the", "same", "growth", "conditions", "(", "permitted", "water", ",", "free", "food", ",", "and", "a", "12", "h", "/", "12", "h", "dark", "/", "light", "cycle", "at", "20", "±", "2", "°", "C", ")", ",", "eight", "-", "week", "-", "old", "male", "C57BL", "/", "6", "mice", "were", "continuously", "fed", "with", "methionine", "-", "and", "choline", "-", "supplemented", "(", "MCS", ")", "or", "methionine", "-", "and", "choline", "-", "deficient", "(", "MCD", ")", "diets", "for", "6", "weeks", ",", "and", "at", "the", "same", "time", ",", "gavaged", "with", "LicoB", ",", "MCC950", "n", "=", "6", "mice", "per", "group", "Real", "-", "time", "quantitative", "PCR", "was", "used", "to", "detect", "the", "mRNA", "levels", "of", "IL", "-", "1β", "(", "G", ")", ",", "and", "IL", "-", "18", "(", "H", ")", "in", "the", "mice", "livers", ",", "as", "described", "in", "(", "A", ")", "(", "n", "=", "6", "mice", "per", "group", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Under the same growth conditions (permitted water, free food, and a 12 h/12 h dark/light cycle at 20±2°C), eight-week-old male C57BL/6 mice were continuously fed with methionine- and choline-supplemented (MCS) or methionine- and choline-deficient (MCD) diets for 6 weeks, and at the same time, gavaged with LicoB, MCC950, or a combination of LicoB and MCC950 (n=8 mice per group (B, C (A) Representative liver section images stained with H&E, Sirius Red, and Masson's trichrome stains. Scale bar: 0.5 cm (top row) and 200 μm (3 bottom ows). (B, C) The serum levels of ALT and AST (n=8 mice per group) were measured using ELISA.Under the same growth conditions (permitted water, free food, and a 12 h/12 h dark/light cycle at 20±2°C), eight-week-old male C57BL/6 mice were continuously fed with methionine- and choline-supplemented (MCS) or methionine- and choline-deficient (MCD) diets for 6 weeks, and at the same time, gavaged with LicoB, MCC950 n=6 mice per group Real-time quantitative PCR was used to detect the mRNA levels of Col1a1 (E), TNF-α (F) in the mice livers, as described in (A) (n=6 mice per group).Under the same growth conditions (permitted water, free food, and a 12 h/12 h dark/light cycle at 20±2°C), eight-week-old male C57BL/6 mice were continuously fed with methionine- and choline-supplemented (MCS) or methionine- and choline-deficient (MCD) diets for 6 weeks, and at the same time, gavaged with LicoB, MCC950 n=6 mice per group Real-time quantitative PCR was used to detect the mRNA levels of IL-1β (G), and IL-18 (H) in the mice livers, as described in (A) (n=6 mice per group)."}
{"words": ["Figure", "1Release", "of", "IL", "-", "6", "and", "/", "or", "TNF", "release", "(", "ELISA", ")", "from", "(", "C", ")", "human", "MoMacs", "(", "n", "=", "6", "-", "8", ")", "Data", "information", "represent", "data", "(", "mean", "+", "SEM", ")", "combined", "from", "'", "n", "'", "(", "given", "in", "brackets", "for", "each", "panel", ")", "technical", "or", "biological", "replicates", "(", "human", "donor", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "according", "to", "Wilcoxon", "signed", "rank", "sum", "(", "Release", "of", "IL", "-", "6", "and", "/", "or", "TNF", "release", "(", "ELISA", ")", "fro", "(", "D", ")", "murine", "BMDMs", "(", "n", "=", "6", "Data", "information", "represent", "data", "(", "mean", "+", "SEM", ")", "combined", "from", "'", "n", "'", "(", "given", "in", "brackets", "for", "each", "panel", ")", "technical", "or", "biological", "replicate", "mic", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "according", "to", "Wilcoxon", "signed", "rank", "sum", "(", "C", ",", "DRelease", "of", "IL", "-", "(", "ELISA", ")", "fro", "THP", "-", "1", "cells", "(", "n", "=", "3", ")", "Data", "information", "I", "one", "representative", "of", "'", "n", "'", "(", "given", "in", "brackets", "for", "each", "panel", ")", "independent", "experiments", "is", "shown", "(", "mean", "+", "SD", ")", "Student", "'", "s", "t", "-", "tes", "(", "f", ")", "GFP", "in", "vivo", "fluorescence", "post", "intradermal", "injection", "of", "chitin", "oligomers", "into", "LysMEGFP", "/", "+", "C57BL", "/", "6", "mice", "(", "n", "=", "3", "/", "group", ")", "Data", "information", "represent", "data", "(", "mean", "+", "SEM", ")", "combined", "from", "'", "n", "'", "(", "given", "in", "brackets", "for", "each", "panel", ")", "technical", "or", "biological", "replicate", "mic", "(", "G", ")", "Representative", "in", "vivo", "imaging", "results", "I", "one", "representative", "of", "'", "n", "'", "(", "given", "in", "brackets", "for", "each", "panel", ")", "independent", "experiments", "is", "shown", "(", "mean", "+", "SD", ")", "Leukocyte", "infiltration", "in", "vivo", "after", "intratracheal", "administration", "assessed", "by", "(", "H", ")", "BALF", "flow", "cytometry", "(", "n", "=", "3", "-", "4", "/", "group", "Data", "information", "represent", "data", "(", "mean", "+", "SEM", ")", "combined", "from", "'", "n", "'", "(", "given", "in", "brackets", "for", "each", "panel", ")", "technical", "or", "biological", "replicate", "mic", ")", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", "(", "HLeukocyte", "infiltration", "in", "vivo", "after", "intratracheal", "administration", "assessed", "b", "(", "I", ")", "histology", "analysis", "(", "n", "=", "2", ")", ",", "scale", "bar", "=", "200", "μm", ",", "arrows", "show", "cellular", "infiltrate", "I", "one", "representative", "of", "'", "n", "'", "(", "given", "in", "brackets", "for", "each", "panel", ")", "independent", "experiments", "is", "shown", "(", "mean", "+", "SD", ")", "A", ".", "thaliana", "seedling", "(", "J", ")", "target", "gene", "mRNA", "induction", "(", "n", "=", "3", "I", "one", "representative", "of", "'", "n", "'", "(", "given", "in", "brackets", "for", "each", "panel", ")", "independent", "experiments", "is", "shown", "(", "mean", "+", "SD", ")", "Student", "'", "s", "t", "-", "tesA", ".", "thalian", "leaf", "piece", "(", "K", ")", "ROS", "production", "(", "0", "-", "45", "min", ",", "n", "=", "6", ")", "Data", "information", "represent", "data", "(", "mean", "+", "SEM", ")", "combined", "from", "'", "n", "'", "(", "given", "in", "brackets", "for", "each", "panel", ")", "technical", "or", "biological", "replicate", "plant"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Release of IL-6 and/or TNF release (ELISA) from (C) human MoMacs (n=6-8) Data information represent data (mean+SEM) combined from 'n' (given in brackets for each panel) technical or biological replicates (human donor * p<0.05 according to Wilcoxon signed rank sum (Release of IL-6 and/or TNF release (ELISA) fro (D) murine BMDMs (n=6 Data information represent data (mean+SEM) combined from 'n' (given in brackets for each panel) technical or biological replicate mic * p<0.05 according to Wilcoxon signed rank sum (C, DRelease of IL- (ELISA) fro THP-1 cells (n=3) Data information I one representative of 'n' (given in brackets for each panel) independent experiments is shown (mean+SD) Student's t-tes (f) GFP in vivo fluorescence post intradermal injection of chitin oligomers into LysMEGFP/+ C57BL/6 mice (n=3/group) Data information represent data (mean+SEM) combined from 'n' (given in brackets for each panel) technical or biological replicate mic(G) Representative in vivo imaging results I one representative of 'n' (given in brackets for each panel) independent experiments is shown (mean+SD)Leukocyte infiltration in vivo after intratracheal administration assessed by (H) BALF flow cytometry (n=3-4/group Data information represent data (mean+SEM) combined from 'n' (given in brackets for each panel) technical or biological replicate mic ), one-way ANOVA (HLeukocyte infiltration in vivo after intratracheal administration assessed b (I) histology analysis (n=2), scale bar = 200 μm, arrows show cellular infiltrate I one representative of 'n' (given in brackets for each panel) independent experiments is shown (mean+SD)A. thaliana seedling (J) target gene mRNA induction (n=3 I one representative of 'n' (given in brackets for each panel) independent experiments is shown (mean+SD) Student's t-tesA. thalian leaf piece (K) ROS production (0-45 min, n=6) Data information represent data (mean+SEM) combined from 'n' (given in brackets for each panel) technical or biological replicate plant leave"}
{"words": ["Figure", "2TNF", "released", "from", "WT", "or", "Myd88", "(", "A", "KO", "BMDM", "(", "total", "n", "=", "6", "-", "9", "/", "group", "combined", "from", "3", "experiments", ")", "Data", "information", ":", "I", "represent", "data", "(", "mean", "+", "SEM", ")", "combined", "from", "'", "n", "'", "technical", "or", "biological", "replicate", "mic", "Student", "'", "t", "-", "testTNF", "released", "from", "W", "or", "Tlr", "KO", "BMDM", "(", "total", "n", "=", "6", "-", "9", "/", "group", "combined", "from", "3", "experiments", ")", "Student", "'", "s", "t", "-", "tes", "(", "C", ")", "IL", "-", "6", "released", "from", "primary", "MoMacs", "(", "n", "=", "5", ")", "treated", "with", "non", "-", "targeting", "(", "NT", ")", ",", "TLR2", "-", "or", "MyD88", "-", "specific", "siRNA", "relative", "to", "NT", "condition", "one", "-", "sample", "t", "-", "tes", "(", "D", ")", "CD62L", "shedding", "from", "human", "PMNs", "(", "n", "=", "4", "-", "8", ")", "with", "or", "without", "isotype", "control", "or", "anti", "-", "TLR2", "blocking", "antibody", "Data", "information", ":", "I", "represent", "data", "(", "mean", "+", "SEM", ")", "combined", "from", "'", "n", "'", "technical", "or", "biological", "replicate", "(", "human", "donor", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "according", "to", "Mann", "-", "Whitney", "(", "E", ")", "IL", "-", "6", "protein", "released", "from", "mock", "or", "TLR2", "Cas9", "-", "CRISPR", "-", "edited", "THP", "-", "1", "cells", "(", "n", "=", "3", ")", "I", "one", "representative", "of", "'", "n", "'", "independent", "experiments", "is", "shown", "(", "mean", "+", "SD", ")", ")", ",", "Student", "'", "s", "t", "-", "tes", "(", "F", ")", "NF", "-", "κB", "activity", "in", "empty", "vector", "(", "EV", ")", "or", "TLR2", "-", "transfected", "HEK293T", "cells", "(", "n", "=", "3", ")", "I", "one", "representative", "of", "'", "n", "'", "independent", "experiments", "is", "shown", "(", "mean", "+", "SD", ")", "(", "G", ")", "MPO", "release", "from", "intradermally", "injected", "WT", "or", "Tlr2", "KO", "mice", "(", "n", "=", "5", "-", "15", "biopsies", "each", ")", "Data", "information", "I", "represent", "data", "(", "mean", "+", "SEM", ")", "combined", "from", "'", "n", "'", "technical", "or", "biological", "replicate", "mic", ")", ",", "Student", "'", "s", "t", "-", "tes", "(", "H", ")", "BALF", "IL", "-", "6", "and", "TNF", "from", "intratracheally", "treated", "WT", "or", "Tlr2", "KO", "mice", "(", "n", "=", "4", "-", "5", "mice", "each", ")", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Dunnett", "'", "s", "multiple", "compariso", "(", "I", ")", "Relative", "IL10", "mRNA", "in", "whole", "blood", "of", "WT", "or", "heterozygous", "TLR2", "R753Q", "carriers", "(", "n", "=", "5", "each", ")", "Data", "information", ":", "I", "represent", "data", "(", "mean", "+", "SEM", ")", "combined", "from", "'", "n", "'", "technical", "or", "biological", "replicate", "(", "human", "donor", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "according", "to", "Mann", "-"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2TNF released from WT or Myd88 (A KO BMDM (total n=6-9/group combined from 3 experiments) Data information: I represent data (mean+SEM) combined from 'n' technical or biological replicate mic Student' t-testTNF released from W or Tlr KO BMDM (total n=6-9/group combined from 3 experiments) Student's t-tes (C) IL-6 released from primary MoMacs (n=5) treated with non-targeting (NT), TLR2- or MyD88-specific siRNA relative to NT condition one-sample t-tes (D) CD62L shedding from human PMNs (n=4-8) with or without isotype control or anti-TLR2 blocking antibody Data information: I represent data (mean+SEM) combined from 'n' technical or biological replicate (human donor * p<0.05 according to Mann-Whitney (E) IL-6 protein released from mock or TLR2 Cas9-CRISPR-edited THP-1 cells (n=3) I one representative of 'n' independent experiments is shown (mean+SD) ), Student's t-tes (F) NF-κB activity in empty vector (EV) or TLR2-transfected HEK293T cells (n=3) I one representative of 'n' independent experiments is shown (mean+SD)  (G) MPO release from intradermally injected WT or Tlr2 KO mice (n=5-15 biopsies each) Data information I represent data (mean+SEM) combined from 'n' technical or biological replicate mic ), Student's t-tes (H) BALF IL-6 and TNF from intratracheally treated WT or Tlr2 KO mice (n=4-5 mice each) one-way ANOVA with Dunnett's multiple compariso  (I) Relative IL10 mRNA in whole blood of WT or heterozygous TLR2 R753Q carriers (n=5 each) Data information: I represent data (mean+SEM) combined from 'n' technical or biological replicate (human donor * p<0.05 according to Mann-Whitney"}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "NF", "-", "κB", "activity", "in", "TLR2", "-", "transfected", "HEK293T", "cells", "(", "n", "=", "3", ")", "Data", "information", "I", "one", "representative", "of", "'", "n", "'", "independent", "experiments", "is", "shown", "(", "mean", "+", "SD", ")", "Student", "'", "s", "t", "-", "tes", "(", "B", ")", "IL", "-", "8", "release", "and", "ROS", "production", "from", "primary", "PMNs", "(", "n", "=", "7", ")", "Data", "information", "represent", "data", "(", "mean", "+", "SEM", ")", "from", "'", "n", "'", "technical", "or", "biological", "replicates", "(", "donors", ")", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "according", "to", "Wilcoxon", "signed", "rank", "su", "(", "D", ")", "IRAK4", "S186", "and", "T345", "phospho", "-", "site", "containing", "IRAK4", "peptides", "quantified", "in", "proteome", "-", "wide", "phospho", "-", "screen", "in", "THP", "-", "1", "cells", "(", "n", "=", "1", ")", "Data", "informatio", "I", "one", "representative", "of", "'", "n", "'", "independent", "experiments", "is", "shown", "(", "mean", "+", "SD", ")", "for", "details", "on", "data", "acquisition", "and", "analysis", "for", "panel", "see", "Expanded", "View", "Information", "(", "F", ")", "Microarray", "intensities", "(", "excerpt", ")", "of", "chitin", "-", "specific", "signature", "genes", "(", "n", "=", "5", ")", "Data", "information", "represent", "data", "(", "mean", "+", "SEM", ")", "from", "'", "n", "'", "technical", "or", "biological", "replicates", "(", "donors", ")", "for", "details", "on", "data", "acquisition", "and", "analysis", "for", "panels", "(", "D", "-", "F", ")", "see", "Expanded", "View", "Information", "(", "G", ")", "Relative", "cytokine", "mRNAs", "in", "whole", "blood", "stimulation", "(", "n", "=", "5", "-", "13", ")", "Data", "information", "represent", "data", "(", "mean", "+", "SEM", ")", "from", "'", "n", "'", "technical", "or", "biological", "replicates", "(", "donors", ")", "*", "p", "<", "0", ".", "05", "according", "to", "Wilcoxon", "signed", "rank"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3 (A) NF-κB activity in TLR2-transfected HEK293T cells (n=3) Data information I one representative of 'n' independent experiments is shown (mean+SD) Student's t-tes (B) IL-8 release and ROS production from primary PMNs (n=7) Data information represent data (mean+SEM) from 'n' technical or biological replicates (donors) * p<0.05 according to Wilcoxon signed rank su (D) IRAK4 S186 and T345 phospho-site containing IRAK4 peptides quantified in proteome-wide phospho-screen in THP-1 cells (n=1) Data informatio I one representative of 'n' independent experiments is shown (mean+SD) for details on data acquisition and analysis for panel see Expanded View Information (F) Microarray intensities (excerpt) of chitin-specific signature genes (n=5) Data information represent data (mean+SEM) from 'n' technical or biological replicates (donors) for details on data acquisition and analysis for panels (D-F) see Expanded View Information (G) Relative cytokine mRNAs in whole blood stimulation (n=5-13) Data information represent data (mean+SEM) from 'n' technical or biological replicates (donors) * p<0.05 according to Wilcoxon signed rank su"}
{"words": ["Figure", "4Flow", "cytometric", "quantificatio", "of", "Alexa647", "-", "labeled", "C10", "-", "15", "interaction", "with", "mTLR2", "-", "Fc", "Protein", "(", "n", "=", "4", "each", ")", "Data", "information", ":", "Quantification", "sub", "-", "panel", "represent", "data", "(", "mean", "+", "SE", "combined", "from", "'", "n", "'", "biological", "replicate", "mic", "I", "one", "representative", "of", "'", "n", "'", "independent", "experiments", "is", "show", "p", "<", "0", ".", "05", "according", "to", "Mann", "-", "Whitney", "U", "(", "Amicroscale", "thermophoresis", "(", "MST", ")", "analysis", "(", "B", ")", "of", "Alexa647", "-", "labeled", "C10", "-", "15", "interaction", "with", "mTLR2", "-", "Fc", "Protein", "(", "n", "=", "4", "each", ")", "I", "one", "representative", "of", "'", "n", "'", "independent", "experiments", "is", "show", "(", "C", ")", "Flow", "cytometr", "of", "Candida", "albicans", "stained", "with", "control", "IgG", "or", "mTLR2", "-", "Fc", "anti", "-", "Fc", "-", "Alexa594", ",", "together", "with", "ConA", "-", "Alexa488", "and", "CFW", "(", "n", "=", "4", "each", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "5", "μm", "Data", "information", ":", "Quantification", "sub", "-", "panel", "represent", "data", "(", "mean", "+", "SE", "combined", "from", "'", "n", "'", "biological", "replicate", "mic", "I", "one", "representative", "of", "'", "n", "'", "independent", "experiments", "is", "show", "one", "-", "sample", "t", "-", "test", "(", "C", "(", "D", ")", "fluorescence", "microscopy", "of", "Candida", "albicans", "stained", "with", "control", "IgG", "or", "mTLR2", "-", "Fc", "anti", "-", "Fc", "-", "Alexa594", ",", "together", "with", "ConA", "-", "Alexa488", "and", "CFW", "(", "n", "=", "4", "each", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "5", "μm", "I", "one", "representative", "of", "'", "n", "'", "independent", "experiments", "is", "show", "(", "g", ")", "MST", "analysis", "of", "Alexa647", "-", "labeled", "C10", "-", "15", "and", "mTLR2", "-", "Fc", "protein", "with", "SSL3", "titration", "(", "n", "=", "2", ")", "Data", "information", "I", "one", "representative", "of", "'", "n", "'", "independent", "experiments", "is", "show", "(", "H", ")", "NF", "-", "κB", "activation", "in", "TLR2", "-", "transfected", "HEK293T", "cells", "(", "n", "=", "3", "Data", "information", "I", "one", "representative", "of", "'", "n", "'", "independent", "experiments", "is", "shown", "(", "for", "asmean", "+", "SD", ")", ")", ",", "Student", "'", "s", "t", "-", "tesIL", "-", "8", "release", "from", "primary", "PMNs", "(", "n", "=", "2", ")", "without", "or", "with", "SSL3", "Data", "information", "I", "one", "representative", "of", "'", "n", "'", "independent", "experiments", "is", "show", "asmean", "+", "SD", ")", "Student", "'", "s", "t", "-", "tes", "(", "J", ")", "BALF", "TNF", "in", "C57BL", "/", "6", "mice", "(", "n", "=", "5", "/", "group", ")", "upon", "C10", "-", "15", "administration", "without", "or", "with", "SSL3", "Data", "information", ":", "Quantificatio", "-", "panel", "represent", "data", "(", "mean", "+", "SE", "combined", "from", "'", "n", "'", "biological", "replicate", "mic", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Dunnett", "'", "s", "multiple", "comparison", "(", "J", ")", "(", "K", ")", "ROS", "production", "between", "0", "and", "45", "min", "post", "chitin", "application", "in", "A", ".", "thaliana", "leaf", "pieces", "(", "n", "=", "6", ")", "Data", "information", ":", "Quantificatio", "panels", "(", "represent", "dat", "mean", "±", "SD", "in", "K", "combined", "from", "'", "n", "'", "biological", "replicate", "plant", "leave", "(", "L", ")", "MST", "analysis", "of", "Alexa647", "-", "labeled", "C10", "-", "15", "and", "mTLR2", "-", "Fc", "Protein", "with", "C5", "titration", "(", "n", "=", "2", ")", "Data", "informatio", "I", "one", "representative", "of", "'", "n", "'", "independent", "experiments", "is"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Flow cytometric quantificatio of Alexa647-labeled C10-15 interaction with mTLR2-Fc Protein (n=4 each) Data information: Quantification sub-panel represent data (mean+SE combined from 'n' biological replicate mic I one representative of 'n' independent experiments is show p<0.05 according to Mann-Whitney U (Amicroscale thermophoresis (MST) analysis (B) of Alexa647-labeled C10-15 interaction with mTLR2-Fc Protein (n=4 each) I one representative of 'n' independent experiments is show(C) Flow cytometr of Candida albicans stained with control IgG or mTLR2-Fc anti-Fc-Alexa594, together with ConA-Alexa488 and CFW (n=4 each). Scale bar = 5 μm Data information: Quantification sub-panel represent data (mean+SE combined from 'n' biological replicate mic I one representative of 'n' independent experiments is show one-sample t-test (C(D) fluorescence microscopy of Candida albicans stained with control IgG or mTLR2-Fc anti-Fc-Alexa594, together with ConA-Alexa488 and CFW (n=4 each). Scale bar = 5 μm I one representative of 'n' independent experiments is show (g) MST analysis of Alexa647-labeled C10-15 and mTLR2-Fc protein with SSL3 titration (n=2) Data information I one representative of 'n' independent experiments is show(H) NF-κB activation in TLR2-transfected HEK293T cells (n=3 Data information I one representative of 'n' independent experiments is shown (for asmean+SD) ), Student's t-tesIL-8 release from primary PMNs (n=2) without or with SSL3 Data information I one representative of 'n' independent experiments is show asmean+SD) Student's t-tes (J) BALF TNF in C57BL/6 mice (n=5/group) upon C10-15 administration without or with SSL3 Data information: Quantificatio -panel represent data (mean+SE combined from 'n' biological replicate mic one-way ANOVA with Dunnett's multiple comparison (J) (K) ROS production between 0 and 45 min post chitin application in A. thaliana leaf pieces (n=6) Data information: Quantificatio panels ( represent dat mean±SD in K combined from 'n' biological replicate plant leave (L) MST analysis of Alexa647-labeled C10-15 and mTLR2-Fc Protein with C5 titration (n=2) Data informatio I one representative of 'n' independent experiments is show"}
{"words": ["Figure", "1B", ".", "Screening", "results", "of", "compounds", "competing", "Dvl", "-", "CXXC5", "interaction", ".", "Each", "2", "μM", "of", "the", "compounds", "was", "used", "for", "competing", "as", "described", "in", "Fig", "1A", ".", "[", "n", "=", "3", "]", "C", ",", "D", ".", "Primary", "calvaria", "cells", "were", "treated", "with", "2", "μM", "of", "each", "compound", "for", "2", "days", ".", "The", "cells", "were", "subjected", "to", "immunofluorescence", "analyses", "to", "visualize", "β", "-", "catenin", "(", "C", ";", "green", ")", ".", "The", "relative", "numbers", "of", "β", "-", "catenin", "-", "positive", "nuclei", "were", "counted", "(", "D", ")", ".", "[", "n", "=", "3", "]", "E", ",", "F", ".", "The", "calvariae", "from", "4", "-", "day", "-", "old", "mice", "were", "cultured", "ex", "vivo", "for", "7", "days", "with", "2", "µM", "of", "each", "compound", ".", "Representative", "calvaria", "sections", "were", "visualized", "by", "H", "&", "amp", ";", "amp", ";", "E", "staining", "(", "E", ")", ".", "The", "calvaria", "thicknesses", "were", "measured", "from", "the", "images", "using", "Image", "Pro", "software", "(", "F", ")", ".", "[", "n", "=", "3", "]"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B . Screening results of compounds competing Dvl-CXXC5 interaction. Each 2 μM of the compounds was used for competing as described in Fig 1A. [n=3]C, D. Primary calvaria cells were treated with 2 μM of each compound for 2 days. The cells were subjected to immunofluorescence analyses to visualize β-catenin (C; green). The relative numbers of β-catenin-positive nuclei were counted (D). [n=3]E, F . The calvariae from 4-day-old mice were cultured ex vivo for 7 days with 2 µM of each compound. Representative calvaria sections were visualized by H&amp;amp;E staining (E). The calvaria thicknesses were measured from the images using Image Pro software (F). [n=3]"}
{"words": ["Figure", "2B", ".", "A", "competition", "curve", "for", "the", "Dvl", "-", "CXXC5", "interaction", "by", "KY", "-", "02061", ".", "C", "-", "E", ".", "NMR", "titration", "analyses", "for", "Dvl", "PZD", "domain", "with", "KY", "-", "02061", ".", "1H", "-", "15N", "-", "HSQC", "analyses", "were", "performed", "to", "analyze", "the", "interaction", "of", "15N", "-", "labelled", "Dvl", "-", "PDZ", "domain", "with", "KY", "-", "02061", ".", "The", "1H", "-", "15N", "-", "HSQC", "spectrum", "of", "different", "molar", "ratios", "(", "Dvl", "PDZ", "domain", ":", "KY", "-", "02061", ")", "are", "displayed", "as", "red", "(", "1", ":", "0", ")", ",", "orange", "(", "1", ":", "10", ")", ",", "purple", "(", "1", ":", "20", ")", ",", "cyan", "(", "1", ":", "40", ")", ",", "green", "(", "1", ":", "60", ")", "and", "blue", "(", "1", ":", "80", ")", "(", "C", ",", "residues", "with", "meaningful", "chemical", "shift", "change", "are", "indicated", "by", "arrows", ")", ".", "Plot", "of", "chemical", "shift", "changes", "(", "Δδ", ")", "as", "a", "function", "of", "residue", "number", "in", "molecular", "ratio", "1", ":", "80", "(", "D", ",", "a", "red", "-", "colored", "line", "indicates", "the", "line", "for", "Δδ", "=", "0", ".", "05", ")", ".", "The", "residues", "with", "Δδ", "greater", "than", "0", ".", "05", "are", "visualized", "as", "a", "stick", "model", "on", "the", "ribbon", "representation", "of", "the", "Dvl", "PDZ", "domain", "structure", "(", "E", ")", ".", "F", ".", "Molecular", "docking", "of", "Dvl", "binding", "motif", "(", "DBM", ")", "or", "KY", "-", "02061", "to", "Dvl", "PDZ", "domain", "were", "analyzed", "by", "in", "silico", "experiments", ".", "The", "superimposed", "structure", "of", "DBM", "(", "green", ")", "and", "KY", "-", "02061", "(", "yellow", ")", "on", "the", "surface", "of", "Dvl", "PDZ", "domain", "(", "gray", ")", "was", "visualized", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B . A competition curve for the Dvl-CXXC5 interaction by KY-02061.C-E. NMR titration analyses for Dvl PZD domain with KY-02061. 1H-15N-HSQC analyses were performed to analyze the interaction of 15N-labelled Dvl-PDZ domain with KY-02061. The 1H-15N-HSQC spectrum of different molar ratios (Dvl PDZ domain:KY-02061) are displayed as red (1:0), orange (1:10), purple (1:20), cyan (1:40), green (1:60) and blue (1:80) (C, residues with meaningful chemical shift change are indicated by arrows). Plot of chemical shift changes (Δδ) as a function of residue number in molecular ratio 1:80 (D, a red-colored line indicates the line for Δδ=0.05). The residues with Δδ greater than 0.05 are visualized as a stick model on the ribbon representation of the Dvl PDZ domain structure (E).F. Molecular docking of Dvl binding motif (DBM) or KY-02061 to Dvl PDZ domain were analyzed by in silico experiments. The superimposed structure of DBM (green) and KY-02061 (yellow) on the surface of Dvl PDZ domain (gray) was visualized."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "MC3T3E1", "cells", "were", "transfected", "with", "pTOPFLASH", "together", "with", "pCMV", "-", "β", "-", "gal", ".", "After", "24", "h", ",", "the", "cells", "were", "treated", "with", "DMSO", ",", "KY", "-", "02061", "in", "DMSO", ",", "or", "5", "µM", "PolyR", "-", "DBM", "for", "2", "days", ".", "The", "luciferase", "activities", "of", "whole", "cell", "lysates", "were", "measured", "and", "normalized", "with", "β", "-", "galactosidase", "activities", ".", "[", "n", "=", "3", "]", "B", ".", "Primary", "calvaria", "cells", "were", "isolated", "from", "the", "calvariae", "of", "4", "-", "day", "-", "old", "mice", "(", "Manton", "et", "al", ",", "2007", ")", ",", "and", "treated", "with", "DMSO", "or", "KY", "-", "02061", "in", "DMSO", "for", "4", "days", ".", "ALP", "activity", "levels", "were", "visualized", "by", "ALP", "staining", ".", "C", ".", "Primary", "calvaria", "cells", "were", "treated", "with", "DMSO", "or", "5", "µM", "KY", "-", "02061", "in", "DMSO", "for", "14", "days", ".", "The", "cells", "were", "subjected", "to", "immunofluorescence", "analyses", "to", "visualize", "Runx2", "(", "green", ")", "and", "β", "-", "catenin", "(", "red", ")", ".", "The", "cell", "nuclei", "were", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "D", ",", "E", ".", "Calvariae", "from", "4", "-", "day", "-", "old", "mice", "were", "cultured", "ex", "vivo", "for", "7", "days", "with", "KY", "-", "02061", "in", "DMSO", "(", "D", ")", ".", "The", "calvaria", "thicknesses", "were", "measured", "from", "the", "stained", "sections", "using", "Image", "Pro", "software", "(", "E", ")", ".", "[", "n", "=", "3", "]"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A . MC3T3E1 cells were transfected with pTOPFLASH together with pCMV-β-gal. After 24 h, the cells were treated with DMSO, KY-02061 in DMSO, or 5 µM PolyR-DBM for 2 days. The luciferase activities of whole cell lysates were measured and normalized with β-galactosidase activities. [n=3]B . Primary calvaria cells were isolated from the calvariae of 4-day-old mice (Manton et al, 2007), and treated with DMSO or KY-02061 in DMSO for 4 days. ALP activity levels were visualized by ALP staining.C. Primary calvaria cells were treated with DMSO or 5 µM KY-02061 in DMSO for 14 days. The cells were subjected to immunofluorescence analyses to visualize Runx2 (green) and β-catenin (red). The cell nuclei were counterstained with DAPI (blue).D, E. Calvariae from 4-day-old mice were cultured ex vivo for 7 days with KY-02061 in DMSO (D). The calvaria thicknesses were measured from the stained sections using Image Pro software (E). [n=3]"}
{"words": ["Figure", "4B", ".", "A", "competition", "curve", "for", "the", "Dvl", "-", "CXXC5", "interaction", "by", "KY", "-", "02327", ".", "C", ".", "Fluorescence", "quenching", "plot", "of", "Dvl", "PDZ", "domain", "upon", "addition", "of", "different", "amounts", "of", "KY", "-", "02327", ".", "From", "top", "to", "bottom", "final", "moral", "ratio", "between", "Dvl", "PDZ", "and", "KY", "-", "02327", "was", ",", "1", ":", "0", ",", "1", ":", "1", ",", "1", ":", "2", ",", "1", ":", "3", ",", "1", ":", "4", ",", "1", ":", "5", ",", "1", ":", "6", ",", "1", ":", "7", ",", "1", ":", "8", ",", "1", ":", "9", ",", "1", ":", "10", ",", "1", ":", "15", ",", "1", ":", "20", "and", "1", ":", "25", ",", "respectively", ".", "D", "-", "F", ".", "1H", "-", "15N", "-", "HSQC", "analyses", "were", "performed", "to", "analyze", "the", "interaction", "of", "15N", "-", "labelled", "Dvl", "-", "PDZ", "domain", "with", "KY", "-", "02327", ".", "The", "1H", "-", "15N", "-", "HSQC", "spectrum", "of", "different", "molar", "ratios", "(", "Dvl", "PDZ", "domain", ":", "KY", "-", "02327", ")", "are", "displayed", "as", "red", "(", "1", ":", "0", ")", ",", "yellow", "(", "1", ":", "5", ")", ",", "green", "(", "1", ":", "10", ")", ",", "and", "magenta", "(", "1", ":", "20", ")", "(", "D", ",", "residues", "with", "meaningful", "chemical", "shift", "change", "are", "indicated", "by", "arrows", ")", ".", "Plot", "of", "chemical", "shift", "changes", "(", "Δδ", ")", "as", "a", "function", "of", "residue", "number", "in", "molecular", "ratio", "1", ":", "20", "(", "E", ",", "a", "red", "-", "colored", "line", "indicates", "the", "line", "for", "Δδ", "=", "0", ".", "05", ")", ".", "The", "residues", "with", "Δδ", "greater", "than", "0", ".", "05", "are", "visualized", "as", "a", "stick", "model", "on", "the", "ribbon", "representation", "of", "the", "Dvl", "PDZ", "domain", "structure", "(", "F", ")", ".", "G", ".", "Molecular", "docking", "of", "KY", "-", "02061", "or", "KY", "-", "02327", "to", "Dvl", "PDZ", "domain", "were", "analyzed", "by", "in", "silico", "experiments", ".", "The", "superimposed", "structure", "of", "KY", "-", "02061", "(", "yellow", ")", "and", "KY", "-", "02327", "(", "cyan", ")", "on", "the", "surface", "of", "Dvl", "PDZ", "domain", "(", "gray", ")", "was", "visualized", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B. A competition curve for the Dvl-CXXC5 interaction by KY-02327.C. Fluorescence quenching plot of Dvl PDZ domain upon addition of different amounts of KY-02327. From top to bottom final moral ratio between Dvl PDZ and KY-02327 was, 1:0, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:15, 1:20 and 1:25, respectively.D-F. 1H-15N-HSQC analyses were performed to analyze the interaction of 15N-labelled Dvl-PDZ domain with KY-02327. The 1H-15N-HSQC spectrum of different molar ratios (Dvl PDZ domain:KY-02327) are displayed as red (1:0), yellow (1:5), green (1:10), and magenta (1:20) (D, residues with meaningful chemical shift change are indicated by arrows). Plot of chemical shift changes (Δδ) as a function of residue number in molecular ratio 1:20 (E, a red-colored line indicates the line for Δδ=0.05). The residues with Δδ greater than 0.05 are visualized as a stick model on the ribbon representation of the Dvl PDZ domain structure (F).G. Molecular docking of KY-02061 or KY-02327 to Dvl PDZ domain were analyzed by in silico experiments. The superimposed structure of KY-02061 (yellow) and KY-02327 (cyan) on the surface of Dvl PDZ domain (gray) was visualized."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "MC3T3E1", "cells", "were", "transfected", "with", "pTOPFLASH", "together", "with", "pCMV", "-", "β", "-", "gal", ".", "After", "24", "h", ",", "the", "cells", "were", "treated", "with", "indicated", "dose", "of", "KY", "-", "02327", "for", "2", "days", ".", "The", "luciferase", "activities", "of", "whole", "cell", "lysates", "were", "measured", "and", "normalized", "with", "β", "-", "galactosidase", "activities", ".", "[", "n", "=", "3", "]", "B", "-", "C", ".", "MC3T3E1", "cells", "were", "treated", "with", "indicated", "concentrations", "of", "KY", "-", "02327", "for", "2", "days", ".", "β", "-", "Catenin", "and", "α", "-", "tubulin", "were", "detected", "by", "immunoblot", ".", "B", "-", "C", ".", "MC3T3E1", "cells", "were", "treated", "with", "indicated", "concentrations", "of", "KY", "-", "02327", "for", "2", "days", ".", "β", "-", "Catenin", "and", "α", "-", "tubulin", "were", "detected", "by", "immunoblot", "(", "B", ")", "or", "immunofluorescence", "(", "C", ")", "analyses", ".", "Nuclei", "were", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "C", ",", "blue", ")", ".", "D", ".", "MC3T3E1", "cells", "were", "treated", "with", "indicated", "concentrations", "of", "KY", "-", "02327", "for", "14", "days", ".", "The", "mRNA", "level", "of", "collagen", "1a", "(", "Col1a", ")", "was", "measured", "by", "quantitative", "real", "-", "time", "qRT", "-", "PCR", ".", "[", "n", "=", "3", "]", "E", ".", "MC3T3E1", "cells", "were", "treated", "with", "indicated", "concentrations", "of", "KY", "-", "02327", "for", "21", "days", ".", "The", "mRNA", "level", "of", "osteocalcin", "(", "OCN", ")", "was", "measured", "by", "qRT", "-", "PCR", ".", "[", "n", "=", "3", "]"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A . MC3T3E1 cells were transfected with pTOPFLASH together with pCMV-β-gal. After 24 h, the cells were treated with indicated dose of KY-02327 for 2 days. The luciferase activities of whole cell lysates were measured and normalized with β-galactosidase activities. [n=3]B-C . MC3T3E1 cells were treated with indicated concentrations of KY-02327 for 2 days. β-Catenin and α-tubulin were detected by immunoblot.B-C . MC3T3E1 cells were treated with indicated concentrations of KY-02327 for 2 days. β-Catenin and α-tubulin were detected by immunoblot (B) or immunofluorescence (C) analyses. Nuclei were counterstained with DAPI (C, blue).D. MC3T3E1 cells were treated with indicated concentrations of KY-02327 for 14 days. The mRNA level of collagen 1a (Col1a) was measured by quantitative real-time qRT-PCR. [n=3]E. MC3T3E1 cells were treated with indicated concentrations of KY-02327 for 21 days. The mRNA level of osteocalcin (OCN) was measured by qRT-PCR. [n=3]"}
{"words": ["Figure", "6A", "-", "F", ".", "Vehicle", "or", "20", "mg", "of", "KY", "-", "02327", "per", "kg", "of", "animal", "body", "weight", "(", "mpk", ")", "was", "orally", "administered", "or", "0", ".", "06", "mpk", "of", "the", "N", "-", "terminal", "fragment", "of", "PTH", "(", "amino", "acids", "1", "-", "34", ")", "was", "subcutaneously", "injected", "into", "the", "Sham", "-", "operated", "(", "Sham", ")", "or", "ovariectomized", "(", "OVX", ")", "mice", "on", "5", "sequential", "days", "per", "week", "for", "4", "weeks", "[", "n", "=", "4", "]", ".", "After", "calcein", "injection", ",", "the", "prepared", "femoral", "sections", "of", "the", "OVX", "mice", "were", "examined", "under", "fluorescence", "microscope", "to", "visualize", "integrated", "calcein", "(", "A", ",", "green", ",", "arrows", ")", ".", "Nuclei", "were", "counterstained", "with", "DAPI", "(", "A", ",", "blue", ")", ".", "Osteoblast", "numbers", "(", "B", ")", "and", "calcein", "double", "labelled", "surfaces", "(", "C", ")", "were", "measured", "in", "the", "femoral", "sections", ".", "A", "-", "F", ".", "Vehicle", "or", "20", "mg", "of", "KY", "-", "02327", "per", "kg", "of", "animal", "body", "weight", "(", "mpk", ")", "was", "orally", "administered", "or", "0", ".", "06", "mpk", "of", "the", "N", "-", "terminal", "fragment", "of", "PTH", "(", "amino", "acids", "1", "-", "34", ")", "was", "subcutaneously", "injected", "into", "the", "Sham", "-", "operated", "(", "Sham", ")", "or", "ovariectomized", "(", "OVX", ")", "mice", "on", "5", "sequential", "days", "per", "week", "for", "4", "weeks", "[", "n", "=", "4", "]", ".", "The", "mouse", "femurs", "were", "analyzed", "using", "micro", "-", "CT", "and", "BMD", "(", "D", ")", "and", "BV", "/", "TV", "(", "E", ")", "were", "calculated", "from", "the", "micro", "-", "CT", "data", ".", "A", "-", "F", ".", "Vehicle", "or", "20", "mg", "of", "KY", "-", "02327", "per", "kg", "of", "animal", "body", "weight", "(", "mpk", ")", "was", "orally", "administered", "or", "0", ".", "06", "mpk", "of", "the", "N", "-", "terminal", "fragment", "of", "PTH", "(", "amino", "acids", "1", "-", "34", ")", "was", "subcutaneously", "injected", "into", "the", "Sham", "-", "operated", "(", "Sham", ")", "or", "ovariectomized", "(", "OVX", ")", "mice", "on", "5", "sequential", "days", "per", "week", "for", "4", "weeks", "[", "n", "=", "4", "]", ".", "The", "three", "-", "dimensional", "images", "of", "femoral", "trabecular", "bone", "were", "reconstructed", "(", "F", ")", ",", "and", "trabecular", "number", "(", "G", ")", "and", "trabecular", "separation", "(", "H", ")", "were", "calculated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A-F. Vehicle or 20 mg of KY-02327 per kg of animal body weight (mpk) was orally administered or 0.06 mpk of the N-terminal fragment of PTH (amino acids 1-34) was subcutaneously injected into the Sham-operated (Sham) or ovariectomized (OVX) mice on 5 sequential days per week for 4 weeks [n=4]. After calcein injection, the prepared femoral sections of the OVX mice were examined under fluorescence microscope to visualize integrated calcein (A, green, arrows). Nuclei were counterstained with DAPI (A, blue). Osteoblast numbers (B) and calcein double labelled surfaces (C) were measured in the femoral sections.A-F. Vehicle or 20 mg of KY-02327 per kg of animal body weight (mpk) was orally administered or 0.06 mpk of the N-terminal fragment of PTH (amino acids 1-34) was subcutaneously injected into the Sham-operated (Sham) or ovariectomized (OVX) mice on 5 sequential days per week for 4 weeks [n=4]. The mouse femurs were analyzed using micro-CT and BMD (D) and BV/TV (E) were calculated from the micro-CT data.A-F. Vehicle or 20 mg of KY-02327 per kg of animal body weight (mpk) was orally administered or 0.06 mpk of the N-terminal fragment of PTH (amino acids 1-34) was subcutaneously injected into the Sham-operated (Sham) or ovariectomized (OVX) mice on 5 sequential days per week for 4 weeks [n=4]. The three-dimensional images of femoral trabecular bone were reconstructed (F), and trabecular number (G) and trabecular separation (H) were calculated."}
{"words": ["Figure", "2B", ",", "C", "Kinetic", "change", "of", "mRNA", "expression", "of", "Top1", ",", "Btbd1", ",", "Tdp1", ",", "and", "Srsf1", "in", "microglia", "following", "LPS", "/", "IFNγ", "stimulation", "(", "n", "=", "6", ",", "technical", "replicates", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Dunnett", "'", "s", "Multiple", "Comparison", "test", "for", "(", "B", "and", "C", ")", ",", "D", ",", "E", "The", "protein", "expression", "of", "TOP1", "was", "detected", "by", "Western", "blotting", "(", "n", "=", "3", ",", "biological", "replicates", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "the", "student", "'", "s", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ".", "F", "-", "H", "Immunostaining", "of", "TOP1", "(", "red", ")", "in", "stimulated", "microglia", "(", "4", "h", "after", "LPS", "/", "IFNγ", "stimulation", ")", "or", "resting", "microglia", ",", "co", "-", "stained", "with", "Hoechst", "(", "blue", ")", "(", "bar", "=", "20", "μm", ")", ";", "for", "the", "lower", "-", "left", "panel", "in", "(", "H", ")", ",", "n", "=", "3", "technical", "replicates", "per", "group", "(", "2", "to", "5", "random", "fields", "per", "well", "were", "analyzed", ")", ";", "for", "the", "lower", "right", "panel", ",", "201", "cells", "from", "unstimulated", "microglia", "and", "256", "cells", "from", "stimulated", "microglia", "were", "analyzed", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "the", "student", "'", "s", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ".", "G", "Immunofluorescent", "staining", "of", "spinal", "cord", "sections", "from", "mice", "at", "EAE", "peak", "and", "control", "mice", "with", "anti", "-", "F4", "/", "80", "(", "green", ")", ",", "TOP1", "(", "magenta", ")", ",", "and", "nuclei", "with", "Hoechst", "(", "blue", ")", ".", "For", "the", "left", "panels", ",", "bar", "=", "400", "μm", ";", "for", "the", "magnified", "panels", ",", "bar", "=", "100", "μm", ".", "The", "yellow", "arrowhead", "indicates", "a", "representative", "F4", "/", "80", "+", "cell", "with", "high", "TOP1", "expression", ".", "I", "A", "magnified", "image", "of", "the", "selected", "region", "(", "white", "box", ")", "in", "(", "G", ")", ";", "bar", "=", "50", "F4", "/", "80", "+", "cell", "with", "increased", "TOP1", "expression", "in", "the", "nucleus", "in", "(", "G", ")", ".", "J", "The", "mean", "fluorescent", "intensity", "of", "TOP1", "expression", "in", "the", "white", "matter", "in", "(", "G", ")", "was", "graphed", ";", "n", "=", "3", "to", "4", "mice", "per", "group", "with", "3", "-", "5", "sections", "from", "each", "mouse", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "the", "student", "'", "s", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ".", "K", "TOP1", "expression", "in", "the", "spinal", "cord", "homogenates", "of", "EAE", "mice", "dissected", "at", "disease", "peak", "(", "scored", "3", ")", "or", "control", "mice", "were", "examined", "by", "Western", "blotting", ".", "L", "The", "quantification", "of", "TOP1", "protein", "expression", "of", "Western", "blot", "bands", "in", "(", "K", ")", "with", "normalization", "to", "GAPDH", "and", "β", "-", "actin", "(", "n", "=", "3", "biological", "samples", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "the", "student", "'", "s", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ".", "M", ",", "Western", "blotting", "of", "TOP1", "expression", "from", "brain", "homogenates", "of", "mice", "receiving", "intracisternal", "LPS", "injection", "or", "PBS", "after", "8", "h", "(", "n", "=", "4", "or", "5", "biological", "samples", ")", ".", "TOP1", "expression", "from", "brain", "homogenates", "of", "mice", "receiving", "intracisternal", "LPS", "injection", "or", "PBS", "after", "8", "h", "(", "n", "=", "4", "or", "5", "biological", "samples", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "the", "student", "'", "s", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ".", "O", "Microglia", "were", "sorted", "from", "LPS", "challenged", "mice", "(", "i", ".", "p", ")", "after", "4", "h", "or", "naive", "mice", ",", "and", "the", "mRNA", "expression", "of", "TOP1", "was", "graphed", "(", "n", "=", "5", "or", "6", "biological", "samples", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "the", "student", "'", "s", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", ".", "P", "Brain", "sections", "from", "healthy", "control", "and", "MS", "brain", "tissues", ",", "including", "the", "active", "MS", "lesion", ",", "chronic", "active", "lesion", ",", "and", "the", "normal", "-", "appearing", "white", "matter", "(", "NAWM", ")", ",", "were", "stained", "with", "anti", "-", "HLA", "-", "DR", ",", "anti", "-", "TOP1", ",", "and", "co", "-", "stained", "with", "Hoechst", "(", "bar", "=", "50", "μm", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B, C Kinetic change of mRNA expression of Top1, Btbd1, Tdp1, and Srsf1 in microglia following LPS/IFNγ stimulation (n = 6, technical replicates). Data information: Data are presented as the mean ± s.e.m. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; Statistical analyses were performed using two-way ANOVA with Dunnett's Multiple Comparison test for (B and C),D, E The protein expression of TOP1 was detected by Western blotting (n = 3, biological replicates). Data information: Data are presented as the mean ± s.e.m. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 Statistical analyses were performed using the student's unpaired two-tailed t-test.F-H Immunostaining of TOP1 (red) in stimulated microglia (4 h after LPS/IFNγ stimulation) or resting microglia, co-stained with Hoechst (blue) (bar = 20 μm); for the lower-left panel in (H), n = 3 technical replicates per group (2 to 5 random fields per well were analyzed); for the lower right panel, 201 cells from unstimulated microglia and 256 cells from stimulated microglia were analyzed. Data information: Data are presented as the mean ± s.e.m. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; Statistical analyses were performed using the student's unpaired two-tailed t-test.G Immunofluorescent staining of spinal cord sections from mice at EAE peak and control mice with anti-F4/80 (green), TOP1 (magenta), and nuclei with Hoechst (blue). For the left panels, bar = 400 μm; for the magnified panels, bar = 100 μm. The yellow arrowhead indicates a representative F4/80+ cell with high TOP1 expression.I A magnified image of the selected region (white box) in (G); bar = 50 F4/80+ cell with increased TOP1 expression in the nucleus in (G). J The mean fluorescent intensity of TOP1 expression in the white matter in (G) was graphed; n = 3 to 4 mice per group with 3-5 sections from each mouse. Data information: Data are presented as the mean ± s.e.m. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 Statistical analyses were performed using the student's unpaired two-tailed t-test.K TOP1 expression in the spinal cord homogenates of EAE mice dissected at disease peak (scored 3) or control mice were examined by Western blotting. L The quantification of TOP1 protein expression of Western blot bands in (K) with normalization to GAPDH and β-actin (n = 3 biological samples). Data information: Data are presented as the mean ± s.e.m. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 Statistical analyses were performed using the student's unpaired two-tailed t-test.M, Western blotting of TOP1 expression from brain homogenates of mice receiving intracisternal LPS injection or PBS after 8 h (n = 4 or 5 biological samples).TOP1 expression from brain homogenates of mice receiving intracisternal LPS injection or PBS after 8 h (n = 4 or 5 biological samples). Data information: Data are presented as the mean ± s.e.m. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 Statistical analyses were performed using the student's unpaired two-tailed t-test.O Microglia were sorted from LPS challenged mice (i.p) after 4 h or naive mice, and the mRNA expression of TOP1 was graphed (n = 5 or 6 biological samples). Data information: Data are presented as the mean ± s.e.m. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001 Statistical analyses were performed using the student's unpaired two-tailed t-test.P Brain sections from healthy control and MS brain tissues, including the active MS lesion, chronic active lesion, and the normal-appearing white matter (NAWM), were stained with anti-HLA-DR, anti-TOP1, and co-stained with Hoechst (bar = 50 μm)."}
{"words": ["Figure", "3C", ",", "D", "Immunostaining", "of", "iNOS", "(", "red", ")", "and", "Phalloidin", "(", "green", ")", "in", "microglia", "(", "n", "=", "3", "technical", "replicates", "with", "more", "than", "5", "random", "fields", "per", "well", ")", "(", "bar", "=", "50", "μm", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "shown", "are", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "n", ".", "s", ".", "=", "no", "statistical", "significance", ".", "Statistical", "analyses", "were", "performed", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Dunnett", "'", "s", "Multiple", "Comparison", "Test", "for", "(", "D", ")"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3C, D Immunostaining of iNOS (red) and Phalloidin (green) in microglia (n = 3 technical replicates with more than 5 random fields per well) (bar = 50 μm). Data information: Data shown are mean ± s.e.m. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001; n.s. = no statistical significance. Statistical analyses were performed using one-way ANOVA with Dunnett's Multiple Comparison Test for (D)"}
{"words": ["Figure", "4B", "Microglia", "in", "the", "hippocampus", "and", "thalamus", "were", "stained", "with", "Iba1", "(", "red", ")", ";", "bar", "=", "50", "μm", ";", "microglia", "in", "the", "yellow", "boxes", "were", "presented", "in", "(", "E", ")", ".", "C", ",", "D", "Fluorescent", "intensity", "of", "Iba1", "in", "hippocampus", "and", "thalamus", "in", "(", "B", ")", ";", "n", "=", "2", ",", "4", ",", "5", "mice", "for", "naive", ",", "LPS", ",", "and", "LPS", "+", "TPT", "group", ",", "respectively", "(", "2", "-", "6", "sections", "per", "mouse", "were", "analyzed", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "shown", "are", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "n", ".", "s", ".", "=", "no", "statistical", "significance", ".", "Statistical", "analyses", "comparing", "the", "LPS", "_", "PBS", "group", "with", "the", "LPS", "_", "TPT", "group", "were", "performed", "using", "the", "Student", "'", "s", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "-", "testL", ",", "M", "Cytokine", "array", "on", "brain", "homogenates", "after", "24", "h", "of", "LPS", "challenge", "(", "n", "=", "2", "mice", "for", "the", "naïve", "group", ";", "n", "=", "3", "mice", "for", "the", "LPS", "and", "LPS", "+", "TPT", "groups", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B Microglia in the hippocampus and thalamus were stained with Iba1 (red); bar = 50 μm; microglia in the yellow boxes were presented in (E).C, D Fluorescent intensity of Iba1 in hippocampus and thalamus in (B); n = 2, 4, 5 mice for naive, LPS, and LPS + TPT group, respectively (2-6 sections per mouse were analyzed). Data information: Data shown are mean ± s.e.m. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; n.s. = no statistical significance. Statistical analyses comparing the LPS_PBS group with the LPS_TPT group were performed using the Student's unpaired two-tailed t-testL, M Cytokine array on brain homogenates after 24 h of LPS challenge (n = 2 mice for the naïve group; n = 3 mice for the LPS and LPS + TPT groups)."}
{"words": ["Figure", "6K", "Spinal", "cord", "sections", "dissected", "from", "Day", "30", "from", "the", "EAE", "batch", "in", "(", "H", ")", "were", "stained", "with", "CD11b", "(", "red", ")", ",", "Fluoromyelin", "(", "green", ")", ",", "and", "Hoechst", "(", "blue", ")", "(", "bar", "=", "200", "μm", ")", ".", "L", "The", "CD11b", "immunofluorescent", "intensity", "in", "(", "K", ")", "was", "graphed", "(", "n", "=", "2", "mice", "for", "the", "control", "group", ";", "n", "=", "4", "mice", "for", "the", "EAE", "-", "PBS", "and", "EAE", "-", "TPT", "groups", ")", ".", "M", "The", "percentage", "of", "demyelinated", "area", "in", "the", "white", "matter", "of", "the", "spinal", "cord", "was", "graphed", "(", "n", "=", "2", "mice", "for", "the", "control", "group", ",", "n", "=", "4", "mice", "for", "the", "EAE", "-", "PBS", "and", "EAE", "-", "TPT", "groups", ")", ".", "Data", "information", ":", "Data", "are", "presented", "as", "the", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ";", "the", "Student", "'", "s", "unpaired", "two", "-", "tailed", "t", "-", "test", "was", "used", "for", "comparing", "the", "EAE", "-", "PBS", "group", "with", "the", "EAE", "-", "TPT", "group", "in", "L", ",", "and", "M", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6K Spinal cord sections dissected from Day 30 from the EAE batch in (H) were stained with CD11b (red), Fluoromyelin (green), and Hoechst (blue) (bar = 200 μm). L The CD11b immunofluorescent intensity in (K) was graphed (n = 2 mice for the control group; n = 4 mice for the EAE-PBS and EAE-TPT groups). M The percentage of demyelinated area in the white matter of the spinal cord was graphed (n = 2 mice for the control group, n = 4 mice for the EAE-PBS and EAE-TPT groups). Data information: Data are presented as the mean ± s.e.m. *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0.001; the Student's unpaired two-tailed t-test was used for comparing the EAE-PBS group with the EAE-TPT group in L, and M."}
{"words": ["Figure", "1A", "RNA", "-", "seq", ".", "of", "freshly", "isolated", ",", "proliferating", "and", "differentiating", "satellite", "cells", "reveals", "an", "increased", "expression", "of", "linc", "-", "MYH", "in", "proliferating", "and", "differentiating", "MuSCs", ",", "but", "no", "expression", "is", "found", "in", "in", "freshly", "isolated", "MuSCs", ".", "Expression", "of", "linc", "-", "MYH", "is", "confined", "to", "skeletal", "muscle", "in", "mouse", "(", "B", ")", "tissues", ".", "Expression", "of", "linc", "-", "MYH", "is", "confined", "to", "skeletal", "muscle", "in", "human", "(", "C", ")", "tissues", ".", "D", "Expression", "of", "linc", "-", "MYH", "is", "not", "detected", "in", "limb", "buds", "at", "E10", ".", "5", "(", "n", "=", "3", ")", ",", "E13", ".", "5", "(", "n", "=", "3", ")", "and", "E15", ".", "5", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Expression", "of", "linc", "-", "MYH", "in", "hindlimb", "muscle", "of", "E18", ".", "5", ",", "newborn", "and", "7", "day", "old", "animals", "(", "n", "=", "3", "/", "3", "/", "3", ")", ".", "Expression", "of", "linc", "-", "MYH", "in", "m", ".", "soleus", "(", "soleus", ")", ",", "m", ".", "tibialis", "anterior", "(", "TA", ")", "and", "and", "m", ".", "extensor", "digitorum", "longus", "(", "EDL", ")", "muscle", "at", "3", "weeks", "(", "n", "=", "3", ")", "and", "8", "weeks", "of", "age", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "Biological", "replicates", "were", "used", "for", "all", "PCR", "experiments", ",", "data", "are", "mean", " ", "±", " ", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "E", "Murine", "linc", "-", "Myh", "is", "localized", "in", "nuclear", "extracts", "of", "C2C12", "cells", ".", "Xist", "(", "nuclear", ")", "and", "Gapdh", "(", "mainly", "cytoplasmic", ")", "were", "used", "as", "controls", "(", "n", "=", "2", "nuclear", "/", "3", "cytoplasmic", "biological", "replicates", ".", ")", "Data", "are", "mean", " ", "±", " ", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "F", "-", "H", "RNA", "-", "FISH", "identifies", "linc", "-", "Myh", "in", "nuclei", "(", "DAPI", ",", "blue", ")", "of", "C2C12", "myoblasts", ".", "(", "G", ")", "Adipor", "(", "cytoplasmic", ")", "and", "(", "H", ")", "Xist", "(", "nuclear", ")", "were", "used", "as", "controls", ".", "(", "J", ")", "Heat", "map", "of", "proteins", "pulled", "down", "in", "the", "same", "experiments", "as", "in", "I", ",", "demonstrating", "that", "INO80", "chromatin", "remodeler", "complex", "exclusively", "interacts", "with", "linc", "-", "MYH", ".", "Blue", "color", "indicates", "pull", "-", "down", "of", "the", "respective", "protein", ",", "white", "color", "indicates", "that", "the", "protein", "was", "not", "detected", "in", "the", "respective", "sample", ".", "RNA", "-", "IP", "experiments", "using", "an", "anti", "-", "INO80", "antibody", "to", "isolate", "the", "INO80", "complex", "from", "murine", "C2C12", "cells", "(", "K", ")", "INO80", "in", "L", "refer", "to", "replicate", "INO80", "precipitation", "experiments", ".", "Precipitated", "RNAs", "were", "detected", "by", "RT", "-", "PCR", ".", "RNA", "-", "IP", "experiments", "using", "an", "anti", "-", "INO80", "antibody", "to", "isolate", "the", "INO80", "complex", "from", "human", "HSMM", "cells", "(", "L", ")", ".", "INO80", "II", "in", "L", "refer", "to", "replicate", "INO80", "precipitation", "experiments", ".", "Precipitated", "RNAs", "were", "detected", "by", "RT", "-", "PCR", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A RNA-seq. of freshly isolated, proliferating and differentiating satellite cells reveals an increased expression of linc-MYH in proliferating and differentiating MuSCs, but no expression is found in in freshly isolated MuSCs.Expression of linc-MYH is confined to skeletal muscle in mouse (B) tissues.Expression of linc-MYH is confined to skeletal muscle in human (C) tissues.D Expression of linc-MYH is not detected in limb buds at E10.5 (n = 3), E13.5 (n = 3) and E15.5 (n = 3). Expression of linc-MYH in hindlimb muscle of E18.5, newborn and 7 day old animals (n = 3/3/3). Expression of linc-MYH in m. soleus (soleus), m. tibialis anterior (TA) and and m. extensor digitorum longus (EDL) muscle at 3 weeks (n = 3) and 8 weeks of age (n = 5). Biological replicates were used for all PCR experiments, data are mean ± S.E.M.E Murine linc-Myh is localized in nuclear extracts of C2C12 cells. Xist (nuclear) and Gapdh (mainly cytoplasmic) were used as controls (n = 2 nuclear / 3 cytoplasmic biological replicates.) Data are mean ± S.E.M.F-H RNA-FISH identifies linc-Myh in nuclei (DAPI, blue) of C2C12 myoblasts. (G) Adipor (cytoplasmic) and (H) Xist (nuclear) were used as controls.(J) Heat map of proteins pulled down in the same experiments as in I, demonstrating that INO80 chromatin remodeler complex exclusively interacts with linc-MYH. Blue color indicates pull-down of the respective protein, white color indicates that the protein was not detected in the respective sample.RNA-IP experiments using an anti-INO80 antibody to isolate the INO80 complex from murine C2C12 cells (K) INO80 in L refer to replicate INO80 precipitation experiments. Precipitated RNAs were detected by RT-PCR.RNA-IP experiments using an anti-INO80 antibody to isolate the INO80 complex from human HSMM cells (L). INO80 II in L refer to replicate INO80 precipitation experiments. Precipitated RNAs were detected by RT-PCR."}
{"words": ["Figure", "2Body", "weight", "(", "A", ")", "of", "male", "linc", "-", "MYH", "KO", "and", "ctrl", "mice", "at", "10", "weeks", "(", "n", "=", "24", "KO", "/", "17", "WT", ";", "Student", "'", "s", "t", "test", ",", "two", "-", "tailed", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", "tibia", "length", "(", "B", ")", "of", "male", "linc", "-", "MYH", "KO", "and", "ctrl", "mice", "of", "10", "weeks", "(", "n", "=", "9", "KO", "/", "13", "WT", ";", "Student", "'", "s", "t", "test", ",", "two", "-", "tailed", ",", "not", "significant", ")", ".", "Data", "are", "mean", " ", "±", " ", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "C", ",", "D", "Weight", "of", "m", ".", "tibialis", "anterior", "(", "TA", ")", "and", "m", ".", "digitorum", "longus", "(", "EDL", ")", "of", "male", "linc", "-", "MYH", "KO", "and", "ctrl", "mice", "at", "10", "weeks", "(", "n", "=", "9", "KO", "/", "10", "WT", "for", "TA", ",", "n", "=", "10", "KO", "/", "11", "WT", "for", "EDL", ";", "Student", "'", "s", "t", "test", ",", "two", "-", "tailed", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ")", ".", "Data", "are", "mean", " ", "±", " ", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "Size", "distribution", "of", "fibers", "in", "cross", "sections", "of", "TA", "(", "E", ",", "F", ")", "and", "EDL", "(", "G", ",", "H", ")", "muscle", "in", "male", "linc", "-", "MYH", "KO", "(", "blue", ")", "and", "ctrl", "(", "grey", ")", "animals", "at", "10", "weeks", ".", "A", "significant", "increase", "of", "fiber", "size", "was", "observed", "for", "TA", "and", "EDL", "muscles", "of", "linc", "-", "MYH", "KO", "mice", "(", "n", "=", "5", "KO", "/", "4", "WT", "for", "TA", ",", "n", "=", "3", "KO", "/", "3", "WT", "for", "EDL", "muscle", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Fisher", "'", "s", "multiple", "comparisons", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", ">", "250", "fibers", "per", "animal", "were", "counted", ")", ".", "Data", "are", "mean", " ", "±", " ", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "Size", "distribution", "of", "fibers", "in", "cross", "sections", "of", "TA", "and", "EDL", "muscle", "in", "male", "linc", "-", "MYH", "KO", "(", "blue", ")", "and", "ctrl", "(", "grey", ")", "animals", "at", "10", "weeks", ".", "A", "significant", "increase", "of", "fiber", "size", "was", "observed", "for", "TA", "and", "EDL", "muscles", "of", "linc", "-", "MYH", "KO", "mice", "(", "n", "=", "5", "KO", "/", "4", "WT", "for", "TA", ",", "n", "=", "3", "KO", "/", "3", "WT", "for", "EDL", "muscle", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "Fisher", "'", "s", "multiple", "comparisons", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ";", ">", "250", "fibers", "per", "animal", "were", "counted", ")", ".", "Data", "are", "mean", " ", "±", " ", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "K", "Numbers", "of", "myonuclei", "in", "cross", "sections", "of", "TA", "and", "EDL", "muscle", "(", "TA", ":", "n", "=", "6", "KO", "/", "6", "WT", ",", "EDL", "n", "=", "3", "KO", "/", "3", "WT", "animals", ",", "Mann", "-", "Whitney", "test", "one", "-", "tailed", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "05", ")", "Data", "are", "mean", " ", "±", " ", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "L", "-", "O", "Number", "of", "myonuclei", "/", "fiber", "and", "of", "Pax7pos", "(", "red", ")", "MuSCs", "(", "red", "arrows", ")", "on", "myofibers", "isolated", "from", "flexor", "digitorum", "brevis", "muscle", ".", "Nuclei", "were", "stained", "using", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", "in", "L", "indicates", "50", "µm", "for", "L", "and", "M", ".", "(", "N", ")", "The", "number", "of", "myonuclei", "/", "isolated", "fiber", "is", "increased", "in", "linc", "-", "MYH", "KO", "compared", "to", "WT", "myofibers", "(", "n", "=", "4", "KO", "/", "4", "WT", ",", ">", "26", "fibers", "/", "animal", ";", "Mann", "-", "Whitney", "test", "two", "-", "tailed", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "(", "O", ")", "Number", "of", "MuSCs", "on", "isolated", "fibers", "from", "linc", "-", "MYH", "KO", "and", "WT", "mice", "(", "n", "=", "4", "KO", "/", "4", "WT", "animals", ",", "Mann", "-", "Whitney", "test", "two", "-", "tailed", ";", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ")", ".", "Data", "are", "mean", " ", "±", " ", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "P", "-", "S", "Number", "of", "Pax7", "(", "red", ")", "positive", "MuSCs", "in", "cross", "sections", "of", "tibialis", "anterior", "muscle", "(", "P", "-", "R", ")", ";", "the", "relative", "amount", "of", "quiescent", "MuSCs", "identified", "by", "double", "staining", "(", "yellow", "arrows", ")", "for", "Pax7", "and", "CalcR", "(", "green", ")", "does", "not", "significantly", "differ", "between", "WT", "and", "linc", "-", "MYH", "KO", "animals", "(", "S", ")", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", "in", "P", "indicates", "25", "µm", "for", "P", "and", "Q", ".", "(", "n", "=", "3", "KO", "/", "3", "WT", "animals", ",", "Mann", "-", "Whitney", "test", "one", "-", "tailed", ";", "*", "p", "=", "0", ".", "05", ",", "ns", ":", "not", "significant", ")", ".", "All", "data", "are", "mean", " ", "±", " ", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "T", "The", "number", "of", "MuSC", "-", "related", "events", "in", "FACS", "experiments", "is", "significantly", "increased", "in", "linc", "-", "MYH", "-", "KO", "animals", "(", "n", "=", "7", "KO", "/", "7", "WT", ",", "Student", "'", "s", "t", "test", ",", "two", "-", "tailed", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0126", ")", ".", "Data", "are", "mean", " ", "±", " ", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "U", "-", "V", "Structure", "of", "MuSCs", "and", "the", "heterochromatin", "content", "of", "MuSC", "nuclei", "is", "not", "changed", "in", "linc", "-", "MYH", "KO", "(", "V", ")", "compared", "to", "WT", "mice", "(", "U", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Body weight (A) of male linc-MYH KO and ctrl mice at 10 weeks (n = 24 KO/17 WT; Student's t test, two-tailed, **p < 0.01)tibia length (B) of male linc-MYH KO and ctrl mice of 10 weeks (n = 9 KO/13 WT; Student's t test, two-tailed, not significant). Data are mean ± S.E.M.C, D Weight of m. tibialis anterior (TA) and m. digitorum longus (EDL) of male linc-MYH KO and ctrl mice at 10 weeks (n = 9 KO/10 WT for TA, n = 10 KO/11 WT for EDL; Student's t test, two-tailed, **p < 0.01, ***p<0.001). Data are mean ± S.E.M.Size distribution of fibers in cross sections of TA (E, F) and EDL (G, H) muscle in male linc-MYH KO (blue) and ctrl (grey) animals at 10 weeks. A significant increase of fiber size was observed for TA and EDL muscles of linc-MYH KO mice (n = 5 KO/4 WT for TA, n = 3 KO/3 WT for EDL muscle, two-way ANOVA with Fisher's multiple comparisons; *p < 0.05, **p < 0.01; > 250 fibers per animal were counted). Data are mean ± S.E.M.Size distribution of fibers in cross sections of TA and EDL muscle in male linc-MYH KO (blue) and ctrl (grey) animals at 10 weeks. A significant increase of fiber size was observed for TA and EDL muscles of linc-MYH KO mice (n = 5 KO/4 WT for TA, n = 3 KO/3 WT for EDL muscle, two-way ANOVA with Fisher's multiple comparisons; *p < 0.05, **p < 0.01; > 250 fibers per animal were counted). Data are mean ± S.E.M.K Numbers of myonuclei in cross sections of TA and EDL muscle (TA: n = 6 KO/6 WT, EDL n = 3 KO/3 WT animals, Mann-Whitney test one-tailed, **p<0.01, *p = 0.05) Data are mean ± S.E.M.L-O Number of myonuclei / fiber and of Pax7pos (red) MuSCs (red arrows) on myofibers isolated from flexor digitorum brevis muscle. Nuclei were stained using DAPI (blue). Scale bar in L indicates 50 µm for L and M. (N) The number of myonuclei / isolated fiber is increased in linc-MYH KO compared to WT myofibers (n = 4 KO/4 WT, > 26 fibers/animal; Mann-Whitney test two-tailed, * p < 0.05). (O) Number of MuSCs on isolated fibers from linc-MYH KO and WT mice (n = 4 KO/4 WT animals, Mann-Whitney test two-tailed; ****p < 0.0001). Data are mean ± S.E.M.P-S Number of Pax7 (red) positive MuSCs in cross sections of tibialis anterior muscle (P-R); the relative amount of quiescent MuSCs identified by double staining (yellow arrows) for Pax7 and CalcR (green) does not significantly differ between WT and linc-MYH KO animals (S). Nuclei were stained with DAPI (blue). Scale bar in P indicates 25 µm for P and Q. (n = 3 KO/3 WT animals, Mann-Whitney test one-tailed; *p = 0.05, ns: not significant). All data are mean ± S.E.M.T The number of MuSC-related events in FACS experiments is significantly increased in linc-MYH-KO animals (n = 7 KO/7 WT, Student's t test, two-tailed, *p = 0.0126). Data are mean ± S.E.M.U-V Structure of MuSCs and the heterochromatin content of MuSC nuclei is not changed in linc-MYH KO (V) compared to WT mice (U)."}
{"words": ["Figure", "3RNA", "in", "situ", "hybridization", "proximity", "ligation", "assay", "(", "rISH", "-", "PLA", ")", "detects", "the", "close", "proximity", "of", "a", "specific", "RNA", "with", "proteins", "in", "situ", "modified", "from", "Roussis", "et", "al", ".", ".", "(", "B", "-", "C", ")", "rISH", "-", "PLA", "confirms", "the", "proximity", "of", "linc", "-", "MYH", "to", "endogenous", "INO80", "-", "V5", "in", "the", "nucleus", "of", "proliferating", "WT", "MuSCs", "(", "B", ")", ".", "The", "specific", "signal", "is", "lost", "in", "linc", "-", "MYH", "deficient", "MuSCs", "(", "C", ")", ".", "(", "n", "=", "3", "WT", "/", "3", "KO", "biological", "replicates", ";", "Mann", "-", "Whitney", "test", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "05", ")", ".", "Data", "are", "mean", " ", "±", " ", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "E", "-", "I", "Representative", "images", "of", "TA", "muscle", "sections", "of", "10", "weeks", "old", "mice", "stained", "for", "PAX7", "(", "green", ")", "and", "EdU", "incorporation", "(", "red", ")", ".", "MuSCs", "without", "(", "green", "arrows", ")", "and", "with", "EdU", "-", "labeling", "(", "red", "arrows", ")", "are", "indicated", ".", "(", "E", ",", "F", ")", "Deletion", "of", "linc", "-", "MYH", "results", "in", "increased", "numbers", "of", "muscle", "stem", "cells", "and", "pronounced", "increase", "of", "the", "ratio", "of", "EdU", "-", "positive", "MuSCs", ".", "(", "G", "-", "I", ")", "The", "increase", "in", "both", "the", "number", "of", "MuSCs", "and", "EdU", "positive", "MuSCs", "in", "linc", "-", "MYH", "mutant", "muscle", "is", "abolished", "by", "constitutive", "(", "G", ":", "Pax7", "-", "Crepos", "/", "INO80", "-", "/", "-", ",", "Ino80", "KO", ";", "H", ":", "linc", "-", "MYH", "-", "/", "-", "/", "Pax7", "-", "Crepos", "/", "INO80", "-", "/", "-", ",", "dKO", ")", "and", "induced", "(", "I", ":", "linc", "-", "MYH", "-", "/", "-", "/", "Pax7", "-", "CreERT2pos", "/", "INO80", "-", "/", "-", ",", "dKO", "CreERT", ")", "deletion", "of", "INO80", "in", "Pax7", "expressing", "cells", ".", "Statistical", "evaluation", "of", "the", "number", "of", "muscle", "stem", "cells", "observed", "in", "TA", "muscles", "(", "J", ")", ".", ";", "(", "n", "=", "5", "WT", "/", "5", "linc", "-", "MYH", "KO", "/", "4", "Ino80", "KO", "/", "5", "dKO", "/", "3", "CreERT", "dKO", "animals", "in", "J", "/", "K", ",", "n", "=", "6", "WT", "/", "6", "linc", "-", "MYH", "KO", "/", "5", "Ino80", "KO", "/", "6", "dKO", "/", "3", "CreERT", "dKO", "animals", "in", "L", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", ">", "31", "MSCs", "/", "animal", "in", "K", ";", "ANOVA", "test", "with", "multiple", "comparisons", "against", "WT", ".", "Sidak", "-", "Holm", "correction", "was", "used", ".", "Data", "are", "mean", " ", "±", " ", "S", ".", "E", ".", "M", ".", ")", ".", "Statistical", "evaluation", "of", "the", "ratio", "of", "EdU", "-", "incorporating", "MuSCs", "relative", "to", "all", "Pax7", "-", "positive", "MuSCs", "(", "K", ")", ".", ";", "(", "n", "=", "5", "WT", "/", "5", "linc", "-", "MYH", "KO", "/", "4", "Ino80", "KO", "/", "5", "dKO", "/", "3", "CreERT", "dKO", "animals", "in", "J", "/", "K", ",", "n", "=", "6", "WT", "/", "6", "linc", "-", "MYH", "KO", "/", "5", "Ino80", "KO", "/", "6", "dKO", "/", "3", "CreERT", "dKO", "animals", "in", "L", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", ">", "31", "MSCs", "/", "animal", "in", "K", ";", "ANOVA", "test", "with", "multiple", "comparisons", "against", "WT", ".", "Sidak", "-", "Holm", "correction", "was", "used", ".", "Data", "are", "mean", " ", "±", " ", "S", ".", "E", ".", "M", ".", ")", ".", "Statistical", "evaluation", "of", "the", "number", "of", "myonuclei", "in", "myofibers", "of", "TA", "muscles", "from", "different", "genotypes", "(", "L", ")", "(", "n", "=", "5", "WT", "/", "5", "linc", "-", "MYH", "KO", "/", "4", "Ino80", "KO", "/", "5", "dKO", "/", "3", "CreERT", "dKO", "animals", "in", "J", "/", "K", ",", "n", "=", "6", "WT", "/", "6", "linc", "-", "MYH", "KO", "/", "5", "Ino80", "KO", "/", "6", "dKO", "/", "3", "CreERT", "dKO", "animals", "in", "L", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", ">", "31", "MSCs", "/", "animal", "in", "K", ";", "ANOVA", "test", "with", "multiple", "comparisons", "against", "WT", ".", "Sidak", "-", "Holm", "correction", "was", "used", ".", "Data", "are", "mean", " ", "±", " ", "S", ".", "E", ".", "M", ".", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3RNA in situ hybridization proximity ligation assay (rISH-PLA) detects the close proximity of a specific RNA with proteins in situ modified from Roussis et al.. (B-C) rISH-PLA confirms the proximity of linc-MYH to endogenous INO80-V5 in the nucleus of proliferating WT MuSCs (B). The specific signal is lost in linc-MYH deficient MuSCs (C). (n = 3 WT/3 KO biological replicates; Mann-Whitney test, *p = 0.05). Data are mean ± S.E.M.E-I Representative images of TA muscle sections of 10 weeks old mice stained for PAX7 (green) and EdU incorporation (red). MuSCs without (green arrows) and with EdU-labeling (red arrows) are indicated. (E, F) Deletion of linc-MYH results in increased numbers of muscle stem cells and pronounced increase of the ratio of EdU-positive MuSCs. (G-I) The increase in both the number of MuSCs and EdU positive MuSCs in linc-MYH mutant muscle is abolished by constitutive (G: Pax7-Crepos / INO80-/-, Ino80 KO; H: linc-MYH-/- / Pax7-Crepos / INO80-/-, dKO) and induced (I: linc-MYH-/- / Pax7-CreERT2pos / INO80-/-, dKO CreERT) deletion of INO80 in Pax7 expressing cells.Statistical evaluation of the number of muscle stem cells observed in TA muscles (J). ; (n = 5 WT/5 linc-MYH KO/4 Ino80 KO/5 dKO/3 CreERT dKO animals in J/K, n = 6 WT/6 linc-MYH KO/5 Ino80 KO/6 dKO/3 CreERT dKO animals in L **p < 0.01, ****p <0.0001, > 31 MSCs /animal in K; ANOVA test with multiple comparisons against WT. Sidak-Holm correction was used. Data are mean ± S.E.M.).Statistical evaluation of the ratio of EdU-incorporating MuSCs relative to all Pax7-positive MuSCs (K). ; (n = 5 WT/5 linc-MYH KO/4 Ino80 KO/5 dKO/3 CreERT dKO animals in J/K, n = 6 WT/6 linc-MYH KO/5 Ino80 KO/6 dKO/3 CreERT dKO animals in L **p < 0.01, ****p <0.0001, > 31 MSCs /animal in K; ANOVA test with multiple comparisons against WT. Sidak-Holm correction was used. Data are mean ± S.E.M.).Statistical evaluation of the number of myonuclei in myofibers of TA muscles from different genotypes (L) (n = 5 WT/5 linc-MYH KO/4 Ino80 KO/5 dKO/3 CreERT dKO animals in J/K, n = 6 WT/6 linc-MYH KO/5 Ino80 KO/6 dKO/3 CreERT dKO animals in L **p < 0.01, ****p <0.0001, > 31 MSCs /animal in K; ANOVA test with multiple comparisons against WT. Sidak-Holm correction was used. Data are mean ± S.E.M.)."}
{"words": ["Figure", "4A", "-", "D", "Isolated", "linc", "-", "MYH", "KO", "MuSCs", "reach", "confluence", "much", "faster", "than", "WT", "MuSCs", "indicating", "higher", "proliferation", "rates", ".", "Deletion", "of", "INO80", "eliminates", "the", "difference", "between", "Pax7", "-", "Crepos", "/", "INO80", "-", "/", "-", "(", "Ino80", "KO", ")", "and", "linc", "-", "MYH", "-", "/", "-", "/", "linc", "-", "MYH", "-", "/", "-", "/", "Pax7", "-", "Crepos", "/", "INO80", "-", "/", "-", "(", "dKO", ")", ".", "Images", "are", "representative", "images", "for", "cultures", "after", "13", "days", "in", "culture", ".", "E", "Differences", "in", "proliferation", "rates", "are", "abolished", "by", "additional", "deletion", "of", "INO80", "in", "MuSCs", ".", "Cell", "confluence", "was", "monitored", "by", "a", "live", "cell", "imaging", "analysis", "system", "for", "13", "days", "(", "n", "=", "7", "WT", "/", "6", "linc", "-", "MYH", "KO", "/", "3", "Ino80", "KO", "/", "3", "dKO", "independent", "preparations", "of", "MuSCs", ")", ".", "F", "Statistical", "analysis", "of", "cell", "confluence", "after", "13", "days", "of", "muscle", "stem", "cell", "proliferation", "(", "n", "=", "7", "WT", "/", "6", "linc", "-", "MYH", "KO", "/", "3", "Ino80", "KO", "/", "3", "dKO", "independent", "preparations", "of", "MuSCs", ",", "Student", "'", "s", "t", "test", ",", "two", "-", "tailed", ";", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "ns", "=", "not", "significant", ")", ".", "Data", "are", "mean", " ", "±", " ", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "G", "-", "I", "Gene", "set", "enrichment", "analysis", "(", "GSEA", ",", "broadinstitute", ".", "org", ")", "of", "microarray", "data", "from", "proliferating", "MuSCs", ".", "Comparison", "of", "linc", "-", "MYH", "-", "/", "-", "vs", ".", "WT", "proliferating", "MuSC", "transcriptomes", "shows", "enrichment", "of", "genes", "related", "to", "cell", "proliferation", "(", "G", ")", ",", "enrichment", "of", "genes", "containing", "cis", "regulatory", "elements", "for", "YY1", "(", "H", ")", "and", "p53", "(", "I", ")", ".", "Enrichments", "are", "highly", "significant", "using", "the", "most", "conservative", "familywise", "-", "error", "rate", "method", "(", "FWER", ")", ".", "Enrichments", "were", "lost", "in", "linc", "-", "MYH", "-", "/", "-", "MuSCs", "after", "additional", "deletion", "of", "INO80", "(", "dKOs", ")", "compared", "to", "Pax7", "-", "Crepos", "/", "INO80", "-", "/", "-", "MuSCs", ".", "Heat", "maps", "of", "the", "10", "most", "upregulated", "genes", "of", "the", "respective", "gene", "sets", "depicted", "in", "G", "-", "I", "in", "linc", "-", "MYH", "-", "/", "-", "vs", ".", "WT", "MuSCs", "and", "in", "linc", "-", "MYH", "-", "/", "-", "/", "Pax7", "-", "Crepos", "/", "INO80", "-", "/", "-", "dKO", "vs", ".", "Pax7", "-", "Crepos", "/", "INO80", "-", "/", "-", "MuSCs", ".", "Expression", "of", "up", "-", "regulated", "genes", "in", "linc", "-", "MYH", "-", "/", "-", "was", "normalized", "after", "additional", "deletion", "of", "INO80", "(", "dKOs", ")", ",", "indicating", "that", "effects", "of", "linc", "-", "MYH", "completely", "depend", "on", "INO80", "(", "WT", "n", "=", "4", ",", "linc", "-", "MYH", "-", "/", "-", "n", "=", "4", ",", "Pax7", "-", "Crepos", "/", "INO80", "-", "/", "-", "n", "=", "4", ",", "Pax7", "-", "Cre", "dKO", "n", "=", "3", "animals", "used", "for", "independent", "isolations", "of", "MuSCs", ")", ".", "Heat", "maps", "of", "the", "10", "most", "upregulated", "genes", "of", "the", "respective", "gene", "sets", "depicted", "in", "G", "-", "I", "in", "linc", "-", "MYH", "-", "/", "-", "vs", ".", "WT", "MuSCs", "and", "in", "linc", "-", "MYH", "-", "/", "-", "/", "Pax7", "-", "Crepos", "/", "INO80", "-", "/", "-", "dKO", "vs", ".", "Pax7", "-", "Crepos", "/", "INO80", "-", "/", "-", "MuSCs", ".", "Expression", "of", "up", "-", "regulated", "genes", "in", "linc", "-", "MYH", "-", "/", "-", "was", "normalized", "after", "additional", "deletion", "of", "INO80", "(", "dKOs", ")", ",", "indicating", "that", "effects", "of", "linc", "-", "MYH", "completely", "depend", "on", "INO80", "(", "WT", "n", "=", "4", ",", "linc", "-", "MYH", "-", "/", "-", "n", "=", "4", ",", "Pax7", "-", "Crepos", "/", "INO80", "-", "/", "-", "n", "=", "4", ",", "Pax7", "-", "Cre", "dKO", "n", "=", "3", "animals", "used", "for", "independent", "isolations", "of", "MuSCs", ")", ".", "Heat", "maps", "of", "the", "10", "most", "upregulated", "genes", "of", "the", "respective", "gene", "sets", "depicted", "in", "G", "-", "I", "in", "linc", "-", "MYH", "-", "/", "-", "vs", ".", "WT", "MuSCs", "and", "in", "linc", "-", "MYH", "-", "/", "-", "/", "Pax7", "-", "Crepos", "/", "INO80", "-", "/", "-", "dKO", "vs", ".", "Pax7", "-", "Crepos", "/", "INO80", "-", "/", "-", "MuSCs", ".", "Expression", "of", "up", "-", "regulated", "genes", "in", "linc", "-", "MYH", "-", "/", "-", "was", "normalized", "after", "additional", "deletion", "of", "INO80", "(", "dKOs", ")", ",", "indicating", "that", "effects", "of", "linc", "-", "MYH", "completely", "depend", "on", "INO80", "(", "WT", "n", "=", "4", ",", "linc", "-", "MYH", "-", "/", "-", "n", "=", "4", ",", "Pax7", "-", "Crepos", "/", "INO80", "-", "/", "-", "n", "=", "4", ",", "Pax7", "-", "Cre", "dKO", "n", "=", "3", "animals", "used", "for", "independent", "isolations", "of", "MuSCs", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A-D Isolated linc-MYH KO MuSCs reach confluence much faster than WT MuSCs indicating higher proliferation rates. Deletion of INO80 eliminates the difference between Pax7-Crepos / INO80-/- (Ino80 KO) and linc-MYH-/- / linc-MYH-/-/ Pax7-Crepos / INO80-/- (dKO). Images are representative images for cultures after 13 days in culture.E Differences in proliferation rates are abolished by additional deletion of INO80 in MuSCs. Cell confluence was monitored by a live cell imaging analysis system for 13 days (n = 7 WT / 6 linc-MYH KO / 3 Ino80 KO / 3 dKO independent preparations of MuSCs).F Statistical analysis of cell confluence after 13 days of muscle stem cell proliferation (n = 7 WT / 6 linc-MYH KO / 3 Ino80 KO / 3 dKO independent preparations of MuSCs, Student's t test, two-tailed; *p < 0.05, ns = not significant). Data are mean ± S.E.M.G-I Gene set enrichment analysis (GSEA, broadinstitute.org) of microarray data from proliferating MuSCs. Comparison of linc-MYH-/- vs. WT proliferating MuSC transcriptomes shows enrichment of genes related to cell proliferation (G), enrichment of genes containing cis regulatory elements for YY1 (H) and p53 (I). Enrichments are highly significant using the most conservative familywise-error rate method (FWER). Enrichments were lost in linc-MYH-/- MuSCs after additional deletion of INO80 (dKOs) compared to Pax7-Crepos / INO80-/- MuSCs.Heat maps of the 10 most upregulated genes of the respective gene sets depicted in G-I in linc-MYH-/- vs. WT MuSCs and in linc-MYH-/-/ Pax7-Crepos / INO80-/- dKO vs. Pax7-Crepos / INO80-/- MuSCs. Expression of up-regulated genes in linc-MYH-/- was normalized after additional deletion of INO80 (dKOs), indicating that effects of linc-MYH completely depend on INO80 (WT n = 4, linc-MYH-/- n = 4, Pax7-Crepos / INO80-/- n = 4, Pax7-Cre dKO n = 3 animals used for independent isolations of MuSCs).Heat maps of the 10 most upregulated genes of the respective gene sets depicted in G-I in linc-MYH-/- vs. WT MuSCs and in linc-MYH-/-/ Pax7-Crepos / INO80-/- dKO vs. Pax7-Crepos / INO80-/- MuSCs. Expression of up-regulated genes in linc-MYH-/- was normalized after additional deletion of INO80 (dKOs), indicating that effects of linc-MYH completely depend on INO80 (WT n = 4, linc-MYH-/- n = 4, Pax7-Crepos / INO80-/- n = 4, Pax7-Cre dKO n = 3 animals used for independent isolations of MuSCs).Heat maps of the 10 most upregulated genes of the respective gene sets depicted in G-I in linc-MYH-/- vs. WT MuSCs and in linc-MYH-/-/ Pax7-Crepos / INO80-/- dKO vs. Pax7-Crepos / INO80-/- MuSCs. Expression of up-regulated genes in linc-MYH-/- was normalized after additional deletion of INO80 (dKOs), indicating that effects of linc-MYH completely depend on INO80 (WT n = 4, linc-MYH-/- n = 4, Pax7-Crepos / INO80-/- n = 4, Pax7-Cre dKO n = 3 animals used for independent isolations of MuSCs)."}
{"words": ["Figure", "5A", "-", "D", "γ", "-", "H2AX", "staining", "of", "proliferating", "MuSCs", "from", "WT", "(", "A", ")", ",", "linc", "-", "MYH", "deficient", "(", "B", ")", ",", "Pax7", "-", "Crepos", "/", "INO80", "KO", "(", "C", ")", ",", "and", "linc", "-", "MYH", "/", "INO80", "dKO", "(", "D", ")", "mice", ".", "Deletion", "of", "INO80", "results", "in", "increased", "γ", "-", "H2AX", "signals", "while", "deletion", "of", "linc", "-", "MYH", "has", "no", "effects", "(", "asterisk", ":", "low", "γ", "-", "H2AX", "signals", ",", "arrow", ":", "γ", "-", "H2AX", "-", "foci", "detected", "in", "nuclei", ",", "arrowhead", ":", "pan", "-", "nuclear", "γ", "-", "H2AX", "signal", ".", "E", "-", "G", "Statistical", "evaluation", "of", "the", "presence", "of", "γ", "-", "H2AX", "signals", "in", "MuSCs", "of", "different", "genotypes", "(", "n", "=", "3", "/", "3", "/", "3", "/", "3", "animals", "used", "for", "independent", "isolations", "of", "MuSCs", ",", "two", "technical", "replicates", "for", "each", "animal", "and", "at", "least", "164", "cells", "were", "counted", ",", "Mann", "-", "Whitney", "test", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ".", "Data", "are", "mean", " ", "±", " ", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", ".", "H", "-", "I", "Gene", "set", "enrichment", "analysis", "of", "microarray", "data", "obtained", "for", "proliferating", "MuSCs", "shows", "enrichment", "of", "genes", "related", "to", "activity", "of", "ATR", "in", "response", "to", "replication", "stress", "recovery", "(", "H", ")", "and", "enrichment", "of", "genes", "involved", "in", "chromosome", "maintenance", "(", "I", ")", "in", "WT", "compared", "to", "Pax7", "-", "Crepos", "INO80", "-", "/", "-", "MuSCs", ".", "Enrichment", "of", "these", "or", "similar", "gene", "sets", "was", "not", "observed", "when", "comparing", "WT", "to", "linc", "-", "MYH", "-", "/", "-", "MuSCs", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A-D γ-H2AX staining of proliferating MuSCs from WT (A), linc-MYH deficient (B), Pax7-Crepos / INO80 KO (C), and linc-MYH/INO80 dKO (D) mice. Deletion of INO80 results in increased γ-H2AX signals while deletion of linc-MYH has no effects (asterisk: low γ-H2AX signals, arrow: γ-H2AX-foci detected in nuclei, arrowhead: pan-nuclear γ-H2AX signal.E-G Statistical evaluation of the presence of γ-H2AX signals in MuSCs of different genotypes (n = 3/3/3/3 animals used for independent isolations of MuSCs, two technical replicates for each animal and at least 164 cells were counted, Mann-Whitney test, **p<0.01. Data are mean ± s.e.m.).H-I Gene set enrichment analysis of microarray data obtained for proliferating MuSCs shows enrichment of genes related to activity of ATR in response to replication stress recovery (H) and enrichment of genes involved in chromosome maintenance (I) in WT compared to Pax7-Crepos INO80-/- MuSCs. Enrichment of these or similar gene sets was not observed when comparing WT to linc-MYH-/- MuSCs."}
{"words": ["Figure", "6A", ",", "B", "Co", "-", "Immunoprecipitation", "of", "INO80", "complex", "subunits", "from", "TA", "muscles", "of", "WT", "and", "linc", "-", "MYH", "KO", "mice", "followed", "by", "Western", "Blot", "analysis", ".", "(", "B", ")", "Statistical", "analysis", "of", "Co", "-", "IP", "/", "Western", "Blot", "data", ".", "The", "amount", "of", "RUVBL1", "and", "RUVBL2", "in", "the", "INO80", "complex", "is", "not", "changed", "after", "deletion", "of", "linc", "-", "MYH", ",", "while", "the", "amounts", "of", "YY1", ",", "WDR5", "and", "TFPT", "pulled", "down", "by", "INO80", "increase", "(", "n", "=", "3", "WT", "/", "3", "linc", "-", "MYH", "KO", "animals", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "multiple", "comparisons", "by", "Fishers", "LSD", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "Data", "are", "mean", " ", "±", " ", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "C", "-", "K", "Proximity", "ligation", "assays", "between", "INO80", "and", "YY1", "(", "C", ",", "D", ")", ",", "INO80", "and", "WDR5", "(", "F", ",", "G", ")", ",", "and", "INO80", "and", "RuvBl2", "(", "I", ",", "J", ")", "in", "proliferating", "MuSCs", ".", "Red", "signals", "indicate", "close", "proximity", "of", "INO80", "-", "V5", "and", "the", "respective", "interacting", "protein", ".", "Nuclei", "were", "stained", "using", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Statistical", "evaluation", "of", "proximity", "ligation", "assays", "indicating", "increased", "interactions", "of", "INO80", "-", "V5", "and", "YY1", "(", "E", ",", "n", "=", "3", "/", "3", "animals", ",", "3", "independent", "wells", "per", "animal", ",", "two", "-", "tailed", "students", "t", "-", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", "and", "of", "INO80", "-", "V5", "to", "WDR5", "(", "H", ",", "n", "=", "2", "(", "WT", ")", "/", "2", "(", "KO", ")", "animals", ",", "3", "independent", "wells", "per", "animal", ",", "two", "-", "tailed", "students", "t", "-", "test", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "No", "increase", "in", "proximity", "was", "detected", "between", "Ino80", "-", "V5", "and", "Ruvbl2", "(", "K", ",", "n", "=", "2", "(", "WT", ")", "/", "2", "(", "KO", ")", "animals", ",", "3", "independent", "wells", "per", "animal", ",", "two", "-", "tailed", "students", "t", "-", "test", ",", "ns", ":", "not", "significant", ")", ".", "Specificity", "of", "all", "analyzed", "signals", "was", "analyzed", "using", "single", "primary", "or", "single", "secondary", "antibodies", "in", "PLA", "assays", ".", "No", "signals", "were", "detected", "for", "these", "controls", ".", "Data", "are", "mean", " ", "±", " ", "S", ".", "E", ".", "M", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A, B Co-Immunoprecipitation of INO80 complex subunits from TA muscles of WT and linc-MYH KO mice followed by Western Blot analysis. (B) Statistical analysis of Co-IP/Western Blot data. The amount of RUVBL1 and RUVBL2 in the INO80 complex is not changed after deletion of linc-MYH, while the amounts of YY1, WDR5 and TFPT pulled down by INO80 increase (n = 3 WT / 3 linc-MYH KO animals; one-way ANOVA, multiple comparisons by Fishers LSD test, *p<0.05). Data are mean ± S.E.M.C-K Proximity ligation assays between INO80 and YY1 (C, D), INO80 and WDR5 (F, G), and INO80 and RuvBl2 (I, J) in proliferating MuSCs. Red signals indicate close proximity of INO80-V5 and the respective interacting protein. Nuclei were stained using DAPI (blue). Statistical evaluation of proximity ligation assays indicating increased interactions of INO80-V5 and YY1 (E, n = 3/3 animals, 3 independent wells per animal, two-tailed students t-test, *p<0.05) and of INO80-V5 to WDR5 (H, n = 2 (WT)/2 (KO) animals, 3 independent wells per animal, two-tailed students t-test, **p<0.01). No increase in proximity was detected between Ino80-V5 and Ruvbl2 (K, n = 2 (WT)/2 (KO) animals, 3 independent wells per animal, two-tailed students t-test, ns: not significant). Specificity of all analyzed signals was analyzed using single primary or single secondary antibodies in PLA assays. No signals were detected for these controls. Data are mean ± S.E.M."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Coomassie", "stained", "SDS", "-", "PAGE", "showing", "purified", "T", ".", "thermophila", "tubulin", ".", "(", "B", ")", "A", "representative", "cryo", "-", "electron", "micrograph", "of", "paclitaxel", "-", "stabilized", "T", ".", "thermophila", "MTs", ".", "(", "C", ")", "Kymographs", "obtained", "by", "TIRF", "microscopy", "showing", "the", "dynamics", "of", "T", ".", "thermophila", "MTs", "at", "the", "indicated", "concentrations", "in", "µM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Coomassie stained SDS-PAGE showing purified T. thermophila tubulin.(B) A representative cryo-electron micrograph of paclitaxel-stabilized T. thermophila MTs.(C) Kymographs obtained by TIRF microscopy showing the dynamics of T. thermophila MTs at the indicated concentrations in µM."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "D", ")", "Plot", "showing", "the", "time", "course", "of", "T", ".", "thermophila", "cell", "growth", "in", "the", "presence", "of", "CA4", "(", "20µM", ")", "or", "parabulin", "(", "50µM", ";", "error", "bars", "corresponding", "to", "the", "standard", "deviation", "of", "triplicate", "biological", "measurements", ")", ".", "Control", "experiments", "are", "done", "with", "DMSO", "alone", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(D) Plot showing the time course of T. thermophila cell growth in the presence of CA4 (20µM) or parabulin (50µM; error bars corresponding to the standard deviation of triplicate biological measurements). Control experiments are done with DMSO alone."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Plot", "showing", "quantification", "of", "the", "T", ".", "thermophila", "MT", "growth", "events", "in", "TIRF", "microscopy", "MT", "dynamics", "reconstitution", "assays", "in", "the", "presence", "of", "the", "indicated", "drugs", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "mean", "+", "/", "-", "95", "%", "CI", ".", "For", "each", "concentration", ",", "data", "is", "obtained", "from", "at", "least", "2", "independent", "experiments", ".", "For", "growth", "rates", "and", "growth", "lengths", ",", "n", "=", "41", "(", "DMSO", ")", ",", "n", "=", "4", "(", "0", ".", "04uM", "parabulin", ")", ",", "n", "=", "34", "(", "0", ".", "04", "uM", "colchicine", ")", ".", "Rates", "were", "compared", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ";", "DMSO", "vs", "parabulin", "P", "<", "0001", "(", "*", "*", "*", "*", ")", ";", "DMSO", "vs", "colchicine", "p", "=", "0", ".", "40", "(", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ")", ".", "(", "B", ")", "T", ".", "thermophila", "MT", "growth", "rates", "in", "the", "presence", "of", "the", "indicated", "drugs", "(", "40", "μM", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "the", "mean", "+", "/", "-", "95", "%", "CI", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Rates", "were", "compared", "using", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "test", ";", "DMSO", "vs", "parabulin", "P", "=", "0", ".", "25", ";", "DMSO", "vs", "colchicine", "P", "=", "0", ".", "20", "(", "n", ".", "s", ".", ",", "not", "significant", ")", ".", "(", "D", ")", "Representative", "kymographs", "obtained", "by", "TIRF", "microscopy", "showing", "the", "effect", "of", "parabulin", "and", "colchicine", "on", "dynamic", "Tt", "-", "MTs", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Plot showing quantification of the T. thermophila MT growth events in TIRF microscopy MT dynamics reconstitution assays in the presence of the indicated drugs. Error bars represent the mean +/- 95% CI. For each concentration, data is obtained from at least 2 independent experiments. For growth rates and growth lengths, n=41(DMSO), n= 4 (0.04uM parabulin), n= 34 (0.04 uM colchicine). Rates were compared using one-way ANOVA with Tukey's multiple comparison test; DMSO vs parabulin P<0001 (****); DMSO vs colchicine p = 0.40 (n.s., not significant). (B) T. thermophila MT growth rates in the presence of the indicated drugs (40 μM). Error bars represent the mean +/- 95% CI (n=4). Rates were compared using one-way ANOVA with Tukey's multiple comparison test; DMSO vs parabulin P = 0.25; DMSO vs colchicine P = 0.20 (n.s., not significant).(D) Representative kymographs obtained by TIRF microscopy showing the effect of parabulin and colchicine on dynamic Tt-MTs."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Evaluation", "of", "vertebrate", "cell", "toxicity", "using", "the", "MTT", "assay", "which", "detects", "metabolic", "activity", "proportionate", "to", "the", "number", "of", "viable", "cells", "in", "a", "sample", ".", "The", "absorbance", "measurements", "for", "all", "treatment", "conditions", "were", "normalized", "to", "the", "null", "control", "value", "which", "is", "set", "to", "100", "%", "growth", ".", "Sub", "-", "confluent", "human", "fibroblasts", "were", "used", "to", "visualize", "potential", "compound", "effects", "during", "proliferation", ".", "The", "results", "represent", "the", "average", "of", "9", "readings", "(", "3", "biological", "replicates", "with", "3", "technical", "replicates", "of", "each", "treatment", ")", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", ".", "(", "B", ")", "Replication", "of", "GFP", "-", "expressing", "T", ".", "gondii", "tachyzoites", "in", "individual", "intracellular", "vacuoles", "can", "be", "followed", "by", "live", "cell", "imaging", ".", "Since", "vacuoles", "containing", "more", "than", "eight", "tachyzoites", "are", "not", "always", "easy", "to", "score", ",", "we", "tallied", "vacuoles", "above", "eight", "as", "being", "8", "+", "in", "size", ".", "At", "36", "hours", ",", "both", "null", "and", "vehicle", "control", "samples", "show", "most", "vacuoles", "harbor", "eight", "or", "more", "tachyzoites", "(", "three", "or", "more", "doublings", ")", ".", "Vacuoles", "in", "parabulin", "-", "treated", "cultures", "contain", "significantly", "fewer", "parasites", ",", "indicating", "that", "replication", "is", "slowed", ".", "The", "graph", "shows", "three", "biological", "replicates", "with", "values", "normalized", "to", "100", "%", "for", "each", "condition", "and", "each", "replicate", ",", "error", "bars", "represent", "standard", "error", "of", "the", "mean", "between", "experiments", ".", "(", "C", ")", "The", "parabulin", "EC50", "value", "for", "T", ".", "gondii", "growth", "was", "determined", "using", "a", "plaque", "assay", "to", "measure", "a", "reduction", "in", "plaque", "area", "relative", "to", "control", "conditions", ".", "Error", "bars", "represent", "standard", "error", "of", "the", "mean", ".", "The", "results", "represent", "the", "average", "of", "18", "readings", "(", "6", "biological", "replicates", "with", "3", "technical", "replicates", "of", "each", "treatment", ")", "±", "standard", "error", "of", "the", "mean", ".", "(", "D", ")", "Phase", "contrast", "of", "extracellular", "parasite", "cultures", ".", "Serial", "passage", "of", "T", ".", "gondii", "in", "40", "-", "80", "μM", "parabulin", "induces", "accumulation", "of", "aberrant", "tachyzoite", "forms", ".", "These", "arise", "with", "MT", "defects", "that", "disconnect", "coordinated", "nuclear", "division", "and", "daughter", "cell", "budding", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Evaluation of vertebrate cell toxicity using the MTT assay which detects metabolic activity proportionate to the number of viable cells in a sample. The absorbance measurements for all treatment conditions were normalized to the null control value which is set to 100% growth. Sub-confluent human fibroblasts were used to visualize potential compound effects during proliferation. The results represent the average of 9 readings (3 biological replicates with 3 technical replicates of each treatment) ± standard error of the mean.(B) Replication of GFP-expressing T. gondii tachyzoites in individual intracellular vacuoles can be followed by live cell imaging. Since vacuoles containing more than eight tachyzoites are not always easy to score, we tallied vacuoles above eight as being 8+ in size. At 36 hours, both null and vehicle control samples show most vacuoles harbor eight or more tachyzoites (three or more doublings). Vacuoles in parabulin-treated cultures contain significantly fewer parasites, indicating that replication is slowed. The graph shows three biological replicates with values normalized to 100% for each condition and each replicate, error bars represent standard error of the mean between experiments.(C) The parabulin EC50 value for T. gondii growth was determined using a plaque assay to measure a reduction in plaque area relative to control conditions. Error bars represent standard error of the mean. The results represent the average of 18 readings (6 biological replicates with 3 technical replicates of each treatment) ± standard error of the mean.(D) Phase contrast of extracellular parasite cultures. Serial passage of T. gondii in 40-80 μM parabulin induces accumulation of aberrant tachyzoite forms. These arise with MT defects that disconnect coordinated nuclear division and daughter cell budding."}
{"words": ["Figure", "2A", ")", "Solid", "phase", "transfection", "of", "nontargeting", "(", "scrambled", ")", "or", "PLK1", "targeting", "gRNAs", "into", "Cas9", "expressing", "RPE", "-", "1TP53", "-", "/", "-", "cells", ".", "Cells", "were", "fixed", "after", "24", ",", "48", "and", "72", "hours", "and", "imaged", "after", "DNA", "staining", "with", "Hoechst", ".", "Green", "arrowheads", "indicate", "examples", "of", "prometaphase", "arrested", "cells", ",", "and", "the", "red", "arrowheads", "indicate", "examples", "of", "dead", "cells", "due", "to", "Plk1", "downregulation", ".", "Phenotypic", "penetrance", "is", "indicated", "at", "the", "top", "of", "each", "panel", "with", "standard", "deviation", "derived", "from", "2", "independent", "experiments", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "μm", ".", "B", ")", "Solid", "phase", "transfection", "of", "nontargeting", "(", "scrambled", ")", "or", "CCNA2", "targeting", "gRNAs", "into", "Cas9", "expressing", "RPE", "-", "1TP53", "-", "/", "-", "cells", ".", "Cells", "were", "fixed", "after", "72", "hours", "and", "imaged", "after", "DNA", "staining", "with", "Hoechst", ".", "C", ")", "Quantification", "of", "nuclear", "size", "measurements", "from", "Fig", "2B", ".", "Data", "derived", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "P", "value", "(", "scrambled", "vs", "CCNA2", ")", "<", "2e", "-", "16", ",", "Kolmogorov", "-", "Smirnov", "test", ".", "D", ")", "Solid", "phase", "transfection", "of", "nontargeting", "(", "scrambled", ")", ",", "GOLGA2", "targeting", "gRNA", "complexes", "into", "Cas9", "expressing", "RPE", "-", "1TP53", "-", "/", "-", "cells", ".", "Cells", "were", "fixed", "after", "72", "hours", ",", "stained", "with", "Golga2", "antibody", "(", "red", ")", ",", "and", "Hoechst", "(", "blue", ")", "to", "mark", "DNA", "and", "imaged", ".", "Scale", "bar", ",", "50μm", ".", "E", ")", "Quantification", "of", "experiments", "in", "Fig", "2D", ".", "Data", "derived", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "P", "value", "(", "scrambled", "vs", "GOLGA2", ")", "<", "2e", "-", "16", ",", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ".", "F", ")", "Solid", "phase", "transfection", "of", "nontargeting", "(", "scrambled", ")", ",", "MKI67", "targeting", "gRNA", "complexes", "into", "Cas9", "expressing", "RPE", "-", "1TP53", "-", "/", "-", "cells", ".", "Cells", "were", "fixed", "after", "72", "hours", ",", "stained", "with", "Ki67", "antibody", "(", "red", ")", ",", "and", "Hoechst", "(", "blue", ")", "to", "mark", "DNA", "and", "imaged", ".", "Scale", "bar", ",", "50μm", ".", "G", ")", "Quantification", "of", "experiments", "in", "Fig", "2F", ".", "Data", "derived", "from", "3", "independent", "experiments", ".", "P", "value", "(", "scrambled", "vs", "MKI67", ")", "<", "2e", "-", "16", ",", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ".", "H", ")", "Comparison", "of", "phenotypic", "penetrance", "with", "liquid", "and", "solid", "phase", "transfection", ".", "RPE", "-", "1", ",", "HEK293T", ",", "NCI", "-", "H358", "and", "NCI", "-", "N87", "cells", "were", "transfected", "with", "scrambled", "or", "POLR2A", "targeting", "gRNAs", "in", "in", "two", "different", "cell", "numbers", "(", "2250", "or", "20000", "cells", "/", "well", ")", ".", "5", "days", "post", "transfection", "cell", "viability", "were", "measured", "by", "CellTiter", "-", "Glo", ".", "Boxplots", "represent", "values", "from", "at", "least", "3", "independent", "experiments", "containing", "3", "technical", "replicates", ".", "I", ")", "Cell", "viability", "measurements", "after", "solid", "phase", "transfection", "targeting", "POLR2A", "in", "a", "panel", "of", "cell", "lines", ".", "Cas9", "expressing", "cell", "lines", "were", "transfected", "with", "scrambled", "and", "POLR2A", "targeting", "gRNA", "and", "cell", "viability", "was", "assessed", "after", "5", "days", ".", "The", "raw", "values", "are", "background", "subtracted", "and", "normalized", "to", "the", "mock", "controls", ".", "Results", "are", "from", "at", "least", "3", "independent", "experiments", "containing", "3", "technical", "replicates", ".", "For", "all", "cell", "lines", ",", "P", "values", "(", "scrambled", "vs", "POLR2A", ")", "<", "0", ".", "005", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A) Solid phase transfection of nontargeting (scrambled) or PLK1 targeting gRNAs into Cas9 expressing RPE-1TP53 -/- cells. Cells were fixed after 24, 48 and 72 hours and imaged after DNA staining with Hoechst. Green arrowheads indicate examples of prometaphase arrested cells, and the red arrowheads indicate examples of dead cells due to Plk1 downregulation. Phenotypic penetrance is indicated at the top of each panel with standard deviation derived from 2 independent experiments. Scale bar, 20 μm.B) Solid phase transfection of nontargeting (scrambled) or CCNA2 targeting gRNAs into Cas9 expressing RPE-1TP53 -/- cells. Cells were fixed after 72 hours and imaged after DNA staining with Hoechst. C) Quantification of nuclear size measurements from Fig 2B. Data derived from 3 independent experiments. P value (scrambled vs CCNA2) < 2e-16, Kolmogorov-Smirnov test.D) Solid phase transfection of nontargeting (scrambled), GOLGA2 targeting gRNA complexes into Cas9 expressing RPE-1TP53 -/- cells. Cells were fixed after 72 hours, stained with Golga2 antibody (red), and Hoechst (blue) to mark DNA and imaged. Scale bar, 50μm. E) Quantification of experiments in Fig 2D. Data derived from 3 independent experiments. P value (scrambled vs GOLGA2) < 2e-16, Mann-Whitney U test. F) Solid phase transfection of nontargeting (scrambled), MKI67 targeting gRNA complexes into Cas9 expressing RPE-1TP53 -/- cells. Cells were fixed after 72 hours, stained with Ki67 antibody (red), and Hoechst (blue) to mark DNA and imaged. Scale bar, 50μm. G) Quantification of experiments in Fig 2F. Data derived from 3 independent experiments. P value (scrambled vs MKI67) < 2e-16, Mann-Whitney U test. H) Comparison of phenotypic penetrance with liquid and solid phase transfection. RPE-1, HEK293T, NCI-H358 and NCI-N87 cells were transfected with scrambled or POLR2A targeting gRNAs in in two different cell numbers (2250 or 20000 cells/well). 5 days post transfection cell viability were measured by CellTiter-Glo. Boxplots represent values from at least 3 independent experiments containing 3 technical replicates.I) Cell viability measurements after solid phase transfection targeting POLR2A in a panel of cell lines. Cas9 expressing cell lines were transfected with scrambled and POLR2A targeting gRNA and cell viability was assessed after 5 days. The raw values are background subtracted and normalized to the mock controls. Results are from at least 3 independent experiments containing 3 technical replicates. For all cell lines, P values (scrambled vs POLR2A) < 0.005."}
{"words": ["Figure", "3A", ")", "Solid", "phase", "transfection", "of", "nontargeting", "(", "scrambled", ")", "or", "CCNA2", "targeting", "RNP", "complexes", "into", "WT", "RPE", "-", "1TP53", "-", "/", "-", "cells", ".", "Cells", "were", "fixed", "after", "72", "hours", "and", "imaged", "after", "DNA", "staining", "with", "Hoechst", ".", "Scale", "bar", ",", "50μm", ".", "B", ")", "Quantification", "of", "experiments", "in", "Fig", "3A", ".", "Data", "derived", "from", "2", "independent", "experiments", ".", "P", "value", "(", "scrambled", "vs", "CCNA2", ")", "<", "2e", "-", "16", ",", "Kolmogorov", "-", "Smirnov", "test", ".", "C", ")", "Solid", "phase", "transfection", "of", "nontargeting", "(", "scrambled", ")", ",", "MKI67", "targeting", "RNP", "complexes", "into", "WT", "RPE", "-", "1TP53", "-", "/", "-", "cells", ".", "Cells", "were", "fixed", "after", "72", "hours", ",", "stained", "with", "Ki67", "antibody", "(", "red", ")", ",", "and", "Hoechst", "(", "blue", ")", "to", "mark", "DNA", "and", "imaged", ".", "Scale", "bar", ",", "50μm", ".", "D", ")", "Quantification", "of", "experiments", "in", "Fig", "3C", ".", "Data", "derived", "from", "2", "independent", "experiments", ".", "P", "value", "(", "scrambled", "vs", "MKI67", ")", "<", "2e", "-", "16", ",", "Mann", "-", "Whitney", "U", "test", ".", "E", ")", "Four", "cell", "lines", "were", "transfected", "with", "RNP", "complexes", "with", "scrambled", "or", "POLR2A", "targeting", "gRNA", ".", "5", "days", "post", "transfection", ",", "cell", "viability", "in", "each", "well", "was", "measured", ".", "Results", "are", "from", "at", "least", "3", "independent", "experiments", "containing", "3", "technical", "replicates", ".", "For", "all", "cell", "lines", ",", "P", "values", "(", "scrambled", "vs", "POLR2A", ")", "<", "0", ".", "005", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A) Solid phase transfection of nontargeting (scrambled) or CCNA2 targeting RNP complexes into WT RPE-1TP53 -/- cells. Cells were fixed after 72 hours and imaged after DNA staining with Hoechst. Scale bar, 50μm. B) Quantification of experiments in Fig 3A. Data derived from 2 independent experiments. P value (scrambled vs CCNA2) < 2e-16, Kolmogorov-Smirnov test. C) Solid phase transfection of nontargeting (scrambled), MKI67 targeting RNP complexes into WT RPE-1TP53 -/- cells. Cells were fixed after 72 hours, stained with Ki67 antibody (red), and Hoechst (blue) to mark DNA and imaged. Scale bar, 50μm. D) Quantification of experiments in Fig 3C. Data derived from 2 independent experiments. P value (scrambled vs MKI67) < 2e-16, Mann-Whitney U test. E) Four cell lines were transfected with RNP complexes with scrambled or POLR2A targeting gRNA. 5 days post transfection, cell viability in each well was measured. Results are from at least 3 independent experiments containing 3 technical replicates. For all cell lines, P values (scrambled vs POLR2A) < 0.005."}
{"words": ["Figure", "4A", ")", "Viability", "of", "NCI", "-", "N87", "and", "NCI", "-", "H358", "cells", "upon", "transfection", "of", "45", "different", "gRNAs", "by", "solid", "phase", "transfection", ".", "Cas9", "expressing", "NCI", "-", "N87", "and", "NCI", "-", "H358", "cell", "were", "seeded", "on", "pre", "-", "coated", "plates", ".", "5", "days", "post", "transfection", ",", "cell", "viability", "in", "each", "well", "were", "measured", "by", "CellTiter", "-", "Glo", ".", "Values", "were", "background", "subtracted", ",", "normalized", "to", "scrambled", "controls", "and", "plotted", "against", "each", "other", ".", "Blue", "dots", "represent", "scrambled", "controls", ",", "whereas", "the", "yellow", "dots", "represent", "POLR2A", "gRNAs", ".", "Green", "dots", "represent", "the", "genes", "that", "affect", "the", "viability", "in", "a", "cell", "line", "dependent", "manner", ".", "Results", "are", "representative", "of", "3", "independent", "experiments", ".", "B", ",", "C", ")", "Logarithm", "of", "the", "odds", "(", "LOD", ")", "scores", "of", "cancer", "associated", "gene", "KOs", "in", "NCI", "-", "N87", "and", "NCI", "-", "H358", "cells", "derived", "from", "screens", "with", "gRNAs", "(", "B", ")", "and", "RNPs", "(", "C", ")", ".", "Bottom", "panels", "show", "distribution", "of", "positive", "(", "POLR2A", ")", "and", "negative", "(", "scrambled", ")", "controls", "for", "each", "experiment", ".", "LOD", "score", "of", "3", "is", "highlighted", "with", "a", "dashed", "line", ",", "indicating", "statistical", "significance", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A) Viability of NCI-N87 and NCI-H358 cells upon transfection of 45 different gRNAs by solid phase transfection. Cas9 expressing NCI-N87 and NCI-H358 cell were seeded on pre-coated plates. 5 days post transfection, cell viability in each well were measured by CellTiter-Glo. Values were background subtracted, normalized to scrambled controls and plotted against each other. Blue dots represent scrambled controls, whereas the yellow dots represent POLR2A gRNAs. Green dots represent the genes that affect the viability in a cell line dependent manner. Results are representative of 3 independent experiments.B, C) Logarithm of the odds (LOD) scores of cancer associated gene KOs in NCI-N87 and NCI-H358 cells derived from screens with gRNAs (B) and RNPs (C). Bottom panels show distribution of positive (POLR2A) and negative (scrambled) controls for each experiment. LOD score of 3 is highlighted with a dashed line, indicating statistical significance."}
{"words": ["Figure", "5A", ")", "Solid", "phase", "transfection", "of", "nontargeting", "(", "scrambled", ")", "or", "PLK1", "targeting", "RNP", "complexes", "into", "human", "primary", "lung", "fibroblasts", "(", "HLF", "-", "1", ")", ",", "primary", "lung", "adenocarcinoma", "cells", "(", "LAD", "-", "1", ")", "or", "RPE", "-", "1TP53", "-", "/", "-", "cells", ".", "72", "hours", "post", "transfection", "cells", "were", "stained", "with", "Hoechst", "and", "imaged", ".", "Boxplots", "represent", "values", "from", "3", "independent", "experiments", "containing", "3", "technical", "replicates", ".", "For", "all", "cell", "lines", ",", "P", "values", "(", "scrambled", "vs", "Plk1", ")", "<", "0", ".", "05", ".", "In", "the", "right", "panels", ",", "representative", "images", "for", "each", "cell", "line", "is", "shown", "after", "RNP", "transfection", "targeting", "PLK1", ".", "Arrowheads", "indicate", "the", "cells", "that", "are", "arrested", "in", "prometaphase", "due", "to", "Plk1", "downregulation", ".", "Scale", "bars", "indicate", "20μm", ".", "B", ")", "Two", "human", "primary", "lung", "fibroblasts", "(", "HLF", ")", "and", "three", "primary", "tumor", "cell", "lines", "derived", "from", "patients", "suffering", "from", "either", "lung", "squamous", "carcinoma", "(", "LSC", ")", "or", "lung", "adenocarcinoma", "(", "LAD", ")", "were", "transfected", "with", "RNP", "complexes", "with", "scrambled", "or", "POLR2A", "targeting", "gRNA", ".", "5", "days", "post", "transfection", ",", "cell", "viability", "in", "each", "well", "was", "measured", ".", "Results", "are", "from", "at", "least", "3", "independent", "experiments", "containing", "3", "technical", "replicates", ".", "For", "all", "cell", "lines", ",", "P", "values", "(", "scrambled", "vs", "POLR2A", ")", "<", "0", ".", "005", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A) Solid phase transfection of nontargeting (scrambled) or PLK1 targeting RNP complexes into human primary lung fibroblasts (HLF-1), primary lung adenocarcinoma cells (LAD-1) or RPE-1TP53 -/- cells. 72 hours post transfection cells were stained with Hoechst and imaged. Boxplots represent values from 3 independent experiments containing 3 technical replicates. For all cell lines, P values (scrambled vs Plk1) < 0.05. In the right panels, representative images for each cell line is shown after RNP transfection targeting PLK1. Arrowheads indicate the cells that are arrested in prometaphase due to Plk1 downregulation. Scale bars indicate 20μm.B) Two human primary lung fibroblasts (HLF) and three primary tumor cell lines derived from patients suffering from either lung squamous carcinoma (LSC) or lung adenocarcinoma (LAD) were transfected with RNP complexes with scrambled or POLR2A targeting gRNA. 5 days post transfection, cell viability in each well was measured. Results are from at least 3 independent experiments containing 3 technical replicates. For all cell lines, P values (scrambled vs POLR2A) < 0.005."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "C", ")", "Mass", "spectra", "of", "recombinant", "HTTex1", "23Q", "after", "16", "hour", "of", "co", "-", "incubation", "with", "by", "TBK1", "showing", "complete", "phosphorylation", "of", "S13", "and", "S16", ".", "The", "lower", "panel", "is", "a", "representative", "western", "blot", "of", "the", "same", "phosphorylation", "reaction", "(", "upper", "panel", ")", "using", "anti", "-", "pT3", "(", "CHDI", "-", "90001528", "-", "1", ")", ",", "pS13", "HTT", "(", "CHDI", "-", "90001039", "-", "1", ")", "and", "pS16", "(", "ZCH11020", "-", "generated", "in", "house", ")", ",", "antibodies", "(", "ab", ")", "after", "the", "indicated", "phosphorylation", "reaction", "times", ".", "(", "D", ")", "Representative", "western", "blot", "of", "HTT", "(", "ab", "-", "MAB5492", ")", ",", "HTT", "pS13", "(", "ab", "-", "CHDI", "-", "90001039", "-", "1", ")", "and", "HTT", "pT3", "(", "ab", "-", "CHDI", "-", "90001528", "-", "1", ")", "upon", "coexpression", "of", "HTTex1", "16Q", "and", "72Q", "eGFP", "with", "the", "indicated", "kinases", "for", "48", "hour", "in", "HEK293T", "cells", ".", "(", "E", ")", "Quantification", "of", "the", "fold", "changes", "in", "the", "HTT", "pS13", "and", "pT3", "ratios", "to", "total", "HTT", "compared", "to", "empty", "vector", "(", "EV", ")", "control", "upon", "coexpression", "of", "the", "indicated", "kinase", "from", "the", "experiments", "like", "in", "D", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(C) Mass spectra of recombinant HTTex1 23Q after 16 hour of co-incubation with by TBK1 showing complete phosphorylation of S13 and S16. The lower panel is a representative western blot of the same phosphorylation reaction (upper panel) using anti-pT3 (CHDI-90001528-1), pS13 HTT (CHDI-90001039-1) and pS16 (ZCH11020 -generated in house), antibodies (ab) after the indicated phosphorylation reaction times.(D) Representative western blot of HTT (ab-MAB5492), HTT pS13 (ab-CHDI-90001039-1) and HTT pT3 (ab-CHDI-90001528-1) upon coexpression of HTTex1 16Q and 72Q eGFP with the indicated kinases for 48 hour in HEK293T cells.(E) Quantification of the fold changes in the HTT pS13 and pT3 ratios to total HTT compared to empty vector (EV) control upon coexpression of the indicated kinase from the experiments like in D."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Representative", "western", "blot", "of", "HTT", "(", "ab", "-", "MAB5492", ")", ",", "HTT", "pS13", "(", "ab", "-", "CHDI", "-", "90001039", "-", "1", ")", "and", "HTT", "pT3", "(", "ab", "-", "CHDI", "-", "90001528", "-", "1", ")", "upon", "coexpression", "of", "HTTex1", "16Q", "eGFP", ",", "mutants", "with", "S", "to", "A", "substitutions", "at", "T3", "or", "S13", "/", "S16", "or", "HTTex1", "72Q", "eGFP", "with", "TBK1", "or", "TBK1", "kinase", "-", "dead", "(", "KD", ")", "for", "48", "hour", "in", "HEK293T", "cells", "(", "the", "additional", "high", "molecular", "weight", "HTTex1", "and", "HTT", "pS13", "band", "is", "possibly", "due", "to", "the", "co", "-", "occurrence", "of", "phosphorylation", "at", "both", "S13", "and", "T3", ")", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "the", "fold", "changes", "in", "the", "HTT", "pS13", "(", "upper", "panel", ")", "and", "pT3", "(", "lower", "panel", ")", "ratio", "to", "total", "HTT", "compared", "to", "those", "of", "the", "kinase", "-", "dead", "mutant", "from", "the", "experiments", "like", "in", "A", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "C", ")", "Representative", "western", "blot", "of", "HTT", "(", "ab", "-", "MAB2166", ")", "and", "HTT", "pS13", "(", "ab", "-", "CHDI", "-", "90001039", "-", "1", ")", "upon", "coexpression", "of", "HTT", "N543", "55Q", "with", "the", "indicated", "kinase", "for", "24", "hour", "in", "HEK293T", "cells", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "HTT", "pS13", "using", "the", "Singulex", "assay", "(", "using", "ab", "-", "MW1", "as", "capture", "and", "CHDI", "-", "90001039", "or", "2B7", "as", "detection", "antibodies", "for", "pS13", "or", "total", "HTT", ")", "upon", "coexpression", "of", "HTT", "N543", "55Q", "with", "the", "indicated", "kinase", "for", "24", "hour", "in", "HEK293T", "cells", "from", "the", "experiment", "in", "C", "(", "representative", "of", "3", "repeats", ")", ".", "(", "E", ")", "Representative", "western", "blot", "of", "HTT", "(", "ab", "-", "MAB2166", ")", "and", "HTT", "pS13", "(", "ab", "-", "CHDI", "-", "90001039", "-", "1", ")", "upon", "coexpression", "of", "HTT", "-", "FL", "48Q", "or", "HTT", "-", "FL", "48Q", "S13A", "/", "S16A", "with", "the", "indicated", "kinase", "for", "24", "hour", "in", "HEK293T", "cells", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "HTT", "pS13", "using", "the", "Singulex", "assay", "(", "using", "ab", "-", "MW1", "as", "capture", "and", "CHDI", "-", "90001039", "or", "2B7", "as", "detection", "antibodies", "for", "pS13", "or", "total", "HTT", ")", "upon", "coexpression", "of", "HTT", "-", "FL", "48Q", "or", "HTT", "-", "FL", "48Q", "S13A", "/", "S16A", "with", "the", "indicated", "kinase", "for", "24", "hour", "in", "HEK293T", "cells", "from", "the", "experiments", "likein", "E", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "G", ")", "Representative", "western", "blot", "of", "immunoprecipitated", "(", "IP", ")", "HTT", "(", "ab", "-", "MAB2166", ")", "and", "HTT", "pS13", "(", "ab", "-", "CHDI", "-", "90001039", "-", "1", ")", "after", "lentivirus", "(", "LV", ")", "-", "mediated", "overexpression", "of", "TBK1", "or", "TBK1", "KD", "for", "72", "hour", "in", "rat", "primary", "striatal", "neuronal", "cells", ".", "(", "H", ")", "Quantification", "of", "the", "fold", "changes", "in", "the", "HTT", "pS13", "ratio", "to", "total", "HTT", "compared", "to", "those", "of", "the", "kinase", "-", "dead", "mutant", "from", "the", "experiments", "like", "in", "G", "(", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Representative western blot of HTT (ab-MAB5492), HTT pS13 (ab-CHDI-90001039-1) and HTT pT3 (ab-CHDI-90001528-1) upon coexpression of HTTex1 16Q eGFP, mutants with S to A substitutions at T3 or S13/S16 or HTTex1 72Q eGFP with TBK1 or TBK1 kinase-dead (KD) for 48 hour in HEK293T cells (the additional high molecular weight HTTex1 and HTT pS13 band is possibly due to the co-occurrence of phosphorylation at both S13 and T3). (B) Quantification of the fold changes in the HTT pS13 (upper panel) and pT3 (lower panel) ratio to total HTT compared to those of the kinase-dead mutant from the experiments like in A (n=3). (C) Representative western blot of HTT (ab-MAB2166) and HTT pS13 (ab-CHDI-90001039-1) upon coexpression of HTT N543 55Q with the indicated kinase for 24 hour in HEK293T cells. (D) Quantification of HTT pS13 using the Singulex assay (using ab-MW1 as capture and CHDI-90001039 or 2B7 as detection antibodies for pS13 or total HTT) upon coexpression of HTT N543 55Q with the indicated kinase for 24 hour in HEK293T cells from the experiment in C (representative of 3 repeats). (E) Representative western blot of HTT (ab-MAB2166) and HTT pS13 (ab-CHDI-90001039-1) upon coexpression of HTT-FL 48Q or HTT-FL 48Q S13A/S16A with the indicated kinase for 24 hour in HEK293T cells. (F) Quantification of HTT pS13 using the Singulex assay (using ab-MW1 as capture and CHDI-90001039 or 2B7 as detection antibodies for pS13 or total HTT) upon coexpression of HTT-FL 48Q or HTT-FL 48Q S13A/S16A with the indicated kinase for 24 hour in HEK293T cells from the experiments likein E (n=3). (G) Representative western blot of immunoprecipitated (IP) HTT (ab-MAB2166) and HTT pS13 (ab-CHDI-90001039-1) after lentivirus (LV)-mediated overexpression of TBK1 or TBK1 KD for 72 hour in rat primary striatal neuronal cells. (H) Quantification of the fold changes in the HTT pS13 ratio to total HTT compared to those of the kinase-dead mutant from the experiments like in G (n=3). "}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Representative", "western", "blot", "of", "soluble", "HTT", "(", "ab", "-", "MAB5492", ")", ",", "HTT", "pS13", "(", "ab", "-", "CHDI", "-", "90001039", "-", "1", ")", "and", "HTT", "pT3", "(", "ab", "-", "CHDI", "-", "90001528", "-", "1", ")", "upon", "coexpression", "of", "HTTex1", "16Q", "eGFP", "or", "72Q", "eGFP", "or", "its", "phosphorylation", "-", "incompetent", "mutants", "with", "the", "indicated", "kinases", "for", "48", "hour", "in", "HEK293T", "cells", ".", "(", "B", ")", "The", "graph", "indicates", "the", "fold", "change", "in", "HTT", "in", "samples", "like", "illustrated", "in", "A", ",", "relative", "to", "empty", "vector", "controls", "normalized", "to", "GAPDH", ".", "(", "C", ")", "Representative", "immunoblot", "of", "the", "HTT", "(", "ab", "-", "MAB5492", ")", "after", "filter", "retardation", "assay", "from", "the", "insoluble", "cellular", "fraction", "upon", "expression", "of", "HTTex1", "16Q", "eGFP", "or", "72Q", "eGFP", "or", "its", "phosphorylation", "-", "incompetent", "mutants", "with", "the", "indicated", "kinases", "for", "48", "hour", "in", "HEK293T", "cells", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "the", "fold", "change", "in", "HTT", "aggregates", "compared", "to", "EV", "expressing", "HTTex1", "16Q", "from", "the", "experiments", "like", "in", "C", ".", "(", "E", ")", "Representative", "immunofluorescence", "images", "of", "HTT", "aggregates", "(", "eGFP", ")", "and", "TBK1", "(", "ab", "-", "anti", "-", "MYC", ")", "upon", "coexpression", "of", "HTTex1", "72Q", "eGFP", "or", "its", "phosphorylation", "-", "incompetent", "mutants", "with", "the", "indicated", "kinases", "for", "48", "hour", "in", "HEK293T", "cells", "(", "scale", "bar", "20μm", ")", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "the", "percentage", "of", "co", "-", "transfected", "cells", "presenting", "aggregates", "upon", "expression", "of", "the", "indicated", "kinase", ",", "from", "the", "experiments", "like", "in", "E", ".", "(", "G", ")", "Quantification", "of", "the", "percentage", "of", "cells", "presenting", "nuclear", "aggregates", "from", "the", "experiments", "like", "in", "E", ".", "(", "H", ")", "Representative", "western", "blots", "of", "HTT", "(", "ab", "-", "MAB5492", ")", ",", "HTT", "pS13", "(", "ab", "-", "CHDI", "-", "90001039", "-", "1", ")", "in", "soluble", "fraction", "and", "aggregates", "from", "HEK293T", "cells", "transfected", "first", "with", "HTTex1", "72Q", "eGFP", "and", "then", "after", "48", "hour", "(", "to", "enable", "the", "formation", "of", "aggregates", "before", "the", "kinase", "expression", ")", ";", "with", "TBK1", ";", "cells", "were", "lysed", "at", "the", "indicated", "time", "after", "kinase", "transfection", ".", "(", "I", ")", "Quantification", "of", "the", "percentage", "of", "cells", "presenting", "aggregates", "and", "kinase", "expression", "from", "the", "experiments", "in", "H", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Representative western blot of soluble HTT (ab-MAB5492), HTT pS13 (ab-CHDI-90001039-1) and HTT pT3 (ab-CHDI-90001528-1) upon coexpression of HTTex1 16Q eGFP or 72Q eGFP or its phosphorylation-incompetent mutants with the indicated kinases for 48 hour in HEK293T cells. (B) The graph indicates the fold change in HTT in samples like illustrated in A, relative to empty vector controls normalized to GAPDH. (C) Representative immunoblot of the HTT (ab-MAB5492) after filter retardation assay from the insoluble cellular fraction upon expression of HTTex1 16Q eGFP or 72Q eGFP or its phosphorylation-incompetent mutants with the indicated kinases for 48 hour in HEK293T cells. (D) Quantification of the fold change in HTT aggregates compared to EV expressing HTTex1 16Q from the experiments like in C. (E) Representative immunofluorescence images of HTT aggregates (eGFP) and TBK1 (ab-anti-MYC) upon coexpression of HTTex1 72Q eGFP or its phosphorylation-incompetent mutants with the indicated kinases for 48 hour in HEK293T cells (scale bar 20μm).(F) Quantification of the percentage of co-transfected cells presenting aggregates upon expression of the indicated kinase, from the experiments like in E. (G) Quantification of the percentage of cells presenting nuclear aggregates from the experiments like in E. (H) Representative western blots of HTT (ab-MAB5492), HTT pS13 (ab-CHDI-90001039-1) in soluble fraction and aggregates from HEK293T cells transfected first with HTTex1 72Q eGFP and then after 48 hour (to enable the formation of aggregates before the kinase expression); with TBK1; cells were lysed at the indicated time after kinase transfection. (I) Quantification of the percentage of cells presenting aggregates and kinase expression from the experiments in H. "}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", "Quantification", "of", "cell", "death", "by", "a", "nuclear", "condensation", "assay", ",", "cells", "were", "fixed", "and", "the", "nuclei", "were", "stained", "with", "Hoechst", "dye", ",", "cells", "with", "a", "nuclear", "intensity", "higher", "than", "the", "average", "intensity", "plus", "two", "standard", "deviations", "are", "considered", "dead", ".", "(", "A", ")", "The", "percentage", "of", "cell", "death", "at", "DIV14", ",", "after", "co", "-", "transfection", "of", "indicated", "kinases", "and", "HTTex1", "plasmid", "in", "rat", "primary", "striatal", "neurons", "at", "DIV9", "(", "n", "=", "3", ")", ",", "B", ")", "Quantification", "of", "cell", "death", "by", "a", "nuclear", "condensation", "assay", ",", "cells", "were", "fixed", "and", "the", "nuclei", "were", "stained", "with", "Hoechst", "dye", ",", "cells", "with", "a", "nuclear", "intensity", "higher", "than", "the", "average", "intensity", "plus", "two", "standard", "deviations", "are", "considered", "dead", ".", "(", "B", ")", "The", "percentage", "of", "cell", "death", "at", "DIV7", ",", "after", "co", "-", "transfection", "of", "indicated", "kinases", "and", "HTT", "N586", "plasmid", "in", "mouse", "primary", "striatal", "neurons", "at", "DIV5", "(", "n", "=", "8", ")", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "cell", "death", "by", "a", "TUNEL", "assay", "in", "rat", "primary", "striatal", "neurons", "transfected", "with", "the", "indicated", "kinases", "at", "DIV9", "with", "the", "indicated", "HTT", "plasmid", ".", "The", "cells", "were", "fixed", "at", "DIV14", ",", "and", "the", "percentage", "of", "TUNEL", "-", "positive", "neurons", "was", "counted", "and", "plotted", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "D", ")", "The", "percentage", "of", "cell", "death", ".", ",", "quantification", "by", "a", "nuclear", "condensation", "assay", "in", "mouse", "primary", "cortical", "neurons", "co", "-", "transfected", "with", "the", "indicated", "HTT", "N586", "and", "kinases", "at", "DIV5", ",", "cells", "were", "treated", "with", "TBK1", "inhibitor", "MRT", "68601", "at", "DIV5", "till", "DIV7", ".", "Cells", "were", "fixed", ",", "and", "the", "nuclei", "were", "stained", "with", "Hoechst", "dye", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "E", ")", "Quantification", "of", "cell", "death", "by", "a", "TUNEL", "assay", "in", "mouse", "primary", "striatal", "neurons", "transfected", "with", "the", "indicated", "kinases", "at", "DIV9", "with", "the", "indicated", "HTT", "plasmid", ".", "The", "cells", "were", "fixed", "on", "DIV14", ",", "and", "the", "percentage", "of", "TUNEL", "-", "positive", "neurons", "was", "counted", "and", "plotted", "(", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A Quantification of cell death by a nuclear condensation assay, cells were fixed and the nuclei were stained with Hoechst dye, cells with a nuclear intensity higher than the average intensity plus two standard deviations are considered dead. (A) The percentage of cell death at DIV14, after co-transfection of indicated kinases and HTTex1 plasmid in rat primary striatal neurons at DIV9 (n=3),B) Quantification of cell death by a nuclear condensation assay, cells were fixed and the nuclei were stained with Hoechst dye, cells with a nuclear intensity higher than the average intensity plus two standard deviations are considered dead. (B) The percentage of cell death at DIV7, after co-transfection of indicated kinases and HTT N586 plasmid in mouse primary striatal neurons at DIV5 (n=8).(C) Quantification of cell death by a TUNEL assay in rat primary striatal neurons transfected with the indicated kinases at DIV9 with the indicated HTT plasmid. The cells were fixed at DIV14, and the percentage of TUNEL-positive neurons was counted and plotted (n=3).(D) The percentage of cell death., quantification by a nuclear condensation assay in mouse primary cortical neurons co-transfected with the indicated HTT N586 and kinases at DIV5, cells were treated with TBK1 inhibitor MRT 68601 at DIV5 till DIV7. Cells were fixed, and the nuclei were stained with Hoechst dye (n=3).(E) Quantification of cell death by a TUNEL assay in mouse primary striatal neurons transfected with the indicated kinases at DIV9 with the indicated HTT plasmid. The cells were fixed on DIV14, and the percentage of TUNEL-positive neurons was counted and plotted (n=3)."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "Representative", "immunofluorescence", "image", "of", "C", ".", "elegans", "overexpressing", "HTT", "N513", "Q15", "and", "HTT", "N513", "Q128", "(", "scale", "bar", "20μm", ")", ".", "Top", "panel", "complete", "worm", ",", "lower", "panel", "head", "region", ".", "(", "B", ")", "Western", "blot", "showing", "HTT", "(", "ab", "-", "MAB5492", ")", ",", "HTT", "pS13", "(", "ab", "-", "CHDI", "-", "90001039", "-", "1", ")", "and", "HTT", "pT3", "(", "ab", "-", "CHDI", "-", "90001528", "-", "1", ")", "levels", "in", "C", ".", "elegans", "overexpressing", "HTT", "N513", "Q15", "and", "HTT", "N513", "Q128", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "the", "fold", "changes", "in", "ratios", "of", "HTT", "pS13", "and", "pT3", "to", "total", "HTT", "in", "C", ".", "elegans", "overexpressing", "HTT", "N513", "Q15", "and", "HTT", "N513", "Q128", "from", "the", "experiments", "like", "in", "B", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "D", ")", "Representative", "western", "blots", "showing", "the", "HTT", "(", "ab", "-", "MAB5492", ")", "and", "HTT", "pS13", "(", "ab", "-", "CHDI", "-", "90001039", "-", "1", ")", "levels", "from", "the", "detergent", "soluble", "fraction", "and", "HTT", "aggregates", "(", "ab", "-", "MAB5492", ")", "from", "the", "detergent", "insoluble", "fraction", "in", "three", "different", "transgenic", "C", ".", "elegans", "lines", "overexpressing", "TBK1", "or", "the", "TBK1", "KD", ".", "(", "E", ")", "The", "bottom", "graph", "indicates", "the", "fold", "change", "in", "the", "HTT", "pS13", "(", "ab", "-", "CHDI", "-", "90001039", "-", "1", ")", "ratios", "to", "total", "HTT", "(", "ab", "-", "MAB5492", ")", "compared", "to", "those", "in", "the", "kinase", "-", "dead", "mutant", "line", "1", "from", "the", "experiments", "like", "in", "D", ".", "The", "top", "graph", "indicates", "the", "fold", "change", "in", "HTT", "aggregates", "(", "ab", "-", "MAB5492", ")", "compared", "to", "that", "in", "the", "kinase", "-", "dead", "mutant", "the", "experiments", "like", "in", "D", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "F", ")", "Mobility", "of", "the", "Q15", "and", "Q128", "C", ".", "elegans", "lines", "upon", "overexpression", "of", "TBK1", "or", "TBK1", "KD", "(", "n", "=", "26", "-", "29", ")", ".", "(", "G", ")", "Survival", "graph", "of", "the", "Q15", "and", "Q128", "C", ".", "elegans", "lines", "upon", "overexpression", "of", "TBK1", "or", "TBK1", "KD", "(", "n", "=", "30", ")", ".", "(", "H", ")", "Representative", "western", "blots", "showing", "HTT", "(", "ab", "-", "MAB5492", ")", "and", "HTT", "pS13", "(", "ab", "-", "CHDI", "-", "90001039", "-", "1", ")", "from", "the", "detergent", "soluble", "fraction", "and", "HTT", "aggregates", "(", "ab", "-", "MAB5492", ")", "from", "the", "detergent", "insoluble", "fraction", "in", "TBK1", "orthologue", "(", "ikke", "-", "1", "or", "unc", "-", "51", ")", "RNAi", "-", "treated", "C", ".", "elegans", "lines", "expressing", "HTT", "N513", "Q15", "and", "HTT", "N513", "Q128", ".", "(", "I", ")", "Quantification", "of", "the", "fold", "change", "in", "the", "ratio", "of", "pS13", "HTT", "to", "total", "HTT", "compared", "to", "non", "-", "targeting", "RNAi", "from", "the", "experiments", "like", "in", "H", "(", "n", "=", "4", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) Representative immunofluorescence image of C. elegans overexpressing HTT N513 Q15 and HTT N513 Q128 (scale bar 20μm). Top panel complete worm, lower panel head region.(B) Western blot showing HTT (ab-MAB5492), HTT pS13 (ab-CHDI-90001039-1) and HTT pT3 (ab-CHDI-90001528-1) levels in C. elegans overexpressing HTT N513 Q15 and HTT N513 Q128. (C) Quantification of the fold changes in ratios of HTT pS13 and pT3 to total HTT in C. elegans overexpressing HTT N513 Q15 and HTT N513 Q128 from the experiments like in B (n=3). (D) Representative western blots showing the HTT (ab-MAB5492) and HTT pS13 (ab-CHDI-90001039-1) levels from the detergent soluble fraction and HTT aggregates (ab-MAB5492) from the detergent insoluble fraction in three different transgenic C. elegans lines overexpressing TBK1 or the TBK1 KD. (E) The bottom graph indicates the fold change in the HTT pS13 (ab-CHDI-90001039-1) ratios to total HTT (ab-MAB5492) compared to those in the kinase-dead mutant line 1 from the experiments like in D. The top graph indicates the fold change in HTT aggregates (ab-MAB5492) compared to that in the kinase-dead mutant the experiments like in D (n=3). (F) Mobility of the Q15 and Q128 C. elegans lines upon overexpression of TBK1 or TBK1 KD (n= 26-29).(G) Survival graph of the Q15 and Q128 C. elegans lines upon overexpression of TBK1 or TBK1 KD (n=30).(H) Representative western blots showing HTT (ab-MAB5492) and HTT pS13 (ab-CHDI-90001039-1) from the detergent soluble fraction and HTT aggregates (ab-MAB5492) from the detergent insoluble fraction in TBK1 orthologue (ikke-1 or unc-51) RNAi-treated C. elegans lines expressing HTT N513 Q15 and HTT N513 Q128. (I) Quantification of the fold change in the ratio of pS13 HTT to total HTT compared to non-targeting RNAi from the experiments like in H (n=4). "}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Representative", "immunoblot", "of", "a", "filter", "retardation", "of", "HTT", "(", "ab", "-", "MAB5492", ")", "from", "the", "insoluble", "cellular", "fraction", ";", "HEK293T", "cells", "co", "-", "expressed", "HTTex1", "72Q", "eGFP", "and", "TBK1", "or", "TBK1", "KD", "for", "48", "hour", ",", "and", "for", "the", "last", "16", "hour", ",", "they", "were", "treated", "with", "the", "indicated", "proteasome", "inhibitor", "(", "MG132", ",", "5", "µM", ")", "or", "autophagy", "inhibitor", "(", "Baf", "A1", ",", "200", "nM", ",", "NH4Cl", ",", "10", "mM", ",", "3", "-", "MA", ",", "5", "mM", ")", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "the", "fold", "change", "in", "HTT", "aggregates", "compared", "to", "TBK1", "KD", "treated", "with", "DMSO", "from", "the", "blots", "like", "in", "A", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "C", ")", "Immunoblot", "of", "LC3", "(", "ab48394", ")", "from", "soluble", "HEK293", "cellular", "fractions", "overexpressing", "TBK1", "or", "TBK1", "KD", "for", "24", "hour", ";", "for", "the", "last", "hour", ",", "Baf", "A1", "(", "500", "nM", ")", "was", "added", "as", "indicated", ".", "(", "D", ")", "Fold", "change", "in", "LC3", "-", "II", "levels", "(", "lower", "band", ")", "relative", "to", "the", "respective", "untreated", "kinase", "dead", "mutant", "normalized", "to", "actin", "from", "the", "blots", "like", "in", "C", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "E", ")", "Immunoblot", "of", "LC3", "(", "ab48394", ")", "from", "soluble", "rat", "primary", "neuronal", "cells", "overexpressing", "lentivirus", "-", "mediated", "TBK1", "and", "TBK1", "KD", "for", "96", "hour", ".", "For", "the", "last", "1", "or", "4", "hour", ",", "Baf", "A1", "(", "500", "nM", ")", "was", "added", "as", "indicated", ".", "(", "F", ")", "Quantification", "of", "the", "fold", "change", "in", "LC3", "-", "II", "levels", "(", "lower", "band", ")", "compared", "to", "the", "kinase", "dead", "mutant", ",", "which", "was", "untreated", ",", "normalized", "to", "GAPDH", "from", "the", "blots", "like", "in", "E", "(", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Representative immunoblot of a filter retardation of HTT (ab-MAB5492) from the insoluble cellular fraction; HEK293T cells co-expressed HTTex1 72Q eGFP and TBK1 or TBK1 KD for 48 hour, and for the last 16 hour, they were treated with the indicated proteasome inhibitor (MG132, 5 µM) or autophagy inhibitor (Baf A1, 200 nM, NH4Cl, 10 mM, 3-MA,5 mM). (B) Quantification of the fold change in HTT aggregates compared to TBK1 KD treated with DMSO from the blots like in A (n=3).(C) Immunoblot of LC3 (ab48394) from soluble HEK293 cellular fractions overexpressing TBK1 or TBK1 KD for 24 hour; for the last hour, Baf A1 (500 nM) was added as indicated. (D) Fold change in LC3-II levels (lower band) relative to the respective untreated kinase dead mutant normalized to actin from the blots like in C (n=3). (E) Immunoblot of LC3 (ab48394) from soluble rat primary neuronal cells overexpressing lentivirus-mediated TBK1 and TBK1 KD for 96 hour. For the last 1 or 4 hour, Baf A1 (500 nM) was added as indicated. (F) Quantification of the fold change in LC3-II levels (lower band) compared to the kinase dead mutant, which was untreated, normalized to GAPDH from the blots like in E (n=3)."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Western", "blot", "of", "soluble", "HTT", "(", "ab", "-", "MAB5492", ")", ",", "HTT", "pS13", "(", "ab", "-", "CHDI", "-", "90001039", "-", "1", ")", "and", "HTT", "aggregates", "(", "ab", "-", "MAB5492", ")", ",", "upon", "coexpression", "of", "the", "HTTex1", "72Q", "eGFP", "or", "HTTex1", "72Q", "eGFP", "S13A", "/", "S16A", "variant", "with", "TBK1", "KD", ",", "TBK1", "or", "TBK1", "Δ690", "-", "713", "for", "48", "hour", "in", "HEK293", "cells", ".", "(", "B", ")", "The", "graph", "indicates", "the", "calculated", "fold", "changes", "in", "HTT", ",", "HTT", "pS13", "ratio", "to", "total", "HTT", "and", "HTT", "aggregates", "all", "compared", "to", "the", "levels", "in", "TBK1", "KD", "from", "the", "experiments", "like", "in", "A", "(", "bottom", "panel", "normalized", "to", "Tubulin", ",", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "C", ")", "Representative", "immunofluorescence", "images", "of", "eGFP", "HTTex1", "72Q", "or", "its", "phosphorylation", "-", "deficient", "variant", "S13A", "/", "S16A", "upon", "coexpression", "with", "TBK1", "KD", "or", "TBK1", "or", "TBK1", "Δ690", "-", "713", "(", "ab", "-", "anti", "-", "Myc", ")", "with", "for", "48", "hour", "in", "HEK293", "cells", "(", "scale", "bar", "20μm", ")", ".", "(", "D", ")", "The", "graph", "indicates", "the", "percentage", "of", "co", "-", "transfected", "cells", "presenting", "aggregates", "upon", "expression", "of", "the", "indicated", "kinase", ",", "from", "the", "experiments", "like", "in", "C", "(", "n", "=", "3", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Western blot of soluble HTT (ab-MAB5492), HTT pS13 (ab-CHDI-90001039-1) and HTT aggregates (ab-MAB5492), upon coexpression of the HTTex1 72Q eGFP or HTTex1 72Q eGFP S13A/S16A variant with TBK1 KD, TBK1 or TBK1 Δ690-713 for 48 hour in HEK293 cells. (B) The graph indicates the calculated fold changes in HTT, HTT pS13 ratio to total HTT and HTT aggregates all compared to the levels in TBK1 KD from the experiments like in A (bottom panel normalized to Tubulin, n=3). (C) Representative immunofluorescence images of eGFP HTTex1 72Q or its phosphorylation-deficient variant S13A/S16A upon coexpression with TBK1 KD or TBK1 or TBK1 Δ690-713 (ab-anti-Myc) with for 48 hour in HEK293 cells (scale bar 20μm). (D) The graph indicates the percentage of co-transfected cells presenting aggregates upon expression of the indicated kinase, from the experiments like in C (n=3). "}
{"words": ["Figure", "1A", "-", "O", "(", "A", ",", "F", ",", "K", ")", "slices", "through", "electron", "cryo", "-", "tomograms", "of", "L", ".", "pneumophila", ",", "P", ".", "aeruginosa", ",", "and", "S", ".", "oneidensis", "cells", ",", "respectively", ",", "highlighting", "a", "PL", "sub", "-", "complex", "in", "the", "outer", "membrane", "(", "dashed", "yellow", "circle", ")", ".", "(", "B", ",", "G", ",", "L", ")", "Enlarged", "views", "of", "the", "complexes", ".", "(", "C", ",", "H", ",", "M", ")", "Sub", "-", "tomogram", "averages", "of", "PL", "sub", "-", "complexes", "from", "each", "species", ".", "(", "D", ",", "I", ",", "N", ")", "Schematic", "representations", "of", "the", "sub", "-", "tomogram", "averages", "with", "different", "rings", "colored", "and", "labeled", ".", "(", "E", ",", "J", ",", "O", ")", "Sub", "-", "tomogram", "averages", "of", "fully", "-", "assembled", "flagella", "from", "each", "species", "for", "comparison", ".", "Scale", "bars", ":", "(", "black", ")", "50", "nm", ",", "(", "orange", ")", "25", "nm", ",", "(", "red", ")", "20", "nm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A-O (A, F, K) slices through electron cryo-tomograms of L. pneumophila, P. aeruginosa, and S. oneidensis cells, respectively, highlighting a PL sub-complex in the outer membrane (dashed yellow circle). (B, G, L) Enlarged views of the complexes. (C, H, M) Sub-tomogram averages of PL sub-complexes from each species. (D, I, N) Schematic representations of the sub-tomogram averages with different rings colored and labeled. (E, J, O) Sub-tomogram averages of fully-assembled flagella from each species for comparison. Scale bars: (black) 50 nm, (orange) 25 nm, (red) 20 nm."}
{"words": ["Figure", "2Sub", "-", "tomogram", "average", "of", "the", "IM", "sub", "-", "complex", "constituting", "the", "C", "-", "ring", ",", "MS", "-", "ring", "and", "export", "apparatus", ".", "Schematic", "representation", "of", "the", "sub", "-", "tomogram", "average", "shown", "in", "(", "A", ")", "highlighting", "the", "different", "parts", "of", "the", "complex", ".", "Sub", "-", "tomogram", "average", "of", "the", "motors", "of", "fully", "-", "assembled", "flagella", ".", "Slices", "through", "electron", "cryo", "-", "tomograms", "showing", "neighboring", "PL", "and", "IM", "sub", "-", "complexes", ".", "Dashed", "-", "yellow", "circles", "highlight", "the", "IM", "sub", "-", "complex", "while", "dashed", "-", "blue", "arrows", "highlight", "the", "PL", "sub", "-", "complex", ".", "Dashed", "-", "red", "lines", "mark", "the", "border", "between", "two", "images", "used", "to", "make", "a", "composite", "image", "when", "the", "PL", "and", "IM", "sub", "-", "complexes", "were", "found", "at", "different", "levels", "in", "the", "tomogram", ".", "Schematic", "representation", "of", "an", "IM", "sub", "-", "complex", "in", "the", "vicinity", "of", "a", "PL", "sub", "-", "complex", ".", "Slices", "through", "electron", "cryo", "-", "tomograms", "of", "L", ".", "pneumophila", "highlighting", "the", "presence", "of", "a", "fully", "-", "assembled", "basal", "body", "lacking", "the", "hook", "and", "the", "filament", ".", "Schematic", "representation", "of", "the", "basal", "bodies", "in", "(", "L", "and", "M", ")", ".", "Central", "slice", "through", "an", "electron", "cryo", "-", "tomogram", "of", "a", "lysed", "cell", ".", "The", "dashed", "-", "yellow", "circle", "highlights", "the", "flagellar", "motor", ".", "Enlarged", "view", "of", "the", "same", "slice", "shown", "in", "(", "O", ")", ".", "The", "absence", "of", "the", "C", "-", "ring", "and", "the", "export", "apparatus", "is", "highlighted", "by", "the", "dashed", "-", "orange", "arrow", ".", "Schematic", "representation", "of", "the", "complex", "found", "in", "(", "P", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Sub-tomogram average of the IM sub-complex constituting the C- ring, MS-ring and export apparatus. Schematic representation of the sub-tomogram average shown in (A) highlighting the different parts of the complex. Sub-tomogram average of the motors of fully-assembled flagella. Slices through electron cryo-tomograms showing neighboring PL and IM sub-complexes. Dashed-yellow circles highlight the IM sub-complex while dashed-blue arrows highlight the PL sub-complex. Dashed-red lines mark the border between two images used to make a composite image when the PL and IM sub-complexes were found at different levels in the tomogram. Schematic representation of an IM sub-complex in the vicinity of a PL sub-complex. Slices through electron cryo-tomograms of L. pneumophila highlighting the presence of a fully-assembled basal body lacking the hook and the filament. Schematic representation of the basal bodies in (L and M). Central slice through an electron cryo-tomogram of a lysed cell. The dashed-yellow circle highlights the flagellar motor. Enlarged view of the same slice shown in (O). The absence of the C-ring and the export apparatus is highlighted by the dashed-orange arrow. Schematic representation of the complex found in (P)."}
{"words": ["Figure", "3Slices", "through", "electron", "cryo", "-", "tomograms", "showing", "fully", "-", "assembled", "motors", "without", "the", "hook", "and", "filament", ".", "The", "dashed", "-", "yellow", "circles", "indicate", "the", "IM", "sub", "-", "complex", ".", "Schematic", "representation", "of", "the", "P", ".", "aeruginosa", "motors", "lacking", "the", "hook", "and", "filament", "shown", "in", "(", "A", "-", "C", ")", ".", "Slices", "through", "electron", "cryo", "-", "tomograms", "showing", "fully", "-", "assembled", "motors", "with", "the", "hook", "and", "lacking", "the", "filament", ".", "Schematic", "representation", "of", "the", "motors", "with", "the", "hook", "shown", "in", "(", "E", "-", "G", ")", ".", "Slices", "through", "electron", "cryo", "-", "tomograms", "of", "intact", "P", ".", "aeruginosa", "∆", "flgI", "cells", "showing", "the", "presence", "of", "the", "inner", "-", "membrane", "sub", "-", "complex", "with", "the", "rod", ".", "Schematic", "representation", "of", "the", "inner", "-", "membrane", "sub", "-", "complex", "with", "the", "rod", "shown", "in", "(", "I", "-", "K", ")", ".", "Slices", "through", "electron", "cryo", "-", "tomogram", "of", "lysed", "P", ".", "aeruginosa", "∆", "flgI", "cells", "showing", "the", "presence", "of", "the", "sub", "-", "complex", "constituting", "the", "MS", "-", "ring", "and", "the", "rod", ".", "Schematic", "representation", "of", "the", "sub", "-", "complex", "described", "in", "(", "M", "-", "O", ")", ".", "A", "slice", "through", "an", "electron", "cryo", "-", "tomogram", "of", "a", "P", ".", "aeruginosa", "∆", "flgG", "cell", "highlighting", "the", "presence", "of", "the", "inner", "-", "membrane", "sub", "-", "complex", ".", "Schematic", "representation", "of", "the", "inner", "-", "membrane", "sub", "-", "complex", "shown", "in", "(", "Q", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Slices through electron cryo-tomograms showing fully-assembled motors without the hook and filament. The dashed-yellow circles indicate the IM sub-complex. Schematic representation of the P. aeruginosa motors lacking the hook and filament shown in (A-C). Slices through electron cryo-tomograms showing fully-assembled motors with the hook and lacking the filament. Schematic representation of the motors with the hook shown in (E-G). Slices through electron cryo-tomograms of intact P. aeruginosa ∆flgI cells showing the presence of the inner-membrane sub-complex with the rod. Schematic representation of the inner-membrane sub-complex with the rod shown in (I-K). Slices through electron cryo-tomogram of lysed P. aeruginosa ∆flgI cells showing the presence of the sub-complex constituting the MS-ring and the rod. Schematic representation of the sub-complex described in (M-O). A slice through an electron cryo-tomogram of a P. aeruginosa ∆flgG cell highlighting the presence of the inner-membrane sub-complex. Schematic representation of the inner-membrane sub-complex shown in (Q)."}
{"words": ["Figure", "4Slices", "through", "electron", "cryo", "-", "tomograms", "of", "wild", "type", "cells", "showing", "fully", "-", "assembled", "motors", "without", "the", "hook", "and", "filament", ".", "Schematic", "representation", "of", "the", "motors", "lacking", "the", "hook", "and", "filament", "shown", "in", "(", "A", "-", "C", ")", ".", "Sub", "-", "tomogram", "average", "of", "the", "motors", "of", "fully", "-", "assembled", "flagella", ".", "Slice", "through", "an", "electron", "cryo", "-", "tomogram", "of", "a", "ΔflgH", "cell", "showing", "an", "IM", "sub", "-", "complex", ",", "indicated", "by", "the", "dashed", "-", "yellow", "circle", ".", "Schematic", "representation", "of", "the", "IM", "sub", "-", "complex", "shown", "in", "(", "F", ")", ".", "Slices", "through", "electron", "cryo", "-", "tomograms", "of", "ΔflgH", "cells", "showing", "the", "IM", "sub", "-", "complex", "with", "the", "rod", "and", "the", "P", "-", "ring", ",", "indicated", "by", "the", "dashed", "-", "yellow", "circles", ".", "Schematic", "representation", "of", "the", "structures", "shown", "in", "(", "H", "and", "I", ")", ".", "Slices", "through", "electron", "cryo", "-", "tomograms", "of", "ΔflaA", "/", "B", "cells", "highlighting", "the", "flagellar", "motor", "and", "the", "hook", "(", "without", "the", "filament", ")", ".", "Sub", "-", "tomogram", "average", "of", "the", "flagellar", "motor", "and", "the", "hook", "structure", "found", "in", "ΔflaA", "/", "B", "cells", ".", "Schematic", "representation", "of", "the", "sub", "-", "tomogram", "average", "shown", "in", "(", "N", ")", ".", "Slices", "through", "electron", "cryo", "-", "tomograms", "of", "ΔflaA", "/", "B", "cells", "illustrating", "a", "disassembly", "product", "constituting", "the", "PL", "sub", "-", "complex", ",", "the", "rod", "and", "the", "hook", ".", "Sub", "-", "tomogram", "average", "of", "the", "disassembly", "complex", "shown", "in", "(", "P", "-", "R", ")", ".", "The", "dashed", "-", "orange", "arrow", "indicates", "the", "absence", "of", "the", "IM", "sub", "-", "complex", "in", "this", "structure", ".", "Schematic", "representation", "of", "the", "disassembly", "product", "shown", "in", "(", "P", "-", "S", ")", ".", "Slices", "through", "electron", "cryo", "-", "tomograms", "of", "ΔflaA", "/", "B", "cells", "highlighting", "PL", "sub", "-", "complexes", "(", "dashed", "-", "yellow", "circles", ")", ".", "Sub", "-", "tomogram", "average", "of", "the", "PL", "sub", "-", "complexes", "in", "ΔflaA", "/", "B", "cells", ".", "Schematic", "representation", "of", "the", "sub", "-", "tomogram", "average", "shown", "in", "(", "X", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Slices through electron cryo-tomograms of wild type cells showing fully-assembled motors without the hook and filament. Schematic representation of the motors lacking the hook and filament shown in (A-C). Sub-tomogram average of the motors of fully-assembled flagella. Slice through an electron cryo-tomogram of a ΔflgH cell showing an IM sub-complex, indicated by the dashed-yellow circle. Schematic representation of the IM sub-complex shown in (F). Slices through electron cryo-tomograms of ΔflgH cells showing the IM sub-complex with the rod and the P-ring, indicated by the dashed-yellow circles. Schematic representation of the structures shown in (H and I). Slices through electron cryo-tomograms of ΔflaA/B cells highlighting the flagellar motor and the hook (without the filament). Sub-tomogram average of the flagellar motor and the hook structure found in ΔflaA/B cells. Schematic representation of the sub-tomogram average shown in (N). Slices through electron cryo-tomograms of ΔflaA/B cells illustrating a disassembly product constituting the PL sub-complex, the rod and the hook. Sub-tomogram average of the disassembly complex shown in (P-R). The dashed-orange arrow indicates the absence of the IM sub-complex in this structure. Schematic representation of the disassembly product shown in (P-S). Slices through electron cryo-tomograms of ΔflaA/B cells highlighting PL sub-complexes (dashed-yellow circles). Sub-tomogram average of the PL sub-complexes in ΔflaA/B cells. Schematic representation of the sub-tomogram average shown in (X)."}
{"words": ["Figure", "1A", ",", "B", ".", "Immunoblotting", "were", "performed", "to", "validate", "Mettl3", "or", "Mettl14", "expression", "levels", "in", "CT26", "and", "B16", "cells", "as", "indicated", ".", "Gapdh", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "Tumor", "volume", "was", "monitored", "for", "control", "and", "Mettl3", "or", "Mettl14", "-", "depleted", "tumors", "with", "treatment", "as", "indicated", "in", "CT26", "colon", "cancer", "Data", "are", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", "of", "the", "indicated", "number", "of", "mice", "in", "each", "group", ".", "n", ",", "the", "numbers", "of", "mice", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", ".", "Tumor", "volume", "was", "monitored", "for", "control", "and", "Mettl3", "or", "Mettl14", "-", "depleted", "tumors", "with", "treatment", "as", "indicated", "in", "B16", "melanoma", ",", "respectively", ".", "Data", "are", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", "of", "the", "indicated", "number", "of", "mice", "in", "each", "group", ".", "n", ",", "the", "numbers", "of", "mice", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", ".", "E", ",", "F", ".", "Survival", "analysis", "of", "control", "tumors", "and", "those", "with", "depleted", "genes", "were", "recorded", "as", "indicated", "in", "CT26", "colon", "cancer", "and", "B16", "melanoma", ",", "respectively", ".", "Data", "are", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "of", "the", "indicated", "number", "of", "mice", "in", "each", "group", ".", "n", ",", "the", "numbers", "of", "mice", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A, B. Immunoblotting were performed to validate Mettl3 or Mettl14 expression levels in CT26 and B16 cells as indicated. Gapdh served as a loading control.Tumor volume was monitored for control and Mettl3 or Mettl14-depleted tumors with treatment as indicated in CT26 colon cancer Data are mean ± s.e.m of the indicated number of mice in each group. n, the numbers of mice. * P < 0.05; * * * P < 0.001 by Student's t-tests.Tumor volume was monitored for control and Mettl3 or Mettl14-depleted tumors with treatment as indicated in B16 melanoma, respectively. Data are mean ± s.e.m of the indicated number of mice in each group. n, the numbers of mice. * P < 0.05; * * * P < 0.001 by Student's t-tests.E, F. Survival analysis of control tumors and those with depleted genes were recorded as indicated in CT26 colon cancer and B16 melanoma, respectively. Data are mean ± s.e.m. of the indicated number of mice in each group. n, the numbers of mice. * P < 0.05; * * P < 0.01; * * * P < 0.001 by Student's t-tests."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Percentage", "of", "tumor", "-", "infiltrating", "T", "cells", ",", "Treg", "and", "NK", "cells", "were", "identified", "by", "flow", "cytometry", "from", "CT26", "tumors", "as", "indicated", ".", "Each", "spot", "represents", "one", "mouse", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", ".", "B", ".", "Representative", "images", "of", "CD8", "by", "IHC", "staining", ".", "Tissue", "sections", "from", "BALB", "/", "c", "mice", "bearing", "the", "indicated", "knockout", "of", "genes", "with", "treatment", "of", "PD1", "antibody", ".", "Scale", "bars", ",", "50", "μm", ".", "C", ".", "Percentage", "of", "Granzyme", "B", "-", "expressing", "CD8", "+", "T", "cells", "from", "control", "and", "Mettl3", "or", "Mettl14", "deficient", "CT26", "tumors", ".", "Each", "spot", "represents", "one", "mouse", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", ".", "Mice", "bearing", "control", "and", "Mettl3", "or", "Mettl14", "null", "tumors", "were", "treated", "with", "CD8", "-", "depleting", "antibody", "and", "PD", "-", "1", "antibody", "or", "PD", "-", "1", "as", "indicated", ".", "Tumor", "volume", "was", "measured", "over", "time", "points", ".", "n", ",", "the", "numbers", "of", "mice", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", ".", "Mice", "bearing", "control", "and", "Mettl3", "or", "Mettl14", "null", "tumors", "were", "treated", "with", "CD8", "-", "depleting", "antibody", "and", "PD", "-", "1", "antibody", "or", "PD", "-", "1", "/", "GVAX", "as", "indicated", ".", "Tumor", "volume", "was", "measured", "over", "time", "points", ".", "n", ",", "the", "numbers", "of", "mice", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", ".", "IFNγ", "production", "in", "serum", "(", "F", ")", "from", "BALB", "/", "c", "mice", "by", "ELISA", ".", "The", "results", "are", "representatives", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "n", ",", "the", "numbers", "of", "mice", ".", "Data", "are", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", ".", "IFNγ", "production", "in", "Intratumor", "(", "G", ")", "from", "BALB", "/", "c", "mice", "by", "ELISA", ".", "The", "results", "are", "representatives", "of", "at", "least", "three", "independent", "experiments", ".", "n", ",", "the", "numbers", "of", "mice", ".", "Data", "are", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Percentage of tumor-infiltrating T cells, Treg and NK cells were identified by flow cytometry from CT26 tumors as indicated. Each spot represents one mouse. * P < 0.05; * * P < 0.01 by Student's t-tests.B. Representative images of CD8 by IHC staining. Tissue sections from BALB/c mice bearing the indicated knockout of genes with treatment of PD1 antibody. Scale bars, 50 μm.C. Percentage of Granzyme B-expressing CD8+ T cells from control and Mettl3 or Mettl14 deficient CT26 tumors. Each spot represents one mouse. * P < 0.05; * * P < 0.01 by Student's t-tests.Mice bearing control and Mettl3 or Mettl14 null tumors were treated with CD8-depleting antibody and PD-1 antibody or PD-1 as indicated. Tumor volume was measured over time points. n, the numbers of mice. * P < 0.05; * * P < 0.01; * * * P < 0.001 by Student's t-tests.Mice bearing control and Mettl3 or Mettl14 null tumors were treated with CD8-depleting antibody and PD-1 antibody or PD-1/GVAX as indicated. Tumor volume was measured over time points. n, the numbers of mice. * P < 0.05; * * P < 0.01; * * * P < 0.001 by Student's t-tests.IFNγ production in serum (F) from BALB/c mice by ELISA. The results are representatives of at least three independent experiments. n, the numbers of mice. Data are mean ± s.e.m. * P < 0.05 by Student's t-tests.IFNγ production in Intratumor (G) from BALB/c mice by ELISA. The results are representatives of at least three independent experiments. n, the numbers of mice. Data are mean ± s.e.m. * P < 0.05 by Student's t-tests."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "Volcano", "plot", "of", "differentially", "expressed", "genes", "obtained", "by", "DESeq2", "analysis", "in", "Mettl3", "or", "Mettl14", "null", "tumors", "compared", "to", "control", "tumors", ".", "Significantly", "upregulated", "or", "downregulated", "genes", "are", "plotted", "in", "red", "and", "blue", "points", ",", "respectively", ".", "n", ".", "s", ",", "non", "-", "significant", ".", "F", ".", "Representative", "genes", "with", "m6A", "sites", "generated", "by", "integrative", "genomics", "viewer", ".", "Data", "is", "representative", "of", "duplicates", "with", "similar", "results", ".", "Red", "represents", "reads", "coverage", "of", "IP", "sample", "and", "blue", "represents", "reads", "coverage", "of", "input", "sample", ".", "Rectangular", "cyan", "shade", "represents", "the", "m6A", "peaks", "located", "on", "transcripts", ".", "G", ".", "m6A", "enrichment", "of", "Stat1", "and", "Irf1", "was", "examined", "by", "m6A", "RIP", "-", "qPCR", "in", "control", ",", "Mettl3", ",", "or", "Mettl14", "depleted", "CT26", "tumors", "as", "indicated", ".", "Ctla4", "functioned", "as", "a", "m6A", "negative", "control", "(", "Wang", "et", "al", ".", ",", "2019", ")", "Data", "are", "mean", "±", "s", ".", "d", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", ".", "H", ".", "Immunoblots", "of", "p", "-", "Stat1", "(", "phosphorylated", ")", ",", "Stat1", "and", "Irf1", "were", "carried", "out", "in", "the", "indicated", "tumors", "in", "triplicate", "with", "Gapdh", "as", "a", "loading", "control", ".", "I", ".", "Tumor", "growth", "from", "CT26", "cells", "with", "Mettl3", ",", "Mettl14", ",", "Mettl3", "/", "Stat1", ",", "Mettl3", "/", "Irf1", ",", "Mettl14", "/", "Stat1", "or", "Mettl14", "/", "Irf1", "-", "depleted", "genes", "and", "control", "under", "treatment", "of", "PD", "-", "1", "antibody", "as", "indicated", ".", "n", ",", "the", "numbers", "of", "mice", ".", "Data", "are", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", "of", "the", "indicated", "number", "of", "mice", "in", "each", "group", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. Volcano plot of differentially expressed genes obtained by DESeq2 analysis in Mettl3 or Mettl14 null tumors compared to control tumors. Significantly upregulated or downregulated genes are plotted in red and blue points, respectively. n.s, non-significant.F. Representative genes with m6A sites generated by integrative genomics viewer. Data is representative of duplicates with similar results. Red represents reads coverage of IP sample and blue represents reads coverage of input sample. Rectangular cyan shade represents the m6A peaks located on transcripts.G. m6A enrichment of Stat1 and Irf1 was examined by m6A RIP-qPCR in control, Mettl3, or Mettl14 depleted CT26 tumors as indicated. Ctla4 functioned as a m6A negative control (Wang et al., 2019) Data are mean ± s.d. * * P < 0.01 by Student's t-tests.H. Immunoblots of p-Stat1 (phosphorylated), Stat1 and Irf1 were carried out in the indicated tumors in triplicate with Gapdh as a loading control.I. Tumor growth from CT26 cells with Mettl3, Mettl14, Mettl3/Stat1, Mettl3/Irf1, Mettl14/Stat1 or Mettl14/Irf1-depleted genes and control under treatment of PD-1 antibody as indicated. n, the numbers of mice. Data are mean ± s.e.m of the indicated number of mice in each group."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "Cellular", "proliferation", "analysis", "of", "Mettl3", "or", "Mettl14", "depleted", "and", "control", "CT26", "cells", "treated", "with", "indicated", "combinations", "of", "cytokines", "for", "48h", ".", "The", "mean", "±", "SD", "of", "three", "replicates", "is", "shown", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", ".", "B", ".", "BALB", "/", "c", "mice", "bearing", "Mettl3", "or", "Mettl14", "deficient", "and", "control", "tumors", "were", "treated", "with", "IFNγ", "-", "blocking", "antibody", "and", "PD", "-", "1", "antibody", "as", "indicated", ".", "Tumor", "size", "was", "measured", "over", "time", ".", "n", ",", "the", "numbers", "of", "mice", ".", "Data", "are", "mean", "±", "s", ".", "e", ".", "m", "of", "the", "indicated", "number", "of", "mice", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", ".", "C", ".", "Quantitative", "RT", "-", "PCR", "was", "performed", "to", "identify", "transcriptional", "changes", "of", "the", "IFN", "-", "γ", "response", "gene", "expression", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Data", "are", "shown", "as", "the", "relative", "fold", "change", "(", "RFC", ",", "color", "coded", "bar", ")", ".", "D", ",", "E", ".", "mRNA", "stability", "of", "Stat1", "and", "Irf1", "were", "measured", "by", "qRT", "-", "PCR", "in", "tumor", "cells", "treated", "with", "IFN", "-", "γ", "and", "actinomycin", "D", ".", "Mean", "±", "SD", "of", "n", "=", "3", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", ".", "F", ".", "Validation", "the", "effect", "of", "knock", "out", "of", "Ythdf1", "-", "3", "using", "western", "blotting", ",", "Gapdh", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "G", ".", "qPCR", "analysis", "of", "Stat1", "and", "Irf1", "'", "s", "expression", "in", "the", "indicated", "depletion", "of", "CT26", "cells", "with", "/", "without", "stimulation", "of", "IFNγ", ".", "Mean", "±", "SD", "of", "n", "=", "3", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", ".", "H", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "Mettl3", "and", "Mettl14", "in", "overexpressed", "CT26", "cells", ".", "Gapdh", "served", "as", "a", "loading", "control", "for", "each", ".", "I", ",", "J", ".", "qPCR", "analysis", "of", "the", "mRNA", "stability", "of", "Stat1", "and", "Irf1", "in", "the", "indicated", "CT26", "cells", "treated", "with", "IFNγ", "and", "actinomycin", "D", ".", "Mean", "±", "SD", "of", "n", "=", "3", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "tests", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. Cellular proliferation analysis of Mettl3 or Mettl14 depleted and control CT26 cells treated with indicated combinations of cytokines for 48h. The mean ± SD of three replicates is shown. * P < 0.05; * * P < 0.01 by Student's t-tests.B. BALB/c mice bearing Mettl3 or Mettl14 deficient and control tumors were treated with IFNγ -blocking antibody and PD-1 antibody as indicated. Tumor size was measured over time. n, the numbers of mice. Data are mean ± s.e.m of the indicated number of mice. * P < 0.05; * * P < 0.01; * * * P < 0.001 by Student's t-tests.C. Quantitative RT-PCR was performed to identify transcriptional changes of the IFN-γ response gene expression (n=3). Data are shown as the relative fold change (RFC, color coded bar).D, E. mRNA stability of Stat1 and Irf1 were measured by qRT-PCR in tumor cells treated with IFN-γ and actinomycin D. Mean ± SD of n=3. * * P < 0.01; * * * P < 0.001 by Student's t-tests.F. Validation the effect of knock out of Ythdf1-3 using western blotting, Gapdh served as a loading control.G. qPCR analysis of Stat1 and Irf1's expression in the indicated depletion of CT26 cells with/without stimulation of IFNγ. Mean ± SD of n=3. * P < 0.05 by Student's t-tests.H. Western blot analysis of Mettl3 and Mettl14 in overexpressed CT26 cells. Gapdh served as a loading control for each.I, J. qPCR analysis of the mRNA stability of Stat1 and Irf1 in the indicated CT26 cells treated with IFNγ and actinomycin D. Mean ± SD of n=3. * P < 0.05; * * P < 0.01; * * * P < 0.001 by Student's t-tests."}
{"words": ["Figure", "5A", ",", "B", ".", "The", "protein", "level", "of", "STAT1", "was", "negatively", "correlated", "with", "METTL3", "and", "METTL14", "in", "human", "pMMR", "-", "MSI", "-", "L", "CRC", "colon", "tissue", "(", "r2", "=", "-", "3", ".", "2477", "for", "METTL3", ",", "r2", "=", "-", "2", ".", "7491", "for", "METTL14", ")", ".", "Each", "dot", "represents", "one", "tumor", "tissue", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A, B. The protein level of STAT1 was negatively correlated with METTL3 and METTL14 in human pMMR-MSI-L CRC colon tissue (r2=-3.2477 for METTL3, r2=-2.7491 for METTL14). Each dot represents one tumor tissue."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "Detection", "of", "Sufu", "and", "Skp1", "after", "immunoprecipitation", "of", "the", "indicated", "Flag", "-", "tagged", "F", "-", "Box", "Proteins", "(", "FBPs", ")", ".", "An", "Empty", "Vector", "(", "EV", ")", "was", "used", "as", "a", "negative", "control", ".", "HEK293T", "cells", "were", "treated", "with", "MLN4924", "(", "2", "M", ")", "for", "5", "hours", "prior", "collection", ".", "B", ",", "C", ".", "Immunoprecipitation", "of", "endogenous", "Sufu", "from", "PC3", "(", "B", ")", "and", "DAOY", "cells", "(", "C", ")", "transfected", "with", "either", "an", "empty", "vector", "(", "EV", ")", "or", "Myc", "-", "tagged", "Fbxl17", ".", "Non", "-", "specific", "rabbit", "immunoglobulin", "G", "(", "IgG", ")", "was", "used", "as", "a", "negative", "control", ".", "Detection", "of", "light", "chains", "of", "immunoglobulin", "(", "IgG", ")", "was", "used", "to", "assess", "the", "amount", "of", "IgG", "used", "for", "each", "immunoprecipitation", "reaction", ".", "Treatment", "with", "MLN4924", "(", "2", "M", ")", "was", "started", "5", "hours", "before", "cell", "collection", ".", "D", ".", "Quantification", "of", "Fbxl17", "mRNA", "levels", "in", "PC3", "and", "DAOY", "transfected", "with", "a", "non", "-", "targeting", "siRNA", "(", "Control", ")", "or", "two", "siRNAs", "to", "Fbxl17", "(", "1", ")", "and", "(", "2", ")", ".", "Cells", "were", "serum", "starved", "for", "24", "hours", "in", "serum", "-", "reduced", "medium", "and", "treated", "with", "SAG", "(", "100", "nM", ")", "for", "24", "hours", "prior", "collection", ".", "E", ".", "Sufu", "protein", "levels", "in", "PC3", "and", "DAOY", "cells", "treated", "as", "in", "D", ".", "GAPDH", "was", "used", "as", "a", "loading", "control", ".", "Representative", "image", "of", "three", "independent", "experiments", "is", "shown", ".", "F", ".", "Sufu", "protein", "levels", "in", "PC3", "and", "DAOY", "cells", "infected", "with", "an", "empty", "backbone", "retrovirus", "(", "EV", ")", "or", "a", "retrovirus", "expressing", "Myc", "-", "tagged", "Fbxl17", ".", "Representative", "image", "from", "three", "independent", "experiments", "is", "shown", ".", "G", ".", "Detection", "of", "Sufu", "protein", "levels", "following", "cycloheximide", "(", "CHX", ")", "treatment", "for", "the", "indicated", "hours", ",", "and", "Fbxl17", "depletion", "using", "two", "different", "siRNAs", ".", "(", "Hrs", "=", "hours", ")", ".", "Representative", "image", "of", "two", "independent", "experiments", "is"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. Detection of Sufu and Skp1 after immunoprecipitation of the indicated Flag-tagged F-Box Proteins (FBPs). An Empty Vector (EV) was used as a negative control. HEK293T cells were treated with MLN4924 (2 M) for 5 hours prior collection.B, C. Immunoprecipitation of endogenous Sufu from PC3 (B) and DAOY cells (C) transfected with either an empty vector (EV) or Myc-tagged Fbxl17. Non-specific rabbit immunoglobulin G (IgG) was used as a negative control. Detection of light chains of immunoglobulin (IgG) was used to assess the amount of IgG used for each immunoprecipitation reaction. Treatment with MLN4924 (2 M) was started 5 hours before cell collection.D. Quantification of Fbxl17 mRNA levels in PC3 and DAOY transfected with a non-targeting siRNA (Control) or two siRNAs to Fbxl17 (1) and (2). Cells were serum starved for 24 hours in serum-reduced medium and treated with SAG (100 nM) for 24 hours prior collection.E. Sufu protein levels in PC3 and DAOY cells treated as in D. GAPDH was used as a loading control. Representative image of three independent experiments is shown.F. Sufu protein levels in PC3 and DAOY cells infected with an empty backbone retrovirus (EV) or a retrovirus expressing Myc-tagged Fbxl17. Representative image from three independent experiments is shown.G. Detection of Sufu protein levels following cycloheximide (CHX) treatment for the indicated hours, and Fbxl17 depletion using two different siRNAs. (Hrs=hours). Representative image of two independent experiments is shown"}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Detection", "of", "polyubiquitylated", "species", "of", "endogenous", "Sufu", "co", "-", "immunopurified", "from", "DAOY", "cells", "transfected", "with", "Myc", "-", "tagged", "ubiquitin", "(", "Ub", ")", "either", "in", "the", "presence", "of", "non", "-", "targeting", "siRNA", "(", "Control", ")", "or", "two", "siRNAs", "against", "Fbxl17", "(", "1", ")", "and", "(", "2", ")", ".", "MG132", "(", "10µM", ")", "was", "added", "in", "all", "samples", ".", "B", ".", "Detection", "of", "polyubiquitylated", "species", "of", "Sufu", "upon", "co", "-", "transfection", "of", "HEK293T", "cells", "with", "HA", "-", "tagged", "Sufu", "and", "Myc", "-", "tagged", "ubiquitin", "(", "Ub", ")", "either", "in", "the", "presence", "of", "non", "-", "targeting", "siRNA", "(", "Control", ")", "or", "two", "siRNAs", "against", "Fbxl17", "(", "1", ")", "and", "(", "2", ")", ".", "MG132", "(", "10µM", ")", "was", "added", "in", "all", "samples", ".", "C", ".", "Fbxl17", "mRNA", "relative", "levels", "in", "DAOY", "and", "HEK293T", "cells", "upon", "Fbxl17", "depletion", "with", "either", "a", "non", "-", "targeting", "siRNA", "(", "Control", ")", "or", "two", "siRNAs", "to", "Fbxl17", "(", "1", ")", "and", "(", "2", ")", ".", "D", ".", "Detection", "of", "ubiquitylated", "Sufuco", "-", "immunoprecipitated", "from", "HEK293T", "cells", "co", "-", "transfected", "with", "HA", "-", "tagged", "Sufu", ",", "Myc", "-", "ubiquitin", "(", "Ub", ")", "along", "with", "either", "Flag", "-", "tagged", "Fbxl17", "wild", "type", "(", "WT", ")", "or", "a", "mutant", "lacking", "the", "F", "-", "box", "domain", "(", "Fbxl17ΔF", ")", ".", "MG132", "(", "10µM", ")", "was", "added", "in", "all", "samples", ".", "E", ".", "Detection", "of", "ubiquitylated", "Sufuco", "-", "immunoprecipitated", "from", "HEK293T", "cells", "co", "-", "transfected", "with", "Myc", "-", "tagged", "ubiquitin", "(", "Ub", ")", ",", "Flag", "-", "tagged", "Fbxl17", "and", "HA", "-", "tagged", "Sufu", "WT", "or", "Sufu", "mutant", "K257R", ".", "MG132", "(", "10µM", ")", "was", "added", "in", "all", "samples", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Detection of polyubiquitylated species of endogenous Sufu co-immunopurified from DAOY cells transfected with Myc-tagged ubiquitin (Ub) either in the presence of non-targeting siRNA (Control) or two siRNAs against Fbxl17 (1) and (2). MG132 (10µM) was added in all samples.B. Detection of polyubiquitylated species of Sufu upon co-transfection of HEK293T cells with HA-tagged Sufu and Myc-tagged ubiquitin (Ub) either in the presence of non-targeting siRNA (Control) or two siRNAs against Fbxl17 (1) and (2). MG132 (10µM) was added in all samples.C. Fbxl17 mRNA relative levels in DAOY and HEK293T cells upon Fbxl17 depletion with either a non-targeting siRNA (Control) or two siRNAs to Fbxl17 (1) and (2).D. Detection of ubiquitylated Sufuco-immunoprecipitated from HEK293T cells co-transfected with HA-tagged Sufu, Myc-ubiquitin (Ub) along with either Flag-tagged Fbxl17 wild type (WT) or a mutant lacking the F-box domain (Fbxl17ΔF). MG132 (10µM) was added in all samples.E. Detection of ubiquitylated Sufuco-immunoprecipitated from HEK293T cells co-transfected with Myc-tagged ubiquitin (Ub), Flag-tagged Fbxl17 and HA-tagged Sufu WT or Sufu mutant K257R. MG132 (10µM) was added in all samples."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "Detection", "of", "Myc", "-", "tagged", "Fbxl17", "after", "immunoprecipitation", "of", "HA", "-", "tagged", "Sufu", "WT", "or", "Sufu", "S342", "/", "6A", "and", "S342", "/", "6D", ",", "as", "indicated", ".", "HEK293T", "cells", "were", "treated", "with", "MLN4924", "(", "2", "M", ")", "for", "5", "hours", "prior", "collection", ".", "B", ".", "Detection", "of", "Flag", "-", "tagged", "Gli1", "and", "Myc", "-", "tagged", "Fbxl17", "binding", "to", "immunoprecipitated", "HA", "-", "tagged", "Sufu", "Wild", "-", "Type", "(", "WT", ")", "or", "to", "Sufu", "S352F", ".", "An", "Empty", "Vector", "(", "EV", ")", "was", "used", "as", "a", "negative", "control", ".", "HEK293T", "cells", "were", "treated", "with", "MLN4924", "(", "2", "M", ")", "for", "5", "hours", "prior", "collection", ".", "C", ".", "Detection", "of", "phosphorylated", "Sufu", "on", "S352", "/", "T353", "after", "immunoprecipitation", "of", "HA", "-", "tagged", "Sufu", "WT", "and", "Sufu", "351", "-", "353", "AAA", ",", "as", "indicated", ".", "D", ".", "Detection", "of", "Myc", "-", "tagged", "Fbxl17", "binding", "to", "Sufu", "full", "length", "(", "FL", ")", "or", "to", "the", "following", "Sufu", "peptides", ":", "Sufu", "340", "-", "360", "(", "APSRKDSLESDSSTAIIPHEL", ")", ";", "Sufu", "340", "-", "360", "[", "S352P", "/", "T353P", "]", "(", "phosphorylated", "on", "the", "residues", "S352", "and", "T353", ")", ";", "Sufu", "351", "-", "372", "(", "SSTAIIPHELIRTRQLESVHLK", ")", ".", "E", ".", "Detection", "of", "HA", "-", "tagged", "Sufu", "binding", "to", "a", "Myc", "-", "tagged", "Fbxl17", "construct", "encompassing", "the", "residues", "318", "to", "701", "(", "corresponding", "to", "the", "F", "-", "box", "motif", "and", "C", "-", "terminus", "region", ")", "assessed", "by", "in", "vitro", "binding", "assay", ".", "Both", "proteins", "were", "synthetized", "in", "vitro", "using", "a", "T7", "-", "coupled", "reticulocyte", "lysate", "system", ".", "F", ".", "Detection", "of", "ubiquitylated", "Sufu", "immunoprecipitated", "from", "HEK293T", "cells", "co", "-", "transfected", "with", "HA", "-", "tagged", "ubiquitin", "(", "Ub", ")", ",", "Myc", "-", "tagged", "Fbxl17", "and", "Flag", "-", "tagged", "Gli1", ".", "MG132", "(", "10µM", ")", "was", "added", "in", "all", "samples", ".", "G", ".", "Detection", "of", "Flag", "-", "tagged", "Gli1", "binding", "to", "Myc", "-", "tagged", "Fbxl17", "co", "-", "immunoprecipitated", "from", "HEK293T", "cells", "transfected", "with", "a", "non", "-", "targeting", "siRNA", "(", "Control", ")", "or", "two", "siRNA", "to", "Sufu", "(", "1", ")", "and", "(", "2", ")", ",", "as", "indicated", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. Detection of Myc-tagged Fbxl17 after immunoprecipitation of HA-tagged Sufu WT or Sufu S342/6A and S342/6D, as indicated. HEK293T cells were treated with MLN4924 (2 M) for 5 hours prior collection.B. Detection of Flag-tagged Gli1 and Myc-tagged Fbxl17 binding to immunoprecipitated HA-tagged Sufu Wild-Type (WT) or to Sufu S352F. An Empty Vector (EV) was used as a negative control. HEK293T cells were treated with MLN4924 (2 M) for 5 hours prior collection.C. Detection of phosphorylated Sufu on S352/T353 after immunoprecipitation of HA-tagged Sufu WT and Sufu 351-353 AAA, as indicated.D. Detection of Myc-tagged Fbxl17 binding to Sufu full length (FL) or to the following Sufu peptides: Sufu 340-360(APSRKDSLESDSSTAIIPHEL); Sufu 340-360 [S352P/T353P] (phosphorylated on the residues S352 and T353); Sufu 351-372 (SSTAIIPHELIRTRQLESVHLK).E. Detection of HA-tagged Sufu binding to a Myc-tagged Fbxl17 construct encompassing the residues 318 to 701 (corresponding to the F-box motif and C-terminus region) assessed by in vitro binding assay. Both proteins were synthetized in vitro using a T7-coupled reticulocyte lysate system.F. Detection of ubiquitylated Sufu immunoprecipitated from HEK293T cells co-transfected with HA-tagged ubiquitin (Ub), Myc-tagged Fbxl17 and Flag-tagged Gli1. MG132 (10µM) was added in all samples.G. Detection of Flag-tagged Gli1 binding to Myc-tagged Fbxl17 co-immunoprecipitated from HEK293T cells transfected with a non-targeting siRNA (Control) or two siRNA to Sufu (1) and (2), as indicated."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "Sufu", "protein", "levels", "in", "mouse", "embryonic", "fibroblasts", "(", "MEFs", ")", "Ptch1", "+", "/", "+", ",", "Ptch1", "+", "/", "-", "and", "Ptch1", "-", "/", "-", "transfected", "with", "a", "non", "-", "targeting", "siRNA", "(", "Control", ")", "or", "two", "siRNAs", "targeting", "mouse", "Fbxl17", "(", "1", ")", "and", "(", "2", ")", ".", "B", ".", "Quantification", "of", "Fbxl17", "mRNA", "levels", "in", "MEFs", "Ptch1", "+", "/", "+", ",", "Ptch1", "+", "/", "-", "and", "Ptch1", "-", "/", "-", "transfected", "as", "in", "A", ".", "C", ".", "Analysis", "of", "Gli1", "mRNA", "levels", "in", "MEFs", "Ptch1", "+", "/", "+", "and", "Ptch1", "-", "/", "-", "upon", "Fbxl17", "depletion", "using", "two", "different", "siRNAs", ".", "(", "mean", "±", "SEM", "from", "3", "independent", "experiments", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0005", ")", ".", "D", ".", "Analysis", "of", "Bcl2", "mRNA", "levels", "in", "MEFs", "Ptch1", "+", "/", "+", "and", "Ptch1", "-", "/", "-", "upon", "Fbxl17", "depletion", "using", "two", "different", "siRNAs", ".", "(", "mean", "±", "SEM", "from", "3", "independent", "experiments", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0005", ")", ".", "E", ".", "Detection", "of", "Flag", "-", "tagged", "Gli1", "binding", "to", "HA", "-", "tagged", "Sufu", "in", "MEFs", "Ptch1", "-", "/", "-", "cells", "upon", "expression", "of", "Myc", "-", "tagged", "Fbxl17", ",", "or", "Fbxl17", "depletion", "by", "two", "siRNAs", ".", "For", "each", "condition", ",", "200", "µg", "of", "whole", "cell", "lysate", "was", "immunoprecipitated", ".", "F", ".", "Immunostaining", "of", "Fbxl17", "using", "anti", "-", "Myc", "antibody", "in", "Ptch1", "-", "/", "-", "MEFs", "stably", "transduced", "with", "a", "pBABE", "vector", "expressing", "Fbxl17", "tagged", "with", "Myc", "either", "at", "the", "N", "-", "terminus", "[", "Myc", "(", "N", ")", "-", "Fbxl17", "]", "or", "at", "the", "C", "-", "terminus", "[", "Myc", "(", "C", ")", "-", "Fbxl17", "]", ".", "Scale", "bars", ":", "20", "m", ".", "G", ".", "Detection", "of", "Fbxl17", "using", "anti", "-", "Myc", "antibody", "in", "Ptch1", "-", "/", "-", "MEFs", "stably", "expressing", "Myc", "(", "N", ")", "-", "Fbxl17", "(", "Fbxl17", "tagged", "at", "the", "N", "-", "terminus", ")", "and", "Myc", "(", "C", ")", "-", "Fbxl17", "(", "Fbxl17", "tagged", "at", "the", "C", "-", "terminus", ")", ".", "H", ".", "Detection", "of", "HA", "-", "tagged", "Fbxl17", "binding", "to", "endogenous", "Sufu", "immunoprecipitated", "from", "cytoplasmic", "and", "nuclear", "extracts", "from", "Ptch1", "-", "/", "-", "MEFs", ".", "Asterisk", "(", "*", ")", "indicates", "a", "non", "specific", "band", ".", "Identification", "of", "cytoplasmic", "and", "nuclear", "fractions", "was", "performed", "by", "Lamin", "A", "/", "C", "and", "GAPDH", "detection", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. Sufu protein levels in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) Ptch1+/+, Ptch1+/- and Ptch1-/- transfected with a non-targeting siRNA (Control) or two siRNAs targeting mouse Fbxl17 (1) and (2).B. Quantification of Fbxl17 mRNA levels in MEFs Ptch1+/+, Ptch1+/- and Ptch1-/- transfected as in A.C. Analysis of Gli1 mRNA levels in MEFs Ptch1+/+ and Ptch1-/- upon Fbxl17 depletion using two different siRNAs. (mean ± SEM from 3 independent experiments, ***p<0.0005).D. Analysis of Bcl2 mRNA levels in MEFs Ptch1+/+ and Ptch1-/- upon Fbxl17 depletion using two different siRNAs. (mean ± SEM from 3 independent experiments, **p<0.005; ***p<0.0005).E. Detection of Flag-tagged Gli1 binding to HA-tagged Sufu in MEFs Ptch1-/- cells upon expression of Myc-tagged Fbxl17, or Fbxl17 depletion by two siRNAs. For each condition, 200 µg of whole cell lysate was immunoprecipitated.F. Immunostaining of Fbxl17 using anti-Myc antibody in Ptch1-/- MEFs stably transduced with a pBABE vector expressing Fbxl17 tagged with Myc either at the N-terminus [Myc(N)-Fbxl17] or at the C-terminus [Myc(C)-Fbxl17]. Scale bars: 20 m.G. Detection of Fbxl17 using anti-Myc antibody in Ptch1-/- MEFs stably expressing Myc(N)-Fbxl17 (Fbxl17 tagged at the N-terminus) and Myc(C)-Fbxl17 (Fbxl17 tagged at the C-terminus).H. Detection of HA-tagged Fbxl17 binding to endogenous Sufu immunoprecipitated from cytoplasmic and nuclear extracts from Ptch1-/- MEFs. Asterisk (*) indicates a non specific band. Identification of cytoplasmic and nuclear fractions was performed by Lamin A/C and GAPDH detection."}
{"words": ["Figure", "5A", ".", "Cell", "proliferation", "of", "DAOY", "cells", "upon", "Fbxl17", "depletion", "using", "a", "non", "-", "targeting", "siRNA", "(", "Control", ")", ",", "two", "siRNAs", "against", "Fbxl17", "(", "1", ")", "and", "(", "2", ")", "or", "upon", "reintroduction", "of", "a", "Myc", "-", "tagged", "Fbxl17", "construct", "in", "Fbxl17", "-", "depleted", "DAOY", "cells", "using", "siRNA", "Fbxl17", "(", "2", ")", "(", "mean", "±", "SEM", "from", "3", "independent", "experiments", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0005", ")", ".", "B", ".", "Quantification", "of", "Fbxl17", "mRNA", "levels", "in", "DAOY", "cells", "transfected", "with", "a", "non", "-", "targeting", "siRNA", "(", "Control", ")", "or", "two", "siRNAs", "against", "Fbxl17", "(", "1", ")", "and", "(", "2", ")", "(", "mean", "±", "SEM", "from", "3", "independent", "experiments", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ")", ".", "C", ".", "Sufu", "protein", "levels", "in", "DAOY", "cells", "treated", "as", "in", "A", ".", "Representative", "image", "of", "three", "independent", "experiments", "is", "shown", ".", "D", ".", "Cell", "proliferation", "of", "DAOY", "cells", "transfected", "with", "non", "-", "targeting", "siRNA", "(", "Control", ")", ",", "siRNA", "against", "Fbxl17", "or", "a", "combination", "of", "siRNA", "targeting", "Fbxl17", "and", "Sufu", ".", "(", "mean", "±", "SEM", "from", "3", "independent", "experiments", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0005", ")", ".", "E", ".", "Quantification", "of", "Fbxl17", "mRNA", "levels", "in", "DAOY", "cells", "treated", "as", "in", "D", "mean", "±", "SEM", "from", "3", "independent", "experiments", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0005", ")", ".", "F", ".", "Sufu", "protein", "levels", "in", "DAOY", "cells", "treated", "as", "in", "D", ".", "Representative", "image", "of", "three", "independent", "experiments", "is", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A. Cell proliferation of DAOY cells upon Fbxl17 depletion using a non-targeting siRNA (Control), two siRNAs against Fbxl17 (1) and (2) or upon reintroduction of a Myc-tagged Fbxl17 construct in Fbxl17-depleted DAOY cells using siRNA Fbxl17 (2) (mean ± SEM from 3 independent experiments, **p<0.005; ***p<0.0005).B. Quantification of Fbxl17 mRNA levels in DAOY cells transfected with a non-targeting siRNA (Control) or two siRNAs against Fbxl17 (1) and (2) (mean ± SEM from 3 independent experiments, **p<0.005).C. Sufu protein levels in DAOY cells treated as in A. Representative image of three independent experiments is shown.D. Cell proliferation of DAOY cells transfected with non-targeting siRNA (Control), siRNA against Fbxl17 or a combination of siRNA targeting Fbxl17 and Sufu. (mean ± SEM from 3 independent experiments, **p<0.005; ***p<0.0005).E. Quantification of Fbxl17 mRNA levels in DAOY cells treated as in D mean ± SEM from 3 independent experiments, ***p<0.0005).F. Sufu protein levels in DAOY cells treated as in D. Representative image of three independent experiments is shown."}
{"words": ["Figure", "6A", ".", "Quantification", "of", "Fbxl17", "mRNA", "levels", "in", "DAOY", "cells", "transfected", "with", "control", "shRNA", "or", "shRNA", "targeting", "Fbxl17", ".", "(", "mean", "±", "SEM", "from", "3", "independent", "experiments", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0005", ")", ".", "B", ".", "Detection", "of", "Sufu", "protein", "levels", "in", "DAOY", "cells", "transfected", "with", "control", "shRNA", "or", "shRNA", "Fbxl17", ".", "Representative", "image", "of", "three", "independent", "experiments", "is", "shown", ".", "C", ".", "Quantification", "of", "Gli1", "mRNA", "levels", "in", "DAOY", "cells", "transfected", "with", "control", "shRNA", "or", "shRNA", "Fbxl17", ".", "(", "mean", "±", "SEM", "from", "3", "independent", "experiments", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ")", ".", "D", ".", "T2", "-", "weighted", "magnetic", "resonance", "imaging", "(", "MRI", ")", "showing", "tumour", "development", "in", "rats", "injected", "with", "DAOY", "cells", "transfected", "with", "control", "shRNA", "or", "shRNA", "against", "Fbxl17", ".", "One", "representative", "image", "for", "each", "condition", ",", "at", "10", "weeks", "is", "shown", ".", "Scale", "bar", ":", "5mm", ".", "E", ".", "Graph", "showing", "area", "of", "T2", "hyperintensity", "(", "a", "surrogate", "marker", "of", "tumourgrowth", ")", "between", "4", "and", "10", "weeks", "post", "-", "tumour", "induction", ".", "Animals", "were", "injected", "with", "DAOY", "cells", "stably", "expressing", "control", "shRNA", "or", "shRNA", "against", "Fbxl17", "(", "10", ",", "000", "cells", "/", "1µL", ")", ".", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "5", ";", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "followed", "by", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "F", ".", "Representative", "immunohistochemistry", "image", "of", "Vimentin", "staining", ".", "Scale", "bar", ":", "1", "mm", ".", "G", ".", "Quantification", "of", "tumour", "growth", "(", "vimentin", "staining", ")", "in", "rats", "injected", "with", "DAOY", "cells", "transfected", "with", "either", "control", "shRNA", "or", "shRNA", "against", "Fbxl17", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "5", ";", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "H", ".", "Representative", "immunohistochemistry", "image", "of", "Ki67", "staining", ".", "Scale", "bar", ":", "0", ".", "5", "mm", "/", "0", ".", "1", "mm", ".", "I", ".", "Quantification", "of", "proliferative", "index", "(", "Ki67", "staining", ")", "in", "rats", "injected", "with", "DAOY", "cells", "transfected", "with", "either", "control", "shRNA", "or", "shRNA", "against", "Fbxl17", "(", "mean", "±", "SEM", ";", "n", "=", "5", ";", "unpaired", "t", "-", "test", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A. Quantification of Fbxl17 mRNA levels in DAOY cells transfected with control shRNA or shRNA targeting Fbxl17. (mean ± SEM from 3 independent experiments, ***p<0.0005).B. Detection of Sufu protein levels in DAOY cells transfected with control shRNA or shRNA Fbxl17. Representative image of three independent experiments is shown.C. Quantification of Gli1 mRNA levels in DAOY cells transfected with control shRNA or shRNA Fbxl17. (mean ± SEM from 3 independent experiments, **p<0.005).D. T2- weighted magnetic resonance imaging (MRI) showing tumour development in rats injected with DAOY cells transfected with control shRNA or shRNA against Fbxl17. One representative image for each condition, at 10 weeks is shown. Scale bar: 5mm. E. Graph showing area of T2 hyperintensity (a surrogate marker of tumourgrowth) between 4 and 10 weeks post-tumour induction. Animals were injected with DAOY cells stably expressing control shRNA or shRNA against Fbxl17 (10,000 cells/1µL). (mean ± SEM; n = 5; two-way ANOVA, followed by unpaired t-test, *p<0.05, **p<0.01).F. Representative immunohistochemistry image of Vimentin staining. Scale bar: 1 mm.G. Quantification of tumour growth (vimentin staining) in rats injected with DAOY cells transfected with either control shRNA or shRNA against Fbxl17 (mean ± SEM; n = 5; unpaired t-test, *p<0.05).H. Representative immunohistochemistry image of Ki67 staining. Scale bar: 0.5 mm/0.1 mm.I. Quantification of proliferative index (Ki67 staining) in rats injected with DAOY cells transfected with either control shRNA or shRNA against Fbxl17 (mean ± SEM; n = 5; unpaired t-test, *p<0.05)."}
{"words": ["Figure", "7A", "-", "C", ".", "mRNA", "expression", "of", "Sufu", ",", "Gli1", "and", "Fbxl17", "detected", "in", "285", "medulloblastoma", "samples", "(", "GEO", "accession", ":", "GSE37382", ")", ",", "stratified", "by", "tumor", "subtype", ".", "Level", "of", "significance", "(", "p", ")", "for", "Kruskal", "-", "Wallis", "(", "KW", ")", "rank", "test", "is", "p", "<", "10", "-", "8", ".", "Analysis", "using", "one", "-", "way", "anova", "gave", "comparable", "results", ".", "D", ".", "Expression", "of", "Gli1", "and", "Fbxl17", "in", "the", "285", "patients", "is", "shown", "colored", "by", "subgroup", ";", "level", "of", "significance", "(", "p", ")", "for", "Kruskal", "-", "Wallis", "(", "KW", ")", "rank", "test", "is", "p", "<", "10", "-", "8", ",", "and", "Spearman", "'", "s", "rank", "correlation", "(", "R", "=", "0", ".", "5640", ")", "is", "indicated", ".", "E", ".", "Detection", "of", "HA", "-", "tagged", "Sufu", "wild", "type", "(", "WT", ")", "and", "HA", "-", "tagged", "Sufu", "S352F", "protein", "levels", "in", "NIH3T3", "cells", "after", "cycloheximide", "(", "CHX", ")", "treatment", ".", "Where", "indicated", ",", "cells", "were", "transfected", "with", "a", "non", "-", "targeting", "siRNA", "(", "Control", ")", "or", "two", "siRNA", "to", "Fbxl17", "(", "1", ")", "and", "(", "2", ")", ".", "F", ".", "Assessment", "of", "Hh", "pathway", "activation", "using", "Gli1", "-", "luciferase", "reporter", "assay", "in", "MEFs", "Sufu", "-", "/", "-", "upon", "reintroduction", "of", "HA", "-", "tagged", "Sufu", "WT", "or", "Sufu", "mutant", "S352F", "using", "a", "retroviral", "system", ".", "(", "mean", "±", "SEM", "from", "3", "independent", "experiments", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "005", ";", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0005", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A-C. mRNA expression of Sufu, Gli1 and Fbxl17 detected in 285 medulloblastoma samples (GEO accession: GSE37382), stratified by tumor subtype. Level of significance (p) for Kruskal-Wallis (KW) rank test is p<10-8. Analysis using one-way anova gave comparable results.D. Expression of Gli1 and Fbxl17 in the 285 patients is shown colored by subgroup; level of significance (p) for Kruskal-Wallis (KW) rank test is p<10-8, and Spearman's rank correlation (R=0.5640) is indicated.E. Detection of HA-tagged Sufu wild type (WT) and HA-tagged Sufu S352F protein levels in NIH3T3 cells after cycloheximide (CHX) treatment. Where indicated, cells were transfected with a non- targeting siRNA (Control) or two siRNA to Fbxl17 (1) and (2).F. Assessment of Hh pathway activation using Gli1-luciferase reporter assay in MEFs Sufu-/- upon reintroduction of HA-tagged Sufu WT or Sufu mutant S352F using a retroviral system. (mean ± SEM from 3 independent experiments, **p<0.005; ***p<0.0005)."}
{"words": ["Figure", "1T2", "-", "weighed", "brain", "MRIs", "of", "patient", "A", "(", "D1", "-", "3", ")", "at", "28", "months", "of", "age", "and", "patient", "B", "at", "(", "D4", "-", "6", ")", "at", "16", "months", "of", "age", ",", "showing", "global", "brain", "atrophy", "as", "well", "as", "periventricular", "and", "deep", "white", "matter", "hyperintensities", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1T2-weighed brain MRIs of patient A (D1-3) at 28 months of age and patient B at (D4-6) at 16 months of age, showing global brain atrophy as well as periventricular and deep white matter hyperintensities."}
{"words": ["Figure", "3Quantifications", "of", "HOPS", "/", "CORVET", "subunits", "in", "fibroblast", "lysates", "(", "top", ")", "and", "representative", "immunoblots", "(", "bottom", ")", ",", "analyzed", "as", "in", "(", "C", ")", ".", "(", "E", ")", "VPS33A", ",", "(", "F", ")", "VPS11", ",", "(", "G", ")", "VPS18", ".", "Immunoblots", "(", "left", ")", "and", "quantifications", "normalized", "to", "control", "(", "right", ")", "of", "VPS16", ",", "VPS33A", "and", "VPS11", "in", "lysates", "from", "fibroblasts", "transduced", "with", "a", "lentivirus", "to", "express", "VPS16", "or", "control", "(", "empty", "vector", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Quantifications of HOPS/CORVET subunits in fibroblast lysates (top) and representative immunoblots (bottom), analyzed as in (C). (E) VPS33A, (F) VPS11, (G) VPS18.Immunoblots (left) and quantifications normalized to control (right) of VPS16, VPS33A and VPS11 in lysates from fibroblasts transduced with a lentivirus to express VPS16 or control (empty vector)."}
{"words": ["Figure", "4Analysis", "of", "the", "early", "endosome", "marker", "EEA1", "in", "fibroblasts", "transduced", "with", "control", "or", "VPS16", "-", "expressing", "lentivirus", "by", "confocal", "microscopy", ".", "(", "A", ")", "Representative", "confocal", "micrographs", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "μm", ".", "(", "B", ")", "Quantification", "of", "EEA1", "-", "stained", "puncta", "number", "and", "intensities", "(", "ca", "80", "cells", "analyzed", "for", "each", "of", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "Analysis", "of", "intracellular", "Transferrin", "trafficking", ".", "Fibroblasts", "fed", "with", "fluorescently", "labeled", "Transferrin", "were", "co", "-", "stained", "with", "LysoTracker", "(", "G", ")", "or", "an", "antibody", "against", "LAMP2", "(", "H", ")", ".", "Representative", "images", "(", "left", ")", "of", "fibroblasts", "transduced", "with", "control", "virus", ",", "with", "magnified", "areas", "demonstrating", "co", "-", "localized", "puncta", "(", "arrowheads", ")", ".", "Scale", "bars", "10", "μm", "or", "2", "μm", "(", "inserts", ")", ".", "Quantifications", "(", "right", ")", "of", "the", "co", "-", "localization", "between", "Transferrin", "and", "LysoTracker", "or", "LAMP2", ",", "respectively", ",", "expressed", "as", "Pearson", "correlation", "coefficients", ".", "Colored", "horizontal", "bars", "indicate", "the", "median", "values", "and", "whiskers", "5", "and", "95", "percentiles", "(", "n", "=", "10", "optical", "sections", "from", "3", "independent", "experiments", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Analysis of the early endosome marker EEA1 in fibroblasts transduced with control or VPS16-expressing lentivirus by confocal microscopy. (A) Representative confocal micrographs. Scale bar, 20 μm. (B) Quantification of EEA1-stained puncta number and intensities (ca 80 cells analyzed for each of n=3 biological replicates).Analysis of intracellular Transferrin trafficking. Fibroblasts fed with fluorescently labeled Transferrin were co-stained with LysoTracker (G) or an antibody against LAMP2 (H). Representative images (left) of fibroblasts transduced with control virus, with magnified areas demonstrating co-localized puncta (arrowheads). Scale bars 10 μm or 2 μm (inserts). Quantifications (right) of the co-localization between Transferrin and LysoTracker or LAMP2, respectively, expressed as Pearson correlation coefficients. Colored horizontal bars indicate the median values and whiskers 5 and 95 percentiles (n=10 optical sections from 3 independent experiments)."}
{"words": ["Figure", "5Confocal", "micrographs", "of", "fibroblasts", "transduced", "with", "control", "or", "VPS16", "-", "expressing", "lentivirus", "and", "labeled", "with", "LysoTracker", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "μm", ".", "Quantification", "of", "LysoTracker", "-", "stained", "puncta", "number", "and", "intensities", "(", "ca", "80", "cells", "analyzed", "for", "each", "of", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "Representative", "immunoblots", "(", "bottom", ")", "and", "summary", "quantifications", "(", "top", ")", "of", "the", "levels", "of", "LAMP1", "(", "C", ")", "and", "LAMP2", "(", "D", ")", "in", "fibroblasts", ",", "normalized", "to", "levels", "of", "actin", "(", "ACTB", ")", "and", "expressed", "as", "%", "of", "controls", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "Analysis", "of", "lysosomal", "Cathepsin", "D", "(", "CtsD", ")", "processing", "by", "immunoblotting", ".", "Immunoblot", "to", "detect", "CtsD", "isoforms", "(", "left", ")", "and", "quantification", "(", "right", ")", "of", "processing", ",", "calculated", "as", "the", "percentage", "of", "CtsD", "divided", "by", "the", "sum", "of", "all", "isoforms", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Confocal micrographs of fibroblasts transduced with control or VPS16-expressing lentivirus and labeled with LysoTracker. Scale bar, 20 μm. Quantification of LysoTracker-stained puncta number and intensities (ca 80 cells analyzed for each of n=3 biological replicates).Representative immunoblots (bottom) and summary quantifications (top) of the levels of LAMP1 (C) and LAMP2 (D) in fibroblasts, normalized to levels of actin (ACTB) and expressed as % of controls (n=3 biological replicates). Analysis of lysosomal Cathepsin D (CtsD) processing by immunoblotting. Immunoblot to detect CtsD isoforms (left) and quantification (right) of processing, calculated as the percentage of CtsD divided by the sum of all isoforms (n=3 biological replicates)."}
{"words": ["Figure", "6Analysis", "of", "autophagosome", "numbers", "in", "fibroblasts", "transfected", "to", "express", "mRFP", "-", "GFP", "-", "LC3", ".", "(", "F", ")", "Representative", "confocal", "micrographs", "(", "optical", "sections", ")", "of", "fibroblasts", "imaged", "live", "under", "basal", "or", "serum", "-", "starved", "conditions", ".", "Scale", "bar", ",", "20", "μm", ".", "Analysis", "of", "autophagosome", "numbers", "in", "fibroblasts", "transfected", "to", "express", "mRFP", "-", "GFP", "-", "LC3", ".", "Quantification", "of", "autophagosomes", ",", "defined", "as", "green", "+", "red", "puncta", "(", "G", ")", "and", "autophago", "-", "lysosomes", ",", "calculated", "as", "the", "number", "of", "red", "(", "but", "not", "green", ")", "puncta", "divided", "by", "the", "total", "number", "of", "puncta", ".", "Colored", "horizontal", "bars", "denote", "median", "values", "and", "whiskers", "5", "and", "95", "percentiles", "(", "n", "=", "50", "-", "113", "cells", "from", "a", "total", "of", "3", "independent", "experiments", ";", "for", "exact", "values", "see", "Appendix", "Table", "S1", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Analysis of autophagosome numbers in fibroblasts transfected to express mRFP-GFP-LC3. (F) Representative confocal micrographs (optical sections) of fibroblasts imaged live under basal or serum-starved conditions. Scale bar, 20 μm.Analysis of autophagosome numbers in fibroblasts transfected to express mRFP-GFP-LC3. Quantification of autophagosomes, defined as green + red puncta (G) and autophago-lysosomes, calculated as the number of red (but not green) puncta divided by the total number of puncta. Colored horizontal bars denote median values and whiskers 5 and 95 percentiles (n=50-113 cells from a total of 3 independent experiments; for exact values see Appendix Table S1)."}
{"words": ["Figure", "7Myelination", ",", "as", "reported", "using", "the", "Tg", "(", "mbp", ":", "gfp", "-", "caax", ")", "transgenic", ",", "is", "significantly", "reduced", "in", "vps16", "crispants", ".", "The", "yellow", "box", "indicates", "the", "region", "assessed", "in", "D", ".", "Scale", "bar", "100", "μm", ".", "Bar", "graphs", "represent", "data", "as", "mean", "±", "SEM", ".", "Statistical", "comparisons", "by", "Mann", "-", "Whitney", "U", "tests", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Myelination, as reported using the Tg(mbp:gfp-caax) transgenic, is significantly reduced in vps16 crispants. The yellow box indicates the region assessed in D. Scale bar 100 μm. Bar graphs represent data as mean ±SEM. Statistical comparisons by Mann-Whitney U tests (n=6). ** p < 0.01."}
{"words": ["Figure", "8LysoTracker", "signal", "colocalizes", "with", "the", "astroglial", "reporter", "slc1a2b", ":", "citrine", "and", "does", "not", "appear", "to", "overlap", "with", "the", "pan", "-", "neuronal", "reporter", "elavl3", ":", "GCaMP5G", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8LysoTracker signal colocalizes with the astroglial reporter slc1a2b:citrine and does not appear to overlap with the pan-neuronal reporter elavl3:GCaMP5G."}
{"words": ["Figure", "1b", ".", "In", "vitro", "activity", ".", "Left", "y", "-", "axis", ":", "13C2", "-", "oxalate", "in", "mM", ",", "right", "y", "-", "axis", ":", "13C", "-", "formate", "in", "mM", ",", "x", "-", "axis", ":", "time", "in", "minutes", ".", "SYNB8802", "(", "blue", ",", "circles", ",", "solid", "line", ":", "oxalate", ",", "dotted", "line", ":", "formate", ")", "The", "control", "EcN", "(", "pink", ",", "triangle", ",", "solid", "line", ":", "oxalate", ",", "dotted", "line", ":", "formate", ")", ".", "Three", "biological", "replicates", "were", "run", "and", "plotted", "separately", ".", "c", ".", "In", "vitro", "simulation", "(", "IVS", ")", ".", "Left", "y", "-", "axis", ":", "Rate", "of", "oxalate", "degradation", "in", "μmol", "/", "h", "/", "109", "cells", ".", "X", "-", "axis", "=", "time", "in", "hours", ".", "Left", "X", "-", "axis", "0", "-", "4", "hours", ",", "Right", "X", "-", "axis", "6", "-", "48", "h", ".", "Three", "biological", "replicates", "were", "run", "and", "plotted", "separately", ".", "Data", "points", "in", "the", "orange", "box", "represent", "incubation", "in", "simulated", "gastric", "fluid", "(", "SGF", ")", ".", "Data", "points", "in", "the", "light", "blue", "box", "represent", "incubation", "in", "simulated", "intestinal", "fluid", "(", "SIF", ")", ".", "Data", "points", "in", "the", "pink", "box", "represent", "incubation", "in", "simulated", "colonic", "fluid", "(", "SCF", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1b. In vitro activity. Left y-axis: 13C2-oxalate in mM, right y-axis: 13C-formate in mM, x-axis: time in minutes. SYNB8802 (blue, circles, solid line: oxalate, dotted line: formate) The control EcN (pink, triangle, solid line: oxalate, dotted line: formate). Three biological replicates were run and plotted separately.c. In vitro simulation (IVS). Left y-axis: Rate of oxalate degradation in μmol/h/109 cells. X-axis = time in hours. Left X-axis 0 - 4 hours, Right X-axis 6 - 48 h. Three biological replicates were run and plotted separately. Data points in the orange box represent incubation in simulated gastric fluid (SGF). Data points in the light blue box represent incubation in simulated intestinal fluid (SIF). Data points in the pink box represent incubation in simulated colonic fluid (SCF)."}
{"words": ["Figure", "2b", ".", "Acute", "mouse", "study", "of", "UOx", "lowering", "with", "SYNB8802", ".", "The", "y", "-", "axis", "shows", "the", "urinary", "13", "C2", "-", "oxalate", "normalized", "to", "creatine", ".", "The", "x", "-", "axis", "shows", "the", "two", "groups", ",", "EcN", "(", "control", ",", "pink", ")", "vs", "SYNB8802AbxR", "(", "light", "blue", ";", "n", "=", "15", "mice", "per", "group", ")", ".", "Individual", "dots", "represent", "each", "metabolic", "cage", "(", "n", "=", "3", "mice", "per", "metabolic", "cage", ")", ".", "Error", "bars", "are", "calculated", "as", "SEM", ".", "(", "unpaired", "t", "-", "test", "with", "Welch", "'", "s", "correction", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ")", "d", ".", "Nonhuman", "primate", "model", "development", "study", ".", "The", "y", "-", "axis", "shows", "urinary", "oxalate", "normalized", "to", "creatine", ".", "X", "-", "axis", "shows", "baseline", "urinary", "oxalate", "levels", "after", "overnight", "fast", ",", "and", "urinary", "oxalate", "measured", "6", "hours", "post", "administration", "of", "either", "a", "spinach", "preparation", "(", "triangle", ",", "pink", ")", "or", "water", "(", "circle", ",", "blue", ")", "(", "n", "=", "6", "for", "each", "group", ")", ".", "Individual", "dots", "represent", "individual", "animals", ".", "Error", "bars", "are", "calculated", "as", "SEM", ".", "(", "Two", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Sidak", "'", "s", "multiple", "comparison", "analysis", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ")", ".", "f", ".", "Urinary", "recovery", "of", "oxalate", "in", "nonhuman", "primates", ".", "The", "y", "-", "axis", "shows", "change", "in", "urinary", "oxalate", "from", "vehicle", "control", ".", "The", "x", "-", "axis", "shows", "vehicle", "(", "control", ",", "grey", ")", "and", "increasing", "doses", "of", "SYNB8802AbxR", "(", "n", "=", "24", "for", "vehicle", ",", "n", "=", "6", "for", "treatment", "groups", ")", ".", "Individual", "dots", "represent", "normalized", "urinary", "oxalate", "for", "each", "individual", "animal", ".", "Error", "bars", "are", "calculated", "as", "SEM", ".", "(", "One", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "analysis", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", "g", ".", "Urinary", "recovery", "of", "13C2", "oxalate", "in", "nonhuman", "primates", ".", "The", "y", "-", "axis", "shows", "change", "in", "urinary", "13C2", "-", "oxalate", "from", "vehicle", "control", ".", "The", "x", "-", "axis", "shows", "vehicle", "(", "control", ",", "grey", ")", "and", "increasing", "doses", "of", "SYNB8802AbxR", "(", "n", "=", "24", "for", "vehicle", ",", "n", "=", "6", "for", "treatmentgroups", ")", ".", "Individual", "dots", "represent", "normalized", "urinary", "13C2", "-", "oxalate", "for", "each", "individual", "animal", ".", "Error", "bars", "are", "calculated", "as", "SEM", ".", "(", "One", "-", "way", "ANOVA", "followed", "by", "Tukey", "'", "s", "multiple", "comparison", "analysis", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2b. Acute mouse study of UOx lowering with SYNB8802. The y-axis shows the urinary 13 C2-oxalate normalized to creatine. The x-axis shows the two groups, EcN (control, pink) vs SYNB8802AbxR (light blue; n = 15 mice per group). Individual dots represent each metabolic cage (n = 3 mice per metabolic cage). Error bars are calculated as SEM. (unpaired t-test with Welch's correction, **** p < 0.0001)d. Nonhuman primate model development study. The y-axis shows urinary oxalate normalized to creatine. X-axis shows baseline urinary oxalate levels after overnight fast, and urinary oxalate measured 6 hours post administration of either a spinach preparation (triangle, pink) or water (circle, blue) (n=6 for each group). Individual dots represent individual animals. Error bars are calculated as SEM. (Two-way ANOVA followed by Sidak's multiple comparison analysis, **** p < 0.0001).f. Urinary recovery of oxalate in nonhuman primates. The y-axis shows change in urinary oxalate from vehicle control. The x-axis shows vehicle (control, grey) and increasing doses of SYNB8802AbxR (n = 24 for vehicle, n = 6 for treatment groups). Individual dots represent normalized urinary oxalate for each individual animal. Error bars are calculated as SEM. (One-way ANOVA followed by Tukey's multiple comparison analysis, * p < 0.05)g. Urinary recovery of 13C2 oxalate in nonhuman primates. The y-axis shows change in urinary 13C2-oxalate from vehicle control. The x-axis shows vehicle (control, grey) and increasing doses of SYNB8802AbxR (n = 24 for vehicle, n = 6 for treatmentgroups). Individual dots represent normalized urinary 13C2-oxalate for each individual animal. Error bars are calculated as SEM. (One-way ANOVA followed by Tukey's multiple comparison analysis, ** p < 0.01)"}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", ")", "Time", "constants", "of", "decay", ",", "τdecay", ",", "of", "the", "STC", "isolated", "pharmacologically", "in", "WT", "and", "FHM2", "KI", "mice", ".", "Top", ",", "superimposed", "representative", "traces", "of", "the", "inward", "current", "evoked", "in", "an", "astrocyte", "(", "held", "at", "-", "90", "mV", ")", "by", "a", "single", "pulse", "stimulation", "(", "indicated", "by", "the", "arrow", ")", "in", "a", "WT", "slice", ",", "before", "(", "trace", "a", ")", "and", "after", "(", "trace", "b", ")", "application", "of", "a", "saturating", "concentration", "of", "the", "GluT", "inhibitor", "TFB", "-", "TBOA", "(", "TBOA", ")", ".", "The", "STC", "was", "obtained", "by", "subtracting", "the", "residual", "current", "remaining", "in", "the", "presence", "of", "TBOA", "from", "the", "total", "inward", "current", "(", "trace", "a", "-", "b", ")", ";", "the", "decay", "of", "the", "STC", "was", "best", "fitted", "by", "a", "single", "exponential", "function", "with", "τdecay", "=", "6", ".", "53", "ms", "(", "in", "red", ")", ".", "The", "bar", "plot", "shows", "the", "average", "values", "of", "τdecay", "of", "the", "STC", "isolated", "pharmacologically", "in", "cortical", "slices", "(", "n", "=", "13", ")", "from", "P22", "-", "23", "WT", "(", "N", "=", "7", ")", "and", "KI", "mice", "(", "n", "=", "9", ";", "N", "=", "3", ")", ".", "STC", "τdecay", "is", "17", "%", "higher", "in", "KI", "compared", "to", "WT", "astrocytes", "(", "unpaired", "t", "-", "test", ":", "P", "=", "0", ".", "003", ")", ".", "Hereafter", ",", "n", "indicates", "the", "number", "of", "slices", "and", "N", "indicates", "the", "number", "of", "mice", ".", "(", "C", ")", "τdecay", "of", "the", "STC", "isolated", "using", "an", "exponential", "waveform", "approximating", "the", "average", "TBOA", "-", "insensitive", "current", "in", "WT", "and", "KI", "mice", ".", "Top", "trace", ",", "average", "normalized", "TBOA", "-", "insensitive", "current", "obtained", "by", "pooling", "the", "normalized", "TBOA", "-", "insensitive", "currents", "recorded", "in", "16", "WT", "and", "KI", "cells", ".", "This", "current", "was", "best", "fitted", "by", "an", "exponentially", "rising", "function", "(", "1", "-", "exp", "(", "-", "t", "/", "τrise", ")", ")", "with", "τrise", "=", "2", ".", "35", "ms", "(", "in", "green", ")", ".", "The", "STC", "was", "obtained", "by", "subtracting", "from", "the", "total", "current", "elicited", "in", "the", "astrocyte", "(", "a", ":", "same", "representative", "trace", "as", "in", "(", "B", ")", ")", "the", "exponential", "function", "A", "(", "1", "-", "exp", "(", "-", "t", "/", "τrise", ")", ")", "with", "τrise", "=", "2", ".", "35", "ms", "and", "A", "equal", "to", "the", "maximal", "current", "measured", "in", "the", "astrocyte", "at", "about", "60", "ms", "after", "stimulation", "(", "trace", "c", ")", ";", "the", "decay", "of", "the", "STC", "(", "trace", "a", "-", "c", ")", "was", "best", "fitted", "by", "a", "single", "exponential", "function", "with", "τdecay", "=", "6", ".", "49", "ms", "(", "in", "red", ")", ".", "The", "bar", "plot", "shows", "the", "average", "values", "of", "τdecay", "of", "the", "STC", "isolated", "as", "shown", "in", "the", "top", "panel", "in", "cortical", "slices", "from", "P22", "-", "23", "WT", "(", "n", "=", "28", ";", "N", "=", "11", ")", "and", "KI", "mice", "(", "n", "=", "27", ";", "N", "=", "9", ")", ".", "STC", "τdecay", "is", "21", "%", "higher", "in", "KI", "compared", "to", "WT", "astrocytes", "(", "unpaired", "t", "-", "test", ":", "P", "<", "0", ".", "0001", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B) Time constants of decay, τdecay, of the STC isolated pharmacologically in WT and FHM2 KI mice. Top, superimposed representative traces of the inward current evoked in an astrocyte (held at -90 mV) by a single pulse stimulation (indicated by the arrow) in a WT slice, before (trace a) and after (trace b) application of a saturating concentration of the GluT inhibitor TFB-TBOA (TBOA). The STC was obtained by subtracting the residual current remaining in the presence of TBOA from the total inward current (trace a-b); the decay of the STC was best fitted by a single exponential function with τdecay = 6.53 ms (in red). The bar plot shows the average values of τdecay of the STC isolated pharmacologically in cortical slices (n=13) from P22-23 WT (N=7) and KI mice (n=9; N=3). STC τdecay is 17% higher in KI compared to WT astrocytes (unpaired t-test: P = 0.003). Hereafter, n indicates the number of slices and N indicates the number of mice.(C) τdecay of the STC isolated using an exponential waveform approximating the average TBOA-insensitive current in WT and KI mice. Top trace, average normalized TBOA-insensitive current obtained by pooling the normalized TBOA-insensitive currents recorded in 16 WT and KI cells. This current was best fitted by an exponentially rising function (1-exp (-t/τrise)) with τrise= 2.35 ms (in green). The STC was obtained by subtracting from the total current elicited in the astrocyte (a: same representative trace as in (B)) the exponential function A(1-exp (-t/τrise)) with τrise = 2.35 ms and A equal to the maximal current measured in the astrocyte at about 60 ms after stimulation (trace c); the decay of the STC (trace a-c) was best fitted by a single exponential function with τdecay = 6.49 ms (in red). The bar plot shows the average values of τdecay of the STC isolated as shown in the top panel in cortical slices from P22-23 WT (n = 28; N=11) and KI mice (n = 27; N=9). STC τdecay is 21% higher in KI compared to WT astrocytes (unpaired t-test: P < 0.0001)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Isolation", "of", "the", "STC", "elicited", "by", "the", "last", "pulse", "of", "a", "high", "-", "frequency", "train", "of", "action", "potentials", ".", "Left", ":", "superimposed", "representative", "traces", "of", "the", "inward", "current", "evoked", "in", "an", "astrocyte", "(", "held", "at", "-", "90", "mV", ")", "by", "extracellular", "stimulation", "with", "a", "train", "of", "10", "pulses", "(", "trace", "a", ":", "black", ")", "and", "a", "train", "of", "9", "pulses", "(", "trace", "b", ":", "brown", ")", "at", "50", "Hz", "in", "a", "WT", "cortical", "slice", ".", "The", "inward", "current", "elicited", "by", "the", "10th", "pulse", "was", "obtained", "by", "subtracting", "the", "current", "elicited", "by", "9", "pulses", "from", "that", "elicited", "by", "10", "pulses", "(", "trace", "a", "-", "b", ")", ".", "Right", ":", "The", "STC", "elicited", "by", "the", "10th", "pulse", "(", "trace", "a", "-", "b", "-", "c", ")", "was", "obtained", "by", "subtracting", "the", "exponential", "function", "that", "simulates", "the", "TBOA", "-", "insensitive", "current", "elicited", "by", "a", "single", "pulse", "(", "trace", "c", ",", "obtained", "as", "in", "Figure", "1C", ")", "to", "the", "10", "-", "9", "pulses", "difference", "current", "(", "trace", "a", "-", "b", ")", ".", "The", "decay", "of", "the", "STC", "elicited", "by", "the", "10th", "pulse", "was", "best", "fitted", "by", "a", "single", "exponential", "function", "with", "τdecay", "=", "8", ".", "04", "ms", "(", "in", "red", ")", ".", "(", "B", ")", "τdecay", "of", "the", "STC", "elicited", "by", "the", "10th", "pulse", "of", "50", "Hz", "(", "τ10", "(", "50", "Hz", ")", ",", "left", "panel", ")", "and", "100", "Hz", "(", "τ10", "(", "100", "Hz", ")", ",", "right", "panel", ")", "trains", "in", "layer", "1", "astrocytes", "in", "acute", "cortical", "slices", "from", "P22", "-", "23", "WT", "(", "n", "=", "23", ";", "N", "=", "10", "for", "50", "Hz", ";", "n", "=", "18", ";", "N", "=", "8", "for", "100", "Hz", ")", "and", "KI", "(", "n", "=", "21", ";", "N", "=", "9", "for", "50", "Hz", "and", "n", "=", "14", ";", "N", "=", "7", "for", "100", "Hz", ")", "mice", ".", "The", "STC", "elicited", "by", "the", "10th", "pulse", "was", "obtained", "as", "described", "in", "(", "A", ")", ".", "STC", "τ10", "(", "50", "Hz", ")", "and", "τ10", "(", "100", "Hz", ")", "are", "30", "%", "and", "37", "%", "higher", "in", "KI", "compared", "to", "WT", "mice", ",", "respectively", "(", "unpaired", "t", "-", "test", ":", "P", "<", "0", ".", "0001", "in", "both", "cases", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Isolation of the STC elicited by the last pulse of a high-frequency train of action potentials. Left: superimposed representative traces of the inward current evoked in an astrocyte (held at -90 mV) by extracellular stimulation with a train of 10 pulses (trace a: black) and a train of 9 pulses (trace b: brown) at 50 Hz in a WT cortical slice. The inward current elicited by the 10th pulse was obtained by subtracting the current elicited by 9 pulses from that elicited by 10 pulses (trace a-b). Right: The STC elicited by the 10th pulse (trace a-b-c) was obtained by subtracting the exponential function that simulates the TBOA-insensitive current elicited by a single pulse (trace c, obtained as in Figure 1C) to the 10-9 pulses difference current (trace a-b). The decay of the STC elicited by the 10th pulse was best fitted by a single exponential function with τdecay = 8.04 ms (in red).(B) τdecay of the STC elicited by the 10th pulse of 50 Hz (τ10 (50 Hz), left panel) and 100 Hz (τ10 (100 Hz), right panel) trains in layer 1 astrocytes in acute cortical slices from P22-23 WT (n = 23; N=10 for 50 Hz; n = 18; N=8 for 100 Hz) and KI (n = 21; N=9 for 50 Hz and n = 14; N=7 for 100 Hz) mice. The STC elicited by the 10th pulse was obtained as described in (A). STC τ10 (50 Hz) and τ10 (100 Hz) are 30% and 37% higher in KI compared to WT mice, respectively (unpaired t-test: P < 0.0001 in both cases)."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ")", "Simultaneous", "visualization", "of", "GLT", "-", "1a", "+", "(", "green", ")", "and", "VGLUT1", "+", "puncta", "(", "red", ")", "in", "first", "somatic", "sensory", "cortex", "(", "SI", ")", "of", "a", "WT", "and", "a", "KI", "mouse", "(", "P35", ")", ".", "Arrows", "point", "to", "some", "GLT", "-", "1a", "+", "puncta", "overlaying", "with", "VGLUT1", "+", "puncta", "(", "i", ".", "e", ".", ",", "GLT", "-", "1a", "/", "VGLUT1", "related", "puncta", ")", ";", "framed", "regions", "(", "enlarged", "below", ")", "are", "examples", "of", "GLT", "-", "1a", "/", "VGLUT1", "related", "puncta", "(", "arrowheads", ")", ".", "All", "microscopic", "fields", "are", "from", "layers", "II", "/", "III", ".", "Scale", "bars", ":", "3", ".", "5", "µm", "for", "left", "and", "right", "panels", "and", "1", "µm", "for", "enlarged", "framed", "areas", ".", "(", "B", ")", "Percentage", "and", "size", "of", "GLT", "-", "1a", "+", "puncta", "overlaying", "with", "VGLUT1", "in", "P35", "WT", "and", "KI", "mice", ".", "Left", ",", "percentage", "of", "GLT", "-", "1a", "+", "puncta", "overlaying", "with", "VGLUT1", "is", "comparable", "in", "WT", "and", "KI", "mice", "(", "data", "were", "obtained", "from", "14", "and", "18", "fields", "of", "20", "µm", "x", "20", "µm", "from", "2", "WT", "and", "2", "KI", "mice", "(", "4", "sections", "/", "animal", ")", ",", "respectively", ")", "(", "unpaired", "t", "-", "test", ":", "P", "=", "0", ".", "52", ")", ".", "Right", ",", "size", "of", "GLT", "-", "1a", "/", "VGLUT1", "related", "puncta", "is", "19", "%", "reduced", "in", "KI", "mice", "(", "169", "GLT", "-", "1a", "+", "puncta", "analyzed", "from", "2", "mice", ")", "compared", "to", "WT", "(", "174", "GLT", "-", "1a", "+", "puncta", "analyzed", "from", "2", "mice", ")", "(", "Mann", "-", "Withney", "U", "test", ":", "P", "=", "0", ".", "016", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A) Simultaneous visualization of GLT-1a+ (green) and VGLUT1+ puncta (red) in first somatic sensory cortex (SI) of a WT and a KI mouse (P35). Arrows point to some GLT-1a+ puncta overlaying with VGLUT1+ puncta (i.e., GLT-1a/VGLUT1 related puncta); framed regions (enlarged below) are examples of GLT-1a/VGLUT1 related puncta (arrowheads). All microscopic fields are from layers II/III. Scale bars: 3.5 µm for left and right panels and 1 µm for enlarged framed areas.(B) Percentage and size of GLT-1a+ puncta overlaying with VGLUT1 in P35 WT and KI mice. Left, percentage of GLT-1a+ puncta overlaying with VGLUT1 is comparable in WT and KI mice (data were obtained from 14 and 18 fields of 20 µm x 20 µm from 2 WT and 2 KI mice (4 sections/animal), respectively) (unpaired t-test: P = 0.52). Right, size of GLT-1a/VGLUT1 related puncta is 19 % reduced in KI mice (169 GLT-1a+ puncta analyzed from 2 mice) compared to WT (174 GLT-1a+ puncta analyzed from 2 mice) (Mann-Withney U test: P = 0.016)."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Distribution", "of", "GLT", "-", "1agold", "particles", "in", "astrocytic", "processes", "contacting", "asymmetric", "synapses", "(", "perisynaptic", "astrocytic", "processes", ":", "PAP", ")", "in", "SI", "of", "5", "WT", "and", "5", "KI", "(", "2", "male", ",", "3", "female", ")", "mice", "(", "P34", "-", "35", ")", ".", "In", "cortical", "PAP", "of", "KI", "mice", "the", "density", "(", "particles", "/", "µm2", ")", "of", "total", "and", "membrane", "-", "associated", "gold", "particles", "(", "arrowheads", ")", "are", "reduced", "compared", "to", "WT", "mice", ",", "whereas", "the", "density", "of", "cytoplasmicgold", "particles", "(", "arrows", ")", "is", "comparable", "to", "that", "in", "WT", "(", "cf", "Table", "I", "for", "numerical", "values", "and", "statistics", ")", ".", "(", "B", ")", "Distribution", "of", "GLT", "-", "1agold", "particles", "in", "excitatory", "axon", "terminals", "forming", "asymmetric", "synaptic", "contact", "(", "AxT", ")", "in", "SI", "of", "P34", "-", "35", "WT", "and", "KI", "mice", ".", "In", "cortical", "AxT", "of", "KI", "and", "WT", "mice", ",", "GLT", "-", "1a", "density", "is", "comparable", "(", "arrowheads", ":", "membrane", "-", "associated", "gold", "particles", ";", "arrows", ":", "cytoplasmicgold", "particles", ")", "(", "cf", "Table", "I", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Distribution of GLT-1agold particles in astrocytic processes contacting asymmetric synapses (perisynaptic astrocytic processes: PAP) in SI of 5 WT and 5 KI (2 male, 3 female) mice (P34-35). In cortical PAP of KI mice the density (particles/µm2) of total and membrane-associated gold particles (arrowheads) are reduced compared to WT mice, whereas the density of cytoplasmicgold particles (arrows) is comparable to that in WT (cf Table I for numerical values and statistics).(B) Distribution of GLT-1agold particles in excitatory axon terminals forming asymmetric synaptic contact (AxT) in SI of P34-35 WT and KI mice. In cortical AxT of KI and WT mice, GLT-1a density is comparable (arrowheads: membrane-associated gold particles; arrows: cytoplasmicgold particles) (cf Table I)."}
{"words": ["Figure", "5Left", ",", "superimposed", "representative", "traces", "of", "the", "normalized", "inward", "current", "evoked", "in", "a", "WT", "(", "black", "trace", ")", "and", "a", "KI", "corticalastrocyte", "(", "blue", "trace", ")", "by", "extracellular", "stimulation", "with", "a", "train", "of", "10", "pulses", "at", "50", "Hz", "in", "cortical", "slices", ".", "The", "inset", "shows", "in", "an", "expanded", "time", "scale", "the", "portion", "of", "the", "traces", "indicated", "by", "the", "dotted", "line", ".", "The", "slowly", "decaying", "current", "(", "τdecay", "=", "2", ".", "00", "s", "and", "3", ".", "04", "s", "for", "the", "WT", "and", "KI", "trace", ",", "respectively", ")", "is", "largely", "a", "[", "K", "+", "]", "e", "-", "dependent", "K", "+", "current", "(", "IK", ")", "whose", "decay", "kinetics", "provide", "a", "measure", "of", "the", "rate", "of", "K", "+", "clearance", "by", "astrocytes", "(", "see", "text", ")", ".", "Right", ",", "time", "constant", "of", "decay", "of", "IK", "elicited", "by", "trains", "of", "10", "pulses", "at", "50", "Hz", "in", "corticalastrocytes", "from", "P22", "-", "23", "WT", "(", "n", "=", "21", ";", "N", "=", "12", ")", "and", "KI", "mice", "(", "n", "=", "20", ";", "N", "=", "8", ")", ".", "IK", "τdecay", "is", "22", "%", "higher", "in", "KI", "compared", "to", "WT", "astrocytes", "(", "unpaired", "t", "-", "test", ":", "P", "=", "0", ".", "001", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5Left, superimposed representative traces of the normalized inward current evoked in a WT (black trace) and a KI corticalastrocyte (blue trace) by extracellular stimulation with a train of 10 pulses at 50 Hz in cortical slices. The inset shows in an expanded time scale the portion of the traces indicated by the dotted line. The slowly decaying current (τdecay = 2.00 s and 3.04 s for the WT and KI trace, respectively) is largely a [K+]e-dependent K+current (IK) whose decay kinetics provide a measure of the rate of K+ clearance by astrocytes (see text). Right, time constant of decay of IK elicited by trains of 10 pulses at 50 Hz in corticalastrocytes from P22-23 WT (n = 21; N=12) and KI mice (n = 20; N=8). IK τdecay is 22% higher in KI compared to WT astrocytes (unpaired t-test: P = 0.001)."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Images", "of", "a", "cortical", "slice", "before", "(", "t", "=", "0", ")", "and", "after", "(", "t", "=", "15", ".", "6", "s", ")", "pressure", "ejection", "of", "a", "high", "KCl", "pulse", "that", "elicits", "a", "CSD", "(", "top", "panels", ")", ",", "showing", "that", "the", "propagating", "CSD", "is", "associated", "with", "a", "change", "in", "light", "transmittance", ".", "Scale", "bar", ":", "500", "µm", ".", "The", "traces", "below", "show", "representative", "changes", "in", "intrinsic", "optical", "signal", "(", "IOS", ")", "relative", "to", "background", "measured", "in", "a", "WT", "and", "a", "KI", "cortical", "slice", "during", "CSD", "propagation", "at", "increasing", "times", "and", "distances", "from", "the", "KCl", "puff", ",", "as", "indicated", "in", "color", "code", "in", "the", "right", "image", "on", "the", "top", ".", "The", "velocity", "of", "CSD", "propagation", ",", "obtained", "from", "the", "rate", "of", "horizontal", "spread", "of", "the", "change", "in", "IOS", ",", "in", "these", "two", "representative", "WT", "and", "KI", "slices", "is", "3", ".", "11", "and", "4", ".", "14", "mm", "/", "min", ",", "respectively", ".", "(", "B", ")", "Stimulation", "threshold", "for", "CSD", "induction", "(", "CSD", "threshold", ")", "and", "rate", "of", "CSD", "propagation", "(", "CSD", "velocity", ")", "in", "WT", "(", "n", "=", "24", ";", "N", "=", "3", ")", "and", "KI", "(", "n", "=", "27", ";", "N", "=", "8", ")", "cortical", "slices", "from", "P22", "-", "23", "mice", ".", "CSD", "threshold", "is", "expressed", "as", "duration", "of", "the", "first", "KCl", "pulse", "eliciting", "a", "CSD", ".", "CSD", "threshold", "is", "28", "%", "lower", "(", "Mann", "Whitney", "U", "test", ",", "P", "<", "0", ".", "0001", ")", "and", "CSD", "velocity", "21", "%", "higher", "(", "unpaired", "t", "-", "test", ":", "P", "<", "0", ".", "0001", ")", "in", "KI", "compared", "to", "WT", "mice", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Images of a cortical slice before (t = 0) and after (t = 15.6 s) pressure ejection of a high KCl pulse that elicits a CSD (top panels), showing that the propagating CSD is associated with a change in light transmittance. Scale bar: 500 µm. The traces below show representative changes in intrinsic optical signal (IOS) relative to background measured in a WT and a KI cortical slice during CSD propagation at increasing times and distances from the KCl puff, as indicated in color code in the right image on the top. The velocity of CSD propagation, obtained from the rate of horizontal spread of the change in IOS, in these two representative WT and KI slices is 3.11 and 4.14 mm/min, respectively.(B) Stimulation threshold for CSD induction (CSD threshold) and rate of CSD propagation (CSD velocity) in WT (n = 24; N=3) and KI (n = 27; N=8) cortical slices from P22-23 mice. CSD threshold is expressed as duration of the first KCl pulse eliciting a CSD. CSD threshold is 28% lower (Mann Whitney U test, P < 0.0001) and CSD velocity 21% higher (unpaired t-test: P< 0.0001) in KI compared to WT mice."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Western", "blottings", "of", "GLT", "-", "1a", "in", "cortical", "crude", "synaptic", "membranes", "of", "P39", "WT", "mice", "following", "Cef", "treatment", "for", "8", "days", ".", "GLT", "-", "1a", "levels", "are", "significantly", "increased", "in", "mice", "treated", "with", "Cef", "(", "Cef", "WT", ",", "N", "=", "4", ")", "compared", "to", "control", "saline", "-", "injected", "mice", "(", "Ctr", "WT", ",", "N", "=", "4", ")", "(", "Mann", "-", "Withney", "U", "test", ":", "P", "=", "0", ".", "028", ")", ".", "(", "B", ")", "Visualization", "of", "GLT", "-", "1a", "+", "puncta", "(", "green", ")", "and", "VGLUT1", "+", "puncta", "(", "red", ")", "in", "sections", "from", "SI", "of", "P45", "-", "46", "WT", "mice", "that", "were", "treated", "with", "saline", "(", "Ctr", "WT", ")", "or", "Cef", "(", "Cef", "WT", ")", ".", "Arrows", "point", "to", "some", "GLT", "-", "1a", "/", "VGLUT1", "related", "puncta", ".", "Framed", "regions", "(", "enlarged", "below", ")", "are", "examples", "of", "GLT", "-", "1a", "/", "VGLUT1", "related", "puncta", "(", "arrowheads", ")", ".", "Right", ",", "Cef", "treatment", "increased", "significantly", "the", "size", "of", "GLT", "-", "1a", "+", "puncta", "overlaying", "VGLUT1", "(", "142", "and", "186", "GLT", "-", "1a", "+", "puncta", "analyzed", "from", "4", "Ctr", "WT", "and", "4", "Cef", "WT", "mice", ",", "respectively", ";", "3", "sections", "/", "animal", ")", "(", "Mann", "-", "Withney", "U", "test", ":", "P", "<", "0", ".", "0001", ")", ".", "All", "microscopic", "fields", "are", "from", "layers", "II", "/", "III", ".", "Scale", "bars", ":", "3", ".", "5", "µm", "for", "left", "and", "right", "panels", "and", "1", "µm", "for", "enlarged", "framed", "areas", ".", "(", "C", ")", "CSD", "threshold", "and", "CSD", "velocity", "in", "cortical", "slices", "from", "P30", "-", "33", "KI", "mice", "that", "were", "injected", "with", "saline", "(", "Ctr", "KI", ",", "n", "=", "38", ";", "N", "=", "7", ")", "or", "Cef", "(", "Cef", "KI", ",", "n", "=", "31", ";", "N", "=", "6", ")", ".", "CSD", "threshold", "is", "12", "%", "higher", "(", "Mann", "-", "Withney", "U", "test", ":", "P", "=", "0", ".", "02", ")", "in", "Cef", "-", "treated", "compared", "to", "saline", "-", "treated", "KI", "mice", ".", "CSD", "velocity", "is", "not", "altered", "by", "Cef", "treatment", "(", "P", "=", "0", ".", "90", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Western blottings of GLT-1a in cortical crude synaptic membranes of P39 WT mice following Cef treatment for 8 days. GLT-1a levels are significantly increased in mice treated with Cef (Cef WT, N = 4) compared to control saline-injected mice (Ctr WT, N = 4) (Mann-Withney U test: P = 0.028).(B) Visualization of GLT-1a+ puncta (green) and VGLUT1+ puncta (red) in sections from SI of P45-46 WT mice that were treated with saline (Ctr WT) or Cef (Cef WT). Arrows point to some GLT-1a/VGLUT1 related puncta. Framed regions (enlarged below) are examples of GLT-1a/VGLUT1 related puncta (arrowheads). Right, Cef treatment increased significantly the size of GLT-1a+ puncta overlaying VGLUT1 (142 and 186 GLT-1a+ puncta analyzed from 4 Ctr WT and 4 Cef WT mice, respectively; 3 sections/animal) (Mann-Withney U test: P < 0.0001). All microscopic fields are from layers II/III. Scale bars: 3.5 µm for left and right panels and 1 µm for enlarged framed areas.(C) CSD threshold and CSD velocity in cortical slices from P30-33 KI mice that were injected with saline (Ctr KI, n = 38; N=7) or Cef (Cef KI, n = 31; N=6). CSD threshold is 12% higher (Mann-Withney U test: P = 0.02) in Cef-treated compared to saline-treated KI mice. CSD velocity is not altered by Cef treatment (P = 0.90)."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "A", ")", "Distribution", "of", "GLT", "-", "1agold", "particles", "in", "PAP", "of", "saline", "-", "injected", "(", "Ctr", "KI", ",", "N", "=", "4", ")", "and", "Cef", "-", "treated", "KI", "mice", "(", "Cef", "KI", ",", "N", "=", "4", ")", "(", "P45", "-", "46", ")", ".", "Cef", "treatment", "does", "not", "modify", "the", "density", "of", "total", ",", "cytoplasmic", "(", "arrows", ")", "and", "membrane", "-", "associated", "(", "arrowheads", ")", "gold", "particles", "in", "PAP", "of", "KI", "mice", "(", "cf", "Table", "II", ")", ".", "(", "B", ")", "Distribution", "of", "GLT", "-", "1agold", "particles", "in", "AxT", "in", "SI", "of", "Ctr", "KI", "and", "Cef", "KI", "KI", "mice", ".", "The", "density", "of", "the", "membrane", "-", "associated", "gold", "particles", "(", "arrowheads", ")", "is", "increased", "in", "Cef", "-", "treated", "KI", "mice", "(", "cf", "Table", "II", ")", ".", "(", "C", ")", "Western", "blottings", "of", "GLT", "-", "1a", "in", "cortical", "crude", "synaptic", "membranes", "of", "P39", "KI", "mice", "following", "Cef", "treatment", ".", "GLT", "-", "1a", "levels", "are", "similar", "in", "Cef", "-", "treated", "(", "Cef", "KI", ",", "N", "=", "4", ")", "and", "and", "saline", "-", "injected", "(", "Ctr", "KI", ",", "N", "=", "4", ")", "(", "Mann", "-", "Withney", "U", "test", ":", "P", "=", "0", ".", "83", ")", ".", "(", "D", ")", "Visualization", "of", "GLT", "-", "1a", "+", "puncta", "(", "green", ")", "and", "VGLUT1", "+", "puncta", "(", "red", ")", "in", "KI", "mice", "that", "received", "saline", "(", "Ctr", "KI", ")", "and", "in", "Cef", "-", "treated", "KI", "mice", "(", "Cef", "KI", ")", "(", "P45", "-", "46", ")", ".", "Arrows", "point", "to", "some", "GLT", "-", "1a", "/", "VGLUT1", "related", "puncta", ";", "framed", "regions", "are", "examples", "of", "GLT", "-", "1a", "/", "VGLUT1", "related", "puncta", "(", "arrowheads", ")", ".", "Right", ",", "Cef", "treatment", "does", "not", "increase", "the", "size", "of", "GLT", "-", "1a", "+", "puncta", "overlaying", "with", "VGLUT1", "(", "160", "and", "175", "GLT", "-", "1a", "+", "puncta", "analyzed", "from", "the", "same", "4", "Ctr", "KI", "and", "4", "Cef", "KI", "used", "for", "post", "-", "embedding", "electron", "microscopy", "analysis", ";", "3", "sections", "/", "animal", ")", "(", "Mann", "-", "Withney", "U", "test", ":", "P", "=", "0", ".", "31", ")", ".", "Scale", "bar", ":", "3", ".", "5", "µm", "for", "left", "and", "right", "panels", "and", "1", "µm", "for", "enlarged", "framed", "areas", ".", "All", "microscopic", "fields", "are", "from", "layers", "II", "/", "III", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(A) Distribution of GLT-1agold particles in PAP of saline-injected (Ctr KI, N=4) and Cef-treated KI mice (Cef KI, N=4) (P45-46). Cef treatment does not modify the density of total, cytoplasmic (arrows) and membrane-associated (arrowheads) gold particles in PAP of KI mice (cf Table II).(B) Distribution of GLT-1agold particles in AxT in SI of Ctr KI and Cef KI KI mice. The density of the membrane-associated gold particles (arrowheads) is increased in Cef-treated KI mice (cf Table II).(C) Western blottings of GLT-1a in cortical crude synaptic membranes of P39 KI mice following Cef treatment. GLT-1a levels are similar in Cef-treated (Cef KI, N=4) and and saline-injected (Ctr KI, N=4) (Mann-Withney U test: P = 0.83).(D) Visualization of GLT-1a+ puncta (green) and VGLUT1+ puncta (red) in KI mice that received saline (Ctr KI) and in Cef-treated KI mice (Cef KI) (P45-46). Arrows point to some GLT-1a/VGLUT1 related puncta; framed regions are examples of GLT-1a/VGLUT1 related puncta (arrowheads). Right, Cef treatment does not increase the size of GLT-1a+ puncta overlaying with VGLUT1 (160 and 175 GLT-1a+ puncta analyzed from the same 4 Ctr KI and 4 Cef KI used for post-embedding electron microscopy analysis; 3 sections/animal) (Mann-Withney U test: P = 0.31). Scale bar: 3.5 µm for left and right panels and 1 µm for enlarged framed areas. All microscopic fields are from layers II/III."}
{"words": ["Figure", "9", "(", "A", ")", "τdecay", "of", "the", "STC", "evoked", "by", "single", "pulse", "stimulation", "in", "layer", "1", "astrocytes", "in", "acute", "cortical", "slices", "from", "P22", "-", "23", "WT", "mice", "before", "(", "Ctr", "WT", ")", "and", "after", "application", "of", "2", ".", "5", "µM", "DL", "-", "TBOA", "(", "TBOA", "2", ".", "5", ")", "(", "n", "=", "4", ";", "N", "=", "2", ")", "(", "right", "panel", ")", ".", "The", "traces", "on", "the", "left", "are", "the", "corresponding", "average", "normalized", "STCs", ",", "isolated", "as", "in", "Figure", "1C", ".", "The", "STC", "τdecay", "in", "TBOA", "2", ".", "5", "is", "32", "±", "2", "%", "higher", "than", "in", "Ctr", "WT", "(", "paired", "t", "-", "test", ":", "P", "=", "0", ".", "002", ")", ".", "The", "left", "top", "panel", "shows", "the", "time", "course", "of", "τdecay", "of", "the", "transient", "component", "(", "due", "to", "the", "STC", ")", "of", "the", "current", "recorded", "in", "an", "astrocyte", "during", "a", "representative", "experiment", "in", "which", "TBOA", "2", ".", "5", "was", "applied", "at", "the", "time", "indicated", "by", "the", "horizontal", "bar", ".", "The", "steady", "-", "state", "effect", "was", "reached", "within", "10", "-", "15", "minutes", "from", "the", "beginning", "of", "the", "drug", "perfusion", ".", "(", "B", ")", "CSD", "threshold", "and", "velocity", "measured", "in", "cortical", "slices", "from", "P22", "-", "23", "WT", "mice", "after", "perfusion", "for", "20", "minutes", "with", "extracellular", "solution", "without", "(", "Ctr", "WT", ":", "n", "=", "23", ";", "N", "=", "15", ")", "and", "with", "2", ".", "5", "µM", "DL", "-", "TBOA", "(", "TBOA", "2", ".", "5", ":", "n", "=", "25", ";", "N", "=", "8", ")", ".", "CSD", "threshold", "in", "TBOA", "2", ".", "5", "is", "36", "%", "lower", "than", "in", "Ctr", "WT", "(", "Mann", "-", "Withney", "U", "test", "test", ":", "P", "<", "0", ".", "0001", ")", "and", "CSD", "velocity", "is", "20", "%", "higher", "(", "unpaired", "t", "-", "test", ":", "P", "<", "0", ".", "0001", ")", ".", "(", "C", ")", "τdecay", "of", "the", "STC", "evoked", "by", "single", "pulse", "stimulation", "in", "layer", "1", "astrocytes", "in", "acute", "cortical", "slices", "from", "P22", "-", "23", "WT", "mice", "before", "(", "Ctr", "WT", ")", "and", "after", "application", "of", "1", ".", "5", "µM", "DL", "-", "TBOA", "(", "TBOA", "1", ".", "5", ")", "(", "n", "=", "4", ";", "N", "=", "4", ")", ".", "The", "STC", "τdecay", "in", "TBOA", "1", ".", "5", "is", "22", "±", "3", "%", "higher", "than", "in", "Ctr", "WT", "(", "paired", "t", "-", "test", ":", "P", "=", "0", ".", "004", ")", ".", "(", "D", ")", "CSD", "threshold", "and", "velocity", "measured", "in", "cortical", "slices", "from", "P22", "-", "23", "WT", "mice", "after", "perfusion", "for", "20", "minutes", "with", "extracellular", "solution", "without", "(", "Ctr", "WT", ":", "n", "=", "23", ";", "N", "=", "15", ")", "and", "with", "1", ".", "5", "µM", "DL", "-", "TBOA", "(", "TBOA", "1", ".", "5", ":", "n", "=", "18", ";", "N", "=", "6", ")", ".", "CSD", "threshold", "in", "TBOA", "1", ".", "5", "is", "23", "%", "lower", "than", "in", "Ctr", "WT", "(", "Mann", "-", "Withney", "U", "test", "test", ":", "P", "<", "0", ".", "0001", ")", "and", "CSD", "velocity", "is", "13", "%", "higher", "(", "unpaired", "t", "-", "test", ":", "P", "=", "0", ".", "003", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 9(A) τdecay of the STC evoked by single pulse stimulation in layer 1 astrocytes in acute cortical slices from P22-23 WT mice before (Ctr WT) and after application of 2.5 µM DL-TBOA (TBOA 2.5) (n = 4; N=2) (right panel). The traces on the left are the corresponding average normalized STCs, isolated as in Figure 1C. The STC τdecay in TBOA 2.5 is 32 ± 2 % higher than in Ctr WT (paired t-test: P = 0.002). The left top panel shows the time course of τdecay of the transient component (due to the STC) of the current recorded in an astrocyte during a representative experiment in which TBOA 2.5 was applied at the time indicated by the horizontal bar. The steady-state effect was reached within 10-15 minutes from the beginning of the drug perfusion.(B) CSD threshold and velocity measured in cortical slices from P22-23 WT mice after perfusion for 20 minutes with extracellular solution without (Ctr WT: n = 23; N = 15) and with 2.5 µM DL-TBOA (TBOA 2.5: n = 25; N = 8). CSD threshold in TBOA 2.5 is 36 % lower than in Ctr WT (Mann-Withney U test test: P < 0.0001) and CSD velocity is 20% higher (unpaired t-test: P < 0.0001).(C) τdecay of the STC evoked by single pulse stimulation in layer 1 astrocytes in acute cortical slices from P22-23 WT mice before (Ctr WT) and after application of 1.5 µM DL-TBOA (TBOA 1.5) (n = 4; N=4). The STC τdecay in TBOA 1.5 is 22 ± 3 % higher than in Ctr WT (paired t-test: P = 0.004).(D) CSD threshold and velocity measured in cortical slices from P22-23 WT mice after perfusion for 20 minutes with extracellular solution without (Ctr WT: n = 23; N = 15) and with 1.5 µM DL-TBOA (TBOA 1.5: n = 18; N = 6). CSD threshold in TBOA 1.5 is 23 % lower than in Ctr WT (Mann-Withney U test test: P < 0.0001) and CSD velocity is 13 % higher (unpaired t-test: P = 0.003)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", "Total", "PD", "-", "L1", ",", "PARP", "from", "colon", "(", "Colo", "-", "205", ")", ",", "lung", "(", "A549", ")", ",", "pancreatic", "(", "PANK1", ")", "lysates", "treated", "with", "indicated", "DR5", "agonist", "antibodies", "named", "Lexa", "(", "lexatumumab", ")", ",", "KMTR2", "GAPDH", "is", "loading", "controlTotal", "PD", "-", "L1", ",", "PARP", "from", "triple", "negative", "breast", "cancer", "cell", "(", "MDA", "-", "MB", "-", "436", ")", "lysates", "treated", "with", "indicated", "DR5", "agonist", "antibodies", "named", "Lexa", "(", "lexatumumab", ")", ",", "KMTR2", ",", "BaCa", ",", "GAPDH", "is", "loading", "controlC", ")", "Total", "PD", "-", "L1", ",", "PARP", ",", "cleaved", "caspase", "-", "3", "from", "ovarian", "cell", "(", "Cavo", "-", "3", ")", "lysates", "treated", "with", "indicated", "DR5", "agonist", "antibodies", "named", "tigatuzumab", ".", "GAPDH", "is", "loading", "control", "(", "D", ")", "Total", "PD", "-", "L1", ",", "CD47", ",", "Calreticulin", ",", "PARP", "from", "MDA", "-", "MB", "-", "436", "cell", "lysates", "treated", "with", "indicated", "DR5", "agonist", "antibodies", "±", "caspase", "inhibitor", "Z", "-", "VAD", ".", "GAPDH", "is", "loading", "control", ".", "(", "E", ")", "Total", "PD", "-", "L1", "western", "blotting", "signal", "from", "the", "lysates", "of", "OVCAR", "-", "3", "(", "n", "=", "3", ")", "and", "MDA", "-", "MB", "-", "436", "(", "n", "=", "3", ")", "cells", "after", "6", "hrs", "treatment", "of", "100nM", "lexa", "(", "DR5", "agonist", "antibody", ")", "was", "normalized", "to", "GAPDH", ".", "(", "F", ")", "Surface", "biotinylation", "of", "PD", "-", "L1", "from", "indicated", "tumor", "cells", "after", "indicated", "DR5", "agonist", "treatments", ".", "Cleaved", "caspase", "-", "3", "and", "PARP", "indicates", "activation", "of", "DR5", "signaling", ".", "In", "lane", "3", "and", "4", ",", "KMTR2", "was", "pre", "-", "neutralized", "either", "with", "recombinant", "DR5", "(", "rDR5", ")", "or", "recombinant", "FOLR1", "(", "rFOLR1", ")", ".", "(", "G", ")", "Representative", "flow", "cytometry", "plots", "of", "PD", "-", "L1", "from", "two", "different", "tumor", "cell", "lines", "treated", "with", "indicated", "DR5", "antibodies", ".", "Secondary", "alone", "and", "IgG1", "control", "are", "included", ".", "(", "H", ")", "Relative", "surface", "PD", "-", "L1", "%", "cells", ",", "after", "DR5", "agonist", "treatments", "Relative", "signal", "is", "normalized", "to", "surface", "PD", "-", "L1", "in", "IgG1", "treated", "cells", "in", "corresponding", "tumor", "cells", "and", "horizontal", "line", "in", "samples", "indicated", "mean", "(", "n", "=", "3", "-", "4", ")", ".", "(", "J", ")", "Relative", "surface", "PD", "-", "L1", "%", "cells", "in", "indicated", "tumors", "after", "DR5", "agonist", "treatments", "Relative", "signal", "is", "normalized", "to", "surface", "PD", "-", "L1", "in", "IgG1", "treated", "tumors", "and", "horizontal", "line", "in", "samples", "indicated", "mean", "(", "n", "=", "2", "-", "6", ")", "(", "K", ")", "ER", "(", "-", ")", ",", "PR", "(", "-", ")", "and", "HER2", "(", "-", ")", "UCD52", "patient", "derived", "tumor", "tissue", "was", "xenografted", "in", "breast", "fat", "pad", "of", "NOD", ".", "Cg", "-", "Prkdcscid", "Il2rgtm1Wjl", "/", "SzJ", "mice", ",", "following", "by", "treatment", "with", "IgG1", "or", "KMTR2", "(", "50μg", ",", "4", "doses", ")", ".", "Harvested", "tumors", "were", "analyzed", "for", "PD", "-", "L1", ",", "CD47", "and", "PARP", "in", "lysates", ".", "(", "L", ")", "KMTR2", "treated", "(", "50μg", ",", "4", "doses", ")", "UCD52", "TNBC", "PDX", "tumors", "were", "stained", "for", "PD", "-", "L1", "using", "immunohistochemistry", "(", "IHC", ")", ".", "(", "M", ")", "Total", "PD", "-", "L1", "and", "CD47", "blotting", "analysis", "from", "DR5", "resistant", "MDA", "-", "MB", "-", "436", "cell", "lines", "after", "indicated", "DR5", "agonist", "treatment", "(", "50nM", ",", "6hr", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A Total PD-L1, PARP from colon (Colo-205), lung (A549), pancreatic (PANK1) lysates treated with indicated DR5 agonist antibodies named Lexa (lexatumumab), KMTR2 GAPDH is loading controlTotal PD-L1, PARP from triple negative breast cancer cell (MDA-MB-436) lysates treated with indicated DR5 agonist antibodies named Lexa (lexatumumab), KMTR2, BaCa, GAPDH is loading controlC) Total PD-L1, PARP, cleaved caspase-3 from ovarian cell (Cavo-3) lysates treated with indicated DR5 agonist antibodies named tigatuzumab. GAPDH is loading control(D) Total PD-L1, CD47, Calreticulin, PARP from MDA-MB-436 cell lysates treated with indicated DR5 agonist antibodies ± caspase inhibitor Z-VAD. GAPDH is loading control.(E) Total PD-L1 western blotting signal from the lysates of OVCAR-3 (n=3) and MDA-MB-436 (n=3) cells after 6 hrs treatment of 100nM lexa (DR5 agonist antibody) was normalized to GAPDH.(F) Surface biotinylation of PD-L1 from indicated tumor cells after indicated DR5 agonist treatments. Cleaved caspase-3 and PARP indicates activation of DR5 signaling. In lane 3 and 4, KMTR2 was pre-neutralized either with recombinant DR5 (rDR5) or recombinant FOLR1 (rFOLR1).(G) Representative flow cytometry plots of PD-L1 from two different tumor cell lines treated with indicated DR5 antibodies. Secondary alone and IgG1 control are included.(H) Relative surface PD-L1 % cells, after DR5 agonist treatments Relative signal is normalized to surface PD-L1 in IgG1 treated cells in corresponding tumor cells and horizontal line in samples indicated mean (n=3-4).(J) Relative surface PD-L1 % cells in indicated tumors after DR5 agonist treatments Relative signal is normalized to surface PD-L1 in IgG1 treated tumors and horizontal line in samples indicated mean (n=2-6)(K) ER (-), PR (-) and HER2 (-) UCD52 patient derived tumor tissue was xenografted in breast fat pad of NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice, following by treatment with IgG1 or KMTR2 (50μg, 4 doses). Harvested tumors were analyzed for PD-L1, CD47 and PARP in lysates.(L) KMTR2 treated (50μg, 4 doses) UCD52 TNBC PDX tumors were stained for PD-L1 using immunohistochemistry (IHC).(M) Total PD-L1 and CD47 blotting analysis from DR5 resistant MDA-MB-436 cell lines after indicated DR5 agonist treatment (50nM, 6hr)."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "C", ")", "Luciferase", "activity", "of", "reporter", "lines", "from", "tumor", "cell", "-", "Jurkat", "cell", "co", "-", "culture", "assay", "using", "MDA", "-", "MB", "-", "436", "and", "OVCAR3", "cells", "after", "treatment", "(", "50nM", ")", "with", "indicated", "DR5", "agonists", "(", "tiga", ":", "tigatuzumab", ",", "AMG", ":", "AMG655", ",", "KMTR1", ",", "Lexa", ":", "Lexatumumab", ")", ".", "The", "background", "luciferase", "signal", "from", "untreated", "cells", "(", "due", "to", "basal", "surface", "PD", "-", "L1", ")", "was", "subtracted", ".", "Various", "controls", "treatments", "(", "IgG1", ",", "anti", "-", "PD", "-", "L1", ",", "anti", "-", "EGFR", ")", "are", "also", "shown", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "D", ")", "Same", "as", "(", "C", ")", "except", "tumor", "cells", "were", "pre", "-", "treated", "with", "indicated", "inhibitors", "for", "AKT", ",", "ERK", ",", "mTOR", ",", "MEK", ",", "STAT3", ",", "PARP", "-", "i", "and", "NF", "-", "Kβ", "along", "with", "DR5", "agonist", "KMTR2", "antibody", "prior", "to", "co", "-", "culture", ".", "MDA", "-", "MB", "-", "436", "cells", "were", "treated", "with", "TNFα", "and", "indicated", "DR5", "agonists", "for", "indicated", "times", ".", "Lysates", "were", "analyzed", "for", "PD", "-", "L1", ",", "CSN5", "GAPDH", "is", "loading", "control", "in", "EMDA", "-", "MB", "-", "436", "cells", "were", "treated", "with", "TNFα", "and", "indicated", "DR5", "agonists", "for", "indicated", "times", ".", "Lysates", "were", "analyzed", "for", "PD", "-", "L1", "phosphorylated", "p65", ",", "total", "p65", ",", "cleaved", "caspase", "-", "3", "and", "PARP", ".", "Tubulin", "is", "loading", "control", "in", "F", ".", "MDA", "-", "MB", "-", "436", "cells", "were", "treated", "with", "TNFα", "and", "indicated", "DR5", "agonists", "for", "indicated", "times", ".", "Lysates", "were", "analyzed", "for", "PD", "-", "L1", ",", "CSN5", ",", "phosphorylated", "p65", "and", "PARP", ".", "GAPDH", "is", "loading", "control", "in", "G", ".", "(", "H", ")", "Flow", "cytometry", "analysis", "of", "MDA", "-", "MB", "-", "436", "cells", "treated", "with", "TNFα", "±", "MG132", "(", "top", ")", "and", "indicated", "DR5", "agonist", "±", "MG132", "(", "bottom", ")", ".", "(", "I", ")", "Total", "PD", "-", "L1", "from", "OVCAR3", "cell", "lysates", "was", "analyzed", "after", "treatment", "of", "indicated", "DR5", "agonist", "±", "MG132", ".", "(", "J", ")", "Flow", "cytometry", "surface", "PD", "-", "L1", "analysis", "of", "OVCAR", "-", "3", "cells", "treated", "with", "indicated", "DR5", "agonist", "±", "MG132", ".", "(", "K", ")", "MDA", "-", "MB", "-", "436", "cells", "were", "treated", "with", "MG132", "for", "indicated", "times", "and", "total", "PD", "-", "L1", "from", "lysates", "was", "analyzed", ".", "GAPDH", "is", "loading", "control", ".", "(", "L", ")", "Immunoblotting", "of", "DR5", "confirming", "generation", "of", "knock", "out", "(", "DR5", "-", "KO", ")", "cell", "lines", ".", "(", "M", ")", "Cell", "viability", "analysis", "of", "DR5", "-", "KO", "and", "DR5", "-", "WT", "cells", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "N", ")", "DR5", "-", "KO", "and", "WT", "cells", "were", "treated", "with", "TNFα", "and", "indicated", "DR5", "agonist", "followed", "by", "flow", "cytometry", "using", "PD", "-", "L1", "specific", "antibodies", ".", "(", "O", ")", "TNBC", "WT", "and", "DR5", "-", "KO", "(", "MDA", "-", "MB", "-", "436", ")", "cells", "were", "treated", "with", "either", "DR5", "agonist", "or", "TNFα", "as", "indicated", ".", "Lysates", "were", "analyzed", "for", "PD", "-", "L1", ",", "S5a", "and", "DR5", ".", "GAPDH", "is", "loading", "control", ".", "(", "P", ")", "OVCAR", "-", "3", "and", "MDA", "-", "MB", "-", "436", "(", "WT", "and", "DR5", "-", "KO", ")", "cells", "were", "treated", "with", "KMTR2", "followed", "by", "ubiquitin", "and", "S5a", "immunoblotting", "from", "total", "lysates", ".", "GAPDH", "is", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(C) Luciferase activity of reporter lines from tumor cell-Jurkat cell co-culture assay using MDA-MB-436 and OVCAR3 cells after treatment (50nM) with indicated DR5 agonists (tiga: tigatuzumab, AMG: AMG655, KMTR1, Lexa: Lexatumumab). The background luciferase signal from untreated cells (due to basal surface PD-L1) was subtracted. Various controls treatments (IgG1, anti-PD-L1, anti-EGFR) are also shown (n=3). (D) Same as (C) except tumor cells were pre-treated with indicated inhibitors for AKT, ERK, mTOR, MEK, STAT3, PARP-i and NF-Kβ along with DR5 agonist KMTR2 antibody prior to co-culture. MDA-MB-436 cells were treated with TNFα and indicated DR5 agonists for indicated times. Lysates were analyzed for PD-L1, CSN5 GAPDH is loading control in EMDA-MB-436 cells were treated with TNFα and indicated DR5 agonists for indicated times. Lysates were analyzed for PD-L1 phosphorylated p65, total p65, cleaved caspase-3 and PARP. Tubulin is loading control in F.MDA-MB-436 cells were treated with TNFα and indicated DR5 agonists for indicated times. Lysates were analyzed for PD-L1, CSN5, phosphorylated p65 and PARP. GAPDH is loading control in G.(H) Flow cytometry analysis of MDA-MB-436 cells treated with TNFα ± MG132 (top) and indicated DR5 agonist ± MG132 (bottom).(I) Total PD-L1 from OVCAR3 cell lysates was analyzed after treatment of indicated DR5 agonist ± MG132.(J) Flow cytometry surface PD-L1 analysis of OVCAR-3 cells treated with indicated DR5 agonist ± MG132.(K) MDA-MB-436 cells were treated with MG132 for indicated times and total PD-L1 from lysates was analyzed. GAPDH is loading control.(L) Immunoblotting of DR5 confirming generation of knock out (DR5-KO) cell lines.(M) Cell viability analysis of DR5-KO and DR5-WT cells (n=3).(N) DR5-KO and WT cells were treated with TNFα and indicated DR5 agonist followed by flow cytometry using PD-L1 specific antibodies.(O) TNBC WT and DR5-KO (MDA-MB-436) cells were treated with either DR5 agonist or TNFα as indicated. Lysates were analyzed for PD-L1, S5a and DR5. GAPDH is loading control.(P) OVCAR-3 and MDA-MB-436 (WT and DR5-KO) cells were treated with KMTR2 followed by ubiquitin and S5a immunoblotting from total lysates. GAPDH is loading control."}
{"words": ["Figure", "3ApoEVs", "isolated", "after", "IgG1", "and", "KMTR2", "treatment", "(", "OVCAR", "-", "3", ")", "were", "blotted", "against", "CD63", "and", "PD", "-", "L1", "in", "dot", "blots", ".", "ApoEVs", "isolated", "after", "IgG1", "and", "tigatuzumab", "treatment", "(", "MDA", "-", "MB", "-", "436", ")", "were", "run", "on", "western", "and", "blotted", "against", "CD63", "and", "PD", "-", "L1", ".", "ApoEVs", "isolated", "after", "IgG1", "and", "lexatumumab", "(", "D", ")", "treatment", "(", "MDA", "-", "MB", "-", "436", ")", "were", "run", "on", "western", "and", "blotted", "against", "CD63", "and", "PD", "-", "L1", ".", "(", "F", ")", "ApoEVs", "isolated", "from", "DR5", "sensitive", "tumor", "cells", "grown", "in", "Met", "-", "HPG", "+", "media", "were", "added", "on", "to", "DR5", "-", "KO", "cells", "(", "growing", "in", "regular", "media", ")", ".", "After", "48", "hrs", "flow", "cytometry", "analysis", "was", "carried", "out", "with", "HPG", "catalyzing", "dye", ".", "HPG", "incorporation", "from", "flow", "cytometry", "data", "confirms", "ApoEVs", "transfer", "from", "cells", "growing", "in", "Met", "-", "HPG", "+", "(", "DR5", "-", "WT", ")", "to", "DR5", "-", "KO", "cells", ".", "(", "G", ")", "ApoEVs", "isolated", "from", "DR5", "-", "WT", "OVCAR", "-", "3", "cells", "(", "KMTR2", "treated", ")", "were", "added", "on", "to", "DR5", "-", "KO", "(", "MDA", "-", "MB", "-", "231", ")", "cells", "for", "indicated", "times", "(", "24", "-", "96", "hrs", ")", "to", "analyze", "PD", "-", "L1", "transfer", "kinetics", "from", "ApoEVsafter", "addition", "of", "MDA", "-", "MB", "-", "436", "derived", "ApoEVs", "(", "treated", "with", "combination", "of", "KMTR2", "+", "lexatumumab", "DR5", "agonists", "or", "IgG1", ")", "on", "to", "DR5", "-", "KO", "MDA", "-", "MB", "-", "231", "cells", ",", "total", "lysates", "were", "immunoblotted", "for", "PD", "-", "L1", "after", "24", "hrs", ".", "KMTR2", "+", "lexatumumab", "(", "n", "=", "3", ")", ",", "IgG1", "(", "n", "=", "2", ")", ".", "(", "I", ")", "Left", ":", "PD", "-", "L1", "surface", "histogram", "shows", "direct", "antibody", "treatment", "on", "DR5", "-", "KO", "cells", ".", "Right", ":", "PD", "-", "L1", "surface", "histogram", "from", "DR5", "-", "KO", "cells", "after", "treatment", "(", "24", "hrs", ")", "with", "ApoEVs", "isolated", "from", "DR5", "sensitive", "cells", "after", "either", "Lexa", "or", "KMTR2", "treatment", ".", "ApoEVs", "treated", "tumor", "cells", "were", "analyzed", "in", "PD", "-", "1", "reporter", "co", "-", "culture", "assays", "for", "luciferase", "signal", "(", "K", ")", "MDA", "-", "MB", "-", "436", "cells", "were", "treated", "with", "KMTR2", "for", "6", "hrs", "and", "along", "with", "ZDEVD", "for", "indicated", "times", ".", "-", "ZDEVD", "shows", "final", "time", "of", "KMTR2", "exposure", "to", "cells", "in", "absence", "inhibitor", ".", "Lysates", "were", "immunoblotted", "for", "cleaved", "caspase", "-", "3", ",", "8", ",", "PARP", ",", "PD", "-", "L1", ",", "S5a", ",", "ROCK1", "and", "GAPDH", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "u", ".", "c", ":", "uncleaved", ",", "c", ":", "cleaved", ",", "n", ".", "s", ":", "non", "-", "specific", "band", "(", "L", ")", "Relative", "caspase", "-", "8", "and", "caspase", "-", "3", "activity", "assays", "caspase", "-", "8", "maintained", "steady", "activity", ",", "while", "caspase", "-", "3", "activity", "required", "at", "least", "40", "(", "+", ")", "mins", "of", "DR5", "agonist", "treatment", "without", "ZDEVD", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "M", ")", "After", "indicated", "treatments", "with", "KMTR2", "(", "DR5", "agonist", ")", "and", "ZDEVD", "(", "caspase", "-", "3", "preferred", "inhibitor", ")", ",", "cells", "were", "allowed", "to", "grow", "24", "hrs", ",", "followed", "by", "cell", "viability", "analysis", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3ApoEVs isolated after IgG1 and KMTR2 treatment (OVCAR-3) were blotted against CD63 and PD-L1 in dot blots.ApoEVs isolated after IgG1 and tigatuzumab treatment (MDA-MB-436) were run on western and blotted against CD63 and PD-L1.ApoEVs isolated after IgG1 and lexatumumab (D) treatment (MDA-MB-436) were run on western and blotted against CD63 and PD-L1.(F) ApoEVs isolated from DR5 sensitive tumor cells grown in Met-HPG+ media were added on to DR5-KO cells (growing in regular media). After 48 hrs flow cytometry analysis was carried out with HPG catalyzing dye. HPG incorporation from flow cytometry data confirms ApoEVs transfer from cells growing in Met-HPG+ (DR5-WT) to DR5-KO cells.(G) ApoEVs isolated from DR5-WT OVCAR-3 cells (KMTR2 treated) were added on to DR5-KO (MDA-MB-231) cells for indicated times (24-96 hrs) to analyze PD-L1 transfer kinetics from ApoEVsafter addition of MDA-MB-436 derived ApoEVs (treated with combination of KMTR2+lexatumumab DR5 agonists or IgG1) on to DR5-KO MDA-MB-231 cells, total lysates were immunoblotted for PD-L1 after 24 hrs. KMTR2+lexatumumab (n=3), IgG1 (n=2).(I) Left: PD-L1 surface histogram shows direct antibody treatment on DR5-KO cells. Right: PD-L1 surface histogram from DR5-KO cells after treatment (24 hrs) with ApoEVs isolated from DR5 sensitive cells after either Lexa or KMTR2 treatment.ApoEVs treated tumor cells were analyzed in PD-1 reporter co-culture assays for luciferase signal(K) MDA-MB-436 cells were treated with KMTR2 for 6 hrs and along with ZDEVD for indicated times. - ZDEVD shows final time of KMTR2 exposure to cells in absence inhibitor. Lysates were immunoblotted for cleaved caspase-3, 8, PARP, PD-L1, S5a, ROCK1 and GAPDH (n=3). u.c: uncleaved, c: cleaved, n.s: non-specific band(L) Relative caspase-8 and caspase-3 activity assays caspase-8 maintained steady activity, while caspase-3 activity required at least 40 (+) mins of DR5 agonist treatment without ZDEVD (n=3).(M) After indicated treatments with KMTR2 (DR5 agonist) and ZDEVD (caspase-3 preferred inhibitor) , cells were allowed to grow 24 hrs, followed by cell viability analysis."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", "KMTR2", ",", "KMTR2", "+", "Z", "-", "VAD", "treated", "MDA", "-", "MB", "-", "436", "lysates", "for", "indicated", "early", "time", "points", "were", "analyzed", "for", "caspase", "-", "8", ",", "caspase", "-", "3", ",", "ROCK1", "PARP", "as", "indicated", ".", "B", ")", "lexatumumab", "treated", "OVCAR3", "lysates", "for", "indicated", "early", "time", "points", "were", "analyzed", "for", "caspase", "-", "3", ",", "ROCK1", ",", "pMLC", ",", "PARP", ",", "PD", "-", "L1", "and", "CMTM6", "etc", ".", "as", "indicated", ".", "(", "C", ")", "OVCAR3", "cells", "were", "treated", "with", "pMLC", "activating", "ionophore", "A23187", "(", "positive", "control", ")", "and", "lexatumumab", "±", "ROCK1", "inhibitors", "or", "±", "rDR5", "or", "±", "rFOLR1", ".", "Lysates", "were", "later", "analyzed", "for", "ROCK1", ",", "pMLC", ",", "caspase", "-", "3", "and", "PARP", "with", "GAPDH", "as", "loading", "control", ".", "Blue", "arrows", "indicate", "cleaved", "and", "activated", "ROCK1", "and", "caspase", "-", "3", ".", "(", "D", ")", "MDA", "-", "MB", "-", "436", "and", "OVCAR3", "cells", "were", "treated", "with", "indicated", "ROCK1", "inhibitors", "2", "hours", "prior", "to", "DR5", "agonist", "KMTR2", "treatment", "(", "20nM", ")", ".", "After", "6", "hours", "flow", "cytometry", "was", "used", "to", "analyze", "surface", "PD", "-", "L1", ".", "(", "GSK269", ":", "GSK269962A", ",", "GSK429", ":", "GSK429286A", ")", "(", "E", ")", "MDA", "-", "MB", "-", "436", "cell", "survival", "assay", "after", "treatment", "with", "DR5", "agonist", "antibody", "KMTR2", "±", "ROCK1", "inhibitors", ",", "error", "bars", "indicate", "SD", "(", "n", "=", "2", ")", ".", "(", "GSK269", ":", "GSK269962A", ",", "GSK429", ":", "GSK429286A", ")", "Cultured", "MDA", "-", "MB", "-", "436", "cells", "were", "treated", "with", "KMTR2", "(", "IgG1", "-", "Fc", ")", "or", "IgG1", "control", "±", "ROCK1i", "(", "GSK269962", ")", "for", "6", "hrs", ".", "After", "6", "hrs", ",", "500nM", "anti", "-", "PD", "-", "L1", "avelumab", "(", "IgG4", "-", "Fc", ")", "was", "added", "to", "the", "media", "for", "additional", "1", "hr", ".", "Cellular", "lysates", "were", "pulled", "down", "with", "anti", "-", "hu", "-", "IgG4", "specific", "beads", ".", "(", "G", ")", "Immunoprecipitated", "lysates", "and", "leftover", "supernatant", "after", "various", "treatments", "were", "run", "at", "the", "same", "time", "followed", "by", "blotting", "with", "ROCK1", ",", "PD", "-", "L1", "and", "CMTM6", ".", "Total", "lysates", "as", "a", "control", "were", "also", "generated", "in", "exactly", "similar", "conditions", "and", "run", "next", "to", "supernatant", "and", "IP", "samples", ".", "Blue", "arrows", "indicate", "cleaved", "and", "activated", "ROCK1", ".", "(", "H", ")", "Immunoprecipitation", "assays", "with", "anti", "-", "PD", "-", "L1", "(", "avelumab", ")", "using", "OVCAR", "-", "3", "cell", "lines", ".", "Blue", "arrow", "indicates", "cleaved", "and", "activated", "ROCK1", ".", "(", "J", ")", "Relative", "luciferase", "activity", "ata", "is", "from", "4", "different", "DR5", "agonist", "antibodies", "used", "in", "combination", "of", "two", "different", "ROCK1i", "inhibitors", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "K", ")", "Tumor", "regression", "efficacy", "of", "MD5", "-", "1", "(", "50μg", ")", ",", "GSK269962A", "(", "<", "2mg", "/", "kg", ")", "and", "MD5", "-", "1", "+", "GSK269962A", "(", "50μg", "+", "2mg", "/", "kg", ")", "4T1", "tumors", "(", "n", "=", "4", "-", "7", ")", ".", "6", "-", "8", "weeks", "old", "BALB", "/", "c", "mice", "bearing", "4T1", "tumors", "(", "~", "100mm3", ")", "were", "intraperitoneally", "(", "i", ".", "p", ".", ")", "injected", "with", "50μg", "of", "indicated", "antibody", "every", "third", "day", "(", "n", "=", "4", "-", "6", ")", ".", "GSK269962A", "(", "ROCK1i", ")", "was", "injected", "directly", "into", "the", "tumors", ".", "Tumor", "volumes", "were", "quantified", "at", "indicated", "days", "by", "caliper", "measurements", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A KMTR2, KMTR2+Z-VAD treated MDA-MB-436 lysates for indicated early time points were analyzed for caspase-8, caspase-3, ROCK1 PARP as indicated.B) lexatumumab treated OVCAR3 lysates for indicated early time points were analyzed for caspase-3, ROCK1, pMLC, PARP, PD-L1 and CMTM6 etc. as indicated.(C) OVCAR3 cells were treated with pMLC activating ionophore A23187 (positive control) and lexatumumab ± ROCK1 inhibitors or ± rDR5 or ± rFOLR1. Lysates were later analyzed for ROCK1, pMLC, caspase-3 and PARP with GAPDH as loading control. Blue arrows indicate cleaved and activated ROCK1 and caspase-3.(D) MDA-MB-436 and OVCAR3 cells were treated with indicated ROCK1 inhibitors 2 hours prior to DR5 agonist KMTR2 treatment (20nM). After 6 hours flow cytometry was used to analyze surface PD-L1. (GSK269: GSK269962A, GSK429: GSK429286A)(E) MDA-MB-436 cell survival assay after treatment with DR5 agonist antibody KMTR2 ± ROCK1 inhibitors, error bars indicate SD (n=2). (GSK269: GSK269962A, GSK429: GSK429286A)Cultured MDA-MB-436 cells were treated with KMTR2 (IgG1-Fc) or IgG1 control ± ROCK1i (GSK269962) for 6 hrs. After 6 hrs, 500nM anti-PD-L1 avelumab (IgG4-Fc) was added to the media for additional 1 hr. Cellular lysates were pulled down with anti-hu-IgG4 specific beads. (G) Immunoprecipitated lysates and leftover supernatant after various treatments were run at the same time followed by blotting with ROCK1, PD-L1 and CMTM6. Total lysates as a control were also generated in exactly similar conditions and run next to supernatant and IP samples. Blue arrows indicate cleaved and activated ROCK1.(H) Immunoprecipitation assays with anti-PD-L1 (avelumab) using OVCAR-3 cell lines. Blue arrow indicates cleaved and activated ROCK1.(J) Relative luciferase activity ata is from 4 different DR5 agonist antibodies used in combination of two different ROCK1i inhibitors (n=3).(K) Tumor regression efficacy of MD5-1 (50μg), GSK269962A (<2mg/kg) and MD5-1+ GSK269962A (50μg + 2mg/kg) 4T1 tumors (n=4-7). 6-8 weeks old BALB/c mice bearing 4T1 tumors (~100mm3) were intraperitoneally (i.p.) injected with 50μg of indicated antibody every third day (n=4-6). GSK269962A (ROCK1i) was injected directly into the tumors. Tumor volumes were quantified at indicated days by caliper measurements."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "B", "-", "D", ")", "FACs", "plots", "confirming", "expression", "of", "human", "DR5", "(", "huDR5", ")", "and", "Chi", "-", "G4S", "-", "DR5", "in", "mouse", "4T1", "cells", ".", "Chi", "-", "DR5", "was", "not", "expressed", "on", "cell", "surface", "(", "C", ")", ".", "(", "E", ")", "Cell", "viability", "analysis", "of", "huDR5", "and", "Chi", "-", "G4S", "-", "DR5", "stable", "4T1", "cells", "with", "indicated", "human", "DR5", "agonists", "lexatumumab", "and", "KMTR2", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "F", ")", "Comparison", "of", "tumor", "growth", "of", "grafted", "huDR5", "and", "Chi", "-", "G4S", "-", "DR5", "stable", "4T1", "cells", "in", "Balb", "/", "c", "mice", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "G", ")", "Chi", "-", "G4S", "-", "DR5", "stable", "4T1", "tumors", "(", "after", "reaching", "~", "150", "-", "200mm3", ")", "were", "treated", "with", "4", "doses", "(", "100μg", ")", "of", "IgG1", ",", "lexatumumab", ",", "lexatumumab", "+", "avelumab", "followed", "by", "tumor", "recovery", "and", "surface", "PD", "-", "L1", "analysis", "using", "flow", "cytometry", "(", "H", ")", "Chi", "-", "G4S", "-", "DR5", "stable", "4T1", "tumors", "(", "after", "reaching", "~", "100mm3", ")", "were", "treated", "with", "6", "doses", "of", "indicated", "treatment", ".", "Isolated", "tumors", "were", "imaged", "together", "(", "n", "=", "4", "-", "5", ")", ".", "ROCK1i", "indicates", "GSK269962A", "and", "was", "administered", "to", "animals", "via", "intra", "-", "tumor", "injections", "(", "2mg", "/", "kg", ")", ".", "(", "H", ")", "Chi", "-", "G4S", "-", "DR5", "stable", "4T1", "tumors", "(", "after", "reaching", "~", "100mm3", ")", "were", "treated", "with", "6", "doses", "of", "indicated", "treatment", ".", "ROCK1i", "indicates", "GSK269962A", "and", "was", "administered", "to", "animals", "via", "intra", "-", "tumor", "injections", "(", "2mg", "/", "kg", ")", ".", "average", "tumor", "weight", "is", "shown", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "(", "J", "-", "K", ")", "Confirmation", "of", "selective", "CD8", "+", "T", "cell", "population", "depletion", "in", "mice", "spleen", "and", "grafted", "tumors", "after", "injecting", "animals", "with", "either", "anti", "-", "PD", "-", "L1", "avelumab", "alone", "or", "avelumab", "+", "anti", "-", "CD8a", "antibody", ".", "CD4", "+", "T", "-", "cells", "remained", "unchanged", ".", "(", "L", ")", "Average", "of", "tumor", "weights", "(", "harvested", "at", "same", "time", ")", "from", "mice", "treated", "(", "i", ".", "p", ".", ")", "with", "IgG1", ",", "lexatumumab", ",", "ROCK1i", ",", "lexatumumab", "+", "ROCK1i", "and", "anti", "-", "CD8", "+", "lexatumumab", "+", "ROCK1i", "(", "n", "=", "4", "-", "6", ",", "50μg", "Lexatumumab", ",", "2mg", "/", "kg", "ROCK1i", ",", "6", "doses", ")", ".", "ROCK1i", "indicates", "GSK269962A", "and", "was", "administered", "to", "animals", "via", "intra", "-", "tumor", "injections", ".", "Various", "treatments", "were", "started", "when", "tumors", "were", "~", "100mm3", "size", ".", "(", "M", ")", "Average", "of", "tumor", "weights", "(", "harvested", "at", "same", "time", ")", "from", "mice", "treated", "(", "i", ".", "p", ".", ")", "with", "IgG1", ",", "lexatumumab", ",", "avelumab", ",", "lexatumumab", "+", "avelumab", "and", "anti", "-", "CD8", "+", "lexatumumab", "+", "avelumab", "(", "n", "=", "4", "-", "6", ")", ".", "(", "N", ")", "6", "-", "8", "weeks", "old", "C57BL", "/", "6", "bearing", "Chi", "-", "G4S", "-", "DR5", "expressing", "MC38", "tumors", "were", "intraperitoneally", "(", "i", ".", "p", ".", ")", "injected", "with", "50μg", "of", "indicated", "antibody", "every", "third", "day", "(", "n", "=", "4", "-", "6", ")", ".", "Various", "treatments", "were", "started", "when", "tumors", "were", "~", "100mm3", "size", ".", "Tumor", "volumes", "were", "quantified", "at", "indicated", "days", "by", "caliper", "measurements", ".", "Chi", "-", "G4S", "-", "DR5", "stable", "4T1", "tumors", "(", "after", "reaching", "~", "100mm3", ")", "were", "treated", "with", "6", "doses", "of", "indicated", "treatment", ".", "Isolated", "tumors", "were", "imaged", "together", "(", "n", "=", "4", "-", "5", ")", ".", "ROCK1i", "indicates", "GSK269962A", "and", "was", "administered", "to", "animals", "via", "intra", "-", "tumor", "injections", "(", "2mg", "/", "kg", ")", ".", "(", "O", ")", "KMTR2", "(", "8", "doses", ")", "antibody", "used", "as", "the", "DR5", "agonist", "for", "the", "experiment", ".", "(", "P", ")", "Average", "of", "tumor", "weights", "of", "data", "shown", "in", "(", "O", ")", ".", "(", "Q", ")", "Kaplan", "-", "Meier", "plot", "depicting", "the", "survival", "of", "syngeneic", "Chi", "-", "G4S", "-", "DR5", "4T1", "tumor", "bearing", "animals", "injected", "i", ".", "p", ".", "with", "100μg", "of", "indicated", "antibodies", "such", "as", "IgG1", ",", "KMTR2", "and", "avelumab", ".", "Animals", "were", "injected", "with", "GSK269962A", "2mg", "/", "kg", "(", "in", "PBS", ")", "directly", "into", "tumors", "wherever", "ROCK1i", "is", "indicated", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(B-D) FACs plots confirming expression of human DR5 (huDR5) and Chi-G4S-DR5 in mouse 4T1 cells. Chi-DR5 was not expressed on cell surface (C).(E) Cell viability analysis of huDR5 and Chi-G4S-DR5 stable 4T1 cells with indicated human DR5 agonists lexatumumab and KMTR2 (n=3).(F) Comparison of tumor growth of grafted huDR5 and Chi-G4S-DR5 stable 4T1 cells in Balb/c mice (n=3).(G) Chi-G4S-DR5 stable 4T1 tumors (after reaching ~150-200mm3) were treated with 4 doses (100μg) of IgG1, lexatumumab, lexatumumab +avelumab followed by tumor recovery and surface PD-L1 analysis using flow cytometry(H) Chi-G4S-DR5 stable 4T1 tumors (after reaching ~100mm3) were treated with 6 doses of indicated treatment. Isolated tumors were imaged together (n=4-5). ROCK1i indicates GSK269962A and was administered to animals via intra-tumor injections (2mg/kg).(H) Chi-G4S-DR5 stable 4T1 tumors (after reaching ~100mm3) were treated with 6 doses of indicated treatment. ROCK1i indicates GSK269962A and was administered to animals via intra-tumor injections (2mg/kg). average tumor weight is shown (n=4).(J-K) Confirmation of selective CD8+ T cell population depletion in mice spleen and grafted tumors after injecting animals with either anti-PD-L1 avelumab alone or avelumab+anti-CD8a antibody. CD4+ T-cells remained unchanged.(L) Average of tumor weights (harvested at same time) from mice treated (i.p.) with IgG1, lexatumumab, ROCK1i, lexatumumab + ROCK1i and anti-CD8+ lexatumumab + ROCK1i (n=4-6, 50μg Lexatumumab, 2mg/kg ROCK1i, 6 doses). ROCK1i indicates GSK269962A and was administered to animals via intra-tumor injections. Various treatments were started when tumors were ~100mm3 size.(M) Average of tumor weights (harvested at same time) from mice treated (i.p.) with IgG1, lexatumumab, avelumab, lexatumumab +avelumab and anti-CD8+ lexatumumab +avelumab (n=4-6).(N) 6-8 weeks old C57BL/6 bearing Chi-G4S-DR5 expressing MC38 tumors were intraperitoneally (i.p.) injected with 50μg of indicated antibody every third day (n=4-6). Various treatments were started when tumors were ~100mm3 size. Tumor volumes were quantified at indicated days by caliper measurements.Chi-G4S-DR5 stable 4T1 tumors (after reaching ~100mm3) were treated with 6 doses of indicated treatment. Isolated tumors were imaged together (n=4-5). ROCK1i indicates GSK269962A and was administered to animals via intra-tumor injections (2mg/kg). (O) KMTR2 (8 doses) antibody used as the DR5 agonist for the experiment. (P) Average of tumor weights of data shown in (O). (Q) Kaplan-Meier plot depicting the survival of syngeneic Chi-G4S-DR5 4T1 tumor bearing animals injected i.p. with 100μg of indicated antibodies such as IgG1, KMTR2 and avelumab. Animals were injected with GSK269962A 2mg/kg (in PBS) directly into tumors wherever ROCK1i is indicated."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Chi", "-", "G4S", "-", "DR5", "stable", "4T1", "tumors", "harboring", "mice", "were", "treated", "lexatumumab", ",", "lexatumumab", "+", "ROCK1i", ",", "and", "avelumab", "+", "lexatumumab", "and", "other", "controls", "as", "indicated", ".", "Antibodies", "were", "treated", "i", ".", "p", "at", "100μg", "dose", "(", "6", "total", ")", ",", "ROCK1i", "(", "in", "PBS", ")", "was", "injected", "directly", "into", "tumors", "at", "2mg", "/", "kg", "dose", "(", "6", "total", ")", ".", "Various", "treatments", "were", "started", "when", "tumors", "were", "~", "400mm3", "size", ".", "Harvested", "tumors", "were", "grouped", "together", "and", "sized", "matched", "(", "3", "independent", "sets", ":", "n", "=", "2", "-", "6", "tumors", "in", "each", "set", ")", "followed", "by", "TIL", "isolation", "CD8", "/", "CD45", "and", "CD4", "/", "CD45", "expressing", "cells", "were", "measured", "by", "flow", "cytometry", ".", "(", "B", ")", "Plots", "showing", "%", "of", "total", "double", "positive", "TILs", "(", "CD8", "+", "CD45", "+", "+", "CD4", "+", "CD45", "+", ")", "in", "right", "upper", "quadrant", "after", "combining", "3", "independent", "experiments", ".", "(", "C", ")", "Ratio", "of", "CD8", "+", "CD45", "+", "/", "CD4", "+", "CD45", "+", "isolated", "TILs", "from", "tumors", "in", "each", "indicated", "treatment", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Chi", "-", "G4S", "-", "DR5", "stable", "MC38", "tumors", "harboring", "mice", "were", "treated", "(", "6", "total", "doses", ")", "lexatumumab", ",", "avelumab", ",", "ROCK1i", ",", "lexatumumab", "+", "ROCKi", ",", "and", "avelumab", "+", "lexatumumab", "and", "IgG1", "control", "as", "indicated", ".", "Harvested", "tumors", "homogenized", "followed", "by", "quantitation", ".", "Protein", "lysates", "were", "run", "on", "SDS", "-", "Page", "followed", "by", "immunoblotting", "using", "indicated", "CD8", ",", "CD4", ",", "Foxp3", ",", "caspase", "-", "3", "and", "granzyme", "-", "b", "antibody", ".", "GAPDH", "is", "loading", "control", ".", "Red", "arrows", "indicated", "cleaved", "caspase", "-", "3", "p19", "and", "p17", "fragments", ".", "(", "H", ")", "Cell", "killing", "assay", "of", "4T1", "cells", "treated", "with", "murine", "DR5", "agonist", "MD5", "-", "1", "and", "bispecific", "avelu", "-", "MD5", "antibody", ".", "(", "I", ")", "Balb", "/", "c", "mice", "harboring", "luciferase", "stable", "4T1", "tumors", "were", "i", ".", "p", ".", "injected", "with", "indicated", "antibodies", ".", "50μg", "dose", "and", "mice", "were", "imaged", "after", "5", "doses", ".", "(", "J", ")", "6", "-", "8", "weeks", "old", "C57BL", "/", "6", "mice", "bearing", "MC38", "tumors", "were", "intraperitoneally", "(", "i", ".", "p", ".", ")", "injected", "with", "50μg", "of", "indicated", "antibody", "every", "third", "day", "(", "n", "=", "4", "-", "6", ")", ".", "Indicated", "treatments", "were", "started", "when", "tumors", "were", "~", "100mm3", "size", ".", "Tumor", "volumes", "were", "quantified", "at", "indicated", "days", "by", "caliper", "measurements", ".", "(", "K", ")", "~", "150", "-", "200mm3", "size", "MC38", "tumor", "bearing", "C57LB", "/", "6", "mice", "were", "treated", "with", "indicated", "MD5", "-", "1", ",", "avelumab", "and", "bispecific", "antibodies", "along", "with", "control", "IgG1", ",", "6", "total", "doses", ".", "Harvested", "tumors", "were", "homogenized", "followed", "by", "quantitation", ".", "Protein", "lysates", "were", "run", "on", "SDS", "-", "Page", "followed", "by", "immunoblotting", "using", "indicated", "CD8", ",", "CD4", ",", "caspase", "-", "3", "and", "granzyme", "-", "b", "antibody", ".", "GAPDH", "is", "loading", "control", ".", "Red", "arrows", "indicated", "cleaved", "caspase", "-", "3", "p19", "and", "p17", "fragments", ".", "(", "L", ")", "6", "-", "8", "weeks", "old", "C57BL", "/", "6", "mice", "were", "injected", "with", "MC38", "cells", ".", "When", "tumors", "reached", "~", "150", "-", "200mm3", ",", "animals", "were", "intraperitoneally", "(", "i", ".", "p", ".", ")", "injected", "with", "50μg", "of", "indicated", "antibody", "every", "third", "day", ".", "On", "day", "18", ",", "tumors", "were", "harvested", ",", "sized", "matched", "and", "pooled", "by", "treatment", "group", ",", "exposed", "to", "collagenase", "/", "DNase", "and", "were", "single", "cell", "suspensions", "enriched", "for", "CD8", "+", "cells", ".", "Enriched", "CD8", "+", "T", "-", "cells", "from", "various", "treatments", "were", "restimulated", "with", "anti", "-", "CD3", "(", "OKT3", ")", "antibody", "for", "4", "additional", "hours", ".", "CD8", "gated", "cells", "were", "next", "analyzed", "for", "IFN", "-", "γ", "intracellular", "expression", "using", "flow", "cytometry", ".", "(", "M", ")", "Percentage", "of", "IFN", "-", "γ", "+", "CD8", "+", "double", "positive", "cells", "from", "3", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Chi-G4S-DR5 stable 4T1 tumors harboring mice were treated lexatumumab, lexatumumab +ROCK1i, and avelumab + lexatumumab and other controls as indicated. Antibodies were treated i.p at 100μg dose (6 total), ROCK1i (in PBS) was injected directly into tumors at 2mg/kg dose (6 total). Various treatments were started when tumors were ~400mm3 size. Harvested tumors were grouped together and sized matched (3 independent sets: n=2-6 tumors in each set) followed by TIL isolation CD8/CD45 and CD4/CD45 expressing cells were measured by flow cytometry.(B) Plots showing % of total double positive TILs (CD8+CD45+ + CD4+CD45+) in right upper quadrant after combining 3 independent experiments. (C) Ratio of CD8+CD45+/CD4+CD45+ isolated TILs from tumors in each indicated treatment (n=3).Chi-G4S-DR5 stable MC38 tumors harboring mice were treated (6 total doses) lexatumumab, avelumab, ROCK1i, lexatumumab +ROCKi, and avelumab + lexatumumab and IgG1 control as indicated. Harvested tumors homogenized followed by quantitation. Protein lysates were run on SDS-Page followed by immunoblotting using indicated CD8, CD4, Foxp3, caspase-3 and granzyme-b antibody. GAPDH is loading control. Red arrows indicated cleaved caspase-3 p19 and p17 fragments.(H) Cell killing assay of 4T1 cells treated with murine DR5 agonist MD5-1 and bispecific avelu-MD5 antibody.(I) Balb/c mice harboring luciferase stable 4T1 tumors were i.p. injected with indicated antibodies. 50μg dose and mice were imaged after 5 doses.(J) 6-8 weeks old C57BL/6 mice bearing MC38 tumors were intraperitoneally (i.p.) injected with 50μg of indicated antibody every third day (n=4-6). Indicated treatments were started when tumors were ~100mm3 size. Tumor volumes were quantified at indicated days by caliper measurements.(K) ~150-200mm3 size MC38 tumor bearing C57LB/6 mice were treated with indicated MD5-1, avelumab and bispecific antibodies along with control IgG1, 6 total doses. Harvested tumors were homogenized followed by quantitation. Protein lysates were run on SDS-Page followed by immunoblotting using indicated CD8, CD4, caspase-3 and granzyme-b antibody. GAPDH is loading control. Red arrows indicated cleaved caspase-3 p19 and p17 fragments.(L) 6-8 weeks old C57BL/6 mice were injected with MC38 cells. When tumors reached ~150-200mm3, animals were intraperitoneally (i.p.) injected with 50μg of indicated antibody every third day. On day 18, tumors were harvested, sized matched and pooled by treatment group, exposed to collagenase/DNase and were single cell suspensions enriched for CD8+ cells. Enriched CD8+ T-cells from various treatments were restimulated with anti-CD3 (OKT3) antibody for 4 additional hours. CD8 gated cells were next analyzed for IFN-γ intracellular expression using flow cytometry.(M) Percentage of IFN-γ+CD8+ double positive cells from 3 independent experiments."}
{"words": ["Figure", "1Median", "CSF", "protein", "abundance", "distribution", "as", "calculated", "from", "MS", "-", "intensities", "of", "quantified", "peptides", "of", "each", "protein", ".", "The", "top", "ten", "most", "abundant", "proteins", "and", "hemoglobin", "proteins", "are", "highlighted", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Median CSF protein abundance distribution as calculated from MS-intensities of quantified peptides of each protein. The top ten most abundant proteins and hemoglobin proteins are highlighted."}
{"words": ["Figure", "2", "A", "-", "C", "Protein", "AD", "/", "non", "-", "AD", "fold", "changes", "plotted", "vs", "statistical", "significance", "for", "Sweden", "(", "A", ")", ",", "Magdeburg", "/", "Kiel", "(", "B", ")", ",", "and", "Berlin", "(", "C", ")", "cohort", ".", "Proteins", "associated", "with", "the", "GO", "annotation", "neuron", "projection", "labelled", "in", "orange", ".", "Proteins", "above", "the", "dashed", "green", "line", "are", "statistically", "significant", "(", "p", "<", "0", ".", "05", ")", "and", "those", "above", "the", "black", "curves", "have", "a", "q", "-", "value", "below", "0", ".", "05"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2 A-C Protein AD/non-AD fold changes plotted vs statistical significance for Sweden (A), Magdeburg/Kiel (B), and Berlin (C) cohort. Proteins associated with the GO annotation neuron projection labelled in orange. Proteins above the dashed green line are statistically significant (p < 0.05) and those above the black curves have a q-value below 0.05 "}
{"words": ["Figure", "3Correlation", "of", "protein", "AD", "/", "non", "-", "AD", "fold", "changes", "in", "pairwise", "combinations", "of", "two", "cohorts", "each", ".", "Combinations", "are", "Sweden", "vs", "Magdeburg", "/", "Kiel", "Proteins", "included", "differ", "significantly", "(", "p", "<", "0", ".", "05", ")", "and", "consistently", "in", "abundance", "by", "AD", "status", "in", "both", "cohorts", "each", ".", "Correlation", "of", "protein", "AD", "/", "non", "-", "AD", "fold", "changes", "in", "pairwise", "combinations", "of", "two", "cohorts", "each", ".", "Combinations", "are", "Sweden", "vs", "Berlin", "(", "D", ")", ",", "and", "Magdeburg", "/", "Kiel", "vs", "Berlin", "(", "E", ")", ".", "Proteins", "included", "differ", "significantly", "(", "p", "<", "0", ".", "05", ")", "and", "consistently", "in", "abundance", "by", "AD", "status", "in", "both", "cohorts", "each", ".", "Proteins", "that", "differ", "significantly", "(", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", "in", "E", ";", "q", "-", "value", "<", "0", ".", "05", "in", "F", ")", "in", "abundance", "by", "AD", "status", "across", "all", "three", "cohorts", ".", "Z", "-", "scored", "abundances", "of", "proteins", "in", "the", "AD", "and", "non", "-", "AD", "groups", "of", "all", "cohorts", "shown", "by", "the", "heat", "map", "Hierarchical", "clustering", "separates", "AD", "from", "non", "-", "AD", "groups", ".", "Pyruvat", "kinase", "PKM", "(", "PKM", ")", "was", "quantified", "in", "two", "isoforms", "and", "UniProt", "IDs", "are", "given", "in", "parenthesis", ".", "Black", "frames", "highlight", "proteins", "with", "consistent", "AD", "/", "non", "-", "AD", "fold", "changes", "across", "cohorts", ".", "Proteins", "that", "differ", "significantly", "(", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "05", "in", "E", ";", "q", "-", "value", "<", "0", ".", "05", "in", "F", ")", "in", "abundance", "by", "AD", "status", "across", "all", "three", "cohorts", ".", "Z", "-", "scored", "abundances", "of", "proteins", "in", "the", "AD", "and", "non", "-", "AD", "groups", "of", "all", "cohorts", "shown", "by", "the", "heat", "map", "Hierarchical", "clustering", "separates", "AD", "from", "non", "-", "AD", "groups", ".", "Pyruvat", "kinase", "PKM", "(", "PKM", ")", "was", "quantified", "in", "two", "isoforms", "and", "UniProt", "IDs", "are", "given", "in", "parenthesis", ".", "Black", "frames", "highlight", "proteins", "with", "consistent", "AD", "/", "non", "-", "AD", "fold", "changes", "across", "cohorts", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Correlation of protein AD/non-AD fold changes in pairwise combinations of two cohorts each. Combinations are Sweden vs Magdeburg/Kiel Proteins included differ significantly (p < 0.05) and consistently in abundance by AD status in both cohorts each. Correlation of protein AD/non-AD fold changes in pairwise combinations of two cohorts each. Combinations are Sweden vs Berlin (D), and Magdeburg/Kiel vs Berlin (E). Proteins included differ significantly (p < 0.05) and consistently in abundance by AD status in both cohorts each. Proteins that differ significantly (p-value < 0.05 in E; q-value < 0.05 in F) in abundance by AD status across all three cohorts. Z-scored abundances of proteins in the AD and non-AD groups of all cohorts shown by the heat map Hierarchical clustering separates AD from non-AD groups. Pyruvat kinase PKM (PKM) was quantified in two isoforms and UniProt IDs are given in parenthesis. Black frames highlight proteins with consistent AD/non-AD fold changes across cohorts.Proteins that differ significantly (p-value < 0.05 in E; q-value < 0.05 in F) in abundance by AD status across all three cohorts. Z-scored abundances of proteins in the AD and non-AD groups of all cohorts shown by the heat map Hierarchical clustering separates AD from non-AD groups. Pyruvat kinase PKM (PKM) was quantified in two isoforms and UniProt IDs are given in parenthesis. Black frames highlight proteins with consistent AD/non-AD fold changes across cohorts."}
{"words": ["Figure", "4", "A", "-", "C", ")", "Correlation", "of", "proteins", "with", "ELISA", "-", "measured", "t", "-", "tau", "concentration", "across", "samples", "within", "the", "Sweden", "(", "A", ")", ",", "Magdeburg", "(", "B", ")", "and", "Berlin", "(", "C", ")", "cohorts", ".", "Proteins", "with", "a", "q", "-", "value", "below", "0", ".", "05", "are", "labeled", "in", "yellow", ".", "Proteins", "of", "the", "40", "protein", "signature", "are", "colored", "in", "red", "for", "those", "with", "higher", "abundance", "in", "AD", "CSF", "and", "in", "blue", "for", "those", "with", "higher", "abundance", "in", "non", "-", "AD", "CSF", ".", "D", ")", "Three", "cohort", "summary", "of", "proteins", "significantly", "correlating", "with", "ELISA", "-", "measured", "t", "-", "tau", ".", "Protein", "names", "given", "for", "the", "29", "proteins", "out", "of", "the", "40", "protein", "signature", "with", "significant", "(", "p", "<", "0", ".", "05", ")", "correlation", "in", "each", "of", "the", "three", "cohorts", ".", "Pyruvat", "kinase", "PKM", "(", "PKM", ")", "was", "quantified", "in", "two", "isoforms", "and", "UniProt", "IDs", "are", "given", "in", "parenthesis", ".", "Protein", "abundance", "distribution", "of", "CSF", "showing", "the", "abundances", "of", "AD", "-", "modulated", "CSF", "proteins", ".", "Proteins", "of", "our", "40", "protein", "signature", "are", "highlighted", "in", "red", "(", "elevated", "abundance", "in", "AD", ")", "and", "blue", "(", "elevated", "abundance", "in", "non", "-", "AD", ")", ".", "Proteins", "linked", "to", "glucose", "metabolism", "are", "highlighted", "in", "purple", "and", "labelled", ".", "Protein", "abundance", "distribution", "of", "brain", "showing", "the", "abundances", "of", "AD", "-", "modulated", "CSF", "proteins", ".", "Proteins", "of", "our", "40", "protein", "signature", "are", "highlighted", "in", "red", "(", "elevated", "abundance", "in", "AD", ")", "and", "blue", "(", "elevated", "abundance", "in", "non", "-", "AD", ")", ".", "Proteins", "linked", "to", "glucose", "metabolism", "are", "highlighted", "in", "purple", "and", "labelled", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4 A-C) Correlation of proteins with ELISA-measured t-tau concentration across samples within the Sweden (A), Magdeburg (B) and Berlin (C) cohorts. Proteins with a q-value below 0.05 are labeled in yellow. Proteins of the 40 protein signature are colored in red for those with higher abundance in AD CSF and in blue for those with higher abundance in non-AD CSF.  D) Three cohort summary of proteins significantly correlating with ELISA-measured t-tau. Protein names given for the 29 proteins out of the 40 protein signature with significant (p < 0.05) correlation in each of the three cohorts. Pyruvat kinase PKM (PKM) was quantified in two isoforms and UniProt IDs are given in parenthesis.  Protein abundance distribution of CSF showing the abundances of AD-modulated CSF proteins. Proteins of our 40 protein signature are highlighted in red (elevated abundance in AD) and blue (elevated abundance in non-AD). Proteins linked to glucose metabolism are highlighted in purple and labelled.  Protein abundance distribution of brain showing the abundances of AD-modulated CSF proteins. Proteins of our 40 protein signature are highlighted in red (elevated abundance in AD) and blue (elevated abundance in non-AD). Proteins linked to glucose metabolism are highlighted in purple and labelled. "}
{"words": ["Figure", "2Circular", "representation", "of", "DNA", "methylation", "levels", "for", "mothers", "(", "outer", "circle", ")", "and", "children", "(", "inner", "circle", ")", ".", "The", "height", "of", "each", "bar", "indicates", "the", "methylation", "change", "between", "the", "smoking", "and", "non", "‐", "smoking", "group", "(", "dark", "hue", ":", "hypermethylation", ",", "light", "hue", ":", "hypomethylation", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Circular representation of DNA methylation levels for mothers (outer circle) and children (inner circle). The height of each bar indicates the methylation change between the smoking and non‐smoking group (dark hue: hypermethylation, light hue: hypomethylation)."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Endogenous", "FAM134B", "forms", "oligomers", ".", "FAM134B", "knockout", "(", "KO", ")", "or", "wild", "type", "(", "WT", ")", "293T", "cells", "were", "treated", "with", "1μM", "of", "Thapsigargin", "(", "Tg", ")", "for", "different", "time", "and", "the", "cell", "lysates", "were", "prepared", "and", "analyzed", "by", "Western", "-", "blot", ".", "(", "B", ")", "Analysis", "the", "oligomer", "size", "of", "recombinant", "FAM134B", "WT", "using", "Native", "PAGE", ".", "(", "C", ")", "In", "vitro", "liposome", "fragmentation", "assay", ".", "After", "the", "injection", "of", "recombinant", "proteins", "(", "100μg", "/", "100μl", ")", "into", "the", "chamber", "(", "500μl", ")", ",", "the", "morphological", "changes", "of", "liposomes", "were", "monitored", "by", "live", "imaging", "for", "20", "min", ".", "The", "images", "at", "different", "time", "points", "as", "indicated", "are", "presented", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "\"", "ns", "\"", "means", "no", "significance", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "error", "bars", "indicate", "SEM", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "D", ")", "Quantification", "of", "the", "time", "between", "protein", "addition", "and", "liposome", "fragmentation", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "error", "bars", "indicate", "SEM", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "E", ",", "F", ")", "Measurement", "of", "the", "intracellular", "ER", "-", "scission", "activity", ".", "U2OS", "cells", "transiently", "expressing", "EGFP", "-", "FAM134B", "(", "WT", ")", ",", "EGFP", "-", "FAM134B", "(", "84", "-", "233", ")", "or", "EGFP", "-", "FAM134B", "(", "Δ84", "-", "233", ")", "at", "same", "levels", ",", "lysosomal", "degradation", "of", "EGFP", "-", "FAM134B", "was", "blocked", "by", "Bafilomycin", "A1", "(", "Baf", "A1", ")", "or", "DMSO", ".", "GFP", "-", "positive", "puncta", "were", "quantified", "for", "each", "cell", "in", "(", "F", ")", ".", "For", "Each", "group", ",", "at", "least", "30", "cells", "were", "counted", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "\"", "ns", "\"", "means", "no", "significance", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "error", "bars", "indicate", "SEM", ".", "(", "G", ",", "H", ")", "Measurement", "of", "the", "ER", "-", "phagy", "activity", ".", "U2OS", "cells", "transiently", "expressing", "mCherry", "-", "EGFP", "-", "FAM134B", "(", "WT", ")", ",", "mCherry", "-", "EGFP", "-", "FAM134B", "(", "84", "-", "233", ")", "or", "mCherry", "-", "EGFP", "-", "FAM134B", "(", "Δ84", "-", "233", ")", "at", "same", "levels", ".", "ER", "-", "phagy", "is", "indicated", "by", "mCherry", "-", "positive", "but", "EGFP", "-", "negative", "puncta", "were", "quantified", "for", "each", "cell", "in", "(", "H", ")", ".", "For", "mCherry", "-", "EGFP", "-", "FAM134B", "(", "WT", ")", ",", "50", "cells", "were", "counted", "(", "n", "=", "50", ")", ";", "for", "mCherry", "-", "EGFP", "-", "FAM134B", "(", "84", "-", "233", ")", ",", "n", "=", "56", ";", "for", "mCherry", "-", "EGFP", "-", "FAM134B", "(", "Δ84", "-", "233", ")", ",", "n", "=", "66", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "The", "scale", "bars", "in", "the", "magnification", "boxes", "are", "2μm", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "error", "bars", "indicate", "SEM", ".", "(", "I", ")", "Lysosomal", "cleavage", "of", "GFP", "was", "analyzed", "by", "Western", "blot", "for", "the", "cells", "co", "-", "expressing", "GFP", "-", "SEC61B", "and", "FAM134B", "WT", "-", "Flag", ",", "FAM134B", "(", "84", "-", "233", ")", "-", "Flag", "or", "FAM134B", "(", "Δ84", "-", "233", ")", "-", "Flag", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Endogenous FAM134B forms oligomers. FAM134B knockout (KO) or wild type (WT) 293T cells were treated with 1μM of Thapsigargin (Tg) for different time and the cell lysates were prepared and analyzed by Western-blot.(B) Analysis the oligomer size of recombinant FAM134B WT using Native PAGE.(C) In vitro liposome fragmentation assay. After the injection of recombinant proteins (100μg/100μl) into the chamber (500μl), the morphological changes of liposomes were monitored by live imaging for 20 min. The images at different time points as indicated are presented. Scale bars, 10 μm. \"ns\" means no significance, one-way ANOVA, error bars indicate SEM (n=3).(D) Quantification of the time between protein addition and liposome fragmentation. ***P<0.001, one-way ANOVA, error bars indicate SEM (n=3).(E, F) Measurement of the intracellular ER-scission activity. U2OS cells transiently expressing EGFP-FAM134B (WT), EGFP-FAM134B (84-233) or EGFP-FAM134B (Δ84-233) at same levels, lysosomal degradation of EGFP-FAM134B was blocked by Bafilomycin A1 (Baf A1) or DMSO. GFP-positive puncta were quantified for each cell in (F). For Each group, at least 30 cells were counted. Scale bars, 10 μm. ***P<0.001, \"ns\" means no significance, one-way ANOVA, error bars indicate SEM.(G, H) Measurement of the ER-phagy activity. U2OS cells transiently expressing mCherry-EGFP-FAM134B (WT), mCherry-EGFP-FAM134B (84-233) or mCherry-EGFP-FAM134B (Δ84-233) at same levels. ER-phagy is indicated by mCherry-positive but EGFP-negative puncta were quantified for each cell in (H). For mCherry-EGFP-FAM134B (WT), 50 cells were counted (n=50); for mCherry-EGFP-FAM134B (84-233), n=56; for mCherry-EGFP-FAM134B (Δ84-233), n=66. Scale bars, 10 μm. The scale bars in the magnification boxes are 2μm. ***P<0.001, one-way ANOVA, error bars indicate SEM.(I) Lysosomal cleavage of GFP was analyzed by Western blot for the cells co-expressing GFP-SEC61B and FAM134B WT-Flag, FAM134B (84-233)-Flag or FAM134B (Δ84-233)-Flag."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "Mass", "spectrometry", "analysis", "uncovered", "that", "FAM134B", "was", "phosphorylated", "at", "serine", "151", ".", "(", "B", ")", "Comparison", "of", "the", "self", "-", "interaction", "of", "FAM134B", "mono", "-", "phosphorylation", "mutants", "using", "co", "-", "IP", ".", "(", "C", ")", "Comparison", "of", "the", "self", "-", "interaction", "of", "FAM134", "tri", "-", "phosphorylation", "mutants", "using", "co", "-", "IP", ".", "(", "D", ")", "Comparison", "of", "membrane", "scission", "activity", "using", "in", "vitro", "liposome", "fragmentation", "assay", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "error", "bars", "indicate", "SEM", "(", "n", "≧", "3", ")", ".", "(", "E", ")", "Lysosomal", "cleavage", "of", "GFP", "was", "analyzed", "by", "Western", "blot", "for", "the", "cells", "co", "-", "expressing", "GFP", "-", "SEC61B", "and", "FAM134B", "(", "WT", ")", "-", "Flag", ",", "FAM134B", "(", "SA", ")", "-", "Flag", "or", "FAM134B", "(", "SD", ")", "-", "Flag", ".", "(", "F", ",", "G", ")", "Measurement", "of", "the", "intracellular", "ER", "-", "scission", "activity", ".", "FAM134B", "knockout", "(", "KO", ")", "U2OS", "cells", "was", "engineered", "to", "express", "EGFP", "-", "FAM134B", "(", "WT", ")", ",", "EGFP", "-", "FAM134B", "(", "SA", ")", "or", "EGFP", "-", "FAM134B", "(", "SD", ")", "at", "endogenous", "levels", ",", "lysosomal", "degradation", "of", "EGFP", "-", "FAM134B", "was", "blocked", "by", "Bafilomycin", "A1", "(", "Baf", "A1", ")", ".", "GFP", "-", "positive", "puncta", "were", "quantified", "for", "each", "cell", "in", "(", "G", ")", ".", "For", "control", ",", "25", "cells", "were", "counted", "(", "n", "=", "25", ")", ";", "For", "EGFP", "-", "FAM134B", "(", "WT", ")", ",", "n", "=", "27", ";", "for", "EGFP", "-", "FAM134B", "(", "SA", ")", ",", "n", "=", "29", ";", "for", "EGFP", "-", "FAM134B", "(", "SD", ")", ",", "n", "=", "25", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "error", "bars", "indicate", "SEM", ".", "(", "H", ",", "I", ")", "Measurement", "of", "the", "ER", "-", "phagy", "activity", ".", "FAM134B", "knockout", "(", "KO", ")", "U2OS", "cells", "was", "engineered", "to", "express", "mCherry", "-", "EGFP", "-", "FAM134B", "(", "WT", ")", ",", "mCherry", "-", "EGFP", "-", "FAM134B", "(", "S151A", ")", "or", "mCherry", "-", "EGFP", "-", "FAM134B", "(", "S151D", ")", "at", "endogenous", "levels", ".", "Lysosomal", "mCherry", "-", "positive", "but", "GFP", "-", "negative", "puncta", "were", "quantified", "for", "each", "cell", "in", "(", "I", ")", ".", "For", "mCherry", "-", "EGFP", "-", "FAM134B", "(", "WT", ")", ",", "25", "cells", "were", "counted", "(", "n", "=", "25", ")", ";", "for", "mCherry", "-", "EGFP", "-", "FAM134B", "(", "SA", ")", ",", "n", "=", "23", ";", "for", "mCherry", "-", "EGFP", "-", "FAM134B", "(", "SD", ")", ",", "n", "=", "21", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "The", "scale", "bars", "in", "the", "magnification", "boxes", "are", "2", "μm", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "error", "bars", "indicate", "SEM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) Mass spectrometry analysis uncovered that FAM134B was phosphorylated at serine 151.(B) Comparison of the self-interaction of FAM134B mono-phosphorylation mutants using co-IP.(C) Comparison of the self-interaction of FAM134 tri-phosphorylation mutants using co-IP.(D) Comparison of membrane scission activity using in vitro liposome fragmentation assay. Scale bars, 10 μm. ***P<0.001, one-way ANOVA, error bars indicate SEM (n≧3).(E) Lysosomal cleavage of GFP was analyzed by Western blot for the cells co-expressing GFP-SEC61B and FAM134B (WT)-Flag, FAM134B (SA)-Flag or FAM134B (SD)-Flag.(F, G) Measurement of the intracellular ER-scission activity. FAM134B knockout (KO) U2OS cells was engineered to express EGFP-FAM134B (WT), EGFP-FAM134B (SA) or EGFP-FAM134B (SD) at endogenous levels, lysosomal degradation of EGFP-FAM134B was blocked by Bafilomycin A1 (Baf A1). GFP-positive puncta were quantified for each cell in (G). For control, 25 cells were counted (n=25); For EGFP-FAM134B (WT), n=27; for EGFP-FAM134B (SA), n=29; for EGFP-FAM134B (SD), n=25. Scale bars, 10 μm. ***P<0.001, one-way ANOVA, error bars indicate SEM.(H, I) Measurement of the ER-phagy activity. FAM134B knockout (KO) U2OS cells was engineered to express mCherry-EGFP-FAM134B (WT), mCherry-EGFP-FAM134B (S151A) or mCherry-EGFP-FAM134B (S151D) at endogenous levels. Lysosomal mCherry-positive but GFP-negative puncta were quantified for each cell in (I). For mCherry-EGFP-FAM134B (WT), 25 cells were counted (n=25); for mCherry-EGFP-FAM134B (SA), n=23; for mCherry-EGFP-FAM134B (SD), n=21. Scale bars, 10 μm. The scale bars in the magnification boxes are 2 μm. ***P<0.001, one-way ANOVA, error bars indicate SEM."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", ",", "B", ")", "Endogenous", "CAMK2B", "redistribution", "to", "ER", "membrane", "structures", "labeled", "by", "mCherry", "-", "FAM134B", "and", "BAP31", "upon", "Tg", "treatment", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "The", "scale", "bars", "in", "the", "magnification", "boxes", "are", "2", "μm", ".", "The", "colocalization", "was", "analyzed", "by", "Pearson", "'", "s", "correlation", "coefficient", "(", "PCC", ")", "in", "(", "B", ")", ".", "For", "Ctrl", ",", "16", "cells", "were", "counted", "(", "n", "=", "16", ")", ";", "for", "Tg", "treatment", ",", "18", "cells", "were", "counted", "(", "n", "=", "18", ")", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "error", "bars", "indicate", "SEM", ".", "(", "C", ")", "In", "vitro", "FAM134B", "S151", "phosphorylation", "by", "CAMK2B", "was", "detected", "by", "Western", "blot", ".", "Recombinant", "proteins", "for", "FAM134BWT", "and", "FAM134BS151A", "were", "purified", "from", "E", ".", "coil", "were", "incubated", "with", "purified", "CAMK2B", "by", "IP", "in", "kinase", "buffer", ".", "FAM134B", "phosphorylation", "was", "analyzed", "by", "a", "specific", "antibody", "recognizing", "phos", "-", "Serine151", "of", "human", "FAM134B", ".", "(", "D", ")", "FAM134B", "S151", "phosphorylation", "in", "cells", "treated", "with", "CAMK2", "activator", "(", "100nM", "EB1089", "for", "1h", ")", "or", "/", "and", "inhibitor", "(", "10μM", "KN93", "for", "2h", ")", ".", "293T", "or", "SKN", "-", "SH", "(", "a", "cell", "line", "derived", "from", "neuroblastoma", ")", "cells", "were", "treated", "with", "drugs", "as", "indicated", ",", "whole", "cell", "lysates", "were", "analyzed", "by", "phospho", "-", "FAM134B", "(", "S151", ")", "antibody", ".", "(", "E", ")", "FAM134B", "S151", "phosphorylation", "in", "CAMK2B", "knockdown", "293T", "cells", ".", "(", "F", ")", "In", "vitro", "reconstitution", "of", "CAMK2B", "-", "FAM134B", "-", "mediated", "membrane", "fragmentation", "using", "liposome", "assay", ".", "Purified", "recombinant", "FAM134B", "and", "CAMK2B", "were", "preincubated", "in", "kinase", "buffer", "with", "ADP", "or", "ATP", "at", "30", "°", "C", "for", "10min", ",", "the", "resultant", "protein", "mixtures", "were", "transferred", "to", "chamber", "coated", "with", "liposomes", ".", "Liposome", "fragmentation", "was", "monitored", "by", "live", "imaging", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "error", "bars", "indicate", "SEM", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "(", "G", ",", "H", ")", "Measurement", "of", "the", "ER", "-", "phagy", "activity", ".", "U2OS", "cells", "transiently", "expressing", "mCherry", "-", "EGFP", "-", "FAM134B", "(", "WT", ")", "were", "treated", "with", "compounds", "as", "indicated", ".", "Lysosomal", "mCherry", "-", "positive", "but", "GFP", "-", "negative", "puncta", "were", "quantified", "for", "each", "cell", "in", "(", "H", ")", ".", "For", "vehicle", "control", ",", "53", "cells", "were", "counted", "(", "n", "=", "53", ")", ",", "for", "Ionomycin", ",", "n", "=", "56", ";", "for", "EB1089", ",", "n", "=", "54", ";", "for", "KN", "-", "93", ",", "n", "=", "58", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "The", "scale", "bars", "in", "the", "magnification", "boxes", "are", "2", "μm", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "error", "bars", "indicate", "SEM", ".", "(", "I", ")", "FAM134B", "WT", "or", "knockout", "(", "KO", ")", "U2OS", "cells", "were", "treated", "with", "CAMK2", "activator", "Ionomycin", "(", "Iono", ")", ",", "EB1089", "or", "inhibitor", "KN93", "for", "24", "hours", ",", "Western", "-", "blot", "was", "performed", "to", "analyze", "the", "proteins", "as", "indicated", ".", "(", "J", ")", "CAMK2B", "WT", "or", "knockdown", "(", "KD", ")", "U2OS", "cells", "were", "treated", "with", "1", "μM", "Thapsigargin", "(", "Tg", ")", "to", "induce", "ER", "stress", "for", "different", "time", "as", "indicated", ".", "Cells", "were", "collected", "and", "analyzed", "for", "proteins", "as", "indicated", "by", "Western", "blot", ".", "(", "K", ")", "GFP", "-", "cleavage", "assay", ".", "CAMK2B", "WT", "or", "knockdown", "(", "KD", ")", "U2OS", "cells", "were", "co", "-", "transfected", "with", "FAM134B", "-", "Flag", "and", "GFP", "-", "SEC61B", ",", "24", "hours", "post", "transfection", ",", "cells", "were", "treated", "with", "drugs", "as", "indicated", "and", "analyzed", "for", "GFP", "-", "cleavage", "by", "Western", "blot", ".", "Note", ":", "the", "levels", "of", "Flag", "-", "FAM134B", ",", "CAMK2B", ",", "GFP", "-", "SEC61B", "and", "Tubulin", "were", "analyzed", "by", "Western", "blot", "using", "different", "membranes", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A, B) Endogenous CAMK2B redistribution to ER membrane structures labeled by mCherry-FAM134B and BAP31 upon Tg treatment. Scale bars, 10 μm. The scale bars in the magnification boxes are 2 μm. The colocalization was analyzed by Pearson's correlation coefficient (PCC) in (B). For Ctrl, 16 cells were counted(n=16); for Tg treatment, 18 cells were counted (n=18). ***P<0.001, one-way ANOVA, error bars indicate SEM.(C) In vitro FAM134B S151 phosphorylation by CAMK2B was detected by Western blot. Recombinant proteins for FAM134BWT and FAM134BS151A were purified from E. coil were incubated with purified CAMK2B by IP in kinase buffer. FAM134B phosphorylation was analyzed by a specific antibody recognizing phos-Serine151 of human FAM134B.(D) FAM134B S151 phosphorylation in cells treated with CAMK2 activator (100nM EB1089 for 1h) or/and inhibitor (10μM KN93 for 2h). 293T or SKN-SH (a cell line derived from neuroblastoma) cells were treated with drugs as indicated, whole cell lysates were analyzed by phospho-FAM134B (S151) antibody.(E) FAM134B S151 phosphorylation in CAMK2B knockdown 293T cells.(F) In vitro reconstitution of CAMK2B-FAM134B-mediated membrane fragmentation using liposome assay. Purified recombinant FAM134B and CAMK2B were preincubated in kinase buffer with ADP or ATP at 30°C for 10min, the resultant protein mixtures were transferred to chamber coated with liposomes. Liposome fragmentation was monitored by live imaging. Scale bars, 10 μm. ***P<0.001, one-way ANOVA, error bars indicate SEM (n=3).(G, H) Measurement of the ER-phagy activity. U2OS cells transiently expressing mCherry-EGFP-FAM134B (WT) were treated with compounds as indicated. Lysosomal mCherry-positive but GFP-negative puncta were quantified for each cell in (H). For vehicle control, 53 cells were counted (n=53), for Ionomycin, n=56; for EB1089, n=54; for KN-93, n=58. Scale bars, 10 μm. The scale bars in the magnification boxes are 2 μm. ***P<0.001, one-way ANOVA, error bars indicate SEM.(I) FAM134B WT or knockout (KO) U2OS cells were treated with CAMK2 activator Ionomycin (Iono), EB1089 or inhibitor KN93 for 24 hours, Western-blot was performed to analyze the proteins as indicated.(J) CAMK2B WT or knockdown (KD) U2OS cells were treated with 1 μM Thapsigargin (Tg) to induce ER stress for different time as indicated. Cells were collected and analyzed for proteins as indicated by Western blot.(K) GFP-cleavage assay. CAMK2B WT or knockdown (KD) U2OS cells were co-transfected with FAM134B-Flag and GFP-SEC61B, 24 hours post transfection, cells were treated with drugs as indicated and analyzed for GFP-cleavage by Western blot. Note: the levels of Flag-FAM134B, CAMK2B, GFP-SEC61B and Tubulin were analyzed by Western blot using different membranes."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "Comparison", "of", "the", "self", "-", "interaction", "of", "FAM134B", "WT", "with", "mutants", "as", "indicated", "using", "co", "-", "IP", ".", "SA", "-", "G216R", "was", "constructed", "by", "simultaneously", "mutating", "S149", ",", "S151", "and", "S153", "to", "alanine", "(", "SA", ")", "on", "the", "basis", "of", "FAM134B", "-", "G216R", ".", "(", "B", ")", "In", "vitro", "liposome", "fragmentation", "assay", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "error", "bars", "indicate", "SEM", "(", "n", "≧", "3", ")", ".", "(", "C", ",", "D", ")", "Measurement", "of", "the", "intracellular", "ER", "-", "scission", "activity", "of", "FAM134B", "WT", ",", "G216R", ",", "S151A", "-", "G216R", "and", "SA", "-", "G216R", ".", "GFP", "-", "tagged", "FAM134B", "proteins", "were", "expressed", "in", "U2OS", "cells", "at", "same", "levels", ".", "The", "autolyosomal", "degradation", "of", "ER", "fragments", "labelled", "by", "GFP", "-", "FAM134B", "were", "blocked", "by", "Baf", "A1", "or", "DMSO", ".", "GFP", "-", "positive", "puncta", "were", "quantified", "for", "each", "cell", "in", "(", "D", ")", ".", "For", "all", "of", "the", "groups", ",", "at", "least", "30", "cells", "were", "included", "for", "quantification", ";", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "error", "bars", "indicate", "SEM", ".", "(", "E", ",", "F", ")", "Measurement", "of", "the", "ER", "-", "phagy", "activity", "of", "FAM134BG216R", ".", "U2OS", "cells", "transiently", "expressing", "mCherry", "-", "EGFP", "-", "FAM134B", "(", "WT", ")", ",", "mCherry", "-", "EGFP", "-", "FAM134B", "(", "G216R", ")", ",", "mCherry", "-", "EGFP", "-", "FAM134B", "(", "S151A", "-", "G216R", ")", "or", "mCherry", "-", "EGFP", "-", "FAM134B", "(", "SA", "-", "G216R", ")", "at", "same", "levels", ".", "Lysosomal", "mCherry", "-", "positive", "but", "GFP", "-", "negative", "puncta", "were", "quantified", "for", "each", "cell", "in", "(", "F", ")", ".", "For", "WT", ",", "50", "cells", "were", "counted", "(", "n", "=", "50", ")", ";", "for", "G216R", ",", "n", "=", "55", ";", "for", "S151A", "-", "G216R", ",", "n", "=", "51", ";", "for", "SA", "-", "G216R", ",", "n", "=", "52", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "The", "scale", "bars", "in", "the", "magnification", "boxes", "are", "2", "μm", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "one", "-", "way", "ANOVA", ",", "error", "bars", "indicate", "SEM", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) Comparison of the self-interaction of FAM134B WT with mutants as indicated using co-IP. SA-G216R was constructed by simultaneously mutating S149, S151 and S153 to alanine (SA) on the basis of FAM134B-G216R.(B) In vitro liposome fragmentation assay. Scale bars, 10 μm. ***P<0.001, one-way ANOVA, error bars indicate SEM (n≧3).(C, D) Measurement of the intracellular ER-scission activity of FAM134B WT, G216R, S151A-G216R and SA-G216R. GFP-tagged FAM134B proteins were expressed in U2OS cells at same levels. The autolyosomal degradation of ER fragments labelled by GFP-FAM134B were blocked by Baf A1 or DMSO. GFP-positive puncta were quantified for each cell in (D). For all of the groups, at least 30 cells were included for quantification; Scale bars, 10 μm. ***P<0.001, one-way ANOVA, error bars indicate SEM.(E, F) Measurement of the ER-phagy activity of FAM134BG216R. U2OS cells transiently expressing mCherry-EGFP-FAM134B (WT), mCherry-EGFP-FAM134B (G216R), mCherry-EGFP-FAM134B (S151A-G216R) or mCherry-EGFP-FAM134B (SA-G216R) at same levels. Lysosomal mCherry-positive but GFP-negative puncta were quantified for each cell in (F). For WT, 50 cells were counted (n=50); for G216R, n=55; for S151A-G216R, n=51; for SA-G216R, n=52. Scale bars, 10 μm. The scale bars in the magnification boxes are 2 μm. *P<0.05, ***P<0.001, one-way ANOVA, error bars indicate SEM."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ",", "A", "'", ")", "Specific", "expression", "of", "FAM134B", "mRNA", "(", "green", ")", "in", "sensory", "neurons", "(", "red", ")", "of", "P4d", "vGlut2Cre", ";", "R26lsl", "-", "tdTommouse", ".", "Scale", "bars", ",", "100μm", ".", "The", "white", "dotted", "line", "indicates", "the", "dorsal", "root", "ganglia", "(", "DRG", ")", "where", "sensory", "neurons", "are", "genetically", "labeled", "with", "Tomato", ".", "Insets", "of", "(", "a", ")", "and", "(", "a", "'", ")", "are", "high", "magnifications", "of", "sensory", "neurons", "showing", "the", "co", "-", "localization", "of", "FAM134B", "mRNA", "and", "Tomato", ".", "Scale", "bars", ",", "10", "μm", ".", "Cultured", "sensory", "neurons", "from", "DRGs", "of", "E14", ".", "5", "vGlut2Cre", ";", "R26lsl", "-", "tdTom", "embryos", "were", "infected", "with", "same", "titers", "of", "recombinant", "lentivirus", "expressing", "GFP", "-", "FAM134B", "WT", "(", "B", ")", ",", "G216R", "(", "C", ")", ",", "S151A", "-", "G216R", "(", "D", ")", ",", "SA", "-", "G216R", "(", "E", ")", ",", "G216R", "-", "ΔLIR", "(", "F", ")", "respectively", ".", "Infected", "sensory", "neurons", "(", "GFP", "+", "/", "Tom", "+", ")", "are", "indicated", "with", "arrowheads", ".", "The", "nuclei", "of", "all", "cells", "are", "shown", "with", "DAPI", "staining", ".", "Scale", "bars", ",", "20", "μm", ".", "Cultured", "sensory", "neurons", "from", "DRGs", "of", "E14", ".", "5", "vGlut2Cre", ";", "R26lsl", "-", "tdTom", "embryos", "were", "infected", "with", "same", "titers", "of", "recombinant", "lentivirus", "expressing", "G216R", "supplemented", "with", "5μM", "KN93", "(", "G", ")", "Infected", "sensory", "neurons", "(", "GFP", "+", "/", "Tom", "+", ")", "are", "indicated", "with", "arrowheads", ".", "The", "nuclei", "of", "all", "cells", "are", "shown", "with", "DAPI", "staining", ".", "Scale", "bars", ",", "20", "μm", ".", "(", "H", ")", "Quantification", "of", "the", "viability", "of", "sensory", "neuron", "after", "48h", ",", "72h", "and", "96h", "of", "infection", ".", "Sensory", "neuron", "viability", "was", "calculated", "as", "the", "percentage", "of", "transfected", "sensory", "neuron", "(", "GFP", "+", "/", "Tom", "+", ")", "in", "total", "sensory", "neurons", "(", "Tom", "+", ")", ".", "For", "each", "time", "point", ",", "four", "biological", "replicates", "were", "included", "for", "statistical", "analysis", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "two", "-", "way", "ANOVA", ",", "error", "bars", "indicate", "SEM", ".", "\"", "ns", "\"", "is", "the", "abbreviation", "for", "\"", "not", "significant", "\"", ".", "For", "all", "of", "the", "groups", ",", "at", "least", "10", "fields", "of", "the", "slides", "were", "included", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A,A') Specific expression of FAM134B mRNA (green) in sensory neurons (red) of P4d vGlut2Cre;R26lsl-tdTommouse. Scale bars, 100μm. The white dotted line indicates the dorsal root ganglia (DRG) where sensory neurons are genetically labeled with Tomato. Insets of (a) and (a') are high magnifications of sensory neurons showing the co-localization of FAM134B mRNA and Tomato. Scale bars, 10 μm.Cultured sensory neurons from DRGs of E14.5 vGlut2Cre;R26lsl-tdTom embryos were infected with same titers of recombinant lentivirus expressing GFP-FAM134B WT (B), G216R(C), S151A-G216R(D), SA-G216R(E), G216R-ΔLIR (F) respectively. Infected sensory neurons (GFP+/Tom+) are indicated with arrowheads. The nuclei of all cells are shown with DAPI staining. Scale bars, 20 μm.Cultured sensory neurons from DRGs of E14.5 vGlut2Cre;R26lsl-tdTom embryos were infected with same titers of recombinant lentivirus expressing G216R supplemented with 5μM KN93 (G) Infected sensory neurons (GFP+/Tom+) are indicated with arrowheads. The nuclei of all cells are shown with DAPI staining. Scale bars, 20 μm.(H) Quantification of the viability of sensory neuron after 48h, 72h and 96h of infection. Sensory neuron viability was calculated as the percentage of transfected sensory neuron (GFP+/Tom+) in total sensory neurons (Tom+). For each time point, four biological replicates were included for statistical analysis. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, two-way ANOVA, error bars indicate SEM. \"ns\" is the abbreviation for \"not significant\". For all of the groups, at least 10 fields of the slides were included."}
{"words": ["Figure", "1", ".", "Entry", "of", "MLV", "pseudotyped", "with", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "S", ",", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "Sfur", "/", "mut", "and", "SARS", "-", "CoV", "S", "in", "VeroE6", "cells", ".", "Entry", "of", "MLV", "pseudotyped", "with", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "S", "or", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "Sfur", "/", "mut", "in", "BHK", "cells", "transiently", "transfected", "with", "hACE2", ".", "The", "experiments", "were", "carried", "out", "in", "triplicate", "with", "two", "independent", "pseudovirus", "preparations", "and", "a", "representative", "experiment", "is", "shown", ".", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "S", "-", "MLV", ",", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "Sfur", "/", "mut", "-", "MLV", "and", "SARS", "-", "CoV", "S", "-", "MLV", "pseudovirions", "using", "an", "anti", "-", "SARS", "-", "CoV", "S2", "antibody", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1.Entry of MLV pseudotyped with SARS-CoV-2 S, SARS-CoV-2 Sfur/mut and SARS-CoV S in VeroE6 cells.Entry of MLV pseudotyped with SARS-CoV-2 S or SARS-CoV-2 Sfur/mut in BHK cells transiently transfected with hACE2. The experiments were carried out in triplicate with two independent pseudovirus preparations and a representative experiment is shown.. Western blot analysis of SARS-CoV-2 S-MLV, SARS-CoV-2 Sfur/mut-MLV and SARS-CoV S-MLV pseudovirions using an anti-SARS-CoV S2 antibody."}
{"words": ["Figure", "2", ".", "Biolayer", "interferometry", "binding", "analysis", "of", "the", "hACE2", "ectodomain", "to", "immobilized", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "SB", "(", "B", ")", "or", "SARS", "-", "CoV"], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2.Biolayer interferometry binding analysis of the hACE2 ectodomain to immobilized SARS-CoV-2 SB (B) or SARS-CoV SB"}
{"words": ["Figure", "3", ".", "Two", "orthogonal", "views", "of", "the", "closed", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "S", "trimer", "cryoEM", "map", ".", "C", ".", "Atomic", "model", "of", "the", "closed", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "S", "trimer", "in", "the", "same", "orientation", "as", "in", "panel", "A", ".", "D", "-", "E", ".", "Two", "orthogonal", "views", "of", "the", "partially", "open", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "S", "trimer", "cryoEM", "map", "(", "one", "SB", "domain", "is", "open", ")", ".", "F", ".", "Atomic", "model", "of", "the", "closed", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "S", "trimer", "in", "the", "same", "orientation", "as", "in", "panel", "D", ".", "The", "glycans", "were", "omitted", "for", "clarity", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3.Two orthogonal views of the closed SARS-CoV-2 S trimer cryoEM map. C. Atomic model of the closed SARS-CoV-2 S trimer in the same orientation as in panel A.D-E. Two orthogonal views of the partially open SARS-CoV-2 S trimer cryoEM map (one SB domain is open). F. Atomic model of the closed SARS-CoV-2 S trimer in the same orientation as in panel D. The glycans were omitted for clarity."}
{"words": ["Figure", "5", ".", "Entry", "of", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "and", "SARS", "-", "CoV", "S", "pseudotyped", "viruses", "is", "potently", "inhibited", "by", "four", "SARS", "-", "CoV", "S", "mouse", "polyclonal", "immune", "plasma", "."], "labels": ["O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5.Entry of SARS-CoV-2 and SARS-CoV S pseudotyped viruses is potently inhibited by four SARS-CoV S mouse polyclonal immune plasma."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Western", "blot", "showing", "the", "protein", "expression", "of", "ASCL1", "and", "/", "or", "NEUROD1", "in", "NCI", "-", "H69", ",", "NCI", "-", "H82", ",", "NCI", "-", "H146", ",", "NCI", "-", "H510A", ",", "NCI", "-", "H526", ",", "SHP", "-", "77", "and", "DMS", "-", "53", "SCLC", "cells", "(", "lanes", "4", "-", "10", ")", ";", "A549", "and", "NCI", "-", "H460", "NSCLC", "cells", "and", "a", "IMR", "-", "90", "HFL", "cell", "lines", "(", "lanes", "1", "-", "3", ")", ".", "Tubulin", "(", "α", "-", "Tub", ")", "is", "shown", "as", "loading", "control", ".", "Each", "blot", "is", "representative", "from", "at", "least", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Western blot showing the protein expression of ASCL1 and/or NEUROD1 in NCI-H69, NCI-H82, NCI-H146, NCI-H510A, NCI-H526, SHP-77 and DMS-53 SCLC cells (lanes 4-10); A549 and NCI-H460 NSCLC cells and a IMR-90 HFL cell lines (lanes 1-3). Tubulin (α-Tub) is shown as loading control. Each blot is representative from at least three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", "-", "E", ")", "ChIP", "-", "seq", "experiments", "indicates", "the", "localization", "of", "(", "A", ")", "ASCL1", ",", "(", "B", ")", "NEUROD1", "and", "(", "E", ")", "RNAPII", ".", "ATAC", "-", "seq", "(", "C", ")", "and", "(", "D", ")", "the", "presence", "of", "H3K27Ac", "mark", "indicate", "the", "chromatin", "accessibility", "around", "the", "TSS", "at", "t", "=", "0", "(", "blue", ")", "and", "t", "=", "4h", "(", "green", ")", "after", "lurbinectedin", "treatment", ";", "-", "2", ".", "0", "and", "+", "2", ".", "0", "kb", "to", "TSS", "coordinates", "of", "all", "hg19", "genes", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A-E) ChIP-seq experiments indicates the localization of (A) ASCL1, (B) NEUROD1 and (E) RNAPII. ATAC-seq (C) and (D) the presence of H3K27Ac mark indicate the chromatin accessibility around the TSS at t=0 (blue) and t=4h (green) after lurbinectedin treatment; -2.0 and +2.0 kb to TSS coordinates of all hg19 genes."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "A", "-", "D", ")", "Chip", "-", "seq", "genome", "track", "of", "ASCL1", "/", "NEUROD1", ",", "RNAPII", ",", "and", "H3K27Ac", "on", "ASCL1", ",", "BCL2", ";", "INSM1", "and", "MYB", "(", "hg19", ")", ",", "in", "untreated", "(", "dark", "blue", ")", "and", "in", "lurbinectedin", "treated", "(", "green", ")", "conditions", "respectively", ";", "to", "be", "noticed", "the", "location", "of", "CGG", "rich", "motifs", "(", "lower", "part", "of", "each", "panel", ")", "which", "parallel", "the", "presence", "of", "lurbinectedin", "(", "red", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(A-D) Chip-seq genome track of ASCL1/NEUROD1, RNAPII, and H3K27Ac on ASCL1, BCL2; INSM1 and MYB (hg19), in untreated (dark blue) and in lurbinectedin treated (green) conditions respectively; to be noticed the location of CGG rich motifs (lower part of each panel) which parallel the presence of lurbinectedin (red)."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "a", ")", "Western", "blot", "showing", "RNAPII", "across", "the", "panel", "of", ";", "A549", "and", "NCI", "-", "H460", "NSCLC", "cells", ";", "IMR", "-", "90", "HFL", "cells", ";", "NCI", "-", "H146", ",", "NCI", "-", "H82", ",", "DMS", "-", "53", ",", "NCI", "-", "H510A", ",", "NCI", "-", "H526", "and", "SHP", "-", "77", "SCLC", "cells", "before", "(", "-", ")", "and", "after", "(", "+", ")", "treatment", "with", "lurbinectedin", ".", "α", "-", "Tubulin", "(", "α", "-", "Tub", ")", "is", "shown", "as", "loading", "control", ";", "lower", "panel", ",", "Histogram", "showing", "the", "average", "of", "RNAPII", "before", "(", "dark", "blue", ")", "and", "after", "(", "light", "Blue", ")", "lurbinectedin", "treatment", "in", "arbitrary", "units", "(", "a", ".", "u", ".", ")", "normalized", "against", "α", "-", "Tub", ".", "Data", "is", "presented", "as", "Mean", "±", "SEM", "as", "determined", "by", "Two", "Way", "RM", "ANOVA", "and", "Šídák", "'", "s", "multiple", "comparisons", "test", "(", "n", "=", "3", "biological", "replicas", ")", ".", "*", "*", "*", "*", "P", "≤", "0", ".", "0001", ".", "(", "B", "Immunofluorescence", "of", "RNAPII", "(", "red", ")", "before", "(", "Ctrl", ")", "and", "after", "lurbinectedin", "treatment", ".", "DAPI", "(", "blue", ")", "was", "used", "to", "stain", "nuclei", ";", "scale", "bar", "is", "65", "μm", ".", "(", "D", ")", "Affinity", "purification", "of", "Bio", "-", "lur", "fractions", "containing", "elongating", "RNAPII", "Ser2", "(", "lane", "4", ")", ".", "Input", "(", "lanes", "1", "-", "2", ")", "represents", "10", "%", "of", "the", "starting", "material", ".", "Respective", "molecular", "weights", "are", "shown", "on", "the", "right", "(", "kDa", ")", ".", "(", "E", ")", "Upper", "panel", ":", "GST", "-", "pulldown", "of", "ubiquitinated", "proteins", "showing", "hypo", "-", "(", "IIA", ")", ",", "-", "hyper", "(", "II0", ")", "phosphorylated", "RNAPII", "(", "lanes", "4", "-", "5", "upper", "panel", ")", "and", "Ser2", "Phosphorylated", "RNAPII", "(", "Ser2P", ")", "(", "lanes", "4", "-", "5", "lower", "panel", ")", "after", "lurbinectedin", "treatment", ".", "Empty", "beads", "(", "Mock", ")", "(", "lane", "3", ")", "as", "a", "negative", "control", ";", "Lower", "Panel", ":", "GST", "-", "pulldown", "of", "ubiquitinated", "proteins", "Ser2P", ")", "(", "lanes", "4", "-", "5", ")", ".", "Representative", "smear", "of", "successful", "ubiquitinated", "proteins", "pulldown", "(", "Lanes", "4", "and", "5", ")", "as", "compared", "to", "input", "(", "lanes", "1", "and", "2", ")", ".", "Empty", "beads", "(", "Mock", ")", "(", "lane", "3", ")", "as", "a", "negative", "control", ".", "Each", "Western", "blot", "is", "representative", "of", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(a) Western blot showing RNAPII across the panel of; A549 and NCI-H460 NSCLC cells; IMR-90 HFL cells; NCI-H146, NCI-H82, DMS-53, NCI-H510A, NCI-H526 and SHP-77 SCLC cells before (-) and after (+) treatment with lurbinectedin. α-Tubulin (α-Tub) is shown as loading control; lower panel, Histogram showing the average of RNAPII before (dark blue) and after (light Blue) lurbinectedin treatment in arbitrary units (a.u.) normalized against α-Tub. Data is presented as Mean ± SEM as determined by Two Way RM ANOVA and Šídák's multiple comparisons test (n=3 biological replicas). ****P ≤0.0001.(B Immunofluorescence of RNAPII (red) before (Ctrl) and after lurbinectedin treatment. DAPI (blue) was used to stain nuclei; scale bar is 65 μm.(D) Affinity purification of Bio-lur fractions containing elongating RNAPII Ser2 (lane 4). Input (lanes 1-2) represents 10% of the starting material. Respective molecular weights are shown on the right (kDa).(E) Upper panel: GST-pulldown of ubiquitinated proteins showing hypo- (IIA), -hyper (II0) phosphorylated RNAPII (lanes 4-5 upper panel) and Ser2 Phosphorylated RNAPII (Ser2P) (lanes 4-5 lower panel) after lurbinectedin treatment. Empty beads (Mock) (lane 3) as a negative control; Lower Panel: GST-pulldown of ubiquitinated proteins Ser2P) (lanes 4-5). Representative smear of successful ubiquitinated proteins pulldown (Lanes 4 and 5) as compared to input (lanes 1 and 2). Empty beads (Mock) (lane 3) as a negative control. Each Western blot is representative of three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "1A", ")", "GFP", "tagged", "Syb", "protein", "expressed", "in", "Hh", "-", "receiving", "cells", "co", "-", "localizes", "with", "endogenous", "immuno", "-", "labelled", "Ptc", "along", "the", "apico", "-", "basal", "axis", "(", "3D", "reconstruction", ")", ".", "Vesicles", "containing", "Syb", "and", "Ptc", "are", "visualized", "at", "lateral", "and", "basal", "planes", "(", "arrows", ")", ",", "and", "can", "be", "detected", "along", "cytonemes", "marked", "with", "Syb", "-", "GFP", "(", "arrowhead", ")", ".", "B", ")", "Expression", "of", "the", "GFP", "tagged", "Syt1", "also", "co", "-", "localizes", "with", "inmmuno", "-", "labelled", "endogenous", "Ptc", "at", "vesicles", "(", "lateral", "plane", ",", "arrows", "point", "at", "vesicles", "with", "co", "-", "localization", ")", "and", "decorates", "the", "cytoneme", "membranes", "(", "basal", "plane", ",", "arrowheads", "indicate", "cytonemes", ")", ".", "C", ")", "GRASP", "experiment", "shows", "exocytic", "events", "in", "Hh", "-", "receiving", "cells", "at", "basal", "membrane", "contacts", ".", "Hh", "-", "receiving", "cells", "express", "the", "GFP", "barrel", "1", "-", "10", "tagged", "to", "Syb", "and", "Hh", "-", "producing", "cells", "express", "the", "complementary", "GFP", "barrel", "11", "tagged", "to", "the", "membrane", "protein", "CD4", ".", "Note", "the", "fluorescent", "discrete", "punctae", "(", "arrows", ")", "along", "Hh", "producing", "cells", "cytonemes", "(", "stabilized", "with", "Ihog", "-", "RFP", ")", "crossing", "the", "reception", "area", ".", "D", ")", "Expression", "in", "receiving", "cells", "of", "the", "Syb", "functional", "partner", "Syx1A", "tagged", "to", "GFP", ".", "Note", "a", "strong", "localization", "in", "clusters", "close", "to", "the", "basal", "membrane", "in", "the", "3D", "reconstruction", "(", "left", "panel", ")", "and", "in", "confocal", "lateral", "and", "basal", "planes", ",", "including", "cytonemes", "(", "right", "panels", ",", "arrows", "and", "arrowhead", "indicate", "vesicle", "-", "like", "structures", "along", "cytoenemes", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A) GFP tagged Syb protein expressed in Hh-receiving cells co-localizes with endogenous immuno-labelled Ptc along the apico-basal axis (3D reconstruction). Vesicles containing Syb and Ptc are visualized at lateral and basal planes (arrows), and can be detected along cytonemes marked with Syb-GFP (arrowhead).B) Expression of the GFP tagged Syt1 also co-localizes with inmmuno-labelled endogenous Ptc at vesicles (lateral plane, arrows point at vesicles with co-localization) and decorates the cytoneme membranes (basal plane, arrowheads indicate cytonemes).C) GRASP experiment shows exocytic events in Hh-receiving cells at basal membrane contacts. Hh-receiving cells express the GFP barrel 1-10 tagged to Syb and Hh-producing cells express the complementary GFP barrel 11 tagged to the membrane protein CD4. Note the fluorescent discrete punctae (arrows) along Hh producing cells cytonemes (stabilized with Ihog-RFP) crossing the reception area.D) Expression in receiving cells of the Syb functional partner Syx1A tagged to GFP. Note a strong localization in clusters close to the basal membrane in the 3D reconstruction (left panel) and in confocal lateral and basal planes, including cytonemes (right panels, arrows and arrowhead indicate vesicle-like structures along cytoenemes)."}
{"words": ["Figure", "2A", ")", "Ptc", "protein", "distribution", "in", "a", "wing", "disc", "(", "3D", "reconstitution", ")", "under", "down", "-", "regulation", "of", "the", "SNARE", "proteins", "Syb", "and", "Syt1", "in", "the", "dorsal", "compartment", "(", "D", ")", ",", "keeping", "the", "ventral", "compartment", "(", "V", ")", "as", "a", "WT", "internal", "control", ".", "Note", "the", "basal", "accumulation", "of", "endogenous", "Ptc", "(", "arrowheads", ")", "when", "knocking", "down", "Syb", "or", "Syt1", ".", "B", ")", "Confocal", "images", "of", "immuno", "-", "labelled", "endogenous", "Ptc", "and", "cytonemes", "stabilized", "with", "Ihog", "-", "RFP", "protruding", "from", "Hh", "producing", "cells", "in", "wild", "type", "receiving", "cells", "(", "left", "panel", ")", ",", "or", "B", "'", ")", "when", "either", "blocking", "exocytosis", "by", "down", "-", "regulating", "Syb", "(", "middle", "panel", ")", "or", "B", "'", "'", ")", "blocking", "endocytosis", "by", "expressing", "a", "dominant", "negative", "form", "of", "the", "Drosophila", "Dynamin", ",", "Shibire", "(", "right", "panel", ")", "in", "the", "Hh", "-", "receiving", "cells", ".", "Endogenous", "Ptc", "in", "wild", "type", "conditions", "cannot", "be", "visualized", "due", "to", "its", "rapid", "internalization", "and", "processing", "after", "Hh", "reception", ";", "while", "blocking", "exocytosis", "causes", "an", "accumulation", "of", "basal", "Ptc", "in", "intracellular", "punctae", "(", "arrowheads", ")", ",", "and", "endocytosis", "inhibition", "leads", "to", "Ptc", "accumulation", "at", "the", "plasma", "membrane", "(", "arrows", ")", ".", "C", ")", "Confocal", "apical", "(", "left", ")", "and", "basal", "(", "right", ")", "images", "of", "a", "shits", "mutant", "wing", "disc", "expressing", "Syb", "RNAi", "dorsally", "(", "D", ")", "to", "also", "block", "exocytosis", ",", "keeping", "the", "ventral", "compartment", "(", "V", ")", "as", "an", "internal", "control", "where", "just", "endocytosis", "is", "inhibited", ".", "After", "dorsal", "Syb", "RNAi", "induction", ",", "endocytosis", "was", "inhibited", "in", "the", "whole", "shits", "disc", "by", "incubation", "at", "restrictive", "temperature", ".", "Note", "the", "dorsal", "reduction", "of", "Ptc", "at", "plasma", "membrane", "after", "blocking", "exocytosis", ".", "D", ")", "Quantification", "of", "Ptc", "-", "GFP", "levels", "(", "Yac", "construct", ")", "along", "the", "wing", "disc", "apico", "-", "basal", "axis", ",", "integrating", "both", "fluorescence", "intensity", "and", "signal", "area", "(", "Integrated", "Density", ")", ".", "The", "graph", "on", "the", "left", "shows", "values", "for", "wild", "type", "situations", "in", "purple", "(", "average", "in", "blue", ")", ",", "while", "Syb", "RNAi", "treatment", "values", "are", "shown", "in", "green", "(", "average", "in", "orange", ")", ".", "a", "clear", "shift", "of", "higher", "values", "towards", "the", "basal", "side", "of", "the", "discs", "after", "inhibition", "of", "Syb", "function", ".", "The", "graph", "to", "the", "right", "shows", "correlation", "coefficients", "between", "the", "maximum", "Ptc", "value", "and", "distance", "from", "the", "basal", "side", "(", "-", "1", "=", "basal", ",", "+", "1", "=", "apical", ")", "of", "discs", "after", "RNAi", "expression", "for", "different", "SNARE", "proteins", "and", "the", "wild", "type", ".", "Central", "horizontal", "lines", "show", "median", "values", "of", "N", "=", "7", "-", "16", ",", "box", "shows", "lower", "and", "upper", "quartiles", "and", "the", "whiskers", "show", "the", "maximum", "and", "minimum", "excluding", "outliers", ".", "A", "basal", "association", "is", "particularly", "noticeable", "for", "Syb", ",", "Syx1A", "and", "α", "-", "Snap", "down", "-", "regulation", ".", "Right", "panel", "is", "a", "scheme", "illustrating", "the", "wild", "type", "and", "RNAi", "-", "treated", "patterns", "of", "quantified", "Ptc", "-", "GFP", "levels", "distribution", "along", "the", "wing", "disc", "apico", "-", "basal", "axis", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A) Ptc protein distribution in a wing disc (3D reconstitution) under down-regulation of the SNARE proteins Syb and Syt1 in the dorsal compartment (D), keeping the ventral compartment (V) as a WT internal control. Note the basal accumulation of endogenous Ptc (arrowheads) when knocking down Syb or Syt1.B) Confocal images of immuno-labelled endogenous Ptc and cytonemes stabilized with Ihog-RFP protruding from Hh producing cells in wild type receiving cells (left panel), or B') when either blocking exocytosis by down-regulating Syb (middle panel) or B'') blocking endocytosis by expressing a dominant negative form of the Drosophila Dynamin, Shibire (right panel) in the Hh-receiving cells. Endogenous Ptc in wild type conditions cannot be visualized due to its rapid internalization and processing after Hh reception; while blocking exocytosis causes an accumulation of basal Ptc in intracellular punctae (arrowheads), and endocytosis inhibition leads to Ptc accumulation at the plasma membrane (arrows).C) Confocal apical (left) and basal (right) images of a shits mutant wing disc expressing Syb RNAi dorsally (D) to also block exocytosis, keeping the ventral compartment (V) as an internal control where just endocytosis is inhibited. After dorsal Syb RNAi induction, endocytosis was inhibited in the whole shits disc by incubation at restrictive temperature. Note the dorsal reduction of Ptc at plasma membrane after blocking exocytosis.D) Quantification of Ptc-GFP levels (Yac construct) along the wing disc apico-basal axis, integrating both fluorescence intensity and signal area (Integrated Density). The graph on the left shows values for wild type situations in purple (average in blue), while Syb RNAi treatment values are shown in green (average in orange). a clear shift of higher values towards the basal side of the discs after inhibition of Syb function. The graph to the right shows correlation coefficients between the maximum Ptc value and distance from the basal side (-1=basal, +1=apical) of discs after RNAi expression for different SNARE proteins and the wild type. Central horizontal lines show median values of N=7-16, box shows lower and upper quartiles and the whiskers show the maximum and minimum excluding outliers. A basal association is particularly noticeable for Syb, Syx1A and α-Snap down-regulation. Right panel is a scheme illustrating the wild type and RNAi-treated patterns of quantified Ptc-GFP levels distribution along the wing disc apico-basal axis."}
{"words": ["Figure", "3A", ")", "Electron", "Microscopy", "imaging", "of", "wing", "discs", "expressing", "the", "UAS", "-", "Ptc", "-", "GFP", "construct", "for", "24", "hours", "in", "receiving", "cells", "using", "Ptc", "-", "Gal4", ";", "TubGal80ts", ".", "Left", "panel", "shows", "areas", "with", "anti", "-", "GFP", "immuno", "-", "labelling", "(", "marked", "in", "blue", ")", "throughout", "the", "apico", "/", "basal", "axis", "of", "the", "wing", "disc", "epithelium", "a", ")", "anti", "-", "GFP", "gold", "-", "labelling", "corresponding", "to", "Ptc", "is", "located", "on", "the", "apical", "membrane", "and", "early", "endosomes", "towards", "MVB", "formation", ".", "b", ")", "Ptc", "immuno", "-", "gold", "labelling", "is", "present", "in", "multivesicular", "bodies", "(", "MVBs", ")", "subapically", "(", "top", "right", "panels", ")", ".", "b1", ")", "subapical", "MVBs", "appear", "as", "less", "dense", "with", "greater", "Ptc", "labelling", "on", "the", "MVB", "outer", "membranes", ".", "c", ")", "Ptc", "label", "is", "also", "present", "in", "MVBs", "close", "to", "the", "basal", "membrane", "(", "lower", "right", "panels", ")", ",", "c1", ")", "basolateral", "Ptc", "MVBs", "are", "significantly", "denser", "and", "richer", "in", "Ptc", "positive", "intraluminal", "vesicles", "(", "ILV", ")", ".", "B", ")", "Endogenous", "Ptc", "subcellular", "localization", "after", "endocytosis", "inhibition", "by", "the", "dorsal", "expression", "of", "a", "dominant", "negative", "form", "of", "Rab5", ".", "The", "top", "panel", "is", "a", "schematic", "representation", "of", "the", "localized", "expression", ".", "The", "left", "panel", "is", "a", "digital", "3D", "reconstruction", "and", "the", "right", "panel", "shows", "an", "apical", "and", "basal", "confocal", "sections", ".", "that", "accumulation", "of", "Ptc", "occurs", "at", "both", "the", "apical", "and", "basal", "sides", "of", "the", "dorsal", "part", "of", "the", "disc", ",", "compared", "to", "the", "wild", "type", "control", "on", "the", "ventral", "side", ".", "accumulation", "of", "Ptc", "occurs", "at", "both", "the", "apical", "and", "basal", "sides", "of", "the", "dorsal", "part", "of", "the", "disc", ",", "compared", "to", "the", "wild", "type", "control", "on", "the", "ventral", "side", ".", "C", ")", "Digital", "3D", "reconstruction", "(", "left", ")", "and", "apical", "and", "basal", "confocal", "sections", "(", "right", ")", "of", "endogenous", "Ptc", "localization", "after", "endocytosis", "inhibition", "by", "the", "dorsal", "expression", "of", "a", "dominant", "negative", "form", "of", "shibire", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A) Electron Microscopy imaging of wing discs expressing the UAS-Ptc-GFP construct for 24 hours in receiving cells using Ptc-Gal4; TubGal80ts. Left panel shows areas with anti-GFP immuno-labelling (marked in blue) throughout the apico/basal axis of the wing disc epithelium a) anti-GFP gold-labelling corresponding to Ptc is located on the apical membrane and early endosomes towards MVB formation. b) Ptc immuno-gold labelling is present in multivesicular bodies (MVBs) subapically (top right panels). b1) subapical MVBs appear as less dense with greater Ptc labelling on the MVB outer membranes. c) Ptc label is also present in MVBs close to the basal membrane (lower right panels), c1) basolateral Ptc MVBs are significantly denser and richer in Ptc positive intraluminal vesicles (ILV).B) Endogenous Ptc subcellular localization after endocytosis inhibition by the dorsal expression of a dominant negative form of Rab5. The top panel is a schematic representation of the localized expression. The left panel is a digital 3D reconstruction and the right panel shows an apical and basal confocal sections. that accumulation of Ptc occurs at both the apical and basal sides of the dorsal part of the disc, compared to the wild type control on the ventral side.accumulation of Ptc occurs at both the apical and basal sides of the dorsal part of the disc, compared to the wild type control on the ventral side. C) Digital 3D reconstruction (left) and apical and basal confocal sections (right) of endogenous Ptc localization after endocytosis inhibition by the dorsal expression of a dominant negative form of shibire."}
{"words": ["Figure", "4A", ")", "3D", "reconstructions", "of", "immuno", "-", "labelled", "endogenous", "Ptc", "of", "wing", "discs", "in", "wild", "type", "condition", "and", "after", "RNAi", "expression", "for", "different", "ESCRT", "complex", "components", ".", "All", "RNAis", "'", "expression", "result", "in", "Ptc", "accumulation", "in", "large", "structures", ",", "located", "apically", "under", "Hrs", "(", "ESCRT", "-", "0", "component", ")", "inhibition", ",", "and", "basally", "under", "inhibition", "of", "the", "ESCRT", "components", "I", "(", "Tsg101", ")", ",", "II", "(", "Vps22", ")", "and", "III", "(", "Shrub", ")", ".", "Graphs", "depicting", "signal", "values", "from", "apical", "to", "basal", "show", "a", "shift", "of", "higher", "intensity", "curves", "either", "towards", "acute", "apical", "or", "basal", "accumulation", ".", "B", ")", "Detailed", "confocal", "imaging", "of", "immuno", "-", "labelled", "endogenous", "Ptc", "localization", "after", "clonal", "Tsg101", "down", "-", "regulation", ".", "The", "image", "shows", "abnormal", "accumulation", "of", "Ptc", "clusters", "in", "basal", "cytonemes", "emanating", "from", "receiving", "cells", "(", "arrows", ")", ",", "since", "in", "wild", "type", "conditions", "Ptc", "visualization", "at", "basal", "membranes", "is", "not", "possible", "due", "to", "its", "rapid", "internalization", "and", "processing", "after", "Hh", "receptionC", ")", "Ptc", "accumulation", "in", "these", "punctated", "structures", "(", "arrows", ")", "is", "also", "visualized", "on", "receiving", "cytonemes", "stabilized", "with", "the", "co", "-", "receptor", "Ihog", "-", "RFP", "and", "after", "Tsg101", "inhibition", ".", "D", ")", "3D", "reconstruction", "of", "Hh", "producing", "cytoneme", "network", "stabilized", "by", "Ihog", "-", "RFP", "shows", "that", "Ptc", "accumulation", "after", "Tsg101", "treatment", "localizes", "above", "the", "signal", "sending", "cytoneme", "extensions", "(", "arrow", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A) 3D reconstructions of immuno-labelled endogenous Ptc of wing discs in wild type condition and after RNAi expression for different ESCRT complex components. All RNAis' expression result in Ptc accumulation in large structures, located apically under Hrs (ESCRT-0 component) inhibition, and basally under inhibition of the ESCRT components I (Tsg101), II (Vps22) and III (Shrub). Graphs depicting signal values from apical to basal show a shift of higher intensity curves either towards acute apical or basal accumulation.B) Detailed confocal imaging of immuno-labelled endogenous Ptc localization after clonal Tsg101 down-regulation. The image shows abnormal accumulation of Ptc clusters in basal cytonemes emanating from receiving cells (arrows), since in wild type conditions Ptc visualization at basal membranes is not possible due to its rapid internalization and processing after Hh receptionC) Ptc accumulation in these punctated structures (arrows) is also visualized on receiving cytonemes stabilized with the co-receptor Ihog-RFP and after Tsg101 inhibition.D) 3D reconstruction of Hh producing cytoneme network stabilized by Ihog-RFP shows that Ptc accumulation after Tsg101 treatment localizes above the signal sending cytoneme extensions (arrow)."}
{"words": ["Figure", "5A", ")", "Confocal", "image", "of", "wing", "disc", "expressing", "the", "human", "tetraspanin", "CD63", "-", "GFP", "expressed", "in", "the", "Hh", "receiving", "cells", "colocalizing", "with", "Ptc", "(", "Bac", ".", "Ptc", "-", "cherry", ")", "in", "vesicle", "-", "like", "structures", "(", "yellow", "arrows", ")", "along", "basal", "cytonemes", ".", "B", ")", "In", "vivo", "confocal", "frames", "of", "abdominal", "histoblasts", "showing", "colocalization", "of", "CD63", "-", "Cherry", "and", "Ptc", "(", "Yac", ".", "Ptc", "-", "GFP", ")", "at", "punctae", "moving", "in", "anterograde", "direction", "along", "cytonemes", "(", "white", "arrowheads", "show", "trajectory", "in", "time", "-", "lapse", "frames", ")", ".", "C", ")", "Lateral", "confocal", "plane", "of", "wing", "disc", "showing", "endogenous", "Ptc", "colocalizing", "with", "the", "Drosophila", "tetraspanin", "Tsp96F", "-", "RFP", "(", "orthologous", "to", "the", "mammalian", "tetraspanin", "CD9", "/", "CD81", ")", "(", "yellow", "arrows", "indicate", "co", "-", "localization", "in", "punctate", "structures", ")", ".", "D", ")", "Basolateral", "in", "vivo", "imaging", "of", "abdominal", "histoblasts", "expressing", "Tsp96F", "-", "RFP", "in", "the", "Hh", "receiving", "cells", "shows", "colocalization", "with", "Ptc", "-", "GFP", "at", "mobile", "punctae", "(", "yellow", "arrows", ")", ".", "E", ")", "Tsp96F", "-", "RFP", "expressed", "in", "wing", "disc", "Hh", "-", "receiving", "cells", "also", "shows", "localization", "in", "basal", "cytonemes", "stabilized", "by", "Ihog", "-", "CFP", "expression", "(", "yellow", "arrows", "indicate", "Tsp96F", "-", "RFP", "-", "positive", "punctate", "structures", ")", ".", "F", ")", "Frames", "showing", "in", "vivo", "localization", "of", "Tsp96", "-", "RFP", "punctae", "to", "cytonemes", "stabilized", "with", "Ihog", "-", "CFP", "expressed", "in", "the", "abdominal", "histoblasts", "Hh", "-", "receiving", "cells", ",", "moving", "in", "an", "anterograde", "fashion", "towards", "the", "P", "compartment", "(", "white", "arrowheads", "show", "trajectory", "in", "time", "-", "lapse", "frames", ")", ".", "G", ")", "Confocal", "imaging", "of", "receiving", "cells", "expressing", "the", "HA", "tagged", "Tsp96F", "construct", "also", "shows", "co", "-", "localization", "with", "endogenous", "Ptc", "at", "cytonemes", "(", "yellow", "arrows", "indicate", "Tsp96F", "-", "HA", "and", "Ptc", "co", "-", "localizing", "punctate", "structures", ")", ".", "H", ")", "Western", "blot", "against", "HA", "-", "tag", "of", "Immuno", "-", "Precipitated", "sample", "(", "IP", ")", ",", "Depleted", "Sample", "(", "Dep", ")", ",", "High", "Speed", "Sample", "(", "HSS", ")", "Whole", "Sample", "and", "Control", "sample", "from", "a", "co", "-", "immunoprecipitation", "experiment", "isolating", "GFP", "of", "Tsp96F", "-", "HA", "and", "Ptc", "-", "GFP", "expressing", "larvae", "or", "GFP", "and", "Tsp96F", "-", "HA", "expressing", "larvae", "as", "negative", "control", ".", "Arrowhead", "indicates", "the", "positive", "band", "corresponding", "to", "Tsp96F", "-", "HA", "expected", "molecular", "weight", "(", "30", "-", "40", "kDa", ")", ",", "present", "in", "all", "samples", "including", "the", "immuno", "-", "precipitated", "one", "and", "not", "present", "in", "the", "negative", "control", "sample", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A) Confocal image of wing disc expressing the human tetraspanin CD63-GFP expressed in the Hh receiving cells colocalizing with Ptc (Bac.Ptc-cherry) in vesicle-like structures (yellow arrows) along basal cytonemes.B) In vivo confocal frames of abdominal histoblasts showing colocalization of CD63-Cherry and Ptc (Yac.Ptc-GFP) at punctae moving in anterograde direction along cytonemes (white arrowheads show trajectory in time-lapse frames).C) Lateral confocal plane of wing disc showing endogenous Ptc colocalizing with the Drosophila tetraspanin Tsp96F-RFP (orthologous to the mammalian tetraspanin CD9/CD81) (yellow arrows indicate co-localization in punctate structures).D) Basolateral in vivo imaging of abdominal histoblasts expressing Tsp96F-RFP in the Hh receiving cells shows colocalization with Ptc-GFP at mobile punctae (yellow arrows).E) Tsp96F-RFP expressed in wing disc Hh-receiving cells also shows localization in basal cytonemes stabilized by Ihog-CFP expression (yellow arrows indicate Tsp96F-RFP-positive punctate structures).F) Frames showing in vivo localization of Tsp96-RFP punctae to cytonemes stabilized with Ihog-CFP expressed in the abdominal histoblasts Hh-receiving cells, moving in an anterograde fashion towards the P compartment (white arrowheads show trajectory in time-lapse frames).G) Confocal imaging of receiving cells expressing the HA tagged Tsp96F construct also shows co-localization with endogenous Ptc at cytonemes (yellow arrows indicate Tsp96F-HA and Ptc co-localizing punctate structures).H) Western blot against HA-tag of Immuno-Precipitated sample (IP), Depleted Sample (Dep), High Speed Sample (HSS) Whole Sample and Control sample from a co-immunoprecipitation experiment isolating GFP of Tsp96F-HA and Ptc-GFP expressing larvae or GFP and Tsp96F-HA expressing larvae as negative control. Arrowhead indicates the positive band corresponding to Tsp96F-HA expected molecular weight (30-40 kDa), present in all samples including the immuno-precipitated one and not present in the negative control sample."}
{"words": ["Figure", "6A", ")", "3D", "reconstruction", "of", "wing", "disc", "immuno", "-", "labelled", "for", "endogenous", "Ptc", "and", "dorsally", "over", "-", "expressing", "the", "Tsp96F", "-", "HA", "construct", ",", "keeping", "the", "ventral", "side", "of", "the", "disc", "in", "wild", "type", "condition", "as", "internal", "control", ".", "the", "dorsal", "accumulation", "of", "Ptc", "in", "very", "large", "punctae", "across", "the", "apico", "-", "basal", "axis", ",", "but", "mainly", "at", "the", "basal", "side", "of", "the", "epithelium", ".", "On", "the", "right", ",", "graphs", "represent", "fluorescence", "values", "from", "apical", "to", "basal", ",", "comparing", "dorsal", "and", "ventral", "sides", "and", "showing", "a", "shift", "of", "the", "highest", "values", "towards", "the", "basal", "side", "after", "Tsp96", "-", "HA", "expression", ".", "B", ")", "Confocal", "image", "of", "a", "wing", "disc", "with", "a", "clone", "expressing", "Tsp96F", "-", "HA", "and", "immuno", "-", "labelled", "with", "anti", "-", "Ptc", "and", "anti", "-", "HA", "antibodies", ",", "which", "co", "-", "localize", "in", "the", "large", "basolateral", "punctae", "(", "yellow", "arrows", ")", ".", "C", ")", "Electron", "microscopy", "image", "from", "immunolabelled", "(", "anti", "-", "GFP", ")", "Hh", "-", "receiving", "cells", "of", "a", "wing", "disc", "expressing", "Ptc", "-", "GFP", "and", "Tsp96F", "-", "HA", ".", "The", "detailed", "image", "shows", "large", "sac", "structures", "that", "accumulate", "several", "dense", "MVBs", "positive", "labelled", "for", "Ptc", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6A) 3D reconstruction of wing disc immuno-labelled for endogenous Ptc and dorsally over-expressing the Tsp96F-HA construct, keeping the ventral side of the disc in wild type condition as internal control. the dorsal accumulation of Ptc in very large punctae across the apico-basal axis, but mainly at the basal side of the epithelium. On the right, graphs represent fluorescence values from apical to basal, comparing dorsal and ventral sides and showing a shift of the highest values towards the basal side after Tsp96-HA expression.B) Confocal image of a wing disc with a clone expressing Tsp96F-HA and immuno-labelled with anti-Ptc and anti-HA antibodies, which co-localize in the large basolateral punctae (yellow arrows).C) Electron microscopy image from immunolabelled (anti-GFP) Hh-receiving cells of a wing disc expressing Ptc-GFP and Tsp96F-HA. The detailed image shows large sac structures that accumulate several dense MVBs positive labelled for Ptc."}
{"words": ["Figure", "7A", ")", "Ptc", "is", "mainly", "secreted", "in", "small", "EVs", "(", "P100K", ")", "from", "Cl8", "cells", ".", "B", ")", "Large", "EVs", "(", "lEVs", ")", ",", "small", "EVs", "(", "sEVs", ")", "and", "very", "small", "EVs", "(", "vsEVs", ")", "were", "analysed", "in", "triplicate", "by", "Western", "blotting", ".", "sEVs", "are", "enriched", "in", "Ptc", "and", "in", "the", "EV", "-", "associated", "proteins", "Syntaxin1", "(", "Synt1A", ")", ",", "Late", "bloomer", "(", "Lbm", ")", "and", "Hsp70", ".", "C", ")", "Fractionation", "of", "sEVs", "by", "Sucrose", "Density", "Gradient", ":", "Ptc", "partially", "co", "-", "fractioned", "with", "Synt1A", ",", "Lbm", "and", "Hsp70", ".", "Note", "that", "while", "unprocessed", "form", "of", "co", "-", "receptor", "Ihog", "does", "not", "co", "-", "fraction", "with", "Ptc", ",", "the", "processed", "form", "does", "in", "the", "same", "subpopulation", ".", "D", ")", "Fractionation", "of", "sEVs", "by", "Size", "Exclusion", "Chromatography", ":", "Ptc", "perfectly", "co", "-", "fractioned", "with", "Synt1A", ",", "Lbm", "and", "Hsp70", ".", "In", "agreement", "with", "the", "density", "gradient", "analysis", ",", "unprocessed", "form", "of", "co", "-", "receptor", "Ihog", "does", "not", "co", "-", "fraction", "with", "Ptc", "in", "the", "same", "subpopulation", "of", "sEVs", ".", "E", ")", "Effect", "on", "EV", "-", "associated", "Ptc", "secretion", "after", "gene", "silencing", "on", "Cl8", "cells", "by", "dsRNAs", "against", "the", "SNARE", "proteins", "Syb", "and", "α", "-", "Snap", ",", "the", "tetraspanin", "Tsp96F", "and", "the", "ESCRT", "components", "Hrs", ",", "Tsg101", ",", "Shrub", "and", "Vps4", ".", "Hsp70", "in", "cells", "and", "EVs", "is", "detected", "by", "different", "exposition", "time", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A) Ptc is mainly secreted in small EVs (P100K) from Cl8 cells.B) Large EVs (lEVs), small EVs (sEVs) and very small EVs (vsEVs) were analysed in triplicate by Western blotting. sEVs are enriched in Ptc and in the EV-associated proteins Syntaxin1 (Synt1A), Late bloomer (Lbm) and Hsp70.C) Fractionation of sEVs by Sucrose Density Gradient: Ptc partially co-fractioned with Synt1A, Lbm and Hsp70. Note that while unprocessed form of co-receptor Ihog does not co-fraction with Ptc, the processed form does in the same subpopulation.D) Fractionation of sEVs by Size Exclusion Chromatography: Ptc perfectly co-fractioned with Synt1A, Lbm and Hsp70. In agreement with the density gradient analysis, unprocessed form of co-receptor Ihog does not co-fraction with Ptc in the same subpopulation of sEVs.E) Effect on EV-associated Ptc secretion after gene silencing on Cl8 cells by dsRNAs against the SNARE proteins Syb and α-Snap, the tetraspanin Tsp96F and the ESCRT components Hrs, Tsg101, Shrub and Vps4. Hsp70 in cells and EVs is detected by different exposition time."}
{"words": ["Figure", "8A", ")", "Projection", "images", "of", "three", "confocal", "sections", "(", "1", "μm", ")", "at", "the", "basal", "side", "of", "wing", "discs", "expressing", "the", "Bac", "constructs", "for", "Hh", "-", "GFP", "and", "Ptc", "-", "cherry", ",", "used", "to", "analyse", "co", "-", "localization", "between", "the", "ligand", "and", "the", "receptor", "in", "wild", "type", "conditions", "and", "after", "inhibition", "of", "vesicle", "fusion", "(", "Syb", "RNAi", ")", ",", "vesicle", "trafficking", "(", "Hrs", "RNAi", ")", "or", "Ptc", "protein", "degradation", "(", "Dor", "RNAi", ")", ".", "Boxplot", "shows", "co", "-", "localization", "rates", "using", "the", "Manders", "coefficient", "for", "proportion", "of", "red", "covered", "by", "green", "in", "projected", "images", "for", "wing", "discs", "temporally", "expressing", "RNAi", "against", "ESCRT", "proteins", "Hrs", "and", "Vps4", ",", "SNAREs", "Syb", "and", "α", "-", "Snap", ",", "and", "Dor", "as", "control", "for", "effects", "after", "Ptc", "degradation", "-", "blocking", ",", "as", "well", "as", "temporally", "over", "-", "expressing", "the", "Tsp96F", "-", "HA", ".", "Central", "horizontal", "lines", "show", "median", "values", "of", "N", "=", "8", "-", "12", "box", "shows", "lower", "and", "upper", "quartiles", "and", "the", "whiskers", "show", "the", "maximum", "and", "minimum", "excluding", ".", "Note", "the", "significant", "reduction", "in", "co", "-", "localization", "rates", "(", "1", "=", "total", "coverage", "of", "red", "by", "green", ")", "after", "RNAi", "expression", "for", "both", "ESCRT", "and", "SNARE", "proteins", "as", "well", "as", "after", "Tsp96F", "-", "HA", "over", "-", "expression", ",", "while", "RNAi", "expression", "for", "Dor", "presents", "greater", "co", "-", "localization", ".", "B", ")", "Projection", "images", "of", "three", "confocal", "sections", "(", "1", "μm", ")", "from", "the", "apical", "side", "of", "the", "wing", "discs", ".", "Quantification", "of", "co", "-", "localization", "rates", "using", "apical", "projection", "images", ";", "central", "horizontal", "lines", "show", "median", "values", "of", "N", "=", "8", "-", "12", ",", "box", "shows", "lower", "and", "upper", "quartiles", "and", "the", "whiskers", "show", "the", "maximum", "and", "minimum", "excluding", "outliers", ".", "Note", "that", "at", "the", "apical", "side", "no", "clear", "significant", "reduction", "in", "co", "-", "localization", "rates", "(", "1", "=", "total", "coverage", "of", "red", "by", "green", ")", "is", "observed", "after", "RNAi", "expression", "or", "in", "Tsp96F", "-", "HA", "over", "-", "expression", ".", "C", ")", "Correlation", "coefficients", "between", "the", "maximum", "value", "of", "quantified", "integrated", "density", "(", "integrating", "both", "fluorescence", "intensity", "and", "signal", "area", ")", "for", "Ptc", "-", "GFP", "values", "(", "Yac", "construct", ")", "and", "distance", "from", "the", "basal", "side", "(", "-", "1", "=", "basal", ",", "+", "1", "=", "apical", ")", ".", "Box", "plot", "shows", "quantification", "data", "of", "discs", "after", "RNAi", "expression", "for", "the", "vacuole", "sorting", "protein", "Dor", "(", "necessary", "for", "Ptc", "degradation", ")", ",", "the", "ESCRT", "Hrs", ",", "the", "SNARE", "Syb", "as", "well", "as", "after", "over", "-", "expression", "of", "the", "Tsp96F", "-", "HA", "construct", "and", "wild", "type", "condition", ".", "Central", "horizontal", "lines", "show", "median", "values", "of", "N", "=", "8", "-", "12", ",", "box", "shows", "lower", "and", "upper", "quartiles", "and", "the", "whiskers", "show", "the", "maximum", "and", "minimum", "excluding", "outliers", ".", "Note", "the", "apical", "localization", "of", "Ptc", "-", "GFP", "highest", "values", "after", "degradation", "impairment", "(", "Dor", "RNAi", ")", "in", "contrast", "to", "the", "basal", "shift", "resulting", "from", "exocytosis", "deficiency", "(", "Syb", "RNAi", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8A) Projection images of three confocal sections (1 μm) at the basal side of wing discs expressing the Bac constructs for Hh-GFP and Ptc-cherry, used to analyse co-localization between the ligand and the receptor in wild type conditions and after inhibition of vesicle fusion (Syb RNAi), vesicle trafficking (Hrs RNAi) or Ptc protein degradation (Dor RNAi). Boxplot shows co-localization rates using the Manders coefficient for proportion of red covered by green in projected images for wing discs temporally expressing RNAi against ESCRT proteins Hrs and Vps4, SNAREs Syb and α-Snap, and Dor as control for effects after Ptc degradation-blocking, as well as temporally over-expressing the Tsp96F-HA. Central horizontal lines show median values of N=8-12 box shows lower and upper quartiles and the whiskers show the maximum and minimum excluding. Note the significant reduction in co-localization rates (1= total coverage of red by green) after RNAi expression for both ESCRT and SNARE proteins as well as after Tsp96F-HA over-expression, while RNAi expression for Dor presents greater co-localization.B) Projection images of three confocal sections (1 μm) from the apical side of the wing discs. Quantification of co-localization rates using apical projection images; central horizontal lines show median values of N=8-12 , box shows lower and upper quartiles and the whiskers show the maximum and minimum excluding outliers. Note that at the apical side no clear significant reduction in co-localization rates (1= total coverage of red by green) is observed after RNAi expression or in Tsp96F-HA over-expression.C) Correlation coefficients between the maximum value of quantified integrated density (integrating both fluorescence intensity and signal area) for Ptc-GFP values (Yac construct) and distance from the basal side (-1=basal, +1=apical). Box plot shows quantification data of discs after RNAi expression for the vacuole sorting protein Dor (necessary for Ptc degradation), the ESCRT Hrs, the SNARE Syb as well as after over-expression of the Tsp96F-HA construct and wild type condition. Central horizontal lines show median values of N=8-12, box shows lower and upper quartiles and the whiskers show the maximum and minimum excluding outliers. Note the apical localization of Ptc-GFP highest values after degradation impairment (Dor RNAi) in contrast to the basal shift resulting from exocytosis deficiency (Syb RNAi)."}
{"words": ["Figure", "9A", ")", "Confocal", "images", "at", "the", "lateral", "plane", "showing", "the", "immunostaining", "of", "the", "medium", "threshold", "Hh", "target", "Collier", "(", "Col", ")", "of", "wild", "type", "wing", "discs", "and", "discs", "after", "inhibition", "of", "vesicle", "fusion", "(", "α", "-", "Snap", "RNAi", ")", ",", "vesicle", "trafficking", "(", "Hrs", "RNAi", ")", "or", "in", "over", "-", "expression", "of", "the", "Tsp96F", "-", "HA", ".", "Quantification", "of", "gradient", "lengths", "(", "μm", ")", "using", "Collier", "signal", "and", "normalized", "to", "the", "wing", "pouch", "size", ",", "showing", "the", "proportion", "of", "wing", "pouch", "covered", "by", "signal", "(", "1", "=", "total", "coverage", ")", ".", "Quantification", "was", "performed", "for", "wild", "type", "condition", "as", "well", "as", "in", "temporally", "regulated", "RNAi", "expression", "for", "the", "ESCRT", "complex", "proteins", "Hrs", ",", "Tsg101", ",", "Shrub", "and", "Vps4", "and", "for", "the", "SNARE", "proteins", "Syb", ",", "Snap24", ",", "α", "-", "Snap", ",", "as", "well", "as", "in", "transient", "over", "-", "expression", "of", "the", "Tsp96F", "-", "HA", ".", "Central", "horizontal", "lines", "show", "median", "values", "of", "N", "=", "7", "-", "22", ",", "box", "shows", "lower", "and", "upper", "quartiles", "and", "the", "whiskers", "show", "the", "maximum", "and", "minimum", "excluding", "outliers", ".", "Note", "a", "slight", "but", "significant", "increase", "in", "the", "length", "of", "Col", "signal", "for", "all", "treatment", "compared", "to", "the", "wild", "type", "condition", ".", "B", ")", "Lateral", "confocal", "images", "and", "quantification", "of", "the", "extension", "of", "immuno", "-", "labeled", "Engrailed", "as", "the", "high", "threshold", "Hh", "target", ".", "Quantification", "shows", "number", "of", "cell", "diameters", "covered", "by", "signal", "from", "the", "posterior", "/", "anterior", "border", "marked", "by", "Hh", "-", "GFP", "(", "Bac", "construct", ")", ";", "central", "horizontal", "lines", "show", "median", "values", "of", "N", "=", "6", "-", "10", "box", "shows", "lower", "and", "upper", "quartiles", "and", "the", "whiskers", "show", "the", "maximum", "and", "minimum", "excluding", "outliers", ".", "Note", "a", "significant", "reduction", "after", "RNAi", "expression", ",", "suggesting", "Hh", "reception", "impairment", "and", "flattening", "of", "the", "signal", "gradient", ".", "C", ")", "Lateral", "confocal", "images", "and", "quantification", "of", "Ptc", "transcription", "as", "a", "Hh", "target", "through", "immunolabeling", "of", "the", "reporter", "β", "−", "galactosidase", "(", "Ptc", "-", "LacZ", ")", ".", "Middle", "graph", "shows", "the", "extension", "covered", "by", "signal", "normalized", "to", "wing", "pouch", "size", ",", "in", "wild", "type", "condition", "(", "N", "=", "6", ")", "or", "after", "ectopic", "expression", "of", "the", "Tsp96F", "-", "HA", "construct", "(", "N", "=", "9", ")", ".", "Green", "shaded", "areas", "show", "data", "variability", "and", "dotted", "line", "gives", "the", "average", "values", ".", "Note", "the", "greater", "distance", "covered", "after", "Tsp96F", "-", "HA", "transient", "expression", ".", "Boxplot", "(", "right", ")", "shows", "distance", "quantifications", "with", "central", "horizontal", "lines", "showing", "median", "values", "of", "N", "=", "6", "-", "9", ",", "box", "showing", "lower", "and", "upper", "quartiles", "and", "whiskers", "showing", "the", "maximum", "and", "minimum", "excluding", "outliers", ".", "Note", "a", "significant", "extension", "under", "Tsp96F", "-", "HA", "expression", ",", "suggesting", "again", "flattening", "of", "the", "signal", "gradient", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 9A) Confocal images at the lateral plane showing the immunostaining of the medium threshold Hh target Collier (Col) of wild type wing discs and discs after inhibition of vesicle fusion (α-Snap RNAi), vesicle trafficking (Hrs RNAi) or in over-expression of the Tsp96F-HA. Quantification of gradient lengths (μm) using Collier signal and normalized to the wing pouch size, showing the proportion of wing pouch covered by signal (1=total coverage). Quantification was performed for wild type condition as well as in temporally regulated RNAi expression for the ESCRT complex proteins Hrs, Tsg101, Shrub and Vps4 and for the SNARE proteins Syb, Snap24, α-Snap, as well as in transient over-expression of the Tsp96F-HA. Central horizontal lines show median values of N=7-22 , box shows lower and upper quartiles and the whiskers show the maximum and minimum excluding outliers. Note a slight but significant increase in the length of Col signal for all treatment compared to the wild type condition.B) Lateral confocal images and quantification of the extension of immuno-labeled Engrailed as the high threshold Hh target. Quantification shows number of cell diameters covered by signal from the posterior/anterior border marked by Hh-GFP (Bac construct); central horizontal lines show median values of N=6-10 box shows lower and upper quartiles and the whiskers show the maximum and minimum excluding outliers. Note a significant reduction after RNAi expression, suggesting Hh reception impairment and flattening of the signal gradient.C) Lateral confocal images and quantification of Ptc transcription as a Hh target through immunolabeling of the reporter β−galactosidase (Ptc-LacZ). Middle graph shows the extension covered by signal normalized to wing pouch size, in wild type condition (N=6) or after ectopic expression of the Tsp96F-HA construct (N=9). Green shaded areas show data variability and dotted line gives the average values. Note the greater distance covered after Tsp96F-HA transient expression. Boxplot (right) shows distance quantifications with central horizontal lines showing median values of N=6-9 , box showing lower and upper quartiles and whiskers showing the maximum and minimum excluding outliers. Note a significant extension under Tsp96F-HA expression, suggesting again flattening of the signal gradient."}
{"words": ["Figure", "1BACE1", "or", "APP", "was", "immunoprecipitated", "from", "mouse", "brains", "and", "blotted", "with", "E4", "-", "PHA", "lectin", "(", "lower", ")", "or", "anti", "-", "BACE1", "or", "APP", "antibodies", "(", "upper", ")", ".", "hAPP", "indicates", "the", "APP23", "transgenic", "mouse", "model", "for", "AD", ".", "Proteins", "from", "mouse", "brain", "membrane", "fractions", "were", "treated", "with", "or", "without", "PNGase", "F", "and", "then", "immunoblotted", "for", "BACE1", "or", "for", "syntaxin", "6", "(", "loading", "control", ")", ".", "LC", "-", "MS", "base", "peak", "chromatogram", "of", "desialo", "-", "alditol", "N", "-", "glycans", "derived", "from", "mouse", "brain", "BACE1", ".", "To", "simplify", "the", "results", ",", "N", "-", "glycans", "were", "chemically", "desialylated", "before", "LC", "-", "MS", "analysis", ".", "BACE1", "-", "specific", "glycans", ",", "judged", "by", "comparison", "with", "N", "-", "glycan", "structures", "from", "anti", "-", "BACE1", "IgG", "(", "shown", "in", "Supplementary", "Fig", "S2C", ")", ",", "are", "highlighted", "by", "red", "squares", ".", "Asterisks", "indicate", "glycans", "demonstrated", "by", "MS", "/", "MS", "analysis", "to", "contain", "a", "bisecting", "GlcNAc", "structure", ".", "Numbers", "in", "parentheses", "indicate", "the", "charge", "state", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1BACE1 or APP was immunoprecipitated from mouse brains and blotted with E4-PHA lectin (lower) or anti-BACE1 or APP antibodies (upper). hAPP indicates the APP23 transgenic mouse model for AD.Proteins from mouse brain membrane fractions were treated with or without PNGase F and then immunoblotted for BACE1 or for syntaxin 6 (loading control).LC-MS base peak chromatogram of desialo-alditol N-glycans derived from mouse brain BACE1. To simplify the results, N-glycans were chemically desialylated before LC-MS analysis. BACE1-specific glycans, judged by comparison with N-glycan structures from anti-BACE1 IgG (shown in Supplementary Fig S2C), are highlighted by red squares. Asterisks indicate glycans demonstrated by MS/MS analysis to contain a bisecting GlcNAc structure. Numbers in parentheses indicate the charge state."}
{"words": ["Figure", "2BACE1", "from", "temporal", "lobe", "membrane", "fractions", "of", "NC", ",", "eAD", ",", "or", "AD", "patients", "was", "immunoprecipitated", "and", "blotted", "with", "E4", "-", "PHA", "(", "upper", ")", "or", "anti", "-", "BACE1", "(", "lower", ")", ".", "The", "signal", "intensity", "of", "E4", "-", "PHA", "relative", "to", "that", "of", "BACE1", "was", "calculated", "(", "n", "=", "10", ")", ".", "The", "graph", "shows", "means", "±", "SEM", "(", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "one", "-", "way", "ANOVA", "with", "post", "hoc", "Tukey", "-", "Kramer", "test", ".", "P", "=", "0", ".", "014", "for", "NC", "versus", "eAD", ",", "P", "=", "0", ".", "028", "for", "NC", "versus", "AD", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2BACE1 from temporal lobe membrane fractions of NC, eAD, or AD patients was immunoprecipitated and blotted with E4-PHA (upper) or anti-BACE1 (lower). The signal intensity of E4-PHA relative to that of BACE1 was calculated (n = 10). The graph shows means ± SEM (*P < 0.05; one-way ANOVA with post hoc Tukey-Kramer test. P = 0.014 for NC versus eAD, P = 0.028 for NC versus AD)."}
{"words": ["Figure", "3APP", "metabolites", "from", "3", "-", "month", "-", "old", "mouse", "brain", "membrane", "(", "A", ")", "or", "soluble", "(", "B", ")", "fractions", "were", "immunoblotted", ".", "The", "signal", "intensity", "was", "quantified", "(", "n", "=", "4", "-", "5", ")", ".", "All", "graphs", "show", "means", "±", "SEM", "(", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ";", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "for", "(", "A", ")", "βCTF", "and", "(", "B", ")", "sAPPα", ",", "and", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", "for", "the", "others", ".", "P", "=", "0", ".", "386", "for", "APP", ",", "P", "=", "0", ".", "602", "for", "αCTF", ",", "P", "=", "0", ".", "045", "for", "βCTF", ",", "P", "=", "0", ".", "218", "for", "sAPPα", ",", "P", "=", "0", ".", "022", "for", "sAPPβ", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3APP metabolites from 3-month-old mouse brain membrane (A) or soluble (B) fractions were immunoblotted. The signal intensity was quantified (n = 4-5). All graphs show means ± SEM (*P < 0.05; Student's t-test for (A) βCTF and (B) sAPPα, and Mann-Whitney U-test for the others. P = 0.386 for APP, P = 0.602 for αCTF, P = 0.045 for βCTF, P = 0.218 for sAPPα, P = 0.022 for sAPPβ)."}
{"words": ["Figure", "4Amounts", "of", "Aβ40", "or", "Aβ42", "in", "the", "TBS", "-", "soluble", "or", "Gu", "-", "HCl", "-", "extractable", "fraction", "from", "(", "A", ")", "3", "-", "month", "-", "old", "or", "(", "B", ")", "12", "-", "month", "-", "old", "hAPP", "/", "Mgat3", "+", "/", "+", ",", "hAPP", "/", "Mgat3", "+", "/", "−", ",", "or", "hAPP", "/", "Mgat3", "−", "/", "−", "brains", "(", "n", "=", "5", ")", ".", "P", "=", "0", ".", "015", "for", "TBS", "Aβ40", ",", "P", "=", "0", ".", "034", "for", "TBS", "Aβ42", ",", "P", "=", "0", ".", "001", "and", "0", ".", "012", "for", "Gn", "-", "HCl", "Aβ40", ",", "P", "=", "0", ".", "024", "for", "Gn", "-", "HCl", "Aβ42", "in", "(", "A", ")", ",", "P", "=", "0", ".", "040", "for", "Gn", "-", "HCl", "Aβ40", ",", "P", "=", "0", ".", "047", "for", "Gn", "-", "HCl", "Aβ42", "in", "(", "B", ")", ".", "Amounts", "of", "Aβ40", "or", "Aβ42", "in", "the", "TBS", "-", "soluble", "or", "Gu", "-", "HCl", "-", "extractable", "fraction", "from", "3", "-", "to", "4", "-", "month", "-", "old", "Mgat3", "+", "/", "+", "or", "Mgat3", "−", "/", "−", "brains", "(", "n", "=", "7", "-", "8", ")", ".", "An", "outlier", "value", "was", "rejected", "by", "the", "Smirnov", "-", "Grubbs", "'", "test", "(", "P", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "P", "=", "0", ".", "045", "for", "Gn", "-", "HCl", "Aβ40", ".", "Immunostaining", "of", "Aβ", "plaques", "in", "12", "-", "month", "-", "old", "mouse", "brain", "(", "left", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "300", "μm", ".", "The", "number", "of", "FSB", "-", "stained", "Aβ", "plaques", "in", "brain", "sections", "prepared", "from", "12", "-", "month", "-", "old", "male", "mice", "was", "quantified", "(", "right", ")", "(", "n", "=", "6", ")", ".", "P", "=", "0", ".", "004", "for", "hippocampus", ",", "P", "=", "0", ".", "0003", "for", "cortex", ".", "The", "Y", "-", "maze", "test", "was", "performed", "using", "12", "-", "month", "-", "old", "male", "Mgat3", "+", "/", "+", ",", "Mgat3", "−", "/", "−", ",", "hAPP", "/", "Mgat3", "+", "/", "+", ",", "or", "hAPP", "/", "Mgat3", "−", "/", "−", "mice", "(", "n", "=", "8", "-", "10", ")", ".", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "004", "for", "Mgat3", "+", "/", "+", "versus", "hAPP", "/", "Mgat3", "+", "/", "+", ",", "*", "P", "=", "0", ".", "022", "for", "hAPP", "/", "Mgat3", "+", "/", "+", "versus", "hAPP", "/", "Mgat3", "−", "/", "−", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Amounts of Aβ40 or Aβ42 in the TBS-soluble or Gu-HCl-extractable fraction from (A) 3-month-old or (B) 12-month-old hAPP/Mgat3+/+, hAPP/Mgat3+/−, or hAPP/Mgat3−/− brains (n = 5). P = 0.015 for TBS Aβ40, P = 0.034 for TBS Aβ42, P = 0.001 and 0.012 for Gn-HCl Aβ40, P = 0.024 for Gn-HCl Aβ42 in (A), P = 0.040 for Gn-HCl Aβ40, P = 0.047 for Gn-HCl Aβ42 in (B).Amounts of Aβ40 or Aβ42 in the TBS-soluble or Gu-HCl-extractable fraction from 3- to 4-month-old Mgat3+/+ or Mgat3−/− brains (n = 7-8). An outlier value was rejected by the Smirnov-Grubbs' test (P < 0.05). P = 0.045 for Gn-HCl Aβ40.Immunostaining of Aβ plaques in 12-month-old mouse brain (left). Scale bar, 300 μm. The number of FSB-stained Aβ plaques in brain sections prepared from 12-month-old male mice was quantified (right) (n = 6). P = 0.004 for hippocampus, P = 0.0003 for cortex.The Y-maze test was performed using 12-month-old male Mgat3+/+, Mgat3−/−, hAPP/Mgat3+/+, or hAPP/Mgat3−/− mice (n = 8-10). **P = 0.004 for Mgat3+/+ versus hAPP/Mgat3+/+, *P = 0.022 for hAPP/Mgat3+/+ versus hAPP/Mgat3−/−."}
{"words": ["Figure", "5BACE1", "from", "2", "-", "week", "-", "old", "mouse", "brains", "was", "immunoprecipitated", "and", "immunoblotted", "(", "left", ")", ".", "Immunoprecipitated", "BACE1", "activity", "was", "measured", "in", "vitro", "(", "right", ",", "n", "=", "3", ")", ".", "The", "values", "of", "Bace1", "−", "/", "−", "samples", "were", "subtracted", "as", "a", "background", ".", "N", ".", "S", ".", ",", "P", "=", "0", ".", "101", ".", "MEF", "homogenates", "were", "fractionated", "by", "sucrose", "density", "centrifugation", "and", "immunoblotted", "for", "BACE1", ",", "APP", ",", "rab5", ",", "or", "rab7", ".", "EE", ",", "early", "endosome", ";", "LE", ",", "late", "endosome", ".", "Brain", "homogenates", "were", "fractionated", "by", "sucrose", "density", "centrifugation", "and", "immunoblotted", "for", "BACE1", ",", "rab5", ",", "or", "rab9", ".", "EE", ",", "early", "endosome", ";", "LE", ",", "late", "endosome", ".", "Signal", "intensities", "were", "quantified", "and", "are", "shown", "in", "the", "right", "graphs", ".", "Immunostaining", "of", "12", "-", "month", "-", "old", "mouse", "cerebral", "cortex", "for", "BACE1", "and", "APP", ".", "A", "typical", "image", "in", "the", "vicinity", "of", "plaque", "-", "forming", "area", "is", "shown", "for", "hAPP", "/", "Mgat3", "+", "/", "+", "brain", ".", "The", "area", "of", "co", "-", "localization", "was", "quantified", "using", "random", "images", "of", "cerebral", "cortex", "(", "n", "=", "10", ")", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "015", ".", "Immunoblot", "of", "BACE1", "or", "GAPDH", "(", "loading", "control", ")", "from", "immortalized", "MEFs", "treated", "with", "a", "proteasome", "inhibitor", "(", "MG132", ")", "or", "a", "lysosome", "inhibitor", "(", "chloroquine", ";", "CQ", ")", ".", "Immunostaining", "of", "12", "-", "month", "-", "old", "mouse", "cerebral", "cortex", "for", "BACE1", "(", "F", ")", ",", "or", "nicastrin", "(", "G", ")", ",", "and", "Lamp1", ".", "LE", ",", "late", "endosome", ".", "Scale", "bar", ",", "10", "μm", ".", "The", "area", "in", "which", "co", "-", "localized", "staining", "was", "observed", "was", "quantified", "as", "a", "percentage", "of", "the", "total", "BACE1", "-", "positive", "area", "(", "right", ",", "n", "=", "10", ")", ".", "*", "*", "P", "=", "0", ".", "007", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5BACE1 from 2-week-old mouse brains was immunoprecipitated and immunoblotted (left). Immunoprecipitated BACE1 activity was measured in vitro (right, n = 3). The values of Bace1−/− samples were subtracted as a background. N.S., P = 0.101.MEF homogenates were fractionated by sucrose density centrifugation and immunoblotted for BACE1, APP, rab5, or rab7. EE, early endosome; LE, late endosome.Brain homogenates were fractionated by sucrose density centrifugation and immunoblotted for BACE1, rab5, or rab9. EE, early endosome; LE, late endosome. Signal intensities were quantified and are shown in the right graphs.Immunostaining of 12-month-old mouse cerebral cortex for BACE1 and APP. A typical image in the vicinity of plaque-forming area is shown for hAPP/Mgat3+/+ brain. The area of co-localization was quantified using random images of cerebral cortex (n = 10). *P = 0.015.Immunoblot of BACE1 or GAPDH (loading control) from immortalized MEFs treated with a proteasome inhibitor (MG132) or a lysosome inhibitor (chloroquine; CQ).Immunostaining of 12-month-old mouse cerebral cortex for BACE1 (F), or nicastrin (G), and Lamp1. LE, late endosome. Scale bar, 10 μm. The area in which co-localized staining was observed was quantified as a percentage of the total BACE1-positive area (right, n = 10). **P = 0.007."}
{"words": ["Figure", "6Immunostaining", "of", "12", "-", "month", "-", "old", "brain", "sections", "(", "cerebral", "cortex", ")", "with", "anti", "-", "BACE1", ".", "Scale", "bar", ",", "100", "μm", ".", "Proteins", "from", "the", "membrane", "fractions", "of", "12", "-", "month", "-", "old", "mouse", "brains", "(", "n", "=", "4", "-", "5", ")", "were", "immunoblotted", "for", "BACE1", ",", "and", "BACE1", "intensity", "was", "quantified", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "044", ".", "Lysates", "from", "MEFs", "were", "immunoblotted", "for", "APP", ",", "BACE1", ",", "or", "GAPDH", "(", "loading", "control", ")", ",", "and", "BACE1", "intensity", "was", "quantified", "(", "n", "=", "4", ")", ".", "Amount", "of", "Aβ40", "in", "the", "culture", "medium", "of", "immortalized", "MEFs", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "*", "P", "=", "0", ".", "045", ".", "MEFs", "were", "transfected", "with", "control", "siRNA", "or", "GGA3", "-", "siRNA", "and", "then", "immunoblotted", "for", "BACE1", ",", "GGA3", ",", "or", "GAPDH", "(", "loading", "control", ")", "(", "n", "=", "6", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Immunostaining of 12-month-old brain sections (cerebral cortex) with anti-BACE1. Scale bar, 100 μm.Proteins from the membrane fractions of 12-month-old mouse brains (n = 4-5) were immunoblotted for BACE1, and BACE1 intensity was quantified. *P = 0.044.Lysates from MEFs were immunoblotted for APP, BACE1, or GAPDH (loading control), and BACE1 intensity was quantified (n = 4).Amount of Aβ40 in the culture medium of immortalized MEFs (n = 3). *P = 0.045.MEFs were transfected with control siRNA or GGA3-siRNA and then immunoblotted for BACE1, GGA3, or GAPDH (loading control) (n = 6)."}
{"words": ["Figure", "7Membrane", "fractions", "from", "3", "-", "week", "-", "old", "Mgat3", "+", "/", "+", ",", "Mgat3", "−", "/", "−", ",", "and", "Bace1", "−", "/", "−", "mice", "were", "immunoblotted", "for", "CHL1", "(", "upper", ")", ",", "contactin", "-", "2", "(", "middle", ")", ",", "or", "syntaxin", "6", "(", "lower", ")", "(", "n", "=", "4", "-", "5", ")", ".", "The", "graphs", "show", "means", "±", "SEM", "(", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ";", "two", "-", "way", "ANOVA", "with", "post", "hoc", "Tukey", "-", "Kramer", "test", ",", "P", "=", "0", ".", "006", "for", "Mgat3", "+", "/", "+", "versus", "Bace1", "−", "/", "−", ",", "P", "=", "0", ".", "008", "for", "Mgat3", "−", "/", "−", "versus", "Bace1", "−", "/", "−", "in", "CHL1", "/", "syn6", ",", "P", "=", "0", ".", "001", "for", "Mgat3", "+", "/", "+", "versus", "Bace1", "−", "/", "−", ",", "P", "=", "0", ".", "002", "for", "Mgat3", "−", "/", "−", "versus", "Bace1", "−", "/", "−", "in", "Contactin", "-", "2", "/", "syn6", ")", ".", "Number", "of", "pups", "surviving", "at", "4", "weeks", "following", "a", "cross", "between", "heterozygous", "male", "and", "female", "mice", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Membrane fractions from 3-week-old Mgat3+/+, Mgat3−/−, and Bace1−/− mice were immunoblotted for CHL1 (upper), contactin-2 (middle), or syntaxin 6 (lower) (n = 4-5). The graphs show means ± SEM (**P < 0.01; two-way ANOVA with post hoc Tukey-Kramer test, P = 0.006 for Mgat3+/+ versus Bace1−/−, P = 0.008 for Mgat3−/− versus Bace1−/− in CHL1/syn6, P = 0.001 for Mgat3+/+ versus Bace1−/−, P = 0.002 for Mgat3−/− versus Bace1−/− in Contactin-2/syn6).Number of pups surviving at 4 weeks following a cross between heterozygous male and female mice."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "A", ")", "Heteroplasmy", "levels", "by", "PCR", "-", "RFLP", "at", "position", "3243", "in", "82", "hiPSCs", "clones", "at", "passage", "2", ",", "derived", "from", "three", "MELAS", "patients", "(", "MitoA", ",", "MitoB", ",", "MitoC", ")", ".", "The", "black", "dots", "represent", "the", "mutation", "load", "for", "a", "specific", "hiPSC", "clone", ";", "n", "is", "the", "total", "number", "of", "individual", "hiPSC", "clones", "analyzed", "per", "patient", ".", "The", "red", "stars", "represent", "the", "heteroplasmy", "levels", "for", "the", "parental", "fibroblasts", ".", "(", "A", ")", "Heteroplasmy", "levels", "by", "PCR", "-", "RFLP", "at", "position", "3243", "in", "82", "hiPSCs", "clones", "at", "passage", "2", ",", "derived", "from", "three", "MELAS", "patients", "(", "MitoA", ",", "MitoB", ",", "MitoC", ")", ".", "The", "black", "dots", "represent", "the", "mutation", "load", "for", "a", "specific", "hiPSC", "clone", ";", "n", "is", "the", "total", "number", "of", "individual", "hiPSC", "clones", "analyzed", "per", "patient", ".", "The", "red", "stars", "represent", "the", "heteroplasmy", "levels", "for", "the", "parental", "fibroblasts", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(A) Heteroplasmy levels by PCR-RFLP at position 3243 in 82 hiPSCs clones at passage 2, derived from three MELAS patients (MitoA, MitoB, MitoC). The black dots represent the mutation load for a specific hiPSC clone; n is the total number of individual hiPSC clones analyzed per patient. The red stars represent the heteroplasmy levels for the parental fibroblasts.(A) Heteroplasmy levels by PCR-RFLP at position 3243 in 82 hiPSCs clones at passage 2, derived from three MELAS patients (MitoA, MitoB, MitoC). The black dots represent the mutation load for a specific hiPSC clone; n is the total number of individual hiPSC clones analyzed per patient. The red stars represent the heteroplasmy levels for the parental fibroblasts."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "A", ")", "mtDNA", "NGS", "of", "MitoA", "fibroblasts", "(", "MitoA", "FB", "at", "passage", "5", ")", "and", "MitoA", "-", "derived", "hiPSCs", "(", "passages", "7", "-", "9", ")", ";", "n", "=", "13", ".", "(", "B", ")", "mtDNA", "NGS", "of", "MitoB", "fibroblasts", "(", "MitoB", "FB", "at", "passage", "3", ")", "and", "MitoB", "-", "derived", "hiPSCs", "(", "passages", "5", "-", "11", ")", ";", "n", "=", "12", ".", "(", "C", ")", "mtDNA", "NGS", "of", "MitoC", "fibroblasts", "(", "MitoC", "FB", "at", "passage", "7", ")", "and", "MitoC", "-", "derived", "hiPSCs", "(", "passages", "5", "-", "11", ")", ";", "n", "=", "11", ".", "GPMs", "are", "represented", "by", "black", "diamonds", "at", "the", "specific", "mtDNA", "positions", ";", "small", "black", "diamonds", "denote", "mutation", "load", "between", "1", "and", "10", "%", ",", "medium", "black", "diamonds", "10", "to", "40", "%", ",", "and", "large", "black", "diamonds", ">", "40", "%", ".", "Red", "diamonds", ":", "point", "mutation", "A3243G", "(", "MELAS", "causing", "disease", "mutation", ")", ".", "Numbers", "beside", "diamonds", "indicate", "the", "specific", "mutation", "load", "at", "that", "position", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(A) mtDNA NGS of MitoA fibroblasts (MitoA FB at passage 5) and MitoA-derived hiPSCs (passages 7-9); n=13.(B) mtDNA NGS of MitoB fibroblasts (MitoB FB at passage 3) and MitoB-derived hiPSCs (passages 5-11); n=12.(C) mtDNA NGS of MitoC fibroblasts (MitoC FB at passage 7) and MitoC-derived hiPSCs (passages 5-11); n=11.GPMs are represented by black diamonds at the specific mtDNA positions; small black diamonds denote mutation load between 1 and 10%, medium black diamonds 10 to 40%, and large black diamonds > 40%. Red diamonds: point mutation A3243G (MELAS causing disease mutation). Numbers beside diamonds indicate the specific mutation load at that position."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", ")", "Distribution", "of", "GPMs", "with", "mutation", "load", "lower", "or", "greater", "than", "10", "%", ",", "in", "control", "and", "MELAS", "groups", ".", "The", "majority", "of", "GPMs", "are", "present", "at", "levels", "lower", "than", "10", "%", "in", "either", "group", ".", "(", "C", ")", "Location", "of", "GPMs", "greater", "than", "10", "%", ",", "in", "mtDNA", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(B) Distribution of GPMs with mutation load lower or greater than 10%, in control and MELAS groups. The majority of GPMs are present at levels lower than 10% in either group.(C) Location of GPMs greater than 10%, in mtDNA."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "B", ")", "mtDNA", "NGS", "showing", "the", "position", "and", "mutation", "load", "of", "GPMs", "in", "seven", "isogenic", "MitoA", "-", "derived", "hiPSCs", "clones", "and", "their", "differentiated", "counterparts", ".", "The", "mtDNA", "genotype", "is", "stable", "during", "in", "vitro", "cardiac", "differentiation", "and", "lactate", "enrichment", ".", "MitoA", "hiPSCs", "57", "and", "65", "(", "wild", "-", "type", ")", "are", "labelled", "in", "black", ",", "MitoA", "hiPSCs", "61", "and", "69", "(", "m", ".", "3243A", ">", "G", "mutant", ")", "are", "labelled", "in", "red", "and", "MitoA", "hiPSCs", "58", ",", "59", "and", "217", "(", "with", "amplified", "GPMs", "in", "nuclear", "reprogramming", ")", "are", "labelled", "in", "blue", ".", "(", "C", ")", "Quantification", "of", "the", "percentage", "of", "mature", "hiPSCs", "-", "derived", "cardiomyocytes", "in", "direct", "differentiation", "of", "hiPSC", "clones", ".", "Representative", "histograms", "showing", "the", "percentage", "of", "the", "cells", "expressing", "mature", "cardiac", "markers", ":", "myosin", "heavy", "chain", "(", "MF20", ")", ",", "troponin", "T", "(", "cTnT", ")", "and", "troponin", "I", "(", "cTnI", ")", "by", "flow", "cytometry", ",", "in", "MitoA", "-", "57", "-", "derived", "cardiomyocytes", "(", "wild", "-", "type", ")", "and", "MitoA", "-", "69", "-", "derived", "cardiomyocytes", "(", "83", "%", "m", ".", "3243A", ">", "G", ")", ".", "For", "complete", "quantification", "of", "cardiac", "markers", "in", "all", "hiPSCs", "-", "derived", "cardiomyocytes", "generated", ".", "(", "D", ")", "Immunofluorescence", "images", "of", "cardiac", "markers", "(", "cTnT", "and", "MF20", ")", "showing", "similar", "sarcomere", "structures", "in", "hiPSC", "-", "derived", "cardiomyocytes", "wild", "-", "type", "(", "MitoA", "-", "57", ")", "and", "mutant", "(", "MitoA", "-", "69", ")", ".", "(", "E", ")", "Oxygen", "consumption", "rate", "(", "OCR", ")", "in", "hiPSCs", ".", "OCR", "reported", "as", "a", "%", "of", "that", "in", "MitoA", "-", "57", "hiPSC", ",", "the", "control", "line", ".", "MitoA", "-", "57", "and", "MitoA", "-", "65", "hiPSCs", "wild", "-", "type", "(", "in", "black", ")", ",", "MitoA", "-", "61", "and", "MitoA", "-", "69", "m", ".", "3243A", ">", "G", "mutant", "(", "in", "red", ")", ",", "MitoA", "-", "58", ",", "MitoA", "-", "59", "and", "MitoA", "-", "217", "hiPSCs", "amplified", "GPMs", "(", "in", "blue", ")", ".", "Error", "bars", "are", "mean", "±", "SD", "and", "OCR", "data", "are", "representative", "3", "biological", "replicates", "in", "all", "samples", ".", "(", "F", ")", "Oxygen", "consumption", "rate", "in", "hiPSCs", "-", "derived", "cardiomyocytes", "at", "day", "19", "of", "cardiac", "differentiation", ".", "OCR", "reported", "as", "%", "of", "that", "in", "MitoA", "-", "57", "-", "derived", "cardiomyocytes", ",", "the", "control", "line", ".", "MitoA", "-", "57", "and", "MitoA", "-", "65", "derived", "cardiomyocytes", "wild", "-", "type", "(", "in", "black", ")", ",", "MitoA", "-", "61", "and", "MitoA", "-", "69", "derived", "cardiomyocytes", "mutants", "m", ".", "3243A", ">", "G", "(", "in", "red", ")", ",", "MitoA", "-", "58", ",", "MitoA", "-", "59", "and", "MitoA", "-", "217", "derived", "cardiomyocytes", "with", "amplified", "GPMs", "(", "in", "blue", ")", ".", "Error", "bars", "are", "mean", "±", "SD", "and", "OCR", "data", "are", "representative", "of", "two", "independent", "in", "vitro", "cardiac", "differentiation", "experiments", ",", "with", "at", "least", "3", "biological", "replicates", "in", "each", "sample", ",", "and", "significance", "established", "using", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(B) mtDNA NGS showing the position and mutation load of GPMs in seven isogenic MitoA-derived hiPSCs clones and their differentiated counterparts. The mtDNA genotype is stable during in vitro cardiac differentiation and lactate enrichment. MitoA hiPSCs 57 and 65 (wild-type) are labelled in black, MitoA hiPSCs 61 and 69 (m.3243A>G mutant) are labelled in red and MitoA hiPSCs 58, 59 and 217 (with amplified GPMs in nuclear reprogramming) are labelled in blue.(C) Quantification of the percentage of mature hiPSCs-derived cardiomyocytes in direct differentiation of hiPSC clones. Representative histograms showing the percentage of the cells expressing mature cardiac markers: myosin heavy chain (MF20), troponin T (cTnT) and troponin I (cTnI) by flow cytometry, in MitoA-57-derived cardiomyocytes (wild-type) and MitoA-69-derived cardiomyocytes (83% m.3243A>G). For complete quantification of cardiac markers in all hiPSCs-derived cardiomyocytes generated.(D) Immunofluorescence images of cardiac markers (cTnT and MF20) showing similar sarcomere structures in hiPSC-derived cardiomyocytes wild-type (MitoA-57) and mutant (MitoA-69).(E) Oxygen consumption rate (OCR) in hiPSCs. OCR reported as a % of that in MitoA-57 hiPSC, the control line. MitoA-57 and MitoA-65 hiPSCs wild-type (in black), MitoA-61 and MitoA-69 m.3243A>G mutant (in red), MitoA-58, MitoA-59 and MitoA-217 hiPSCs amplified GPMs (in blue). Error bars are mean ± SD and OCR data are representative 3 biological replicates in all samples.(F) Oxygen consumption rate in hiPSCs-derived cardiomyocytes at day 19 of cardiac differentiation. OCR reported as % of that in MitoA-57-derived cardiomyocytes, the control line. MitoA-57 and MitoA-65 derived cardiomyocytes wild-type (in black), MitoA-61 and MitoA-69 derived cardiomyocytes mutants m.3243A>G (in red), MitoA-58, MitoA-59 and MitoA-217 derived cardiomyocytes with amplified GPMs (in blue). Error bars are mean ± SD and OCR data are representative of two independent in vitro cardiac differentiation experiments, with at least 3 biological replicates in each sample, and significance established using Student's t-test."}
{"words": ["Figure", "1B", ".", "Representative", "E", "-", "cadherin", "(", "E", "-", "cad", ")", "and", "DAPI", "immunofluorescence", "images", "of", "AECs", "treated", "apically", "with", "TGFβ1", "or", "vehicle", "control", "after", "72", "h", "in", "the", "co", "-", "culture", "system", "(", "scale", "bars", "25", "µm", ")", ".", "E", ".", "ELISA", "analysis", "shows", "increased", "αSMA", "levels", "in", "a", "TGFβ1", "dose", "-", "dependent", "manner", "from", "MCs", "and", "IPF", "-", "MCs", "in", "the", "co", "-", "culture", "system", ".", "Note", "a", "stronger", "αSMA", "response", "in", "IPF", "-", "MCs", "(", "mean", "+", "s", ".", "d", ".", ",", "n", "=", "3", "biological", "replicates", "from", "6", "MCs", "and", "6", "IPF", "-", "MCs", "donors", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0014", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "Nonlinear", "Regression", "followed", "by", "ANOVA", "/", "Sidak", "'", "s", ")", ".", "G", ",", "H", ".", "72", "h", "after", "substitutions", "in", "the", "co", "-", "culture", ",", "αSMA", "and", "E", "-", "cad", "levels", "of", "MCs", "and", "AECs", ",", "respectively", ",", "were", "measured", "with", "ELISA", "and", "normalised", "to", "the", "control", ".", "Note", "replacement", "of", "injured", "AECs", "with", "untreated", "AECs", "or", "replacement", "of", "media", "and", "MCs", "attenuates", "αSMA", "expression", "and", "increases", "E", "-", "cad", "levels", "(", "mean", "+", "s", ".", "d", ".", ",", "ns", "=", "non", "-", "significant", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "n", "=", "3", "biological", "replicates", "with", "6", "MCs", "donors", ",", "repeated", "measurement", "ANOVA", "for", "MCs", "or", "ordinary", "ANOVA", "for", "AECs", "with", "Dunnett", "´", "s", "posthoc", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1B. Representative E-cadherin (E-cad) and DAPI immunofluorescence images of AECs treated apically with TGFβ1 or vehicle control after 72 h in the co-culture system (scale bars 25 µm).E. ELISA analysis shows increased αSMA levels in a TGFβ1 dose-dependent manner from MCs and IPF-MCs in the co-culture system. Note a stronger αSMA response in IPF-MCs (mean + s.d., n = 3 biological replicates from 6 MCs and 6 IPF-MCs donors, **p = 0.0014, ****p < 0.0001, Nonlinear Regression followed by ANOVA/Sidak's).G, H. 72 h after substitutions in the co-culture, αSMA and E-cad levels of MCs and AECs, respectively, were measured with ELISA and normalised to the control. Note replacement of injured AECs with untreated AECs or replacement of media and MCs attenuates αSMA expression and increases E-cad levels (mean + s.d., ns = non-significant, ***p < 0.001, **p < 0.01, n = 3 biological replicates with 6 MCs donors, repeated measurement ANOVA for MCs or ordinary ANOVA for AECs with Dunnett´s posthoc test)."}
{"words": ["Figure", "2B", ".", "Volcano", "plot", "representing", "logarithmic", "ratio", "of", "differentially", "secreted", "proteins", "from", "proteomics", "analysis", "of", "co", "-", "culture", "medium", "upon", "apical", "TGFβ1", "stimulation", "(", "p", "-", "adj", "<", "0", ".", "05", ",", "t", "-", "test", ")", ",", "with", "examples", "of", "profibrotic", "secreted", "proteins", "(", "red", "dots", "indicating", "significantly", "upregulated", "proteins", ",", "blue", "dots", "indicating", "significantly", "downregulated", "proteins", ",", "and", "grey", "dots", "indicating", "no", "significant", "change", "in", "protein", "expression", "levels", ")", ".", "H", ".", "Representative", "H3K27me3", "and", "EZH2", "immunofluorescence", "images", "and", "box", "plots", "(", "minimum", ",", "first", "quartile", ",", "median", ",", "third", "quartile", "and", "maximum", ")", "showing", "decreased", "H3K27me3", "levels", "but", "increased", "total", "EZH2", "levels", "in", "TGFβ1", "-", "injured", "AECs", "in", "co", "-", "culture", "with", "MCs", "(", "n", "=", "5", "biological", "replicates", "with", ">", "50", "cells", "per", "experiment", ",", "scale", "bars", "50", "µm", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "unpaired", "t", "-", "test", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2B. Volcano plot representing logarithmic ratio of differentially secreted proteins from proteomics analysis of co-culture medium upon apical TGFβ1 stimulation (p-adj < 0.05, t-test), with examples of profibrotic secreted proteins (red dots indicating significantly upregulated proteins, blue dots indicating significantly downregulated proteins, and grey dots indicating no significant change in protein expression levels).H. Representative H3K27me3 and EZH2 immunofluorescence images and box plots (minimum, first quartile, median, third quartile and maximum) showing decreased H3K27me3 levels but increased total EZH2 levels in TGFβ1-injured AECs in co-culture with MCs (n = 5 biological replicates with >50 cells per experiment, scale bars 50 µm, *p < 0.05, unpaired t-test)."}
{"words": ["Figure", "3G", ".", "EZH2", "-", "deleted", "AECs", "(", "sgEZH2", ")", "reintroducing", "empty", "vector", "(", "EV", ")", ",", "T311", "wildtype", "(", "WT", ")", ",", "a", "phosphorylated", "-", "deficient", "T311A", ",", "or", "a", "phosphomimetic", "T311D", "form", "of", "EZH2", "were", "quantified", "for", "the", "expression", "of", "profibrotic", "genes", ".", "Vehicle", "and", "TGFβ1", "treated", "AECs", "(", "sgNEG", "+", "vehicle", "/", "TGFβ1", ")", "were", "used", "as", "control", ".", "mRNA", "levels", "are", "normalised", "to", "HPRT1", "expression", ".", "(", "mean", "+", "s", ".", "d", ".", ",", "n", "=", "4", "biological", "replicates", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "0001", ",", "Kruskal", "-", "Wallis", "/", "Dunn", "'", "s", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3G. EZH2-deleted AECs (sgEZH2) reintroducing empty vector (EV), T311 wildtype (WT), a phosphorylated-deficient T311A, or a phosphomimetic T311D form of EZH2 were quantified for the expression of profibrotic genes. Vehicle and TGFβ1 treated AECs (sgNEG + vehicle / TGFβ1) were used as control. mRNA levels are normalised to HPRT1 expression. (mean + s.d., n = 4 biological replicates, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001, Kruskal-Wallis/Dunn's)."}
{"words": ["Figure", "4B", ".", "Nuclear", "fractionation", "followed", "by", "simple", "western", "analysis", "(", "Peggy", "Sue", ")", "of", "AECs", "exposed", "to", "72", "h", "of", "TGFβ1", "in", "the", "co", "-", "culture", "system", "shows", "an", "increase", "in", "phosphorylated", "TAK1", "and", "a", "parallel", "increase", "in", "ph", "-", "EZH2", ".", "Quantifications", "(", "lower", "panels", ")", "show", "mean", "+", "s", ".", "d", ".", ",", "n", "=", "3", "biological", "replicates", "(", "ns", "=", "non", "-", "significant", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "Kruskal", "-", "Wallis", "/", "Dunn", "'", "s", ")", ".", "E", ".", "ChIP", "-", "qPCR", "shows", "diminished", "POL2", "occupancy", "on", "profibrotic", "genes", "in", "injured", "AECs", "subjected", "to", "5", "-", "OZ", "(", "mean", "+", "s", ".", "d", ".", ",", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "Unspecific", "IgG", "was", "used", "as", "negative", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4B. Nuclear fractionation followed by simple western analysis (Peggy Sue) of AECs exposed to 72 h of TGFβ1 in the co-culture system shows an increase in phosphorylated TAK1 and a parallel increase in ph-EZH2. Quantifications (lower panels) show mean + s.d., n = 3 biological replicates (ns = non-significant, ***p < 0.001, Kruskal-Wallis/Dunn's).E. ChIP-qPCR shows diminished POL2 occupancy on profibrotic genes in injured AECs subjected to 5-OZ (mean + s.d., n = 3 biological replicates). Unspecific IgG was used as negative control."}
{"words": ["Figure", "5C", ",", "D", ".", "ChIP", "-", "qPCR", "shows", "increased", "occupancy", "of", "(", "C", ")", "POL2", "-", "S5p", "at", "promoters", "of", "profibrotic", "genes", "in", "AECs", "subjected", "to", "TGFβ1", "for", "24", "h", ",", "whereas", "no", "enrichment", "of", "(", "D", ")", "POL2", "-", "S2p", "at", "the", "gene", "bodies", "of", "these", "genes", "was", "detected", ".", "Negative", "IgG", "control", "is", "shown", "in", "Appendix", "Figure", "S5B", "(", "mean", "+", "s", ".", "d", ".", ",", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", ".", "E", ",", "F", ".", "ChIP", "-", "qPCR", "shows", "increased", "occupancy", "of", "(", "E", ")", "POL2", "-", "S5p", "at", "promoters", "and", "(", "F", ")", "POL2", "-", "S2p", "at", "the", "gene", "bodies", "of", "profibrotic", "genes", "in", "AECs", "subjected", "to", "TGFβ1", "for", "48", "h", ".", "Negative", "IgG", "control", "is", "shown", "in", "Appendix", "Figure", "S5C", "(", "mean", "+", "s", ".", "d", ".", ",", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5C, D. ChIP-qPCR shows increased occupancy of (C) POL2-S5p at promoters of profibrotic genes in AECs subjected to TGFβ1 for 24 h, whereas no enrichment of (D) POL2-S2p at the gene bodies of these genes was detected. Negative IgG control is shown in Appendix Figure S5B (mean + s.d., n = 3 biological replicates). E, F. ChIP-qPCR shows increased occupancy of (E) POL2-S5p at promoters and (F) POL2-S2p at the gene bodies of profibrotic genes in AECs subjected to TGFβ1 for 48 h. Negative IgG control is shown in Appendix Figure S5C (mean + s.d., n = 3 biological replicates). "}
{"words": ["Figure", "6B", ".", "Simple", "western", "analysis", "(", "Peggy", "Sue", ")", "of", "EZH2", "immunoprecipitates", "shows", "abolition", "of", "TGFβ1", "-", "induced", "profibrotic", "transcriptional", "complex", "of", "EZH2", "/", "POL2", "/", "actin", "upon", "the", "convergent", "treatment", "of", "TGFβ1", "and", "Y27632", ".", "Unspecific", "IgG", "binding", "was", "used", "as", "a", "negative", "control", ".", "Representative", "from", "3", "biological", "replicates", "is", "shown", ".", "E", ".", "qPCR", "analysis", "of", "profibrotic", "genes", "in", "MCs", "co", "-", "culture", "with", "AECs", "shows", "that", "depletion", "of", "IPO9", "in", "TGFβ1", "-", "injured", "AECs", "blocks", "the", "fibrotic", "crosstalk", "with", "MCs", ".", "Data", "show", "mRNA", "levels", "of", "profibrotic", "genes", "normalised", "to", "S26", "(", "mean", "+", "s", ".", "d", ".", ",", "n", "=", "3", "biological", "replicates", "with", "5", "MCs", "donors", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "ANOVA", "/", "Tukey", "'", "s", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6B. Simple western analysis (Peggy Sue) of EZH2 immunoprecipitates shows abolition of TGFβ1-induced profibrotic transcriptional complex of EZH2/POL2/actin upon the convergent treatment of TGFβ1 and Y27632. Unspecific IgG binding was used as a negative control. Representative from 3 biological replicates is shown.E. qPCR analysis of profibrotic genes in MCs co-culture with AECs shows that depletion of IPO9 in TGFβ1-injured AECs blocks the fibrotic crosstalk with MCs. Data show mRNA levels of profibrotic genes normalised to S26 (mean + s.d., n = 3 biological replicates with 5 MCs donors, *p < 0.05, ***p < 0.001, ANOVA/Tukey's)."}
{"words": ["Figure", "7A", ".", "Simple", "western", "analysis", "(", "Peggy", "Sue", ")", "and", "quantifications", "(", "right", "panels", ")", "of", "mouse", "lung", "epithelial", "cells", "shows", "increased", "ph", "-", "EZH2", "(", "T311", ")", ",", "ph", "-", "TAK1", ",", "myosin", "activity", "(", "ph", "-", "MLC2", ")", "and", "POL2", "-", "K7m", "levels", "in", "AAV", "-", "mediated", "TGFβ1", "over", "-", "expression", ".", "Note", ",", "increased", "ph", "-", "EZH2", "and", "POL2", "-", "K7m", "levels", "are", "attenuated", "by", "the", "EZH2", "inhibitor", "GSK126", ",", "whereas", "ph", "-", "TAK1", "and", "ph", "-", "MLC2", "levels", "cannot", "be", "rescued", "by", "GSK126", ".", "Quantifications", "(", "right", "panels", ")", "show", "violin", "plots", ",", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "ns", "=", "non", "-", "significant", ",", "Kruskal", "-", "Wallis", "/", "Dunn", "'", "s", ".", "Data", "information", ":", "All", "violin", "plots", "display", "minimum", ",", "first", "quartile", ",", "median", ",", "third", "quartile", "and", "maximum", ";", "n", "=", "5", "control", ",", "12", "AAV", "-", "TGFβ1", "and", "13", "GSK126", "-", "treated", "AAV", "-", "TGFβ1", "mice", ".", "B", ".", "Representative", "of", "3D", "computed", "tomography", "(", "CT", ")", "reconstruction", "of", "the", "lung", "from", "control", ",", "AAV", "-", "TGFβ1", "and", "GSK126", "-", "treated", "AAV", "-", "TGFβ1", "mice", "(", "green", ":", "lung", "tissue", ",", "red", ":", "airways", ",", "and", "region", "-", "of", "-", "interest", "(", "ROI", ")", ":", "blue", ")", ".", "Insets", "show", "µCT", "slices", "in", "the", "middle", "of", "the", "lung", "from", "respective", "mice", ".", "Note", ",", "GSK126", "attenuates", "TGFβ1", "-", "induced", "lung", "injury", ".", "Quantification", "(", "right", "panel", ")", "shows", "mean", "intensity", "of", "ROIs", "from", "the", "whole", "lung", "(", "violin", "plots", ",", "*", "p", "=", "0", ".", "0385", ",", "*", "*", "p", "=", "0", ".", "0012", ",", "ANOVA", "/", "Holm", "-", "Sidak", "'", "s", ")", ".", "Data", "information", ":", "All", "violin", "plots", "display", "minimum", ",", "first", "quartile", ",", "median", ",", "third", "quartile", "and", "maximum", ";", "n", "=", "5", "control", ",", "12", "AAV", "-", "TGFβ1", "and", "13", "GSK126", "-", "treated", "AAV", "-", "TGFβ1", "mice", ".", "D", ".", "Immunofluorescence", "analysis", "of", "KRT5", "as", "a", "marker", "for", "alveolar", "metaplastic", "basal", "cells", "and", "ph", "-", "EZH2", "(", "scale", "bars", "100", "µm", ")", ",", "pro", "-", "SFTPC", "as", "a", "marker", "for", "alveolar", "type", "2", "epithelial", "cells", "(", "scale", "bars", "50", "µm", ")", "and", "quantifications", "(", "right", "panels", ")", "show", "percentage", "of", "KRT5", "+", "pods", "area", "per", "10X", "field", "and", "percentage", "of", "pro", "-", "SFTPC", "+", "cells", "per", "20X", "field", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "unpaired", "t", "-", "test", ")", ".", "Data", "information", ":", "All", "violin", "plots", "display", "minimum", ",", "first", "quartile", ",", "median", ",", "third", "quartile", "and", "maximum", ";", "n", "=", "5", "control", ",", "12", "AAV", "-", "TGFβ1", "and", "13", "GSK126", "-", "treated", "AAV", "-", "TGFβ1", "mice", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A. Simple western analysis (Peggy Sue) and quantifications (right panels) of mouse lung epithelial cells shows increased ph-EZH2 (T311), ph-TAK1, myosin activity (ph-MLC2) and POL2-K7m levels in AAV-mediated TGFβ1 over-expression. Note, increased ph-EZH2 and POL2-K7m levels are attenuated by the EZH2 inhibitor GSK126, whereas ph-TAK1 and ph-MLC2 levels cannot be rescued by GSK126. Quantifications (right panels) show violin plots, *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ns = non-significant, Kruskal-Wallis/Dunn's. Data information: All violin plots display minimum, first quartile, median, third quartile and maximum; n = 5 control, 12 AAV-TGFβ1 and 13 GSK126-treated AAV-TGFβ1 mice.B. Representative of 3D computed tomography (CT) reconstruction of the lung from control, AAV-TGFβ1 and GSK126-treated AAV-TGFβ1 mice (green: lung tissue, red: airways, and region-of-interest (ROI): blue). Insets show µCT slices in the middle of the lung from respective mice. Note, GSK126 attenuates TGFβ1-induced lung injury. Quantification (right panel) shows mean intensity of ROIs from the whole lung (violin plots, *p = 0.0385, **p = 0.0012, ANOVA/Holm-Sidak's). Data information: All violin plots display minimum, first quartile, median, third quartile and maximum; n = 5 control, 12 AAV-TGFβ1 and 13 GSK126-treated AAV-TGFβ1 mice.D. Immunofluorescence analysis of KRT5 as a marker for alveolar metaplastic basal cells and ph-EZH2 (scale bars 100 µm), pro-SFTPC as a marker for alveolar type 2 epithelial cells (scale bars 50 µm) and quantifications (right panels) show percentage of KRT5+ pods area per 10X field and percentage of pro-SFTPC+ cells per 20X field (*p < 0.05, unpaired t-test). Data information: All violin plots display minimum, first quartile, median, third quartile and maximum; n = 5 control, 12 AAV-TGFβ1 and 13 GSK126-treated AAV-TGFβ1 mice. "}
{"words": ["f1", "(", "a", ")", "MEFs", "stably", "expressing", "EGFP", "-", "Parkin", "were", "exposed", "to", "CCCP", "(", "30", "μM", ")", "for", "the", "indicated", "times", "and", "then", "subjected", "to", "immunoblot", "analysis", "(", "IB", ")", "with", "antibodies", "to", "the", "indicated", "proteins", ".", "The", "asterisk", "indicates", "a", "nonspecific", "band", ".", "(", "b", ")", "SH", "-", "SY5Y", "cells", "were", "exposed", "to", "CCCP", "(", "10", "μM", ")", "for", "the", "indicated", "times", "and", "then", "subjected", "to", "immunoblot", "analysis", ".", "(", "c", ")", "MEFs", "stably", "expressing", "EGFP", "-", "Parkin", "were", "treated", "with", "CCCP", "(", "30", " ", "μM", ")", "for", "the", "indicated", "times", ",", "fixed", ",", "permeabilized", "and", "subjected", "to", "immunofluorescence", "analysis", "with", "antibodies", "to", "FKBP38", "and", "to", "cytochrome", "c", "and", "with", "a", "confocal", "microscope", ".", "The", "fluorescence", "of", "EGFP", "-", "Parkin", "was", "monitored", "directly", ".", "(", "d", ")", "Higher", "-", "magnification", "views", "of", "the", "boxed", "areas", "in", "c", ".", "Scale", "bar", "(", "c", ",", "d", ")", ",", "10", " ", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f1(a) MEFs stably expressing EGFP-Parkin were exposed to CCCP (30 μM) for the indicated times and then subjected to immunoblot analysis (IB) with antibodies to the indicated proteins. The asterisk indicates a nonspecific band.(b) SH-SY5Y cells were exposed to CCCP (10 μM) for the indicated times and then subjected to immunoblot analysis.(c) MEFs stably expressing EGFP-Parkin were treated with CCCP (30 μM) for the indicated times, fixed, permeabilized and subjected to immunofluorescence analysis with antibodies to FKBP38 and to cytochrome c and with a confocal microscope. The fluorescence of EGFP-Parkin was monitored directly. (d) Higher-magnification views of the boxed areas in c. Scale bar (c,d), 10 μm."}
{"words": ["f2", "(", "a", ",", "c", ")", "MEFs", "(", "a", ")", "stably", "expressing", "FLAG", "-", "Parkin", "and", "either", "EGFP", "-", "VAP", "-", "A", "or", "HA", "-", "VAP", "-", "A", "were", "treated", "with", "CCCP", "(", "30", "and", "10", " ", "μM", ",", "respectively", ")", "for", "the", "indicated", "times", ",", "fixed", ",", "permeabilized", "and", "subjected", "to", "immunofluorescence", "analysis", "with", "antibodies", "to", "FKBP38", ",", "to", "HA", "or", "to", "FLAG", "(", "M2", ")", ".", "The", "fluorescence", "of", "EGFP", "-", "VAP", "-", "A", "was", "also", "monitored", "directly", ".", "(", "b", ",", "d", ")", "Higher", "-", "magnification", "views", "of", "the", "boxed", "areas", "in", "a", "and", "c", ",", "respectively", ".", "(", "a", ",", "c", ")", "HeLa", "cells", "(", "c", ")", "stably", "expressing", "FLAG", "-", "Parkin", "and", "either", "EGFP", "-", "VAP", "-", "A", "or", "HA", "-", "VAP", "-", "A", "were", "treated", "with", "CCCP", "(", "30", "and", "10", " ", "μM", ",", "respectively", ")", "for", "the", "indicated", "times", ",", "fixed", ",", "permeabilized", "and", "subjected", "to", "immunofluorescence", "analysis", "with", "antibodies", "to", "FKBP38", ",", "to", "HA", "or", "to", "FLAG", "(", "M2", ")", ".", "The", "fluorescence", "of", "EGFP", "-", "VAP", "-", "A", "was", "also", "monitored", "directly", ".", "(", "b", ",", "d", ")", "Higher", "-", "magnification", "views", "of", "the", "boxed", "areas", "in", "a", "and", "c", ",", "respectively", ".", "(", "e", ")", "NIH", "3T3", "cells", "stably", "expressing", "EGFP", "-", "Parkin", "were", "incubated", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "CCCP", "(", "30", " ", "μM", ")", "for", "4", " ", "h", ",", "after", "which", "whole", "-", "cell", "homogenates", "as", "well", "as", "cytosolic", ",", "ER", "and", "mitochondrial", "fractions", "were", "prepared", "and", "subjected", "to", "immunoblot", "analysis", ".", "Scale", "bar", "(", "a", "-", "d", ")", ",", "10", " ", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f2(a,c) MEFs (a) stably expressing FLAG-Parkin and either EGFP-VAP-A or HA-VAP-A were treated with CCCP (30 and 10 μM, respectively) for the indicated times, fixed, permeabilized and subjected to immunofluorescence analysis with antibodies to FKBP38, to HA or to FLAG (M2). The fluorescence of EGFP-VAP-A was also monitored directly. (b,d) Higher-magnification views of the boxed areas in a and c, respectively.(a,c) HeLa cells (c) stably expressing FLAG-Parkin and either EGFP-VAP-A or HA-VAP-A were treated with CCCP (30 and 10 μM, respectively) for the indicated times, fixed, permeabilized and subjected to immunofluorescence analysis with antibodies to FKBP38, to HA or to FLAG (M2). The fluorescence of EGFP-VAP-A was also monitored directly. (b,d) Higher-magnification views of the boxed areas in a and c, respectively.(e) NIH 3T3 cells stably expressing EGFP-Parkin were incubated in the absence or presence of CCCP (30 μM) for 4 h, after which whole-cell homogenates as well as cytosolic, ER and mitochondrial fractions were prepared and subjected to immunoblot analysis. Scale bar (a-d), 10 μm."}
{"words": ["f3", "(", "a", ")", "MEFs", "stably", "expressing", "EGFP", "-", "tagged", "wild", "-", "type", "(", "WT", ")", "or", "T240R", "mutant", "forms", "of", "Parkin", "as", "well", "as", "FLAG", "-", "tagged", "VAP", "-", "A", "were", "incubated", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "CCCP", "(", "30", " ", "μM", ")", "for", "24", " ", "h", ",", "fixed", ",", "permeabilized", "and", "subjected", "to", "immunofluorescence", "analysis", "with", "antibodies", "to", "FKBP38", ",", "to", "FLAG", "(", "M2", ")", "and", "to", "cytochrome", "c", ".", "The", "fluorescence", "of", "EGFP", "was", "also", "monitored", "directly", ".", "(", "b", ")", "MEFs", "as", "in", "a", "were", "treated", "with", "CCCP", "(", "30", " ", "μM", ")", "for", "the", "indicated", "times", "and", "then", "subjected", "to", "immunoblot", "analysis", ".", "(", "c", ")", "MEFs", "stably", "expressing", "EGFP", "-", "Parkin", "and", "FLAG", "-", "VAP", "-", "A", "were", "incubated", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "CCCP", "(", "30", " ", "μM", ")", "and", "lactacystin", "(", "10", " ", "μM", ")", "for", "24", " ", "h", ",", "fixed", ",", "permeabilized", "and", "subjected", "to", "immunofluorescence", "analysis", "with", "antibodies", "to", "FKBP38", ",", "to", "FLAG", "(", "M2", ")", "and", "to", "cytochrome", "c", ".", "The", "fluorescence", "of", "EGFP", "-", "Parkin", "was", "also", "monitored", "directly", ".", "(", "d", ")", "MEFs", "stably", "expressing", "EGFP", "-", "Parkin", "were", "incubated", "for", "12", " ", "h", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "CCCP", "(", "30", " ", "μM", ")", "and", "lactacystin", "(", "10", " ", "μM", ")", "as", "indicated", "and", "then", "subjected", "to", "immunoblot", "analysis", ".", "Scale", "bar", "(", "a", ",", "c", ")", ",", "10", " ", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f3(a) MEFs stably expressing EGFP-tagged wild-type (WT) or T240R mutant forms of Parkin as well as FLAG-tagged VAP-A were incubated in the absence or presence of CCCP (30 μM) for 24 h, fixed, permeabilized and subjected to immunofluorescence analysis with antibodies to FKBP38, to FLAG (M2) and to cytochrome c. The fluorescence of EGFP was also monitored directly.(b) MEFs as in a were treated with CCCP (30 μM) for the indicated times and then subjected to immunoblot analysis.(c) MEFs stably expressing EGFP-Parkin and FLAG-VAP-A were incubated in the absence or presence of CCCP (30 μM) and lactacystin (10 μM) for 24 h, fixed, permeabilized and subjected to immunofluorescence analysis with antibodies to FKBP38, to FLAG (M2) and to cytochrome c. The fluorescence of EGFP-Parkin was also monitored directly.(d) MEFs stably expressing EGFP-Parkin were incubated for 12 h in the absence or presence of CCCP (30 μM) and lactacystin (10 μM) as indicated and then subjected to immunoblot analysis. Scale bar (a,c), 10 μm."}
{"words": ["f4", "(", "b", ")", "MEFs", "stably", "expressing", "FLAG", "-", "Parkin", "and", "EGFP", "-", "tagged", "forms", "of", "FKBP38", ",", "Omp25", ",", "Omp25", "/", "FKBP38", "or", "FKBP38", "/", "Omp25", "were", "treated", "with", "CCCP", "(", "30", " ", "μM", ")", "for", "4", " ", "h", ",", "fixed", ",", "permeabilized", "and", "subjected", "to", "immunofluorescence", "analysis", "with", "antibodies", "to", "cytochrome", "c", "and", "to", "FLAG", "(", "rabbit", "polyclonal", ")", ".", "The", "fluorescence", "of", "EGFP", "was", "also", "monitored", "directly", ".", "Scale", "bar", ",", "10", " ", "μm", ".", "(", "c", ")", "MEFs", "stably", "expressing", "mCherry", "-", "tagged", "Parkin", "and", "EGFP", "-", "tagged", "forms", "of", "FKBP38", ",", "Omp25", ",", "Omp25", "/", "FKBP38", "or", "FKBP38", "/", "Omp25", "were", "incubated", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "CCCP", "(", "30", " ", "μM", ")", "for", "24", " ", "h", "and", "then", "subjected", "to", "immunoblot", "analysis", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f4(b) MEFs stably expressing FLAG-Parkin and EGFP-tagged forms of FKBP38, Omp25, Omp25/FKBP38 or FKBP38/Omp25 were treated with CCCP (30 μM) for 4 h, fixed, permeabilized and subjected to immunofluorescence analysis with antibodies to cytochrome c and to FLAG (rabbit polyclonal). The fluorescence of EGFP was also monitored directly. Scale bar, 10 μm.(c) MEFs stably expressing mCherry-tagged Parkin and EGFP-tagged forms of FKBP38, Omp25, Omp25/FKBP38 or FKBP38/Omp25 were incubated in the absence or presence of CCCP (30 μM) for 24 h and then subjected to immunoblot analysis."}
{"words": ["f5", "(", "a", ")", "MEFs", "stably", "expressing", "FLAG", "-", "Parkin", "and", "either", "EGFP", "-", "Bcl", "-", "2", "or", "EGFP", "-", "Bcl", "-", "xL", "were", "incubated", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "CCCP", "(", "30", " ", "μM", ")", "for", "24", " ", "h", "and", "then", "subjected", "to", "immunoblot", "analysis", ".", "(", "c", ")", "MEFs", "stably", "expressing", "FLAG", "-", "Parkin", "and", "EGFP", "-", "tagged", "forms", "of", "Bcl", "-", "2", ",", "Bcl", "-", "xL", ",", "Bcl", "-", "2", "/", "xL", "or", "Bcl", "-", "xL", "/", "2", "were", "incubated", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "CCCP", "(", "30", " ", "μM", ")", "for", "4", " ", "h", ",", "fixed", ",", "permeabilized", "and", "subjected", "to", "immunofluorescence", "analysis", "with", "antibodies", "to", "cytochrome", "c", "and", "to", "FLAG", "(", "rabbit", "polyclonal", ")", ".", "The", "fluorescence", "of", "EGFP", "was", "also", "monitored", "directly", ".", "(", "d", ")", "Higher", "-", "magnification", "views", "of", "the", "boxed", "areas", "in", "c", ".", "Scale", "bar", "(", "c", ",", "d", ")", ",", "10", " ", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f5(a) MEFs stably expressing FLAG-Parkin and either EGFP-Bcl-2 or EGFP-Bcl-xL were incubated in the absence or presence of CCCP (30 μM) for 24 h and then subjected to immunoblot analysis.(c) MEFs stably expressing FLAG-Parkin and EGFP-tagged forms of Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-2/xL or Bcl-xL/2 were incubated in the absence or presence of CCCP (30 μM) for 4 h, fixed, permeabilized and subjected to immunofluorescence analysis with antibodies to cytochrome c and to FLAG (rabbit polyclonal). The fluorescence of EGFP was also monitored directly. (d) Higher-magnification views of the boxed areas in c. Scale bar (c,d), 10 μm."}
{"words": ["f7", "(", "a", ")", "MEFs", "stably", "expressing", "EGFP", "-", "FKBP38", "(", "N402K", ")", "and", "FLAG", "-", "Parkin", "were", "incubated", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "CCCP", "(", "30", " ", "μM", ")", "for", "4", " ", "h", ",", "fixed", ",", "permeabilized", "and", "subjected", "to", "immunofluorescence", "analysis", "with", "antibodies", "to", "cytochrome", "c", "and", "to", "FLAG", "(", "rabbit", "polyclonal", ")", ".", "The", "fluorescence", "of", "EGFP", "-", "FKBP38", "(", "N402K", ")", "was", "also", "monitored", "directly", ".", "Higher", "-", "magnification", "views", "of", "the", "boxed", "areas", "are", "shown", "in", "the", "right", "panels", "of", "each", "set", ".", "(", "b", ")", "MEFs", "stably", "expressing", "EGFP", "-", "FKBP38", "(", "N402K", ")", ",", "mCherry", "-", "FKBP38", "and", "FLAG", "-", "Parkin", "were", "incubated", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "CCCP", "(", "30", " ", "μM", ")", "for", "4", " ", "h", ",", "fixed", ",", "permeabilized", "and", "subjected", "to", "immunofluorescence", "analysis", "with", "antibodies", "to", "FLAG", "(", "M2", ")", ".", "The", "fluorescence", "of", "EGFP", "-", "FKBP38", "(", "N402K", ")", "and", "mCherry", "-", "FKBP38", "was", "also", "monitored", "directly", ".", "(", "c", ")", "MEFs", "stably", "expressing", "FLAG", "-", "Parkin", "and", "either", "EGFP", "-", "FKBP38", "or", "EGFP", "-", "FKBP38", "(", "N402K", ")", "were", "incubated", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "CCCP", "(", "30", " ", "μM", ")", "for", "24", " ", "h", "and", "then", "subjected", "to", "immunoblot", "analysis", ".", "(", "d", ")", "Densitometric", "quantitation", "of", "EGFP", "fusion", "protein", "abundance", "in", "immunoblots", "similar", "to", "those", "in", "(", "c", ")", ".", "Data", "are", "expressed", "relative", "to", "the", "corresponding", "control", "value", "(", "CCCP", "0", " ", "h", ")", "and", "are", "means", "±", "s", ".", "d", ".", ",", "from", "three", "independent", "experiments", ".", "*", "*", "P0", ".", "01", "(", "Student", "'", "s", "t", "test", ")", ".", "(", "e", ")", "MEFs", "stably", "expressing", "EGFP", "-", "Bcl", "-", "2", "(", "H235R", ")", "and", "FLAG", "-", "Parkin", "were", "incubated", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "CCCP", "(", "30", " ", "μM", ")", "for", "4", " ", "h", ",", "fixed", ",", "permeabilized", "and", "subjected", "to", "immunofluorescence", "analysis", "with", "antibodies", "to", "cytochrome", "c", "and", "to", "FLAG", "(", "rabbit", "polyclonal", ")", ".", "The", "fluorescence", "of", "EGFP", "-", "Bcl", "-", "2", "(", "H235R", ")", "was", "also", "monitored", "directly", ".", "Higher", "-", "magnification", "views", "of", "the", "boxed", "areas", "are", "shown", "in", "the", "right", "panels", "of", "each", "set", ".", "(", "g", ")", "HeLa", "cells", "stably", "expressing", "FLAG", "-", "Parkin", "were", "transiently", "transfected", "with", "vectors", "for", "KikGR", "-", "FKBP38ΔN47", "or", "KikGR", "-", "FKBP38ΔN47", "(", "N402K", ")", ",", "exposed", "to", "UV", ",", "incubated", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "CCCP", "(", "10", " ", "μM", ")", "for", "4", " ", "h", ",", "and", "then", "monitored", "for", "red", "and", "green", "KikGR", "fluorescence", ".", "Scale", "bar", "(", "a", ",", "b", ",", "e", ",", "g", ")", ",", "10", " ", "μm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f7(a) MEFs stably expressing EGFP-FKBP38(N402K) and FLAG-Parkin were incubated in the absence or presence of CCCP (30 μM) for 4 h, fixed, permeabilized and subjected to immunofluorescence analysis with antibodies to cytochrome c and to FLAG (rabbit polyclonal). The fluorescence of EGFP-FKBP38(N402K) was also monitored directly. Higher-magnification views of the boxed areas are shown in the right panels of each set.(b) MEFs stably expressing EGFP-FKBP38(N402K), mCherry-FKBP38 and FLAG-Parkin were incubated in the absence or presence of CCCP (30 μM) for 4 h, fixed, permeabilized and subjected to immunofluorescence analysis with antibodies to FLAG (M2). The fluorescence of EGFP-FKBP38(N402K) and mCherry-FKBP38 was also monitored directly.(c) MEFs stably expressing FLAG-Parkin and either EGFP-FKBP38 or EGFP-FKBP38(N402K) were incubated in the absence or presence of CCCP (30 μM) for 24 h and then subjected to immunoblot analysis. (d) Densitometric quantitation of EGFP fusion protein abundance in immunoblots similar to those in (c). Data are expressed relative to the corresponding control value (CCCP 0 h) and are means±s.d., from three independent experiments. **P0.01 (Student's t test).(e) MEFs stably expressing EGFP-Bcl-2(H235R) and FLAG-Parkin were incubated in the absence or presence of CCCP (30 μM) for 4 h, fixed, permeabilized and subjected to immunofluorescence analysis with antibodies to cytochrome c and to FLAG (rabbit polyclonal). The fluorescence of EGFP-Bcl-2(H235R) was also monitored directly. Higher-magnification views of the boxed areas are shown in the right panels of each set.(g) HeLa cells stably expressing FLAG-Parkin were transiently transfected with vectors for KikGR-FKBP38ΔN47 or KikGR-FKBP38ΔN47(N402K), exposed to UV, incubated in the absence or presence of CCCP (10 μM) for 4 h, and then monitored for red and green KikGR fluorescence. Scale bar (a,b,e,g), 10 μm."}
{"words": ["f8", "(", "a", ")", "Wild", "-", "type", "(", "Mfn2", "+", "/", "+", ")", "and", "Mfn2", "knockout", "(", "Mfn2", "-", "/", "-", ")", "MEFs", "stably", "expressing", "mCherry", "-", "Parkin", "were", "incubated", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "CCCP", "(", "30", " ", "μM", ")", "for", "4", " ", "h", ",", "fixed", ",", "permeabilized", "and", "subjected", "to", "immunofluorescence", "analysis", "with", "antibodies", "to", "FKBP38", "and", "to", "cytochrome", "c", ".", "The", "fluorescence", "of", "mCherry", "-", "Parkin", "was", "also", "monitored", "directly", ".", "(", "b", ")", "MEFs", "as", "in", "a", "but", "expressing", "EGFP", "-", "Parkin", "were", "treated", "with", "CCCP", "(", "30", " ", "μM", ")", "for", "the", "indicated", "times", "and", "then", "subjected", "to", "immunoblot", "analysis", ".", "The", "asterisk", "indicates", "a", "nonspecific", "band", ".", "(", "c", ")", "Wild", "-", "type", "MEFs", "stably", "expressing", "EGFP", "-", "Parkin", "and", "FLAG", "-", "VAP", "-", "A", "were", "incubated", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "CCCP", "(", "30", " ", "μM", ")", "or", "nocodazole", "(", "10", " ", "μM", ")", "for", "6", " ", "h", "as", "indicated", ",", "fixed", ",", "permeabilized", "and", "subjected", "to", "immunofluorescence", "analysis", "with", "antibodies", "to", "cytochrome", "c", ",", "to", "FLAG", "and", "to", "FKBP38", ".", "The", "fluorescence", "of", "EGFP", "-", "Parkin", "was", "also", "monitored", "directly", ".", "(", "d", ")", "Higher", "-", "magnification", "views", "of", "the", "boxed", "areas", "in", "(", "c", ",", "e", ")", ".", "Wild", "-", "type", "MEFs", "stably", "expressing", "FLAG", "-", "Parkin", "and", "EGFP", "-", "FKBP38", "were", "incubated", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "CCCP", "(", "30", " ", "μM", ")", "for", "10", " ", "h", "and", "then", "subjected", "to", "immuno", "-", "electron", "microscopic", "analysis", "with", "antibodies", "to", "GFP", ".", "Black", "arrowheads", "indicate", "the", "mitochondria", ".", "White", "arrowheads", "indicate", "small", "vesicle", ".", "(", "f", ")", "Wild", "-", "type", "(", "Fkbp38", "+", "/", "+", ")", "and", "Fkbp38", "knockout", "(", "Fkbp38", "−", "/", "−", ")", "MEFs", "stably", "expressing", "FLAG", "-", "Parkin", "and", "either", "EGFP", "or", "EGFP", "-", "FKBP38", "were", "incubated", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "CCCP", "(", "30", " ", "μM", ")", "for", "24", " ", "h", "and", "then", "stained", "with", "allophycocyanin", "(", "APC", ")", "-", "labelled", "annexin", "V", "and", "propidium", "iodide", "(", "PI", ")", "for", "flow", "cytometric", "analysis", "of", "the", "percentage", "of", "apoptotic", "cells", "(", "annexin", "V", "+", "and", "PI", "+", "cells", ")", ".", "Data", "are", "means", "±", "s", ".", "d", ".", ",", "from", "three", "independent", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f8(a) Wild-type (Mfn2+/+) and Mfn2 knockout (Mfn2-/-) MEFs stably expressing mCherry-Parkin were incubated in the absence or presence of CCCP (30 μM) for 4 h, fixed, permeabilized and subjected to immunofluorescence analysis with antibodies to FKBP38 and to cytochrome c. The fluorescence of mCherry-Parkin was also monitored directly.(b) MEFs as in a but expressing EGFP-Parkin were treated with CCCP (30 μM) for the indicated times and then subjected to immunoblot analysis. The asterisk indicates a nonspecific band.(c) Wild-type MEFs stably expressing EGFP-Parkin and FLAG-VAP-A were incubated in the absence or presence of CCCP (30 μM) or nocodazole (10 μM) for 6 h as indicated, fixed, permeabilized and subjected to immunofluorescence analysis with antibodies to cytochrome c, to FLAG and to FKBP38. The fluorescence of EGFP-Parkin was also monitored directly. (d) Higher-magnification views of the boxed areas in (c,e). Wild-type MEFs stably expressing FLAG-Parkin and EGFP-FKBP38 were incubated in the absence or presence of CCCP (30 μM) for 10 h and then subjected to immuno-electron microscopic analysis with antibodies to GFP. Black arrowheads indicate the mitochondria. White arrowheads indicate small vesicle.(f) Wild-type (Fkbp38+/+) and Fkbp38 knockout (Fkbp38−/−) MEFs stably expressing FLAG-Parkin and either EGFP or EGFP-FKBP38 were incubated in the absence or presence of CCCP (30 μM) for 24 h and then stained with allophycocyanin (APC)-labelled annexin V and propidium iodide (PI) for flow cytometric analysis of the percentage of apoptotic cells (annexin V+ and PI+ cells). Data are means±s.d., from three independent experiments."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "B", "-", "C", ")", "Immunofluorescent", "(", "IF", ")", "staining", "of", "Pax7", "and", "YY1", "was", "performed", "on", "cryosections", "of", "myotome", "or", "limb", "bud", "from", "Ctrl", "or", "YY1cKO", "mice", "to", "confirm", "the", "ablation", "of", "YY1", "in", "Pax7", "expressing", "progenitors", ".", "Scale", "bar", "=", "100", "µm", ".", "(", "D", ")", "Representative", "images", "of", "Ctrl", ",", "Heterozygous", "(", "Het", ")", "and", "YY1cKO", "newborn", "(", "P0", ")", "mice", "or", "embryos", "at", "E18", ".", "5", "day", ".", "(", "E", ")", "Excised", "lungs", "from", "P0", "Ctrl", "or", "YY1cKO", "pups", "were", "placed", "in", "a", "beaker", "for", "sinking", "test", ".", "The", "lung", "from", "YY1cKO", "pup", "sank", "whereas", "Ctrl", "floated", ".", "(", "F", ")", "P0", "lungs", "were", "stained", "with", "Hematoxylin", "and", "Eosin", "(", "H", "&", "E", ")", "and", "representative", "images", "are", "shown", ".", "Scale", "bar", "=", "100", "µm", ".", "(", "G", ")", "Representative", "images", "of", "diaphragms", "(", "Dps", ")", "isolated", "from", "P0", "Ctrl", "or", "YY1cKO", "littermates", ".", "(", "H", ")", "The", "above", "Dps", "were", "used", "for", "H", "&", "E", "or", "Immunohistochemistry", "(", "IHC", ")", "staining", "for", "MyHC", ".", "Representative", "images", "from", "3", "pairs", "of", "littermates", "are", "shown", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "µm", ".", "The", "above", "harvested", "Dps", "were", "subjected", "to", "IF", "staining", "for", "MyHC", "together", "with", "Laminin", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "µm", ".", "Quantifications", "of", "positively", "stained", "fibers", "per", "area", "are", "shown", "on", "the", "right", "(", "n", "=", "3", "mice", ",", "each", ")", ".", "The", "above", "harvested", "Dps", "were", "subjected", "to", "IF", "staining", "for", "Troponin", "T", "(", "TnT", ")", "together", "with", "Laminin", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "µm", ".", "Quantifications", "of", "positively", "stained", "fibers", "per", "area", "are", "shown", "on", "the", "right", "(", "n", "=", "3", "mice", ",", "each", ")", ".", "(", "K", ")", "Representative", "images", "of", "H", "&", "E", "staining", "of", "hind", "limb", "muscles", "isolated", "from", "Ctrl", "or", "YY1cKO", "embryos", "at", "E18", ".", "5", "day", ".", "Scale", "bar", "=", "400", "µm", "(", "left", ")", "or", "50", "µm", "(", "right", ")", ".", "The", "above", "harvested", "limb", "muscles", "were", "subjected", "to", "IF", "staining", "for", "MyHC", "together", "with", "Laminin", ".", "Scale", "bar", "=", "400", "µm", "(", "left", ")", "or", "50", "µm", "(", "right", ")", ".", "Quantifications", "of", "the", "numbers", "of", "MyHC", "+", "fibers", "per", "area", "are", "shown", "on", "the", "right", "(", "n", "=", "3", "mice", ",", "each", ")", ".", "The", "above", "harvested", "limb", "muscles", "were", "subjected", "to", "IF", "staining", "for", "TnT", "together", "with", "Laminin", ".", "Scale", "bar", "=", "400", "µm", "(", "left", ")", "or", "50", "µm", "(", "right", ")", ".", "Quantifications", "of", "the", "numbers", "of", "TnT", "+", "fibers", "per", "area", "are", "shown", "on", "the", "right", "(", "n", "=", "3", "mice", ",", "each", ")", ".", "The", "above", "harvested", "limb", "(", "N", ")", "muscles", "were", "subjected", "to", "IF", "staining", "for", "Pax7", "and", "Laminin", ".", "Scale", "bar", "=", "100", "µm", "(", "N", ")", "Quantification", "of", "the", "numbers", "of", "Pax7", "+", "muscle", "progenitor", "cells", "per", "area", "are", "shown", "on", "the", "right", "(", "n", "=", "3", "mice", ",", "each", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "s", ".", "d", ".", "'", "s", "of", "the", "mean", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "two", "-", "sided", ")", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "The", "above", "harvested", "diaphragm", "(", "O", ")", "muscles", "were", "subjected", "to", "IF", "staining", "for", "Pax7", "and", "Laminin", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "µm", "(", "O", ")", ".", "Quantification", "of", "the", "numbers", "of", "Pax7", "+", "muscle", "progenitor", "cells", "per", "area", "are", "shown", "on", "the", "right", "(", "n", "=", "3", "mice", ",", "each", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "s", ".", "d", ".", "'", "s", "of", "the", "mean", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "two", "-", "sided", ")", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(B-C) Immunofluorescent (IF) staining of Pax7 and YY1 was performed on cryosections of myotome or limb bud from Ctrl or YY1cKO mice to confirm the ablation of YY1 in Pax7 expressing progenitors. Scale bar = 100 µm.(D) Representative images of Ctrl, Heterozygous (Het) and YY1cKO newborn (P0) mice or embryos at E18.5 day.(E) Excised lungs from P0 Ctrl or YY1cKO pups were placed in a beaker for sinking test. The lung from YY1cKO pup sank whereas Ctrl floated.(F) P0 lungs were stained with Hematoxylin and Eosin (H&E) and representative images are shown. Scale bar = 100 µm. (G) Representative images of diaphragms (Dps) isolated from P0 Ctrl or YY1cKO littermates.(H) The above Dps were used for H&E or Immunohistochemistry (IHC) staining for MyHC. Representative images from 3 pairs of littermates are shown. Scale bar = 50 µm.The above harvested Dps were subjected to IF staining for MyHC together with Laminin. Scale bar = 50 µm. Quantifications of positively stained fibers per area are shown on the right (n=3 mice, each).The above harvested Dps were subjected to IF staining for Troponin T (TnT) together with Laminin. Scale bar = 50 µm. Quantifications of positively stained fibers per area are shown on the right (n=3 mice, each).(K) Representative images of H&E staining of hind limb muscles isolated from Ctrl or YY1cKO embryos at E18.5 day. Scale bar = 400 µm (left) or 50 µm (right).The above harvested limb muscles were subjected to IF staining for MyHC together with Laminin. Scale bar = 400 µm (left) or 50 µm (right). Quantifications of the numbers of MyHC+ fibers per area are shown on the right (n=3 mice, each).The above harvested limb muscles were subjected to IF staining for TnT together with Laminin. Scale bar = 400 µm (left) or 50 µm (right). Quantifications of the numbers of TnT+ fibers per area are shown on the right (n=3 mice, each).The above harvested limb (N) muscles were subjected to IF staining for Pax7 and Laminin. Scale bar = 100 µm (N) Quantification of the numbers of Pax7+ muscle progenitor cells per area are shown on the right (n=3 mice, each). Error bars represent s.d.'s of the mean. Student's t-test (two-sided): *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.The above harvested diaphragm (O) muscles were subjected to IF staining for Pax7 and Laminin. Scale bar = 50 µm (O). Quantification of the numbers of Pax7+ muscle progenitor cells per area are shown on the right (n=3 mice, each). Error bars represent s.d.'s of the mean. Student's t-test (two-sided): *P<0.05, **P<0.01 ***P<0.001."}
{"words": ["Figure", "2", "(", "B", ")", "SCs", "were", "FACS", "sorted", "3", "days", "after", "the", "last", "TM", "injection", "and", "cultured", "for", "1", ".", "5", "days", ";", "RT", "-", "qPCR", "detection", "of", "YY1", "mRNA", "shows", "the", "ablation", "in", "YY1iKO", "cells", ".", "(", "C", ")", "IF", "staining", "for", "Pax7", "and", "YY1", "on", "freshly", "isolated", "FISCs", "or", "(", "D", ")", "single", "myofibers", "from", "EDL", "muscles", "or", "(", "E", ")", "cryosections", "from", "TA", "muscles", "showing", "the", "deletion", "of", "YY1", "protein", "from", "YY1iKO", "cells", ".", "Scale", "bar", "=", "100", "µm", "in", "(", "C", ")", "or", "50", "µm", "in", "(", "D", "-", "E", ")", ".", "(", "F", ")", "Representative", "FACS", "plots", ".", "About", "100", ",", "000", "cells", "from", "2", "-", "month", "-", "old", "Ctrl", "and", "YY1iKO", "mice", "were", "sorted", "by", "FACS", "3", "weeks", "post", "-", "TM", "injection", ".", "The", "percentage", "of", "SCs", "was", "shown", ".", "(", "n", "=", "3", "mice", ",", "each", ")", ".", "(", "G", ")", "H", "&", "E", "staining", "was", "performed", "on", "the", "injured", "TA", "muscles", "collected", "from", "the", "designated", "times", "post", "-", "CTX", "injection", "to", "visualize", "the", "degree", "of", "regeneration", ".", "Scale", "bar", "=", "100", "µm", ".", "(", "H", ")", "IF", "staining", "for", "eMyHC", "on", "the", "TA", "muscles", "5", "days", "post", "-", "CTX", "injury", ".", "Quantifications", "of", "the", "number", "of", "eMyHC", "+", "fibers", "are", "shown", "on", "the", "right", "(", "n", "=", "3", ",", "each", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "µm", ".", "(", "I", ")", "Left", ":", "representative", "images", "of", "TA", "muscles", "isolated", "from", "Ctrl", "or", "YY1iKO", "mice", "60", "days", "post", "-", "CTX", "injury", ".", "Right", ":", "Masson", "'", "s", "Trichrome", "staining", "of", "the", "above", "muscles", "to", "visualize", "the", "degree", "of", "fibrosis", ".", "Scale", "bar", "=", "100", "µm", ".", "(", "J", ")", "Cross", "-", "section", "area", "(", "CSA", ")", "of", "individual", "myofibers", "in", "TA", "muscles", "4", "weeks", "after", "injury", "was", "measured", ".", "The", "distribution", "for", "CSA", "was", "calculated", "(", "n", "=", "3", "mice", ")", ".", "(", "K", ")", "Representative", "FACS", "plots", "showing", "the", "percentage", "of", "SCs", "sorted", "from", "TA", "muscles", "3", "days", "after", "CTX", "injury", "of", "Ctrl", "and", "YY1iKO", "mice", ".", "Immunostaining", "for", "Pax7", "together", "with", "Laminin", "was", "performed", "on", "the", "TA", "muscles", "3", "days", "post", "-", "CTX", "injury", ".", "Scale", "bar", "=", "100", "µm", ".", "Quantifications", "of", "the", "numbers", "of", "Pax7", "+", "SCs", "per", "area", "are", "shown", "on", "the", "right", "(", "n", "=", "3", "mice", ",", "each", ")", ".", "Immunostaining", "for", "MyoD", "together", "with", "Laminin", "was", "performed", "on", "the", "TA", "muscles", "3", "days", "post", "-", "CTX", "injury", ".", "Scale", "bar", "=", "100", "µm", ".", "Quantifications", "of", "the", "numbers", "of", "MyoD", "+", "SCs", "per", "area", "are", "shown", "on", "the", "right", "(", "n", "=", "3", "mice", ",", "each", ")", ".", "(", "N", ")", "IF", "staining", "for", "Pax7", "and", "Laminin", "on", "TA", "muscles", "4", "weeks", "after", "CTX", "injury", "of", "Ctrl", "or", "YY1iKO", "mice", ".", "Quantifications", "of", "the", "numbers", "of", "Pax7", "+", "SCs", "per", "100", "fibers", "are", "shown", "on", "the", "right", "(", "n", "=", "3", "mice", ",", "each", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "100", "μm", ".", "(", "P", ")", "H", "&", "E", "staining", "was", "performed", "on", "TA", "muscles", "of", "Ctrl", "or", "YY1iKO", "mice", "7", "day", "after", "second", "CTX", "injury", ".", "Scale", "bar", "=", "400", "μm", "(", "left", ")", "or", "100", "μm", "(", "right", ")", ".", "(", "Q", ")", "Representative", "images", "of", "above", "TA", "muscles", "7", "days", "after", "second", "injury", ".", "(", "R", ")", "Quantifications", "of", "the", "weight", "above", "TA", "muscles", "from", "three", "pairs", "of", "littermate", "mice", ".", "(", "S", ")", "IF", "staining", "for", "eMyHC", "and", "Laminin", "on", "TA", "muscles", "7", "days", "after", "the", "second", "CTX", "injury", "of", "Ctrl", "or", "YY1iKO", "mice", ".", "Quantifications", "of", "the", "number", "of", "eMyHC", "+", "fibers", "per", "area", "are", "shown", "on", "the", "right", "(", "n", "=", "3", "mice", ",", "each", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "100", "μm", ".", "(", "T", ")", "IF", "staining", "for", "Pax7", "and", "Laminin", "on", "the", "above", "muscles", "and", "the", "quantifications", "of", "the", "number", "of", "Pax7", "+", "SCs", "per", "area", "are", "shown", "on", "the", "right", "(", "n", "=", "3", "mice", ",", "each", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "100", "μm", ".", "Error", "bars", "represent", "s", ".", "d", ".", "'", "s", "of", "the", "mean", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "two", "-", "sided", ")", ":", "N", ".", "S", "=", "non", "-", "significant", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2(B) SCs were FACS sorted 3 days after the last TM injection and cultured for 1.5 days; RT-qPCR detection of YY1 mRNA shows the ablation in YY1iKO cells.(C) IF staining for Pax7 and YY1 on freshly isolated FISCs or (D) single myofibers from EDL muscles or (E) cryosections from TA muscles showing the deletion of YY1 protein from YY1iKO cells. Scale bar =100 µm in (C) or 50 µm in (D-E).(F) Representative FACS plots. About 100,000 cells from 2-month-old Ctrl and YY1iKO mice were sorted by FACS 3 weeks post-TM injection. The percentage of SCs was shown. (n=3 mice, each).(G) H&E staining was performed on the injured TA muscles collected from the designated times post-CTX injection to visualize the degree of regeneration. Scale bar = 100 µm.(H) IF staining for eMyHC on the TA muscles 5 days post-CTX injury. Quantifications of the number of eMyHC+ fibers are shown on the right (n=3, each). Scale bar = 50 µm.(I) Left: representative images of TA muscles isolated from Ctrl or YY1iKO mice 60 days post-CTX injury. Right: Masson's Trichrome staining of the above muscles to visualize the degree of fibrosis. Scale bar = 100 µm.(J) Cross-section area (CSA) of individual myofibers in TA muscles 4 weeks after injury was measured. The distribution for CSA was calculated (n=3 mice).(K) Representative FACS plots showing the percentage of SCs sorted from TA muscles 3 days after CTX injury of Ctrl and YY1iKO mice.Immunostaining for Pax7 together with Laminin was performed on the TA muscles 3 days post-CTX injury. Scale bar = 100 µm. Quantifications of the numbers of Pax7+ SCs per area are shown on the right (n=3 mice, each).Immunostaining for MyoD together with Laminin was performed on the TA muscles 3 days post-CTX injury. Scale bar = 100 µm. Quantifications of the numbers of MyoD+ SCs per area are shown on the right (n=3 mice, each).(N) IF staining for Pax7 and Laminin on TA muscles 4 weeks after CTX injury of Ctrl or YY1iKO mice. Quantifications of the numbers of Pax7+ SCs per 100 fibers are shown on the right (n=3 mice, each). Scale bar = 100 μm.(P) H&E staining was performed on TA muscles of Ctrl or YY1iKO mice 7 day after second CTX injury. Scale bar = 400 μm (left) or 100 μm (right).(Q) Representative images of above TA muscles 7 days after second injury.(R) Quantifications of the weight above TA muscles from three pairs of littermate mice.(S) IF staining for eMyHC and Laminin on TA muscles 7 days after the second CTX injury of Ctrl or YY1iKO mice. Quantifications of the number of eMyHC+ fibers per area are shown on the right (n=3 mice, each). Scale bar = 100 μm.(T) IF staining for Pax7 and Laminin on the above muscles and the quantifications of the number of Pax7+ SCs per area are shown on the right (n=3 mice, each). Scale bar = 100 μm. Error bars represent s.d.'s of the mean. Student's t-test (two-sided): N.S = non-significant, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "B", ")", "SCs", "were", "FACS", "sorted", "4", "months", "after", "the", "last", "TM", "injection", ";", "RT", "-", "qPCR", "detection", "of", "YY1", "mRNA", "shows", "the", "ablation", "in", "YY1dKO", "cells", ".", "(", "C", ")", "Representative", "images", "of", "Ctrl", "or", "YY1dKO", "mice", "4", "months", "after", "the", "TM", "administration", ".", "(", "D", ")", "Representative", "images", "of", "limb", "muscles", "(", "Tibialis", "anterior", ",", "TA", ";", "Gastrocnemius", ",", "Gas", ";", "Quadruple", ",", "Quad", ")", "from", "Ctrl", "or", "YY1dKO", "mice", ".", "(", "E", ")", "Quantifications", "of", "muscle", "weight", "from", "three", "pairs", "of", "littermate", "mice", ".", "(", "F", ")", "Representative", "images", "of", "Dp", "muscles", "isolated", "from", "Ctrl", "or", "YY1dKO", "mice", "4", "months", "after", "the", "TM", "injection", ".", "(", "G", ")", "H", "&", "E", "or", "(", "H", ")", "MyHC", "staining", "was", "performed", "on", "TA", "or", "Dp", "muscles", "from", "Ctrl", "or", "YY1dKO", "mice", ".", "Quantifications", "of", "the", "numbers", "of", "MyHC", "+", "fibers", "per", "area", "of", "TA", "or", "Dp", "muscles", "are", "shown", "on", "the", "right", "(", "n", "=", "3", "mice", ",", "each", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "100", "µm", ".", "(", "I", ")", "Collagen1", "or", "(", "J", ")", "Masson", "'", "s", "Trichrome", "staining", "was", "performed", "on", "TA", "or", "Dp", "muscles", "from", "Ctrl", "or", "YY1dKO", "mice", ".", "Scale", "bar", "=", "100", "µm", ".", "(", "K", ")", "The", "distribution", "of", "fiber", "size", "measured", "by", "CSA", "in", "TA", "muscles", "from", "3", "pairs", "of", "6", "-", "month", "-", "old", "Ctrl", "and", "YY1dKO", "mice", "was", "calculated", "(", "n", "=", "3", "mice", ",", "each", ")", ".", "(", "L", ")", "Representative", "FACS", "plots", "showing", "the", "percentage", "of", "SCs", "sorted", "from", "6", "-", "month", "-", "old", "Ctrl", "and", "YY1dKO", "mice", "(", "n", "=", "3", "mice", ",", "each", ")", ".", "(", "M", ")", "IF", "staining", "for", "Pax7", "and", "Laminin", "on", "TA", "muscles", "of", "Ctrl", "or", "YY1dKO", "mice", ".", "Quantifications", "of", "the", "numbers", "of", "Pax7", "+", "SCs", "per", "100", "fibers", "are", "shown", "on", "the", "right", "(", "n", "=", "3", "mice", ",", "each", ")", ".", "EDL", "muscles", "from", "Ctrl", "or", "YY1dKO", "mice", "were", "subjected", "to", "measurement", "of", "maximal", "isometric", "tetanic", "force", ".", "Left", ":", "Representative", "trace", "images", "of", "normalized", "tetanic", "force", ".", "(", "Right", ")", ":", "quantification", "of", "the", "force", "by", "normalizing", "with", "cross", "-", "sectional", "area", "(", "CSA", ")", ".", "(", "n", "=", "3", "mice", ",", "each", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "s", ".", "d", ".", "'", "s", "of", "the", "mean", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "two", "-", "sided", ")", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "SOL", "muscles", "from", "Ctrl", "or", "YY1dKO", "mice", "were", "subjected", "to", "measurement", "of", "maximal", "isometric", "tetanic", "force", ".", "Left", ":", "Representative", "trace", "images", "of", "normalized", "tetanic", "force", ".", "(", "Right", ")", ":", "quantification", "of", "the", "force", "by", "normalizing", "with", "cross", "-", "sectional", "area", "(", "CSA", ")", ".", "(", "n", "=", "3", "mice", ",", "each", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "s", ".", "d", ".", "'", "s", "of", "the", "mean", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "two", "-", "sided", ")", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(B) SCs were FACS sorted 4 months after the last TM injection; RT-qPCR detection of YY1 mRNA shows the ablation in YY1dKO cells.(C) Representative images of Ctrl or YY1dKO mice 4 months after the TM administration.(D) Representative images of limb muscles (Tibialis anterior, TA; Gastrocnemius, Gas; Quadruple, Quad) from Ctrl or YY1dKO mice. (E) Quantifications of muscle weight from three pairs of littermate mice.(F) Representative images of Dp muscles isolated from Ctrl or YY1dKO mice 4 months after the TM injection.(G) H&E or (H) MyHC staining was performed on TA or Dp muscles from Ctrl or YY1dKO mice. Quantifications of the numbers of MyHC+ fibers per area of TA or Dp muscles are shown on the right (n=3 mice, each). Scale bar = 100 µm.(I) Collagen1 or (J) Masson's Trichrome staining was performed on TA or Dp muscles from Ctrl or YY1dKO mice. Scale bar = 100 µm.(K) The distribution of fiber size measured by CSA in TA muscles from 3 pairs of 6-month-old Ctrl and YY1dKO mice was calculated (n=3 mice, each).(L) Representative FACS plots showing the percentage of SCs sorted from 6-month-old Ctrl and YY1dKO mice (n=3 mice, each).(M) IF staining for Pax7 and Laminin on TA muscles of Ctrl or YY1dKO mice. Quantifications of the numbers of Pax7+ SCs per 100 fibers are shown on the right (n=3 mice, each).EDL muscles from Ctrl or YY1dKO mice were subjected to measurement of maximal isometric tetanic force. Left: Representative trace images of normalized tetanic force. (Right): quantification of the force by normalizing with cross-sectional area (CSA). (n = 3 mice, each). Error bars represent s.d.'s of the mean. Student's t-test (two-sided): *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001.SOL muscles from Ctrl or YY1dKO mice were subjected to measurement of maximal isometric tetanic force. Left: Representative trace images of normalized tetanic force. (Right): quantification of the force by normalizing with cross-sectional area (CSA). (n = 3 mice, each). Error bars represent s.d.'s of the mean. Student's t-test (two-sided): *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001."}
{"words": ["Figure", "4", "(", "A", ")", "FACS", "-", "isolated", "SCs", "from", "Pax7", "-", "nGFP", "mice", "were", "cultured", "for", "the", "designated", "time", "(", "0", ",", "24", ",", "48", "or", "72", "hrs", ")", ".", "YY1", "expression", "was", "quantified", "by", "RT", "-", "qPCR", ".", "18S", "was", "used", "as", "the", "normalization", "control", ".", "(", "B", ")", "Flow", "cytometric", "analysis", "of", "YY1", "protein", "or", "IgG", "control", "in", "FACS", "-", "isolated", "SCs", "cultured", "for", "the", "designated", "time", "(", "0", ",", "24", "or", "48hrs", ")", ".", "YY1", "protein", "level", "is", "normalized", "to", "IgG", "levels", ".", "The", "numbers", "indicate", "the", "normalized", "level", "of", "YY1", "protein", "relative", "to", "that", "of", "FISCs", ".", "(", "C", ")", "An", "equal", "number", "of", "FACS", "-", "isolated", "SCs", "from", "Ctrl", "or", "YY1iKO", "mice", "were", "cultured", "for", "48", "hrs", "and", "EdU", "labelled", "for", "8", "hrs", ",", "followed", "by", "immunostaining", "for", "Pax7", "(", "green", ")", "and", "EdU", "(", "red", ")", ".", "Quantifications", "of", "the", "percentage", "of", "EdU", "+", "cells", "are", "shown", "on", "the", "right", "(", "n", "=", "3", "mice", ",", "each", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "100", "µm", ".", "(", "D", ")", "The", "above", "cells", "were", "also", "IF", "stained", "for", "Pax7", "(", "red", ")", "and", "MyoD", "(", "green", ")", ".", "Quantifications", "of", "each", "population", ",", "Pax7", "+", "MyoD", "+", ",", "or", "Pax7", "-", "MyoD", "+", ",", "are", "shown", "on", "the", "right", "(", "n", "=", "3", ",", "each", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "100", "µm", ".", "(", "E", ")", "Single", "EDL", "myofibers", "were", "cultured", "for", "48", "hrs", "before", "staining", "for", "Pax7", "(", "red", ")", "and", "MyoD", "(", "green", ")", ".", "Quantifications", "of", "the", "numbers", "of", "each", "population", ",", "Pax7", "+", "MyoD", "-", ",", "Pax7", "-", "MyoD", "+", ",", "or", "Pax7", "+", "MyoD", "+", ",", "are", "shown", "on", "the", "right", "(", "n", "=", "3", "mice", ",", "each", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "µm", ".", "(", "F", ")", "Pax7", "(", "green", ")", "and", "Ki67", "(", "red", ")", "staining", "was", "performed", "on", "the", "above", "single", "EDL", "myofibers", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "µm", ".", "Quantifications", "of", "the", "numbers", "of", "each", "population", ",", "Pax7", "+", "Ki67", "-", ",", "Pax7", "-", "Ki67", "+", ",", "or", "Pax7", "+", "Ki67", "+", ",", "are", "shown", "on", "the", "right", "(", "n", "=", "3", "mice", ",", "each", ")", ".", "(", "G", ")", "SCs", "expansion", "in", "vivo", "was", "determined", "by", "EdU", "labeling", "for", "12", "hrs", "2", ".", "5", "days", "after", "CTX", "injury", ".", "Quantifications", "of", "the", "numbers", "of", "EdU", "+", "cells", "are", "shown", "on", "the", "right", "(", "n", "=", "3", "mice", ",", "each", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "100", "µm", ".", "(", "H", ")", "An", "equal", "number", "of", "FACS", "-", "isolated", "SCs", "from", "Ctrl", "or", "YY1iKO", "mice", "were", "cultured", "for", "24hrs", "and", "EdU", "labeled", "for", "12", "hrs", ",", "followed", "by", "immunostaining", "for", "Pax7", "(", "green", ")", "and", "EdU", "(", "red", ")", "was", "performed", ".", "Quantifications", "of", "the", "percentage", "of", "EdU", "+", "cells", "are", "shown", "on", "the", "right", "(", "n", "=", "3", "mice", ",", "each", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "100", "µm", ".", "Single", "EDL", "myofibers", "were", "cultured", "for", "12", "(", "I", ")", "hrs", "in", "growth", "media", "before", "staining", "for", "Pax7", "(", "green", ")", "and", "MyoD", "(", "red", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "µm", ".", "Quantifications", "of", "the", "proportion", "of", "MyoD", "+", "cells", "are", "shown", "on", "the", "right", "(", "n", "=", "3", "mice", ",", "each", ")", ".", "Single", "EDL", "myofibers", "were", "cultured", "for", "24", "(", "J", ")", "hrs", "in", "growth", "media", "before", "staining", "for", "Pax7", "(", "green", ")", "and", "MyoD", "(", "red", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "µm", ".", "Quantifications", "of", "the", "proportion", "of", "MyoD", "+", "cells", "are", "shown", "on", "the", "right", "(", "n", "=", "3", "mice", ",", "each", ")", ".", "(", "K", ")", "FACS", "-", "isolated", "SCs", "from", "YY1iKO", "mice", "were", "infected", "with", "YY1", "expressing", "or", "control", "viruses", ",", "followed", "by", "immunostaining", "for", "Pax7", "(", "green", ")", "and", "MyoD", "(", "red", ")", "36", "hrs", "post", "-", "transfection", ".", "Scale", "bar", "=", "100", "µm", ".", "Quantifications", "of", "the", "numbers", "of", "each", "population", ",", "Pax7", "+", "MyoD", "-", ",", "Pax7", "-", "MyoD", "+", ",", "or", "Pax7", "+", "MyoD", "+", ",", "are", "shown", "on", "the", "right", "(", "n", "=", "3", "mice", ",", "each", ")", ".", "(", "L", ")", "Single", "EDL", "myofibers", "were", "cultured", "for", "3", "days", ",", "followed", "by", "immunostaining", "for", "Myogenin", "(", "red", ")", "and", "MyoD", "(", "green", ")", ".", "Scale", "bar", "=", "50", "µm", ".", "Quantifications", "of", "the", "numbers", "of", "each", "population", ",", "MyoD", "+", "Myog", "+", ",", "MyoD", "-", "Myog", "+", ",", "or", "MyoD", "+", "Myog", "-", ",", "are", "shown", "on", "the", "right", "(", "n", "=", "3", "mice", ",", "each", ")", ".", "(", "M", ")", "FACS", "-", "isolated", "SCs", "were", "cultured", "for", "2", "days", "in", "proliferation", "medium", "followed", "by", "2", "days", "in", "differentiation", "medium", ";", "the", "degree", "of", "differentiation", "was", "assessed", "by", "IF", "staining", "of", "MF20", "+", ".", "Scale", "bar", "=", "100", "µm", ".", "Quantifications", "of", "the", "numbers", "of", "MF20", "+", "area", "per", "nucleus", "are", "shown", "on", "the", "right", "(", "n", "=", "3", "mice", ",", "each", ")", ".", "Error", "bars", "represent", "s", ".", "d", ".", "'", "s", "of", "the", "mean", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "two", "-", "sided", ")", ":", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4(A) FACS-isolated SCs from Pax7-nGFP mice were cultured for the designated time (0, 24, 48 or 72 hrs). YY1 expression was quantified by RT-qPCR. 18S was used as the normalization control.(B) Flow cytometric analysis of YY1 protein or IgG control in FACS-isolated SCs cultured for the designated time (0, 24 or 48hrs). YY1 protein level is normalized to IgG levels. The numbers indicate the normalized level of YY1 protein relative to that of FISCs.(C) An equal number of FACS-isolated SCs from Ctrl or YY1iKO mice were cultured for 48 hrs and EdU labelled for 8 hrs, followed by immunostaining for Pax7 (green) and EdU (red). Quantifications of the percentage of EdU+ cells are shown on the right (n=3 mice, each). Scale bar = 100 µm.(D) The above cells were also IF stained for Pax7 (red) and MyoD (green). Quantifications of each population, Pax7+MyoD+, or Pax7-MyoD+, are shown on the right (n=3, each). Scale bar = 100 µm.(E) Single EDL myofibers were cultured for 48 hrs before staining for Pax7 (red) and MyoD (green). Quantifications of the numbers of each population, Pax7+MyoD-, Pax7-MyoD+, or Pax7+MyoD+, are shown on the right (n=3 mice, each). Scale bar = 50 µm.(F) Pax7 (green) and Ki67 (red) staining was performed on the above single EDL myofibers. Scale bar = 50 µm. Quantifications of the numbers of each population, Pax7+Ki67-, Pax7-Ki67+, or Pax7+Ki67+, are shown on the right (n= 3 mice, each).(G) SCs expansion in vivo was determined by EdU labeling for 12 hrs 2.5 days after CTX injury. Quantifications of the numbers of EdU+ cells are shown on the right (n=3 mice, each). Scale bar = 100 µm.(H) An equal number of FACS-isolated SCs from Ctrl or YY1iKO mice were cultured for 24hrs and EdU labeled for 12 hrs, followed by immunostaining for Pax7 (green) and EdU (red) was performed. Quantifications of the percentage of EdU+ cells are shown on the right (n=3 mice, each). Scale bar = 100 µm.Single EDL myofibers were cultured for 12 (I) hrs in growth media before staining for Pax7 (green) and MyoD (red). Scale bar = 50 µm. Quantifications of the proportion of MyoD+ cells are shown on the right (n=3 mice, each).Single EDL myofibers were cultured for 24 (J) hrs in growth media before staining for Pax7 (green) and MyoD (red). Scale bar = 50 µm. Quantifications of the proportion of MyoD+ cells are shown on the right (n=3 mice, each).(K) FACS-isolated SCs from YY1iKO mice were infected with YY1 expressing or control viruses, followed by immunostaining for Pax7 (green) and MyoD (red) 36 hrs post-transfection. Scale bar = 100 µm. Quantifications of the numbers of each population, Pax7+MyoD-, Pax7-MyoD+, or Pax7+MyoD+, are shown on the right (n=3 mice, each).(L) Single EDL myofibers were cultured for 3 days, followed by immunostaining for Myogenin (red) and MyoD (green). Scale bar = 50 µm. Quantifications of the numbers of each population, MyoD+Myog+, MyoD-Myog+, or MyoD+Myog-, are shown on the right (n=3 mice, each).(M) FACS-isolated SCs were cultured for 2 days in proliferation medium followed by 2 days in differentiation medium; the degree of differentiation was assessed by IF staining of MF20+. Scale bar = 100 µm. Quantifications of the numbers of MF20+ area per nucleus are shown on the right (n=3 mice, each). Error bars represent s.d.'s of the mean. Student's t-test (two-sided): *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "A", ")", "RNA", "-", "seq", "was", "performed", "with", "RNAs", "extracted", "from", "ASCs", "(", "FACS", "purified", "and", "cultured", "for", "36hrs", ")", "of", "YY1iKO", "or", "Ctrl", "mice", ";", "scatter", "plot", "shows", "differentially", "expressed", "genes", "with", "a", "fold", "change", ">", "=", "2", "(", "red", "dots", ")", "in", "YY1iKO", "vs", "Ctrl", ".", "(", "C", ")", "Genomic", "snapshots", "showing", "the", "examples", "of", "mitochondrial", "genes", "(", "Uqcr11", ",", "Mrp11", ",", "Apo5o", "and", "Nme4", ")", "up", "-", "regulated", "in", "YY1iKO", "vs", "Ctrl", "cells", ".", "(", "D", ")", "GSEA", "analysis", "shows", "oxidative", "phosphorylation", "gene", "set", "is", "enriched", "in", "YY1iKO", "vs", "Ctrl", "cells", "(", "p", "-", "value", "<", "0", ".", "0001", ")", ".", "(", "E", ")", "RT", "-", "qPCR", "validation", "of", "the", "expression", "of", "the", "selected", "up", "-", "regulated", "mitochondrial", "genes", "in", "YY1iKO", "vs", "Ctrl", ".", "(", "F", ")", "Protein", "levels", "of", "the", "respiratory", "chain", "complexes", "I", "-", "V", "components", "in", "YY1iKO", "vs", "Ctrl", "ASCs", "were", "detected", "using", "a", "mitoprofile", "antibody", "cocktail", ".", "β", "-", "actin", "was", "used", "as", "the", "loading", "control", ".", "(", "G", ")", "RNA", "-", "seq", "was", "performed", "using", "RNAs", "from", "freshly", "isolated", "SCs", "(", "FISCs", ")", ";", "scatter", "plot", "shows", "differentially", "expressed", "genes", "with", "a", "fold", "change", ">", "=", "2", "(", "red", "dots", ")", "in", "YY1iKO", "vs", "Ctrl", ".", "(", "I", ")", "Genomic", "snapshots", "show", "the", "selected", "mitochondrial", "genes", "(", "Cox8b", ",", "Nme4", ",", "Slc25a29", ",", "Nnt", ")", "up", "-", "regulated", "in", "YY1iKO", "vs", "Ctrl", "FISCs", ".", "(", "J", ")", "ChIPseq", "was", "performed", "using", "chromatins", "from", "WT", "ASCs", "and", "the", "genomic", "distribution", "of", "2031", "YY1", "binding", "peaks", "is", "shown", ".", "(", "N", ")", "Genomic", "snapshots", "of", "two", "of", "the", "above", "identified", "mitochondrial", "genes", "(", "Tomm40I", "and", "Ndufa13", ")", "that", "are", "bound", "by", "YY1", "in", "their", "TSS", "(", "ChIPseq", "tracks", ")", "and", "up", "-", "regulated", "by", "YY1", "deletion", "(", "RNAseq", "tracks", ")", ".", "(", "O", ")", "ChIP", "-", "qPCR", "validation", "of", "YY1", "binding", "on", "some", "mitochondrial", "genes", ".", "Negative", "control", "(", "NC", ")", "represents", "a", "genomic", "region", "on", "Chromosome", "11", "with", "no", "YY1", "binding", "peak", "identified", ".", "Enrichment", "fold", "was", "calculated", "as", "the", "amount", "of", "amplified", "DNA", "from", "YY1", "binding", "sites", "normalized", "to", "values", "obtained", "from", "IgG", "control", ".", "ChIP", "-", "qPCR", "was", "performed", "to", "show", "the", "enrichment", "of", "Ezh2", "(", "P", ")", "binding", "on", "selected", "mitochondrial", "genes", ".", "ChIP", "-", "qPCR", "was", "performed", "to", "show", "the", "enrichment", "of", "Suz12", "(", "Q", ")", "binding", "on", "selected", "mitochondrial", "genes", ".", "ChIP", "-", "qPCR", "was", "performed", "to", "show", "the", "enrichment", "of", "H3K27", "me3", "(", "R", ")", "binding", "on", "selected", "mitochondrial", "genes", ".", "(", "S", ")", "A", "construct", "to", "express", "wild", "type", "YY1", "(", "WT", ")", ",", "or", "two", "mutants", "lacking", "DNA", "binding", "activity", ",", "YY1", "(", "1", "-", "394", ")", "and", "YY1", "(", "S365D", ")", "were", "transfected", "into", "YY1iKO", "cells", ";", "the", "expression", "of", "mitochondrial", "gene", "was", "measured", ".", "Error", "bars", "represent", "s", ".", "d", ".", "'", "s", "of", "the", "mean", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "two", "-", "sided", ")", ":", "N", ".", "S", "=", "non", "-", "significant", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(A) RNA-seq was performed with RNAs extracted from ASCs (FACS purified and cultured for 36hrs) of YY1iKO or Ctrl mice; scatter plot shows differentially expressed genes with a fold change >=2 (red dots) in YY1iKO vs Ctrl.(C) Genomic snapshots showing the examples of mitochondrial genes (Uqcr11, Mrp11, Apo5o and Nme4) up-regulated in YY1iKO vs Ctrl cells.(D) GSEA analysis shows oxidative phosphorylation gene set is enriched in YY1iKO vs Ctrl cells (p-value < 0.0001).(E) RT-qPCR validation of the expression of the selected up-regulated mitochondrial genes in YY1iKO vs Ctrl.(F) Protein levels of the respiratory chain complexes I-V components in YY1iKO vs Ctrl ASCs were detected using a mitoprofile antibody cocktail. β-actin was used as the loading control.(G) RNA-seq was performed using RNAs from freshly isolated SCs (FISCs); scatter plot shows differentially expressed genes with a fold change >=2 (red dots) in YY1iKO vs Ctrl.(I) Genomic snapshots show the selected mitochondrial genes (Cox8b, Nme4, Slc25a29, Nnt) up-regulated in YY1iKO vs Ctrl FISCs.(J) ChIPseq was performed using chromatins from WT ASCs and the genomic distribution of 2031 YY1 binding peaks is shown.(N) Genomic snapshots of two of the above identified mitochondrial genes (Tomm40I and Ndufa13) that are bound by YY1 in their TSS (ChIPseq tracks) and up-regulated by YY1 deletion (RNAseq tracks).(O) ChIP-qPCR validation of YY1 binding on some mitochondrial genes. Negative control (NC) represents a genomic region on Chromosome 11 with no YY1 binding peak identified. Enrichment fold was calculated as the amount of amplified DNA from YY1 binding sites normalized to values obtained from IgG control.ChIP-qPCR was performed to show the enrichment of Ezh2 (P) binding on selected mitochondrial genes.ChIP-qPCR was performed to show the enrichment of Suz12 (Q) binding on selected mitochondrial genes.ChIP-qPCR was performed to show the enrichment of H3K27 me3 (R) binding on selected mitochondrial genes.(S) A construct to express wild type YY1(WT), or two mutants lacking DNA binding activity, YY1(1-394) and YY1(S365D) were transfected into YY1iKO cells; the expression of mitochondrial gene was measured. Error bars represent s.d.'s of the mean. Student's t-test (two-sided): N.S = non-significant, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "An", "equal", "number", "of", "FACS", "-", "isolated", "SCs", "from", "C57", "mice", "were", "cultured", "for", "24", "hrs", "and", "treated", "with", "0", ",", "1", ",", "10", ",", "or", "20mM", "2", "-", "DG", "(", "glycolytic", "inhibitor", ")", "or", "NaN3", "(", "respiration", "inhibitor", ")", "for", "3", "hrs", "before", "measurement", "of", "ATP", "production", ".", "The", "relative", "ATP", "levels", "normalized", "to", "the", "0", "mM", "values", "are", "plotted", ".", "N", "=", "3", "mice", ".", "(", "B", ")", "SCs", "from", "C57", "mice", "were", "treated", "with", "10mM", "2", "-", "DG", "or", "10mM", "NaN3", "for", "36", "hrs", "before", "measurement", "of", "proliferation", "rate", "by", "MTS", "assay", "(", "n", "=", "3", "mice", ",", "each", ")", ".", "(", "C", ")", "SCs", "from", "C57", "mice", "were", "treated", "with", "10mM", "2", "-", "DG", "for", "24", "hrs", "and", "subject", "to", "EdU", "labeling", "for", "6", "hrs", ".", "The", "percentage", "of", "Pax7", "+", "/", "EdU", "+", "cells", "over", "the", "total", "number", "of", "Pax7", "+", "cells", "was", "quantified", "(", "n", "=", "3", "mice", ",", "each", ")", ".", "(", "D", ")", "Ctrl", "and", "YY1iKO", "ASCs", "were", "stained", "with", "60", "ug", "/", "mL", "2", "-", "NBDG", "for", "45", "mins", "and", "the", "fluorescence", "intensity", "(", "MFI", ")", "of", "2", "-", "NBDG", "was", "measured", "by", "flow", "cytometry", "(", "n", "=", "3", "mice", ",", "each", ")", ".", "An", "equal", "number", "of", "Ctrl", "and", "YY1iKO", "cells", "were", "cultured", "for", "36h", ";", "basal", "extracellular", "acidification", "rate", "(", "ECAR", ")", "level", "were", "measured", "and", "normalized", "with", "cell", "numbers", ".", "N", "=", "3", "mice", ".", "An", "equal", "number", "of", "Ctrl", "and", "YY1iKO", "cells", "were", "cultured", "for", "36h", "Lactate", "concentration", "(", "F", ")", "were", "measured", "and", "normalized", "with", "cell", "numbers", ".", "N", "=", "3", "mice", ".", "byAn", "equal", "number", "of", "Ctrl", "and", "YY1iKO", "cells", "were", "cultured", "for", "36h", "ATP", "production", "(", "G", ")", "were", "measured", "and", "normalized", "with", "cell", "numbers", ".", "N", "=", "3", "mice", ".", "(", "H", ")", "Genomic", "snapshots", "depict", "RNAseq", "profiles", "of", "the", "selected", "glycolytic", "genes", "(", "Hk2", ",", "Glut1", ",", "Ldha", ",", "Pdk1", ",", "Eno1", ")", "down", "-", "regulated", "in", "YY1iKO", "vs", "Ctrl", "ASCs", ".", "(", "I", ")", "Expression", "of", "the", "selected", "glycolytic", "genes", "was", "quantified", "by", "RT", "-", "qPCR", ".", "Hsp90ab1", "was", "used", "as", "the", "normalization", "control", ".", "(", "J", ")", "Re", "-", "expression", "of", "YY1", "by", "transfecting", "YY1iKO", "ASCs", "with", "a", "YY1", "WT", "expressing", "plasmid", "led", "to", "up", "-", "regulation", "of", "glycolytic", "genes", "including", "Glut1", ",", "Pfkl", ",", "Gapdh", ",", "Eno1", ",", "Pgam1", ",", "Pkm", ".", "Hsp90ab1", "was", "used", "as", "the", "normalization", "control", ".", "(", "K", ")", "FACS", "-", "isolated", "SCs", "from", "Pax7", "-", "nGFP", "mice", "were", "transfected", "with", "Hif1α", "or", "control", "siRNAs", "and", "EdU", "labeled", "for", "5", "hrs", ".", "The", "percentage", "of", "MyoD", "+", "EdU", "+", "cells", "over", "the", "total", "number", "of", "MyoD", "+", "cells", "was", "quantified", ".", "Scale", "bar", "=", "100", "µm", ".", "N", "=", "3", "mice", ".", "(", "L", ")", "The", "expression", "of", "glycolytic", "genes", "and", "cell", "cycle", "related", "genes", "was", "detected", "by", "RT", "-", "qPCR", "in", "the", "above", "transfected", "cells", ".", "β", "-", "actin", "was", "used", "as", "the", "normalization", "control", ".", "(", "M", ")", "Hif1α", "protein", "level", "was", "detected", "by", "Western", "blotting", "in", "YY1iKO", "vs", "Ctrl", "ASCs", ".", "β", "-", "actin", "was", "used", "as", "the", "loading", "control", ".", "(", "N", ")", "Left", ":", "Image", "of", "flow", "cytometric", "analysis", "of", "Hif1α", "protein", "or", "IgG", "control", "in", "YY1iKO", "vs", "Ctrl", "ASCs", ".", "Right", ":", "Relative", "mean", "fluorescence", "intensity", "(", "MFI", ")", "of", "Hif1α", "protein", "is", "shown", ".", "N", "=", "3", "mice", ".", "(", "O", ")", "YY1iKO", "ASCs", "were", "transfected", "with", "empty", "YY1", "WT", "viruses", ";", "the", "relative", "expression", "level", "of", "Hif1a", "protein", "was", "detected", "by", "the", "above", "described", "flow", "cytometric", "analysis", "N", "=", "3", "mice", ".", "Error", "bars", "represent", "s", ".", "d", ".", "'", "s", "of", "the", "mean", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "two", "-", "sided", ")", ":", "N", ".", "S", "=", "non", "-", "significant", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) An equal number of FACS-isolated SCs from C57 mice were cultured for 24 hrs and treated with 0, 1, 10, or 20mM 2-DG (glycolytic inhibitor) or NaN3 (respiration inhibitor) for 3 hrs before measurement of ATP production. The relative ATP levels normalized to the 0 mM values are plotted. N=3 mice.(B) SCs from C57 mice were treated with 10mM 2-DG or 10mM NaN3 for 36 hrs before measurement of proliferation rate by MTS assay (n=3 mice, each).(C) SCs from C57 mice were treated with 10mM 2-DG for 24 hrs and subject to EdU labeling for 6 hrs. The percentage of Pax7+/EdU+ cells over the total number of Pax7+ cells was quantified (n=3 mice, each).(D) Ctrl and YY1iKO ASCs were stained with 60 ug/mL 2-NBDG for 45 mins and the fluorescence intensity (MFI) of 2-NBDG was measured by flow cytometry (n=3 mice, each).An equal number of Ctrl and YY1iKO cells were cultured for 36h; basal extracellular acidification rate (ECAR) level were measured and normalized with cell numbers. N=3 mice.An equal number of Ctrl and YY1iKO cells were cultured for 36h Lactate concentration (F) were measured and normalized with cell numbers. N=3 mice. byAn equal number of Ctrl and YY1iKO cells were cultured for 36h ATP production (G) were measured and normalized with cell numbers. N=3 mice.(H) Genomic snapshots depict RNAseq profiles of the selected glycolytic genes (Hk2, Glut1, Ldha, Pdk1, Eno1) down-regulated in YY1iKO vs Ctrl ASCs.(I) Expression of the selected glycolytic genes was quantified by RT-qPCR. Hsp90ab1 was used as the normalization control.(J) Re-expression of YY1 by transfecting YY1iKO ASCs with a YY1 WT expressing plasmid led to up-regulation of glycolytic genes including Glut1, Pfkl, Gapdh, Eno1, Pgam1, Pkm. Hsp90ab1 was used as the normalization control.(K) FACS-isolated SCs from Pax7-nGFP mice were transfected with Hif1α or control siRNAs and EdU labeled for 5 hrs. The percentage of MyoD+EdU+ cells over the total number of MyoD+ cells was quantified. Scale bar = 100 µm. N=3 mice.(L) The expression of glycolytic genes and cell cycle related genes was detected by RT-qPCR in the above transfected cells. β-actin was used as the normalization control.(M) Hif1α protein level was detected by Western blotting in YY1iKO vs Ctrl ASCs. β-actin was used as the loading control.(N) Left: Image of flow cytometric analysis of Hif1α protein or IgG control in YY1iKO vs Ctrl ASCs. Right: Relative mean fluorescence intensity (MFI) of Hif1α protein is shown. N=3 mice.(O) YY1iKO ASCs were transfected with empty YY1 WT viruses; the relative expression level of Hif1a protein was detected by the above described flow cytometric analysis N=3 mice. Error bars represent s.d.'s of the mean. Student's t-test (two-sided): N.S = non-significant, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", "-", "B", ")", "Ctrl", "or", "YY1iKO", "ASCs", "were", "treated", "with", "CHX", "(", "Cycloheximide", ")", "for", "90", "mins", "and", "Hif1α", "protein", "was", "measured", "by", "flow", "cytometry", ".", "The", "numbers", "indicate", "the", "degradation", "rate", "after", "CHX", "treatment", ".", "N", "=", "3", "mice", ".", "(", "C", ")", "The", "relative", "degradation", "rate", "was", "calculated", "by", "the", "ratio", "of", "degradation", "rate", "in", "YY1iKO", "(", "11", ".", "14", "%", "±", "1", ".", "71", "%", ")", "vs", "Ctrl", "(", "5", ".", "08", "%", "±", "0", ".", "796", "%", ")", ".", "N", "=", "3", "mice", ".", "(", "D", ")", "Lysates", "from", "C2C12", "myoblasts", "(", "GM", ")", "were", "subjected", "to", "co", "-", "immunoprecipitation", "(", "Co", "-", "IP", ")", "assays", "with", "anti", "-", "YY1", "or", "anti", "-", "IgG", "antibodies", "and", "blotted", "with", "anti", "-", "Hif1α", "or", "anti", "-", "YY1", "antibodies", ".", "(", "E", ")", "The", "above", "lysates", "were", "also", "IPed", "with", "anti", "-", "Hif1α", "or", "anti", "-", "IgG", "antibodies", "and", "blotted", "with", "anti", "-", "YY1", "or", "anti", "-", "Hif1α", "antibodies", ".", "(", "F", ")", "ASCs", "from", "YY1iKO", "mice", "were", "infected", "with", "pRlenti", "-", "Hif1α", "(", "P402A", "/", "P564A", ")", "(", "Hif1α", "-", "DM", ")", "viruses", "to", "overexpress", "a", "non", "-", "degradable", "Hif1α", "protein", "or", "GFP", "-", "expressing", "viruses", ".", "ASCs", "from", "Ctrl", "mice", "were", "also", "infected", "with", "the", "GFP", "viruses", ".", "36", "hrs", "after", "infection", ",", "the", "expression", "of", "target", "glycolytic", "genes", "was", "detected", "by", "RT", "-", "qPCR", ".", "Hsp90ab1", "was", "used", "as", "the", "normalization", "control", ".", "(", "G", ")", "SCs", "were", "isolated", "from", "Ctrl", "or", "YY1iKO", "mice", "and", "infected", "with", "the", "above", "viruses", ".", "EdU", "labeling", "was", "then", "performed", "for", "5", ".", "5", "hrs", ".", "The", "percentage", "of", "MyoD", "+", "EdU", "+", "cells", "over", "the", "total", "number", "of", "MyoD", "+", "cells", "was", "quantified", ".", "Scale", "bar", "=", "100", "µm", ".", "N", "=", "3", "mice", ".", "Heat", "maps", "indicating", "gene", "expression", "levels", "(", "Log2", "[", "FPKM", "]", ")", "of", "pentose", "cycle", "enzymes", "(", "H", ")", "in", "YY1iKO", "vs", "Ctrl", ".", "Heat", "maps", "indicating", "gene", "expression", "levels", "(", "Log2", "[", "FPKM", "]", ")", "of", "amino", "acid", "transporter", "(", "I", ")", "in", "YY1iKO", "vs", "Ctrl", ".", "(", "J", ")", "YY1", "(", "WT", ")", "or", "YY1", "(", "S365D", ")", "mutant", "was", "expressed", "in", "YY1iKO", "ASCs", "and", "EdU", "labeled", "for", "6", "hrs", ".", "(", "K", ")", "Similarly", ",", "YY1", "(", "WT", ")", "or", "YY1", "(", "1", "-", "394", ")", "mutant", "was", "expressed", "and", "EdU", "labeled", "for", "6hrs", ".", "A", "GFP", "expressing", "plasmid", "was", "used", "the", "negative", "control", ".", "The", "percentage", "of", "Pax7", "+", "/", "EdU", "+", "cells", "over", "the", "total", "number", "of", "Pax7", "+", "cells", "was", "quantified", ".", "Error", "bars", "represent", "s", ".", "d", ".", "'", "s", "of", "the", "mean", ".", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "(", "two", "-", "sided", ")", ":", "N", ".", "S", "=", "non", "-", "significant", ",", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A-B) Ctrl or YY1iKO ASCs were treated with CHX (Cycloheximide) for 90 mins and Hif1α protein was measured by flow cytometry. The numbers indicate the degradation rate after CHX treatment. N=3 mice. (C) The relative degradation rate was calculated by the ratio of degradation rate in YY1iKO (11.14% ± 1.71%) vs Ctrl (5.08% ± 0.796%). N=3 mice.(D) Lysates from C2C12 myoblasts (GM) were subjected to co-immunoprecipitation (Co-IP) assays with anti-YY1 or anti-IgG antibodies and blotted with anti-Hif1α or anti-YY1 antibodies.(E) The above lysates were also IPed with anti-Hif1α or anti-IgG antibodies and blotted with anti-YY1 or anti-Hif1α antibodies.(F) ASCs from YY1iKO mice were infected with pRlenti-Hif1α (P402A/P564A) (Hif1α-DM) viruses to overexpress a non-degradable Hif1α protein or GFP-expressing viruses. ASCs from Ctrl mice were also infected with the GFP viruses. 36 hrs after infection, the expression of target glycolytic genes was detected by RT-qPCR. Hsp90ab1 was used as the normalization control.(G) SCs were isolated from Ctrl or YY1iKO mice and infected with the above viruses. EdU labeling was then performed for 5.5 hrs. The percentage of MyoD+EdU+ cells over the total number of MyoD+ cells was quantified. Scale bar = 100 µm. N=3 mice.Heat maps indicating gene expression levels (Log2[FPKM]) of pentose cycle enzymes (H) in YY1iKO vs Ctrl.Heat maps indicating gene expression levels (Log2[FPKM]) of amino acid transporter (I) in YY1iKO vs Ctrl.(J) YY1(WT) or YY1(S365D) mutant was expressed in YY1iKO ASCs and EdU labeled for 6 hrs. (K) Similarly, YY1 (WT) or YY1 (1-394) mutant was expressed and EdU labeled for 6hrs. A GFP expressing plasmid was used the negative control. The percentage of Pax7+/EdU+ cells over the total number of Pax7+ cells was quantified. Error bars represent s.d.'s of the mean. Student's t-test (two-sided): N.S = non-significant, *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001."}
{"words": ["Figure", "2Human", "osteosarcoma", "U2OS", "cells", "were", "treated", "with", "dactinomycin", "(", "DACT", ")", "at", "0", ".", "5", "or", "1", "µM", ",", "or", "with", "mitoxantrone", "(", "MTX", ")", "between", "1", "and", "6", "µM", "as", "positive", "control", "Human", "osteosarcoma", "U2OS", "stably", "expressing", "CALR", "-", "GFP", "and", "H2B", "-", "RFP", "were", "treated", "as", "described", "above", "and", "images", "were", "acquired", "once", "per", "hour", "for", "12", "h", "(", "A", ")", ".", "For", "one", "representative", "experiment", "among", "three", ",", "the", "mean", "±", "SEM", "of", "the", "average", "area", "of", "high", "CALR", "dots", "(", "normalized", "to", "the", "control", "at", "each", "timepoint", ")", "of", "quadruplicates", "is", "shown", "(", "B", ")", ".", "Values", "are", "depicted", "as", "the", "area", "under", "the", "curve", "±", "SD", "of", "triplicatesHuman", "osteosarcoma", "U2OS", "cells", "were", "treated", "with", "dactinomycin", "(", "DACT", ")", "at", "0", ".", "5", "or", "1", "µM", ",", "or", "with", "mitoxantrone", "(", "MTX", ")", "between", "1", "and", "6", "µM", "as", "positive", "control", "Treated", "U2OS", "cells", "stably", "expressing", "HMGB1", "-", "GFP", "and", "H2B", "-", "RFP", "images", "were", "acquired", "every", "hour", "for", "24", "h", "(", "D", ")", ".", "For", "one", "representative", "experiment", "among", "three", ",", "the", "mean", "±", "SEM", "of", "the", "green", "fluorescence", "intensity", "in", "the", "nucleus", "(", "normalized", "to", "the", "control", "at", "each", "timepoint", ")", "of", "quadruplicates", "is", "depicted", "(", "E", ")", ".", "For", "each", "cell", ",", "the", "speed", "of", "nuclear", "release", "(", "difference", "of", "HMGB1", "nuclear", "green", "fluorescence", "intensity", "between", "two", "time", "points", ")", "was", "calculated", ".", "Values", "are", "depicted", "as", "the", "average", "speed", "of", "the", "nuclear", "release", "±", "SD", "of", "quadruplicatesHuman", "osteosarcoma", "U2OS", "cells", "were", "treated", "with", "dactinomycin", "(", "DACT", ")", "at", "0", ".", "5", "or", "1", "µM", ",", "or", "with", "mitoxantrone", "(", "MTX", ")", "between", "1", "and", "6", "µM", "as", "positive", "control", "U2OS", "cells", "were", "treated", "for", "6", ",", "12", "or", "24", "h", "and", "ATP", "was", "stained", "with", "quinacrine", "(", "G", ")", ".", "The", "number", "of", "quinacrine", "negative", "cells", "was", "assessed", "based", "on", "the", "distribution", "of", "cellular", "green", "fluorescence", "intensity", "in", "MTX", "versus", "control", "conditions", ".", "For", "one", "representative", "experiment", "among", "three", "the", "mean", "±", "SD", "of", "quadruplicate", "assessments", "is", "shownHuman", "osteosarcoma", "U2OS", "cells", "were", "treated", "with", "dactinomycin", "(", "DACT", ")", "at", "0", ".", "5", "or", "1", "µM", ",", "or", "with", "mitoxantrone", "(", "MTX", ")", "between", "1", "and", "6", "µM", "as", "positive", "control", "U2OS", "wild", "-", "type", "cells", "were", "treated", "with", "MTX", "or", "DACT", "as", "described", "above", "for", "6", "h", ".", "Then", "medium", "was", "refreshed", "and", "24", "h", "later", ",", "type", "I", "interferon", "response", "was", "assessed", "by", "transferring", "the", "supernatant", "on", "HT29", "MX1", "-", "GFP", "reporter", "cells", "lines", "cells", "for", "additional", "48", "h", ".", "Human", "type", "1α", "interferon", "(", "IFNα1", ")", "was", "also", "added", "on", "the", "cells", "as", "an", "additional", "positive", "control", ".", "Images", "were", "acquired", "by", "fluorescence", "microscopy", "and", "the", "number", "of", "positive", "cells", "was", "assessed", "based", "on", "the", "distribution", "of", "cellular", "green", "fluorescence", "intensity", "in", "IFNα1", "versus", "control", "conditions", "(", "I", ")", ".", "The", "percentage", "of", "MX1", "positive", "cells", "was", "calculated", "and", "the", "mean", "±", "SEM", "of", "five", "independent", "experiments", "is", "depictedHuman", "osteosarcoma", "U2OS", "cells", "were", "treated", "with", "dactinomycin", "(", "DACT", ")", "at", "0", ".", "5", "or", "1", "µM", ",", "or", "with", "mitoxantrone", "(", "MTX", ")", "between", "1", "and", "6", "µM", "as", "positive", "control", "U2OS", "wild", "-", "type", "cells", "were", "treated", "as", "mentioned", "above", "for", "6", "h", "and", "then", "medium", "was", "refreshed", ".", "Twenty", "-", "four", "hours", "later", ",", "cells", "were", "collected", "and", "surface", "-", "exposed", "calreticulin", "(", "CALR", ")", "was", "stained", "with", "an", "antibody", "specific", "for", "CALR", ".", "DAPI", "was", "used", "as", "an", "exclusion", "dye", "and", "cells", "were", "acquired", "by", "flow", "cytometry", "(", "K", ")", ".", "The", "percentage", "of", "CALR", "+", "cells", "among", "viable", "(", "DAPI", "-", ")", "ones", "are", "depicted", ".", "The", "mean", "±", "SEM", "of", "six", "independent", "experiments", "is", "depictedHuman", "osteosarcoma", "U2OS", "cells", "were", "treated", "with", "dactinomycin", "(", "DACT", ")", "at", "0", ".", "5", "or", "1", "µM", ",", "or", "with", "mitoxantrone", "(", "MTX", ")", "between", "1", "and", "6", "µM", "as", "positive", "control", "U2OS", "cells", "were", "treated", "as", "described", "above", "for", "24", "h", "and", "the", "concentration", "of", "HMGB1", "released", "in", "the", "supernatant", "was", "quantified", "with", "an", "ELISA", "kit", ",", "then", "normalized", "to", "control", ".", "The", "mean", "±", "SEM", "of", "four", "independent", "experiments", "is", "shown", ".", "Human", "osteosarcoma", "U2OS", "cells", "were", "treated", "with", "dactinomycin", "(", "DACT", ")", "at", "0", ".", "5", "or", "1", "µM", ",", "or", "with", "mitoxantrone", "(", "MTX", ")", "between", "1", "and", "6", "µM", "as", "positive", "control", "U2OS", "were", "treated", "as", "described", "above", "for", "24", "h", ".", "Concentration", "of", "secreted", "ATP", "in", "the", "supernatant", "was", "quantified", "with", "a", "luciferase", "-", "based", "bioluminescence", "kit", ".", "The", "mean", "±", "SD", "of", "quadruplicates", "from", "one", "representative", "among", "three", "experiments", "is", "depicted", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2Human osteosarcoma U2OS cells were treated with dactinomycin (DACT) at 0.5 or 1 µM, or with mitoxantrone (MTX) between 1 and 6 µM as positive control Human osteosarcoma U2OS stably expressing CALR-GFP and H2B-RFP were treated as described above and images were acquired once per hour for 12 h (A). For one representative experiment among three, the mean ± SEM of the average area of high CALR dots (normalized to the control at each timepoint) of quadruplicates is shown (B). Values are depicted as the area under the curve ± SD of triplicatesHuman osteosarcoma U2OS cells were treated with dactinomycin (DACT) at 0.5 or 1 µM, or with mitoxantrone (MTX) between 1 and 6 µM as positive control Treated U2OS cells stably expressing HMGB1-GFP and H2B-RFP images were acquired every hour for 24 h (D). For one representative experiment among three, the mean ± SEM of the green fluorescence intensity in the nucleus (normalized to the control at each timepoint) of quadruplicates is depicted (E). For each cell, the speed of nuclear release (difference of HMGB1 nuclear green fluorescence intensity between two time points) was calculated. Values are depicted as the average speed of the nuclear release ± SD of quadruplicatesHuman osteosarcoma U2OS cells were treated with dactinomycin (DACT) at 0.5 or 1 µM, or with mitoxantrone (MTX) between 1 and 6 µM as positive control U2OS cells were treated for 6, 12 or 24 h and ATP was stained with quinacrine (G). The number of quinacrine negative cells was assessed based on the distribution of cellular green fluorescence intensity in MTX versus control conditions. For one representative experiment among three the mean ± SD of quadruplicate assessments is shownHuman osteosarcoma U2OS cells were treated with dactinomycin (DACT) at 0.5 or 1 µM, or with mitoxantrone (MTX) between 1 and 6 µM as positive control U2OS wild-type cells were treated with MTX or DACT as described above for 6 h. Then medium was refreshed and 24 h later, type I interferon response was assessed by transferring the supernatant on HT29 MX1-GFP reporter cells lines cells for additional 48 h. Human type 1α interferon (IFNα1) was also added on the cells as an additional positive control. Images were acquired by fluorescence microscopy and the number of positive cells was assessed based on the distribution of cellular green fluorescence intensity in IFNα1 versus control conditions (I). The percentage of MX1 positive cells was calculated and the mean ± SEM of five independent experiments is depictedHuman osteosarcoma U2OS cells were treated with dactinomycin (DACT) at 0.5 or 1 µM, or with mitoxantrone (MTX) between 1 and 6 µM as positive control U2OS wild-type cells were treated as mentioned above for 6 h and then medium was refreshed. Twenty-four hours later, cells were collected and surface-exposed calreticulin (CALR) was stained with an antibody specific for CALR. DAPI was used as an exclusion dye and cells were acquired by flow cytometry (K). The percentage of CALR+ cells among viable (DAPI-) ones are depicted. The mean ± SEM of six independent experiments is depictedHuman osteosarcoma U2OS cells were treated with dactinomycin (DACT) at 0.5 or 1 µM, or with mitoxantrone (MTX) between 1 and 6 µM as positive control U2OS cells were treated as described above for 24 h and the concentration of HMGB1 released in the supernatant was quantified with an ELISA kit, then normalized to control. The mean ± SEM of four independent experiments is shown.Human osteosarcoma U2OS cells were treated with dactinomycin (DACT) at 0.5 or 1 µM, or with mitoxantrone (MTX) between 1 and 6 µM as positive control U2OS were treated as described above for 24 h. Concentration of secreted ATP in the supernatant was quantified with a luciferase-based bioluminescence kit. The mean ± SD of quadruplicates from one representative among three experiments is depicted."}
{"words": ["Figure", "3Human", "osteosarcoma", "U2OS", "cells", "were", "treated", "with", "different", "concentrations", "of", "dactinomycin", "(", "DACT", ")", "(", "0", ".", "25", ",", "0", ".", "5", "or", "1", "µM", ")", "for", "6", "h", ".", "Thapsigargin", "(", "THAPS", ")", "at", "3", "µM", "was", "used", "as", "a", "positive", "control", ".", "After", "fixation", ",", "cells", "were", "stained", "with", "phospho", "-", "eIF2α", "(", "Ser51", ")", "specific", "antibody", "followed", "by", "an", "AlexaFluor", "-", "647", "secondary", "antibody", ",", "nuclei", "were", "counterstained", "with", "Hoechst", "33342", "and", "phosphorylation", "was", "assessed", "by", "fluorescence", "microscopy", ".", "Images", "were", "segmented", ",", "analyzed", "and", "the", "red", "cytoplasmic", "fluorescence", "intensity", "was", "measured", ".", "Images", "are", "shown", "for", "untreated", "control", "cells", "(", "Ctr", ")", ",", "THAPS", "and", "DACT", "at", "1", "µMU2OS", "cells", "stably", "expressing", "ATF4", "-", "reporter", "were", "treated", "as", "described", "above", "for", "12", "h", ".", "The", "expression", "and", "nuclear", "translocation", "of", "ATF4", "was", "assessed", "by", "fluorescence", "microscopy", "and", "the", "nuclear", "green", "fluorescence", "intensity", "was", "quantified", ".", "Images", "are", "shown", "for", "untreated", "control", "cells", "(", "Ctr", ")", ",", "THAPS", "and", "DACT", "at", "1", "µMU2OS", "stably", "expressing", "ATF6", "-", "GFP", "were", "treated", "as", "described", "above", "and", "nuclear", "translocation", "of", "ATF6", "was", "represented", "as", "the", "ratio", "of", "nuclear", "versus", "cytoplasmic", "green", "fluorescence", "intensity", ".", "Images", "are", "shown", "for", "untreated", "control", "cells", "(", "Ctr", ")", ",", "THAPS", "and", "DACT", "at", "1", "µMU2OS", "cells", "stably", "expressing", "venus", "in", "frame", "with", "alternatively", "spliced", "XBP1", "(", "sXBP1", ")", "were", "treated", "as", "described", "above", "for", "12", "h", ".", "De", "novo", "expressed", "venus", "was", "measured", "intracellular", ".", "Images", "are", "shown", "for", "untreated", "control", "cells", "(", "Ctr", ")", ",", "THAPS", "and", "DACT", "at", "1", "µMU2OS", "wild", "-", "type", "and", "knock", "out", "for", "eIF2α", "kinases", "1", ",", "2", ",", "3", "and", "4", "cells", "were", "treated", "with", "3", "µM", "THAPS", "as", "a", "positive", "control", "for", "EIF2AK3", "-", "mediated", "eIF2α", "phosphorylation", "or", "with", "1", "µM", "DACT", "for", "6", "h", ".", "After", "fixation", ",", "cells", "were", "stained", "for", "peIF2α", "as", "described", "above", "and", "cytoplasmic", "intensity", "was", "quantified", ".", "Images", "are", "shown", "for", "untreated", "control", "cells", "(", "Ctr", ")", ",", "THAPS", "and", "DACT", "at", "1", "µMU2OS", "CALR", "-", "RFP", "were", "injected", "subcutaneously", "(", "s", ".", "c", ")", "in", "the", "flank", "of", "nu", "/", "nu", "mice", ".", "Tumors", "were", "further", "injected", "with", "PBS", "(", "Ctr", ")", "(", "n", "=", "5", ")", ",", "0", ".", "5", "mg", "/", "kg", "tunicamycin", "(", "TM", ")", "for", "6", "h", "(", "n", "=", "3", ")", "or", "0", ".", "5", "mg", "/", "kg", "DACT", "for", "6", "h", "(", "n", "=", "4", ")", "or", "24", "h", "(", "n", "=", "3", ")", ".", "Tumor", "slices", "were", "cut", "and", "stained", "with", "a", "peIF2α", "antibody", "followed", "by", "an", "AlexaFluor", "-", "647", "secondary", "antibody", "and", "counterstained", "with", "Hoechst", "33342", ".", "Two", "slices", "per", "tumor", "were", "imaged", "for", "their", "DAPI", ",", "RFP", "and", "Cy5", "signals", ".", "Out", "-", "of", "-", "focused", "images", "were", "removed", "from", "the", "dataset", "leading", "to", "the", "analysis", "of", "the", "following", "conditions", ":", "8", "x", "Ctr", ",", "5", "x", "TM", ",", "8", "x", "DACT", "6", "h", "and", "6", "x", "for", "DACT", "24", "h", ".", "PeIF2α", "was", "quantified", "measuring", "Cy5", "intensity", "in", "the", "cytoplasm", "(", "K", ",", "L", ")", "and", "CALR", "translocation", "by", "measuring", "the", "coefficient", "variation", "(", "CV", ")", "of", "the", "RFP", "signal", "in", "the", "cytoplasm", "(", "M", ",", "N", ")", ".", "Representative", "images", "of", "peIF2α", "are", "shown", "for", "Ctr", ",", "TM", "and", "DACT", "at", "6", "h", "(", "K", ")", ",", "whereas", "images", "of", "CALR", "are", "shown", "for", "Ctr", "and", "DACT", "at", "24"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Human osteosarcoma U2OS cells were treated with different concentrations of dactinomycin (DACT) (0.25, 0.5 or 1 µM) for 6 h. Thapsigargin (THAPS) at 3 µM was used as a positive control. After fixation, cells were stained with phospho-eIF2α (Ser51) specific antibody followed by an AlexaFluor-647 secondary antibody, nuclei were counterstained with Hoechst 33342 and phosphorylation was assessed by fluorescence microscopy. Images were segmented, analyzed and the red cytoplasmic fluorescence intensity was measured. Images are shown for untreated control cells (Ctr), THAPS and DACT at 1 µMU2OS cells stably expressing ATF4-reporter were treated as described above for 12 h. The expression and nuclear translocation of ATF4 was assessed by fluorescence microscopy and the nuclear green fluorescence intensity was quantified. Images are shown for untreated control cells (Ctr), THAPS and DACT at 1 µMU2OS stably expressing ATF6-GFP were treated as described above and nuclear translocation of ATF6 was represented as the ratio of nuclear versus cytoplasmic green fluorescence intensity. Images are shown for untreated control cells (Ctr), THAPS and DACT at 1 µMU2OS cells stably expressing venus in frame with alternatively spliced XBP1 (sXBP1) were treated as described above for 12 h. De novo expressed venus was measured intracellular. Images are shown for untreated control cells (Ctr), THAPS and DACT at 1 µMU2OS wild-type and knock out for eIF2α kinases 1, 2, 3 and 4 cells were treated with 3 µM THAPS as a positive control for EIF2AK3-mediated eIF2α phosphorylation or with 1 µM DACT for 6 h. After fixation, cells were stained for peIF2α as described above and cytoplasmic intensity was quantified. Images are shown for untreated control cells (Ctr), THAPS and DACT at 1 µMU2OS CALR-RFP were injected subcutaneously (s.c) in the flank of nu/nu mice. Tumors were further injected with PBS (Ctr) (n=5), 0.5 mg/kg tunicamycin (TM) for 6 h (n=3) or 0.5 mg/kg DACT for 6 h (n=4) or 24 h (n=3). Tumor slices were cut and stained with a peIF2α antibody followed by an AlexaFluor-647 secondary antibody and counterstained with Hoechst 33342. Two slices per tumor were imaged for their DAPI, RFP and Cy5 signals. Out-of-focused images were removed from the dataset leading to the analysis of the following conditions: 8 x Ctr, 5 x TM, 8 x DACT 6 h and 6 x for DACT 24 h. PeIF2α was quantified measuring Cy5 intensity in the cytoplasm (K, L) and CALR translocation by measuring the coefficient variation (CV) of the RFP signal in the cytoplasm (M, N). Representative images of peIF2α are shown for Ctr, TM and DACT at 6 h (K), whereas images of CALR are shown for Ctr and DACT at 24 h"}
{"words": ["Figure", "4Mouse", "fibrosarcoma", "MCA205", "cells", "were", "stained", "with", "CellTracker", "Orange", "(", "CMTMR", ")", "and", "treated", "for", "24", "h", "with", "1", "µM", "dactinomycin", "(", "DACT", ")", "or", "500", "µM", "oxaliplatin", "(", "OXA", ")", "as", "a", "positive", "control", ".", "Then", ",", "untreated", "or", "dying", "MCA205", "were", "co", "-", "cultured", "with", "differentiated", "bone", "marrow", "-", "derived", "dendritic", "cells", "(", "BMDCs", ")", "for", "4", "h", "at", "37", "°", "C", "or", "at", "4", "°", "C", ".", "Cells", "were", "collected", "and", "dendritic", "cells", "were", "stained", "with", "CD11c", "specific", "antibody", "before", "analysis", "by", "flow", "cytometry", "The", "percentage", "of", "CMTMR", "and", "CD11c", "double", "positive", "cells", "among", "all", "CD11c", "+", "cells", "are", "indicatedMCA205", "cells", "were", "treated", "for", "24", "h", "with", "500", "µM", "oxaliplatin", "(", "OXA", ")", "or", "with", "0", ".", "25", ",", "0", ".", "5", "or", "1", "µM", "dactinomycin", "(", "DACT", ")", ".", "Then", ",", "untreated", "or", "dying", "MCA205", "were", "co", "-", "cultured", "with", "BMDCs", "for", "24", "h", "at", "37", "°", "C", ".", "As", "a", "positive", "control", ",", "BMDCs", "were", "co", "-", "cultured", "with", "1", "μg", "/", "mL", "LPS", "and", "100", "ng", "/", "mL", "IFNγ", ".", "The", "increase", "in", "the", "percentages", "of", "MHCII", "+", "and", "CD86", "+", "cells", "among", "CD11c", "+", "cells", "was", "quantified", "with", "respect", "to", "untreated", "controls", ".", "1", "x", "106", "mouse", "fibrosarcoma", "MCA205", "cells", "were", "treated", "in", "vitro", "with", "1", "µM", "dactinomycin", "(", "DACT", ")", ".", "Next", ",", "tumor", "size", "was", "measured", "regularly", "and", "individual", "tumor", "growths", "of", "DACT", "-", "vaccinated", "versus", "Ctr", "mice", "are", "depicted1", "x", "106", "mouse", "fibrosarcoma", "MCA205", "cells", "were", "treated", "in", "vitro", "with", "1", "µM", "dactinomycin", "(", "DACT", ")", ".", "Overall", "survival", "is", "depicted", "and", "p", "-", "values", "(", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ".", ")", "were", "calculated", "with", "a", "Log", "-", "Rank"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Mouse fibrosarcoma MCA205 cells were stained with CellTracker Orange (CMTMR) and treated for 24 h with 1 µM dactinomycin (DACT) or 500 µM oxaliplatin (OXA) as a positive control. Then, untreated or dying MCA205 were co-cultured with differentiated bone marrow-derived dendritic cells (BMDCs) for 4 h at 37 °C or at 4 °C. Cells were collected and dendritic cells were stained with CD11c specific antibody before analysis by flow cytometry The percentage of CMTMR and CD11c double positive cells among all CD11c+ cells are indicatedMCA205 cells were treated for 24 h with 500 µM oxaliplatin (OXA) or with 0.25, 0.5 or 1 µM dactinomycin (DACT). Then, untreated or dying MCA205 were co-cultured with BMDCs for 24 h at 37 °C. As a positive control, BMDCs were co-cultured with 1 μg/mL LPS and 100 ng/mL IFNγ. The increase in the percentages of MHCII+ and CD86+ cells among CD11c+ cells was quantified with respect to untreated controls.1 x 106 mouse fibrosarcoma MCA205 cells were treated in vitro with 1 µM dactinomycin (DACT). Next, tumor size was measured regularly and individual tumor growths of DACT-vaccinated versus Ctr mice are depicted1 x 106 mouse fibrosarcoma MCA205 cells were treated in vitro with 1 µM dactinomycin (DACT). Overall survival is depicted and p-values (*** p<0.001.) were calculated with a Log-Rank test"}
{"words": ["Figure", "53", "x", "105", "mouse", "fibrosarcoma", "WEHI", "164", "cells", "were", "injected", "subcutaneously", "(", "s", ".", "c", ")", "into", "the", "flank", "of", "immunocompetent", "syngeneic", "Balb", "/", "c", "mice", "When", "tumors", "became", "palpable", ",", "the", "mice", "were", "injected", "intraperitoneally", "(", "i", ".", "p", ".", ")", "with", "injectable", "solution", "(", "Ctr", ")", "or", "with", "0", ".", "5", "mg", "/", "kg", "dactinomycin", "(", "DACT", ")", ".", "A", "second", "injection", "of", "chemotherapy", "was", "performed", "four", "days", "later", ".", "Tumor", "size", "was", "assessed", "regularly", "and", "individual", "tumor", "growth", "curves", "of", "DACT", "versus", "Ctr3", "x", "105", "mouse", "fibrosarcoma", "WEHI", "164", "cells", "were", "injected", "subcutaneously", "(", "s", ".", "c", ")", "into", "the", "flank", "of", "immunocompetent", "syngeneic", "Balb", "/", "c", "mice", "When", "tumors", "became", "palpable", ",", "the", "mice", "were", "injected", "intraperitoneally", "(", "i", ".", "p", ".", ")", "with", "injectable", "solution", "(", "Ctr", ")", "or", "with", "0", ".", "5", "mg", "/", "kg", "dactinomycin", "(", "DACT", ")", ".", "A", "second", "injection", "of", "chemotherapy", "was", "performed", "four", "days", "later", ".", "DACT", "+", "anti", "-", "CD4", "/", "CD8", "versus", "anti", "-", "CD", "-", "4", "/", "anti", "-", "CD", "-", "8", "Mean", "tumor", "area", "for", "each", "group", "was", "calculated", "and", "significances", "were", "tested", "using", "a", "type", "II", "ANOVA", "test", "Overall", "survival", "is", "depicted", "and", "p", "-", "values", "were", "calculated", "with", "a", "Log", "-", "Rank", "test", "Stars", "indicate", "the", "p", "-", "values", "of", "each", "treatment", "versus", "Ctr", "and", "hashes", "indicate", "the", "p", "-", "values", "of", "the", "DACT", "+", "anti", "-", "CD", "-", "4", "/", "anti", "-", "CD", "-", "8", "versus", "DACT", "alone3", "x", "105", "mouse", "fibrosarcoma", "WEHI", "164", "cells", "were", "injected", "subcutaneously", "(", "s", ".", "c", ")", "into", "the", "flank", "of", "immunocompetent", "syngeneic", "Balb", "/", "c", "mice", "When", "tumors", "became", "palpable", ",", "the", "mice", "were", "injected", "intraperitoneally", "(", "i", ".", "p", ".", ")", "with", "injectable", "solution", "(", "Ctr", ")", "or", "with", "0", ".", "5", "mg", "/", "kg", "dactinomycin", "(", "DACT", ")", ".", "A", "second", "injection", "of", "chemotherapy", "was", "performed", "four", "days", "later", ".", "DACT", "+", "anti", "-", "PD", "-", "1", "versus", "anti", "-", "PD", "-", "1", "are", "depicted", ".", "Overall", "survival", "is", "depicted", "and", "p", "-", "values", "were", "calculated", "with", "a", "Log", "-", "Rank", "test", "Stars", "indicate", "the", "p", "-", "values", "of", "each", "treatment", "versus", "Ctr", "and", "of", "DACT", "+", "anti", "-", "PD", "-", "1", "versus", "anti", "-", "PD", "-", "1", "alone3", "x", "105", "mouse", "fibrosarcoma", "WEHI", "164", "cells", "were", "injected", "subcutaneously", "(", "s", ".", "c", ")", "into", "the", "flank", "of", "immunocompetent", "syngeneic", "Balb", "/", "c", "mice", "When", "tumors", "became", "palpable", ",", "the", "mice", "were", "injected", "intraperitoneally", "(", "i", ".", "p", ".", ")", "with", "injectable", "solution", "(", "Ctr", ")", "or", "with", "0", ".", "5", "mg", "/", "kg", "dactinomycin", "(", "DACT", ")", ".", "A", "second", "injection", "of", "chemotherapy", "was", "performed", "four", "days", "later", ".", "Five", "naïve", "mice", "or", "the", "eleven", "mice", "that", "were", "cured", "by", "treatment", "with", "DACT", "alone", "or", "in", "combination", "with", "PD", "-", "1", "blockade", "were", "(", "re", ")", "challenged", "with", "WEHI", "164", "cells", ",", "and", "individual", "tumor", "growths", "(", "I", ",", "J", ")", ",", "as", "well", "as", "overall", "survival", "(", "*", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "001", ",", "Log", "-", "Rank", "test", ")", "(", "K", ")", ",", "were", "monitored", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 53 x 105 mouse fibrosarcoma WEHI 164 cells were injected subcutaneously (s.c) into the flank of immunocompetent syngeneic Balb/c mice When tumors became palpable, the mice were injected intraperitoneally (i.p.) with injectable solution (Ctr) or with 0.5 mg/kg dactinomycin (DACT). A second injection of chemotherapy was performed four days later. Tumor size was assessed regularly and individual tumor growth curves of DACT versus Ctr3 x 105 mouse fibrosarcoma WEHI 164 cells were injected subcutaneously (s.c) into the flank of immunocompetent syngeneic Balb/c mice When tumors became palpable, the mice were injected intraperitoneally (i.p.) with injectable solution (Ctr) or with 0.5 mg/kg dactinomycin (DACT). A second injection of chemotherapy was performed four days later. DACT + anti-CD4/CD8 versus anti-CD-4/anti-CD-8 Mean tumor area for each group was calculated and significances were tested using a type II ANOVA test Overall survival is depicted and p-values were calculated with a Log-Rank test Stars indicate the p-values of each treatment versus Ctr and hashes indicate the p-values of the DACT + anti-CD-4/anti-CD-8 versus DACT alone3 x 105 mouse fibrosarcoma WEHI 164 cells were injected subcutaneously (s.c) into the flank of immunocompetent syngeneic Balb/c mice When tumors became palpable, the mice were injected intraperitoneally (i.p.) with injectable solution (Ctr) or with 0.5 mg/kg dactinomycin (DACT). A second injection of chemotherapy was performed four days later. DACT + anti-PD-1 versus anti-PD-1 are depicted. Overall survival is depicted and p-values were calculated with a Log-Rank test Stars indicate the p-values of each treatment versus Ctr and of DACT + anti-PD-1 versus anti-PD-1 alone3 x 105 mouse fibrosarcoma WEHI 164 cells were injected subcutaneously (s.c) into the flank of immunocompetent syngeneic Balb/c mice When tumors became palpable, the mice were injected intraperitoneally (i.p.) with injectable solution (Ctr) or with 0.5 mg/kg dactinomycin (DACT). A second injection of chemotherapy was performed four days later. Five naïve mice or the eleven mice that were cured by treatment with DACT alone or in combination with PD-1 blockade were (re)challenged with WEHI 164 cells, and individual tumor growths (I, J), as well as overall survival (*** p<0.001, Log-Rank test) (K), were monitored."}
{"words": ["Figure", "6Mice", "bearing", "WEHI", "164", "sarcomas", "were", "treated", "by", "systemic", "(", "intraperitoneal", ",", "i", ".", "p", ".", ")", "injections", "of", "DACT", "or", "PBS", "as", "a", "control", "(", "Ctr", ")", ",", "and", "tumor", "were", "excised", "9", "days", "later", "for", "the", "quantitation", "of", "mRNA", "coding", "for", "IFNγ", "Two", "independent", "experiments", "were", "conducted", "with", "a", "total", "of", "22", "mice", "in", "the", "Ctr", "group", "and", "23", "mice", "in", "the", "DACT", "-", "treated", "group", ",", "with", "each", "data", "point", "indicating", "one", "tumor", ".", "The", "cycle", "threshold", "of", "the", "qRT", "-", "PCR", "of", "IFNγ", "was", "normalized", "to", "the", "one", "of", "the", "housekeeping", "gene", "peptidylpropyl", "isomerase", "A", "(", "Ppia", ")", "in", "each", "mouse", "and", "results", "are", "shown", "normalized", "with", "respect", "to", "controls", "as", "a", "dot", "plot", "depicting", "mean", "±", "SD", ".", "The", "p", "-", "value", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", "was", "calculated", "by", "means", "of", "a", "Student", "'", "s", "t", "test", "(", "B", ")", ".", "Balb", "/", "c", "mice", "with", "palpable", "WEHI", "164", "sarcomas", "(", "n", "=", "7", "mice", "in", "Ctr", "and", "anti", "-", "IFNγ", "groups", ";", "n", "=", "8", "mice", "in", "DACT", "and", "DACT", "+", "anti", "-", "IFNγ", "groups", ")", "received", "two", "injections", "of", "DACT", "-", "based", "chemotherapy", "(", "0", ".", "5", "mg", "/", "kg", ")", "as", "well", "as", "multiple", "injections", "(", "3", "times", "per", "week", ")", "of", "neutralizing", "IFNγ", "-", "specific", "antibody", "(", "C", ")", ".", "Tumor", "growth", "curves", "are", "shown", "for", "individual", "mice", "(", "D", ")", "and", "as", "means", "(", "E", ")", ".", "Statistical", "difference", "between", "DACT", "-", "treated", "tumors", "and", "respective", "controls", ",", "which", "was", "calculated", "with", "a", "type", "II", "ANOVA", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ",", "is", "lost", "upon", "IFNγ", "neutralization", "(", "E", ")", ".", "Overall", "survival", "of", "mice", "is", "also", "indicated", "with", "statistics", "to", "respective", "controls", "calculated", "with", "a", "Log", "-", "Rank", "test", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ")", "(", "F", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Mice bearing WEHI 164 sarcomas were treated by systemic (intraperitoneal, i.p.) injections of DACT or PBS as a control (Ctr), and tumor were excised 9 days later for the quantitation of mRNA coding for IFNγ Two independent experiments were conducted with a total of 22 mice in the Ctr group and 23 mice in the DACT-treated group, with each data point indicating one tumor. The cycle threshold of the qRT-PCR of IFNγ was normalized to the one of the housekeeping gene peptidylpropyl isomerase A (Ppia) in each mouse and results are shown normalized with respect to controls as a dot plot depicting mean ± SD . The p-value (* p<0.05) was calculated by means of a Student's t test (B).Balb/c mice with palpable WEHI 164 sarcomas (n=7 mice in Ctr and anti-IFNγ groups; n=8 mice in DACT and DACT+anti-IFNγ groups) received two injections of DACT-based chemotherapy (0.5 mg/kg) as well as multiple injections (3 times per week) of neutralizing IFNγ-specific antibody (C). Tumor growth curves are shown for individual mice (D) and as means (E). Statistical difference between DACT-treated tumors and respective controls, which was calculated with a type II ANOVA (* p<0.05), is lost upon IFNγ neutralization (E). Overall survival of mice is also indicated with statistics to respective controls calculated with a Log-Rank test (* p<0.05) (F)."}
{"words": ["Figure", "7Human", "osteosarcoma", "U2OS", "cells", "were", "pre", "-", "treated", "with", "dactinomycin", "(", "DACT", ")", ",", "bortezomib", "(", "BTZ", ")", ",", "daunorubicin", "(", "DAUN", ")", ",", "docetaxel", "(", "DOC", ")", ",", "doxorubicin", "(", "DOXO", ")", ",", "epirubicin", "(", "EPI", ")", ",", "mitoxantrone", "(", "MTX", ")", ",", "paclitaxel", "(", "PACL", ")", ",", "vinblastine", "(", "VB", ")", "and", "vincristine", "(", "VC", ")", "at", "0", ".", "5", ",", "1", "and", "5", "µM", ";", "with", "cisplatin", "(", "CDDP", ")", "at", "75", ",", "150", "and", "300", "µM", ",", "with", "oxaliplatin", "(", "OXA", ")", "at", "250", ",", "500", "and", "1000", "µM", "and", "with", "crizotinib", "(", "CRIZ", ")", "at", "10", ",", "20", "and", "40", "µM", "for", "1", ".", "5", "to", "2", ".", "5", "h", "and", "followed", "by", "an", "additional", "hour", "of", "treatment", "in", "the", "presence", "of", "100", "mM", "5", "-", "ethynyl", "uridine", "(", "EU", ")", ".", "After", "fixation", "cells", "were", "permeabilized", "and", "EU", "was", "stained", "with", "an", "AlexaFluor", "-", "488", "-", "coupled", "azide", ".", "Representative", "images", "are", "shown", "for", "each", "treatment", "(", "A", ")", ".", "The", "EU", "intensity", "in", "the", "nucleus", "of", "each", "condition", "was", "ranked", "between", "the", "untreated", "control", "(", "Ctr", ",", "0", "%", "transcription", "inhibition", ")", "and", "the", "control", "that", "was", "not", "incubated", "with", "EU", "(", "corresponding", "to", "100", "%", "transcription", "inhibition", ")", "(", "B", ")", ".", "Representative", "images", "of", "DACT", "1", "µM", ",", "BTZ", "1", "µM", ",", "CDDP", "150", "µM", ",", "CRIZ", "20", "µM", ",", "DAUN", "0", ".", "5", "µM", ",", "DOC", "1", "µM", ",", "DOXO", "1", "µM", ",", "EPI", "1", "µM", ",", "MTX", "1", "µM", ",", "OXA", "500", "µM", ",", "PACL", "1", "µM", ",", "VB", "1", "µM", ",", "VC", "1", "µM", "are", "shownHuman", "osteosarcoma", "U2OS", "cells", "were", "pre", "-", "treated", "with", "dactinomycin", "(", "DACT", ")", ",", "bortezomib", "(", "BTZ", ")", ",", "daunorubicin", "(", "DAUN", ")", ",", "docetaxel", "(", "DOC", ")", ",", "doxorubicin", "(", "DOXO", ")", ",", "epirubicin", "(", "EPI", ")", ",", "mitoxantrone", "(", "MTX", ")", ",", "paclitaxel", "(", "PACL", ")", ",", "vinblastine", "(", "VB", ")", "and", "vincristine", "(", "VC", ")", "at", "0", ".", "5", ",", "1", "and", "5", "µM", ";", "with", "cisplatin", "(", "CDDP", ")", "at", "75", ",", "150", "and", "300", "µM", ",", "with", "oxaliplatin", "(", "OXA", ")", "at", "250", ",", "500", "and", "1000", "µM", "and", "with", "crizotinib", "(", "CRIZ", ")", "at", "10", ",", "20", "and", "40", "µM", "for", "1", ".", "5", "to", "2", ".", "5", "h", "Cells", "were", "treated", "for", "2", ".", "5", "h", "and", "before", "fixation", "and", "permeabilization", ".", "Then", ",", "cells", "were", "stained", "with", "a", "rabbit", "anti", "-", "fibrillarin", "antibody", "followed", "by", "a", "staining", "with", "an", "anti", "-", "rabbit", "AlexaFluor", "-", "647", "-", "or", "AlexaFluor", "-", "546", "-", "coupled", "secondary", "antibody", "as", "well", "as", "with", "a", "mouse", "anti", "-", "nucleolin", "antibody", "followed", "by", "a", "staining", "with", "an", "anti", "-", "mouse", "AlexaFluor", "-", "488", "-", "coupled", "secondary", "antibody", ".", "Then", "images", "were", "acquired", "and", "colocalization", "between", "both", "signals", "was", "assessed", "(", "C", ")", ".", "The", "surface", "overlap", "coefficient", "(", "SOC", ")", "was", "calculated", "and", "ranked", "between", "the", "untreated", "control", "(", "Ctr", ")", "and", "the", "positive", "control", "(", "DACT", ")", "Representative", "images", "of", "DACT", "1", "µM", ",", "BTZ", "1", "µM", ",", "CDDP", "150", "µM", ",", "CRIZ", "20", "µM", ",", "DAUN", "0", ".", "5", "µM", ",", "DOC", "1", "µM", ",", "DOXO", "1", "µM", ",", "EPI", "1", "µM", ",", "MTX", "1", "µM", ",", "OXA", "500", "µM", ",", "PACL", "1", "µM", ",", "VB", "1", "µM", ",", "VC", "1", "µM", "are", "shownHuman", "osteosarcoma", "U2OS", "cells", "were", "pre", "-", "treated", "with", "dactinomycin", "(", "DACT", ")", ",", "bortezomib", "(", "BTZ", ")", ",", "daunorubicin", "(", "DAUN", ")", ",", "docetaxel", "(", "DOC", ")", ",", "doxorubicin", "(", "DOXO", ")", ",", "epirubicin", "(", "EPI", ")", ",", "mitoxantrone", "(", "MTX", ")", ",", "paclitaxel", "(", "PACL", ")", ",", "vinblastine", "(", "VB", ")", "and", "vincristine", "(", "VC", ")", "at", "0", ".", "5", ",", "1", "and", "5", "µM", ";", "with", "cisplatin", "(", "CDDP", ")", "at", "75", ",", "150", "and", "300", "µM", ",", "with", "oxaliplatin", "(", "OXA", ")", "at", "250", ",", "500", "and", "1000", "µM", "and", "with", "crizotinib", "(", "CRIZ", ")", "at", "10", ",", "20", "and", "40", "µM", "for", "1", ".", "5", "to", "2", ".", "5", "h", "Cells", "were", "pre", "-", "treated", "overnight", "with", "the", "aforementioned", "compounds", "in", "complete", "medium", "followed", "by", "washout", "and", "treatment", "pursued", "in", "methionine", "-", "free", "medium", "for", "30", "min", ".", "Afterwards", ",", "the", "treatments", "were", "continued", "in", "methionine", "-", "free", "medium", "supplemented", "with", "25", "µM", "L", "-", "azidohomoalanine", "(", "AHA", ")", "for", "additional", "1", ".", "5", "h", ".", "AHA", "incorporation", "was", "detected", "after", "fixation", ",", "permeabilization", "and", "blocking", "by", "the", "addition", "of", "an", "AlexaFluor", "-", "488", "-", "coupled", "azide", ".", "Then", "images", "were", "acquired", "(", "E", ")", "and", "AHA", "intensity", "in", "the", "cells", "was", "ranked", "between", "the", "untreated", "control", "(", "Ctr", ",", "0", "%", "translation", "inhibition", ")", "and", "the", "untreated", "control", "without", "AHA", "(", "corresponding", "to", "100", "%", "translation", "inhibition", ")", "(", "F", ")", ".", "Representative", "images", "of", "DACT", "1", "µM", ",", "BTZ", "1", "µM", ",", "CDDP", "150", "µM", ",", "CRIZ", "20", "µM", ",", "DAUN", "0", ".", "5", "µM", ",", "DOC", "1", "µM", ",", "DOXO", "1", "µM", ",", "EPI", "1", "µM", ",", "MTX", "1", "µM", ",", "OXA", "500", "µM", ",", "PACL", "1", "µM", ",", "VB", "1", "µM", ",", "VC", "1", "µM", "are", "shownCorrelation", "between", "the", "transcription", "measured", "by", "EU", "incorporation", "and", "measured", "by", "fibrillarin", "and", "nucleolin", "colocalization", "is", "depicted", "with", "Pearson", "correlation", "coefficient", "(", "R", ")", "and", "p", "-", "value", "(", "p", ")", "(", "G", ")", ".", "The", "same", "parameters", "are", "shown", "for", "the", "correlation", "between", "transcription", "measured", "by", "EU", "incorporation", "and", "translation", "measured", "with", "AHA"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Human osteosarcoma U2OS cells were pre-treated with dactinomycin (DACT), bortezomib (BTZ), daunorubicin (DAUN), docetaxel (DOC), doxorubicin (DOXO), epirubicin (EPI), mitoxantrone (MTX), paclitaxel (PACL), vinblastine (VB) and vincristine (VC) at 0.5, 1 and 5 µM ; with cisplatin (CDDP) at 75, 150 and 300 µM, with oxaliplatin (OXA) at 250, 500 and 1000 µM and with crizotinib (CRIZ) at 10, 20 and 40 µM for 1.5 to 2.5 h and followed by an additional hour of treatment in the presence of 100 mM 5-ethynyl uridine (EU). After fixation cells were permeabilized and EU was stained with an AlexaFluor-488-coupled azide. Representative images are shown for each treatment (A). The EU intensity in the nucleus of each condition was ranked between the untreated control (Ctr, 0 % transcription inhibition) and the control that was not incubated with EU (corresponding to 100 % transcription inhibition) (B). Representative images of DACT 1 µM, BTZ 1 µM, CDDP 150 µM, CRIZ 20 µM, DAUN 0.5 µM, DOC 1 µM, DOXO 1 µM, EPI 1 µM, MTX 1 µM, OXA 500 µM, PACL 1 µM, VB 1 µM, VC 1 µM are shownHuman osteosarcoma U2OS cells were pre-treated with dactinomycin (DACT), bortezomib (BTZ), daunorubicin (DAUN), docetaxel (DOC), doxorubicin (DOXO), epirubicin (EPI), mitoxantrone (MTX), paclitaxel (PACL), vinblastine (VB) and vincristine (VC) at 0.5, 1 and 5 µM ; with cisplatin (CDDP) at 75, 150 and 300 µM, with oxaliplatin (OXA) at 250, 500 and 1000 µM and with crizotinib (CRIZ) at 10, 20 and 40 µM for 1.5 to 2.5 h Cells were treated for 2.5 h and before fixation and permeabilization. Then, cells were stained with a rabbit anti-fibrillarin antibody followed by a staining with an anti-rabbit AlexaFluor-647- or AlexaFluor-546-coupled secondary antibody as well as with a mouse anti-nucleolin antibody followed by a staining with an anti-mouse AlexaFluor-488-coupled secondary antibody. Then images were acquired and colocalization between both signals was assessed (C). The surface overlap coefficient (SOC) was calculated and ranked between the untreated control (Ctr) and the positive control (DACT) Representative images of DACT 1 µM, BTZ 1 µM, CDDP 150 µM, CRIZ 20 µM, DAUN 0.5 µM, DOC 1 µM, DOXO 1 µM, EPI 1 µM, MTX 1 µM, OXA 500 µM, PACL 1 µM, VB 1 µM, VC 1 µM are shownHuman osteosarcoma U2OS cells were pre-treated with dactinomycin (DACT), bortezomib (BTZ), daunorubicin (DAUN), docetaxel (DOC), doxorubicin (DOXO), epirubicin (EPI), mitoxantrone (MTX), paclitaxel (PACL), vinblastine (VB) and vincristine (VC) at 0.5, 1 and 5 µM ; with cisplatin (CDDP) at 75, 150 and 300 µM, with oxaliplatin (OXA) at 250, 500 and 1000 µM and with crizotinib (CRIZ) at 10, 20 and 40 µM for 1.5 to 2.5 h Cells were pre-treated overnight with the aforementioned compounds in complete medium followed by washout and treatment pursued in methionine-free medium for 30 min. Afterwards, the treatments were continued in methionine-free medium supplemented with 25 µM L-azidohomoalanine (AHA) for additional 1.5 h. AHA incorporation was detected after fixation, permeabilization and blocking by the addition of an AlexaFluor-488-coupled azide. Then images were acquired (E) and AHA intensity in the cells was ranked between the untreated control (Ctr, 0 % translation inhibition) and the untreated control without AHA (corresponding to 100 % translation inhibition) (F). Representative images of DACT 1 µM, BTZ 1 µM, CDDP 150 µM, CRIZ 20 µM, DAUN 0.5 µM, DOC 1 µM, DOXO 1 µM, EPI 1 µM, MTX 1 µM, OXA 500 µM, PACL 1 µM, VB 1 µM, VC 1 µM are shownCorrelation between the transcription measured by EU incorporation and measured by fibrillarin and nucleolin colocalization is depicted with Pearson correlation coefficient (R) and p-value (p) (G). The same parameters are shown for the correlation between transcription measured by EU incorporation and translation measured with AHA incorporation"}
{"words": ["Figure", "8U2OS", "wild", "-", "type", "cells", "were", "treated", "with", "a", "custom", "made", "anti", "-", "cancer", "library", "previously", "described", "Bezu", "et", "al", ",", "2018", "(", ")", "at", "3", "μM", ",", "supplemented", "with", "500", "μM", "oxaliplatin", "(", "OXA", ")", ",", "150", "μM", "cisplatin", ",", "50", "μM", "resveratrol", "and", "50", "μM", "spermidine", ".", "For", "assessing", "transcription", ",", "cells", "were", "pre", "-", "treated", "for", "1", ".", "5", "h", "with", "the", "library", "followed", "by", "1", "h", "with", "the", "same", "drugs", "in", "which", "EU", "was", "added", ".", "The", "correlations", "between", "transcription", "inhibition", "and", "ICD", "prediction", "score", "Known", "immunogenic", "drugs", "are", "indicated", "with", "colors", ":", "dactinomycin", "(", "DACT", ")", ",", "mitoxantrone", "(", "MTX", ")", ",", "doxorubicin", "(", "DOXO", ")", ",", "daunorubicin", "(", "DAUN", ")", ",", "OXA", ",", "docetaxel", "(", "DOC", ")", ",", "paclitaxel", "(", "PACL", ")", ",", "vinblastine", "(", "VB", ")", ",", "vincristine", "(", "VC", ")", "and", "vinorelbine", "(", "VR", ")", "U2OS", "wild", "-", "type", "cells", "were", "treated", "with", "a", "custom", "made", "anti", "-", "cancer", "library", "previously", "described", "Bezu", "et", "al", ",", "2018", "(", ")", "at", "3", "μM", ",", "supplemented", "with", "500", "μM", "oxaliplatin", "(", "OXA", ")", ",", "150", "μM", "cisplatin", ",", "50", "μM", "resveratrol", "and", "50", "μM", "spermidine", ".", "For", "assessing", "transcription", ",", "cells", "were", "pre", "-", "treated", "for", "1", ".", "5", "h", "with", "the", "library", "followed", "by", "1", "h", "with", "the", "same", "drugs", "in", "which", "EU", "was", "added", ".", "The", "correlations", "between", "transcription", "inhibition", "and", "peIF2α", "expression", "Known", "immunogenic", "drugs", "are", "indicated", "with", "colors", ":", "dactinomycin", "(", "DACT", ")", ",", "mitoxantrone", "(", "MTX", ")", ",", "doxorubicin", "(", "DOXO", ")", ",", "daunorubicin", "(", "DAUN", ")", ",", "OXA", ",", "docetaxel", "(", "DOC", ")", ",", "paclitaxel", "(", "PACL", ")", ",", "vinblastine", "(", "VB", ")", ",", "vincristine", "(", "VC", ")", "and", "vinorelbine", "(", "VR", ")", "U2OS", "wild", "-", "type", "cells", "were", "treated", "with", "a", "custom", "made", "anti", "-", "cancer", "library", "previously", "described", "Bezu", "et", "al", ",", "2018", "(", ")", "at", "3", "μM", ",", "supplemented", "with", "500", "μM", "oxaliplatin", "(", "OXA", ")", ",", "150", "μM", "cisplatin", ",", "50", "μM", "resveratrol", "and", "50", "μM", "spermidine", ".", "For", "assessing", "transcription", ",", "cells", "were", "pre", "-", "treated", "for", "1", ".", "5", "h", "with", "the", "library", "followed", "by", "1", "h", "with", "the", "same", "drugs", "in", "which", "EU", "was", "added", ".", "The", "correlations", "between", "transcription", "inhibition", "and", "CALR", "exposure", "Known", "immunogenic", "drugs", "are", "indicated", "with", "colors", ":", "dactinomycin", "(", "DACT", ")", ",", "mitoxantrone", "(", "MTX", ")", ",", "doxorubicin", "(", "DOXO", ")", ",", "daunorubicin", "(", "DAUN", ")", ",", "OXA", ",", "docetaxel", "(", "DOC", ")", ",", "paclitaxel", "(", "PACL", ")", ",", "vinblastine", "(", "VB", ")", ",", "vincristine", "(", "VC", ")", "and", "vinorelbine", "(", "VR", ")", "U2OS", "wild", "-", "type", "cells", "were", "treated", "with", "a", "custom", "made", "anti", "-", "cancer", "library", "previously", "described", "Bezu", "et", "al", ",", "2018", "(", ")", "at", "3", "μM", ",", "supplemented", "with", "500", "μM", "oxaliplatin", "(", "OXA", ")", ",", "150", "μM", "cisplatin", ",", "50", "μM", "resveratrol", "and", "50", "μM", "spermidine", ".", "For", "assessing", "transcription", ",", "cells", "were", "pre", "-", "treated", "for", "1", ".", "5", "h", "with", "the", "library", "followed", "by", "1", "h", "with", "the", "same", "drugs", "in", "which", "EU", "was", "added", ".", "The", "correlations", "between", "transcription", "inhibition", "and", "ATP", "decrease", "Known", "immunogenic", "drugs", "are", "indicated", "with", "colors", ":", "dactinomycin", "(", "DACT", ")", ",", "mitoxantrone", "(", "MTX", ")", ",", "doxorubicin", "(", "DOXO", ")", ",", "daunorubicin", "(", "DAUN", ")", ",", "OXA", ",", "docetaxel", "(", "DOC", ")", ",", "paclitaxel", "(", "PACL", ")", ",", "vinblastine", "(", "VB", ")", ",", "vincristine", "(", "VC", ")", "and", "vinorelbine", "(", "VR", ")", "U2OS", "wild", "-", "type", "cells", "were", "treated", "with", "a", "custom", "made", "anti", "-", "cancer", "library", "previously", "described", "Bezu", "et", "al", ",", "2018", "(", ")", "at", "3", "μM", ",", "supplemented", "with", "500", "μM", "oxaliplatin", "(", "OXA", ")", ",", "150", "μM", "cisplatin", ",", "50", "μM", "resveratrol", "and", "50", "μM", "spermidine", ".", "For", "assessing", "transcription", ",", "cells", "were", "pre", "-", "treated", "for", "1", ".", "5", "h", "with", "the", "library", "followed", "by", "1", "h", "with", "the", "same", "drugs", "in", "which", "EU", "was", "added", ".", "The", "correlations", "between", "transcription", "inhibition", "and", "HMBG1", "exodus", "Known", "immunogenic", "drugs", "are", "indicated", "with", "colors", ":", "dactinomycin", "(", "DACT", ")", ",", "mitoxantrone", "(", "MTX", ")", ",", "doxorubicin", "(", "DOXO", ")", ",", "daunorubicin", "(", "DAUN", ")", ",", "OXA", ",", "docetaxel", "(", "DOC", ")", ",", "paclitaxel", "(", "PACL", ")", ",", "vinblastine", "(", "VB", ")", ",", "vincristine", "(", "VC", ")", "and", "vinorelbine", "(", "VR", ")", "U2OS", "wild", "-", "type", "cells", "were", "treated", "with", "a", "custom", "made", "anti", "-", "cancer", "library", "previously", "described", "Bezu", "et", "al", ",", "2018", "(", ")", "at", "3", "μM", ",", "supplemented", "with", "500", "μM", "oxaliplatin", "(", "OXA", ")", ",", "150", "μM", "cisplatin", ",", "50", "μM", "resveratrol", "and", "50", "μM", "spermidine", ".", "For", "assessing", "transcription", ",", "cells", "were", "pre", "-", "treated", "for", "1", ".", "5", "h", "with", "the", "library", "followed", "by", "1", "h", "with", "the", "same", "drugs", "in", "which", "EU", "was", "added", ".", "The", "correlations", "between", "transcription", "inhibition", "and", "biological", "ICD", "score", "(", "F", ")", "previously", "measured", "and", "expressed", "as", "z", "-", "scores", "(", "except", "for", "ICD", "prediction", "score", ")", "Known", "immunogenic", "drugs", "are", "indicated", "with", "colors", ":", "dactinomycin", "(", "DACT", ")", ",", "mitoxantrone", "(", "MTX", ")", ",", "doxorubicin", "(", "DOXO", ")", ",", "daunorubicin", "(", "DAUN", ")", ",", "OXA", ",", "docetaxel", "(", "DOC", ")", ",", "paclitaxel", "(", "PACL", ")", ",", "vinblastine", "(", "VB", ")", ",", "vincristine", "(", "VC", ")", "and", "vinorelbine", "(", "VR", ")", "U2OS", "wild", "-", "type", "cells", "were", "treated", "with", "a", "custom", "made", "anti", "-", "cancer", "library", "previously", "described", "Bezu", "et", "al", ",", "2018", "(", ")", "at", "3", "μM", ",", "supplemented", "with", "500", "μM", "oxaliplatin", "(", "OXA", ")", ",", "150", "μM", "cisplatin", ",", "50", "μM", "resveratrol", "and", "50", "μM", "spermidine", ".", "For", "assessing", "transcription", ",", "cells", "were", "pre", "-", "treated", "for", "1", ".", "5", "h", "with", "the", "library", "followed", "by", "1", "h", "with", "the", "same", "drugs", "in", "which", "EU", "was", "added", ".", "For", "assessing", "translation", ",", "cells", "were", "pre", "-", "treated", "with", "the", "library", "for", "12", "h", "followed", "by", "30", "min", "in", "methionine", "free", "-", "medium", ",", "before", "addition", "of", "azidohomoalanine", "(", "AHA", ")", ".", "Percentage", "of", "inhibition", "was", "calculated", "and", "transformed", "as", "z", "-", "scores", ".", "The", "correlations", "between", "transcription", "and", "translation", "inhibitions", "Known", "immunogenic", "drugs", "are", "indicated", "with", "colors", ":", "dactinomycin", "(", "DACT", ")", ",", "mitoxantrone", "(", "MTX", ")", ",", "doxorubicin", "(", "DOXO", ")", ",", "daunorubicin", "(", "DAUN", ")", ",", "OXA", ",", "docetaxel", "(", "DOC", ")", ",", "paclitaxel", "(", "PACL", ")", ",", "vinblastine", "(", "VB", ")", ",", "vincristine", "(", "VC", ")", "and", "vinorelbine", "(", "VR", ")", "The", "inhibition", "of", "transcription", "was", "assessed", "for", "the", "negative", "and", "positive", "ICD", "hits", "identified", "with", "the", "predictive", "algorithm", "(", "Figure", "1", ")", ".", "U2OS", "cells", "were", "treated", "with", "the", "agents", "at", "concentrations", "corresponding", "to", "their", "IC60", ":", "1", "μM", "dactinomycin", "(", "DACT", ")", ",", "50", "μM", "topotecan", ",", "1", "μM", "becatecarin", ",", "0", ".", "5", "μM", "trabectedin", ",", "5", "μM", "UCN", "-", "01", ",", "30", "μM", "mycophenolate", "mofetil", ",", "30", "μM", "nonoxynol", "-", "9", ",", "25", "μM", "dactolisib", ",", "2", ".", "5", "μM", "β", "-", "lapachone", ",", "5", "μM", "5", "-", "fluorodeoxycytidine", "and", "2", "μM", "RH", "-", "1", "for", "1", ".", "5", "h", "followed", "by", "1", "h", "with", "EU", ".", "The", "percentage", "of", "transcription", "inhibition", "was", "calculated", "and", "the", "coefficient", "of", "correlation", "(", "R", ")", "and", "associated", "p", "-", "value", "(", "p", ")", "between", "the", "percentage", "of", "inhibition", "and", "the", "theoretical", "ICD", "score", "was", "calculated", "using", "the", "Pearson", "method", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8U2OS wild-type cells were treated with a custom made anti-cancer library previously described Bezu et al, 2018() at 3 μM, supplemented with 500 μM oxaliplatin (OXA), 150 μM cisplatin, 50 μM resveratrol and 50 μM spermidine. For assessing transcription, cells were pre-treated for 1.5 h with the library followed by 1 h with the same drugs in which EU was added. The correlations between transcription inhibition and ICD prediction score Known immunogenic drugs are indicated with colors: dactinomycin (DACT), mitoxantrone (MTX), doxorubicin (DOXO), daunorubicin (DAUN), OXA, docetaxel (DOC), paclitaxel (PACL), vinblastine (VB), vincristine (VC) and vinorelbine (VR)U2OS wild-type cells were treated with a custom made anti-cancer library previously described Bezu et al, 2018() at 3 μM, supplemented with 500 μM oxaliplatin (OXA), 150 μM cisplatin, 50 μM resveratrol and 50 μM spermidine. For assessing transcription, cells were pre-treated for 1.5 h with the library followed by 1 h with the same drugs in which EU was added. The correlations between transcription inhibition and peIF2α expression Known immunogenic drugs are indicated with colors: dactinomycin (DACT), mitoxantrone (MTX), doxorubicin (DOXO), daunorubicin (DAUN), OXA, docetaxel (DOC), paclitaxel (PACL), vinblastine (VB), vincristine (VC) and vinorelbine (VR)U2OS wild-type cells were treated with a custom made anti-cancer library previously described Bezu et al, 2018() at 3 μM, supplemented with 500 μM oxaliplatin (OXA), 150 μM cisplatin, 50 μM resveratrol and 50 μM spermidine. For assessing transcription, cells were pre-treated for 1.5 h with the library followed by 1 h with the same drugs in which EU was added. The correlations between transcription inhibition and CALR exposure Known immunogenic drugs are indicated with colors: dactinomycin (DACT), mitoxantrone (MTX), doxorubicin (DOXO), daunorubicin (DAUN), OXA, docetaxel (DOC), paclitaxel (PACL), vinblastine (VB), vincristine (VC) and vinorelbine (VR)U2OS wild-type cells were treated with a custom made anti-cancer library previously described Bezu et al, 2018() at 3 μM, supplemented with 500 μM oxaliplatin (OXA), 150 μM cisplatin, 50 μM resveratrol and 50 μM spermidine. For assessing transcription, cells were pre-treated for 1.5 h with the library followed by 1 h with the same drugs in which EU was added. The correlations between transcription inhibition and ATP decrease Known immunogenic drugs are indicated with colors: dactinomycin (DACT), mitoxantrone (MTX), doxorubicin (DOXO), daunorubicin (DAUN), OXA, docetaxel (DOC), paclitaxel (PACL), vinblastine (VB), vincristine (VC) and vinorelbine (VR)U2OS wild-type cells were treated with a custom made anti-cancer library previously described Bezu et al, 2018() at 3 μM, supplemented with 500 μM oxaliplatin (OXA), 150 μM cisplatin, 50 μM resveratrol and 50 μM spermidine. For assessing transcription, cells were pre-treated for 1.5 h with the library followed by 1 h with the same drugs in which EU was added. The correlations between transcription inhibition and HMBG1 exodus Known immunogenic drugs are indicated with colors: dactinomycin (DACT), mitoxantrone (MTX), doxorubicin (DOXO), daunorubicin (DAUN), OXA, docetaxel (DOC), paclitaxel (PACL), vinblastine (VB), vincristine (VC) and vinorelbine (VR)U2OS wild-type cells were treated with a custom made anti-cancer library previously described Bezu et al, 2018() at 3 μM, supplemented with 500 μM oxaliplatin (OXA), 150 μM cisplatin, 50 μM resveratrol and 50 μM spermidine. For assessing transcription, cells were pre-treated for 1.5 h with the library followed by 1 h with the same drugs in which EU was added. The correlations between transcription inhibition and biological ICD score (F) previously measured and expressed as z-scores (except for ICD prediction score)  Known immunogenic drugs are indicated with colors: dactinomycin (DACT), mitoxantrone (MTX), doxorubicin (DOXO), daunorubicin (DAUN), OXA, docetaxel (DOC), paclitaxel (PACL), vinblastine (VB), vincristine (VC) and vinorelbine (VR)U2OS wild-type cells were treated with a custom made anti-cancer library previously described Bezu et al, 2018() at 3 μM, supplemented with 500 μM oxaliplatin (OXA), 150 μM cisplatin, 50 μM resveratrol and 50 μM spermidine. For assessing transcription, cells were pre-treated for 1.5 h with the library followed by 1 h with the same drugs in which EU was added. For assessing translation, cells were pre-treated with the library for 12 h followed by 30 min in methionine free-medium, before addition of azidohomoalanine (AHA). Percentage of inhibition was calculated and transformed as z-scores. The correlations between transcription and translation inhibitions Known immunogenic drugs are indicated with colors: dactinomycin (DACT), mitoxantrone (MTX), doxorubicin (DOXO), daunorubicin (DAUN), OXA, docetaxel (DOC), paclitaxel (PACL), vinblastine (VB), vincristine (VC) and vinorelbine (VR)The inhibition of transcription was assessed for the negative and positive ICD hits identified with the predictive algorithm (Figure 1). U2OS cells were treated with the agents at concentrations corresponding to their IC60: 1 μM dactinomycin (DACT), 50 μM topotecan, 1 μM becatecarin, 0.5 μM trabectedin, 5 μM UCN-01, 30 μM mycophenolate mofetil, 30 μM nonoxynol-9, 25 μM dactolisib, 2.5 μM β-lapachone, 5 μM 5-fluorodeoxycytidine and 2 μM RH-1 for 1.5 h followed by 1 h with EU. The percentage of transcription inhibition was calculated and the coefficient of correlation (R) and associated p-value (p) between the percentage of inhibition and the theoretical ICD score was calculated using the Pearson method."}
{"words": ["Figure", "1Jurkat", "T", "cells", "were", "transfected", "with", "control", ",", "FIP3", ".", "1", "or", "FIP3", ".", "2", "siRNA", "oligonucleotides", ".", "A", ":", "Intracellular", "distribution", "of", "endogenous", "Rab11", "and", "Rac1", "was", "assessed", "by", "immunofluorescence", ".", "A", ",", "E", ",", "G", ":", "Three", "-", "dimensional", "(", "3D", ")", "confocal", "images", "were", "post", "-", "treated", "by", "deconvolution", ".", "A", "0", ".", "4", "-", "µ", "-", "thick", "medial", "stack", "is", "shown", ".", "The", "pericentrosomal", "vesicular", "compartment", "is", "zoomed", "at", "the", "bottom", "right", "-", "hand", "corner", ".", "B", ",", "F", ",", "H", ":", "Population", "analysis", "of", "the", "co", "-", "localization", "volume", "between", "Rab11", "and", "Rac1", "within", "the", "percentriolar", "vesicular", "compartment", ".", "Each", "dot", "represents", "one", "cell", ".", "Horizontal", "bars", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ",", "Mann", "-", "Whitney", "test", "was", "used", ".", "Images", "are", "representative", "of", "three", "experiments", ".", "Bar", ",", "5", "µmA", "-", "C", ":", "JurkatT", "cells", "were", "transfected", "with", "control", ",", "FIP3", ".", "1", "or", "FIP3", ".", "2", "siRNA", "oligonucleotides", ".", "A", ":", "Intracellular", "distribution", "of", "endogenous", "Rab11", "and", "Rac1", "was", "assessed", "by", "immunofluorescence", ".", "C", ":", "FIP3", "expression", "was", "analyzed", "by", "Western", "blot", ".", "Quantification", "of", "bands", "was", "performed", "with", "ImageJ", "and", "normalized", "to", "a", "non", "-", "specific", "band", "of", "35", "kDa", "used", "as", "loading", "control", ".", "E", ",", "F", ":", "Jurkat", "cells", "were", "transfected", "with", "expression", "vectors", "encoding", "GFP", ",", "GFP", "-", "FIP3", "-", "WT", "or", "GFP", "-", "FIP3", "-", "I738E", ".", "Endogenous", "Rac1", "was", "detected", "by", "immunofluorescence", ".", "G", ":", "Jurkat", "cells", "were", "transfected", "with", "expression", "vectors", "encoding", "GFP", ",", "Rab11WT", "-", "GFP", ",", "or", "Rab11Q70L", "-", "GFP", "(", "constitutively", "active", ")", "or", "Rab11S25N", "-", "GFP", "(", "dominant", "negative", ")", "mutants", ".", "Endogenous", "Rac1", "was", "detected", "by", "immunofluorescence", ".", "A", ",", "E", ",", "G", ":", "Three", "-", "dimensional", "(", "3D", ")", "confocal", "images", "were", "post", "-", "treated", "by", "deconvolution", ".", "A", "0", ".", "4", "-", "µ", "-", "thick", "medial", "stack", "is", "shown", ".", "The", "pericentrosomal", "vesicular", "compartment", "is", "zoomed", "at", "the", "bottom", "right", "-", "hand", "corner", ".", "B", ",", "F", ",", "H", ":", "Population", "analysis", "of", "the", "co", "-", "localization", "volume", "between", "Rab11", "and", "Rac1", "within", "the", "percentriolar", "vesicular", "compartment", ".", "Each", "dot", "represents", "one", "cell", ".", "Horizontal", "bars", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ",", "Mann", "-", "Whitney", "test", "was", "used", ".", "Images", "are", "representative", "of", "three", "experiments", ".", "Bar", ",", "5"], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1Jurkat T cells were transfected with control, FIP3.1 or FIP3.2 siRNA oligonucleotides. A: Intracellular distribution of endogenous Rab11 and Rac1 was assessed by immunofluorescence.A, E, G: Three-dimensional (3D) confocal images were post-treated by deconvolution. A 0.4-µ-thick medial stack is shown. The pericentrosomal vesicular compartment is zoomed at the bottom right-hand corner.B, F, H: Population analysis of the co-localization volume between Rab11 and Rac1 within the percentriolar vesicular compartment. Each dot represents one cell. Horizontal bars represent the mean ± SEM, Mann-Whitney test was used. Images are representative of three experiments. Bar, 5 µmA-C: JurkatT cells were transfected with control, FIP3.1 or FIP3.2 siRNA oligonucleotides. A: Intracellular distribution of endogenous Rab11 and Rac1 was assessed by immunofluorescence.C: FIP3 expression was analyzed by Western blot. Quantification of bands was performed with ImageJ and normalized to a non-specific band of 35 kDa used as loading control.E, F: Jurkat cells were transfected with expression vectors encoding GFP, GFP-FIP3-WT or GFP-FIP3-I738E. Endogenous Rac1 was detected by immunofluorescence.G: Jurkat cells were transfected with expression vectors encoding GFP, Rab11WT-GFP, or Rab11Q70L-GFP (constitutively active) or Rab11S25N-GFP (dominant negative) mutants. Endogenous Rac1 was detected by immunofluorescence.A, E, G: Three-dimensional (3D) confocal images were post-treated by deconvolution. A 0.4-µ-thick medial stack is shown. The pericentrosomal vesicular compartment is zoomed at the bottom right-hand corner.B, F, H: Population analysis of the co-localization volume between Rab11 and Rac1 within the percentriolar vesicular compartment. Each dot represents one cell. Horizontal bars represent the mean ± SEM, Mann-Whitney test was used. Images are representative of three experiments. Bar, 5 µm"}
{"words": ["Figure", "2A", ",", "B", ":", "Effect", "of", "FIP3", "silencing", "on", "Rac1", "expression", ".", "Jurkat", "cells", "were", "transfected", "with", "control", ",", "FIP3", ".", "1", "or", "FIP3", ".", "2", "siRNA", ".", "Three", "days", "later", "cells", "were", "lysed", "and", "the", "expression", "of", "FIP3", ",", "Rac1", "and", "β", "-", "tubulin", "analyzed", "by", "western", "blot", ".", "The", "intensity", "of", "bands", "corresponding", "to", "FIP3", "and", "to", "Rac1", "was", "quantified", "by", "ImageJ", "and", "normalized", "to", "the", "β", "-", "tubulin", "band", "used", "as", "loading", "control", ".", "The", "mean", "±", "SD", "of", "the", "percentage", "of", "band", "intensity", "in", "silenced", "cells", "with", "respect", "to", "controls", "of", "three", "independent", "experiments", "is", "shown", ".", "B", ":", "Rac1", "interaction", "with", "FIP3", ":", "HEK293T", "cells", "were", "transfected", "with", "GFP", ",", "GFP", "-", "FIP3", "WT", "or", "GFP", "-", "FIP3I738E", "expression", "vectors", ".", "24", "h", "later", ",", "cells", "were", "lysed", "and", "immunoprecipitated", "with", "anti", "-", "GFP", "Ab", ".", "Immunoprecipitates", "were", "analyzed", "by", "electrophoresis", "and", "western", "blot", "using", "anti", "-", "GFP", "Ab", "(", "top", "panel", ")", "or", "anti", "-", "Rac1", "Ab", "(", "bottom", "panel", ")", ".", "Total", "cell", "lysates", "were", "analyzed", "(", "100", ",", "000", "cells", ")", ".", "The", "position", "of", "Rac1", "(", "20", "kDa", ")", "and", "Ig", "light", "chain", "(", "25", "kDa", ")", "polypeptides", "is", "depicted", "on", "the", "right", "side", ".", "Arrowheads", "at", "the", "bottom", "point", "the", "bands", "corresponding", "to", "Rac", ".", "Quantification", "of", "bands", "was", "performed", "with", "ImageJ", "as", "the", "percentage", "of", "intensity", "with", "respect", "to", "the", "total", "lysate", "bands", "on", "the", "left", ",", "shown", "below", ".", "A", "representative", "experiment", "out", "of", "three", "carried", "out", "is", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A, B: Effect of FIP3 silencing on Rac1 expression. Jurkat cells were transfected with control, FIP3.1 or FIP3.2 siRNA. Three days later cells were lysed and the expression of FIP3, Rac1 and β-tubulin analyzed by western blot. The intensity of bands corresponding to FIP3 and to Rac1 was quantified by ImageJ and normalized to the β-tubulin band used as loading control. The mean ± SD of the percentage of band intensity in silenced cells with respect to controls of three independent experiments is shown.B: Rac1 interaction with FIP3: HEK293T cells were transfected with GFP, GFP-FIP3 WT or GFP-FIP3I738E expression vectors. 24 h later, cells were lysed and immunoprecipitated with anti-GFP Ab. Immunoprecipitates were analyzed by electrophoresis and western blot using anti-GFP Ab (top panel) or anti-Rac1 Ab (bottom panel). Total cell lysates were analyzed (100,000 cells). The position of Rac1 (20 kDa) and Ig light chain (25 kDa) polypeptides is depicted on the right side. Arrowheads at the bottom point the bands corresponding to Rac. Quantification of bands was performed with ImageJ as the percentage of intensity with respect to the total lysate bands on the left, shown below. A representative experiment out of three carried out is shown."}
{"words": ["Figure", "3JurkatT", "cells", "were", "transfected", "with", "expression", "vectors", "encoding", ":", "A", ",", "C", ":", "GFP", ",", "GFP", "-", "FIP3WT", ",", "or", "GFP", "-", "FIP3I738E", ".", "B", ",", "C", ":", "Rab11WT", "-", "GFP", ",", "Rab11Q70L", "-", "GFP", "(", "constitutively", "active", ")", ",", "or", "Rab11S25N", "-", "GFP", "(", "dominant", "negative", ")", ".", "C", ":", "Rab11WT", "-", "GFP", ",", "Rab11Q70L", "-", "GFP", "(", "constitutively", "active", ")", ",", "or", "Rab11S25N", "-", "GFP", "(", "dominant", "negative", ")", ".", "D", ",", "E", ":", "or", "transfected", "with", "control", ",", "or", "FIP3", ".", "1", "siRNA", ".", "Cells", "were", "allowed", "to", "form", "immunological", "synapses", "with", "SEE", "-", "pulsed", "Raji", "cells", "for", "30", "min", ".", "Intracellular", "distribution", "of", "endogenous", "Rac1", "and", "surface", "distribution", "of", "CD3", "were", "detected", "by", "immunofluorescence", ".", "3D", "confocalimages", "were", "post", "-", "treated", "by", "deconvolution", ".", "A", "0", ".", "4", "-", "µm", "-", "thick", "medial", "stack", "is", "shown", ".", "C", ",", "E", ":", "Population", "analyses", "of", "the", "amount", "of", "Rac1", "at", "the", "immunological", "synapse", "relative", "to", "the", "total", "cellular", "Rac1", ".", "Each", "dot", "corresponds", "to", "one", "cell", ".", "Horizontal", "bars", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "Images", "are", "representative", "of", "three", "experiments", ".", "Bar", ",", "5", "µm", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3JurkatT cells were transfected with expression vectors encoding: A, C: GFP, GFP-FIP3WT, or GFP-FIP3I738E. B, C: Rab11WT-GFP, Rab11Q70L-GFP (constitutively active), or Rab11S25N-GFP (dominant negative).C: Rab11WT-GFP, Rab11Q70L-GFP (constitutively active), or Rab11S25N-GFP (dominant negative).D, E: or transfected with control, or FIP3.1 siRNA. Cells were allowed to form immunological synapses with SEE-pulsed Raji cells for 30 min. Intracellular distribution of endogenous Rac1 and surface distribution of CD3 were detected by immunofluorescence. 3D confocalimages were post-treated by deconvolution. A 0.4-µm-thick medial stack is shown. C, E: Population analyses of the amount of Rac1 at the immunological synapse relative to the total cellular Rac1. Each dot corresponds to one cell. Horizontal bars represent the mean ± SEM. Mann-Whitney test. Images are representative of three experiments. Bar, 5 µm."}
{"words": ["Figure", "4JurkatT", "cells", "were", "transfected", "with", "either", "control", "or", "FIP3", ".", "1", "siRNA", ".", "A", ":", "Cells", "were", "allowed", "to", "form", "immunological", "synapses", "with", "SEE", "-", "pulsed", "Raji", "cells", "for", "30", "min", "and", "endogenous", "Lck", "was", "detected", "by", "immunofluorescence", ".", "3D", "confocalimages", "were", "post", "-", "treated", "by", "deconvolution", ".", "A", "0", ".", "4", "-", "µm", "-", "thick", "medial", "stack", "is", "shown", ".", "B", ",", "C", ":", "The", "minimal", "angle", "formed", "by", "the", "axis", "connecting", "the", "synapse", "edges", "and", "the", "axis", "connecting", "the", "mass", "centers", "of", "the", "T", "cell", "and", "the", "APC", "nuclei", "was", "measured", ",", "as", "schematized", "in", "B", ".", "D", ":", "Transfected", "Jurkat", "T", "cells", "were", "allowed", "to", "spread", "on", "anti", "-", "CD3", "-", "coated", "coverslips", "for", "the", "indicated", "time", ",", "and", "F", "-", "actin", "was", "detected", "with", "FITC", "-", "Phalloidin", ".", "A", "single", "optical", "section", "at", "the", "level", "of", "the", "contact", "surface", "is", "shown", ".", "E", ",", "F", ":", "Population", "analyses", "of", "the", "spreading", "area", "of", "cells", "at", "the", "level", "of", "the", "contact", "surface", ".", "Each", "dot", "corresponds", "to", "one", "cell", ".", "Horizontal", "bars", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "Images", "are", "representative", "of", "three", "experiments", ".", "Bar", ",", "5", "µm", ".", "G", ":", "FIP3", "expression", "was", "analyzed", "by", "Western", "blot", ".", "Quantification", "of", "bands", "was", "performed", "with", "ImageJ", "and", "normalized", "to", "a", "non", "-", "specific", "band", "of", "35", "kDa", "used", "as", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4JurkatT cells were transfected with either control or FIP3.1 siRNA. A: Cells were allowed to form immunological synapses with SEE-pulsed Raji cells for 30 min and endogenous Lck was detected by immunofluorescence. 3D confocalimages were post-treated by deconvolution. A 0.4-µm-thick medial stack is shown.B, C: The minimal angle formed by the axis connecting the synapse edges and the axis connecting the mass centers of the T cell and the APC nuclei was measured, as schematized in B.D: Transfected Jurkat T cells were allowed to spread on anti-CD3-coated coverslips for the indicated time, and F-actin was detected with FITC-Phalloidin. A single optical section at the level of the contact surface is shown. E, F: Population analyses of the spreading area of cells at the level of the contact surface. Each dot corresponds to one cell. Horizontal bars represent the mean ± SEM. Mann-Whitney test. Images are representative of three experiments. Bar, 5 µm.G: FIP3 expression was analyzed by Western blot. Quantification of bands was performed with ImageJ and normalized to a non-specific band of 35 kDa used as loading control."}
{"words": ["Figure", "5A", ",", "B", ",", "C", ":", "JurkatT", "cells", "transfected", "with", "siRNA", "control", ",", "FIP3", ".", "1", "or", "FIP3", ".", "2", "were", "allowed", "to", "spread", "on", "poly", "-", "lysine", "-", "coated", "coverslips", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Intracellular", "actin", "was", "detected", "with", "FITC", "-", "coupled", "Phalloidin", ".", "A", ":", "A", "single", "optical", "section", "at", "the", "level", "of", "the", "contact", "surface", "is", "shown", ".", "Bar", ",", "5", "µm", ".", "B", ":", "Population", "analyses", "of", "the", "spreading", "area", "of", "cells", "at", "the", "level", "of", "the", "contact", "surface", ".", "Each", "dot", "represents", "one", "cell", ".", "Horizontal", "bars", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "C", ":", "Time", "course", "representation", "of", "B", ",", "showing", "mean", "±", "SEM", ".", "D", "-", "F", ":", "Primary", "humanCD4T", "cells", "were", "transfected", "with", "control", "or", "FIP3", ".", "1", "siRNA", ".", "D", ",", "E", ":", "Cells", "were", "allowed", "to", "spread", "on", "poly", "-", "lysine", "-", "coated", "coverslips", "for", "5", "min", ".", "Intracellular", "Lck", "was", "detected", "by", "immunofluoresecence", ".", "D", ":", "A", "single", "optical", "section", "at", "the", "level", "of", "the", "contact", "surface", "is", "shown", ".", "Bar", ",", "10", "µm", ".", "E", ":", "Population", "analyses", "of", "the", "spreading", "area", "of", "cells", "at", "the", "level", "of", "the", "contact", "surface", ".", "F", ":", "Cells", "were", "stained", "with", "CMFDA", "dye", ",", "suspended", "in", "a", "paraformaldehyde", "solution", "and", "submitted", "to", "centrifugation", "at", "3", ",", "724", "xg", "onto", "poly", "-", "lysine", "-", "coated", "coverslips", ".", "Confocal", "optical", "sections", "separated", "by", "0", ".", "2", "µm", "were", "acquired", ".", "X", "-", "Z", "images", "were", "built", "with", "ImageJ", ".", "The", "maximal", "sections", "in", "'", "x", "'", "(", "width", ")", "and", "'", "z", "'", "(", "thickness", ")", "were", "determined", "for", "each", "cell", "(", "upper", "panel", ")", ".", "Plots", "represent", "the", "deformability", "index", "(", "x", "/", "z", ")", ".", "Each", "dot", "corresponds", "to", "one", "cell", ".", "Horizontal", "bars", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "Images", "are", "representative", "of", "three", "experiments", ".", "G", ":", "FIP3", "expression", "was", "analyzed", "by", "Western", "blot", ".", "Quantification", "of", "bands", "was", "performed", "with", "ImageJ", "and", "normalized", "to", "a", "non", "-", "specific", "band", "of", "35", "kDa", "used", "as", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5A, B, C: JurkatT cells transfected with siRNA control, FIP3.1 or FIP3.2 were allowed to spread on poly-lysine-coated coverslips for the indicated times. Intracellular actin was detected with FITC-coupled Phalloidin. A: A single optical section at the level of the contact surface is shown. Bar, 5 µm. B: Population analyses of the spreading area of cells at the level of the contact surface. Each dot represents one cell. Horizontal bars represent the mean ± SEM. C:Time course representation of B, showing mean ± SEM.D-F: Primary humanCD4T cells were transfected with control or FIP3.1 siRNA. D, E: Cells were allowed to spread on poly-lysine-coated coverslips for 5 min. Intracellular Lck was detected by immunofluoresecence. D: A single optical section at the level of the contact surface is shown. Bar, 10 µm. E: Population analyses of the spreading area of cells at the level of the contact surface.F: Cells were stained with CMFDA dye, suspended in a paraformaldehyde solution and submitted to centrifugation at 3,724 xg onto poly-lysine-coated coverslips. Confocal optical sections separated by 0.2 µm were acquired. X-Z images were built with ImageJ. The maximal sections in 'x' (width) and 'z' (thickness) were determined for each cell (upper panel). Plots represent the deformability index (x/z). Each dot corresponds to one cell. Horizontal bars represent the mean ± SEM. Mann-Whitney test. Images are representative of three experiments.G: FIP3 expression was analyzed by Western blot. Quantification of bands was performed with ImageJ and normalized to a non-specific band of 35 kDa used as loading control."}
{"words": ["Figure", "6Jurkat", "T", "cells", "were", "transfected", "with", "control", "or", "FIP3", ".", "1", "siRNA", ",", "then", "transfected", "again", "with", "empty", "vector", "or", "with", "expression", "vectors", "encoding", "Myc", "-", "tagged", "-", "Rac1WT", ",", "-", "Rac1G12V", "(", "constitutively", "active", "mutant", ")", ",", "or", "-", "Rac1Rac1T17N", "(", "dominant", "negative", "mutant", ")", ".", "Cells", "were", "allowed", "to", "spread", "on", "poly", "-", "lysine", "-", "coated", "coverslips", "for", "the", "indicated", "time", "and", "the", "spreading", "area", "of", "cells", "measured", ".", "A", "-", "C", ",", "H", ":", "Population", "analyses", "of", "the", "spreading", "area", "of", "cells", "at", "the", "level", "of", "the", "contact", "surface", ".", "A", "-", "C", ":", "Time", "course", "plots", "representing", "the", "mean", "±", "SEM", "of", "the", "data", "shown", "as", "in", "I", ".", "D", "-", "G", ":", "Staining", "for", "nucleus", "(", "blue", "=", "Dapi", ")", ",", "F", "-", "actin", "(", "green", "=", "phalloidin", ")", "and", "Rac1", "-", "Myc", "(", "red", "=", "anti", "-", "Myc", ")", "is", "shown", ".", "A", "single", "optical", "section", "at", "the", "level", "of", "the", "contact", "surface", "is", "shown", ".", "Bar", ",", "5", "µm", ".", "H", ":", "Dot", "plots", "corresponding", "to", "measurements", "at", "15", "min", "of", "spreading", ":", "Each", "dot", "represents", "one", "cell", ".", "Horizontal", "bars", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "Data", "are", "representative", "of", "three", "experiments", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Jurkat T cells were transfected with control or FIP3.1 siRNA, then transfected again with empty vector or with expression vectors encoding Myc-tagged-Rac1WT, -Rac1G12V (constitutively active mutant), or -Rac1Rac1T17N (dominant negative mutant). Cells were allowed to spread on poly-lysine-coated coverslips for the indicated time and the spreading area of cells measured. A-C, H: Population analyses of the spreading area of cells at the level of the contact surface. A-C: Time course plots representing the mean ± SEM of the data shown as in I. D-G: Staining for nucleus (blue = Dapi), F-actin (green = phalloidin) and Rac1-Myc (red = anti-Myc) is shown. A single optical section at the level of the contact surface is shown. Bar, 5 µm.H: Dot plots corresponding to measurements at 15 min of spreading: Each dot represents one cell. Horizontal bars represent the mean ± SEM. Mann-Whitney test. Data are representative of three experiments."}
{"words": ["Figure", "7A", ":", "Jurkat", "T", "cells", "transfected", "with", "control", "or", "FIP3", ".", "1", "were", "treated", "1", "h", "with", "the", "Rac1", "inhibitor", "NSC23766", "at", "100", "µM", "and", "allowed", "to", "spread", "on", "poly", "-", "lysine", "-", "coated", "coverslips", "for", "15", "min", ".", "F", "-", "actin", "was", "detected", "with", "FITC", "-", "Phalloidin", "and", "the", "spreading", "area", "of", "cells", "at", "the", "contact", "surface", "was", "measured", ".", "B", ":", "Transfected", "cells", "were", "allowed", "to", "form", "immunological", "synapses", "with", "SEE", "-", "pulsed", "Raji", "cells", "for", "30", "min", "and", "intracellular", "distribution", "of", "Lck", "was", "detected", "by", "immunofluorescence", ".", "Synapse", "angle", "was", "measured", "as", "in", "figure", "4", ".", "Each", "dot", "corresponds", "to", "one", "cell", ".", "Horizontal", "bars", "represent", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "Mann", "-", "Whitney", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7A: Jurkat T cells transfected with control or FIP3.1 were treated 1 h with the Rac1 inhibitor NSC23766 at 100 µM and allowed to spread on poly-lysine-coated coverslips for 15 min. F-actin was detected with FITC-Phalloidin and the spreading area of cells at the contact surface was measured.B: Transfected cells were allowed to form immunological synapses with SEE-pulsed Raji cells for 30 min and intracellular distribution of Lck was detected by immunofluorescence. Synapse angle was measured as in figure 4. Each dot corresponds to one cell. Horizontal bars represent the mean ± SEM. Mann-Whitney test."}
{"words": ["Figure", "8A", ":", "Jurkat", "T", "cells", "transfected", "with", "control", "or", "FIP3", ".", "1", "were", "activated", "on", "anti", "-", "CD3", "-", "coated", "plastic", "plates", "in", "the", "presence", "of", "soluble", "anti", "-", "CD28", "during", "16", "h", ".", "Concentration", "of", "IL2", "released", "in", "the", "supernatant", "was", "measured", "by", "ELISA", ".", "Histograms", "represent", "the", "mean", "±", "SD", "of", "three", "experiments", ".", "Mann", "-", "Whitney", "test", ".", "B", ":", "T", "cells", "were", "activated", "with", "soluble", "anti", "-", "CD3", "and", "Erk1", "/", "2", "phosphorylation", "was", "analyzed", "by", "Western", "blot", ".", "Graph", "represents", "the", "percentage", "of", "each", "band", "intensity", "with", "respect", "to", "that", "of", "cells", "transfected", "with", "control", "siRNA", "and", "left", "non", "-", "stimulated", "(", "t", "=", "0", ")", ".", "The", "intensity", "each", "band", "from", "Western", "blot", "was", "normalized", "with", "respect", "to", "the", "intensity", "of", "β", "-", "actin", "for", "each", "time", "point", ".", "Representative", "experiment", "out", "of", "three", "performed", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8A: Jurkat T cells transfected with control or FIP3.1 were activated on anti-CD3-coated plastic plates in the presence of soluble anti-CD28 during 16 h. Concentration of IL2 released in the supernatant was measured by ELISA. Histograms represent the mean ± SD of three experiments. Mann-Whitney test.B: T cells were activated with soluble anti-CD3 and Erk1/2 phosphorylation was analyzed by Western blot. Graph represents the percentage of each band intensity with respect to that of cells transfected with control siRNA and left non-stimulated (t=0). The intensity each band from Western blot was normalized with respect to the intensity of β-actin for each time point. Representative experiment out of three performed."}
{"words": ["Figure", "1A", ".", "Representative", "images", "of", "IHC", "staining", "of", "PCIF1", "in", "three", "CRC", "tissues", "and", "adjacent", "noncancerous", "tissues", ".", "Scale", "bar", ",", "50", "μm", "(", "left", ")", ".", "Analysis", "of", "the", "PCIF1", "protein", "expression", "in", "normal", "and", "CRC", "tissues", ".", "Each", "dot", "represents", "one", "sample", "(", "right", ")", ".", "Data", "are", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "B", ".", "Kaplan", "-", "Meier", "plots", "of", "overall", "survival", "of", "27", "CRC", "patients", "with", "low", "tumor", "PCIF1", "expression", "(", "0", "-", "4", ".", "5", "staining", "score", ",", "n", "=", "18", ")", "or", "high", "tumor", "PCIF1", "expression", "(", "4", ".", "6", "-", "9", ".", "0", "staining", "score", ",", "n", "=", "9", ")", ".", "Data", "are", "the", "mean", "±", "SEM", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "C", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "PCIF1", "in", "normal", "colon", "cells", "(", "CCD841CON", ")", "and", "various", "CRC", "cell", "lines", ".", "GAPDH", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "D", ".", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "PCIF1", "mRNA", "in", "the", "indicated", "cell", "lines", ".", "Levels", "were", "normalized", "to", "GAPDH", "expression", ".", "Data", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "E", ".", "Representative", "immunofluorescence", "images", "of", "HT29", "and", "HCT116", "cells", "stained", "for", "endogenous", "PCIF1", "protein", "(", "green", ")", ".", "Nuclei", "were", "stained", "with", "DAPI", "(", "blue", ")", ".", "Scale", "bar", ",", "30", "μm", ".", "F", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "PCIF1", "in", "whole", "extract", "(", "W", ")", ",", "cytosolic", "(", "C", ")", ",", "and", "nuclear", "(", "N", ")", "fractions", "of", "HCT116", "and", "HT29", "cells", ".", "Tubulin", "and", "lamin", "A", "/", "C", "served", "as", "cytosolic", "and", "nuclear", "markers", ",", "respectively", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1A. Representative images of IHC staining of PCIF1 in three CRC tissues and adjacent noncancerous tissues. Scale bar, 50 μm (left). Analysis of the PCIF1 protein expression in normal and CRC tissues. Each dot represents one sample (right). Data are the mean ± SEM. **P < 0.01, by Student's t-test.B. Kaplan-Meier plots of overall survival of 27 CRC patients with low tumor PCIF1 expression (0-4.5 staining score, n = 18) or high tumor PCIF1 expression (4.6-9.0 staining score, n = 9). Data are the mean ± SEM. ***P < 0.001 by Student's t-test.C. Western blot analysis of PCIF1 in normal colon cells (CCD841CON) and various CRC cell lines. GAPDH served as a loading control.D. qRT-PCR analysis of PCIF1 mRNA in the indicated cell lines. Levels were normalized to GAPDH expression. Data are the mean ± SD of n=3 biological replicates. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 by Student's t-test.E. Representative immunofluorescence images of HT29 and HCT116 cells stained for endogenous PCIF1 protein (green). Nuclei were stained with DAPI (blue). Scale bar, 30 μm.F. Western blot analysis of PCIF1 in whole extract (W), cytosolic (C), and nuclear (N) fractions of HCT116 and HT29 cells. Tubulin and lamin A/C served as cytosolic and nuclear markers, respectively."}
{"words": ["Figure", "2A", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "PCIF1", "in", "HT29", "and", "HCT116", "cells", "depleted", "of", "PCIF1", "using", "four", "different", "sgRNAs", ".", "GAPDH", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "Matrigel", "invasion", "assay", "(", "B", ")", ",", "of", "the", "indicated", "control", "and", "PCIF1", "-", "depleted", "CRC", "cell", "lines", ".", "Representative", "images", "and", "quantification", "of", "cells", "are", "shown", "at", "the", "left", "and", "right", ",", "respectively", ",", "of", "each", "panel", ".", "Data", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "n", "=", "3", "replicates", "/", "condition", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "fibronectin", "adhesion", "assay", "(", "C", ")", ",", "of", "the", "indicated", "control", "and", "PCIF1", "-", "depleted", "CRC", "cell", "lines", ".", "Representative", "images", "and", "quantification", "of", "cells", "are", "shown", "at", "the", "left", "and", "right", ",", "respectively", ",", "of", "each", "panel", ".", "Data", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "n", "=", "3", "replicates", "/", "condition", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "colony", "formation", "assay", "(", "D", ")", "of", "the", "indicated", "control", "and", "PCIF1", "-", "depleted", "CRC", "cell", "lines", ".", "Representative", "images", "and", "quantification", "of", "cells", "are", "shown", "at", "the", "left", "and", "right", ",", "respectively", ",", "of", "each", "panel", ".", "Data", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "n", "=", "3", "replicates", "/", "condition", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "wound", "healing", "migration", "assay", "(", "E", ")", "of", "the", "indicated", "control", "and", "PCIF1", "-", "depleted", "CRC", "cell", "lines", ".", "Representative", "images", "and", "quantification", "of", "cells", "are", "shown", "at", "the", "left", "and", "right", ",", "respectively", ",", "of", "each", "panel", ".", "Data", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "n", "=", "3", "replicates", "/", "condition", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "F", ".", "Growth", "of", "the", "indicated", "HCT116", "tumors", "after", "subcutaneous", "injection", "into", "athymic", "nude", "mice", ".", "Tumor", "volume", "was", "recorded", "on", "the", "indicated", "days", ".", "Data", "are", "the", "mean", "±", "SEM", "of", "the", "number", "of", "mice", "/", "group", "indicated", "on", "each", "panel", ".", "n", ",", "the", "numbers", "of", "mice", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "G", ".", "Survival", "analysis", "of", "mice", "injected", "bearing", "the", "indicated", "HCT116", "tumors", ".", "Data", "are", "the", "mean", "±", "SEM", "of", "the", "number", "of", "mice", "/", "group", "indicated", "on", "each", "panel", ".", "n", ",", "the", "numbers", "of", "mice", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2A. Western blot analysis of PCIF1 in HT29 and HCT116 cells depleted of PCIF1 using four different sgRNAs. GAPDH served as a loading control.Matrigel invasion assay (B), of the indicated control and PCIF1-depleted CRC cell lines. Representative images and quantification of cells are shown at the left and right, respectively, of each panel. Data are the mean ± SD of n=3 replicates/condition. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 by Student's t-test.fibronectin adhesion assay (C), of the indicated control and PCIF1-depleted CRC cell lines. Representative images and quantification of cells are shown at the left and right, respectively, of each panel. Data are the mean ± SD of n=3 replicates/condition. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 by Student's t-test.colony formation assay (D) of the indicated control and PCIF1-depleted CRC cell lines. Representative images and quantification of cells are shown at the left and right, respectively, of each panel. Data are the mean ± SD of n=3 replicates/condition. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 by Student's t-test.wound healing migration assay (E) of the indicated control and PCIF1-depleted CRC cell lines. Representative images and quantification of cells are shown at the left and right, respectively, of each panel. Data are the mean ± SD of n=3 replicates/condition. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 by Student's t-test.F. Growth of the indicated HCT116 tumors after subcutaneous injection into athymic nude mice. Tumor volume was recorded on the indicated days. Data are the mean ± SEM of the number of mice/group indicated on each panel. n, the numbers of mice. *P < 0.05, **P < 0.01 by Student's t-test.G. Survival analysis of mice injected bearing the indicated HCT116 tumors. Data are the mean ± SEM of the number of mice/group indicated on each panel. n, the numbers of mice. **P < 0.01, ***P < 0.001 by Student's t-test."}
{"words": ["Figure", "3A", ".", "LC", "-", "MS", "/", "MS", "identification", "and", "quantification", "of", "m6Am", "or", "m6A", "levels", "in", "mRNA", "from", "control", "and", "PCIF1", "-", "depleted", "HCT116", "cells", ".", "Data", "are", "presented", "as", "the", "enrichment", "of", "methylated", "vs", "unmethylated", "mRNA", ".", "Data", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "B", ".", "Metagene", "plots", "analysis", "of", "m6Am", "enrichment", "around", "the", "transcription", "start", "site", "(", "TSS", ")", "of", "all", "expressed", "genes", "in", "control", "and", "PCIF1", "-", "depleted", "HCT116", "cells", ".", "E", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "FOS", "and", "PCIF1", "in", "control", "and", "PCIF1", "-", "depleted", "HCT116", "and", "HT29", "cells", ".", "GAPDH", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "F", ".", "Genome", "browser", "views", "of", "FOS", "with", "m6Am", "sites", ".", "Read", "coverage", "of", "input", "sample", "and", "IP", "sample", "are", "shown", "in", "blue", "and", "red", ",", "respectively", ",", "and", "green", "rectangle", "indicates", "the", "m6Am", "peaks", "located", "near", "the", "TSS", ".", "G", ".", "m6Am", "-", "exo", "-", "qPCR", "analysis", "of", "m6Am", "enrichment", "in", "FOS", "mRNAs", "from", "the", "indicated", "HCT116", "cells", ".", "GAPDH", "served", "as", "a", "negative", "control", ".", "Data", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "H", ".", "qRT", "-", "PCR", "analysis", "of", "FOS", "mRNA", "stability", "in", "control", "and", "PCIF1", "-", "depleted", "HCT116", "and", "HT29", "cells", "treated", "with", "actinomycin", "D", "for", "the", "indicated", "times", ".", "Data", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "I", ".", "Growth", "of", "tumors", "after", "subcutaneous", "injection", "of", "the", "indicated", "HCT116", "cells", "into", "athymic", "nude", "mice", ".", "Tumor", "volumes", "were", "recorded", "on", "the", "indicated", "days", ".", "Data", "are", "the", "mean", "±", "SEM", "of", "n", "=", "5", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3A. LC-MS/MS identification and quantification of m6Am or m6A levels in mRNA from control and PCIF1-depleted HCT116 cells. Data are presented as the enrichment of methylated vs unmethylated mRNA. Data are the mean ± SD of n=3 biological replicates. **P < 0.01 by Student's t-test.B. Metagene plots analysis of m6Am enrichment around the transcription start site (TSS) of all expressed genes in control and PCIF1-depleted HCT116 cells.E. Western blot analysis of FOS and PCIF1 in control and PCIF1-depleted HCT116 and HT29 cells. GAPDH served as a loading control.F. Genome browser views of FOS with m6Am sites. Read coverage of input sample and IP sample are shown in blue and red, respectively, and green rectangle indicates the m6Am peaks located near the TSS.G. m6Am-exo-qPCR analysis of m6Am enrichment in FOS mRNAs from the indicated HCT116 cells. GAPDH served as a negative control. Data are the mean ± SD of n=3 biological replicates. **P < 0.01 by Student's t-test.H. qRT-PCR analysis of FOS mRNA stability in control and PCIF1-depleted HCT116 and HT29 cells treated with actinomycin D for the indicated times. Data are the mean ± SD of n=3 biological replicates. *P < 0.05, **P < 0.01 by Student's t-test.I. Growth of tumors after subcutaneous injection of the indicated HCT116 cells into athymic nude mice. Tumor volumes were recorded on the indicated days. Data are the mean ± SEM of n=5. *P < 0.05 by Student's t-test."}
{"words": ["Figure", "4A", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "FOS", "in", "control", "and", "FOS", "-", "depleted", "HCT116", "and", "HT29", "cells", ".", "GAPDH", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "MTS", "cell", "proliferation", "assay", "(", "B", ")", ",", "of", "control", "and", "FOS", "-", "depleted", "HCT116", "cells", ".", "Data", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "wound", "healing", "migration", "assay", "(", "C", ")", ",", "of", "control", "and", "FOS", "-", "depleted", "HCT116", "cells", ".", "Representative", "images", "and", "quantification", "of", "colonies", "are", "shown", "to", "the", "left", "and", "right", ",", "respectively", ".", "Data", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "colony", "formation", "assay", "(", "D", ")", "of", "control", "and", "FOS", "-", "depleted", "HCT116", "cells", ".", "Representative", "images", "and", "quantification", "of", "colonies", "are", "shown", "to", "the", "left", "and", "right", ",", "respectively", ".", "Data", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "E", ".", "Growth", "of", "control", "and", "FOS", "-", "depleted", "HCT116", "tumors", "after", "subcutaneous", "injection", "into", "athymic", "nude", "mice", ".", "Tumor", "volume", "was", "recorded", "on", "the", "indicated", "days", ".", "Data", "are", "the", "mean", "±", "SEM", "of", "n", "=", "10", "mice", "/", "group", ".", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "F", ".", "Survival", "analysis", "of", "mice", "bearing", "control", "and", "FOS", "-", "depleted", "HCT116", "tumors", ".", "Data", "are", "the", "mean", "±", "SEM", "of", "n", "=", "5", "mice", "/", "group", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "G", ".", "Positive", "correlation", "between", "FOS", "and", "PCIF1", "protein", "levels", "in", "tumors", "from", "29", "patients", "with", "CRC", "(", "R2", "=", "0", ".", "6902", ",", "P", "<", "0", ".", "001", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4A. Western blot analysis of FOS in control and FOS-depleted HCT116 and HT29 cells. GAPDH served as a loading control.MTS cell proliferation assay (B), of control and FOS-depleted HCT116 cells. Data are the mean ± SD of n=3 biological replicates. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 by Student's t-test.wound healing migration assay (C), of control and FOS-depleted HCT116 cells. Representative images and quantification of colonies are shown to the left and right, respectively. Data are the mean ± SD of n=3 biological replicates. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 by Student's t-test.colony formation assay (D) of control and FOS-depleted HCT116 cells. Representative images and quantification of colonies are shown to the left and right, respectively. Data are the mean ± SD of n=3 biological replicates. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 by Student's t-test.E. Growth of control and FOS-depleted HCT116 tumors after subcutaneous injection into athymic nude mice. Tumor volume was recorded on the indicated days. Data are the mean ± SEM of n=10 mice/group. **P < 0.01 by Student's t-test.F. Survival analysis of mice bearing control and FOS-depleted HCT116 tumors. Data are the mean ± SEM of n= 5 mice/group. *P < 0.05 by Student's t-test.G. Positive correlation between FOS and PCIF1 protein levels in tumors from 29 patients with CRC (R2 =0.6902, P < 0.001)."}
{"words": ["Figure", "7B", ".", "mRNA", "expression", "of", "PCIF1", "was", "quantified", "by", "qRT", "-", "PCR", "in", "the", "HCT116", "cells", "transfected", "with", "gradient", "amount", "of", "control", "and", "PCIF1", "siRNAs", ".", "Data", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "C", ".", "Western", "blot", "analysis", "of", "PCIF1", "in", "HCT116", "cells", "with", "control", "and", "PCIF1", "siRNAs", ".", "GAPDH", "served", "as", "a", "loading", "control", ".", "D", ".", "Cell", "viability", "assays", "were", "performed", "in", "in", "the", "HCT116", "cells", "transfected", "with", "100pmol", "control", "and", "PCIF1", "siRNAs", ".", "Data", "are", "the", "mean", "±", "SD", "of", "n", "=", "3", "biological", "replicates", ".", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "F", ".", "Tumor", "growth", "of", "HCT116", "cells", "treated", "with", "1mg", "/", "kg", "control", "and", "PCIF1", "LNP", "-", "siRNAs", "starting", "on", "day", "9", "and", "mice", "were", "intratumorally", "treated", "twice", "a", "week", ".", "Data", "are", "the", "mean", "±", "SEM", "of", "n", "=", "5", "mice", "/", "group", ".", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "by", "Student", "'", "s", "t", "-", "test", ".", "G", ".", "Immunoblots", "of", "PCIF1", "and", "FOS", "were", "carried", "out", "from", "the", "indicated", "tumors", "in", "four", "replicates", "with", "GAPDH", "as", "a", "loading", "control", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7B. mRNA expression of PCIF1 was quantified by qRT-PCR in the HCT116 cells transfected with gradient amount of control and PCIF1 siRNAs. Data are the mean ± SD of n=3 biological replicates. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001 by Student's t-test.C. Western blot analysis of PCIF1 in HCT116 cells with control and PCIF1 siRNAs. GAPDH served as a loading control.D. Cell viability assays were performed in in the HCT116 cells transfected with 100pmol control and PCIF1 siRNAs. Data are the mean ± SD of n=3 biological replicates. ***P < 0.001 by Student's t-test.F. Tumor growth of HCT116 cells treated with 1mg/kg control and PCIF1 LNP-siRNAs starting on day 9 and mice were intratumorally treated twice a week. Data are the mean ± SEM of n=5 mice/group. *P < 0.05, **P < 0.01 by Student's t-test.G. Immunoblots of PCIF1 and FOS were carried out from the indicated tumors in four replicates with GAPDH as a loading control."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "b", "-", "c", ")", "Western", "blot", "for", "p53", "and", "select", "p53", "targets", "post", "-", "radiation", "in", "(", "b", ")", "oscillatory", "and", "(", "c", ")", "rising", "conditions", ".", "Actin", "is", "shown", "as", "a", "loading", "control", ".", "(", "d", "-", "e", ")", "Average", "levels", "of", "(", "d", ")", "mRNA", "quantified", "by", "RNAseq", "(", "red", ")", "or", "qRT", "-", "PCR", "(", "grey", ")", "or", "(", "e", ")", "protein", "quantified", "by", "mass", "spectrometry", "(", "light", "green", ")", "or", "western", "blot", "(", "grey", ")", "for", "select", "p53", "target", "genes", "under", "oscillatory", "p53", ".", "Data", "information", ":", ",", "n", "=", "2", "biological", "replicates", ",", "error", "bars", "represent", "std", "dev", ".", "(", "f", "-", "g", ")", "Average", "levels", "of", "(", "f", ")", "mRNA", "quantified", "by", "RNAseq", "(", "blue", ")", "or", "qRT", "-", "PCR", "(", "grey", ")", "or", "(", "g", ")", "protein", "quantified", "by", "mass", "spectrometry", "(", "dark", "green", ")", "or", "western", "blot", "(", "grey", ")", "for", "select", "p53", "target", "genes", "under", "rising", "p53", ".", "Data", "information", ":", "n", "=", "2", "biological", "replicates", ",", "error", "bars", "represent", "std", "dev", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(b-c) Western blot for p53 and select p53 targets post-radiation in (b) oscillatory and (c) rising conditions. Actin is shown as a loading control.(d-e) Average levels of (d) mRNA quantified by RNAseq (red) or qRT-PCR (grey) or (e) protein quantified by mass spectrometry (light green) or western blot (grey) for select p53 target genes under oscillatory p53. Data information: , n=2 biological replicates, error bars represent std dev.(f-g) Average levels of (f) mRNA quantified by RNAseq (blue) or qRT-PCR (grey) or (g) protein quantified by mass spectrometry (dark green) or western blot (grey) for select p53 target genes under rising p53. Data information: n=2 biological replicates, error bars represent std dev."}
{"words": ["f1a", ",", "Pancreatic", "sections", "stained", "with", "Atg7", ",", "LC3", "and", "p62", "showing", "Atg7", "−", "/", "−", "next", "to", "Atg7", "+", "/", "+", "regions", "after", "Pdx", "-", "Cre", "-", "mediated", "recombination", ".", "Right", "-", "side", "images", "are", "cropped", "and", "magnified", "regions", "(", "boxed", ")", "from", "left", "-", "side", "images", ".", "The", "magnification", "is", "×", "2", ".", "5", ".", "b", ",", "Haematoxylin", "and", "eosin", "(", "HE", ")", ",", "p53", "and", "caspase", "-", "3", "staining", "of", "exocrine", "tissue", "in", "Atg7", "+", "/", "+", "and", "Atg7", "−", "/", "−", "pancreases", ".", "c", ",", "Quantification", "(", "median", ",", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", "of", "p53", "and", "caspase", "-", "3", "activation", "in", "Atg7", "-", "deficient", "acinar", "tissue", ".", "d", ",", "Kaplan", "-", "Meier", "analysis", "comparing", "overall", "survival", "of", "mice", "either", "wild", "type", "(", "blue", ")", "or", "Atg7", "−", "/", "−", "(", "red", ")", "in", "the", "pancreas", ".", "Mantel", "-", "Cox", "test", "was", "used", "for", "statistics", ".", "'", "n", "/", "a", "'", ",", "14", "/", "16", "mice", "were", "killed", ">", "500", "days", "when", "completely", "healthy", ".", "e", ",", "Biochemical", "analysis", "of", "endocrine", "function", "in", "moribund", "Atg7", "−", "/", "−", "or", "age", "-", "matched", "healthy", "control", "mice", ".", "Detailed", "information", "about", "the", "mice", "is", "tabulated", ".", "A", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", "was", "used", "for", "statistics", ".", "Scale", "bars", ":", "50", "µm", ".", "*", "*", "P", "0", ".", "01", "and", "*", "*", "*", "P", "0", ".", "001", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f1a, Pancreatic sections stained with Atg7, LC3 and p62 showing Atg7−/− next to Atg7+/+ regions after Pdx-Cre-mediated recombination. Right-side images are cropped and magnified regions (boxed) from left-side images. The magnification is × 2.5.b, Haematoxylin and eosin (HE), p53 and caspase-3 staining of exocrine tissue in Atg7+/+ and Atg7−/− pancreases.c, Quantification (median, s.e.m.) of p53 and caspase-3 activation in Atg7-deficient acinar tissue.d, Kaplan-Meier analysis comparing overall survival of mice either wild type (blue) or Atg7−/− (red) in the pancreas. Mantel-Cox test was used for statistics. 'n/a', 14/16 mice were killed >500 days when completely healthy.e, Biochemical analysis of endocrine function in moribund Atg7−/− or age-matched healthy control mice. Detailed information about the mice is tabulated. A Mann-Whitney U-test was used for statistics. Scale bars: 50 µm. **P 0.01 and ***P 0.001."}
{"words": ["f2a", ",", "Alcian", "blue", "/", "PAS", "(", "AB", "/", "PAS", ")", "staining", "in", "pancreases", "from", "150", "-", "day", "-", "old", "Atg7", "-", "proficient", "or", "Atg7", "-", "deficient", "KrasG12D", "/", "+", "mice", "(", "wild", "-", "type", "mice", "with", "expression", "of", "KrasG12D", "in", "their", "pancreases", ")", ".", "b", ",", "Quantification", "of", "PanIN", "from", "mice", "of", "the", "indicated", "genotype", "and", "age", ".", "Fold", "increase", "and", "male", "/", "female", "ratios", "are", "shown", ".", "Box", "plots", "express", "the", "first", "(", "Q1", ")", "and", "third", "(", "Q3", ")", "quartiles", "set", "by", "the", "upper", "and", "lower", "limits", "of", "the", "box", ",", "whereas", "the", "median", "is", "shown", "by", "the", "horizontal", "line", "inside", "the", "box", ".", "The", "whiskers", "extend", "upward", "and", "downward", "to", "the", "highest", "or", "lowest", "observation", "within", "the", "upper", "(", "Q3", "+", "1", ".", "5", "×", "the", "interquartile", "range", ")", "and", "lower", "(", "Q1", "−", "1", ".", "5", "×", "interquartile", "range", ")", "limits", ".", "Values", "outside", "the", "upper", "and", "lower", "limits", "are", "'", "outliers", "'", "and", "are", "shown", "by", "individual", "symbols", ".", "c", ",", "d", ",", "Kaplan", "-", "Meier", "analysis", "comparing", "overall", "survival", "(", "c", ")", "or", "PDAC", "-", "free", "survival", "(", "d", ")", "of", "Atg7", "+", "/", "+", "(", "blue", ")", "or", "Atg7", "−", "/", "−", "(", "red", ")", "KrasG12D", "/", "+", "mice", ".", "c", ",", "d", ",", "Kaplan", "-", "Meier", "analysis", "comparing", "overall", "survival", "(", "c", ")", "or", "PDAC", "-", "free", "survival", "(", "d", ")", "of", "Atg7", "+", "/", "+", "(", "blue", ")", "or", "Atg7", "−", "/", "−", "(", "red", ")", "KrasG12D", "/", "+", "micee", ",", "PanIN", "grading", "of", "pancreases", "from", "150", "-", "day", "-", "old", "Atg7", "+", "/", "+", "or", "Atg7", "−", "/", "−", "Pdx", "-", "Cre", "KrasG12D", "/", "+", "mice", ".", "Values", "are", "mean", "and", "error", "bars", "are", "s", ".", "d", ".", "b", ",", "e", ",", "A", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", "was", "used", "for", "statistics", ".", "f", ",", "Representative", "p53", "staining", "from", "150", "-", "day", "-", "old", "mice", "of", "both", "genotypes", ".", "g", ",", "PDAC", "-", "free", "survival", "of", "autophagy", "-", "proficient", "(", "blue", ")", "and", "Atg5", "-", "deficient", "(", "red", ")", "KrasG12D", "/", "+", "mice", ".", "d", ",", "g", ",", "Median", "survival", "±", " ", "s", ".", "d", ".", "and", "male", "/", "female", "(", "m", "/", "f", ")", "ratio", "are", "provided", ".", "'", "n", "/", "a", "'", ",", "no", "animals", "succumbed", "to", "PDAC", ".", "A", "log", "-", "rank", "test", "(", "Mantel", "-", "Cox", ")", "was", "used", "for", "statistics", ".", "a", ",", "f", ",", "Scale", "bars", ":", "500", " ", "µm", "(", "a", ")", ",", "50", " ", "µm", "(", "f", ")", ".", "*", "P", " ", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", " ", " ", "0", ".", "01", ";", "NS", ",", "not", "significant", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f2a, Alcian blue/PAS (AB/PAS) staining in pancreases from 150-day-old Atg7-proficient or Atg7-deficient KrasG12D/+ mice (wild-type mice with expression of KrasG12D in their pancreases).b, Quantification of PanIN from mice of the indicated genotype and age. Fold increase and male/female ratios are shown. Box plots express the first (Q1) and third (Q3) quartiles set by the upper and lower limits of the box, whereas the median is shown by the horizontal line inside the box. The whiskers extend upward and downward to the highest or lowest observation within the upper (Q3 + 1.5 × the interquartile range) and lower (Q1 − 1.5 × interquartile range) limits. Values outside the upper and lower limits are 'outliers' and are shown by individual symbols.c, d, Kaplan-Meier analysis comparing overall survival (c) or PDAC-free survival (d) of Atg7+/+ (blue) or Atg7−/− (red) KrasG12D/+ mice.c, d, Kaplan-Meier analysis comparing overall survival (c) or PDAC-free survival (d) of Atg7+/+ (blue) or Atg7−/− (red) KrasG12D/+ micee, PanIN grading of pancreases from 150-day-old Atg7+/+ or Atg7−/− Pdx-Cre KrasG12D/+ mice. Values are mean and error bars are s.d. b, e, A Mann-Whitney U-test was used for statistics.f, Representative p53 staining from 150-day-old mice of both genotypes.g, PDAC-free survival of autophagy-proficient (blue) and Atg5-deficient (red) KrasG12D/+ mice. d, g, Median survival ± s.d. and male/female (m/f) ratio are provided. 'n/a', no animals succumbed to PDAC. A log-rank test (Mantel-Cox) was used for statistics. a, f, Scale bars: 500 µm (a), 50 µm (f). *P  0.05, **P  0.01; NS, not significant."}
{"words": ["f3a", ",", "Kaplan", "-", "Meier", "analysis", "comparing", "PDAC", "-", "free", "survival", "in", "Atg7", "+", "/", "+", "(", "blue", ")", "or", "Atg7", "−", "/", "−", "(", "red", ")", "KrasG12D", "/", "+", " ", "p53", "−", "/", "−", "mice", ".", "b", ",", "Pancreatic", "tumours", "of", "indicated", "genotypes", "stained", "for", "Atg7", ",", "LC3", "and", "p62", ".", "Insets", "are", "magnified", "crops", "from", "the", "same", "images", "to", "show", "specifics", "of", "LC3", "and", "p62", "staining", ".", "The", "magnification", "is", " ", "×", " ", "4", ".", "c", ",", "Tumour", "incidence", "and", "tumour", "weight", "(", "median", ",", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ")", "in", "mice", "from", "indicated", "genotypes", ",", "killed", "at", "21", ",", "29", "and", "38", "days", "of", "age", ".", "Numbers", "in", "the", "incidence", "diagram", "represent", "tumour", "-", "bearing", "mice", "versus", "all", "mice", ".", "Significance", "was", "assessed", "with", "Fisher", "'", "s", "exact", "test", "(", "incidence", ")", "and", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", "(", "weight", ")", ".", "d", ",", "Representative", "haematoxylin", "and", "eosin", "stainings", "of", "pancreases", "from", "indicated", "time", "points", "and", "genotypes", ".", "e", ",", "Kaplan", "-", "Meier", "analysis", "comparing", "PDAC", "-", "free", "survival", "of", "Atg5", "+", "/", "+", "(", "blue", ")", "or", "Atg5", "−", "/", "−", "(", "green", ")", "KrasG12D", "/", "+", " ", "p53", "−", "/", "−", "mice", ".", "f", ",", "Kaplan", "-", "Meier", "analysis", "comparing", "PDAC", "-", "free", "survival", "of", "KrasG12D", "/", "+", "p53", "−", "/", "−", "mice", "that", "were", "chloroquine", "-", "treated", "(", "CQ", ",", "red", ")", ",", "vehicle", "-", "treated", "(", "PBS", ",", "black", ")", "or", "untreated", "(", "blue", ")", ".", "a", ",", "e", ",", "f", ",", "The", "blue", "curve", "in", "all", "Kaplan", "-", "Meier", "plots", "represents", "the", "same", "colony", "of", "mice", "(", "KrasG12D", "/", "+", ",", "p53", "−", "/", "−", ",", "Atg7", "+", "/", "+", ",", "Atg5", "+", "/", "+", ")", ".", "A", "Mantel", "-", "Cox", "test", "was", "used", "for", "statistics", ".", "b", ",", "d", ",", "Scale", "bars", ":", "100", "µm", "(", "b", ")", ",", "200", "µm", "(", "d", ")", ".", "*", "P", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", "0", ".", "01", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f3a, Kaplan-Meier analysis comparing PDAC-free survival in Atg7+/+ (blue) or Atg7−/− (red) KrasG12D/+ p53−/− mice.b, Pancreatic tumours of indicated genotypes stained for Atg7, LC3 and p62. Insets are magnified crops from the same images to show specifics of LC3 and p62 staining. The magnification is × 4.c, Tumour incidence and tumour weight (median, s.e.m.) in mice from indicated genotypes, killed at 21, 29 and 38 days of age. Numbers in the incidence diagram represent tumour-bearing mice versus all mice. Significance was assessed with Fisher's exact test (incidence) and Mann-Whitney U-test (weight).d, Representative haematoxylin and eosin stainings of pancreases from indicated time points and genotypes.e, Kaplan-Meier analysis comparing PDAC-free survival of Atg5+/+ (blue) or Atg5−/− (green) KrasG12D/+ p53−/− mice.f, Kaplan-Meier analysis comparing PDAC-free survival of KrasG12D/+ p53−/− mice that were chloroquine-treated (CQ, red), vehicle-treated (PBS, black) or untreated (blue). a, e, f, The blue curve in all Kaplan-Meier plots represents the same colony of mice (KrasG12D/+, p53−/−, Atg7+/+, Atg5+/+). A Mantel-Cox test was used for statistics. b, d, Scale bars: 100 µm (b), 200 µm (d). *P 0.05, **P 0.01."}
{"words": ["f4a", ",", "LC3", "staining", "of", "representative", "pancreatic", "tumours", "from", "mice", "of", "indicated", "genotypes", ".", "Scale", "bars", ":", "50", "µm", ".", "b", ",", "Western", "blotting", "for", "LC3", ",", "p53", "and", "Atg7", "in", "cell", "lines", "derived", "from", "individual", "tumours", "which", "developed", "in", "the", "absence", "or", "presence", "of", "p53", ".", "c", ",", "d", ",", "Average", "oxygen", "consumption", "rate", "(", "OCR", ",", "c", ")", "and", "extracellular", "acidification", "rate", "(", "ECAR", ",", "c", ",", "d", ",", "Average", "oxygen", "consumption", "rate", "(", "OCR", ",", "c", ")", "and", "extracellular", "acidification", "rate", "(", "ECAR", ",", "d", ")", "of", "eight", "Atg7", "+", "/", "+", "and", "seven", "Atg7", "−", "/", "−", "cell", "lines", "revealed", "increased", "ECAR", "in", "autophagy", "-", "deficient", "cells", ".", "Error", "bars", "are", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "e", ",", "Treatment", "with", "2", "-", "deocyglucose", "(", "2", "-", "DG", ")", "reduces", "ECAR", "and", "abrogates", "the", "difference", "between", "cell", "lines", "from", "Atg7", "+", "/", "+", "and", "Atg7", "−", "/", "−", "tumours", ".", "Values", "are", "the", "average", "of", "three", "biological", "replicates", ".", "Error", "bars", "are", "s", ".", "e", ".", "m", ".", ",", "g", ",", "LC", "-", "MS", "analysis", "revealed", "increased", "glucose", "consumption", "from", "medium", "(", "f", ")", "and", "extracellular", "lactate", "accumulation", "(", "g", ")", "in", "Atg7", "-", "null", "cell", "lines", ".", "Values", "are", "the", "average", "of", "eight", "(", "Atg7", "+", "/", "+", ")", "and", "seven", "(", "Atg7", "−", "/", "−", ")", "biological", "replicates", ".", "h", ",", "LC", "-", "MS", "analysis", "shows", "increased", "accumulation", "of", "2", "-", "DG", "and", "its", "metabolite", "2", "-", "DG", "-", "6", "-", "phosphate", "in", "Atg7", "-", "deficient", "cell", "lines", ".", "Values", "are", "averages", "of", "five", "biological", "replicates", "for", "each", "genotype", ".", "i", ",", "Background", "levels", "of", "18F", "-", "FDG", "uptake", "in", "brain", "and", "heart", "can", "be", "seen", "in", "sagittal", "and", "coronal", "views", "(", "middle", "and", "right", "panels", ",", "respectively", ")", "of", "wild", "-", "type", "Atg7", "mice", "(", "top", "row", ")", ".", "In", "contrast", ",", "intense", "18F", "-", "FDG", "uptake", "is", "seen", "in", "pancreatic", "tumours", "of", "Atg7", "deficient", "mice", "(", "bottom", "row", ")", ".", "j", ",", "LC", "-", "MS", "of", "intracellular", "glycolytic", "and", "pentose", "phosphate", "pathway", "intermediates", "shows", "enhanced", "accumulation", "in", "Atg7", "−", "/", "−", "tumour", "cell", "lines", ".", "Values", "are", "average", "of", "eight", "(", "Atg7", "+", "/", "+", ")", "and", "six", "(", "Atg7", "−", "/", "−", ")", "biological", "replicates", ".", "f", "-", "h", ",", "j", ",", "Error", "bars", "are", "s", ".", "e", ".", "m", ".", "a", ",", "f", "-", "h", ",", "j", ",", "A", "Mann", "-", "Whitney", "U", "-", "test", "was", "used", "to", "ascertain", "significance", ".", "*", "P", " ", " ", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "P", " ", " ", "0", ".", "01", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "f4a, LC3 staining of representative pancreatic tumours from mice of indicated genotypes. Scale bars: 50 µm.b, Western blotting for LC3, p53 and Atg7 in cell lines derived from individual tumours which developed in the absence or presence of p53.c, d, Average oxygen consumption rate (OCR, c) and extracellular acidification rate (ECAR,c, d, Average oxygen consumption rate (OCR, c) and extracellular acidification rate (ECAR, d) of eight Atg7+/+ and seven Atg7−/− cell lines revealed increased ECAR in autophagy-deficient cells. Error bars are s.e.m.e, Treatment with 2-deocyglucose (2-DG) reduces ECAR and abrogates the difference between cell lines from Atg7+/+ and Atg7−/− tumours. Values are the average of three biological replicates. Error bars are s.e.m., g, LC-MS analysis revealed increased glucose consumption from medium (f) and extracellular lactate accumulation (g) in Atg7-null cell lines. Values are the average of eight (Atg7+/+) and seven (Atg7−/−) biological replicates.h, LC-MS analysis shows increased accumulation of 2-DG and its metabolite 2-DG-6-phosphate in Atg7-deficient cell lines. Values are averages of five biological replicates for each genotype.i, Background levels of 18F-FDG uptake in brain and heart can be seen in sagittal and coronal views (middle and right panels, respectively) of wild-type Atg7 mice (top row). In contrast, intense 18F-FDG uptake is seen in pancreatic tumours of Atg7 deficient mice (bottom row).j, LC-MS of intracellular glycolytic and pentose phosphate pathway intermediates shows enhanced accumulation in Atg7−/− tumour cell lines. Values are average of eight (Atg7+/+) and six (Atg7−/−) biological replicates. f-h, j, Error bars are s.e.m. a, f-h, j, A Mann-Whitney U-test was used to ascertain significance. *P  0.05, **P  0.01."}
{"words": ["Figure", "1", "(", "f", ")", "A549", "-", "ACE2", "or", "control", "A549", "-", "Venus", "cells", "were", "pretreated", "with", "Tubercidin", "or", "vehicle", "(", "DMSO", ")", "3h", "prior", "to", "infection", "with", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "at", "MOI", "0", ".", "1", ".", "After", "24", "hours", ",", "abundances", "of", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "nucleoprotein", "(", "N", ")", ",", "ACE2", ",", "Venus", "and", "β", "-", "actin", "(", "ACTB", ",", "loading", "control", ")", "were", "visualized", "using", "Western", "blotting", ".", "Presented", "data", "is", "representative", "of", "3", "independent", "repeats", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1(f) A549-ACE2 or control A549-Venus cells were pretreated with Tubercidin or vehicle (DMSO) 3h prior to infection with SARS-CoV-2 at MOI 0.1. After 24 hours, abundances of SARS-CoV-2 nucleoprotein (N), ACE2, Venus and β-actin (ACTB, loading control) were visualized using Western blotting. Presented data is representative of 3 independent repeats."}
{"words": ["Figure", "3", "(", "i", ")", "NHBEs", "derived", "from", "three", "independent", "donors", "were", "pretreated", "for", "6", "h", "with", "indicated", "concentrations", "of", "DZNep", "or", "vehicle", "and", "infected", "with", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "for", "24", "h", ".", "Cells", "were", "fixed", "and", "the", "abundance", "of", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "N", "was", "quantified", "by", "immunofluorescent", "staining", ".", "Shown", "are", "vehicle", "-", "normalized", "integrated", "anti", "-", "N", "fluorescent", "intensity", "and", "cell", "confluence", ",", "error", "bars", "represent", "mean", "+", "/", "-", "sd", "of", "n", "=", "3", "donors", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3(i) NHBEs derived from three independent donors were pretreated for 6 h with indicated concentrations of DZNep or vehicle and infected with SARS-CoV-2 for 24 h. Cells were fixed and the abundance of SARS-CoV-2 N was quantified by immunofluorescent staining. Shown are vehicle-normalized integrated anti-N fluorescent intensity and cell confluence, error bars represent mean +/- sd of n=3 donors."}
{"words": ["Figure", "4Mass", "spectrometry", "based", "analysis", "of", "cells", "treated", "with", "DZNep", "and", "infected", "with", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "and", "SARS", "-", "CoV", ".", "(", "b", ")", "Number", "of", "significantly", "up", "-", "or", "downregulated", "proteins", "in", "indicated", "comparisons", "according", "to", "(", "a", ")", ".", "Mass", "spectrometry", "based", "analysis", "of", "cells", "treated", "with", "DZNep", "and", "infected", "with", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "and", "SARS", "-", "CoV", ".", "(", "c", ")", "Donor", "-", "normalized", "LFQ", "abundances", "of", "viral", "nucleoprotein", "(", "N", ")", "and", "spike", "(", "S", ")", "in", "the", "indicated", "conditions", ".", "Error", "bars", "represent", "mean", "+", "/", "-", "sd", "of", "n", "=", "4", "donors", "(", "NHBE", ")", "or", "n", "=", "4", "independently", "infected", "A549", "-", "ACE2", "cultures", ".", "Statistics", "were", "calculated", "using", "Student", "'", "s", "two", "-", "sided", "t", "-", "test", "as", "indicated", ".", "(", "d", ")", "Expression", "patterns", "according", "to", "(", "a", ")", "of", "a", "selection", "of", "genes", "related", "to", "the", "disease", "-", "relevant", "pathways", "as", "annotated", ".", "(", "e", ")", "NHBEs", "(", "6", "independent", "donors", ")", "were", "pretreated", "for", "6", "h", "with", "0", ".", "75", "μM", "DZNep", "or", "vehicle", "and", "infected", "with", "SARS", "-", "CoV", "or", "SARS", "-", "CoV", "-", "2", "at", "MOI", "3", ".", "24", "h", "later", ",", "accumulation", "of", "IL", "-", "6", "and", "IP", "-", "10", "was", "measured", "in", "the", "supernatant", "by", "ELISA", ".", "Donor", "-", "wise", "IL", "-", "6", "and", "IP", "-", "10", "secretion", ",", "normalized", "to", "vehicle", "treated", "uninfected", "controls", "(", "as", "further", "described", "in", "materials", "and", "methods", ")", "is", "shown", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4Mass spectrometry based analysis of cells treated with DZNep and infected with SARS-CoV-2 and SARS-CoV. (b) Number of significantly up- or downregulated proteins in indicated comparisons according to (a).Mass spectrometry based analysis of cells treated with DZNep and infected with SARS-CoV-2 and SARS-CoV. (c) Donor-normalized LFQ abundances of viral nucleoprotein (N) and spike (S) in the indicated conditions. Error bars represent mean +/- sd of n=4 donors (NHBE) or n=4 independently infected A549-ACE2 cultures. Statistics were calculated using Student's two-sided t-test as indicated.(d) Expression patterns according to (a) of a selection of genes related to the disease-relevant pathways as annotated.(e) NHBEs (6 independent donors) were pretreated for 6 h with 0.75 μM DZNep or vehicle and infected with SARS-CoV or SARS-CoV-2 at MOI 3. 24 h later, accumulation of IL-6 and IP-10 was measured in the supernatant by ELISA. Donor-wise IL-6 and IP-10 secretion, normalized to vehicle treated uninfected controls (as further described in materials and methods) is shown."}
{"words": ["Figure", "1", "B", "An", "Integrative", "Genomics", "Viewer", "(", "IGV", ")", "screenshot", "of", "the", "Notch", "de", "novo", "TE", "insertion", "site", "from", "sample", "P47", "(", "clonal", "neoplasia", ")", "and", "its", "head", "control", ",", "sample", "P48", ".", "Bars", "represent", "sequencing", "reads", ".", "Reads", "supporting", "the", "TE", "insertion", "are", "colored", "according", "to", "homology", "to", "a", "specific", "TE", "insertion", "sequence", ".", "Multiple", "colors", "at", "a", "putative", "insert", "site", "frequently", "indicate", "homology", "to", "different", "reference", "copies", "of", "the", "same", "TE", "family", ".", "Two", "types", "of", "supporting", "reads", "can", "be", "seen", ":", "soft", "-", "clipped", "reads", "-", "spanning", "the", "insertion", "site", "and", "mapping", "partially", "to", "the", "reference", "genome", "and", "partially", "to", "the", "TE", ",", "and", "mate", "pair", "support", "reads", "-", "flanking", "the", "insertion", "site", "and", "mapping", "to", "the", "reference", "genome", "but", "with", "mates", "(", "not", "seen", ")", "mapping", "to", "the", "TE", ".", "D", "PCR", "validation", "of", "4", "somatic", ",", "neoplasia", "-", "specific", "TE", "insertions", ".", "Primers", "were", "designed", "to", "target", "regions", "flanking", "the", "insertion", "sites", ".", "Yellow", "arrowheads", "indicate", "PCR", "products", "containing", "an", "insertion", "amplified", "in", "the", "clonal", "DNA", "but", "not", "in", "the", "neighboring", "gut", "tissue", "(", "non", "-", "clonal", ")", ",", "head", "or", "thorax", "for", "the", "same", "fly", ".", "Short", "wild", "-", "type", "amplicon", "was", "detectable", "in", "all", "samples", ".", "Thorax", "DNA", "sample", "was", "not", "available", "for", "sample", "P15", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1 B An Integrative Genomics Viewer (IGV) screenshot of the Notch de novo TE insertion site from sample P47 (clonal neoplasia) and its head control, sample P48. Bars represent sequencing reads. Reads supporting the TE insertion are colored according to homology to a specific TE insertion sequence. Multiple colors at a putative insert site frequently indicate homology to different reference copies of the same TE family. Two types of supporting reads can be seen: soft-clipped reads - spanning the insertion site and mapping partially to the reference genome and partially to the TE, and mate pair support reads - flanking the insertion site and mapping to the reference genome but with mates (not seen) mapping to the TE.  D PCR validation of 4 somatic, neoplasia-specific TE insertions. Primers were designed to target regions flanking the insertion sites. Yellow arrowheads indicate PCR products containing an insertion amplified in the clonal DNA but not in the neighboring gut tissue (non-clonal), head or thorax for the same fly. Short wild-type amplicon was detectable in all samples. Thorax DNA sample was not available for sample P15. "}
{"words": ["Figure", "2", "D", "TSD", "length", "distribution", "for", "somatic", "insertions", "of", "most", "frequent", "TE", "families", ".", "Insertions", "from", "both", "genotypes", "were", "pooled", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2 D TSD length distribution for somatic insertions of most frequent TE families. Insertions from both genotypes were pooled. "}
{"words": ["Figure", "3", "C", "The", "distribution", "of", "somatic", "insertions", "with", "estimated", "cell", "fraction", "higher", "or", "lower", "than", "Notch", "-", "inactivating", "mutations", "for", "the", "most", "represented", "LTR", "-", "elements", "(", "rover", "and", "copia", ")", "and", "LINE", "-", "like", "I", "-", "elements", ".", "(", "p", "-", "values", "were", "calculated", "with", "Fisher", "'", "s", "exact", "test", ",", "two", "-", "tailed", ",", "n", "=", "number", "of", "insertions", ")"], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3 C The distribution of somatic insertions with estimated cell fraction higher or lower than Notch-inactivating mutations for the most represented LTR-elements (rover and copia) and LINE-like I-elements. (p-values were calculated with Fisher's exact test, two-tailed, n= number of insertions) "}
{"words": ["Figure", "4", "A", "Heatmaps", "representing", "normalized", "TE", "expression", "levels", "(", "in", "log2", "(", "TPM", ")", ",", "transcripts", "per", "million", ")", "and", "mobility", "(", "log2", "(", "insertion", "counts", ")", ")", "in", "Pros", ">", "2xGFP", "midguts", ".", "TEs", "with", "TPM", "values", "below", "0", ".", "05", "(", "log2", "(", "TPM", ")", "<", "-", "4", ".", "3", ")", "are", "not", "depicted", ".", "Crossed", "out", "cells", "represent", "no", "somatic", "insertions", "of", "that", "family", "identified", ".", "B", "Normalized", "read", "coverage", "over", "the", "full", "-", "length", "canonical", "sequence", "of", "selected", "TE", "families", ".", "C", "Normalized", "expression", "levels", "of", "siRNA", "pathway", "genes", ".", "D", "The", "size", "distribution", "of", "sense", "and", "antisense", "reads", "from", "gut", "small", "RNA", "fractions", "mapping", "to", "all", "TEs", "(", "upper", "panel", ")", "or", "selected", "TE", "families", "mobilizing", "in", "the", "gut", ".", "R1", "and", "R2", "are", "two", "biological", "replicates", ".", "E", "Scatter", "plot", "of", "normalized", "transcript", "(", "mRNA", ")", "levels", "and", "antisense", ",", "21nt", "siRNA", "levels", "for", "all", "TE", "families", ".", "Transposons", "generating", "somatic", "insertions", "are", "highlighted", "in", "red", "(", "LTR", "-", "elements", ")", "or", "blue", "(", "LINE", "-", "like", ")", ",", "with", "a", "symbol", "size", "reflecting", "the", "somatic", "insertion", "counts", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4 A Heatmaps representing normalized TE expression levels (in log2(TPM), transcripts per million) and mobility (log2(insertion counts)) in Pros>2xGFP midguts. TEs with TPM values below 0.05 (log2(TPM)< -4.3) are not depicted. Crossed out cells represent no somatic insertions of that family identified.  B Normalized read coverage over the full-length canonical sequence of selected TE families.  C Normalized expression levels of siRNA pathway genes.  D The size distribution of sense and antisense reads from gut small RNA fractions mapping to all TEs (upper panel) or selected TE families mobilizing in the gut. R1 and R2 are two biological replicates.  E Scatter plot of normalized transcript (mRNA) levels and antisense, 21nt siRNA levels for all TE families. Transposons generating somatic insertions are highlighted in red (LTR-elements) or blue (LINE-like), with a symbol size reflecting the somatic insertion counts. "}
{"words": ["Figure", "5", "B", "TE", "families", "with", "tissue", "-", "specific", ",", "singleton", "TSD", "-", "bearing", "insertions", "detected", "in", "pooled", "gut", "or", "head", "DNA", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5 B TE families with tissue-specific, singleton TSD-bearing insertions detected in pooled gut or head DNA. "}
{"words": ["Figure", "6", "B", "Somatic", "TE", "insertion", "sites", "of", "rover", "LTR", "elements", "were", "depleted", "from", "intergenic", "and", "exonic", "sequences", "and", "enriched", "in", "introns", "and", "3", "'", "UTR", "regions", "of", "the", "fly", "genome", ".", "Insertions", "of", "copia", "LTR", "elements", "were", "also", "enriched", "in", "introns", ".", "D", "Correlations", "of", "somatic", "insertion", "sites", "of", "the", "three", "most", "represented", "TE", "families", "(", "rover", ",", "copia", "and", "I", "-", "element", ")", "with", "modENCODE", "tracks", "for", "adult", "fly", "tissues", ".", "E", "Correlations", "of", "somatic", "insertion", "sites", "of", "the", "three", "most", "represented", "TE", "families", "(", "rover", ",", "copia", "and", "I", "-", "element", ")", "with", "DamID", "tracks", "for", "adult", "fly", "intestinal", "stem", "cells", "(", "ISC", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6 B Somatic TE insertion sites of rover LTR elements were depleted from intergenic and exonic sequences and enriched in introns and 3'UTR regions of the fly genome. Insertions of copia LTR elements were also enriched in introns.  D Correlations of somatic insertion sites of the three most represented TE families (rover, copia and I-element) with modENCODE tracks for adult fly tissues.  E Correlations of somatic insertion sites of the three most represented TE families (rover, copia and I-element) with DamID tracks for adult fly intestinal stem cells (ISC). "}
{"words": ["Figure", "1", "[", "Ca2", "+", "]", "i", "changes", "in", "individual", "BMDMs", "were", "measured", "(", "A", ")", "using", "fura", "-", "2", "during", "frustrated", "phagocytosis", "(", "n", "=", "46", "-", "113", ")", "and", "(", "B", ")", "by", "dropping", "beads", "onto", "adherent", "cells", "loaded", "with", "Calbryte", "520", "(", "n", "=", "64", "-", "159", ")", ",", "in", "1", ".", "8", "mM", "extracellular", "Ca2", "+", "(", "+", "Ca2", "+", "o", ")", "or", "Ca2", "+", "-", "free", "medium", "containing", "100", "μM", "EGTA", "(", "-", "Ca2", "+", "o", ")", "with", "or", "without", "prior", "loading", "with", "25", "μM", "EGTA", "/", "AM", "or", "25", "μM", "BAPTA", "/", "AM", ".", "The", "maximum", "fura", "-", "2", "ratio", "changes", "(", "∆", "350", "/", "380", ")", "or", "fluorescence", "changes", "normalized", "to", "initial", "fluorescence", "(", "∆", "F", "/", "F0", ")", "are", "plotted", ".", "FcγR", "-", "mediated", "phagocytosis", "was", "monitored", "using", "beads", "conjugated", "to", "Alexa", "Fluor", "488", "(", "in", "green", ")", ".", "External", "beads", "were", "differentially", "labelled", "with", "anti", "-", "IgG", "(", "in", "red", ")", "and", "distinguished", "by", "their", "dual", "labelling", "(", "in", "yellow", ")", ".", "Cytochalasin", "D", "(", "10", "μM", ",", "Cyt", "D", ")", "prevented", "bead", "internalization", ".", "Bead", "uptake", "in", "15", "min", ",", "under", "conditions", "as", "in", "(", "A", ",", "B", ")", ",", "n", "=", "80", "-", "91", "cells", "with", "representative", "images", "of", "individual", "cells", "delineated", "by", "a", "dotted", "line", ".", "Experiments", "conducted", "in", "-", "Ca2", "+", "o", ":", "(", "F", ")", "1", "μM", "thapsigarin", "(", "Tg", ")", "or", "10", "μM", "CPA", "pre", "-", "treatment", ",", "all", "but", "eliminated", "the", "1", "μM", "ionomycin", "(", "iono", ")", "response", ";", "single", "-", "cell", "Ca2", "+", "traces", "and", "mean", "∆", "F", "/", "F0", ",", "n", "=", "450", "-", "603", "cells", ".", "(", "G", ")", "FcγR", "activation", "(", "as", "in", "B", ")", "evoked", "Ca2", "+", "oscillations", "that", "were", "blocked", "with", "Tg", "or", "CPA", "treatment", ",", "whilst", "bead", "phagocytosis", "was", "not", "affected", "(", "H", ")", ",", "n", "=", "312", "-", "428", "cells", ".", "(", "I", ")", "1", "μM", "bafilomycin", "A1", "(", "Baf", ")", "for", "3h", ",", "or", "Ca2", "+", "-", "binding", "dextran", "(", "Cal520", "-", "dx", ")", "and", "non", "-", "Ca2", "+", "-", "binding", "dextrans", "(", "FITC", "-", "dx", "and", "Texas", "red", "-", "dx", ")", "trafficked", "to", "lysosomes", ",", "minimally", "affected", "global", "Ca2", "+", "signals", "evoked", "by", "FcγR", "activation", "(", "J", ")", ";", "in", "parallel", ",", "bead", "uptake", "was", "only", "reduced", "by", "bafilomycin", "A1", "or", "by", "chelating", "Ca2", "+", "within", "the", "lysosome", "with", "Cal520", "-", "dx", "(", "K", ")", ",", "n", "=", "100", "-", "162", "cells", ".", "All", "cells", "are", "WT", "BMDM", "and", "all", "beads", "are", "3", "-", "μm", "IgG", "-", "opsonized", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 1[Ca2+]i changes in individual BMDMs were measured (A) using fura-2 during frustrated phagocytosis (n = 46-113) and (B) by dropping beads onto adherent cells loaded with Calbryte 520 (n = 64-159), in 1.8 mM extracellular Ca2+ (+Ca2+o) or Ca2+-free medium containing 100 μM EGTA (-Ca2+o) with or without prior loading with 25 μM EGTA/AM or 25 μM BAPTA/AM. The maximum fura-2 ratio changes (∆ 350/380) or fluorescence changes normalized to initial fluorescence (∆ F/F0) are plotted.FcγR-mediated phagocytosis was monitored using beads conjugated to Alexa Fluor 488 (in green). External beads were differentially labelled with anti-IgG (in red) and distinguished by their dual labelling (in yellow). Cytochalasin D (10 μM, Cyt D) prevented bead internalization.Bead uptake in 15 min, under conditions as in (A, B), n = 80-91 cells with representative images of individual cells delineated by a dotted line.Experiments conducted in -Ca2+o: (F) 1 μM thapsigarin (Tg) or 10 μM CPA pre-treatment, all but eliminated the 1 μM ionomycin (iono) response; single-cell Ca2+ traces and mean ∆ F/F0, n = 450-603 cells. (G) FcγR activation (as in B) evoked Ca2+ oscillations that were blocked with Tg or CPA treatment, whilst bead phagocytosis was not affected (H), n = 312-428 cells. (I) 1 μM bafilomycin A1 (Baf) for 3h, or Ca2+- binding dextran (Cal520-dx) and non-Ca2+-binding dextrans (FITC-dx and Texas red-dx) trafficked to lysosomes, minimally affected global Ca2+ signals evoked by FcγR activation (J); in parallel, bead uptake was only reduced by bafilomycin A1 or by chelating Ca2+ within the lysosome with Cal520-dx (K), n = 100-162 cells. All cells are WT BMDM and all beads are 3-μm IgG-opsonized."}
{"words": ["Figure", "2", "The", "Ca2", "+", "signal", "elicited", "by", "frustrated", "phagocytosis", "was", "significantly", "reduced", "in", "Ned", "-", "19", "(", "10", "μM", ")", "-", "treated", "WT", "and", "in", "all", "TPC", "-", "KO", "BMDMs", ";", "maximum", "Ca2", "+", "amplitude", ",", "expressed", "as", "a", "percentage", "of", "WT", "control", "(", "n", "=", "314", "-", "641", "cells", ")", ".", "Phagocytosis", "of", "opsonized", "3", "-", "µm", "(", "B", "and", "C", ")", "and", "6", "-", "μm", "(", "D", ")", "beads", "was", "inhibited", "by", "Ned", "-", "19", "(", "B", ")", "and", "in", "BMDMs", "from", "Tpcn", "-", "/", "-", "mice", "compared", "to", "WT", "(", "n", "=", "134", "-", "280", "cells", ")", ".", "(", "E", ")", "Phagocytosis", "of", "3", "-", "µm", "beads", "was", "unchanged", "in", "MCOLN1", "-", "/", "-", "BMDMs", ",", "but", "was", "impaired", "using", "6", "-", "µm", "beads", "(", "F", ")", ",", "n", "=", "89", "-", "157", ".", "Heterologous", "expression", "of", "mouse", "TPCs", "tagged", "with", "TagRFP", "-", "T", "(", "in", "red", ")", "rescues", "the", "phagocytic", "defect", "of", "Tpcn1", "-", "/", "-", "and", "Tpcn2", "-", "/", "-", "BMDM", ",", "but", "a", "pore", "-", "dead", "TPC2", "-", "mutant", "(", "N257A", ")", "does", "not", ",", "n", "=", "39", "-", "94", ".", "Images", "taken", "40", "min", "post", "-", "3", "-", "μm", "bead", "addition", ".", "Raising", "cytosolic", "Ca2", "+", "with", "ionomycin", "(", "1", "μM", ")", "rescues", "the", "Tpcn1", "-", "/", "-", "and", "Tpcn2", "-", "/", "-", "phagocytic", "defect", ",", "whilst", "UTP", "(", "100", "μM", ")", "and", "ML", "-", "SA1", "(", "50", "μM", ")", "only", "weakly", "rescue", "(", "n", "=", "84", "-", "192", "cells", ")", "."], "labels": ["O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 2 The Ca2+ signal elicited by frustrated phagocytosis was significantly reduced in Ned-19 (10 μM)-treated WT and in all TPC-KO BMDMs; maximum Ca2+ amplitude, expressed as a percentage of WT control (n = 314-641 cells). Phagocytosis of opsonized 3-µm (B and C) and 6-μm (D) beads was inhibited by Ned-19 (B) and in BMDMs from Tpcn-/- mice compared to WT (n = 134-280 cells).(E) Phagocytosis of 3-µm beads was unchanged in MCOLN1-/- BMDMs, but was impaired using 6-µm beads (F), n = 89-157.Heterologous expression of mouse TPCs tagged with TagRFP-T (in red) rescues the phagocytic defect of Tpcn1-/- and Tpcn2-/- BMDM, but a pore-dead TPC2-mutant (N257A) does not, n = 39-94. Images taken 40 min post- 3-μm bead addition.Raising cytosolic Ca2+ with ionomycin (1 μM) rescues the Tpcn1-/- and Tpcn2-/- phagocytic defect, whilst UTP (100 μM) and ML-SA1 (50 μM) only weakly rescue (n = 84-192 cells)."}
{"words": ["Figure", "3Internalization", "of", "bacteria", "is", "reduced", "in", "Tpcn", "-", "/", "-", "BMDM", ",", "as", "assessed", "by", "single", "-", "cell", "imaging", "of", "BMDM", "allowed", "to", "internalise", "M", ".", "smegmatis", "tagged", "with", "mCherry", "(", "in", "red", ")", "for", "1", "h", ".", "Internalization", "of", "bacteria", "assessed", "discontinuously", "in", "BMDM", "populations", ":", "(", "B", ")", "The", "resultant", "growth", "of", "bacteria", "colonies", "on", "agar", "plates", "following", "lysis", "of", "BMDM", "infected", "with", "M", ".", "smegmatis", "and", "(", "C", ")", "quantification", "of", "colony", "forming", "units", "(", "CFU", ")", "expressed", "as", "a", "percentage", "of", "WT", "control", "(", "n", "=", "12", ")", ";", "Real", "-", "time", "internalization", "of", "fluorescent", "bacteria", "into", "BMDM", "populations", ":", "(", "D", ")", "Relative", "Fluorescence", "Units", "(", "RFU", ")", "of", "internalised", "mCherry", "-", "tagged", "M", ".", "smegmatis", "(", "E", ")", "and", "mCherry", "-", "tagged", "BCG", "over", "time", ",", "read", "using", "a", "plate", "reader", "(", "n", "=", "8", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 3Internalization of bacteria is reduced in Tpcn-/- BMDM, as assessed by single-cell imaging of BMDM allowed to internalise M. smegmatis tagged with mCherry (in red) for 1 h. Internalization of bacteria assessed discontinuously in BMDM populations: (B) The resultant growth of bacteria colonies on agar plates following lysis of BMDM infected with M. smegmatis and (C) quantification of colony forming units (CFU) expressed as a percentage of WT control (n = 12);Real-time internalization of fluorescent bacteria into BMDM populations: (D) Relative Fluorescence Units (RFU) of internalised mCherry-tagged M. smegmatis (E) and mCherry-tagged BCG over time, read using a plate reader (n = 8)."}
{"words": ["Figure", "4BMDMs", "were", "co", "-", "loaded", "with", "2", "µM", "Calbryte590", "/", "AM", "(", "50", "min", ")", "and", "200", "nM", "Lysotracker", "Green", "(", "LTG", ",", "5", "min", ")", "and", ",", "at", "room", "temperature", ",", "presented", "with", "3", "-", "µm", "opsonized", "beads", "labelled", "with", "Alexa", "Fluor", "647", "(", "blue", ")", ".", "A", "three", "-", "channel", "image", "was", "recorded", "every", "10", "s", ".", "The", "LTG", "brightness", "has", "been", "enhanced", "post", "hoc", "to", "visualize", "the", "dimmer", ",", "peripheral", "lysosomes", ".", "Time", "Zero", "is", "defined", "as", "the", "frame", "when", "the", "first", "Ca2", "+", "signal", "was", "observed", ".", "(", "A", ")", "Images", "represent", "Ca2", "+", "responses", "or", "an", "overlay", "of", "LTG", "and", "bead", "fluorescence", ".", "Times", "of", "each", "image", "are", "relative", "to", "the", "first", "Ca2", "+", "spike", ".", "(", "B", ")", "Enlargement", "of", "the", "first", "contact", "point", "between", "lysosomes", "and", "bead", "(", "red", "arrow", ")", "as", "depicted", "by", "the", "dashed", "box", ",", "80", "s", "post", "-", "Ca2", "+", ".", "(", "C", ")", "Whole", "-", "cell", "Ca2", "+", "responses", "from", "the", "cell", "in", "A", ".", "(", "D", ")", "Collation", "of", "the", "post", "-", "Ca2", "+", "contact", "time", ",", "displayed", "as", "a", "scatter", "plot", "of", "individual", "cells", "and", "the", "mean", "±", "S", ".", "E", ".", "M", ".", "(", "n", "=", "27", "cells", ")", ".", "RAW246", ".", "7", "cells", "were", "transfected", "with", "either", "TPC1", "-", "TagRFP", "-", "T", "or", "TPC2", "-", "TagRFP", "-", "T", "(", "red", ")", "and", "presented", "with", "3", "-", "µm", "opsonized", "beads", "labelled", "with", "Alexa", "Fluor", "647", "(", "blue", ")", ".", "Acute", "time", "-", "series", "of", "bead", "engagement", "were", "collected", ".", "Contact", "between", "TPCs", "and", "beads", "are", "depicted", "in", "the", "time", "-", "stamped", "micrographs", ",", "where", "time", "is", "arbitrary", "after", "the", "start", "of", "the", "image", "stack", "(", "E", ",", "F", ")", "i", ".", "e", ".", "110", "s", "is", "still", "prior", "to", "engagement", ".", "The", "spatial", "relationship", "between", "TPCs", "and", "beads", "was", "quantified", "using", "a", "target", "graticule", "of", "0", ".", "5", "-", "µm", "bands", "centred", "on", "the", "engulfed", "bead", ";", "the", "mean", "fluorescence", "within", "each", "band", "was", "normalized", "to", "the", "fluorescence", "of", "the", "maximum", "band", "and", "plotted", "against", "this", "radial", "distance", "(", "G", ",", "H", ")", ";", "n", "=", "35", "-", "36", "cells", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 4BMDMs were co-loaded with 2 µM Calbryte590/AM (50 min) and 200 nM Lysotracker Green (LTG, 5 min) and, at room temperature, presented with 3-µm opsonized beads labelled with Alexa Fluor 647 (blue). A three-channel image was recorded every 10 s. The LTG brightness has been enhanced post hoc to visualize the dimmer, peripheral lysosomes. Time Zero is defined as the frame when the first Ca2+ signal was observed. (A) Images represent Ca2+ responses or an overlay of LTG and bead fluorescence. Times of each image are relative to the first Ca2+ spike. (B) Enlargement of the first contact point between lysosomes and bead (red arrow) as depicted by the dashed box, 80 s post-Ca2+. (C) Whole-cell Ca2+ responses from the cell in A. (D) Collation of the post-Ca2+ contact time, displayed as a scatter plot of individual cells and the mean ± S.E.M. (n = 27 cells).RAW246.7 cells were transfected with either TPC1-TagRFP-T or TPC2-TagRFP-T (red) and presented with 3-µm opsonized beads labelled with Alexa Fluor 647 (blue). Acute time-series of bead engagement were collected. Contact between TPCs and beads are depicted in the time-stamped micrographs, where time is arbitrary after the start of the image stack (E,F) i.e. 110 s is still prior to engagement. The spatial relationship between TPCs and beads was quantified using a target graticule of 0.5-µm bands centred on the engulfed bead; the mean fluorescence within each band was normalized to the fluorescence of the maximum band and plotted against this radial distance (G,H); n = 35-36 cells."}
{"words": ["Figure", "5RAW", "247", ".", "6", "macrophages", "loaded", "with", "a", "cytosolic", "chemical", "dye", "(", "Cyto", "dye", ")", "to", "detect", "global", "cytosolic", "Ca2", "+", ",", "and", "heterologously", "expressing", "(", "B", ")", "TPC1", "-", "G", "-", "GECO1", ".", "2", "(", "TPC1", "-", "GG", ")", "or", "(", "C", "-", "E", ")", "TPC2", "-", "G", "-", "GECO1", ".", "2", "(", "TPC2", "-", "GG", ")", "to", "detect", "peri", "-", "endo", "-", "lysosomal", "Ca2", "+", "domains", ",", "which", "were", "not", "detected", "by", "(", "F", ")", "a", "TPC2", "mutant", "(", "D276K", ")", "-", "G", "-", "GECO1", ".", "2", "that", "blocks", "ion", "permeation", "or", "(", "A", ")", "unfused", "cytosolic", "G", "-", "GECO1", ".", "2", "(", "Cyto", "GG", ")", ".", "(", "A", "-", "F", ")", "Single", "-", "cell", "Ca2", "+", "traces", "upon", "FcγR", "activation", "by", "opsonized", "3", "-", "μm", "beads", "in", "-", "Ca2", "+", "o", "expressed", "as", "a", "percentage", "of", "the", "maximum", "fluorescence", "of", "the", "indicator", ",", "determined", "by", "adding", "2", "μM", "ionomycin", "and", "10", "mM", "CaCl2", "at", "the", "end", "of", "each", "experiment", "(", "%", "Fmax", ")", "(", "D", ")", "TPC2", "-", "G", "-", "GECO1", ".", "2", "activity", "was", "inhibited", "by", "10", "µM", "Ned", "-", "19", ",", "but", "was", "unaffected", "by", "(", "E", ")", "chelating", "global", "Ca2", "+", "with", "EGTA", "/", "AM", "(", "100", "μM", "for", "2", "min", "prior", "to", "bead", "addition", ")", ".", "Summary", "data", "of", "the", "first", "spike", "from", "cells", "A", "-", "F", "(", "subsequent", "spikes", "show", "the", "same", "pattern", ";", "Appendix", "Fig", ".", "S4B", ")", ",", "n", "=", "87", "-", "274", "cells", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "Cyto", "GG", ",", "#", "#", "#", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "TPC2", "-", "GG", "ctrl", ",", "†", "†", "†", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "Cyto", "GG", ".", "Fusion", "of", "G", "-", "GECO1", ".", "2", "to", "TPC2", "did", "not", "alter", "the", "affinity", "of", "G", "-", "GECO1", ".", "2", "for", "Ca2", "+", "determined", "in", "permeabilized", "cells", "(", "n", "=", "34", "-", "71", "cells", ")", ".", "(", "I", ")", "Single", "-", "cell", "Ca2", "+", "traces", "upon", "FcγR", "activation", "by", "opsonized", "3", "-", "μm", "beads", "in", "-", "Ca2", "+", "o", "expressed", "as", "a", "percentage", "of", "Fmax", ".", "(", "I", ",", "J", ")", "Pre", "-", "emptying", "the", "ER", "stores", "with", "CPA", "or", "thapsigargin", "(", "Tg", ")", "abolished", "the", "global", "cytosolic", "Ca2", "+", "response", "evoked", "by", "beads", ",", "but", "a", "TPC2", "-", "G", "‑", "GECO1", ".", "2", "component", "remained", ",", "n", "=", "17", "-", "121", "cells", ".", "No", "local", "Ca2", "+", "signal", "was", "detected", "with", "TPC2", "-", "G", "-", "GECO1", ".", "2", "when", "Ca2", "+", "spiking", "was", "evoked", "by", "ER", "-", "Ca2", "+", "release", "with", "100", "μM", "UTP", "(", "K", ",", "L", ")", "or", "10", "μM", "CPA", "(", "M", ")", ";", "only", "a", "bystander", "response", "equivalent", "to", "unfused", "cytosolic", "G", "-", "GECO1", ".", "2", "was", "detected", "(", "n", "=", "121", "-", "182", "cells", ";", "*", "P", "<", "0", ".", "05", ")", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5RAW 247.6 macrophages loaded with a cytosolic chemical dye (Cyto dye) to detect global cytosolic Ca2+, and heterologously expressing (B) TPC1-G-GECO1.2 (TPC1-GG) or (C-E) TPC2-G-GECO1.2 (TPC2-GG) to detect peri-endo-lysosomal Ca2+ domains, which were not detected by (F) a TPC2 mutant (D276K)-G-GECO1.2 that blocks ion permeation or (A) unfused cytosolic G-GECO1.2 (Cyto GG). (A-F) Single-cell Ca2+ traces upon FcγR activation by opsonized 3-μm beads in -Ca2+o expressed as a percentage of the maximum fluorescence of the indicator, determined by adding 2 μM ionomycin and 10 mM CaCl2 at the end of each experiment (% Fmax) (D) TPC2-G-GECO1.2 activity was inhibited by 10 µM Ned-19, but was unaffected by (E) chelating global Ca2+ with EGTA/AM (100 μM for 2 min prior to bead addition). Summary data of the first spike from cells A-F (subsequent spikes show the same pattern; Appendix Fig. S4B), n = 87-274 cells; ***P<0.001 vs Cyto GG, ### P<0.001 vs TPC2-GG ctrl, ††† P<0.001 vs Cyto GG. Fusion of G-GECO1.2 to TPC2 did not alter the affinity of G-GECO1.2 for Ca2+ determined in permeabilized cells (n = 34-71 cells).(I) Single-cell Ca2+ traces upon FcγR activation by opsonized 3-μm beads in -Ca2+o expressed as a percentage of Fmax. (I, J) Pre-emptying the ER stores with CPA or thapsigargin (Tg) abolished the global cytosolic Ca2+ response evoked by beads, but a TPC2-G‑GECO1.2 component remained, n = 17 - 121 cells.No local Ca2+ signal was detected with TPC2-G-GECO1.2 when Ca2+ spiking was evoked by ER-Ca2+ release with 100 μM UTP (K, L) or 10 μM CPA (M); only a bystander response equivalent to unfused cytosolic G-GECO1.2 was detected (n = 121-182 cells; *P<0.05)."}
{"words": ["Figure", "6Translocation", "of", "CB", ",", "a", "non", "-", "Ca2", "+", "binding", "CB", "mutant", "(", "CB", "mut", ")", "or", "a", "triple", "mTagBFP2", "(", "BFP", ")", "to", "the", "lysosome", "(", "LAMP1", ")", ",", "as", "indicated", "by", "the", "increase", "in", "the", "Pearson", "'", "s", "correlation", "coefficient", "was", "induced", "by", "250", "nM", "rapalog", "(", "30", "mins", ")", "compared", "with", "ethanol", "(", "EtOH", ")", "control", "-", "treated", "RAW", "247", ".", "6", "cells", ".", "n", "=", "11", "-", "25", "cells", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Images", "of", "a", "single", "RAW", "247", ".", "6", "cell", "displaying", "yellow", "puncta", "indicative", "of", "successful", "re", "-", "positioning", "of", "CB", "(", "in", "green", ")", "to", "the", "lysosome", "(", "in", "red", ")", "in", "the", "presence", "of", "rapalog", "but", "not", "EtOH", ".", "When", "CB", "was", "brought", "to", "the", "lysosome", "(", "+", "rapalog", ")", "uptake", "of", "beads", "was", "inhibited", ",", "whilst", "the", "non", "-", "Ca2", "+", "binding", "CB", "(", "CB", "mut", ";", "n", "=", "46", "-", "187", "cells", ")", "or", "triple", "mTagBFP2", "(", "BFP", ";", "n", "=", "38", "-", "52", "cells", ")", "did", "not", "block", "phagocytosis", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Bead", "uptake", "in", "BMDMs", "with", "and", "without", "loading", "of", "25", "µM", "EGTA", "/", "AM", "and", "10", "μM", "Ned", "-", "19", ".", "EGTA", "-", "insensitive", "phagocytosis", "of", "beads", "was", "inhibited", "by", "Ned", "-", "19", "(", "n", "=", "75", "-", "102", "cells", ")", "in", "WT", "BMDM", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "RAW", "247", ".", "6", "macrophages", "expressing", "cytosolic", "G", "-", "GECO1", ".", "2", "(", "Cyto", "GG", ")", ",", "TPC2", "-", "G", "-", "GECO1", ".", "2", "(", "TPC2", "-", "GG", ")", "or", "TRPML1", "-", "G", "-", "GECO1", ".", "2", "(", "TRPML1", "-", "GG", ")", ".", "(", "F", ")", "Single", "-", "cell", "Ca2", "+", "traces", "upon", "FcγR", "activation", "by", "opsonized", "3", "-", "μm", "or", "6", "-", "μm", "beads", "in", "-", "Ca2", "+", "o", "expressed", "as", "a", "percentage", "of", "the", "maximum", "indicator", "fluorescence", "(", "%", "Fmax", "=", "2", "μM", "ionomycin", "and", "10", "mM", "CaCl2", ")", ".", "(", "G", ")", "Summary", "of", "first", "Ca2", "+", "spike", ";", "n", "=", "69", "-", "121", "(", "3", "-", "μm", "bead", ")", ",", "22", "-", "46", "(", "6", "-", "μm", "beads", ")", "cells", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", "vs", "Cyto", "GG", ",", "#", "#", "#", "P", "<", "0", ".", "001", "TPC2", "-", "GG", "vs", "TRPML1", "-", "GG", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6Translocation of CB, a non-Ca2+ binding CB mutant (CB mut) or a triple mTagBFP2 (BFP) to the lysosome (LAMP1), as indicated by the increase in the Pearson's correlation coefficient was induced by 250 nM rapalog (30 mins) compared with ethanol (EtOH) control-treated RAW 247.6 cells. n = 11-25 cells; ***P<0.001.Images of a single RAW 247.6 cell displaying yellow puncta indicative of successful re-positioning of CB (in green) to the lysosome (in red) in the presence of rapalog but not EtOH.When CB was brought to the lysosome (+rapalog) uptake of beads was inhibited, whilst the non-Ca2+ binding CB (CB mut; n = 46-187 cells) or triple mTagBFP2 (BFP; n = 38-52 cells) did not block phagocytosis;***P<0.001.Bead uptake in BMDMs with and without loading of 25 µM EGTA/AM and 10 μM Ned-19. EGTA-insensitive phagocytosis of beads was inhibited by Ned-19 (n= 75-102 cells) in WT BMDM; ***P<0.001.RAW 247.6 macrophages expressing cytosolic G-GECO1.2 (Cyto GG), TPC2-G-GECO1.2 (TPC2-GG) or TRPML1-G-GECO1.2 (TRPML1-GG). (F) Single-cell Ca2+ traces upon FcγR activation by opsonized 3-μm or 6-μm beads in -Ca2+o expressed as a percentage of the maximum indicator fluorescence (% Fmax = 2 μM ionomycin and 10 mM CaCl2). (G) Summary of first Ca2+ spike; n = 69-121 (3-μm bead), 22-46 (6-μm beads) cells; ***P<0.001, **P<0.01 vs Cyto GG, ### P<0.001 TPC2-GG vs TRPML1-GG."}
{"words": ["Figure", "7Dynamin", "inhibitors", "(", "80", "μM", "Dynasore", "or", "20", "μM", "Dyngo", "-", "4a", ")", "inhibit", "phagocytosis", "of", "opsonized", "3", "-", "μm", "beads", "in", "WT", "BMDM", ";", "n", "=", "101", "-", "149", "cells", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Rescue", "of", "the", "TPC", "-", "KO", "dynamin", "defect", "by", "the", "dynamin", "activator", ",", "Ryngo", "-", "1", "-", "23", "(", "80", "μM", ")", ":", "mean", "number", "of", "internalised", "beads", "per", "cell", "as", "a", "percentage", "of", "the", "WT", "control", ";", "n", "=", "128", "-", "241", "cells", ",", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "In", "WT", "BMDM", ",", "expression", "of", "a", "dominant", "-", "negative", "dynamin", "-", "2", "mutant", "(", "Dyn2", "K44A", ")", "reduced", "phagocytosis", "(", "n", "=", "68", "-", "184", ")", ".", "Expression", "of", "wildtype", "dynamin", "-", "2", "(", "Dyn2", ")", "or", "constitutively", "active", "dynamin", "-", "2", "(", "S764A", "mutant", ",", "mimicking", "the", "dephosphorylated", "state", ")", "in", "Tpcn1", "-", "/", "-", "macrophages", "restored", "phagocytosis", "of", "3", "-", "μm", "beads", "after", "10", "min", ",", "n", "=", "10", "-", "76", "cells", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "WT", "control", ",", "#", "#", "#", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "Tpcn1", "-", "/", "-", "control", ".", "Single", "WT", "BMDM", "expressing", "HA", "-", "tagged", "dynamin", "-", "2", "(", "immunolabelled", "with", "anti", "-", "HA", ",", "in", "red", ")", "undergoing", "phagocytosis", "of", "IgG", "-", "3", "-", "μm", "beads", "(", "blue", ")", ".", "Images", "were", "taken", "10", "or", "30", "min", "post", "-", "addition", "of", "beads", ";", "actin", "(", "green", ")", "labelled", "with", "Phalloidin", "Alexa", "488", ".", "Calcineurin", "inhibitors", ",", "FK506", "(", "10", "μM", ")", "or", "cyclosporin", "A", "(", "CsA", ",", "10", "μM", ")", "inhibited", "phagocytosis", "in", "WT", "cells", ",", "n", "=", "65", "-", "159", "cells", ".", "Ryngo", "(", "80", "μM", ")", "rescued", "phagocytosis", "defects", "in", "Tpcn1", "-", "/", "-", "BMDM", "even", "in", "the", "presence", "of", "FK506", "or", "CsA", ",", "n", "=", "103", "-", "208", "cells", ".", "Calcineurin", "activity", "and", "cytosolic", "Ca2", "+", "responses", "simultaneously", "monitored", "in", "single", "RAW", "247", ".", "6", "using", "CaNAR2", "and", "jRGECO1a", ",", "respectively", ",", "upon", "addition", "of", "3", "-", "μm", "beads", ".", "CaNAR2", "signals", "(", "FRET", "Y", "/", "C", ")", "were", "inhibited", "by", "FK506", "(", "10", "μM", ")", "and", "Ned", "-", "19", "(", "10", "μM", ")", ";", "(", "H", ")", "single", "-", "cell", "traces", "and", "(", "I", ")", "mean", "maximum", "responses", ".", "n", "=", "65", "-", "169", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "vs", "control", ".", "Phagocytosis", "induced", "dephosphorylation", "of", "dynamin", "-", "2", "(", "ratio", "of", "phospho", "-", "dynamin", "to", "total", "dynamin", "-", "2", "expressed", "as", "a", "percentage", "of", "WT", "at", "time", "zero", ")", "in", "WT", "BMDM", ",", "but", "not", "in", "Tpcn1", "-", "/", "-", "BMDM", ";", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "01", ",", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "(", "time", "-", "point", "matched", "unpaired", "t", "-", "test", ")", "n", "=", "10", "-", "15", ".", "Measured", "using", "in", "-", "cell", "western", "assay", ",", "representative", "wells", "of", "plate", "image", ":", "total", "dyn2", "(", "red", ")", "and", "phospho", "-", "dyn2", "(", "green", ")", ".", "See", "also", "Appendix", "Figures", "S6", "and", "S7", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7Dynamin inhibitors (80 μM Dynasore or 20 μM Dyngo-4a) inhibit phagocytosis of opsonized 3-μm beads in WT BMDM; n = 101-149 cells, ***P<0.001.Rescue of the TPC-KO dynamin defect by the dynamin activator, Ryngo-1-23 (80 μM): mean number of internalised beads per cell as a percentage of the WT control; n = 128-241 cells, **P<0.01, ***P<0.001.In WT BMDM, expression of a dominant-negative dynamin-2 mutant (Dyn2 K44A) reduced phagocytosis (n = 68-184). Expression of wildtype dynamin-2 (Dyn2) or constitutively active dynamin-2 (S764A mutant, mimicking the dephosphorylated state) in Tpcn1-/- macrophages restored phagocytosis of 3-μm beads after 10 min, n = 10-76 cells; ***P<0.001 vs WT control, ### P<0.001 vs Tpcn1-/- control.Single WT BMDM expressing HA-tagged dynamin-2 (immunolabelled with anti-HA, in red) undergoing phagocytosis of IgG-3-μm beads (blue). Images were taken 10 or 30 min post-addition of beads; actin (green) labelled with Phalloidin Alexa 488.Calcineurin inhibitors, FK506 (10 μM) or cyclosporin A (CsA, 10 μM) inhibited phagocytosis in WT cells, n = 65-159 cells. Ryngo (80 μM) rescued phagocytosis defects in Tpcn1-/- BMDM even in the presence of FK506 or CsA, n = 103-208 cells.Calcineurin activity and cytosolic Ca2+ responses simultaneously monitored in single RAW 247.6 using CaNAR2 and jRGECO1a, respectively, upon addition of 3-μm beads. CaNAR2 signals (FRET Y/C) were inhibited by FK506 (10 μM) and Ned-19 (10 μM); (H) single-cell traces and (I) mean maximum responses. n = 65-169; ***P<0.001 vs control.Phagocytosis induced dephosphorylation of dynamin-2 (ratio of phospho-dynamin to total dynamin-2 expressed as a percentage of WT at time zero) in WT BMDM, but not in Tpcn1-/- BMDM; **P<0.01, ***P<0.001 (time-point matched unpaired t-test) n = 10-15. Measured using in-cell western assay, representative wells of plate image: total dyn2 (red) and phospho-dyn2 (green). See also Appendix Figures S6 and S7."}
{"words": ["Figure", "8RAW", "246", ".", "7", "macrophages", "expressing", "the", "dynein", "-", "binding", "protein", "(", "mTagBFP2", "-", "BicD2", "-", "FKBP12", ")", "for", "rapalog", "-", "induced", "lysosome", "repositioning", "to", "the", "MTOC", ",", "also", "co", "-", "expressed", "HsLAMP1", "-", "mCherry", "with", "or", "without", "a", "C", "-", "terminal", "FRB", "*", "(", "LAMP", "-", "FRB", "*", "or", "LAMP", ",", "in", "red", ")", ".", "Cells", "were", "treated", "with", "0", ".", "1", "%", "ethanol", "or", "250", "nM", "rapalog", "for", "2", "h", ".", "Only", "the", "tripartite", "complex", "of", "FKBP12", "-", "rapalog", "-", "FRB", "induced", "clustering", "of", "lysosomes", "at", "the", "MTOC", "(", "A", ",", "B", ")", ".", "This", "clustering", "was", "selective", "for", "lysosomes", "because", "ER", "and", "mitochondria", "(", "KDEL", "-", "GFP", "and", "MitoTracker", "Green", ")", "were", "not", "affected", "(", "C", ")", ".", "(", "A", ",", "B", ")", "Phagocytosis", "of", "IgG", "-", "3", "-", "μm", "beads", "was", "reduced", "by", "immobilizing", "lysosomes", "at", "the", "MTOC", ",", "n", "=", "80", "-", "564", "cells", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", ".", "Activation", "of", "dynamin", "-", "2", "with", "Ryngo", "1", "-", "23", "or", "expression", "of", "constitutively", "active", "dynamin", "-", "2", "(", "S764A", "mutant", ",", "expression", "confirmed", "by", "the", "grayscale", "image", ")", "restored", "phagocytosis", "of", "IgG", "-", "3", "-", "μm", "beads", "(", "n", "=", "34", "-", "51", "cells", ")", ",", "but", "had", "no", "effect", "on", "the", "phagocytosis", "of", "IgG", "-", "6", "-", "μm", "beads", ",", "n", "=", "36", "-", "72", "cells", "(", "E", ")", ";", "*", "*", "*", "P", "<", "0", ".", "001", "EtOH", "Ctrl", "vs", "rapalog", "Ctrl", ",", "#", "#", "#", "P", "<", "0", ".", "001", "rapalog", "Ctrl", "vs", "rapalog", "Ryngo", "/", "Dyn2S764A", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8RAW 246.7 macrophages expressing the dynein-binding protein (mTagBFP2-BicD2-FKBP12) for rapalog-induced lysosome repositioning to the MTOC, also co-expressed HsLAMP1-mCherry with or without a C-terminal FRB* (LAMP-FRB* or LAMP, in red). Cells were treated with 0.1% ethanol or 250 nM rapalog for 2 h. Only the tripartite complex of FKBP12-rapalog-FRB induced clustering of lysosomes at the MTOC (A, B). This clustering was selective for lysosomes because ER and mitochondria (KDEL-GFP and MitoTracker Green) were not affected (C). (A, B) Phagocytosis of IgG-3-μm beads was reduced by immobilizing lysosomes at the MTOC, n = 80-564 cells; ***P<0.001.Activation of dynamin-2 with Ryngo 1-23 or expression of constitutively active dynamin-2 (S764A mutant, expression confirmed by the grayscale image) restored phagocytosis of IgG-3-μm beads (n = 34-51 cells), but had no effect on the phagocytosis of IgG-6-μm beads, n = 36-72 cells (E); ***P<0.001 EtOH Ctrl vs rapalog Ctrl, ###P<0.001 rapalog Ctrl vs rapalog Ryngo/Dyn2S764A."}
{"words": ["figf2", "(", "a", ")", "Relative", "CK2α", "protein", "concentration", "over", "time", "following", "cytoplasmic", "microinjection", "of", "REF52", "cells", "with", "the", "HA", "-", "tagged", "semisynthetic", "proteins", "bearing", "different", "modifications", "using", "immunocytochemistry", "with", "HA", "-", "specific", "antibody", ".", "Data", "represent", "mean", "values", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "b", ")", "Relative", "CK2α", "protein", "concentration", "following", "injection", "of", "β", "subunit", "together", "with", "CK2α", "proteins", ".", "Data", "represent", "mean", "values", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "c", ")", "Relative", "CK2α", "protein", "concentration", "following", "injection", "of", "proteasome", "inhibitor", "(", "1", "μM", "MG132", ")", "together", "with", "unmodified", "CK2α", "protein", ".", "Data", "represent", "mean", "values", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "d", ")", "Western", "blot", "for", "total", "CK2α", "protein", "in", "HeLa", "cells", "following", "treatment", "with", "Cdk", "inhibitors", ".", "Numbers", "indicate", "relative", "quantification", "normalized", "for", "loading", "control", ".", "Mean", "values", "(", "n", "=", "3", ")", "shown", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "e", ")", "Western", "blot", "for", "total", "CK2α", "protein", "in", "HeLa", "cells", "following", "treatment", "with", "nocodazole", "to", "arrest", "cells", "in", "mitosis", ".", "Full", "gels", "corresponding", "to", "those", "in", "panels", "d", "and", "e", "are", "in", "Supplementary", "Figure", "8", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf2(a) Relative CK2α protein concentration over time following cytoplasmic microinjection of REF52 cells with the HA-tagged semisynthetic proteins bearing different modifications using immunocytochemistry with HA-specific antibody. Data represent mean values ± s.d. (b) Relative CK2α protein concentration following injection of β subunit together with CK2α proteins. Data represent mean values ± s.d. (c) Relative CK2α protein concentration following injection of proteasome inhibitor (1 μM MG132) together with unmodified CK2α protein. Data represent mean values ± s.d.(d) Western blot for total CK2α protein in HeLa cells following treatment with Cdk inhibitors. Numbers indicate relative quantification normalized for loading control. Mean values (n = 3) shown ± s.d.(e) Western blot for total CK2α protein in HeLa cells following treatment with nocodazole to arrest cells in mitosis. Full gels corresponding to those in panels d and e are in Supplementary Figure 8."}
{"words": ["figf3", "(", "a", ")", "Pull", "-", "down", "experiments", "with", "semisynthetic", "HA", "-", "CK2α", "protein", "and", "recombinant", "Pin1", ".", "CK2α", "was", "immobilized", "using", "HA", "-", "specific", "(", "anti", "-", "HA", ")", "antibodies", "bound", "to", "protein", "G", "beads", ".", "Pin1", "was", "incubated", "with", "immobilized", "CK2α", "for", "20", "min", "at", "4", "°", "C", ".", "(", "b", ")", "Coimmunoprecipitation", "of", "endogenous", "Pin1", "with", "CK2α", ".", "Pfa", "-", "containing", "and", "unmodified", "semisynthetic", "HA", "-", "CK2α", "proteins", "were", "spiked", "into", "REF52", "cell", "lysates", "and", "immobilized", "using", "HA", "-", "specific", "antibodies", ".", "Input", "samples", "are", "shown", "for", "loading", "control", ".", "(", "c", ")", "Pull", "-", "down", "experiments", "with", "Pfa344", "HA", "-", "CK2α", "protein", "and", "recombinant", "Pin1", "in", "the", "presence", "of", "Pin1", "-", "specific", "or", "nonspecific", "IgY", ".", "(", "d", ")", "Relative", "CK2α", "protein", "concentration", "over", "time", "following", "microinjection", "of", "Pfa344", "CK2α", "with", "Pin1", "-", "specific", "IgY", "or", "nonspecific", "IgY", "(", "control", ")", ".", "Data", "represent", "mean", "values", "±", "s", ".", "d", ".", "Full", "gels", "corresponding", "to", "those", "in", "panels", "a", "-", "c", "are", "in", "Supplementary", "Figures", "10", "and", "11", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf3(a) Pull-down experiments with semisynthetic HA-CK2α protein and recombinant Pin1. CK2α was immobilized using HA-specific (anti-HA) antibodies bound to protein G beads. Pin1 was incubated with immobilized CK2α for 20 min at 4 °C.(b) Coimmunoprecipitation of endogenous Pin1 with CK2α. Pfa-containing and unmodified semisynthetic HA-CK2α proteins were spiked into REF52 cell lysates and immobilized using HA-specific antibodies. Input samples are shown for loading control.(c) Pull-down experiments with Pfa344 HA-CK2α protein and recombinant Pin1 in the presence of Pin1-specific or nonspecific IgY.(d) Relative CK2α protein concentration over time following microinjection of Pfa344 CK2α with Pin1-specific IgY or nonspecific IgY (control). Data represent mean values ± s.d. Full gels corresponding to those in panels a-c are in Supplementary Figures 10 and 11."}
{"words": ["figf4", "(", "a", ")", "Phosphorylation", "of", "C", "-", "terminal", "tail", "CK2α", "peptides", "(", "residues", "337", "-", "352", ")", "by", "Cdk1", "-", "cyclin", "B", ".", "In", "vitro", "Cdk1", "-", "cyclin", "B", "kinase", "assays", "were", "performed", "using", "the", "following", "peptide", "substrate", ":", "SSMPGGSTPVXSANMMK", "(", "εBiotin", ")", ",", "where", "X", "=", "serine", "or", "S", "-", "GlcNAc", "serine", ".", "After", "reactions", "were", "quenched", ",", "peptides", "were", "separated", "from", "the", "reaction", "mixture", "on", "Tris", "-", "tricine", "gels", ".", "Data", "represent", "mean", "values", "±", "s", ".", "d", ".", "(", "b", ")", "Immunoprecipitation", "and", "western", "blot", "for", "O", "-", "GlcNAc", "CK2α", "in", "HeLa", "cells", "after", "treatment", "with", "the", "O", "-", "GlcNAcase", "inhibitor", "TMG", "for", "12", "h", ".", "Numbers", "indicate", "relative", "quantification", "normalized", "for", "total", "CK2α", "concentrations", ".", "(", "c", ")", "Western", "blot", "for", "total", "CK2α", "protein", "in", "HeLa", "cells", "following", "treatment", "with", "TMG", "for", "12", "h", "or", "16", "h", ".", "Numbers", "indicate", "relative", "quantification", "normalized", "for", "loading", "control", ",", "mean", "values", "(", "n", "=", "4", ")", "shown", "±", "s", ".", "d", ".", "Full", "gels", "corresponding", "to", "those", "in", "panels", "b", "and", "c", "are", "in", "Supplementary", "Figures", "14", "and", "15", "."], "labels": ["O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf4(a) Phosphorylation of C-terminal tail CK2α peptides (residues 337-352) by Cdk1-cyclin B. In vitro Cdk1-cyclin B kinase assays were performed using the following peptide substrate: SSMPGGSTPVXSANMMK(εBiotin), where X = serine or S-GlcNAc serine. After reactions were quenched, peptides were separated from the reaction mixture on Tris-tricine gels. Data represent mean values ± s.d.(b) Immunoprecipitation and western blot for O-GlcNAc CK2α in HeLa cells after treatment with the O-GlcNAcase inhibitor TMG for 12 h. Numbers indicate relative quantification normalized for total CK2α concentrations.(c) Western blot for total CK2α protein in HeLa cells following treatment with TMG for 12 h or 16 h. Numbers indicate relative quantification normalized for loading control, mean values (n = 4) shown ± s.d. Full gels corresponding to those in panels b and c are in Supplementary Figures 14 and 15."}
{"words": ["figf5Phosphorimage", "analysis", "of", "in", "vitro", "CK2", "kinase", "assays", "with", "protein", "substrates", ".", "All", "reactions", "were", "performed", "at", "30", "°", "C", ".", "Numbers", "indicate", "the", "concentration", "(", "nM", ")", "of", "product", "for", "each", "kinase", "reaction", ".", "(", "a", ")", "AHCYL2", "substrate", "(", "25", "ng", "μl", "−", "1", ")", "with", "100", "μM", "ATP", "and", "10", "nM", "CK2α", "±", "11", "nM", "CK2β", "for", "6", "min", ".", "(", "b", ")", "NAP1L3", "substrate", "(", "15", "ng", "μl", "−", "1", ")", "with", "100", "μM", "ATP", "and", "10", "nM", "CK2α", "±", "11", "nM", "CK2β", "for", "6", "min", ".", "(", "c", ")", "NIPBL", "substrate", "(", "50", "ng", "μl", "−", "1", ")", "with", "100", "μM", "ATP", "and", "5", "nM", "CK2α", "±", "11", "nM", "Pin1", "for", "5", "min", ".", "Full", "gels", "corresponding", "to", "those", "in", "panels", "a", "-", "c", "are", "in", "Supplementary", "Figures", "19", "and", "25", "."], "labels": ["B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "figf5Phosphorimage analysis of in vitro CK2 kinase assays with protein substrates. All reactions were performed at 30 °C. Numbers indicate the concentration (nM) of product for each kinase reaction. (a) AHCYL2 substrate (25 ng μl−1) with 100 μM ATP and 10 nM CK2α ± 11 nM CK2β for 6 min. (b) NAP1L3 substrate (15 ng μl−1) with 100 μM ATP and 10 nM CK2α ± 11 nM CK2β for 6 min. (c) NIPBL substrate (50 ng μl−1) with 100 μM ATP and 5 nM CK2α ± 11 nM Pin1 for 5 min. Full gels corresponding to those in panels a-c are in Supplementary Figures 19 and 25."}
{"words": ["Figure", "5", "(", "B", ")", "Levels", "of", "PIN2", "phosphopeptide", "in", "our", "experiments", ".", "Bars", "represent", "the", "mean", "plus", "standard", "error", "of", "replicates", "(", "2", "biological", "replicates", "for", "nitrate", "treatments", "at", "20", "min", "(", "Col", "-", "0", "roots", ")", "and", "3", "biological", "replicates", "for", "all", "other", "experimental", "conditions", ")", ".", "Each", "independent", "biological", "replicate", "consisted", "of", "a", "pool", "of", "4", ".", "500", "roots", "collected", "from", "Arabidopsis", "plants", "grown", "independently", "under", "the", "same", "experimental", "conditions", ".", "The", "asterisk", "indicates", "statistically", "significant", "differences", "in", "phosphoproteomic", "analysis", "(", "multiple", "t", "-", "test", "comparison", "without", "testing", "corrections", ",", "assuming", "same", "variance", ",", "p", "<", "0", ".", "05", ")", ".", "(", "C", ")", "Detection", "of", "phosphorylation", "PIN2", "by", "Phos", "-", "tag", "Western", "blotting", ".", "Arabidopsis", "plants", "(", "Col", "-", "0", ")", "were", "growth", "in", "ammonium", "as", "only", "nitrogen", "source", ",", "and", "treated", "with", "5", "mM", "KNO3", "or", "5mM", "KCl", "as", "control", ".", "Total", "protein", "from", "roots", "were", "analyzed", "in", "SDS", "PAGE", "using", "Phos", "-", "tag", "to", "detect", "changes", "in", "phosphorylation", "status", ".", "Immunoblotting", "was", "performed", "with", "PIN2", "antibody", ".", "Total", "proteins", "isolated", "from", "eir1", ".", "1", "roots", "were", "used", "as", "a", "negative", "control", ".", "White", "and", "red", "asterisks", "indicate", "a", "slow", "-", "or", "fast", "-", "mobility", "band", "corresponding", "to", "a", "more", "or", "less", "phosphorylated", "PIN2", ",", "respectively", ".", "(", "D", ")", "Western", "blot", "against", "PIN2", "protein", "comparing", "nitrate", "treated", "(", "KNO3", ")", "and", "control", "(", "KCl", ")", "condition", "in", "Arabidopsis", "roots", "for", "all", "genotypes", "(", "eir1", "-", "1", "mutant", "background", "was", "complemented", "with", "PIN2", ":", ":", "PIN2wt", "-", "GFP", "(", "PIN2wt", ")", ",", "PIN2", ":", ":", "PIN2S439D", "-", "GFP", "(", "PIN2S439D", "phospho", "-", "mimic", "point", "mutation", ")", "or", "PIN2", ":", ":", "PIN2S439A", "-", "GFP", "(", "PIN2S439A", ",", "phospho", "-", "null", "point", "mutation", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 5(B) Levels of PIN2 phosphopeptide in our experiments. Bars represent the mean plus standard error of replicates (2 biological replicates for nitrate treatments at 20 min (Col-0 roots) and 3 biological replicates for all other experimental conditions). Each independent biological replicate consisted of a pool of 4.500 roots collected from Arabidopsis plants grown independently under the same experimental conditions. The asterisk indicates statistically significant differences in phosphoproteomic analysis (multiple t-test comparison without testing corrections, assuming same variance, p < 0.05).(C) Detection of phosphorylation PIN2 by Phos-tag Western blotting. Arabidopsis plants (Col-0) were growth in ammonium as only nitrogen source, and treated with 5 mM KNO3 or 5mM KCl as control. Total protein from roots were analyzed in SDS PAGE using Phos-tag to detect changes in phosphorylation status. Immunoblotting was performed with PIN2 antibody. Total proteins isolated from eir1.1 roots were used as a negative control. White and red asterisks indicate a slow- or fast-mobility band corresponding to a more or less phosphorylated PIN2, respectively.(D) Western blot against PIN2 protein comparing nitrate treated (KNO3) and control (KCl) condition in Arabidopsis roots for all genotypes (eir1-1 mutant background was complemented with PIN2::PIN2wt-GFP (PIN2wt), PIN2::PIN2S439D-GFP (PIN2S439D phospho-mimic point mutation) or PIN2::PIN2S439A-GFP (PIN2S439A, phospho-null point mutation)."}
{"words": ["Figure", "6", "(", "A", ")", "Primary", "root", "length", "of", "Col", "-", "0", "wild", "type", "plants", "or", "eir1", "-", "1", "mutant", "plants", "was", "measured", "using", "the", "ImageJ", "program", "3", "days", "after", "5", "mM", "KNO3", "or", "KCl", "treatments", ".", "Tukey", "box", "plot", "show", "results", "from", "3", "independent", "biological", "replicates", "per", "experimental", "condition", "(", "n", "=", "10", "-", "15", "roots", "each", "replicate", ")", ".", "The", "box", "plot", "shows", "the", "data", "within", "the", "interquartile", "range", "(", "25th", "and", "75th", "percentiles", ")", "and", "a", "solid", "black", "line", "represents", "the", "median", ".", "Whiskers", "show", "maximum", "and", "minimum", "values", "no", "further", "than", "1", ".", "5x", "IQR", "(", "interquartile", "range", ")", ".", "Outlier", "data", "are", "plotted", "individually", ".", "Asterisk", "indicates", "statistically", "significant", "difference", "between", "analyzed", "by", "unpaired", ",", "two", "-", "tailed", "and", "assuming", "equal", "variance", "t", "-", "test", "(", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "(", "B", ")", "Number", "of", "initiating", "and", "emerging", "lateral", "roots", "of", "Col", "-", "0", "or", "eir1", "-", "1", "mutant", "plants", "were", "counted", "using", "light", "microscopy", "3", "days", "after", "5", "mM", "KNO3", "or", "KCl", "treatments", ".", "Tukey", "box", "plot", "show", "results", "from", "3", "independent", "biological", "replicates", "per", "experimental", "condition", "(", "n", "=", "10", "-", "15", "roots", "each", "replicate", ")", ".", "The", "box", "plot", "shows", "the", "data", "within", "the", "interquartile", "range", "(", "25th", "and", "75th", "percentiles", ")", "and", "a", "solid", "black", "line", "represents", "the", "median", ".", "Whiskers", "show", "maximum", "and", "minimum", "values", "no", "further", "than", "1", ".", "5x", "IQR", "(", "interquartile", "range", ")", ".", "Asterisk", "indicates", "statistically", "significant", "difference", "between", "analyzed", "by", "unpaired", ",", "two", "-", "tailed", "and", "assuming", "equal", "variance", "t", "-", "test", "(", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 6(A) Primary root length of Col-0 wild type plants or eir1-1 mutant plants was measured using the ImageJ program 3 days after 5 mM KNO3 or KCl treatments. Tukey box plot show results from 3 independent biological replicates per experimental condition (n = 10-15 roots each replicate). The box plot shows the data within the interquartile range (25th and 75th percentiles) and a solid black line represents the median. Whiskers show maximum and minimum values no further than 1.5x IQR (interquartile range). Outlier data are plotted individually. Asterisk indicates statistically significant difference between analyzed by unpaired, two-tailed and assuming equal variance t-test (** p < 0.01).(B) Number of initiating and emerging lateral roots of Col-0 or eir1-1 mutant plants were counted using light microscopy 3 days after 5 mM KNO3 or KCl treatments. Tukey box plot show results from 3 independent biological replicates per experimental condition (n = 10-15 roots each replicate). The box plot shows the data within the interquartile range (25th and 75th percentiles) and a solid black line represents the median. Whiskers show maximum and minimum values no further than 1.5x IQR (interquartile range). Asterisk indicates statistically significant difference between analyzed by unpaired, two-tailed and assuming equal variance t-test (** p < 0.01)."}
{"words": ["Figure", "7", "(", "A", ")", "Primary", "root", "length", "of", "the", "different", "genotypes", "was", "measured", "using", "the", "ImageJ", "program", "3", "days", "after", "5", "mM", "KNO3", "or", "KCl", "treatments", ".", "Tukey", "box", "plot", "show", "results", "from", "3", "independent", "biological", "replicates", "per", "experimental", "condition", "(", "n", "=", "8", "-", "10", "roots", "each", "replicate", ")", ".", "The", "box", "plot", "shows", "the", "data", "within", "the", "interquartile", "range", "(", "25th", "and", "75th", "percentiles", ")", "and", "a", "solid", "black", "line", "represents", "the", "median", ".", "Whiskers", "show", "maximum", "and", "minimum", "values", "no", "further", "than", "1", ".", "5x", "IQR", "(", "interquartile", "range", ")", ".", "Outlier", "data", "are", "plotted", "individually", ".", "Asterisk", "indicate", "statistically", "significant", "difference", "between", "means", "analyzed", "by", "unpaired", ",", "two", "-", "tailed", "and", "assuming", "equal", "variance", "t", "-", "test", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", ".", "(", "B", ")", "Number", "of", "initiating", "and", "emerging", "lateral", "roots", "for", "all", "genotypes", "were", "counted", "using", "light", "microscopy", "3", "days", "after", "5", "mM", "KNO3", "or", "KCl", "treatments", ".", "Tukey", "box", "plot", "show", "results", "from", "3", "independent", "biological", "replicates", "per", "experimental", "condition", "(", "n", "=", "8", "-", "10", "roots", "each", "replicate", ")", ".", "The", "box", "plot", "shows", "the", "data", "within", "the", "interquartile", "range", "(", "25th", "and", "75th", "percentiles", ")", "and", "a", "solid", "black", "line", "represents", "the", "median", ".", "Whiskers", "show", "maximum", "and", "minimum", "values", "no", "further", "than", "1", ".", "5x", "IQR", "(", "interquartile", "range", ")", ".", "Outlier", "data", "are", "plotted", "individually", ".", "Asterisk", "indicate", "statistically", "significant", "difference", "between", "means", "analyzed", "by", "unpaired", ",", "two", "-", "tailed", "and", "assuming", "equal", "variance", "t", "-", "test", "(", "*", "p", "<", "0", ".", "05", ",", "*", "*", "p", "<", "0", ".", "01", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 7(A) Primary root length of the different genotypes was measured using the ImageJ program 3 days after 5 mM KNO3 or KCl treatments. Tukey box plot show results from 3 independent biological replicates per experimental condition (n = 8-10 roots each replicate). The box plot shows the data within the interquartile range (25th and 75th percentiles) and a solid black line represents the median. Whiskers show maximum and minimum values no further than 1.5x IQR (interquartile range). Outlier data are plotted individually. Asterisk indicate statistically significant difference between means analyzed by unpaired, two-tailed and assuming equal variance t-test (*p < 0.05, **p < 0.01).(B) Number of initiating and emerging lateral roots for all genotypes were counted using light microscopy 3 days after 5 mM KNO3 or KCl treatments. Tukey box plot show results from 3 independent biological replicates per experimental condition (n = 8-10 roots each replicate). The box plot shows the data within the interquartile range (25th and 75th percentiles) and a solid black line represents the median. Whiskers show maximum and minimum values no further than 1.5x IQR (interquartile range). Outlier data are plotted individually. Asterisk indicate statistically significant difference between means analyzed by unpaired, two-tailed and assuming equal variance t-test (*p < 0.05, **p < 0.01)."}
{"words": ["Figure", "8", "(", "A", ")", "Confocal", "microscopy", "using", "Zeiss", "Airyscan", "microscope", "and", "Zeiss", "-", "blue3", ".", "1", "software", "was", "used", "to", "visualize", "PIN2", "in", "Arabidopsis", "roots", ".", "\"", "e", "\"", "denotes", "epidermis", "and", "\"", "c", "\"", "cortex", ".", "Scale", "bar", "=", "20", "µm", ".", "(", "B", "-", "D", ")", "Tuckey", "box", "plots", "show", "PIN2", "-", "GFP", "fluorescence", "intensity", "quantification", "(", "number", "of", "roots", "analyzed", "per", "experimental", "conditions", "=", "8", "-", "10", ";", "arbitrary", "units", ",", "a", ".", "u", ".", ")", "at", "the", "total", "cell", "membrane", "in", "roots", "(", "B", ")", ",", "and", "from", "epidermal", "(", "C", ")", "and", "cortex", "(", "D", ")", "plasma", "membrane", "in", "the", "different", "genotypes", ".", "The", "box", "plot", "shows", "the", "data", "within", "the", "interquartile", "range", "(", "25th", "and", "75th", "percentiles", ")", "and", "a", "solid", "black", "line", "represents", "the", "median", ".", "Whiskers", "show", "maximum", "and", "minimum", "values", "no", "further", "than", "1", ".", "5x", "IQR", "(", "interquartile", "range", ")", ".", "Outlier", "data", "are", "plotted", "individually", ".", "Letters", "denote", "statistically", "significant", "difference", "between", "means", "as", "determined", "by", "one", "-", "way", "ANOVA", "analysis", "followed", "by", "Tukey", "HSD", "post", "hoc", "test", "(", "p", "<", "0", ".", "05", ")", "."], "labels": ["O", "O", "B-PANEL_START", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O", "O"], "text": "Figure 8(A) Confocal microscopy using Zeiss Airyscan microscope and Zeiss-blue3.1 software was used to visualize PIN2 in Arabidopsis roots. \"e\" denotes epidermis and \"c\" cortex. Scale bar = 20 µm. (B-D) Tuckey box plots show PIN2-GFP fluorescence intensity quantification (number of roots analyzed per experimental conditions = 8-10; arbitrary units, a.u.) at the total cell membrane in roots (B), and from epidermal (C) and cortex (D) plasma membrane in the different genotypes. The box plot shows the data within the interquartile range (25th and 75th percentiles) and a solid black line represents the median. Whiskers show maximum and minimum values no further than 1.5x IQR (interquartile range). Outlier data are plotted individually. Letters denote statistically significant difference between means as determined by one-way ANOVA analysis followed by Tukey HSD post hoc test (p < 0.05). "}